WO2001031004A1 - Nouvelle proteine et son utilisation - Google Patents

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WO2001031004A1
WO2001031004A1 PCT/JP2000/007480 JP0007480W WO0131004A1 WO 2001031004 A1 WO2001031004 A1 WO 2001031004A1 JP 0007480 W JP0007480 W JP 0007480W WO 0131004 A1 WO0131004 A1 WO 0131004A1
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salt
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dna
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PCT/JP2000/007480
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Hiroshi Sugino
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Takeda Pharmaceutical Co Ltd
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Takeda Chemical Industries Ltd
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a novel protein having a specific amino acid sequence, a DNA containing a DNA region encoding the protein, a method for producing the protein, and a use of the protein and the DNA.
  • physiologically active substances have been isolated and identified, and their functions have been elucidated. It is known that some of them exhibit various activities in various organs or cells. Various biological activities in various organs or cells are usually embodied via receptors to which the physiologically active substance binds, but the combination of physiologically active substances that bind to the receptor is present in all organs and cells. In many cases, it is unclear whether they are the same or specific to each organ or cell.
  • bioactive proteins have a PDZ domain, and the PDZ domain is a protein binding domain module that has been discovered relatively recently. For this reason, the distribution, function, and control mechanism of the protein having the PDZ domain in vivo are still unknown, but through its function of protein binding, the lining structure of the cell membrane and the formation of the cytoskeleton network are formed. In addition, it is thought to play an important role in the formation of intracellular signal transduction networks developed on the intracellular surface. In the nervous system, it is indispensable for the assembly of protein clusters at synaptic sites, such as in the formation of complexes such as neurotransmitter receptors and ion channels.
  • PDZ protein whose expression is regulated by synaptic plasticity was discovered, and PDZ protein may be involved in synaptic morphological changes associated with plasticity through receptor rearrangement. It is thought to be involved in network construction and higher-order functions of the living brain.
  • PDZ domains are known peptide bonds It has some commonalities with the merged domain, but also has distinctive features.
  • the PDZ domain is a domain that is widely conserved from bacteria to higher plants and animals.In many cases, the PDZ domain recognizes the shortest amino acid sequence at the C-terminal end of the target protein, and these target proteins are It is often a penetrating receptor or channel.
  • PDZ domains are often found in the same protein as being repeated about 2 to 6 times, and unlike other domain modules, some form homodimers. These are important features for the PDZ domain to be involved in the formation of protein cross-linking networks and microdomains in cell-cell adhesion, such as cell surface structures such as synapses and tight junctions.
  • Activin is a regulator of mesoderm and neural induction in the early embryo, a regulator of follicle-stimulating hormone (FSH) secretion from the anterior pituitary gland, and is a member of the TGF_ / 3 superfamily. There are two types of TGF- / 3 family receptors, type I and type II, which have serine Z threonine kinase activity.
  • Ligand stimulation causes activation of type I by type II, and information is transmitted from the activated type I via activin intracellular signaling molecule Smad and the like.
  • Activin receptor type II contains various molecules that are selectively produced by splicing from two genes, ⁇ ⁇ and ⁇ ⁇ , and may have an important role in addition to activation of type I. Is considered, but it has not been clarified yet. In the past, pituitary secretion of gonadotropin was thought to be mainly regulated by gonad-produced steroid hormones.However, the discovery of activin and inhibin, which has a contradictory effect to this, was considered.
  • the present invention is intended to elucidate the physiological activity of a protein having a PDZ domain and a receptor capable of binding to the protein (eg, an activin receptor), and to inhibit cell differentiation in a tissue of the activin-activin receptor system and to improve neurotrophic factor-like activity.
  • Activity As means for elucidating the detailed molecular mechanism of the expression of physiological activity, such as a novel method for isolating and detecting the protein, a DNA containing the novel protein gene, a method for producing a protein encoded by the novel protein gene, And to provide uses of the DNA and the protein. Disclosure of the invention
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, have found that the yeast cell obtained by binding the intracellular region of the mouse activin IIA receptor protein represented by SEQ ID NO: 1 to a bait.
  • the hybrid (two-hybrid) method we search for binding proteins from a mouse brain cDNA library, and isolate and analyze a cDNA clone that can confirm binding to the activin IIA receptor even in COS 7 cells.
  • the gene contained a region encoding one PDZ domain.
  • the protein encoded by this gene is a protein factor having a protein-protein interaction domain, and binds to the intracellular region of the activin receptor through the domain, but does not inhibit the activin signal transduction. was found.
  • the present inventors extracted po1y (A) + RNA from various mouse organs, and used the DNA shown in SEQ ID NO: 4 as a probe, to obtain the novel protein of the present invention by the Northern hybridization method.
  • the expression was examined, they found that it was widely expressed in various organs such as the heart, brain, liver, skeletal muscle, kidney, and testis.
  • the novel protein plays an important role in the activin-activin receptor signal transduction system in various organs (for example, transport of the activin receptor onto the cell membrane). It has been found that it can be applied to diagnosis, treatment, etc. of diseases associated with functional abnormalities.
  • amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 A protein having a amino acid sequence or a salt thereof,
  • test wave containing the protein described in (1), the partial peptide described in (2) or a salt thereof, and a labeled (1) ), Wherein the protein described in (1) and the partial peptide described in (2) are competitively reacted with the protein described in (2) or the partial peptide described in (2). Or a method for quantifying those salts,
  • the protein according to item (1) characterized in that it contains the protein according to item (1), the partial peptide according to item (2) or a salt thereof.
  • the protein according to item (12) which is administered to a mammal with an effective amount of the protein according to item (12), the compound according to item (16), or a salt thereof.
  • the protein lacks the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or one or more (preferably 2 or more and 10 or less) amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 Amino acid sequence in which one or more (preferably 2 ⁇ to 10) amino acid sequences are added or inserted into the amino acid sequence represented by the lost amino acid sequence, SEQ ID NO: 2, or SEQ ID NO: Item (1), wherein one or more (preferably 2 or more and 10 or less) amino acid sequences in the amino acid sequence represented by 2 contain an amino acid sequence in which another amino acid is substituted. Proteins and their salts,
  • a pharmaceutical composition comprising the compound according to (32) or a salt thereof, and
  • FIG. 1 shows the entire nucleotide sequence of cDNA encoding the novel protein of the present invention and the amino acid sequence encoded thereby (SEQ ID NO: 2).
  • FIG. 2 shows the entire nucleotide sequence of cDNA encoding the novel protein of the present invention and the amino acid sequence encoded thereby (SEQ ID NO: 2), and is a continuation of FIG. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • Examples of the protein containing an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 of the present invention include human warm-blooded animals (eg, guinea pig, rat, mouse, chicken, rabbit, pig) , Hedge, oocyte, monkey, etc.) [e.g., hepatocytes, spleen cells, nerve cells, glial cells, kidney / 3 cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells, Fibroblasts, fibrocytes, muscle cells, adipocytes, immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes, etc.) , Megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, osteocytes, osteoblasts, osteoclasts, mammary cells, or stromal cells,
  • a protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is about 70% or more, preferably about 80% or more, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. And more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more proteins having an amino acid sequence having a homology of about 95% or more.
  • the protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 of the present invention includes, for example, a protein substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 described above.
  • a protein having an amino acid sequence and having substantially the same physiological activity as a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is preferred.
  • Substantially the same physiological activity includes, for example, qualitative factors such as receptor affinity, signal information transmission ability, and organ expression distribution. Substantially identical indicates that their bioactivity is biologically or physiologically equivalent. Therefore, it is preferable that the activities such as the receptor affinity are the same (for example, about 0.1 to 20 times, and preferably about 0.5 to 2 times). Quantitative factors such as the molecular weight of may be different.
  • the measurement of receptor affinity can be performed according to a method known per se, and for example, can be measured according to a screening method described later.
  • the protein of the present invention include, for example, one or two or more (preferably about 1 to 10 ⁇ , more preferably about 1 to 5 amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2; More preferably 1 to 3) amino acids lacking amino acids
  • the amino acid sequence represented by the acid sequence or SEQ ID NO: 2 contains one or more (preferably about 1 to 10, more preferably about 1 to 5, and still more preferably 1 to 3) amino acids.
  • mucins such as proteins containing an amino acid sequence in which the amino acid is replaced with another amino acid, or an amino acid sequence obtained by combining the amino acid sequences.
  • the protein has a N-terminus (amino terminus) at the left end and a C-terminus (aminopropyl terminus) at the right end according to the convention of peptide notation.
  • the protein of the present invention including the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, has a C-terminus which is usually a hydroxyl group (one COOH) or a carboxylate (one COO one).
  • the terminal may be an amide (—CONH 2 ) or an ester (—COOR).
  • R in the ester e.g., methyl, Echiru, n- propyl Le, Ci e alkyl group such as isopropyl or n- butyl, consequent opening pentyl, C 3 _ 8 cycloalkyl group such as cyclohexyl, for example, phenylene Le, shed - c 6 12 Ariru groups, naphthyl, for example, benzyl, phenethyl, C 6 _ 12 7 reels such as a- naphthylmethyl - C i_ other two alkyl groups, orally.
  • the protein of the present invention has a lipoxyl group (or carboxylate) at a position other than the C-terminus
  • a protein in which the lipoxyl group is amidated or esterified is also included in the protein of the present invention.
  • the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
  • the amino group of the N-terminal methionine residue has a protecting group.
  • an acyl group such as a formyl group or an acetyl group
  • a glutamic acid residue at the N-terminus which is formed by cleavage in vivo, and which has been converted into a pyridal amine, the side chain of an amino acid in the molecule
  • an appropriate protecting group eg, formyl group, acetyl group, etc.
  • complex proteins such as so-called glycoproteins to which sugar chains are bound. It is.
  • a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and the like are used.
  • the partial peptide of the protein of the present invention is the partial peptide of the protein of the present invention described above, and is a physiological activity possessed by the protein of the present invention, for example, an activity such as receptor affinity, signal signal transduction ability, organ, etc. Any substance having an expression distribution or the like may be used. For example, 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 80 or more, more preferably 100 or more, most preferably 120 or more of the constituent amino acid sequences of the protein of the present invention. Peptides having an amino acid sequence and having receptor affinity, signal transduction ability, and the like are used.
  • the partial peptide of the present invention has one or two or more (preferably about 1 to 10, more preferably 1 to 3) amino acids in its amino acid sequence, or One or two or more (preferably about 1 to 10, more preferably about 1 to 5, and more preferably 1 to 3) amino acids are added to the amino acid sequence, or One or two or more (preferably about 1 to 10, more preferably about 1 to 5, and still more preferably about 1 to 3) amino acids may be substituted with another amino acid.
  • the partial peptide of the present invention usually has a carboxyl group (one COOH) or a carboxylate (one c-) at the C-terminus, but has an amide (_C ⁇ NH) 2 ) or ester (_C ⁇ R).
  • the partial peptide of the present invention has an N-terminal methionine residue in which the amino group of the methionine residue is protected by a protecting group, and is formed by cleavage of the N-terminal side in vivo.
  • examples include those in which the daltamyl group is pyroglutaminated, those in which the substituent on the side chain of the amino acid in the molecule is protected with an appropriate protecting group, and those in which a sugar chain is bonded, such as a so-called glycopeptide.
  • a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable.
  • salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid) , Tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, and benzenesulfonic acid).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid
  • Tartaric acid citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, and benzenesulfonic acid.
  • salts with inorganic bases for example, alkali metals such as sodium and potassium, alkaline earth metals such as calcium and magnesium, aluminum or ammonium
  • organic bases for example, trimethylamine, triethylamine, pyridine, picoline
  • Salts with 2,6-lutidine, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, cyclohexylamine, dicyclohexylamine, N, N'-dibenzylethylenediamine, etc. are also used.
