WO2001029200A1

WO2001029200A1 - DNA ENCODING ENDO-β-GALACTOSIDASE

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Publication number: WO2001029200A1
Application number: PCT/JP2000/007347
Authority: WO
Inventors: Takashi Muramatsu; Haruko Ogawa; Hisako Muramatsu; Takaaki Kobayashi; Itsuo Yokoyama
Original assignee: Seikagaku Corp
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Filing date: 2000-10-20
Publication date: 2001-04-26
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Description

明細書ェンド一 3—ガラクトシダ'ーゼをコードする D N A 技術分野本発明は、エンド一/3—ガラクトシダーゼをコードする D NA、当該 D NAを組み込んだ組換えベクター、当該 D N A又は組換えベクターで形質転換した形質転換体、及び、当該形質転換体を用いたエンド— /?—ガラクトシダーゼの製造方法に関する。

また本発明は、エンド一 / 5—ガラクトシダーゼを含有する臓器処理剤、及び臓器をこの処理剤によって処理して得られる臓器に関する。背景技術

Clostridium perfringens (クロストリジゥム · パーフリンジエンス）由来のエンド一一ガラクトシダーゼ（以下、「エンド一 ?—ガラクトシダーゼ C」という）は、複合糖質の末端の Galひ 1→3Gal ? 1→4GlcNAc配列に作用して Gal/? 1→4GlcNAc結合を切断するが、 Galひ 1→3 (Fuc ひ 1→2 ) Gal 31→4GlcNAc 配列には作用しない酵素である（特公平 7— 87 7 83号公報）。この酵素は分析用試薬として有用である。

この酵素は、 Clostridium perf ringensを培養して製造することができるが、この酵素をコードする D NAが得られれば、遺伝子工学的手法により更なる大量調製も可能になる。また後述するように、異種移植の際に利用できる可能性もある。発明の開示従って本発明の課題は、ェンドー /?一ガラクトシダーゼ Cをコ一ドする DNA を単離し、エンド一 5—ガラクトシダーゼ Cを遺伝子工学的手法によって純粋な形で安価かつ大量に提供することである。

また本発明の課題は、持に異種移植の際に有 fflな、ェンド一 /3—ガラクトシダ —ゼ Cを含有する臓器処理剤を提供し、さらに、特に異種移植の際に有用な臓器を提供することである。

本発明者らは上記課題の解決のために鋭意検討を重ねた結果、ニンドー/?—ガラク卜シダーゼ Cをコードする D N Aを単離してその塩基配列を明らかにし、さらにこの D N A力酵素活性を有するェンド一 3—ガラクトシダーゼ Cを発現することを確認して本発明を完成した。

すなわち、本発明は、以下の（A) 又は（B) のタンパク質をコードする D N A (以下、「本発明 D NA」ともいう）を提供する。

( A) 配列番号 2に示すアミノ酸配列からなる夕ンパク質。

( B ) アミノ酸配列（A) において、 1 もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配列からなり、かつェンドー 5—ガラクトシダ一ゼ活性を有するタンパク質。

本発明は、上記 D N Aにおいて、前記アミノ酸配列（A) において、 1もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配列からなり、かつェンドー /5—ガラクトシダーゼ活性を有する夕ンパク質が、配列番号 2におけるアミノ酸番号 3 5〜 84 5で示されるァミノ酸配列を有する夕ンパク質である、 D N Aを提供する。

このような D N Aの好ましい具体例としては、下記（ a) 又は（b ) に示す D N Aが挙げられる。

( a) 配列番号 1に記載の塩基配列のうち、塩基番号 2 4 6〜 2 7 8 0からなる塩基配列を含む D N A。

(b) 配列番号 1に記載の塩基配列のうち、塩基番号 2 4 6〜 2 7 8 0からなる塩基配列に相補的な塩基配列の全部または一部を有する D N Aとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ、エンド一 /?—ガラク卜シダーゼ活性を有するタンパク質をコードする D N A。

さらに、上記 D N Aの好ましい具体例として、下記（a) 又は（b) に示す D N Aが挙げられる。

(a) 配列番号 1に記載の塩基配列のうち、塩基番号 3 4 8〜 2 7 8 0からなる塩基配列を含む D N A。 (b) 配列番号 1に記載の塩基配列のうち、塩基番号 3 4 8〜 2 7 8 0からなる塩基配列に相補的な塩基配列の全部または一部を有する D N Aとストリンジエン卜な条件下でハイブリダィズし、かつ、エンド一 /?—ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする D NA。

また、太発明は、本発明 D N Aを組み込んだ組換えベクター（以下、「本発明組換えベクター」ともいう）を提供する。さらに、本発明は、本発明 D N A又は本発明組換えベクターを細胞に導入することにより得られる形質転換体（以下、「本発明形質転換体」ともいう）を提供する。

さらに、本発明は、本発明形質転換体を生育させてエンド一 ?—ガラクトシダ —ゼをコードする D N Aを発現させ、生成したェンドー /?—ガラクトシダーゼを採取することを特徴とするェンド _ ?—ガラクトシダーゼの製造方法（以下、「本発明製造方法」ともいう）を提供する。

さらに本発明は、エンド一 5—ガラクトシダーゼを含有する、臓器処理剤（以下、「本発明処理剤」ともいう）を提供する。本発明処理剤は、移植用臓器処理剤であることが好ましく、この処理される臓器は、ひ一ガラクトース抗原を発現している臓器であることが好ましい。このような移植用臓器としては、ブ夕の臓器であることが好ましく、ヒトに移植するための臓器であることがさらに好ましい。例えば、腎臓が好ましい例として挙げられる。

また本発明は、ひ一ガラクトース抗原を発現している臓器を、本発明処理剤によって処理して得られる臓器（以下、「本発明臓器」ともいう）を提供する。また本発明は、ひ一ガラクトース抗原を発現している臓器を、エンド一 /?ーガラクトシダーゼで処理することを特徴とする、ひ一ガラクトース抗原による拒絶反応が抑制された移植用臓器の生産方法を提供する。

本発明:こおいて、エンド一 5—ガラクトシダーゼ活性とは、複合糖質の末端の Galひ 1→3Gal ? 1→4GicNAc配列の Gai 1→4GicNAc結合を切断する反応を触媒する活性をいう。以下、本発明を詳細に説明する。ぐ 1〉本発明 D N A 本発明 DNAは、以下の（A) 又は（B) のタンパク質をコードする DNAである。

( A ) 配列番号 2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質。

(B ) アミノ酸配列（A) において、 1もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配列からなり、かつェンドー /?一ガラクトシダーゼ活性を有する夕ンパク質。

この中でも、（A) のタンパク質をコードする DNAが好ましい。

なお本明細書中において、「 1もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配列からなり、かつエンド一 /?一ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質」とは、複合糖質の末端の Gaiひ l→3Gai ? l→4GlcNAc配列に作用して Gal/51→4GlcNAc結合を切断する活性（ェンド一 —ガラクトシダーゼ活性）を実質的に害さない 1もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は転位を有していてもよいことを示す。

すなわち天然に存在するタンパク質には、それをコードする DN Aの多形や変異の他、生成後の夕ンパク質の生体内および精製中の修飾反応などによってそのアミノ酸配列中にアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転位等の変異が起こりうるが、それにもかかわらず、変異を有しないタンパク質と実質的に同等の生理、生物学的活性を示すものがあることが知られている。このように構造的に若干の差異があってもその機能については大きな違いが認められないタンパク質をコードする DNAも、本発明 D N Aに包含される。

