WO2001016309A1 - Proteine recepteur couplee a une proteine g et adn correspondant - Google Patents

Proteine recepteur couplee a une proteine g et adn correspondant Download PDF

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salt
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Takuya Watanabe
Yasuko Terao
Yasushi Shintani
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Takeda Pharmaceutical Co Ltd
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Takeda Chemical Industries Ltd
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a novel protein derived from human brain (G protein-coupled receptor protein) or a salt thereof, a DNA encoding the same, and the like.
  • G protein-coupled receptor protein G protein-coupled receptor protein
  • G protein conjugated guanine nucleic acid de-binding protein
  • G protein-coupled receptor proteins are present on the surface of various functional cells of living cells and organs, and are very useful as targets for molecules that regulate the functions of these living cells and organs, such as hormones, neurotransmitters and bioactive substances. Plays an important role. To clarify the relationship between substances that regulate complex functions in cells and organs of various organisms and their specific receptor proteins, particularly G protein-coupled receptor proteins, It will elucidate the functions of cells and organs and provide a very important means for drug development closely related to those functions.
  • the physiological functions of the brain are regulated by the regulation of many hormones, hormone-like substances, neurotransmitters or bioactive substances.
  • neurotransmitters are present in various parts of the brain, and regulate their physiological functions through their corresponding receptor proteins.
  • There are still many unknown neurotransmitters in the brain and it is thought that there are many unreported structures of the cDNA encoding the receptor protein. Can be In addition, it was unknown whether there was a known receptor subtype of the Yuichi protein.
  • the present invention relates to a novel protein derived from human brain (G protein-coupled receptor protein), a partial peptide or a salt thereof, a DNA containing a DNA encoding the protein or a partial peptide thereof, and a DNA containing the DNA.
  • G protein-coupled receptor protein G protein-coupled receptor protein
  • the present inventors isolated cDNA encoding a novel protein (G protein-coupled receptor protein) derived from human brain and analyzed the entire nucleotide sequence. Successfully analyzed. When this nucleotide sequence was translated into an amino acid sequence, the first to seventh transmembrane regions were confirmed on the hydrophobicity plot, and the proteins encoded by these cDNAs were G-protein conjugated to the seven transmembrane type. It was confirmed that the protein was Recept Yuichi protein ( Figure 3). The present inventors have conducted further studies based on these findings, and as a result, have completed the present invention.
  • G protein-coupled receptor protein G protein-coupled receptor protein
  • a protein or a salt thereof which comprises the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1;
  • (10) A compound that changes the binding property between the ligand described in (1) above or the partial peptide described in (2) or a salt thereof and the protein described in (1) or a salt thereof Or a method for screening a salt thereof, (11) a ligand comprising the protein of the above (1) or the partial peptide of the above (2) or a salt thereof, and a protein or a protein of the above (1).
  • a screening kit for a compound or a salt thereof that changes the binding property to the salt (12) Altering the binding property between the ligand and the protein or the salt thereof according to (1), which can be obtained by using the screening method according to (10) or the screening kit according to (11).
  • the protein is: (1) 1 or 2 or more in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 9, more preferably several (1 or 2))
  • the amino acid sequence of which amino acid has been deleted 2 SEQ ID NO: 1 or 2 or more (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, Preferably an amino acid sequence to which several (1 or 2) amino acids have been added; and 3 one or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (preferably about 1 to 30, more preferably Is a protein containing an amino acid sequence in which about 1 to 10, more preferably several (one or two) amino acids are substituted with another amino acid, or an amino acid sequence obtained by combining them.
  • the ligands are angiotensin, bombesin, canapinoid, cholesis tokinin, glutamine, serotonin, melatonin, neuropeptide Y, obioid, purine, vasopletcin, oxitocin, PACAP, secretin, glucagon, calcitonin, adrenomedullin , Somatos, Chin, GHRH, CRF, ACTH, GRP, PTH, VIP (Vasoactive Intesty Null and related polypeptides), somatosustin, dopamine, motilin, amylin, bradykinin, CGRP (calcitonin gene relay peptide), leukotriene, pancreatastatin, prostaglandin, tropoxane, adenosine, adrenaline, hi and; 3—chemokines (eg, IL-18, GROa ;, GROj3, GROr, NAP—2, ENA
  • the compound that activates the protein according to (1) above is angiotensin, bombesin, canapinoid, cholecystokinin, glutamine, serotonin, melatonin, neuropeptide Y, opioid, purine, vasoprescin, oxocytosine , PACAP, secretin, glucagon, calcitonin, adrenomedullin, somatos, GHRH, CRF, ACTH, GRP, PTH, VIP (Vasoactive Intestinal and Rerated Polypeptide), somatos, dopamine, motilin, amylin, Bradykinin, CGRP (calcitonin gene relayed peptide), leukotriene, pancreastatin, prostaglandin, thromboxane, adenosine, adrenaline, and 3) -chemokine (eg, IL) I-8, GR ⁇ HI, GR ⁇ ) 3, GROr, NAP—2, ENA
  • a compound or a salt thereof which can be obtained by the screening method according to the above (18) to (25), which changes the binding property between the ligand and the protein or the salt thereof according to the above (1).
  • (31) a compound or a salt thereof, which can be obtained by using the screening kit according to any of (28) to (30) above, which alters the binding property between the ligand and the protein or salt thereof according to (1) above;
  • a medicament characterized by:
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence (ZAQC) of the DNA encoding the human brain-derived protein of the present invention obtained in Example 1 and the amino acid sequence deduced therefrom (FIG. 2). followed by) .
  • FIG. 2 shows the nucleotide sequence (ZAQC) of the DNA encoding the human brain-derived protein of the present invention obtained in Example 1 and the amino acid sequence deduced therefrom (continued from FIG. 1 and continued from FIG. 3).
  • ZAQC nucleotide sequence
  • FIG. 3 shows the nucleotide sequence (ZAQC) of the DNA encoding the human brain-derived protein of the present invention obtained in Example 1 and the amino acid sequence deduced therefrom (continuation of FIG. 2).
  • FIG. 4 shows the nucleotide sequence (ZAQT) of DNA encoding the human brain-derived protein of the present invention obtained in Example 1 and the amino acid sequence deduced therefrom (following FIG. 5).
  • FIG. 5 shows the nucleotide sequence (ZAQT) of DNA encoding the human brain-derived protein of the present invention obtained in Example 1 and the amino acid sequence deduced therefrom (continued from FIG. 4 and continued from FIG. 6).
  • FIG. 6 shows the nucleotide sequence (ZAQT) of DNA encoding the human brain-derived protein of the present invention obtained in Example 1 and the amino acid sequence deduced therefrom (continuation of FIG. 5).
  • FIG. 7 shows a hydrophobicity plot of the human brain-derived protein of the present invention.
  • FIG. 8 shows the results of analysis of the expression distribution of ZAQ performed in Example 2.
  • FIG. 9 shows the amino acid sequences of MIT1, human ZAQ ligand precursor peptide (A type) and human ZAQ ligand precursor peptide (G type).
  • MIT 1 is the amino acid sequence of MIT 1
  • Human (A t ype) is the amino acid sequence of the human type ZAQ ligand mature peptide (A type)
  • Human (B t e p) Shows the amino acid sequence of the human Z AQ ligand mature peptide (B type), respectively.
  • FIG. 10 shows the results of measurement of the ZAQ activating effect of the purified ZAQ ligand peptide performed in Example 6 (6-3).
  • FIG. 11 shows a restriction map of plasmid PCAN618 used in Example 5 (5-1). BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the protein of the present invention (the G protein-coupled receptor protein) is the same as or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (the amino acid sequence in FIG. 1 to FIG. 3 or FIG. 4 to FIG. 6). (Hereinafter, the protein of the present invention (G protein-coupled receptor protein) or a salt thereof may be abbreviated to the protein of the present invention in some cases).
  • the protein of the present invention includes, for example, human mammals (for example, guinea pigs, rats, mice, rabbits, pigs, sheep, sheep, monkeys, etc.), and all cells (for example, Splenocytes, nerve cells, glial cells, kidney / 3 cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, fiber cells, muscle cells, adipocytes, immune cells ( Eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, bone cells, osteoblasts , Osteoclasts, mammary gland cells, hepatocytes or stromal cells, or precursors of these cells, stem cells or cancer cells, etc., and blood cells (eg, MEL
  • the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is, for example, about 90% or more, preferably about 95% or more, more preferably the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Include amino acid sequences having about 98% or more homology.
  • Examples of a protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 include, for example, a protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; Proteins having substantially the same properties as the protein having the amino acid sequence represented by 1 are preferred.
  • Examples of the protein of the present invention having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 include, for example, the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Proteins containing an amino acid sequence and having substantially the same activity as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 are preferred.
  • substantially the same activity examples include a ligand binding activity and a signal information transmitting action. Substantially the same indicates that their activities are the same in nature. Therefore, it is preferable that the activities such as the ligand binding activity and the signal transduction activity are equivalent (eg, about 0.5 to 2 times), but the quantitative factors such as the degree of these activities and the molecular weight of the protein are different. May be.
  • the activities such as the ligand binding activity and signal transduction can be measured according to a method known per se.
  • the activity can be measured according to a determination method or a screening method.
  • the protein of the present invention includes: (1) one or two or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (preferably, about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, more preferably about 1 to 10; An amino acid sequence in which several (1 or 2) amino acids have been deleted, and 1 or 2 or more (preferably about 1 to 30) amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Preferably about 1 to 10 amino acids, more preferably several (one or two) amino acids added; 3 one or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (preferably 1-30 Or more preferably about 1 to 10, more preferably several (one or two) amino acids in which the amino acid sequence is replaced by another amino acid, or a protein containing an amino acid sequence obtained by combining them. Is also used.
  • the protein has a N-terminus (amino terminus) at the left end and a C-terminus (carboxyl terminus) at the right end according to the convention of peptide labeling.
  • the C-terminus is usually a hydroxyl group (one COOH) or a carboxylate (—COO one).
  • the terminal may be an amide (_CONH 2 ) or an ester (one COOR).
  • R in the ester e.g., methyl, Echiru, n- propyl Le, CI- e alkyl group such as isopropyl or n- butyl, consequent opening pentyl, C 3, such as cyclohexyl - 8 cycloalkyl group , for example, phenylene Le, alpha-C 6, such as naphthyl - 12 Ariru group, e.g., benzyl, phenethyl that what phenylene Lou CI_ 2 alkyl group Moshikuwahi - Ji Bok 2 alkyl groups - alpha-naphthyl, such as naphthylmethyl C 7 such as - other 14 Ararukiru group, Viva port Iruokishimechiru groups commonly as a oral ester.
  • Ariru group e.g., benzyl, phen
  • the protein of the present invention When the protein of the present invention has a lipoxyl group (or carboxylate) at a position other than the C-terminal, the protein of the present invention includes a lipoxyl group amidated or esterified.
  • the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
  • the amino acid of the N-terminal methionine residue may be a protecting group (for example, an acyl group such as a C 2 _ 6 alkanoyl group such as a formyl group or an acetyl group).
  • a protecting group for example, an acyl group such as a C 2 _ 6 alkanoyl group such as a formyl group or an acetyl group.
  • the glutamyl group formed by cleavage of the N-terminal side in vivo and pyroglutamine oxidation, the substituent on the side chain of the amino acid in the molecule (for example, —OH, one SH, amino acid) Groups, imidazole groups, indole groups, guanidino groups, etc.) are protected by appropriate protecting groups (for example, acyl groups such as C 2 _ 6 alkanoyl groups such as formyl group and acetyl group). Or complex proteins such as so-called glycoproteins with sugar chains attached Quality is also included.
  • protein of the present invention include, for example, a protein derived from human (more preferably, derived from human brain) containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the partial peptide of the protein of the present invention may be any of the above-mentioned partial peptides of the protein of the present invention.
  • the molecules those which are exposed outside the cell membrane and have receptor binding activity are used.
  • the partial peptide of the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 was analyzed to be an extracellular region (Hydrophilic region) in the hydrophobicity plot analysis shown in FIG. It is a peptide containing the portion shown. Further, a peptide partially containing a hydrophobic (Hydrophobic) site can also be used. A peptide containing individual domains may be used, but a peptide containing a plurality of domains at the same time may be used.
  • the number of amino acids of the partial peptide of the present invention is at least 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 100 or more amino acids in the amino acid sequence constituting the protein of the present invention. Peptides having a sequence are preferred.
  • a substantially identical amino acid sequence refers to an amino acid sequence of about 50% or more, preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, still more preferably about 90% or more, most preferably Indicates an amino acid sequence having about 95% or more homology.
  • substantially the same activity has the same meaning as described above.
  • the “substantially the same activity” can be measured in the same manner as described above.
  • the partial peptide of the present invention lacks one or more (preferably about 1 to 10, more preferably several (1 or 2)) amino acids in the above amino acid sequence. Or one or more (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, more preferably several (1 or 2)) amino acids in the amino acid sequence. 1 or 2 or more in the amino acid sequence (preferably about 1 to 10, more preferably about 1 to 5, Preferably, several (one or two) amino acids may be substituted with other amino acids.
  • C-terminal is normally carboxyl group (one CO OH) or Karupokishireto (one COO-), as the protein of the present invention described above, C-terminal amide (one CO NH 2 ) Or ester (one COOR).
  • the partial peptide of the present invention includes a peptide in which the amino group of the N-terminal methionine residue is protected with a protecting group, and a Gin formed by cleavage of the N-terminal side in vivo.
  • a protecting group examples thereof include those obtained by oxidizing pyroglutamine, those in which the substituent on the side chain of the amino acid in the molecule is protected with an appropriate protecting group, and those in which a sugar chain is bound, such as a complex peptide such as a so-called sugar peptide.
  • the partial peptide of the present invention usually has a carboxyl group (one COOH) or a carboxylate (—COO—) at the C-terminus.
  • the C-terminal has an amide (one C ⁇ NH 2). ) Or ester (one COOR).
  • a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable.
  • examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid) , Tartaric acid, cunic acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid
  • Tartaric acid cunic acid, malic acid, oxalic acid
  • benzoic acid methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid
  • the protein of the present invention or a salt thereof can be produced from the above-described human or mammalian cells or tissues by a method for purifying the protein known per se, or a trait containing a DNA encoding the protein of the present invention described below. It can also be produced by culturing the transformant. In addition, it can also be produced by the protein synthesis method described below or according to it.
  • the human or mammalian tissues or cells are homogenized, and then extracted with an acid or the like. Purification and isolation can be achieved by combining chromatography such as mouth chromatography and ion exchange chromatography.
  • a commercially available resin for protein synthesis can be usually used.
  • resins include, for example, chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzohydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, 4-hydroxy Methyl methylphenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ', 4'-dimethoxyphenyl-hydroxymethyl) phenoxy resin, 4_ (2', 4'-dimethoxyphenyl-Fmocamino Ethyl) phenoxy resin and the like.
  • an amino acid having an ⁇ -amino group and a side chain functional group appropriately protected is condensed on the resin in accordance with the sequence of the target protein according to various known condensation methods.
  • various protecting groups are removed at the same time, and an intramolecular disulfide bond formation reaction is carried out in a highly diluted solution to obtain a target protein or an amide thereof.
  • carbodiimides are particularly preferable.
  • the carpoimides include DC (:, N, ⁇ '-diisopropylcarpo- imide, ⁇ -ethyl- ⁇ '-(3-dimethylaminoprolyl) carbopimide, etc.
  • the activation by these is racemization.
  • the solvent used for the activation of the protected amino acid and the condensation with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for the protein condensation reaction.
  • acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride, chloroform, alcohols such as trifluoroethanol , Dimethyl sulfoxy Sulfoxides such as sides, ethers such as pyridine, dioxane, and tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, or an appropriate mixture thereof are used.
  • the reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for a protein bond formation reaction, and is usually appropriately selected from a range of about 120 ° C. (: to 50 ° C.)
  • the amino acid derivative is usually used in a 1.5- to 4-fold excess, and as a result of a test using the ninhydrin reaction, if the condensation is insufficient, it is sufficient to repeat the condensation reaction without removing the protecting group. When sufficient condensation cannot be obtained even by repeating the reaction, unreacted amino acid can be acetylated using acetic anhydride or acetylimidazole.
  • Examples of the protecting group for the amino group of the starting material include, for example, Z, Bo and pentyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, ⁇ -Z, Br-Z, adamantyl
  • oxycarbonyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 2-ditrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like are used.
  • the carboxyl group may be, for example, alkyl esterified (for example, methyl, ethyl, propyl, butyl, tert-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.).
  • alkyl esterified for example, methyl, ethyl, propyl, butyl, tert-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.
  • Cyclic alkyl esterification aralkyl esterification (for example, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-cyclobenzyl ester, benzhydryl esterification), phenacyl esterification, benzylo It can be protected by xycarbonylhydrazide, tertiary butoxycarbonyl hydrazide, trityl hydrazide and the like. The hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • groups suitable for the esterification for example, a lower alkanol group such as an acetyl group, an aroyl group such as a benzoyl group, a group derived from carbonic acid such as a benzyloxycarbonyl group, an ethoxycarbonyl group, and the like are used.
  • groups suitable for etherification include, for example, benzyl group, A loviranyl group, a t-butyl group and the like.
  • protecting group for the phenolic hydroxyl group of tyrosine for example, Bzl, Cl 2 -Bzl, 2-nitrobenzyl, Br-Z, Yuichi Sharybutyl and the like are used.
  • imidazole protecting group for histidine for example, Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like are used.
  • Examples of the activated carboxyl groups of the raw materials include, for example, corresponding acid anhydrides, azides, active esters [alcohols (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4 -Dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, H0NB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, ester with HOBt).
  • active esters eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4 -Dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, H0NB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, ester with HOBt.
  • Methods for removing (eliminating) protecting groups include, for example, catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or anhydrous hydrogen fluoride, Acid treatment with acid, trifluoromethanesulfonic acid, trifluoroacetic acid or a mixture thereof, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., reduction with sodium in liquid ammonia, etc. Used.
  • the elimination reaction by the above acid treatment is generally performed at a temperature of about 120 ° C. to 40 ° C.
  • the 2,4-dinitro phenyl group used as an imidazole protecting group for histidine is removed by thiophenol treatment
  • the formyl group used as an indole protecting group for tributofan is 1,2-ethanedithiol
  • it is also removed by alkali treatment with dilute sodium hydroxide solution, dilute ammonia and the like.
  • Protection of functional groups that should not participate in the reaction of The removal of the protecting group, the activation of the functional group involved in the reaction, and the like can be appropriately selected from known groups or known means.
  • an amide form of a protein for example, first, after protecting the carboxy-terminal amino acid with a single amino acid, the amino acid side of the peptide chain is extended to a desired length. A protein from which only the protecting group for the N-terminal monoamino group of the peptide chain has been removed and a protein from which only the protecting group for the C-terminal lipoxyl group has been removed, and the two proteins are mixed as described above. Condensation in Details of the condensation reaction are the same as described above. After purifying the protected protein obtained by the condensation, all the protecting groups are removed by the above-mentioned method to obtain a desired crude protein. This crude protein is purified by various known purification means, and the main fraction is freeze-dried to obtain an amide of the desired protein.
  • a protein ester for example, after condensing the ⁇ -functional lipoxyl group of the carboxy-terminal amino acid with a desired alcohol to form an amino acid ester, the desired protein ester is obtained in the same manner as the protein amide. Can be obtained.
  • the partial peptide of the protein of the present invention or a salt thereof can be produced according to a peptide synthesis method known per se, or by cleaving the protein of the present invention with an appropriate peptidase.
  • a peptide synthesis method for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used.
  • the target peptide can be produced by condensing a partial peptide or amino acid capable of constituting the protein of the present invention with the remaining portion, and when the product has a protecting group, removing the protecting group.
  • Known condensation methods and elimination of protecting groups include, for example, the methods described in the following 1 to 5.
  • the partial peptide of the present invention can be purified and isolated by a combination of ordinary purification methods such as solvent extraction / distillation, column chromatography / liquid chromatography / recrystallization.
  • the partial peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method, and conversely, when it is obtained as a salt, it can be converted to a free form by a known method.
  • the DNA encoding the protein of the present invention may be any DNA containing the above-described nucleotide sequence encoding the protein of the present invention.
  • RNA DNA may be any of a genome DNA, a genome DNA library, the above-described cell / tissue-derived cDNA, the above-described cell / tissue-derived cDNA library, and a synthetic DNA.
  • the vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like.
  • RT-PCR method direct reverse transcription polymerase chain reaction
  • DNA encoding the protein of the present invention for example, DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3, or SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 Has a DNA that hybridizes under high stringent conditions with a DNA having the nucleotide sequence represented by the following, and has substantially the same activity as the protein of the present invention (eg, ligand binding activity, signal signal transduction action, etc.) Any DNA may be used as long as it encodes a protein.
  • Examples of the DNA that hybridizes with the DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 under stringent conditions include, for example, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3
  • a DNA containing a base sequence having a homology of about 90% or more, preferably about 95% or more, more preferably about 98% or more is used.
  • Hybridization is performed by a method known per se or a method analogous thereto, for example,
  • the method can be performed according to the method described in Molecular Cloning (Molecule Coloring) 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). it can.
  • a commercially available library it can be carried out according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, it can be performed under high stringent conditions.
  • High stringency conditions include, for example, a sodium concentration of about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and a temperature of about 50 to 70 ° C, preferably about 60 to The conditions at 65 ° C are shown. In particular, the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C is most preferable.
  • examples of the DNA encoding the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 include DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3.
  • a nucleotide (oligonucleotide) containing a base sequence encoding the protein of the present invention or containing a part of a base sequence complementary to the base sequence is a protein of the present invention or a partial peptide thereof.
  • the term is used to mean not only encompasses DNA encoding, but also encompasses RNA.
  • an antisense (oligo) nucleotide (nucleic acid) capable of inhibiting the replication or expression of the protein gene of the present invention is cloned or determined. It can be designed and synthesized based on sequence information. Such (oligo) nucleotides (nucleic acids) can hybridize with the RNA of the G protein-coupled protein gene and can inhibit the synthesis or function of the RNA, or can inhibit the G protein-coupled protein-related RNA. It is possible to regulate and control the expression of G protein-coupled protein gene through the interaction with.
  • (Oligo) nucleotides complementary to the selected sequence of G protein-coupled protein-related RNA and (oligo) nucleotides capable of specifically hybridizing with G protein-coupled protein-related RNA are in vivo and It is useful for regulating and controlling the expression of G protein-coupled protein gene in vitro, and is also useful for treating or diagnosing diseases.
  • the term "corresponding" means having homology or being complementary to a specific sequence of nucleotides, base sequences or nucleic acids including genes.
  • the “correspondence” between a nucleotide, a nucleotide sequence or a nucleic acid and a peptide (protein) usually refers to the amino acid of the peptide (protein) specified by the instruction derived from the nucleotide (nucleic acid) sequence or its complement.
  • the translation region, the 3 'end palindrome region, and the 3' end hairpin loop can be selected as preferred regions of interest, but any region within the G protein-coupled protein gene can be selected as the region of interest.
  • the relationship between the target nucleic acid and the (oligo) nucleotide complementary to at least a part of the target region is that the relationship between the (oligo) nucleotide that can hybridize with the target is “antisense”. it can.
  • Antisense '(oligo) nucleotides are 2-deoxy D-report-containing polydeoxynucleotides, D-report-containing polydeoxynucleotides, N-glycosides of purine or pyrimidine bases.
  • polynucleotides or other polymers having a non-nucleotide backbone eg, commercially available protein nucleic acids and synthetic sequence-specific nucleic acid polymers
  • polymers containing special bonds but not including the polymer Represents a base pair found in DNA or RNA and contains a nucleotide having a configuration permitting the attachment of a base.
  • RNA hybrids can be double-stranded DNA, single-stranded DNA, double-stranded RNA, single-stranded RNA, and even DNA: RNA hybrids, and can be unmodified polynucleotides or unmodified oligonucleotides, as well as known Modified, e.g., labeled in the art, labeled, capsulated, methylated, substituted for one or more natural nucleotides by analogs, intramolecular nucleotides Modified, eg, having uncharged bonds (eg, methylphosphonate, phosphotriester, phosphoramidate, olebamate, etc.), charged or sulfur-containing bonds (eg, For example, those having phosphorothioate, phosphorodithioate, etc., such as proteins (nucleases, nuclease inhibitors, toxins, antibodies, signal peptides, poly-L-lysine, etc.) and sugars (eg, monos
  • nucleoside may include not only those containing purine and pyrimidine bases but also those having other modified complex ring bases. Such modifications may include methylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other heterocycles. Modified nucleotides and modified nucleotides may also be modified at the sugar moiety, e.g., one or more hydroxyl groups are replaced with halogens, aliphatic groups, etc., or functional groups such as ethers, amines, etc. May be converted to
  • the antisense nucleic acid of the present invention is RNA, DNA or a modified nucleic acid.
  • modified nucleic acid include, but are not limited to, sulfur derivatives of nucleic acids, thiophospho derivatives, and polynucleoside amides, which are resistant to degradation of oligonucleoside amides.
  • the antisense nucleic acid of the present invention can be preferably designed according to the following policy. That is, to make the antisense nucleic acid more stable in the cell, to increase the cell permeability of the antisense nucleic acid, to increase the affinity for the target sense strand, and to antisense if toxic. Make nucleic acids less toxic.
  • many modifications are known in the art, for example, J.
  • the antisense nucleic acids of the present invention may have altered or modified sugars, bases, It may contain a linkage and may be provided in a special form such as ribosomes, microspheres, applied by gene therapy, or provided in an added form.
  • the addition forms include polycations, such as polylysine, which act to neutralize the charge of the phosphate backbone, and lipids, which enhance the interaction with cell membranes or increase the uptake of nucleic acids ( For example, phospholipids, cholesterol, etc.).
  • Preferred lipids for addition include cholesterol and its derivatives (eg, cholesteryl chromate formate, cholic acid, etc.).
  • nucleic acid can be attached via a base, sugar, or intramolecular nucleoside bond.
  • Other groups include cap groups specifically located at the 3 'or 5' end of nucleic acids that prevent degradation by nucleases such as exonucleases and RNases. .
  • capping groups include, but are not limited to, hydroxyl-protecting groups known in the art, including glycols such as polyethylene glycol and tetraethylene glycol.
  • the inhibitory activity of the antisense nucleic acid can be examined using the transformant of the present invention, the in vivo or in vitro gene expression system of the present invention, or the in vivo or in vitro translation system of a protein.
  • the nucleic acid itself can be applied to cells by various methods known per se.
  • any DNA may be used as long as it contains the above-described nucleotide sequence encoding the partial peptide of the present invention. Further, it may be any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the cells and tissues described above, cDNA library derived from the cells and tissues described above, and synthetic DNA.
  • the vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like.
  • amplification can be performed directly by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using the mRNA fraction prepared from the cells and tissues described above.
  • DNA encoding the partial peptide of the present invention for example, Part of DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 DNA having the nucleotide sequence, or ⁇ DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 and high stringency
  • a partial nucleotide sequence of a DNA encoding a protein having a DNA that hybridizes under simple conditions and having substantially the same activity as the protein peptide of the present invention (eg, ligand binding activity, signal transduction action, etc.) DNA or the like is used.
  • Examples of the DNA that hybridizes with the DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 under eight stringent conditions include, for example, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3.
  • a DNA containing a nucleotide sequence having a homology of about 90% or more, preferably about 95% or more, more preferably about 98% or more is used.
  • a partial base of the nucleotide sequence of the DNA encoding the protein of the present invention may be used.
  • the DNA base sequence can be converted by PCR or a known kit, for example, Mutan TM -super Express Km (Takara Shuzo Co., Ltd.), Mutan TM -K (Takara Shuzo Co., Ltd.), etc. It can be carried out according to a method known per se, such as the Gupped duplex method or Kunke method, or a method analogous thereto.
  • the DNA encoding the cloned protein can be used as it is depending on the purpose, or it can be used after digestion with a restriction enzyme or addition of a linker if desired. it can.
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon at the 5 'end and TAA, TGA or TAG as a translation termination codon at the 3' end. These translation initiation codon and translation termination codon can also be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
  • the expression vector of the protein of the present invention may be prepared, for example, by (a) cutting out a DNA fragment of interest from the DNA encoding the protein of the present invention, and (mouth) extracting the DNA fragment from a promoter in an appropriate expression vector. It can be manufactured by connecting downstream.
  • the vector examples include a plasmid derived from E. coli (eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), a plasmid derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5, pC194), a plasmid derived from yeast ( For example, pSH19, pSH15), bacteriophage such as phage ⁇ , animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, baculovirus, etc., pAl-11, pXT1, pRc / CMV, pRc / RSV, pc DNA I / Neo, pc DN A3.1, pRcZCMV2, pRc / RSV (Invitrogen) and the like are used.
  • E. coli eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13
  • Bacillus subtilis eg, pUB110, p
  • the promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression.
  • examples include the SR promoter, SV40 promoter, HIV-LTR promoter, CMV promoter, HSV-TK promoter and the like.
  • the CMV promoter, SR ⁇ promoter and the like are preferably used.
  • the host is Eshierihia genus bacterium, trp promoter, lac promoter one coater, re cA promoter, AP L promoter Isseki one, such as l pp promo Isseki one is, when the host is Bacillus, spol promoter
  • yeast such as Yuichi, SP ⁇ 2 promoter, penP promoter, etc.
  • PH05 Promoter PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter and the like are preferable.
  • the host is an insect cell, polyhedrin pro Motors, P10 promoters and the like are preferred.
  • an expression vector containing an enhancer, a splicing signal, a polyA addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori), etc. may be used. be able to.
  • the selection marker include a dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dhfr) gene (methotrexate (MTX) resistance), an ampicillin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Amp 1 ), neomycin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Ne o 1 ", G418 resistance).
  • dhfr dihydrofolate reductase
  • Amp 1 ampicillin resistance gene
  • Ne o 1 neomycin resistance gene
  • a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal of the protein of the present invention.
  • the PhoA signal sequence and the immediate A signal sequence are included.
  • a human amylase signal sequence and a subtilisin signal sequence are included. If the host is an animal cell, an insulin signal sequence, a human interferon signal sequence, an antibody molecule, a signal sequence, if the host is an animal cell. Etc. can be used respectively.
  • a transformant can be produced.
  • Escherichia bacteria for example, Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, yeast, insect cells, insects, animal cells, and the like are used.
  • Escherichia coli Escherichia coli K12 ⁇ DH1 [Procedings of the national academy of the sciences of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. US A), Vol. 60, 160 (1968)], JM103 [Nucleic Acids Research], (Nucleic Acids Research), Vol. 9, 309 (1981)], JA221 [Journal of Ob. ⁇ Molecular ⁇ Biology (Journal of Molecular Biology)], 120, 517 (1978)], HB 101 [Journal of Ob.
  • Bacillus bacteria include, for example, Bacillus subtilis MI114 (Gene, 24, 255 (1983)), 207-21 (Journal of Biochemistry, 95). Vol. 87 (1 984)].
  • yeast examples include, for example, Saccharomyces cerevisiae AH 22, AH22R—, ⁇ 87-11 A, DKD-5 D, 20B—12, Schizosaccharomyces pombe N CYC 1913, NCYC 2036 And Pichia pastoris.
  • insect cells for example, when the virus is Ac NPV, a cell line derived from a larva of night roth moth (Spodoptera frugiperda cell; S f cell), MG 1 cell derived from the midgut of Trichoplusia ni, and egg derived from egg of Trichoplusia ni High Five TM cells, cells derived from Mamestra brassicae or cells derived from Est igmena acrea are used.
  • Sf cell for example, Sf9 cell (ATCC CRL1711) Sf21 cell (Vaughn, JL et al., In Vivo, 13, 213-217, (1977)) and the like are used.
  • insects for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Nature, 315, 592 (1985)].
  • Animal cells include, for example, monkey cell COS-7, Vero, Chinese hamster cell CHO (hereinafter abbreviated as CHO cell), dh fr gene-deficient chinini — Zhamster cell CHO (hereinafter abbreviated as CHO (dhfr)) cell. ), Mouse L cells, mouse AtT-20, mouse myeoma cells, rat GH3, and human FL cells.
  • Transformation of insect cells or insects can be carried out according to the method described in, for example, Bio / Technology, 6, 47-55 (1988).
  • a liquid medium is suitable as a medium used for culturing, and a carbon source necessary for the growth of the transformant is contained therein.
  • Inorganic or organic substances such as liquids and inorganic substances include, for example, calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride and the like.
  • yeast extract, vitamins, raw A long promoting factor may be added.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • a medium for culturing Escherichia sp. For example, M9 medium containing glucose and casamino acid [Miller, Journal of Journal of Molecular Genetics (Journal of Experiments in Molecular Genetics), 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972]. If necessary, a drug such as 3i3-indolylacrylic acid can be added to make the promotion work more efficiently.
  • cultivation is usually performed at about 15 to 43 ° C for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be added.
  • the cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be applied.
  • the culture medium When culturing a transformant in which the host is an insect cell or an insect, the culture medium was 10% immobilized in Grace's Insect Medium (Grace, TCC, Nature, 195, 788 (1962)). Those to which additives such as serum are appropriately added are used.
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. Culture is usually performed at about 27 ° C for about 3 to 5 days, and aeration and agitation are added as necessary.
  • the medium When culturing a transformant in which the host is an animal cell, the medium may be, for example, a MEM medium containing approximately 5 to 20% fetal bovine serum [Science, 122, 501 (1952)), DMEM medium (Virology, 8, 396 (1959)), RPMI 1640 medium (Journal of the American Medical 'Medical' Association (The Journal of the American Medical Association) 199, 519 (1967)], 199 medium [Proceding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)] Etc. are used.
  • the pH is about 6-8.
  • the cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C for about 15 to 60 hours, and aeration and agitation are added as necessary.
  • the G protein-coupled protein of the present invention can be produced in the transformant, inside the cell membrane, or outside the cell.
  • the protein of the present invention can be separated and purified from the culture by, for example, the following method.
  • the cells or cells When extracting the protein of the present invention from cultured cells or cells, the cells or cells are collected by a known method after culture, and suspended in an appropriate buffer. After the cells or cells are destroyed by the method, a method of obtaining a crude extract of the protein by centrifugation or filtration is used as appropriate.
  • the buffer may contain a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100 TM .
  • Purification of the protein contained in the thus obtained culture supernatant or extract can be carried out by appropriately combining known separation and purification methods.
  • known separation and purification methods include methods using solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • the protein thus obtained when the protein thus obtained is obtained in a free form, it can be converted to a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and conversely, when the protein is obtained in a salt, a method known per se or It can be converted into a free form or another salt by a method analogous thereto.
  • the protein produced by the recombinant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by the action of an appropriate protein-modifying enzyme before or after purification.
  • an appropriate protein-modifying enzyme for example, trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like are used.
  • the activity of the thus-produced protein of the present invention or a salt thereof can be measured by a binding experiment with a labeled ligand, an enzymimnoassay using a specific antibody, or the like.
  • the antibody against the protein of the present invention, its partial peptide or a salt thereof may be any of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody as long as it can recognize the protein of the present invention, its partial peptide or a salt thereof. Is also good.
  • Antibodies against the protein of the present invention, its partial peptide or a salt thereof can be prepared by using the protein or the like of the present invention as an antigen according to a known method for producing an antibody or antiserum. Can be manufactured.
  • the protein or the like of the present invention is administered to a mammal at a site where the antibody can be produced by administration, itself or together with a carrier or a diluent.
  • Complete Freund's adjuvant / incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration.
  • the administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times. Examples of mammals to be used include monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, and goats, and mice and rats are preferably used.
  • a warm-blooded animal immunized with the antigen for example, an individual with an antibody titer is selected from a mouse, and the spleen or lymph node is collected 2 to 5 days after the final immunization.
