WO2000059932A1 - Peptides se liant a l'hemagglutinine du virus de la grippe - Google Patents

Description

明 細 書

ィ ンフルェ ンザウ イ ノレス · へマグルチニ ン 結合性ペプチ ド

技術分野

本発明は、 ィ ン フルェ ンザウィ ルスに特異的結合性を 有するペプチ ドに関する 。 よ り 詳細には、 本発明はイ ン フルェ ンザゥイ ノレス膜に存在するへマ グルチニ ンに特異 的に結合する べプチ ドに関する。

イ ンフルエ ンザゥ イ ノレスの宿主への感染は、 ウイ ノレス がその表面膜に埋め込ま れたへマ グルチニ ンを介 して宿 主受容体に結合する こ と によ っ て成立する 。 本発明のぺ プチ ドは、 へマグルチニ ン と結合する こ と に よ り 、 イ ン フルェ ンザウ ィ ルスの宿主受容体への結合を妨げる こ と によ っ て、 イ ン フノレェ ンザウィルス感染の防止に有意に 寄与する ものであ る 。

ゆえに、 本発明は、 上記ペプチ ドについて、 イ ン フル ェ ンザウィ ルスのへマグルチニ ンを介 した宿主受容体へ の結合の阻害剤 と しての用途、 並びに抗イ ン フルエ ンザ 剤と しての用途に関する も のでも あ る 。

背景技術 イ ンフルエ ンザウ イ ノレス膜にはへマ グルチニ ン （ H A ) 及びノ ィ ラ ミ ニダ一ゼ （ N A、 シァ リ ダーゼ） とい つ た 2 種類のスパイ ク 糖蛋白質が存在 し、 それぞれウイ ルスの感染成立及びウ ィ ルスの宿主細胞か らの出芽に重 要な役割を果た している。 前者のへマ グルチニンは、 ヒ トやその他の動物 （ほ乳類、 鳥類、 は虫類、 魚類、 両生 類等） とい っ た宿主の細胞膜上に普遍的に存在する シァ ル酸含有糖鎖を受容体と して認識 してそれに特異的に結 合 し、 イ ン フ ルエ ンザウ イ ルスの細胞内へのエ ン ドサイ ト ー シスを導 く 。 一方、 後者のノ ィ ラ ミ ニダーゼは、 受 容体破壊酵素であ り 、 宿主細胞か ら ウ ィルス粒子が出芽 ま たは遊離する際に、 自 らのま たは宿主細胞膜上の シァ ル酸残基を切断する役割を担っ ている 。

イ ン フルエ ンザウ イ ノレス は、 ウ イ ノレス核蛋白質や ウ イ ルス膜の内側に存在する マ ト リ ッ ク ス蛋白質な どの抗原 性によ り 、 A型、 B型及び C型に分類される。 特に A型 イ ン フルエ ンザウ イ ルスは、 遺伝子交雑や点変異等によ る抗原性の変化に伴う 亜型間の変化によ り 、 世界的規模 での流行を繰 り 返 している 。

前述する よ う にイ ンフルエンザウ イ ルス感染の第 1 ス テ ツ プに関与するへマグルチニ ン には、 極めて変異 しや すい抗原決定領域 （ A 〜 E ) のア ミ ノ 酸配列の多様性に 基づいて、 種々 の亜型が存在する。 へマグルチニ ンの亜 型間のア ミ ノ 酸配列の相違は 2 5 〜 7 5 %にわたるが、 宿主細胞の受容体と結合する いわゆ る受容体結合ポケ ッ ト領域は、 比較的変異がな く 、 その三次元構造はよ く 保 存さ れている ( Y. Suzuki, Prog. Lipid. Res. , 33， 429 (1994))

従来か ら、 イ ン フルエ ンザウ イ ルスの感染を防止する ために、 感染成立に寄与する へマグルチニ ンに特異的に 結合する こ とによ つ てその働きを阻害する作用を有する ワ ク チ ンの開発が検討されている。

その一例と して、 へマグルチニ ンが宿主受容体の シァ ル酸含有糖鎖を認識 して結合する こ と に基づいて、 種々 の糖アナ口 グを用いてへマグノレチニ ンのその結合部位に 特異的に結合する糖をス ク リ ーニ ングする という 手法に よ り 、 現在ま でに種々 のへマグルチニ ン結合性糖アナ口 グカ 取得されている （R. Roy, et al. , J. Chem. Soc. , Ch era. Coramun. , 1869 ( 1993 ) ； M. ammeii, et al. , J . Med. Chem. , 38, 4179 (1995) ； T. Sato, et al. , Chem. Let t. , 145 ( 1999 ) ； M. ltzstein, et al. , Nature, 3jB3, 418 (1993)) 。

そのほか、 へマグルチニ ンの受容体糖鎖に対する モノ ク ローナル抗体の抗原結合部位の もつ抗原性 （イ ディ ォ タ イ プ） に対する抗体 （抗イ ディ ォタ イ プ抗体） を作成 する手法も あ る。 すなわち、 これはへマグルチニ ンの受 容体とな る シアル酸およびシァ ロ糖鎖の三次元構造に'代 えて、 それと立体構造が類似する抗イ ディ ォタイ プ抗体 の超可変部のア ミ ノ 酸配列を作成 し、 宿主細胞のへマグ ルチニン受容体に模擬させる とい う も のであ る （鈴木康 夫 「ウ ィ ルス感染と糖鎖」 、 別冊 日 経サイ エ ンス 「糖鎖 と細胞」 ， 8 9 - 1 0 1頁， 1 9 9 4年 1 0月 ） 。

しか し、 これ らのいずれ もへマグノレチニ ンの種々 の亜 型に特異的であ り 、 ま た結合定数も高 く ない。

こ のため、 亜型の別に関わ らずィ ン フノレェ ンザウイ ノレ ス全般に働 く 広域ワ ク チ ンの開発が待たれているのが現 状でめ る。

イ ン フ ルエ ンザウ イ ルスのへマ グルチニ ンを特異的に 認識 し結合する物質、 すなわち宿主細胞の受容体に代え てへマグルチニ ンの受容体とな り 得る物質が提供できれ ば、 イ ン フ ルエ ンザがへマグルチニ ンを介 して宿主受容 体に結合する こ とを競合的に抑制ない し阻害する こ とが でき、 イ ン フ ルエ ンザウ イ ルス の感染を予防する こ とが 可能にな る もの と期待さ れる 。 ま た上記物質が、 イ ン フ ルェ ンザウィ ルスの亜型間でよ く 保存されたへマグルチ ニ ンの 「受容体結合ポケ ッ ト 」 を特異的に認識 してそれ と結合する も のであれば、 亜型の別な く イ ン フルエ ンザ ウィ ルス全般にわた っ てその感染を予防でき る もの と期 待される

本発明は、 かかる効果を奏 し得る、 イ ン フルエ ンザゥ ィ ルス · へマグルチニ ン結合性べプチ ドを提供する こ と を 目 的とする ものであ る 。 図面の簡単な説明

図 1 は、 マイ ク ロ プ レー ト へのイ ン フルエ ンザウ イ ノレ ス · へマグルチニ ンの固定化工程を示す概略図であ る。

図 2 は、 へマグルチニ ン H 1 をタ ーゲ ッ ト と してパニ ングされた H 1 フ ァ ー ジ （ H 1 7 フ ァ ー ジ及び H 1 Z 3 フ ァ ー ジ） について、 へマグルチニ ン H 1 に対する結 合性を調べた結果を示す図であ る。

図 3 は、 実施例 4 において、 実施例 1 及び実施例 3 で 得 られたフ ァ ー ジ ク ロ ー ン （「A- 1上「B_1上「B- 2丄「C- 1」， 「C_2丄「H1- 1」及び「IU- 2」） の、 イ ン フ ルエ ンザ ， へマ グ ノレチニ ン H 1 及び H 3 、 並びに小麦胚ァグルチニ ン （ WG A) に対する結合性を調べた結果を示す図であ る。

図 4 は、 実施例 5 において、 実施例 1 及び実施例 3 で 得られたフ ァ ー ジ ク ロー ン （「A- 1」，「B- 1上「B- 2丄「C- 1」及 び「C- 2」 （以上、 図 4 (a)に示す） 、 「 _1」及び「111-2」 (以上、 図 4 (b)に示す） ） の、 抗 G M 3抗体に対する結 合性を調べた結果を示す図である。 尚、 図中、 random 1 ibrary (図中一△一で示す） とは、 バニング前のラ ンダ ムなぺプチ ドを発現している フ ァージの集合を意味する。

図 5 は、 実施例 7 において、 へマグルチニンへのフ ァ ージク ロー ン （「A- 1上「B- 1」，「B- 2丄「C- 1」及び「C- 2」） の 結合に対するガングリ オシ ド G M 3 の阻害作用を調べた 結果を示す図である。 図 5 の a ) はへマグルチニ ン と し て H 1 亜型 （A/PR/8/34 ( H1N1) ) を使用 した場合の結果 を、 b ) はへマグルチニンと して H 3 亜型 （A/武漢 /359 /95 (H3N2) ) を使用 した場合の結果を示す。

図 6 は、 実施例 7 において、 へマグルチニ ンへのフ ァ —ジク ロー ン （「A- 1丄「B- 1」，「B- 2丄「C- 1」及び「C- 2」） の 結合に対するガングリ オシ ド G M 1 の阻害作用を調べた 結果を示す図である。 図 6 の a ) はへマグルチニンと し て H 1 亜型 （ A/PR/8/34 ( H1N1) ) を使用 した場合の結果 を、 b ) はへマグルチニンと して H 3 亜型 （A/武漠 /359 /95 (H3N2) ) を使用 した場合の結果を示す。

図 7 は、 実施例 11において、 ガング リ オシ ド G M 3 ( G M 3 キャス ト膜） へのへマグルチニンの結合に対す る、 フ ァ ージク ロー ン （「A- 1」） 発現ペプチ ド （合成ぺプ チ ド） の阻害作用を調べた結果を示す図である （図中、 —〇—で示す。 ） 。 図 7 の a ) はへマグルチニ ン と して H 1 亜型 （ A/PR/8/34 ( H1N1) ) を使用 した場合の結果を、 b ) はへマグルチニ ン と して H 3 亜型 （ A/武漢 7359/95 ( H3N2) ) を使用 した場合の結果を示す。 尚、 図中、 一 □— はペプチ ドを挿入 している ρ Π蛋白の N端 1 5 残基 ペプチ ド （コ ン ト ロ ール） 、 一 ◊ — はシァ リ ノレラ ク ト ー ス （スタ ンダー ド） によ る結果を示す。

図 8 は、 実施例 12において、 実施例 9 で調製 した リ ポ ペプチ ド （ C₁₈ A- 1 リ ポペプチ ド） を用いて、 細胞に対す るィ ンフルェ ンザウィルス感染阻害活性を調べた結果を 示す図であ る。 a ) はイ ン フルエ ンザウイルス と して H 1 亜型 （ A/PR/8/34 (H1N1) ) を使用 した と きの結果を、 b ) は H 3 亜型 （ A/武漢 /359/95 ( H3N2) ) を使用 したと き結果であ る 。 尚、 図中、 —〇— は C₁₈ A- 1 リ ポペプチ ド の結果、 —口 - は p III蛋白 N端 15残基ペプチ ドのステア リ ン酸誘導体の結果を示す。

図 9 は、 実施例 12において、 実施例 9 で調製 した リ ポ ペプチ ド （ C₁₈ A- 1 リ ポペプチ ド） 修飾 リ ボ ソ ームを用い て、 細胞に対する イ ンフルエ ンザウ イ ルス感染阻害活性 を調べた結果を示す図であ る 。 a ) はイ ンフルエンザゥ ィ ルス と して H I 亜型 （ A/PR/8/34 ( H1N1) ) を使用 した と きの結果を、 b ) は H 3 亜型 （ A/武漢 /359/95 ( H3N 2) ) を使用 した と き結果である。 尚、 図中、 一〇 一 は C is A-1 リ ポペプチ ドの結果、 —□ 一 は p ill蛋白 N端 15残 基ペプチ ドのステア リ ン酸誘導体の結果を示す。 発明の開示

本発明者 ら は、 上記課題を解決すべ く 鋭意研究を重ね ていた と こ ろ、 フ ァ ー ジディ スプレイ 法を用いる こ とに よ り 、 イ ンフ ノレエ ンザゥイ ノレスのへマ グルチニ ンを特異 的に認識 して結合するべプチ ドが選択的に取得でき る こ とを確認 した。

本発明は、 かかる知見に基づいて開発された ものであ

O o

すなわち、 本発明は下記 1 ~ 6 に掲げる イ ン フ ルェ ン ザウィ ルス · へマグルチニ ン結合性ぺプチ ドであ る ： 丄. 下記（a)ま たは（b)のいずれかであ る 、 イ ンフルェ ン ザウィ ルスへ へマグルチニ ン結合性ぺプチ ド ：

(a) 配列番号 1 〜 1 1 で示される ア ミ ノ 酸配列のいずれ かか ら選ばれる ァ ミ ノ 酸配列を有する ぺプチ ド、

( b) 上記 （a) に示される ア ミ ノ 酸配列において 1 若 し く は複数のア ミ ノ 酸が置換、 欠失若 し く は付加によ り 改 変さ れたア ミ ノ 酸配列か らな り 、 且つイ ン フルエ ンザゥ ィ ルス · へマ グルチニ ンに結合性を有するぺプチ ド。 _2_ · 配列番号 1 ま たは 6 で示される ア ミ ノ 酸配列を有す るイ ンフルエ ンザウ イ ノレス · へマグルチニ ン結合性ぺプ チ ド。

3_ . 配列番号 7〜 1 1 で示される いずれかのア ミ ノ 酸配 列を有する ィ ンフルェ ンザウィ ルス · へマグルチニ ン結 合性べプチ ド。

. イ ンフルエ ンザウ イ ルスが Α型ウ ィ ルスであ る、 1 乃至 3 のいずれかに記載のィ ンフルェ ンザウィ ルス · へ マグルチニ ン結合性べプチ ド。

5_ . イ ンフノレエ ンザゥ イ ノレス力 H 1 亜型である、 1 乃至 3 のいずれかに記載のィ ン フノレェ ンザウィルス · へマグ ルチニ ン結合性べプチ ド。

_6_ . イ ンフルエ ンザウイ ルスが H 3 亜型である、 1 又は 3 に記載のィ ンフノレェ ンザウィ ルス · へマグルチニ ン結 合性ペプチ ド。

これ らのぺプヂ ドはアルキル化又は脂質 （ リ ン脂質） 化する こ とによ っ て リ ポベプチ ドと して調製する こ と も でき る。 従っ て本発明のペプチ ドには リ ポペプチ ドが包 含さ れる。

ま た本発明は、 当該 リ ポペプチ ドを含有する リ ポ ソ一 ムであ る。

さ らに本発明は、 上に記載さ れる イ ンフルエ ンザウイ ルス · へマグルチニ ン結合性べプチ ド の少な く と も 1 種 を有効成分と して含有する ィ ンフルェ ンザウィ ルス · へ マグルチニ ン結合阻害剤であ る。 尚、 当該ペプチ ドは リ ポソ ームの形態であ る こ と もでき る。

