WO2001009294A1 - Composiciones antifungicas y metodos para controlar hongos - Google Patents

Composiciones antifungicas y metodos para controlar hongos Download PDF

Info

Publication number
WO2001009294A1
WO2001009294A1 PCT/ES2000/000292 ES0000292W WO0109294A1 WO 2001009294 A1 WO2001009294 A1 WO 2001009294A1 ES 0000292 W ES0000292 W ES 0000292W WO 0109294 A1 WO0109294 A1 WO 0109294A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
fungus
antifungal
glucanase
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/ES2000/000292
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Manuel Rey Barrera
Andres Soler Castells
Hassane Ait Lahsen
Jesus De La Cruz Diaz
Enrique Monte Vazquez
Antonio Llobell Gonzalez
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universidad de Sevilla
Newbiotechnic SA
Original Assignee
Universidad de Sevilla
Newbiotechnic SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universidad de Sevilla, Newbiotechnic SA filed Critical Universidad de Sevilla
Priority to EP00951534A priority Critical patent/EP1207197A1/en
Priority to AU64435/00A priority patent/AU6443500A/en
Priority to CA002389719A priority patent/CA2389719A1/en
Publication of WO2001009294A1 publication Critical patent/WO2001009294A1/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01084—Glucan 1,3-alpha-glucosidase (3.2.1.84), i.e. mutanase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N37/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids
    • A01N37/44—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids containing at least one carboxylic group or a thio analogue, or a derivative thereof, and a nitrogen atom attached to the same carbon skeleton by a single or double bond, this nitrogen atom not being a member of a derivative or of a thio analogue of a carboxylic group, e.g. amino-carboxylic acids
    • A01N37/46—N-acyl derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the invention relates to the use as an antifungal agent of a protein that possesses at least ⁇ - enzymatic activity.
  • (1, 3) -glucanase to antifungal compositions comprising said protein and to methods to control, prevent and / or treat infections caused by pernicious fungi.
  • fungi caused by different species of fungi arise, such as Candida sp., Aspergill us sp., Etc., which can lead to serious pathological conditions, especially in mmunocompromised patients, for example, oropharyngeal candidiasis in AIDS patients.
  • fungicides are used in human or animal therapy, based on polyenes or azoles, effective antifungal agents are still sought against such infections.
  • the chemical structure of the fungal cell wall is quite complex and relatively poorly studied.
  • the cell wall is formed by a skeleton of chitin or cellulose and of ⁇ -1,3-glucans together with other minor polymers, such as ⁇ -1, 6-glucans or - (1, 3 ) -glucanos, but that seem to exert a critical function in maintaining the structure of the wall.
  • a specific way to destroy the cell wall of a fungus would be through the use of hydrolytic enzymes of the constituent polymers of the cell wall.
  • hydrolytic capacity resides in the ability of the hydrolytic enzyme to bind to the cell wall of the fungus to be destroyed.
  • Such ability resides in a wall-binding domain of the hydrolytic enzyme that is independent of the domain responsible for enzymatic activity. Therefore, in the search for selective antifungal agents, said hydrolytic enzymes capable of binding to fungal cell walls would be very promising candidates.
  • chitin and ⁇ -1,3-glucan are the main structural components of fungal cell walls (except in the case of Oomycetes, which contain ⁇ -glucans and cellulose), it has been proposed that chitmases and ⁇ -1,3-glucanases are the key enzymes in the lysis of the cell walls of phytopathogenic fungi. However, it seems that other enzymes that degrade cell walls, including those that hydrolyze minor polymers ( ⁇ -1, 6-glucans, -1, 3-glucans, etc.), may also be involved in effective and complete degradation. of the walls of the mycelium and the conidia of phytopathogenic fungi.
  • the glucans known as alkali soluble glucans include from polymers containing only linked ⁇ - (1, 3) - glycosidic to polymers containing - (l, 3) - I - (1, 4) - glycosides that alternate regularly [Bartnicki- Garc ⁇ a, Annu. Rev. Microbiol., 1968, 22, 87-109; Bacon et al., Biochim. Biophys Minutes, 1968, 158, 313-315].
  • S-glucan It represents the majority polysaccharide of the matrix of many fungi, reaching up to approximately 25% of the dry weight of the cell wall of Aspergillus nidulans. Despite the importance of S-glucan, little is known about the existence of enzymatic activities capable of hydrolyzing said polymer.
  • the a- (1, 3) -glucanases [glucan (1, 3) - -glucosidase, EC 3.2.1.84] are enzymes capable of hydrolyzing ⁇ - (1, 3) -glucosidic bonds. There is not much information about these enzymes.
  • Japanese patent application JP 04058889 describes an enzyme with activity - (1, 3) -glucanase of T ⁇ choderma harz ⁇ anum, which degrades mutane (mutanase) an extracellular polymer of - (1, 3) - glucan produced by Streptococcus sp. They colonize the teeth.
  • Patent application WO 98/00528 describes a recombinant mutanase derived from T. harz ⁇ anum and its use in products intended for oral hygiene.
  • the invention faces the problem of providing agents with antifungal activity.
  • the solution provided by this invention is based on the fact that the inventors have identified a protein that possesses, at least, enzymatic activity - (1, 3) -glucanase, and also, surprisingly, has antifungal activity, so it is useful for controlling fungi, in particular, fungi that contain in their cell wall polymers that possess ⁇ - (1, 3) -glucosidic bonds, for example, S-glucan.
  • the antifungal activity of said protein has been demonstrated by tests of spore germination inhibition and / or fungal mycelium growth inhibition and fungal cell wall binding assays.
  • an object of this invention is the use as an antifungal agent of a protein that has at least ⁇ - (1, 3) -glucanase enzymatic activity.
  • a further object of this invention is an antifungal composition comprising said protein useful as antifungal agent
  • Another additional object of this invention is a pharmaceutical composition comprising said protein useful as an antifungal agent.
  • Another additional object of this invention is a method for inhibiting spore germination and / or fungal mycelium growth, which comprises contacting said fungi with said antifungal composition.
  • Another additional object of this invention is a method for controlling phytopathogenic fungi comprising contacting said fungi with said antifungal composition.
  • Another additional object of this invention is a method for preventing and / or treating infections caused by pathogenic fungi of animals, including humans, which comprises administering to the animal or patient in need of treatment a therapeutically effective amount of said protein useful as an agent. antifungal or of said pharmaceutical composition.
  • Another additional object of this invention is the use of said protein useful as an antifungal agent, in the preparation of a medicament for the treatment and / or prevention of fungal diseases.
  • Figure 1 shows an image observed under an optical microscope where the antifungal effect is determined, determined by the growth inhibition of the phytopathogenic fungus Peni cilli uu digi ta tum, produced by the antifungal protein AGN13.1 of T. harz ⁇ anum [Figure 1A] and the comparison with a negative control [ Figure IB].
  • Figure 2 shows an image observed under an optical microscope showing the antifungal effect, determined by the morphological alterations of the mycelium of the phytopathogenic fungus P. digi ta tum, produced by the antifungal protein AGN13.1 [Figure 2A] and the comparison with a negative control [ Figure 2B].
  • Figure 3 is a bar chart showing the antifungal effect of T. harz ⁇ anum AGN13.1 enzyme on the germination of Aspergillus niger CECT 2574 spores determined at 12 hours [Example 11].
  • Figure 4 is a graph showing the effect of the enzyme AGN13.1 of T. harz ⁇ anum on the growth of A. niger CECT 2574 [Example 11].
  • Figure 5 shows an image observed under the optical microscope where the antifungal effect is determined, determined by the morphological alterations of the mycelium of A. niger CECT
  • the invention relates to the use as an antifungal agent of a protein that possesses at least ⁇ - (1, 3) -glucanase enzymatic activity, hereinafter antifungal protein.
  • the antifungal protein is a protein that has at least enzymatic activity - (1, 3) -glucanase and the ability to bind to a cell wall of a fungus, in particular of a fungus that contains in its cell wall a polymer that has bonds - (1, 3) -glucosides, and inhibit the germination of spores and / or mycelial growth of a fungus, in particular, of a fungus that contains in its cell wall a polymer that possesses ⁇ - (1, 3 ) -glucosides.
  • said antifungal protein has an amino acid sequence selected from: a) the amino acid sequence shown in the SEC. ID. N °: 1, and b) a substantially homologous amino acid sequence and functionally equivalent to the amino acid sequence shown in the SEC. ID. N °: 1.
  • substantially homologous means that the amino acid sequences in question have a degree of identity, at the amino acid level, of at least 70%, preferably of at least 85%, and, more preferably of at least , 95%.
  • the term "functionally equivalent” means that the protein in question has ⁇ - (1, 3) -glucanase activity and antifungal activity, the latter determined by the ability to bind to a cell wall of a fungus, in particular of a fungus that contains in its cell wall a polymer that possesses ⁇ - (1, 3) -glucosidic bonds, and inhibit spore germination and / or mycelial growth of a fungus, in particular, of a fungus that contains in its cell wall a polymer that possesses ⁇ - (1,3) -glucosidic bonds.
  • the ⁇ - (1,3) -glucanase activity can be determined by the assays described in Example 2;
  • the binding capacity of the antifungal protein to fungal cell wall components can be determined by the protocol described in Example 9;
  • the binding capacity of the antifungal protein to fungal cell walls can be determined by the protocol described in Example 11; and the antifungal activity of the antifungal protein can be checked by the protocol described in Example 10.
  • said antifungal protein is an ⁇ - (1, 3) -glucanase of T. harz ⁇ anum, for example, the ⁇ - (1, 3) -glucanase identified as AGN13.1 and has the amino acid sequence shown in the SEC. ID. N °: 1.
  • Said AGN13.1 protein has the following characteristics: it is a monomechanic enzyme that degrades ⁇ - (1, 3) -glucan, has an apparent molecular weight of approximately 72 kDa (determined by SDS-PAGE) and approximately 67 kDa (determined by gel filtration chromatography), it has an isoelectric point of approximately 7 (determined by isoelectric focusing) and approximately 7.6 (determined by chromato-focusing), its mechanism of action is exo type, its hydrolytic activity is specific to - (1, 3) -glucosidic bonds, is induced under conditions that simulate the antagonistic response of T. harz ⁇ anum (determined by analysis by Northern blot and Western blot), and is capable of binding to cell walls of some fungi, hydrolyzing and inhibiting spore germination and mycelial growth of these fungi.
  • the antifungal protein can be obtained from an organism producing it, by means of a method comprising cultivating said organism under appropriate conditions for the expression of said protein and recovering it.
  • the producing organism is T. harz ⁇ anum [Example 1].
  • the isolation and purification of the antifungal protein can be carried out by adsorption to fungal cell walls and release by digestion of these, by a method comprising precipitation of the protein with ammonium sulfate, adsorption-digestion to cell walls. of fungi or components of said walls, and separation by gel filtration chromatography of the concentrated fractions exhibiting antifungal activity [Example 3]. This method allows to isolate proteins with affinity for the structure or components of fungal cell walls.
  • the antifungal protein according to this invention is capable of hydrolyzing polymers having - (1, 3) -glucosidic bonds, for example, polymers of - (1, 3) -glucan.
  • the cell walls of some fungi contain such polymers, among others (chitin, ⁇ - (1, 3) -glucans, ⁇ (1, 6) -glucans, etc.), so that said antifungal protein can be used to control fungi that contain in their cell wall polymers that have bonds - (1, 3) -glucosides.
  • the antifungal protein according to the invention is capable of degrading S-glucan, so it can be used to inhibit spore germination and / or the growth of fungal mycelium containing S-glucan in its cell wall, and, therefore, to control fungi that contain said polymer in their cell wall.
  • the term "fungus”, as used in this description, includes yeasts.
  • said fungi are pernicious fungi that contain in their cell wall a polymer that has - (1, 3) -glucosidic bonds, for example, S-glucan.
  • the term "pernicious fungi” includes plant pathogenic fungi (including pre-and post-harvest fruit-contaminating fungi), animal pathogenic fungi.
  • the fungi susceptible to being attacked by the antifungal protein according to this invention are fungi that contain in their cell wall the target polymer (polymers that possess bonds - (1, 3) -glucosides) and spread in the Fungi Kingdom , from yeasts to filamentous fungi.
  • phytopathogenic fungi susceptible to being controlled by the antifungal protein according to this invention are, by way of illustration, not limitation, the Ascomycetes and Basidiomycetes, in their sexual and asexual phases, for example, the causes of diseases such as oidios, rust, Coals, blight, canker, radicular mycosis, foliar mycosis, vascular mycosis, post-harvest miscosis, etc.
  • fungi involved in diseases such as piti ⁇ asis [Malassezia f ⁇ rfur), black stone ⁇ Piedraia hortae), white stone ⁇ Trichosporon beigelii), dermatomycosis ⁇ My crosporum, Trichophyton, Epidermophyton), sporotrichosis (Sporothr ⁇ x schenkn), chromoblastomycosis (yeasts and dermatiaceous hyphomycetes), pheohifomycosis ⁇ Fonsepoea c pedrosoi, Clarous carrion, Claros carrion, Claum carrion Phialophora verrucosa), fungal mycetomas ⁇ Madurella gr ⁇ sea, Pseudallescheria boydii), histoplasmosis (H
  • Nidulans, A. Niger, A. Fumigate you and A. flavus), opportunistic mycoses ⁇ Candida sp., Pneumocysti s carina), zygomycosis ⁇ Rhi zopus sp. , Absidia sp., Mucor sp.) And cryptococcosis ⁇ Fi lobasidiel la neoformans Cryptococcus neoforms).
  • the invention provides an antifungal composition
  • an antifungal composition comprising at least one antifungal protein according to the invention, together with an inert carrier, such as a diluent, a solvent or a surfactant.
  • inert is used to indicate that said vehicle does not have a significant antifungal activity.
  • Said antifungal composition may also contain other natural, recombinant or synthetic fungicides that enhance the action of the antifungal protein according to the invention.
  • This antifungal composition can be used for the demolition of surfaces, equipment, devices, of any sector of the technique, for example, industrial, agricultural or livestock, by its application on said surfaces, equipment or devices.
  • the The invention provides a composition for controlling phytopathogenic fungi comprising an effective antifungal amount of said antifungal protein according to the invention, together with, optionally, one or more agriculturally acceptable carriers.
  • This composition has a good antifungal activity against a large group of phytopathogenic fungi, in particular, against phytopathogenic fungi that contain polymers in their cell wall that possess ⁇ - (1,3) -glucosidic bonds.
  • control includes the inhibition, reduction or paralysis of spore germination and / or fungal mycelium growth that may result in the elimination of said fungi or in the reduction of damage. caused by these.
  • the term "effective antifungal amount” refers to the amount of antifungal protein capable of inhibiting spore germination and / or mycelium growth of the target fungus when applied to the plant, or to the medium. that surrounds it or when it is expressed in a transgenic plant.
  • the term “agriculturally acceptable vehicle” refers to those substances, or combination of substances, known in the agricultural sector, and includes adjuvants, solids or liquids, diluents, solvents, surfactants, etc.
  • said composition comprises, in addition to said antifungal protein, one or more proteins, with the same or different enzymatic activities, for example, different enzymatic activities required for the modification or degradation of fungal cell walls.
  • said composition may include one or more lithic enzymes capable of modifying or degrading fungal cell walls, for example, enzymes with cellulolytic, mannanolytic, chitmolytic or proteolytic activity, such as cellulases, - (1, 3) -glucanases , ⁇ - (1, 6) -glucanases, ⁇ - (l, 3) - glucanases, mannanases, endo- or exochitmases, chitosanases, proteases, ⁇ - or ⁇ -mannosidases, etc.
  • lithic enzymes capable of modifying or degrading fungal cell walls, for example, enzymes with cellulolytic, mannanolytic, chitmolytic or proteolytic activity, such as cell
  • the composition for controlling phytopathogenic fungi further comprises one or more chemical fungicides.
  • a chemical fungicide any of the commonly used chemical fungicides can be used, preferably a chemical fungicide selected from the group formed by the fungicides that affect the membrane, the fungicides that affect the synthesis of the cell wall and mixtures thereof.
  • composition for controlling phytopathogenic fungi contains between 0.01% and 100% by weight of said antifungal protein, can be prepared by conventional methods and can be presented in liquid or solid form, for example, in the form of a granulate. Additionally, said composition may contain additives, for example, preservatives and stabilizers that prolong the preservation and stability thereof.
  • the invention provides a method for controlling a phytopathogenic fungus in a plant, in particular, a fungus that contains in its cell wall a polymer having bonds - (1, 3) -glucosides, for example, S-glucan, which comprises the step of applying to said plant, or the surrounding environment, an effective amount of said composition to control said phytopathogenic fungus.
  • said method comprises the application of said composition on the aerial parts of the plant in order to prevent and / or treat a fungal infection caused by a phytopathogenic fungus.
  • the invention provides a method for controlling phytopathogenic fungi in a fruit comprising the step of applying to an fruit an effective amount of said composition for controlling phytopathogenic fungi.
  • the application of said composition on the fruit is carried out before its collection (pre-harvest) while in another alternative embodiment the application of the composition is made on the fruit already collected (post-harvest) .
  • the invention also contemplates the possibility of obtaining transgenic plants that express the antifungal protein according to the invention both in specific tissues or organs and in any other place of the plant or fruit.
  • plants and / or fruits resistant to phytopathogenic fungi can be obtained, responsible for considerable damage both during harvest and post-harvest.
  • Obtaining said transgenic plants can be carried out by conventional methods known to those skilled in the art, transforming plant cells with a DNA construct containing the coding sequence of an antifungal protein according to the invention [see the section on MOLECULAR BIOLOGY] .
  • the expression of said antifungal protein can be regulated by a constitutive or inducible promoter in plants in order for said antifungal protein to be expressed at the appropriate time and place so as to confer effective protection against the phytopathogenic fungus to be controlled.
  • the invention provides a pharmaceutical composition for preventing and / or treating pathogenic fungi of animals, including human pathogens, in particular fungi containing polymers in their cell wall that possess ⁇ - (1, 3) -glucosidic bonds, for example, S-glucan, which comprises an effective antifungal amount of said antifungal protein according to the invention together with, optionally, one or more pharmaceutically acceptable excipients.
  • This composition has a good antifungal activity against a large group of animal pathogenic fungi.
  • prevent and / or treat includes the inhibition, reduction or paralysis of spore germination and / or fungal mycelium growth that may result in the removal of such fungi or in the decrease of the damages caused by these.
  • the term "effective antifungal amount” refers to the amount of antifungal protein capable of inhibiting spore germination and / or mycelial growth of the pathogenic target fungus of animals when applied to the animal.
  • pharmaceutically acceptable excipient refers to those substances, or combination of substances, known in the pharmaceutical sector, and includes adjuvants, solids or liquids, solvents, surfactants, etc.
  • said pharmaceutical composition comprises, in addition to said antifungal protein, one or more proteins, with the same or different enzymatic activities, for example, different enzymatic activities required for the modification or degradation of cell walls, such as the enzymes mentioned previously. in relation to the composition to control phytopathogenic fungi.
  • said pharmaceutical composition further comprises one or more fungicides of those commonly used in the treatment of mycoses in animals.
  • the pharmaceutical composition provided by this invention contains between 0.01% and 99.99% by weight of said antifungal protein, can be presented in any appropriate administration form. In general, said pharmaceutical composition will be administered topically, in the form of an ointment or cream.
  • a review of the different ways pharmaceutical drug delivery and their methods of preparation can be found, for example, in the Tratado de Farmacia Galenica, C. Fauli i Trillo, I Edition, 1993, Luzan 5, SA de Ediils.
  • the invention relates to the use of said antifungal protein in the preparation of a medicament for the prevention and / or treatment of infection of animal fungi, including human pathogens.
  • the invention also provides a method for preventing and / or treating pathogenic fungi of animals, including pathogens of humans, in particular fungi that have polymers in their cell wall that possess bonds - (1, 3) -glucosides, by For example, S-glucan, which comprises the step of applying to an animal or a human being, in need of treatment, an effective amount of said pharmaceutical composition for the prevention and / or treatment of infections of animal pathogenic fungi.
  • Livestock facilities are susceptible to being infected by pathogenic fungi of animals that grow and develop on substrates that are in contact with the animal, for example, the straw used in animal beds, or in animal housing conditions , with which there is a risk that these animals will be infected by such pathogens.
  • the antifungal protein according to the invention can be used to disinfest, prevent and / or treat infection caused by pathogenic fungi of animals in livestock facilities comprising the step of applying on said livestock facilities an effective amount of said pharmaceutical composition for prevention and / or the treatment of fungal infections of animal pathogens.
  • test samples for analysis by For example, biological, food samples, etc., have fungal contamination that makes it difficult or impossible to analyze these samples.
  • the invention also provides a solution to said problem which comprises contacting the sample to be analyzed with an effective amount of said antifungal protein according to the invention, in order to control the possible fungal contamination.
  • MOLECULAR BIOLOGY From the information provided by the antifungal protein according to this invention it is possible to identify and isolate the DNA sequence encoding said protein by using conventional techniques, for example, by creating genomic DNA libraries (gDNA) or of DNA copy (cDNA) of organisms producing said protein; sequencing the ammo end of said protein and tryptic fragments thereof; the design of oligonucleotides suitable for amplifying, by means of the polymerase chain reaction (PCR), a region of the genomic clone of the organisms producing said protein that serves to obtain probes intended to screen said libraries; and the analysis and selection of positive clones. All these steps are described in more detail in Examples 12 and 13.
  • gDNA genomic DNA libraries
  • cDNA DNA copy
  • PCR polymerase chain reaction
  • the invention provides a DNA construct encoding an antifungal protein according to the invention, comprising: a) a DNA sequence identified as SEC. ID. N °: 2; or b) a DNA sequence analogous to the sequence defined in a) that i) is substantially homologous to the sequence of
  • DNA defined in a); and / or ii) encodes for a polypeptide that is substantially homologous to the protein encoded by the DNA sequence defined in to) .
  • the term "analogue” is intended to include any DNA sequence encoding an antifungal protein according to the invention having the properties i) -i ⁇ ) mentioned above.
  • the analogous DNA sequence can be isolated from an organism that produces the antifungal protein and exhibits activity - (1, 3) - glucanase, based on the DNA sequence shown in the SEC. ID. N °: 2, or is constructed based on the DNA sequence shown in the SEC. ID.
  • N ° 2, for example, by the introduction of conservative nucleotide substitutions, that is, they do not give rise to another amino acid sequence of the protein with antifungal activity encoded by said DNA sequence shown in SEC. ID. N °: 1, but that corresponds to the use of codons of the host organism destined for the production of the protein, or by the introduction of nucleotide substitutions that give rise to a different amino acid sequence and, therefore, possibly, to a Different protein structure that could lead to a mutant protein with different properties than the native protein.
  • analog DNA sequence may be a sub sequence of the DNA sequence shown in any of the sequences shown in SEC. ID. N °: 2.