  • the protein of the present invention or a salt thereof can be produced from cells or tissues of the aforementioned human warm-blooded animal by a method known per se, or a transformant containing a DNA encoding the protein described below. Can also be produced by culturing E. coli. Further, it can be produced according to the peptide synthesis method described later.
  • the human or mammalian tissues or cells are homogenized and extracted with an acid or the like, and the extract is subjected to chromatography such as reverse phase chromatography or ion exchange chromatography. It can be isolated and purified by a combination of chromatography.
  • resins for protein synthesis can be used.
  • resins include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, and 4-hydro Xymethylphenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ', 4'-dimethoxyphenylhydroxymethyl) phenoxy resin, 4_ (2,, 4'-dimethoxyphenyl-Fmocaminoethyl ) Phenoxy resin And the like.
  • -Amino group and a side chain functional group appropriately protected is condensed on the resin in accordance with the sequence of the target protein according to various known condensation methods.
  • the protein is cleaved from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed.
  • an intramolecular disulfide bond formation reaction is carried out in a highly diluted solution to obtain the target protein, its partial peptide, or an amide thereof. To get.
  • the protected amino acid may be added directly to the resin with a racemization inhibitor additive (eg, H ⁇ B t, HOOB t), or may be pre-protected as a symmetric anhydride or HOB t ester or HOOB t ester
  • a racemization inhibitor additive eg, H ⁇ B t, HOOB t
  • the amino acid can be added to the resin after activation.
  • the solvent used for activating the protected amino acid or condensing with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for the protein condensation reaction.
  • acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride, chloroform, alcohols such as trifluoroethanol , Sulfoxides such as dimethylsulfoxide, ethers such as pyridine, dioxane, and tetrahydrofuran; nitriles such as acetonitrile and propionitrile; esters such as methyl acetate and ethyl acetate; or an appropriate mixture thereof. Used.
  • the reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for a protein bond formation reaction, and is usually appropriately selected from a range of about 120 ° C to 50 ° C.
  • the activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess.
  • Examples of the protecting group for the amino group of the starting material include Z, Boc, tert-pentyloxycarbonyl, isopolnyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, C1Z, Br-Z, Damantyloxycarbonyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 2-ditrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like are used.
  • the carboxyl group may be, for example, alkyl-esterified (eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, tert-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.).
  • alkyl-esterified eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, tert-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.
  • Cyclic alkyl esterification aralkyl esterification, (eg, benzyl ester, 412 trobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-cyclobenzyl ester, benzhydryl esterification), phenacyl ester Benzyloxycarbonylhydrazide, tert-butoxycarbylhydrazide, tritylhydrazide, and the like.
  • the hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • a lower alkanol group such as an acetyl group, an aroyl group such as a benzoyl group, a group derived from carbonic acid such as a benzyloxycarbonyl group, an ethoxycarbonyl group and the like are used.
  • a group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydrobiranyl group, a t-tert-butyl group, and the like.
  • the protecting group of the phenolic hydroxyl group of tyrosine for example, B z 1, C 1 2 - B zl, 2- nitrobenzyl, B r- Z, such as tert- butyl Ru is used.
  • a protecting group for imidazole of histidine for example, Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like are used.
  • Activated carboxyl groups of the raw materials include, for example, the corresponding acid anhydrides, azides, active esters [alcohols (eg, phenol, Esters with 2,4,5-trichlorophenol, 2,4-dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HON fe, N-hydroxysuccinimide, HOB t) are used.
  • active esters eg, phenol, Esters with 2,4,5-trichlorophenol, 2,4-dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HON fe, N-hydroxysuccinimide, HOB t
  • the activated amino group of the raw material for example, a corresponding phosphoric amide is used.
  • Methods for removing (eliminating) protecting groups include, for example, catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd black or Pd-carbon, or hydrogen fluoride anhydride or methanesulfonic acid.
  • the elimination reaction by the above acid treatment is generally carried out at a temperature of about 120 ° C. to 40 ° C.
  • the protection of the functional group which should not be involved in the reaction of the raw materials, the protection group, the elimination of the protective group, and the activation of the functional group involved in the reaction can be appropriately selected from known groups or known means.
  • an amide form of a protein or a partial peptide thereof for example, first, amidating and protecting the ⁇ -hydroxyl group of the carboxyl terminal amino acid, a peptide (protein) chain is added to the amino group side with a desired peptide (protein) chain. After extending the chain length, a protein (partial peptide) in which only the protecting group of the amino group at the ⁇ end of the peptide chain is removed and a protein (partial peptide) in which only the protecting group of the carboxyl group at the C terminal is removed And the two proteins (partial peptides) are condensed in a mixed solvent as described above. Combine. Details of the condensation reaction are the same as described above.
  • the crude protein (partial peptide) is purified by using various known purification means, and the main fraction is lyophilized to obtain an amide of the desired protein (partial peptide).
  • an ester of a protein or its partial peptide for example, after condensing the ⁇ -hydroxyl group of the carboxyl terminal amino acid with a desired alcohol to obtain an amino acid ester, an amide of the protein (partial peptide) is obtained. Similarly, an ester of the desired protein (partial peptide) can be obtained.
  • the partial peptide of the present invention or a salt thereof can be produced according to a peptide synthesis method known per se, or by cleaving the protein of the present invention with an appropriate peptidase.
  • a peptide synthesis method for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, the target peptide can be produced by condensing a partial peptide or amino acid capable of constituting the protein of the present invention with the remaining portion and, if the product has a protecting group, removing the protecting group. Wear. Examples of the known condensation method and elimination of the protecting group include the methods described in the following 1 to 5.
  • the protein of the present invention can be purified by a combination of ordinary purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, and recrystallization.
  • the partial peptide can be isolated and purified.
  • the protein or its partial peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method, and conversely, when the protein or a partial peptide thereof is obtained by a salt, it is obtained by a known method. Can be converted to the free form.
  • the DNA encoding the protein of the present invention may be any DNA containing the above-described nucleotide sequence encoding the protein of the present invention.
  • any of genomic DNA, genomic DNA library, the above-described cell-tissue-derived cDNA, the above-described cell-tissue-derived cDNA library isolated by a method known per se, and synthetic DNA May be.
  • the vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like.
  • a direct Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) ) Can be isolated.
  • Examples of the DNA encoding the protein of the present invention include: (1) DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 or (2) DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 under high stringent conditions.
  • Hybridization is performed by a method known per se or a method equivalent thereto, for example, For example, molecular cloning (Mo 1 ecu 1 ar CI on ing) 2 nd (J. Samb rooketa 1., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) Can be.
  • molecular cloning Mo 1 ecu 1 ar CI on ing
  • 2 nd J. Samb rooketa 1., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989
  • a commercially available library it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, it can be performed under high stringency conditions.
  • High stringency conditions include, for example, a sodium concentration of about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 2 OmM, and a temperature of about 50 to 70 ° C, preferably about 60 to 65 ° C. Are shown. In particular, a sodium concentration of about 19 mM and a temperature of about 65 ° C are most preferable.
  • DNA encoding the protein containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 a DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 3 and the like are used.
  • the DNA encoding the partial peptide of the present invention may be any as long as it contains the above-described nucleotide sequence encoding the partial peptide of the present invention.
  • any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the above-described cells / tissue, cDNA isolated from the aforementioned cDNA library derived from the cells / tissue by a method known per se, and synthetic DNA may be used. .
  • Examples of the DNA encoding the partial peptide of the present invention include a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 and high stringency.
  • DNA having a partial nucleotide sequence of DNA encoding a protein having the same activity as that of the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having a DNA that hybridizes under the following conditions is used. .
  • partial partitioning of the protein of the present invention is used.
  • DNA, genomic DNA library, cDNA derived from cells and tissues described above A part of or all of the protein of the present invention isolated by a method known per se from a cDNA library derived from the cells and tissues described above. It can be isolated by hybridization with a DNA fragment encoding the region or labeled with synthetic DNA. Hybridization methods are described, for example, in Molecular Cloning (Molec u l a r C l on i n g) 2 n d (J.
  • the cloned DNA encoding the protein of the present invention can be used as it is depending on the purpose, or can be digested with a restriction enzyme or added with a linker if desired.
  • the DNA has AT at its 5 'end as a translation initiation codon.
  • the expression vector for the protein of the present invention includes, for example, (a) cutting out a DNA fragment of interest from DNA encoding the protein of the present invention, and (mouth) placing the DNA fragment downstream of a promoter in an appropriate expression vector. It can be manufactured by linking.
  • a plasmid derived from E. coli eg, pBR322, pBR3 25, pUC 12, pUC 13
  • Bacillus subtilis-derived plasmids eg, pUB110, pTP5, pC194
  • Yeast-derived plasmids eg, pSH19, pSH15
  • ⁇ phage etc.
  • animal viruses such as bacteriophages, retroviruses, vaccinia viruses, and baculoviruses, ⁇ 11_1, XT1, pRc / CMV, pRcZRSV, pcDNAI / Neo, and the like are used.
  • the promoter used in the present invention may be any promoter that is appropriate for the host used for gene expression.
  • a promoter derived from SV40 a promoter derived from SV40, a retrovirus promoter, a metamouth thionein promoter, a heat shock promoter, a cytomegalovirus promoter, an SR ⁇ promoter, and the like can be mentioned.
  • cytomegalovirus promoter overnight, SR ⁇ promoter and the like.
  • the host is Eshierihia genus bacterium, trp promoter -.
  • the host is Bacillus case, SP 0
  • yeast such as 1-promo, SP02 promoter, pen P promoter, etc., pHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, etc. are preferred.
  • a polyhedrin promoter, a P10 promoter and the like are preferable.
  • an expression vector containing, if desired, an enhancer, a splicing signal, a poly A addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori), and the like may be used. be able to.
  • selectable markers include dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dhfr) gene [methotrexate (MTX) resistance], ampicillin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Amp), neomycin Syn resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Neo, G418 resistance) etc.
  • dhfr gene is used as a selection marker using CH ⁇ (dhfr-) cells, the gene of interest is contained.
  • Transformants with thymidine Selection can also be made depending on the medium that does not contain.
  • a signal sequence suitable for the host can be added to the N-terminal side of the protein of the present invention. If the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, the lipophilic phosphatase * signal sequence and the OmpA signal sequence are included. If the host is a bacterium belonging to the genus Bacillus, the ⁇ -amylase signal sequence and the subtilisin signal sequence are included. when the host is a yeast, mating factor Ichihi-chi signal sequence, such as inverso evening over Ze signal sequence, the host if an animal cell, for example, insulin signal sequence, alpha _ interferon signaling Le Sequence, antibody molecule, signal sequence, etc. can be used.
  • a transformant can be produced.
  • Escherichia bacteria for example, Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, yeast, insect cells, insects, animal cells, and the like are used.
  • Escherichia coli K12-DH1 Procedures of the nation, academy, obs, science, obs, the usa (P. Roc. atl. Acad. Sci. USA), 60, 160 (1968)], JM 103 [Nucleic Acids Research], 9, 309 (198) 1), JA 22 1 [Journal of MoI ecu 1 ar Biology], 120, 5 17 (1 978)], HB 10 1 [ Journal 'ob' Molecular 'biology, Vol. 41, 459 (1969)], C600 [Genetics, Vol. 39, 440 (1954)], etc. are used.
  • Bacillus spp. include, for example, Bacillus S-ubtilis MI114 (Gene, 24, 255 (1983)), 207—221 (Journa Biochemistry) 1 of B ioch em istry), Vol. 95, 87 (1 984)].