タンパク質をコードする D N Aに人為的に上記のような変異を導入した場合も同様であり、この場合にはさらに多種多様の変異体を作製することができる。例えば、ヒトインターロイキン 2 ( I L - 2 ) のアミノ酸配列中の、あるシスティン残基をセリン残基に置換したタンパク質が、 I L一 2活性を保持することが知られている（Science, 224,1431( 1984))。また、ある種のタンパク質は、活性には必要ないぺプチド領域を有していることが知られている。例えば細胞外に分泌されるタンパク質に存在するシグナルペプチドや、プロテア一ゼの前駆体等に見られるプロ配列などがこれにあたり、これらの領域のほとんどは翻訳後、または活性型タンパク質への転換に際して除去される。このようなタンパク質は、一次構造上は異なった形で存在しているが、最終的には同等の機能を有するタンパク質であり、このようなタンパク質をコードする DNAも、本発明 DN Aに包含される。例えば配列番号 2におけるアミノ酸番号 3 5〜 845で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質は、ァミノ酸番号 1〜 34に相当する部分（シグナル配列に相当すると考えられる）を欠いているタンパク質であるが、エンド一 /?—ガラクトシダーゼ活性を保持している。従って、このようなタンパク質をコードする D N Aを本発明 D N Aに包含される。

なお、本明細書における「数個のアミノ酸」は、例えば 80 0アミノ酸残基からなるタンパク質の場合、 2〜4 0程度、好ましくは 2〜2 0、より好ましくは 2〜 1 0以下の数を示す。

エンド—/?一ガラクトシダーゼ活性は、例えば後記実施例に示す通り、ブ夕赤血球や血管内皮細胞（表面に Galひ 1→3Gal 51→4GlcNAc配列が存在している）と、 Galひ 1→3Gal構造を特異的に認識するレクチンを利用した測定方法により測定できる。また後記実施例に示す通り、基質として Galひ卜 3Gal 51-4GlcNAc ?l-3G al ?l_4Glc等を用いて酵素反応を行い、その酵素反応産物を薄層クロマトグラフィー（TL C) や質量分析等によって分析することによつても、ェンドー 5—ガラクトシダーゼ活性を測定することができる。よって当業者であれば、エンド一 5—ガラクトシダーゼ活性の有無を指標として、該活性を実質的に害さない 1もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入もしくは転位を容易に選択できる。エンド一ーガラクトシダーゼ活性を実質的に害さない、 1もしくは数個のァミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は転位は、自然条件下でも起こりうるし、人工的にそのアミノ酸配列をコードする D N Aに、そのような置換、欠失、挿入又は転位を起こすような、ヌクレオチドの置換、欠失、挿入又は転位を導入することによって得ることができる。ヌクレオチドの置換、欠失、挿入又は転位は、両末端に制限酵素切断末端を持ち、変異点の両側を含む配列を合成し、未変異 D NA が有する塩基配列の相当する部分と入れ換えることにより、 DN Aに導入することができる。また、部位特異的変異法（Kramer, W. and Frits,H. J. ,Meth. in En zymol., 154, 350( 1987) ;Kunkel , T. A. et al., Meth. in Enzymol . , 154, 367( 198 7)) などの方法によってもヌクレオチドの置換、欠失、挿入又は転位を導入することができる。

本発明 DN Aとしては具体的には、咧えば配列番号 1において塩基番号 246 〜 2 7 80で表される塩基配列を含む D N Aが例示され、かつ好ましい。また、本発明 D N Aは、コードされるタンパク質がェンド一 5—ガラクトシダーゼ活性を有する限り、配列番号 1に記載の塩基配列のうち、塩基番号 246〜 2 7 80 からなる塩基配列に相補的な塩基配列の全部または一部を有する D N Aとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする D N Aであってもよい。ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう（Sambrook, J. et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual , Second Edition, Cold Spring Harbor Laborat ory Press (1989)等参照）。この「ストリンジヱン卜な条件」には、通常の遺伝子のハイブリダィゼーシヨンに用いられる条件、例えばサザンプロット、ノーザンブロット、ハイブリダィゼーシヨンを用いたスクリ一ニング等に使用される条件が包含される。具体的には、冽えば 50% ホルムアミド、 5 x SSPE (20x SSPC ： 3.6M塩化ナトリウム、 0.2Mリン酸ナトリゥム緩衝液（pH7.7)、 20mM EDTAニナトリウム）、 5 x Denhardt' s solution, 0.1¾ SDSの存在下、 42°Cでハイブリダィスする条件が挙げられる。

なお、 ¾列番号 2に示すァミノ酸配列と実質的に同一のァミノ酸配列をコードする限り、遺伝暗号の縮重による異なった塩基配列を有する D N Aも本発明 D N Aに S含されることは、当業者であれば容易に理解されるところである。

本発明には、本発明 D N Aに相補的な DN A又は RNAも包含される。さらに本発明 DN Aは、ニンド一 /5—ガラクトシダーゼ Cをコードするコード鎖のみの一本鎖であってもよく、この一本鎖およびこれと相補的な塩基配列を有する D N A鎖また：ま R N A鎖からなる二本鎖であってもよい。

上記配列番号 1記載の塩基配列を有する本発明 D N Aは、もともと Clostridiu m perfringens由来であるが、その由来は限定されず遺伝子工学的手法や化学合成等により製造された D N Aも当然に含まれる。また本発明 D NAを、ある機能を有する、又は他のタンパク質等をコードする D N Aと連結させた D N Aであつても、本発明 DNAが保持されている限りにおいて、本発明 D N Aに包含される。尚、配列番号 1に示す塩基配列中、ヌクレオチド番号 6 6 0の「t」は「c」であり、配列番号 1及び 2に示すアミノ酸配列において 1 3 9番目のアミノ酸残基「Ser」は「Pro」である可能性がある。いずれにしても、コードされるタンパク質がェンドー 3—ガラクトシダ一ゼ活性を有する限り、本発明 D N Aに包含される。

なお本発明 D N Aは、以下の遺伝子工学的手法により初めて取得されたものである。

(1)精製されたェンドー /?ーガラクトシダーゼ C (特公平 7— 8 7 7 8 3号公報参照）の部分アミノ酸配列を解析し、これに基づいて P CRプライマーを作製する。

(2) (1)で取得したプライマーを用い、 Clostridium perf ringensのゲノム DNAを铸型として P CRを行い、ェンド一 5—ガラクトシダーゼ Cをコードする cDNAの部分断片を取得する。

(3) (2)で取得した部分的 cDNAを用いてカセヅト P CRを行い、更に 5'側及び 3' 側の領域を取得する。

(4) (3)で得られた情報に基づき全長 cDNAを得るためのプライマーを準備し、 P C Rにより全長 cDNAを取得して、塩基配列を解析する。

本発明 D N Aの採取原としては、エンド一 /?一ガラクトシダ一ゼ Cを保持する限り特に制限されないが、具体的には、 Clostridium perfringens ATCC 10873が挙げられる。該菌株は、アメリカン ' 夕イブ ' カルチャー ' コレクション（ァメリカ合衆国、メリーランド 20852、ロックビル、パークローンドライブ 12301) から入手することができる。また、同菌株は、本出願人により工業技術院生命ェ学工業技術研究所に、 FERM P-8917の受託番号で寄託されている。

< 2〉本発明組換えベクター、本発明形質転換体

本発明組換えべク夕一は、本発明 D N Aをべク夕一に組み込むことにより得られるものである。本発明組換えベクターは、適当な細胞等に導入することができ、これにより本発明 D N Aの種々の機能を発揮させることができる。