  • the analogous DNA sequence is substantially homologous to the DNA sequence encoding the antifungal protein of the invention, for example SEC. ID. N °: 2, that is, it has a nucleotide level homology of at least 70%, preferably at least 85%, or more preferably at least 95% with respect to any of the previously mentioned sequences .
  • said DNA sequence is the sequence identified as SEC. ID. N °: 2 corresponding to the nucleotide sequence encoding the complete AGN13.1 of T. harz ⁇ anum.
  • the invention also provides a DNA sequence that encodes only the domain responsible for binding to the cell wall of said antifungal protein according to the invention, selected from the group consisting of: a) a DNA sequence identified as SEC. ID. N °: 3; b) a DNA sequence that is substantially homologous to the DNA sequence defined in a); and c) a DNA sequence encoding a polypeptide that is substantially homologous to the domain responsible for binding to the cell wall of the antifungal protein encoded by the DNA sequence defined in a).
  • SEC. ID. N °: 3 corresponds to the nucleotide sequence that encodes the module responsible for binding to the cell wall that has the AGN13.1 protein.
  • DNA sequence encoding said antifungal protein as well as the DNA sequence encoding only the domain responsible for binding to the cell wall of said protein constitute, interchangeably, what is called the DNA sequence of the invention.
  • the DNA sequence of the invention can be derived from any microorganism that naturally contains it, for example, T. harz ⁇ anum or from a host organism transformed with said DNA sequence.
  • the DNA sequence of the invention can be isolated, by conventional techniques, from the DNA of any organism by the use of probes or oligonucleotides prepared from the information on the DNA sequence provided in this description.
  • the DNA sequence of the invention, or the construction that it contains it, it can be inserted in an appropriate vector. Therefore, the invention also relates to a vector, such as an expression vector, comprising said DNA sequence, or a construct containing it. The choice of the vector will depend on the host cell into which it will be subsequently introduced.
  • the vector where said DNA sequence is introduced can be a plasmid or a vector that, when introduced into a host cell, is integrated into the genome of said cells and replicated together with the chromosome (or chromosomes) in which (in which) it has been integrated.
  • the DNA sequence of the invention must be operatively connected to a promoter and a thermistor sequence.
  • the promoter can be any DNA sequence that shows a transcriptional activity in the chosen host cell and can be derived either from genes encoding homologous or heterologous proteins of the host cell.
  • the methods used to bind the DNA sequence of the invention to the promoter and the thermistor sequence, respectively, and to insert said construct into a vector are well known to those skilled in the art and have been described, for example, by Sambrook et al. . [Molecular Clonmg. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1989].
  • the invention also provides a cell comprising a DNA sequence of the invention, or a DNA construct containing said sequence or said vector mentioned above.
  • the host cells that can be transformed with the DNA sequence of the invention can be prokaryotic or, preferably, eukaryotic cells, such as plant tissue cells or fungal cells, for example, yeast or filamentous fungal cells.
  • the transformation of fungal cells can be carried out by conventional techniques, for example, techniques that involve the formation of protoplasts and their transformation followed by the regeneration of the cell wall.
  • Cell transformation of plant tissues can also be carried out by conventional methods and it can be interesting to provide resistance to the transformed plant against pernicious organisms, for example, phytopathogenic fungi.
  • the invention also provides a method for the production of an antifungal protein according to the invention comprising culturing a suitable host cell that contains the DNA sequence encoding said antifungal protein under conditions that allow protein production and recovering the protein from the medium. of cultivation
  • the medium used to grow the transformed host cells can be any suitable means to grow the host cells in question.
  • the expressed protein can, advantageously, be secreted into the culture medium and can be recovered by any conventional method of protein isolation which comprises the separation of the cells from the culture medium, the precipitation of the proteins and the separation by chromatographic methods.
  • T. harz ⁇ anum and the production of AGN13.1 can be carried out in several ways using various carbon sources.
  • T was cultivated for the production and purification of AGN13.1. harz ⁇ anum 2413 in two stages following protocols already described by De la Cruz et al. [De la Cruz et al., J. Bacteriol., 1995, Vol. 177, No. 7, 1864-1871]. Briefly, in a first stage spores of T.
  • harz ⁇ anum were inoculated at a final concentration of 10 8 spores / ml in minimal medium (MM) [KH 2 P0 4 , 15 g / 1; (NH 4 ) 2 SOschreib, 5 g / 1; 1 ml / l of trace elements (FeS0 4 -7H 2 0, 5 g / 1; MnS0 4 -H 2 0, 1.6 g / 1; ZnS0 4 -7H 2 0, 1.4 g / 1; CoCl 2 - 6H 2 0, 3.7 g / 1)] supplemented with 2% glucose as a carbon source.
  • the final pH of the culture medium was adjusted to 5.5 with 1 M KOH. In this pre-induction medium T.
  • harz ⁇ anum was cultured for 48 hours at 28 ° C and with orbital stirring at 200 rpm. Subsequently, the mycelium was collected, washed successively with MgCl 2 and H 2 0 and transferred to MM supplemented with 1.5% chitin as a carbon source.
  • T. harz ⁇ anum CECT 2413 was maintained in a PDA (potato-dextrose-agar) culture medium [Difco].
  • PDA potato-dextrose-agar
  • T. harz ⁇ anum 2413 was grown in two stages following protocols already described by De la Cruz et al. [De la Cruz et al., Arch. Microbiol., 1993, 159, 316-322]. Briefly, in a first stage aliquots of 10 6 conidia of T. harz ⁇ anum 2413 were inoculated in 1 1 Erlenmeyer flasks containing 600 ml of potato-dextrose broth supplemented with Czapek salts [De la Cruz et al., Arch.
  • ⁇ - (1, 3) - Glucanase is repressed at high concentrations of glucose [2% (w / v)] but not in conditions of carbon starvation [0.1% (w / v)] and is induced in the presence of complete fungal cell walls or their constituent polymers . Therefore, the production of ⁇ - (1, 3) -glucanase activity [AGN13.1] by T. harzianum is dependent on the available carbon source. In view of Table 1, cell walls of A can be used routinely for the purification of AGN13.1. niger [0.5% (w / v)].
  • the ⁇ - (1, 3) -glucanase activity can be determined by an assay consisting of preparing a reaction mixture containing 0.8 ml of 0.5% (w / v) - (1/3) -glucan solution ) in 50 mM potassium acetate buffer, pH 5.5, and 0.2 ml of the enzyme solution to be tested properly diluted in the same buffer.
  • the - (1, 3) -glucan was obtained following previously described protocols [Zonneveld, Biochim. Biophys Minutes, 1971, 258, 541-547].
  • the reaction mixture is incubated at 37 ° C for a period of time between 30 minutes and 1 hour, stopping the reaction by heating at 100 ° C for 7 minutes.
  • the results obtained by testing the enzyme AGN13.1 of T. harzianum by this method showed that said enzyme can degrade - (1, 3) -glucan.
  • the activity of the AGN13.1 enzyme to degrade other polymers present in fungal cell walls, such as - (1, 4) - and - (1, 6) -glucan, chitin was assessed by the corresponding assays. ⁇ - (l, 3) - and ⁇ - (1, 6) -glucan, etc., obtaining a negative result in all cases.
  • the ⁇ - (1, 3) -glucanase activity can also be determined by an assay consisting of preparing a mixture of reaction containing 2 ml of a 5 mg / ml solution of S-glucan [- (1, 3) -glucan] of A. niger in 50 mM potassium acetate buffer, pH 5.5, and 50 ⁇ l of the enzymatic solution a Test properly diluted in the same buffer.
  • the reaction mixture is incubated at 37 ° C for 1 hour and the reaction is stopped by heating at 100 ° C for 5 minutes.
  • the samples are centrifuged at 5,000 g for 5 minutes, 0.15 ml of supernatant is collected per reaction and the increase in reducing sugars is determined by the Somogyi method [J.
  • 1 unit of activity - (1, 3) -glucanase is defined as the amount of enzyme that releases 1 ⁇ mol of equivalents of reducing sugars, expressed as glucose, per minute, under the conditions tested.
  • Protein concentration was determined by the method of Bradford [Bradford, Anal. Biochem , 1976, 72, 248-254].
  • the purification of the AGN13.1 protein from T. Harz ⁇ anum relied on its affinity for a more soluble substrate.
  • the purification of said protein can be carried out following several methods, based on said characteristic, which comprise precipitation with ammonium sulfate, adsorption-digestion to a more soluble substrate for which it has affinity and separation by gel filtration chromatography.
  • 3.1 Method A The purification of the AGN13.1 protein from T. harzianum according to this alternative comprises the steps of: A) Precipitation with ammonium sulfa
  • the precipitates obtained after the successive adsorption were washed three times with 3 ml of a 1 M NaCl solution in 70 mM phosphate-KOH buffer, pH 6.0 and finally resuspended in 50 mM potassium acetate buffer, pH 5.5 with 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride and 1 mM sodium azide. These samples were incubated overnight at 37 ° C. The clarified fraction, the result of degradation of cell walls, was centrifuged at 12,000 g for 10 minutes. The supernatant (5-10 ml) was dialyzed again against 25 mM imidazole-HCl buffer, pH 7.4. Under these test conditions, a mayorita ⁇ a protein was obtained which is the one identified in this description as AGN13.1.
  • step b) Gel filtration
  • the dialyzed solution from step b) was applied to a column (1.6 x 40 cm) of Sephacryl S-200 HR (Pharmacia) equilibrated with 100 mM potassium acetate buffer, pH 5.5 with 100 mM KC1 and eluted with the same buffer at a flow of 7 ml / h.
  • the different fractions obtained were tested to evaluate the ⁇ - (1, 3) -glucanase activity, selecting those that showed the highest levels, which were collected, washed and concentrated in 50 mM potassium acetate buffer, pH 5.5 in a Centricon 10 (Amicon) concentrator.
  • the purified proteins (AGN13.1) were stored at 4 ° C.
  • Example 4 Analysis by SDS-PAGE (Example 4) of samples from the digestion of S-glucan revealed a major band and other minor bands. The final purified preparation migrated as a single band in SDS-PAGE with an apparent molecular weight of approximately 72 kDa. When the molecular weight was calculated by gel filtration chromatography, the value obtained was approximately 67 kDa. The gel filtration elution model showed a correlation between the protein mayorita ⁇ a present in the digestions of S-glucan and the activity ⁇ - (1, 3) -glucanase.
  • EXAMPLE 4 Determination of molecular weight The molecular weight of AGN13.1 protein was determined by analytical electrophoresis under denaturing conditions and by gel filtration chromatography.
  • electrophoresis of the AGN13.1 protein can be performed under denaturing conditions (SDS-PAGE) by the method of Laemmli [Laemmli, UK, Nature, 1970, 227, 680-685], using 4% ac ⁇ lamide gels in in stacking gels and 12% acrylamide in the separation gel.
  • the samples were diluted in Laemmli buffer and boiled for 3 minutes before loading.
  • the gels were stained with Coomassie R-250 bright blue.
  • Low molecular weight protein (Bio-Rad) patterns were used for molecular weight determination. The apparent molecular weight of the AGN13.1 protein, under the conditions tested, It is approximately 72 kDa.
  • the molecular weight of the native AGN 13.1 protein was determined by gel filtration chromatography technique on a Sephacryl S-200 HR column (Pharmacia) (1.6 x 40 cm) calibrated with marker proteins, obtaining a value of Approximately 67 kDa
  • the molecular weight of AGN13.1 was determined from the digestion of S-glucan, by gel filtration chromatography on a PAK125 column.
  • the AGN13.1 pl of T. harz ⁇ anum was determined by analytical basic chromato-focus using a Polybuffer Exchanger PBE94 column (Amersham-Pharmacia) following exactly the procedure described by De la Cruz et al. [De la Cruz et al., J. Bacteriol., 1995, 177, 1864-7].
  • the value of Apparent pl calculated by analytical basic chromatoenfoque was approximately 7.6.
  • the Michaelis-Menten constant was determined from Lineweaver-Burk representations using the data obtained by measuring the initial rate of S-glucan hydrolysis (used as substrate) in a range of S-glucan concentrations between 0.5 and 20 mg / ml. The values obtained were the following: - Km: 2.5 mg / ml; and - Vmax: 43 ⁇ moles of product / min .mg of protein
  • the optimum temperature was determined by a conventional test within a temperature range between 20 ° C and 80 ° C.
  • the optimum temperature for AGN13.1 was calculated at 55 ° C at a pH of 5.5.
  • Thermal stability was determined by incubating purified AGN13.1 protein for 30 minutes at temperatures between 20 ° C and 80 ° C, in 50 mM potassium acetate buffer, pH 5.5, and then measuring the remaining activity at 37 ° C adding S-glucan as a substrate.
  • the inactivation temperature was defined as the temperature at which the specific activity was reduced by 50%, under the conditions previously described.
  • the inactivation temperature obtained was 50 ° C.
  • the ⁇ - (1,3) -glucanase activity was determined by any of the protocols described in Example 2.
  • the chitmase activity was determined following the protocol described by De la Cruz et al. [De la Cruz et al., Eur. J. Biochem. , 1992, 206, 856-867], protease activity by the protocol described by Schwartz & Barrett [Schwartz, W. & Barrett, AJ, Biochem. J., 1980, 191, 487-497], and lithic activity using the protocol described by De la Cruz et al. [De la Cruz et al., Arch. Microbiol., 1993, 159, 316-322].
  • 2 ⁇ -glucans have been described in detail as components of the matrix of at least the cell walls of Penicillium sp. and A. niger
  • A. niger 2514 was grown in 10 1 in 8 1 flasks of medium containing glucose (46 g / 1), tartaric acid (2.66 g / 1), ammonium nitrate (2.66 g / 1), sulfate ammonium (0.167 g / 1), potassium bicarbonate (0.932 g / 1), magnesium carbonate (0.266 g / 1), monoammonium diacid phosphate (0.5 g / 1), ferrous sulfate
  • the culture was maintained for a week with aeration at 28 ° C.
  • the culture was autoclaved and the mycelium was collected by filtration through a heartman filter paper No. 1, and washed extensively with 2% magnesium chloride and distilled water. All recovered biomass, primarily material from cell walls, was lyophilized and ground in a mortar with liquid nitrogen. Then, it was treated with 5% KOH for 18 hours at 37 ° C.
  • the supernatant which mainly contained a fraction of the alkali-soluble glucan cell wall (S-glucan), was obtained by centrifugation at 9000 g for 10 minutes.
  • T. harzianum AGN13.1 against S-glucan was examined by measuring glucose production against reducing sugar production at different times, comparing the activities of the purified enzyme against S-glucan and S -glucan oxidized with periodate (I04-S-glucan) and finally analyzing the corresponding hydrolysis products by high performance liquid chromatography (HPLC) analysis.
  • the hydrolysis of the substrates was determined by the purified AGN13.1 of T. harzianum by HPLC using Aminex HPX 42-A (Bio-Rad) columns maintained at 40 ° C, using water as eluent at a flow of 0.4 l / min The products were detected based on the refractive index and were identified by comparison with glucose and oligosaccharide patterns of 2 to 4 glucoses.
  • This mechanism would allow combining the AGN13.1 of T. harzianum with other lithic cell wall enzymes with exo- and / or endo-hydrolytic action mechanisms, in order to more efficiently degrade cell wall polymers containing - (1, 3) -glucan, together with another other polymers, as well as having a greater enzymatic potential with antifungal activity on pernicious fungi.
  • the fungal cell wall is a very complex structure composed of polymers of many different types. Therefore, knowing exactly which of the various elements that make up the wall binds a protein can be very useful information to find out by what activity (or activities) that protein produces the antifungal effect.
  • a fractionation of the different fungal cell wall components was carried out following previously described protocols [Ben ⁇ tez et 1., Arch. Microbiol., 1976, 108, 183- 188]. Subsequently, binding assays of the AGN13.1 protein were performed with each of the purified components, following the procedure used for purification of the AGN13.1 protein by adsorption to cell walls of Penic ⁇ llium sp. [see Example 3.1 Method A]. The result was that the AGN13.1 protein showed a strong affinity for the fraction enriched in ⁇ - (1, 3) -glucans.
  • T. harzianum performed a test, briefly, on growing in a microplate well 3,000 spores of
  • Penicillium sp. in PDA (Difco) diluted 3 times with respect to the concentration recommended by the manufacturer, together with the protein whose antifungal activity is desired to be tested (AGN13.1), at different concentrations, kept at 25 ° C for a period of time between 15 and 60 hours, and subsequently, observed under an optical microscope.
  • AGN13.1 protein whose antifungal activity is desired to be tested
  • BSA bovine serum albumin
  • Figure 1A shows the antifungal effect, determined as the inhibition of the growth of the phytopathogenic fungus Peni cilli um digi ta tum, produced by the AGN13.1 protein, at a concentration of 225 ⁇ g / ml, on 3,000 spores of P. digi ta tum after 17 hours of incubation.
  • Figure IB shows the result of a negative control consisting of incubating for 3 hours 3,000 spores of P. digi ta tum with 225 ⁇ g / ml of BSA.
  • Figure 1 shows the reduction in the germination of fungal spores due to the action of the AGN13.1 protein that results in an inhibition of fungus growth.
  • Figure 2A shows the antifungal effect, determined as the appearance of morphological alterations of the mycelium of the phytopathogenic fungus P. digi ta tum, produced by the T. harz ⁇ anum AGN13.1 protein, at a concentration of 225 ⁇ g / ml, on 3,000 spores of P. digi ta tum after 60 hours of incubation.
  • Figure 2B shows the result of a negative control consisting of incubating for 3 hours 3,000 spores of P. digi ta tum with 225 ⁇ g / ml of BSA.
  • Figure 2 shows the appearance of morphological alterations in the hyphae of the fungus P. digi ta tum due to the action of the AGN13.1 protein of T. harz ⁇ anum.
  • T. harzian ⁇ m AGN13.1 protein Binding of T. harzian ⁇ m AGN13.1 protein to fungal cell walls
  • a first trial was performed with A spores. niger CECT 2574 in NUNC microplates, in a total volume of 15 ⁇ l containing 1 ⁇ l of 5x (5 x 24 g / 1) concentrated potato-dextrose broth, 2 ⁇ l of a spore dilution (150 spores) of each fungus and completing with the enzyme AGN13.1 diluted in water (previously dialyzed against itself). Different enzyme concentrations were tested (90, 180 and 270 ⁇ g / ml) and each one was repeated in triplicate using spores with water as a control.
  • Figures 3 and 4 show the results obtained in Figures 3 and 4, where the values that are represented correspond to the average of the three repetitions in each case with determination of the error of each one of them.
  • Figure 5 shows the inhibition of the growth of the mycelium of A. Niger CECT 2574 after 23 hours, at the concentrations tested, which highlights the antifungal effect of AGN13.1 from T. harz ⁇ anum.
  • the AGN13.1 enzyme is quite active against A cell walls. Niger, B. cinérea and P. auran tog ⁇ seum, but it is not active against the cell walls of S. Pombe, S. cerevisiae or P. syringae [see Table 2].
  • the mechanism of action of AGN13.1 was tested against the cell walls of A. niger or P. a uran tog ⁇ seum, an exo type mechanism was detected, in which glucose was the major final product of hydrolysis. Therefore, it seems that the AGN13.1 enzyme acts as a lytic enzyme against cell walls of phytopathogenic fungi containing polymers with ⁇ - (1, 3) -glucosidic bonds.
  • EXAMPLE 12 Clone e of a DNA sequence encoding the AGN13.1 protein
  • the sequences of the amino and / or internal peptide ends of the AGN13.1 protein were used, while for the design of the reverse oligonucleotides, the sequences of the vector in which the cDNA library was constructed were used. .
  • RNA was isolated.
  • an oligo affinity chromatography (dT) cellulose (Stratagene, La Jolla, CA) was used.
  • the cDNA was then synthesized using the commercial kit "ZAP-cDNA synthesis kit" (Stratagene).
  • the Eco RI and Xho I adapters were attached to the cDNA thus obtained and linked to the Uni-Zap XR vector (Stratagene, La Jolla, CA).
  • the kit was used "Gigapack III gold packaging extract" packaging (Stratagene, La Jolla, CA), following the manufacturer's instructions.
  • micro sequencing was performed following the method of Edmans Matsudaira [A practical guide to protein and peptide purification for microsecuencing. Academic Press, Inc., New York, Edmans Masudaira (eds.) 1989]. The results obtained were the following:
  • a degenerate oligonucleotide designed from the internal peptide of the AGN13.1 protein was used as a sense oligonucleotide and as a antisense oligonucleotide a sequence corresponding to the plasmid in which the library was constructed (pBluescript II, Stratagene, La Jolla,
  • the direct and reverse oligonucleotides were the following:
  • N is mosma
  • Y is T or C
  • PCR was performed using cDNA from the cleavage of the library as a template and using 100 pmoles of each oligonucleotide in 25 ⁇ l of total PCR volume.
  • the phage was cleaved following the manufacturer's instructions, then sequenced by both chains of the insert it carried. In said clone was the entire ORF together with fragments of the 5 'and 3' non-coding regions.
  • a cDNA library was constructed in a Uni-Zap XR (Stratagene) vector from the poly (A) + RNA tail isolated from T. harzianum CECT 2413 grown under conditions that simulated antagonism, which, in this case were minimum medium containing 0.5% of B cell walls. cynerea or P. syringae.
  • the cDNA was synthesized using the commercial kit , X ZAP-cDNA synthesis kit "(Stratagene) on each batch of poly (A) + RNA, bound to the Uni-Zap XR vector (Stratagene) and packaged in" Gigapack III gold packaging extract "(Stratagene), following the manufacturer's instructions.
  • the primary library title was approximately 2xl0 6 independent plate forming units (UFP).
  • the total DNA was isolated from said library and was used as a temper for PCR using the oligonucleotide as the direct (sense) primer whose sequence is shown. in the SEC. ID. N °: 6 and as an antisense oligonicleotide a commercial T3 initiator [SEC. ID. N °: 8].
  • DNA amplification was performed under the following conditions: 95 ° C for 1 minute; 55 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 1 minute, repeating this cycle 35 times.
  • a single amplified fragment of 1800 bp was obtained which was subcloned into plasmid pGEM-T (Promega) and sequenced.
  • the amplified cDNA fragment corresponds to the carboxyl end region of the agnl3 gene. one . Therefore, to obtain a full length cDNA to said gene, said 32 P PCR-amplified fragment was used as a probe to screen the previously obtained ZAPII cDNA library. Hybridizations were performed using a conventional protocol [Lora et al., Mol. Gen. Genet., 1995, 247, 639-645]. After the screening of approximately 40,000 PFU of said cDNA library, several positive clones were obtained and from them, the one containing the largest insert (2,190 bp) was selected for subsequent characterization. Said insert was subcloned into plasmid pGEM-T (Promega) and sequenced.
  • the insert contains a single ORF of 1908 bp, a 5 'untranslated sequence of 110 bp and a 3' untranslated sequence of 133 bp.
  • the product translation of the agnl3 gene. 1 has a sequence of 636 amino acids with an estimated molecular weight of approximately 67 kDa. Comparison of the deduced sequence with the experimentally determined amino terminal sequence of AGN13.1 indicates that the mature protein begins at the remainder 38. Thus, the OI- (1,3) -glucanase of T. harzianum contains 597 residues of amino acids and has an estimated molecular weight of 63,789 kDa and an estimated pl of 5.36.
  • the predicted protein contains the peptides sequenced from the purified protein, which demonstrates that the cloned agnl 3. 1 cDNA encodes the purified AGN13.1.
  • EXAMPLE 14 Expression model of the agnl3 AENm. 1 and AGN13.1 protein Northern blot and Western blot analyzes were performed to establish whether the induction of agnl3. 1 occurred preferably under conditions similar to those involving the T. harzianum antagonism response.
  • AGN13.1 mRNA is produced under conditions of carbon starvation in a short period of induction time except in a medium with 0.1% glucose where no signal is observed, probably as a result of presence of glucose in sufficient quantity for catabolic repression.
  • catabolic derepression is a general situation for T. harzianum grown under conditions of carbon starvation. Therefore, similar levels of AGN13.1 mRNA are produced although certain cell wall inducers may exist. Regarding nitrogen conditions, no signal was observed, suggesting that transcription of the 13.1 mRNA depends solely on the carbon source.
  • T. harzianum was grown in the presence of the following carbon sources: 2% glucose, 0.1% glucose, 1.5% chitin, 0.5% P. syringae cell walls, cell walls of P. a uran togriseum 0.5%, and cell walls of A. niger 0.5%, and under conditions of nitrogen hunger.
  • the results show that the extracellular production of AGN13.1 from T. harzianum in the presence of various carbon sources is conditioned by the absence of an assimilable carbon source, especially by the presence of cell walls or polysaccharides, such as Chitin, in the culture media. In 2% glucose media, with or without nitrogen limitation, the protein is not produced.
  • catabolic derepression is the one that mainly leads to the production of the AGN13.1 protein.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Beans For Foods Or Fodder (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