  • yeast include Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R ", NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, and Schizosaccharomyces bomb (Schizosacchar omy cesp omb).
  • Insect cells include, for example, when the virus is Ac NPV, a cell line derived from night larvae of moth larvae (S podopterafrugiperdace 11; S f cells), MG 1 cells derived from the midgut of Trichoplusiani, and Triehop 1 usiani Egg-derived High Five TM cells, Mam estrabrassicae-derived cells, Estigmenaacrea-derived cells, and the like are used.
  • Sf cells include Sf9 cells (ATCC CRL 171 1), Sf21 cells (Vaughn, J.L. et al., In vivo, 13, 2). 1 3-2 1 7, 1977).
  • insects for example, silkworm larvae and the like are used [Maeda et al., Neyya-(Natu ree), 315, 592 (1985)].
  • animal cells examples include monkey cell COS-7, Ver0, Chinese hamster cell CH ⁇ , DHFR gene-deficient Chinese hamster cell CH ⁇ (dhfr-CH ⁇ cell), mouse L cell, mouse AtT-20, Mouse myeloma cells, rat GH3, human FL cells, etc. are used.
  • the method can be performed according to the method described in Larire's Genetics (Mo 1 ecu 1 ar & Genera 1 Ge netics), Vol. 168, 111 (1 979).
  • Transformation of insect cells or insects can be performed, for example, according to the method described in Bio Z Technology (Bio / Technology), 6, 47-55 (1988).
  • a liquid medium is suitable as a medium for culturing, and the medium required for the growth of the transformant is contained therein.
  • the carbon source include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose.
  • examples of the nitrogen source include ammonium salts, nitrates, corn chip lica, peptone, casein, meat extract, soybean meal, potato
  • examples of the inorganic or organic substance and the inorganic substance such as the extract include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride.
  • yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added.
  • the pH of the medium is preferably about 5 to 8.
  • Examples of a culture medium for culturing Escherichia bacteria include, for example, glucose, M9 medium containing amino acids (mirror (Mi 11 er), Journal of Ex peri mentsin Molecular Ge netics), 4 3 1 -433, Co ld Spring Harbor Laboratory, New York 1 972] is preferred.
  • a drug such as 3-indolylacrylic acid can be added to make the promoter work efficiently.
  • culturing is usually performed at about 15 to 43 ° C for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be applied.
  • culturing is usually performed at about 30 to 40 for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and agitation can be added.
  • a medium for example, Burk older minimum medium (Bostian, KL et al., Processings of the National Academy) Nat., USA, Vol. 77, 4505 (1 980)] and 0.5% casamino acid SD medium [Bitter, GA, et al., Processings of the National's Academy of Sciences of the USA (Proc. N at 1. Ac ad. S ci. USA ), 81, 5330 (1984)].
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 5 to 8. Cultivation is usually performed at about 20 ° C to 35 for about 24 to 72 hours, and aeration and agitation are added as necessary.
  • the culture medium is G races Insect Medium (G race, TCC, Nature, 195, 788 (1962)).
  • G race, TCC, Nature, 195, 788 (1962) A solution to which an additive such as immobilized 10% serum or the like is appropriately added is used.
  • the pH of the medium is preferably adjusted from about 6.2 to 6.4. Culture is usually performed at about 27 for about 3 to 5 days, and aeration and agitation are added as necessary.
  • MEM medium containing 5 to 20% fetal calf serum (Science, 122 vol., 501 (1952)], DMEM medium [Virology (V iro 1 ogy), 8 vol. 396 (1959)] ], RPMI 1640 medium [Journa 1 of the American Medical Association] 99, 5 19 (1 967)], 199 medium [Proceding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)].
  • the pH is between about 6 and 8.
  • the cultivation is usually performed at about 30 to 40 to about 15 to 60 hours, and aeration and agitation are added as necessary.
  • the protein of the present invention can be produced in a culture medium or a transformant.
  • the protein of the present invention can be separated and purified from the culture by, for example, the following method.
  • the cells or cells When extracting the protein of the present invention from cultured cells or cells, after culturing, the cells or cells are collected by a known method, suspended in an appropriate buffer, and subjected to sonication, lysozyme and Z or freeze-thawing. After the cells or cells are destroyed by the method described above, a method of obtaining a crude extract of the protein by centrifugation or filtration is used as appropriate.
  • the buffer may contain a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100 (trade name).
  • Purification of the protein contained in the thus obtained culture supernatant or extract can be carried out by appropriately combining known separation and purification methods.
  • These known separation and purification methods include methods using solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • Methods that mainly use differences in molecular weight, such as ion exchange chromatography Methods that use the difference in charge such as chromatography, methods that use specific affinity such as affinity chromatography, methods that use the difference in hydrophobicity such as reversed-phase high-performance liquid chromatography, and isoelectric points.
  • a method utilizing the difference between isoelectric points such as electrophoresis is used.
  • the protein thus obtained when it is obtained in a free form, it can be converted to a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and conversely, when the protein is obtained in a salt, a method known per se or The compound can be converted into a free form or another salt by an analogous method.
  • the protein produced by the recombinant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by the action of an appropriate protein modification enzyme before or after purification.
  • an appropriate protein modification enzyme for example, trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like are used.
  • the activity of the thus produced protein of the present invention or a salt thereof can be measured by a binding experiment with a labeled ligand, an enzymimnoassay using a specific antibody, or the like.
  • the antibody against the protein of the present invention, its partial peptide or a salt thereof may be any of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody as long as it can recognize the protein of the present invention, its partial peptide or a salt thereof. Is also good.
  • An antibody against the protein of the present invention, its partial peptide or a salt thereof (hereinafter abbreviated as the protein of the present invention) is produced by using the protein of the present invention as an antigen according to a known method for producing an antibody or antiserum. be able to.
  • the protein of the present invention is administered by itself or together with a carrier or a diluent to a site capable of producing an antibody when administered to a warm-blooded animal.
  • Complete Freund's adjuvant ⁇ Incomplete Freund's adjuvant to enhance antibody production during administration A bunt may be administered. Administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of 2 to 10 times. Examples of the warm-blooded animal to be used include monkeys, puppies, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats, and chickens, and mice and rats are preferably used.
  • a warm-blooded animal immunized with an antigen for example, an individual with an antibody titer is selected from a mouse, and the spleen or lymph node is collected 2 to 5 days after the final immunization.
  • an individual with an antibody titer is selected from a mouse, and the spleen or lymph node is collected 2 to 5 days after the final immunization.
  • myeloma cells By fusing the contained antibody-producing cells with myeloma cells, monoclonal antibody-producing hybridomas can be prepared.
  • the antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting a labeled protein described below with the antiserum, and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody.
  • the fusion operation can be carried out according to known methods, for example, the method of Koehler and Milstein [Nature, 256, 495 (1975)].
  • the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, and preferably PEG is used.
  • PEG polyethylene glycol
  • myeloma cells include NS-1, P3U1, SP2 / 0, and AP-1, and P3U1 is preferably used.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG 1000 to PEG 600) is 10 to 80. %, And incubated at 20 to 40 ° C., preferably 30 to 37, for 1 to 10 minutes, so that cell fusion can be carried out efficiently.
  • the hybridoma culture supernatant is added to a solid phase (for example, a microplate) on which a protein antigen is adsorbed directly or together with a carrier.
  • a solid phase for example, a microplate
  • Anti-immunoglobulin antibody anti-mouse immunoglobulin antibody is used if the cells used for cell fusion are mice
  • protein A an anti-protein monoclonal antibody bound to the solid phase
  • a method of adding a culture supernatant, adding the protein labeled with a radioactive substance, an enzyme, or the like, and detecting an anti-protein monoclonal antibody bound to a solid phase can be used.
  • Selection of the anti-protein monoclonal antibody can be performed by a method known per se or a method analogous thereto. Usually, it can be performed in a medium for animal cells supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine).
  • HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • any medium can be used as long as the hybridoma can grow.
  • RPMI 1640 medium containing 1 to 20%, preferably 10 to 20% fetal bovine serum, GIT medium containing 1 to 10% fetal bovine serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
  • a serum-free medium for hybridoma culturing SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.
  • the culturing temperature is usually 20 to 40, preferably about 37 ° C.
  • the culture time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks.
  • the cultivation can usually be performed under 5% carbon dioxide.
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the anti-protein antibody titer in the antiserum described above.
  • Separation and purification of anti-protein monoclonal antibodies can be performed by a method known per se, for example, an immunoglobulin separation and purification method [eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ion exchanger (eg, DEAE) )), Ultracentrifugation, gel filtration, specific purification method in which only antibodies are collected using an antigen-bound solid phase or an active adsorbent such as protein A or protein G, and the bonds are dissociated to obtain antibodies. It can be carried out.
  • an immunoglobulin separation and purification method eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ion exchanger (eg, DEAE)
  • Ultracentrifugation gel filtration, specific purification method in which only antibodies are collected using an antigen-bound solid phase or an active adsorbent such as protein A or protein G, and the bonds are dissociated to obtain antibodies
  • the polyclonal antibody of the present invention can be produced by a method known per se or a method analogous thereto. For example, a complex of an immunizing antigen (protein antigen) and a carrier protein is formed, a warm blood animal is immunized in the same manner as in the above-described monoclonal antibody production method, and an antibody-containing substance against the protein of the present invention is obtained from the immunized animal. It can be produced by collecting and collecting and separating the antibody.
  • the type of carrier protein and the mixing ratio of the carrier and the hapten may vary depending on the type and ratio of the hapten immunized by cross-linking the carrier if the antibody can be efficiently produced.
  • ⁇ ⁇ serum albumin ⁇ ⁇ psilogloproline, hemocyanin, etc. may be coupled in a weight ratio of about 0.1 to 20 and preferably about 1 to 5 with respect to 1 hapten. A method is used.
  • various condensing agents can be used for coupling of the hapten and the carrier.
  • daltaraldehyde, carbodiimide, maleimide active ester, an active ester reagent containing a thiol group or a dithiopyridyl group, etc. are used. .
  • the condensation product is administered to a warm-blooded animal at a site where antibody production is possible, or together with a carrier or diluent.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration.
  • the administration is usually performed once every about 2 to 6 weeks, for a total of about 3 to 10 times.
  • the polyclonal antibody can be collected from the blood, ascites, or the like of a warm-blooded animal immunized by the above method, preferably from the blood.
  • the measurement of the polyclonal antibody titer in the antiserum can be performed in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above. Separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same method for separation and purification of immunoglobulin as in the above-described separation and purification of the monoclonal antibody.
  • Antisense DNA having a nucleotide sequence substantially complementary to DNA or mRNA encoding the protein or partial peptide of the present invention includes DNA or mRNA encoding the protein or partial peptide of the present invention.
  • Any oligonucleotide or a derivative thereof having a nucleotide sequence substantially complementary to the nucleotide sequence or a partial nucleotide sequence thereof and having an action of suppressing the expression of the protein or partial peptide. May be antisense DNA.
  • the nucleotide sequence substantially complementary to the DNA or mRNA may be, for example, about the entire nucleotide sequence or a partial nucleotide sequence of the nucleotide sequence complementary to the DNA or mRNA (ie, the complementary strand of the DNA or mRNA).
  • a base sequence having 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and still more preferably about 95% or more homology is exemplified.
  • the complementary sequence of the base sequence of the portion encoding the N-terminal site of the protein or the like of the present invention (for example, the base sequence near the start codon) in the entire base sequence of the complementary chain of the DNA or mRNA of the present invention.