  • an individual with an antibody titer is selected from a mouse, and the spleen or lymph node is collected 2 to 5 days after the final immunization.
  • a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared.
  • the antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting the antiserum with the labeled protein of the present invention described below and measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody. .
  • the fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Keller and Milstein [Nature, 256, 495 (1975)].
  • the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG), Sendai virus, and the like, and preferably, PEG is used.
  • myeloma cells examples include NS-1, P3U1, SP2Z0 and the like, with P3U1 being preferred.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and the concentration of PEG (preferably PEG1000 to PEG6000) is about 10 to 80%.
  • Cell fusion can be carried out efficiently by incubating at about 20 to 40 ° C, preferably about 30 to 37 ° C for about 1 to 10 minutes.
  • the hybridomas can be cultured on a solid phase (eg, microplate) onto which an antigen such as the protein of the present invention is directly or adsorbed together with a carrier.
  • a solid phase eg, microplate
  • Anti-globulin antibody labeled with a radioactive substance or enzyme anti-mouse immunoglobulin antibody is used if the cells used for cell fusion are mice) or protein A, and then added to the solid phase.
  • a method for detecting a bound monoclonal antibody adding a hybridoma culture supernatant to a solid phase to which an anti-immunoglobulin antibody or protein A has been adsorbed, adding a protein of the present invention labeled with a radioactive substance, an enzyme, or the like, And a method for detecting a monoclonal antibody bound to the DNA.
  • the selection of monoclonal antibodies can be carried out according to a method known per se or a method analogous thereto.
  • Midine in a medium for animal cells or the like.
  • any medium can be used as long as it can grow a hybridoma.
  • RPMI 1640 medium containing 1 to 20%, preferably 10 to 20% fetal bovine serum
  • GIT medium containing 1 to 10% fetal bovine serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
  • serum-free medium for hybridoma culture SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.
  • the culture temperature is usually from 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C.
  • the culturing time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks.
  • the culture can be usually performed under 5% carbon dioxide gas.
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
  • Monoclonal antibodies can be separated and purified in the same manner as ordinary polyclonal antibodies.
  • immunoglobulin separation and purification eg, salting out, alcohol precipitation, isoelectric precipitation, electrophoresis, ion exchanger (eg, DEAE), ultracentrifugation, gel filtration, antigen-binding solid phase or specific purification method in which only antibodies are collected using an active adsorbent such as protein A or protein G, and the bonds are dissociated to obtain antibodies.
  • an active adsorbent such as protein A or protein G
  • the polyclonal antibody of the present invention can be produced by a method known per se or a method analogous thereto.
  • a complex of an immunizing antigen an antigen such as the protein of the present invention
  • a carrier-protein is formed, and a mammal is immunized in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody.
  • the antibody can be produced by collecting an antibody-containing substance against a protein or the like and separating and purifying the antibody.
  • the type of carrier protein and the mixing ratio of the carrier and the hapten should be such that an antibody can be efficiently produced against the hapten immunized by crosslinking the carrier.
  • Any kind may be crosslinked at any ratio.
  • serum albumin thyroglobulin, keyhole limpet, hemocyanin, etc.
  • a method of coupling the hapten at a ratio of about 0.1 to 20 and preferably about 1 to 5 with respect to 1 of the hapten is used.
  • various condensing agents can be used for force coupling between the hapten and the carrier, and glutaraldehyde, carbodiimide, a maleimide active ester, an active ester reagent containing a thiol group or a dithioviridyl group, or the like is used.
  • the condensation product is administered to a warm-blooded animal at a site where antibody production is possible or together with a carrier or diluent.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production ability upon administration.
  • the administration can usually be performed once every about 2 to 6 weeks, for a total of about 3 to 10 times.
  • the polyclonal antibody can be collected from blood, ascites, etc., preferably from blood, of the mammal immunized by the above method.
  • the polyclonal antibody titer in the antiserum can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the serum described above. Separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same method for separation and purification of immunoglobulin as in the separation and purification of the monoclonal antibody described above.
  • the protein of the present invention is: (1) a method for determining a ligand for the protein of the present invention; (2) obtaining antibodies and antisera; and (3) expression of a recombinant protein.
  • a method for determining a ligand for the protein of the present invention is: (1) a method for determining a ligand for the protein of the present invention; (2) obtaining antibodies and antisera; and (3) expression of a recombinant protein.
  • a compound that changes the binding property of a ligand to a G protein-coupled receptor specific to human / mammal by using a receptor protein binding assay using the recombinant protein expression system of the present invention can be used as an agent for preventing or treating various diseases.
  • a protein, a partial peptide or a salt thereof of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as the protein of the present invention), a DNA encoding the protein of the present invention or a partial peptide thereof (hereinafter abbreviated as a DNA of the present invention)
  • the use of antibodies against the protein and the like of the present invention (hereinafter, may be abbreviated as the antibody of the present invention) is specifically described below.
  • the protein of the present invention or a salt thereof or the partial peptide of the present invention or a salt thereof is useful as a reagent for searching for or determining a ligand (agonist) for the protein of the present invention or a salt thereof.
  • the present invention provides a method for determining a ligand for a protein of the present invention, which comprises contacting a protein of the present invention or a salt thereof or a partial peptide of the present invention or a salt thereof with a test compound.
  • Test compounds include known ligands (e.g., angiotensin, bombesin, canapinoid, cholecystokinin, glutamine, serotonin, melatonin, neuropeptide Y, opioid, purine, vasopressin, oxytocin, PACAP, secretin, glucagon, calcitonin).
  • known ligands e.g., angiotensin, bombesin, canapinoid, cholecystokinin, glutamine, serotonin, melatonin, neuropeptide Y, opioid, purine, vasopressin, oxytocin, PACAP, secretin, glucagon, calcitonin.
  • Adrenomedullin Adrenomedullin, Somatos, Chitin, GHRH, CRF, ACTH, GRP, PTH, VIP (Vasoactive Intestinal and Rerated Polypeptide), Somatos, Chitin, Dopamine, Motilin, Amylin, Bradykinin, C GRP (Calcitonin Gene) Relayed peptide), leukotriene, pancreastatin, prostaglandin, trompoxane, adenosine, adrenaline, a and] 3-chemokine (eg, IL-1 8, GRO, GR ⁇ ) 3, GROA, NAP—2, ENA_78, PF4, IP10, GCP-2, MCP-1, HC14, MCP-3, 1-309, ⁇ ⁇ 1 ⁇ , MIP — L i3, RANTES, etc.), Endothelin, Enterogastrin, Hiss Yu Min, Neurotensin, TRH, Pancreatic Polypeptide, Gas Lanin, ⁇
  • tissue extracts of humans or mammals eg, mouse, rat, pig, pig, wedge, monkey, etc.
  • cell culture supernatant e.g., cell culture supernatant
  • the tissue extract, the cell culture supernatant, and the like are added to the protein of the present invention, and fractionation is performed while measuring cell stimulating activity and the like, whereby a single ligand can be finally obtained.
  • the ligand when the ligand is a peptide ligand, the ligand may be referred to as a ligand peptide. Also, when the ligand peptide is expressed as a precursor and the signal peptide is removed to form a mature form, they may be referred to as a ligand precursor peptide and a ligand mature form, respectively. Sometimes simply called ligand peptide.
  • the ligand determination method of the present invention uses the protein of the present invention, its partial peptide or a salt thereof, or constructs an expression system for a recombinant protein, and uses a receptor using the expression system. by using an coupling Atsusi system evening, bind to cell stimulating activity to a protein of the present invention (e.g., Arakidon acid release, acetylcholine release, intracellular C a 2 + release, intracellular c AM P production, intracellular c GM P-producing, inositol phosphate-producing, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, PH reduction, etc. promoting or inhibiting activities (eg, peptides, proteins, Non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, etc.) or salts thereof.
  • a protein of the present invention e.g., Arakidon acid release, acetylcholine release, intracellular C a 2 + release, intracellular c AM P production,
  • the protein of the present invention or a partial peptide thereof is brought into contact with a test compound, for example, the amount of the test compound bound to the protein or the partial peptide, It is characterized by measuring its activity.
  • the present invention relates to the following: (1) when a labeled test compound is brought into contact with a protein or a salt thereof of the present invention or a partial peptide of the present invention or a salt thereof, A method for determining a ligand for the protein or a salt thereof according to the present invention, which comprises measuring the amount of binding to the protein or a salt thereof, or the partial peptide or a salt thereof; (2) When a labeled test compound is brought into contact with a cell containing the protein of the present invention or a membrane fraction of the cell, measuring the amount of binding of the labeled test compound to the cell or the membrane fraction is measured. A method for determining a ligand for the protein of the present invention or a salt thereof,
  • Protein-mediated cell-stimulating activity eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP
  • Production intracellular c GMP production, inositol monophosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, activation of c-fos, activity to promote or suppress pH reduction, etc.
  • the protein-mediated cell stimulating activity for example, arachidonic acid release, Acetylcholine release, intracellular Ca2 + release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH
  • a method for determining a ligand for the protein of the present invention or a salt thereof for example, arachidonic acid release, Acetylcholine release, intracellular Ca2 + release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH
  • a method for determining a ligand for the protein of the present invention or a salt thereof for example, arachidonic acid release, Acetylcholine release, intracellular Ca2 + release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol
  • the protein used in the method for determining a ligand may be any protein containing the protein of the present invention or the partial peptide of the present invention. Suitable proteins are suitable.
  • the above-described expression method is used, but it is preferable to express the DNA encoding the protein in mammalian cells or insect cells.
  • Complementary DNA is usually used as the DNA fragment encoding the protein portion of interest, but is not necessarily limited to this.
  • gene fragments or synthetic DNA may be used.
  • the DNA fragment should be expressed by using a nuclear polyhedrosis virus belonging to baculovirus using insects as a host.
  • NPV downstream of the polyhedrin promoter, SV40-derived promoter, retroviral promoter, meta-oral thionine promoter, human heat shock promoter, cytomegalovirus promoter, SR hypromo Incorporation is preferred.
  • the amount and quality of the expressed receptor can be examined by a method known per se. For example, the method described in the literature [Nambi, P. et al., The Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chem.), 267, 19555-19559, 1992] is used. Can be.
  • a cell containing the protein or a cell membrane fraction thereof may be used.
  • the cells When cells containing the protein of the present invention are used in the method for determining a ligand of the present invention, the cells may be immobilized with daltaraldehyde, formalin, or the like.
  • the immobilization method can be performed according to a method known per se.
  • the cell containing the protein of the present invention refers to a host cell expressing the protein of the present invention.
  • Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cells, animal cells and the like are used as the host cell.
  • the cell membrane fraction refers to a fraction abundant in cell membrane obtained by disrupting cells and then obtained by a method known per se.
  • Cell crushing methods include a method of crushing cells with a Potter-Elvehjem homogenizer and a pelleting blender. Examples include crushing with a lytron (manufactured by Kinematica), sonication, and crushing by ejecting cells from a thin nozzle while applying pressure with a French press.
  • centrifugal fractionation methods such as differential centrifugation and density gradient centrifugation are mainly used.
  • the cell lysate is centrifuged at a low speed (500 rpm to 3000 rpm) for a short time (typically about 1 minute to 10 minutes), and the supernatant is further spun at a higher speed (15000 rpm to 30000 rm) for 30 minutes to 30 minutes. Centrifuge for 2 hours and use the resulting precipitate as the membrane fraction.
  • the membrane fraction is rich in the expressed protein and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
  • the amount of the protein in the cell containing the protein or in the membrane fraction thereof is preferably 10 3 to 10 8 molecules, and more preferably 10 5 to 10 7 molecules per cell.
  • the protein fraction is preferably a natural receptor protein fraction or a recombinant receptor protein fraction having an activity equivalent thereto.
  • equivalent activity refers to equivalent ligand binding activity, signal transduction action, and the like.
  • cells or a membrane fraction of the cell containing the protein of the present invention are first suspended in a buffer suitable for the determination method.
  • a buffer suitable for the determination method such as a phosphate buffer having a pH of 4 to 10 (preferably pH 6 to 8) or a tris-hydrochloride buffer.
  • surfactants such as CHAPS, Tween-80 TM (Kaoichi Atlas), digitonin, deoxycholate, etc.
  • proteins such as serum albumin and gelatin are buffered. Can be added.
  • a protease inhibitor such as PMS F, leptin, E-64 (manufactured by Peptide Research Laboratories), or peptide sutin may be added in order to suppress receptor degradation and degradation of the ligand by proteases. it can.
  • a protease inhibitor such as PMS F, leptin, E-64 (manufactured by Peptide Research Laboratories), or peptide sutin may be added in order to suppress receptor degradation and degradation of the ligand by proteases. it can.
  • a quantity of (5000 c pm ⁇ 500000 c pm) [3 H], [125 I], [14 C] labeled with a [35 S] The test compound is allowed to coexist.
  • the reaction is carried out at about 0 to 50 ° ⁇ , preferably at about 4 ° C to 37 ° C, for about 20 minutes to 24 hours, preferably for about 30 minutes to 3 hours.
  • the reaction solution is filtered through a glass fiber filter or the like, washed with an appropriate amount of the same buffer, and the radioactivity remaining on the glass fiber filter is measured using a liquid scintillation counter or an oven.
  • a test compound having a count (B-NSB) of less than Ocpm obtained by subtracting the non-specific binding amount (NSB) from the total binding amount (B) is a ligand (agonist) for the protein of the present invention or a salt thereof.
  • B-NSB count of less than Ocpm obtained by subtracting the non-specific binding amount (NSB) from the total binding amount (B) is a ligand (agonist) for the protein of the present invention or a salt thereof.
  • cell stimulating activity via the protein for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ Activity or inhibition that promotes release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, fluctuations in cell membrane potential, phosphorylation of intracellular proteins, activation of c-fos, decrease in pH, etc.
  • Activity can be measured using a known method or a commercially available measurement kit. Specifically, first, cells containing the protein of the present invention are cultured in a multiwell plate or the like.
  • the assay may be performed by adding an inhibitor against the degrading enzyme. .
  • activities such as inhibition of cAMP production can be detected as an activity of inhibiting production of cells whose basal production has been increased by forskolin or the like.
  • the kit for determining a ligand that binds to the protein of the present invention or a salt thereof contains the protein of the present invention or a salt thereof, the partial peptide of the present invention or a salt thereof, a cell containing the protein of the present invention, or a protein of the present invention. It contains the membrane fraction of the cells to be treated.
  • Examples of the ligand determination kit of the present invention include the following. 1. Reagent for ligand determination
  • CHO cells expressing the protein of the present invention were subcultured on a 12-well plate at 5 ⁇ 10 5 cells / well, and cultured at 37 ° C., 5% C 2 , and 95% air for 2 days.
  • the same as the labeled compound is prepared at a concentration 100 to 1000 times higher.
  • the CHO cells expressing the protein of the present invention cultured on a 12-well tissue culture plate are washed twice with 1 ml of the measurement buffer, and 4901 measurement buffer is added to each well.
  • the ligand capable of binding to the protein of the present invention or a salt thereof includes, for example, substances specifically present in the brain, pituitary gland, kidney, etc., and specifically, angiotensin, bombesin , Canapinoid, cholecystokinin, glumin, serotonin, melatonin, neuropeptide Y, opioid, purine, vasopressin, oxitosine, PACAP, secretin, glucagon, calcitonin, adrenomedullin, somatosulin, GHRH, CRF, A CTH, GRP, PTH, VIP (Vasoactive Intestinal And Renewed Polypeptide), Somatosintin, Dopamine, Motilin, Amylin, Bradykinin, CGRP (Calcitonin Gene Relayed Peptide), Leukotorien, Pancrea Statins, prostaglandins, thromboxanes, adenosine, adrenaline,
  • IL-8 E.g., IL-8, GROa, GROiS, GROA, NAP-2, ENA_78, PF4, IP10, GCP-2, MCP_1, HC14, MCP-3, I-309, ⁇ ⁇ ⁇ 1 ⁇ , MIP-1) 3, RANTES, etc.
  • endothelin enterogastrin, histamine, neurotensin, TRH, pancreatic lipopolypeptide, galanin, MIT1 or its homologues of mammals, etc.
  • the protein of the present invention or the DNA encoding the protein can be replaced with the protein of the present invention in accordance with the action of the ligand. It can be used as a medicament such as an agent for preventing and / or treating a disease associated with dysfunction of the drug.
  • the DNA encoding the protein of the present invention is useful as a medicament such as an agent for preventing and / or treating a disease associated with dysfunction of the safe and low-toxic receptor protein of the present invention.
  • the protein of the present invention or DNA encoding the protein may be a central disease (eg, Alheimer's disease 'dementia' eating disorder (anorexia), epilepsy, etc.), a hormonal disease (eg, For example, weak labor, lax hemorrhage, before and after delivery of the placenta, incomplete uterine reconstruction, cesarean section, artificial abortion, milk stasis, etc., liver / biliary / ⁇ / endocrine disorders (eg diabetes, eating disorders, etc.), inflammation Sexual diseases (allergies, asthma, rheumatism, etc.), cardiovascular diseases (eg, hypertension, cardiac hypertrophy, angina, arteriosclerosis, etc.), respiratory diseases (eg, pneumonia, asthma, bronchitis, respiratory organs) Prevention of infectious diseases, chronic obstructive pulmonary disease, etc., infectious diseases (eg, sepsis, MRSA, respiratory infections, urinary tract infections, biliary tract infections, infectious enteritis, otiti
  • the protein of the present invention or DNA encoding the protein is particularly useful for prevention and Z or treatment of digestive diseases (eg, enteritis, diarrhea, constipation, malabsorption syndrome, etc.).
  • digestive diseases eg, enteritis, diarrhea, constipation, malabsorption syndrome, etc.
  • the protein of the present invention When used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated according to a conventional method.
  • the DNA of the present invention when a DNA encoding the protein of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as the DNA of the present invention) is used as the above-mentioned prophylactic or therapeutic agent, the DNA of the present invention may be used alone or in a retroviral vector. After insertion into an appropriate vector such as an adenovirus vector or an adenovirus associated virus vector, it can be carried out according to a conventional method.
  • the DNA of the present invention can be administered as it is or together with an adjuvant for promoting uptake by a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
  • the protein of the present invention or (2) DNA encoding the protein may be orally administered as tablets, capsules, elixirs, microcapsules or the like, or coated with water or other water, if necessary. It can be used parenterally in the form of an injection, such as a sterile solution with a pharmaceutically acceptable liquid, or a suspension.
  • the protein of the present invention or (2) DNA encoding the protein was generally recognized together with known physiologically recognized carriers, flavors, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, and the like. It can be manufactured by mixing in the unit dosage form required for formulation. The amount of active ingredient in these preparations is such that a suitable dosage in the specified range can be obtained.
  • Additives that can be incorporated into tablets, capsules, etc. include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc.
  • binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic
  • excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc.
  • leavening agents such as magnesium stearate
  • sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin
  • flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cellulose are used.
  • a liquid carrier such as oils and fats can be further contained in the above type of material.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to standard pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, or naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil, etc. .
  • aqueous liquid for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other auxiliary agents (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) and the like are used.
  • agents For example, alcohol (e.g., ethanol), polyalcohol (e.g., propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactant (eg, polysorbate preparative 8 0 TM, HCO- 5 0), such as a combination You may.
  • the oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
  • prophylactic / therapeutic agent examples include a buffer (for example, a phosphate buffer and a sodium acetate buffer), a soothing agent (for example, benzalkonidum chloride, pro-proin hydrochloride, etc.), a stabilizer (for example, It may be combined with human serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants and the like.
  • a buffer for example, a phosphate buffer and a sodium acetate buffer
  • a soothing agent for example, benzalkonidum chloride, pro-proin hydrochloride, etc.
  • a stabilizer for example, It may be combined with human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • preservatives eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • antioxidants and the like examples of the prophylactic / therapeutic agent.
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, for example, against human mammals (for example, rats, puppies, sheep, bush, bush, cats, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be administered.
  • human mammals for example, rats, puppies, sheep, bush, bush, cats, cats, dogs, monkeys, etc.
  • the dosage of the protein or DNA of the present invention may vary depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like.
  • the dose is about 0.1 mg to 100 mg, preferably about 1.0 to 5 Omg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day.
  • the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, and the like.
  • it is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 2 Omg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day by intravenous injection. It is.
  • the dose can be administered in terms of 6 O kg.
  • the DNA of the present invention can be used as a probe to produce the protein of the present invention or a partial peptide thereof in humans or mammals (eg, rat, puppies, higgs, bush, puppies, cats, dogs, monkeys, etc.). Can detect abnormalities (gene abnormalities) in DNA or mRNA that encodes, for example, genes such as damage, mutation, or decreased expression of the DNA or mRNA, and increased or excessive expression of the DNA or mRNA. Useful as a diagnostic agent.
  • the above-described genetic diagnosis using the DNA of the present invention includes, for example, the known Northern hybridization and PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989), Procedings Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol. 86, pp. 2766-2770 (1989)) It can be implemented by:
  • the concentration of the ligand in the living body can be quantified with high sensitivity.
  • the quantification method of the present invention can be used, for example, in combination with a competition method. That is, the ligand concentration in the test sample can be measured by bringing the test sample into contact with the protein of the present invention or the like. Specifically, for example, It can be used according to the method described in 1 or 2 or a method analogous thereto.
  • the binding between the ligand and the protein or the like of the present invention can be improved.
  • Compounds to be changed eg, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, etc.
  • salts thereof can be efficiently screened.
  • G protein coupled receptions evening through an cell-stimulating activity e.g., Arakidon acid release, acetylcholine release, intracellular C a 2 + release, intracellular C AM P generation, intracellular c
  • an cell-stimulating activity e.g., Arakidon acid release, acetylcholine release, intracellular C a 2 + release, intracellular C AM P generation, intracellular c
  • An agonist against the protein of the present invention (mouth) a compound having no cell-stimulating activity (so-called, an agonist against the protein of the present invention), (8) a compound that enhances the binding force between a ligand and the protein of the present invention, Or (2) a compound that decreases the binding force between the ligand and the protein of the present invention. It is preferable to screening by).
  • the present invention relates to (i) a case where the protein of the present invention, its partial peptide or a salt thereof is brought into contact with a ligand, and (ii) a protein of the present invention, its partial peptide or a salt thereof, A script of a compound or a salt thereof that changes the binding property between the ligand and the protein of the present invention, a partial peptide thereof or a salt thereof, which is compared with a case where the ligand and the test compound are brought into contact with each other. Provide a ding method.
  • the amount of ligand binding to the protein or the like, cell stimulating activity, and the like are measured and compared.
  • the present invention provides
  • the labeled ligand and the test compound are brought into contact with the cell containing the protein or the like of the present invention or the membrane of the cell.
  • a compound that changes the binding property between the ligand and the protein of the present invention which is characterized by measuring and comparing the amount of labeled ligand bound to the cell or the membrane fraction when contacted with the fraction Or its salt screening method,
  • a compound that activates the protein or the like of the present invention eg, a ligand for the protein or the like of the present invention
  • a cell containing the protein or the like of the present invention or when the protein or the like of the present invention is activated.
  • Cell stimulating activity via receptor receptor when a compound and a test compound are brought into contact with cells containing the protein of the present invention for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, cells Intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, activation of c-fos, reduction of pH, etc.
  • a method for screening a compound or a salt thereof, which alters the binding property between the ligand and the protein of the present invention e.g, a ligand for the protein or the like of the present invention.
  • a compound that activates the protein or the like of the present invention eg, a ligand for the protein or the like of the present invention
  • a transformant containing the DNA of the present invention When it is brought into contact with a protein or the like, and when the transformant containing the DNA of the present invention is cultured with a compound that activates the protein or the like of the present invention and a test compound, the protein or the like of the present invention expressed on the cell membrane is cultured.
  • a cell, tissue or cell membrane fraction containing a G protein-coupled receptor protein such as a rat is used.
  • a test to confirm whether the candidate compound actually inhibits the binding of human G protein-coupled receptor protein to its ligand (secondary screening) was needed. If the cell, tissue or cell membrane fraction was used as it was, other receptor proteins were also mixed, so it was difficult to actually screen the agonist or gonist for the desired receptor protein. .
  • the human-derived protein of the present invention primary screening is not required, and a compound that inhibits binding between a ligand and a G protein-coupled receptor protein can be efficiently screened. Furthermore, it is possible to easily evaluate whether the screened compound is an agonist or an engonist.
  • the specific description of the screening method of the present invention is as follows.
  • the protein and the like of the present invention used in the screening method of the present invention may be any as long as they contain the above-described protein and the like of the present invention.
  • Cell membrane fractions of mammalian organs are preferred.
  • human-derived receptor proteins expressed in large amounts using recombinants are suitable for screening.
  • the above-mentioned method is used for producing the protein and the like of the present invention, but it is preferably carried out by expressing the DNA of the present invention in mammalian cells and insect cells.
  • Complementary DNA is used for the DNA fragment encoding the target protein portion, but is not necessarily limited thereto.
  • gene fragments or synthetic DNA may be used.
  • the DNA fragment In order to introduce the DNA fragment encoding the protein of the present invention into host animal cells and express them efficiently, the DNA fragment must be expressed in a nuclear polyhedrosis virus belonging to baculovirus using an insect as a host.
  • lyhedros is virus (NPV) polyhedrin promoter, SV40-derived promoter, retrovirus promoter, meta-mouth thionine promoter, human heat shock promoter, cytomegalovirus promoter, SRa promoter, etc. It is preferably incorporated downstream of.
  • Examination of the quantity and quality of the expressed receptor can be carried out in a manner known per se. For example, the method is carried out according to the method described in the literature [Namb i, P. et al., The Journal 'Ob' Biological Chemistry (L Biol. Chem.), 267, 19555-19559, 1992]. be able to.
  • the protein or the like containing the protein of the present invention may be a protein or the like purified according to a method known per se, or a cell containing the protein or the like may be used. Alternatively, a membrane fraction of a cell containing the protein or the like may be used.
  • the cells may be immobilized with daltaraldehyde, formalin, or the like.
  • the immobilization method can be performed according to a method known per se.
  • the cell containing the protein or the like of the present invention refers to a host cell that has expressed the protein or the like, and the host cell is preferably Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cells, animal cells, or the like.
  • the cell membrane fraction refers to a cell membrane-rich fraction obtained by disrupting cells and then obtained by a method known per se.
  • Cells can be crushed by crushing the cells with a Potter-Elvehjem homogenizer, crushing with a one-ring blender ⁇ Polytron (manufactured by Kinematica), crushing with an ultrasonic wave, thinning the cells while applying pressure with a French press, etc. Crushing by jetting from a nozzle is one example.
  • fractionation by centrifugal force such as fractionation centrifugation or density gradient centrifugation is mainly used.
  • the cell lysate is centrifuged at low speed (500 rpm to 3000 rpm) for a short time (typically about 1 minute to 10 minutes), and the supernatant is further centrifuged at a higher speed (15000 rpm to 30000 rpm) for 30 minutes to 30 minutes. Centrifuge for 2 hours and use the resulting precipitate as the membrane fraction.
  • the membrane fraction is rich in expressed proteins and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
  • the protein fraction is preferably a natural receptor protein fraction or a recombinant receptor protein protein having an activity equivalent thereto.
  • “equivalent activity” means equivalent ligand binding activity, signal transduction action, and the like.
  • a labeled ligand, a labeled ligand analog compound, or the like is used as the labeled ligand.
  • ligands labeled with [ 3 H], [ 125 I], [ 14 C], [ 35 S] and the like are used.
  • a membrane fraction of a cell or a cell containing the protein of the present invention is first suitable for screening.
  • the buffer may be any buffer such as a phosphate buffer of pH 4 to 10 (preferably pH 6 to 8) or a buffer of Tris-HCl, which does not inhibit the binding between the ligand and the protein.
  • surfactants such as CHAPS, Tween-80 TM (Kaoichi Atlas), digitonin, and deoxycholate can be added to the buffer to reduce non-specific binding.
  • protease inhibitors such as PMSF, leptin, E-64 (manufactured by Peptide Research Institute), and peptide suptin can be added for the purpose of suppressing receptor degradation and degradation of the ligand by proteases. 0. to 0 lm.
  • the solution is filtered through a glass fiber filter paper and the like, washed with an appropriate amount of the same buffer, and the radioactivity remaining on the glass fiber filter paper is measured with a liquid scintillation counter or a T-counter.
  • the specific binding amount (B-NSB) is For example, a test compound having 50% or less can be selected as a candidate substance having a competitive inhibitory ability.
  • protein stimulating activity for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, Activities that promote intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, fluctuations in cell membrane potential, phosphorylation of intracellular proteins, activation of c-fos, lowering of pH, etc. Or inhibitory activity
  • protein stimulating activity for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, Activities that promote intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, fluctuations in cell membrane potential, phosphorylation of intracellular proteins, activation of c-fos, lowering of pH, etc. Or inhibitory activity
  • cells containing the protein or the like of the present invention are first cultured in a multiwell plate or the like. Before performing screening, replace the cells with fresh medium or an appropriate buffer that is not toxic to cells, add test compounds, etc., incubate for a certain period of time, and then extract cells or collect supernatant. Then, the produced product is quantified according to each method. If the production of a substance (for example, arachidonic acid) as an indicator of cell stimulating activity is difficult due to a degrading enzyme contained in cells, an inhibitor for the degrading enzyme is added to perform the assay. Is also good. In addition, activities such as inhibition of CAMP production can be detected as an activity of inhibiting production of cells whose basal production has been increased by forskolin or the like.
  • a substance for example, arachidonic acid
  • Cells expressing an appropriate protein are required.
  • Cells expressing the protein of the present invention and the like are preferably cell lines having the natural protein of the present invention and the like, and cell lines expressing the above-mentioned recombinant proteins and the like.
  • test compounds for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, etc. are used, and these compounds are novel compounds. Or a known compound.
  • a screening kit for a compound or a salt thereof that alters the binding property between a ligand and the protein or the like of the present invention may be a cell containing the protein or the like of the present invention, or a cell containing the protein or the like of the present invention. And a membrane fraction containing the same.
  • screening kit of the present invention examples include the following. 1. Screening reagent
  • CHO cells expressing the protein of the present invention were subcultured on a 12-well plate at 5 ⁇ 10 5 holes, and cultured at 37 ° C., 5 C0 2 95% air for 2 days.
  • the compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is a compound having an action of changing the binding property between the ligand and the protein of the present invention.
  • cell stimulating activity via G protein-coupled receptor eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP generation, intracellular c
  • G protein-coupled receptor eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP generation, intracellular c
  • Agonist for the protein of the present invention (Agonist for the protein of the present invention), (Mouth) a compound having no cell stimulating activity (so-called angonist for the protein of the present invention), (8) Ligand and the present invention
  • a compound that enhances the bonding strength between the G protein-coupled protein, some have is (two) G protein-coupled protein is thereby of compound decreasing the binding force between the cytoplasm of the ligand and the present invention.
  • Examples of the compound include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, and fermentation products. These compounds may be novel compounds or known compounds.
  • the agonist against the protein or the like of the present invention has the same activity as the biological activity of the ligand on the protein or the like of the present invention, it is a safe and low-toxic drug depending on the ligand activity [for example, central disease ( For example, Alzheimer's disease, dementia, anorexia (anorexia nervosa), epilepsy, etc., hormonal diseases (eg, weak labor, laxity bleeding, before and after delivery of the placenta, incomplete uterine reconstruction, cesarean section, abortion, milk stasis ), Hepatic / biliary / falling / endocrine disorders (eg diabetes, eating disorders, etc.), inflammatory diseases (allergy 'asthma, rheumatism, etc.), cardiovascular diseases (eg hypertension, cardiac hypertrophy, angina pectoris, Arteriosclerosis), respiratory diseases (eg, pneumonia, asthma, bronchitis, respiratory infections, chronic obstructive pulmonary disease, etc.), infectious diseases (eg, se
  • the agonist against the protein or the like of the present invention has the same action as the physiological activity of the ligand for the protein or the like of the present invention, it is safe and has low toxicity according to the ligand activity. , Diarrhea, constipation, malabsorption syndrome, etc.) are particularly useful as prophylactic and / or therapeutic agents.
  • a safe and low-toxic drug that suppresses the ligand activity for example, a hormone secretion regulator, Central disease, hormonal disease, hepatic Z-bile / ⁇ / endocrine disease (eg, anti-obesity drug, overeating, etc.), inflammatory disease, circulation caused by excessive production of ligand for the protein of the invention, etc. Respiratory diseases, respiratory diseases), prevention of infectious diseases and Z or therapeutic agents.
  • the antagonist to the protein or the like of the present invention can suppress the physiological activity of the ligand to the protein or the like of the present invention, it is a safe and low-toxic gastrointestinal disease that suppresses the ligand activity (eg, enteritis, diarrhea, constipation). It is particularly useful as a prophylactic and / or therapeutic agent for malabsorption syndrome and the like.
  • Compounds that decrease the binding force between the ligand and the protein of the present invention include safe and low-toxic drugs for decreasing the physiological activity of the ligand for the protein of the present invention [for example, hormone secretion regulators, the present invention Central diseases, hormonal diseases, hepatic Z-bile Z ⁇ Z endocrine diseases (eg, anti-obesity drugs, overeating, etc.), inflammatory diseases, circulatory diseases, It is useful as a prophylactic and / or therapeutic agent for respiratory diseases and infections.
  • Compounds that decrease the binding force between the ligand and the protein of the present invention can reduce the physiological activity of the ligand for the protein of the present invention and the like, so that safe and low-toxic gastrointestinal diseases (e.g., enteritis, diarrhea, It is particularly useful as a prophylactic and / or therapeutic agent for constipation, malabsorption syndrome, etc.).
  • safe and low-toxic gastrointestinal diseases e.g., enteritis, diarrhea, It is particularly useful as a prophylactic and / or therapeutic agent for constipation, malabsorption syndrome, etc.
  • a compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is used as the above-mentioned pharmaceutical composition, it is subjected to a conventional method.
  • a conventional method can be implemented.
  • tablets, capsules, elixirs, microcapsules, sterile solutions, suspensions, and the like can be prepared in the same manner as the above-mentioned drug containing the protein of the present invention.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, for example, against humans or mammals (eg, rats, puppies, higgs, bush, puppies, cats, dogs, sal, etc.). Can be administered.
  • humans or mammals eg, rats, puppies, higgs, bush, puppies, cats, dogs, sal, etc.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like. However, in the case of oral administration, in general, for an adult (as 60 kg), the dose is daily. About 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 2 Omg.
  • the single dose varies depending on the subject of administration, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • parenteral injections usually adult (as 60 kg) patients with gastrointestinal disorders
  • the amount converted per 60 kg can be administered.
  • the antibody of the present invention can specifically recognize the protein and the like of the present invention, it can be used for quantification of the protein and the like of the present invention in a test solution, particularly for quantification by a sandwich immunoassay. That is, the present invention is characterized by, for example, (i) reacting the antibody of the present invention with a test wave and a labeled protein or the like competitively and measuring the ratio of the labeled protein or the like bound to the antibody.
  • a method for quantifying the protein of the present invention in a test wave is characterized by, for example, (i) reacting the antibody of the present invention with a test wave and a labeled protein or the like competitively and measuring the ratio of the labeled protein or the like bound to the antibody.
  • one of the antibodies may be an antibody that recognizes the N-terminal of the protein or the like of the present invention, and the other antibody may be an antibody that reacts with the C-terminal of the protein or the like of the present invention. preferable.
  • the ability to measure the protein, etc. of the present invention using a monoclonal antibody against the protein, etc. of the present invention (hereinafter sometimes referred to as the monoclonal antibody of the present invention), and detection by tissue staining, etc. it can.
