WO2001007602A2 - Oligonukleotide zur inhibierung der expression von humanem eg5 - Google Patents

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    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • Oligonucleotides to inhibit the expression of human eg5 Oligonucleotides to inhibit the expression of human eg5
  • the present invention relates to an oligonucleotide or one of its derivatives having a sequence which corresponds to a specific part of a nucleic acid sequence which encodes human eg5 or a mutated form thereof, and the invention further relates to a method for producing the oligonucleotide and its use.
  • a spindle device based on microtubules helps to evenly distribute the duplicated chromosomes among the daughter cells.
  • Motor proteins related to kinesin make up part of the forces required to assemble the spindle and split the chromosomes.
  • the formation of a bipolar mitotic spindle requires the activity of many different motor proteins.
  • One of the human motor proteins related to kinesin is human eg5, which interacts with the mitotic centrosomes and has been shown to be essential for the formation of the bipolar spindle (Blangy et al., Celi (1995) 83, 1159).
  • Microinjection of specific anti-human eg5 antibodies blocks centrosome migration and causes cells to stop mitosis.
  • Another way to block the formation of a bipolar spindle would be to inhibit eg5 expression.
  • One way to specifically inhibit eg5 expression is to use antisense oligonucleotides, which may have been modified to improve their properties (E. Uhimann and A. Peyman, Chemical Reviews 90, 543 (1990); S. Agrawal, TIBTECH 1996, 376).
  • Antisense oligonucleotides are believed to bind to specific sequences of the mRNA, which leads to degradation of the mRNA and / or inhibition of protein synthesis.
  • the present invention relates to an oligonucleotide or one of its derivatives which corresponds to part of the eg5 coding sequence - preferably human eg5 or the eg5 of a pathogen, for example Plasmodium falciparum (malaria).
  • the oligonucleotide preferably corresponds to 8 to 100 nucleotides, particularly preferably 8 to 20 nucleotides of the eg5 sequence.
  • the oligonucleotide or the derivative thereof binds to said sequence and inhibits the formation of the eg5 protein.
  • the human eg5 sequence has been published (Blangy et al., Cell (1995) 83, 1159).
  • SEQ ID NO .: 20 shows an example of a sequence encoding human eg5.
  • SEQ ID NO .: 21 shows an example of a Plasmodium falciparum eg 5 sequence.
  • the oligonucleotide preferably has a sequence that is part of a
  • the term “corresponds” means that the base sequence of the oligonucleotide is complementary to a part of a nucleic acid sequence which encodes eg5 (eg gene, cDNA, mRNA), which allows the oligonucleotide with the "sense part" of the nucleic acid encoding the eg ⁇ to hybridize (bind to it).
  • eg5 eg gene, cDNA, mRNA
  • the oligonucleotide is therefore an antisense oligonucleotide.
  • the oligonucleotide is a ribozyme.
  • a ribozyme is a catalytic nucleic acid that cleaves mRNA.
  • the ribozyme is preferably selected from the group of the hammerhead ribozymes (Vaish et al., Nucleic Acids Res. (1998) 26, 5237).
  • An oligonucleotide according to the invention binds to a part of the eg5 mRNA suitable for hybridization and inhibits the formation of the eg5 protein. Suitable for binding to eg5 mRNA and for inhibiting expression
  • Oligonucleotides are e.g. targeting the translation starter region of eg5.
  • the portion of the eg5 coding nucleic acid sequence corresponding to the oligonucleotide has a length of 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 or more nucleotides, and the oligonucleotide preferably corresponds to a length of 12 nucleotides or 19 nucleotides of an eg5 coding sequence.
  • An oligonucleotide according to the invention therefore has a length of 10 (10mer), 11 (11mer), 12 (12mer), 13 (13mer), 14 (14mer), 15 (15mer), 16 (16mer), 17 (17mer), 18 (18mer) or 19 (19mer) nucleotides.
  • the oligonucleotide has a length of 12 or 19 nucleotides; such oligonucleotides can, for example, one of the sequences SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9 or a part thereof, wherein SEQ ID NO. 1: 3-'CTTAAGGCAGTACCGCAGC-5 '; 5'CGACGCCATGACGGAATTC-3 'SEQ ID NO.
  • the oligonucleotide is modified to improve its properties; e.g. to increase its resistance to nucleases or to make it resistant to nucleases, to improve its binding affinity for a complementary eg5-encoding nucleic acid, e.g. mRNA, or to increase its uptake into the cell.
  • the present invention therefore preferably relates to an oligonucleotide which has a specific sequence as given above and which, in addition, compared to a "natural" DNA which is composed of the "natural" nucleosides deoxyadenosine (adenine + ⁇ -D-2 ' deoxyribose) , Deoxyguanosine (guanine + ß-D-2 ' -deoxyribose), deoxycytidine (cytosine + ß-D-2 ' -deoxyribose) and thymidine (thymine + ß-D-2 ' -deoxyribose), which are connected by phosphodiester bridges between the nucleosides are, has one or more chemical modifications.
  • the oligonucleotides can contain one or more modifications of the same type and / or modifications of a different type; each type of modification can be made independently of the others be known for the modification of oligonucleotides known modification types.
  • the invention also relates to derivatives of oligonucleotides, for example their salts, in particular their physiologically tolerable salts. Salts and physiologically acceptable salts are e.g. described in Remington's Pharmaceuticals Science (1985) Mack Publishing Company, Easton, PA (page 1418). Derivatives also refer to modified oligonucleotides that contain one or more modifications (e.g. at certain nucleotide positions and / or at certain internucleoside bridges), oligonucleotide analogs (e.g. polyamide nucleic acids
  • PNAs phosphomonoester nucleic acids
  • PMENAs PMENAs
  • oligonucleotide chimers e.g. consisting of a DNA and a PNA part or consisting of a DNA and a PHONA part
  • Derivatives also refer to oligonucleotides corresponding to alleles and / or mutated forms (mutants) of normal or natural eg5, e.g. Alleles and / or mutants of human eg5 (e.g. related to SEQ ID NO. 20) and alleles and / or mutants of Plasmodium falciparum eg5 (e.g. related to SEQ ID NO. 21).
  • a phosphodiester bridge between nucleosides, a ⁇ -D-2 ' deoxyribose unit and / or a natural nucleoside base (adenine, guanine, cytosine, thymine) can be modified or exchanged.
  • An oligonucleotide according to the invention can have one or more of these modifications, each modification compared to an oligonucleotide of the same sequence consisting of natural DNA on a specific phosphodiester internucleoside bridge and / or on a specific ⁇ - D-2 ' deoxyribose unit and / or at a specific natural nucleus base position.
  • the invention relates to an oligonucleotide which contains one or more modifications, each modification being selected independently from the following list: a) the exchange of a phosphodiester bridge between nucleosides which are located at the 3 ' and / or at the 5 ' end of one Nucleoside is through a modified internucleoside bridge, b) the exchange of a phosphodiester bridge located at the 3 ' and / or the 5 ' end of a nucleoside with a dephospho bridge, c) the exchange of a sugar phosphate unit from the sugar phosphate skeleton with another unit, d ) the exchange of a ⁇ -D-2 ' -deoxyribose unit by a modified sugar unit, e) the exchange of a natural nucleoside base by a modified nucleoside base, f) the connection to a molecule which influences the properties of the oligonucleotide, g) the connection to a 2'5'-linked oligo
  • oligonucleotide More precise examples of the chemical modifications of an oligonucleotide are a) the exchange of a phosphodiester bridge between nucleosides, which is located at the 3 ' and / or at the 5 ' end of a nucleoside, with a modified internucleoside bridge, the modified internucleoside bridge being made, for example, from phosphorothioate , Phosphorodithioat-, NR 1 R r -phosphoramidate-, boranophosphate-, phosphate- (C ⁇ -C 2 ⁇ ) -0-alkyl ester-, phosphate - [(C 6 -C ⁇ 2 ) aryl - ((C 1 -C 2 ⁇ ) -0-alkyl] esters, (CrC 8 ) alkylphosphonate and / or (C 6 -C 2 ) arylphosphonate bridges and (C 7 -C ⁇ 2 ) - ⁇ -
  • Nitro, cyano are substituted, and wherein R 1 and R 1 independently of one another are hydrogen, (C 8 -C) alkyl, (C6-C 2 o) aryl,
  • (C 6 -C 4 ) aryl- (-C 8 ) alkyl preferably hydrogen, (CC 8 ) alkyl, preferably (C 1 -C 4 ) alkyl and / or methoxyethyl, or
  • R 1 and R 1 together with the nitrogen atom carrying them form a 5- to 6-gl ⁇ edr ⁇ gen heterocyclic ring which additionally contains a further heteroatom from the
  • dephospho bridges are described, for example, in Uhlmann, E and Peyman, A in “Methods in Molecular Biology", volume 20, “Protocols for Oligonucleotides and Analogs", S Agrawal, ed., Humana Press, Totowa 1993, chapter 16, 355ff.), A dephosphobrucke for example formacetal, 3'-thioformacetal, methylhydroxylamine, oxime, methylenedimethylhydrazo, dimethylene sulfone and / or is a silyl group,
  • 2-Am ⁇ noethylglyc ⁇ n a phosphonic acid monoester nucleic acid
  • PHONA phosphonic acid monoester nucleic acid
  • PHONA phosphonic acid monoester nucleic acid
  • a natural nucleoside base by a modified nucleoside base
  • the modified nucleoside base consisting, for example, of uracil, hypoxanthine, 5- (hydroxymethyl) uracil, N 2 -dimethylguanosine, pseudouracil, 5- (hydroxymethyl) uracil, 5-aminouracil, dihydrouracil, 5-fluorouracil, 5-fluorocytosine, 5-chlorouracil, 5-chlorocytosine, 5-bromouracil, 5-bromocytosine, 2,4-diaminopurine, 8-azapurine, a substituted 7-deazapurine, preferably 7-deaza-7-substituted and / or 7-deaza-8-substituted purine or other modifications of natural nucleoside bases is selected (modified nucleoside bases are described, for example, in EP 0 710 667 A2 and EP 0 680 969 A2);
  • connection to a molecule which influences the properties of the oligonucleotide the connection of the oligonucleotide to one or more molecules which influence the properties of the oligonucleotide (favorably) (for example the ability of the oligonucleotide to penetrate the cell membrane or in to penetrate a cell, the stability towards nucleases, the affinity for an eg5 coding target sequence, the pharmacokinetics of the oligonucleotide, the ability of an antisense oligonucleotide / ribozyme or a molecule conjugated with the oligonucleotide, to attack the respective eg5 coding target sequence, eg the ability to attack Binding and / or cross-linking when the oligonucleotide hybridizes with the eg5-encoding target sequence), polyiysin, intercalating agents such as pyrene, acridine, phenazine or phen
  • connection to a 2'5'-linked oligoadenylate preferably via a suitable linker molecule, the 2'-5'-linked oligoadenylate consisting, for example, of 2'5'-linked triadenylate, 2'5'-linked tetraadenylate .
  • 2'5'-linked pentaadenylate, 2'5'-linked hexaadenyltate or 2'5'-linked heptaadenylate molecules and their derivatives is selected, a 2 ' 5 ' -linked oligoadenylate derivative being, for example, cordycepin (2'5 ' -bound 3'-deoxyadenylate) and where, for example, triethylene glycol is a suitable linker and where the 5 'end of the 2'5'-linked oligoadenylate must carry a phosphate, diphosphate or triphosphate radical in which one or more oxygen atoms are used Example can be replaced by sulfur atoms, the substitution by a phosphate or thiophosphate residue is preferred; and
  • the scaffold unit can preferably be the replacement of a nucleotide by, for example, a PNA unit or a PHONA unit which already contains natural nucleoside bases and / or modified nucleoside bases, for example one of the modified nucleoside bases from the group uracil, hypoxanthine, 5- (hydroxymethyl) uracil, N 2 - dimethylguanosine, pseudouracil, 5- (hydroxymethyl) uracii, 5-aminouracil, pseudouracil, dihydrouracil, 5-fluorouracil, 5-fluorocytosine, 5-chlorouracil, 5-chlorocytosine, 5-bromouracil, 5-bromocytosine, 2, 4-diaminopurine, 8-azapurine, a substituted 7-deazapurine, preferably 7-deaza-7-substituted and / or 7-deaza-8-substituted purine or other modifications of a natural nucleoside base (modified nucleot
  • one or more phosphodiester bridges between the nucleosides within the oligonucleotide sequence are modified; are preferably one or more phosphodiester bridges between the nucleosides by phosphorothioate bridges between the nucleosides and / or (C 6 -Ci 2 ) arylphosphonate bridges between the nucleosides, preferably by ⁇ -hydroxybenzylphosphonate bridges in which the benzyl group is preferably substituted, for example by nitro, methyl, Halogen, replaced.
  • a phosphorothioate oligonucleotide only, all phosphodiester bridges between the nucleosides are modified by phosphorothioate.
  • the invention preferably relates to an oligonucleotide in which not all phosphodiester bridges between the nucleosides are modified uniformly with phosphorothioate (phosphorothioate bridges between the nucleosides).
  • Preferably at least one internucleoside bridge has a different type of modification or it is not modified.
  • the invention relates in particular to an oligonucleotide which additionally contains at least one other type of modification.
  • one or more nucleosides are modified within the oligonucleotide sequence; the ⁇ -D-2 ' deoxyribose is preferably replaced by 2'-0- (CrC 6 ) -alkyl ribose, preferably by 2 ' -0-methyl ribose, and / or the nucleoside base is 8-azapurine, 7-deaza-7 -substituted purine and / or 7-deaza-8-substituted purine (purine: adenine, guanine).
  • the invention preferably relates to an oligonucleotide in which not all nucleosides are uniformly modified.
  • the invention preferably relates to an oligonucleotide which additionally contains at least one other type of modification.
  • one or more sugar phosphate units are removed from the sugar-phosphate framework by PNA-
  • the exchanged sugar phosphate units are preferably connected to one another at least to a certain degree.
  • the invention preferably relates to an oligonucleotide in which not all sugar phosphate units are exchanged uniformly.
  • the invention particularly relates to chimeric oligonucleotides, e.g. those composed of one or more PNA parts and one or more DNA parts. Possible examples of such chimeric oligonucleotides are the following modification patterns, which do not serve to restrict the invention: DNA-PNA, PNA-DNA, DNA-PNA-DNA, PNA-DNA-PNA, DNA-PNA-DNA-PNA, PNA- DNA-PNA-DNA. Similar patterns would be out
  • DNA parts and PHONA parts composed of chimeric molecules possible, for example DNA-PHONA, PHONA -DNA, DNA-PHONA -DNA, PHONA -DNA- PHONA, DNA- PHONA -DNA- PHONA, PHONA -DNA- PHONA -DNA.
  • chimeric molecules from three different parts such as DNA part (s), PHONA part (s) and PNA part (s) are of course also possible.
  • the invention preferably relates to an oligonucleotide which additionally contains at least one other type of modification.
  • the 3 ' end and / or the 5 ' end of the oligonucleotide is connected to a (C 2 -C 18 ) allyl residue, preferably a C 6 alkyl residue, a triethylene glycol residue or a hexaethylene glycol residue -
  • residues are preferably bound to the oligonucleotide via a phosphate group.
  • the invention preferably relates to an oligonucleotide in which both ends (the 3 ' and the 5 ' end) are not modified (equally).
  • the invention preferably relates to an oligonucleotide which additionally contains at least one other type of modification.
  • oligonucleotide sequence In a preferred embodiment of the invention, only certain positions within an oligonucleotide sequence are modified (e.g. partially modified oligonucleotide).
  • partially modified oligonucleotides are also referred to as minimally modified oligonucleotides.
  • a modification can be located in certain positions within the sequence (with certain nucleotides, with certain nucleosides, with certain nucleoside bases, with certain internucleoside bridges).
  • a partially modified oligonucleotide is made by only some of the phosphodiester bridges through modified internucleoside bridges, e.g. Phosphorothioate bridges and / or ⁇ -hydroxybenzylphosphonate bridges can be replaced.
  • modified internucleoside bridges e.g. Phosphorothioate bridges and / or ⁇ -hydroxybenzylphosphonate bridges can be replaced.