本発明 D N Aを組込むベクターは、本発明 D N Aを組込むことが可能な限りにおいて特に限定されないが、発現ベクターが好ましい。

また本発明 D N Aは、直接発現させてもよく、また他のポリペプチドとの融合ポリべプチドとして発現させてもよい。他のポリぺプチドとの融合ポリぺプチドとして発現させる場合、当該他のポリペプチドをコードする D N Aが予め組み込まれた発現ベクターに、本発明 D N Aを組み込むことが好ましい。

また本発明 D N Aは全長を発現させてもよく、一部を部分べプチドとして発現させてもよい。所望の発現形態に応じて本発明 D N Aを適宜加工して、発現べク夕一に組み込むことができる。

本発明 D N A又は本発明組換えベクターを細胞に導入することにより、本発明形質転換体を得ることができる。本発明 D N A又は本発明組換えベクターを導入できる細胞は、本発明 D N A又は本発明組換えベクターの機能を発揮できる限りにおいて特に限定されず、ベクターの種類、及び目的等に応じて適宜選択することができる。例えば、大腸菌等の原核細胞や哺乳動物細胞等の真核細胞が例示される。

本発明 D N Aを発現ベクターに組込んで得られる本発明組換えべクタ一は、哺乳類動物細胞、冽えば C O S - 7細胞、大腸菌（E . col i Bい 12細胞等）、昆虫細胞、植物細胞等、遺伝子発現に適した宿主細胞に導入することができ、かつ好ましい。

本発明 D N Aや本発明組換えベクターを宿主細胞に導入する方法としては、公知の方法を用いることができるが、市販されている専用の試薬（例えば L I P0FECT AMINE PLUS Reagent( Gibco BRL製）等）を利用することもできる。

< 3 >本発明製造方法

本発明製造方法は、本発明形質転換体を生育させてェンドーーガラクトシダ —ゼをコードする D N Aを発現させ、生成されたェンド一 5—ガラクトシダーゼを採取することを特徴とするエンド一 /?一ガラクトシダーゼの製造方法である。生育の具体的方法としては培養が最も好ましいが、動植物体内で生育させたり、動植物体そのものとして生育させることもできる。

例えば、本発明形質転換体を好適な培地で培養し、本発明 D N Aがコードするエンド一 /?—ガラクトシダ一ゼを培養物中に生成蓄積させ、その培養物から該酵素を採取することにより、エンド一一ガラクトシダーゼを製造することができる。

本発明に用いる宿主によっては、ェンドー /?一ガラク卜シダ一ゼが細胞内に蓄積することが予想されるが、その場合には当該細胞からェンドー 5—ガラクトシダーゼを採取する。また、宿主又は発現の形態によっては、エンド一 /?一ガラクトシダ一ゼは培地中に蓄積する。その場合には、エンド一 /?—ガラクトシダ一ゼは該培地から採取する。

本発明形質転換体の生育条件は、本発明 D N A又は本発明組換えベクターが導入された宿主細胞が生育可能な条件（培地、培養条件等）や、発現させるポリぺプチドの形態等に応じて、適宜選択することができる。例えば宿主細胞として C 0 S— 7細胞を用いる場合は、 2 %程度のゥシ胎仔血清（ F C S ) を含有する D M E M培地を用い、 3 7 °C条件下で培養することができる。また例えば、宿主細胞として大腸菌を用いる場合は、 L B培地等を主成分として適宜調製した培地を用いることができる。

また、エンド一 5—ガラクトシダーゼをプロティン Aとの融合ポリぺプチドとして発現させ、 IgGとの特異的ァフィ二ティーを利用して精製することを企図する場合は、培地に添加する F C Sから予め I gGを除去しておくことが好ましい。 I gGの除去は、 I gGの特異的リガンド、例えばプロテイン Aを担持させた担体に F C Sを接触させ、固液分離して液相を回収することにより行うことができる。エンド— /?一ガラクトシダーゼの採取は、公知の酵素の抽出、精製方法を適宜組み合わせることにより行うことができる。酵素の抽出方法としては、ホモジナィズ、ガラスビーズミル法、音波処理、浸透ショック;'去、凍結融解法等の細胞破砕による抽出、界面活性剤抽出、またはこれらの組み合わせ等の処理操作が挙げられる。

エンド一 /?ーガラクトシダーゼの精製方法としては、例えば硫酸アンモニゥム (硫安）や硫酸ナトリウム等による塩析、遠心分離、透析、限外濾過法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過法、ァフィ二ティークロマトグラフィー、電気泳動法等や、これらの組み合わせ等の処理操作が挙げられる。精製された酵素のアミノ酸配列、作用、基質特異性等を分析し、エンド一ーガラクトシダーゼ Cの物性と比較することにより、ェンドー 5—ガラクトシダーゼ Cの製造が確認できる。

なお、ェンドー /?一ガラクトシダ一ゼを他のポリぺプチドとの融合ポリべプチドとして発現させることにより、抽出 · 精製工程を容易にすることができる。例えば、本発明 D N Aをプロテイン Aとの融合ポリペプチドとして発現させると、融合ポリぺプチドは培養上清中に分泌されることから抽出操作が不要になり、またプロテイン Aに特異的なリガンド（例えば I gG) を担持させた担体を用いることによって、ワンステツブで精製することが可能となる。

本発明形質転換体を適当な条件下で生育させることにより、酵素活性を有するェンド一ガラクトシダーゼ Cが発現できることが、後述の実施例により確認された。よって本発明製造方法は、酵素活性を有するエンド一 /?一ガラクトシダーゼ Cの大量調製に利用することができる。

< 4 >本発明処理剤、本発明臓器

本発明処理剤は、エンド一 /?—ガラクトシダーゼを含有する、臓器処理剤である。また本発明臓器は、ひ一ガラクト一ス抗原を発現している臓器を、本発明処理剤によって処理して得られる臓器である。

本発明 D N A及びこれから製造されるェンドー /5—ガラクトシダーゼは、異種移植の際に利用できる。すなわち、 Galひ卜 3Gal構造を有する糖鎖（ひ一ガラクトース抗原）は、ブ夕の組織等には存在するがヒト組織には存在しないため、ブ夕組織をヒ卜に移植すると拒絶反応が起きる。従って、本発明 D N Aにより製造されるェンドー /?一ガラクトシダ一ゼでブ夕の組織を処理することにより Galひ 1 - 3Gal構造を除去したり、ブ夕の細胞（ES細胞等）に本発明 D N Aを導入することによって Galひ l -3Gal構造を発現しないブタ（クローンブ夕等）を作出する等によって、異種移植に利用できる。

以下、本発明処理剤及び本発明臓器について詳述する。

異種移植における超急性拒絶反応を司る主要な抗原は、細胞表面に存在するひ —ガラクトース抗原である。ひ一ガラクトース抗原は、 Galひ l-3Gal構造を有する抗原ある。ヒトを含む旧世界ザルでは、 Galひ l-3Gal構造が糖タンパク質や糖脂質の糖鎖末端に存在しない。そのため、この構造に対する強い自然抗体が生じている。ブ夕をはじめ、ほとんどの哺乳類は Galひ l -3Gal構造を持つので、例えばブタの臓器をヒ卜に移植すると、自然抗体が血管内皮細胞上のこの钪原に結合し、補体依存性の超急性拒絶反応が引き起こされ、血管が破壊される。

本発明処理剤は、このひ一ガラクトース抗原をェンド一 ? —ガラクトシダ一ゼの作用によって、該抗原による急性拒絶反応を消失させる程度に除去することにより、超急性拒絶反応を阻止せんとするものである。