  • the antibody molecule itself may be used, or the F (ab ') 2 , Fab', or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the assay method using an antibody against the protein or the like of the present invention is not particularly limited, and the amount of the antibody, antigen or antibody-antigen complex corresponding to the amount of antigen (eg, the amount of protein) in the test solution is determined.
  • Any measurement method can be used as long as it is detected by chemical or physical means and calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen.
  • nephrometry, a competition method, an immunometric method and a sandwich method are preferably used, but in terms of sensitivity and specificity, a sandwich method described later is particularly preferable.
  • a labeling agent used in a measurement method using a labeling substance for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like are used.
  • the radioisotope for example, [1 2 5 I], [1 3 1 I], [3 H], and [1 4 C] used.
  • the enzyme a stable enzyme having a large specific activity is preferable.
  • the fluorescent substance for example, fluorescamine, fluorescein isothiosinate and the like are used.
  • the luminescent substance for example, luminol, luminol derivative, luciferin, lucigenin and the like are used.
  • a biotin-avidin system can be used for binding the antibody or antigen to the labeling agent.
  • insolubilization of an antigen or an antibody physical adsorption may be used, or a method using a chemical bond usually used for insolubilizing and immobilizing a protein or an enzyme may be used.
  • the carrier for example, insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose, synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon, and glass are used.
  • sandwich method a test solution is reacted with the insolubilized monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further reacted with the labeled monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction). By measuring the activity of the agent, the amount of the protein of the present invention in the test wave can be determined.
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at staggered times.
  • the labeling agent and the method of insolubilization can be the same as those described above.
  • the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody does not necessarily need to be one type, and a mixture of two or more types of antibodies is used for the purpose of improving measurement sensitivity and the like. You may.
  • the monoclonal antibody of the present invention used in the primary reaction and the secondary reaction is preferably an antibody having a different binding site to the protein or the like of the present invention. That is, when the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is, for example, the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal of the protein of the present invention, the antibody used in the primary reaction is preferably An antibody that recognizes other than the C-terminal, for example, the N-terminal, is used.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method, or a nephrometry.
  • a competition method the antigen in the test solution and the labeled antigen are allowed to react competitively with the antibody, and then the unreacted labeled antigen is separated from (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody. Then (B / F separation), measure the amount of labeling of either B or F, and determine the amount of antigen in the test solution.
  • a soluble antibody is used as an antibody
  • BZF separation is carried out using a Polyethylene Render Recall
  • a liquid phase method using a second antibody against the antibody a solid phase antibody is used as the first antibody
  • An immobilization method using an immobilized antibody as the second antibody and a soluble antibody is used for the first antibody.
  • an antigen in a test solution and a solid-phased antigen are subjected to a competitive reaction with a fixed amount of a labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated.
  • the antigen is allowed to react with an excessive amount of the labeled antibody. After binding the antibody to the solid phase, the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the amount of label in either phase is measured to quantify the amount of antigen in the test solution.
  • nephelometry the amount of insoluble sediment generated as a result of an antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured. Even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of sediment is obtained, laser-nephrometry utilizing laser scattering is preferably used.
  • the protein of the present invention or a salt thereof can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention. Furthermore, various diseases can be diagnosed by quantifying the protein of the present invention or its salt using the antibody of the present invention.
  • the antibody of the present invention may be a protein of the present invention present in a subject such as a body fluid or a tissue. It can be used to detect quality and the like.
  • preparation of an antibody column to be used for purifying the protein of the present invention detection of the protein of the present invention in each fraction at the time of purification, analysis of the behavior of the protein of the present invention in test cells, etc. Can be used for
  • a transgenic non-human animal expressing the protein or the like of the present invention can be prepared.
  • Non-human animals include mammals (eg, rats, mice, egrets, sheep, sheep, bush, oysters, cats, dogs, monkeys, etc.) and the like (hereinafter abbreviated as animals). Mice, egrets and the like are preferred.
  • the DNA of the present invention In transferring the DNA of the present invention to a target animal, it is generally advantageous to use the DNA as a gene construct linked downstream of a promoter capable of being expressed in animal cells.
  • a gene construct linked to the downstream of various promoters capable of expressing the DNA of the present invention derived from an animal having high homology to animal cells can be used, for example.
  • a DNA-transferred animal that highly produces the protein or the like of the present invention can be produced.
  • a ubiquitous expression promoter such as a virus-derived promoter or metallothionein may be used, but preferably, an NGF gene promoter specifically expressed in the brain and a phenolase gene promoter are used. Used.
  • Transfer of the DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target animal.
  • the presence of the protein or the like of the present invention in the germinal cells of the produced animal after the transfer of DNA means that all the offspring of the produced animal have the protein or the like of the present invention in all of its germ cells and somatic cells.
  • the offspring of this type of animal that has inherited the gene have the protein of the present invention in all of its germinal and somatic cells.
  • the DNA-transferred animal of the present invention has been confirmed to stably maintain the gene by mating Then, breeding can be performed in a normal breeding environment as the DNA-bearing animal. Furthermore, by crossing male and female animals having the DNA of interest, homozygous animals having the transgene on both homologous chromosomes are obtained, and by crossing the male and female animals, all descendants can obtain the DNA. They can be subcultured to have.
  • the animal to which the DNA of the present invention has been transferred has high expression of the protein or the like of the present invention, and thus is useful as an agonist for screening the protein or the like of the present invention or an animal for screening an gonist.
  • the DNA transgenic animal of the present invention can also be used as a cell source for tissue culture.
  • the protein or the like of the present invention is analyzed by directly analyzing DNA or RNA in the tissue of the DNA transgenic mouse of the present invention or by analyzing the tissue in which the protein of the present invention expressed by the gene is present. be able to.
  • Cells of a tissue having the protein or the like of the present invention can be cultured by standard tissue culture techniques, and these can be used to study the function of cells from tissues that are generally difficult to culture, such as those derived from brain or peripheral tissues. it can.
  • the cells for example, it is possible to select a drug that enhances the function of various tissues.
  • the protein of the present invention can be isolated and purified therefrom.
  • bases, amino acids, and the like are indicated by abbreviations based on the abbreviations by IUPAC-IUB Commision on Biochemical Nomenclature or commonly used abbreviations in the art, and examples thereof are described below.
  • amino acids may have optical isomers, L-form shall be indicated unless otherwise specified.
  • H is or H histidine
  • sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences.
  • FIG 1 shows the amino acid sequence of the human brain-derived protein of the present invention.
  • FIG. 1 shows the base sequence of DNA encoding the human brain-derived protein of the present invention having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (ZAQC).
  • [SEQ ID NO: 3] 1 shows the nucleotide sequence of DNA encoding the human brain-derived protein of the present invention having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (ZAQT).
  • Example 3 shows the nucleotide sequence of a primer ZAQC Sal used in Example 2 described later.
  • Example 3 shows the nucleotide sequence of a primer ZAQC Spe used in Example 2 described later.
  • Example 7 shows the N-terminal amino acid sequence of a ZAQ activating peptide purified in Example 3 (3-8) described later.
  • C represents the nucleotide sequence of ZF2 used in Example 4 described below.
  • Example 7 shows the nucleotide sequence of a DNA fragment obtained in Example 4 described later.
  • Example 7 shows the nucleotide sequence of a DNA fragment obtained in Example 4 described later.
  • SEQ ID NO: 20 shows the nucleotide sequence of DNA encoding the mature human ZAQ ligand peptide represented by SEQ ID NO: 20.
  • SEQ ID NO: 21 This shows the base sequence of DNA encoding the human ZAQ ligand mature peptide represented by SEQ ID NO: 21. [SEQ ID NO: 28]
  • Example 7 shows the N-terminal amino acid sequence of a human ZAQ ligand peptide analyzed in Example 6 (6-2) described later.
  • the transformant Escherichia colODH5 ⁇ / ⁇ CR2.1—ZAQC obtained in Example 1 described below was used on August 23, 2001, in Tsukuba, Higashi, Ibaraki, Japan. 3 Deposit No. FERM BP-6855 with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (NI BH), Ministry of International Trade and Industry, from August 4, 1999 2-17, Jusanhoncho, Yodogawa-ku, Osaka-shi, Osaka, Japan from August 4, 1999. 85 Deposited with the Fermentation Research Institute (IFO) under the deposit number IFO 16301.
  • the transformant Escherichia coli DH5 a / pCR2.1.1—ZAQT obtained in Example 1 described below.
  • the transformant Escherichia coli TOPlO / pHMITA obtained in Example 4 described below has been deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (NI BH) on July 13, 2000, at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (NI BH).
  • NI BH National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
  • FERM BP-7219 has been deposited with the Fermentation Research Institute (IFO) as a deposit number IFO 16440 since May 26, 2000.
  • E. coli The transformant Escherichia coli (Escherichia coli) obtained in Example 4 described later is used.
  • E. coli) TOPlO / pHMITG has been deposited with the Ministry of International Trade and Industry, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (NI BH) on July 13, 2000 under the accession number FERM BP-7220 as a foundation since May 26, 2012. Deposited with the Fermentation Research Institute (IFO) under the deposit number IF ⁇ 16441.
  • the human pituitary gland cDNA (CLONTECH) was designated as type II, and two primers, primer 1 (5'- GTC GAC ATG GAG ACC ACC ATG GGG TTC ATG G -3 '; SEQ ID NO: 4) and primer 1 PCR reaction was carried out using 2 (5′-ACT AGT TTA TTT TAG TCT GAT GCA GTC CAC CTC TTC -3 ′; SEQ ID NO: 5).
  • the composition of the reaction solution used in the reaction was as follows: 1/10 of the above cDNA was used as type III, 1Z50 amount of Advantage2 Polymerase Mix (CLONTECH), Primer 1 and Primer 2 were added at 0.2 M each and dNTPs 200 M The attached buffer was added to ⁇ ,, and enzyme to make a liquid volume of 251.
  • the PCR reaction is performed at 94 ° C for 2 minutes, followed by three cycles of 94 ° C for 20 seconds and 72 ° C for 100 seconds, and three cycles of 94 ° C for 20 seconds and 68 ° C for 100 seconds.
  • the reaction product after the PCR reaction was subcloned into a plasmid vector PCR2.1 (Invitrogen) according to the prescription of a TA cloning kit (Invitrogen). This was introduced into Escherichia coli DH5 ⁇ , and clones containing cDNA were selected on LB agar medium containing ampicillin. The sequence of each clone was analyzed, and as a result, a novel G protein-coupled receptor protein was identified.
  • Primers and probes used for Taqman PCR were searched using Primer Express ver.1.0 (PE Biosystems Japan), and primer 3 (5'-TCATGTTGCTCCACTGGAAGG-3 '(SEQ ID NO: 6)), primer 4 (5' -CCAATTGTCTTGAGGTCCAGG-3 '(SEQ ID NO: 7)) and ZAQprobe (5'-TTCTTACAATGGCGGTAAGTCCAGTGCAG-3' (SEQ ID NO: 8)) were selected.
  • FAM 6-carboxyfluorescein
  • pAK-ZAQC was used as type II, primers ZAQC Sal (5 '-GTCGACATGGAGACCACCATGGGGTTCATGG-3' (SEQ ID NO: 9)) and ZAQC Spe (5'- ACTAGTTTATTTTAGTCTGATGCAGTCCACCTCTTC-3 '(SEQ ID NO: 10)) the PCR fragment was amplified using, CHROMA SPIN200 purified using (CLONTECH Laboratories, Inc. (CA, USA)), it was used to adjust the 10 Q_10 6 copies / 1.
  • Human Multiple Tissue cDNA Panel I and Panel II (CL0NTECH Laboratories, Inc.) were used as cDNA sources for each tissue. Add the specified amount of Taqman Universal PCR Master Mix (PE Biosystems Japan) to the primer, probe, and type II, and perform PCR reaction and analysis using ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (PE Biosystems Japan). Was.
  • Thymus 1.1 Example 3 Isolation of peptides that activate ZAQ
  • the supernatant was filtered with gauze to remove insolubles. Double volume of acetone was added to the supernatant while stirring, followed by stirring at 4 ° C for 3 hours. Then, after centrifugation at 10,000 rpm for 15 minutes using a high-speed centrifuge (CR26H, R10A rotor: Hitachi, Ltd.), the obtained supernatant was filtered with gauze to remove insolubles. The resulting supernatant was applied to a rotary evaporator overnight to remove acetone, and finally concentrated to 1350 ml.
  • a high-speed centrifuge C26H, R10A rotor: Hitachi, Ltd.
  • Each of the obtained solutions I to IV was freeze-dried using a freeze dryer (12EL; VirTis).
  • the eluate was fractionated by assigning a fraction number to each 1 ml, and 2 u ⁇ of each fraction was mixed with 150 1 of 0.2% Bovine Serum Albumin (BSA) / distilled water and freeze-dried. This dried product was used as an assay sample for measuring the activity of increasing the intracellular Ca ion concentration described in (3-5) below.
  • BSA Bovine Serum Albumin
  • a ZAQ stable expression cell line was prepared as follows. That is, one clone of DH5 aZpCR1-ZAQC obtained in Example 1 was shake-cultured in an LB medium containing ampicillin to obtain a plasmid pCR2.1-ZAQC. This was treated with restriction enzymes Sal I and Spe I to cut out the insert encoding ZAQC. Similarly, pAKKO-1.11H treated with restriction enzymes Sal I and Spe I was ligated with the insert using the Ugation Express Kit (CLONTECH Laboratories, Inc. (CA, USA)), and the port was elected to Escherichia coli DH10B. Introduced by the poration method.
  • the structure of the plasmid contained in the obtained clone was confirmed by restriction enzyme treatment and sequence analysis, and a plasmid of the correct construction was used as a plasmid pAK-ZAQC for CH0 cell expression.
  • the plasmid pAK-ZAQC was obtained by transducing CHO / dhfr-cells (American Type Culture Collection) using CellPhect Transfection kit (Amersham Pharmacia Biotech II). First, Buffer A (attached to CellPhect Transfection Kit) 1201 is added to 4 xg of plasmid DNA dissolved in distilled water 1201, stirred, allowed to stand for 10 minutes, and then Buffer B (CellPhect Transfection Kit).
  • the cells After culturing the cells at 37 ° C in 5% carbon dioxide for 6 hours, the cells are washed twice with serum-free Ham's F-12 medium, and the cells in a Petri dish containing 15% glycerol ⁇ (140 mM NaCl, 25 mM HEPES , 1.4 mM Na 2 HP0 4, pH7.1) was added 1.2ml treated for 2 minutes. This was washed again twice with serum-free Ham's F-12 medium and then in 111 '5-12 medium containing 10% fetal calf serum at 37 and overnight in 5% carbon dioxide. Cultured.
  • the cells were dispersed by trypsin treatment, recovered from the Petri dish, and 4 ⁇ 2 ⁇ 10 4 cells were inoculated in a 6-well plate, dialyzed 10% fetal calf serum (JRH BIOSCIENCES), 1 mM MEM non-essential amino acid solution (large Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.) In Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) medium containing 100 units / ml Penicillin, 100 ng / ml Streptomycin (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) at 37 ° (in 5% CO 2 gas) Transformation into which the plasmid has been introduced CH0 cells grow in the medium, but non-transfected cells gradually die, so the medium is exchanged on the first and second days of the culture.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • RNA isolation kit Approximately 21 colonies of transformed CH0 cells that grew 8 to 10 days after the start of culture were selected, and RNA was recovered from each selected cell using a commercially available RNA isolation kit. ZAQ expression that expresses ZAQ at high CH0 cell B1 clone # (hereinafter ZAQC- B1 to cell and abbreviation) were selected.
  • ETA endothelin A receptor, Yuichi
  • CH0 cell clone 24 CH0 cell clone 24
  • the activity of increasing the intracellular Ca ion concentration in ZAQC-B1 cells and ETA24 cells was measured using FLIPRCMolecular Devices. Both ZAQC-B1 cells and ETA24 cells that had been subcultured in DMEM supplemented with 10% dialyzed fetal calf serum (hereinafter referred to as dFBS) were used. Suspend the ZAQC-B1 cells and ETA24 cells in a medium (10% d FBS-DMEM) at a concentration of 15 ⁇ 10 4 cells / ml, and place them in a 96-well plate for FLIPR (Black plate clear bottom, Coster).
  • H / HBSS Nisy Hanks 2 (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) 9.8 g, sodium hydrogen carbonate 0.35 g, HEPES 4.77 g, adjusted to pH 7.4 with sodium hydroxide solution, then sterilized with Filtration) 20 ml, 250 mM Probenecid 200 1 ⁇ Mixed with fetal serum (FBS) 200.
  • sample plate 150 l of H / HBSS containing 2.5 mM Probenecid and 0.2% BSA was added to each fraction to dilute the 96-well plate for FLIPR (V-Bottom plate). , Coster) (hereinafter referred to as sample plate). After dye loading of the cell plate is completed, wash the cell plate four times using a pre-washer (Molecular Devices) with a washing buffer containing 2.5 mM Probenecid added to H / HBSS. Left. The cell plate and the sample plate were set in the FLIPR and assayed (FUPR transfers 50 l of sample from the sample plate to the cell plate).
  • pre-washer Molecular Devices
  • Solution A (0.4% trifluoroacetic acid) was applied to a TSKgel Super-Phenyl reverse-phase high-performance liquid chromatography column (0.46 cm x 10 cm, Tosoichi Co., Ltd.) at a flow rate of 1 ml / min at 40 ° C. / Distilled water) volume 81.7% / B solution (0.13 ⁇ 4 trifluoroacetic acid / 60% acetonitrile) volume 8.3% was flowed to equilibrate.
  • Fraction No.53 obtained in (3-4) above was subjected to a chromatography operation. That is, after 1 ml of the solution of fraction No.
  • the eluate was fractionated with a fraction number of 500 1 each. Each fraction was mixed with 0.2% BSA1501 (25/1 each) and freeze-dried with a freeze dryer (12EL; VirTis). To this dried product, 150 u ⁇ of H / HBSS containing 2.5 mM Probenecid and 0.2% BSA was added and dissolved. Using this solution 501, the intracellular Ca ion concentration was determined by the test method described in (3-5) above. By measuring the ascending activity, the receptor activating effect on ZAQC-B1 cells was measured. As a result, it was found that the target component having a receptor activating effect on ZAQC-B1 cells, that is, the ZAQ activating component, was mainly eluted in fraction Nos. 103-105.
  • the eluate is fractionated by assigning a fraction number to each of the 500 1
  • Each 10 parts was mixed with 150 l of 0.2% BSA and freeze-dried with a freeze dryer (12EL; VirTis).
  • 150 l of H / HBSS containing 2.5 mM Probenecid and 0.2% BSA was added and dissolved, and 50 l of this solution was used to perform the ZAQC-B1
  • the receptor activating effect on the cells was measured.
  • the target component having a receptor activating effect on ZAQC-B1 cells that is, the ZAQ activating component
  • This activity peak completely coincided with the 210 MI ultraviolet absorption peak, and it was judged that the peptide had been purified to a single peptide.
  • the structure of the ZAQ-activating component obtained in (3-7) was determined by the following method.
  • the solvent in the purified sample of the ZAQ-activating component was removed using a vacuum concentrator (servant), and the obtained dried product was dissolved in the solvent DMS0 (dimethylsulfoxide).
  • DMS0 dimethylsulfoxide
  • a part of this solution was subjected to amino acid sequence analysis from the N-terminus using a protein sequencer (PerkinElmer, PE Biosystems Procise 491cLC).
  • a human EST (X40467) containing a sequence equivalent to the nucleotide sequence of DNA encoding a peptide having an amino acid sequence was found. Since this sequence did not have a full-length open reading frame, the sequence of the undetermined portion was determined by the RACE method, and a cDNA clone having the full-length open reading frame was subsequently obtained. I got it.
  • primers ZF1 (SEQ ID NO: 12) and ZF2 (SEQ ID NO: 13) and ZF3 (SEQ ID NO: 14) were prepared, and the 3 ′ RACE experiment described below was performed using human testis Marathon-Ready cDNA (CLONTECH) as type III.
  • ZF1 5'-GGTGCCACGCGAGTCTCAATCATGCTCC-3 '(SEQ ID NO: 12)
  • ZF2 5'-GGGGCCTGTGAGCGGGATGTCCAGTGTG-3 '(SEQ ID NO: 13)
  • ZF3 5'-CTTCTTCAGGAAACGCAAGCACCACACC-3 '(SEQ ID NO: 14)
  • the 3 'RACE PCR reaction solution is 1 fi 1 of 50 x Advantage 2 Polymerase Mix (CLONTECH) and the attached 10 x Advantage 2 PCR buffer (400 mM Tricine-KOH, 150 mM KOAc, 35 mM Mg (0Ac) 2 , 37.5 / ml BSA, 0.05% Tween-20, 0.05% Nonidet-P40) 5 fi ⁇ , dNTP mixture (2.5 mM each, Takara Shuzo) 4 n 10 Primer ZF1 11 1, 10 Primer API (Primer API is CLONTECH Was prepared by mixing 5 ⁇ 1 of thigh (CLONTECH, human testis Marathon-Ready cDNA) and 33 zl of distilled water.
  • the reaction conditions were as follows: after initial denaturation at 94 ° C for 60 seconds, 5 cycles of 94 ° C for 30 seconds to 72 ° C for 4 minutes, 94 ° C for 30 seconds to 70 ° C for 4 minutes.
  • the cycle reaction was performed 5 times, and the cycle reaction was performed 25 times at 94 ° C. for 30 seconds-68 ° C. for 44 minutes.
  • reaction solution was 50 X Advantage 2 Polymerase Mix (CLONTECH) 11 and the attached 10 x Advantage 2 PCR buffer (400 mM Tricine-KOH, 150 mM KOAc, 35 mM Mg (0Ac) 2 , 37.
  • a second nested PCR was performed using the reaction solution of the PCR reaction as a type II.
  • the reaction mixture was 50 X Advantage 2 Polymerase Mix (CLONTECH) ⁇ 1, and the attached 10 x Advantage 2 PCR buffer (400 mM Tricine-KOH, 150 mM KKOAc, 35 m.MMg (0Ac) 2 , 37.5 ⁇ g / ml BSA, 0.053 ⁇ 4Tween-20, 0.05% Nonidet- P40) with 5 x K dNTP mixture (2.5 mM each, Takara Shuzo Co., Ltd.) 4 1, 10 M primer-ZF3 11 and 10 primer AP2 (Primer AP2 used was attached to Marathon-Ready cDNA Kit of CL0NTECH).
  • Type IV DM (the PCR reaction solution diluted 50 times) was prepared by mixing 5 with 33 of distilled water. After initial denaturation reaction conditions 94 ° ⁇ 60 seconds, 94 ° O30 seconds - 72 ° C '4 minutes of cycling reactions 5 times, 94 D C'30 seconds - 70 ° C'4 minute cycle reaction 5 times, A cycle reaction of 94 ° C. for 30 seconds-68 ° C. for 44 minutes was performed 25 times. The obtained DNA fragment was cloned using a TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen) according to the method described in the attached manual. The nucleotide sequence of the cloned DNA was decoded using ABI377 DNA sequencer to obtain a 3′-end sequence (SEQ ID NO: 15).
  • Primers ZAQL-CF (SEQ ID NO: 16) and ZAQL-XR1 (SEQ ID NO: 17) were prepared based on the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 15 and the information of EST (X40467). Using human testis Marathon-Ready cDNA (CL0NTECH) as type III, PCR was performed using primers ZAQL-CF and ZAQL-XR1.
  • ZAQL-CF 5'-CCACCATGAGAGGTGCCACG-3 '(SEQ ID NO: 16)
  • ZAQL-XR1 5'-CTCGAGCTCAGGAAAAGGATGGTG-3 '(SEQ ID NO: 17)
  • the PCR reaction solution was prepared by adding PfuTurbo DNA polymerase (Stratagene) to 1x attached 10xPCR buffer 5 1> 2.5mM dNTP mixture 4n ⁇ , 10M primers ZAQL-CF and ZAQL-XR1 each 2.51,
  • the DNA was prepared by mixing 5 types of DNA and 30 / xl of distilled water.
  • the reaction conditions were as follows: after initial denaturation at 95 ° C'l, 40 cycles of 95 ° 01min-60 ° 01min-72 ° 01min cycle and final extension reaction of 72 ° C for 10min.
  • the obtained DNA fragment was cloned using T0P0 TA Cloning Kit (Invitrogen) according to the method described in the attached manual.
  • the plasmid having the DNA fragment having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 18 was named pHMITA
  • the plasmid having the DNA fragment having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 19 was named PHMITG.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 29 has a typical signal sequence
  • the DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 28 is a human having the base sequence represented by SEQ ID NO: 20.
  • SEQ ID NO: 27 DM
  • a DNA fragment (SEQ ID NO: 30) was cut out.
  • plasmid pHMITG was digested with EcoRI and XhoI, and the obtained DM was electrophoresed on a 1.5% agarose gel, and a gel piece containing a band of about 382 bp to be stained with cyber green was cut off with a razor.
  • DNA fragments were recovered from the gel pieces using a Gene Clean spin DNA extraction kit (BIO 101).
  • the obtained DNA fragment was used as a promoter for the mammalian cell expression vector PCAN618 (Fig. 11) expressing the CMV-IE enhancer and chicken beta-act in promoter as a promoter. It was cloned into the restriction enzyme cleavage site according to a standard method.
  • the mammalian cell expression vector having the DNA encoding the human ZAQ ligand precursor peptide was named pCANZAQLg2.
  • C0S7 cells used were purchased from ATCC and subcultured using DMEM medium (supplemented with 10% FBS). Seeded C0S7 cells 10cm petri dish so as to be 1.5 X 10 6 cells / dish using DMEM medium and incubated overnight in 37 ° C, 5% C0 2 incubator scratch.
  • pCANZAQLg2 human ZAQ ligand precursor peptide expression plasmid
  • buffer EC Effectene transfection reagent, QIAGEN
  • the culture supernatant of the C0S7 cell expressing human ZAQ ligand precursor peptide was collected, and the following operation was performed to prepare an extract.
  • 1.1 ml of diacid was added dropwise to the cell culture supernatant (about 18.5 ml) to a final concentration of 1 M, followed by stirring for 1 hour. In addition, double the capacity of the case Then, the mixture was stirred at 4 ° C for 30 minutes, and then centrifuged at 15,000 rpm for 30 minutes using a high-speed centrifuge (CR26H, type 23 Ryuichi: Hitachi, Ltd.) to obtain a supernatant. The obtained supernatant was subjected to evaporation overnight to remove acetone, and then freeze-dried with a freeze dryer (12 EL; VirTis).
  • a freeze dryer (12 EL; VirTis
  • Solution A (0.13 ⁇ 4 trifluoroacetic acid / distilled water) was applied to a TSKgel Super 0DS reversed-phase high-performance liquid chromatography column (Tosoichi Co., Ltd., 0.46 cm x 10 cm) at 40 ° C at a flow rate of 1 ml / min. ) was run to equilibrate. After applying the SepPak C18-5 g column fraction obtained in (5-3-2) to a servant, the fraction was applied to Super 0DS reversed-phase high-performance liquid chromatography and the solution A (flow rate 1 ml / min for 60 minutes).
  • volume 100% / B solution (0.1% trifluoroacetic acid / 60 acetonitrile) Volume is increased from 03 ⁇ 4 to 0% solution A volume / 100% solution volume in a linear gradient, and the eluate is increased. Collected. The eluate was fractionated with a 1 ml fraction number, and the entire fraction was freeze-dried with a freeze dryer (12EL; VirTis). To this dried product, add 150 mM of 2.5 mM Probenecid and 0.2% BSA to H / HBSS, and dissolve it. Using this solution, perform ZAQC-B1 cell by the following test method (5-3-4). The activation effect was measured.
  • Example 3 Using the sample obtained in (5-3-3) above, the intracellular Ca ion concentration increasing activity of the ZAQ-expressing cells (ZAQC-B1) obtained in Example 3 (3-5) was measured using FLIPR. went.
  • ZAQC-B175-expressing cells hOT7T175-16; described in WO 00/24890
  • Both ZAQC-B1 cells and h0T7T175-16 cells used were those subcultured in DMEM supplemented with 10% dialyzed fetal bovine serum (hereinafter referred to as dFBS).
  • dFBS dialyzed fetal bovine serum
  • ZAQC-B1 cells and hOT7T175-16 cells are each suspended in a medium (10% dFBS-DMEM) at 15 ⁇ 10 4 cells / nil, and dispensed into a 96-well plate for FLIPR (Black plate clear bottom. Coster). seeded by 200 il each Ueru with vessel (3.0 10 4 6115/200 1 / Weru), was cultured overnight at 5% C0 2 incubator in one among 37 ° C, and (hereafter cell plates using ).
  • H / HBSS (HANKS '9., sodium hydrogen carbonate 0.35 g, HEPES 4.77 g, adjusted to pH 7.4 with sodium hydroxide, and filter sterilized) 21 ml, 50 mM Probenecid 210 1, ⁇ fetal serum (FBS) 210 1 was mixed. Also, a Fluo3-A2 vial (50 g) was dissolved in dimethylsulfoxide 421, 20% Pluronic acid 42 il, added to the above H / HBSS-Probenecid-FBS, mixed, and mixed for 8 times. 100 ⁇ l of each well was dispensed to the cell plate from which the culture solution had been removed using a plate, and incubated at 37 ° C.
  • sample plate After dye loading of cell plate, 2.5mM in H / HBSS The cell plate was washed four times with a washing buffer containing Probenecid using a plate washer (Molecular Devices), leaving 100 1 of washing buffer after washing. The cell plate and the sample plate were set on the FLIPR and assayed (the FLIPR transfers a 0.05 ml sample from the sample plate to the cell plate).
  • a human ZAQ ligand precursor peptide expression plasmid (pCANZAQLg2) was introduced into C0S7 cells.
  • plated C0S7 cells in 15cm petri dish so as to be 3.0X10 6 cells / dish using DMEM medium and incubated overnight in 37 ° C, 5% C0 2 ink Yubeta scratch.
  • pCANZAQLg2 dissolved in 41 TE buffer
  • 600 zl of Buffer EC Effectene transfection reagent, QIAGEN
  • Enhancer 321 add 1 After mixing for 2 seconds, the mixture was left at room temperature for 3 minutes.
  • Eifectene Transfection Reagent 120 was added, mixed for 10 seconds, and left at room temperature for 10 minutes. The supernatant of the cells sowed the day before was removed, washed once with 10 ml of DMEM medium, and 30 ml of DMEM medium was added. The plasmid solution was added to DMEM medium lml dropwise to mix after cell, after mixing the whole 37 ° (:., 5% C0 2 incuba- Isseki was over ⁇ cultured in one once with DMEM medium 10 ml wash ., and added to DMEM medium 20ml, 37 ° C, in 5% C0 2 incubator one among the over ⁇ culture after 1 day, the supernatant was collected. the further DMEM medium 20ml was added, 37 ° (:, 5% C0 After culture in a 2 incubator, the culture supernatant was collected.
  • the peptide was eluted with 1000 ml of 0.1 trifluoroacetic acid / 60% acetonitrile.
  • the obtained eluate was applied to an evaporator overnight, and then lyophilized using a freeze dryer (12 EL; VirTis).
  • Solution A (0.1% trifluoroacetic acid / distilled water) was applied to a TSKgel ODS80TM reversed-phase high-performance liquid chromatography column (Tosoichi, 21.5 x 30 cm) at 40 ° C and a flow rate of 4 ml / min. Run off and equilibrate.
  • Solution A After dissolving the obtained lyophilized powder in Solution A, the solution is applied to the 0DS80TM column, and at a flow rate of 4 ml / min for 120 minutes, the volume of Solution A (0.1 trifluoroacetic acid / distilled water) 60% / B solution (0.1% trifluoromethane) The peptide was eluted with a linear gradient from 40 volumes of acetic acid / 60% acetonitrile) to 0% solution A / 100% solution B volume.
  • the eluate was fractionated with a fraction number of 8 ml each, and 50 fractions were collected from the fractionated fraction and freeze-dried with a freeze dryer (12 EL; VirTis).
  • a freeze dryer (12 EL; VirTis).
  • H / HBSS To this dried product, add H / HBSS to which 2.5 mM Probenecid and 0.2% BSA was added, add 2001, and dissolve.
  • ZAQC-B1 The effect of receptor activation on cells was measured. As a result, it was found that the target component having a receptor activating effect on ZAQC-B1 cells, that is, the ZAQ activating component, was eluted in fraction No. 32.
  • Solution A (10 mM ammonium formate / 10 mM formic acid / 10) at 25 ° C at a flow rate of 1 ml / min at 25 ° C at a flow rate of 1 ml / min. (Acetonitrile) and allowed to equilibrate.
  • the above fraction No. 32 was applied to the CM-2SW column, and solution A (10 mM formic acid) was added at a flow rate of 1 ml / min for 60 minutes.
  • the eluate was fractionated with 1 ml fractions each, and 1.5 l was taken from the fractionated fraction, and diluted with H / HBSS in 2.5 mM Probenecid and 0.2% BSA.
  • the receptor activating effect on ZAQC-B1 cells was measured by the test method described in 5-3-4). As a result, it was found that the target component having a receptor activating effect on ZAQC-B1 cells, that is, the ZAQ activating component, was eluted in fractions Nos. 56 and 57.
  • Solution A (0.13 ⁇ 4 trifluoroacetic acid / distilled water) was applied to a TSKgel Super phenyl reversed-phase high-performance liquid chromatography column (Tosoichi Co., Ltd., 4.6 X 10 cm) at 40 ° C at a flow rate of 1 ml / min. ) And allowed to equilibrate.
  • the above fractions Nos. 56 and 57 were applied to the Superphenyl column, and the solution A (0. trifluoroacetic acid / distilled water) volume 70% ZB solution (0.1% trifluoroacetic acid / 60% Acetonitrile)
  • the peptide was eluted with a linear gradient from volume 30 to volume A solution 50% and volume ZB solution 50% with a linear gradient.
  • the eluate was fractionated by adding a fraction number to each 1 ml, and 1.5 1 was taken from the fractionated fraction, and diluted with H / HBSS to 2.5 mM Probenecid and 0.2% BSA 200 1 and this solution was used.
  • the receptor activating effect on ZAQC-B1 cells was measured by the test method described in (5-3-4) above. As a result, it was found that the target component having a receptor activating effect on ZAQC-B1 cells, that is, the ZAQ activating component, was eluted in fractions Nos. 54, 55 and 56. This activity coincided with a single UV absorption peak, and it was concluded that the active ingredient had been purified to a single level.
  • the obtained amino acid sequence was consistent with the predicted N-terminal amino acid sequence of the mature human ZAQ ligand mature peptide.
  • mass spectrometry of the purified sample of the ZAQ-activating component was carried out by electrospray ionization using a Finnigan LCQ LC / MS apparatus (Thermoquest, San Jose, Calif.), And the molecular weight was 9657. It was confirmed that it was 6. This is in good agreement with the theoretical value of 9677.3 for an 86-residue human ZAQ ligand mature peptide (SEQ ID NO: 21) in which all 10 cysteine residues form disulfide bonds. It was confirmed that the preparation had a humanized ZAQ ligand mature peptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21.