  • the invention particularly includes those oligonucleotides that are only modified to a certain degree.
  • the invention relates to an oligonucleotide in which 1 to 5 terminal nucleotide units at the ⁇ 'end and / or at the 3' end by modifying internucleoside bridges which are located at the 5 'and / or at the 3' end of the corresponding nucleoside are protected, preferably by exchanging the phosphodiester bridges between the nucleosides by phosphorothioate bridges and / or ⁇ -hydroxybenzylphosphonate bridges.
  • the 1 to 5 terminal nucleotide units at the 3 'end of the oligonucleotide are very particularly preferably protected by modified internucleoside bridges which are located at the 5' and / or at the 3 'end of the corresponding nucleosides. If necessary, the 1 to 5 Terminal nucleotide units at the 5 'end of the oligonucleotide are additionally protected by modified internucleoside bridges which are located at the 5' and / or at the 3 'end of the corresponding nucleoside.
  • the oligonucleotide can optionally contain additional modifications at other positions.
  • the invention further relates to an oligonucleotide in which at least one internal pyrimidine nucleoside and / or an internucleoside bridge located at the 5 'end and / or at the 3' end of this pyrimidine nucleoside (a nucleoside with a pyrimidine base such as cytosine, uracil, thymine) is modified is, preferably by exchanging the phosphodiester bridge (s) between the nucleosides by one / more phosphorothioate bridge (s) and / or one / more ⁇ -hydroxybenzylphosphonate bridge (s).
  • a nucleoside with a pyrimidine base such as cytosine, uracil, thymine
  • 1 to 5 terminal nucleotide units at the 5 'end and / or at the 3' end of the oligonucleotide are by modifying internucleoside bridges which are located at the 5 'and / or at the 3' end of the corresponding nucleoside, protected, in addition at least one internal pyrimidine nucleoside and / or an internucleoside bridge located at the 5 'end of this pyrimidine nucleoside and / or at the 3' end of this pyrimidine nucleoside is modified.
  • At least one internal pyrimidine nucleoside position is preferably modified; the 3 'and / or the 5' internucleoside bridge (s) of a pyrimidine nucleoside is / are preferably modified / exchanged, for example by one / more phosphorothioate bridge (s) between the nucleosides.
  • Partially modified oligonucleotides have particularly advantageous properties; for example, they are particularly stable to nucleases, and only minimally modified. They also have a considerably reduced tendency to non-antisense effects, which are often associated with the use of phosphorothioate-only oligonucleotides (Stein and Krieg (1994) Antisense Res. Dev. 4, 67). Partially modified oligonucleotides also show a higher binding affinity than phosphorothioates only.
  • the invention particularly relates to partially / minimally modified oligonucleotides.
  • SEQ ID NO. 10 3-'C * T * T * AAGGC * AGT * AC * CG * CAG * C ⁇ 5 ⁇ (K3) 5'-CGAC * G * C * C * A * TGA * CGGAA * T * T * C -3 ';
  • SEQ ID NO. 16 3'-A * G * TAC * CG * CAG * C * G-5 * , 5'-G * C * GAC * GC * CAT * G * A-3 ';
  • SEQ ID NO. 17 3'-C * C * G * CAG * CGT * CG * G-5 ', 5'-G * GC * TGC * GAC * G * C * C-3 ";
  • SEQ ID NO. 18 3'- G * C * AGC * GT * CGG * T * T-5 ',
  • a ß-D-2 ' -deoxyribose is preferably exchanged for 2'-O- (-C-C 6 ) alkyliribose, the exchange for is very particularly preferred 2'-0-methylribose (exchange of a ⁇ -D-2 ' deoxyribonucleoside for a 2 ' -0-methylribonucleoside).
  • the oligonucleotide can also have other types of modification according to the invention.
  • the oligonucleotide therefore contains modified internucleoside bridges at certain positions and additionally modifications of a nucleoside at certain positions, preferably exchange of ⁇ -D-2 ' deoxyribose.
  • the internucleoside modification is the exchange of a phosphodiester bridge for a phosphorothioate bridge, and the modification of the ⁇ -D-2 " deoxyribose is the exchange for 2 ' -0-methylribose; in this case the oligonucleotide is a chimeric oligonucleotide, which is composed of modified and unmodified DNA and RNA parts - which are the
  • a further preferred embodiment of the invention relates to an oligonucleotide which has one or more (C 2 -C 8 ) alkyl residues, preferably one
  • a (-C 2 -C 18 ) -alkyl radical can be bound, for example, as a phosphodiester, as described in EP 0 552 766 A2 (EP 0 552 766 A2 is hereby expressly incorporated by reference), or as a 3'-phosphodiester of 0-CH 2 -CH (OH) -0- (-C 2 -C 18 ) alkyl.
  • An oligonucleotide in which a C 6 -alkyl radical is bonded to the 3 'and / or 5' end is preferred.
  • the invention also relates to an oligonucleotide in which the 3 'and / or the 5' end is connected to an oligoethylene glycol residue, preferably a triethylene glycol or a hexaethylene glycol, very particularly preferably via a phosphodiester (tri- or hexaethylene glycol phosphate ester).
  • an oligonucleotide can of course also contain further modifications.
  • the oligonucleotide is linked via a linker to a 2'5'-linked oligoadenylate 5 '- (thio) phosphate.
  • the linker can be, for example, an oligoethylene glycol phosphate, preferably a triethylene glycol phosphate, tetraethylene glycol phosphate or hexaethylene glycol phosphate residue.
  • the 2'5'-bound oligoadenylate is preferably bound via its 2'-end as a tetra- or as a pentaadenylate, the 5'-hydroxy function of which is substituted by a phosphate or thiophosphate radical. It is known that 2'5'-oligoadenylate induces RNase L to cleave the target mRNA (Torrence et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1993) 90, 1300).
  • the 2'5'-oligoadenylate serves to activate ribonuclease L (RNase L), which then degrades the eg5 mRNA.
  • RNase L ribonuclease L
  • the part of the oligonucleotide which is complementary to the target nucleic acid is preferably modified at certain positions by 2'-0- (C 1 -C 6 ) -alkyl ribonucleoside (preferably 2'-0-methylribonucleoside) or by PNA.
  • Another preferred embodiment of the invention relates to the replacement of one or more natural nucleoside bases by unnatural or modified nucleoside bases, preferably by 8-azapurines and / or 7-deaza-7-substituted purines and / or 7-deaza-8-substituted ones Purines, such as in EP 0 171 066 and EP 0 680 969.
  • the nucleoside can have 3'3 'and / or 5'5' inversions at the 3 'and / or 5' end, as for example in EP 0 464 638 and EP 0 593 901 described.
  • a further preferred embodiment of the invention relates to the exchange of one or more phosphodiester bridges for ⁇ -hydroxybenzylphosphonate bridges, as described in WO 95/01363.
  • the oligonucleotide contains a modification of the sugar phosphate structure, preferably by PNA units.
  • modification patterns are also possible, e.g. DNA-PNA-DNA, PNA-DNA. Comparable modification patterns are also possible for PHONA / DNA chimers. These modification patterns can be combined with any other type of modification, and of course similar modification patterns are also possible for other oligonucleotides according to the invention.
  • An oligonucleotide according to the invention specifically inhibits the expression of the target protein (i.e. eg5) or the target sequence (a nucleic acid which codes for eg5, preferably eg5 mRNA).
  • An oligonucleotide according to the invention preferably specifically inhibits the expression of eg5. This results in a lowering of the eg5 protein concentration compared to an untreated expression.
  • the specificity can be demonstrated, for example, by determining the effect of an oligonucleotide according to the invention on eg5 expression in comparison to the effect of the same oligonucleotide on beta actin expression on the mRNA and / or the protein level.
  • eg5 mRNA and / or the eg5 protein concentration was reduced, while e.g. beta-actin (a household protein) mRNA and / or beta-actin protein concentration remained unchanged.
  • beta-actin a household protein
  • An oligonucleotide according to the invention is preferably capable of and / or has the ability to effectively inhibit the expression of eg5 in human cells Ability to inhibit the growth of tumors in vertebrates.
  • An oligonucleotide according to the invention preferably reduces the eg5 mRNA and / or protein concentration in tumors of treated individuals compared to untreated individuals.
  • An oligonucleotide according to the invention preferably reduces the size of a tumor in a vertebrate, for example in mice, in comparison to untreated mice or in comparison to the size of the tumor determined in the same animal before treatment.
  • the invention also relates to a method for producing a nucleotide according to the invention.
  • One manufacturing process involves chemical synthesis of the oligonucleotide. Chemical synthesis is preferably carried out using a standard method known for use in the synthesis of oligonucleotides, for example the phosphoramidite method according to Caruthers (1983) Tetrahedron Letters 24, 245, the H-phosphonate method (Todd et al. (1957) J. Chem. Soc . 3291) or the phosphotriester method (Sonveaux (1986) Bioorg. Chem.
  • an oligonucleotide according to the invention can be prepared as described in Example 1.
  • An oligonucleotide according to the invention is preferably synthesized on a solid phase by suitably condensing protected monomers (eg nucleosides) to form internucleoside bridges between these monomers for the preparation of an oligonucleotide or a derivative thereof, w or a nucleotide unit with a 3 ' or a 2 ' terminal phosphorus (V) group and a free 5 ' hydroxyl or mercapto grouping with a further nucleotide unit with a phosphorus (III) or a phosphorus (V) grouping in the 3 'position, or their activated derivatives, and optionally using protective groups which can be temporarily introduced into the oligonucleotide to protect other functions and which are removed after synthesis and the one which is split off from the solid phase Oligonucleotide can optionally be converted into a physiologically acceptable salt.
  • protected monomers eg nucleosides
  • modified oligonucleotide To synthesize a modified oligonucleotide, the standard methods are varied to some extent. These are variations known to the person skilled in the art, and they are described, for example, in Agrawal S. "Protocols for oligonucleotides and analogs" (1993, Human Press Inc., Totowa, New Jersey). The preparation of modified oligonucleotides is also described in EP 0 710 667, EP 0 680 969, EP 0464 638, EP 0 593 901, WO 95/01363, EP 0 672 677, EP 0 739 898 and EP 0 552 766. Reference is hereby expressly made to the methods for producing modified oligonucleotides described in the abovementioned documents.
  • the invention further relates to a method for inhibiting the expression of eg5 and / or for modulating the expression of a nucleic acid encoding eg5, an oligonucleotide according to the invention being brought into contact with a nucleic acid encoding eg5 (eg mRNA, cDNA) and the oligonucleotide encoding this eg5 Nucleic acid is hybridized.
  • a nucleic acid encoding eg5 eg mRNA, cDNA
  • the invention therefore also relates to a method in which the oligonucleotide is brought into contact with a nucleic acid encoding eg5 (eg mRNA; cDNA), for example by inserting the oligonucleotide into a cell using known methods, for example by incubating cells with the above-mentioned oligonucleotide or a formulation thereof - such a formulation may contain uptake improvers such as lipofectin, lipofectamine, cellfectin or polycations (eg polylysine).
  • a nucleic acid encoding eg5 eg mRNA; cDNA
  • uptake improvers such as lipofectin, lipofectamine, cellfectin or polycations (eg polylysine).
  • an oligonucleotide previously incubated with Cellfectin is then incubated with a cell for about 5 hours or less to introduce the oligonucleotide into the cell.
  • the invention further relates to the use of the oligonucleotide, preferably as an antisense oligonucleotide (binding of the oligonucleotide to an mRNA coding for eg5) or as a ribozyme (binding to a mRNA coding for eg5 and cleavage of this mRNA).
  • the oligonucleotide can be used to induce the cleavage of the mRNA encoding eg5 by RNase H, which leads to a reduced eg5 expression.
  • the invention relates to the use of an oligonucleotide for inhibiting the formation of a bipolar mitotic spindle and thus for inhibiting cell proliferation, in particular tumor growth.
  • the invention further relates to the use of the oligonucleotide as a medicament and the use of the oligonucleotide for the production of a pharmaceutical preparation.
  • the oligonucleotide can be used in a pharmaceutical preparation which is used for the prevention and / or for the treatment of diseases which are associated with the expression of eg5 or which can be cured by the inhibition of eg5 expression.
  • the invention further relates to a pharmaceutical preparation which contains an oligonucleotide and / or its physiologically acceptable salts together with pharmaceutically acceptable carriers or auxiliaries.
  • the invention relates to a pharmaceutical preparation which contains at least one nucleotide according to the invention which can be used for the treatment of diseases which can be cured by the inhibition of eg5 expression, such as restenosis and cancer.
  • the invention further relates to a method for producing a pharmaceutical preparation, wherein one or more oligonucleotides according to the invention with physiologically acceptable carriers and optionally additional substances, e.g. optionally mixed with suitable additives and / or auxiliaries.
  • the invention relates in particular to the use of an oligonucleotide or a pharmaceutical preparation prepared therefrom for the treatment of cancer, for example for the inhibition of tumor growth and tumor metastasis.
  • the oligonucleotide or a pharmaceutical preparation produced therefrom can be used, for example, for the treatment of solid tumors, such as breast cancer, lung cancer, head and neck cancer, brain cancer, stomach cancer, colon cancer, colorectal cancer, esophageal cancer, gastrointestinal cancer, gliatumor, liver cancer, tongue cancer, Neuroblastoma, osteosarcoma, ovarian cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, retinoblastoma, Wilms tumor, multiple myeloma can be used, and for the treatment of skin cancer such as melanoma, for the treatment of lymph node tumors and blood cancer.
  • solid tumors such as breast cancer, lung cancer, head and neck cancer, brain cancer, stomach cancer, colon cancer, colorectal cancer, esophageal cancer,
  • the invention further relates to the use of an oligonucleotide according to the invention or a pharmaceutical preparation prepared therefrom for inhibiting eg5 expression and / or for inhibiting the accumulation of ascitic fluid and pleural effusions in various types of cancer, for example breast cancer, lung cancer, head cancer, neck cancer, brain cancer, abdominal cancer, and colon cancer , colorectal cancer, esophageal cancer, gastrointestinal cancer, gliatumor, liver cancer, tongue cancer, neuroblastoma, osteosarcoma, ovarian cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, retinoblastoma, Wilms tumor, multiple myeloma, skin cancer, melanoma and blood cancer. Due to the inhibitory effect on eg5 expression, an oligonucleotide according to the invention or a pharmaceutical composition produced therefrom can improve the quality of life.
  • the invention further relates to the use of an oligonucleotide or a pharmaceutical preparation thereof, e.g. for the treatment of cancer or for the prevention of tumor metastasis, in combination with other drugs and / or other therapeutic measures, e.g. with known drugs and / or known therapeutic measures, such as those currently used for the treatment of cancer and / or for the prevention of tumor metastasis.
  • a combination with radiation therapy and chemotherapeutic agents such as cisplatin, cyclophosphamide, 5-fluorouracil, adriamycin, daunorubicin or tamoxifen is preferred.
  • the oligonucleotide and / or its physiologically acceptable salt can be administered to an animal, preferably a mammal and in particular a human being alone, in a mixture with another oligonucleotide (or its physiologically acceptable salt) or in the form of a pharmaceutical preparation which the topical, percutaneous , parenteral or enteral use and as an active ingredient an effective dose of at least one oligonucleotide, in addition to usual pharmaceutically acceptable Carriers and auxiliary substances.
  • a pharmaceutical preparation normally contains about 0.1 to 90% by weight of the therapeutically active oligonucleotide / oligonucleotides.
  • the dose can be varied within a wide range and must be adapted to the individual circumstances.
  • Topical use is preferred for treating psoriasis.
  • infusions, oral and rectal administration, or nasal administration in an aerosol preferably in the case of lung cancer, are preferred, while in the case of diabetic retinopathy, topical, intravitreal and oral administration is preferred.
  • a pharmaceutical preparation can be prepared in a manner known per se (e.g. Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publ. Co., Easton, PA (1985)) using pharmaceutically inert inorganic and / or organic carriers. Lactose, corn starch and / or its derivatives, talc, stearic acid and / or its salts, etc., can be used, for example, for the production of pills, tablets, film-coated tablets and hard gelatin capsules. Examples of carriers for soft gelatin capsules and / or suppositories are fats, waxes, semi-solid and liquid polyols, natural and / or hardened oils, etc.