ま た本発明は下記に掲げる、 抗イ ン フルエ ンザ剤、 具 体的にはィ ンフルェ ンザ予防若 し く は治療剤と して有用 な薬学的組成物であ る。

( A ) 有効成分と して上記のいずれかに記載のイ ン フル ェ ンザウィルス · へマグルチニ ン結合性ぺプチ ドの少な く と も 1 種、 及び薬学的に許容される担体を含有する薬 学的組成物。

( B ) 有効成分であ る ィ ン フルェ ンザウィ ルス · へマグ ルチニン結合性ぺプチ ドを リ ポベプチ ドの形態で含有す る上記薬学的組成物。

( C ) 有効成分であ る イ ン フルエ ンザウイ ノレス ' へマグ ルチニ ン結合性べプチ ドを リ ポ ソーム修飾体の形態で含 有する上記薬学的組成物。

( D ) 対象とする イ ンフルエ ンザウ イ ルスが A型ウィ ル スであ る上記薬学的組成物。

( E ) 対象とする イ ンフルエ ンザウ イ ルスが A型ウ ィ ル スの H 1 亜型であ る上記薬学的組成物。

( F ) 対象とする イ ンフルエ ンザウ イ ルスが A型ウ ィ ル スの H 3 亜型であ る上記薬学的組成物。

( G ) イ ン フルエ ンザの予防又は治療剤と して用い られ る上記薬学的組成物。 ま た本発明は、 上記 （ A ) 〜 （ G ) のいずれかに記載 の薬学的組成物を被験者に投与する こ とからな る ィ ンフ ルェ ンザの感染予防方法若 し く はィ ン フルェ ンザの治療 方法であ る 。 なお、 こ こ で被験者と しては、 イ ンフルェ ンザウィルスの感染を受ける可能性のある者 （ ヒ ト若 し く はその他の動物 （ほ乳類、 鳥類、 は虫類、 魚類、 両生 類等を含む） 並びにイ ン フルエ ンザウイルスに感染 した 者を挙げる こ とができ る 。 好ま し く は感染に係る イ ンフ ルェ ンザゥイ ノレスが A型に属する ものであ り 、 よ り 好ま し く は A型 H 1 亜型又は H 3 亜型に属する ものであ る。 さ ら に本発明は前記に記載するィ ン フルェンザウ ィル ス · へマグルチニ ン結合性ぺプチ ド並びに該ぺプチ ド修 飾 リ ボ ソ ームの、 上記抗イ ン フルエンザ剤 （イ ンフルェ ンザ予防若 し く は治療剤） と しての使用に関 し、 さ らに は前記記載のィ ンフルェ ンザウィ ルス · へマグルチニ ン 結合性べプチ ド並びに該ぺプチ ド修飾 リ ポソームの、 抗 イ ンフルエ ンザ剤 （イ ン フルエ ンザ予防若 し く は治療 剤） と して用い られる薬学的組成物の製造のための使用 に関する。 なお、 以下、 本明細書における ア ミ ノ 酸、 ペプチ ド、 塩基配列、 核酸等の略号によ る表示は、 I U P A C、 I U B の規定、 「塩基配列又はア ミ ノ 酸配列を含む明細書 等の作成のためのガイ ドライ ン」 （特許庁編） 及び当該 分野における慣用記号に従う もの とする。

本発明のィ ンフノレェ ンザゥ イ ノレスのへマグルチニ ン結 合性ペプチ ドの具体例 と しては、 後述する実施例に示さ れる方法によ り 得 られる配列番号 1 か ら 1 1 に示さ れる ァ ミ ノ 酸配列を有する ものを例示する こ とができ る。

以下、 本発明のへマグルチニ ン結合性ペプチ ド （以下

H A結合性ペプチ ドと も い う ） の選別方法及びこれによ り 得 られたぺプチ ドの同定、 並びに該ぺプチ ドのへマグ ルチニンへの結合性について説明する 。

本発明の H A結合性べプチ ドの選別及び同定には、 分 子ライ ブラ リ ーのス ク リ ーニ ング手法を採用する こ とが でき、 上記ラ イ ブラ リ 一 と しては、 例えばフ ァ ー ジディ スプレイ ライ ブラ リ ーを好ま し く 用い る こ とができ る 。

かかる ライ ブラ リ 一 と しては、 市販の ものを用いる こ とができ る。 該ラ イ ブラ リ 一 中のラ ンダムペプチ ドディ スプレイ フ ァ ー ジによれば、 特定の標的分子又は 目 的の 細胞に結合するペプチ ドを、 該分子又は細胞を用いてィ ン ビ ト ロでス ク リ ーニングでき、 しか も該ス ク リ ーニン グによ り 選別 さ れたペプチ ドが発現でき る ので、 標的と する分子又は細胞と特異的に結合するべプチ ドの選別及 び同定に有用であ る。 該フ ァ 一 ジディ スプレイ ライ ブラ リ ーを用いる ス ク リ ーニ ングは、 フ ァ ー ジディ スプ レイ 法と呼ばれ、 従来か ら種々 の細胞表面 レセプタ ー と特異 的に結合する リ ガン ドゃ種々 の抗体の選別及び同定に使 用 されている。 なお、 こ れ ら フ ァ ー ジディ スプレイ ライ ブラ リ ーの作成方法及びイ ン ビ ト ロ ス ク リ ーニング法に ついては、 ス コ ッ ト及びス ミ ス らの方法が参照される （S cott, J. . and Smith, G. P.， Science, 249, 386 - 39 0 ( 1990 )； Smith, G. P. and Scott, J. K. , Method s i n Enzymology, 217, 228 -257 ( 1993 ))。 なお、 これ らの 文献は、 本発明の一部と して こ こ に引用 される。

本発明の H A結合性ペプチ ドは、 上記フ ァ ー ジデイ ス プレイ法を用いてへマグルチニ ンに結合するべプチ ドを イ ン ビ ト ロでス ク リ ーニ ン グする こ と によ っ て取得する こ とができ る 。 具体的には以下の方法によ っ て行う こ と ができ る。

すなわち、 まず、 公知の フ ァ ー ジラ イ ブラ リ ーにラ ン ダムな D N A配列を挿入 して、 フ ァ ー ジの外殻表面にラ ンダムなァ ミ ノ 酸配列を有するぺプチ ドを発現 し得る よ う に構築 したラ ンダムべプチ ドディ スプレイ フ ァ ー ジを 用いて、 これを予めマイ ク ロ プレー ト 等の固相表面上に 固定化 したィ ンフノレェ ンザウ ィ ルスのへマグルチニ ン と 反応させて、 該へマグルチニ ン と特異的に結合する フ ァ ー ジを回収する （バイ オバニ ング） 。

なお、 マイ ク ロ プ レー ト に固定ィ匕さ せるイ ンフルェ ン ザゥイノレスのへマグルチニ ン と しては、 少な く と も宿主 細胞の受容体と結合する 「受容体結合ポケ ッ ト 」 を保存 的に有する も のであれば特に制限さ れず、 例えばへマグ ルチニ ンま たはイ ンフルエ ンザウイ ノレスその ものであ つ て も よい し、 ま たイ ンフルエ ンザウイ ルスをエーテル等 の各種有機溶媒で抽出処理 したィ ン フ ルェ ンザウ ィ ルス 抽出物等であ っ て も よい。 ま た、 イ ン フルエ ンザウ ィ ル スの種類も特に制限されず、 目 的に応 じて A型、 B 型ま たは C型、 乃至は ヒ ト分離型、 ブタゃゥマ等の他の哺乳 動物分離型ま たは鳥類分離型等のいずれであ る こ とがで き る。 好ま し く は A型ウィ ルス、 ま たは ヒ ト分離型のゥ イ ノレスであ る 。

前述する よ う にへマグルチニ ンの 「受容体結合ポケ ッ ト」 の三次構造はイ ンフルエ ンザウ イ ルスの亜型にかか わ らずよ く 保存されている ので、 上記マイ ク ロ プレー ト に固定化させる イ ン フルエ ンザゥ イ ノレスのへマグルチ二 ン と しては、 亜型の別を何 ら問 う ものではないが、 好適 には最近約 1 0 年の間 ヒ トか ら分離さ れている A型の亜 型であ る H 1 亜型や H 3 亜型を例示する こ とができ る。

へマグルチニ ン と特異的に結合する フ ァ ー ジの回収は、 宿主細胞の受容体と競合 してへマグルチニ ン と結合する 能力を有する H A受容体物質、 ま たはへマグルチニ ンの 宿主細胞の受容体への結合を阻害する能力を有する H A 阻害剤を、 固定化 したへマグルチニ ンに対 して作用 させ る こ とによ っ て行う こ とができ る。 すなわち、 マイ ク ロ プレー ト上に固定化されたへマグルチニンに特異的に結 合 している フ ァ ー ジは、 上記 H A受容体物質ま たは H A 阻害剤を競合反応させる こ と によ り 脱離溶出 し、 それに よ り 回収する こ とができ る。

こ こで、 H A受容体物質 と しては、 へマグルチニ ンに 特異的に結合する能力を有する ものであれば特に制限さ れない。 へマグルチニ ンの受容体結合ポケ ッ ト に特異的 に結合 している フ ァ ー ジを回収する には、 H A受容体物 質と してへマグルチニ ンの受容体結合ポケ ッ ト に特異的 に結合する能力を有する も のを用い る こ とが好ま しい。 かかる H A受容体物質と しては、 制限はないが、 ガ ング リ オ シ ド G M 3 、 a ( 2 → 6 ) G M 3 、 シァ リ ノレ Lewis X 等を例示する こ とができ る。

ま た、 H A阻害剤 と しては、 へマグルチニ ンの宿主細 胞受容体への結合を阻害する能力を有する ものであれば 特に制限されず、 例えばシアル酸誘導体 7-F- Neu5Ac2en、 2， 7-Dideoxy-7-fluoro-2, 3-didehydro sialic acid、 シ アル酸デン ド リ マー、 シアル酸含有ポ リ マー等を挙げる こ とができ る 。

か く して得 られる フ ァ ー ジを大腸菌に感染させて大量 培養 し、 分離、 精製 して、 へマグルチニン と特異的に結 合するペプチ ド発現フ ァ ー ジ、 好ま し く はへマグルチ二 ンの受容体結合ポケ ッ 卜 に特異的に結合するペプチ ド発 現フ ァ ー ジを得る。 か く して得 られる フ ァ ー ジは、 再び 上記と同様に、 固定化へマグルチニン と反応させてイ ン フルェ ンザゥ イ ノレスのへマグルチニ ン と特異的に結合す る フ ァ ー ジをス ク リ ーニ ングするノ、⁰ニ ング （ panning) 操 作に供される 。

かかるバニ ング操作を数回、 好ま し く は 4 〜 6 回程度 繰 り 返すこ と によ り へマ グルチニ ン と特異的に結合する ペプチ ド、 好ま し く はへマグルチニ ンの受容体結合ボケ ッ ト に特異的に結合する ペプチ ドを発現 し得る フ ァ ー ジ が選別でき る。 次いで、 選択さ れたフ ァ ー ジか ら D N Aを抽出 しその 配列を決定する こ と によ り 、 フ ァ ー ジが発現するべプチ ド、 すなわちイ ン フルエ ンザのへマグルチニ ン と特異的 に結合するペプチ ド （ H A結合性ペプチ ド） 、 好ま し く はへマグルチニ ンの受容体結合ポケ ッ 卜 に特異的に結合 するぺプチ ドを同定する こ とができ る 。

上記 D N Aの配列決定は、 当業界で公知の方法に よ り 容易に行う こ とができ、 例えばジデォキシ法 〔 Proc. Na tl. Acad. Sci. USA. , 74, 5463-5467 ( 1977)〕 やマキサ ム 一ギノレノ ー 卜法 [Method in Enzymology, 65， 499 (1 980 )] 等を挙げる こ とができ る。 かかる塩基配列の決定 は、 市販の シー ク ェ ンスキ ッ ト等を用いて も容易に行う こ とができ る。

上記フ ァ ー ジディ スプレイ 法においてフ ァ ー ジラ イ ブ ラ リ ー と しては、 通常こ の方法で用い られる公知の フ ァ ー ジライ ブラ リ 一がいずれ も使用でき る。 特に制限さ れ ないが、 具体的にはフ ァ ー ジの コー ト タ ンパク質 p III遺 伝子にラ ンダムな D N Aが挿入さ れて、 フ ァ ー ジ外殻表 面にラ ンダムな 1 5個のア ミ ノ 酸か らなる ア ミ ノ 酸配列 を有するペプチ ドを発現 し得る よ う に構築されたラ ンダ ムペプチ ドディ スプレイ フ ァ ー ジ （繊維状フ ァ ー ジ） を 好適に例示する こ とができ る （演題 ： 2C103 「フ ァ ー ジデ ィ スプレイ 法によ る糖脂質に結合する べプチ ドのセ レ ク シ ヨ ン」 、 第 3 回 日本化学会バイ オテク ノ ロ ジー部会 シ ンポ ジ ウ ム （1998) ; 日 本国特願平 1 1 ー 0 0 0 7 6 9 号 ； ） 。

こ のよ う に して同定さ れた H A結合性ペプチ ドのへマ グルチニ ンに対する親和性 （結合性） は、 前述する H A 結合性ペプチ ドを発現 し得る フ ァ ー ジの選別方法 （バニ ング） において、 ラ ンダムペプチ ドデ ィ スプレイ フ ァ ー ジに代えて、 測定対象ペプチ ドであ る 同定された H A結 合性ペプチ ドを用いて同様に行う こ と によ っ て確認、 評 価する こ とができ る 。

本発明の一例 と して、 固定化イ ン フ ルエ ンザウ イ ルス (へマグルチニ ン） と して、 A型 （ H I 亜型） のイ ンフ ノレェ ンザゥ イ ノレスであ る A/PR/8/34 ( H1N1) のエーテル抽 出物を、 ま た溶出用物質と して H A受容体物質ま たは H A阻害剤のいずれかを用いて、 H A結合性ペプチ ドを発 現する フ ァ ー ジを選択 し、 その発現ペプチ ドを同定する 方法を後記実施例 1 に記載する。

かかる本発明の一態様によ っ て同定されたべプチ ドは、 配列番号 1 か ら 6 に示さ れる いずれかのア ミ ノ 酸配列を 有する ものであ り 、 これ ら はいずれ も ィ ン フルェ ンザゥ イ ノレスのへマグルチニ ン、 特にへマグルチニ ンの受容体 結合ポケ ッ ト に対 して結合性を有する こ とによ り 特徴づ け られる。 ま た これ らのペプチ ドは、 イ ンフルエ ンザゥ ィ ルスの中で も A型ウィ ルス ま たは ヒ ト型ウィ ルスのへ マグルチニ ンに対 して結合性を有する もの と して特徴づ ける こ とができ る。 なお、 こ れ らのペプチ ドは、 へマグ ルチニ ン H I 亜型をタ ーゲ ッ ト と して選択さ れた も ので あ り 、 こ の亜型に特異的結合性を有する もの と して特徴 づけ られる。 中で も配列番号 1 及び配列番号 5 に示され るア ミ ノ 酸配列を有するペプチ ドが、 H I 亜型に特異的 に結合する ペプチ ドと して好適に例示される。