  • the protein of the present invention is: 1) determination of ligand (agonist), 2) acquisition of antibodies and antiserum, 3) expression of recombinant protein ⁇ Development of receptor system using the same expression system ⁇ ⁇ Development of Atsushi system and screening of drug candidate compounds 5

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Description

新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質およびその D N A 技術分野
本発明は、 ヒト脳由来の新規蛋白質 （G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質） ま たはその塩およびそれをコ一ドする D N Aなどに関する。 背景技術
多くのホルモンや神経伝達物質は、 細胞膜に存在する特異的なレセプ夕一蛋 白質を通じて生体の機能を調節している。 これらのレセプ夕一蛋白質の多くは 共役している guanine nuc l eot i de-bind ing prote in (以下、 G蛋白質と略称す る場合がある） の活性化を通じて細胞内のシグナル伝達を行ない、 また 7個の 膜貫通領域を有する共通した構造をもっていることから、 G蛋白質共役型レセ プ夕ー蛋白質あるいは 7回膜貫通型レセプ夕一蛋白質と総称される。
G蛋白質共役型レセプター蛋白質は生体の細胞や臓器の各機能細胞表面に存 在し、 それら生体の細胞や臓器の機能を調節する分子、 例えばホルモン、 神経 伝達物質および生理活性物質等の標的として非常に重要な役割を担っている。 各種生体の細胞や臓器の内の複雑な機能を調節する物質と、 その特異的レセ プ夕ー蛋白質、 特には G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質との関係を明らかにす ることは、 各種生体の細胞や臓器の機能を解明し、 それら機能と密接に関連し た医薬品開発に非常に重要な手段を提供することとなる。
例えば、 脳などの中枢神経系の器官では、 多くのホルモン、 ホルモン様物質、 神経伝達物質あるいは生理活性物質などによる調節のもとで脳の生理的な機能 の調節が行なわれている。 特に、 神経伝達物質は脳内の様々な部位に存在し、 それぞれに対応するレセプ夕一蛋白質を通してその生理機能の調節を行ってい る。 脳内には未だ未知の神経伝達物質も多く、 そのレセプ夕一蛋白質をコード する c D N Aの構造に関しても、 これまで報告されていないものも多いと考え られる。 さらに、 既知のレセプ夕一蛋白質のサブタイプが存在するかどうかに ついても分かっていなかった。
脳における複雑な機能を調節する物質と、 その特異的レセプ夕一蛋白質との 関係を明らかにすることは、 医薬品開発に非常に重要な手段である。 また、 レ セプ夕一蛋白質に対するァゴニスト、 アン夕ゴニストを効率よくスクリ一ニン グし、 医薬品を開発するためには、 脳内で発現しているレセプ夕一蛋白質の遺 伝子の機能を解明し、 それらを適当な発現系で発現させることが必要であった。 近年、 生体内で発現している遺伝子を解析する手段として、 c D N Aの配列 をランダムに解析する研究が活発に行なわれており、 このようにして得られた c D N Aの断片配列が Expres sed Sequence Tag ( E S T) としてデータベース に登録され、 公開されている。 しかし、 多くの E S Tは配列情報のみであり、 その機能を推定することは困難である。 発明の開示
本発明は、 ヒト脳由来の新規蛋白質 （G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質） 、 その部分ペプチドまたはそれらの塩、 該蛋白質またはその部分ペプチドをコー ドする D N Aを含有する D N A、 該 D N Aを含有する組換えベクター、 該組換 えベクターで形質転換された形質転換体、 該蛋白質またはその塩の製造法、 該 蛋白質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体、 該蛋白質 （G蛋白 質共役型レセプター蛋白質） に対するリガンドの決定方法、 リガンドと該蛋白 質 （G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質） との結合性を変化させる化合物または その塩のスクリーニング方法、 該スクリーニング用キット、 該スクリーニング 方法もしくはスクリ一ニングキットを用いて得られるリガンドと該蛋白質 （G 蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質） との結合性を変化させる化合物またはその塩、 およびリガンドと該蛋白質 （G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質） との結合性を 変化させる化合物またはその塩を含有してなる医薬などを提供する。
本発明者らは、 鋭意研究を重ねた結果、 ヒト脳由来の新規な蛋白質 （G蛋白 質共役型レセプ夕一蛋白質） をコードする c D N Aを単離し、 全塩基配列を解 析することに成功した。 そして、 この塩基配列をアミノ酸配列に翻訳したとこ ろ、 第 1〜第 7膜貫通領域が疎水性プロット上で確認され、 これらの cDNA にコードされる蛋白質が 7回膜貫通型の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質であ ることを確認した （図 3) 。 本発明者らは、 これらの知見に基づいて、 さらに 研究を重ねた結果、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、
(1) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有することを特徴とする蛋白質またはその塩、
(2) 上記 （1) 記載の蛋白質の部分ペプチドまたはその塩、
(3) 上記 （1) 記載の蛋白質をコードする DNAを含有する DNA、
(4) 配列番号： 2または配列番号： 3で表される塩基配列を有する上記 （3) 記載の DNA、
(5) 上記 （3) 記載の DNAを含有する組換えべクタ一、
(6) 上記 （5) 記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体、
(7)上記（6)記載の形質転換体を培養し、 上記（1)記載の蛋白質を生成- 蓄積せしめることを特徴とする上記 （1) 記載の蛋白質またはその塩の製造法、
(8) 上記 （1) 記載の蛋白質もしくは上記 （2) 記載の部分ペプチドまたは その塩に対する抗体、
(9) 上記 （1) 記載の蛋白質もしくは上記 （2) 記載の部分ペプチドまたは その塩を用いることを特徴とする上記 （1) 記載の蛋白質またはその塩に対す るリガンドの決定方法、
(10) 上記 （1) 記載の蛋白質もしくは上記 （2) 記載の部分ペプチドまた はその塩を用いることを特徴とするリガンドと上記 （1) 記載の蛋白質または その塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、 (1 1) 上記 （1) 記載の蛋白質もしくは上記 （2) 記載の部分ペプチドまた はその塩を含有することを特徴とするリガンドと上記 （1) 記載の蛋白質また はその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キッ 卜、 (12) 上記 （10) 記載のスクリーニング方法または上記 （1 1) 記載のス クリーニング用キットを用いて得られうる、 リガンドと上記 （1) 記載の蛋白 質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩、
(13) 上記 （10) 記載のスクリーニング方法または上記 （1 1) 記載のス クリーニング用キットを用いて得られうる、 リガンドと上記 （1) 記載の蛋白 質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を含有してなる医 薬、 および
(14) 上記 （3) 記載の DN Aとハイストリンジェン卜な条件下でハイプリ ダイズする D N Aなどを提供する。
より具体的には、
(15) 蛋白質が、 ①配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列中の 1または 2 個以上 （好ましくは、 1〜30個程度、 より好ましくは 1〜9個程度、 さらに 好ましくは数個 （1または 2個） ） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 ②配 列番号： 1で表わされるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜 30個程度、 より好ましくは 1〜10個程度、 さらに好ましくは数個 （1また は 2個） ） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 ③配列番号： 1で表わされる アミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜30個程度、 より好ま しくは 1〜10個程度、 さらに好ましくは数個 （1または 2個） ） のアミノ酸 が他のァミノ酸で置換されたァミノ酸配列、 または④それらを組み合わせたァ ミノ酸配列を含有する蛋白質である上記 （1) 記載の蛋白質またはその塩、
(16) 上記 （1) 記載の蛋白質もしくはその塩または上記 （2) 記載の部分 ペプチドもしくはその塩と、 試験化合物とを接触させることを特徴とする上記
(10) 記載のリガンドの決定方法、
(17) リガンドがアンギオテンシン、 ボンべシン、 カナピノイド、 コレシス トキニン、 グルタミン、 セロトニン、 メラ卜ニン、 ニューロペプチド Y、 オビ ォイド、 プリン、 バソプレツシン、 ォキシトシン、 PACAP、 セクレチン、 グルカゴン、 カルシ卜ニン、 アドレノメジュリン、 ソマトス夕チン、 GHRH、 CRF、 ACTH、 GRP、 PTH、 V I P (バソアクティブ インテスティ ナル アンド リレイテッド ポリペプチド） 、 ソマトス夕チン、 ド一パミン、 モチリン、 アミリン、 ブラジキニン、 CGRP (カルシ卜ニンジーンリレーテ イツドペプチド） 、 ロイコトリェン、 パンクレアスタチン、 プロスタグランジ ン、 トロンポキサン、 アデノシン、 アドレナリン、 ひおよび ;3—ケモカイン (c emokine) (例えば、 I L一 8、 GROa;、 GROj3、 GROr、 NAP— 2、 ENA - 78、 PF4、 I P 10、 GCP - 2、 MCP— 1、 HC 14、 MCP_3、 1— 309、 MI P l a、 M I P— 1 /3、 RANTESなど） 、 エンドセリン、 ェンテロガストリン、 ヒスタミン、 ニューロテンシン、 TRH、 パンクレアティックポリぺプタイド、 ガラニン、 Mamba Intestinal Toxin 1 ( ΜΙΊ と略称することがある ； Toxicon、 28巻、 847 - 856頁、 1990年、 FEBS Letters 461, 183-188 (1999)) またはその哺乳動物のホモログである上記（ 9 ) 記載のリガンドの決定方法、
(18) (i) 上記 （1) 記載の蛋白質もしくはその塩または上記 （2) 記載 の部分ペプチドもしくはその塩と、 リガンドとを接触させた場合と、 （ii) 上 記 （1) 記載の蛋白質もしくはその塩または上記 （2) 記載の部分ペプチドも しくはその塩と、 リガンドおよび試験化合物とを接触させた場合との比較を行 なうことを特徴とする上記 （1 1) 記載のスクリーニング方法、
(19) (i) 標識したリガンドを上記 （1) 記載の蛋白質もしくはその塩ま たは上記（2)記載の部分ペプチドもしくはその塩に接触させた場合と、 （ii) 標識したリガンドおよび試験化合物を上記 （1) 記載の蛋白質もしくはその塩 または上記 （2) 記載の部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合における、 標識したリガンドの上記 （1) 記載の蛋白質もしくはその塩または上記 （2) 記載の部分べプチドもしくはその塩に対する結合量を測定し、 比較することを 特徴とするリガンドと上記 （1) 記載の蛋白質またはその塩との結合性を変化 させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(20) (i) 標識したリガンドを上記 （1) 記載の蛋白質を含有する細胞に 接触させた場合と、 （ii) 標識したリガンドおよび試験化合物を上記 （1) 記 載の蛋白質を含有する細胞に接触させた場合における、 標識したリガンドの該 細胞に対する結合量を測定し、比較することを特徴とするリガンドと上記（ 1 ) 記載の蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスク リーニング方法、
(2 1) ( i ) 標識したリガンドを上記 （1) 記載の蛋白質を含有する細胞の 膜画分に接触させた場合と、 （ii) 標識したリガンドおよび試験化合物を上記 (1) 記載の蛋白質を含有する細胞の膜画分に接触させた場合における、 標識 したリガンドの該細胞の膜画分に対する結合量を測定し、 比較することを特徴 とするリガンドと上記 (1) 記載の蛋白質またはその塩との結合性を変化させ る化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(22) ( i ) 標識したリガンドを上記 （6) 記載の形質転換体を培養するこ とによって該形質転換体の細胞膜に発現した蛋白質に接触させた場合と、 （ii) 標識したリガンドおよび試験化合物を上記 （6) 記載の形質転換体を培養する ことによって該形質転換体の細胞膜に発現した蛋白質に接触させた場合におけ る、 標識したリガンドの該蛋白質に対する結合量を測定し、 比較することを特 徴とするリガンドと上記 （1) 記載の蛋白質またはその塩との結合性を変化さ せる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(23) ( i ) 上記 （1) 記載の蛋白質またはその塩を活性化する化合物を上 記 （1) 記載の蛋白質を含有する細胞に接触させた場合と、 （Π) 上記 （1) 記載の蛋白質またはその塩を活性化する化合物および試験化合物を上記 （ 1 ) 記載の蛋白質を含有する細胞に接触させた場合における、 蛋白質を介した細胞 刺激活性を測定し、 比較することを特徴とするリガンドと上記 （1) 記載の蛋 白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリ一ニン グ方法、
(24) 上記（1) 記載の蛋白質またはその塩を活性化する化合物を上記（6) 記載の形質転換体を培養することによって該形質転換体の細胞膜に発現した蛋 白質に接触させた場合と、 上記 （1) 記載の蛋白質またはその塩を活性化する 化合物および試験化合物を上記 （6) 記載の形質転換体を培養することによつ て該形質転換体の細胞膜に発現した蛋白質に接触させた場合における、 該蛋白 質を介する細胞刺激活性を測定し、 比較することを特徴とするリガンドと上記 ( 1 ) 記載の蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩 のスクリーニング方法、
(2 5) 上記 （1) 記載の蛋白質を活性化する化合物が、 アンギオテンシン、 ボンべシン、 カナピノイド、 コレシストキニン、 グルタミン、 セロトニン、 メ ラトニン、 ニューロペプチド Y、 ォピオイド、 プリン、 バソプレツシン、 ォキ シトシン、 PACAP、 セクレチン、 グルカゴン、 カルシトニン、 アドレノメ ジュリン、 ソマトス夕チン、 GHRH、 CRF、 ACTH、 GRP、 PTH、 V I P (バソアクティブ インテスティナル アンド リレイテッド ポリべ プチド） 、 ソマトス夕チン、 ドーパミン、 モチリン、 アミリン、 ブラジキニン、 CGRP (カルシトニンジーンリレーティッドペプチド） 、 ロイコトリェン、 パンクレアスタチン、 プロスタグランジン、 トロンボキサン、 アデノシン、 ァ ドレナリン、 ひおよび) 3—ケモカイン （chemokine) (例えば、 I L一 8、 GR 〇ひ、 GR〇 )3、 GROr , NAP— 2、 ENA— 7 8、 PF 4、 I P 1 0、 GCP - 2、 MCP - 1、 HC 1 4、 MCP— 3、 I一 3 0 9、 M I P 1 ひ、 M I P- 1 i3 R ANTE Sなど） 、 エンドセリン、 ェンテロガストリン、 ヒ ス夕ミン、 ニューロテンシン、 TRH、 パンクレアティックポリぺプ夕イド、 ガラニン、 MIT1またはその哺乳動物のホモログである上記 （2 3) または上記 (24) 記載のスクリーニング方法、
(26) 上記 （1 8) 〜 （2 5) 記載のスクリーニング方法で得られうる、 リ ガンドと上記 （1) 記載の蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物 またはその塩、
(27) 上記 （1 8) 〜 （2 5) 項記載のスクリーニング方法で得られうる、 リガンドと上記 （1) 記載の蛋白質またはその塩との結合性を変化させるの化 合物またはその塩を含有することを特徴とする医薬、
(28) 上記 （1) 記載の蛋白質を含有する細胞を含有することを特徴とする 上記 （1 1) 記載のスクリーニング用キット、
(29) 上記 （1) 記載の蛋白質を含有する細胞の膜画分を含有することを特 徵とする上記 （1 1) 記載のスクリーニング用キット、
(30) 上記 （6) 記載の形質転換体を培養することによって該形質転換体の 細胞膜に発現した蛋白質を含有することを特徴とする上記 （1 1) 記載のスク リーニング用キット、
(31) 上記 （28) 〜 （30) 記載のスクリーニング用キットを用いて得ら れうる、 リガンドと上記 （1) 記載の蛋白質またはその塩との結合性を変化さ せる化合物またはその塩、
(32) 上記 （28) 〜 （30) 記載のスクリーニング用キットを用いて得ら れうる、 リガンドと上記 （1) 記載の蛋白質またはその塩との結合性を変化さ せる化合物またはその塩を含有することを特徴とする医薬、
(33) 上記 （8) 記載の抗体と、 上記 （1) 記載の蛋白質もしくは上記 （2) 記載の部分ペプチドまたはその塩とを接触させることを特徴とする上記 （1) 記載の蛋白質もしくは上記 （2) 記載の部分ペプチドまたはその塩の定量法、
(34) 上記 （8) 記載の抗体と、 被検液および標識化された上記 （1) 記載 の蛋白質もしくは上記 （2) 記載の部分ペプチドまたはその塩とを競合的に反 応させ、 該抗体に結合した標識化された上記 （1) 記載の蛋白質もしくは上記
( 2 ) 記載の部分べプチドまたはその塩の割合を測定することを特徴とする被 検液中の上記 （1) 記載の蛋白質もしくは上記 （2) 記載の部分ペプチドまた はその塩の定量法、 および
(35) 被検波と担体上に不溶化した上記 （8) 記載の抗体および標識化され た上記 （8) 項記載の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化 担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の上記 （1) 記載 の蛋白質もしくは上記 （2) 記載の部分ペプチドまたはその塩の定量法などを 提供する。 図面の簡単な説明
図 1は実施例 1で得られた本発明のヒト脳由来蛋白質をコードする DNAの 塩基配列 （ZAQC) 、 およびそれから推定されるアミノ酸配列を示す （図 2 に続く） 。
図 2は実施例 1で得られた本発明のヒト脳由来蛋白質をコードする DNAの 塩基配列 （ZAQC) 、 およびそれから推定されるアミノ酸配列を示す （図 1 の続き、 図 3に続く） 。
図 3は実施例 1で得られた本発明のヒト脳由来蛋白質をコードする DNAの 塩基配列 （ZAQC) 、 およびそれから推定されるアミノ酸配列を示す （図 2 の続き） 。
図 4は実施例 1で得られた本発明のヒト脳由来蛋白質をコードする DN Aの 塩基配列 （ZAQT) 、 およびそれから推定されるアミノ酸配列を示す （図 5 に続く） 。
図 5は実施例 1で得られた本発明のヒト脳由来蛋白質をコードする D N Aの 塩基配列 （ZAQT) 、 およびそれから推定されるアミノ酸配列を示す （図 4 の続き、 図 6に続く） 。
図 6は実施例 1で得られた本発明のヒト脳由来蛋白質をコードする DN Aの 塩基配列 （ZAQT) 、 およびそれから推定されるアミノ酸配列を示す （図 5 の続き） 。
図 7は本発明のヒ卜脳由来蛋白質の疎水性プロットを示す。
図 8は実施例 2で行われた ZAQの発現分布の解析結果を示す。
図 9は M I T 1、ヒト型 ZAQリガンド前駆体ペプチド（Aタイプ)およびヒト 型 Z A Qリガンド前駆体べプチド（Gタイプ）のァミノ酸配列を示す。
図中、 「M I T 1」は M I T 1のアミノ酸配列を、 「Human (A t ype)」 はヒト型 ZAQリガンド成熟体ペプチド （Aタイプ） のアミノ酸配列を、 「Hu man (B t yp e) 」 はヒト型 Z AQリガンド成熟体ペプチド （Bタイプ） のアミノ酸配列を、 それぞれ示す。
図 10は実施例 6 (6— 3) で行われた、 精製 ZAQリガンドペプチドの ZAQ活 性化作用の測定結果を示す。
図 11は実施例 5 (5- 1)で用いたプラスミド PCAN618の制限酵素地図を示す。 発明の実施をするための最良の形態
本発明の蛋白質 （G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質） は、 配列番号： 1で表 わされるアミノ酸配列 （図 1〜図 3または図 4〜図 6中のアミノ酸配列） と同 一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するレセプ夕一蛋白質である (以下、 本発明の蛋白質 （G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質） またはその塩を 本発明の蛋白質と略記する場合がある） 。
本発明の蛋白質 （G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質） は、 例えば、 ヒトゃ哺 乳動物 （例えば、 モルモット、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ブタ、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） のあらゆる細胞 （例えば、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 塍臓 /3 細胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム細胞、 ランゲルハンス細胞、 表皮細胞、 上皮細 胞、 内皮細胞、 繊維芽細胞、 繊維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マ クロファージ、 T細胞、 B細胞、 ナチュラルキラー細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝細胞もしくは間質細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくはガン細胞など） や血球系の細胞 （例えば、 MEL， Ml， CT LL- 2, HT- 2, WEH I— 3， HL- 60, J〇SK - 1, K 562, ML- 1, MOLT- 3, MOLT - 4, MOLT— 1 0， CCRF - CEM, TALL - 1， J u r k a t, CCRT— HSB - 2， KE— 37， SKW - 3, HUT- 78, HUT - 102， H9， U 937 , THP - 1， HEL, JK— 1， CMK, KO- 812, MEG— 0 1など） 、 またはそれらの細胞 が存在するあらゆる組織、 例えば、 脳、 脳の各部位 （例、 嗅球、 扁頭核、 大脳 基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 視床下核、 大脳皮質、 延髄、 小脳、 後頭葉、 前頭葉、 側頭葉、 被殻、 尾状核、 脳染、 黒質） 、 脊髄、 下垂体、 胃、 塍臓、 腎 臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管（例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 末梢血球、 前立腺、 睾丸、 精巣、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋など （特に、 脳や脳の各部 位） に由来する蛋白質であってもよく、 また合成蛋白質であってもよい。 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とし ては、 例えば、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と約 9 0 %以上、 好ま しくは約 9 5 %以上、 より好ましくは約 9 8 %以上の相同性を有するアミノ酸 配列などが挙げられる。
配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有 する蛋白質としては、 例えば、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と実質 的に同一のアミノ酸配列を有し、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を有 する蛋白質と実質的に同質の性質を有する蛋白質などが好ましい。
本発明の配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一 のアミノ酸配列を含有する蛋白質としては、 例えば、 配列番号： 1で表わされ るアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番 号： 1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが 好ましい。
実質的に同質の活性としては、 例えば、 リガンド結合活性、 シグナル情報伝 達作用などが挙げられる。 実質的に同質とは、 それらの活性が性質的に同質で あることを示す。 したがって、 リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用など の活性が同等 （例、 約 0 . 5〜2倍） であることが好ましいが、 これらの活性 の程度や蛋白質の分子量などの量的要素は異なつていてもよい。
リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、 自体公知の 方法に準じて行なうことができるが、 例えば、 決定方法やスクリーニング方法 に従つて測定することができる。
また、 本発明の蛋白質としては、 ①配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列 中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜3 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1または 2個） ） のアミノ酸が欠失したァ ミノ酸配列、②配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列に 1または 2個以上（好 ましくは、 1〜3 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましく は数個 （1または 2個） ） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 ③配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜3 0個 程度、より好ましくは 1〜 10個程度、さらに好ましくは数個（ 1または 2個）） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 または④それらを組み 合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質なども用いられる。
本明細書における蛋白質は、 ペプチド標記の慣例に従って左端が N末端 （ァ ミノ末端） 、 右端が C末端 （カルボキシル末端） である。 配列番号： 1で表わ されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をはじめとする本発明の蛋白質は、 C末 端が通常力ルポキシル基 （一 COOH) またはカルボキシレート（—COO一） であるが、 C末端がアミド （_CONH2) またはエステル （一 COOR) で あってもよい。
ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n—プロピ ル、 イソプロピルもしくは n—ブチルなどの Ci— eアルキル基、 例えば、 シク 口ペンチル、 シクロへキシルなどの C 3— 8シクロアルキル基、 例えば、 フエ二 ル、 α—ナフチルなどの C6— 12ァリール基、 例えば、 ベンジル、 フエネチルな どのフエ二ルー Ci_2アルキル基もしくはひ—ナフチルメチルなどの α—ナフ チル—じ卜 2アルキル基などの C7— 14ァラルキル基のほか、 経口用エステルと して汎用されるビバ口ィルォキシメチル基などが用いられる。
本発明の蛋白質が C末端以外に力ルポキシル基 （またはカルポキシレート） を有している場合、 力ルポキシル基がアミド化またはエステル化されているも のも本発明の蛋白質に含まれる。 この場合のエステルとしては、 例えば上記し た C末端のエステルなどが用いられる。
さらに、 本発明の蛋白質には、 上記した蛋白質において、 N末端のメチォ二 ン残基のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基などの C2_6ァ ルカノィル基などの ァシル基など） で保護されているもの、 N端側が生 体内で切断され生成したグル夕ミル基がピログルタミン酸化したもの、 分子内 のアミノ酸の側鎖上の置換基 （例えば、 — OH、 一 SH、 アミノ基、 イミダゾ ール基、 インド一ル基、 グァニジノ基など） が適当な保護基 （例えば、 ホルミ ル基、 ァセチル基などの C2_6アルカノィル基などの ァシル基など）で保 護されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白 質なども含まれる。
本発明の蛋白質の具体例としては、 例えば、 配列番号： 1で表わされるアミ ノ酸配列を含有するヒト由来 （より好ましくはヒト脳由来） の蛋白質などがあ げられる。
本発明の蛋白質の部分ペプチド（以下、部分ペプチドと略記する場合がある） としては、 前記した本発明の蛋白質の部分ペプチドであれば何れのものであつ てもよいが、 例えば、 本発明の蛋白質分子のうち、 細胞膜の外に露出している 部位であって、 レセプ夕一結合活性を有するものなどが用いられる。
具体的には、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質の部分 ぺプチドとしては、図 7で示される疎水性プロット解析において細胞外領域 (親 水性（Hydrophi l i c)部位） であると分析された部分を含むペプチドである。 ま た、 疎水性（Hydrophobi c)部位を一部に含むペプチドも同様に用いることがで きる。 個々のドメインを個別に含むペプチドも用い得るが、 複数のドメインを 同時に含む部分のぺプチドでも良い。
本発明の部分ペプチドのアミノ酸の数は、 前記した本発明の蛋白質の構成ァ ミノ酸配列のうち少なくとも 2 0個以上、 好ましくは 5 0個以上、 より好まし くは 1 0 0個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい。
実質的に同一のアミノ酸配列とは、 これらアミノ酸配列と約 5 0 %以上、 好 ましくは約 7 0 %以上、 より好ましくは約 8 0 %以上、 さらに好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアミノ酸配列を示す。 ここで、 「実質的に同質の活性」 とは、 前記と同意義を示す。 「実質的に同 質の活性」 の測定は前記と同様に行なうことができる。
また、本発明の部分ペプチドは、上記アミノ酸配列中の 1または 2個以上（好 ましくは、 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1または 2個） ） のアミ ノ酸が欠失し、 または、 そのアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜2 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1 または 2個） ） のアミノ酸が付加し、 または、 そのアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜1 0個程度、 より好ましくは 1〜5個程度、 さら に好ましくは数個 （1または 2個） ） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されて いてもよい。
また、 本発明の部分ペプチドは C末端が通常カルボキシル基 （一 C O OH) またはカルポキシレート （一 C O O— ) であるが、 前記した本発明の蛋白質の ごとく、 C末端がアミド （一 C O NH 2) またはエステル （一 C O O R) であ つてもよい。
さらに、 本発明の部分ペプチドには、 前記した本発明の蛋白質と同様に、 N 末端のメチォニン残基のァミノ基が保護基で保護されているもの、 N端側が生 体内で切断され生成した Ginがピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸 の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、 あるいは糖鎖が結合 したいわゆる糖べプチドなどの複合べプチドなども含まれる。
また、 本発明の部分ペプチドは C末端が通常カルボキシル基 （一 C O O H) またはカルボキシレート（—C O O—) であるが、 前記した本発明の蛋白質のご とく、 C末端がアミド （一 C〇NH 2) またはエステル （一 C O O R) であつ てもよい。
本発明の蛋白質またはその部分べプチドの塩としては、 とりわけ生理学的に 許容される酸付加塩が好ましい。 この様な塩としては、 例えば無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩 などが用いられる。
本発明の蛋白質またはその塩は、 前述したヒ卜や哺乳動物の細胞または組織 から自体公知の蛋白質の精製方法によって製造することもできるし、 後述する 本発明の蛋白質をコードする D N Aを含有する形質転換体を培養することによ つても製造することができる。 また、 後述の蛋白質合成法またはこれに準じて 製造することもできる。
ヒトゃ哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、 ヒトゃ哺乳動物の組織 または細胞をホモジナイズした後、 酸などで抽出を行ない、 該抽出液を逆相ク 口マトグラフィー、 イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー を組み合わせることにより精製単離することができる。
本発明の蛋白質、 その部分ペプチドもしくはそれらの塩またはそれらのアミ ド体の合成には、 通常市販の蛋白質合成用樹脂を用いることができる。 そのよ うな樹脂としては、 例えば、 クロロメチル樹脂、 ヒドロキシメチル樹脂、 ベン ズヒドリルァミン樹脂、 アミノメチル樹脂、 4一べンジルォキシベンジルアル コール樹脂、 4一メチルベンズヒドリルァミン樹脂、 PAM樹脂、 4ーヒドロキシ メチルメチルフエニルァセトアミドメチル樹脂、 ポリアクリルアミド樹脂、 4 ― ( 2 '， 4' -ジメトキシフエ二ル一ヒドロキシメチル） フエノキシ樹脂、 4 _ (2'， 4' -ジメトキシフエ二ル一 Fmocアミノエチル） フエノキシ樹脂などを挙げ ることができる。 このような樹脂を用い、 α _アミノ基と側鎖官能基を適当に 保護したアミノ酸を、 目的とする蛋白質の配列通りに、 自体公知の各種縮合方 法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後に樹脂から蛋白質を切り出すと同 時に各種保護基を除去し、 さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィ ド結合形成 反応を実施し、 目的の蛋白質またはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、 蛋白質合成に使用できる各種活性 化試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミド類がよい。 カルポジィ ミド類としては、 DC (：、 N, Ν' -ジイソプロピルカルポジイミド、 Ν-ェチル -Ν' - (3- ジメチルァミノプロリル） カルポジイミドなどが用いられる。 これらによる活 性化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 HOBt, HOOBt)とともに保護アミノ酸を 直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物または HOB tエステルあるいは H00B t エステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加す ることができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、 蛋白質縮 合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。 例えば、 N, N—ジメチルホルムアミド， N， N—ジメチルァセトアミド， N—メチル ピロリドンなどの酸アミド類、 塩化メチレン， クロ口ホルムなどのハロゲン化 炭化水素類、 トリフルォロエタノールなどのアルコール類、 ジメチルスルホキ シドなどのスルホキシド類、 ピリジン， ジォキサン， テトラヒドロフランなど のエーテル類、 ァセトニトリル， プロピオ二トリルなどの二トリル類、 酢酸メ チル， 酢酸ェチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用い られる。 反応温度は蛋白質結合形成反応に使用され得ることが知られている範 囲から適宜選択され、 通常約一 2 0 ° (：〜 5 0 °Cの範囲から適宜選択される。 活 性化されたァミノ酸誘導体は通常 1 . 5〜 4倍過剰で用いられる。ニンヒドリン 反応を用いたテストの結果、 縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うこと なく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。 反応を 繰り返しても十分な縮合が得られないときには、 無水酢酸またはァセチルイミ ダゾ一ルを用いて未反応ァミノ酸をァセチル化することができる。
原料のァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 Bo 夕一シャリ一ペンチル ォキシカルボニル、 イソボルニルォキシカルポニル、 4ーメトキシベンジルォ キシカルボニル、 Π- Z、 Br-Z、 ァダマンチルォキシカルボニル、 トリフルォロ ァセチル、 フタロイル、 ホルミル、 2—二トロフエニルスルフエニル、 ジフエ ニルホスフイノチオイル、 Fmocなどが用いられる。
カルボキシル基は、 例えば、 アルキルエステル化 （例えば、 メチル、 ェチル、 プロピル、 ブチル、 夕ーシャリーブチル、 シクロペンチル、 シクロへキシル、 シクロへプチル、 シクロォクチル、 2—ァダマンチルなどの直鎖状、 分枝状も しくは環状アルキルエステル化） 、 ァラルキルエステル化 （例えば、 ベンジル エステル、 4—ニトロべンジルエステル、 4ーメトキシベンジルエステル、 4 一クロ口べンジルエステル、 ベンズヒドリルエステル化） 、 フエナシルエステ ル化、 ベンジルォキシカルボニルヒドラジド化、 ターシャリーブトキシカルボ ニルヒドラジド化、 トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。 セリンの水酸基は、 例えば、 エステル化またはエーテル化によって保護する ことができる。 このエステル化に適する基としては、 例えば、 ァセチル基など の低級アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジルォキシカル ポニル基、 エトキシカルポニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられ る。 また、 エーテル化に適する基としては、 例えば、 ベンジル基、 テトラヒド ロビラニル基、 t-ブチル基などである。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 例えば、 Bz l、 Cl 2-Bz l、 2—二トロベンジル、 Br- Z、 夕一シャリーブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、 例えば、 Tos、 4 -メトキシ- 2, 3, 6-卜リメチルベンゼンスルホニル、 DNP、 ベンジルォキシメチル、 Bum、 Boc、 Trt、 Fmocなどが用いられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応する酸無 水物、 アジド、 活性エステル 〔アルコール （例えば、 ペンタクロロフエノ一ル、 2， 4， 5-トリクロ口フエノール、 2, 4 -ジニトロフエノール、 シァノメチルアルコ ール、 パラニトロフエノール、 H0NB、 N-ヒドロキシスクシミド、 N-ヒドロキシ フタルイミド、 HOBt) とのエステル〕 などが用いられる。 原料のァミノ基の活 性化されたものとしては、 例えば、 対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 例えば、 P d—黒あるいは P d -炭素な どの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メ 夕ンスルホン酸、 トリフルォロメ夕ンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるいは これらの混合液などによる酸処理や、 ジイソプロピルェチルァミン、 トリェチ ルァミン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニア 中ナトリウムによる還元なども用いられる。 上記酸処理による脱離反応は、 一 般に約一 2 0 °C〜4 0 °Cの温度で行なわれるが、 酸処理においては、 例えば、 ァニソ一ル、 フエノール、 チオアニソール、 メタクレゾ一ル、 パラクレゾール、 ジメチルスルフイ ド、 1, 4-ブタンジチオール、 1， 2 -エタンジチオールなどのよ うなカチオン捕捉剤の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダゾ一ル保 護基として用いられる 2， 4-ジニト口フエニル基はチォフエノール処理により除 去され、 トリブトファンのィンドール保護基として用いられるホルミル基は上 記の 1, 2-エタンジチオール、 1, 4-ブタンジチオールなどの存在下の酸処理によ る脱保護以外に、 希水酸化ナトリウム溶液、 希アンモニアなどによるアルカリ 処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、 およびその保 護基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段 から適宜選択しうる。