  • Suitable carriers for the preparation of solutions and / or syrups are water, sucrose, invert sugar, glucose, polyols , etc.
  • Suitable carriers for the preparation of injection solutions are water, alcohols, glycerol, polyols, vegetable oils, etc.
  • Suitable carriers for microcapsules, implants and / or rods are mixed polymers of glycolic acid and lactic acid.
  • liposome formulations which e.g. in N. Weiner (Drug Develop Ind Pharm 15 (1989) 1523), "Liposome Dermatics” (Springer Verlag 1992) and Hayashi (Gene Therapy 3 (1996) 878).
  • the pharmaceutical composition may also comprise a formulation which increases the oral availability of the oligonucleotide, such as substances for improving intestinal uptake, e.g. Mannitol, urea, bile acid salts such as CDCA (Chenodeoxycholate) (2%).
  • a formulation which increases the oral availability of the oligonucleotide such as substances for improving intestinal uptake, e.g. Mannitol, urea, bile acid salts such as CDCA (Chenodeoxycholate) (2%).
  • Dermal application is also possible, for example using ionophoretic methods and / or using electroporation.
  • lipofectins and other carrier systems for example those in gene therapy used, used.
  • Systems which allow the introduction of oligonucleotides into eukaryotic cells or into the nucleus of eukaryotic cells in a highly efficient manner are particularly suitable.
  • a pharmaceutical preparation can also consist of two or more different oligonucleotides and / or their physiologically acceptable salts and, in addition to at least one oligonucleotide, of one or more different therapeutic active ingredients.
  • a pharmaceutical preparation can also contain additives such as fillers, extenders, disintegrants, binders, lubricants, wetting agents, stabilizers, emulsifiers, preservatives, sweeteners,
  • Oligonucleotides were synthesized using an Applied Biosystems 394 DNA synthesizer (Perkin Elmer Applied Biosystems, Inc., Foster City, USA) and standard phosphoramidite chemistry. After coupling, phosphorothioate bonds were introduced by sulfurization using the Beaucage reagent followed by capping with acetic anhydride and N-methylimidazole. After cleavage from the solid phase and final deprotection by treatment with concentrated ammonia, the ONs were purified by polyacrylamide gel electrophoresis.
  • the 2'-O-Mef 7y / -modified ON s were prepared by exchanging the standard phosphoramidites in the corresponding cycle for 2'-0-methylribonucieoside phosphoramidites. All ON s were analyzed by electrospray mass spectroscopy with negative ions (Fisons Bio-Q), which confirmed the calculated mass in all cases.
  • the C16 modified oligonucleotides were synthesized using hexadecyioxy (cyanoethoxy) -N, N-diisopropyl-aminophosphane instead of a standard amidite as phosphitylation reagent in the last step of the oligonucleotide synthesis or starting from a correspondingly derivatized solid phase.
  • the triethylene glycol linker is commercially available from Glen Research Corporation.
  • the 2'-phosphoramidites of adenosine and cordycepin were purchased from Chem. Genes Corporation and Chemogen Corporation, respectively.
  • oligonucleotides were analyzed by a) analytical gel electrophoresis in 20% acrylamide, 8M urea, 45 ⁇ M trisborate buffer, pH 7.0 and / or b) HPLC analysis: Waters GenPak FAX column, gradient CH3CN (400ml), H2O (1, 61 ), NaH 2 PO (3.1 g), NaCl (11.7 g), pH 6.8 (0.1 M NaCl) according to CH3CN
  • * represents a phosphorothioate internucleoside bridge
  • FITC represents a fluorescent marker
  • ON1 to ON 12 were tested in a cell-based assay for their effectiveness in inhibiting the proliferation of REH leukemia cells.
  • ON1, ON2, ON64-ON71 are antisense oligonucleotides that target the translational start region of eg5 mRNA are targeted.
  • ON4 is the 5'-fluorescein labeled analogue of ON1.
  • ON3 is a reference oligonucleotide.
  • Example 2 Determination of the antiproliferative activity of the eg5 antisense oligonucleotides
  • the REH cells human pre-B leukemia cells, DSM ACC 22
  • the A549 tumor cells were in OptiMEM (Gibco BRL) with 10% fetal calf serum (FCS, GIBCO-BRL) at 37 ° C under 5% CO 2 cultured.
  • FCS fetal calf serum
  • the cell density for the assay was approximately 1 x 106 / ml.
  • the oligonucleotides (0.17mM) were mixed with Cellfectin (0.83 mg / ml; Gibco-BRL) for complex formation in order to improve the uptake by the cells.
  • the oligonucleotide / cellfectin complex was incubated with the cells in the absence of serum in 24-well plates for 4 hours.
  • the oligonucleotide / cellfectin complex was then removed and serum was added so that the final concentration was 10%. After incubation for 96 hours at 37 ° C. under 5% CO 2 , the cell density was measured with Casy 1 (from Sch Sharp). For this purpose, the cells in each well were mixed well and immediately diluted 1: 100 with Casyton. The mean values of the cell density were determined from 3 individual wells with the same oligonucleotide concentration. The results of the antiproliferative activity are shown in Figure 1.
  • SEQ ID NO. 21 P. falciparum sequence (partial sequence; Genbank, ID Z98551).
  • PLASMO SEQ GCTTTAATTTTTGTAGATTGAAATTTATTATTATTATTATTATTGT. TGTTGTTGTT
  • PLASMO SEQ TATATTTCTCTTTCTTTCATATTCTTTTAAACTTGTTACACTCATATTTTCTGTATTTAC
  • PLASMO SEQ ATCAAATCTTTTATTATGTTGATTGTTATTTAAATAATTTAATTCTTGATATGTTTCATC 361 420 human. SEQ TATGGGCTATA .... ATTGCAC .... TATCTTTGC. GTATGGC. CAAACT GG
  • PLASMO SEQ TATTGGTTGTATAGGATTATCCGTTGTATTCTTATTATATAGCATATATTCATTTAAGGG
  • PLASMO SEQ TAGATTATTGTGATTAGTTTTTACATTTAATTTATTTTTATCACCTTTATTATTTATATT
  • Illustration 1

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Oligonukleotid oder eines seiner Derivate, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Sequenz aufweist, die einem bestimmten Teil einer humanen eg5 oder einer davon mutierten Form kodierenden Nukleinsäuresequenz entspricht; darüberhinaus betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des Oligonukleotids und dessen Verwendung.

Description

Beschreibung
Oligonukleotide zur Inhibierung der Expression von humanem eg5
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Oligonukleotid oder eines seiner Derivate mit einer Sequenz, die einem bestimmten Teil einer Nukleinsäuresequenz, die humanes eg5 oder eine mutierte Form davon kodiert, entspricht, und die Erfindung betrifft weiterhin eine Methode zur Herstellung des Oligonukleotids und dessen Verwendung.
Während der Mitose hilft ein auf Mikrotubuli basierender Spindelapparat, die duplizierten Chromosomen gleichmäßig auf die Tochterzellen zu verteilen. Dem Kinesin verwandte Motorproteine machen einen Teil der Kräfte aus, die zum Zusammenbau der Spindel und der Aufteilung der Chromosomen erforderlich sind. Die Bildung einer bipolaren mitotischen Spindel erfordert die Aktivität vieler verschiedener Motorproteine. Eines der menschlichen, mit Kinesin verwandten Motorproteine ist humanes eg5, das mit den mitotischen Centrosomen wechselwirkt und von dem gezeigt wurde, daß es für die Bildung der bipolaren Spindel essentiell ist (Blangy et al., Celi (1995) 83, 1159). Die Mikroinjektion von spezifischen anti- human-eg5 Antikörpern blockiert die Centrosomenwanderung und bringt Zellen dazu, in der Mitose anzuhalten.
Eine andere Möglichkeit zur Blockierung der Bildung einer bipolaren Spindel wäre die Inhibierung der eg5-Expression. Ein Weg, eg5-Expression spezifisch zu inhibieren, ist die Verwendung von Antisense-Oligonukleotiden, die gegebenenfalls zur Verbesserung ihrer Eigenschaften modifiziert sein können (E. Uhimann und A. Peyman, Chemical Reviews 90, 543 (1990); S. Agrawal, TIBTECH 1996, 376). Man nimmt an, daß Antisense-Oligonukleotide sich an spezifische Sequenzen der mRNA binden, was zu einem Abbau der mRNA und/oder der Hemmung der Proteinsynthese führt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Oligonukleotid oder eines seiner Derivate, das einem Teil der eg5 kodierenden Sequenz entspricht - vorzugsweise humanem eg5 oder dem eg5 eines Krankheitserregers, z.B. Plasmodium falciparum (Malaria). Vorzugsweise entspricht das Oligonukleotid 8 bis 100 Nukleotiden, besonders bevorzugt 8 bis 20 Nukleotiden der eg5 Sequenz. Das Oligonukleotid oder das Derivat davon bindet sich an die besagte Sequenz und hemmt die Bildung des eg5-Proteins. Die humane eg5-Sequenz ist veröffentlicht worden (Blangy et al., Cell (1995) 83, 1159). SEQ ID NO.: 20 zeigt ein Beispiel einer Sequenz, die humanes eg5 kodiert. SEQ ID NO.: 21 zeigt ein Beispiel einer Plasmodium falciparum eg 5-Sequenz.
Das Oligonukleotid weist vorzugsweise eine Sequenz auf, die einem Teil einer
Nukleinsäure, die humanes eg5 oder Plasmodium falciparum eg5 kodiert, entspricht. Der Begriff "entspricht" bedeutet, daß die Basensequenz des Oligonukleotids zu einem Teil einer Nukleinsäuresequenz, die eg5 kodiert (z.B. Gen, cDNA, mRNA), komplementär ist, was dem Oligonukleotid erlaubt, mit dem "Sense-Teil" der das egδ kodierenden Nukleinsäure zu hybridisieren (sich daran zu binden). Aus diesem
Grund wird es "Antisense-Oligonukleotid" genannt. In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung ist deshalb das Oligonukleotid ein Antisense-Oligonukleotid. In einer weiteren bevorzugten Ausführung der Erfindung ist das Oligonukleotid ein Ribozym. Ein Ribozym ist eine katalytische Nukleinsäure, die mRNA spaltet. Das Ribozym ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe der Hammerhead-Ribozyme (Vaish et al., Nucleic Acids Res. (1998) 26, 5237).
Ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid bindet an einen für die Hybridisierung geeigneten Teil der eg5-mRNA und hemmt die Bildung des eg5-Proteins. Zur Bindung an eg5-mRNA und zur Inhibierung der Expression geeignete
Oligonukleotide sind z.B. auf die Translations-Starterregion von eg5 gerichtet.
Der dem Oligonukleotid entsprechende Teil der eg5 kodierenden Nukleinsäuresequenz hat eine Länge von 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 oder mehr Nukleotiden, und das Oligonukleotid entspricht vorzugsweise einer Länge von 12 Nukleotiden oder 19 Nukleotiden einer eg5 kodierenden Sequenz. Ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid hat also eine Länge von 10 (10mer), 11 (11 mer), 12 (12mer), 13 (13mer), 14 (14mer), 15 (15mer), 16 (16mer), 17 (17mer), 18 (18mer) oder 19 (19mer) Nukleotiden.
In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung hat das Oligonukleotid eine Länge von 12 oder 19 Nukleotiden; solche Oligonukleotide können zum Beispiel eine der Sequenzen SEQ ID NO. 1 , SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9 oder einen Teil davon aufweisen, wobei SEQ ID NO. 1 : 3-'CTTAAGGCAGTACCGCAGC-5'; 5'CGACGCCATGACGGAATTC-3' SEQ ID NO. 2: 3'-ACCACTCTACGTCTGGTAA-5'; 5'-AATGGTCTGCATCTCACCA-3' SEQ ID NO. 3: 3'-GGCAGTACCGCAGCGTCGG-5'; 5'-GGCTGCGACGCCATGACGG-3' SEQ ID NO. 4: 3'-CTTAAGGCAGTA-5'; 5'-ATGACGGAATTC-3' SEQ ID NO. 5: 3'-TAAGGCAGTACC-5'; 5'-CCATGACGGAAT-3' SEQ ID NO. 6: 3'-GGCAGTACCGCA-5'; 5'-ACGCCATGACGG-3' SEQ ID NO. 7: 3'-AGTACCGCAGCG-5'; S'-GCGACGCCATGA-S" SEQ ID NO. 8: 3'-CCGCAGCGTCGG-5'; 5'-GGCTGCGACGCC-3' SEQ ID NO. 9: 3'-GCAGCGTCGGTT-5'; 5'-TTGGCTGCGACG-3' ist.
Ganz besonders bevorzugt ist, daß das Oligonukleotid zur Verbesserung seiner Eigenschaften modifiziert ist; z.B. zur Erhöhung seiner Resistenz gegen Nukleasen bzw. um es gegen Nukleasen resistent zu machen, zur Verbesserung seiner Bindungsaffinität zu einer komplementären eg5 kodierenden Nukleinsäure, z.B. mRNA, oder um seine Aufnahme in die Zelle zu erhöhen.
Die vorliegende Erfindung betrifft deshalb vorzugsweise ein Oligonukleotid, welches eine wie oben angegebene spezifische Sequenz aufweist und welches darüber hinaus im Vergleich zu einer "natürlichen" DNA, die aus den "natürlichen" Nukleosiden Desoxyadenosin (Adenin + ß-D-2'-Desoxyribose), Desoxyguanosin (Guanin + ß-D-2'-Desoxyribose), Desoxycytidin (Cytosin + ß-D-2'-Desoxyribose) und Thymidin (Thymin + ß-D-2'-Desoxyribose ), die durch Phosphodiesterbrücken zwischen den Nukleosiden verbunden sind, besteht, eine oder mehrere chemische Modifikationen aufweist. Die Oligonukleotide können eine oder mehrere Modifikationen des gleichen Typs und/oder Modifikationen eines verschiedenen Typs enthalten; jeder Modifikationstyp kann unabhängig von den anderen aus den für die Modifizierung von Oligonukleotiden bekannten Modifikationstypen ausgewählt sein.
Die Erfindung betrifft auch Derivate der Oligonukleotide, zum Beispiel ihre Salze, insbesondere ihre physiologisch verträglichen Salze. Salze und physiologisch verträgliche Salze sind z.B. beschrieben in Remingtons Pharmaceuticals Science (1985) Mack Publishing Company, Easton, PA (Seite 1418). Derivate bezieht sich auch auf modifizierte Oligonukleotide, die eine oder mehrere Modifikationen enthalten (z.B an bestimmten Nukleotidpositionen und/oder an bestimmten Internukleosidbrücken), Oligonukleotidanaloge (z.B. Polyamid-Nukleinsäuren
(PNAs), Phosphomonoester-Nukleinsäuren (PHONAs = PMENAs), Oligonukleotid- Chimere (z.B. bestehend aus einem DNA- und einem PNA-Teil oder bestehend aus einem DNA- und einem PHONA-Teil)). Derivate bezieht sich auch auf Oligonukleotide, die Allelen und/oder mutierten Formen (Mutanten), von normalem oder natürlichem eg5 entsprechen, z.B. Allelen und/oder Mutanten von humanem eg5 (z.B. bezüglich SEQ ID NO. 20) und Allelen und/oder Mutanten von Plasmodium falciparum eg5 (z.B. in bezug auf SEQ ID NO. 21 ).
Beispiele chemischer Modifikationen sind dem Fachmann bekannt und zum Beispiel in E. Uhlmann und A. Peyman, Chemical Reviews 90 (1990) 543 und "Protocols for Oligonucleotides and Analogs" Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques, S. Agrawal, Hrsg., Humana Press, Totowa, USA 1993 und S.T. Crooke, F. Bennet, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 36 (1996) 107-129; J. Hunziker und C. Leuman (1995) Mod. Synt. Methods, 7, 331-417 beschrieben.