本発明処理剤中に含有されるェンドー /?一ガラクトシダーゼは、ひ一ガラクトース抗原（ Galひ 1- 3Gal構造）を除去できる酵素である限りにおいて特に限定されないが、 Galひ 1- 3Gal /5 l-4GlcNAc構造からひ一ガラクトース抗原を除去できる酵素が好ましい。このような酵素の中でも、酵素の作用効率の点、中性付近に至適 p Hを有する点、および低温下でも有効に作用する点等から、エンド一 /?ーガラクトシダーゼ Cが好ましい。特に、本発明 D N Aにより製造されるェンドー/?— ガラクトシダーゼ Cは、好適に使用することができる。

本発明処理剤は、移植用臓器の処理に用いられることが好ましく、ひ—ガラクトース抗原を発現している臓器の処理に用いられることが好ましい。また本発明処理剤によって処理された臓器は、ひ一ガラクトース抗原を細胞表面に発現していない哺乳動物に移植されることが好ましい。

特に本発明処理剤によって処理される移植用臓器は、ヒ卜への異種移植への適用が期待されているブ夕の臓器であることが好ましく、ヒトに移植するための臓器であることが特に好ましい。また臓器としては、腎臓、肝臓、心臓、肺等が例示されるが、腎臓が好ましい。

本発明処理剤の剤型は、本発明処理剤を使用する態様によって適宜選択することができる。例えば液剤、灌流用剤、用時溶解用固形剤等として製剤化することができる。

例えば本発明処理剤を液剤として提供する場合、その形態は、溶液状または凍結状のいずれであっても良い。これをボトル、薬液バッグ等の適当な容器に充填 • 密封し、そのまま流通させあるいは保存して使用することができる。固形剤として提供する場合、その形態はェンドー /?—ガラクトシダーゼが安定である限り、限定されないが、例えば凍結乾燥、噴霧乾燥等をしたものが例示される。

本発明処理剤の製剤化は、公知の方法を用いることができる。また製剤化にあたり、エンド一 /?—ガラクトシダ一ゼに悪影響を与えず、かつエンド一 /?ーガラクトシダーゼ処理により得られる効果に影響を与えない限りにおいて、他の医薬活性成分や、慣用の賦形剤、安定化剤、結合剤、滑沢剤、乳化剤、浸透圧調整剤、 p H調整剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤、着色剤、崩壊剤等、通常医薬に用いられる成分を使用できる。

本発明処理剤は、臓器移植の際の超急性拒絶反応の抑制を目的として使用することができる。すなわち、本発明処理剤は、腎臓の異種移植の際の超急性拒絶反応を抑制するために用いられることが極めて好ましい。

臓器移植用に摘出された臓器を本発明処理剤で灌流したり、さらに摘出された臓器を本発明処理剤に接触させて保持 · 保存する等により、かかる臓器の血管内皮細胞上に存在するひ一ガラクトース抗原が、エンド一 5—ガラクトシダーゼの作用によって除去されて、移植時の超急性拒絶反応を抑制することができる。また本発明処理剤は、移植用に既に摘出された臓器のみならず、これから移植用に摘出する臓器に対しても用いることができる。例えば、これから摘出する臓器やその周辺を本発明処理剤で灌流したり満たしたりして、本発明処理剤中で臓器の摘出を行ってもよい。

本発明処理剤におけるェンドー /?ーガラクトシダーゼの配合量等は、本発明処理剤の使用方法、保存対象となる臓器の種類、大きさ、状態、保存の時間、温度等に応じて個別に決定されるべき事項であり、特に限定されないが、液剤とした状態で 0.05〜5ユニット/ mi (約 0.005mg/nil〜0.5mg/ml ) 程度が例示される。「ュニット」の定義は後述する。特に、 0 · 1〜2ュニット /ml (約 0.01mg/ini〜0 , 2mg/ml ) が好ましく、 0 · 4〜0 · 5ュニ 'ソト /mi ( 0.04〜0.05mg/ml )程度が極めて好ましい。また、臓器の処理を行う時の本発明処理剤の温度も、使用方法等に応じて個別に決定することができるが、本発明処理剤が凍結せずに溶液状態を維持でき、臓器の機能を維持でき、かつェンドー /?—ガラクトシダーゼの酵素活性を維持できる程度の温度が好ましい。特にェンドー 5—ガラクトシダーゼ Cは低温下でも有効に作用することから好ましく、この場合、低温、例えば 4て程度とすることが好ましい。

ひ一ガラクトース抗原を発現している臓器を、本発明処理剤によって処理することにより、ひ一ガラクトース抗原が除去された臓器（本発明臓器）を得ることができる。ここで、「ひ一ガラクトース抗原が除去された」とは、臓器に存在する全ひ一ガラクトース抗原が除去される必要はなく、超急性拒絶反応が実質的に惹起されない程度に除去されていればよいことを意味する。具体的には、本発明処理剤によってひ一ガラクトース抗原を発現している臓器を灌流することにより、臓器の血管内皮細胞上に存在するひ一ガラクトース抗原が、実質的に除去されているものであることが好ましい。

後述の実施例でも示す通り、エンド一 5—ガラクトシダ一ゼ Cで処理した腎臓には組織学的変化は見られなかつたことから、本発明処理剤および本発明臓器の安全性が強く推定される。図面の簡単な説明図 1は、ェンドー ?—ガラクトシダーゼ C処理したブ夕赤血球の蛍光活性化セルソー夕一（FACS ) による分析結果を示す図である。

図 2は、エンド一 /?—ガラクトシダ一ゼ Cで処理したブ夕細胞への、 GS- I B ₄とヒト免疫グロプリンの結合性の減少を示す図である。

図 3は、補体依存性の細胞傷害に対するエンド一 5—ガラクトシダーゼ Cの効果を示す図である。

図 4は、エンド一 /?—ガラクトシダーゼ Cで処理したブ夕腎臓血管への、ヒト血漿中の免疫グロブリンの吸着性の減少を示す図である。発明を実施するための最良の形態以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。

く：〉ェンドー 3一ガラクトシダーゼ Cの部分アミノ酸配列の解析、 P C Rブラィマーの作製

特公平 7— 8 7 7 8 3号公報、及び J. Biol. Chem. , 262, 10086-10092 (1987) に記載の方法に従い、 Clostridium perfringens (ATCC10873, FERM P-8917)の培養液から、硫安塩析、 Sephadex G-200 (フアルマシア社製）カラムクロマトグラフィ一、これに続く DEAE- Sephadex A-25 (フアルマシア社製）カラムクロマトグラフィ一によりタンパク質を精製した。この精製タンパク質を SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE) にかけ、泳動後のゲルをクマシ一プリリアン卜ブル一で染色した。分子量 90,000に相当するバンドを切り出して、トリプシン消化後、高速液体クロマトグラフィ一で消化断片を分離し、プロティン · シークェンサ一 ABI494A(ABI製）で各断片の部分ァミノ酸配列を解析した。その結果以下の 4種類のアミノ酸配列を得た。

(No.5) SEVPSQP (配列番号 3 )

(No.19) LSDGDLNEEN (配列番号 4 )

(No. 2) QNSDYLIDWI (配列番号 5 )

(No.45) DENEYVLTNVLNGLIPTTNSK (配列番号 6 ) これらアミノ配列に基づいて以下の P CRプライマーを作製した。

C45- S2(センスブライマー） 5， -GAYGARAAYGARTAYGT- 3，（配列番号 7 )

C19- AS1 (アンチセンスプライマ一） 5， -TCYTCRTTNARRTCNCCRTC-3' (配列番号 8 ) く 2〉上記プライマーを用いた P C R