蛋白質のアミド体を得る別の方法としては、 例えば、 まず、 カルボキシ末端 アミノ酸のひ一力ルポキシル基をアミド化して保護した後、 アミノ基側にぺプ チド鎖を所望の鎖長まで延ばした後、 該ペプチド鎖の N末端のひ一ァミノ基の 保護基のみを除いた蛋白質と C末端の力ルポキシル基の保護基のみを除去した 蛋白質とを製造し、 この両蛋白質を上記したような混合溶媒中で縮合させる。 縮合反応の詳細については上記と同様である。 縮合により得られた保護蛋白質 を精製した後、 上記方法によりすベての保護基を除去し、 所望の粗蛋白質を得 ることができる。 この粗蛋白質は既知の各種精製手段を駆使して精製し、 主要 画分を凍結乾燥することで所望の蛋白質のアミド体を得ることができる。
蛋白質のエステル体を得るには、 例えば、 カルポキシ末端アミノ酸の α—力 ルポキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、 蛋白 質のアミド体と同様にして、 所望の蛋白質のエステル体を得ることができる。 本発明の蛋白質の部分ペプチドまたはその塩は、 自体公知のペプチドの合成 法に従って、 あるいは本発明の蛋白質を適当なぺプチダ一ゼで切断することに よって製造することができる。 ペプチドの合成法としては、 例えば、 固相合成 法、 液相合成法のいずれによっても良い。 すなわち、 本発明の蛋白質を構成し 得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、 生成物が保護基 を有する場合は保護基を脱離することにより目的のぺプチドを製造することが できる。 公知の縮合方法や保護基の脱離としては、 例えば、 以下の①〜⑤に記 載された方法が挙げられる。
ΦΜ. Bodanszky および M. A. Ondet t ペプチド シンセシス （Pept i de Synthes i s) , Intersc ience Publ i shers, New York (1966年)
② Schroederおよび Luebke、 ザペプチド（The Pept i de) , Academi c Press, New York (1965年)
③泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株） （1975年）
④矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 蛋白質の化学 IV、 205、 (1977 年）
⑤矢島治明監修、 続医薬品の開発 第 14巻 ペプチド合成広川書店
また、 反応後は通常の精製法、 たとえば、 溶媒抽出 ·蒸留，カラムクロマト グラフィー ·液体クロマトグラフィー ·再結晶などを組み合わせて本発明の部 分ペプチドを精製単離することができる。 上記方法で得られる部分ペプチドが 遊離体である場合は、 公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、 逆に塩で得られた場合は、 公知の方法によって遊離体に変換することができる。 本発明の蛋白質をコードする D NAとしては、 前述した本発明の蛋白質をコ —ドする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。 また、 ゲノム D NA、 ゲノム D NAライブラリー、 前記した細胞 ·組織由来の c D N A、 前記した細胞 ·組織由来の c D N Aライブラリ一、 合成 D N Aのいずれで もよい。 ライブラリ一に使用するベクターは、 バクテリオファージ、 プラスミ ド、 コスミド、ファ一ジミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞 · 組織より total R NAまたは mR NA画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcr iptase Polymerase Chain Reac t ion (以下、 R T- P C R法と略称する） によって増幅することもできる。
具体的には、 本発明の蛋白質をコードする D NAとしては、 例えば、 配列番 号： 2または配列番号： 3で表わされる塩基配列を含有する D N A、 または配 列番号： 2または配列番号： 3で表わされる塩基配列を有する D NAとハイス トリンジェン卜な条件下でハイブリダィズする D N Aを有し、 本発明の蛋白質 と実質的に同質の活性 （例、 リガンド結合活性、 シグナル情報伝達作用など） を有する蛋白質をコードする D N Aであれば何れのものでもよい。
配列番号： 2または配列番号： 3で表わされる塩基配列を有する D N Aとハ イストリンジェントな条件下でハイブリダイズする D N Aとしては、 例えば、 配列番号： 2または配列番号： 3で表わされる塩基配列と約 9 0 %以上、 好ま しくは約 9 5 %以上、 より好ましくは約 9 8 %以上の相同性を有する塩基配列 を含有する D N Aなどが用いられる。
ハイブリダィゼーシヨンは、 自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例 えば、 モレキュラー ·クロ一ニング（Mol ecu l ar C l oni ng) 2 nd (J. Sambrook et al. , Co l d Spr i ng Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行な うことができる。 また、 市販のライブラリーを使用する場合、 添付の使用説明 書に記載の方法に従って行なうことができる。 より好ましくは、 ハイストリン ジェン卜な条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェン卜な条件とは、 例えば、 ナトリウム濃度が約 1 9〜4 0 mM、 好ましくは約 1 9〜2 O mMで、 温度が約 5 0〜7 0 °C、 好ましくは約 6 0〜6 5 °Cの条件を示す。 特に、 ナトリウム濃度が約 1 9 mMで温度が約 6 5 °Cの場合が最も好ましい。
より具体的には、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質を コードする D N Aとしては、 配列番号： 2または配列番号： 3で表わされる塩 基配列を有する D N Aがあげられる。
本発明の蛋白質をコ一ドする塩基配列を含有する、 または該塩基配列と相補 的な塩基配列の一部を含有してなるヌクレオチド （オリゴヌクレオチド） とは、 本発明の蛋白質またはその部分べプチドをコードする D N Aを包含するだけで はなく、 R NAをも包含する意味で用いられる。
本発明に従えば、 本発明の蛋白質遺伝子の複製又は発現を阻害することので きるアンチセンス · （オリゴ） ヌクレオチド （核酸） を、 クローン化したある いは決定された蛋白質をコードする塩基配列の塩基配列情報に基づき設計し、 合成しうる。 そうした （オリゴ） ヌクレオチド （核酸） は、 G蛋白質共役型蛋 白質遺伝子の R N Aと八イブリダィズすることができ、 該 R N Aの合成又は機 能を阻害することができるか、 あるいは G蛋白質共役型蛋白質関連 R N Aとの 相互作用を介して G蛋白質共役型蛋白質遺伝子の発現を調節 ·制御することが できる。 G蛋白質共役型蛋白質関連 R N Aの選択された配列に相補的な （オリ ゴ） ヌクレオチド、 及び G蛋白質共役型蛋白質関連 R NAと特異的にハイプリ ダイズすることができる （オリゴ） ヌクレオチドは、 生体内及び生体外で G蛋 白質共役型蛋白質遺伝子の発現を調節 ·制御するのに有用であり、 また病気な どの治療又は診断に有用である。 用語 「対応する」 とは、 遺伝子を含めたヌクレオチド、 塩基配列又は核酸の 特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。 ヌクレオ チド、 塩基配列又は核酸とペプチド （蛋白質） との間で 「対応する」 とは、 ヌ クレオチド （核酸） の配列又はその相補体から誘導される指令にあるペプチド (蛋白質） のアミノ酸を通常指している。 G蛋白質共役型蛋白質遺伝子の 5' 端ヘアピンループ、 5' 端 6—べ一スペア · リピート、 5 ' 端非翻訳領域、 ポ リペプチド翻訳開始コドン、 蛋白質コード領域、 ORF翻訳開始コドン、 3' 端非翻訳領域、 3' 端パリンドローム領域、 及び 3' 端ヘアピンループは好ま しい対象領域として選択しうるが、 G蛋白質共役型蛋白質遺伝子内の如何なる 領域も対象として選択しうる。
目的核酸と、 対象領域の少なくとも一部に相補的な （オリゴ） ヌクレオチド との関係は、 対象物とハイブリダィズすることができる （オリゴ） ヌクレオチ ドとの関係は、 「アンチセンス」 であるということができる。 アンチセンス ' (オリゴ） ヌクレオチドは、 2—デォキシー D—リポースを含有しているポリ デォキシヌクレオチド、 D—リポースを含有しているポリデォキシヌクレオチ ド、 プリン又はピリミジン塩基の N—グリコシドであるその他のタイプのポリ ヌクレオチド、 あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー （例え ば、 市販の蛋白質核酸及び合成配列特異的な核酸ポリマー） 又は特殊な結合を 含有するその他のポリマー （但し、 該ポリマ一は DNAや RNA中に見出され るような塩基のペアリナグゃ塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを 含有する） などが挙げられる。 それらは、 2本鎖 DNA、 1本鎖 DNA、 2本 鎖 RNA、 1本鎖 RNA、 さらに DNA： RNAハイブリッドであることがで き、 さらに非修飾ポリヌクレオチド又は非修飾オリゴヌクレオチド、 さらには 公知の修飾の付加されたもの、 例えば当該分野で知られた標識のあるもの、 キ ヤップの付いたもの、 メチル化されたもの、 1個以上の天然のヌクレオチドを 類縁物で置換したもの、 分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、 例えば非荷電 結合 （例えば、 メチルホスホネート、 ホスホトリエステル、 ホスホルアミデー ト、 力ルバメートなど） を持つもの、 電荷を有する結合又は硫黄含有結合 （例 えば、 ホスホロチォェ一ト、 ホスホロジチォエートなど） を持つもの、 例えば 蛋白質 （ヌクレアーゼ、 ヌクレア一ゼ ·インヒビター、 トキシン、 抗体、 シグ ナルペプチド、 ポリ— L一リジンなど） や糖 （例えば、 モノサッカライドなど） などの側鎖基を有しているもの、 イン夕一力レント化合物 （例えば、 ァクリジ ン、 プソラレンなど） を持つもの、 キレート化合物 （例えば、 金属、 放射活性 をもつ金属、 ホウ素、 酸化性の金属など） を含有するもの、 アルキル化剤を含 有するもの、 修飾された結合を持つもの （例えば、 ひァノマ一型の核酸など） であってもよい。 ここで 「ヌクレオシド」 、 「ヌクレオチド」 及び 「核酸」 と は、 プリン及びピリミジン塩基を含有するのみでなく、 修飾されたその他の複 素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。 こうした修飾物は、 メチル化 されたプリン及びピリミジン、 ァシル化されたプリン及びピリミジン、 あるい はその他の複素環を含むものであってよい。 修飾されたヌクレオチド及び修飾 されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、 例えば 1個以上の水 酸基がハロゲンとか、 脂肪族基などで置換されていたり、 あるいはエーテル、 ァミンなどの官能基に変換されていてよい。
本発明のアンチセンス核酸は、 R NA、 D NA、 あるいは修飾された核酸で ある。 修飾された核酸の具体例としては核酸の硫黄誘導体ゃチォホスフエ一卜 誘導体、 そしてポリヌクレオシドアミドゃオリゴヌクレオシドアミドの分解に 抵抗性のものが挙げられるが、 それに限定されるものではない。 本発明のアン チセンス核酸は次のような方針で好ましく設計されうる。 すなわち、 細胞内で のアンチセンス核酸をより安定なものにする、 ァンチセンス核酸の細胞透過性 をより高める、 目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、 そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性をより小さなものにする。 こうして修飾は当該分野で数多く知られており、例えば J. Kawakami e t al. , Phari Tech Japan, Vo l. 8, pp. 247, 1992 ; Vo l. 8, pp. 395, 1992 ; S. T. Crooke et al. ed. , Ant i sense Research and Appl i cat i ons, CRC Press, 1993 などに 開示がある。
本発明のアンチセンス核酸は、 変化せしめられたり、 修飾された糖、 塩基、 結合を含有していて良く、 リボゾーム、 ミクロスフエアのような特殊な形態で 供与されたり、 遺伝子治療により適用されたり、 付加された形態で与えられる ことができうる。 こうして付加形態で用いられるものとしては、 リン酸基骨格 の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、 細胞膜との 相互作用を高めたり、 核酸の取込みを増大せしめるような脂質 （例えば、 ホス ホリピッド、 コレステロールなど） といった粗水性のものが挙げられる。 付加 するに好ましい脂質としては、 コレステロールやその誘導体 （例えば、 コレス テリルクロ口ホルメート、 コール酸など） が挙げられる。 こうしたものは、 核 酸の 3 ' 端あるいは 5' 端に付着させることができ、 塩基、 糖、 分子内ヌクレ オシド結合を介して付着させることができうる。 その他の基としては、 核酸の 3' 端あるいは 5' 端に特異的に配置されたキャップ用の基で、 ェキソヌクレ ァーゼ、 RNa s eなどのヌクレア一ゼによる分解を阻止するためのものが挙 げられる。 こうしたキャップ用の基としては、 ポリエチレングリコール、 テト ラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水 酸基の保護基が挙げられるが、 それに限定されるものではない。
アンチセンス核酸の阻害活性は、 本発明の形質転換体、 本発明の生体内や生 体外の遺伝子発現系、 あるいは蛋白質の生体内や生体外の翻訳系を用いて調べ ることができる。 該核酸其れ自体公知の各種の方法で細胞に適用できる。
本発明の部分ペプチドをコードする DNAとしては、 前述した本発明の部分 ペプチドをコ一ドする塩基配列を含有するものであればいかなるものであって もよい。 また、 ゲノム DNA、 ゲノム DNAライブラリー、 前記した細胞 ·組 織由来の cDNA、 前記した細胞，組織由来の c DNAライブラリー、 合成 D N Aのいずれでもよい。 ライブラリ一に使用するべクタ一は、 バクテリオファ —ジ、 プラスミド、 コスミド、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また、 前記した細胞 ·組織より mRNA画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (以下、 R T- P C R法と略称する） によって増幅することもできる。
具体的には、 本発明の部分ペプチドをコードする DNAとしては、 例えば、 配列番号： 2または配列番号： 3で表わされる塩基配列を有する DN Aの部分 塩基配列を有する DNA、 または②配列番号： 2または配列番号： 3で表わさ れる塩基配列を有する DN Aとハイストリンジェントな条件下でハイプリダイ ズする DNAを有し、 本発明の蛋白質ペプチドと実質的に同質の活性 （例、 リ ガンド結合活性、 シグナル情報伝達作用など） を有する蛋白質をコードする D N Aの部分塩基配列を有する D N Aなどが用いられる。
配列番号： 2または配列番号： 3で表わされる塩基配列を有する DNAと八 イストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズする DNAとしては、 例えば、 配列番号： 2または配列番号： 3で表わされる塩基配列と約 90%以上、 好ま しくは約 95%以上、 より好ましくは約 98%以上の相同性を有する塩基配列 を含有する DN Aなどが用いられる。
本発明の蛋白質またはその部分ペプチド（以下、本発明の蛋白質と略記する） を完全にコ一ドする DN Aのクローニングの手段としては、 本発明の蛋白質を コードする DN Aの塩基配列の部分塩基配列を有する合成 DN Aプライマーを 用いて PC R法によって増幅するか、 または適当なベクターに組み込んだ DN Aを本発明の蛋白質の一部あるいは全領域をコードする DNA断片もしくは合 成 D N Aを用いて標識したものとのハイブリダイゼーシヨンによつて選別する ことができる。 ハイブリダィゼーシヨンの方法は、 例えば、 モレキュラー -ク ローニング（Molecular Cloning) 2nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうことができる。 また、 巿 販のライブラリ一を使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法に従って行 なうことができる。
DNAの塩基配列の変換は、 PCRや公知のキット、 例えば、 Mutan™-super Express Km (宝酒造 （株） ） 、 MutanTM-K (宝酒造 （株） ） 等を用いて、 0DA-LA PCR法や Gupped duplex法や Kunke 去等の自体公知の方法あるいはそれらに準じ る方法に従って行なうことができる。
クローン化された蛋白質をコードする DNAは目的によりそのまま、 または 所望により制限酵素で消化したり、 リンカ一を付加したりして使用することが できる。 該 DNAはその 5' 末端側に翻訳開始コドンとしての ATGを有し、 また 3' 末端側には翻訳終止コドンとしての TAA、 TGAまたは TAGを有 していてもよい。 これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、 適当な合成 D N Aアダプターを用いて付加することもできる。
本発明の蛋白質の発現べクタ一は、 例えば、 （ィ） 本発明の蛋白質をコード する DNAから目的とする DNA断片を切り出し、 （口） 該 DNA断片を適当 な発現べクタ一中のプロモーターの下流に連結することにより製造することが できる。
ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミド （例、 pBR 322， pBR 3 25， pUC 12, pUC 13) 、 枯草菌由来のプラスミド （例、 pUB 1 1 0， pTP 5, p C 194) 、 酵母由来プラスミド （例、 pSH19, p SH 15) 、 λファージなどのバクテリオファージ、 レトロウイルス， ワクシニア ウィルス， バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどの他、 pAl— 11、 p XT1、 pRc/CMV、 pR c/RS V, p c DNA I /N e o, p c DN A3. 1、 pRcZCMV2、 pR c/RS V (Invi trogen社） などが用いら れる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、 遺伝子の発現に用いる宿主に対 応して適切なプロモー夕一であればいかなるものでもよい。 例えば、 動物細胞 を宿主として用いる場合は、 SRひプロモーター、 SV40プロモーター、 H I V-LTRプロモーター、 CMVプロモーター、 H S V-TKプロモーターな どが挙げられる。
これらのうち、 CMVプロモーター、 S R αプロモーターなどを用いるのが 好ましい。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 t r pプロモーター、 l a cプロモ一ター、 r e cAプロモーター、 A PLプロモ一夕一、 l ppプロモ 一夕一などが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 SPOlプロモー夕一、 S P〇 2プロモーター、 p e n Pプロモーターなど、 宿主が酵母である場合は、 PH05プロモー夕一、 PGKプロモーター、 GAPプロモーター、 ADHプ 口モーターなどが好ましい。 宿主が昆虫細胞である場合は、 ポリヘドリンプロ モーター、 P 10プロモーターなどが好ましい。
発現ベクターには、 以上の他に、 所望によりェンハンサ一、 スプライシング シグナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカー、 SV40複製オリジン （以下、 SV40 o r iと略称する場合がある） などを含有しているものを用いること ができる。 選択マ一カーとしては、 例えば、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （以下、 d h f rと略称する場合がある） 遺伝子 〔メソトレキセート （MTX) 耐性〕 、 アンピシリン耐性遺伝子 （以下、 Amp1"と略称する場合がある） 、 ネオマイ シン耐性遺伝子 （以下、 Ne o1"と略称する場合がある、 G418耐性） 等が 挙げられる。 特に、 CHO (dh f r") 細胞を用いて d h f r遺伝子を選択 マーカ一として使用する場合、 目的遺伝子をチミジンを含まない培地によって も選択できる。
また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 本発明の蛋白質の N端 末側に付加する。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 PhoA ·シグナル配列、 0即 A ·シグナル配列などが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 ひ—アミラー ゼ ·シグナル配列、 サブチリシン ·シグナル配列などが、 宿主が酵母である場 合は、 MFひ ·シグナル配列、 SUC2 · シグナル配列など、 宿主が動物細胞 である場合には、 インシュリン · シグナル配列、 ひ—インタ一フエロン · シグ ナル配列、 抗体分子 ·シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明の蛋白質をコードする DN Aを含有するべ クタ一を用いて、 形質転換体を製造することができる。
宿主としては、 例えば、 ェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫細胞、 昆虫、 動物細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌の具体例としては、ェシエリヒア 'コリ（Escherichia col i) K 12 · DH 1 〔プロシージングズ ·ォブ ·ザ .ナショナル ·アカデミー ·ォ ブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスエー （Proc. Natl. Acad. Sci. US A) ， 60卷， 160 (1968)〕 ， JM103 〔ヌクイレック ·ァシッズ' リサーチ， （Nucleic Acids Research) , 9巻， 309 (1981)〕 ， J A2 21 〔ジャーナル ·ォブ ·モレキュラー ·バイオロジー （Journal of Molecular Biology)〕 ， 120巻， 517 (1978)〕 ， HB 101 〔ジャーナル.ォブ. モレキュラー 'バイオロジー， 41巻， 459 (1969)〕 ， C 600 〔ジェ ネティックス （Genetics) ， 39巻， 440 (1954)〕 などが用いられる。 バチルス属菌としては、 例えば、 バチルス ·サチルス （Bacillus subtilis) M I 1 14 〔ジーン， 24巻， 255 (1983)〕 ， 207— 21 〔ジャーナ ル'ォブ 'バイオケミストリ一 （Journal of Biochemistry) , 95巻， 87 (1 984)〕 などが用いられる。
酵母としては、 例えば、 サッカロマイセス セレピシェ （Saccharomyces cerevisiae) AH 22, AH22R— , ΝΑ 87- 1 1 A, DKD- 5 D, 2 0B— 12、 シゾサッカロマイセス ボンべ (Schizosaccharomyces pombe) N CYC 1913, NCYC 2036、 ピキア パストリス （Pichia pastoris) などが用いられる。
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが Ac NPVの場合は、 夜盗蛾の幼虫 由来株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell ； S f細胞) 、 Trichoplusia ni の中腸由来の MG 1細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High Five™細胞、 Mamestra brassicae由来の細胞または Est igmena acrea由来の細胞などが用いら れる。 ウィルスが BmNP Vの場合は、 蚕由来株化細胞 （Bombyxmori N； Bm N細胞） などが用いられる。 該 S f細胞としては、 例えば、 S f 9細胞 （ATCC CRL1711) S f 21細胞（以上、 Vaughn, J. L.ら、 イン ·ヴイボ（In Vivo) , 13, 213-217, (1977)) などが用いられる。
昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、 ネィチヤ 一 (Nature) ， 315巻， 592 (1985)〕 。
動物細胞としては、 例えば、 サル細胞 COS— 7， Vero, チャイニーズハム スター細胞 CHO (以下、 CHO細胞と略記） ， dh f r遺伝子欠損チヤィニ —ズハムスター細胞 CHO (以下、 CHO (d h f r") 細胞と略記） ， マウ ス L細胞， マウス AtT— 20， マウスミエ口一マ細胞， ラット GH3， ヒト FL細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌を形質転換するには、 例えば、 プロシ一ジングズ *ォブ ' ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンジィズ ·ォブ ·ザ ·ュ一エスェ
― (Pro Natl. Acad. Sci. USA) ， 69巻， 21 10 (1972)やジーン (Gene) , 17巻， 107 ( 1982 )などに記載の方法に従って行なうことが できる。 バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー 'アンド · ジェ不ラル ·ン工不ティックス (Molecular & General Genet ics) ， 168巻，
11 1 (1979)などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、メッソズ'イン'ェンザィモ口ジー（Me t hods inEnzymology)， 194巻， 182— 187 (1991) 、 プロシ一ジングズ · ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユー エスエー （Pro Natl. Acad. Sci. USA) , 75巻， 1929 (1978) などに記載の方法に従つて行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、 例えば、 バイオノテクノロジ一 (Bio/Technology) , 6, 47 - 55 (1988)) などに記載の方法に従って行なうことが できる。
動物細胞を形質転換するには、 例えば、 細胞工学別冊 8 新 細胞工学実験 プロトコ一ル. 263— 267 ( 1 995) (秀潤社発行） 、 ヴィロロジ一 (Virology) , 52巻， 456 ( 1973 )に記載の方法に従って行なうことが できる。
このようにして、 G蛋白質共役型蛋白質をコードする DNAを含有する発現 ベクタ一で形質転換された形質転換体が得られる。
宿主がェシエリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培 養に使用される培地としては液体培地が適当であり、 その中には該形質転換体 の生育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物その他が含有せしめられる。 炭素源と しては、 例えば、 グルコース、 デキストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖など、 窒素 源としては、 例えば、 アンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コーンスチープ · リカー、 ペプトン、 カゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液などの無機または 有機物質、 無機物としては、 例えば、 塩化カルシウム、 リン酸二水素ナ卜リウ ム、 塩化マグネシウムなどが挙げられる。 また、 酵母エキス、 ビタミン類、 生 長促進因子などを添加してもよい。 培地の p Hは約 5〜 8が望ましい。
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えば、 グルコース、 カザ ミノ酸を含む M 9培地 〔ミラ一 （Miller) , ジャーナル'ォブ ·ェクスぺリメ ンッ -イン ·モレキュラー -ジェネティックス (Journal of Experiments in Molecular Genet ics) ， 43 1—433， Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1 972]が好ましい。 ここに必要によりプロモ一夕一を効率よく働かせ るために、 例えば、 3 i3—インドリル アクリル酸のような薬剤を加えること ができる。 宿主がェシエリヒア属菌の場合、 培養は通常約 1 5〜43°Cで約 3〜24時間行ない、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 30〜 40 °Cで約 6〜 24時間行 ない、 必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 バーク ホールダ一（Burkholder)最小培地〔Bostian, K. し ら、 「プロシ一ジングズ · ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユー エスェ一 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 77巻， 4505 (1 980)〕 や 0. 5 %カザミノ酸を含有する SD培地 〔Bitter, G. A. ら、 「プロシージン グズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·ァカデミ一 ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ · ユーエスエー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 8 1卷， 5330 ( 1 98 4) 〕 が挙げられる。 培地の pHは約 5〜 8に調整するのが好ましい。 培養は 通常約 20 〜 35 °Cで約 24〜 72時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を 加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、 培地としては、 Grace' s Insect Medium (Grace, T. C. C. ,ネイチヤー (Nature) , 195, 788 (1962)) に非動化した 10 %ゥシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。 培地の pHは約 6. 2〜6. 4に調整するのが好ましい。 培養は通常約 27 °C で約 3〜 5日間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 約 5〜20%の胎児牛血清を含む MEM培地 〔サイエンス （Science) ， 122巻， 501 (1952)) , DMEM培地 〔ヴイロロジ一 （Virology) ， 8巻， 39 6 (1959)〕， RPMI 1640培地〔ジャーナル ·ォブ ·ザ ·ァメリカン ' メディカル ' アソシエーション (The Journal of the American Medical Association) 199巻， 519 (1967)〕 ， 199培地 〔プロシージング' ォブ'ザ 'ソサイエティ ·フォ一 ·ザ'バイオロジカル ·メディスン（Proceeding of the Society for the Biological Medicine) ， 73巻， 1 (1950)〕 な どが用いられる。 pHは約 6〜8であるのが好ましい。 培養は通常約 30で〜 40°Cで約 15〜60時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、 形質転換体の細胞内、 細胞膜または細胞外に本発明の G 蛋白質共役型蛋白質を生成せしめることができる。
上記培養物から本発明の蛋白質を分離精製するには、 例えば、 下記の方法に より行なうことができる。
本発明の蛋白質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、 培養後、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩衝液に懸濁し、 超音波、 リゾチームおよび Zまたは凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊した のち、 遠心分離やろ過により蛋白質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられ る。 緩衝液の中に尿素や塩酸グァニジンなどの蛋白質変性剤や、 トリトン X— 100TMなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中に蛋白質が分泌さ れる場合には、 培養終了後、 それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清と を分離し、 上清を集める。
このようにして得られた培養上清、 あるいは抽出液中に含まれる蛋白質の精 製は、 自体公知の分離 ·精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。 こ れらの公知の分離、 精製法としては、 塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を利用す る方法、 透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法、 および SDS—ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、 イオン交換クロ マトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、 ァフィ二ティーク口マトダラ フィ一などの特異的親和性を利用する方法、 逆相高速液体ク口マトグラフィー などの疎水性の差を利用する方法、 等電点電気泳動法などの等電点の差を利用 する方法などが用いられる。
かくして得られる蛋白質が遊離体で得られた場合には、 自体公知の方法ある いはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、 逆に塩で得られた場 合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、 遊離体または他の塩 に変換することができる。
なお、 組換え体が産生する蛋白質を、 精製前または精製後に適当な蛋白修飾 酵素を作用させることにより、 任意に修飾を加えたり、 ポリペプチドを部分的 に除去することもできる。 蛋白修飾酵素としては、 例えば、 トリプシン、 キモ トリプシン、 アルギニルエンドべプチダーゼ、 プロテインキナーゼ、 グリコシ ダ一ゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明の蛋白質またはその塩の活性は、 標識したリガンド との結合実験および特異抗体を用いたェンザィムィムノアッセィなどにより測 定することができる。
本発明の蛋白質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体は、 本発 明の蛋白質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩を認識し得る抗体であれば、 ポリクロ一ナル抗体、 モノクローナル抗体の何れであってもよい。
本発明の蛋白質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩 （以下、 本発明の蛋白 質等と略記する） に対する抗体は、 本発明の蛋白質等を抗原として用い、 自体 公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
( a ) モノクロナール抗体産生細胞の作製
本発明の蛋白質等は、 哺乳動物に対して投与により抗体産生が可能な部位に それ自体あるいは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能 を高めるため、 完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバント を投与してもよい。 投与は通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計 2〜1 0回程度行な われる。 用いられる哺乳動物としては、 例えば、 サル、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモ ット、 マウス、 ラッ卜、 ヒッジ、 ャギが挙げられるが、 マウスおよびラットが 好ましく用いられる。 モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、 抗原を免疫された温血動物、 例えば、 マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜 5日後に 脾臓またはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と 融合させることにより、 モノクローナル抗体産生ハイプリドーマを調製するこ とができる。 抗血清中の抗体価の測定は、 例えば、 後記の標識化した本発明の 蛋白質等と抗血清とを反応させたのち、 抗体に結合した標識剤の活性を測定す ることにより行なうことができる。 融合操作は既知の方法、 例えば、 ケ一ラー とミルスタインの方法 〔ネィチヤ一 （Nature)、 256巻、 495頁 （1975 年） 〕 に従い実施することができる。 融合促進剤としては、 例えば、 ポリェチ レングリコール （P EG) やセンダイウィルスなどが挙げられるが、 好ましく は P EGが用いられる。
骨髄腫細胞としては、 例えば、 NS— 1、 P 3U1、 SP 2Z0などが挙げ られるが、 P 3U1が好ましく用いられる。 用いられる抗体産生細胞 （脾臓細 胞） 数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 ： 1~20 ： 1程度であり、 PE G (好ましくは、 PEG1000〜PEG6000) が 10〜80 %程度の濃 度で添加され、 約 20〜 40 °C、 好ましくは約 30〜 37 °Cで約 1〜 10分間 インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイプリドーマのスクリ一ニングには種々の方法が 使用できるが、 例えば、 本発明の蛋白質等抗原を直接あるいは担体とともに吸 着させた固相 （例、 マイクロプレート） にハイブリド一マ培養上清を添加し、 次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロプリン抗体 （細胞融合に用い られる細胞がマウスの場合、 抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる） また はプロテイン Aを加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、 抗免疫グロブリン抗体またはプロテイン Aを吸着させた固相にハイプリドーマ 培養上清を添加し、 放射性物質や酵素などで標識した本発明の蛋白質等を加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、 自体公知あるいはそれに準じる方法に従って 行なうことができるが、 通常は HAT (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チ ミジン） を添加した動物細胞用培地などで行なうことができる。 選別および育 種用培地としては、 ハイプリドーマが生育できるものならばどのような培地を 用いても良い。 例えば、 1〜2 0 %、 好ましくは 1 0〜 2 0 %の牛胎児血清を 含む R P M I 1 6 4 0培地、 1〜1 0 %の牛胎児血清を含む G I T培地（和光 純薬工業 （株） ) またはハイプリドーマ培養用無血清培地 （S F M— 1 0 1、 日水製薬 （株） ） などを用いることができる。 培養温度は、 通常 2 0〜4 0 °C、 好ましくは約 3 7 °Cである。 培養時間は、 通常 5日〜 3週間、 好ましくは 1週 間〜 2週間である。 培養は、 通常 5 %炭酸ガス下で行なうことができる。 ハイ プリドーマ培養上清の抗体価は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして 測定できる。
( b ) モノクロナール抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、 通常のポリクローナル抗体の分離精製と 同様に免疫グロブリンの分離精製法 〔例、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等電点 沈殿法、 電気泳動法、 イオン交換体 （例、 D E A E ) による吸脱着法、 超遠心 法、 ゲルろ過法、 抗原結合固相またはプロテイン Aあるいはプロテイン Gなど の活性吸着剤により抗体のみを採取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精 製法〕 に従って行なうことができる。