Im Vergleich zu natürlicher DNA kann zum Beispiel eine Phosphodiesterbrücke zwischen Nukleosiden, eine ß-D-2'-Desoxyriboseeinheit und/oder eine natürliche Nukleosidbase (Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin) modifiziert bzw. ausgetauscht sein. Ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid kann eine oder mehrere dieser Modifikationen aufweisen, wobei sich jede Modifikation im Vergleich zu einem aus natürlicher DNA bestehenden Oligonukleotid der gleichen Sequenz an einer bestimmten Phosphodiester-Internukleosidbrücke und/oder an einer bestimmten ß- D-2'-Desoxyriboseeinheit und/oder an einer bestimmten natürlichen Nukieosidbasenposition befindet.
Die Erfindung betrifft zum Beispiel ein Oligonukleotid, das eine oder mehrere Modifikationen enthält, wobei jede Modifikation unabhängig aus der folgenden Liste ausgewählt ist: a) der Austausch einer Phosphodiesterbrücke zwischen Nukleosiden, die sich am 3'- und/oder am 5'-Ende eines Nukleosids befindet, durch eine modifizierte Internukleosidbrücke, b) der Austausch einer sich an dem 3'- und/oder dem 5'-Ende eines Nukleosids befindenden Phosphodiesterbrücke durch eine Dephosphobrücke, c) der Austausch einer Zuckerphosphateinheit aus dem Zuckerphosphatgerüst durch eine andere Einheit, d) der Austausch einer ß-D-2'-Desoxyriboseeinheit durch eine modifizierte Zuckereinheit, e) der Austausch einer natürlichen Nukleosidbase durch eine modifizierte Nukleosidbase, f) die Anbindung an ein Molekül, das die Eigenschaften des Oligonukleotids beeinflußt, g) die Anbindung an ein 2'5'-verbundenes Oligoadenylat oder ein Derivativ davon, gegebenenfalls über einen geeigneten Linker, und h) die Einführung einer 3'-3' und/oder einer 5'-5'-lnversion am 3'- und/oder am 5'-Ende des Oligonukleotids.
Genauere Beispiele für die chemischen Modifikationen eines Oligonukleotids sind a) der Austausch einer Phosphodiesterbrücke zwischen Nukleosiden, die sich am 3'- und/oder am 5 '-Ende eines Nukleosids befindet, durch eine modifizierte Internukleosidbrücke, wobei die modifizierte Internukleosidbrücke zum Beispiel aus Phosphorothioat-, Phosphorodithioat-, NR1Rr-Phosphoramidat-, Boranophosphat-, Phosphat-(Cι-C2ι)-0-Alkylester-, Phosphat-[(C6-Cι2)-aryl-((C1-C2ι)-0-alkyl]ester, (CrC8)-Alkylphosphonat- und/oder (C6-C 2)-Arylphosphonatbrücken und (C7-C-ι2)-α- Hydroxymethylaryl (bekannt z.B. aus WO 95/01363) ausgewählt ist, wobei (C6-Cι2)- Aryl, (C6-C2o)-Aryl und (C6-Cι4)-Aryl gegebenenfalls durch Halogen, Alkyl, Alkoxy,
Nitro, Cyano substituiert sind, und wobei R1 und R1 unabhängig voneinander Wasserstoff, (C Cι8)-Alkyl, (C6-C2o)-Aryl,
(C6-Cι4)-Aryl-(Cι-C8)-Alkyl sind, vorzugsweise Wasserstoff, (C C8)-Alkyl, vorzugsweise (C-ι-C4)-Alkyl und/oder Methoxyethyl, oder
R1 und R1 zusammen mit dem sie tragenden Stickstoffatom einen 5- bis 6-glιedrιgen heterocyclischen Ring bilden, der zusatzlich ein weiteres Heteroatom aus der
Gruppe O, S und N enthalten kann,
b) der Austausch einer sich an dem 3'- und/oder dem 5'-Ende eines Nukleosids befindlichen Phosphodiesterbrücke durch eine Dephosphobrucke (Dephosphobrucken sind zum Beispiel in Uhlmann, E und Peyman, A in "Methods in Molecular Biology", Band 20, "Protocols for Oligonucleotides and Analogs", S Agrawal, Hrsg , Humana Press, Totowa 1993, Kapitel 16, 355ff beschrieben), wobei eine Dephosphobrucke zum Beispiel Formacetal, 3'-Thιoformacetal, Methylhydroxylamin, Oxim, Methylendimethyl-hydrazo, Dimethylensulfon und/oder eine Silylgruppe ist,
c) der Austausch einer Zuckerphosphateinheit (ß-D-2'-Desoxyπbose und die Phosphodiesterbrücke zwischen den Nukleosiden bilden zusammen eine Zuckerphosphateinheit) aus dem Zuckerphosphatgerust (das Zuckerphosphatgerust besteht aus Zuckerphosphateinheiten) durch eine andere Einheit, wobei die andere Einheit zum Beispiel zum Aufbau - eines "Morpholιnodeπvatιv"-Olιgomeren geeignet ist (wie zum Beispiel in E P
Stirchak et al., Nucleic Aαds Res 17 (1989) 6129 beschrieben ist), das heißt z.B der Austausch durch eine Morpho no-Derivativ-Einheit, einer Polyamid-Nukleinsaure ("PNA") (wie zum Beispiel in P E Nielsen et al , Bioconj Chem 5 (1994) 3 und in EP 0672677 A2 beschrieben) geeignet ist, das heißt z B der Austausch durch eine PNA-Gerusteιnheιt, z.B durch
2-Amιnoethylglycιn, einer Phosphonsauremonoester-Nukleinsaure ("PHONA") (wie z B in Peyman et al , Angew Chem Int Ed Eπgl 35 (1996) 2632-2638 und in EP 0739898 A2 beschrieben) geeignet ist; das heißt z.B. der Austausch durch eine PHONA-Gerüsteinheit; d) der Austausch einer ß-D-2'-Desoxyriboseeinheit durch eine modifizierte Zuckereinheit, wobei die modifizierte Zuckereinheit zum Beispiel aus ß-Dribose, α-D- 2'-Desoxyribose, L-2'-Desoxyribose, 2'-F-2'-Desoxyribose, 2'-0-(Cι-C6)-Alkylribose, wobei die bevorzugte 2'-0-(Cι-C6)-Alkylribose 2'-0-Methylribose ist, 2'-0-(C2-C6)- Alkenylribose, 2'-[0-(C1-C6)-Alkyl-0-(C1-C6)-alkyl]ribose, 2'-NH2-2'-Desoxyribose, ß-D-Xylo-furanose, α-Arabinofuranose, 2,4-Didesoxy-ß-D-erythro-hexo-pyranose und carbocyclischen (zum Beispiel in Froehler, J. Am. Chem. Soc. 114 (1992) 8320 beschrieben) und/oder offenkettigen Zuckeranalogen (zum Beispiel in
Vandendriessche et al., Tetrahedron 49 (1993) 7223 beschrieben) und/oder Bicydozuckeranalogen (zum Beispiel in M. Tarkov et al., Helv. Chim. Acta 76 (1993) 481 beschrieben) ausgewählt wird;
e) der Austausch einer natürlichen Nukleosidbase durch eine modifizierte Nukleosidbase, wobei die modifizierte Nukleosidbase zum Beispiel aus Uracil, Hypoxanthin, 5-(Hydroxymethyl)uracil, N2-Dimethylguanosin, Pseudouracil, 5-(Hydroxymethyl)uracil, 5-Aminouracil, Dihydrouracil, 5-Fluoruracil, 5-Fluorcytosin, 5-Chloruracil, 5-Chlorcytosin, 5-Bromuracil, 5-Bromcytosin, 2,4-Diaminopurin, 8-Azapurin, einem substituierten 7-Deazapurin, vorzugsweise 7-Deaza-7- substitutiertem und/oder 7-Deaza-8-substituiertem Purin oder anderen Modifikationen natürlicher Nukleosidbasen ausgewählt wird (modifizierte Nukleosidbasen sind z.B. in EP 0 710 667 A2 und EP 0 680 969 A2 beschrieben);
f) die Anbindung an ein Molekül, das die Eigenschaften des Oligonukleotids beeinflußt, wobei die Anbindung des Oligonukleotids an ein oder mehrere Moleküle, die die Eigenschaften des Oligonukleotids (günstig) beeinflussen (zum Beispiel die Fähigkeit des Oligonukleotids, die Zellmembran zu durchdringen bzw. in eine Zelle einzudringen, die Stabilität gegenüber Nukleasen, die Affinität für eine eg5 kodierende Targetsequenz, die Pharmakokinetik des Oligonukleotids, die Fähigkeit eines Antisense-Oligonukleotids/Ribozyms bzw. eines mit dem Oligonukleotid konjugierten Moleküls, die jeweilige eg5 kodierende Targetsequenz anzugreifen, z.B. die Fähigkeit zur Bindung und/oder zur Quervernetzung, wenn das Oligonukleotid mit der eg5 kodierenden Targetsequenz hybridisiert), wobei als Beispiele für Moleküle, die an ein Oligonukleotid angebunden werden können, Polyiysin, interkalierende Mittel wie Pyren, Acridin, Phenazin oder Phenanthridin, Fluoreszeπzmittel wie Fluorescein, Crosslinker wie Psoralen oder Azidoproflavin, lipophile Moleküle wie (Cι2-C2o)-Alkyl, Lipide wie 1 ,2-Dihexadecyl-rac-glycerin, Steroide wie Cholesterin oder Testosteron, Vitamine wie Vitamin E, Poly- oder Oligoethylenglykol, vorzugsweise über eine Phosphatgruppe (z.B. Triethylenglykolphosphat, Hexaethylenglykolphosphat) an das Oligonukleotid gebunden, (Cι2-C18)-Alkylphosphatdiester und/oder 0-CH2-CH(OH)-0-(C12-Cι8)- Alkyl in Frage kommen, diese Moleküle können am 5'-Ende und/oder am 3'-Ende und/oder innerhalb der Sequenz eingefügt werden, z.B. an einer Nukleosidbase zur Bildung eines Oligonukleotidkonjugats; Verfahren zur Herstellung eines Oligonukleotidkonjugats sind dem Fachmann bekannt und zum Beispiel in Uhlmann, E. & Peyman, A., Chem. Rev. 90 (1990) 543, M. Manoharan in "Antisense Research and Applications", Crooke and Lebleu, Hrsg., CRC Press, Boca Raton, 1993, Kapitel 17, S. 303ff. und EP-A 0 552 766 beschrieben;
g) die Anbindung an ein 2'5'-gebundenes Oligoadenylat, vorzugsweise über ein geeignetes Linkermolekül, wobei das 2'-5'-gebundene Oligoadenylat zum Beispiel aus 2'5'-gebundenem Triadenylat-, 2'5'-gebundenem Tetraadenylat-,
2'5'-gebundenem Pentaadenylat-, 2'5'-gebundenem Hexaadenyltat- oder 2'5'- gebundenem Heptaadenylatmolekülen und deren Derivativen ausgewählt ist, wobei ein 2'5'-gebundenes Oligoadenylat-Derivat zum Beispiel Cordycepin (2'5'-gebundenes 3'-Desoxyadenylat) ist und wobei zum Beispiel Triethylenglykol ein geeigneter Linker ist und wobei das 5'-Ende des 2'5'-gebundenen Oligoadenylats einen Phosphat-, Diphosphat- oder Triphosphatrest tragen muß, in dem eines oder mehrere Sauerstoffatome zum Beispiel durch Schwefelatome ersetzt sein können, wobei die Substitution durch einen Phosphat- oder Thiophosphatrest bevorzugt ist; und
h) die Einführung einer 3'-3'- und/oder einer 5'-5'-lnversion am 3'- und/oder am 5'-Ende des Oligonukleotids, wobei diese Art der chemischen Modifikation dem Fachmann bekannt und zum Beispiel in M. Koga et al., J. Org. Chem. 56 (1991 ) 3757, EP 0 464 638 und EP 0 593 901 beschrieben ist.
Der Austausch einer Zuckerphosphateinheit aus dem Zuckerphosphatgerust durch eine andere Einheit, die z.B. eine PNA-Gerüsteinheit oder eine PHONA-
Gerüsteinheit sein kann, ist vorzugsweise der Austausch eines Nukleotids durch z.B. eine PNA-Einheit oder eine PHONA-Einheit, die bereits natürliche Nukleosidbasen und/oder modifizierte Nukleosidbasen enthält, z.B. eine der modifizierten Nukleosidbasen aus der Gruppe Uracil, Hypoxanthin, 5-(Hydroxymethyl)uracil, N2- Dimethylguanosin, Pseudouracil, 5-(Hydroxymethyl)uracii, 5-Aminouracil, Pseudouracil, Dihydrouracil, 5-Fluoruracil, 5-Fluorcytosin, 5-Chloruracil, 5-Chlorcytosin, 5-Bromuracil, 5-Bromcytosin, 2,4-Diaminopurin, 8-Azapurin, einem substituierten 7-Deazapurin, vorzugsweise 7-Deaza-7-substituiertem und/oder 7-Deaza-8-substituiertem Purin oder anderen Modifikationen einer natürlichen Nukleosidbase (modifizierte Nukleotidbasen sind z.B. beschrieben in EP 0 710 667 A2 und EP 0 680 969 A2).
Auf die Oligonukleotidmodifikationen, die in EP 0 710 667 A2, EP 0 680 969 A2, EP 0 464 638, EP 0 593 901 , WO 95/01363, EP 0 672 677 A2, EP 0 739 898 A2 und EP 0 552 766 beschrieben werden, wird hiermit ausdrücklich Bezug genommen.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung sind eine oder mehrere Phosphodiesterbrücken zwischen den Nukleosiden innerhalb der Oligonukleotidsequenz modifiziert; vorzugsweise sind eine oder mehrere Phosphodiesterbrücken zwischen den Nukleosiden durch Phosphorothioatbrücken zwischen den Nukleosiden und/oder (C6-Ci2)-Arylphosphonatbrücken zwischen den Nukleosiden, vorzugsweise durch α-Hydroxybenzylphosphonatbrücken, in denen die Benzylgruppe vorzugsweise substituiert ist, z.B. durch Nitro, Methyl, Halogen, ersetzt. In einem Nur-Phosphorothioat-Oligonukleotid sind alle Phosphodiesterbrücken zwischen den Nukleosiden durch Phosphorothioat modifiziert. Vorzugsweise betrifft die Erfindung ein Oligonukleotid, in dem nicht alle Phosphodiesterbrücken zwischen den Nukleosiden einheitlich mit Phosphorothioat (Phosphorothioatbrücken zwischen den Nukleosiden) modifiziert sind. Vorzugsweise weist wenigstens eine Internukleosidbrücke eine andere Modifikationsart auf, oder sie ist nicht modifiziert. Die Erfindung betrifft insbesondere ein Oligonukleotid, welches zusätzlich wenigstens eine andere Modifikationsart enthält. In einer weiteren besonderen Ausführungsform der Erfindung sind eine oder mehrere Nukleoside (ß-D-2 '-Desoxyribose und/oder Nukleosidbase) innerhalb der Oligonukleotidsequenz modifiziert; vorzugsweise ist die ß-D-2 '-Desoxyribose gegen 2'-0-(CrC6)-Alkylribose, vorzugsweise durch 2'-0-Methylribose, ausgetauscht und/oder die Nukleosidbase ist gegen 8-Azapurin, 7-Deaza-7-substituiertes Purin und/oder 7-Deaza-8-substitutiertes Purin ausgetauscht (Purin: Adenin, Guanin).Vorzugsweise betrifft die Erfindung ein Olignonukieotid, in dem nicht alle Nukleoside einheitlich modifiziert sind. Vorzugsweise betrifft die Erfindung ein Oligonukleotid, das zusätzlich wenigstens eine andere Modifikationsart enthält.