ま た本発明の一例 と して、 固定化イ ンフルエ ンザウイ ノレス （へマグルチニ ン） と して、 A型の H I 亜型であ る A/PR/8/34 ( H1N1) 及び H 3 亜型であ る A/武漢 /359 /95 ( H3N2) のエーテル抽出物を、 ま た溶出用物質と して各 種の H A受容体物質 （ シァ リ ル LewisX、 a ( 2 → 6 ) G M 3 ) を用いて、 こ れ らのへマグルチニ ンの両方を認識 し結合するペプチ ドを発現する フ ァ ー ジを選択 し、 該発 現べプチ ドを同定する方法を後記実施例 3 に記載する。

かかる本発明の態様によ っ て同定さ れたペプチ ドは、 配列番号 7 か ら 1 1 に示さ れる いずれかのア ミ ノ 酸配列 を有する ものであ る 。 こ れ らの H A結合性ペプチ ドは、 へマグルチニ ンの亜型であ る H 1 及び H 3 の両方に対 し て結合性を有する こ とによ り 特徴づけ られる。 へマ グル チニ ンの H I 亜型及び H 3 亜型は、 互いにア ミ ノ 酸配列 が 7 5 %相違する こ とが知 られている こ とかち、 上記 H A結合性べプチ ドはへマグルチニ ンの H 1 亜型と H 3 亜 型の相同性の高い部位を認識 して、 該部分に結合する も の と考え られる。

ま た上記 H A結合性ペプチ ドの う ち、 特に配列番号 7 で示されるペプチ ドは、 異な る 2 つの溶出用物質 （ シァ リ ノレ Lew i s X、 a ( 2 → 6 ) G M 3 ) で共に溶出 さ れ取得 される こ とか ら、 そのへマグルチニ ンへの結合部位はシ 了 リ ル Lew i s Xや α ( 2 → 6 ) G M 3 のへマグルチニ ンへ の結合部位と同一であ っ て、 ま た同 じ結合様式を有する もの と考え られる。

本発明のペプチ ドには、 上記配列番号 1 か ら 6 に示さ れる いずれかのア ミ ノ 酸配列を有する ペプチ ド、 並びに 配列番号 7 か ら 1 1 に示さ れる いずれかのア ミ ノ 酸配列 を有するペプチ ドの他に、 こ れ らのア ミ ノ 酸配列におい て、 1 若 し く は複数個のア ミ ノ 酸が置換、 欠失若 し く は 付加によ り 改変されたア ミ ノ 酸配列か らな り 、 且つイ ン フ ルェ ンザゥイ ノレス のへマ グルチニ ン 、 特に Α型ィ ン フ ルェンザウィ ルスのへマグルチニンに結合性を有す るぺ プチ ド並びに蛋白質が包含さ れる。 こ こで配列番号 1 か ら 6 に示される ぺプチ ドに関 して、 ア ミ ノ 酸の 「置換、 欠失若 し く は付加」 の程度及びそれ らの位置な どは、 改変されたべプチ ド若 し く は蛋白質が、 配列番号 1 か ら 6 で示される ア ミ ノ 酸配列のいずれかか らなるぺプチ ドと 同様にィ ンフノレエ ンザゥイ ノレスのへマ グルチニ ン、 特にへマグルチニ ンの受容体結合ポケ ッ ト に対 して結合性を有する とい っ た上記特徴を備えた同効 物であれば特に制限されない。 好ま しい特徴と しては、 へマグルチニ ンの H 1 亜型に特異的に結合性を有する こ とを挙げる こ とができ る。

ま た、 こ こ で配列番号 7 か ら 1 1 に示されるペプチ ド に関 して、 ア ミ ノ 酸の 「置換、 欠失若 し く は付加」 の程 度及びそれ らの位置な どは、 改変されたペプチ ド若 し く は蛋白質が、 配列番号 7 か ら 1 1 で示される ア ミ ノ 酸配 列のいずれかか らな るペプチ ドと同様にイ ン フルエ ンザ ウィルスのへマグルチニ ン、 特にへマ グルチニ ンの受容 体結合ポケ ッ ト に対 して結合性を有する とい っ た特徴を 備えた同効物であれば特に制限されないが、 好ま し く は へマグルチニ ンの H 1 亜型及び H 3 亜型の双方に対 して 結合性を有する とい っ た特徴を備えた同効物を挙げる こ とができ る 。

こ のよ う なア ミ ノ 酸配列の改変 （変異） は、 例えば突 然変異や翻訳後の修飾な どによ り 生 じ る こ と もあ るが、 人為的に行う こ と もでき る 。 本発明は、 こ の よ う な改変 • 変異の原因及び手段な どを問わず、 上記特性を有する 全ての改変べプチ ドを包含する ものであ る。

本発明の H A結合性ペプチ ドは、 そのア ミ ノ 酸配列に 従っ て、 一般的な化学合成法によ り 製造する こ とができ る。 該方法には、 通常の液相法及び固相法によ るべプチ ド合成法が包含さ れる。 かかるペプチ ド合成法は、 よ り 詳 し く は、 本発明で提供する ア ミ ノ 酸配列情報に基づい て、 各ア ミ ノ 酸を 1 個ずつ逐次結合させ鎖を延長させて い く ステ ッ プワイ ズエロゲー シ ヨ ン法と、 ア ミ ノ 酸数個 か らなる フ ラ グメ ン ト を予め合成 し、 次いで各フ ラ グメ ン トをカ ッ プ リ ング反応させる フ ラ グメ ン ト · コ ンデン セー シ ヨ ン法とを包含する 。 本発明のペプチ ドの合成は、 そのいずれによ る こ と もでき る。

上記べプチ ド合成に採用 される縮合法も、 公知の各種 方法に従う こ とができ る。 その具体例 と しては、 例えば アジ ド法、 混合酸無水物法、 D C C 法、 活性エステル法、 酸化還元法、 D P P A (ジ フ ヱニルホスホ リ ルア ジ ド）法、 D C C +添加物（ 1— ヒ ド ロ キシベ ンゾ ト リ ァゾール、 N — ヒ ドロキシサク シ ンア ミ ド、 N— ヒ ドロキシ 一 5 — ノ ノレ ボルネ ン — 2， 3 — ジカルボキシイ ミ ド等）、 ゥ ッ ド ヮ ー ド法等を例示でき る。 こ れ ら各方法に利用でき る溶媒も こ の種のぺプチ ド縮合反応に使用 される こ とがよ く 知 ら れている一般的な ものか ら適宜選択する こ とができ る。 その例 と しては、 例えば ジメ チルホルムア ミ ド（ D M F )、 ジメ チルスルホキシ ド（ D M S 0 )、 へキサホスホ ロ ア ミ ド、 ジォキサ ン、 テ ト ラ ヒ ドロ フ ラ ン（T H F )、 酢 酸ェチル等及びこれ らの混合溶媒等を挙げる こ とができ る。

尚、 上記ペプチ ド合成反応に際 して、 反応に関与 しな いア ミ ノ 酸及至ペプチ ドにおける カルボキシル基は、 一 般にはエステル化によ り 、 例えばメ チルエステル、 ェチ ルエステル、 第三級ブチルエステル等の低級アルキルェ ステル、 例えばべン ジ ノレエ ス テル、 p — メ ト キ シ ベ ン ジ ノレエ ス テノレ、 p — 二 ト 口 べ ン ジ ノレエ ス テノレァ ラ ノレキノレエ ステル等と して保護する こ とができ る 。 ま た、 側鎖に官 能基を有する ア ミ ノ 酸、 例えば Tyrの水酸基は、 ァセチル 基、 ベ ン ジル基、 ベ ン ジルォキシカルボニル基、 第三級 ブチル基等で保護されて も よいが、 必ずし もかかる保護 を行う 必要はない。 更に例えば Argのグァニジノ 基は、 二 ト ロ基、 ト シル基、 2 — メ ト キシベンゼンスルホ二ノレ基、 メ チ レ ン 一 2 — スルホニル基、 ベ ン ジルォキシカルボ二 ル基、 イ ソ ボルニルォキシ カルボニル基、 ァダマ ンチル ォキシカルボニル基等の適当な保護基によ り 保護する こ とができ る。 上記保護基を有する ア ミ ノ 酸、 ペプチ ド及 び最終的に得 られる本発明のぺプチ ドにおける これ ら保 護基の脱保護反応 も ま た、 慣用 される方法、 例えば接触 還元法や、 液体ア ンモニアノナ ト リ ウ ム、 フ ッ 化水素、 臭化水素、 塩化水素、 ト リ フルォロ酢酸、 酢酸、 蟻酸、 メ タ ンスルホ ン酸等を用い る方法等に従って、 実施する こ とができ る。

か く して得 られる本発明の H A結合性ポ リ ペプチ ドは、 通常の方法に従っ て、 例えばイ オ ン交換樹脂、 分配ク ロ マ ト グラ フ ィ 一、 ゲノレク ロ マ ト グラ フ ィ ー、 ァフ ィ ニテ ィ ー ク ロマ ト グラ フ ィ ー、 高速液体ク ロマ ト グラ フ ィ ー ( H P L C )、 向流分配法等のペプチ ド化学の分野で汎用 されている方法に従っ て、 適宜その精製を行う こ とがで き る。

ま た、 上記本発明の H A結合性ペプチ ドは、 適宜に化 学修飾する こ とができ、 例えばアルキル化や脂質化 （ リ ン脂質化） 等によ る化学修飾によ り 、 H A結合性べプチ ドの細胞親和性や組織親和性を増大させ、 或いは血中半 減期の延長等によ る薬理効果の増強を意図する こ とがで る

H A結合性べプチ ドのアルキル化は常法に従っ て実施 する こ とができ る。 例えば、 脂肪酸と H A結合性べプチ ドの N末端ア ミ ノ 基とのア ミ ド結合形成反応 （前記のぺ プチ ド合成と 同様に して実施） によ り 容易に実施さ れる。

脂肪酸と しては、 直鎖や分枝鎖の別及び飽和や不飽和 の別に特に制限される こ とな く 、 任意の脂肪酸を広 く 例 示でき る。 一般的には、 生体内に存在する脂肪酸が好適 に採用でき、 具体的にはラ ウ リ ン酸、 ミ リ スチ ン酸、 ノ、 ° ル ミ チ ン酸、 ステア リ ン酸、 ァラ キ ン酸等の飽和脂肪酸 ； ォ レイ ン酸、 エラ イ ジ ン酸、 リ ノ 一ノレ酸、 リ ノ レ ン酸、 ァラキ ド ン酸等の不飽和脂肪酸な ど、 炭素数が 1 2 〜 2 0程度の脂肪酸が例示さ れる。

ま たアルキル化は、 アルキルァ ミ ン と H A結合性ぺプ チ ドの C末端カルボキシル基とのア ミ ド結合形成反応 (前記ペプチ ド合成と同様に して実施） によ っ て も収得 でき る。 アルキルと しては、 上記脂肪酸と同様に各種の アルキルア ミ ンが例示でき、 一般的には生体内に存在す る脂肪鎖 （炭素数が 1 2 ~ 2 0 程度） を好適に採用する こ とができ る。

H A結合性べプチ ドの脂質化も常法に従っ て実施でき る （New Current, 11 ( 3 ), 15 -20 ( 2000 )； Biochemica e t Biophysica Acta. , 1128, 44-49 ( 1992)； FEBS Lette rs, 413, 177- 180 ( 1997 ) ; J. Biol. Chem. , 257， 286-28 8 ( 1982 )等） 。 例えば、 各種 リ ン脂質の 2 位水酸基或い は 3 位の リ ン酸基を利用 して、 任意のスぺ一サーを介 し て H A結合性べプチ ドの脂質修飾体を調製する こ とがで き る。 反応には各種の縮合法が採用でき、 必要によ り H A結合性ペプチ ドの N端或いは C端に任意の長さ （通常 数個） の システィ ンを含むア ミ ノ 酸配列を付加 して、 縮 合に利用 される反応性 S H基を導入する こ と もでき る。

こ こで リ ン脂質と して も、 特に制限はな く 、 上記 した 各種の脂肪酸からな る、 ホスフ ァ チジ ン酸、 ホス フ ァ チ ジノレコ リ ン （ レ シチ ン） 、 ホス フ ァ チ ジルエタ ノ ーノレア ミ ン、 ホス フ ァ チ ジルセ リ ン、 ホ ス フ ァ チ ジノレイ ノ シ ト ール、 ホス フ ァ チジルグ リ セ ロール等が良好に使用でき る o

なお、 これ らのアルキル化や脂質化された本発明の H A結合性ペプチ ド （ リ ポペプチ ド） は、 リ ボ ソ ーム調製 の際の脂質成分と して も作用 し、 ま た当該ペプチ ドが リ ポ ソ一ム上に提示さ れる こ とによ り 、 後述する リ ポ ソ一 ム製剤に極めて好適に用い られる。

本発明の H A結合性ペプチ ドは、 イ ン フルエ ンザ感染 の第 1 ステ ッ プに関与する イ ン フルエ ンザウ イ ルスのへ マグルチニンを特異的に認識 してそれに結合する ァ ミ ノ 酸配列を有する ものであ り 、 それ 自身、 in v i voにおいて へマグルチニ ンを介 して生 じ る ィ ン フルェ ンザウィ ルス と宿主細胞受容体との結合を競合的に妨げる こ とのでき る もの と して、 すなわちへマグルチニ ン結合阻害剤 と し て用いる こ とができ る。 当該へマグルチニ ン結合阻害剤 は、 へマグルチニ ンを介 して生 じる ィ ンフルェ ンザウイ ルスの感染、 並びにそれに伴う 種々 の細胞機能や生命現 象を解明する のためのツールと して用いる こ とができ、 ま た宿主細胞受容体へのへマグルチニ ンの結合を介 して 生 じるイ ンフルエ ンザウイ ルスの感染を予防 した り 、 ィ ンフルェ ンザを治療する のに用い られる抗ィ ンフノレェ ン ザ剤、 具体的にはィ ンフルェ ンザの感染予防薬又は治療 薬の有効成分と して有用であ る と期待される。

なお、 本発明が対象とする イ ン フルエ ンザウイ ルスは 前述する よ う にその型や由来を特に制限する ものでな く A型、 B 型ま たは C型乃至は ヒ ト分離型、 ブタゃゥ マ等 の他の哺乳動物分離型ま たは鳥類分離型等のいずれであ る こ とができ る。 好ま し く は A型イ ンフルエ ンザウ ィ ル スであ る。 ま た好適には ヒ ト分離型若 し く は ヒ ト感染型 のゥイ ノレスであ る。

イ ンフルエ ンザウイ ルス感染の予防又は治療薬の有効 成分と して用い られる場合、 本発明の H A結合性べプチ ド （ H A結合性を有する その改変若 し く は修飾ペプチ ド を包含する。 以下同 じ。 ） は、 そのま まか、 若 し く は薬 学的に許容さ れる担体を含む薬学的組成物と して調製さ れ、 被験者に投与さ れる 。

こ こで用い られる薬学的に許容される担体は、 調製さ れる薬学的組成物の形態に応 じて、 当該分野において慣 用 さ れている担体の中か ら適宜選択 して用いる こ とがで さ る 。