これらのプライマーを用い、 Clostridium perfringens (ATCC10873, FERM P-8 917) から常法により抽出したゲノム D N Aを鍩型として、 P C R (ポリメラーゼ ' チェイン ' リアクション）を行った。 P C Rは、 94°C( 3分間）での保持に続き、 94°C( 1分間）/ 45°C( 1分間）/ 72°C( 2分間）の反応を 3 5サイクル行った。

得られた増幅産物を、塩基配列决定用クローニングベクター pGEM-T Easy Vect or Systems (プロメガ社製）に連結し、 ABI Prism 377 DNA シークェンサ一（ABI社製）を用いて、ジデォキシ法により塩基配列を解析した。その結果、上記 4種のァミノ酸配列をコードする配列を含む部分的 cDNA( 1946bp)が取得できた。く 3 >上記で取得した部分的 cDNAを用いたカセット P C R

更に、得られた cDNAの 5'及び 3'側の領域を取得するために、 5'及び 3'の両側とも Hindlll- cassette (夕カラ酒造製；コ一ド番号 3870)を用いて、カセット P C Rを行った。ここで用いたプライマーは以下の通りである。

(5， -ブライマー）

CP- 1 δ' -TGATACTTGTGGTACAGTAGAATGCCCACT-3' (配列番号 9 )

CP - 2 5' -ATGTTTACTATTAGTAGTAGGTATTAAGCC-3' (配列番号 1 0 )

(3' -プライマー）

CP- 3 5' -AGATGGTATGCATACTAGACCTATGTTCCC-3' (配列番号 1 1 )

CP-4 5' -AAGTTGGAGATGGTTGGGTTGGTGATGTTG-3' (配列番号 1 2 ) カセット P C Rは、 94°C(30秒間）/ 55°C( 2分間）/ 72°C( 1分間）の反応を 3 0 サイクル行った。

得られた産物は、上記と同様の方法で塩基配列解析し、最終的に 2535bp、 845 アミノ酸からなるオープンリーディングフレーム（ 0RF )を明らかにした。

< 4 >全長 cDNAを得るためのプライマーの調製、 P C Rによる全長 cDNAの取得、塩基配列の確認

全長の cDNAは、上記く 3〉の情報に基づき作製した以下のブラィマー（CP-5および CP-6)を用い、 P C Rで増幅した。 P C Rは、 94°C( 1分間）で保持した後、 9 4°C(30秒間）/ 55°C( 2分間）/ 72°C( 1分間）の反応を 3 0サイクル行った。

CP-5 5' -GCAGCCGAATTCATGAAATTTTTCTCGAAATTCAAAAAGGTA-3' (配列番号 1 3 ) CP - 6 5' -GCGTCGCTCGAGTTATTTATTTTGTAAAAAAGTTACTTTAGC-3' (配列番号 1 4 ) 得られた産物を pGEM-T Easy Vector Systems (プロメガ社製）に連結し、プライマー（CP-3、 CP-5、 CP-6及び以下に示すプライマー）を用いて、塩基配列を確認した。

CP-7 5' -GGTGCAATCTATAATAGGGG-3' (配列番号 1 5 )

CP-8 5' -CCCCTATTATAGATTGCACC-3' (配列番号 1 6 ) C5-S1 5' -AAGTCTGAAGTACCAAGTCA-3' (配列番号 1 7 )

CP- 11 5' -GAACTTGTTTGGAGTGACGAG-3' (配列番号 1 8)

M13 Forward 5' -GTAAAACGACGGCCAGT-3' (配列番号 1 9 )

M13 Reverse 5' -GGAAACAGCTATGACCATG-3' (配列番号 2 0 )

5，側について、 CP-し CP- 2及び下記のプライマーを用いた 5'- RACEを行い、塩基配列を確認した。

C5-AS1 5' -TGACTTGGTACTTCAGACTT-3' (配列番号 2 1 ) 明らかになった塩基配列及びそれに対応するァミノ酸配列を配列番号 1に、ァミノ酸配列のみを配列番号 2にそれそれ示す。明らかにされた本発明 D N Aの塩基配列は、 2535bp、 845アミノ酸からなる 0 R Fからなつていることが確認された。

< 5 >cDNAを用いた酵素の発現、酵素活性のアツセィ

(1)酵素の発現

コ一ド領域の cDNAは、 IgMシグナルぺプチド及びプロティン A遺伝子が組み込まれ、 S Rプロモーターを有する pcDSA発現べクタ一（FEBS Letters, 360, p.l- 4 ( 1995)及び J. Biol. Chem. , 269 (2), p.1402-1409 ( 1994)) の、 EcoRI/XhoI サイ卜に連結させた。得られたプラスミドは、 LIP0FECT AMINE PLUS Reagent(Gi bco BRL製）を用いて COS- 7細胞にトランスフエクトした。トランスフエクシヨンは、 F C Sを含有しない D MEM培地中で行った。

トランスフエクト後の細胞は、プロテイン A セファロース Cい 4B (フアルマシァ製）で IgGを吸着除去したゥシ胎仔血清（FCS)を 2 %含有する、 DMEM培地中で培養した（10cmディッシュ x48枚）。 3日後までの培養液を回収後、新たな培地にて 5日後まで培養し、培養液を回収した。

回収した培養液（約 800ral) を 3000rpmで 10分間遠心分離し、上清を 0.8〃mフィルターでろ過し、この上清液を約 100mlずつ IgG Sepha ose 6 Fast Flow (フアルマシア製； 6.5匪 x 10mm) に通して、吸着画分を回収した。回収した吸着画分を C entricon 10(アミコン社製）を用いて濃縮し、 - 80°Cで保存した。 (2)酵素活性のアツセィ

ブ夕赤血球表面には、ェンドー /?一ガラクトシダーゼ Cの基質となる Galひ卜 3 Gal構造を有する糖鎖（ガラクトース抗原）が存在する。これを利用して、以下の通りェンド一 5—ガラクトシダ一ゼ C活性をアツセィした。

(i)ブタ赤血球の調製

ブ夕から血液を採取して、遠心分離により血球を得た。この血球を 0.2%ゥシ血清アルブミン（BSA) を含有するリン酸緩衝生理食塩水（PBS( -)) で 3回洗浄した。； '先浄後の血球に、 3mg/niiスペルイミノ酸ジメチル二塩酸塩（DMS) (0.1M N a₂C0₂、 0.15M NaCl及び O.lmM エチレンジァミン四酢酸（EDTA)を含有する緩衝液 (pH 10.3)に溶解）を添加して、 37°Cで 20分間インキュベートした。

その後、 0.02% EDTAを含有する PBS (-) (pH 7.4)で 2回洗浄し、血球を充分懸濁させて、 0.2% BSAを含有する PBS (-)で 1 %血球浮遊液とした。

(ii)酵素活性のアツセィ

(i)で調製した血球（ 1 %血球浮遊液 50〃1) をチューブに入れ、 2，000rpmで 1 分間遠心分離した。上清を除去し、沈殿（血球）に、 0.2%BSAを含有する PBS (-) を 100〃 1添加して血球を懸濁させ、上記（ 1)で発現させた酵素の溶液（ 1〃 1又は 8 〃1)又は対照として PBS (-)を添加した。その後、 37てで 1〜 2時間インキュベートした。

インキュベート後、血球を 0.2% BSAを含有する PBS (-)で 2回洗浄し、同緩衝液 50〃1中に再懸濁させた。この¾濁液 25〃1に、 0.2% BSAを含有する PBS (-)で 50倍希釈した FITC (フルォレセインイソチオシァネート）標識した GS-IB4(シグマ社製； Galひ卜 3Gal構造に結合するレクチン； Griff onia simpl icifol ia由来） 25〃 1 を添加し、氷冷下で 30分間インキュベートした。その後、血球を 0.2% BSAを含有する P B S (-)で洗浄し、同緩衝液 0.5m 1で再濁させて、蛍光活性化セルソー夕一 (FACS) で解析した。結果を図 1に示す。