In einer weiteren besonderen Ausführungsform der Erfindung sind ein oder mehrere Zuckerphoshateinheiten aus dem Zucker-Phosphat-Gerüst durch PNA-
Gerüsteinheiten, vorzugsweise durch 2-Aminoethylglycineinheiten, ausgetauscht. Vorzugsweise sind die ausgetauschen Zuckerphosphateinheiten zumindest zu einem gewissen Grad miteinander verbunden. Vorzugsweise betrifft die Erfindung ein Oligonukleotid, in dem nicht alle Zuckerphosphateinheiten einheitlich ausgetauscht sind. Die Erfindung betrifft insbesondere chimere Oligonukleotide, z.B. solche, die aus einem oder mehreren PNA-Teilen und einem oder mehreren DNA-Teilen zusammengesetzt sind. Mögliche Beispiele für solche chimeren Oligonukleotide sind die folgenden Modifikationsmuster, die nicht dazu dienen, die Erfindung einzuschränken: DNA-PNA, PNA-DNA, DNA-PNA-DNA, PNA-DNA-PNA, DNA-PNA-DNA-PNA, PNA-DNA-PNA-DNA. Ähnliche Muster wären für aus
DNA-Teilen und PHONA-Teilen zusammengesetzte chimere Moleküle möglich, z.B. DNA-PHONA, PHONA -DNA, DNA- PHONA -DNA, PHONA -DNA- PHONA, DNA- PHONA -DNA- PHONA, PHONA -DNA- PHONA -DNA. Zusätzlich sind natürlich auch chimere Moleküle aus drei verschiedenen Teilen wie DNA-Teil(en), PHONA-Teil(en) und PNA-Teil(en) möglich. Vorzugsweise betrifft die Erfindung ein Oligonukleotid, das zusätzlich wenigstens eine andere Modifikationsart enthält. In einer weiteren besonderen Ausführungsform der Erfindung ist das 3'-Ende und/oder das 5'-Ende des Oligonukleotids mit einem (Cι2-C18)-Ali'ylrest, vorzugsweise einem Cι6-Alkylrest, einem Triethylenglykolrest oder einem Hexaethylenglykolrest verbunden - diese Reste sind vorzugsweise über eine Phosphatgruppe an das Oligonukleotid gebunden. Die Erfindung betrifft vorzugsweise ein Oligonukleotid, in dem nicht beide Enden (das 3'- und das 5 '-Ende) (gleichermaßen) modifiziert sind. Vorzugsweise betrifft die Erfindung ein Oligonukleotid, das zusätzlich wenigstens eine andere Modifikationsart enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind nur bestimmte Positionen innerhalb einer Oligonukleotidsequenz modifiziert (z.B. teilweise modifiziertes Oligonukleotid). Teilweise modifizierte Oligonukleotide werden in einigen Schriften auch als minimal modifizierte Oligonukleotide bezeichnet. Innerhalb der Sequenz kann eine Modifikation in bestimmten Positionen lokalisiert sein (bei bestimmten Nukleotiden, bei bestimmten Nukleosiden, bei bestimmten Nukleosidbasen, bei bestimmten Internukleosidbrücken).
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung wird ein teilweise modifiziertes Oligonukleotid hergestellt, indem nur einige der Phosphodiesterbrücken durch modifizierte Internukleosidbrücken, z.B. Phosphorothioatbrücken und/oder α-Hydroxybenzylphosphonatbrücken, ersetzt werden. Die Erfindung beinhaltet insbesondere solche Oligonukleotide, die nur zu einem gewissen Grad modifiziert sind.
Insbesondere betrifft die Erfindung ein Oligonukleotid, bei dem 1 bis 5 terminale Nukleotideinheiten am δ'-Ende und/oder am 3'-Ende durch die Modifikation von Internukleosidbrücken, die sich am 5'- und/oder am 3'-Ende des entsprechenden Nukleosids befinden, geschützt sind, vorzugsweise durch Austausch der Phosphodiesterbrücken zwischen den Nukleosiden durch Phosphorothioatbrücken und/oder α-Hydroxybenzylphosphonatbrücken. Ganz besonders bevorzugt sind die 1 bis 5 terminalen Nukleotideinheiten am 3'-Ende des Oligonukleotids durch modifizierte Internukleosidbrücken, die sich am 5'- und/oder am 3'-Ende der entsprechenden Nukleoside befinden, geschützt. Gegebenenfalls sind die 1 bis 5 terminalen Nukleotideinheiten am 5'-Ende des Oligonukleotids zusätzlich geschützt durch modifizierte Internukleosidbrücken, die sich am 5'- und/oder am 3'-Ende des entsprechenden Nukleosids befinden. Gegebenenfalls kann das Oligonukleotid zusätzliche Modifikationen an anderen Positionen enthalten. Darüber hinaus betrifft die Erfindung ein Oligonukleotid, bei dem wenigstens ein internes Pyrimidinnukleosid und/oder eine sich am 5'-Ende und/oder am 3'-Ende dieses Pyrimidinnukleosids (ein Nukleosid mit einer Pyrimidinbase wie Cytosin, Uracil, Thymin) befindliche Internukleosidbrücke modifiziert ist, vorzugsweise durch Austausch der Phosphodiesterbrücke(n) zwischen den Nukleosiden durch eine/mehrere Phosphorothioatbrücke(n) und/oder eine/mehrere α- Hydroxybenzylphosphonatbrücke(n).
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind 1 bis 5 terminale Nukleotideinheiten am 5'-Ende und/oder am 3'-Ende des Oligonukleotids durch modifizierende Internukleosidbrücken, die sich am 5'- und/oder am 3'-Ende des entsprechenden Nukleosids befinden, geschützt, wobei zusätzlich wenigstens ein internes Pyrimidinnukleosid und/oder eine sich am 5'-Ende dieses Pyrimidinnukleosids und/oder am 3'-Ende dieses Pyrimidinnukleosids befindende Internukleosidbrücke modifiziert ist.
Das Prinzip von teilweise modifizierten Oligonukleotiden ist z.B. in A. Peyman, E. Uhlmann, Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 377 (1996) 67-70 und in EP 0 653 439 beschrieben. Auf diese Schriften wird hiermit ausdrücklich Bezug genommen. In diesem Fall sind 1-5 terminale Nukleotideinheiten am 5'-Ende und/oder am 3'-Ende geschützt, z.B. sind die Phosphodiesterbrücken zwischen den Nukleosiden, die sich am 3'- und/oder am 5'-Ende der entsprechenden Nukleoside befinden, zum Beispiel gegen Phosphorothioatbrücken zwischen Nukleosiden ausgetauscht. Zusätzlich ist vorzugsweise wenigstens eine interne Pyrimidinnukleosidposition (bzw. Nukleotidposition) modifiziert; vorzugsweise ist/sind die 3'- und/oder die 5'-lnternukleosidbrücke(n) eines Pyrimidinnukleosids modifiziert/ausgetauscht, zum Beispiel durch eine/mehrere Phosphorothioatbrücke(n) zwischen den Nukleosiden. Teilweise modifizierte Oligonukleotide weisen besonders vorteilhafte Eigenschaften auf; zum Beispiel sind sie in besonders hohem Grade stabil gegenüber Nukleasen, und dabei nur minimal modifiziert. Auch haben sie eine beträchtlich reduzierte Neigung zu non-antisense effects, die häufig mit der Verwendung von Nur- Phosphorothioat-Oligonukleotiden verbunden sind (Stein und Krieg (1994) Antisense Res. Dev. 4, 67). Teilweise modifizierte Oligonukleotide zeigen auch eine höhere Bindungsaffinität als Nur-Phosphorothioate.
Die Erfindung betrifft insbesondere teilweise/minimal modifizierte Oligonukleotide.
SEQ ID NO. 10: 3-'C*T*T*A A G G C*A G T*A C*C G*C A G*C~5\ (K3) 5'-C G A C*G*C*C*A*T G A*C G G A A*T*T*C-3';
SEQ ID NO. 11 : 3'-A*C*C*A C*T C*T A C*G T*C*T G G*T A*A-5', (K4)
5'-A*AT*GGT*C*TG*CAT*CT*CA*C*C*A-3'; SEQ ID NO. 12: 3'-G*G*C*A G*T A C*C G C*A G*C G T*C G*G-5', (K6) 5'-G*G C*T G C*G A*C G C*C A T*G A*C*G*G-3"; SEQ ID NO. 13: 3*-C*T*T*A A G G*C A G*T*A-5',
5'-A*T*G A C*G G A A*T*T*C-3'; SEQ ID NO. 14: 3'-T*A*A G G C*A G*T A*C*C-5', 5'-C*C*A T*G A*C G G A*A*T-3'; SEQ ID NO. 15: 3'-G*G*C A G*T A C*C*G C*A-5', 5'-A*C G*C*C A T*G A C*G*G-3';
SEQ ID NO. 16: 3'-A*G*T A C*C G*C A G*C*G-5*, 5'-G*C*G A C*G C*C A T*G*A-3'; SEQ ID NO. 17: 3'-C*C*G*C A G*C G T*C G*G-5', 5'-G*G C*T G C*G A C*G*C*C-3"; SEQ ID NO. 18 3'-G*C*A G C*G T*C G G*T*T-5',
5'-T*T*G G C*T G C*G A*C*G-3\
wobei " * " die Stelle einer Internukleosidbrücken-Modifikation bezeichnet; " * " ist vorzugsweise eine Phosphorothioat-Internukleosidbrücke.
Ein weiteres Beispiel einer besonderen Ausführungsform der Erfindung betrifft ein teilweise modifiziertes Oligonukleotid, bei dem ein Nukleosid modifiziert ist, z.B. eine Modifikation einer Nukleosidbase und/oder eine Modifikation einer ß-D-2 '- Desoxyriboseeinheit. Vorzugsweise ist eine ß-D-2 '-Desoxyribose gegen 2'-O-(Cι- C6)-Alkyiribose ausgetauscht, ganz besonders bevorzugt ist der Austausch gegen 2'-0-Methylribose (Austausch eines ß-D-2'-Desoxyribonukleosids gegen ein 2'-0-Methylribonukleosid).
Zusätzlich zu einer Modifikationsart kann das Oligonukleotid erfindungsgemäß auch andere Modifikationsarten aufweisen.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung enthält das Oligonukleotid daher modifizierte Internukleosidbrücken an bestimmten Positionen und zusätzlich Modifikationen eines Nukleosids an bestimmten Positionen, vorzugsweise Austausch von ß-D-2 '-Desoxyribose. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Internukleosidmodifikation der Austausch einer Phosphodiesterbrücke gegen eine Phosphorothioatbrücke, und die Modifikation der ß-D-2 "-Desoxyribose ist der Austausch gegen 2'-0-Methylribose; in diesem Fall ist das Oligonukleotid ein chimeres Oligonukleotid, das aus modifizierten und nicht modifizierten DNA- und RNA-Teilen zusammengesetzt ist - welche die
2'-0-Methylribonukleoside und ß-D-2'-Desoxyribonukleoside sowie Phosphor- diester- und Phosphorothioatbrücken zwischen Nukleosiden enthalten.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Oligonukleotid, das einen oder mehrere (Cι2-C-ι8)-Alkylreste aufweist, vorzugsweise einen
C16-Alkylrest an seinem 3'- und/oder seinem 5'-Ende. Ein (Cι2-C18)-Alkyirest kann z.B. als Phosphodiester gebunden sein, wie in EP 0 552 766 A2 beschrieben ist (auf EP 0 552 766 A2 wird hiermit ausdrücklich Bezug genommen), oder als 3'-Phosphodiester von 0-CH2-CH(OH)-0-(Cι2-C18)-Alkyl. Bevorzugt ist ein Oligonukleotid, bei dem ein Cι6-Alkylrest an das 3'- und/oder 5'-Ende gebunden ist.
Die Erfindung betrifft auch ein Oligonukleotid, in dem das 3'- und/oder das 5'-Ende mit einem Oligoethylenglykolrest verbunden ist, vorzugsweise einem Triethylenglykol oder einem Hexaethylenglykol, ganz besonders bevorzugt über einen Phosphodiester (Tri- oder Hexaethylenglykolphosphatester). Natürlich kann ein solches Oligonukleotid auch noch weitere Modifikationen enthalten. In einer weiteren besonderen Ausführungsform der Erfindung ist das Oligonukleotid über einen Linker mit einem 2'5'-gebundenen Oligoadenylat-5'-(thio)phosphat verbunden. Bei dem Linker kann es sich z.B. um einen Oligoethylenglykolphosphat-, vorzugsweise einen Triethylenglykolphosphat-, Tetraethylenglykolphosphat- oder Hexaethylenglykolphosphatrest, handeln. Das 2'5'-gebundene Oligoadenylat ist vorzugsweise über sein 2'-Ende als Tetra- oder als Pentaadenylat gebunden, dessen 5'-Hydroxyfunktion durch einen Phosphat- oder Thiophosphatrest substituiert ist. Es ist bekannt, daß 2'5'-Oligoadenylat RNase L induziert, die Target-mRNA zu spalten (Torrence et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. (1993) 90, 1300). Das 2'5'- Oligoadenylat dient dazu, Ribonuklease L (RNase L) zu aktivieren, die dann die eg5 mRNA abbaut. Anstelle eines 2'5'-gebundenen Adenylats ist es auch möglich, z.B. ein 2'5'-gebundenes 3'-Desoxyadenylat, abgeleitet von dem Nukleosidanalog Cordycepin, einzuführen. In diesem Fall ist der Oligonukleotidteil, der zur Targetnukleinsäure komplementär ist, vorzugsweise an bestimmten Positionen durch 2'-0-(Cι-C6)-Alkylribonukleosid (vorzugsweise 2'-0-Methylribonukleosid) oder durch PNA modifiziert.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft den Austausch einer oder mehrerer natürlicher Nukleosidbase(n) durch nichtnatürliche bzw. modifizierte Nukleosidbasen, vorzugsweise durch 8-Azapurine und/oder 7-Deaza-7-substituierte Purine und/oder 7-Deaza-8-substituierte Purine, wie z.B. in EP 0 171 066 und EP 0 680 969 beschrieben.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann das Nukleosid 3'3'- und/oder 5'5'-lnversionen am 3'- und/oder 5'-Ende aufweisen, wie zum Beispiel in EP 0 464 638 und EP 0 593 901 beschrieben.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft den Austausch einer oder mehrerer Phosphodiesterbrücken gegen α-Hydroxybenzylphosphonatbrücken, wie in WO 95/01363 beschrieben. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält das Oligonukleotid eine Modifikation des Zuckerphosphatgerüstes, vorzugsweise durch PNA-Einheiten.
Es sind auch andere Modifikationsmuster möglich, z.B. DNA-PNA-DNA, PNA-DNA. Vergleichbare Modifikationsmuster sind auch für PHONA/DNA-Chimeren möglich. Diese Modifikationsmuster können mit jeder anderen Modifikationsart kombiniert werden, und ähnliche Modifikationsmuster sind natürlich auch für andere erfindungsgemäße Oligonukleotide möglich.
Die obengenannten konkreten Oligonukleotide - bestimmte Sequenz, bestimmter Modifikationstyp/bestimmte Modifikationstypen an bestimmten Positionen (spezifisches "Modifikationsmuster") stellen nur Beispiele für verschiedene Ausführungsformen der Erfindung dar. Die Erfindung wird durch diese konkreten Oligonukleotide nicht eingeschränkt. Andere Kombinationen von Sequenz und Modifikationsmuster sind gleichfalls möglich.
Ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid inhibiert spezifisch die Expression des Targetproteins (d.h. eg5) bzw. der Targetsequenz (einer Nukleinsäure, die eg5 kodiert, vorzugsweise eg5 mRNA). Ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid hemmt vorzugsweise spezifisch die Expression von eg5. Dies hat eine Absenkung der eg5-Proteinkonzentration im Vergleich zu einer unbehandelten Expression zur Folge. Die Spezifität kann zum Beispiel durch die Bestimmung der Wirkung eines erfindungsgemäßen Oligonukleotids auf die eg5-Expression im Vergleich zur Wirkung desselben Oligonukleotids auf die beta-Actin-Expression auf der mRNA- und/oder der Proteinebene demonstriert werden. Nach Behandlung mit einem erfindungsgemäßen Oligonukleotid war nur die eg5-mRNA- und/oder die eg5-Proteinkonzentration reduziert, während z.B. beta-Actin-(ein Haushaltsprotein)mRNA- und/oder beta-Actin-Proteinkonzentration unverändert blieb.
Ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid ist vorzugsweise dazu in der Lage, die Expression von eg5 in Humanzellen effektiv zu inhibieren, und/oder hat die Fähigkeit, das Wachstum von Tumoren in Wirbeltieren zu inhibieren. Ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid reduziert vorzugsweise die eg5-mRNA- und/oder -Proteinkonzentration in Tumoren von behandelten Individuen im Vergleich zu unbehandelten Individuen. Ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid verringert vorzugsweise die Größe eines Tumors in einem Wirbeltier, z.B. in Mäusen, im Vergleich zu unbehandelten Mäusen bzw. im Vergleich zu der vor der Behandlung bestimmten Größe des Tumors in demselben Tier.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Nukleotides. Ein Herstellungsverfahren beinhaltet die chemische Synthese des Oligonukleotids. Die chemische Synthese wird vorzugsweise mittels einer für die Verwendung für die Synthese von Oligonukleotiden bekannten Standardmethode durchgeführt, z.B. der Phosphoramiditmethode nach Caruthers (1983) Tetrahedron Letters 24, 245, der H-Phosphonatmethode (Todd et al. (1957) J. Chem. Soc. 3291 ) oder der Phosphotriestermethode (Sonveaux (1986) Bioorg. Chem. 14, 274; Gait, M.J. Oligonucleotide Synthesis, A practical Approach", IRL Press, Oxford, 1984) oder verbesserten oder veränderten Methoden, die sich von diesen Standardverfahren ableiten. Ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid kann zum Beispiel wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt werden. Ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid wird vorzugsweise an einer Festphase synthetisiert, indem in geeigneterWeise geschützte Monomere (z.B. Nukleoside) kondensiert werden, um Internukleosidbrücken zwischen diesen Monomeren zu bilden. Die Erfindung betrifft z.B. ein Verfahren zur Herstellung eines Oligonukleotids oder eines Derivates davon, wobei eine Nukleotideinheit mit einer 3'- oder einer 2'-terminalen Phosphor (V)- Gruppe und einer freien 5'-Hydroxyl- oder Mercaptogruppierung mit einer weiteren Nukleotideinheit mit einer Phosphor (III)- oder einer Phosphor (V)-Gruppierung in der 3'-Position, oder deren aktivierten Derivaten, umgesetzt wird, und wobei gegebenenfalls Schutzgruppen verwendet werden, die vorübergehend in das Oligonukleotid eingeführt werden können, um andere Funktionen zu schützen, und die nach der Synthese entfernt werden, und das von der Festphase abgespaltene Oligonukleotid gegebenenfalls in ein physiologisch unbedenkliches Salz umgewandelt werden kann. Zur Synthese eines modifizierten Oligonukleotids werden die Standardmethoden in gewissem Grade variiert. Diese Variationen sind dem Fachmann bekannt, und sie sind z.B. in Agrawal S. "Protocols for oligonucieotides and analogs" (1993, Human Press Inc., Totowa, New Jersey) beschrieben. Die Herstellung modifizierter Oligonukleotide ist ebenfalls in EP 0 710 667, EP 0 680 969, EP 0464 638, EP 0 593 901 , WO 95/01363, EP 0 672 677, EP 0 739 898 und EP 0 552 766 beschrieben. Auf die in den obengenannten Schriften beschriebenen Methoden zur Herstellung modifizierter Oligonukleotide wird hiermit ausdrücklich Bezug genommen.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Inhibierung der Expression von eg5 und/oder zur Modulation der Expression einer eg5 kodierenden Nukleinsäure, wobei ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid mit einer eg5 kodierenden Nukleinsäure (z.B. mRNA, cDNA) in Kontakt gebracht wird und das Oligonukleotid mit dieser eg5 kodierenden Nukleinsäure hybridisiert wird.
Daher betrifft die Erfindung auch ein Verfahren, bei dem das Oligonukleotid mit einer eg5 kodierenden Nukleinsäure (z.B. mRNA; cDNA) in Kontakt gebracht wird, zum Beispiel indem das Oligonukleotid mittels bekannter Methoden in eine Zelle eingefügt wird, zum Beispiel durch Inkubation von Zellen mit dem obengenannten Oligonukleotid oder einer Formulierung desselben - solch eine Formulierung kann Aufnahmeverbesserer, wie Lipofectin, Lipofectamin, Cellfectin oder Polykationen (z.B. Polylysin) enthalten.
So wird zum Beispiel ein Oligonukleotid, das zuvor mit Cellfectin z.B. für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert wurde, dann für ungefähr 5 Stunden oder weniger mit einer Zelle inkubiert, um das Oligonukleotid in die Zelle einzuschleusen. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung des Oligonukleotids, vorzugsweise als Antisense-Oligonukleotid (Bindung des Oligonukleotids an eine eg5 kodierende mRNA) oder als Ribozym (Bindung an eine eg5 kodierende mRNA und Spaltung dieser mRNA). In einer weiteren besonderen Ausführungsform der Erfindung kann das Oligonukleotid verwendet werden, um die Spaltung der eg5 kodierenden mRNA durch RNase H zu induzieren, was zu einer verminderten eg5-Expression führt. Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Oligonukleotids zur Inhibierung der Bildung einer bipolaren mitotischen Spindel und somit zur Inhibierung von Zellproliferation, insbesondere Tumorwachstum.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung des Oligonukleotids als Arzneimittel, und die Verwendung des Oligonukleotids zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung. Insbesondere kann das Oligonukleotid in einer pharmazeutischen Zubereitung verwendet werden, die zur Prävention und/oder zur Behandlung von Krankheiten, die mit der Expression von eg5 assoziiert sind, oder die durch die Inhibierung von eg5-Expression geheilt werden können, eingesetzt wird.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine pharmazeutische Zubereitung, die ein Oligonukleotid und/oder dessen physiologisch unbedenkliche Salze zusammen mit pharmazeutisch unbedenklichen Trägerstoffen oder Hilfsmitteln enthält.
Die Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zubereitung, die wenigstens ein erfindungsgemäßes Nukleotid enthält, welches zur Behandlung von Krankheiten, die durch die Inhibierung von eg5-Expression geheilt werden können, wie Restenosis und Krebs, verwendet werden kann.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung, wobei ein oder mehrere erfindungsgemäße Oligonukleotide mit physiologisch unbedenklichen Trägerstoffen und gegebenenfalls zusätzlichen Substanzen, z.B. gegebenenfalls mit geeigneten Additiven und/oder Hilfsstoffen, gemischt werden.
Die Erfindung betrifft insbesondere die Verwendung eines Oligonukleotids oder einer daraus hergestellten pharmazeutischen Zubereitung zur Behandlung von Krebs, z.B. zur Inhibierung von Tumorwachstum und Tumormetastase. Das Oligonukleotid oder eine daraus hergestellte pharmazeutische Zubereitung kann zum Beispiel zur Behandlung von festen Tumoren, wie Brustkrebs, Lungenkrebs, Kopf- und Halskrebs, Hirnkrebs, Bauchkrebs, Dickdarmkrebs, kolorektales Karzinom, Speiseröhrenkrebs, Magen-Darm-Krebs, Gliatumor, Leberkrebs, Zungenkrebs, Neuroblastom, Osteosarkom, Eierstockkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Retinoblastom, Wilms-T umor, multiples Myelom verwendet werden, und zur Behandlung von Hautkrebs, wie Melanom, zur Behandlung von Lymphknotentumoren und Blutkrebs. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung eines erfindunggemäßen Oligonukleotids oder einer daraus hergestellten pharmazeutischen Zubereitung zur Inhibierung der eg5-Expression und/oder zur Inhibierung der Akkumulation von Ascitenflüssigkeit und Pleuraergüssen bei verschiedenen Krebsarten, z.B. Brustkrebs, Lungenkrebs, Kopfkrebs, Halskrebs, Hirnkrebs, Bauchkrebs, Dickdarmkrebs, kolorektalem Karzinom, Speiseröhrenkrebs, Magen-Darm-Krebs, Gliatumor, Leberkrebs, Zungenkrebs, Neuroblastom, Osteosarkom, Eierstockkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Retinoblastom, Wilms-Tumor, multiples Myelom, Hautkrebs, Melanom, Lymphknotenkrebs und Blutkrebs. Aufgrund der hemmenden Wirkung auf die eg5-Expression kann ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid bzw. eine daraus hergestellte pharmazeutische Zusammensetzung die Lebensqualität verbessern.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung eines Oligonukleotids oder einer pharmazeutischen Zubereitung davon, z.B. zur Behandlung von Krebs oder zur Verhinderung von Tumormetastase, in Verbindung mit anderen Arzneimitteln und/oder anderen Therapiemaßnahmen, z.B. mit bekannten Arzneimitteln und/oder bekannten Therapiemaßnahmen, wie zum Beispiel denen, die gegenwärtig zur Behandlung von Krebs und/oder zur Verhinderung von Tumormetastase angewandt werden. Bevozugt ist eine Kombination mit Bestrahlungstherapie und chemotherapeutischen Mitteln wie Cisplatin, Cyclophosphamid, 5-Fluoruracil, Adriamycin, Daunorubicin oderTamoxifen.
Das Oligonukleotid und/oder sein physiologisch unbedenkliches Salz kann einem Tier, vorzugsweise einem Säugetier und insbesondere einem Menschen allein, in einer Mischung mit einem anderen Oligonukleotid (oder seinem physiologisch unbedenklichen Salz) oder in Form einer pharmazeutischen Zubereitung verabreicht werden, die die topische, perkutane, parenterale oder enterale Verwendung zuläßt und die als aktiven Bestandteil eine wirksame Dosis wenigstens eines Oligonukleotids, zusätzlich zu üblichen pharmazeutisch unbedenklichen Trägerstoffen und Hiifsstoffen, enthält. Solch eine pharmazeutische Zubereitung enthält normalerweise ungefähr 0,1 bis 90 Gew.-% des/der therapeutisch aktiven Oligonukleotids/Oligonukleotide. Die Dosis kann in weiten Bereichen variiert werden und muß jeweils auf die individuellen Umstände angepaßt werden. Zur Behandlung von Schuppenflechte wird ein topischer Gebrauch bevorzugt. Im Fall von Krebs sind Infusionen, orale und rektale Verabreichung oder nasale Verabreichung in einem Aerosol, vorzugsweise im Fall von Lungenkrebs, bevorzugt, während im Fall von diabetischer Retinopathie eine topische, intravitreale und orale Verabreichung bevorzugt ist.
Eine pharmazeutische Zubereitung kann in an sich bekannter Weise hergestellt werden (z.B. Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publ. Co., Easton, PA (1985)), unter Verwendung von pharmazeutisch inerten anorganischen und/oder organischen Trägerstoffen. Lactose, Maisstärke und/oder deren Derivate, Talk, Stearinsäure und/oder deren Salze, usw., können zum Beispiel zur Herstellung von Pillen, Tabletten, Filmtabletten und Hartgelatinekapseln verwendet werden. Beispiele für Trägerstoffe für Weichgelatinekapseln und/oder Zäpfchen sind Fette, Wachse, halbfeste und flüssige Polyole, natürliche und/oder gehärtete Öle, usw. Beispiele für geeignete Trägerstoffe zur Herstellung von Lösungen und/oder Sirupen sind Wasser, Saccharose, Invertzucker, Glukose, Polyole, usw. Geeignete Trägerstoffe zur Herstellung von Injektionslösungen sind Wasser, Alkohole, Glycerin, Polyole, Pflanzenöle, usw. Geeignete Trägerstoffe für Mikrokapseln, Implantate und/oder Stäbe sind Mischpolymere von Glykolsäure und Milchsäure. Zusätzlich gibt es Liposomformulierungen, die z.B. in N. Weiner (Drug Develop Ind Pharm 15 (1989) 1523), "Liposome Dermatics" (Springer Verlag 1992) und Hayashi (Gene Therapy 3 (1996) 878) beschrieben sind. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann gleichfalls eine Formulierung umfassen, die die orale Verfügbarkeit des Oligonukleotids erhöht, wie Stoffe zur Verbesserung der Aufnahme über den Darm, z.B. Mannit, Harnstoff, Salze der Gallensäure, wie CDCA (Chenodesoxycholat) (2 %).
Auch eine dermale Applikation ist möglich, zum Beispiel unter Verwendung von ionophoretischen Methoden und/oder mit Hilfe von Elektroporation. Darüberhinaus können Lipofectine und andere Trägersysteme, zum Beispiel die in der Gentherapie verwendeten, eingesetzt werden. Besonders geeignet sind Systeme, die in hocheffizienter Weise die Einschleusung von Oligonukleotiden in eukaryontische Zellen oder in den Kern von eukaryontischen Zellen ermöglichen. Eine pharmazeutische Zubereitung kann auch aus zwei oder mehr verschiedenen Oligonukleotiden und/oder ihren physiologisch unbedenklichen Salzen und darüberhinaus, zusätzlich zu wenigstens einem Oligonukleotid, aus einem oder mehreren verschiedenen therapeutischen Wirkstoffen bestehen. Zusätzlich zu den Wirk- und Trägerstoffen kann eine pharmazeutische Zubereitung auch Zusatzstoffe wie Füllstoffe, Streckmittel, Sprengmittel, Bindemittel, Gleitmittel, Netzmittel, Stabilisatoren, Emulgiermittel, Konservierungsstoffe, Süßstoffe,
Farbstoffe, Geschmacksstoffe oder Aromen, Verdickungsmittel, Verdünnungsmittel oder Puffersubstanzen enthalten, und zusätzlich Lösungsmittel und/oder lösungsvermittelnde Mittel und/oder Mittel zum Erzielen einer Retardwirkung, und auch Salze zur Änderung des osmotischen Drucks, Beschichtungsmittel und/oder Antioxidantien.
Beispiele:
Beispiel 1 : Oligonukleotidsynthese
Oligonukleotide (ON s) wurden mit Hilfe eines Applied Biosystems 394 DNA-Synthesizers (Perkin Eimer Applied Biosystems, Inc., Foster City, USA) und Standardphosphoramiditchemie synthetisiert. Nach der Kopplung wurden durch Schwefelung unter Verwendung des Beaucage-Reagens und anschließender Verkappung mit Acetanhydrid und N-Methylimidazol Phosphorothioatbindungen eingeführt. Nach Abspaltung von der Festphase und abschließender Entschützung durch Behandlung mit konzentriertem Ammoniak wurden die ON s durch Polyacrylamidgelelektrophorese gereinigt. Die 2'-O-Mef 7y/-modifizierten ON s wurden hergestellt, indem die Standardphosphoramidite in dem entsprechenden Zyklus gegen 2'-0-Methylribonukieosid-Phosphoramidite ausgetauscht wurden. Alle ON s wurden durch Elektrospray-Massenspektroskopie mit negativen Ionen (Fisons Bio-Q) analysiert, die in allen Fällen die berechnete Masse bestätigte. Die C16-modifizierten Oligonukleotide wurden unter Verwendung von Hexadecyioxy- (cyanoethoxy)-N,N-diisopropyl-aminophosphan anstelle eines Standardamidits als Phosphitylierungsreagens im letzten Schritt der Oligonukleotidsynthese oder ausgehend von einer entsprechend derivatisierten Festphase synthetisiert. Der Triethylenglykol-Linker ist im Handel von der Glen Research Corporation erhältlich. Die 2'-Phosphoramidite von Adenosin und Cordycepin wurden von der Chem. Genes Corporation bzw. Chemogen Corporation bezogen. Die Einführung von 5'-Phosphaten oder Thiophosphatresten wurde wie zuvor beschrieben ausgeführt (Uhlmann und Engels (1986) Tetrahedron Lett. 27, 1023). Die PNA-DNA-Chimeren wurden wie in EP 0 672 677 beschrieben hergestellt.
Die Oligonukleotide wurden mittels a) Analytischer Gelelektrophorese in 20%igem Acrylamid, 8M Harnstoff, 45μM Trisboratpuffer, pH 7,0 und/oder b) HPLC-Analyse: Waters GenPak FAX-Säule, Gradient CH3CN (400ml), H2O (1 ,61), NaH2P0 (3,1g), NaCI (11 ,7g), pH6,8 (0,1 M an NaCI) nach CH3CN
(400ml), H20 (1 ,61), NaH2P04 (3,1g), NaCI (17,53g), pH6,8 (1 ,5M an NaCI) und/oder c) Kapillarelektrophorese unter Verwendung einer Beckmann eCApT U100P Gel-Kapillarsäule, 65 cm Länge, 100 mm innerer Durchmesser, wobei sich das Fenster 15 cm von dem einen Ende befindet, Puffer 140 μM Tris, 360mM
Borat, 7M Harnstoff und/oder d) Elektrospray-Massenspektrometrie mit negativen Ionen, die in allen Fällen die erwarteten Massenwerte bestätigte, analysiert.