例えば、 薬学的組成物が水溶液形態と して調製さ れる 場合、 上記の担体と しては、 精製水 （滅菌水） ま たは生 理学的緩衝液を利用する こ とができ る 。 ま た、 該組成物 が適当な溶液形態に調製さ れる場合、 上記担体と しては 例えば、 グ リ コーノレ 、 グ リ セ ロ ー ノレ 、 オ リ ーブ油の よ う な注射投与可能な有機エステルな どを使用する こ とがで き る。 ま た、 これ らの組成物には、 当該分野、 特にぺプ チ ド製剤ない しは蛋白製剤の分野で慣用的に用い られる 安定剤、 賦形剤な どを含むこ とができ る。

ま た本発明の H A結合性べプチ ドは リ ポ ソ ーム製剤と して調製する こ とができ る 。

リ ボ ソーム製剤は、 酸性 リ ン脂質を膜構成成分とする か或いは中性 リ ン脂質と酸性 リ ン脂質とを膜構成成分と する リ ボ ソームに、 本発明の H A結合性ペプチ ドを保持 させる こ と によ っ て調製でき る。 こ こ で、 膜構成成分と しての酸性 リ ン脂質と しては、 通常の酸性 リ ン脂質よ り 狭義-に定義さ れ、 よ り 具体的に は ジ ラ ウ ロ イ ノレホ ス フ ァ チ ジルグ リ セ ロ ーノレ （ D L P G ) 、 ジ ミ リ ス ト イ ノレホス フ ァ チ ジノレグ リ セ ロ ール （ D M P G ) 、 ジパル ミ ト イ ノレホス フ ァ チ ジノレグ リ セ ロ ール ( D P P G ) 、 ジステア ロ イ ノレホス フ ァ チ ジルグ リ セ 口 一ノレ （ D S P G ) 、 ジォ レオイ ノレホス フ ァチ ジノレグ リ セ 口 一ノレ （ D 0 P G ) 、 卵黄ホス フ ァ チ ジルグ リ セ ロ ール (卵黄 P G ) 、 水添卵黄ホス フ ァ チ ジルグ リ セ ロ ール等 の天然ま た は合成ホス フ ァ チ ジルグ リ セ ロ ール類 （ P G ) およ び ジ ラ ウ ロ イ ノレホ ス フ ァ チ ジルイ ノ シ ト ール ( D L P I ) ； ジ ミ リ ス ト イ ルホス フ ァ チ ジルイ ノ シ ト 一ノレ （ D M P I ) 、 ジ ノ、。ノレ ミ ト イ ノレホ ス フ ァ チ ジルイ ノ シ ト ーノレ （ D P P I ) 、 ジ ステア ロ イ ノレホス フ ァ チ ジル イ ノ シ ト ーノレ （ D S P I ) 、 ジォ レオイ ノレホス フ ァ チ ジ ノレイ ノ シ ト ーノレ （ D O P I ) 、 大豆ホ ス フ ァ チ ジルイ ノ シ ト ール （大豆 P I ) 、 水添大豆ホ ス フ ァ チ ジルイ ノ シ ト ール等の天然ま た は合成ホス フ ァ チ ジルイ ノ シ ト ール 類 （ P I ) を示す。 これ ら は一種単独でま たは二種以上 混合 して使用でき る 。

ま た、 中性 リ ン脂質と しては、 大豆ホ ス フ ァ チ ジルコ リ ン、 卵黄ホ ス フ ァ チ ジルコ リ ン、 水添大豆ホ ス フ ァ チ ジ ル コ リ ン、 水添卵黄ホ ス フ ァ チ ジ ル コ リ ン 、 ジ ミ リ ス ト イ ノレホ ス フ ァ チ ジ ノレ コ リ ン （ D M P C ) 、 ジ ノ、。ル ミ ト ィ ルホ ス フ ァ チ ジ ノレ コ リ ン （ D P P C ) 、 ジ ラ ウ ロ イ ノレ ホ ス フ ァ チ ジノレ コ リ ン （ D L P C ) 、 ジ ス テ ア ロ イ ノレホ ス フ ァ チ ジノレ コ リ ン （ D S P C ) 、 ミ リ ス ト イ ノレノ、。ノレ ミ ト イ ノレホ ス フ ァ チ ジ ノレ コ リ ン （ M P P C ) 、 パル ミ ト イ ルス テ ア リ イ ノレホ ス フ ァ チ ジ ノレ コ リ ン （ P S P C ) 、 ジ ォ レ オ イ ノレホ ス フ ァ チ ジ ノレ コ リ ン （ D O P C ) 等の 天然 ま た は合成ホ ス フ ァ チ ジ ル コ リ ン類 （ P C ) 、 大豆ホ ス フ ァ チ ジノレエ タ ノ ー ノレア ミ ン 、 卵黄ホ ス フ ァ チ ジノレエ タ ノ ー ルア ミ ン 、 水添大豆ホ ス フ ァ チ ジ ルエ タ ノ ールア ミ ン 、 水添卵黄ホ ス フ ァ チ ジルエ タ ノ ー ルァ ミ ン 、 ジ ミ リ ス ト イ ノレホ ス フ ァ チ ジノレエ タ ノ ー ノレア ミ ン （ D M P E ) ジノ、。ノレ ミ ト イ ノレホ ス フ ァ チ ジ ノレエ タ ノ ー ノレア ミ ン （ D P P E ) 、 ジ ラ ウ ロ イ ノレホ ス フ ァ チ ジノレエ タ ノ ーノレア ミ ン ( D L P E ) 、 ジス テ ア ロ イ ノレホ ス フ ァ チ ジルエ タ ノ ー ルァ ミ ン （ D S P E ) 、 ミ リ ス ト イ ノレパノレ ミ ト イ ノレホ ス フ ァ チ ジノレエ タ ノ ー ルァ ミ ン （ M P P E ) 、 パル ミ ト イ ノレス テ ア ロ イ ノレホ ス フ ァ チ ジノレエ タ ノ ー ノレア ミ ン （ P S P E ) 、 ジ ォ レオ イ ノレホ ス フ ァ チ ジルエ タ ノ ー ルァ ミ ン ( D O P E ) 等の天然ま た は合成ホ ス フ ァ チ ジルェ タ ノ ールァ ミ ン類 （ P E ) 等を例示でき る 。 これ らは一種単 独でま たは二種以上混合 して使用する こ とができ る 。

上記 リ ボ ソ ーム膜は、 上記酸性 リ ン脂質を単独で構成 成分と して用いるかま たは上記中性 リ ン脂質と酸性 リ ン 脂質とを併用 して常法に従い形成さ れる。 こ こ で酸性 リ ン脂質の併用割合は、 リ ボ ソ ーム膜構成成分中に約 0 . 1 〜 1 0 0 モル％程度、 好ま し く は約 1 〜 9 0 モル％、 よ り 好ま し く は約 1 0 〜 5 0 モル％程度とする のがよい , 上記 リ ボ ソ ームの調製.に当た っ ては、 更に例えばコ レ ステロ ールな どを添加する こ とができ る。 こ の コ レステ ロールの添加によれば リ ン脂質の流動性を調整 して、 リ ポソームの調製をよ り 簡便な もの とする こ とができ る。 該コ レステロ ールは通常 リ ン脂質に対 して等暈ま で、 好 ま し く は 0 . 5 〜 1 倍等量の量で添加配合さ れる のが好 ま しい。

リ ボ ソーム分散液中の有効成分と酸性 リ ン脂質との配 合割合は、 有効成分に対 して酸性 リ ン脂質が約 0 . 5 〜 1 0 0 当量程度、 好ま し く は約 1 〜 6 0 当量程度、 よ り 好ま し く は約 1 . 5 〜 2 0 当量程度と される のがよ い。

ま た、 リ ボ ソ ームに含ま れる本発明 H A結合性べプチ ドの割合は、 全脂質中、 数モル％か ら数十モル％程度、 好ま し く は 5 〜 1 0 モル％程度であ る こ とができ る が、 通常は 5 モル％程度でも あ っ て も よい。 本発明の H A結合性べプチ ドを薬物とする リ ポ ソ ーム の製造には種々 の公知の方法を用いる こ とができ、 ま た、 リ ポペプチ ドであ る本発明ペプチ ドは、 当該方法におけ る脂質成分と して利用する こ と によ つ て も所望の リ ポ ソ —ム とする こ とができ る。

例えば多重層 リ ボ ソーム （ M L V ) は次のよ う に して 調製さ れる。 まず、 脂質を有機溶媒 （ ク ロ 口 ホルム、 ェ 一テル等） に溶解 した後、 丸底フ ラ ス コ に入れ、 窒素気 流下ま たは減圧下で有機溶媒を除去 し、 フ ラ ス コ底部に 脂質の薄膜をつ く る。 こ の場合、 さ ら に減圧下でデシケ 一タ ー中に放置する こ とによ っ て有機溶媒を完全に除去 する こ と もでき る。 次いで、 薬物溶液を脂質薄膜上に加 えて脂質を水和させる こ とによ つ て乳濁色の リ ポ ソ ーム 懸濁液が得 られる。

ま た大きな一枚膜 リ ボ ソ ーム （ L U V ) は、 ホス フ ァ チジルセ リ ンの小さ な一枚膜 リ ボ ソ ームに Ca ² +を添加 し、 融合させてシ リ ンダー状の シー ト と した後、 キ レー ト剤 であ る E D T Aを添加 し Ca^{2 +}を除去する方法 （Biochim. Biophys. Acta 394, 483-491， 1975 ) やエーテルに溶解 した脂質を約 60°Cの水溶液中に注入 し、 エーテルを蒸発 させる方法 ( Biochim. Biophys. Acta 443, 629 -634, 1 976) によ り 作る こ とができ る。 ま た、 Szokaらの考案 した逆相法によ る リ ポソ一ムの調 製法 ( Proc. Natl. Acad. Sci. U. S丄 75， 4194 - 4198， 1978) を用い る こ と もでき る。 こ の方法によ る と、 リ ン 脂質のエーテル溶液に薬物溶液を加え、 超音波処理する と WZ O型エマルシ ヨ ンが作成される 。 この WZ O型ェ マルシ ヨ ンを減圧下、 エバポ レータ ー によ り エーテルを 除去 し、 次いで緩衝液を加えボルテ ッ ク ス ミ キサーで撹 拌する と、 WZ O型エマルシ ヨ ンか ら 0 /W型エマルシ ヨ ンに転相 し、 更に残留する有機溶媒を除 く こ とによ つ て リ ボ ソームが作成でき る。

これ らの調製法のほかに、 フ レ ンチプレス法によ り 粒 子径の小さ な リ ボ ソ ームを調製する こ と もでき る （ FEBS lett. 99, 210-214, 1979 ) 。 ま た大沢 らによ っ て報告 されている リ ポ ソ ームへの保持効率の高い凍結乾燥法 ( Chem. Pharm. Bull. 32, 2442-2445, 1984) と凍結融 解法 ( Chem. Pharm. Bull. 3^, 2916 -2923, 1985 ) を使 用する こ と もでき る 。

このよ う に調製さ れた リ ボ ソ ームは、 透析法 （ J . Pha rm. Sci. 71» 806-812， 1982 ) やポ リ カーボネー ト膜を 用いたろ過法 ( Biochim. Biophys. Acta 557, 9 - 23, 19 79 ； Biochim. Biophys. Acta 601, 559 - 571, 1980 ) によ り 、 粒子径を一定にする こ とができ る 。 ま た調製さ れた リ ボ ソ ーム溶液か ら、 リ ボ ソ ーム内に保持さ れなかっ た 薬物を除 く ためには、 透析法、 ゲルろ過法、 遠心分離法 を利用する こ とができ る （ リ ボ ソ ーム . "脂質の化学" [日 本生化学会編、 生化学実験講座 3 ]、 東京化学同人、 1 97 4 ) 。 更にま た透析膜を用いて リ ボ ソ ームを濃縮する こ と も可能であ る 。

こ のよ う に して調製さ れる リ ボ ソ ーム分散液には、 製 剤設計上必要な添加剤と して、 防腐剤、 等張化剤、 緩衝 剤、 安定化剤、 可溶化剤、 吸収促進剤等の各種の公知物 質を適宜配合する こ とができ、 ま た必要に応 じてこ れ ら の添加物を含む液ま たは水で希釈する こ と もでき る 。 上 記添加剤の具体例と しては、 防腐剤と しては塩化ベ ンザ ルコニゥム、 塩化べ ンゼ トニゥ ム、 ク ロ 口へキシ ジ ン、 パラベ ン類 （メ チルパラ ベン、 ェチルパラベン等） 、 チ メ ロサール等の真菌および細菌に有効な防腐剤を、 等張 化剤と しては D —マ ンニ ト ール、 D — ソ ノレビ ト ール、 D - キシ リ ト ール、 グ リ セ リ ン、 ブ ドウ糖、 マル ト ース、 庶糖、 プロ ピ レ ング リ コ ール等の多価アルコール類や塩 化ナ ト リ ウ ム等の電解質類を、 ま た安定化剤と しては ト コ フ ェ ローノレ、 ブチルヒ ドロキシァニソ一ノレ、 ブチルヒ ドロキシ トルエ ン、 エチ レ ン ジァ ミ ン四酢酸塩 （ E D T A ) 、 システィ ン等をそれぞれ例示でき る。 ま た、 本発明の H A結合性ペプチ ドからな る上記 リ ポ ソ ームの内部には、 例えば抗ウィ ルス剤等の他の薬剤を 更に封入させる こ とができ、 同様に リ ボ ソーム製剤 とす る こ とができ る。

リ ボ ソ ーム製剤の製造は、 具体的には例えばゥ ッ ド レ Long Circulating Liposomes： old drugs, New the rapeutics. , M. C. oodle, G. Storm, Eds : Springer- Ver lag Berlin (1998)) ま たはナ ンノ ら ( Liposomal appli cations to cancer therapy, Y. Namba, N. Oku, J . Bioac t. Compat. Polymers, 8, 158 - 177 ( 1993 )) の文献に記載 される方法に従っ て調製する こ とができ る。 ま た本発明 に関する リ ボ ソーム製剤の具体例は、 例えば後記実施例 9 に示されている。

上記 リ ポ ソ一ム製剤を含む本発明の薬学的組成物中の H A結合性ペプチ ドの量と しては、 特に限定されず広範 囲に適宜選択されるが、 通常組成物中 0 . 0 0 0 2 〜 0 2 ( w/ v % ) 程度、 好ま し く は 0 . 0 0 1 〜 0 . 1 ( w / V % ) 程度とする のがよい。

本発明のィ ンフルェ ンザウ ィ ルス · へマグルチニ ン結 合阻害剤並びに薬学的組成物は、 有効成分と しての H A 結合性べプチ ドと薬学的に許容される担体を含有する製 剤組成物と して、 イ ンフルエ ンザウイ ルスに感染若 し く は感染前の被験者に投与される。

上記阻害剤並びに薬学的組成物の投与方法は特に制限 はな く 、 各種製剤形態、 患者の年齢、 性別、 その他の条 件、 疾病の重篤度等に応じて適宜決定される。 製剤形態 と しては注射剤、 点滴剤、 点鼻剤及び吸入剤等の非経口 投与形態を好適に挙げる こ とができ、 特に注射剤や点滴 剤と して調製される場合は、 必要に応じてブ ドウ糖ゃァ ミ ノ酸等の通常の補液と混合して静脈内投与されるか、 また筋肉内投与、 皮内投与、 皮下投与も し く は腹腔内投 与される。