  • An antisense DNA having a homology of about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and still more preferably about 95% or more is suitable. These antisense DNAs can be produced using a known DNA synthesizer or the like.
  • the antibody against the protein of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as the antibody of the present invention) and the antisense DNA can be obtained by (1) a method for determining a binding protein to the protein of the present invention, (2) a recombinant protein.
  • obtaining a binding protein to the protein of the present invention using the two_hybrid method and further using a binding assay using the protein of the present invention and an activin receptor or another obtained receptor to humans or other warm-blooded animals. It is possible to screen for a promoter or inhibitor of a specific information transmission system, and the promoter or inhibitor can be used as a prophylactic / therapeutic agent for various diseases. .
  • the protein of the present invention is useful as a reagent for searching for or determining a binding protein to the protein of the present invention.
  • the present invention provides a method for determining a binding protein to the protein of the present invention, which comprises screening a binding protein interacting with the protein of the present invention.
  • the method for determining a binding protein of the present invention includes a method in which a protein of the present invention is fused to a DNA binding region of a transcription factor on a host cell expression vector, a test protein and a transcription activation region fusion library. Is introduced into a host cell having a reporter gene carrying the transcription factor-binding region on the promoter, and interaction with the protein is caused by a change in the expression level of the reporter gene which is increased by the binding of the two proteins. This is a method for determining a protein or a salt thereof.
  • the method for determining a binding protein of the present invention is characterized by using a two_hybrid method which detects an interaction between a protein of the present invention and a test protein by converting the interaction into expression of a specific reporter gene.
  • the DNA encoding the protein of the present invention used in the method for determining a binding protein includes a base encoding a protein containing an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 of the present invention. Any sequence may be used as long as it contains a base sequence encoding the sequence or its partial peptide.
  • Genomic DNA of warm-blooded animals (eg, humans), genomic DNA library of warm-blooded animals (eg, humans), cDNA from tissues and cells of warm-blooded animals (eg, humans), warm-blooded DNA isolated from a cDNA library derived from a tissue or cell of an animal (eg, a human) or a cell, a synthetic or semi-synthetic DNA may be used.
  • the vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like.
  • test protein library As a test protein library to be screened, commercially available cDNA libraries derived from various organs of various animals (such as MATCHM AKER cDNA manufactured by Conetech Corporation) and the like are used.
  • PAS2-1, pGBT9, pKAD_09, pSD09, pEG202, pBTM116 and the like are used as vectors for expressing the fusion protein of the DNA binding region and the test protein.
  • PGAD424, ACT2, pKT10OGal-VP, pJG4-5, pVP16 and the like are used as vectors for expressing the fusion protein of the transcription factor activation region and the protein.
  • GAL4, LexA, SRF and the like are used as transcription factors.
  • ⁇ -galactosidase gene (LacZ), histidine gene (HIS3), luciferase gene, chloramphenicol acetyltransferase gene and the like are used.
  • yeast S accharomyces cerevisiae
  • Escherichia coli As host cells, yeast (S accharomyces cerevisiae), Escherichia coli and the like are used. Among them, CG-1945, Y190, ⁇ 187, HF7c, S FY526, L40, EGY48, HIS / L1, A 62 L yeast strain is used.
  • a method of determining a protein that binds to the protein is as follows: a DNA fragment containing a nucleotide sequence encoding the protein and a nucleotide sequence encoding a DNA binding region on a plasmid (for example, pAS2_l). And a DNA fragment containing the nucleotide sequence encoding the transcription activation region of a transcription factor (eg, GAL4) on a plasmid (eg, PACT2).
  • a cDNA library expressed in the form of a protein can be prepared, for example, by molecular cloning (Molecular Cloning in) 2 nd (J. Sam rooket. A 1., Old Spring Harbour Lab. , 1989).
  • the above two plasmids are transferred to host cells (eg, Saccharomyces cerevisiae).
  • host cells eg, Saccharomyces cerevisiae
  • the plasmids can be transformed simultaneously, or one of the plasmids can be introduced first, and then the other can be introduced sequentially.
  • the expression can be detected by converting the expression of the reporter gene of the transformant, the amount of reporter enzyme coloring or fluorescent substance produced or the amount of luminescence. More specifically, when the host cell is yeast, expression of the reporter gene (eg, 3-galactosidase activity) can be determined using the replica plate method or the filter method, preferably using the filter method. Can be detected by color screening.
  • expression of the reporter gene eg, 3-galactosidase activity
  • Colonies that have been colored (eg, blue) by the Phil-Ichiichi method are, for example, AP ractical Ap proach (B artel, P.L. eta 1., O ford University Press, Ox Ford; 153-179, 1993 a) can be used to isolate a single colony of a positive clone.
  • plasmid DNA is recovered, and the receptor for the protein of the present invention can be determined by determining the nucleotide sequence of the DNA.
  • the binding protein to the protein of the present invention can be determined by using a commercially available kit, for example, MATCHMAKER GAL 4 Two—Hybrid Systems (manufactured by C ontech). It can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
  • DNA encoding the protein of the present invention is administered to the patient to express the protein, or (mouth) DNA encoding the protein of the present invention is present in cells of these organs.
  • DNA encoding the protein of the present invention can be used as a safe and low-toxic agent for preventing or treating diseases mediated by a protein binding to the protein of the present invention.
  • the DNA of the present invention When the DNA of the present invention is used as the above-mentioned therapeutic agent, the DNA may be used alone or inserted into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, and the like, followed by a conventional method. It can be implemented according to the following. For example, sterile solutions or suspensions in tablets or capsules, capsules, elixirs, microcapsules, etc., as needed, orally, or in water or other pharmaceutically acceptable liquids It can be used parenterally in the form of injections such as liquids.
  • the DNA of the present invention is mixed with physiologically acceptable carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, and the like in a unit dosage form generally required for the practice of pharmaceutical preparations. This can be manufactured. The amount of the active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose in the specified range can be obtained.
  • Additives that can be incorporated into tablets, capsules, etc. include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc.
  • Such leavening agents such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, and flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry are used.
  • a liquid carrier such as oils and fats can be further contained in the above type of material.
  • the sterile composition for injection can be formulated according to a conventional pharmaceutical preparation such as dissolving or suspending an active substance in a vehicle such as water for injection, or a naturally occurring vegetable oil such as sesame oil or coconut oil.
  • Aqueous liquids for injection include physiological saline, isotonic solutions containing bud sugar and other auxiliaries (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.).
  • auxiliaries eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.
  • Agents for example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), non-ionic surfactant (eg, polysorbate 80 (trade name), HCO-50) May be.
  • the oily liquid include sesame oil and soybean oil, which may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
  • buffers eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer
  • soothing agents eg, benzalkonium chloride, proforce hydrochloride, etc.
  • stabilizers eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • storage Agents eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • antioxidants eg, antioxidants and the like.
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, and should be administered to mammals (eg, rats, puppies, higgs, bush, puppies, cats, dogs, monkeys, humans, etc.). Can be done.
  • the dosage of the DNA varies depending on the symptoms and the like.
  • the single dose depends on the subject, target organ, although it varies depending on symptoms, administration method, etc., for example, in the form of an injection, it is usually about 0.01 to 3 Omg per day for an adult (as 60 kg), preferably about 0.1 to 2 mg / day. It is convenient to administer about Omg, more preferably about 0.1 to 10 mg by intravenous injection. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • Such compounds include a compound having a cell stimulating activity (eg, an activity of promoting or suppressing proliferation, phosphorylation of an intracellular protein, etc.) via a binding protein (a so-called agonist against the protein of the present invention) and Compounds that do not have the cell stimulating activity (so-called antagonists for the protein of the present invention) are included.
  • a cell stimulating activity eg, an activity of promoting or suppressing proliferation, phosphorylation of an intracellular protein, etc.
  • a binding protein a so-called agonist against the protein of the present invention
  • Compounds that do not have the cell stimulating activity are included.
  • the present invention relates to 1) (i) a case in which the protein of the present invention or a salt thereof is contacted with a protein binding to the protein of the present invention; and (ii) a protein binding to the protein of the present invention, (2) (i) DNA encoding the protein of the present invention and a protein binding to the protein of the present invention (for example, an activin receptor); (Ii) inhibiting the binding of the protein of the present invention to a protein binding to the protein of the present invention, which comprises comparing the transformant into which the test compound has been brought into contact with the transformant into which the test compound has been introduced.
  • a method for screening a compound or a salt thereof which accelerates.
  • the binding protein to the protein of the present invention is brought into contact with the protein of the present invention or a salt thereof; and (ii) the binding protein to the protein of the present invention is:
  • the protein of the present invention or a salt thereof and a test compound are brought into contact with each other, for example, the amount of binding of the protein or a salt thereof to a binding protein of the protein of the present invention, cell stimulating activity, and the like are measured and compared.
  • the present invention provides
  • the protein binding to the protein of the present invention is a membrane-bound protein (for example, a transmembrane receptor, a channel, etc.), it contains the labeled protein of the present invention or a salt thereof, and a protein binding to the protein of the present invention.
  • the labeled protein of the present invention or a salt thereof and the test compound are brought into contact with the cell containing the protein binding to the protein of the present invention or the membrane fraction of the cell. Measuring the amount of binding of the labeled protein of the present invention or a salt thereof to the cell or the membrane fraction, and comparing the protein and the salt thereof with the binding protein.
  • the labeled protein of the present invention or a salt thereof is converted into a binding protein expressed in cells by culturing a transformant containing a DNA encoding a binding protein (eg, an activin receptor) to the protein of the present invention.
  • a binding protein eg, an activin receptor
  • the labeled protein of the present invention or a salt thereof and the test compound were expressed in cells by culturing a transformant containing a DNA encoding a protein binding to the protein of the present invention.
  • a binding protein for example, activin receptor
  • binding protein for example, an activin receptor
  • any binding protein or a salt thereof may be used as a binding protein (for example, an activin receptor) used in the screening method of the present invention.
  • Organ extracts are preferred.
  • a binding protein or a salt thereof that has been expressed in a large amount using a gene recombination technique is suitable for screening.
  • the above-described method is used to produce the binding protein.
  • the method is performed by expressing DNA encoding the protein in mammalian cells or insect cells.
  • Complementary DNA is used for the DNA fragment encoding the target portion, but is not necessarily limited thereto.
  • a gene fragment or synthetic DNA may be used.
  • the DNA fragment should be transfected with a nuclear polyhedrosis virus belonging to baculovirus using an insect as a host.
  • edrosisvirus (NPV) polyhedrin promoter SV40-derived promoter, retrovirus promoter, meta-mouth choonein promoter, human heat shock promoter, cytomegalovirus promoter, SR It is preferred to incorporate it downstream, such as at Hypromo Yuichi.
  • NDV edrosisvirus
  • the amount and quality of the expressed binding protein can be examined by a method known per se. P. et al., The Journal of Biological Chemistry — (J. Biol. Chem.), 267, 19555-19559, 1992]. It can be done according to the method.
  • the protein containing a binding protein or a salt thereof may be a binding protein or a salt thereof purified according to a method known per se, or using a cell containing the protein.
  • the protein is a membrane-bound protein, a membrane fraction of cells containing the protein may be used.
  • the cells When cells containing a binding protein are used in the screening method of the present invention, the cells may be immobilized with daltaraldehyde, formalin, or the like.
  • the solidification can be performed according to a method known per se.
  • the cell containing the binding protein refers to a host cell that has expressed the binding protein.
  • Examples of the host cell include Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cells, animal cells, and the like.
  • the membrane fraction refers to a fraction abundant in cell membrane obtained by disrupting cells and then obtained by a method known per se.