Die Methoden zur Analyse-von Oligonukleotiden gemäß a), b), c) und d) sind dem Fachmann bekannt. Diese Methoden werden zum Beispiel in Schweitzer und Engels "Analysis of oligonucleotides" (in "Antisense - from technology to therapy", ein Labor-Handbuch und Lehrbuch, Schlingensiepen et al. Hrsg., Biol. Science Vol. 6 (1997) S. 78 - 103) beschrieben.
Die folgenden Oligonukleotide wurden hergestellt (siehe Beschreibung) und getestet: ON1:3-'C*T*T*AAGGC*AGT*AC*CG*CAG*C (K3) SEQ ID NO.10
ON2: 3'-A*C*C*A C*T C*T A C*G T*C*T G G*T A*A (K4) SEQ ID NO.11
ON3: 3'-A*A*G*A G*T C*A C*T C*T C*C*T A G G*C (K5) SEQ. ID NO.19
ON4: 3-'C*T*T*A A G G C*A G T*A C*C G*C A G*C-FITC-5' (K6) SEQ ID NO.10
ON5: 3'-G*G*C A G*T A C*C G*C A G C*G SEQ ID NO.22
ON6: 3'-C*T*T*A A G G*C A G*T*A SEQ ID NO.13
ON7: 3'-T*A*A G G C*A G*T A*C*C SEQIDNO.14
ON8: 3'-G*G*C A G*T A C*C*G C*A SEQIDNO.15
ON9: 3'-C*A*G*T A C*C G*C A G*C SEQ ID NO.23
ON10: 3'-A*G*T A C*C G*C A G*C*G SEQIDNO.16
ON11 : 3'-C*C*G*C A G*C G T*C G*G SEQIDNO.17
ON12: 3'-G*C*A G C*G T*C G G*T*T SEQIDNO.18
ON 13: 3'-A*A*G*A G*T C*A C*T C*T C*C*T A G G*C-Flu-5' (Vergleich 1 )
SEQIDNO . \9 ON14: 3"-G*G*C*A G*T A C*C G C*A G*C G T*C G*G SEQ ID NO.12
ON15: 3'-C*TTAAG G*C A G*T*A-FITC SEQ ID NO.13
wobei
"*" eine Phosphorothioat-Internukleosidbrücke, und FITC einen Fluoreszenzmarker darstellen.
ON1 bis ON 12 wurden in einem auf Zellen basierenden Assay auf ihre Wirksamkeit, die Proliferation von REH-Leukämiezellen zu inhibieren, getestet. ON1, ON2, ON64- ON71 sind Antisense-Oligonukleotide, die gegen die translationale Startregion von eg5-mRNA gerichtet sind. ON4 ist das 5'-Fluorescein-markierte Analog von ON1. ON3 ist ein Vergleichsoligonukleotid.
Die Ergebnisse des Proliferationsinhibitionsexperiments sind in Abbildung 1 gezeigt.
Beispiel 2: Bestimmung der antiproliferativen Wirksamkeit der eg5-Antisense- Oligonukleotide
Die REH-Zellen (humane Prä-B-Leukämiezellen, DSM ACC 22) bzw. die A549- Tumorzellen wurden in OptiMEM (Gibco BRL) mit 10% fötalem Kälberserum (FCS, GIBCO-BRL) bei 37°C unter 5% C02 kultiviert. Die Zelldichte für den Assay war ungefähr 1 x 106/ml. Die Oligonukleotide (0,17mM ) wurden zur Komplexbiidung mit Cellfectin (0,83 mg/ml; Gibco-BRL) gemischt, um die Aufnahme durch die Zellen zu verbessern. Der Oligonukleotid/Cellfectin-Komplex wurde mit den Zellen in Abwesenheit von Serum in Platten mit 24 Vertiefungen 4 Stunden lang inkubiert. Der Oligonukleotid/Cellfectin-Komplex wurde dann entfernt, und Serum wurde zugegeben, so daß die Endkonzentration 10% betrug. Nach 96stündiger Inkubation bei 37°C unter 5% C02 wurde die Zelldichte mit Casy 1 (Fa. Schärfe) gemessen. Hierzu wurden die Zellen in jeder Vertiefung gut gemischt und sofort 1:100 mit Casyton verdünnt. Die Mittelwerte der Zelldichte wurden jeweils aus 3 einzelnen Vertiefungen mit derselben Oligonukleotidkonzentration bestimmt. Die Ergebnisse der antiproliferativen Wirksamkeit sind in Abbildung 1 gezeigt.
Tabelle 1 : Nukleotidsequenz von humanem eg5 (SEQ ID NO. 20)
1 GAATTCCGTC ATGGCGTCGC AGCCAAATTC GTCTGCGAAG AAGAAAGAGG
51 AGAAGGGGAA GAACATCCAG GTGGTGGTGA GATGCAGACC ATTTAATTTG 301 GCAGAGCGGA AAGCTAGCGC CCATTCAATA GTAGAATGTG ATCCTGTACG
151 AAAAGAAGTT AGTGTACGAA CTGGAGGATT GGCTGACAAG AGCTCAAGGA
201 AAACATACAC TTTTGATATG GTGTTTGGAG CATCTACTAA ACAGATTGAT
251 GTTTACCGAA GTGTTGTTTG TCCAATTCTG GATGAAGTTA TTATGGGCTA
301 TAATTGCACT ATCTTTGCGT ATGGCCAAAC TGGCACTGGA AAAACTTTTA 351 CAATGGAAGG TGAAAGGTCA CCTAATGAAG AGTATACCTG GGAAGAGGAT 401 CCCTTGGCTG GTATAATTCC ACGTACCCTT CATCAAATTT TTGAGAAACT
451 TACTGATAAT GGTACTGAAT TTTCAGTCAA AGTGTCTCTG TTGGAGATCT 501 ATAATGAAGA GCTTTTTGAT CTTCTTAATC CATCATCTGA TGTTTCTGAG
551 AGACTACAGA TGTTTGATGA TCCCCGTAAC AAGAGAGGAG TGATAATTAA
601 AGGTTTAGAA GAAATTACAG TACACAACAA GGATGAAGTC TATCAAATTT 651 TAGAAAAGGG GGCAGCAAAA AGGACAACTG CAGCTACTCT GATGAATGCA
701 TACTCTAGTC GTTCCCACTC AGTTTTCTCT GTTACAATAC ATATGAAAGA
751 AACTACGATT GATGGAGAAG AGCTTGTTAA AATCGGAAAG TTGAACTTGG
801 TTGATCTTGC AGGAAGTGAA AACATTGGCC GTTCTGGAGC TGTTGATAAG
851 AGAGCTCGGG AAGCTGGAAA TATAAATCAA TCCCTGTTGA CTTTGGGAAG 901 GGTCATTACT GCCCTTGTAG AAAGAACACC TCATGTTCCT TATCGAGAAT
951 CTAAACTAAC TAGAATCCTC CAGGATTCTC TTGGAGGGCG TACAAGAACA
1001 TCTATAATTG CAACAATTTC TCCTGCATCT CTCAATCTTG AGGAAACTCT
1051 GAGTACATTG GAATATGCTC ATAGAGCAAA GAACATATTG AATAAGCCTG
1101 AAGTGAATCA GAAACTCACC AAAAAAGCTC TTATTAAGGA GTATΛCGGAG 1151 GAGATAGAAC GTTTAAAACG AGATCTTGCT GCAGCCCGTG AGAAAAATGG
1201 AGTGTATATT TCTGAAGAAA ATTTTAGAGT CATGAGTGGA AAATTAACTG 1251 TTCAAGAAGA GCAGATTGTA GAATTGATTG AAAAAATTGG TGCTGTTGAG
1301 GAGGAGCTGA ATAGGGTTAC AGAGTTGTTT ATGGATAATA AAAATGAACT
1351 TGACCAGTGT AAATCTGACC TGCAAAATAA AACACAAGAA CTTGAAACCA 1401 CTCAAAAACA TTTGCAAGAA ACTAAATTAC AACTTGTTAA AGAAGAATAT
1451 ATCACATCAG CTTTGGAAAG TACTGAGGAG AAACTTCATG ATGCTGCCAG
1501 CAAGCTGCTT AACACAGTTG AAGAAACTAC AAAAGATGTA TCTGGTCTCC
1551 ATTCCAAACT GGATCGTAAG AAGGCAGTTG ACCAACACAA TGCAGAAGCT
1601 CAGGATATTT TTGGCAAAAA CCTGAATAGT CTGTTTAATA ATATGGAAGA 1651 ATTAATTAAG GATGGCAGCT CAAAGCAAAA GGCCATGCTA GAAGTACATA
1701 AGACCTTATT TGGTAATCTG CTGTCTTCCA GTGTCTCTGC ATTAGATACC
1751 ATTACTACAG TAGCACTTGG ATCTCTCACA TCTATTCCAG AAAATGTGTC
1801 TACTCATGTT TCTCAGATTT TTAATATGAT ACTAAAAGAA CAATCATTAG 1851 CAGCAGAAAG TAAAACTGTA CTACAGGAAT TGATTAATGT ACTCAAGACT 1901 GATCTTCTAA GTTCACTGGA AATGATTTTA TCCCCAACTG TGGTGTCTAT 1951 ACTGAAAATC AATAGTCAAC TAAAGCATAT TTTCAAGACT TCATTGACAG
2001 TGGCCGATAA GATAGAAGAT CAAAAAAAAA GGAACTCAGA TGGCTTTCTC 2051 AGTATACTGT GTAACAATCT ACATGAACTA CAAGAAAATA CCATTTGTTC
2101 CTTGGTTGAG TCACAAAAGC AATGTGGAAA CCTAACTGAA GACCTGAAGA
2151 CAATAAAGCA GACCCATTCC CAGGAACTTT GCAAGTTAAT GAATCTTTGG 2201 ACAGAGAGAT TCTGTGCTTT GGAGGAAAAG TGTGAAAATA TACAGAAACC
2251 ACTTAGTAGT GTCCAGGAAA ATATACAGCA GAAATCTAAG GATATAGTCA
2301 ACAAAATGAC TTTTCACAGT CAAAAATTTT GTGCTGATTC TGATGGCTTC
2351 TCACAGGAAC TCAGAAATTT TAACCAAGAA GGTACAAAAT TGGTTGAAGA
2401 ATCTGTGAAA CACTCTGATA AACTCAATGG CAACCTGGAA AAAATATCTC 2451 AAGAGACTGA ACAGAGATGT GAATCTCTGA ACACAAGAAC AGTTTATTTT
2501 TCTGAACAGT GGGTATCTTC CTTAAATGAA AGGGAACAGG AACTTCACAA
2551 CTTATTGGAG GTTGTAAGCC AATGTTGTGA GGCTTCAAGT TCAGACATCA
2601 CTGAGAAATC AGATGGACGT AAGGCAGCTC ATGAGAAACA GCATAACATT
2651 TTTCTTGATC AGATGACTAT TGATGAAGAT AAATTGATAG CACAAAATCT 2701 AGAACTTAAT GAAACCATAA AAATTGGTTT GACTAAGCTT AATTGCTTTC
2751 TGGAACAGGA TCTGAAACTG GATATCCCAA CAGGTACGAC ACCACAGAGG
2801 AAAAGTTATT TATACCCATC AACACTGGTA AGAACTGAAC CACGTGAACA
2851 TCTCCTTGAT CAGCTGAAAA GGAAACAGCC TGAGCTGTTA ATGATGCTAA
2901 ACTGTTCAGA AAACAACAAA GAAGAGACAA TTCCGGATGT GGATGTAGAA 2951 GAGGCAGTTC TGGGGCAGTA TACTGAAGAA CCTCTAAGTC AAGAGCCATC
3001 TGTAGATGCT GGTGTGGATT GTTCATCAAT TGGCGGGGTT CCATTTTTCC 3051 AGCATAAAAA ATCACATGGA AAAGACAAAG AAAACAGAGG CATTAACACA
3101 CTGGAGAGGT CTAAAGTGGA AGAAACTACA GAGCACTTGG TTACAAAGAG
3151 CAGATTACCT CTGCGAGCCC AGATCAACCT TTAATTCACT TGGGGGTTGG 3201 CAATTTTATT TTTAAAGAAA AACTTAAAAA TAAAACCTGA AACCCCAGAA
3251 CTTGAGCCTT GTGTATAGAT TTTAAAAGAA TATATATATC AGCCGGGCGC
3301 GTGGCTCTAG CTGTAATCCC AGCTAACTTT GGAGGCTGAG GCGGGTGGAT
3351 TGCTTGAGCC CAGGAGTTTG AGACCAGCCT GGCCAACGTG CGCTAAAACC
3401 TTCGTCTCTG TTAAAAATTA GCCGGGCGTG GTGGGCACAC TCCTGTAATC 3451 CCAGCTACTG GGGAGGCTGA GGCACGAGAA TCACTTGAAC CCAGAAGCGG 3501 GGTTGCAGTG AGCCAAAGGT ACACCACTAC ACTCCAGCCT GGGCAACAGA
3551 GCAAGACTCG GTCTCAAAAA TAAAATTTAA AAAAGATATA AGGCAGTACT
3601 GTAAATTCAG TTGAATTTTG ATATCTACCC ATTTTTCTGT CATCCCTATA
3651 GTTCACTTTG TATTAAATTG GGTTTCATTT GGGATTTGCA ATGTAAATAC
3701 GTATTTCTAG TTTTCATATA AAGTAGTTCT TTTAGGAATT C
Tabelle 2: SEQ ID NO. 21 : P. falciparum-Sequenz (Teilsequenz; Genbank, ID Z98551 ).