本発明のィ ン フ ノレエ ンザゥ イ ノレス · へマグルチニ ン結 合阻害剤乃至は薬学的組成物の 1 日 当 りの投与量は、 被 験者の症状、 体重、 年齢、 性別等によ って異な り一概に 決定できないが、 H A結合性ペプチ ドの量に換算して通 常成人 1 日 当 り約 0 . 0 0 1 〜 1 0 0 m g程度の範囲か ら選ぶこ とができ る。 当該製剤は 1 日 1 回投与に限らず 数回に分けて投与する こ とができる。 発明を実施するための最良の形態 以下、 本発明の説明のために実施例を記載するが、 当 該実施例はなんら本発明の技術的範囲を制限する も ので はない。 当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発 明に修飾、 変更を加え る こ とができ、 それ ら はいずれも 本発明の技術的範囲に含まれる 。 参考例 1 フ ァ ー ジディ スプレイ ラ イ ブラ リ 一の調製 西、 佐谷 らの報告 ( Nishi T. , Saya H. , et al. , FEB S Lett, 319, 237-240 ( 1996 )) に従っ てフ ァ ー ジデイ ス プレイ ライ ブラ リ ーを作成 した （ 2.5 X 10⁸ク ロ ー ン） 。 該フ ァ ージディ スプレイ ラ イ ブラ リ 一 は、 具体的には N N K ( Nはアデニ ン （ A ) 、 シ ト シ ン （ C ) 、 グァニ ン ( G ) 、 チ ミ ン （ T ) のいずれかの核酸塩基を示 し、 K はグァニ ン （ G ) 又はチ ミ ン （ T ) を示す。 ） が 15回繰 り 返された配列を含む D N Aが遺伝子工学的に挿入され た繊維状フ ァ ー ジ f dであ っ て、 更に外殻タ ンパク 質 p III遺伝子の N末端部分に 15残基のラ ンダムなア ミ ノ 酸配 列か らな るぺプチ ドをコ 一 ドする D N Aが挿入さ れて フ ァ 一 ジ外殻表面にラ ンダムな 15残基のァ ミ ノ 酸配列を有 するぺプチ ドが発現でき る よ う に構築さ れている 。

上記のフ ァ ー ジディ スプレイ ラ イ ブラ リ 一は、 ス コ ッ 卜 ら（Scott, J. K. and Smith, G. P. , Science, 249, 386 - 390 (1990))によ り 報告さ れてい る特徴を有 している。 参考例 2 ィ ンフノレエ ンザゥイ ノレス · へマグルチニ ンの 固定化

イ ンフノレエ ンザゥ イ ノレス · へマグルチニ ンをバイ オノ、。 ニ ングのタ ーゲ ッ ト と して用いる ために、 次の よ う に し て固定化 した。

なお、 固定化するへマグルチニ ン （ H A ) と して、 A 型の H 1 亜型であ る A/PR/8/34(HlNl) (以下、 単に H I 若 し く は H 1 N 1 と も称する。 ） のエーテル抽出物、 及 び A型の H 3 亜型であ る A/武漢 /359/95CH3N2) (以下、 単に H 3若 し く は H 3 N 2 と も称する 。 ） のエーテル抽 出物を用いた。

まず、 96穴カルボプレー ト （SUMIL0N社製） の各ゥエル に、 E D C ( l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbo diimide) および N — ヒ ド ロキシス ク シイ ミ ドの等量混合 液 60 1を添加 して、 プレー ト に結合 したカルボキシル基 を活性化させた。 10分後に該プレー ト のゥエルを 50m M T B S緩衝液 （pH7.6) で 6 回洗浄 し、 H 1 N 1 の溶液 (70 1/ml) ま たは H 3 N 2 溶液 （70;i l/ml) を ΙΟΟμ Ι 添加 した。 2 時間放置 した後、 50 m M T B S緩衝液 (pH7.6) で 6 回洗浄 し、 I m Mエタ ノ ールァ ミ ン水溶液 を 100// 1添加 した。 10分放置 した後、 再度 50m M T B S 緩衝液 （ pH7.6) で 6 回洗浄 し、 プレー ト にイ ン フ ルェ ン ザ H Aを固定化 した （図 1 参照） 。

実施例 1 イ ンフルエ ンザ H A ( H I ) 結合性ペプチ ド の選別及びその同定

( 1 ) H A結合性ペプチ ドディ スプ レイ フ ァ ー ジの選別 ( i ) ノ ィ ォバニ ング一第 1 回 目 一

H A固定化プレー ト と して参考例 2 で調製 した H A (H1N1) 固定化プレー ト を使用 し、 該プレー ト に参考例 1 で調製 したフ ァ ー ジディ スプレイ ラ イ ブラ リ ー溶液 (6.2x l0^{1 D} T U、 T B S緩衝液中） を 100^ 1 イ ン ジ ェ ク 卜 し、 室温で 4 時間放置 した。 その後、 200 1の溶出 用緩衝液 （50mM Tris-HCl、 150mM NaCl) を用いて、 よ く ピベ ッ テ ィ ングしながら 5 回洗浄 し、 結合 していない非 特異フ ァ ー ジを除去 した。 次いで、 各ゥエルに 10m Mの シァノレ酸誘導体 7- F- Neu5Ac2en溶液ま たは 10m Mのガング リ オ シ ド G M 3 溶液を 100 1添加 し、 室温で 1 時間放置 した。

なお、 シアル酸誘導体 7- F- Neu5Ac2enは、 へマグルチ二 ン、 特に H I N 1 への シアル酸含有糖鎖の結合を阻害す る能力を有する H A阻害剤であ り 、 ま たガング リ オ シ ド G M 3 は、 へマグルチニ ンの受容体結合ポケ ッ 卜 に対 し て特異的結合性を有する特異的な H A受容体物質であ る こ とが、 本発明者 ら によ っ て確認さ れている （T. Saito, et al. , Chem. Lett. , 145 ( 1999 ) ) ₀ こ のため、 フ ァ ー ジを結合させたプレー ト のゥエルに、 上記のよ う に H A阻害剤ま たは H A受容体物質を添加する こ と によ り 、 ィ ンフルェ ンザウィ ルスのへマグルチニ ン受容体結合ポ ケ ッ ト に特異的に結合 している フ ァ ー ジを溶出する こ と ができ る。

か く して、 H A結合性フ ァ ー ジを溶出 し、 該フ ァ ー ジ を含む溶液を回収 した。

得 られたフ ァ ー ジ溶液に調製済み大腸菌 K91 -Kan溶液 1 ΟΟ z lを加え、 15分間室温で感染させた。 15分後、 あ らか じめ 37°Cで保温 しておいた、 0.2 /ml テ ト ラサイ ク リ ン （ シグマ社製） （以下、 T C とい う ） を含む N Z Y培 地 20m lに こ の感染溶液を加えて、 37 °Cで 40分間振盪培養 した。

40分後、 T Cのス ト ッ ク溶液 （20mg/ml) 20 1をカロえ (終濃度 20 z g/ml) 、 37°Cで一晚振盪培養 した。 得 られ た培養液を 3， OOOrpmで 10分間遠心 して大腸菌を除去 した。 上清を再度 12， OOOrpmで 10分間遠心 して更に大腸菌を除去 した。 上清に P E G / N a C 1 溶液 3 m l ( 0.15 v/v) を 加え、 100回穏やかに攪拌 した後、 4 °Cで 4 時間以上静置 した。 12， OOOrpmで 10分間遠心 して上清を除去 し、 沈殿 し たフ ァ ー ジペ レ ッ ト に l m l T B S を加えて完全に溶解 した。 得 られたフ ァ ー ジ溶液を 1 · 5ml容 エ ツ ペ ン ドルフ チュ ーブ （ E p チュ ーブ） に移 し、 15， OOOrpmで 10分間遠 心 して不溶物を除去 した。 こ の中に再び P E G Z N a C 1 溶液を 150 1加え、 数回穏やかに攪拌 した後、 4 °Cで 1 時間以上静置 した。 15， OOOrpmで 10分間遠心 してペ レ ツ ト を回収 し、 0.02% N a N ₃/ T B S ( 200 1) に溶解 した。 15， OOOrpmで 10分間遠心 して、 不溶物を除去 し、 上 清のフ ァ ー ジ溶液 （200// 1) を 0.6m 1 容 Epチュ ーブに移 した。 こ う して得 られたフ ァ ー ジ溶液の半分を 2 回以降 のバニ ングに、 ま た 2 1 を titeringに使用 し、 残 り を 保存 した。

(ii) バイ ォバニ ング一第 2 回 目 一

参考例 2 で作成 した H A ( H1N1) 固定化プレー ト に、 増幅 したフ ァ ー ジディ スプ レイ ラ イ ブラ リ ー溶液を 100 1 イ ン ジ ェ ク ト し、 室温で 4 時間放置 した。 その後 200 1の溶出用緩衝液 ( 50m Tris - HC1ヽ 150mM NaCl) を用い て、 よ く ピベ ッ テ ィ ング しなが ら 10回洗浄 し、 結合 して いない非特異フ ァ ー ジを除去 した。 次いで、 各ゥエルに 10m Mシァル酸誘導体 7- F- Neu5Ac2en溶液ま たは 10 m M G M 3 溶液を 100〃 1添加 し、 室温で 1 時間放置 し、 イ ン フルェ ンザ H Aの結合ポケ ッ ト に特異的に結合 している フ ァ ー ジを溶出 し、 その溶液を回収 した。

(iii) バイ オバニ ング—第 3 回 目 一

H A ( H1N1) 固定化プ レー ト に、 増幅 したフ ァ ー ジデ イ スプレイ ラ イ ブラ リ ー溶液を 100 1 イ ン ジ ェ ク ト し、 室温で 1 時間放置 した。 その後 200 1の溶出用緩衝液

( 50mM Tris - HC1、 300raM NaCl) を用いて、 よ く ピぺ ッ テ イ ングしなが ら 10回洗浄 し、 結合 していない非特異フ ァ ー ジを除去 した。 次いで、 各ゥエルに 10m M シアル酸誘 導体 7- F- Neu5Ac2en溶液ま たは 10m M G M 3溶液を 100^ 1添加 し、 室温で 1 時間放置 し、 イ ン フルエ ンザ H Aの結 合ポケ ッ ト に特異的に結合 している フ ァ ー ジを溶出 し、 その溶液を回収 した。

(iv) バイ オバニング一第 4 回 目 一

H A ( H1N1) 固定化プ レー ト に、 増幅 したフ ァ ー ジデ イ スプレイ ラ イ ブラ リ ー溶液を 100 1イ ン ジ ェ ク ト し、 室温で 1 時間放置 した。 その後 200 1の溶出用緩衝液 ( 50mM Tris-HCK 300mM NaCl) を用いて、 よ く ピぺ ッ テ イ ング しなが ら 10回洗浄 し、 結合 していない非特異フ ァ ー ジを除去 した。 次いで、 各ゥエルに 10 Mシアル酸誘 導体 7- F_Neu5Ac2en溶液ま たは G M 3溶液を 100 1添加 し、 室温で 30分間放置 し、 イ ン フルエンザ H Aの結 合ポケ ッ ト に弱 く 結合 している フ ァ ー ジを溶出 した。 次 いで、 各ゥエルに 10m Mシァル酸誘導体 7- F_Neu5Ac2en溶 液ま たは 10 m M G M 3 溶液を 100 1添加 し、 室温で 1 時 間放置 し、 H Aの結合ポケ ッ ト に特異的に結合している フ ァ ー ジを溶出 し、 その溶液を回収 した。 (V) ノくィ ォバニ ング一第 5 〜 7 回 目 一

( iv) に記載の操作を繰 り 返 して、 第 5 回 目、 第 6 回 目及び第 7 回 目のバイ オバニ ングを行っ た。 上記バニ ング操作 （第 1 〜 7 回 目 ） によ っ て得 られた 結果 （ フ ァ ー ジの回収率） を、 溶出用物質 （7-F- Neu5Ac 2en、 G M 3 ) の種類別に表 1 及び 2 に示す。

【表 1 】

<H1-7F> 固定化ウィルス ： A/PR/8/34(HlNl)

溶出用物質 ： シアル酸誘導体 7- F-Neu5Ac2en

ハ。ニンク"回数 使用 7了-シ"量 回収ファ -シ"量 7ァ-シ '、回収率

(TU) (TU) (%)

1回目 6.2X10" 7.7X10⁷ .0.12

2回目 2.6X10¹² 1. lxlO⁷ 0.0044

3回目 2.6X10¹³ 2.9X10⁸ 0.0011

4回目 8.7X10¹³ 8.7X10⁸ 0.0010

5回目 1.7X10¹³ 2.5X10⁹ 0.015

6回目 5. lxlO¹¹ 2.8X10⁹ 0.55

7回目 1.5X10¹² 8.2 x10^s 0.055 【表 2 】

<H1-GM3> 固定化ウィルス： A/PR/8/34CH1N1)

溶出用物質 ：カ"ン Γリオシ GM3

いずれの場合 も、 1 回 目力、 ら 4 回 目 にかけてのパニ ン グは、 サイ ク ル毎にバニ ングの条件を厳 し く している た め高い回収率の増加は認め られなかっ たが、 同一条件で ノ、。ニ ングを繰 り 返 した 4 回 目か ら 6 回 目 にかけて、 フ ァ ー ジの増加がみ られた。 こ れによ り 、 イ ンフルエ ンザゥ ィ ルス · へマグルチニ ン （ H1N1) に特異的に結合するぺ プチ ドを発現 している フ ァ ー ジが回収されている こ とが 確認された。

( 2 ) H A結合性ペプチ ドのア ミ ノ 酸配列の決定 上記各バニ ングにおいて第 6 回 目 のバニ ング操作で得 られたフ ァ ー ジを用いて、 発現 しているペプチ ドのア ミ ノ 酸配列を決定 した。 具体的には、 固定化へマグルチ二 ン H 1 N 1 に結合 し 7- F- Neu5Ac2enで溶出されたフ ァ ー ジ (以下、 H 1 / 7 フ ァ ー ジ とい う ： 19ク ロー ン） 、 及び 固定化へマグルチニ ン H 1 N 1 に結合 しガング リ オ シ ド G M 3 で溶出 されたフ ァ ー ジ （以下、 H 1 Z 3 フ ァ ー ジ とい う ： 20ク ロー ン） の 2 種類の フ ァ ー ジについて、 発 現ぺプチ ドのア ミ ノ 酸配列をシー ク ェ ンスによ っ て決定 した。