その結果、ブ夕赤血球と ¾現酵素とを接触させると、対照（図 1中の A) に比して FITC蛍光強度が減少した（図 1中の B) 。また、接触させる発現酵素量を増加させると、 FITCの蛍光強度がさらに減少した（図 1中の C) 。このことは、発現させた酵素がェンドー ?—ガラクトシダーゼ C活性を保持しており、ブタ赤血球表面の Galal- 3Gal構造を有する糖鎖が切り出された結果、 FITC標識した GS- IB のブ夕赤血球表面への結合が減少したことを示している。この結果から、本発明 D N Aが、真に酵素活性を有するェンド一 /3—ガラクトシダーゼ Cをコードしていることが示された。また本発明 D N Aを用いて調製した本発明組換えべクタ一、本発明組換えベクターを用いて調製した本発明形質転換体、本発明形質転換体を利用した本発明製造方法が、真に実用的かつ有用なものであることが示された。さらに、エンド一 5—ガラクトシダーゼで処理することにより、ひ一ガラクトース抗原を除去できることが示された。

< 6 〉大腸菌を用いた酵素の大量発現、酵素活性のアツセィ、異種移値への応用

以下、特にことわらない限り、酵素反応は、 20〃gの Galひ l_3Gai 51- 4GlcNA c5 i- 3Gal n_4Glc(Calbiocheni)を含有する 50mMリン酸緩衝液（pH7.2) 10〃1中で行った。 37°Cで 30分間インキュベートし、 20〃iのエタノールを添加することにより反応を停止させた。

(1)大腸菌を用いた組換えェンドー ?—ガラクトシダーゼ Cの製造

前記コード領域を含む cDNAを、ぺリブラズムに分泌される遺伝子産物を産生する発現ベクター pFLAG-Shifti "シグマ社）に連結させた。これにより、 ¾素は大腸菌（E.coli)中で、 οιηρΑ遺伝子の調節のもと、ペリブラズム酵素として発現される。この組換え遺伝子で E.coii Bい 12細胞を形質転換し、 37°C下、のァンピシリン、 0.4%のグルコースを含有する LB培地 2L中で培養し、 O.lmMの IPTG (isopropyi 5- D- thiogalactopyranoside)を培地に添加することにより ^素発現を誘導した。 30分後、細胞を 5，000xgで 10分間遠心することにより回収し、室温下、 300mLの Tris-HCl(pH8.0)で 2回洗浄し、 300mLの 0.5M シユークロース、 30mM

Tris- HCl(pH8.0)および ImMの EDTAを含有する溶液でさらに洗浄した。

遠心分離して回収した細胞を 25(kLの氷冷した純水に ¾濁して、ぺリブラズムから酵素を遊離させた。 4 °C下、 3, 500xgで 10分間遠心することによって、遊離した S素を含有する上清を回収し、 Biol. Chem., 262, 10086-10092 ( 1987) に記載の方法で、 Sephadex G- 200(2.7x100cm)および DEAE-Sephadex A- 25(1.0x10 cm) (いずれもフアルマシア社製）を用いたカラムクロマトグラフィーにより酵素画分を精製した。精製した酵素画分は、約 700/ gのタンパク質を含有していた。以上の工程を繰り返して大量の酵素を製造した。

精製した酵素画分を SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE ； 8 %ゲル）で解析した結果、見かけの分子量が 95kDaである主要なバンド、およびこれに近接したマイナーなバンド（97kDa)が見出された。主要なバンド（95kDa) の N末端アミノ酸配列を分析したところ、 D E N E YV L (—文字記号：配列番号 2においてァミノ酸番号 3 5〜 4 1 に相当）であった。又配列番号 2におけるァミノ酸番号 1〜 3 4の部分には、シグナル配列に典型的に見出される疎水性ァミノ酸のクラスターが存在している。これらのことから、配列番号 2におけるアミノ酸番号 1 〜 3 4の部分はシグナル配列であると考えられ、主要なバンド（95kDa) はこのシグナル配列を欠くタンパク質（配列番号 2におけるァミノ酸番号 3 5〜 8 4 5で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質）であると考えられる。また分子量の差異から考えると、マイナーなバンド（97kDa) はシグナル配列を有するタンパク質であると考えられる。

(2)ェンド- 5-ガラクトシダーゼ Cのアツセィ

4 ミリュニットのェンド一 /5—ガラクトシダーゼ Cを用いて、前記の通り酵素 Κ· を了つた。

反応を停止させた後、この反応後の溶液を Dowex 50Wx2H—フォームおよび 1x2ァセテートフォームで脱塩した後、 1/10量の加水分解物を Silica Gel 60 TLCプレート（メルク社）にスポットした。

このプレートを n-プロパノール：酢酸ェチル： H₂0(7:2:Uで展開することにより薄層クロマトグラフィー（ T L C ) を行い、オルシノール -硫酸試薬をスプレーして加熱することにより（J.Neurochem., 1， p42-53( 1956 ) ), 糖のスポットを出現させた。遊離した産物の量をデンシトメ一夕一（Gel Doc 1000(BI0- RAD社）で測定した。なおこのアツセィ条件下では、 40%の基質が加水分解されるまでは、酵素活性は酵素量および反応時間に比例する。また「 1ユニット」の酵素活性とは、前記酵素反応の条件で 1分間に 1 モルの基質を加水分解するために必要な酵素量として定義される。

その結果、上記（1)で得られた組換え酵素は、五糖（Gaiひ卜 3Gal ?l- 4GlcNAc ? l-3Gal 3 l-4Glc)を加水分解し、 T L Cによって分離される 2つのオリゴ糖を遊離した。

次に、これらのオリゴ糖を同定するために、エレクトロスプレー質量分析を行つた。

Galひ 1- 3Gal ?卜 4GlcNAc 51-3Gal/51- 4Glc(20〃g)を、 10〃Lの 30mM NaCl中、 4 ミリュニッ卜の酵素で 37°Cで 30分間加水分解した。 20〃Lのエタノールで酵素反応を停止させた後、反応液を 17mMの酢酸ァンモニゥムを含有する 1.5倍量の 83 % ァセトニトリルと混合した。

質量分析は、エレクトロスプレーイオンソース（electrospray ion source)を装着した三連四重極質量分析計（Triple quadrupole mass spectrometer) API 30 0(Perkin Elmer Sciex Instruments )を用いて行った。サンプルは、エレクト口スプレー ' イオン ' ソースに、流速 0.3ml/時間で直接注入した。スプレーは、 4. 8KVの potential differenceによって得た。

その結果、酵素消化前の五糖を分析した結果、 DI/Z 892.2であった。これは、五糖の分子量の理論値に 23を加えた数字であり、これは Na—ィオンの付加によるものと考えられる。酵素消化後のオリゴ糖を分析した結果、 2つの顕著なピーク力 ½/z 568.1および m/z 365.0の位置に出現した。前者の質量は GlcNAc ? l-3Gal ? 1 - 4Glcに Na—を加えたものに相当し、後者の質量は Galひ卜 3Galに Na^を加えたものに相当する。

これらの結果から、クローニングされた酵素がェンドー /?一ガラクトシダーゼ Cであり、 Gal 51- 4GlcNAc結合を加水分解して Galひ卜 3Gal二糖を遊離することが確認された。またこの酵素の比活性は 10.5ユニット/ mgタンパク質であり、この酵素が強い活性を有していることが示された。なお精製した酵素のタンパク質量は、ゥシ血清アルブミン（bovine serum albumin)をスタンダードとして、 Micr 0 BCA protein assay reagent キッ卜 (Pierce社)を用いて決定した。