  • the cells can be disrupted by crushing the cells with a Potter-E1 Vehjem-type homogenizer, by crushing with a pelleting blender or polytron (Kinell matica), or by ultrasonic waves. Crushing, and crushing by ejecting cells from a thin nozzle while applying pressure with a French press or the like.
  • fractionation by centrifugal force such as fractionation centrifugation or density gradient centrifugation is mainly used.
  • the cell lysate is centrifuged at a low speed (500 to 300 rpm) for a short time (typically about 1 to 10 minutes), and the supernatant is further centrifuged at a high speed (150 to 300 rpm). The mixture is centrifuged at 0,000 rpm for 30 minutes to 2 hours, and the resulting precipitate is used as the membrane fraction.
  • the membrane fraction is rich in the expressed binding protein and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
  • the amount of bound protein in cells or in the membrane fraction containing the binding protein, 1 0 and even preferably at 2 to 1 0 8 molecules per cell, 1 0 5 from the and even preferred 1 0 7 molecule is there.
  • an appropriate binding protein fraction and a labeled protein of the present invention are used. is necessary.
  • the binding protein fraction is preferably a natural binding protein fraction or a recombinant binding protein fraction having an activity equivalent thereto.
  • “equivalent activity” means equivalent binding activity to the protein of the present invention.
  • Examples of the labeled protein of the present invention include a labeled protein of the present invention, a labeled protein analog compound of the present invention, and the like.
  • a labeled protein of the present invention For example [3 H], [125 I], C 1 4 C], it can be utilized such as proteins of the present invention labeled the like [135 S].
  • a binding protein preparation is prepared by suspending in a buffer suitable for the procedure.
  • Buffers that do not inhibit the binding between the protein of the present invention and a protein binding to the protein of the present invention such as a phosphate buffer having a pH of 4 to 10 (preferably, a pH of 6 to 8) or a tris-hydrochloride buffer, may be used. Just a liquid It may be shifted.
  • a surfactant such as CHAPS, Tween-80 (trade name) (Kao-Atlas), digitonin, and deoxycholate can be added to the buffer.
  • a protease inhibitor such as PMS F, leupeptin, E-64 (manufactured by Peptide Research Institute), or peptidyltin is added to suppress the degradation of the binding protein or the protein of the present invention by protease. You can also. From 0.01 to the binding protein solution 10 m 1, it was added to protein labeled present invention a certain amount (5000 from 500000 c pm), the coexistence of test compound 10 1Q M from 10- 4 simultaneously. A reaction tube containing a large excess of the unlabeled protein of the present invention is also prepared to determine the amount of non-specific binding (NSB). The reaction is carried out at 0 to 50 ° C, preferably 4 to 37, for 20 minutes to 24 hours, preferably 30 minutes to 3 hours.
  • NBS non-specific binding
  • the reaction solution is filtered through a glass fiber filter paper and the like, washed with an appropriate amount of the same buffer, and the radioactivity remaining on the glass fiber filter paper is measured with a liquid scintillation counter or a counter.
  • the specific binding amount (B-NSB) can be selected as a candidate substance having a competitive inhibition ability, while a test compound having a specific binding amount (B-NSB) of, for example, 150% or more can be enhanced. It can be selected as a competent candidate compound.
  • a plasmid expressing the gene of the protein of the present invention and a plasmid of the present invention are required. Interaction between a protein of the present invention and a protein binding to a protein of the present invention in a host cell into which a plasmid that allows the expression of a gene for a protein binding to the protein of the present invention (for example, an activin receptor) is introduced.
  • a plasmid that allows the expression of a gene for a protein binding to the protein of the present invention for example, an activin receptor
  • the expression of a group of genes whose expression is controlled, or a physiological response for example, secretion of FSH when the binding protein is an activin receptor
  • a plasmid that allows yeast cells to express a protein obtained by fusing the protein of the present invention with the DNA binding region of a transcription factor and a protein of the present invention are used.
  • a transformant into which a binding protein (eg, activin receptor) and a plasmid that expresses a protein in which the transcription regulatory factor activation region is fused is prepared by the same method as described above. Carrying out the screening, culturing the 2-4 days in 3 o transformants on an agar medium containing a test compound from 1 0- 4 1 O- 1 G M .
  • Examples of the agar medium include Tributofan / leucine / histidine-deficient SD medium, Tributofan Z-leucine-deficient SD medium, and the like. Then, in order to detect the expression of the repo overnight gene as the color of the colony due to the i3-galactosidase activity, it is detected using a filter method or the like. For detection, place a Petman # 5 filter or VWR Grade 4 10 filter moistened with Z buffer ZX_g a1 (C 1 ontech) on the filter on which the transformant is attached, and incubate at 30 for 30 minutes to 8 hours.
  • the coloration of the colony at the top of the filter is compared with the degree of coloration of the transformant as a control containing no test compound.
  • the test compound added to the culture medium of the colony showing a darker color than the control was added as a candidate compound having a binding promoting ability, and the test compound was added to the culture medium of the colony showing a lighter color.
  • the test compound can be selected as a candidate compound having the ability to inhibit binding.
  • the expression of the reporter gene can be quantified by measuring the amount of o-nitrophenol produced by the decomposition of the substrate as the activity of / 3-galactosidase.
  • a liquid medium a tryptophan leucine Z-histidine-deficient SD medium, a tryptophan leucine-deficient SD medium, or the like is used.
  • OD 600 is ⁇ nutrient vibration 5 hours 30 3 so as to be 1.0 from 0.5.
  • An o-nitrophenylgalactoside solution (Sigma) is added to the Z buffer solution 3-mercaptophenol mixture of the residue obtained by centrifuging a part of the culture solution and reacted.
  • the reaction is 0 to 5 Ot: a, 3 minutes to 24 hours, preferably, at 30, performs 30 minutes to 15 hours, measured 420 nm absorbance of the supernatant which colored yellow (OD 420).
  • 3-galactosidase activity is determined by the resulting absorbance (OD 4 2 . ) From the following formula, calculate as a mirror unit (M i 11 erunit).
  • the / 3-galactosidase activity value is about 10% or more, preferably about 20% or more, more preferably about 30% or more, and most preferably about 50% or more.
  • the test compound can be selected as a candidate compound capable of promoting the binding between the protein of the present invention and a binding protein to the protein of the present invention.
  • the / 3-galactosidase activity value is about 10% or more, preferably about 20% or more, more preferably about 30% or more, and most preferably about 30% or more. When it decreases by 50% or more, the test compound can be selected as a candidate compound capable of inhibiting the binding between the protein of the present invention and a protein binding to the protein of the present invention.
  • DNA encoding a binding protein (eg, activin receptor) to the protein of the present invention is required.
  • DNA encoding the binding protein to the protein of the present invention DNA containing the DNA or DNA that hybridizes with the DNA under high stringency conditions is desirable.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, and animal tissue extracts. These compounds are novel compounds. Or a known compound.
  • a kit for screening a compound or a salt thereof that inhibits or promotes the binding of the protein of the present invention to a protein binding to the protein of the present invention includes the protein of the present invention or a salt thereof, a partial peptide thereof or a salt thereof, Cells containing the binding protein to the protein of the present invention, extracted fractions of cells containing the protein binding to the protein of the present invention, or plasmids expressing the protein obtained by fusing the protein of the present invention with the DNA binding region of the transcriptional regulator. It contains a transformant into which a binding protein for the protein of the present invention and a plasmid that allows expression of a protein obtained by fusing the activation region of a transcription control factor are introduced. Examples of the screening kit of the present invention include the following. 1. Screening reagent
  • Plasmid that expresses the protein of the present invention and a protein obtained by fusing the DNA binding region of the transcription control factor and a plasmid that expresses a protein obtained by fusing the activin ⁇ receptor protein and the activation region of the transcription control factor were introduced into the plasmid.
  • Tributofan / mouth isin histidine-deficient SD medium: yeast nitrogen source (Difco) After sterilizing the aqueous solution with autoclave, L-isoleucine, L-valine, L-adenine hemisulphate, L-arginine hydrochloride, L_lysine hydrochloride Add the drop solution that has been sterilized in an autoclave consisting of salt, L-methionine, L-phenylalanine, L-threonine, L-tyrosine, and L-paracilil and stored at 4 ° C. Further, add 40% dextrose Z stock solution (Sigma) sterilized by filtration with a filter, adjust to 2%, and store at 4: or prepare at the time of use.
  • yeast nitrogen source Difco
  • YPD medium After sterilizing an aqueous solution of yeast extract in Difco peptone with an autoclave, add 40% dextrose filtered and sterilized with a filter to adjust the final concentration to 2%, and store at 4 ° C or prepare at use. You may.
  • Z buffer Na 2 HP_ ⁇ 4 '7H 2 ⁇ , NaH 2 P_ ⁇ 4' H 2 ⁇ include KC 1, Mg S0 4 * 7H 2 ⁇ , after adjusting the pH to around 7, and sterilized by autoclaving 4t: or may be prepared at the time of use.
  • Z-buffer Z / 3-mercaptoethanol A mixture of Z-buffer 100 and / 3-mercaptoethanol in a ratio of 0.27.
  • o-Nitrophenylgalactoside solution (Sigma) is dissolved in Z buffer and adjusted to a concentration of 4 mgZm1 before use. 5Reaction stop solution
  • V Amount of suspension of transformant in Z buffer used in reaction X dilution factor
  • the compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is a protein of the present invention (among others, having a PDZ domain, heart, brain, liver, skeletal muscle, kidney, testis, lung, spleen) And a compound that inhibits or promotes the binding between a protein (eg, an activin receptor) and a protein that binds to the protein of the present invention (hereinafter, a promoting compound).
  • a protein of the present invention among others, having a PDZ domain, heart, brain, liver, skeletal muscle, kidney, testis, lung, spleen
  • a compound that inhibits or promotes the binding between a protein eg, an activin receptor
  • a protein that binds to the protein of the present invention hereinafter, a promoting compound.
  • Compounds that inhibit the binding of the protein of the present invention to a protein binding to the protein of the present invention include: (1) the compound of the present invention and the compound of the present invention by binding to the protein binding to the protein of the present invention; A compound or a salt thereof (a so-called agonist) that inhibits the binding of a protein to a protein and binds to the protein of the present invention via the binding protein itself; A compound which inhibits the binding of the protein of the present invention to a binding protein to the protein of the present invention but does not itself have a cell stimulating activity via the binding protein or a salt thereof (so-called angonist); Inhibition of binding between the protein of the present invention and the binding protein to the protein of the present invention without binding to the protein binding to the protein.
  • Objects hereinafter, the inhibitory compound for short
  • the presence or absence of the binding property between the compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention and the binding protein to the protein of the present invention can be confirmed according to the above-described method for measuring the binding activity.
  • the cell stimulating activity via the binding protein can be measured according to a method known per se or a method analogous thereto.
  • Compounds obtained using the screening method or screening kit of the present invention include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, and the like, and these compounds may be novel compounds. However, a known compound may be used.
  • the agonist and the promoting compound have the same activity as the physiological activity of the protein of the present invention or the activity of enhancing the biological activity, it is safe and low toxic according to the protein activity.
  • Pharmaceutical compositions, particularly diseases associated with the binding protein or activin receptor in heart, brain, liver, skeletal muscle, kidney, testis, lung, spleen, etc. eg, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, epilepsy, Huntington's disease
  • the antagonist or inhibitory compound is a physiologic agent possessed by the protein of the present invention. Since its activity can be suppressed, the binding protein or activin receptor in a safe and low toxic pharmaceutical composition that suppresses the protein activity, especially in the heart, brain, liver, skeletal muscle, kidney, testis, lung, and spleen It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for body-related diseases (eg, neuronal abnormalities such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, epilepsy, and Huntington's chorea or brain diseases).