まず、 6 回 目のバニ ングの後のタ イ タ ー測定で得 られ たプレー ト上の コ ロニーをそれぞれ 50コ ロニーずつ、 無 作為に拾い上げ、 新 しい N Z Yプレー ト に、 植菌 し直 し、 一晩 37°Cにて培養 し、 これをマスタ ープレー ト と して 4 °Cで保存した。 マスタ 一プレー ト の コ ロニーを各々 20ml の N Z .Y培地 （20 g/ml T C含有） の入っ た 50ml遠心チ ユ ーブに懸濁 し、 37°Cで一晚 200rpmで振盪培養 した。 つ いで 3， 000rpm、 10分間遠心分離を行っ た後、 上清をォー ク · リ ッ ジ遠心チュ ーブに移 し、 12， OOOrpmで 10分間遠心 分離 し、 大腸菌を除菌 した。 更に上清をオー ク · リ ッ ジ 遠心チュ ーブに移 し、 3 m 1のポ リ エチ レ ング リ コ ール ( P E G 6000 : ナカ ラ イ テス ク 社製） /NaClを加え、 よ く 撹拌 した後、 4 °Cに 4 時間静置 した。 12， OOOrpmで 10分 間遠心分離 し、 フ ァ ー ジを沈殿させた。 ついで上清を除 去 し、 沈殿 したフ ァ ー ジを 1 mlの T B S ( ト リ ス'緩衝塩 溶液） に懸濁させた。 1.5mlの Eqチユ ーブに移 し、 15， 00 Orpmで 10分間遠心分離 し、 不溶性物質を除去後、 上清を 別の Eqチュ ーブに移 し、 150 1のポ リ エチ レ ング リ コー ル Z NaClを加え、 よ く 撹拌 した後、 4 °Cで 1 時間静置 し た。 次いで 15, OOOrpmで 10分間遠心分離 し、 フ ァ ー ジを再 沈殿させた。 ついで上清を除去 し、 沈殿 した フ ァ ー ジを 1の T B Sで再度懸濁 した。 15, OOOrpmで 10分間遠心 分離 し、 不溶性物質を沈殿させた後、 該沈澱物を 0.5mlの Eqチユ ーブに移 し、 フ ァ ー ジ ク ロー ンを 4 °Cで保存 した。

上記で得 られたフ ァ ー ジク ロー ンか らの D N Aの抽出 は、 1.5m lの Eqチ ュ ーブにフ ァ 一ジ ク ロー ン 100 1に対 して T B S 100 1及び T E飽和フ ヱ ノ 一ノレ （ニ ッ ポ ジ一 ン社製） 200 z lを加えて、 10分間激 し く 撹拌後、 15, 000 rpmで 10分間遠心分離 した。 次いで、 上清 （水相） 200 / 1に対 して T E飽和フ エ ノ 一ル 200 l及びク 口 ロ ホノレム 2 00 1を加えて、 前記と同様 10分間激 し く 撹拌後、 15, 00 Orpmで 10分間遠心分離 した。 更に、 上清 （水相） 150 1 に対 して Τ Ε 250μ 1、 3 Μ酢酸ナ ト リ ウ ム 40 1、 20mg/ ml グ リ コーゲ ン （ベ一 リ ンガー ' マイ ン ノヽィ ム社製） 1 1及びエタ ) ール 1 m 1を加えて、 1.5 m 1の Eqチュ ーブ にて— 20°Cで、 一時間放置 した後、 15， OOOrpmで 10分間遠 心分離 した。 上清を取 り 除き 、 1 mlの 80%エタ ノ ール ( - 20°C ) を緩やかに加えて、 15， OOOrpmで 10分間遠心分 離し残存する塩を除いた。 上清を除去後、 チュ ーブ内の 水分を蒸発させ、 沈殿 している D N Aを 10 1 の滅菌蒸 留水に溶解 し、 4 °Cにて保存 した。 か く して得 られた個 々 の フ ァ 一 ジ D N Aをぺプチ ドの配列決定のために使用 し " o

フ ァ ー ジ D N Aによ り コ ー ドされる ペプチ ドの配列決 定は、 ジデォキシ法 ( Proc. Natl. Acad. Sci. , USA.， 74， 5463-5467( 1977 )) によ り 、 アマ シ ャ ム社の THERMO配列 キ ッ 卜 （Amersham Life Sciene, Code； US79765, Lot番 号； 201503) を用いて機器の使用説明書に従い実施 した。 D N Aの伸長反応は、 96°C、 30秒、 45°C、 15秒、 60°C、 4分を 1 サイ クルと して これを 30サイ ク ル行い、 D N A の配列決定は、 A B I 社製の D N A シーケ ンサー （ABI PRISMTM377) を用いて行っ た。

こ のよ う に して 2 種類の フ ァ ー ジ （ H 1 / 7 フ ァ ー ジ、 及び H 1 Z 3 フ ァ ー ジ） の各ク ロー ンか ら決定された、 へマグルチニ ンの受容体結合ポケ ッ ト に結合性を有する ぺプチ ドのァ ミ ノ 酸配列を 1 文字表記と して表 3 に示す _c なお、 下記表記載の各ア ミ ノ 酸配列を後記配列表に、 配 列番号 1 (No.1及び 5) 、 2 (No.2) 、 3 (No.3) 、 4

(No.4) 、 5 (No.6) 及び 6 (No.7) と してそれぞれ記 載する。

【表 3 】

なお、 各フ ァ ー ジにおいて表に記載 しなかっ た残 り の ク ロー ンは、 いずれ も ラ ンダムに配列が欠損 してい るか も し く は配列解読が不能な ものであ っ た。

表からわかる よ う に、 フ ァ ー ジ H 1 7並びにフ ァ ー ジ H 1 / 3 はいずれも、 複数のク ロ ー ン間で共通のア ミ ノ 酸配列が見 られた。 さ ら に、 各フ ァ ー ジ間で比べる と フ ァ ー ジ H 1 ノ 7 と フ ァ ー ジ H 1 / 3 間で共通の配列 (No. 1 と No. 5 ) が見 られた。

なお、 H A受容体物質であ る ガング リ オシ ド G M 3 は へマグルチニ ン H 1 に対 して高い親和性を有 し、 ま た H A阻害剤であ る 7F-Neu5Ac2enはへマグルチニ ン H 1 に対 して高い阻害能を有する こ とが知 られている。 実施例 2 H A結合性べプチ ドのィ ン フ ルェ ンザ · へマ グルチニ ンへの結合性

実施例 1 で得 られたフ ァ ー ジをク ロ ーニ ン グ し、 得 ら れた発現ペプチ ドについて、 へマグルチニ ンに対する結 合性 E L I S Aを用いて評価 した。

具体的には、 まずへマグルチニ ン （H1N1) を 96穴カル ボプレー ト （ SUMIL0N社製） に、 参考例 2 に記載する方法 に従っ て固定化 した。 固定化後、 プレー ト の各ゥエルに 1 % B S A ( Alubumine Bovine, Fatty Acid Free： Sig ma製） を含有する T B S を 100 1添加 し、 室温で 1 時間 放置 した。 こ こ に増幅さ せたフ ァ ー ジの溶液 （ H 1 Z 7 フ ァ ー ジ ： グロ ー ン No. 1 〜 4 、 H 1 / 3 フ ァ ー ジ ： ク ロ ー ン No. 5 〜 7 ) を 50 1添加 し、 室温で 1 時間放置 した。 各ゥエルを T B S T ( T B S / 5 % Tween20) で 5 回洗浄 後、 T B S / 5 % B S Aを 150 1添加 し、 室温で 1 晚放 置 した。

次 ヽで、 各ウ エノレに抗 id Bacteriophage抗体/ T B S 溶液 （ 1 / 1000希釈） を 150 z l添加 し、 室温で 1 晚放置 し た後、 T B S Tで 5 回洗浄 した。 次いで、 各ゥエルに、 抗 - Rabbit IgG Peroxidase Conjugate抗体/ T B S溶液 ( 1/ 1000希釈） を ΙΟΟμ Ι添加 し、 室温で 1 晚放置 した後、 T B S Tで 5 回洗浄 した。

各ウ エノレにヽ 基質溶液 ( 0.4mg/ml o-pheny lendiamine substrate in citrate-phosphate buffer ( pH 5.0)) ¾： IOO I添加 し、 10分間反応させた後、 3 N H ₂ S 0 ₄を 10 0 1ずつ加えて反応を停止さ せ、 マイ ク ロプ レー ト · リ ーダ一で 492nmの吸収を測定 した。

へマグルチニ ン （ H1N1) をタ ーゲ ッ ト と してバニ ング された H I フ ァ ー ジ （ H I ノ 7 フ ァ ー ジ及び H 1 / 3 フ ァ 一 ジ） について、 へマグルチニ ン H 1 に対する結合性 を調べた結果を図 2 に示す。

図 2 か らわかる よ う に、 H 1 Z 7 フ ァ ー ジのク ロ ー ン No.1 (図 2 において〇で表示、 以下 「H1- 1」 と称す る。 ） 及び H 1 Z 3 フ ァ ー ジの ク ロ ー ン No.6 (図 2 にお いて八で表示、 以下 「Η1-2」 と称する 。 ） が、 へマグル チニ ン H 1 に対 して高い結合性を示 した。

これは、 本発明においてへマグルチニ ンの認識部位 (受容体結合ポケ ッ ト ） に対 して特異的に結合するぺプ チ ドを発現する フ ァ ー ジが選択さ れた こ とを示す。 実施例 3 2 種の亜型を認識する H A結合性べプチ ドの 選択

実施例 1 に従っ て、 イ ンフルエ ンザウイ ルス · へマグ ルチニ ン H I (H1N1、 A/PR/8/34) 及び H 3 (H3N2、 A/武 漢 /359/95) の 2種類をタ ーゲ ッ ト と して、 バイオパニン グを行っ た。 具体的には、 H A固定化プレー ト と して参 考例 2 に従っ て調製 した H 1 固定化プ レー ト及び H 3 固 定化プレー ト を用いて、 ま た溶出用物質と して H A受容 体物質であ る シァ リ ル LewisX及び α ( 2→ 6 ) G M 3 を 用いて、 実施例 1 と同様に してバイ オバニ ングを行い、 Η Α結合性ペプチ ドを発現する フ ァ ー ジを選択 した。 か かるバイ オバニ ング選択によ っ て得 られた代表的な フ ァ 一ジの ク ロ ー ンについて、 その発現べプチ ドのァ ミ ノ 酸 配列をシー ク ェ ンス した結果を表 4 に示す。

【表 4 】 フアーシ、、クローン 発現べプチドのァミノ酸配列 対応する

配列番号

「Α- 1」 ARL S PTMVHPNGAQP 7

「Β - 1」 GRVPVFGLSPLFKVE 8

「Β- 2」 GRPPD SVFRSRGWL S 9

「C- 1」 I D I AF S S L AL AD I SR 10

「C- 2」 EPYGF I AFSRAAHSP 11 ク ロ ー ン 「 A — 1 」 は、 下記の表 5 に示す全てのパ ング系で選択された フ ァ ー ジ ク ロー ンに認め られた。 【表 5 】

ク ロー ン 「 Β — 1 」 は、 バニ ング系 「 Η 1 G Μ」 で 選択された 9 ク ロー ンの う ち 2 ク ロー ンに認め られた。

ク ロ ー ン 「 Β — 2 」 は、 バニ ング系 「 Η 3 Ζ X」 で選 択された 1 0 ク ロ ー ンの う ち 1 ク ロ ー ンに認め られた。

ク ロー ン 「 C — 1 」 は、 バニ ング系 「 Η 1 Z G Μ」 で 選択された 9 ク ロ ー ンの う ち 1 ク ロー ン、 及びバニ ング 系 「 H 3 Z G M」 で選択された 1 0 ク ロー ンの う ち 1 ク ロ ー ンに認め られた。

ク ロ ー ン 「 C — 2 」 は、 バニ ング系 「 H 1 / G M」 で 選択された 9 ク ロ ー ンの う ち 1 ク ロー ン、 及びバニ ング 系 「 H 3 / X」 で選択された 1 0 ク ロ ー ンの う ち 4 ク ロ 一ンに認め られた。

上記で示すよ う に、 ク ロー ン 「 A — 1 」 は、 夕 一ゲ ッ ト及び溶出用物質を種々 異に した全てのバニ ング系か ら 選択された。 溶出用物質を異に したバニ ングでこの よ う に同一の配列を有するぺプチ ドを発現する ク ロー ンが得 られた こ とか ら、 当該ク ロ ー ン 「 A — 1 」 の発現べプチ ドは、 H A受容体物質であ る シァ リ ル LewisX及び α ( 2 → 6 ) G M 3 が有するへマグルチニ ンに対する結合サイ ト （ N e u A c が関与 してい るサイ ト ） と同一の結合サ イ ト を有 し、 これ らの受容体物質と 同 じ結合様式を も つ たぺプチ ドであ る と考え られる。

ま た、 ク ロ ー ン 「 B — 1 」 及び 「 B — 2 」 の発現ぺプ チ ドは共通のモチーフ と して G R x P ( X は、 V又は P を意味する ） を有 してお り 、 ま たク ロ ー ン 「 C — 1 」 及 び 「 C 一 2 」 の発現ペプチ ドは共通のモチーフ と して I A F S X y A ( x は S又は Rを、 ま た y は L又は Aをそ れぞれ意味する ） を有 していた。 実施例 4 H A結合性べプチ ドのィ ン フルェ ンザ · へマ グルチニ ンへの結合性

実施例 1 及び実施例 3 で得 られたフ ァ ー ジク ロー ン 「 H 1 — 1 」 、 「 H 1 — 2 」 、 「 A— 1 」 、 「 B — 1 」 . 「 B — 2 」 、 「 C — 1 」 及び 「 C — 2 」 について、 へマ グルチニ ン （ H 1 、 H 3 ) に対する結合性を、 実施例 2 に準 じて E L I S Aを用いて評価 した。

具体的には、 へマグルチニ ン H 1 ( H1N1) 及び H 3 ( H3N2) 、 並びに レ ク チ ンの 1 種であ る小麦胚ァグルチ ニ ン ( WGA： Wheat Germ Agglutinin) をそれぞれ 96穴力 ルポプ レー ト （SUMIL0N社製） に固定 し、 これ らに各フ ァ — ジ ク ロ ー ン溶液 S x lO virions/mlを添加する こ と によ つ て、 E L I S Aを行っ た。

結果を図 3 に示す。 図 3 力、 らわかる よ う に、 実施例 1 で得 られたク ロー ン 「 H 1 — 1 」 及び 「 H 1 — 2 」 はへ マグルチニ ン H 3 に殆ど結合せず、 へマグルチニ ン H 1 に対 して特異的な結合性を示すのに対 して、 実施例 3 で 得 られた ク ロ ー ン 「 A— 1 」 、 「 B — 1 」 、 「 B — 2 」 、 「 C — 1 」 及び 「 C — 2 」 はいずれ もへマグルチニ ン H 1 及び H 3 の両方に共通 して結合する とい う 結果が得 ら れ o

へマグルチニ ン H 1 と H 3 はア ミ ノ 酸配列において 7 5 %相違する こ とが知 られている。 こ の こ とか ら、 ク ロ ー ン 「 A - 1 」 、 「 B - 1 」 、 「 B — 2.」 、 「 C 一 1 」 及び 「 C 一 2 」 の各発現ペプチ ドは、 へマグルチニ ン H 1 と H 3 の両者間で相同性の高い部位を認識 して、 そ こ に特異的に結合する もの と考え られる 。 実施例 5 HA結合性べプチ ドの抗 GM3抗体への結合性