また、精製した酵素画分中の他のグリコシダーゼの夾雑を、それそれの P-二ト口フエ二ルグリコシドを基質として用い、 29.4 zgの精製酵素とともに 0.2mLの反応混合液中で 37°Cで 1時間、 pH7.0(50mMリン酸緩衝液）および pH6.0( 50mMクェン酸-リン酸緩衝液）でィンキュベ一卜することによって決定した。さらにプロテァーゼの夾雑は、 J.Biochem.,75.p707-714( 1974)に記載の方法によって、同様に PH7.0と 6.0の条件下で測定した。

その結果この精製酵素画分は、プロテアーゼ、ひ—ガラクトシダーゼ、 5—ガラクトシダーゼ、および /5— N—ァセチルグルコサミニダーゼを実質的に含有していなかった。またこの組換え酵素は至適 p Η7·0〜8.0であり、 perfringens の培養液から得られた酵素の至適 P H (J. Biol. Chem. ,262, pl0086-10092( 1987)) と同様であった。さらに、この酵素の 4 °Cにおける酵素活性は、 37°Cにおける活性の約 40%であった。

(3) 異種移植に向けての応用

以下、「PBS/BSA」は、 0.2% BSAを含有する PBS (-)を意味する。

(3-1)生細胞からのひ一ガラクトース抗原の除去

ブ夕赤血球を、前記く 5〉と同様に調製した。ブ夕の血管内皮細胞は、 Transp lantation 62, pl05-113( 1996 )に記載の方法でブ夕から単離した。この細胞をトリブシン- EDTA(Gibco BRL)で回収し、 PBS/BSAで 2回洗浄し、再度 PBS/BSAに懸濁させた。上記（1)で得た組換えェンドー/?—ガラク卜シダ一ゼ C(7〃Lの PBS中に 7 0ミリユニット）を血管内皮細胞（2xl0⁵細胞/ 50〃L)に添加し、酵素反応を 37°C下で 1時間行った。

酵素反応後、赤血球または内皮細胞を PBS/BSAで 2回洗浄し、 FITCラベルした G またはヒト血清と反応させた。前者の場合、細胞を l〃gの FITC- GS-IB シグマ）を含有する 50〃 Lの PBS/BSAに懸濁させ、氷冷下で 30分間維持した。後者の場合、洗浄した細胞を、 50人の健常なボランティアから採取しプールした 100〃L の正常ヒト血清（PBS/BSAで 1:Uこ希釈）と共にィンキュベートした。 30分間氷冷下でインキュベートした後、細胞を PBS/BSAで 2回洗浄し、 100〃Lの FITC結合ゥサギ抗ヒト IgG、 IgMまたは IgA(Dako社；それそれ PBS/BSAで 1： 20に希釈）で 30分間氷冷下でィンキュベートした。 FITC結合マウスモノクローナル抗ヒト IgG^Zymed社）、 IgG₂、 IgG₃または IgG4(Sigma)も用いた。

染色された赤血球または内皮細胞を PBS/BSAで 2回洗浄し、 0.5mLの PBS/BSAに ¾5濁させて、 FACS(FACS Calibur； Becton Dickinson)で解析した。

(3- 2)補体依存性の細胞傷害性のアツセィ

ブタ血管内皮細胞を、アツセィの 1 日前に 9 6ゥエルの培養プレート：二 IX 10' 細胞/ゥエルで播いた。 PBS (-)で洗浄した後、細胞を、 70ミリユニットの上記（1) で得た組換えェンドー 5—ガラクトシダーゼ Cを含有する 50〃Lのダルベッコ改変イーグル培地中で 37て、 2時間インキュベートした。コントロールの細胞は酵素なしの条件下でィンキュベートした。細胞を 2回洗浄して、 PBS (-)で希釈した 2 5 %または 5 0 %の正常ヒト皿清（50^L)とともに 3 7 °Cで 1時間ィンキュべ一卜した。ヒト血清は 1 0人の健常なボランティァから採取したものをプールして用いた。ィンキュベートの後、 Biochem. Biophys. Res. Comm. ,232, p731- 736(199 7)に記載の方法により、細胞の生存を 3- (4,5- dimethylthiazo卜 2- yi)- 2,5- diphe nyltetrazolium broniide(MTT)( Sigma社）を用いたァッセィにより決定した。各ゥエルの 5 4 0 nmの吸光度をォートマチック ' プレート ' リーダ一（EAR340, SLT - Labinstruments)で測定し、「補体存在下での細胞の生存」とした。それそれのアツセィで、 56°Cで 30分間処理して補体を不活化した血清を用いて「補体非存在下での細胞の生存」を決定した。補体依存性の細胞傷害性は、以下の式によって算出した。実験は 3回（triplicate)行った。

%細胞傷害性二

[(補体非存在下での細胞の生存一補体存在下での細胞の生存）/補体非存在下での細胞の生存] X 1 0 0 以上の実験の結果を図 2およ図 3に示す。

図 2は、組換えエンド一 /3—ガラクトシダーゼ Cで処理したブタ細胞への、 GS - ΙΒ^とヒト免疫グロプリンの結合性の減少を示す図である。 Aおよび Cは赤血球を用いた実験を、 Bおよび Dは血管内皮細胞を用いた実験を示す。図中の太線は酵素処理後の結果を、細線は酵素処理前の結果を示す。また図 3は、補体依存性の細胞傷害性に対するェンドー /?一ガラクトシダーゼ Cの効果を示す図である。図 3中、網掛けのあるバーは酵素処理していないものの結果を、黒のバーは酵素処理したものの結果をそれそれ示す。 3回のアツセィの平均値を、標準誤差と共に示した。

組換えェンドー 5—ガラクトシダーゼ Cで処理した後、 99%以上のひ-ガラクトース抗原（FITC- GS-IB4により認識される）がブタ赤血球から除去された（図 2 A)。同様に、 98%のひ一ガラクトシルェピトープが酵素的にブ夕血管内皮細胞から除去された（図 2 B )。酵素処理した赤血球への IgMの結合は、無処理の細胞の 25% にまで減少した（図 2 A )。また内皮細胞では 23%以下にまで減少した（図 2 B )。酵素処理した内皮細胞への、ヒト血清中の IgAおよび IgGの結合は、それそれ同様に 21%および 33%にまで減少した（図 2 B )。酵素処理した赤血球への IgGの結合の減少は、比較的少なかった（図 2 A )。

さらに、ヒト IgGサブクラスに対する抗体を用いた結果、処理した細胞への IgG IgG₂、 IgG₃の結合が、顕著に減少していた（図 2 Cおよび D) 。これに対し I gG₄の結合は変化しなかった。エンド一 /?—ガラクトシダ一ゼ Cで処理された細胞は、ヒト血清によって引き起こされる、補体依存性の細胞傷害に対する感受性が低下していた（図 3 ) 。

(3-3)ex vivoでの灌流による、ブタ腎臓血管のェンドー/?—ガラクトシダーゼ C 処理

腎臓は、 Landrace/Yorkshireで異種交配したメスブ夕（ォグリ畜産；体重 10〜1 2kg)から、生理食塩水および University of Wisconsin(UW)溶液（Transplantatio n 45， p673 - 676 ( 1988 ))によって灌流した後に、通常の外科的手法により摘出した。右側の腎臓は、 ex vivoで、 45.1ユニットのエンド一 5—ガラクトシダーゼ Cを含有する lOOraLの冷 U W; ¾を用い、重力（ 1 X g)による流れによって 2回灌流した。左側の腎臓は、酵素なしで灌流した。両方の腎臓は、灌流液中で、 4て、 4 時間保存した。 4 で反応させたのは、低温の方が組織の保存に好ましく、またェンドー 5—ガラクトシダーゼ Cは低温下でも有効に作用するからである。