〔ポリクロ一ナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、 それ自体公知あるいはそれに準じる方法に したがって製造することができる。 例えば、 免疫抗原 （本発明の蛋白質等の抗 原） とキャリア一蛋白質との複合体をつくり、 上記のモノクローナル抗体の製 造法と同様に哺乳動物に免疫を行ない、 該免疫動物から本発明の蛋白質等に対 する抗体含有物を採取して、 抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。 哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合 体に関し、 キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、 キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、 どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、 例えば、 ゥシ血清アルブ ミン、 ゥシサイログロブリン、 キーホール · リンペット ·へモシァニン等を重 量比でハプテン 1に対し、約 0 . 1〜2 0、好ましくは約 1〜5の割合でカプル させる方法が用いられる。
また、 ハプテンとキャリアーの力プリングには、 種々の縮合剤を用いること ができるが、 グルタルアルデヒドやカルポジイミド、 マレイミド活性エステル、 チオール基、 ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。 縮合生成物は、 温血動物に対して、 抗体産生が可能な部位にそれ自体あるい は担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投与してもよ い。 投与は、 通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計約 3〜1 0回程度行なうことが できる。
ポリクローナル抗体は、 上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、 腹水など、 好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリク口一ナル抗体価の測定は、 上記の血清中の抗体価の測定と 同様にして測定できる。 ポリクローナル抗体の分離精製は、 上記のモノクロ一 ナル抗体の分離精製と同様の免疫グロプリンの分離精製法に従って行なうこと ができる。 本発明の蛋白質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩、 およびそれらをコー ドする D N Aは、 ①本発明の蛋白質に対するリガンドの決定方法、 ②抗体およ び抗血清の入手、 ③組換え型蛋白質の発現系の構築、 ④同発現系を用いたレセ プ夕一結合アツセィ系の開発と医薬品候補化合物のスクリーニング、 ⑤構造的 に類似したリガンド · レセプ夕一との比較にもとづいたドラッグデザインの実 施、 ⑥遺伝子診断におけるプローブや P C Rプライマーを作成するための試薬、 ⑦トランスジエニック動物の作製または⑧遺伝子予防 ·治療剤等の医薬などと して用いることができる。
特に、 本発明の組換え型蛋白質の発現系を用いたレセプ夕一結合アツセィ系 を用いることによって、 ヒトゃ哺乳動物に特異的な G蛋白質共役型レセプ夕一 に対するリガンドの結合性を変化させる化合物 （例、 ァゴニスト、 アン夕ゴニ ストなど） をスクリーニングすることができ、 該ァゴ二ストまたはアンタゴニ ストを各種疾病の予防 ·治療剤などとして使用することができる。
本発明の蛋白質、 部分ペプチドまたはそれらの塩 （以下、 本発明の蛋白質等 と略記する場合がある） 、 本発明の蛋白質またはその部分ペプチドをコードす る DNA (以下、 本発明の DNAと略記する場合がある） および本発明の蛋白 質等に対する抗体 （以下、 本発明の抗体と略記する場合がある） の用途につい て、 以下に具体的に記載する。
(1) 本発明の蛋白質に対するリガンド （ァゴ二スト） の決定方法
本発明の蛋白質もしくはその塩または本発明の部分べプチドもしくはその塩 は、 本発明の蛋白質またはその塩に対するリガンド （ァゴ二スト） を探索し、 または決定するための試薬として有用である。
すなわち、 本発明は、 本発明の蛋白質もしくはその塩または本発明の部分べ プチドもしくはその塩と、 試験化合物とを接触させることを特徴とする本発明 の蛋白質に対するリガンドの決定方法を提供する。
試験化合物としては、 公知のリガンド （例えば、 アンギオテンシン、 ボンべ シン、 カナピノイド、 コレシストキニン、 グルタミン、 セロトニン、 メラトニ ン、 ニューロペプチド Y、 ォピオイド、 プリン、 バソプレツシン、 ォキシトシ ン、 PACAP、 セクレチン、 グルカゴン、 カルシトニン、 アドレノメジユリ ン、 ソマトス夕チン、 GHRH、 CRF、 ACTH、 GRP、 PTH、 V I P (バソアクティブ インテスティナル アンド リレイテッド ポリべプチ ド） 、 ソマトス夕チン、 ドーパミン、 モチリン、 アミリン、 ブラジキニン、 C GRP (カルシトニンジーンリレーティッドペプチド） 、 ロイコトリェン、 パ ンクレアスタチン、 プロスタグランジン、 トロンポキサン、 アデノシン、 アド レナリン、 aおよび] 3—ケモカイン （chemokine) (例えば、 I L一 8、 GRO ひ、 GR〇)3、 GROァ、 NAP— 2、 ENA_78、 PF4、 I P 10、 G CP- 2, MCP— 1、 HC 14、 MCP— 3、 1—309、 ΜΙ Ρ 1 α、 M I P— l i3、 RANTESなど） 、 エンドセリン、 ェンテロガストリン、 ヒス 夕ミン、 ニューロテンシン、 TRH、 パンクレアティックポリぺプ夕イド、 ガ ラニン、 ΜΠ1またはその哺乳動物のホモログなどがあげられ、 またその他に、 例えば、 ヒトまたは哺乳動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ブタ、 ゥシ、 ヒッジ、 サルなど） の組織抽出物、 細胞培養上清などが用いられる。 例えば、 該組織抽 出物、 細胞培養上清などを本発明の蛋白質に添加し、 細胞刺激活性などを測定 しながら分画し、 最終的に単一のリガンドを得ることができる。
リガンドがぺプチド性リガンドである場合、 該リガンドをリガンドぺプチド と称することがある。 また、 リガンドペプチドが前駆体として発現し、 シグナ ルぺプチドが除去されて成熟体となる場合、 それぞれをリガンド前駆体べプチ ドおよびリガンド成熟体べプチドと称することがあるが、 両者を総称して単に リガンドペプチドと称することもある。
具体的には、 本発明のリガンド決定方法は、 本発明の蛋白質、 その部分ぺプ チドもしくはそれらの塩を用いるか、 または組換え型蛋白質の発現系を構築し、 該発現系を用いたレセプ夕一結合アツセィ系を用いることによって、 本発明の 蛋白質に結合して細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン 遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシ トールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o s活 性化、 P Hの低下などを促進する活性または抑制する活性）を有する化合物（例 えば、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物など） またはその塩を決定する方法である。
本発明のリガンド決定方法においては、 本発明の蛋白質またはその部分ぺプ チドと試験化合物とを接触させた場合の、 例えば、 該蛋白質または該部分ぺプ チドに対する試験化合物の結合量や、 細胞刺激活性などを測定することを特徴 とする。
より具体的には、 本発明は、 ①標識した試験化合物を、 本発明の蛋白質もし くはその塩または本発明の部分べプチドもしくはその塩に接触させた場合にお ける、 標識した試験化合物の該蛋白質もしくはその塩、 または該部分ペプチド もしくはその塩に対する結合量を測定することを特徴とする本発明の蛋白質ま たはその塩に対するリガンドの決定方法、 ②標識した試験化合物を、 本発明の蛋白質を含有する細胞または該細胞の膜画 分に接触させた場合における、 標識した試験化合物の該細胞または該膜画分に 対する結合量を測定することを特徴とする本発明の蛋白質またはその塩に対す るリガンドの決定方法、
③標識した試験化合物を、 本発明の蛋白質をコードする DNAを含有する形質 転換体を培養することによって細胞膜上に発現した蛋白質に接触させた場合に おける、 標識した試験化合物の該蛋白質またはその塩に対する結合量を測定す ることを特徴とする本発明の蛋白質に対するリガンドの決定方法、
④試験化合物を、 本発明の蛋白質を含有する細胞に接触させた場合における、 蛋白質を介した細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊 離、 細胞内 C a 2+遊離、 細胞内 c AMP生成、 細胞内 c GMP生成、 イノシト 一ルリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o sの活 性化、 pHの低下などを促進する活性または抑制する活性など） を測定するこ とを特徴とする本発明の蛋白質またはその塩に対するリガンドの決定方法、 お よび
⑤試験化合物を、 本発明の蛋白質をコードする DNAを含有する形質転換体を 培養することによって細胞膜上に発現した蛋白質に接触させた場合における、 蛋白質を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊 離、 細胞内 C a2+遊離、 細胞内 c AMP生成、 細胞内 c GMP生成、 イノシト ールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一： f o sの活 性化、 pHの低下などを促進する活性または抑制する活性など） を測定するこ とを特徴とする本発明の蛋白質またはその塩に対するリガンドの決定方法を提 供する。
特に、 上記①〜③の試験を行ない、 試験化合物が本発明の蛋白質に結合する ことを確認した後に、 上記④〜⑤の試験を行なうことが好ましい。
まず、 リガンド決定方法に用いる蛋白質としては、 前記した本発明の蛋白質 または本発明の部分べプチドを含有するものであれば何れのものであってもよ いが、 動物細胞を用いて大量発現させた蛋白質が適している。 本発明の蛋白質を製造するには、 前述の発現方法が用いられるが、 該蛋白質 をコードする DNAを哺乳動物細胞や昆虫細胞で発現することにより行なうこ とが好ましい。 目的とする蛋白質部分をコードする DNA断片には、 通常、 相 補 DNAが用いられるが、 必ずしもこれに制約されるものではない。 例えば、 遺伝子断片や合成 DNAを用いてもよい。 本発明の蛋白質をコードする DNA 断片を宿主動物細胞に導入し、 それらを効率よく発現させるためには、 該 DN A断片を昆虫を宿主とするバキュロウィルスに属する核多角体病ウィルス (nuclear polyhedrosis virus； NPV) のポリヘドリンプロモー夕一、 S V 40由来のプロモーター、 レトロウイルスのプロモータ一、 メタ口チォネイン プロモーター、 ヒトヒートショックプロモー夕一、 サイトメガロウィルスプロ モーター、 SRひプロモー夕一などの下流に組み込むのが好ましい。 発現した レセプターの量と質の検査はそれ自体公知の方法で行うことができる。 例えば、 文献 〔Nambi, P. ら、 ザ ·ジャーナル ·ォブ ·バイオロジカル ·ケミストリ一 (J. Biol. Chem. ) , 267巻， 19555〜19559頁， 1992年〕 に記載の方法に従って行 うことができる。
したがって、 本発明のリガンド決定方法において、 本発明の蛋白質、 その部 分ペプチドまたはそれらの塩を含有するものとしては、 それ自体公知の方法に 従って精製した蛋白質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩であってもよいし、 該蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分を用いてもよい。
本発明のリガンド決定方法において、 本発明の蛋白質を含有する細胞を用い る場合、 該細胞をダルタルアルデヒド、 ホルマリンなどで固定化してもよい。 固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行なうことができる。
本発明の蛋白質を含有する細胞としては、 本発明の蛋白質を発現した宿主細 胞をいうが、 該宿主細胞としては、 大腸菌、 枯草菌、 酵母、 昆虫細胞、 動物細 胞などが用いられる。
細胞膜画分としては、 細胞を破砕した後、 それ自体公知の方法で得られる細 胞膜が多く含まれる画分のことをいう。 細胞の破砕方法としては、 Potter— Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、 ヮーリングブレンダーゃポ リトロン （Kinematica社製） による破碎、 超音波による破砕、 フレンチプレス などで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙 げられる。 細胞膜の分画には、 分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠 心力による分画法が主として用いられる。 例えば、 細胞破砕液を低速 （500 r pm〜3000 r pm) で短時間 （通常、 約 1分〜 10分） 遠心し、 上清を さらに高速 ( 15000 r pm〜30000 r m) で通常 30分〜 2時間遠 心し、 得られる沈澱を膜画分とする。 該膜画分中には、 発現した蛋白質と細胞 由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
該蛋白質を含有する細胞やその膜画分中の蛋白質の量は、 1細胞当たり 103〜 108分子であるのが好ましく、 105〜 107分子であるのが好適であ る。 なお、 発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性 （比活性） が高 くなり、 高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、 同一口 ッ卜で大量の試料を測定できるようになる。
本発明の蛋白質またはその塩に対するリガンドを決定する前記の①〜③の方 法を実施するためには、 適当な蛋白質画分と、 標識した試験化合物が必要であ る。
蛋白質画分としては、 天然型のレセプ夕一蛋白質画分か、 またはそれと同等 の活性を有する組換え型レセプ夕一画分などが望ましい。 ここで、 同等の活性 とは、 同等のリガンド結合活性、 シグナル情報伝達作用などを示す。
標識した試験化合物としては、 〔3H〕 、 〔125 I〕 、 〔14C〕 、 〔35S〕 などで標識したアンギオテンシン、 ボンべシン、 カナピノイド、 コレシストキ ニン、 グルタミン、 セロトニン、 メラトニン、 ニューロペプチド Y、 オビオイ ド、 プリン、 バソプレツシン、 ォキシトシン、 PACAP、 セクレチン、 ダル 力ゴン、 カルシトニン、 アドレノメジュリン、 ソマトス夕チン、 GHRH、 C RF、 ACTH、 GRP、 PTH、 V I P (バソアクティブ インテスティナ ル アンド リイテッド ポリペプチド） 、 ソマトス夕チン、 ドーパミン、 モ チリン、 アミリン、 ブラジキニン、 CGRP (カルシトニンジーンリレーティ ッドペプチド） 、 ロイコトリェン、 パンクレアスタチン、 プロスタグランジン、 トロンポキサン、 アデノシン、 アドレナリン、 αおよび ;3—ケモカイン (chemokine) (例えば、 I L一 8、 GR〇a、 GR〇jS、 GR〇ァ、 NAP— 2、 ENA - 78、 PF4、 I P 10、 GCP— 2、 MCP - 1、 HC 14、 MCP— 3、 I一 309、 ΜΙ Ρ 1 α、 M I P— 1 )3、 R ANTESなど） 、 エンドセリン、 ェンテロガストリン、 ヒスタミン、 ニューロテンシン、 TRH、 パンクレアティックポリぺプタイド、 ガラニン、 MIT1またはその哺乳動物のホ モログなどが好適である。
具体的には、 本発明の蛋白質またはその塩に対するリガンドの決定方法を行 なうには、 まず本発明の蛋白質を含有する細胞または細胞の膜画分を、 決定方 法に適したバッファーに懸濁することによりレセプ夕一標品を調製する。 バッ ファーには、 pH4〜10 (望ましくは pH6〜8) のリン酸バッファ一、 ト リス—塩酸バッファーなどのリガンドと本発明の蛋白質との結合を阻害しない バッファ一であればいずれでもよい。 また、 非特異的結合を低減させる目的で、 CHAPS, Twe e n - 80™ (花王一アトラス社） 、 ジギトニン、 デォキ シコレートなどの界面活性剤ゃゥシ血清アルブミンやゼラチンなどの各種蛋白 質をバッファーに加えることもできる。 さらに、 プロテアーゼによるリセプ夕 一やリガンドの分解を抑える目的で PMS F、 ロイぺプチン、 E— 64 (ぺプ チド研究所製） 、 ぺプス夕チンなどのプロテア一ゼ阻害剤を添加することもで きる。 0. 0 lm 1〜 10mlの該レセプ夕ー溶液に、 一定量 （5000 c pm 〜500000 c pm) の 〔3H〕 、 〔125 I〕 、 〔14C〕 、 〔35S〕 などで 標識した試験化合物を共存させる。 非特異的結合量 （NSB) を知るために大 過剰の未標識の試験化合物を加えた反応チューブも用意する。 反応は約 0 か ら 50Τλ 望ましくは約 4°Cから 37°Cで、 約 20分から 24時間、 望ましく は約 30分から 3時間行なう。 反応後、 ガラス繊維濾紙等で濾過し、 適量の同 バッファ一で洗浄した後、 ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレ ーシヨンカウンタ一あるいはァ—カウン夕一で計測する。 全結合量 （B) から 非特異的結合量 （NSB) を引いたカウント （B— NSB) が O c pmを越え る試験化合物を本発明の蛋白質またはその塩に対するリガンド （ァゴニスト） として選択することができる。
本発明の蛋白質またはその塩に対するリガンドを決定する前記の④〜⑤の方 法を実施するためには、 該蛋白質を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン 酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞 内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質の リン酸化、 c一 f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する活性または抑制す る活性など） を公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することが できる。 具体的には、 まず、 本発明の蛋白質を含有する細胞をマルチウエルプ レート等に培養する。 リガンド決定を行なうにあたっては前もつて新鮮な培地 あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、 試験化合物などを 添加して一定時間インキュベートした後、 細胞を抽出あるいは上清液を回収し て、 生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。 細胞刺激活性の指標と する物質 （例えば、 ァラキドン酸など） の生成が、 細胞が含有する分解酵素に よって検定困難な場合は、 該分解酵素に対する阻害剤を添加してアツセィを行 なってもよい。 また、 c AM P産生抑制などの活性については、 フォルスコリ ンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用と して検出することができる。
本発明の蛋白質またはその塩に結合するリガンド決定用キットは、 本発明の 蛋白質もしくはその塩、 本発明の部分ペプチドもしくはその塩、 本発明の蛋白 質を含有する細胞、 または本発明の蛋白質を含有する細胞の膜画分などを含有 するものである。
本発明のリガンド決定用キッ卜の例としては、 次のものが挙げられる。 1 . リガンド決定用試薬
①測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Bal anced Sal t Solut i on (ギブコ社製） に、 0. 0 5 %のゥシ血清ァ ルブミン （シグマ社製） を加えたもの。
孔径 0. 4 5 mのフィルタ一で濾過滅菌し、 4 °Cで保存するか、あるいは用 時調製しても良い。 ② G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質標品
本発明の蛋白質を発現させた CHO細胞を、 12穴プレートに 5 X 105個 /穴で継代し、 37°C、 5%C〇2、 95 % a i rで 2日間培養したもの。
③標識試験化合物
市販の 〔3H〕 、 〔125 I〕 、 〔14C〕 、 〔35S〕 などで標識した化合物、 または適当な方法で標識化したもの
水溶液の状態のものを 4°Cあるいは一 20 にて保存し、 用時に測定用緩衝 液にて に希釈する。 水に難溶性を示す試験化合物については、 ジメチル ホルムアミド、 DMSO、 メタノール等に溶解する。
④非標識試験化合物
標識化合物と同じものを 100〜1000倍濃い濃度に調製する。
2. 測定法
®12穴組織培養用プレートにて培養した本発明の蛋白質発現 CHO細胞を、 測定用緩衝液 1 m 1で 2回洗浄した後、 490 1の測定用緩衝液を各穴に加 える。
②標識試験化合物を 5 1加え、 室温にて 1時間反応させる。 非特異的結合量 を知るためには非標識試験化合物を 5 1加えておく。
③反応液を除去し、 lm 1の洗浄用緩衝液で 3回洗浄する。 細胞に結合した標 識試験化合物を 0.2N N aOH- 1 %SDSで溶解し、 4m 1の液体シンチ レーター A (和光純薬製） と混合する。
④液体シンチレ一シヨンカウンター （ベックマン社製） を用いて放射活性を測 定する。
本発明の蛋白質またはその塩に結合することができるリガンドとしては、 例 えば、 脳、 下垂体、 塍臓などに特異的に存在する物質などが挙げられ、 具体的 には、 アンギオテンシン、 ボンべシン、 カナピノイド、 コレシストキニン、 グ ル夕ミン、 セロトニン、 メラトニン、 ニューロペプチド Y、 ォピオイド、 プリ ン、 バソプレツシン、 ォキシトシン、 PACAP、 セクレチン、 グルカゴン、 カルシトニン、 アドレノメジュリン、 ソマトス夕チン、 GHRH、 CRF、 A CTH、 GRP、 PTH、 V I P (バソアクティブ インテスティナル アン ド リレイテッド ポリペプチド） 、 ソマトス夕チン、 ドーパミン、 モチリン、 アミリン、 ブラジキニン、 CGRP (カルシ卜ニンジーンリレーティッドぺプ チド） 、 ロイコ卜リエン、 パンクレアスタチン、 プロスタグランジン、 トロン ボキサン、 アデノシン、 アドレナリン、 ひおよび3—ケモカイン （chemokine)
(例えば、 I L一 8、 GROa、 GROiS、 GROァ、 NAP— 2、 ENA_ 78、 PF4、 I P 10、 GCP— 2、 MCP_ 1、 HC 14、 MCP - 3、 I一 309、 Μ Ι Ρ 1 α、 M I P— 1 )3、 RANTESなど） 、 エンドセリン、 ェンテロガストリン、 ヒスタミン、 ニューロテンシン、 TRH、 パンクレアテ イツクポリぺプ夕イド、 ガラニン、 MIT1またはその哺乳動物のホモログなどが 用いられる。
(2) 本発明の蛋白質欠乏症の予防 ·治療剤
上記 （1) の方法において、 本発明の蛋白質に対するリガンドが明らかにな れば、 該リガンドが有する作用に応じて、 ①本発明の蛋白質または②該蛋白質 をコードする DN Aを、 本発明の蛋白質の機能不全に関連する疾患の予防およ びノまたは治療剤などの医薬として使用することができる。
例えば、 生体内において本発明の蛋白質が減少しているためにリガンドの生 理作用が期待できない （該蛋白質の欠乏症） 患者がいる場合に、 ①本発明の蛋 白質を該患者に投与し該蛋白質の量を補充したり、 ② （ィ） 本発明の蛋白質を コードする DNAを該患者に投与し発現させることによって、 あるいは （口） 対象となる細胞に本発明の蛋白質をコードする DN Aを挿入し発現させた後に、 該細胞を該患者に移植することなどによって、 患者の体内における蛋白質の量 を増加させ、 リガンドの作用を充分に発揮させることができる。 したがって、 本発明の蛋白質をコードする DNAは、 安全で低毒性な本発明のレセプ夕ー蛋 白質の機能不全に関連する疾患の予防および/または治療剤などの医薬として 有用である。
本発明の蛋白質または該蛋白質をコードする DN Aは中枢疾患（例えばアル ッハイマー病 '痴呆'摂食障害（拒食症） ，てんかんなど）、ホルモン系の疾患（例 えば、 微弱陣痛、 弛緩出血、 胎盤娩出前後、 子宮復古不全、 帝王切開術、 人工 妊娠中絶、 乳汁うっ滞など）、肝/胆 /塍 /内分泌疾患 (例えば糖尿病 ·摂食障害な ど）、 炎症性疾患（アレルギー ·喘息 · リュウマチなど）、 循環器疾患 (例えば高 血圧症 ·心肥大 ·狭心症 ·動脈硬化等）、 呼吸器系疾患 （例えば、 肺炎、 喘息、 気 管支炎、 呼吸器感染症、 慢性閉塞性肺疾患等） 、 感染症 （例えば、 敗血症、 M R S A、 呼吸器感染症、 尿路感染症、 胆道感染症、 感染性腸炎、 中耳炎、 前立 腺炎等） の予防および Zまたは治療に有用である。
また、本発明の蛋白質または該蛋白質をコードする D N Aは消化器疾患 (例え ば腸炎、 下痢、便秘、 吸収不良性症候群など）の予防および Zまたは治療に特に 有用である。
本発明の蛋白質を上記予防 ·治療剤として使用する場合は、 常套手段に従つ て製剤化することができる。
一方、 本発明の蛋白質をコードする D NA (以下、 本発明の D NAと略記す る場合がある） を上記予防 ·治療剤として使用する場合は、 本発明の D NAを 単独あるいはレトロウイルスベクタ一、 アデノウイルスベクタ一、 アデノウィ ルスァソシエーテッドウィルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、 常套手段に従って実施することができる。 本発明の D N Aは、 そのままで、 あ るいは摂取促進のための補助剤とともに、 遺伝子銃やハイドロゲルカテーテル のようなカテーテルによって投与できる。
例えば、 ①本発明の蛋白質または②該蛋白質をコードする D NAは、 必要に 応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤な どとして経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との 無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。 例え ば、 ①本発明の蛋白質または②該蛋白質をコードする D N Aを生理学的に認め られる公知の担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤など とともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和すること によって製造することができる。 これら製剤における有効成分量は指示された 範囲の適当な用量が得られるようにするものである。 錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えばゼラ チン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セ ルロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのよう な膨化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサ ッカリンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリ一のような 香味剤などが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 前記タイ プの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のため の無菌組成物は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油など のような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に 従って処方することができる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マ ンニトール、 塩化ナトリウムなど） などが用いられ、 適当な溶解補助剤、 例え ば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリアルコール （例、 プロピレングリコ ール、 ポリエチレングリコール） 、 非イオン性界面活性剤 （例、 ポリソルベー ト 8 0 TM、 H C O— 5 0 ) などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用いられ、 溶解補助剤である安息香酸ベンジル、 ベンジ ルアルコールなどと併用してもよい。
また、 上記予防 ·治療剤は、 例えば、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢 酸ナトリウム緩衝液） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロ 力インなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコー ルなど） 、 保存剤 （例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防 止剤などと配合してもよい。 調製された注射液は通常、 適当なアンプルに充填 される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトゃ哺 乳動物 （例えば、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルな ど） に対して投与することができる。
本発明の蛋白質または D N Aの投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与 方法などにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に成人 （6 O k gとし て） の消化器疾患患者においては、 一日につき約 0. lmg〜100mg、好ま しくは約 1. 0〜5 Omg、 より好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非経 口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方 法などによっても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常成人 （6 O kgとし て） の消化器疾患患者においては、 一日につき約 0. 01〜30mg程度、 好 ましくは約 0. 1〜2 Omg程度、 より好ましくは約 0. l〜10mg程度を 静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 6 O kg当た りに換算した量を投与することができる。
(3) 遺伝子診断剤
本発明の DNAは、 プローブとして使用することにより、 ヒトまたは哺乳動 物 （例えば、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） における本発明の蛋白質またはその部分ペプチドをコードする DNAまたは m RNAの異常 （遺伝子異常） を検出することができるので、 例えば、 該 DNA または mRNAの損傷、 突然変異あるいは発現低下や、 該 DNAまたは mRN Aの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤として有用である。
本発明の DNAを用いる上記の遺伝子診断は、 例えば、 自体公知のノーザン ハイブリダィゼ一シヨンや PCR— S SCP法 （ゲノミックス （Genomics) ， 第 5巻， 874〜 879頁 （1989年） 、 プロシ一ジングズ ·ォブ ·ザ ·ナ ショナル'アカデミー'ォブ'サイェンシィズ 'ォブ 'ユーエスエー（Proceedings of the Nat inal Academy of Sciences of the United States of America) , 第 86巻， 2766〜 2770頁 （1989年） ） などにより実施することが できる。
(4) 本発明の蛋白質に対するリガンドの定量法
本発明の蛋白質等は、 リガンドに対して結合性を有しているので、 生体内に おけるリガンド濃度を感度良く定量することができる。
本発明の定量法は、 例えば、 競合法と組み合わせることによって用いること ができる。 すなわち、 被検体を本発明の蛋白質等と接触させることによって被 検体中のリガンド濃度を測定することができる。 具体的には、 例えば、 以下の ①または②などに記載の方法あるいはそれに準じる方法に従って用いることが できる。
①入江寛編 「ラジオイムノアツセィ」 （講談社、 昭和 4 9年発行）
②入江寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 5 4年発行）
( 5 ) 本発明の蛋白質とリガンドとの結合性を変化させる化合物のスクリー二 ング方法
本発明の蛋白質等を用いるか、 または組換え型蛋白質等の発現系を構築し、 該発現系を用いたレセプタ一結合ァッセィ系を用いることによって、 リガンド と本発明の蛋白質等との結合性を変化させる化合物 （例えば、 ペプチド、 蛋白 質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物など） またはその塩を効率 よくスクリーニングすることができる。
このような化合物には、 （ィ） G蛋白質共役型レセプ夕一を介して細胞刺激 活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 C AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜 電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c— f o sの活性化、 p Hの低下などを 促進する活性または抑制する活性など） を有する化合物 （いわゆる、 本発明の 蛋白質に対するァゴニスト） 、 （口） 該細胞刺激活性を有しない化合物 （いわ ゆる、 本発明の蛋白質に対するアン夕ゴニスト） 、 （八） リガンドと本発明の 蛋白質との結合力を増強する化合物、 あるいは （二） リガンドと本発明の蛋白 質との結合力を減少させる化合物などが含まれる （なお、 上記 （ィ） の化合物 は、 前記したリガンド決定方法によってスクリーニングすることが好ましい） 。 すなわち、 本発明は、 （ i ) 本発明の蛋白質、 その部分ペプチドまたはそれ らの塩と、 リガンドとを接触させた場合と （i i) 本発明の蛋白質、 その部分べ プチドまたはそれらの塩と、 リガンドおよび試験化合物とを接触させた場合と の比較を行なうことを特徴とするリガンドと本発明の蛋白質、 その部分べプチ ドまたはそれらの塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリ一二 ング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法においては、 （ i ) と （i i) の場合における、 例えば、 該蛋白質等に対するリガンドの結合量、 細胞刺激活性などを測定して、 比較することを特徴とする。
より具体的には、 本発明は、
①標識したリガンドを、 本発明の蛋白質等に接触させた場合と、 標識したリガ ンドおよび試験化合物を本発明の蛋白質等に接触させた場合における、 標識し たリガンドの該蛋白質等に対する結合量を測定し、 比較することを特徴とする リガンドと本発明の蛋白質等との結合性を変化させる化合物またはその塩のス クリーニング方法、
②標識したリガンドを、 本発明の蛋白質等を含有する細胞または該細胞の膜画 分に接触させた場合と、 標識したリガンドおよび試験化合物を本発明の蛋白質 等を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、 標識した リガンドの該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、 比較することを特 徴とするリガンドと本発明の蛋白質等との結合性を変化させる化合物またはそ の塩のスクリーニング方法、
③標識したリガンドを、 本発明の D N Aを含有する形質転換体を培養すること によって細胞膜上に発現した蛋白質等に接触させた場合と、 標識したリガンド および試験化合物を本発明の D N Aを含有する形質転換体を培養することによ つて細胞膜上に発現した本発明の蛋白質等に接触させた場合における、 標識し たリガンドの該蛋白質等に対する結合量を測定し、 比較することを特徴とする リガンドと本発明の蛋白質等との結合性を変化させる化合物またはその塩のス クリーニング方法、
④本発明の蛋白質等を活性化する化合物 （例えば、 本発明の蛋白質等に対する リガンドなど） を本発明の蛋白質等を含有する細胞に接触させた場合と、 本発 明の蛋白質等を活性化する化合物および試験化合物を本発明の蛋白質等を含有 する細胞に接触させた場合における、 レセプ夕一を介した細胞刺激活性 （例え ば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c A M P生成、 細胞内 c G M P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する活 性または抑制する活性など） を測定し、 比較することを特徴とするリガンドと 本発明の蛋白質等との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニン グ方法、 および
⑤本発明の蛋白質等を活性化する化合物 （例えば、 本発明の蛋白質等に対する リガンドなど） を本発明の D N Aを含有する形質転換体を培養することによつ て細胞膜上に発現した本発明の蛋白質等に接触させた場合と、 本発明の蛋白質 等を活性化する化合物および試験化合物を本発明の D N Aを含有する形質転換 体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明の蛋白質等に接触させた 場合における、 レセプ夕一を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c G M P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c - f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する活性または抑制する活性など） を測定し、 比較することを特徴とするリガンドと本発明の蛋白質等との結合性 を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明の蛋白質等が得られる以前は、 G蛋白質共役型レセプ夕一ァゴニスト またはアン夕ゴニストをスクリーニングする場合、 まずラットなどの G蛋白質 共役型レセプター蛋白質を含む細胞、 組織またはその細胞膜画分を用いて候補 化合物を得て （一次スクリーニング） 、 その後に該候補化合物が実際にヒトの G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質とリガンドとの結合を阻害するか否かを確認 する試験 （二次スクリーニング） が必要であった。 細胞、 組織または細胞膜画 分をそのまま用いれば他のレセプ夕一蛋白質も混在するために、 目的とするレ セプ夕一蛋白質に対するァゴニストまたはアン夕ゴニストを実際にスクリー二 ングすることは困難であった。
しかしながら、 例えば、 本発明のヒト由来蛋白質を用いることによって、 一 次スクリーニングの必要がなくなり、 リガンドと G蛋白質共役型レセプ夕ー蛋 白質との結合を阻害する化合物を効率良くスクリーニングすることができる。 さらに、 スクリーニングされた化合物がァゴニストかアン夕ゴニストかを簡便 に評価することができる。 本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。
まず、 本発明のスクリーニング方法に用いる本発明の蛋白質等としては、 前 記した本発明の蛋白質等を含有するものであれば何れのものであってもよいが、 本発明の蛋白質等を含有する哺乳動物の臓器の細胞膜画分が好適である。 しか し、 特にヒト由来の臓器は入手が極めて困難なことから、 スクリーニングに用 いられるものとしては、 組換え体を用いて大量発現させたヒト由来のレセプ夕 —蛋白質等などが適している。
本発明の蛋白質等を製造するには、 前述の方法が用いられるが、 本発明の D N Aを哺乳細胞や昆虫細胞で発現することにより行なうことが好ましい。 目的 とする蛋白質部分をコードする D N A断片には相補 D N Aが用いられるが、 必 ずしもこれに制約されるものではない。 例えば、 遺伝子断片や合成 D N Aを用 いてもよい。 本発明の蛋白質をコードする D N A断片を宿主動物細胞に導入し、 それらを効率よく発現させるためには、 該 D N A断片を昆虫を宿主とするバキ ュロウィルスに属する核多角体病ウィルス （nuc l ear po lyhedros i s vi rus； N P V) のポリヘドリンプロモ一夕一、 S V 4 0由来のプロモー夕一、 レトロゥ ィルスのプロモーター、 メタ口チォネインプロモーター、 ヒトヒートショック プロモーター、 サイトメガロウィルスプロモーター、 S R aプロモーターなど の下流に組み込むのが好ましい。 発現したレセプ夕一の量と質の検査はそれ自 体公知の方法で行うことができる。 例えば、 文献 〔Namb i， P. ら、 ザ ·ジャー ナル 'ォブ 'バイオロジカル ·ケミストリー （L Bi o l. Chem. ) , 267巻， 19555 〜19559頁， 1992年〕 に記載の方法に従って行なうことができる。
したがって、 本発明のスクリーニング方法において、 本発明の蛋白質等を含 有するものとしては、 それ自体公知の方法に従って精製した蛋白質等であって もよいし、 該蛋白質等を含有する細胞を用いてもよく、 また該蛋白質等を含有 する細胞の膜画分を用いてもよい。
本発明のスクリーニング方法において、 本発明の蛋白質等を含有する細胞を 用いる場合、 該細胞をダルタルアルデヒド、 ホルマリンなどで固定化してもよ い。 固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行なうことができる。 本発明の蛋白質等を含有する細胞としては、 該蛋白質等を発現した宿主細胞 をいうが、 該宿主細胞としては、 大腸菌、 枯草菌、 酵母、 昆虫細胞、 動物細胞 などが好ましい。
細胞膜画分としては、 細胞を破碎した後、 それ自体公知の方法で得られる細 胞膜が多く含まれる画分のことをいう。 細胞の破碎方法としては、 Potter— Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、 ヮ一リングブレンダーゃポ リトロン （Kinematica社製） のよる破砕、 超音波による破砕、 フレンチプレス などで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙 げられる。 細胞膜の分画には、 分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠 心力による分画法が主として用いられる。 例えば、 細胞破砕液を低速 （500 r pm〜3000 r pm) で短時間 （通常、 約 1分〜 10分） 遠心し、 上清を さらに高速 （ 15000 r p m〜 30000 r pm) で通常 30分〜 2時間遠 心し、 得られる沈澱を膜画分とする。 該膜画分中には、 発現した蛋白質等と細 胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