  • body-related diseases eg, neuronal abnormalities such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, epilepsy, and Huntington's chorea or brain diseases.
  • a compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is used as the above-mentioned pharmaceutical composition, it can be carried out in a conventional manner.
  • the compound or a salt thereof may be combined with a physiologically acceptable carrier, flavoring agent, excipient, vehicle, preservative, stabilizer, binder, and the like, in a unit dosage form generally required for accepted pharmaceutical practice. It can be manufactured by mixing.
  • the amount of the active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose in the specified range can be obtained.
  • Additives that can be incorporated into tablets, capsules, etc. include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc. Such leavening agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, and flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry are used.
  • a liquid carrier such as oils and fats can be further contained in the above type of material.
  • the sterile composition for injection can be formulated according to a conventional pharmaceutical preparation such as dissolving or suspending an active substance in a vehicle such as water for injection, or a naturally occurring vegetable oil such as sesame oil or coconut oil.
  • aqueous liquids for injection include physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.).
  • Agents such as alcohol (for example, Ethafur), polyalcohols (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants (eg, polysorbate 80 (TM), HCO-50) may be used in combination.
  • the oily liquid include sesame oil and soybean oil, which may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
  • buffers eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer
  • soothing agents eg, benzalkonium chloride, proforce hydrochloride, etc.
  • stabilizers eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • preservatives eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • antioxidants eg, antioxidants and the like.
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule. Because the preparations obtained in this way are safe and low toxic, they can be administered, for example, to warm-blooded mammals (eg, rats, puppies, higgs, bush, puppies, cats, dogs, monkeys, humans, etc.) can do.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on symptoms, but in the case of oral administration, in general, for an adult (as 60 kg), it is generally about 0.1 to 10 Omg per day, preferably about 10 to 100 mg per day. It is 1.0 to 5 Omg, more preferably about 1.0 to 2 Omg.
  • the single dose varies depending on the target of administration, target organ, symptom administration method, etc.
  • an amount equivalent to 6 OKg can be administered.
  • the protein antibody of the present invention can specifically recognize the protein or the like of the present invention, it can be used for quantification of the protein or the like of the present invention in a test wave, particularly for quantification by a sandwich immunoassay. it can.
  • one of the antibodies is an antibody that recognizes the N-terminal or C-terminal of the protein or the like of the present invention, and the other antibody is SEQ ID NO: 2. It is intended to provide a method for quantifying a protein or the like of the present invention in a test wave, which is characterized in that the antibody reacts with an amino acid sequence.
  • the protein or the like of the present invention can be measured using a monoclonal antibody that recognizes the protein or the like of the present invention (hereinafter, may be referred to as an anti-protein antibody), and can also be detected by tissue staining or the like.
  • an anti-protein antibody a monoclonal antibody that recognizes the protein or the like of the present invention
  • the antibody molecule itself may be used, or the F (ab ') 2 , Fa', or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the method for measuring the protein or the like of the present invention using the antibody of the present invention is not particularly limited, and may be an antibody, an antigen or an antibody corresponding to the amount of an antigen (eg, the amount of the protein of the present invention) in a test solution. Any method that detects the amount of the antigen complex by chemical or physical means and calculates it from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen can be used. Good. For example, nephelometry, competition method, immunometric method and sandwich method are preferably used, but in terms of sensitivity and specificity, it is particularly preferable to use the sandwich method described later.
  • Radioisotopes such as a light emitting substance, for example, [ '2 5 I], [1 3 1 I], [3 H], and [1 4 C] as the enzyme, large preferably stable and specific activity, e.g.
  • a biotin-avidin system can be used for binding the antibody or antigen to the labeling agent.
  • the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose; synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon; and glass.
  • the test solution is reacted with the insolubilized anti-protein antibody (primary reaction), and further reacted with the labeled anti-protein antibody (secondary reaction). Then, the activity of the labeling agent on the insolubilized carrier is determined. By measuring, the amount of the protein of the present invention in the test wave can be quantified.
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at staggered times. Is also good.
  • the labeling agent and the method of insolubilization can be in accordance with those described above.
  • the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody does not necessarily need to be one kind, and a mixture of two or more kinds of antibodies is used for the purpose of improving measurement sensitivity and the like. May be used.
  • an anti-protein antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is preferably an antibody having a different binding site to the protein or the like of the present invention. That is, the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is, for example, an antibody used in the secondary reaction, such as the protein of the present invention.
  • the antibody used in the primary reaction is preferably an antibody recognizing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the antibody against the protein or the like of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method, or a nephrometry.
  • the antigen in the test solution and the labeled antigen are allowed to react competitively with the antibody, and then the labeled antigen from the final reaction is separated from (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody.
  • B / F separation Measure the amount of any of B, F and determine the amount of antigen in the test solution Weigh.
  • a soluble antibody is used as an antibody
  • BZF separation is performed using polyethylene render
  • a liquid phase method using a second antibody against the antibody a solid phase antibody is used as the first antibody
  • An immobilization method using an immobilized antibody as the second antibody and a soluble antibody is used for the first antibody.
  • an antigen in a test wave and a solid-phased antigen are subjected to a competitive reaction with a fixed amount of a labeled antibody, and then a solid phase and a liquid phase are separated. And an excess amount of the labeled antibody, and then immobilized antigen is added to bind unreacted labeled antibody to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the amount of label in either phase is measured to quantify the amount of antigen in the test solution.
  • nephelometry the amount of insoluble sediment generated as a result of an antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured. Even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of sediment is obtained, laser-nephrometry utilizing laser-scattering is preferably used.
  • the measurement system for the protein of the present invention may be constructed by adding ordinary technical considerations of those skilled in the art to the ordinary conditions operating method in each method.
  • the measurement system for the protein of the present invention may be constructed by adding ordinary technical considerations of those skilled in the art to the ordinary conditions operating method in each method.
  • reviews and compendiums for example, Hiroe Irie, edited by “Radio Noatssey” (Kodansha, published in 1974), edited by Hiroshi Irie “Continuing Radio Imnoatssey” (Kodansha, published in 1979), edited by Eiji Ishikawa et al.
  • the protein or the like of the present invention can be quantified with high sensitivity by using an antibody against the protein or the like of the present invention.
  • a disease associated with the protein or the like of the present invention can be diagnosed.
  • the antibody of the present invention can be used for detecting the protein of the present invention or the like present in a subject such as a body fluid or a tissue.
  • preparation of an antibody column used for purifying the protein of the present invention, detection of the protein of the present invention in each fraction at the time of purification, analysis of the behavior of the protein of the present invention, etc. in test cells, etc. Can be used for
  • the DNA of the present invention can be used, for example, in humans or warm-blooded animals (for example, rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, higgies, bush, horses, horses, cats, dogs, etc.) , Monkeys, chimpanzees, etc.) can be used to detect a gene abnormality encoding the protein of the present invention or its partial peptide in, for example, a gene diagnostic agent for mutation of the DNA or abnormal accumulation or decrease of mRNA. Useful.
  • warm-blooded animals for example, rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, higgies, bush, horses, horses, cats, dogs, etc.
  • the above-described genetic diagnosis using the DNA of the present invention includes, for example, known Northern hybridization and PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989)). Prossings of the national academy of the sciences of the rocedings of Na ti on al Ac ademvof Sciences of Unites States of America, Vol. 86, pp. 276 66-277 (1989)).
  • an antisense DNA capable of binding to a DNA or mRNA encoding the protein or the like of the present invention complementarily and suppressing the transcription or translation of the mRNA is capable of abnormally expressing a gene encoding the protein or the like of the present invention. Can be suppressed. Therefore, the antisense DNA can be used, for example, as an agent for preventing or treating a disease caused by abnormal expression of a gene encoding the protein or the like of the present invention.
  • the antisense DNA is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it can be produced in the same manner as the above-mentioned drug containing the DNA of the present invention.
  • the antisense DNA can be administered alone or into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector or the like, and then administered to humans or warm-blooded animals according to conventional means.
  • the antisense DNA can be administered as it is or in the form of a formulation together with a physiologically acceptable carrier such as an auxiliary agent for promoting eating, and can be administered with a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
  • the antisense DNA can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence of the DNA of the present invention in tissues or cells and its expression status.
  • the present invention has a DNA encoding the exogenous protein of the present invention (hereinafter abbreviated as the exogenous DNA of the present invention) or a mutant DNA thereof (sometimes abbreviated as the exogenous mutant DNA of the present invention).
  • the exogenous DNA of the present invention or a mutant DNA thereof (sometimes abbreviated as the exogenous mutant DNA of the present invention).
  • a non-hide mammal is provided.
  • Non-human mammals having the exogenous DNA of the present invention or the mutant DNA thereof include unfertilized eggs, fertilized eggs, germ cells including spermatozoa and their progenitor cells, and the like.
  • the calcium phosphate method, the electric pulse method It can be produced by transferring the target DNA by a method such as a coagulation method, a coagulation method, a microinjection method, a particle gun method, a DEAE-dextran method, or a retrovirus method.
  • the exogenous DNA of the present invention can be transferred to somatic cells, organs of living organisms, tissue cells, and the like, and used for cell culture, tissue culture, and the like.
  • the DNA transgenic animal of the present invention can also be produced by fusing the above-mentioned germ cells with a cell fusion method known per se.
  • non-human mammal for example, rats, mice, guinea pigs, hams, puppies, higgins, pigs, puppies, cats, dogs and the like are used.
  • rodents with relatively short ontogeny and biological cycle in terms of the creation of disease animal model systems, and easy reproduction especially mouse (for example, pure strains such as C57BLZ6 strain, DBA2 strain, etc.)
  • a hybrid line a B6C3F line, a BD line, a B6D2Fi line, a BALBZc line, an ICR line, etc.
  • a rat for example, Wister, SD, etc.
  • mammal in the recombinant vector that can be expressed in mammals, human and the like can be mentioned in addition to the above-mentioned non-human mammals.
  • the exogenous DNA of the present invention refers not to the DNA of the present invention originally possessed by a non-human mammal but to a DNA encoding the protein of the present invention once isolated and extracted from a mammal.
  • the mutant DNA of the present invention includes a mutation in the base sequence of the original DNA of the present invention (for example, For example, DNAs in which mutations or the like have occurred, specifically, DNAs in which bases have been added, deleted, or substituted with other bases, etc. are used, and abnormal DNAs are also included.
  • the abnormal DNA means a DNA containing a gene that expresses an abnormal protein of the present invention, such as DNA containing a gene that expresses a protein that suppresses the function of the normal protein of the present invention. Used.
  • the exogenous DNA of the present invention may be derived from a mammal that is the same or different from the animal of interest.
  • the DNA encoding the protein of the present invention is transferred to a target animal, it is generally advantageous to use the DNA as a DNA construct bound downstream of a promoter capable of being expressed in animal cells.
  • DNA derived from various mammals eg, egret, dog, cat, guinea pig, hamster, rat, mouse, etc.
  • the DNA construct of the present invention (eg, vector) is microinjected into a fertilized egg of a target mammal, such as a mouse fertilized egg, downstream of the promoter. In this case, it is possible to create a DNA transgenic mammal that highly expresses DNA.
  • Examples of a vector that retains the construct include a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis, a plasmid derived from yeast, a bacteriophage such as ⁇ phage, a retrovirus such as Moroni monoleukemia virus, a vaccinia virus or a baculovirus. Animal viruses and the like are used. Among them, a plasmid derived from Escherichia coli or a plasmid derived from yeast is preferably used.
  • promoters derived from viruses for example, simian virus, cytomegalovirus, Moroni leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus, etc.