La invención se refiere al empleo como agente antifúngico de una proteína que posee, al menos, actividad enzimática α-(1, 3)-glucanasa, a composiciones antifúngicas que comprenden dicha proteína y a métodos para controlar, prevenir y/o tratar infecciones causadas por hongos patógenos de plantas, animales, incluido el hombre, contaminantes de cultivos y contaminantes de alimentos.

Description

COMPOSICIONES ANTIFÚNGICAS Y MÉTODOS PARA CONTROLAR HONGOS
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La invención se refiere al empleo como agente antifungico de una proteina que posee, al menos, actividad enzimática α-
(1, 3) -glucanasa, a composiciones antifúngicas que comprenden dicha proteina y a métodos para controlar, prevenir y/o tratar infecciones causadas por hongos perniciosos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Numerosas especies fúngicas pueden actuar como patógenos de plantas de gran importancia económica provocando cuantiosas perdidas de rendimiento y calidad. Para prevenir y reducir las enfermedades causadas por hongos fítopatógenos se han identificado diversos compuestos con actividad antifungica, tanto naturales como sintéticos.
Asimismo, en determinadas ocasiones surgen infecciones fúngicas oportunistas causadas por distintas especies de hongos, tales como Candida sp., Aspergill us sp., etc., que pueden llegar a provocar cuadros patológicos graves, especialmente en pacientes mmunocomprometidos, por ejemplo, la candidiasis orofaπngea en enfermos de SIDA. A pesar de que se utilizan diversos fungicidas en terapia humana o animal, a base de polienos o azoles, se siguen buscando agentes antifúngicos eficaces frente a dichas infecciones.
Una característica común de los hongos, en particular, de los hongos filamentosos y levaduπformes, es la existencia de paredes celulares. La estructura química de la pared celular de los hongos es bastante compleja y está relativamente poco estudiada. En general, se conoce que la pared celular esta formada por un esqueleto de quitina o celulosa y de β-1,3- glucanos junto con otros polímeros minoritarios, tales como los β-1, 6-glucanos o los - ( 1, 3 ) -glucanos, pero que parecen ejercer una función critica en el mantenimiento de la estructura de la pared. Una manera especifica de destruir la pared celular de un hongo seria mediante el empleo de enzimas hidroliticas de los polímeros constituyentes de la pared celular. Aunque se conocen numerosas enzimas hidroliticas de tales polímeros tan solo una minoría de ellas tiene la capacidad de destruir una pared celular fúngica intacta (capacidad lítica) . En algunos casos, la capacidad lítica reside en la capacidad de la enzima hidrolítica de unirse a la pared celular del hongo que se desea destruir. Tal capacidad reside en un dominio de unión a la pared de la enzima hidrolítica que es independiente del dominio responsable de la actividad enzimática. Por tanto, en la búsqueda de agentes antifúngicos selectivos, dichas enzimas hidrolíticas con capacidad de unión a paredes celulares fúngicas serian unos candidatos muy prometedores. Debido a que la quitina y el β-1 , 3-glucano son los principales componentes estructurales de las paredes celulares de los hongos (excepto en el caso de los Oomycetes, que contienen β-glucanos y celulosa) , se ha propuesto que las quitmasas y las β-1 , 3-glucanasas sean las enzimas clave en la lisis de las paredes celulares de hongos fítopatógenos . Sin embargo, parece que otras enzimas que degradan las paredes celulares, incluyendo aquéllas que hidrolizan los polímeros minoritarios ( β-1 , 6-glucanos, -1 , 3-glucanos, etc.), también pueden estar implicadas en la degradación eficaz y completa de las paredes del micelio y de los conidios de hongos fítopatógenos .
Los polisacaridos que contienen enlaces -glicosídicos parecen jugar un papel importante en la arquitectura y composición de la pared celular de los hongos. Los glucanos conocidos como glucanos solubles en álcali (S-glucano) incluyen desde polímeros que contienen únicamente enlaces α- ( 1 , 3 ) - glucosídicos hasta polímeros que contienen enlaces -(l,3)- y o¡- ( 1, 4 ) -glucosídicos que se alternan regularmente [Bartnicki- García, Annu. Rev. Microbiol., 1968, 22, 87-109; Bacon et al., Biochim. Biophys. Acta, 1968, 158, 313-315]. El S-glucano representa el polisacárido mayoritario de la matriz de muchos hongos, llegando a alcanzar hasta aproximadamente el 25% del peso seco de la pared celular de Aspergillus nidulans . A pesar de la importancia del S-glucano, poco se conoce de la existencia de actividades enzimáticas capaces de hidrolizar dicho polímero. Las a- (1, 3) -glucanasas [glucano ( 1, 3) - -glucosidasa, EC 3.2.1.84] son enzimas capaces de hidrolizar enlaces α-(l,3)- glucosidicos . No existe mucha información sobre estas enzimas. La solicitud de patente japonesa JP 04058889 describe una enzima con actividad - ( 1, 3) -glucanasa de Tπ choderma harzíanum, que degrada mutano (mutanasa) un polímero extracelular de -(l,3)- glucano producido por Streptococcus sp . que colonizan los dientes. La solicitud de patente WO 98/00528 describe una mutanasa recombinante derivada de T. harzíanum y su empleo en productos destinados a la higiene oral.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
La invención se enfrenta con el problema de proporcionar agentes con actividad antifungica. La solución proporcionada por esta invención se basa en que los inventores han identificado una proteina que posee, al menos, actividad enzimatica - ( 1, 3 ) -glucanasa, y tiene, ademas, sorprendentemente, actividad antifungica, por lo que es útil para controlar hongos, en particular, hongos que contienen en su pared celular polímeros que poseen enlaces α- ( 1, 3) -glucosidicos, por ejemplo, S-glucano.
La actividad antifungica de dicha proteina se ha puesto de manifiesto mediante ensayos de inhibición de la germinación de esporas y/o de inhibición del crecimiento del micelio de hongos y ensayos de unión a las paredes celulares de los hongos.
Por tanto, un objeto de esta invención lo constituye el empleo como agente antifungico de una protema que posee, al menos, actividad enzimatica α- (1, 3) -glucanasa .
Un objeto adicional de esta invención lo constituye una composición antifungica que comprende dicha protema útil como agente antifúngico.
Otro objeto adicional de esta invención lo constituye una composición farmacéutica que comprende dicha proteína útil como agente antifúngico. Otro objeto adicional de esta invención lo constituye un método para inhibir la germinación de esporas y/o el crecimiento del micelio de hongos, que comprende poner en contacto dichos hongos con dicha composición antifúngica.
Otro objeto adicional de esta invención lo constituye un método para controlar hongos fitopatógenos que comprende poner en contacto dichos hongos con dicha composición antifúngica.
Otro objeto adicional de esta invención lo constituye un método para prevenir y/o tratar infecciones causadas por hongos patógenos de animales, incluidos los seres humanos, que comprende administrar al animal o paciente en necesidad de tratamiento una cantidad terapéuticamente eficaz de dicha proteina útil como agente antifungico o de dicha composición farmacéutica .
Otro objeto adicional de esta invención lo constituye el empleo de dicha proteína útil como agente antifúngico, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades causadas por hongos .
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra una imagen observada al microscopio óptico en donde se aprecia el efecto antifungico, determinado por la inhibición de crecimiento del hongo fitopatogeno Peni cilli uu digi ta tum, producido por la protema antifungica AGN13.1 de T. harzíanum [Figura 1A] y la comparación con un control negativo [Figura IB] .
La Figura 2 muestra una imagen observada al microscopio óptico en donde se aprecia el efecto antifúngico, determinado por las alteraciones morfológicas del micelio del hongo fitopatógeno P. digi ta tum, producido por la proteína antifúngica AGN13.1 [Figura 2A] y la comparación con un control negativo [Figura 2B] .
La Figura 3 es un diagrama de barras que muestra el efecto antifúngico de la enzima AGN13.1 de T. harzíanum sobre la germinación de esporas de Aspergillus niger CECT 2574 determinado a las 12 horas [Ejemplo 11] .
La Figura 4 es una gráfica que muestra el efecto de la enzima AGN13.1 de T. harzíanum sobre el crecimiento de A . niger CECT 2574 [Ejemplo 11] .
La Figura 5 muestra una imagen observada al microscopio óptico en donde se aprecia el efecto antifúngico, determinado por las alteraciones morfológicas del micelio de A . niger CECT
2574, al cabo de 23 horas, producido por la proteína antifúngica
AGN13.1 de T. harzíanum a distintas concentraciones: 90 μg/ml
[Figura 5A] , 180 μg/ml [Figura 5B] y 270 μg/ml [Figura 5C] y la comparación con un control negativo a base de agua [Figura 5D] .
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La invención se relaciona con el empleo como agente antifúngico de una proteina que posee, al menos, actividad enzimatica α- ( 1, 3 ) -glucanasa, en adelante proteína antifungica.
PROTEÍNA ANTIFUNGICA
La proteína antifungica es una proteína que tiene, al menos, actividad enzimática - ( 1, 3) -glucanasa y la capacidad de unirse a una pared celular de un hongo, en particular de un hongo que contiene en su pared celular un polímero que posee enlaces - ( 1, 3) -glucosídicos , e inhibir la germinación de esporas y/o el crecimiento del micelio de un hongo, en particular, de un hongo que contiene en su pared celular un polímero que posee enlaces α- ( 1, 3 ) -glucosídicos .
En una realización particular, dicha proteína antifúngica tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre: a) la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. N°: 1, y b) una secuencia de aminoácidos sustancialmente homologa y funcionalmente equivalente a la secuencia de aminoácidos mostradas en la SEC. ID. N°: 1.
En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión
"sustancialmente homologa" significa que las secuencias de aminoácidos en cuestión tienen un grado de identidad, a nivel de aminoácidos, de, al menos, un 70%, preferentemente de, al menos, un 85%, y, más preferentemente de, al menos, un 95%.
Asimismo, en el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "funcionalmente equivalente" significa que la proteína en cuestión tiene actividad α- (1, 3) -glucanasa y actividad antifúngica, determinada esta última mediante la capacidad de unirse a una pared celular de un hongo, en particular de un hongo que contiene en su pared celular un polímero que posee enlaces α- (1, 3) -glucosídicos, e inhibir la germinación de esporas y/o el crecimiento del micelio de un hongo, en particular, de un hongo que contiene en su pared celular un polímero que posee enlaces α- ( 1, 3) -glucosídicos .
La actividad α- ( 1, 3) -glucanasa se puede determinar mediante los ensayos descritos en el Ejemplo 2; la capacidad de unión de la proteína antifúngica a componentes de paredes celulares de hongos se puede determinar mediante el protocolo descrito en el Ejemplo 9; la capacidad de unión de la proteína antifúngica a paredes celulares de hongos se puede determinar mediante el protocolo descrito en el Ejemplo 11; y la actividad antifúngica de la proteína antifúngica se puede comprobar mediante el protocolo descrito en el Ejemplo 10.
En una realización particular, dicha proteína antifúngica, es una α- ( 1 , 3) -glucanasa de T. harzíanum, por ejemplo, la α- (1, 3) -glucanasa identificada como AGN13.1 y tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. N° : 1.
Dicha proteína AGN13.1 presenta las siguientes características: es una enzima monoméπca que degrada α- ( 1, 3) -glucano, tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 72 kDa (determinado por SDS-PAGE) y de aproximadamente 67 kDa (determinado por cromatografía de filtración en gel) , tiene un punto isoeléctrico de aproximadamente 7 (determinado por isoelectroenfoque) y de aproximadamente 7,6 (determinado por cromatoenfoque) , su mecanismo de acción es de tipo exo, su actividad hidrolitica es especifica de los enlaces - (1, 3) -glucosídicos, es inducida en condiciones que simulan la respuesta antagónica de T. harzíanum (determinado mediante análisis por Northern blot y Western blot) , y es capaz de unirse a paredes celulares de algunos hongos, hidrolizarlas e inhibir la germinación de esporas y el crecimiento del micelio de dichos hongos.
La proteina antifungica se puede obtener a partir de un organismo productor de la misma, mediante un procedimiento que comprende cultivar dicho organismo bajo condiciones apropiadas para la expresión de dicha protema y recuperarla. En una realización particular de esta invención, el organismo productor es T. harzíanum [Ejemplo 1]. El aislamiento y la purificación de la protema antifungica se puede llevar a cabo mediante su adsorción a paredes celulares de hongos y liberación por digestión de estas, mediante un procedimiento que comprende la precipitación de la protema con sulfato amónico, la adsorción-digestión a paredes celulares de hongos o a componentes de dichas paredes, y la separación por cromatografía de filtración en gel de las fracciones concentradas que presentan actividad antifungica [Ejemplo 3]. Este método permite aislar proteínas con afinidad por la estructura o los componentes de las paredes celulares de hongos. La proteina antifungica según esta invención es capaz de hidrolizar polímeros que poseen enlaces - ( 1, 3) -glucosidicos , por ejemplo, polímeros de - ( 1, 3) -glucano . Las paredes celulares de algunos hongos contienen este tipo de polímeros, entre otros (quitina, β- ( 1, 3) -glucanos, β ( 1 , 6) -glucanos, etc.), por lo que dicha proteina antifungica puede ser utilizada para controlar hongos que contienen en su pared celular polímeros que poseen enlaces - (1, 3) -glucosídicos . En una realización particular, se ha observado que la proteína antifúngica según la invención es capaz de degradar S-glucano, por lo que puede ser utilizada para inhibir la germinación de esporas y/o el crecimiento del micelio de hongos que contienen S-glucano en su pared celular, y, por consiguiente, para controlar hongos que contienen dicho polímero en su pared celular. El término "hongo", tal como se utiliza en esta descripción, incluye a las levaduras. En una realización particular, dichos hongos son hongos perniciosos que contienen en su pared celular un polímero que posee enlaces -(l,3)- glucosídicos, por ejemplo, S-glucano. En el sentido utilizado en esta descripción el término "hongos perniciosos" incluye a los hongos patógenos de plantas (incluyendo los hongos contaminantes de frutos pre- y post-cosecha) , hongos patógenos de animales
(incluyendo patógenos de humanos), hongos contaminantes de alimentos y, en general, cualquier hongo que provoque pérdidas económicas en cualquier sector industrial, agrícola o ganadero.
A modo de ejemplo, los hongos susceptibles de ser atacados por la proteína antifungica según esta invención son hongos que contienen en su pared celular el polímero diana (polímeros que poseen enlaces - ( 1 , 3 ) -glucosidicos ) y se extienden en el Reino Fungí, desde las levaduras hasta los hongos filamentosos.
Entre los hongos fítopatógenos susceptibles de ser controlados por la proteína antifúngica según esta invención se encuentran, a título ilustrativo, no limitativo, los Ascomicetos y Basidiomicetos , en sus fases sexual y asexual, por ejemplo, los causantes de enfermedades tales como oidios, royas, carbones, tizones, chancros, micosis radiculares, micosis foliares, micosis vasculares, miscosis en post-cosecha, etc.
Entre los hongos patógenos de animales, mlcuidos lo sseres humanos, susceptibles de ser controlados por la proteína antifúngica según esta invención, a título ilustrativo, no limitativo, se encuentran los hongos implicados en enfermedades tales como pitiπasis [Malassezia fúrfur) , piedra negra { Piedraia hortae) , piedra blanca { Trichosporon beigelii ) , dermatomicosis {Mi crosporum, Trichophyton , Epidermophyton ) , esporotricosis (Sporothrαx schenkn ) , cromoblastomicosis (levaduras e hifomicetos dermatiáceos) , feohifomicosis { Fonsecaea pedrosoí , F. compa cta , Cladospoπ um carrionn , Phialophora verrucosa ) , micetomas micóticos {Madurella grísea , Pseudallescheria boydii ) , histoplasmosis ( Histoplasma capsula tum = Aj ellomyces capsula tus) , blastomicosis [Blastomyceε derma tidi tis) , paracoccidiosis ( Paracoccidioides brasiliensis) , aspergilosis {Aspergillus sp., especialmente, A . nidulans, A . niger, A . fumiga tus y A . flavus) , micosis oportunistas { Candida sp., Pneumocysti s carina ) , cigomicosis { Rhi zopus sp . , Absidia sp., Mucor sp.) y criptococosis { Fi lobasidiel la neoformans = Cryptococcus neoformas) .
COMPOSICIÓN ANTIFÚNGICA La invención proporciona una composición antifúngica que comprende, al menos, una proteína antifúngica según la invención, junto con un vehículo inerte, tal como un diluyente, un disolvente o un tensioactivo.