生検は、灌流後 1時間目および 4時間目の直前に行った。次いで、腎臓を、 3 人の健常なボランティァから採取した lOOmLのヒト新鮮凍結血漿で 2回灌流した。組織学的検討のため、生検によって得たサンプルをホルマリンで固定し、へマトキシリンーェォシンおよび過ヨウ素酸シッフ染色により染色した。サンプルはまた、液体窒素中で直ちに凍結させ、 F I TC-GS- I B 4によって染色し、蛍光顕微鏡で親察した。

この観察により、 F I TC-GS- I B 4による染色によって、血管内皮細胞の内腔に存在するひ一ガラクトース抗原が、 4 °C、 4時間の酵素反応によって実際に除去されていることが確認された。酵素処理した腎臓には、組織学的変化は見られなかつた。

さらに、灌流に用いたヒト血漿を回収し、残存した免疫グロブリンのレベルを、前記のブタ赤血球を用いて FACSで解析した。

これは、 in s i tuでひ一ガラク卜一ス抗原を除去するこの方法によって、酵素処理した血管へのヒト血漿中の免疫グロプリンの結合が、血管内皮細胞や赤血球の場合と同様に減少するか否かを調べるためである。分離した細胞は FACSを用ることによって定量的な解析が可能であるが、インタクトな血管において結合した免疫グロブリン量を直接測定するのは容易ではない。そこで腎臓の灌流後における、ブ夕赤血球への免疫グロブリンの結合活性の減少を測定することとした。ブ夕間のばらつきを防ぐため、同じ個体から摘出した 2つの腎臓を用いた。右側の腎臓はェンド一 5—ガラクトシダーゼ Cで処理し、左側の腎臓は酵素を含有しない溶液で灌流した。次いで、重力下でヒト血漿（100ml )を灌流した。

灌流したヒト血漿を回収してブ夕赤血球と反応させ、次いでヒ卜免疫グロプリンに対する F I TC結合抗体と反応させた。染色した赤血球を FACSで解析した。結果を図 4に示す。なお結果は、灌流前の血漿を用いた場合の平均蛍光強度を 100 % とした相対値で示した。

図 4中の白のバー:ま灌流前の血漿を用いた結果を、網掛けのあるバーは酵素を含有しない溶液のみで灌流したときの結果を、黒のバーは酵素を含有する溶液で灌流したときの結果をそれそれ示す。 3回の独立した実験結果の平均値を、標準誤差と共に示した。結果は、スチューデントの T検定（Student' s T- test )により解析した。図 4中の *は、 Pく 0. 05で有意であることを示す。この結果、酵素処理した腎臓は、酵素を含まない溶液によって処理した腎臓よりも I gMの結合量が有意に少なかった。酵素処理しなかったブ夕腎臓では、平均して 31 %の I gM結合活性がヒト血漿中に残存していた（図 4 ) 。一方、酵素処理した腎臓では、平均して 64%が残存していた（図 4 ) 。この差は統計学的に有意であった。この結果は、大量の I gM結合抗原ェピトープがエンド— /?—ガラクトシダーゼ C消化によって除去されたことを示す。

しかしながら、 I gGおよび IgAの結合能は、酵素処理によってもあまり減少せず、統計学的な有意差もなかった（図 4 ) 。産業上の利用可能性本発明 D N Aにより、エンド— 5—ガラクトシダーゼ Cを遺伝子工学的に安価かつ大量に調製することができる。

また本発明 D N Aを用いて調製した本発明組換えベクター、本発明組換えべク夕一を用いて調製した本発明形質転換体、本発明形質転換体を利用した本発明製造方法は、エンド— ーガラクトシダーゼ Cの大量調製に有用である。

また本発明処理剤は、例えばブ夕等の臓器に発現しているひ -ガラクトース抗原を予め除去し、この臓器をヒト · サル等（ひ -ガラクトース抗原を発現しない）への移植に用いることにより、異種移植の際の超急性拒絶反応を抑制できることから、極めて有用である。特にこのような移植用の腎臓の処理に極めて有用である。

本発明処理剤で処理することによって得られる本発明臓器は、このような異種移植用の臓器として極めて有用である。

Claims

請求の範囲

1. 以下の（A) 又は（B) のタンパク質をコードする D NA。

(A) 配列番号 2に示すアミノ酸配列からなる夕ンパク質。

( B ) アミノ酸配列（A) において、 1もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配列からなり、かつェンドー /?—ガラクトシグーゼ活性を有するタンパク質。

2. 前記アミノ酸配列（A) において、 1 もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配列からなり、かつエンド一 /?ーガラクトシダーゼ活性を有する夕ンパク質が、配列番号 2におけるァミノ酸番号 3 5〜 8 4 5で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質である、請求項 1記載の D N A。

3. 下記（a) 又は（b) に示す D N Aである請求項 1記載の D N A。

(a) 配列番号 1に記載の塩基配列のうち、塩基番号 2 4 6〜 2 7 8 0からなる塩基配列を含む D N A。

(b) 配列番号 1に記載の塩基配列のうち、塩基番号 2 4 6〜 2 7 8 0からなる塩基配列に相補的な塩基配列の全部または一部を有する D N Aとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ、エンド一ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする D NA。

4. 下記（a) 又は（b) に示す D N Aである請求項 1記載の D NA。

( a) 配列番号 1に記載の塩基配列のうち、塩基番号 3 4 8〜 2 7 8 0からなる塩基配列を含む D N A。

(b) 配列番号 1に記載の塩基配列のうち、塩基番号 3 4 8〜 2 7 8 0からなる塩基配列に相補的な塩基配列の全部または一部を有する D N Aとス卜リンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ、エンド一 /?一ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする D NA。

δ . 請求項 1〜 4のいずれか一項に記載の D Ν Αを組み込んだ組換えべク夕

6. 請求項 1〜 4のいずれか一項に記載の D N A又は請求項 5に記載の組換えベクターを細胞に導入することにより得られる、形質転換体。

7. 請求項 6に記載の形質転換体を生育させてェンドー /?—ガラクトシダーゼをコードする D N Aを発現させ、生成したェンドー /?一ガラクトシダ一ゼを採取することを特徴とするェンド一 5—ガラクトシダーゼの製造方;'去。

8. ニンドー 5—ガラクトシダ一ゼを含有する、臓器処理剤。

9. 嗨器が移植用臓器である、請求項 8に記載の処理剤。

1 0. 移植用臓器が、ひ一ガラクトース抗原を発現している臓器であることを特徴とする、請求項 9に記載の処理剤。

1 1. 移植用臓器が、ブタの臓器であることを特徴とする、請求項 1 0に記載の処理剤。

1 2. 移植用臓器が、ヒトに移植するための臓器である、請求項 9〜 1 1のいずれか 1項に記載の処理剤。

1 3. 臓器が腎臓である、 8〜 1 2のいずれか 1項に記載の処理剤。

1 4. ひ一ガラクトース抗原を発現している臓器を、請求項 8〜 1 3のいずれか 1項に記載の処理剤によって処理して得られる、ひ一ガラクトース抗原が除去れた!)！^。

1 5. ひ一ガラクトース抗原を発現している臓器を、ェンド一 /5—ガラクトシダーゼで迅理することを特徴とする、ひーガラクトース抗原による拒絶反応が抑制された移植用臓器の生産方法。