実施例 1 及び実施例 3 で得 られた フ ァ ー ジク ロー ン 「 H 1 — 1 」 、 「 H 1 — 2 」 、 「 A— 1 」 、 「 B - 1 」 、 「 B — 2 」 、 「 C — 1 」 及び 「 C 一 2 」 について、 抗 G M 3抗体に対する結合性を実施例 4 に準 じて E L I S A を用いて評価 した。 具体的には、 E L I S Aは、 抗 G M 3抗体 （M2590、 日本バイ オテス ト研究所） を 96穴カルボ プレー ト （SUMIL0N社製） に固定 し、 これ ら に各フ ァ ー ジ ク 口一ン溶液 5x lO virions/mlを添加する こ とによ つ て 行つ た。

結果を図 4 に示す。 図 4 ( a ) 及び （ b ) か らわかる よ う に、 実施例 1 で得 られた ク ロー ン 「 H 1 — 1 」 及び 「 H 1 — 2」 は抗 G M 3 抗体に殆ど結合 しないのに対 し て、 実施例 3 で得 られた ク ロ ー ン 「 A — 1 」 、 「 B — 1 」 、 「 B — 2 」 、 「 C — 1 」 及び 「 C 一 2 」 はいずれ も抗 G M 3抗体に対 して特異的に結合する こ とが認め ら れ 7こ

こ の こ とか ら、 ク ロ ー ン 「 A — 1 」 、 「 B — 1 」 、

「 B — 2 」 、 「 C — 1 」 及び 「 C — 2 」 の各発現べプチ ドは、 G M 3 の シアル酸を含む構造を模倣する配列を有 する こ とが示唆された。 実施例 6 フ ァ ー ジ ク ロ ー ンによ る 、 ガング リ オ シ ド G M 3 に対する へマグルチニ ンの結合阻害

実施例 1 及び実施例 3 で得 られたフ ァ ー ジ ク ロ ー ン

( 「 H 1 — 1 」 、 「 H 1 — 2 」 、 「 A — 1 」 、 「 B — 1 」 、 「 B — 2 」 、 「 C 一 1 」 、 「 C — 2 」 ） によ っ て、 ガング リ オ シ ド G M 3 に対するへマグルチニ ンの結合が 阻害されるかどう かを常法に従っ て実験する こ と によ つ て調べた （ 「ガング リ オ シ ド研究法 I 」 鈴木康夫 · 安藤 進、 編著、 学会出版セ ンタ ー、 1995年） 。 なお、 へマグ ルチニ ン と して H I ( H1N1) 及び H 3 ( H3N2) を用いた。

具体的には、 96穴マイ ク ロ タ イ タ ープレー ト上に 10 ; 1 の G M 3溶液 （ 8.5 g/ml メ タ ノ ール溶液） を加えた 後、 50 1の 0.08% ポ リ イ ソ プチノレメ タ ク リ レー ト溶液 を加えた。 溶媒を ドラ イ ヤーで蒸散させ、 50 1の 1 % B S A Z T B S を添加 して 4 °Cでー晚放置 した。 T B Sで プレー ト を 3 回洗浄 した後、 所定濃度の フ ァ ー ジ ク ロ 一 ン （表 6参照） とへマグルチニ ン （系内のへマグルチ二 ン濃度が 30 n Mとな る濃度） 溶液 50 ^ 1を添加 して、 20°C で 2 時間放置 した。 T B S でプレー ト を 5 回洗浄 した後、 プレー ト に結合 しているへマグルチニ ン量を抗体で検出 してその減少量よ り 阻害活性を求めた。 結果 （ I C 5 0 値） を表 6 に示す。 なお、 表中の "nd" は not detect ed" を意味する。

【表 6 】

表 6 か らゎカヽる よ う に、 フ ァ 一 ジ ク ロー ン 「 A— 1 」 「 C — 1 」 及び 「 B — 2 」 について、 その発現ペプチ ド がへマグルチニ ン H 1 及び H 3 の両方の結合を阻害する こ とを示す結果が得 られた。 こ の結果はこれ ら フ ァ ー ジ ク ロー ンが有するへマグルチニ ンに対する結合特異性と 相関 していた。 実施例 7 脂質によ る フ ァ 一 ジのへマ グルチニ ンに対す る結合阻害 実施例 3 で得 られたフ ァ ー ジ ク ロ ー ン （ 「 A— 1 」 、 「 B — 1 」 、 「 B — 2 」 、 「 C — 1 」 、 「 C - 2 」 ） に ついて、 該フ ァ 一 ジ ク ロ ー ンがへマ グルチニ ン （ H A ) の宿主受容体認識部位を.実際に認識 している こ とを確認 する ために、 実施例 6 に準 じて E L I S Aを用いて、 H A受容体物質であ る G M 3 によ つ て固定化 H Aに対する 上記フ ァ ー ジ ク ロー ンの結合が阻害さ れるかどう かを調 ベた。 なお、 へマグルチニ ン と して H 1 N 1 及び H 3 N 2 をそれぞれ用いた。 ま た比較実験と して G M 3 に代え て G M 1 及び GlcCerを用いて同様に実験を行っ た。

G M 3 によ る 阻害実験の結果を図 5 に、 G M 1 によ る 阻害実験の結果を図 6 に示す。 なお、 各図と も、 a)はへ マグルチニ ン と して H 1 N 1 を、 b)は H 3 N 2 を用いた 結果を示す。

図 5 か らわかる よ う に、 試験 したいずれのフ ァ ー ジ ク ロー ン も、 へマグルチニ ンに対する特異的な リ ガン ド ( H A受容体物質） であ る G M 3 を添加 した時にその結 合が阻害される とい う 挙動が観察さ れた。 これに対 して へマグルチニ ンに特異結合性を も たない G M 1 (図 6 ) 及び GlcCer (結果省略） を添加 して も、 フ ァ ー ジ ク ロ ー ンのへマグルチニ ンへの結合は阻害さ れなかっ た。

これ らの こ とから、 上記フ ァ ー ジ ク ロー ンの発現ぺプ チ ドは、 ィ ン フルェ ンザウィ ルス · へマグルチニ ンの受 容体認識部位に対 して特異的に相互作用する こ と によ つ て、 イ ン フルエ ンザウイ ルスの宿主受容体への結合 （感 染） を特異的に阻害する よ う に働 く こ とが示唆された。 実施例 8 フ ァ ー ジ上に発現 してい る べプチ ドの合成

実施例 1 及び 3 でそれぞれ得 られた フ ァ ー ジ ク ロ ー ン 上に発現 しているべプチ ドを下記のよ う に して合成 した。

なお、 ペプチ ドの合成は、 全自動ペプチ ド合成機 （ AC T357、 ア ドバンス ト ケムテ ッ ク 社製） を使用 し、 同社の プロ グラ ムに従い、 Fmoc/NMP， HOBt法 〔 Fmoc ： 9 - フノレ ォ レニルメ ト キ シ カノレポニル、 NMP ： N — メ チノレ ピ ロ リ ド ン、 HOBt ： 1 — ヒ ド ロ キ シペ ン ゾ ト リ ア ゾ一ノレ〕 に よ る 固相合成によ り 実施 した。

具体的には、 合成を所望するべプチ ドのア ミ ノ 酸配列 に従っ て、 C 末端ア ミ ノ 酸に相当する Fmoc - ア ミ ノ 酸一 Alko樹脂 0.25mmolに、 C末端よ り 2 番 目以降の各ァ ミ ノ 酸に相当する Fmoc - 了 ミ ノ 酸を順次、 合成プロ グラ ムに 従い伸長反応させた。 尚、 C末端ア ミ ドのペプチ ドは、 Fmoc - NH-FAI 封脂 0.25mmolに C 末端ア ミ ノ 酸に相当する Fmoc - 了 ミ ノ 酸を含成プロ グラ ムに従い縮合反応させ、 その後、 C 末端よ り 2 番目以降の各ァ ミ ノ 酸に相当する Fmoc - 了 ミ ノ 酸を順次縮合反応させて鎖伸長を行った。 各反応終了後、 プロ グラ ムに従っ て、 N末端 Fmoc基の 脱保護反応を行っ た。 か く して得 られた各ペプチ ド樹脂 をポ リ プロ ピ レ ン製の ミ ニカ ラ ム （ア シス ト社製） に回 収 し、 メ タ ノ ール洗浄後、 真空で乾燥 し、 以下の操作に 付 してぺプチ ドを樹脂か ら切 り 出 し、 側鎖の脱保護反応 を行っ た。 即ち、 各樹脂に リ ー ジ ヱ ン ト K ( Reagent K， 82.5% TFA， 5 %フ エ ノ ール， 5 % H₂0, 5 %チオアニソ 一ノレ （Thioanisole) ， 2.5%エタ ン ジチォーノレ） 2 m l を加え、 ミ ニカ ラ ム中で 60分間反応させた。 次いで、 反 応液を冷ジェチルエーテル 8 m 1 中に滴下 して反応を停 止させ、 同時にペプチ ドを沈殿させた。 更に、 ミ ニカ ラ ムを T F A 2 m l にて洗浄 し、 冷ジェチルエーテル 5 m 1 を追加 し、 遠心 し、 沈殿をジェチルエーテル 10 m 1 で 4 回洗浄後、 約 5 m l の 50%ァセ トニ ト リ ルでペプチ ド を可溶化 し、 凍結乾燥 した。 更に可溶化と凍結乾燥操作 を 2 回繰 り 返 して、 所望の粗凍結乾燥品を得た。

これをォク タ デシルカ ラ ム （直径 20 X 250 m m， W C社 製） を用いた逆相高速液体ク ロマ ト グラ フ ィ ー （HPLC) によ り 分画 し、 所望のペプチ ドを単離 した。 尚、 上記に おいて用いた樹脂およびア ミ ノ 酸誘導体は、 いずれ も渡 辺化学工業社製の も のであ る。 か く して単離された各ペプチ ドの同定を、 ア ミ ノ 酸配 列分析およびマススぺク ト ロ メ ト リ 一 によ る分子量測定 によ り 行っ た。

尚、 システィ ン残基を有する合成ペプチ ドは所望によ り 環化する こ とができ る 。 具体的には、 ク ロー ン 「 H 1 - 1 」 の発現べプチ ドを例示する と、 当該べプチ ドは次 のよ う に して環化された。

まず、 ペプチ ド 5.0m g ( 3.2 1 ) を 200m M Tris-H CI緩衝液 （pH8.5) ノ T F E (4/1) 5 m 1 に溶解 した （0. 64m M ) 。 反応系を水酸化ナ ト リ ウ ム水溶液を用いて pH 8.5に調整 した後、 酸素雰囲気下、 室温で激 し く 撹拌 し、 S H基を酸化 して分子内 ジスルフ ィ ド結合を形成させた _c 反応は H P L C によ り 追跡 し、 約 30時間後、 10%水酸化 ナ ト リ ゥム水溶液を加えて p Hを 7 以上と して反応を停 止させた。 生成物は シ ングル ピー ク と して検出 さ れる。 反応溶液を電気透析装置 （マイ ク ロ ア シラ イザ一 G 1 ， 旭化成工業 （株） 製） を用いて脱塩処理を行っ た後、 凍 結乾燥 し、 環状ペプチ ドの白色粉末を得た （収量 ： 401m g ( 2.6 mol) 、 収率 ： 82% ) 。 実施例 9 リ ポベプチ ド及びこれを用 いたぺプチ ド修飾 リ ポ ソ ーム ぺプチ ドの N末端にステア リ ン酸を結合する こ と によ つ て、 本発明の H A結合性ペプチ ドを リ ボソーム上に導 入する こ とができ る。 一例 と して、 実施例 3 で得 られた ク ロ ー ン 「 A— 1 」 の発現ペプチ ドについて説明する。

まず、 上記実施例 8 に従っ て、 ク ロ ー ン 「 A— 1 」 の 発現ペプチ ド配列 （配列番号 7 ) を順次伸長反応させた。 次いでこ のペプチ ドの N末端に、 同合成プロ グラ ムに従 つ て、 ステア リ ン酸を伸長さ せた後、 樹脂か ら切 り 出 し、 脱保護反応を行っ た。 以下、 実施例 8 に従っ て所望のス テア リ ン酸化ペプチ ド （ 「 C i ₈ A- 1リ ポペプチ ド」 ） を得 o

こ の リ ポペプチ ド （ M w ： 1840.73) 、 卵黄レ シチ ン ( M w ： 773、 日本油脂 NC- 10S) 及びコ レステロール （ M w ： 386.66、 Nakarai Chemicals, lot M8A9926 ) をヽ 0. 75 ： 2 ： 1 ( 20% リ ポペプチ ド） 、 0.3 : 2 ： 1 ( 10% リ ポペプチ ド） 又は 0.16： 2 ： 1 ( 5 % リ ポペプチ ド） の モノレ比にて、 30m l ナス型フ ラ ス コ 中に、 ク ロ ロ ホノレム /メ タ ノ ール （ 3 Z 1 ) ¾液 2 m l に溶解した。 溶媒を ロ ータ リ 一エバポ レータ ーで減圧条件下に除去 してー晚 真空乾燥 した。 これにダルべ ッ コ （ Dulbecco) の リ ン酸 緩衝塩溶液 （Ca，Mg不含） （pH7.4) を 5 ml加え、 バス型 ソニケ一夕 一で 30分処理 して リ ボ ソ ー ム （ small unilam ellar liposome) を得た。 べシク ルを形成 していない脂 質は、 遠心型限外濾過 （ l， 500 x g、 15分 ： 分画分子量 30， 000ヽ Amicon centriprep-50 ) にて除去 した ₀

か く して得 られた リ ボ ソ ームについて、 内部に存在す るぺプチ ド含量を市販キ ッ ト （ Bio - Rad Protein Assay Kit) によ り 測定 し、 上記で調製 した リ ポペプチ ドが リ ポ ソームに組み込まれてい る こ とを確認 した。 実施例 10 ペプチ ド修飾 リ ボ ソ ーム

D D P E ( dipalmi toy 1 L- a -phosphatidylethanol a mine：シグマ社） 6.7mg、 N H S — P E G — M a i ( poly (ethylene glycol - a -N- β -maleimide hydroxysuccinim idyl propionate ： 曰 、油 リ ボ ソーム社） 45mgヽ 卜 リ エチノレ ァ ミ ン 980 1をク ロ 口 ホルム 10mlに溶解 し、 室温で撹拌 した、 反応を T L C で追跡 し、 ニ ン ヒ ド リ ン反応が陰性 であ る こ とを確認 した後、 溶媒を留去 した。 得られた白 色粘稠体に蒸留水 2 mlを加え、 バス型超音波で処理 し、 ミ セルを形成 した。 こ の溶液を 2 倍体積のセ ロ フ ア ンチ ユ ーブ （分画分子量 12, 000、 サイ ズ ： 20/30、 三光純薬 製） に入れ、 透析膜の外の蒸留水 1 L を適宜交換 して、 3 日 間透析を行い、 ミ セルを形成 していない副反応物を 除去 した。 さ ら にゲノレろ過 （ Sephadex G50 Fine, Amers ham Pharmacia Biotech AB) によ り 、 ボイ ド近傍の フ ラ ク シ ヨ ンを回収 し、 凍結乾燥 して、 T L C上で単一バン ドを示す白色粉末と して 目 的の D P P E — P E G — M a