En el sentido utilizado en esta descripción, el término "inerte" se utiliza para indicar que dicho vehículo no tiene una actividad antifúngica significativa.
Dicha composición antifúngica puede contener, además, otros fungicidas naturales, recombmantes o sintéticos que potencien la acción de la proteína antifúngica según la invención.
Esta composición antifúngica puede ser utilizada para la desmfestación de superficies, equipos, aparatos, de cualquier sector de la técnica, por ejemplo, industrial, agrícola o ganadero, mediante su aplicación sobre dichas superficies, equipos o aparatos.
COMPOSICIÓN ANTIFÚNGICA PARA CONTROLAR HONGOS FITOPATÓGENOS Un sector importante donde encuentra aplicación el objeto de esta invención es en el sector agrícola. En este sentido, la invención proporciona una composición para controlar hongos fítopatógenos que comprende una cantidad antifúngica eficaz de dicha proteína antifungica según la invención, junto con, opcionalmente, uno o más vehículos agπcolamente aceptables. Esta composición posee una buena actividad antifúngica frente a un amplio grupo de hongos fítopatogenos, en particular, frente a hongos fítopatogenos que contienen en su pared celular polímeros que poseen enlaces α- (1, 3 ) -glucosidicos .
En el sentido utilizado en esta descripción el termino "controlar" incluye la inhibición, reducción o paralización de la germinación de las esporas y/o del crecimiento del micelio de hongos que puede resultar en la eliminación de dichos hongos o en la disminución de los daños causados por estos.
En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad antifúngica eficaz" se refiere a la cantidad de proteina antifungica capaz de inhibir la germinación de esporas y/o el crecimiento del micelio del hongo diana cuando se aplica a la planta, o al medio que la rodea o cuando se expresa en una planta transgenica. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "vehículo agricolamente aceptable" se refiere a aquellas sustancias, o combinación de sustancias, conocidas en el sector agrícola, e incluye adyuvantes, solidos o líquidos, diluyentes, disolventes, tensioactivos, etc. En una realización particular, dicha composición comprende, ademas de dicha proteina antifungica, una o mas proteínas, con iguales o diferentes actividades enzimaticas, por ejemplo, diferentes actividades enzimaticas requeridas para la modificación o degradación de paredes celulares fungicas. A modo de ejemplo, dicha composición puede incluir una o mas enzimas liticas capaces de modificar o degradar paredes celulares de hongos, por ejemplo, enzimas con actividad celulolitica, mananolítica, quitmolítica o proteolítica, tales como celulasas, - (1, 3) -glucanasas, β- (1, 6) -glucanasas, β-(l,3)- glucanasas, mananasas, endo- o exo- quitmasas, quitosanasas, proteasas, α- o β-manosidasas, etc. Estas enzimas pueden proceder de cualquier organismo productor de las mismas.
En otra realización particular, la composición para controlar hongos fítopatógenos comprende, además, uno o mas fungicidas químicos. Como fungicida químico puede utilizarse cualquiera de los fungicidas químicos utilizados habitualmente, preferentemente un fungicida químico seleccionado del grupo formado por los fungicidas que afectan a la membrana, los fungicidas que afectan a la síntesis de la pared celular y sus mezclas.
La composición para controlar hongos fítopatogenos proporcionada por esta invención, contiene entre 0,01% y 100% en peso de dicha proteina antifungica, puede prepararse por métodos convencionales y puede presentarse en forma liquida o solida, por ejemplo, en forma de un granulado. Adicionalmente, dicha composición puede contener aditivos, por ejemplo, conservantes y estabilizantes que prolonguen la conservación y estabilidad de la misma.
MÉTODO PARA CONTROLAR HONGOS FITOPATOGENOS
En otro aspecto, la invención proporciona un método para controlar un hongo fitopatogeno en una planta, en particular, un hongo que contiene en su pared celular un polímero que posee enlaces - ( 1 , 3 ) -glucosidicos, por ejemplo, S-glucano, que comprende la etapa de aplicar a dicha planta, o al medio que la rodea, una cantidad eficaz de dicha composición para controlar dicho hongo fitopatogeno.
En una realización particular, dicho método comprende la aplicación de dicha composición sobre las partes aereas de la planta con el fin de prevenir y/o tratar una infección fungica causada por un hongo fitopatogeno.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para controlar hongos fítopatogenos en un fruto que comprende la etapa de aplicar a un fruto una cantidad eficaz de dicha composición para controlar hongos fítopatogenos . En una realización particular de dicho método, la aplicación de dicha composición sobre el fruto se realiza antes de la recogida del mismo (pre-cosecha) mientras que en otra realización alternativa la aplicación de la composición se efectúa sobre el fruto ya recogido (post-cosecha) .
La invención también contempla la posibilidad de obtener plantas transgénicas que expresen la proteína antifúngica según la invención tanto en tejidos u órganos específicos como en cualquier otro lugar de la planta o fruto. De esta manera se pueden obtener plantas y/o frutos resistentes a hongos fítopatógenos, responsables de cuantiosos daños tanto durante la cosecha como en post-cosecha. La obtención de dichas plantas transgénicas puede realizarse por métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia, transformando células de plantas con una construcción de ADN que contenga la secuencia codificante de una proteína antifungica según la invención [véase el apartado relativo a la BIOLOGÍA MOLECULAR] . La expresión de dicha proteína antifúngica puede ser regulada por un promotor constitutivo o inducible en plantas con el fin de que se exprese dicha proteína antifúngica en el momento y en el lugar apropiado de manera que confiera una protección eficaz frente al hongo fitopatógeno a controlar.
COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA PARA LA PREVENCIÓN Y/O EL TRATAMIENTO DE HONGOS PATÓGENOS DE ANIMALES
Otro campo importante donde encuentra aplicación el objeto de esta invención es en la Sanidad, tanto humana como animal. Er este sentido, la invención proporciona una composición farmacéutica para prevenir y/o tratar hongos patógenos de animales, incluido patógenos de humanos, en particular de hongos que contienen en su pared celular polímeros que poseen enlaces α- (1 , 3) -glucosídicos, por ejemplo, S-glucano, que comprende una cantidad antifúngica eficaz de dicha proteína antifúngica según la invención junto con, opcionalmente, uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Esta composición posee una buena actividad antifúngica frente a un amplio grupo de hongos patógenos de animales.
En el sentido utilizado en esta descripción el término "prevenir y/o tratar" incluye la inhibición, reducción o paralización de la germinación de las esporas y/o del crecimiento del micelio de hongos que puede resultar en la eliminación de dichos hongos o en la disminución de los daños causados por éstos.
En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad antifúngica eficaz" se refiere a la cantidad de proteína antifúngica capaz de inhibir la germinación de esporas y/o el crecimiento del micelio del hongo diana patógeno de animales cuando se aplica al animal.
En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "excipiente farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas sustancias, o combinación de sustancias, conocidas en el sector farmacéutico, e incluye adyuvantes, sólidos o líquidos, disolventes, tensioactivos, etc.
En una realización particular, dicha composición farmacéutica comprende, además de dicha proteína antifúngica, una o más proteínas, con iguales o diferentes actividades enzimáticas, por ejemplo, diferentes actividades enzimáticas requeridas para la modificación o degradación de paredes celulares, tales como las enzimas mencionadas previamente en relación con la composición para controlar hongos fitopatógenos .
En otra realización particular, dicha composición farmacéutica comprende, además, uno o más fungicidas de los utilizados habitualmente en el tratamiento de micosis en animales . La composición farmacéutica proporcionada por esta invención, contiene entre 0,01% y 99,99% en peso de dicha proteína antifúngica, puede presentarse en cualquier forma de administración apropiada. En general, dicha composición farmacéutica se administrará por vía tópica, en forma de una pomada o crema. Una revisión de las distintas formas farmacéuticas de administración de fármacos y de sus procedimientos de preparación puede encontrarse, por ejemplo, en el Tratado de Farmacia Galénica, C. Fauli i Trillo, Ia edición, 1993, Luzán 5, S.A. de Ediciones. En otro aspecto, la invención se refiere al empleo de dicha proteína antifúngica en la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de la infección de hongos patógenos de animales, incluidos patógenos de humanos.
MÉTODO PARA LA PREVENCIÓN Y/0 EL TRATAMIENTO
DE HONGOS PATÓGENOS DE ANIMALES La invención también proporciona un método para prevenir y/o tratar hongos patógenos de animales, incluidos patógenos de humanos, en particular hongos que tienen en su pared celular polímeros que poseen enlaces - ( 1, 3) -glucosídicos, por ejemplo, S-glucano, que comprende la etapa de aplicar a un animal o a un ser humano, en necesidad de tratamiento, una cantidad eficaz de dicha composición farmacéutica para la prevención y/o el tratamiento de infecciones de hongos patógenos de animales. Las instalaciones ganaderas son susceptibles de estar infectadas por hongos patógenos de animales que crecen y se desarrollan en sustratos que están en contacto con el animal, por ejemplo, la paja utilizada en las camas de los animales, o en las condiciones de estabulación de los animales, con lo que existe el riesgo de que dichos animales sean infectados por tales patógenos. La proteína antifúngica según la invención puede ser utilizada para desinfestar, prevenir y/o tratar la infección causada por hongos patógenos de animales en instalaciones ganaderas que comprende la etapa de aplicar sobre dichas instalaciones ganaderas una cantidad eficaz de dicha composición farmacéutica para la prevención y/o el tratamiento de infecciones de hongos patógenos de animales.
APLICACIONES ANALÍTICAS En ocasiones, las muestras de ensayo para análisis, por ejemplo, muestras biológicas, de alimentos, etc., presentan contaminaciones por hongos que dificultan o impiden el análisis de dichas muestras. La invención proporciona también una solución a dicho problema que comprende poner en contacto la muestra a analizar con una cantidad eficaz de dicha proteína antifúngica según la invención, con el fin de controlar la posible contaminación fúngica.
BIOLOGÍA MOLECULAR A partir de la información proporcionada por la proteína antifúngica según esta invención se puede identificar y aislar la secuencia de ADN que codifica para dicha proteína mediante el empleo de técnicas convencionales, por ejemplo, mediante la creación de genotecas de ADN genómico (ADNg) o de ADN copia (ADNc) de organismos productores de dicha proteína; la secuenciación del extremo ammo de dicha proteína y de fragmentos trípticos de la misma; el diseño de oligonucleótidos adecuados para amplificar, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), una región del clon genómico de los organismos productores de dicha proteína que sirva para obtener sondas destinadas a escrutar dichas genotecas; y el análisis y selección de los clones positivos. Todas estas etapas se describen con más detalle en los Ejemplos 12 y 13.
En otro aspecto, la invención proporciona una construcción de ADN que codifica para una proteína antifungica según la invención, que comprende: a) una secuencia de ADN identificada como SEC. ID. N°: 2; o b) una secuencia de ADN análoga a la secuencia definida en a) que i) es sustancialmente homologa a la secuencia de
ADN definida en a) ; y/o ii) codifica para un polipéptido que es sustancialmente homólogo a la proteína codificada por la secuencia de ADN definida en a) . En el sentido utilizado en esta descripción, el término "análogo/a" pretende incluir a cualquier secuencia de ADN que codifica para una proteína antifúngica según la invención que tiene las propiedades i)-iι) arriba mencionadas. Típicamente la secuencia de ADN análoga se puede aislar de un organismo que produce la proteína antifúngica y exhibe actividad -(l,3)- glucanasa, en base a la secuencia de ADN mostrada en la SEC. ID. N°: 2, o bien se construye en base a la secuencia de ADN mostrada en la SEC. ID. N°: 2, por ejemplo, mediante la introducción de sustituciones conservativas de nucleotidos, es decir, que no dan lugar a otra secuencia de aminoácidos de la proteína con actividad antifúngica codificada por dicha secuencia de ADN mostrada en SEC. ID. N° : 1, pero que corresponde al empleo de codones del organismo hospedador destinado a la producción de la proteína, o bien mediante la introducción de sustituciones de nucleótidos que dan lugar a una secuencia de aminoácidos diferente y, por tanto, posiblemente, a una estructura proteica diferente que pudiera dar lugar a una proteína mutante con propiedades diferentes a las de la proteina nativa. Otros ejemplos de posibles modificaciones incluyen la inserción de uno o mas nucleotidos en la secuencia, la adición de uno o mas nucleótidos en cualquiera de los extremos de la secuencia, o la deleción de uno o más nucleótidos en cualquier extremo o en el interior de la secuencia. Por ejemplo, la secuencia de ADN análogo puede ser una subsecuencia de la secuencia de ADN mostrada en cualquiera de las secuencias mostradas en SEC. ID. N°: 2.
En general, la secuencia de ADN análoga es sustancialmente homologa a la secuencia de ADN que codifica para la proteína antifúngica de la invención, por ejemplo SEC. ID. N° : 2, es decir, presenta una homología a nivel de nucleótidos de, al menos, un 70%, preferentemente, al menos un 85%, o más preferentemente, al menos, un 95% respecto a cualquiera de las secuencias mencionadas previamente. En una realización particular, dicha secuencia de ADN es la secuencia identificada como SEC. ID. N°: 2 que corresponde a la secuencia de nucleótidos que codifica para la AGN13.1 completa de T. harzíanum . En otro aspecto, la invención también proporciona una secuencia de ADN que codifica únicamente para el dominio responsable de la unión a la pared celular de dicha proteína antifúngica según la invención, seleccionada del grupo formado por: a) una secuencia de ADN identificada como SEC. ID. N° : 3; b) una secuencia de ADN que es sustancialmente homologa a la secuencia de ADN definida en a) ; y c) una secuencia de ADN que codifica para un polipéptido que es sustancialmente homólogo al dominio responsable de la unión a la pared celular de la proteína antifúngica codificado por la secuencia de ADN definida en a) .
La SEC. ID. N° : 3 corresponde a la secuencia de nucleótidos que codifica al módulo responsable de la unión a la pared celular que presenta la proteína AGN13.1.
La secuencia de ADN que codifica para dicha proteína antifúngica así como la secuencia de ADN que codifica únicamente para el dominio responsable de la unión a la pared celular de dicha proteína constituyen, indistintamente, lo que se denomina secuencia de ADN de la invención.
La secuencia de ADN de la invención puede proceder de cualquier microorganismo que de forma natural la contenga, por ejemplo, T. harzíanum o de un organismo hospedador transformado con dicha secuencia de ADN. Alternativamente, la secuencia de ADN de la invención, puede ser aislada, mediante técnicas convencionales, a partir del ADN de cualquier organismo mediante el empleo de sondas o de oligonucleótidos preparadas a partir de la información sobre la secuencia de ADN proporcionada en esta descripción. La secuencia de ADN de la invención, o la construcción que la contiene, puede ser insertada en un vector apropiado. Por tanto, la invención también se refiere a un vector, tal como un vector de expresión, que comprende dicha secuencia de ADN, o una construcción que la contiene. La elección del vector dependerá de la célula hospedadora en la que se va a introducir posteriormente. A modo de ejemplo, el vector donde se introduce dicha secuencia de ADN puede ser un plasmido o un vector que, cuando se introduce en una célula hospedadora, se integra en el genoma de dicha células y se replica junto con el cromosoma (o cromosomas) en el que (en los que) se ha integrado.
En el vector proporcionado por esta invención, la secuencia de ADN de la invención debe estar conectada operativamente a un promotor y a una secuencia termmadora. El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN que muestra una actividad transcripcional en la célula hospedadora elegida y puede derivar bien de genes que codifican para proteínas homologas o heterologas de la célula hospedadora. Los procedimientos utilizados para ligar la secuencia de ADN de la invención al promotor y a la secuencia termmadora, respectivamente, y para insertar dicha construcción en un vector son bien conocidos por los técnicos en la materia y han sido descritos, por ejemplo, por Sambrook et al. [Molecular Clonmg. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1989] .