  • mammals of each species Human, egret, dog, cat, guinea pig, hamster, rat, mouse, etc.
  • albumin insulin II, peroplacin II, elastase, erythropoietin, endothelin, muscle creatine kinase, Glial fibrillary acidic protein, dalyuthione S-transferase, platelet-derived growth factor / 3, keratin Kl, K10 and ⁇ 14, collagen type I and type II, cyclic AMP-dependent protein kinase / 3I subunit, Dystrophin, Tartrate-Resistant Alkaline Phosphatase, Atrial Natriuretic Factor, Endothelial Receptor Thio
  • the vector preferably has a sequence that terminates the transcription of the mRNA of interest in a DNA transgenic mammal (generally referred to as “one-one-one-one-one”). Sequences of respective DNAs derived from various mammals can be used, and preferably, Simian virus SV40 / Mine / Minute is used.
  • the splicing signal of each DNA, the enhancer region, a part of the intron of eukaryotic DNA, etc. are used to promote the expression of the target DNA even higher 5 'upstream of the promoter region, between the promoter region and the translation region, or the translation region. It is also possible depending on the purpose to connect 3 ′ downstream of the above.
  • the normal translation region of the protein of the present invention includes liver, kidney, and the like derived from various mammals (eg, egret, dog, cat, guinea pig, hamster, rat, mouse, human, etc.). All or part of the genomic DNA from the genomic DNA derived from the glands, thyroid cells, and fibroblasts and various commercially available genomic DNA libraries, or methods known from liver, kidney, thyroid cells, and fibroblast-derived RNA Can be obtained by a method known per se using the complementary DNA prepared by the above as a raw material.
  • the exogenous abnormal DNA can be obtained from the above-described cells or tissues that have developed a disease caused by mutation of the protein of the present invention.
  • a translation region obtained by mutating a translation region of a normal protein obtained from the above cells or tissues by a point mutagenesis method can be produced.
  • the translation region can be prepared as a DNA construct that can be expressed in a transposed animal by a conventional DNA engineering technique in which the translation region is ligated downstream of the above promoter and, if desired, upstream of the transcription termination site.
  • Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • the presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after DNA transfer indicates that all the progeny of the produced animal retain the exogenous DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells. Means to do. Progeny of such animals that inherit the exogenous DNA of the present invention will have the DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells.
  • the non-human mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred can be subcultured in a normal breeding environment as the DNA-bearing animal after confirming that the DNA is stably maintained by mating. .
  • Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in excess in all germinal and somatic cells of the target mammal.
  • Excessive presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the animal after transfer of the DNA indicates that the offspring of the animal produce the exogenous DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells. It means having in excess.
  • the offspring of such animals that have inherited the exogenous DNA of the present invention have an excess of the exogenous DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells.
  • a homozygous animal having the introduced DNA on both homologous chromosomes is obtained, and by crossing these male and female animals, all the offspring Breeding passages can be made to have excess NA.
  • the normal DNA of the present invention is highly expressed, and the function of the protein of the present invention is finally enhanced by promoting the function of endogenous normal DNA.
  • the disease may develop, and it can be used as a disease model animal.
  • the pathological mechanism of hyperactivity of the protein of the present invention and diseases associated with the protein of the present invention will be elucidated, and methods for treating these diseases will be examined. It is possible.
  • the mammal into which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of the protein of the present invention, it can be used for a screening test for a therapeutic drug for a disease associated with the protein of the present invention.
  • non-human mammals having the exogenous abnormal DNA of the present invention should be subcultured in a normal breeding environment as an animal containing the DNA after confirming that the exogenous DNA is stably maintained by mating.
  • the desired exogenous DNA can be incorporated into the above-mentioned plasmid and used as a raw material.
  • a DNA construct with a promoter can be prepared by a general genetic engineering technique. Transfer of the abnormal DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • the presence of the abnormal DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after the transfer of the DNA means that all the progeny of the produced animal have the abnormal DNA of the present invention in all of its germinal cells and somatic cells. .
  • the progeny of this type of animal that has inherited the DNA has the abnormal DNA of the present invention in all of its germinal and somatic cells.
  • the abnormal DNA of the present invention is highly expressed, and the function of the protein of the present invention is ultimately suppressed by inhibiting the function of endogenous normal DNA.
  • Inactive refractory disease may occur and can be used as a model animal for the disease.
  • using the abnormal DNA transgenic animal of the present invention It is possible to elucidate the pathological mechanism of the function-inactive refractory of the protein of the present invention and to examine a method for treating this disease.
  • the abnormal DNA highly expressing animal of the present invention elucidates the function inhibition (dominantnegative action) of the normal protein by the abnormal protein of the present invention in the function-inactive refractory disease of the protein of the present invention.
  • Model since the mammal to which the foreign abnormal I3 NA of the present invention has been transferred has an increased symptom of the protein of the present invention, it can also be used for a therapeutic drug screening test for a functionally inactive refractory disease of the protein of the present invention. is there.
  • the DNA-transferred animal of the present invention it is possible to examine clinical symptoms of diseases related to the protein of the present invention, including inactive refractory type of the protein of the present invention. More detailed pathological findings in each organ of the relevant disease model can be obtained, which can contribute to the development of new treatment methods and the study and treatment of secondary diseases caused by the disease.
  • bases, amino acids, and the like are indicated by abbreviations, which are based on the abbreviations by IUPAC-IUB Commionion Biochemistry, or commonly used abbreviations in the art. Is described below. When amino acids can have optical isomers, the L-form is indicated unless otherwise specified.
  • sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences.
  • 1 shows the nucleotide sequence of a DNA fragment encoding the intracellular domain of the activin II A receptor protein as a bait plasmid used in the two-hybrid method.
  • the base sequence of DNA as a probe used for Northern hybridization is shown.
  • the transformant Escherichia coli HB10lZpACT2 YA1 obtained in Example 1 described below was used on November 1, 2001 by the National Institute of Biotechnology and Industrial Technology (NI BH ) Has been deposited with the Fermentation Research Institute (IFO) under the deposit number IF ⁇ 16325 from October 14, 2001 under the deposit number FERM BP-6927.
  • NI BH National Institute of Biotechnology and Industrial Technology
  • MATCHMAKER TM Two-Hybrid System 2 (C at. No. K 1604-1: C 1 ontech) was used as a kit. Was used.
  • the EcoRI site and the BamHI site of the DNA binding vector pAS2_1 were cleaved with an appropriate restriction enzyme, treated with alkaline phosphatase, and purified. Thereafter, a DNA fragment encoding the intracellular domain of the activin IIA receptor protein represented by SEQ ID NO: 1 is ligated, and the desired GAL4 DNA binding domain and the intracellular activin IIA receptor are ligated.
  • a plasmid (PAS-IIA) expressing the entire domain as a fusion protein was obtained.
  • GA As the L4 transcription activation region fusion library plasmid, a commercially available mouse brain MATCHMAKER cDNA library (Clontech) was used.
  • the cell suspension (1 ml) prepared above was added to the previously prepared 10 ag plasmid (pAS-IIA) and 2 mg of dicine testis carrier DNA (C 1 ontech) and mixed well. Further, a mixed solution of 6 ml of PEG (40% PEG4000) / TE buffer / 0.1 M lithium acetate solution was added, and mixed with a Portex mixer. After shaking at 30 and 200 rpm for 30 minutes, 7001 DMSO (final concentration 10%) was added and the mixture was gently stirred. Thereafter, the mixture was heated for 15 minutes at 42 while shaking occasionally, and the vessel was cooled on ice and centrifuged at 1000 ⁇ g for 5 minutes.
  • the supernatant was discarded and the cells were suspended in 0.5 ml of TE buffer.
  • the resulting cell suspension 1001 was spread on a tryptophan-deficient SD medium and cultured at 30 for 4 days to obtain a strain stably retaining the plasmid.
  • a GAL4 transcription activation region fusion library plasmid was also introduced into the yeast strain in the same manner.
  • the obtained transformant (0.2 ml) was spread on an SD medium lacking tributophan leucine Z-histidine and cultured at 30 for 8 days, and then His + colonies were streaked on an agar plate lacking tributane leucine histidine.
  • Z buffer 5 m 1 in a petri dish Na 2 HP_ ⁇ 4 '7H 2 0, N aH 2 P0 4 - H 2 ⁇ , KC 1, Mg S 0 4 ⁇ 7 H 2 0, pH 7)
  • ZX- gal solution 5—Pro Mo_4_black mouth 3 indolyl / 3_D-galactoside in 2% DMF solution
  • a mixture of Zi3-mercaptoethanol was added to moisten the sterile Whatman # 5 filter. After placing another filter on the agar plate with the transformant colonies, the filter was picked up and frozen with liquid nitrogen with the colonies facing up. The filter was taken out of liquid nitrogen, thawed at room temperature, and then placed on the wet filter with the colony side up.
  • the petri dish was closed and incubated at 30 ° C for 1 hour to isolate about 100 positive colonies that turned blue.
  • Each of the obtained positive clones was inoculated in a 3 ml 1 leucine-deficient SD liquid medium and cultured for 2 days.Then, the culture was diluted 10000-fold, spread on a leucine-deficient SD plate, and incubated at 30 ° C for 3 days. Insulated. Twenty to thirty colonies were picked with a sterile toothpick and replicated on Tributofan-leucine-deficient SD plates and leucine-deficient SD plates. Here, a colony exhibiting tryptophan auxotrophy was selected from the above positive colonies, and 3) -galactosidase activity was assayed. Two colonies exhibiting no activity were selected.
  • the obtained true positive colonies were inoculated in 2 ml of YPD liquid medium and cultured overnight at 30 ° C. After centrifuging the culture at room temperature for 5 seconds, discarding the supernatant, 0.2 ml of yeast lysate (2% Triton X—100, 1% SDS, 10 OmM Na C 1, 1 OmM Tris- HC 1 (pH 8.0), 1 mM EDTA) was added to suspend. 0.2 ml of phenol black-mouthed form Z isoamyl alcohol (25: 24: 1) and glass beads washed with acid were added, and the mixture was stirred for 2 minutes with a portex mixer.
  • yeast lysate 2% Triton X—100, 1% SDS, 10 OmM Na C 1, 1 OmM Tris- HC 1 (pH 8.0), 1 mM EDTA
  • the full-length cDNA of the protein of the present invention is 888 bp and encodes a polypeptide consisting of 153 amino acids represented by SEQ ID NO: 2 [FIGS. 1 and 2].
  • Escherichia coli HB101 was transformed with the plasmid pACT2YA1 containing the full-length cDNA encoding the polypeptide consisting of the amino acid represented by SEQ ID NO: 2, and a transformant: Escherichia coli HB101 / PACT2YA1 was obtained.
  • the DNA represented by SEQ ID NO: 4 was labeled with digoxigenin using a DIG-PCR probe synthesis kit (Boehringenger) and used as a probe.
  • the plate was washed three times with 0.1 XS SC and 0.1% SDS at 65 and 20 minutes. Furthermore, after keeping in a solution containing alkaline phosphatase-labeled anti-digoxigenin antibody (Boehringer) (0.1 M Tris-HCl pH 7.5, 0.15 M NaC1, 150 mUZm1 antibody) , 0.1 MT ris -HCl (pH 7.5), 0.15 M NaCl, and 0.1% Tween 20 for 3 times for 15 minutes.