該蛋白質等を含有する細胞や膜画分中の該蛋白質の量は、 1細胞当たり
103〜 108分子であるのが好ましく、 105〜 107分子であるのが好適であ る。 なお、 発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性 （比活性） が高 くなり、 高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、 同一口 ッ卜で大量の試料を測定できるようになる。
リガンドと本発明の蛋白質等との結合性を変化させる化合物をスクリーニン グする前記の①〜③を実施するためには、 例えば、 適当な蛋白質画分と、 標識 したリガンドが必要である。
蛋白質画分としては、 天然型のレセプ夕一蛋白質画分か、 またはそれと同等 の活性を有する組換え型レセプ夕一蛋白質画分などが望ましい。 ここで、 同等 の活性とは、 同等のリガンド結合活性、 シグナル情報伝達作用などを示す。 標識したリガンドとしては、 標識したリガンド、 標識したリガンドアナログ 化合物などが用いられる。 例えば 〔3H〕 、 〔125 I〕 、 〔14C〕 、 〔35S〕 などで標識されたリガンドなどが用いられる。 具体的には、 リガンドと本発明の蛋白質等との結合性を変化させる化合物の スクリーニングを行なうには、 まず本発明の蛋白質等を含有する細胞または細 胞の膜画分を、 スクリーニングに適したバッファーに懸濁することにより蛋白 質標品を調製する。 バッファーには、 pH4〜10 (望ましくは pH6〜8) のリン酸バッファー、 トリスー塩酸バッファーなどのリガンドと蛋白質との結 合を阻害しないバッファ一であればいずれでもよい。 また、 非特異的結合を低 減させる目的で、 CHAPS、 Twe e n- 80™ (花王一アトラス社） 、 ジ ギトニン、 デォキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもで きる。 さらに、 プロテアーゼによるレセプ夕一やリガンドの分解を抑える目的 で PMSF、 ロイぺプチン、 E— 64 (ペプチド研究所製） 、 ぺプス夕チンな どのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。 0. 0 lm 1〜 10m 1の該 レセプ夕一溶液に、 一定量 （5000 c pn！〜 500000 c pm) の標識し たリガンドを添加し、同時に 10— 4M〜10— 1QMの試験化合物を共存させる。 非特異的結合量 （NSB) を知るために大過剰の未標識のリガンドを加えた反 応チューブも用意する。反応は約 0°Cから 50°C、望ましくは約 4°Cから 37°C で、 約 20分から 24時間、 望ましくは約 30分から 3時間行う。 反応後、 ガ ラス繊維濾紙等で濾過し、 適量の同バッファ一で洗浄した後、 ガラス繊維濾紙 に残存する放射活性を液体シンチレーシヨンカウン夕一または T一カウンター で計測する。拮抗する物質がない場合のカウント（B 0)から非特異的結合量（N SB) を引いたカウント （B。一 NSB) を 100%とした時、 特異的結合量 (B-NSB) が、 例えば、 50%以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のあ る候補物質として選択することができる。
リガンドと本発明の蛋白質等との結合性を変化させる化合物スクリーニング する前記の④〜⑤の方法を実施するためには、 例えば、 蛋白質を介する細胞刺 激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 Ca2+遊離、 細胞内 c AMP生成、 細胞内 c GMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜 電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 pHの低下などを 促進する活性または抑制する活性など） を公知の方法または市販の測定用キッ トを用いて測定することができる。
具体的には、 まず、 本発明の蛋白質等を含有する細胞をマルチウエルプレー ト等に培養する。 スクリーニングを行なうにあたっては前もって新鮮な培地あ るいは細胞に毒性を示さない適当なバッファ一に交換し、 試験化合物などを添 加して一定時間インキュベートした後、 細胞を抽出あるいは上清液を回収して、 生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。 細胞刺激活性の指標とする 物質 （例えば、 ァラキドン酸など） の生成が、 細胞が含有する分解酵素によつ て検定困難な場合は、 該分解酵素に対する阻害剤を添加してアツセィを行なつ てもよい。 また、 C A M P産生抑制などの活性については、 フオルスコリンな どで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として 検出することができる。
細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、 適当な蛋白質を発現 した細胞が必要である。 本発明の蛋白質等を発現した細胞としては、 天然型の 本発明の蛋白質等を有する細胞株、 前述の組換え型蛋白質等を発現した細胞株 などが望ましい。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などが用 いられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であつ てもよい。
リガンドと本発明の蛋白質等との結合性を変化させる化合物またはその塩の スクリーニング用キットは、 本発明の蛋白質等、 本発明の蛋白質等を含有する 細胞、 または本発明の蛋白質等を含有する細胞の膜画分を含有するものなどで ある。
本発明のスクリーニング用キッ卜の例としては、 次のものが挙げられる。 1 . スクリーニング用試薬
①測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Bal anced Sal t So l ut i on (ギブコ社製） に、 0. 0 5 %のゥシ血清ァ ルブミン （シグマ社製） を加えたもの。 孔径 0.45 のフィル夕一で濾過滅菌し、 4°Cで保存するか、あるいは用 時調製しても良い。
② G蛋白質共役型レセプ夕一標品
本発明の蛋白質を発現させた CHO細胞を、 12穴プレートに 5 X 105個 穴で継代し、 37°C、 5 C02 95 % a i rで 2日間培養したもの。
③標識リガンド
市販の 〔3H〕 、 〔125 I〕 、 〔14C〕 、 〔35S〕 などで標識したリガンド 水溶液の状態のものを 4°Cあるいは一 20°Cにて保存し、 用時に測定用緩衝 液にて 1 Mに希釈する。
④リガンド標準液
リガンドを 0. 1 %ゥシ血清アルブミン（シグマ社製）を含む PBSで ImM となるように溶解し、 — 20°Cで保存する。
2. 測定法
① 12穴組織培養用プレートにて培養した本発明の蛋白質発現 CH〇細胞を、 測定用緩衝液 1 m 1で 2回洗浄した後、 490 1の測定用緩衝液を各穴に加 える。
② 10— 3〜10— 1QMの試験化合物溶液を 5 1加えた後、 標識リガンドを 5 II 1加え、 室温にて 1時間反応させる。 非特異的結合量を知るためには試験化 合物の代わりに 10— 3Mのリガンドを 5 1加えておく。
③反応液を除去し、 lm 1の洗浄用緩衝液で 3回洗浄する。 細胞に結合した標 識リガンドを 0. 2N NaOH- 1 %SDSで溶解し、 4m 1の液体シンチレ 一夕一 A (和光純薬製） と混合する。
④液体シンチレ一シヨンカウンター （ベックマン社製） を用いて放射活性を測 定し、 Percent Maximum Binding (PMB) を次の式で求める。
PMB= [ (B— NSB) / (B。― NSB) ] X 100
P MB： Percent Maximum Binding
B ：検体を加えた時の値 N S B ： Non-spec i f ic Binding (非特異的結合量）
B 0 ： 取大糸口 π" 本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られ る化合物またはその塩は、 リガンドと本発明の蛋白質等との結合性を変化させ る作用を有する化合物であり、 具体的には、 （ィ） G蛋白質共役型レセプ夕一 を介して細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細 胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリ ン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する活性または抑制する活性など） を有する化合物 （い わゆる、 本発明の蛋白質に対するァゴニスト） 、 （口） 該細胞刺激活性を有し ない化合物 （いわゆる、 本発明の蛋白質に対するアン夕ゴニスト） 、 （八） リ ガンドと本発明の G蛋白質共役型蛋白質との結合力を増強する化合物、 あるい は （二） リガンドと本発明の G蛋白質共役型蛋白質との結合力を減少させる化 合物である。
該化合物としては、 ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物などが挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であつてもよい。
本発明の蛋白質等に対するァゴニストは、 本発明の蛋白質等に対するリガン ドが有する生理活性と同様の作用を有しているので、 該リガンド活性に応じて 安全で低毒性な医薬 [例えば、 中枢疾患 (例えばアルツハイマー病 ·痴呆 '摂食 障害 （拒食症） ·てんかんなど）、 ホルモン系の疾患 （例えば、 微弱陣痛、 弛緩 出血、 胎盤娩出前後、 子宮復古不全、 帝王切開術、 人工妊娠中絶、 乳汁うっ滞 など） 、肝/胆 /降/内分泌疾患 (例えば糖尿病 ·摂食障害など）、炎症性疾患 (ァレ ルギー '喘息 ·リュウマチなど）、循環器疾患 (例えば高血圧症，心肥大 ·狭心症 · 動脈硬化等)、 呼吸器系疾患 （例えば、 肺炎、 喘息、 気管支炎、 呼吸器感染症、 慢性閉塞性肺疾患等） 、 感染症 （例えば、 敗血症、 MR S A、 呼吸器感染症、 尿路感染症、 胆道感染症、 感染性腸炎、 中耳炎、 前立腺炎等） の予防および Z または治療剤など]として有用である。
また、 本発明の蛋白質等に対するァゴニストは、 本発明の蛋白質等に対する リガンドが有する生理活性と同様の作用を有しているので、 該リガンド活性に 応じて安全で低毒性な消化器疾患 (例えば腸炎、 下痢、便秘、 吸収不良性症候群 など）の予防および/または治療剤として特に有用である。
本発明の蛋白質等に対するアンタゴニストは、 本発明の蛋白質等に対するリ ガンドが有する生理活性を抑制することができるので、 該リガンド活性を抑制 する安全で低毒性な医薬 [例えば、ホルモン分泌調節薬、本発明の蛋白質等に対 するリガンドの過剰な産生によって惹起される中枢疾患、 ホルモン系の疾患、 肝 Z胆/塍/内分泌疾患 （例えば抗肥満薬 ·摂食過剰など） 、 炎症性疾患、 循 環器疾患、 呼吸器系疾患）、感染症の予防および Zまたは治療薬など]として有 用である。
本発明の蛋白質等に対するアンタゴニストは、 本発明の蛋白質等に対するリ ガンドが有する生理活性を抑制することができるので、 該リガンド活性を抑制 する安全で低毒性な消化器疾患 (例えば腸炎、 下痢、便秘、 吸収不良性症候群な ど）の予防および/または治療剤として特に有用である。
リガンドと本発明の蛋白質との結合力を減少させる化合物は、 本発明の蛋白 質等に対するリガンドが有する生理活性を減少させるための安全で低毒性な医 薬 [例えば、ホルモン分泌調節薬、本発明の蛋白質等に対するリガンドの過剰な 産生によって惹起される中枢疾患、 ホルモン系の疾患、 肝 Z胆 Z塍 Z内分泌疾 患 （例えば抗肥満薬 ·摂食過剰など） 、 炎症性疾患、 循環器疾患、 呼吸器系疾 患、 感染症の予防および Zまたは治療薬など]として有用である。
リガンドと本発明の蛋白質との結合力を減少させる化合物は、 本発明の蛋白 質等に対するリガンドが有する生理活性を減少させることができるので、 安全 で低毒性な消化器疾患 (例えば腸炎、 下痢、 便秘、 吸収不良性症候群など）の予 防および または治療剤として特に有用である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られ る化合物またはその塩を上述の医薬組成物として使用する場合、 常套手段に従 つて実施することができる。 例えば、 前記した本発明の蛋白質を含有する医薬 と同様にして、 錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤、 無菌 性溶液、 懸濁液剤などとすることができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトまた は哺乳動物 （例えば、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サ ルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法な どにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に成人 （60 kgとして） に おいては、 一日につき約 0. ；!〜 100mg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜2 Omgである。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常成人 （60 kgとして） の消化器疾患患者におい ては、 一日につき約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. ；!〜 2 Omg 程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが 好都合である。 他の動物の場合も、 60 k g当たりに換算した量を投与するこ とができる。
(6) 本発明の蛋白質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩の定量
本発明の抗体は、 本発明の蛋白質等を特異的に認識することができるので、 被検液中の本発明の蛋白質等の定量、 特にサンドィツチ免疫測定法による定量 などに使用することができる。 すなわち、 本発明は、 例えば、 （ i) 本発明の 抗体と、 被検波および標識化蛋白質等とを競合的に反応させ、 該抗体に結合し た標識化蛋白質等の割合を測定することを特徴とする被検波中の本発明の蛋白 質等の定量法、
(ii) 被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の 抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化担体上の標識剤の活性 を測定することを特徴とする被検液中の本発明の蛋白質等の定量法を提供する。 上記 （ii) においては、 一方の抗体が本発明の蛋白質等の N端部を認識する 抗体で、 他方の抗体が本発明の蛋白質等の C端部に反応する抗体であることが 好ましい。
本発明の蛋白質等に対するモノクローナル抗体 （以下、 本発明のモノクロ一 ナル抗体と称する場合がある） を用いて本発明の蛋白質等の測定を行なえるほ 力、、 組織染色等による検出を行なうこともできる。 これらの目的には、 抗体分 子そのものを用いてもよく、 また、 抗体分子の F ( a b ' ) 2 、 F a b '、 あるい は F a b画分を用いてもよい。 本発明の蛋白質等に対する抗体を用いる測定法 は、 特に制限されるべきものではなく、 被測定液中の抗原量 （例えば、 蛋白質 量） に対応した抗体、 抗原もしくは抗体一抗原複合体の量を化学的または物理 的手段により検出し、 これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準 曲線より算出する測定法であれば、 いずれの測定法を用いてもよい。 例えば、 ネフロメトリー、 競合法、 ィムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に 用いられるが、 感度、 特異性の点で、 後述するサンドイッチ法を用いるのが特 に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、 例えば、 放射性同位 元素、 酵素、 蛍光物質、 発光物質などが用いられる。 放射性同位元素としては、 例えば、 〔1 2 5 I〕 、 〔1 3 1 I〕 、 〔3 H〕 、 〔1 4 C〕 などが用いられる。 上記 酵素としては、 安定で比活性の大きなものが好ましく、 例えば、 3—ガラクト シダ一ゼ、 /3—ダルコシダーゼ、 アルカリフォスファタ一ゼ、 パーォキシダ一 ゼ、 リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。 蛍光物質としては、 例えば、 フル ォレスカミン、 フルォレツセンイソチオシァネートなどが用いられる。 発光物 質としては、 例えば、 ルミノール、 ルミノール誘導体、 ルシフェリン、 ルシゲ ニンなどが用いられる。 さらに、 抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビォチ ンーアビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、 物理吸着を用いてもよく、 また通常、 蛋白質あるいは酵素等を不溶化、 固定化するのに用いられる化学結合を用いる 方法でもよい。 担体としては、 例えば、 ァガロース、 デキストラン、 セルロー スなどの不溶性多糖類、 ポリスチレン、 ポリアクリルアミド、 シリコン等の合 成樹脂、 あるいはガラス等が用いられる。 サンドィツチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液 を反応させ （1次反応） 、 さらに標識化した本発明のモノクローナル抗体を反 応させ （2次反応） たのち、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定することによ り被検波中の本発明の蛋白質量を定量することができる。 1次反応と 2次反応 は逆の順序に行なっても、 また、 同時に行なってもよいし時間をずらして行な つてもよい。 標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができ る。
また、 サンドイッチ法による免疫測定法において、 固相用抗体あるいは標識 用抗体に用いられる抗体は必ずしも 1種類である必要はなく、 測定感度を向上 させる等の目的で 2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法による本発明の蛋白質等の測定法においては、 1次 反応と 2次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は本発明の蛋白質等 の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。 即ち、 1次反応および 2次反応に用いられる抗体は、 例えば、 2次反応で用いられる抗体が、 本発明 の蛋白質の C端部を認識する場合、 1次反応で用いられる抗体は、 好ましくは C端部以外、 例えば N端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドィツチ法以外の測定システム、 例えば、 競合法、 ィムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができ る。 競合法では、 被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応さ せたのち、 未反応の標識抗原と（F ) と抗体と結合した標識抗原（B ) とを分離 し （B / F分離） 、 B， Fいずれかの標識量を測定し、 被検液中の抗原量を定 量する。 本反応法には、 抗体として可溶性抗体を用い、 B Z F分離をポリエヂ レンダリコール、 前記抗体に対する第 2抗体などを用いる液相法、 および、 第 1抗体として固相化抗体を用いるか、 あるいは、 第 1抗体は可溶性のものを用 い第 2抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
ィムノメトリック法では、 被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化 抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、 あるいは、 被検液中 の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、 次に固相化抗原を加え未反応の標 識化抗体を固相に結合させたのち、 固相と液相を分離する。 次に、 いずれかの 相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、 ネフロメトリーでは、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果、 生じた不溶性の沈降物の量を測定する。 被検液中の抗原量が僅かであり、 少量 の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザ一ネフロメ トリ一などが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の測定方法に適用するにあたっては、 特別の条件、 操作等の設定は必要とされない。 それぞれの方法における通常の 条件、 操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明の蛋白質またはその 塩の測定系を構築すればよい。 これらの一般的な技術手段の詳細については、 総説、 成書などを参照することができる 〔例えば、 入江 寛編 「ラジオィムノ アツセィ〕 （講談社、 昭和 49年発行） 、 入江 寛編 「続ラジオィムノアッセ ィ〕 （講談社、 昭和 54年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （医学書 院、 昭和 53年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （第 2版） （医学書 院、 昭和 57年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （第 3版） （医学書 院、 昭和 6 2年発行） 、 「メソッズ ·イン ·ェンジモノジー （Methods in ENZYMOLOGY) J Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Par t A))、 同書 Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B))、 同書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part 0)、 同書 Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D:Selected Immunoassays)) , 同書 Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part EiMonoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)) , 同書 Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I： Hybr idoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (以上、 アカデミックプレス社発行）など参照〕 。
以上のように、 本発明の抗体を用いることによって、 本発明の蛋白質または その塩を感度良く定量することができる。 さらに、 本発明の抗体を用いて本発 明の蛋白質またはその塩を定量することによって、 各種疾病の診断をすること ができる。
また、 本発明の抗体は、 体液や組織などの被検体中に存在する本発明の蛋白 質等を検出するために使用することができる。 また、 本発明の蛋白質等を精製 するために使用する抗体カラムの作製、 精製時の各分画中の本発明の蛋白質等 の検出、 被検細胞内における本発明の蛋白質の挙動の分析などのために使用す ることができる。
( 7 ) 本発明の G蛋白質共役型蛋白質をコードする D N Aを有する非ヒト動物 の作製
本発明の D N Aを用いて、 本発明の蛋白質等を発現するトランスジエニック 非ヒト動物を作製することができる。 非ヒ卜動物としては、 哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） など (以下、 動物と略記する） が挙げれるが、 特に、 マウス、 ゥサギなどが好適で ある。
本発明の D N Aを対象動物に転移させるにあたっては、 該 D N Aを動物細胞 で発現させうるプロモーターの下流に結合した遺伝子コンストラクトとして用 いるのが一般に有利である。 例えば、 ゥサギ由来の本発明の D N Aを転移させ る場合、 これと相同性が高い動物由来の本発明の D N Aを動物細胞で発現させ うる各種プロモーターの下流に結合した遺伝子コンストラクトを、 例えば、 ゥ サギ受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明の蛋白質等を 高産生する D N A転移動物を作出できる。 このプロモータ一としては、 例えば、 ウィルス由来プロモーター、 メタロチォネィン等のュビキアスな発現プロモ一 夕一も使用しうるが、 好ましくは脳で特異的に発現する N G F遺伝子プロモー 夕ーゃェノラ一ゼ遺伝子プロモーターなどが用いられる。
受精卵細胞段階における本発明の D N Aの転移は、 対象動物の胚芽細胞およ び体細胞の全てに存在するように確保される。 D N A転移後の作出動物の胚芽 細胞において本発明の蛋白質等が存在することは、 作出動物の子孫が全てその 胚芽細胞及び体細胞の全てに本発明の蛋白質等を有することを意味する。 遺伝 子を受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発 明の蛋白質等を有する。
本発明の D N A転移動物は、 交配により遺伝子を安定に保持することを確認 して、 該 DN A保有動物として通常の飼育環境で飼育継代を行うことができる。 さらに、 目的 DNAを保有する雌雄の動物を交配することにより、 導入遺伝子 を相同染色体の両方に持つホモザィゴ一ト動物を取得し、 この雌雄の動物を交 配することによりすべての子孫が該 D N Aを有するように繁殖継代することが できる。
本発明の DN Aが転移された動物は、 本発明の蛋白質等が高発現させられて いるので、 本発明の蛋白質等に対するァゴニストまたはアン夕ゴニス卜のスク リーニング用の動物などとして有用である。
本発明の DN A転移動物を、 組織培養のための細胞源として使用することも できる。 例えば、 本発明の DNA転移マウスの組織中の DNAもしくは RNA を直接分析するか、 あるいは遺伝子により発現された本発明の蛋白質が存在す る組織を分析することにより、 本発明の蛋白質等について分析することができ る。 本発明の蛋白質等を有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、 これらを使用して、 例えば、 脳や末梢組織由来のような一般に培養困難な組織 からの細胞の機能を研究することができる。 また、 その細胞を用いることによ り、 例えば、 各種組織の機能を高めるような医薬の選択も可能である。 また、 高発現細胞株があれば、 そこから、 本発明の蛋白質等を単離精製することも可 能である。
本明細書および図面において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 I UP AC - I UB Commision on Biochemical Nomenclature による略号あ るいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 ま たアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示 すものとする。
DNA デォキシリボ核酸
c DNA 相補的デォキシリボ核酸
A アデニン
T チミン
G グァニン C ン
RNA リポ核酸
mRNA メッセンジャーリポ核酸 d ATP デォキシアデノシン三リン酸 dTTP デォキシチミジン三リン酸 dGTP デォキシグアノシン三リン酸 d CTP デォキシシチジン三リン酸 G 1 yまたは G
A 1 aまたは A ァラニン
Va 1または V バリン
L e uまたは; L
I 1 eまたは I
S e rまたは S セリン
Th rまたは T スレオニン
Cy sまたは C
Me tまたは M メチォニン
G 1 uまたは E グルタミン酸
A s または D
L y sまたは K リジン
八 8または アルギニン
H i sまたは H ヒスチジン
Ph eまたは F フエ二ルァラニン
Ty rまたは Y チロシン
T r pまたは W トリプトファン
P r oまたはP プロリン
A s nまたは N
G 1 nまたは Q グルタミン
pG 1 u ピログルタミン酸 Xa a 未同定アミノ酸残基
T o s p -トルエンスルフォニル
B z 1
Cl2Bzl 2, 6—ジクロ口べンジル
Bom
Z ベンジルォキシカルボニル
C 1一 z 2—クロ口べンジルォキシカルポニル
B r -Z 2一ブロモベンジルォキシカルボニル
B o c t一ブトキシカルボニル
DNP ジニトロフエノール
T r t トリチル
Bum tーブ卜キシメチル
Fmo c N— 9—フルォレニルメトキシカルポニル
HOB t 1—ヒドロキシベンズトリアゾ一ル
HOOB 3， 4—ジヒドロー 3—ヒドロキシー 4—ォキソ一
1, 2, 3—べンゾ卜リアジン
HONB ： 卜ヒドロキシ- 5-ノルボルネン -2, 3-ジカルボキシイミド
ATP ：アデノシン三リン酸
EDTA ：エチレンジァミン四酢酸
SDS ： ドデシル硫酸ナトリウム
本明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
〔配列番号： 1〕
本発明のヒト脳由来蛋白質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 2〕
配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を有する本発明のヒト脳由来蛋白質 をコードする DNAの塩基配列を示す （ZAQC) 。
〔配列番号： 3〕 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を有する本発明のヒト脳由来蛋白質 をコードする DN Aの塩基配列を示す （ZAQT) 。
〔配列番号： 4〕
後述の実施例 1で用いられたプライマ一 1の塩基配列を示す。
〔配列番号： 5〕
後述の実施例 1で用いられたプライマー 2の塩基配列を示す。
〔配列番号： 6〕
後述の実施例 2で用いられたプライマー 3の塩基配列を示す。
〔配列番号： 7〕
後述の実施例 2で用いられたプライマー 4の塩基配列を示す。
〔配列番号： 8〕
後述の実施例 2で用いられた ZAQprobeの塩基配列を示す。
〔配列番号： 9〕
後述の実施例 2で用いられたプライマー ZAQC Salの塩基配列を示す。
〔配列番号： 10〕
後述の実施例 2で用いられたプライマー ZAQC Speの塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 1〕
後述の実施例 3 (3-8)で精製された ZAQ活性化ペプチドの N末端のァミノ 酸配列を示す。
〔配列番号： 12〕
後述の実施例 4で用いられた ZF1の塩基配列を示す。
〔配列番号： 13〕
後述の実施例 4で用いられた 一 ZF2の塩基配列を示す c
〔配列番号： 14〕
後述の実施例 4で用いられた ― ZF3の塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 5〕
後述の実施例 4で得られたヒ 一ドする DNAの 3 ' 端塩基配列を示す。 〔配列番号： 16〕
後述の実施例 4で用いられたプライマ一 ZAQL-CFの塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 7〕
後述の実施例 4で用いられたプライマ一 ZAQL- XR1の塩基配列を示す。
〔配列番号： 18〕
後述の実施例 4で得られた DNA断片の塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 9〕
後述の実施例 4で得られた DNA断片の塩基配列を示す。
〔配列番号： 20〕
ヒト型 ZAQリガンド成熟体ペプチドのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 21〕
ヒト型 Z A Qリガンド成熟体べプチドのァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 22〕
ヒト型 Z A Qリガンド前駆体べプチドのァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 23〕
ヒト型 Z A Qリガンド前駆体べプチドのァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 24〕
配列番号： 28で表わされるヒト型 ZAQリガンド前駆体ペプチドをコード する DNAを含有する DNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 25〕
配列番号： 29で表わされるヒト型 ZAQリガンド前駆体ペプチドをコード する DNAを含有する DNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 26〕
配列番号： 20で表わされるヒト型 ZAQリガンド成熟体ペプチドをコード する DNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 27〕
配列番号： 2 1で表わされるヒト型 ZAQリガンド成熟ペプチドをコードす る DNAの塩基配列を示す。 〔配列番号： 28〕
配列番号： 22で表わされるヒ卜型 ZAQリガンド前駆体ペプチドをコード する DNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 29)
配列番号： 23で表わされるヒ卜型 ZAQリガンド前駆体ペプチドをコード する DNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 30〕
後述の実施例 5 (5- 1) で用いられた DNA断片の塩基配列を示す。
〔配列番号： 31〕
後述の実施例 6 (6-2) で分析された、 ヒト型 ZAQリガンドペプチドの N末端アミノ酸配列を示す。
後述の実施例 1で得られた形質転換体ェシエリヒア コリ （Escherichia colODH 5 α/ρ CR 2. 1— ZAQCは、平成 1 1年 8月 23日から、 日本 国茨城県つくば巿東 1一 1一 3 通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究 所 （N I BH) に寄託番号 FERM B P— 6855として、 平成 11年 8月 4日から、 日本国大阪府大阪市淀川区十三本町 2— 17— 85 財団法人 ·発 酵研究所 （I FO) に寄託番号 I FO 16301として寄託されている。 後述の実施例 1で得られた形質転換体ェシヱリヒア コリ （Escherichia coli) DH5 a/pCR2. 1— ZAQTは、 平成 1 1年 8月 23日から通商 産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（N I BH)に寄託番号 F E RM B P- 6856として、 平成 1 1年 8月 4日から財団法人 ·発酵研究所（I FO) に寄託番号 I F O 16302として寄託されている。
後述の実施例 4で得られた形質転換体ェシエリヒア コリ （Escherichia coli) TOPlO/pHMITAは、 平成 12年 7月 13日から通商産業省工業技術院生命 工学工業技術研究所 （N I BH) に寄託番号 FERM BP— 7219として、 平成 12年 5月 26日から財団法人 ·発酵研究所 （I FO) に寄託番号 I FO 16440として寄託されている。
後述の実施例 4で得られた形質転換体ェシエリヒア コリ （Escherichia coli) TOPlO/pHMITGは、 平成 12年 7月 13日から通商産業省工業技術院生命 工学工業技術研究所 （N I BH) に寄託番号 FERM BP— 7220として、 平成 1 2年 5月 26日から財団法人 ·発酵研究所 （ I FO) に寄託番号 I F〇 1 6441として寄託されている。
以下に実施例を示して、 本発明をより詳細に説明するが、 これらは本発明の 範囲を限定するものではない。 なお、 大腸菌を用いての遺伝子操作法は、 モレ キユラ一'クローニング （Molecular cloning) に記載されている方法に従った。 実施例 1 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 Z AQをコードする c DNAの クローニングと塩基配列の決定
ヒト脳下垂体 cDNA (CLONTECH社） を铸型とし、 2個のプライマ 一、 プライマ一 1 (5'- GTC GAC ATG GAG ACC ACC ATG GGG TTC ATG G -3' ；配列番号： 4) 及びプライマ一 2 (5'- ACT AGT TTA TTT TAG TCT GAT GCA GTC CAC CTC TTC -3' ；配列番号： 5) を用いて PCR反応を行 つた。 該反応における反応液の組成は上記 c DNAの 10分の 1量を铸型とし て使用し、 Advantage2 Polymerase Mix (CLONTECH社） 1Z50量、 プライマ一 1及びプライマー 2を各 0.2^M, dNTPs 200^Μ、 及び酵素に添付 のバッファーを加え、 25 1の液量とした。 PCR反応は、 94°C ' 2分の後、 94°C · 20秒、 72 °C · 100秒のサイクルを 3回、 94°C · 20秒、 68°C · 100秒のサイクルを 3回、 94°C ' 20秒、 64°C · 20秒、 68°Ο 1 0 0秒のサイクルを 38回繰り返し、 最後に 68°C， 7分の伸長反応を行った。 該 PCR反応後の反応産物を TAクローニングキット （Invitrogen社） の処方 に従いプラスミドベクター PCR2.1 (Invitrogen社） へサブクローニングした。 これを大腸菌 DH 5 αに導入し、 c DNAをもつクローンをアンピシリンを含 む LB寒天培地中で選択した後、 個々のクローンの配列を解析した結果、 新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質をコ一ドする 2種類の c DNA配列 Z AQC (配列番号： 2) 及び ZAQT (配列番号： 3) を得た。 この cDNAより導 き出されるアミノ酸配列を有する蛋白質はいずれも同一配列 （配列番号： 1) を有したため ZAQと命名し、 配列番号： 2で表される DNAを含有する形質 転換体を大腸菌 (Escherichia coli) DH5 a/pCR2.卜 ZAQCならびに配列番号： 3で表される DNAを含有する形質転換体を大腸菌 DH5a/pCR2.卜 ZAQTと命名 した。 実施例 2 Taqman PCRによる ZAQの発現分布の解析
Taqman PCRに用いるプライマー及びプローブは、 Primer Express ver.1.0 (PE バイオシステムスジャパン ）を用いて検索し、 プライマー 3 ( 5' - TCATGTTGCTCCACTGGAAGG - 3' (配列番号： 6 ) ) , プライマー 4 (5'- CCAATTGTCTTGAGGTCCAGG-3' (配列番号 ： 7 ) ) , ZAQprobe ( 5' - TTCTTACAATGGCGGTAAGTCCAGTGCAG - 3' (配列番号： 8) ) を選択した。 プローブ のリポ一夕一色素として、 FAM ( 6-carboxyfluorescein ) を付加した。
スタンダード DNA として、 pAK— ZAQC を铸型に、 プライマー ZAQC Sal (5' - GTCGACATGGAGACCACCATGGGGTTCATGG- 3' (配列番号： 9 ) )および ZAQC Spe( 5'- ACTAGTTTATTTTAGTCTGATGCAGTCCACCTCTTC - 3' (配列番号： 1 0) )を用いて増 幅した PCR断片を、 CHROMA SPIN200 ( CLONTECH Laboratories, Inc. ( CA， USA ) ) を用いて精製し、 10 Q_10 6コピー/ 1 に調整して使用した。 各組 識の cDNAソースとして、 Human Multiple Tissue cDNA Panel Iおよび Panel II ( CL0NTECH Laboratories, Inc. ) を 使用した。 プライマ一、 プローブ、 铸型に、 Taqman Universal PCR Master Mix ( PE バイオシステムスジャパン） を添付書類記載の規定量加え、 ABI PRISM 7700 Sequence Detection System ( PE バイォシステムズジャパン） で PCR反応および解析をおこなった。
結果を図 8および表 1に示した。 主に精巣、 ついで肺、 脳等の部位で ZAQの 発現がみられた。 表 1
t issue ZAQ(copies/ l)
Brain 6. 1
Heart 2.9
Kidney 2.8
Liver 2.6
Lung 7.0
Pancreas 2. 1
Placenta 3.2
Skeletal Muscle 2.6
Colon 1.8
Ovary 3.4
Leukocyte 0.0
Prostate 0.7
Smal 1 Intestine 2.2
Spleen 2. 1
Test is 28.0
Thymus 1. 1 実施例 3 ZAQを活性化するべプチドの単離
(3-1) 牛乳抽出液の調製
市販の低温殺菌牛乳を用いて、 以下の操作を行い抽出液を調製した。 牛乳 2 literを高速遠心機（CR26H、 R10A型ローター：日立株式会社） を用いて、 10,000 rpm, 15分間、 4°Cで遠心し、 得られた上清をガーゼでろ過し、 脂質片を取り除 いた。 上清に最終濃度 1 Mになるように酢酸を加え、 4°Cにて 30分間攪拌し、 次 いで高速遠心機 （CR26H、 R10A型ローター：日立株式会社） を用いて 10, 000 rpm、 15分間遠心し上清をガーゼでろ過し不溶物を除去した。 上清に撹拌しながら 2 倍容のアセトンを加え 4°Cにて 3時間攪拌した。次いで高速遠心機（CR26H、 R10A 型ローター： 日立株式会社） を用いて 10, 000 rpm、 15分間遠心後、 得られた上 清をガーゼでろ過し不溶物を除去した。 得られた上清をロータリーエバポレー 夕一にかけ、 アセトンを除去し、 最終的に 1350 mlまで濃縮した。 得られた濃縮 液を、 675 mlごとに 338 mlのジェチルェ一テルと混合し、 分液ロート中にて激 しく混和し、 2相分離後、 水相を得た。 得られた水相について同じ操作をさら に 1回繰り返し、 清澄な水相を得た。得られた水相を、 ロータリ一エバポレー夕 —を用いて 800 mlまで濃縮し、 最終的な抽出液を得た。 (3— 2) 牛乳抽出液の CI 8逆相クロマトグラフィーによる粗分画