La invención también proporciona una célula que comprende una secuencia de ADN de la invención, o una construcción de ADN que contiene a dicha secuencia o dicho vector mencionado mas arriba. Las células hospedadoras que se pueden transformar con la secuencia de ADN de la invención pueden ser células procarioticas o, preferentemente, eucaπoticas , tales como células de tejidos vegetales o células fungicas, por ejemplo, células de levadura o de hongos filamentosos. La transformación de células fungicas puede llevarse a cabo mediante técnicas convencionales, por ejemplo, técnicas que implican la formación de protoplastos y la transformación de los mismos seguido de la regeneración de la pared celular. La transformación de células de tejidos vegetales también puede realizarse por métodos convencionales y puede ser interesante para dotar de resistencia a la planta transformada frente a organismos perniciosos, por ejemplo, hongos fitopatógenos . La invención también proporciona un método para la producción de una proteína antifúngica según la invención que comprende cultivar una célula hospedadora adecuada que contiene la secuencia de ADN que codifica para dicha proteína antifúngica bajo condiciones que permiten la producción de la proteína y recuperar la proteína del medio de cultivo.
El medio utilizado para cultivar las células hospedadoras transformadas puede ser cualquier medio adecuado para cultivar las células hospedadoras en cuestión. La proteína expresada puede ser, ventajosamente, secretada al medio de cultivo y puede ser recuperada mediante cualquier procedimiento convencional de aislamiento de proteínas que comprende la separación de las células del medio de cultivo, la precipitación de las proteínas y la separación por métodos cromatográficos .
Los siguientes ejemplos ilustran la presente invención y no deben ser considerados como limitativos del alcance de la misma.
EJEMPLO 1 Cultivo de T. harz anvm y producción de AGN13.1
El cultivo de T. harzíanum y la producción de AGN13.1 puede realizarse de varias maneras utilizando diversas fuentes de carbono.
1.1 Método I: Quitina como fuente de carbono T. harzíanum CECT 2413 se obtuvo de la Colección Española de Cultivos Tipo, CECT (Valencia, España) y se mantuvo en un medio de cultivo PPG (puré de patata + glucosa, ambos al 2%), suplementado con agar al 2%.
Para la producción y purificación de AGN13.1 se cultivó T . harzíanum 2413 en dos etapas siguiendo protocolos ya descritos por De la Cruz et al. [De la Cruz et al., J. Bacteriol., 1995, Vol. 177, No. 7, 1864-1871] . Brevemente, en una primera etapa se inocularon esporas de T. harzíanum a una concentración final de 108 esporas/ml en medio mínimo (MM) [KH2P04, 15 g/1; (NH4)2SO„, 5 g/1; 1 mi/l de oligoelementos (FeS04-7H20, 5 g/1; MnS04-H20, 1,6 g/1; ZnS04-7H20, 1,4 g/1; CoCl2-6H20, 3,7 g/1)] suplementado con glucosa al 2% como fuente de carbono. El pH final del medio de cultivo se ajustó a 5,5 con KOH 1 M. En este medio de preinducción se cultivó T. harzíanum durante 48 horas a 28°C y con agitación orbital a 200 rpm. Posteriormente, se recogió el micelio, se lavó sucesivamente con MgCl2 y H20 y se trasfirió a MM suplementado con quitina al 1,5% como fuente de carbono.
1.2 Método IT: Otras fuentes de carbono T. harzíanum CECT 2413 se mantuvo en un medio de cultivo PDA (patata-dextrosa-agar) [Difco] . Para la producción y purificación de AGN13.1, se cultivo T. harzíanum 2413 en dos etapas siguiendo protocolos ya descritos por De la Cruz et al. [De la Cruz et al., Arch. Microbiol., 1993, 159, 316-322]. Brevemente, en una primera etapa se inocularon alícuotas de 106 conidios de T. harzíanum 2413 en matraces Erlenmeyer de 1 1 conteniendo 600 mi de caldo de cultivo patata-dextrosa suplementado con sales de Czapek [De la Cruz et al., Arch. Microbiol., 1993, 159, 316-322] y se incubaron durante 2 días a 26°C y 200 rpm (condiciones de represión) . A continuación, los micelios se recogieron y lavaron bajo condiciones estériles, se transfirieron a matraces Erlenmeyer de 1 1 conteniendo 600 mi de medio mínimo de Czapek suplementado con distintas fuentes de carbono (glucosa, quitina, paredes celulares de A . ni ger, paredes celulares de P. aurantogriseum, y paredes celulares de P. syπngae) , se incubaron durante 48 horas en las condiciones mencionadas previamente (condiciones de inducción) y se midieron los niveles de actividad α- (1, 3) -glucanasa extracelulares, mediante el procedimiento que se describe en el Ejemplo 2. Adicionalmente se realizo un ensayo en condiciones de hambre de nitrógeno, que corresponde a una reducción de 100 veces la concentración de cloruro amónico en el medio (21 mg/1 de cloruro amónico). Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1 Efecto de la fuente de carbono sobre la producción de actividad - (1 ,3) -glucanasa extracelular por T. harzlanum Fuente de carbono Actividad - (1 , 3) -glucanasa
[%(p/v)3 (mU/mg de proteina)
Glucosa (0,1) 120 Glucosa (2) 60
Quitina (1,5) 98
Paredes celulares de A . niger (0,5) 380
Paredes celulares de P. aurantogriseum (0,5) 130
Paredes celulares de P. syringae (0,5) 320 Hambre de nitrógeno 40
Tal como se ha indicado previamente para otras enzimas degradadoras de la pared celular de T. harzianum [De la Cruz et al., Arch. Microbiol., 1993, 159, 316-322], la actividad α- ( 1, 3) -glucanasa es reprimida a elevadas concentraciones de glucosa [2% (p/v) ] pero no en condiciones de hambre de carbono [0,1% (p/v)] y es inducida en presencia de paredes celulares fúngicas completas o sus polímeros constituyentes. Por tanto, la producción de actividad α- (1, 3) -glucanasa [AGN13.1] por T. harzianum es dependiente de la fuente de carbono disponible. A la vista de la Tabla 1, para la purificación de AGN13.1 pueden utilizarse, rutinariamente, paredes celulares de A . niger [0,5% (p/v)] .
EJEMPLO 2
Ensayo de la actividad α- (1 , 3) -glucanasa y determinación de la concentración de proteina
2.1 Actividad - ( 1.3 ) -glucanasa La actividad α- ( 1, 3) -glucanasa se puede ensayar por diversos métodos.
2.1.1 Método A
La actividad α- ( 1, 3) -glucanasa se puede determinar mediante un ensayo que consiste en preparar una mezcla de reacción conteniendo 0,8 mi de solución de - (1, 3) -glucano al 0,5% (p/v) en tampón acetato potásico 50 mM, pH 5,5, y 0,2 mi de la solución enzimática a ensayar apropiadamente diluida en el mismo tampón. El - (1, 3) -glucano se obtuvo siguiendo protocolos previamente descritos [Zonneveld, Biochim. Biophys. Acta, 1971, 258, 541-547]. La mezcla de reacción se incuba a 37°C durante un periodo de tiempo comprendido entre 30 minutos y 1 hora, parando la reacción por calentamiento a 100°C durante 7 minutos. Posteriormente se determina el incremento de azúcares reductores en 0,15 mi de mezcla de reacción por el método de Somogyi [J. Biol. Chem., 1952, 195, 19-23] y Nelson [Methods Enzymol . , 1957, 3, 85-86] , usando como patrón glucosa a concentraciones comprendidas entre 0 y 1 mg/ml. Se incluyen blancos de enzima y de sustrato. Se define 1 unidad de actividad - ( 1 , 3 ) -glucanasa como la cantidad de enzima que libera 1 μmol de equivalentes de azúcares reductores, expresados como glucosa, por minuto, bajo las condiciones ensayadas.
Los resultados obtenidos al ensayar la enzima AGN13.1 de T. harzianum mediante este método pusieron de manifiesto que dicha enzima puede degradar - ( 1, 3) -glucano . Además, se valoró, mediante los ensayos correspondientes, la actividad de la enzima AGN13.1 para degradar otros polímeros presentes en las paredes celulares fúngicas, tales como -(l,4)- y - (1, 6) -glucano, quitina, β-(l,3)- y β- ( 1, 6) -glucano, etc., obteniéndose un resultado negativo en todos los casos.
2.1.2 Método B
La actividad α- ( 1 , 3) -glucanasa también se puede determinar mediante un ensayo que consiste en preparar una mezcla de reacción conteniendo 2 mi de una solución de 5 mg/ml de S- glucano [ - (1, 3) -glucano] de A. niger en tampón acetato potásico 50 mM, pH 5,5, y 50 μl de la solución enzimática a ensayar apropiadamente diluida en el mismo tampón. La mezcla de reacción se incuba a 37°C durante 1 hora y la reacción se detiene por calentamiento a 100°C durante 5 minutos. Las muestras se centrifugan a 5.000 g, durante 5 minutos, se recogen 0,15 mi de sobrenadante por reacción y se determina el incremento de azúcares reductores por el método de Somogyi [J. Biol. Chem., 1952, 195, 19-23] y Nelson [Methods Enzymol., 1957, 3, 85-86], usando como patrón glucosa a concentraciones comprendidas entre 0 y 1 mg/ml. Se incluyen blancos de enzima y de sustrato.
Se define 1 unidad de actividad - (1, 3) -glucanasa como la cantidad de enzima que libera 1 μmol de equivalentes de azúcares reductores, expresados como glucosa, por minuto, bajo las condiciones ensayadas.
Los resultados obtenidos al ensayar la enzima AGN13.1 de T . harzíanum mediante este método pusieron de manifiesto que dicha enzima puede degradar α- (1, 3) -glucano.
2.2 Determinación de la concentración de proteína La concentración de proteína se determinó mediante el método de Bradford [Bradford, Anal. Biochem. , 1976, 72, 248- 254] .
EJEMPLO 3 Purificación de la proteina AGN13.1 de T. arzianvαα
La purificación de la protema AGN13.1 de T . harzíanum se baso en su afinidad por un sustrato msoluble. La purificación de dicha proteína se puede realizar siguiendo varios métodos, basados en dicha característica, que comprenden la precipitación con sulfato amónico, la adsorción-digestión a un sustrato msoluble por el que tiene afinidad y la separación por cromatografía de filtración en gel. 3.1 Método A La purificación de la proteína AGN13.1 de T. harzianum según esta alternativa comprende las etapas de: A) Precipi ta ción con sulfa to amónico
Esta etapa, al igual que todos las demás (salvo que se indique lo contrario) se realizó a 4°C. Cultivos de T. harzianum 2413 incubados durante 48 horas en MM suplementado con quitina al 1,5% se filtraron a través de papel Whatman n° 1 y se centrifugaron a 6.000 g durante 10 minutos. A continuación, el sobrenadante (aproximadamente 200 mi) se precipitó con sulfato amónico al 80% de saturación. Tras una noche de incubación, el precipitado se recuperó centrifugando a 12.000 g durante 20 minutos, se resuspendió en el menor volumen posible de agua destilada y se dializó frente a tampón acetato potásico 50 mM, pH 5,5.
B) Adsorción-digestión a paredes cel ulares Para la adsorción a paredes celulares se incubaron alícuotas de 3 mi de sobrenadante dializado con 0,6 mi de una solución 20 mg/ml de paredes celulares purificadas y liofilizadas de Peni ci llí um sp., obtenidas según protocolos previamente descritos Tanaka y Phaff [Tanaka y Phaff, J. Bacteriol. 1965, 89, 1570-1580]. La incubación se realizó durante 20 minutos con agitación magnética y posteriormente se centrifugó a 12.000 g durante 10 minutos. El sobrenadante (la fracción no adsorbida a pustulano) se volvió a incubar con paredes celulares (este proceso se repite dos veces más) . Los precipitados obtenidos tras las sucesivas adsorciones se lavaron tres veces con 3 mi de una solución de NaCl 1 M en tampón fosfato-KOH 70 mM, pH 6,0 y, finalmente, se resuspendieron en tampón acetato potásico 50 mM, pH 5,5 con fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM y azida sódica 1 mM. Estas muestras se incubaron durante toda la noche a 37°C. La fracción clarificada, fruto de la degradación de las paredes celulares, se centrifugó a 12.000 g durante 10 minutos. El sobrenadante (5-10 mi) se dializó nuevamente frente a tampón imidazol-HCl 25 mM, pH 7,4. En estas condiciones de ensayo se obtuvo una proteina mayoritaπa que es la que se identifica en esta descripción como AGN13.1.
C) Fil tración en gel La solución dializada procedente de la etapa b) se aplicó a una columna (1,6 x 40 cm) de Sephacryl S-200 HR (Pharmacia) equilibrada con tampón acetato potásico 100 mM, pH 5,5 con KC1 100 mM y se eluyó con el mismo tampón a un flujo de 7 ml/h. Las distintas fracciones obtenidas se ensayaron para evaluar la actividad α- ( 1 , 3 ) -glucanasa, seleccionándose aquellas que mostraban los mayores niveles, las cuales se recogieron, se lavaron y se concentraron en tampón acetato potásico 50 mM, pH 5,5 en un concentrador Centricon 10 (Amicon) . Las proteínas (AGN13.1) purificadas se almacenaron a 4°C.
3.2 Método B El procedimiento de purificación de la proteína AGN13.1 de T. harzíanum según esta alternativa comprende las siguientes etapas :
A) Precipi ta ción con sulfa to amóni co Esta etapa, al igual que todos las demás (salvo que se indique lo contrario) se realizó a 4°C. Cultivos de T. harzíanum incubados durante 48 horas en medio Czapek suplementado con 0,1% de paredes celulares de A . niger se filtraron a través de papel
Whatman n° 1 y se centrifugaron a 8.000 g durante 10 minutos. A continuación, el sobrenadante (aproximadamente 1.200 mi) se precipito con sulfato amónico al 80% de saturación y el precipitado se recuperó mediante centrifugación a 12.000 g durante 20 minutos, se resuspendió en el menor volumen posible de agua destilada y se dializó frente a tampón acetato potásico 50 mM, pH 5,5. La preparación de enzima cruda (aproximadamente 35 mi) se recuperó mediante centrifugación a 12.000 g durante 20 minutos de la fracción dializada.
B) Adsorci ón -digesti ón a S-glucano Alícuotas de 3 mi de enzima cruda se adsorbieron a S- glucano (5 mg/ml) durante 2 horas con agitación magnética y se sedimentaron mediante centrifugación a 12.000 g durante 10 minutos. Las fracciones adsorbidas se lavaron tres veces con tampón acetato potásico 50 mM, pH 5,5 conteniendo NaCl 1M, se resuspendieron en tampón acetato potásico 50 mM, pH 5,5 conteniendo fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM y azida sódica 1 mM y se incubaron durante toda la noche a 37°C para la digestión del S-glucano.
Figure imgf000028_0001
Alícuotas de 1 mi procedentes de la digestión del S-glucano se aplicaron repetidas veces a una columna de filtración en gel (7,8 mm x 40 cm) PAK125 (Waters) equilibrada con tampon acetato potásico 100 mM, pH 5,5 conteniendo NaCl 0,5 M y se eluyo con el mismo tampon a un flujo de 0,2 ml/min. Se recogieron fracciones de 0,2 mi y se ensayaron para determinar la concentración de proteina (A280) y para evaluar la actividad α- ( 1, 3) -glucanasa, seleccionándose las fracciones más activas, que se recogen, se lavan y se concentran en tampón acetato potásico 100 mM, pH 5,5 en un concentrador Centπcon 10 (Amicon) . La proteína purificada se almaceno a -20°C, y, en esas condiciones, la actividad α- ( 1, 3) -glucanasa permanece inalterada durante al menos 1 mes.
El análisis mediante SDS-PAGE (Ejemplo 4) de muestras procedentes de la digestión de S-glucano revelo una banda mayoritaria y otras bandas minoritarias. La preparación purificada final migraba como una sola banda en SDS-PAGE con un peso molecular aparente de aproximadamente 72 kDa. Cuando el peso molecular se calculó por cromatografía de filtración en gel, el valor obtenido fue de aproximadamente 67 kDa. El modelo de elución de la filtración en gel mostró una correlación entre la proteína mayoritaπa presente en las digestiones de S-glucano y la actividad α- (1, 3) -glucanasa.
Operando de esta manera se consiguió una purificación de AGN13.1 a homogeneidad electroforética, con una recuperación mínima estimada del 11%, y se pudo observar, ademas, que dicha enzima es una proteína monomérica.
EJEMPLO 4 Determinación del peso molecular El peso molecular de la proteína AGN13.1 se determino por electroforesis analítica en condiciones desnaturalizantes y por cromatografía en filtración en gel.
4.1 SDS-PAGE La electroforesis de la proteína AGN13.1 en condiciones desnaturalizantes [electroforesis en gel de poliacrilamida tratado con dodecilsulfato sódico, SDS-PAGE] se realizo según el procedimiento descrito por Weber & Osborn [Weber & Osborn, The protems. Vol . 1, 1975, 179-221. Neurath y Hill eds . Academic Press, Inc., New York], usando geles al 12% de acrilamida- bisacrilamida y un aparato Mini-Protean II de Bio-Rad (EEUU) y siguiendo las instrucciones del fabricante. El peso molecular aparente de la protema AGN13.1, en las condiciones ensayadas, es de 72 kDa aproximadamente. Alternativamente, se puede realizar la electroforesis de la protema AGN13.1 en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE) mediante el método de Laemmli [Laemmli, U.K., Nature, 1970, 227, 680-685], usando geles al 4% de acπlamida en en los geles de apilamiento y al 12% de acrilamida en el gel de separación. Las muestras se diluyeron en tampon Laemmli y se hirvieron durante 3 minutos antes de su carga. Tras la electroforesis, los geles se tiñeron con azul brillante de Coomassie R-250. Para la determinación del peso molecular se utilizaron patrones de proteínas de bajo peso molecular (Bio-Rad). El peso molecular aparente de la protema AGN13.1, en las condiciones ensayadas, es de 72 kDa aproximadamente.