TTTTTTTTTTTTTATTCCTTGGATGTTCTTGGTAGTTTAAATTTTTTATTTTTGTAGTTTTC TTCTTTTATACGTTTTAAAGCAGGGGATGCCTTTTTAGGAAATGCCCTATTTTCAATAGCTT TAATTTTTGTAGATTGAAATTTATTATTATTATTATTATTATTGTTGTTGTTGTTGTTGTTG TTGTTGTTGTTATTATTTGAATAATTATTTGTTATATGAACATTTTGAACATTTATATTTCT CTTTCTTTCATATTCTTTTAAACTTGTTACACTCATATTTTCTGTATTTACATCAAATCTTT TATTATGTTGATTGTTATTTAAATAATTTAATTCTTGATATGTTTCATCTATTGGTTGTATA GGATTATCCGTTGTATTCTTATTATATAGCATATATTCATTTAAGGGTAGATTATTGTGATT AGTTTTTACATTTAATTTATTTTTATCACCTTTATTATTTATATTATGAGGTATACTACTAT TCGTTGTATGATCATTTAAACTATTGTAACGAGAGTAATTATTTTCATGCGCTACAATTTTA TCATCTTGAATAAGAAATTGGAAGTTTTCATCGATTTGTTCAAATACTTTACTTAAATCTAT ATCATGTGTTGTTGTAATTTGTTCTATCTCTTTCATCAAGGTATTTTTAACTTCCAAGTATA AATTTTGTCTTATGATATCATCATTATAAAGATAATAATTATGATGATCACCTTGATCTATT TTATTATCATCATTATAAAGATAATAATTATGATGATCACCTTGATCCATTTTATTATCATC ATTATAAAGATAATTATTATGATCATGACCTTGATCCATTTTATTATCATCATTATAAAGAT AATTATTATGATCATGACCTTGATCCATTTTATTATCATCATTATAAAGATAATTATTATGA TCATGACCTTGATCCATTTTATTATCATCATAATTATTATTGTCACCATTTTTATTATTGTC ATGATCATTTTTATTATTGTCACCATTTTTATTATTATCATGATTATTTTTATTATTATCAT GATTATTTTTATTATTATCATGATTATTTTTATTATTATCATCATTTTTATTATTATCATAA TTCGTGTCGTAAGTCGAATCCCTATTTAGTGATGTGATTTTCATCGGAGTAAACATATCTAT GACATTCACAAACGTTTCCCTTATCCTTTGTACATCATCCTTTATATTTAGATAAAATTCAT CATCCATATTTTCCATGAGATCATAACTTGATGTACTTGGAATGTCTTGTAAGTAATCTTTT TTTTTTAATATATCTATTAATTCTGCTATATACATATTACATTTGTTTAAATTTTGTTCAAA TATATTATTAAAAAGTTTTATATTTTCATTAGACTTTAACATATGTATACGACGTCCCCCTT TTTGTTCTTGTGATTCTTTATTTTTATTTTGTAAAATCTTTTCAGATATAACGTTATATAAC TTTCGTTTCTCTATTTTGTTTATATTAGTTTGACTTGTAAAGTTATTTATGATTTTATCAAT ATTTAGATTATTTGTATATAATAAATTATTATAAATATTTAAAGTATCATTTAAACATTTGC TGTGTTCCTTTTCTTCAATATAACTTTTTCTTTTTAAATAAGATAATATGTTATATAAAACA GTATGATAATTTGTTATCTTCCTTTTAATATCATTATTAATATTATTATATTCCTTTTCATC ATTAATATTGCATTCAGAAAAATGTTGTATAGTATCATCTATCTTTTTTACAGAATTCATAA AAACAGATTTATAATTTTTTTTTGACTTATCATATAATTCTTTATTTAATAAATCGAACTTG TTATTCATTTTTTCATAAATATCTTCCACATTTTTATTTATAAGTAATTCAATATCTTTCAA AATATTTTCTTTAAATTCTTGTATATCTTCATTTATCATTTTTTTATAATTATTAATTATAA TATTATCCTCCTTTTCAAAAACATCATATTTTTTATAAATATATTCAATGTTGTCATTCATA ATCTTCTTGTCCTTATCCCAATGTATATATTTTTCATGACATTTTTTTTCTAGTAACATAAA TGATTCGTTTAAAAAAATATGAAATATATTACATATACTTTTAATATATTGTATTAATGATT TTGCATTATATAACTTTTTTTCAGATTCGTGATTATCTAAA TTTGTATAATATCTTCACCT TGTCTATTTAATAATAAATCTTTTATAAATTCTTTATTCTCAGGATAATTAAATGATTCCTC TATATGGTCAAATGGCATCTCATTATTTTCTTCTTTACCATATTGTTTTTGACATGTTTTTC CTTCACCATTTTGTTTTTCACATATTATTCCTTCACCGTTTTGTTTTTCACATATTATCTCG TCACCGTTTTGTTTTTCACATATTATCTTT CACCACTTTGTTTTTCACATATTATCTCTTC ACCGTTTTGTTTTTCACATATTATCTTTTCACCACTTTGTTTTTCACATATTATCTTTTCAC CACTTTGTTTTTCACATATTATCTTTTCACCACTTTGTTTTTCTTTTTTTAATCCGTTTGTA TTATATACACCAATAATTGCTGGCATTTTCTGCTTGGCTTCATCACTTATATGTGGTATGTT TATTTTACATTGTGATATTTCCTTTTTAATATTTTCGGAGAGAGAAAAGTAATCATGATCAT ATTTTTGTAAAATATCCATATGGTCCAGTATAAAATTCAGAGTATCATTATATTTAAAATTA ATGTTACTATTGAGTTCTTCAAAATGGTTAATATAATCATTGTATGATTTTTTATTTTGTAC TAGATAATTTTTGGTATCATCTAAAATGAATAAGATGGTTTTACATATATCGTTTAAAAGAT GATTTTCTTGATGAATATTTTTTTTTATATTTAATAGATTATCATGCATTATATTAGACATA TTTGTTTTAATTTGTTGAAAAGATTTTTTTTGATTTATAAAATTTTCTTCTAAAGAATGATA TTTATTTAATAAGAATTGTGTAATATATTTTTCTTCTATTATTTTTTTAATTAATATTTGAT GAAATGCTTGTATATTTTTATATTTTTGAATAGTATCTTTTAAAAAGAAAAATATTTTATTT TGTAGATCATCTGTATTATCCATTTTATTTAATAAATTTTTTATTTTTTTACTTTTTTCAAA TAAAATTTTTTCTTTTTCTAATAATATTTCTTTATTTTTCTTTAGACTATTTTGTATATTAT TATATTCTTCTGTATCAAGATAAACACCTCTCTTTTCTCTGCTTAAATTCAGTGCATTTCTT AACTTTTCGATTTCATTATTTAAATCCTTTATTTTTAATTGTTTCGTTGTTTTTATATTTAT CTCGGGTCTATTCTTAATATTCTTAGCTCGAAAGACATAATCTAAAGTGCTTAAAGTCTCAT CAATACATAAAGAGGAGGGTGATATAGTGGCGACAATAAAAGTCTTCGTTTTCCCACCTAAC GAATCTTGTAATAATCTGGTTAATTTAGAATCTCTGTAAGGAATATAAGATGAATTCTCAAT CAACGAATTAATAACTCTACCTAAGGTTAATAAAGATTGATTTATATTACAACTTTCTTGTT GTCTAATTTTTAAAGAACCATAAGAGCTTTTCAAAGCATTTTCACTACCCGCTAAATCAACT AAATTTAATTTTCCTATTTTTGTTATACTTTCTCCTACATTATTTATATCTTTTATAATTAA TGTTATAGTAAAAATCGAATGACTTCTACTCGATTTTTTATTATAAGCCGTTTCAGCTGTCC TTCTTTTTTTAATAGCTGAACATATAATATAATATATTTCTTCAAAAGAATTAATACTTTTT TCTTCTAACTTATCAACATTTAATCCTTTACTTTTATTATTACTATCTTCATATATTCGAAG TTTCATATTTTCATTTGTTGAACTTAATAAATCACATAATTCTTCATTATATATTTCTAGAT AGCTAATTTTTATATTAAAATCGTACATATTCTTATCATCAAATGTTTGATACATATCATTA TTCCTATTTTTATCTACACTACATTTTTGTACAACATCACAAGTAATATCTCTACTCTTTTC GTTAACTAACAAATTGTTAGGTTCTTTATTAATTTTTAAATTATTATAAATATCATTTTTAT CAATATTTATTTTGTTACATAATAAATTATTATAATTATTATTAATAATATTATTATTGTTA CCATTAGTTTCCTTATTTATTACATTTATATGTTCGTTATCCTTTTCATCAAATATATTCTT TTTTCCTTTAAAATGTCGAATCTTTTCTTCTTTCCTTTTATTTAATATATCGAATATTCTTT TCGTAACTCGAAATATAAGTCCAGTATCCTCATTCTCACAAAGTTCATAGCAATAGCTGATG TCGCTATTAATACTTTCATTCAAATCCACCTTTTTATTATTATCATATTGTTTCAGGTGTTC
TAGTATTTTCCCTTCCATAGTATAGGTCTTACCCGTCCCGGTCTGTCCATAGCAGAACAGCG
TACAATTGAATCCTTGCAAAACCTGAAGCGGCGAACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATATAT
ATATATATGTACATGTATATTTATATGTATATGTATATATATATGTATAGTTATATGTATTT
TTATTTTTATTTTTATTTTTATATTTATTTTTATTTTTATATTTATTTTTATTTTTATATTT ATTTTTATTTTTATATTTATATTTATATA
CCATATATTTTTTTTTTTTAATCTATTTAATAAAACATTATTATGATATACGCAGAGGTGAT
ATATACATGGTATTTATTTATTTTTTTTTATATATTTTTCAT
TTGTTTCGTAGGAATATTCTTTTTTTTTCTGCACATATATTTCACTATCCATATAATATCAT
AATACATCATGGAATAATTTATATATATATATATATATATGTATATTTTATTTTTACCTCAT
CTACTATTTGGTAAATATAATTATTGAACAAAGTTTTCTGATCCACATCTTTATCACATGCA
TAATCAAAACTATATTTTTTTTCGTATATTTCATTGTTTCTATTAATTGTTAATATAACCTC
ATTATTATTAATTCGAACTACCTCTTCATTATTTATATCGTTTTTTTCTTTTTCATTTAATG
GTCTACACCTTACGATAACTTTTATATTTACGCAACTTGATTTATCATTATTATAAGAATTT
CTGAGCATTTTACTTTTATTCAAATAAT
Tabelle 3:
Sequenzhomologie: Vergleich der humanen eg5-Sequenz mit der Plasmodium falciparum-eg5-Sequenz
1 60 human . SEQ GAATTCCGTCAT GGCGTC .... GCAGCC .AAATTC ... GTCTGCGAAGAAG P ASMO . SEQ TTTTTTTTTTTTTATTCCTTGGATGTTCTTGGTAGTTTAAATTTTTTATTTTTGTAGTTT
61 120 human . SEQ AAAGA....GGAGAAGGGGAAGAACATCCAGGTGGTGGTGAGATGCAGACC PLASMO . SEQ TCTTCTTTTATACGTTTTAAAGCAGGGGATGCCTTTTTAGGAAATGCCCTATTTTCAATA
121 180 human. SEQ A. TTTAATTTGGCAGAGCGGAAAGCTAGCGCCCAT . TCAATAGTAGAATGTGATCCTGTA
PLASMO . SEQ GCTTTAATTTTTGTAGATTGAAATTTATTATTATTATTATTATTATTGT . TGTTGTTGTT
181 240 human .SEQ CGAAAAGAAGTTAGTGT .ACGAACTGGAGGATTGGCTG .. ACAAGAGCTCAAGGAAAACA PLASMO . SEQ GTTGTTGTTGTTGTTGTTATTATTTGAATAATTATTTGTTATATGAACATTTTGAACATT
241 300 human . SEQ TACACTTTTGAT ATGGTGTTTGGAGC ATCTACTAAAC .. AG
PLASMO . SEQ TATATTTCTCTTTCTTTCATATTCTTTTAAACTTGTTACACTCATATTTTCTGTATTTAC
301 360 human. SEQ ATTGA.. TGTTTACCG ....AAGTGTTGTTTG TCCAATTCTGGATGAAGT . AT .
PLASMO . SEQ ATCAAATCTTTTATTATGTTGATTGTTATTTAAATAATTTAATTCTTGATATGTTTCATC 361 420 human. SEQ TATGGGCTATA.... ATTGCAC .... TATCTTTGC . GTATGGC . CAAACT GG
PLASMO . SEQ TATTGGTTGTATAGGATTATCCGTTGTATTCTTATTATATAGCATATATTCATTTAAGGG
421 480 human. SEQ CA. CTG . GAAAAACTTTTACAATGGA... AGGTGAAAGGTC ACCTA....
PLASMO . SEQ TAGATTATTGTGATTAGTTTTTACATTTAATTTATTTTTATCACCTTTATTATTTATATT
Abbildung 1 :
Diese Abbildung faßt die Ergebnisse von Beispielen 1 + 2 zusammen:
Gezeigt ist die Wirkung von Oligonukleotiden ON1 bis ON12 (eg5-Antisense) auf die
Inhibierung der Proliferation von REH-Zellen (in Prozent).
■ 1. Experiment ♦ 2. Experiment CF : Cellfectin-Vergleich

Claims

Ansprüche:
1. Antisense-Oligonukleotid oder eines seiner Derivate, dadurch gekennzeichnet, daß es einem Teil einer eg5 kodierenden Sequenz entspricht.
2. Antisense-Oligonukleotid oder eines seiner Derivate nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß es 8-100 Nukleotiden einer eg5 kodierenden Sequenz entspricht.
3. Antisense-Oligonukleotid oder eines seiner Derivate gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Länge von 8 bis 20 Nukleotiden hat.
4. Antisense-Oligonukleotid oder eines seiner Derivate gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es einem Teil einer humanen eg5 und/oder einer Plasmodium falciparum eg5 kodierenden Sequenz entspricht.
5. Antisense-Oligonukleotid oder eines seiner Derivate gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es eine der Sequenzen SEQ ID NO. 1 , SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3 , SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8 oder SEQ ID NO. 9 hat, wobei
SEQ ID NO. 1 ' 5'-CGACGCCATGACGGAATTC-3'
SEQ ID NO. 2 5'-AATGGTCTGCATCTCACCA-3'
SEQ ID NO. 3 5'-GGCTGCGACGCCATGACGG-3'
SEQ ID NO. 4 5'-ATGACGGAATTC-3' SEQ ID NO. 5 5'-CCATGACGGAAT-3'
SEQ ID NO. 6 5'-ACGCCATGACGG-3'
SEQ ID NO. 7 5'-GCGACGCCATGA-3'
SEQ ID NO. 8 5'-GGCTGCGACGCC-3' und SEQ ID NO. 9 5'-TTGGCTGCGACG-3' ist.
6. Antisense-Oligonukleotid oder eines seiner Derivate gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Oligonukleotid eine oder mehrere Modifikationen aufweist, wobei sich jede
Modifikation, im Vergleich zu einem aus natürlicher DNA aufgebautem Oligonukleotid mit der gleichen Sequenz, an einer bestimmten Phosphodiester Internukleosidbrücke und/oder an einer bestimmten ß-D-2'- Desoxyriboseeinheit und/oder an einer bestimmten natürlichen Nukleosidbasenposition befindet.
7. Antisense-Oligonukleotid oder eines seiner Derivate gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß 1 bis 5 terminale Nukleotideinheiten am 5'-Ende und/oder am 3'-Ende des Oligonukleotids durch modifizierte Internukleosidbrücken die am 5'- und/oder am 3'-Ende des bzw. der entsprechenden Nukleoside lokalisiert sind, geschützt ist.
8. Antisense-Oligonukleotid oder eines seiner Derivate gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens ein internes Pyrimidinnukleosid und/oder eine am 5'-Ende und/oder am 3'-Ende dieses Pyrimidinnukleosids lokalisierte Internukleosidbrücke modifiziert ist.
9. Antisense-Oligonukleotid oder eines seiner Derivate gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß jede Modifikation unabhängig voneinander ausgewählt ist aus a) dem Austausch der Phosphodiesterbrücke am 3'- und/oder 5'-Ende eines Nukleosids durch eine modifizierte Internukleosidbrücke, b) dem Austausch der Phosphodiesterbrücke am 3'- und/oder 5'- Ende eines Nukleosids durch eine Dephosphobrucke, c) der Austausch eines Zuckerphosphatrests aus dem Zuckerphosphatgerust durch einen anderen Rest, d) dem Austausch einer ß-D-2'-Desoxyriboseeinheit durch eine modifizierte Zuckereinheit, e) dem Austausch einer natürlichen Nukleosidbase durch eine modifizierte Nukleosidbase, f) der Anbindung an ein Molekül, das die Eigenschaften des Oligonukleotids beeinflußt, g) der Anbindung an ein 2'5'-verbundenes Oligoadenylatmolekül oder ein Derivat davon, gegebenenfalls über ein geeignetes Linkermolekül, und h) der Einführung einer 3'-3'- und/oder einer 5'-5'-lnversion am 3'- und/oder am 5'- Ende des Oligonukleotids.
10. Verfahren zur Herstellung eines Antisense-Oligonukleotids oder eines seiner Derivate gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9, wobei in geeigneter weise geschützte Monomere an einer Festphase kondensiert werden.
11. Verwendung eines Antisense-Oligonukleotids oder eines seiner Derivate gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9 zur Inhibition der Expression von eg5.
12. Verfahren zur Inhibition der Expression von eg5, dadurch gekennzeichnet, daß ein Antisense-Oligonukleotid oder eines seiner Derivate gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9 mit einer eg5-kodierenden Nukleinsäure in Kontakt gebracht wird und an diese bindet.
13. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung, dadurch gekennzeichnet, daß ein oder mehrere Antisense-Oligonukleotide oder eines seiner Derivate gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9 mit einem physiologisch unbedenklichen Trägerstoff und gegebenenfalls zusätzlichen Substanzen gemischt werden.
4. Pharmazeutische Zubereitung, dadurch gekennzeichnet, daß sie wenigstens ein Antisense-Oligonukleotid oder eines seiner Derivate gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9 enthält.
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