ォク夕デシル基を固定したシリ力ゲルを充填した力ラム Sep-Pak C18 (Waters 社） 10 gをメタノールで膨潤後、 1 M酢酸で平衡化した。 このカラムに、 （3 —1) で調製した抽出液 （牛乳 2 liter分） を添着した。 続いて、 このカラムに、 100 mlの 1 M酢酸を流しゲルを洗浄した。 次に、 このカラムに 200 mlの 60% ァ セトニトリル /0. トリフルォロ酢酸を流し、 目的とする粗ペプチド成分を溶 出した。 得られた溶出液を、 エバポレーターを用いて濃縮した後、 凍結乾燥機 (12EL； VirTis社) にて凍結乾燥した。 (3-3) 牛乳抽出液のスルホプロピルイオン交換クロマトグラフィーによる 粗分画
ポリプロピレン製のカラムに 100 mM塩酸中で膨潤させた SP Sep adex C-25 (Amersham Pharmacia Biotech社） を、 容量が 2 mlになるよう充填し、 蒸留水 及び 2 Mギ酸アンモニゥム（pH 4.0)で洗浄した後、 I液 （2 M ギ酸アンモニゥ ム：ァセトニトリル：水 =1:25:74) で平衡化した。 上記 （3_2) で得られた 凍結乾燥物を I液 20 mlに溶解し、 SP Sephadex C-25 2 mlにロードした。 I液 10mlで洗浄後、 II液（2M ギ酸アンモニゥム：ァセトニトリル：水 =1 :2.5:6.5)、 III液 （2 Mギ酸アンモニゥム：ァセトニトリル：水 =1:1 :2) 、 IV液 （2 M ギ 酸アンモニゥム：ァセトニトリル：水 =1:0.5:0.5) 各 10 mlで順次溶出した。 得られた I液から IV液を、 それぞれ凍結乾燥機（12EL ; VirTis社） にて凍結乾 燥した。
(3— 4) 牛乳抽出液の TSKgel ODS80TS逆相高速液体クロマトグラフィーによ る分画
TSKge 1 ODS-80TS逆相高速液体クロマトグラフィー用カラム（東ソ一株式会社、 4.6 國 X 25 cm) を、 40°Cにて、 流速 1 ml/minで A液 （0. トリフルォロ酢 酸/蒸留水）容量 81.7%/B液（0.1¾ トリフルォロ酢酸/ 60% ァセトニトリル）容 量 8.3%を流し、 平衡化した。 上記 （3— 3) で得られた I液から IV液の凍結乾 燥物 を、 それぞれ 1 M酢酸 4mlに溶解しクロマトグラフィー操作に処した。 即 ち、 凍結乾燥物の溶液 4 mlを該カラムに添着した後、 流速 l ml/minで、 1分間か けて A液容量 67%ZB液容量 33% まで上昇させ、 次いで 40分間かけて A液容量 67%/B液容量 33%から A液容量 0%ZB液容量 100% まで、 B液濃度を直線的グ ラジェン卜で上昇させた。
溶出液を、 1 mlずつフラクション番号をつけて分取し、 各フラクション 2 u\ を 150 1 の 0.2% Bovine Serum Albumin (BSA) /蒸留水と混合し凍結乾燥した。 この乾燥物を後述の （3— 5) に記した細胞内 Caイオン濃度上昇活性測定用の アツセィ用サンプルとした。
(3— 5) FLIPRを用いた細胞内 Caイオン濃度上昇活性の測定
ZAQ安定発現細胞株は以下のようにして調製した。 すなわち、 実施例 1で得 た DH5 aZpCR 1— ZAQCの 1クローンを、 アンピシリンを含む LB培地で振と う培養し、 プラスミド pCR2.1-ZAQCを得た。 これを制限酵素 Sal Iおよび Spe Iで処理し、 ZAQCをコードするインサート部分を切り出した。 同様に制限酵素 Sal Iおよび Spe Iで処理した pAKKO— 1.11Hと、 該インサート部分を Ugat ion Express Kit ( CLONTECH Laboratories, Inc. ( CA, USA ) ) を用いて連 結し、 大腸菌 DH10Bにエレクト口ポーレーシヨン法にて導入した。 得られたク ローンの有するプラスミドの構造を、 制限酵素処理ならびに配列解析で確認し、 正しい構築のものを CH0細胞発現用プラスミド pAK— ZAQCとして使用した。 このプラスミ ド pAK— ZAQCを CHO/dhfr—細胞 （American Type Culture Col lection) に CellPhect Transfection kit (Amersham Pharmacia Biotech¾) を用いて形質導入することにより取得した。まず、蒸留水 120 1に溶解したプ ラスミド DNA4 xgに対して Buffer A (Cel lPhect Transfect ion Ki tに添付） 120 1を添加し、 撹拌し、 10分間静置後、 Buffer B (CellPhect Transfection Kit に添付） 240 1を添加し、 激しく撹拌し該 DNAを含有する DNA_リン酸カル シゥム複合体を形成させた。 5 X 105個の CH0/ dhfr細胞を 60 匪シャーレに 播き、 10%のゥシ胎児血清 （BIO WHITTAKER社） を含む Ham's F-12培地 （日水 製薬株式会社） 中で 37°C、 5%炭酸ガス中で 1日間培養した後、 該 DNA—リン 酸カルシウム複合体の懸濁液 480 をシャーレの該細胞上に滴下させた。 こ れを、 37°C、 5%炭酸ガス中にて 6時間培養した後、 血清を含まない Ham's F - 12培地で 2回細胞を洗浄し、 シャーレの該細胞上に 15%グリセロールを含む緩 謹（140 mM NaCl, 25 mM HEPES, 1.4 mM Na2HP04, pH7.1) 1.2mlを添加し 2分 間処理した。 これを、 再度、 血清を含まない Ham's F-12培地で 2回洗浄した後、 10%のゥシ胎児血清を含む 111' 5?-12培地中で37で、 5%炭酸ガス中で一晩培養 した。 該細胞をトリプシン処理により分散させてシャーレから回収し、 2 x l04 個ずつ 6- well plateに植え込み、 透析済み 10%ゥシ胎児血清 (JRH BIOSCIENCES 社） 、 1 mM MEM非必須アミノ酸溶液 （大日本製薬株式会社） 、 100 units/ml Penicillin, 100 n g/ml Streptomycinを含む Dulbecco s modified Eagle medium (DMEM) 培地 （日水製薬株式会社） 中にて 37° (：、 5%炭酸ガス中にて培養 を開始した。 プラスミドの導入された形質転換 CH0細胞は該培地中で生育する が、 非導入細胞は次第に死滅していくので、 培養開始 1日目、 および 2日目に培 地を交換して死滅細胞を除去した。培養開始 8 -10日後に生育してきた形質転換 CH0細胞のコロニーを約 21個選んだ。 それぞれ選択された細胞から RNAを市販の RNA単離用キットを用いて回収し、 以降公知の RT-PCR法により ZAQを高発現する ZAQ発現 CH0細胞 B- 1番クローン（以後 ZAQC- B1細胞と略称する）を選別した。
また、 対照として ETA (エンドセリン Aレセプ夕一） 発現 CH0細胞 24番クロ ーン （以後 ETA24細胞と略称する。 Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 279卷、 675 - 685頁、 1996年参照） を用いた。
上記 （3— 4) で得られたアツセィ用サンプルについて、 ZAQC-B1細胞及び ETA24細胞における細胞内 Caイオン濃度上昇活性の測定を FLIPRCMolecular Devices社）を用いて行った。 ZAQC- B1細胞、 ETA24細胞共に 10%透析処理済ゥシ 胎児血清（以後 d FBSとする）を加えた DMEMで継代培養しているものを用いた。 ZAQC-B1細胞、 ETA24細胞をそれぞれ 15X104cells/mlとなるように培地（10% d FBS-DMEM)に懸濁し、 FLIPR用 96穴プレート（Black plate clear bottom、 Coster 社）に分注器を用いて各ゥエルに 200 a 1ずつ植え込み（3.0X104cells/200 1/ ゥエル）、 5% C02インキュベータ一中にて 37°Cで一晩培養した後用いた（以後細 胞プレートとする）。 H/HBSS (二ッスィハンクス 2 (日水製薬株式会社） 9.8g、 炭酸水素ナトリウム 0.35g、 HEPES 4.77 g 、 水酸化ナトリウム溶液で pH7.4 に合わせた後、 フィル夕一滅菌処理） 20ml、 250 mM Probenecid 200 1、 ゥ シ胎児血清 (FBS) 200 を混合した。 また、 Fluo 3- AM (同仁化学研究所） 2 バイアル（50 g)をジメチルスルフオキサイド 40 1、 20% Pluronic acid (Molecular Probes社) 40 Iに溶解し、これを上記 H/HBSS— Probenecid— FBS に加え、混和後、 8連ピぺットを用いて培養液を除いた細胞プレートに各ゥエル 100 1ずつ分注し、 5% C02インキュべ一夕一中にて 37°Cで 1時間インキュベー トした（色素ローデイング)。 上記 （3— 4) で得られたアツセィ用サンプルに ついて、 各フラクションに、 2.5 mM Probenecid, 0.2% BSAを含む H/HBSS 150 lを加えて希釈し、 FLIPR用 96穴プレート（V- Bottomプレート、 Coster社）へ移 した（以後、 サンプルプレートとする）。 細胞プレートの色素ローデイング終了 後、 H/HBSSに 2.5mMProbenecidを加えた洗浄バッファ一でプレートゥォッシャ —(Molecular Devices社）を用いて細胞プレートを 4回洗浄し、 洗浄後 100 1 の洗浄バッファ一を残した。この細胞プレートとサンプルプレートを FLIPRにセ ットしアツセィを行った（FUPRにより、 サンプルプレートから 50 lのサンプ ルが細胞プレートへと移される）。
その結果、 上記 （3— 3) IV液を上記 （3— 4) 逆相高速液体クロマトダラ フィ一分離して得られたフラクション No.53に ZAQC- B1細胞に特異的な細胞内 Ca ィォン濃度上昇活性が見られた。
(3-6) TSKgel Super- Phenyl逆相高速液体クロマトグラフィーによる精製 (1)
TSKgel Super- Phenyl逆相高速液体クロマトグラフィー用カラム（東ソ一株式 会社、 0.46 cm X 10 cm) を、 40°Cにて、 流速 1 ml/minで A液 （0. \% トリフル ォロ酢酸/蒸留水）容量 81.7%/B液（0.1¾ トリフルォロ酢酸/ 60% ァセトニトリ ル）容量 8.3%を流し平衡化した。 上記（3— 4) で得られたフラクション No.53 についてクロマトグラフィー操作を行った。 即ち、 フラクション No.53の溶液 1 mlを該カラムに添着した後、 流速 lml/minで、 1分間かけて A液容量 75%/B液 容量 25% まで上昇させ、 次いで 75分間かけて A液容量 67%ZB液容量 33 まで、 B液濃度を直線的グラジェン卜で上昇させた。
溶出液を、 500 1ずつフラクション No.をつけて分取した。 分取フラクショ ンより各 25 /1づっ 0.2% BSA 150 1と混合し凍結乾燥機 （12EL； VirTis社） で凍結乾燥させた。この乾燥物に、 2.5 mM Probenecid, 0.2% BSAを含む H/HBSS 150 u \ を加えて溶解し、 この溶液 50 1を用いて上記 （3— 5) の試験法に より、 細胞内 Caイオン濃度上昇活性を測定することにより、 ZAQC- B1細胞に対 するレセプ夕一活性化作用を測定した。その結果、 目的とする ZAQC- B1細胞に対 するレセプ夕一活性化作用を有する成分、 すなわち、 ZAQ活性化成分は、 主とし てフラクション No.103-105に溶出されていることが判明した。
(3-7) //RPC C2/C18 ST 4.6/100逆相高速液体クロマトグラフィーによる精 製
RPC C2/C18 ST 4.6/100逆相高速液体ク口マ トグラフィー用カラム (Amersham Pharmacia Biotech社、 0.46 cm x 10 cm)を、 40°Cにて、流速 1 ml/min で A液（ヘプ夕フルォロ酪酸/蒸留水）容量 95%/B液（0.1%ヘプ夕フルォロ酪酸 /100¾ ァセトニトリル） 容量^を流し平衡化した。
上記 （3— 6) で得られた TSKgel Super- Phenyl逆相高速液体クロマトグラフ ィ一分取フラクションのうちフラクション No.103- 105をそのまま; RPC C2/C18 ST 4.6/100逆相カラムに添着した後、流速 lml/minで 1分間で A液（0.1% へ プ夕フルォロ酪酸/蒸留水)容量 95%ZB液 (0. ヘプ夕フルォロ酪酸/ 100% ァ セトニトリル）容量 5%から A液容量 65%ZB液容量 35%まで急速に上昇させ、 こ れを次に、 流速 lml/minで、 60分間かけて A液容量 液容量 50% まで直線 的グラジェントで上昇させ溶出液を回収した。 溶出液は、 210 nmの紫外吸収で は単一なピークとして検出された。
溶出液を、 500 1ずつフラクション番号をつけて分取し、分取フラクション より各 10 づっを 0.2% BSA150 lと混合し凍結乾燥機 （12EL； VirTis社） で凍結乾燥させた。この乾燥物に、 2, 5 mM Probenecid, 0.2% BSAを含む H/HBSS 150 lを加えて溶解し、 この溶液 50 lを用いて上記（3— 5) の試験法によ り、 ZAQC-B1細胞に対するレセプ夕一活性化作用を測定した。 その結果、 目的 とする ZAQC- B1細胞に対するレセプ夕一活性化作用を有する成分、すなわち、 ZAQ 活性化成分は、 フラクション No.82- 84に溶出されていることが判明した。 この 活性ピークは、 210 MIの紫外吸収ピークに完全に一致し、 単一ペプチドにまで 精製されたものと判断した。 (3- 8) 精製された ZAQ活性化べプチドの構造解析
上記（3— 7)で得られた ZAQ活性化成分について以下の方法で構造決定を実 施した。 ZAQ活性化成分精製標品中の溶媒を真空濃縮機 （サーバント） を用い て除去し、 得られた乾固物を溶媒 DMS0 (ジメチルサルフォキシド）に溶解した。 この溶液の一部をプロティンシ一クェンサ一（パーキンエルマ一社、 PE Biosystems Procise 491cLC)を用いた N末端からのアミノ酸配列解析に供した。 その結果、 N末端のアミノ酸残基から 16番目のアミノ酸残基のうち、 14残基 を同定することができた （Ala Val lie Thr Gly Ala Xaa Glu Arg Asp Val Gin Xaa Arg Ala Gly (配列番号： 1 1 ; Xaaは未同定残基） ） 。 実施例 4 ヒ卜型 Z AQリガンドペプチドの cDNAのクローニング
実施例 3で得られた牛乳から精製された ZAQを活性化するぺプチドの N末端 アミノ酸配列 （配列番号： 1 1) をクエリーとしてデータベースを Blast検索し たところ、 配列番号： 1 1で表わされるアミノ酸配列を有するペプチドをコー ドする DNAの塩基配列と同等な配列を含むヒト EST(X40467)を見出した。本配 列は完全長のオープンリーディング 'フレームを有していなかつたので、 以下 に RACE法により未確定部分の配列を明らかにし、 引き続いて完全長のオープン リーディング ·フレームを有す cDNAクロ一ンを取得した。
EST (X40467) の情報よりプライマ一 ZF1 (配列番号： 12)、 ZF2(配列番号： 1 3)と ZF3(配列番号: 1 4)を作成し、ヒト精巣 Marathon- Ready cDNA (CLONTECH 社）を铸型として以下に記した 3' RACE実験を実施した。
ZF1： 5'-GGTGCCACGCGAGTCTCAATCATGCTCC-3' (配列番号： 1 2)
ZF2: 5'-GGGGCCTGTGAGCGGGATGTCCAGTGTG-3' (配列番号： 1 3)
ZF3: 5 ' -CTTCTTCAGGAAACGCAAGCACCACACC-3 ' (配列番号： 1 4)
3' RACEの PCR反応液は 50 x Advantage 2 Polymerase Mix (CLONTECH社）を 1 fi 1、 添付の 10 x Advantage 2 PCR buffer (400 mM Tricine-KOH, 150 mM KOAc, 35 mM Mg(0Ac)2 , 37.5 /ml BSA, 0.05%Tween-20, 0.05% Nonidet- P40)を 5 fi\, dNTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造）を 4 n 10 プライマー ZF1を 1 1、 10 プライマー API (プライマー APIは CLONTECH社の Marathon-Ready cMA Kit に添付のもの）を 1 翻 c腿 (CLONTECH社、ヒ卜精巣 Marathon- Ready cDNA) を 5 ^1、 及び蒸留水を 33 zlを混合して作製した。 反応条件は 94°C'60秒の初 期変性後、 94°C'30秒- 72°C'4分のサイクル反応を 5回、 94°C ·30秒- 70°C ·4分のサ ィクル反応を 5回、 94°Ο30秒- 68°C'44分のサイクル反応を 25回行った。
続いて、 該 PCR反応の反応液を铸型として nested PCRを実施した。 反応液は 50 X Advantage 2 Polymerase Mix (CLONTECH社）を 1 1、 添付の 10 x Advantage 2 PCR buffer (400 mM Tricine-KOH, 150 mM KOAc, 35 mM Mg(0Ac)2, 37. ^mg/ml BSA, 0.05¾Tween-20, 0.05% Nonidet- P40)を 5 1、 dNTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造）を 4
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10 プライマ一 ZF2を 1 l、 10 Μプライマ一 ΑΡ2 (プラ イマ一 ΑΡ2は CLONTECH社の Marathon-Ready cDNA Kitに添付のもの） を 1 1、 铸 型 DNA (該 PCR反応液 50倍希釈液） を 5 / K及び蒸留水を 33 を混合して作製 した。反応条件は 94°060秒の初期変性後、 94t>30秒- 72 >4分のサイクル反応 を 5回、 94°C'30秒- 70°O4分のサイクル反応を 5回、 94°C ·30秒- 68°C ·44分のサイ クル反応を 25回行った。
さらに続いて、 該 PCR反応の反応液を铸型として 2回目の nested PCRを実施し た。 反応液は 50 X Advantage 2 Polymerase Mix (CLONTECH社）を〗 1、 添付の 10 x Advantage 2 PCR buffer (400 mM Tricine-KOH, 150mMKOAc, 35 m.MMg(0Ac)2, 37.5^g/ml BSA, 0.05¾Tween-20, 0.05% Nonidet- P40)を 5 x K dNTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造）を 4 1, 10 Mプライマ一 ZF3を 1 1、 10 プライ マ一 AP2 (プライマー AP2は CL0NTECH社の Marathon- Ready cDNAKi tに添付のもの を用いた。 ） を 1 ^し 铸型 DM (該 PCR反応液 50倍希釈液） を 5 及び蒸留 水を 33 を混合して作製した。 反応条件は 94°Ο60秒の初期変性後、 94°O30 秒- 72°C' 4分のサイクル反応を 5回、 94DC'30秒- 70°C'4分のサイクル反応を 5回、 94°C'30秒- 68°C'44分のサイクル反応を 25回行った。得られた DNA断片を TOPO TA Cloning Kit (Invi trogen社）を用いて添付のマニュアルに記載された方法に従 つてクローニングした。 クローニングされた DNAの塩基配列を ABI377DNA sequencerを用いて解読し、 3'端配列 （配列番号： 1 5) を得た。
配列番号： 1 5で表わされる塩基配列及び EST (X40467) の情報によりプライ マー ZAQL- CF (配列番号： 1 6)及び ZAQL-XR1 (配列番号： 1 7)を作成した。 ヒ ト精巣 Marathon- Ready cDNA (CL0NTECH社）を铸型としてプライマ一 ZAQL- CF と ZAQL-XR1を いて PCRを実施した。
ZAQL-CF: 5' -CCACCATGAGAGGTGCCACG-3' (配列番号： 1 6)
ZAQL-XR1： 5' -CTCGAGCTCAGGAAAAGGATGGTG-3' (配列番号： 1 7)
PCR反応液は P fuTurbo DNA polymerase (Strat agene社)を 1 K添付の 10 xPCR bufferを 5 1> 2.5 mM dNTP mixtureを 4 n\, 10 Mプライマー ZAQL- CF及び ZAQL-XR1を各 2.5 1 、铸型 DNAを 5 し及び蒸留水を 30 /xlを混合して作製し た。 反応条件は 95°C'l分の初期変性後、 95°01分-60°01分-72°01分のサィク ル反応を 40回、および 72°C · 10分の最終伸長反応とした。得られた DNA断片を T0P0 TA Cloning Kit (Invi trogen社）を用いて添付のマニュアルに記載された方法に 従ってクロ一ニングした。 クローニングされた DNA断片の塩基配列を ABI377DNA sequencerを用いて解読した結果、 371bpの、 それぞれ配列番号： 1 8および配 列番号： 1 9で表わされる塩基配列を有していることが明らかとなった。 配列 番号： 1 8で表わされる塩基配列を有する DNA断片を有するプラスミドを pHMITA と、配列番号： 1 9で表わされる塩基配列を有する DNA断片を有するプラスミド を PHMITGと命名した。
プラスミド pHMITA及び pHMITGにより大腸菌 （Escherichia coli) をトランス フォームさせ、それぞれェシエリヒア コリ （Escherichia coli) ΤΟΡΙΟ/ρΗΜΙΤΑ およびェシエリヒア コリ （Escherichia coli) TOPlO/pHMITGと命名した。 これらの DNA断片の塩基配列を解析した結果、配列番号： 18で表わされる DNA 断片は、 配列番号： 22で表わされるヒト型 ZAQリガンド前駆体ペプチド（A タイプ、 105アミノ酸残基）をコードする DNA (配列番号： 28) を含んでおり、 配列番号： 1 9で表わされる DNA断片は、配列番号： 23で表わされるヒト型 Z A Qリガンド前駆体べプチド（Gタイプ、 105ァミノ酸残基）をコードする DNA (配 列番号： 29) を含んでいることが明らかとなった。
また、 配列番号： 28および配列番号： 29で表わされる塩基配列は典型的 なシグナル配列を有しており、 配列番号： 28で表わされる塩基配列を有する DNAは、 配列番号： 20で表わされるヒト型 ZAQリガンド成熟体べプチド（A タイプ、 86アミノ酸残基）をコードする 258塩基対からなる DNA (配列番号： 26) を含んでおり、配列番号： 29で表わされる塩基配列を有する DNAは、配列番号： 21で表わされるヒト型 ZAQリガンド成熟体ペプチド（Gタイプ、 86アミノ酸 残基）をコードする 258塩基対からなる DM (配列番号： 27) を含んでいること が明らかとなった。 実施例 5 ヒ卜型 ZAQリガンドペプチドの哺乳動物細胞での産生 （1)
( 5— 1 )ヒト型 ZAQリガンド前駆体べプチド哺乳動物細胞発現ベクターの構築 実施例 4において取得したプラスミド pHMITGから EcoRI、 Xho I制限酵素消化 によってヒト型 ZAQリガンド前駆体べプチドをコードする cDNAを含む 382bpの
DNA断片 （配列番号： 30) を切出した。
すなわち、プラスミド pHMITGを EcoRIおよび Xho Iで酵素消化し、得られた DM を 1.5 %ァガロースゲルを用いて電気泳動し、 サイバーグリーン染色される約 382 bpのバンドを含むゲル片を剃刀で切り取った。 該ゲル片より Gene Clean spin DNA抽出キット （BIO 101社） を用いて DNA断片を回収した。 得られた DNA 断片を CMV- IEェンハンサーおよび chicken beta- act in promoterを発現プロモ一 夕一とする哺乳動物細胞発現ベクター PCAN618 (図 1 1) に対して EcoRI、 Xho I 制限酵素切断部位に定法に従ってクローニングした。 クロ一ニングされた DNA 断片の塩基配列を前述の方法により解読した結果、 配列番号： 30で表わされ る塩基配列を有していることが確認された。このヒト型 ZAQリガンド前駆体べプ チドをコ一ドする DNAを有する哺乳動物細胞発現べクタ一を pCANZAQLg2と命名 した。
(5-2) C0S7細胞への発現ベクターの導入
C0S7細胞は ATCCより購入し、 DMEM培地 （10% FBSを加えたもの） を用いて継 代培養しているものを用いた。 DMEM培地を用いて C0S7細胞を 1.5 X 106cells/dishとなるよう 10cmシャーレにまき、 37°C、 5% C02インキュベータ一 中で一晩培養した。 ヒト型 ZAQリガンド前駆体べプチド発現プラスミ ド (pCANZAQLg2) l g (2 1の TEバッファ一に溶解) にバッファー EC (Effectene transfection reagent, QIAGEN) 298 1を加え、 さらに Enhancer 16 1を加え、 1秒間混和後室温で 3分間放置した。 さらに Effectene Transfection Reagent 60 wlを加え、 10秒間混和後室温で 10分間放置した。前日にまいた細胞の上清を除 き、 DMEM培地 10mlで 1回洗浄し、 DMEM培地を 9 mlを加えた。 プラスミド溶液に DMEM培地 lmlを加えて混和後細胞に滴下し、 全体を混ぜた後 37°C、 5% C02インキ ュべ—夕—中でー晚培養した。 DMEM培地！0 mlで 2回洗浄し、 DMEM培地 10mlを 加え、 37°C、 5 C02インキュベータ一中で一晩培養した。 2日後、 培養上清を回 収した。
(5- 3) ヒ卜型 ZAQリガンド前駆体べプチド発現 C0S7細胞培養上清からの ZAQ を活性化するペプチドの部分精製
( 5— 3— 1 )ヒト型 ZAQリガンド前駆体べプチド発現 C0S7細胞培養上清抽出液 の調製
ヒト型 ZAQリガンド前駆体ペプチド発現 C0S7細胞培養上清を回収し、以下の操 作を行い抽出液を調製した。 先ず、 細胞培養上清 （約 18.5ml) に終濃度が 1 M になるように齚酸 1.1 mlを滴下し、 一時間攪拌した。 さらにその 2倍容量のァセ トンを加え、 4°Cにて 30分間攪拌し、次いで高速遠心機（CR26H、 23型ロー夕一： 日立株式会社） を用いて 15, 000 rpm, 30分間遠心し上清を得た。 得られた上清 をエバポレー夕一にかけ、 アセトンを除去した後、 凍結乾燥機 （1 2 EL ； VirTis社) にて凍結乾燥した。
(5— 3 - 2) ヒト型 ZAQリガンド前駆体べプチド発現 C0S7細胞培養上清の Sephadex G50ゲルろ過クロマトグラフィー及び SepPakカラムクロマトグラフィ 上記 （5— 3— 1) で得られた凍結乾燥粉末を 1M酢酸 2mlに溶解後、 1 M酢酸 で平衡化した Sephadex G15 (直径 3cm、 35mK Pharmacia Biotech 社）カラムに 吸着させた後、 1 M酢酸をカラムに流し、 溶出液を 5 mlづっフラクション No.を つけて分取し、 凍結乾燥機 （1 2EL ； VirTis社） で凍結乾燥させた。
SepPak C18-5gカラム （10ml) を、 メタノールにて膨潤後、 0. トリフルォ 口酢酸/蒸留水を流し、 平衡化した。 Sephadex G50ゲルろ過クロマトグラフィー 分取フラクションのうちフラクション No.卜 16の凍結乾燥品をまとめて 0.1%ト リフルォロ酢酸/蒸留水 3mlに溶解し、 SepPakC18- 5gカラムに添着した後、 0.1% トリフルォロ酢酸/蒸留水 24mlで洗浄後、 0.1% トリフルォロ酢酸/ 60% ァセト 二トリル 20mlで溶出した。 得られた溶出液をサーバントにかけた。 (5-3-3) Super 0DS逆相高速液体クロマトグラフィーによる精製
TSKgel Super 0DS逆相高速液体クロマトグラフィー用カラム （東ソ一株式会 社、 0.46 cm X 10 cm) を、 40°Cにて、 流速 1 ml/minで A液 （0.1¾ トリフルォ 口酢酸/蒸留水） を流し、 平衡化した。 （5— 3— 2) で得られた SepPak C18 - 5gカラムフラクションをサーバントにかけた後、 Super 0DS逆相高速液体ク口マ トグラフィ一に添着し、流速 1 ml/minで 60分間で A液（0.1% トリフルォロ酢 酸/蒸留水） 容量 100%/B液 （0.1% トリフルォロ酢酸 /60 ァセトニトリル） 容量 0¾から A液容量 0 %/ 液容量 100%まで直線的グラジェン卜で上昇させ、溶 出液を回収した。 溶出液を、 1 mlずつフラクション No.をつけて分取し、 分取フラクション全量 を凍結乾燥機 （12EL； VirTis社） で凍結乾燥させた。 この乾燥物に H/HBSS に 2.5mM Probenecid 、 0.2% BSAを加えたもの 150 1を加えて溶解し、 この溶 液を用いて下記 （5— 3— 4) の試験法により、 ZAQC- B1細胞に対するレセプ 夕一活性化作用を測定した。
(5— 3— 4) FLIPRを用いた細胞内 Caイオン濃度上昇活性の測定
上記 （5— 3— 3) で得られたサンプルについて、 実施例 3 (3-5) で得 られた ZAQ発現細胞 （ZAQC- B1) における細胞内 Caイオン濃度上昇活性の測定を FLIPRを用いて行った。 また、 対照として h0T7T175発現細胞（hOT7T175- 16； WO 00/24890に記載）を用いた。
ZAQC- B1細胞、 h0T7T175-16細胞共に 10%透析処理済ゥシ胎児血清 (以後 d FBS とする）を加えた DMEMで継代培養しているものを用いた。 ZAQC- B1細胞、 hOT7T175-16細胞をそれぞれ 15X 104cells/nilとなるように培地 (10%dFBS- DMEM)に懸濁し、 FLIPR用 96穴プレート（Black plate clear bottom. Coster社） に分注器を用いて各ゥエルに 200 ilずつ播き（3.0 104 6115/200 1/ゥェル）、 5% C02インキュベータ一中で 37°Cで一晩培養した後、 用いた（以後細胞プレー トとする）。 H/HBSS (HANKS' 9. 、 炭酸水素ナトリウム 0.35g、 HEPES 4.77 g、 水酸化ナトリウムで pH7.4に合わせた後、 フィルター滅菌処理） 21ml、 50mM Probenecid 210 1、 ゥシ胎児血清（FBS) 210 1を混合した。 また、 Fluo3-A 2 バイアル（50 g)をジメチルスルフオキサイド 42 1、 20% Pluronic acid 42 ilに溶解し、 これを上記 H/HBSS— Probenecid— FBS に加え、 混和後、 8連ピぺ ットを用いて培養液を除いた細胞プレートに各ゥエル 100 1ずつ分注し、 5% C02インキュベータ一中で 37°Cで 1時間インキュベートした（色素ローディング）。 上記 （5— 3— 3) で得られたアツセィ用サンプルについて、 各フラクション に H/HBSSに 2.5mM Probenecid 、 0.2% BSAを加えたもの 150 1を加えて溶解し、 FL IPR用 96穴プレート（V- Bottomプレート、 Coster社）へ移した（以後、 サンプル プレートとする）。 細胞プレートの色素ローデイング終了後、 H/HBSSに 2.5mM Probenecidを加えた洗浄バッファーでプレートウォッシャー（Molecular Dev i ces社）を用いて細胞プレートを 4回洗浄し、 洗浄後 100 1の洗浄バッファ —を残した。 この細胞プレートとサンプルプレートを FLIPRにセットし、 アツセ ィを行った（FLIPRにより、 サンプルプレー卜から 0.05mlのサンプルが細胞プレ 一卜へと移される）。 フラクション No.48- 68に ZAQC- B1細胞特異的な細胞内 Caィ オン濃度上昇活性が見られた。 このことから、 目的とする ZAQC-B1細胞に対する レセプ夕一活性化作用を有する成分、 すなわち、 ZAQ活性化成分は、 フラクショ ン No.48- 68に溶出されていることが判明した。 実施例 6 ヒト型 ZAQリガンドペプチドの哺乳動物細胞での産生 （2)
(6 - 1) 培養上清の調製
実施例 5に記載した方法で C0S7細胞にヒ卜型 ZAQリガンド前駆体ペプチド発 現プラスミド （pCANZAQLg2) を導入した。 すなわち、 DMEM培地を用いて C0S7細 胞を 3.0X106cells/dishとなるよう 15cmシャーレにまき、 37°C、 5% C02インキ ュベータ一中で一晩培養した。ヒト型 ZAQリガンド前駆体べプチド発現プラスミ ド（pCANZAQLg2) 4 g (4 1の TEバッファ一に溶解）にバッファ一 EC (Effectene transfection reagent, QIAGEN) 600 zlを加え、 さらに Enhancer 32 1を加え、 1秒間混和後室温で 3分間放置した。 さらに Eifectene Transfection Reagent 120 を加え、 10秒間混和後室温で 10分間放置した。前日にまいた細胞の上清を除 き、 DMEM培地 10 mlで 1回洗浄し、 DMEM培地を 30 mlを加えた。 プラスミド溶液 に DMEM培地 lmlを加えて混和後細胞に滴下し、 全体を混ぜた後 37° (：、 5% C02イン キュベ一夕一中でー晚培養した。 DMEM培地 10 mlで 1回洗浄し、 DMEM培地 20ml を加え、 37°C、 5% C02インキュベータ一中でー晚培養した。 1日後、 培養上清を 回収し、 さらに DMEM培地 20mlを加え、 37° (：、 5% C02インキュベータ一中でー晚 培養した後培養上清を回収した。
(6-2) 培養上清からのヒト型 ZAQリガンドぺプチドの精製
(6- 1) に記載した方法で 15 cmシャーレ 80枚分の培養上清を回収し、 こ れに酢酸を終濃度 1Mになるように添加した。 1時間攪拌した後、 2倍容のァセ トンを添加し蛋白質を析出させた。 4°Cにて 30分間攪拌し、 次いで高速遠心機 (CR26H, RR10A型口一夕一 ： 日立株式会社） を用いて 10， 000 ΠΜ, 30分間遠心 し上清を得た。 得られた上清をエバポレー夕一にかけアセトンを除去し、 あら かじめ 0.1% トリフルォロ酢酸/蒸留水で平衡化した逆相カラム （Waters社 C18、 100 g) に流した。 0.1 トリフルォロ酢酸/蒸留水 1000ml、 次いで 0.1% トリフ ルォロ酢酸 /20% ァセトニトリル 1000mlでカラムを洗浄した後、 0.1 トリフル ォロ酢酸/ 60% ァセトニトリル 1000mlでペプチドを溶出した。得られた溶出液を エバポレー夕一にかけた後、 凍結乾燥器（1 2 EL； VirTis社） にて凍結乾燥 した。
TSKgel ODS80TM逆相高速液体クロマトグラフィー用カラム （東ソ一株式会社、 21.5 匪 X 30 cm) を、 40°Cにて、 流速 4 ml/minで A液 （0.1% トリフルォロ酢 酸/蒸留水） を流し、 平衡化した。 得られた凍結乾燥粉末を A液に溶解した後、 該 0DS80TMカラムに添着し、 流速 4ml/minで 120分間に A液（0.1 トリフルォ 口酢酸/蒸留水）容量 60%/B液（0.1% トリフルォロ酢酸/ 60% ァセトニトリル） 容量 40 から A液容量 0 %/B液容量 100%まで直線的グラジェントで上昇させて、 ペプチドを溶出させた。
溶出液を、 8 mlずつフラクション No.をつけて分取し、 分取フラクションか ら 50 を取り凍結乾燥機 （1 2 EL； VirTis社） で凍結乾燥させた。 この乾 燥物に H/HBSSに 2.5mM Probenecid 、 0.2% BSAを加えたもの 200 1を加えて溶 解し、 この溶液を用いて上記 （5— 3— 4) の試験法により、 ZAQC-B1細胞に 対するレセプ夕一活性化作用を測定した。その結果、 目的とする ZAQC- B1細胞に 対するレセプ夕一活性化作用を有する成分、 すなわち、 ZAQ活性化成分は、 フラ クシヨン No. 32に溶出されていることが判った。
TSKgel CM- 2SWイオン交換高速液体クロマトグラフィー用カラム（東ソ一株式 会社、 4.6 讓 X 25 cm) を、 25 °Cにて、 流速 1 ml/minで A液 （10 mMぎ酸アン モニゥム /10 ァセトニトリル） を流し、 平衡化した。 上記フラクション No.32 を該 CM- 2SWカラムに添着し、 流速 1 ml/minで 60分間に A液 （10 mMぎ酸アン モニゥム /10% ァセトニトリル） 容量 100%ZB液 （1000 mMぎ酸アンモニゥム /10% ァセトニトリル） 容量 0%から A液容量 0%/B液容量 100%まで直線的ダラ ジェン卜で上昇させて、 ペプチドを溶出させた。
溶出液を、 1 mlずつフラクション No.をつけて分取し、 分取フラクションか ら 1.5 lを取り、 これを H/HBSSに 2.5mM Probenecid 、 0.2% BSA 希釈 し、 この溶液を用いて上記 （5— 3— 4) の試験法により、 ZAQC-B1細胞に対 するレセプター活性化作用を測定した。その結果、 目的とする ZAQC-B1細胞に対 するレセプ夕一活性化作用を有する成分、 すなわち、 ZAQ活性化成分は、 フラク ション No. 56および 57に溶出されていることが判った。
TSKgel Super phenyl逆相高速液体クロマトグラフィー用カラム （東ソ一株式 会社、 4.6 誦 X 10 cm) を、 40 °Cにて、 流速 1 ml/minで A液 （0.1¾ トリフル ォロ酢酸/蒸留水） を流し、 平衡化した。 上記フラクション No.56および 57を 該 Super phenylカラムに添着し、 流速 1 ml/minで 60分間に A液 （0. トリ フルォロ酢酸/蒸留水）容量 70%ZB液（0.1% トリフルォロ酢酸 /60% ァセトニ トリル） 容量 30 から A液容量 50%ZB液容量 50%まで直線的グラジェントで上 昇させて、 ペプチドを溶出させた。
溶出液を、 1 mlずつフラクション No.をつけて分取し、 分取フラクションか ら 1.5 1を取り、 これを H/HBSSに 2.5mM Probenecid 、 0.2% BSA 200 1希釈 し、 この溶液を用いて上記 （5— 3— 4) の試験法により、 ZAQC- B1細胞に対 するレセプ夕一活性化作用を測定した。その結果、 目的とする ZAQC- B1細胞に対 するレセプ夕一活性化作用を有する成分、 すなわち、 ZAQ活性化成分は、 フラク シヨン No. 54、 55および 56に溶出されていることが判った。 本活性は単一な紫 外吸収ピークと一致し、 活性成分が単一にまで精製されたものと判断した。
ZAQ活性化成分精製標品中の溶媒を凍結乾燥して除去し、得られた凍結乾燥物 を溶媒 DMS0(ジメチルサルフォキシド）に溶解した。 この溶液の一部（約 7.5 pmol)をプロテインシークェンサ一（パーキンエルマ一社、 PE Biosystems Procise491cLC)を用いた N末端アミノ酸配列解析に供した。 その結果、 N末端 のアミノ酸残基から 1 0番目のアミノ酸残基のうち、 9残基を同定することが できた （Al a Val l i e Thr Gly Al a Xaa Glu Arg Asp (配列番号： 3 1 ; Xaa は未同定残基） ） 。 得られたアミノ酸配列は、 予想されるヒト型 ZAQリガンド成 熟体ペプチドの N端アミノ酸配列と一致した。また、 ZAQ活性化成分精製標品の 質量分析を F innigan LCQ LC/MS装置（Thermoques t, San 〗ose, CA)を用いて、 エレクトロスプレ一^ Γオン化法により実施し、 分子量が 9657. 6であることを確 認した。 これは 1 0個のシスティン残基がすべてジスルフィド結合を形成した 86残基のヒト型 ZAQリガンド成熟体ペプチド （配列番号： 2 1 ) の理論値 9657. 3 に良く一致し、 ZAQ活性化成分精製標品が、配列番号： 2 1で表わされるァミノ 酸配列を有するヒト型 Z A Qリガンド成熟体べプチドを有していることが確認 された。
( 6 - 3 ) 精製ヒト型 ZAQリガンドぺプチドの ZAQ活性化作用の測定
上記 （6— 2 ) で精製したヒト型 ZAQリガンド成熟体ペプチドの ZAQC-B1細胞 に対するレセプ夕一活性化作用を上記 （5— 3— 4 ) の試験法により測定した。 その結果、 ZAQ発現 CH0細胞 （ZAQC-B1細胞） においてヒト型 ZAQリガンド成熟体 ペプチドは濃度依存的に細胞内カルシウム濃度の上昇を惹起した。 EC5„値は 96 pMで、ヒ卜型 ZAQリガンド成熟体ペプチドは非常に強いァゴニスト活性を示すこ とが明らかとなった。 結果を図 1 0に示す。 産業上の利用可能性
本発明の蛋白質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩、 およびそれらをコ一 ドする D NAは、 ①リガンド （ァゴ二スト） の決定、 ②抗体および抗血清の入 手、 ③組み替え型蛋白質の発現系の構築、 ④同発現系を用いたレセプ夕一結合 アツセィ系の開発と医薬品候補化合物のスクリーニング、 ⑤構造的に類似した リガンド ·レセプターとの比較にもとづぃたドラッグデザィンの実施、 ⑥遺伝 子診断におけるプローブや P C Rプライマーの作成のための試薬、 ⑦トランス ジエニック動物の作製または⑧遺伝子予防 ·治療剤等の医薬等として用いるこ とができる。

Claims

請求の範囲
I . 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有することを特徴とする蛋白質またはその塩。
2 . 請求項 1記載の蛋白質の部分ペプチドまたはその塩。
3 . 請求項 1記載の蛋白質をコードする D N Aを含有する D NA。
4 . 配列番号： 2または配列番号： 3で表される塩基配列を有する請求項 3記 載の D NA。
5 . 請求項 3記載の D NAを含有する組換えベクター。
6 . 請求項 5記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
7 . 請求項 6記載の形質転換体を培養し、 請求項 1記載の蛋白質を生成 ·蓄積 せしめることを特徴とする請求項 1記載の蛋白質またはその塩の製造法。
8 . 請求項 1記載の蛋白質もしくは請求項 2記載の部分べプチドまたはその塩 に対する抗体。
9 . 請求項 1記載の蛋白質もしくは請求項 2記載の部分ペプチドまたはその塩 を用いることを特徴とする請求項 1記載の蛋白質またはその塩に対するリガン ドの決定方法。
1 0 . 請求項 1記載の蛋白質もしくは請求項 2記載の部分ペプチドまたはその 塩を用いることを特徴とするリガンドと請求項 1記載の蛋白質またはその塩と の結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。
I I . 請求項 1記載の蛋白質もしくは請求項 2記載の部分ペプチドまたはその 塩を含有することを特徴とするリガンドと請求項 1記載の蛋白質またはその塩 との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
1 2 . 請求項 1 0記載のスクリーニング方法または請求項 1 1記載のスクリー ニング用キットを用いて得られうる、 リガンドと請求項 1記載の蛋白質または その塩との結合性を変化させる化合物またはその塩。
1 3 . 請求項 1 0記載のスクリーニング方法または請求項 1 1記載のスクリー ニング用キットを用いて得られうる、 リガンドと請求項 1記載の蛋白質または その塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を含有してなる医薬。 14. 請求項 3記載の DNAとハイストリンジェントな条件下でハイブリダィ ズする DNA。
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