4.2 Cromatografía de filtración en αel
Se determinó el peso molecular de la proteína AGN 13.1 nativa mediante la técnica de cromatografía de filtración en gel en una columna de Sephacryl S-200 HR (Pharmacia) (1,6 x 40 cm) calibrada con unas proteínas marcadoras, obteniéndose un valor de 67 kDa aproximadamente.
Alternativamente, se determinó el peso molecular de la AGN13.1 a partir de la digestión del S-glucano, mediante cromatografía de filtración en gel en una columna PAK125
(Waters) (7,8 mm x 40 cm) equilibrada con tampón acetato potásico 100 mM, pH 5,5 conteniendo NaCl 0,5 M y se eluyo con el mismo tampón a un flujo de 0,2 ml/mm, obteniéndose un valor de 67 kDa aproximadamente.
EJEMPLO 5 Determinación del punto isoeléctrico
5.1 Isoelectroenfoque Para determinar el punto isoeléctrico (pl) de la proteína AGN13.1 de T. harzíanum mediante isoelectroenfoque se siguió el procedimiento descrito por Robertson et al. [Anal. Biochem. , 1987, 167, 290-294]. Las proteínas se visualizaron mediante tinción con azul de Coomassie. El valor del pl aparente para la proteína AGN13.1 se calculó por referencia a proteínas marcadoras convencionales con valores de pl comprendidos entre 3,5 y 9,3 (Amersham-Pharmacia) . El valor de pl aparente calculado mediante isoelectroenfoque fue de aproximadamente 7.
5.2 Cromatoenfoque básico analítico
Se determinó el pl de AGN13.1 de T. harzíanum mediante cromatoenfoque básico analítico utilizando una columna Polybuffer Exchanger PBE94 (Amersham-Pharmacia) siguiendo exactamente el procedimiento descrito por De la Cruz et al. [De la Cruz et al., J. Bacteriol., 1995, 177, 1864-7]. El valor de pl aparente calculado mediante cromatoenfoque básico analítico fue de aproximadamente 7,6.
Los resultados obtenidos ponen de manifiesto que la enzima AGN13.1 tiene un pl cercano a la neutralidad.
EJEMPLO 6 Determinación de la constante de Michaelis-Menten La constante de Michaelis-Menten se determinó a partir de representaciones de Lineweaver-Burk utilizando los datos obtenidos midiendo la velocidad inicial de la hidrólisis de S- glucano (utilizado como sustrato) en un intervalo de concentraciones de S-glucano comprendido entre 0,5 y 20 mg/ml. Los valores obtenidos fueron los siguientes: - Km: 2,5 mg/ml; y - Vmax: 43 μmoles de producto/min .mg de proteína
EJEMPLO 7 Determinación de la temperatura óptima y de inactivación
La temperatura óptima se determinó mediante un ensayo convencional dentro de un intervalo de temperaturas comprendido entre 20°C y 80°C. La temperatura óptima para la AGN13.1 se calculó en 55°C a un pH de 5,5.
La estabilidad térmica se determinó incubando la proteína AGN13.1 purificada durante 30 minutos a temperaturas entre 20°C y 80°C, en tampón acetato potásico 50 mM, pH 5,5, y, a continuación, midiendo la actividad remanente a 37 °C añadiendo S-glucano como sustrato. La temperatura de inactivación se definió como la temperatura en la que la actividad específica se reducía un 50%, bajo la condiciones descritas previamente. La temperatura de inactivación obtenida fue de 50°C. Estos resultados parecen sugerir que el S-glucano estabiliza a la AGN13.1.
EJEMPLO 8 Especificidad por sustrato y análisis de los productos de reacción de la AGN13.1
8.1 Especificidad por sustrato La actividad de la AGN13.1 de T. harzíanum se ensayó en los polímeros con enlaces - y β-glucosídicos que se mencionan en la Tabla 2, a una concentración de 5 mg/ml.
La actividad α- (1, 3) -glucanasa se determinó mediante cualquiera de los protocolos descritos en el Ejemplo 2. La actividad quitmasa se determinó siguiendo el protocolo descrito por De la Cruz et al. [De la Cruz et al., Eur. J. Biochem. , 1992, 206, 856-867], la actividad proteasa mediante el protocolo descrito por Schwartz & Barrett [Schwartz, W. & Barrett, A.J., Biochem. J. , 1980, 191, 487-497], y la actividad litica mediante el protocolo descrito por De la Cruz et al. [De la Cruz et al., Arch. Microbiol., 1993, 159, 316-322]. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 2, donde puede apreciarse que la actividad máxima se detectó frente a S- glucano [un - (1, 3) -glucano lineal] como sustrato pero no se observo actividad frente a nigerano, un poliglucano que contiene enlaces OÍ- (1,3) y -(l,4) alternantes o frente a otros - o β- glucanos, quitina o proteínas. Estos resultados muestran que la enzima AGN13.1 es una - ( 1 , 3) -glucanasa específica.
Tabla 2
Especxf-.c-.dad por sustrato de AGN13 . 1 purificada de T. ha.rzla.num
Figure imgf000033_0001
1 Todos los sustratos se utilizaron a una concentración final de 4 mg/ml
2 α-glucanos han sido descritos en detalle como componentes de la matriz de al menos las paredes celulares de Penicillium sp. y A. niger
3 100% de actividad corresponde a 0,9 U/mg de proteina El pustulano (de Umbilicaria papulloεa ) y el paquimano (de Poria cocos) eran de Calbiochem (EEUU) . La azocaseína, carboximetilcelulosa, quitina (de caparazón de cangrejo) , dextrano (de Leuconostoc mesen teroides) , glucosa, laminarina (de Laminaria digi ta ta ) , nigerano (de A . nidulans) y almidón soluble eran de Sigma Chemical Co . (EEUU).
Las paredes celulares se prepararon según el procedimiento descrito por Fleet & Phaff [Fleet, G.H. & Phaff, H.J., J. Biol. Chem., 1974, 249, 1717-1728]. El β-glucano de S . cerevisiae se preparó a partir de levadura de panadería, según el protocolo descrito por Rombous & Phaff [Rombous, F.M. & Phaff, H.J., Eur. J. Biochem., 1976, 63, 109-120]. El S-glucano de A . niger se preparó de acuerdo con procedimientos conocidos [Zonneveld, Biochim. Biophys. Acta, 1971, 249, 506-514; Hasegawa, S. & Nordin, J.H, J. Biol. Chem. 1969, 244, 5460-5470]; brevemente, A. niger 2514 se creció en matraces de 10 1 en 8 1 de medio conteniendo glucosa (46 g/1), ácido tartárico (2,66 g/1), nitrato amónico (2,66 g/1), sulfato amónico (0,167 g/1), bicarbonato potásico (0,932 g/1), carbonato magnésico (0,266 g/1), fosfato diácido monoamónico (0,5 g/1), sulfato ferroso
(0,0466 g/1) y sulfato de zinc (0,0466 g/1). El cultivo se mantuvo durante una semana con aireación a 28°C. A continuación, el cultivo se esterilizó en autoclave y el micelio se recogió por filtración a través de un papel de filtro hartman n° 1, y se lavó extensamente con cloruro magnésico al 2% y agua destilada. Toda la biomasa recuperada, fundamentalmente material de las paredes celulares, se liofilizó y se molió en un mortero con nitrógeno líquido. A continuación, se trató con KOH al 5% durante 18 horas a 37°C. El sobrenadante, que contenía principalmente una fracción de la pared celular de glucano soluble en álcalis (S-glucano), se obtuvo mediante centrifugación a 9000 g durante 10 minutos. Esta fracción se precipitó bajando el pH con ácido acético glacial a pH 7 , 0 y lavando ampliamente con agua destilada. La composición del S- glucano se determinó mediante espectroscopia de infrarrojos [Bacon et al., Biochim. Biophys . Acta, 1968, 158, 313-315] resultando en un polímero que tenía enlaces -(l,3) prácticamente puros.
8.2 Mecanismo de acción
El mecanismo de acción de la AGN13.1 de T. harzianum frente a S-glucano se examinó midiendo la producción de glucosa frente a la producción de azúcar reductor a diferentes tiempos, comparando las actividades de la enzima purificada frente a S- glucano y S-glucano oxidado con periodato ( I04-S-glucano) y analizando finalmente los productos de hidrólisis correspondientes mediante análisis de cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) .
Brevemente, se determinó la hidrólisis de los sustratos por la AGN13.1 purificada de T. harzianum mediante HPLC utilizando columnas Aminex HPX 42-A (Bio-Rad) mantenida a 40°C, utilizando agua como eluyente a un flujo de 0,4 l/min. Los productos se detectaron en base al ínidice de refracción y fueron identificados por comparación con patrones de glucosa y de oligosacáridos de 2 a 4 glucosas.
Las incubaciones de S-glucano con la enzima AGN13.1 dieron como resultado una correlación entre los azúcares reductores y la glucosa producida, lo que indica que la glucosa responde por casi todo el poder reductor y es el único producto de la enzima. Por otra parte, la AGN13.1 purificada fue incapaz de hidrolizar I04-S-glucano (véase la Tabla 2), lo que demuestra que el mecanismo exolítico de dicha enzima ya que la oxidación del extremo reductor del - (1, 3) -glucano impide la actividad de la enzima AGN13.1. Tras el análisis por HPLC, se detectó una liberación inicial de glucosa. A tiempos mayores, aumentó el pico de glucosa siendo el producto final de la hidrólisis. Estos resultados, tomados en su conjunto, indican un mecanismo de acción de tipo exo para la AGN13.1 purificada. Este mecanismo permitiría combinar a la AGN13.1 de T. harzianum con otras enzimas líticas de pared celular con mecanismos de acción de tipo exo- y/o endo-hidrolítico, con el fin de degradar más eficientemente los polímeros de paredes celulares que contienen - ( 1, 3) -glucano, junto con otro u otros polímeros, así como disponer de un mayor potencial enzimático con actividad antifúngica sobre hongos perniciosos.
EJEMPLO 9 Unión de la proteina AGN13.1 de T. harzianum a componentes de paredes celulares de hongos
La pared celular de los hongos es una estructura muy compleja compuesta por polímeros de muy diversos tipos. Por lo tanto, saber exactamente a cuál de los diversos elementos que constituyen la pared se une una proteína puede ser una información muy útil para averiguar mediante qué actividad (o actividades) dicha proteína produce el efecto antifúngico.
Se efectuó un fraccionamiento de los distintos componentes de paredes celulares de hongos (quitina, mananos, β-glucanos, α-glucanos, etc.) siguiendo protocolos ya descritos [Benítez et 1., Arch. Microbiol., 1976, 108, 183-188]. Posteriormente, se realizaron ensayos de unión de la proteína AGN13.1 con cada uno de los componentes purificados, siguiendo el procedimiento empleado para la purificación de la proteína AGN13.1 por adsorción a paredes celulares de Penicíllium sp . [véase el Ejemplo 3.1 Método A] . El resultado obtenido fue que la proteína AGN13.1 mostró una fuerte afinidad por la fracción enriquecida en α- ( 1 , 3) -glucanos .
EJEMPLO 10 Ensayo de la actividad antifúngica
Para determinar la actividad antifúngica de la AGN13.1 de
T. harzianum se realizó un ensayo consistente, brevemente, en crecer en un pocilio de una microplaca 3.000 esporas de
Penicillium sp. en PDA (Difco) diluido 3 veces respecto a la concentración recomendada por el fabricante, junto con la proteína cuyo actividad antifúngica se desea ensayar (AGN13.1), a distintas concentraciones, manteniéndose a 25°C durante un periodo de tiempo comprendido entre 15 y 60 horas, y, posteriormente, se observa al microscopio óptico. Como control negativo se realiza un ensayo sin proteína, con PDA, esporas y una proteína sin propiedades antifúngicas, por ejemplo, seroalbúmma bovina (BSA) . Se analiza tanto la inhibición de la germinación de las esporas como la disminución del tamaño de las hifas de Peni cillium sp. Una cuantificación, en dichas condiciones, del porcentaje de germinación de las muestras tratadas con 150 ppm de la proteína AGN13.1 de T. harzíanum respecto a los tratamientos control puso de manifiesto que en el primer caso (esporas tratadas con AGN13.1) la germinación se había reducido en casi un 50%. Además, los resultados muestran que la cantidad de biomasa final es muy inferior en las muestras tratadas con la proteina AGN13.1 que en los controles.
La Figura 1A muestra el efecto antifúngico, determinado como la inhibición del crecimiento del hongo fitopatógeno Peni cilli um digi ta tum, producido por la protema AGN13.1, a una concentración de 225 μg/ml, sobre 3.000 esporas de P. digi ta tum tras 17 horas de incubación. La Figura IB muestra el resultado de un control negativo consistente en incubar durante 17 horas 3.000 esporas de P. digi ta tum con 225 μg/ml de BSA. La Figura 1 pone de manifiesto la reducción de la germinación de las esporas del hongo debido a la acción de la proteína AGN13.1 que se traduce en una inhibición del crecimiento del hongo.
La Figura 2A muestra el efecto antifúngico, determinado como la aparición de alteraciones morfológicas del micelio del hongo fitopatogeno P. digi ta tum, producido por la proteína AGN13.1 de T. harzíanum, a una concentración de 225 μg/ml, sobre 3.000 esporas de P. digi ta tum tras 60 horas de incubación. La Figura 2B muestra el resultado de un control negativo consistente en incubar durante 60 horas 3.000 esporas de P. digi ta tum con 225 μg/ml de BSA. La Figura 2 pone de manifiesto la aparición de alteraciones morfológicas en las hifas del hongo P. digi ta tum debido a la acción de la proteína AGN13.1 de T. harzíanum .
EJEMPLO 11
Unión de la proteina AGN13.1 de T. harzianυm a paredes celulares de hongos
Con el fin de determinar el posible papel de la AGN13.1 purificada en el antagonismo de T. harzianum, se evaluó dicha proteína en ensayos de unión a paredes celulares de hongos y de actividad degradadora de dichas paredes.
Un primer ensayo se realizó con esporas de A . niger CECT 2574 en microplacas NUNC, en un volumen total de 15 μl conteniendo 1 μl de caldo de cultivo-patata-dextrosa concentrado 5 veces (5 x 24 g/1), 2 μl de una dilución de esporas (150 esporas) de cada hongo y completando con la enzima AGN13.1 diluida en agua (previamente dializada frente a sí mismo) . Se ensayaron distintas concentraciones de enzima (90, 180 y 270 μg/ml) y cada una de ellas se repitió por triplicado utilizando como control esporas con agua. Los resultados obtenidos se muestran en las Figuras 3 y 4, en donde los valores que se representan corresponden a la media de las tres repeticiones en cada caso con determinación del error de cada una de ellas. En la Figura 5 se aprecia la inhibición del crecimiento del micelio de A . niger CECT 2574 al cabo de 23 horas, en las concentraciones ensayadas, lo que pone de manifiesto el efecto antifúngico de AGN13.1 de T. harzíanum .
Siguiendo el procedimiento descrito previamente se ensayaron otras paredes celulares fúngicas, concretamente de Botrytis cinérea , Peni cillium a urantogriseum, Rhizotocnia solaní , Phytophtora syringae, Gibberella fuj íkuroi y Saccharomyces cerevisiae . Los resultados obtenidos pusieron de manifiesto que la enzima AGN13.1 se une a las paredes celulares de los hongos B . cinérea , P. aurantogπseum, y R . solaní , pero no se une a las de Phytoph tora syringae, Gibberel la fuj ikuroi o Saccharomyces cerevisiae .
La enzima AGN13.1 es bastante activa frente a paredes celulares de A . niger, B . cinérea y P. auran togπseum, pero no es activa frente a las paredes celulares de S . pombe, S . cerevisiae o P. syringae [véase la Tabla 2]. Además, cuando se ensayó el mecanismo de acción de AGN13.1 frente a las paredes celulares de A . niger o P. a uran togπseum, se detectó un mecanismo de tipo exo, en el que la glucosa era el producto final mayoπtario de la hidrólisis. Por tanto, parece ser que la enzima AGN13.1 actúa como una enzima lítica frente a paredes celulares de hongos fitopatógenos que contienen polímeros con enlaces α- ( 1 , 3) -glucosídicos .
EJEMPLO 12 Clona e de una secuencia de ADN que codifica para la proteina AGN13.1
Para obtener el clon completo de cDNA de la proteína AGN13.1 de T. harzíanum se siguió una estrategia que comprendía el empleo de PCR. Para ello, se diseñaron oligonucleótidos degenerados a partir de la microsecuenciación del extremo amino y de péptidos trípticos de la proteína AGN13.1.
Para el diseño de los oligonucleótidos directos se utilizaron las secuencias del extremos amino y/o de péptidos internos de la proteína AGN13.1 mientras que para el diseño de los oligonucleótidos inversos se utilizaron las secuencias del vector en el que se construyó la genoteca de cDNA.
Con dichos oligonucleótidos y ba o las condiciones experimentales que se describen mas adelante [véase el Ejemplo 12.5] se obtuvieron unas bandas específicas de la secuencia codificante para la proteina de la invención que se subclonó en el vector comercial pGEM-T (Promega, I, USA). La secuenciación de las bandas amplificadas confirmó que se trataba de fragmentos de los clones buscados. A continuación, los fragmentos obtenidos por PCR se marcaron radiactivamente y se utilizaron como sonda para escrutar una genoteca de ADNc de T. harzíanum CECT 2413. Del total de clones escrutados se obtuvieron unos clones positivos, cuyos análisis pusieron de manifiesto que portaban unos insertos que englobaban completamente la ORF y algo de las secuencias flanqueantes de las regiones promotora y terminadora.
12.1 Extracción del ADNg El ADNg de Tri choderma harzianum CECT 2413 se obtuvo siguiendo el protocolo descrito por Kaiser et al. (1994) [Methods in yeast genetics . A Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York] con algunas modificaciones incluyendo la adición de un paso de purificación con fenol. Brevemente, 0,3-0,5 g de micelio liofilizado se resuspende en Tris-HCl 50 mM y EDTA 20 mM, se homogeniza y se añaden 200 mi de dodecilsulfato sódico (SDS) al 10%. A continuación, se incuba a 65°C durante 30 minutos, se añade acetato sódico y se incuba otros 30 minutos a 4°C. Finalmente se centrifuga y el sobrenadante se trata con fenol y se precipita con etanol .