1 を得た。

実施例 9 と 同様に して.調製 した リ ボ ソーム （卵黄 レ シ チ ン /コ レステ ロ一ノレ = 2 / 1 ) と こ の D P P E — P E G - M a I を混合 し、 5 10 20及び 100% D P P E — P E G - M a 1 含有 リ ボ ソームを調製 した。 こ の リ ボ ソ ーム 溶液に 1 N NaOH水溶液を加えて p Hを約 8 と し、 「 A— 1 」 ペプチ ドの C端に H- Gly- Cys- 0Hを付加 してな る本発 明のペプチ ドを所定濃度とな る よ う に混合 して、 室温で 6 時間穏やかに撹拌 し、 実施例 9 と同様に遠心型限外濾 過 して リ ボ ソ ーム溶液と した。 得 られた リ ボソーム上に 導入さ れたべプチ ド含量は実施例 9 と 同様に して測定 し ο

以上のよ う に して、 D P P E — P E G— M a 1 のマ レ イ ミ ドを介 して H A結合性ペプチ ドがシスティ ンの S H 基で結合 してな るぺプチ ド修飾体を リ ポソーム上に導入 し、 ペプチ ド修飾 リ ボ ソ ーム と した。 実施例 11 へマグルチニ ンの G M 3 キ ャ ス ト膜への結合 の阻害評価 実施例 8 に記載する方法によ っ て、 ク ロー ン 「 A— 1 」 の発現ペプチ ドを合成 し、 該合成ペプチ ドについて、 その、 ガング リ オ シ ド G M 3 に対する へマグルチニ ンの 結合の阻害活性を調べた。 具体的には、 固定化 H A ( H 1 N 1 、 H 3 N 2 ) に対する ガング リ オシ ド G M 3 の結 合を、 上記合成ペプチ ドが阻害するかどう かを E L I S Aを用いて実験 した。 なお、 比較対照実験と して、 上記 合成ペプチ ドに代えて、 フ ァ ー ジの コ ー ト タ ンノ、 °ク 質 p 1 1 1の N端 1 5 残基ペプチ ド、 及びシァ リ ルラ ク ト ースを 用いて同様に実験を行っ た。

結果を図 7 に示す。

この結果か ら、 A— 1 ペプチ ドはへマグルチニ ン と G M 3 との結合を用量依存的に阻害する こ とが明 らかとな つ た。 これに対 して p I I I蛋白由来のペプチ ドは阻害を示 さなかっ た。 こ の こ とか ら、 A — 1 ペプチ ドが配列特異 的にへマグルチニ ン と結合する こ と によ り 、 G M 3 との 結合を阻害する こ とが示さ れた。 なお、 シァ リ ルラ ク ト ースは G M 3 の シアル酸部分と競合する こ とによ り 、 へ マグルチニ ン と G M 3 との結合を阻害する こ とが示唆さ れた。 実施例 1 2 イ ン フルエ ンザウ イ ルス感染阻害活性の評価 本発明の H A結合性ペプチ ドについて、 イ ンフルェ ン ザウ ィ ルス感染阻害活性を評価 した。

イ ンフルエ ンザウイ ルス感染細胞と して、 M D C K細 胞 ( Mardin-Darby canine kidney) を用いた ₀ 当該細胞 へのィ ン フルェ ンザウィ ルス感染の評価は、 市販キ ッ ト ( LDH— Cytotoxic Test, Wako) を用 ヽて し D H ( lactat e dehydrogenase) 活性を検出する こ とによ り 行っ た （ J. Virol. eth. , 51, 185- 192 ( 1995 )) 。 ま たイ ンフルェン ザウィ ルス と して、 Α型の H I (A/PR/ 8/ 34 (H1N1) ) 及 び H 3 ( A/Victoria/395 (H3N2) ) を用いた。

具体的には、 イ ンフルエ ンザウイ ルスの感染力価は次 のよ う に して測定 した。

即ち、 M E MZ10% F B Sの培地で培養 した 3 x 10⁵c ell /mlの M D C K細胞を 96穴マイ ク ロ タ イ タ ープレー ト に 100m lずつ蒔き、 5 % C 0 ₂雰囲気下、 37°Cでー晚イ ン キュベー ト した。 全ての ゥエルの細胞が単層飽和にな つ ている こ とを確認 した後、 血清を含ま ない M E M ( M E M (― ) ) で 2 回洗浄 し、 これに系列希釈 したウィ ルス 溶液 （ M E M (― ) ) を 100 1ずつイ ン ジ ェ ク ト した。 これを 5 % C O ₂雰囲気下 37°Cで 2 時間イ ンキュベー ト し た後、 ウィルス溶液を除き、 培地で 2 回洗浄後、 同培地 で 20時間イ ンキュベー ト した。 ゥエル内の上清 15 1をと り 、 これを P B Sで 4倍希釈 して 50 z lと し、 これを新 し いプレー ト に移 し、 各ウエノレに発色液 ( nitrobluetetra zolium, diaphorase and NDA+ in litiumlactate PBS) を 50ml添加 した。 室温で 20分放置 した後、 反応停止液 (0.5M HC1 in PBS) を 100m l添加 し、 発色反応を停止 させ、 マイ ク 口プレー ト リ 一ダーを用いて 550 nmの吸光度 を測定 した。 得 られた結果か ら I D ₅。値を求めた。

H A結合性ぺプチ ドによ る ィ ンフルェ ンザウ ィ ルス感 染阻害実験は、 上記で得 られた I D ₅。値の 50倍濃度 （ 50 LDH IDso) のウィ ルス量を用いて試験 した。 H A結合性 ペプチ ドと して実施例 9 で得 られた 「 C i ₈ A- 1リ ポぺプチ ド」 及びこれを 10 %含む リ ボ ソームを用いて行っ たイ ン フルェ ンザウ ィ ルスの感染阻害試験の結果を図 8 及び図 9 に示す。 図 8 は 「 C i ₈ A- 1リ ポペプチ ド」 を用いた結果 を、 ま た図 9 は 「 C i ₈ A- 1リ ポペプチ ド」 によ り 修飾され た リ ボ ソ ーム （ 10 %ペプチ ド） を用いた結果を示す。 尚、 いずれの図 も、 a ) は A型イ ンフルエ ンザウイ ルス H I (A/PR/ 8/ 34 ( H1N1) ) に対する感染阻害を、 b ) は H 3 ( A/Victoria/359 (H3N2) ) に対する感染阻害をみた結 果であ る。

図 8及び図 9 力、 らわかる よ う に、 「 C L ₈ A- 1リ ポぺプチ ド」 は、 効果的にイ ン フルエ ンザウイ ルスの細胞への感 染を阻害 し、 こ の効果は該ペプチ ドをペプチ ド修飾 リ ポ ソ 一ムにする こ とによ り 増強さ れた。 これ らの こ とから 本発明の H A結合性べプチ ドがィ ン フルェンザ感染の予 防若 し く は治療剤と して有用であ る こ とが示唆された。 産業上の利用可能性 本発明によれば、 ィ ン フ ノレエ ンザゥ イ ノレスのへマグル チニ ンに特異的結合性を有するぺプチ ドが提供される。

本発明のペプチ ドは、 イ ン フルエ ンザウ イ ルス感染の 第 1 ステ ッ プに関与するへマグルチニ ンに特異的に結合 する こ とによ り 、 宿主受容体へのウ ィ ルスの結合を妨げ る こ とができ 、 こ れによ り イ ン フルエ ンザウ イ ノレス感染 予防剤 と して、 ま たイ ン フルエンザ治療剤と しての応用 が可能であ る 。 特に、 本発明の好適なペプチ ドは、 亜型 間で三次構造がよ く 保存さ れているへマグルチニ ンの受 容体結合ポケ ッ ト に特異的に結合する性質を有 している また比較的短いペプチ ドゆえに安定であ り 、 その側鎖の 多様性か ら、 へマグルチニ ンの結合部位と相互作用する こ の こ とか ら、 本発明のペプチ ドは亜型の種類に関わ ら ず、 多種の亜型間にま たがっ てイ ン フルエ ンザウイ ルス 全般、 特に A型全般に有効な広域感染予防剤及び治療剤 と しての応用が期待される。

さ ら に従来抗ィ ン フルェ ンザ剤 と して開発検討さ れて いる糖鎖アナ ロ グに比べ、 本発明はペプチ ドであ る がゆ えに、 大量合成並びに修飾が容易であ り 、 薬剤の生産な らびにさ らな る薬剤の開発とい う 面において も有用であ る

Claims

請求の範囲

1 . 下記（a )ま たは（b )のいずれかであ る、 イ ンフルェン ザウィ ルス · へマグルチニ ン結合性ぺプチ ド ：

( a ) 配列番号 1 〜 1 1 で示される ア ミ ノ 酸配列のいずれ かを有するぺプチ ド、

( b ) 上記 （ a ) に示される ア ミ ノ 酸配列において 1 若 し く は複数のア ミ ノ 酸が置換、 欠失若 し く は付加によ り 改 変されたア ミ ノ 酸配列か らな り 、 且つイ ン フルエ ンザゥ ィ ルス · へマグルチニ ン に結合性を有するぺプチ ド。

2 . 配列番号 1 ま たは 6 で示されるア ミ ノ 酸配列を有す る ィ ン フ ルェ ンザウ ィ ルス · へマ グルチニ ン結合性ぺプ チ ド。

3 . 配列番号 7 〜 1 1 で示される ア ミ ノ 酸配列のいずれ かを有するィ ン フルェンザウィルス · へマグルチニ ン結 合性べプチ ド。

4 . イ ンフルエ ンザウイ ノレスが A型ゥ イ ノレスであ る 、 請 求項 1 乃至 3 のいずれかに記載のィ ン フルェンザウ ィ ル ス · へマグルチニ ン結合性べプチ ド。

5 . イ ンフルエ ンザウ イ ルスが H I 亜型であ る 、 請求項 1 乃至 3 のいずれかに記載のィ ンフルェンザウィ ルス · へマグルチニ ン結合性べプチ ド。

6 . イ ンフルエ ンザウ イ ルスが H 3 亜型であ る、 請求項 1 又は 3 に記載のィ ン フノレエ ンザゥイ ノレス ' へマグルチ ニ ン結合性べプチ ド。

7 . アルキル化又は脂質化さ れてな る請求項 1 に記載の ィ ンフルェ ンザウィ ルス · へマグルチニ ン結合性ぺプチ ド、。

8 . 請求項 7 記載のイ ン フルエ ンザウ ィ ルス ' へマグル チニ ン結合性ペプチ ドを含有する リ ボ ソーム。

9 . 請求項 1 に記載のイ ン フルエ ンザウイルス · へマグ ルチニ ン結合性べプチ ドを有効成分と して含有する ィ ン フルェ ンザウィ ルス · へマグルチニ ン結合阻害剤。

10 . 請求項 7 に記載のィ ンフルェンザウィ ルス · へマグ ルチニ ン結合性べプチ ドを有効成分と して含有する ィ ン フルェ ンザウ ィ ルス · へマグルチニ ン結合阻害剤。

1 1 . 請求項 8 に記載の リ ボ ソ ームを有効成分と して含有 する ィ ン フルェ ンザウィ ルス · へマグルチニ ン結合阻害 剤。

12. 配列番号 1 ま たは 6 で示さ れる ア ミ ノ 酸配列を有す る ィ ン フルェ ンザウ イ ノレス · へマ グルチニ ン結合性ぺプ チ ドを有効成分と して含有する ィ ンフルェ ザウィ ルス • へマグルチニ ン結合阻害剤。

13. 配列番号 7 ~ 1 1 で示される ア ミ ノ 酸配列のいずれ かを有する ィ ンフルェ ンザウイ ノレス · へマグルチニ ン結 合性べプチ ドを有効成分と して含有する ィ ンフルェ ンザ ウィ ルス · へマグルチニ ン結合阻害剤。

14. 請求項 1 に記載のイ ン フルエ ンザウィルス ' へマグ ルチニ ン結合性ペプチ ドを有効成分と して、 薬学的に許 容さ れる担体と と も に含有する薬学的組成物。

15. 請求項 7 に記載のィ ン フルェ ンザウィ ルス · へマグ ルチニ ン結合性ペプチ ドを有効成分と して、 薬学的に許 容さ れる担体 と と も に含有する薬学的組成物。

16. 請求項 8 に記載の リ ボ ソ ームを有効成分と して、 薬 学的に許容さ れる担体と と も に含有する薬学的組成物。

17. 配列番号 1 ま たは 6 で示さ れる ア ミ ノ 酸配列を有す るィ ンフルェ ンザウィ ルス · へマグルチニン結合性ぺプ チ ドを有効成分と して、 薬学的に許容さ れる担体と と も に含有する薬学的組成物。

18. 配列番号 7 〜 1 1 で示さ れる ア ミ ノ 酸配列のいずれ かを有するィ ン フルェ ンザウ ィ ルス · へマグルチニ ン結 合性ペプチ ドを有効成分と して、 薬学的に許容される担 体と と も に含有する薬学的組成物。

19. 対象とする イ ン フルエ ンザウイ ルスが A型ウィ ルス であ る請求項 14記載の薬学的組成物。

20. 抗イ ン フ ルエ ンザ剤 と して用い られる請求項 14〜： 16 のいずれかに記載の薬学的組成物。

21 . 請求項 1 に記載のイ ンフルエ ンザウィ ルス ' へマグ ルチニ ン結合性ペプチ ドを有効量、 被験者に投与する こ とか らな る ィ ンフルェンザの感染予防方法若 し く はィ ン フルェ ンザの治療方法。

22. 請求項 7 に記載のイ ン フルエンザウィルス ' へマグ ルチニン結合性ペプチ ドを有効量、 被験者に投与する こ とか らな る ィ ンフルェ ンザの感染予防方法若 し く はィ ン フルェ ンザの治療方法。

23. 請求項 8 に記載の リ ボ ソ ームを有効量、 被験者に投 与する こ とか らな るィ ンフルェ ンザの感染予防方法若 し く はィ ンフルェンザの治療方法。

24. 請求項 14乃至 16のいずれかに記載の薬学的組成物を 被験者に投与する こ とか らな る イ ン フルエンザの感染予 防方法若 し く はィ ンフルェ ンザの治療方法。

25. 請求項 1 記載のィ ン フルェ ンザウ ィ ルス · へマグル チニ ン結合性ペプチ ドの、 抗イ ンフルエンザ剤と しての 使用。

26. 請求項 7 記載のィ ン フ ノレエ ンザゥ イ ノレス · へマグル チニ ン結合性ペプチ ドの、 抗イ ンフルエンザ剤と しての 使用。

27. 請求項 8 に記載の リ ボ ソ ームの抗イ ン フルエ ンザ剤 と しての使用。

28. 請求項 1 記載のイ ン フルエ ンザウ ィルス ' へマ グル チニ ン結合性ペプチ ドの、 抗イ ンフルエンザ剤 と して用 い られる薬学的組成物の製造のための使用。

29. 請求項 7 記載のィ ンフルェ ンザウィ ルス · へマグル チニ ン結合性ペプチ ドの、 抗イ ン フルエ ンザ剤と して用 い られる薬学的組成物の製造のための使用。

30. 請求項 8 記載の リ ボ ソ ームの、 抗イ ン フルエ ンザ剤 と して用い られる薬学的組成物の製造のための使用。