12.2 Extracción del ARN total El ARN total de T. harzianum CECT 2413 se extrajo utilizando el método del fenol ácido descrito por Chomczynski & Sacchi [Chomczynski & Sacchi, Anal. Biochem., 1987, 162, 156] con ligeras modificaciones.
12.3 Construcción de una genoteca de ADNc
A partir del ARN total de T. harzianum CECT 2413, obtenido tras cultivar dicho hongo en MM con paredes celulares de Botrytis al 0,5% como fuente de carbono durante 9 horas, se aisló el ARNm. Para ello se utilizó una cromatografía de afinidad a oligo (dT) celulosa (Stratagene, La Jolla, CA) . A continuación, se sintetizó el ADNc empleando el kit comercial "ZAP-cDNA synthesis kit" (Stratagene) . Al ADNc así obtenido se le unieron los adaptadores Eco RI y Xho I y se ligó al vector Uni-Zap XR (Stratagene, La Jolla, CA) . Finalmente, para empaquetar el ADNc ligado al fago λ se empleó el kit de empaquetamiento "Gigapack III gold packaging extract" (Stratagene, La Jolla, CA) , siguiendo las instrucciones del fabricante.
12.4 Microsecuenciación de proteínas
Para determinar el extremo amino de la proteína AGN13.1, así como para obtener fragmentos internos que permitieran la clonación del gen correspondiente, se realizó la micro- secuenciación siguiendo el método de Edmans Matsudaira [A practical guide to protein and peptide purification for microsecuencing. Academic Press, Inc., New York, Edmans Masudaira (eds.) 1989]. Los resultados obtenidos fueron los siguientes :
Extremo a mo: ASSADRLVFSHFMIGIVGD [SEC. ID. N° : 4]
Péptido interno: DDTVYVAALLKTAGSVTVTSGGT [SEC. ID. N°: 5]
12.5 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
En los experimentos de PCR se utilizó como oligonucleótido sentido un oligonucleótido degenerado diseñado a partir del péptido interno de la proteína AGN13.1 y como oligonucleótido antisentido una secuencia correspondiente al plásmido en el que se construyó la genoteca (pBluescript II, Stratagene, La Jolla,
CA) . Concretamente, los oligonucleótidos directo e inverso fueron los siguientes:
directo: 5' -GATGATACNGTYTAYGTNGCNGC-3' [SEC. ID. N° : 6] inverso: 5' -GTAATACGACTCACTATAGGGC -3' [SEC. ID. N° : 7]
donde N es mosma, e Y es T o C.
Para la realización de las PCR se emplearon los siguientes parámetros :
1 ciclo de desnaturalización a 95°C durante 1 minuto, seguido de 35 ciclos de síntesis compuestos por: una fase de hibridación a 55°C durante 1 minuto, una fase de elongación a 72°C durante 1 minuto, y una fase de desnaturalización a 95°C durante 1 minuto; y finalmente 1 ciclo de elongación adicional de 7 minutos a 72°C para completar los productos inacabados.
En todos los casos la PCR se realizó utilizando ADNc procedente de la escisión de la genoteca como molde y empleando 100 pmoles de cada oligonucleótido en 25 μl de volumen total de PCR.
12.6 Escrutinio de la genoteca de ADNc El escrutinio de la genoteca de ADNc se realizó siguiendo procedimientos convencionales descritos por Sambrook et al. [Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1989], empleando sondas marcadas radiactivamente con α32P-dCTP siguiendo el método de cebadores al azar descrito por Femgerg y Volgeistem (1983) [Anal. Biochem, 132:6] . Para ello se usó el kit comercial "Oligolabellmg kit" (Pharmacia, Suecia) , siguiendo las instrucciones del fabricante.
12.7 Clonación del ADNc Para el diseño del oligonucleotido directo se utilizo la secuencia del extremo ammo de AGN13.1 y para el diseño del oligonucleotido inverso se utilizo una secuencia del plasmido en el que se construyó la genoteca [SEC. ID. N°: 7].
Con dichos oligonucleótidos y bajo las condiciones experimentales previamente descritas [véase el Ejemplo 8.5] se obtuvo una banda específica de 900 nucleótidos que se subclonó en el vector comercial pGEM-T (Promega, WI) . Posteriormente, la secuenciacion de esta banda confirmó que se trataba de un fragmento del clon buscado. A continuación, el fragmento obtenido por PCR se marcó radiactivamente y se utilizó como sonda para escrutar una genoteca de λ Zap construida a partir de ARN extraído de T. harzianum CECT 2413 tras 48 horas de inducción en MM con paredes de Botrytis . De unos 50.000 clones escrutados se obtuvieron varios clones, subclonando solamente el que presentó el mayor tamaño (2,2 kb) . Para el análisis del clon, en primer lugar, se escindió el fago siguiendo las instrucciones del fabricante, procediendo después a la secuenciación por ambas cadenas del inserto que portaba. En dicho clon se encontraba toda la ORF junto con fragmentos de las regiones 5' y 3' no codificante.
EJEMPLO 13 Clonaje molecular del ADNc al gen agnl3. 1
El clonaje molecular del gen agnl3. 1 que codifica para la AGN13.1 de T. harzianum se realizó mediante técnicas de PCR basadas en la información obtenida a partir del extremo amino terminal de la secuencia de aminoácidos de dicha proteína [Ejemplo 12] .
Brevemente, se construyó una genoteca de ADNc en un vector Uni-Zap XR (Stratagene) a partir de la cola poli (A) + de RNA aislado de T. harzianum CECT 2413 crecido en condiciones que simulaban antagonismo, que, en este caso eran medio mínimo conteniendo 0,5% de paredes celulares de B . cynerea o de P. syringae . El ADNc se sintetizó empleando el kit comercial ,XZAP- cDNA synthesis kit" (Stratagene) sobre cada lote de poli (A) + de RNA, se ligó al vector Uni-Zap XR (Stratagene) y se empaquetó en "Gigapack III gold packaging extract" (Stratagene) , siguiendo las instrucciones del fabricante. El título de la genoteca primaria fue de aproximadamente 2xl06 unidades formadoras de placa (UFP) independientes.
El ADN total se aisló a partir de dicha genoteca y se utilizó como templado para la PCR utilizando como iniciador directo (sentido) al oligonucleótido cuya secuencia se muestra en la SEC. ID. N°: 6 y como oligonicleótido antisentido un iniciador comercial de T3 [SEC. ID. N° : 8]. La amplificación del ADN se realizó en las siguientes condiciones: 95°C durante 1 minuto; 55°C durante 1 minuto, y 72°C durante 1 minuto, repitiéndose este ciclo en 35 ocasiones. Se obtuvo un único fragmento amplificado de 1.800 pb que se subclonó en el plásmido pGEM-T (Promega) y se secuenció. El fragmento de ADNc amplificado corresponde a la región del extremo carboxilo del gen agnl3. 1 . Por tanto, para obtener un ADNc a dicho gen, de longitud completa, dicho fragmento amplificado por PCR, marcado con 32P, se utilizó como sonda para escrutar la genoteca de ADNc ZAPII previamente obtenida. Las hibridaciones se realizaron mediante un protocolo convencional [Lora et al., Mol. Gen. Genet., 1995, 247, 639-645]. Tras el escrutinio de aproximadamente 40.000 UFP de dicha genoteca de ADNc se obtuvieron varios clones positivos y de ellos, el que contenía el inserto más grande (2.190 pb) se seleccionó para su posterior caracterización. Dicho inserto se subclonó en el plásmido pGEM-T (Promega) y se secuenció. El inserto contiene una única ORF de 1908 pb, una secuencia 5' sin traducir de 110 pb y una secuencia 3' sin traducir de 133 pb . La traducción del producto del gen agnl3. 1 tiene una secuenca de 636 aminoácidos con un peso molecular estimado de aproximadamente 67 kDa. La comparación de la secuencia deducida con la secuencia del extremo amino terminal de AGN13.1 determinada experimentalmente indica que la proteína madura comienza en el resto 38. Por tanto, la OÍ- (1,3)- glucanasa de T. harzianum contiene 597 restos de aminoácidos y tiene un peso molecular estimado de 63.789 kDa y un pl estimado de 5,36. La proteína predicha contiene los péptidos secuenciados a partir de la proteína purificada, lo que demuestra que el ADNc de agnl 3. 1 clonado codifica para la AGN13.1 purificada.
EJEMPLO 14 Modelo de expresión del AENm de agnl3. 1 y de la proteina AGN13.1 Se realizaron unos análisis Northern blot y Western blot para establecer si la inducción de agnl3. 1 ocurría preferentemente bajo condiciones similares a las que implican la respuesta del antagonismo de T. harzianum .
14.1 Northern blot La realización de este análisis se realizó mediante un protocolo convencional. Los resultados obtenidos pusieron de manifiesto que el ARNm de AGN13.1 estaba presente en los micelios crecidos en quitina y en paredes celulares fúngicas. Los niveles de estos ARNm eran diferentes en las condiciones en las que la señal aparecía después de 9 horas de inducción (cultivos con quitina y paredes celulares fúngicas) mientras que eran similares al cabo de 48 horas. La relativamente baja presencia de ARNm de AGN13.1 en T. harzianum crecido con paredes de Aspergill us al cabo de 9 horas puede ser debido a una liberación de glucosda más alta a partir de esas paredes celulares o a una menor eficacia de un posible inductor. Por tanto, parece que el ARNm de AGN13.1 se produce en condiciones de hambre de carbono en un corto periodo de tiempo de inducción excepto en un medio con glucosa al 0,1% donde no se observa ninguna señal, probablemente como consecuencia de la presencia de glucosa en cantidad suficiente para la represión catabólica. A tiempos mayores, la desrepresión catabólica es una situación general para T. harzianum cultivado en condiciones de hambre de carbono. Por tanto, se producen niveles similares de ARNm de AGN13.1 aunque puedn existir ciertos inductores de paredes celulares. Respecto a la condiciones de nitrógeno, no se observó ninguna señal, lo que sugiere que la transcripción del ARNm de ADN13.1 depende únicamente de la fuente de carbono.
14.2 Western blot Este análisis se realizó siguiendo las especificaciones generales [Ausubel et al., Analysis of proteins, Vol. 2, John Wiley & Sons, Inc. N. York, 1994] y utilizando un sistema de transferencia de proteínas comercial (Amersham-Pharmacia) . Brevemente, 20 μg de proteína AGN13.1 fueron transferidos desde el gel de poliacrilamida a una membrana de nitrocelulosa a 400 V durante 2 horas. A continuación, se bloqueó la membrana con leche en polvo al 5% en TBS, y se incubó durante 12 horas con anti-AGN13.1 obtenida en conejo, se lavó con Tween® al 0,05% en TBS y se incubó con un anticuerpo anticonejo conjugado con peroxidasa de rábano picante (Sigma Chemical Co.). A continuación, se lavó nuevamente con Tween® al 0,05% y finalmente se reveló la presencia de proteína con 2,5-cloro- naftol y peróxido de hidrógeno.
Para la realización de este ensayo T. harzianum se creció en presencia de las siguientes fuentes de carbono: glucosa 2%, glucosa 0,1%, quitina 1,5%, paredes celulares de P. syringae 0,5%, paredes celulares de P. a uran togriseum 0,5%, y paredes celulares de A. niger 0,5%, y en condiciones de hambre de nitrógeno . Los resultados obtenidos ponen de manifiesto que la producción extracelular de AGN13.1 de T. harzianum en presencia de diversas fuentes de carbono está condicionada por la ausencia de fuente de carbono asimilable, sobre todo por la presencia de paredes celulares o polisacáridos , tales como la quitina, en los medios de cultivo. En medios de glucosa al 2%, con o sin limitación de nitrógeno, no se produce la proteína.
De acuerdo con estos resultados, la desrepresión catabólica es la que conduce, fundamentalmente, a la producción de la proteína AGN13.1.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Empleo como agente antifúngico de una proteína que posee, al menos, actividad enzimática α- (1, 3) -glucanasa.
2. Empleo según la reivindicación 1, en el que dicha proteína tiene la capacidad de unirse a una pared celular de un hongo e inhibir la germinación de esporas y/o el crecimiento del micelio de un hongo.
3. Empleo según la reivindicación 2, en el que dicho hongo es un hongo que contiene en su pared celular un polímero que posee enlaces α- (1, 3) -glucosídicos .
4. Empleo según la reivindicación 2, en el que dicho hongo es un hongo que contiene S-glucano en su pared celular.
5. Empleo según la reivindicación 1, en el que dicha proteína tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre:
a) la secuencia de aminoácidos mostrada en la ΞEC. ID. N°: 1, y b) una secuencia de aminoácidos sustancialmente homologa y funcionalmente equivalente a la secuencia de aminoácidos mostradas en la SEC. ID. N°: 1.
6. Empleo según la reivindicación 1, en el que dicha proteína es una α- (1, 3) -glucanasa de T. harzianum .
7. Empleo según la reivindicación 6, en el que dicha α- (1, 3) -glucanasa de T. harzianum es la proteína identificada como AGN13.1 y tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. N°: 1.
8. Empleo según la reivindicación 2, en el que dicho hongo
HOJA SUSTITUTORIA (REGLA 26) es un hongo que contiene en su pared celular un polímero que posee enlaces - (1, 3) -glucosídicos, seleccionado entre un hongo patógeno de plantas, un hongo patógeno de animales, un hongo patógeno de humanos y un hongo contaminante de alimentos o instalaciones industriales, agrícolas o ganaderas.
9. Una composición antifúngica que comprende, al menos, una proteína que posee, al menos, actividad enzimática OÍ- (1,3)- glucanasa, junto con un vehículo inerte.
10. Una composición para controlar hongos fitopatógenos que comprende una cantidad antifúngica eficaz de, al menos, una proteína que posee, al menos, actividad enzimática OÍ- (1,3)- glucanasa, junto con, opcionalmente, uno o más vehículos agrícolamente aceptables.
11. Una composición farmacéutica para prevenir y/o tratar hongos patógenos de animales, incluidos patógenos de humanos, que comprende una cantidad antifúngica eficaz de, al menos, una proteína que posee, al menos, actividad enzimática -(l,3)- glucanasa, junto con, opcionalmente, uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
12. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en la que dicha proteína tiene la capacidad de unirse a una pared celular de un hongo e inhibir la germinación de esporas y/o el crecimiento del micelio de un hongo.
13. Composición según la reivindicación 12, en el que dicho hongo es un hongo que contiene en su pared celular un polímero que posee enlaces α- (1, 3) -glucosídicos .
14. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en la que dicha proteína tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre:
HOJA SUSTITUTORIA (REGLA 26) a) la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. N°: 1, y b) una secuencia de aminoácidos sustancialmente homologa y funcionalmente equivalente a la secuencia de aminoácidos mostradas en la SEC. ID. N°: 1.
15. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en la que dicha proteína es una α- (1, 3) -glucanasa de T. harzíanum .
16. Composición según la reivindicación 15, en el que dicha α- (1, 3) -glucanasa de T. harzíanum es la proteína identificada como AGN13.1 y tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. N°: 1.
17. Composición según la reivindicación 9, que comprende, además, uno o más fungicidas seleccionados entre fungicidas naturales, recombinantes o sintéticos.
18. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11, que comprende, además, una o más proteínas, con iguales o diferentes actividades enzimaticas para la modificación o degradación de paredes celulares fúngicas.
19. Composición según la reivindicación 18, que comprende una o más enzimas líticas capaces de modificar o degradar paredes celulares de hongos.
20. Composición según la reivindicación 18, que comprende, además, uno o más fungicidas químicos.
21. Un método para controlar un hongo fitopatógeno en una planta que comprende la etapa de aplicar a dicha planta, o al medio que la rodea, una cantidad eficaz de una composición para controlar dicho hongo fitopatógeno según la reivindicación 10.
HOJA SUSTITUTORIA (REGLA 26)
22. Método según la reivindicación 21, en el que dicha composición se aplica sobre las partes aéreas de la planta.
23. Método según la reivindicación 21, en el que dicha composición se aplica sobre un fruto, antes o después de su recogida .
24. Un método para desinfestar, prevenir y/o tratar la infección causada por hongos patógenos de animales en instalaciones ganaderas que comprende la etapa de aplicar sobre dichas instalaciones ganaderas una cantidad eficaz de dicha composición farmacéutica según la reivindicación 11.
25. Un método para controlar la contaminación fúngica en muestras de ensayo para análisis que comprende poner en contacto dicha muestra de ensayo con una cantidad eficaz de dicha composición según la reivindicación 9.
HOJA SUSTITUTORIA (REGLA 26)
PCT/ES2000/000292 1999-07-31 2000-07-28 Composiciones antifungicas y metodos para controlar hongos Ceased WO2001009294A1 (es)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP00951534A EP1207197A1 (en) 1999-07-31 2000-07-28 Antifungic compositions and method for controlling fungi
AU64435/00A AU6443500A (en) 1999-07-31 2000-07-28 Antifungic compositions and method for controlling fungi
CA002389719A CA2389719A1 (en) 1999-07-31 2000-07-28 Antifungic compositions and method for controlling fungi

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ESP9901746 1999-07-31
ES009901746A ES2163988B1 (es) 1999-07-31 1999-07-31 Proteina con actividad antifungica.

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2001009294A1 true WO2001009294A1 (es) 2001-02-08

Family

ID=8309472

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/ES2000/000292 Ceased WO2001009294A1 (es) 1999-07-31 2000-07-28 Composiciones antifungicas y metodos para controlar hongos

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP1207197A1 (es)
AU (1) AU6443500A (es)
CA (1) CA2389719A1 (es)
ES (1) ES2163988B1 (es)
WO (1) WO2001009294A1 (es)
ZA (1) ZA200201114B (es)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023225459A2 (en) 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections
CN118562762A (zh) * 2024-06-26 2024-08-30 中国海洋大学 一种抗真菌水解酶及其应用

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2641589A1 (en) * 2008-04-11 2013-09-25 Danisco US Inc. Alpha-glucanase and oral care composition containing the same
US20120023616A1 (en) * 2009-03-16 2012-01-26 National Institute Of Agrobiological Sciences Methods for preventing or inhibiting microbial infection of plants and plant exhibiting resistance to microbial infection
WO2026008785A1 (en) * 2024-07-03 2026-01-08 Biotalys NV Agrochemical compositions
EP4678160A1 (en) * 2024-07-11 2026-01-14 SkyLab AG A hair and scalp microbiome-friendly combination of enzymes

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0458889A (ja) * 1990-06-25 1992-02-25 Aizo Matsushiro α―１，３グルカナーゼ遺伝子

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1226282A (zh) * 1996-06-28 1999-08-18 诺沃挪第克公司 具有齿斑葡聚糖酶活性的重组酶
EP0951272A1 (en) * 1996-10-25 1999-10-27 Novo Nordisk A/S An oral care product comprising a mutan binding domain

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0458889A (ja) * 1990-06-25 1992-02-25 Aizo Matsushiro α―１，３グルカナーゼ遺伝子

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DE VRIES O.M.H. ET AL.: "Relase of protoplasts from schizophyllum commune by combined action of purified alpha-1,3-glucanase and chitinase derived from trichoderma viride", JOURNAL OF GENERAL MICROBIOLOGY, vol. 76, 1973, pages 319 - 330, XP001008492 *
FUGLSANG C.C. ET AL.: "Biochemical analysis of recombinant fungal mutanases", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 275, no. 3, 2000, pages 2009 - 2018, XP001008801 *
GOLDMAN G.H. ET AL.: "Molecular and cellular biology of biocontrol by trichoderma Spp.", TIBTECH, vol. 12, 1994, pages 478 - 482, XP001007499 *
QUIVEY R.G. ET AL.: "Raffinose-induced mutanase production from trichoderma harzianum", FEMS MICROBIOLOGY LETTERS, vol. 112, 1993, pages 307 - 312, XP001008406 *
SANDHU D. ET AL.: "Use of lytic enzymes for protoplast production in trichoderma reesei QM 9414", ENZYME MICROB. TECHNOL., vol. 11, 1989, pages 21 - 25, XP001008407 *
TSUNODA A. ET AL.: "Purification and properties of an exo-alpha-1,3-glucanase from trichoderma viride", AGRIC. BIOL. CHEM., vol. 41, no. 6, 1977, pages 939 - 943, XP001008426 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023225459A2 (en) 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections
CN118562762A (zh) * 2024-06-26 2024-08-30 中国海洋大学 一种抗真菌水解酶及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
ES2163988B1 (es) 2003-04-01
EP1207197A1 (en) 2002-05-22
ZA200201114B (en) 2003-04-30
ES2163988A1 (es) 2002-02-01
AU6443500A (en) 2001-02-19
CA2389719A1 (en) 2001-02-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kim et al. Purification and characterization of chitinase from Streptomyces sp. M-20
Rosado et al. QID74 Cell wall protein of Trichoderma harzianum is involved in cell protection and adherence to hydrophobic surfaces
Holdom et al. The Cu, Zn superoxide dismutases of Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, and Aspergillus terreus: purification and biochemical comparison with the Aspergillus fumigatus Cu, Zn superoxide dismutase
JP2000507222A (ja) 真菌細胞壁分解酵素および真菌細胞膜作用化合物の組み合せ
Middelbeek et al. Production, purification and properties of a Pichia kluyveri killer toxin
Dumas-Gaudot et al. Chitinase isoforms in roots of various pea genotypes infected with arbuscular mycorrhizal fungi
Yan et al. In vitro antifungal activity and mechanism of action of chitinase against four plant pathogenic fungi
Eshel et al. Resistance of gibberellin-treated persimmon fruit to Alternaria alternata arises from the reduced ability of the fungus to produce endo-1, 4-β-glucanase
US7670820B2 (en) Chitinase and uses thereof
Liu et al. A novel endo-β-1, 6-glucanase from the mushroom Coprinopsis cinerea and its application in studying of cross-linking of β-1, 6-glucan and the wall extensibility in stipe cell walls
EP0623672A1 (en) New alkaline serine protease of Paecilomyces lilacinus
Holdom et al. Purification, N-Terminal Amino Acid Sequence and Partial Characterization of A Cu, Zn Superoxide Dismutase From the Pathogenic Fungus Aspergillusfumiga Tus
US5378821A (en) Gene encoding for endochitinase
Zhang et al. Cloning, characterization and expression of an exo-1, 3-β-glucanase gene from the antagonistic yeast, Pichia guilliermondii strain M8 against grey mold on apples
Lee et al. Differential induction and accumulation of β‐1, 3‐glucanase and chitinase isoforms in the intercellular space and leaf tissues of pepper by Xanthomonas campestris pv. vesicatoria infection
US9534025B2 (en) Method for inducing resistance to stress caused by pathogens in plants
Mota et al. Chitinase from the latex of Ficus benjamina L. displays antifungal activity by inducing ROS generation and structural damage to the fungal cell wall and plasma membrane
EP0656059A1 (en) Purified chitinases and use thereof
WO2001009294A1 (es) Composiciones antifungicas y metodos para controlar hongos
ES2205982B1 (es) Enzima con actividad beta-(1,6)-endoglucanasa.
Slezack et al. Purification and partial amino acid sequencing of a mycorrhiza-related chitinase isoform from Glomus mosseae-inoculated roots of Pisum sativum L.
US20040078842A1 (en) Chitinases, derived from carnivorous plants polynucleotide sequences encoding thereof, and methods of isolating and using same
JP2000175698A (ja) ピラノースオキシダーゼを含有するピラノース測定用試薬
JP4516258B2 (ja) 新規タンパク質、それをコードする遺伝子及びそれらの利用法
Kim et al. Molecular cloning and characterization of a class III chitinase in pumpkin leaves, which strongly binds to regenerated chitin affinity gel

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CR CU CZ DE DK DM DZ EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NO NZ PL PT RO RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TR TT TZ UA UG US UZ VN YU ZA ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE BF BJ CF CG CI CM GA GN GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2389719

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2002/01114

Country of ref document: ZA

Ref document number: 200201114

Country of ref document: ZA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 64435/00

Country of ref document: AU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2000951534

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2000951534

Country of ref document: EP

REG Reference to national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: 8642

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 2000951534

Country of ref document: EP