  • alkaline phosphatase-labeled anti-digoxigenin antibody Boehringer
  • Lum i _Pho As a result of chemiluminescence using s530 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) as a substrate, exposure to X-ray film and detection, the protein of the present invention showed that the protein of the present invention was found in the heart, brain, liver, skeletal muscle, kidney, testis, etc. It was confirmed that the expression was large. Industrial applicability
  • the antibody against the protein of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as the antibody of the present invention) and the antisense DNA include (1) determination of a binding protein to the protein of the present invention, (2) acquisition of antibody and serum, and (3) Construction of recombinant protein expression system, (1) Development of Atsushi system using expression system and Atsey system using two-hybrid method and screening of pharmaceutical compounds, (2) Structurally similar ligand / receptor Perform drug design based on comparison with (1), (2) Use as a probe in genetic diagnosis, PCR primers, etc. It can also be used as a drug for gene therapy. In particular, elucidation of the structure and properties of the protein of the present invention will lead to the development of unique

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Description

明 細 書 新規蛋白質およびその用途 技術分野
本発明は、特定のアミノ酸配列を有する新規蛋白質、該蛋白質をコードする D N A領域を含有する D N A、該蛋白質の製造方法および該蛋白質ならびに D N Aの用途に関する。 背景技術
従来、 多数の生理活性物質が単離 同定され、 その機能が解明されつつある。 そのなかには、種々の臓器あるいは細胞で多様な活性を示すものもあることが 知られている。 種々の臓器あるいは細胞における多様な生理活性は、 通常、 該 生理活性物質が結合する受容体を介して具現化しているが、その受容体に結合 する生理活性物質の組み合わせがすべての臓器 ·細胞において同一なのか、 あ るいは各臓器 ·細胞に特異的なのかは、 解明されていない例が多い。
生理活性蛋白質の中には P D Zドメインを持つものがあり、その P D Zドメ ィンは比較的最近見いだされた蛋白質結合ドメインモジュールである。そのた め、 P D Zドメインを持つ蛋白質の生体内での分布、 機能、 制御機構などはま だ多くが不明であるが、その蛋白質結合の機能を介して、細胞膜の裏打ち構造 や細胞骨格のネットワーク形成、さらに細胞内表層に発達した細胞内シグナル 伝達のネットワーク形成などに重要な役割を担っていると考えられる。神経系 においては、神経伝達物質受容体やイオンチャンネルなどの複合体形成に係わ るなど、 シナプス部位の蛋白質クラスターのアセンブリーに欠かせない。 また、 最近、 シナプス可塑性に伴い発現が調節される P D Z蛋白質が見出され、 P D Z蛋白質が受容体の再配置などを通じて可塑性に伴うシナプスの形態変化に 係わっている可能性があり、発生段階の神経ネットワークの構築や生体の脳の 高次機能にも関与していると考えられる。 P D Zドメインは既知のペプチド結 合ドメインとの共通点もあるが、 明らかな特徴的な点も有している。 P D Zド メインは細菌から高等植物、 動物にまで広く保存されたドメインであり、 多く の場合、 P D Zドメインが認識するのは標的蛋白質の最も C末端の短いアミノ 酸配列で、これらの標的蛋白質は膜貫通型受容体やチャンネルであることが多 い。 P D Zドメインは同一蛋白質中に 2から 6回程度繰り返された形で見いだ されることが多く、 また、 ほかのドメインモジュールとは異なり、 そのいくつ かはホモダイマーを形成する。 これらは、 P D Zドメインがシナプスなどの細 胞表面構造やタイトジャンクションなど、細胞間接着における蛋白質架橋ネッ- トワークやマイクロドメインの形成などに係わるための重要な特徵である。 ァクチビンは、初期胚の中胚葉誘導や神経誘導の制御、脳下垂体前葉からの 卵胞刺激ホルモン （F S H) の分泌促進に関わる調節因子であり、 T G F _ /3 スーパーファミリーの一員である。 T G F— /3フアミリーの受容体には、 セリ ン Zスレオニンキナーゼ活性を有する I型と I I型の 2種類が存在する。リガン ド刺激が I I型による I型の活性化を惹起し、活性化された I型からァクチビン 細胞内情報伝達分子である S m a d等を介して情報伝達が行われる。ァクチビ ン受容体 I I型には Π Α、 Π Βの 2種類の遺伝子から選択的にスプライシングに より生産される多様な分子が存在し、 I型の活性化以外に重要な役割を持つ可 能性が考えられているが、 未だ明らかとなっていない。 また、 従来、 脳下垂体 からの性腺刺激ホルモンの分泌調節は、生殖腺で生産されるステロイドホルモ ンが主であると考えられていたが、ァクチビンおよびこれと相反する作用をも つインヒビンの発見により視床下部一脳下垂体一生殖器官系の新しいホルモ ン分泌調節機構として関心を集めている。ァクチビンの生理活性の解析が進む につれて、 この系は、 F S H分泌調節以外に血球系や生殖器官の細胞の分化誘 導あるいは阻害活性、神経細胞生存維持活性などの多様な生理活性を有するこ とが解ったが、 その詳細な機構については未だ解明されていない点が多い。 本発明は、 P D Zドメインを持つ蛋白質および該蛋白質に対する結合能を有 する受容体 （例えば、 ァクチビン受容体） の生理活性の解明、 およびァクチビ ンーァクチビン受容体系の組織での細胞分化阻害および神経栄養因子様活性 などの生理活性発現の詳細な分子機構等を解明する手段として、新規な該蛋白 質の単離法ならびに検出法、 該新規蛋白質遺伝子を含む DNA、 該新規蛋白質 遺伝子がコードする蛋白質の製造法、および該 DNAならびに該蛋白質の用途 を提供することを目的とする。 発明の開示
本発明者らは、 上記課題を解決するために、 鋭意研究を行った結果、 配列番 号： 1で表されるマウスァクチビン I I A受容体蛋白質の細胞内領域をべィト (b a i t ) とじた酵母ツーハイブリッド （ two— hyb r i d) 法を用い、 マウス脳 c DNAライブラリーより結合蛋白質の探索を行い、 COS 7細胞内 でもァクチビン I I A受容体との結合が確認できる c DN Aクローンを単離 し、 解析したところ、 1個の PDZドメインをコードする領域を含む遺伝子で あることを見いだした。 この遺伝子にコードされる該蛋白質は、蛋白質—蛋白 質相互作用ドメインを持つ蛋白質因子であり、そのドメインを介してァクチビ ン受容体の細胞内領域と結合するが、ァクチビンのシグナル伝達を抑制しない ことを見いだした。
さらに、 本発明者らは、 マウスの各種臓器から p o 1 y (A) +RNAを抽 出し、 配列番号： 4に示す DNAをプローブとして用い、 ノーザンハイブリダ ィゼーシヨン法にて本発明の新規蛋白質の発現を調べたところ、 心臓、 脳、 肝 臓、 骨格筋、 腎臓、 精巣などの種々の臓器で広範囲にその発現が見られること を見いだした。 このことから、該新規蛋白質は種々の臓器でのァクチビン—ァ クチビン受容体情報伝達系において重要な役割（例えば、 ァクチビン受容体の 細胞膜上への運搬など） を果たすことが示唆され、 ァクチビン受容体の機能異 常に関連する疾患の診断、 治療等へ応用できることを見いだした。
本発明者らは、 これらの知見に基づいて、 さらに検討を重ねた結果、 本発明 を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、
(1)配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を有する蛋白質またはその塩、
(2) 第 （1) 項記載の蛋白質の部分ペプチドまたはその塩、
(3) 第 （1) 項記載の蛋白質をコードする DNAを含有する組換え DNA、
(4)配列番号： 3で表される塩基配列またはそれと八ィストリンジェントな 条件下でハイブリダィズする塩基配列を有する第 （3) 項記載の DNA、
(5) 第 （2) 項記載の部分ペプチドをコードする DNAを含有する組換え D NA、
(6) 第 （3) 項記載の DNAを含有する組換えベクター、
(7) 第 （6) 項記載の組換えベクターを保持する形質転換体、
(8)第（7)項記載の形質転換体を培養し、第（1)項記載の蛋白質を生成 · 蓄積せしめ、 これを採取することを特徴とする、 第 （1) 項記載の蛋白質また はその塩の製造方法、
(9) 第 （1) 項記載の蛋白質、 第 （2) 項記載の部分ペプチドまたはそれら の塩に対する抗体、
(10) 第 （9) 項記載の抗体に対して、 第 （1) 項記載の蛋白質、 第 （2) 項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩を含有する被検波および標識化され た第 （1) 項記載の蛋白質、 第 （2) 項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩 を競合的に反応させることを特徴とする、 第 （1) 項記載の蛋白質、 第 （2) 項記載の部分べプチドまたはそれらの塩の定量方法、
(1 1) 第 （1) 項記載の蛋白質、 第 （2) 項記載の部分ペプチドまたはそれ らの塩を用いることを特徴とする、 第 （1) 項記載の蛋白質、 第 （2) 項記載 の部分ペプチドまたはそれらの塩と結合する蛋白質の決定方法、
(1 2) 第 （1 1) 項記載の方法により得られる、 第 （1) 項記載の蛋白質、 第（2)項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩と結合する蛋白質またはその Άτη、
(1 3) 第 （1) 項記載の蛋白質、 第 （2) 項記載の部分ペプチドまたはそれ らの塩と、 第 （12) 項記載の蛋白質またはその塩あるいはァクチビン受容体 蛋白質またはその塩との結合を阻害または促進する化合物またはその塩のス クリーニング方法、
(14) ツーハイプリッド法を用いることを特徴とする、 第 （1 1) 項記載の 蛋白質の決定方法または第 （1 3) 項記載のスクリーニング方法、
(1 5) 第 （1) 項記載の蛋白質、 第 （2) 項記載の部分ペプチドまたはそれ らの塩を含有することを特徴とする、 第 （1) 項記載の蛋白質、 第 （2) 項記 載の部分ペプチドまたはそれらの塩と、 第 （12) 項記載の蛋白質またはその 塩あるいはァクチビン受容体蛋白質またはその塩との結合を阻害または促進 する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
(16) 第 （1 3) 項記載のスクリーニング方法または第 （15) 項記載のス クリーニング用キットを用いて得られる、 第 （1) 項記載の蛋白質、 第 （2) 項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩と、 第 （12) 項記載の蛋白質または その塩あるいはァクチビン受容体蛋白質またはその塩との結合を阻害または 促進する化合物またはその塩、
(1 7) 第 （12) 項記載の蛋白質、 第 （16) 項記載の化合物またはそれら の塩を含有してなる医薬、
(1 8) 第 （12) 項記載の蛋白質もしくはその塩、 ァクチビン受容体または ァクチビン細胞内情報伝達分子に関連した神経細胞異常または脳疾患の予 防 ·治療剤である第 （17) 項記載の医薬、
(1 9) 哺乳動物に対して第 （12) 項記載の蛋白質、 第 （16) 項記載の化 合物またはその塩を有効量投与することを特徴とする、 第 （12) 項記載の蛋 白質もしくはその塩、ァクチビン受容体またはァクチビン細胞内情報伝達分子 に関連した神経細胞異常または脳疾患の予防 ·治療方法、 および
(20) 第 （12) 項記載の蛋白質もしくはその塩、 ァクチビン受容体または ァクチビン細胞内情報伝達分子に関連した神経細胞異常または脳疾患の予 防 ·治療剤を製造するための第 （12) 項記載の蛋白質、 第 （ 16 ) 項記載の 化合物またはその塩の使用を提供する。
さらに、 本発明は、
(2 1) 蛋白質が PDZドメインを有する蛋白質である第 （1) 項記載の蛋白 質、
(22) 蛋白質が心臓、 脳、 肝臓、 骨格筋、 腎臓、 精巣、 肺、 脾臓で発現する 蛋白質である第 （2 1) 項記載の蛋白質、
(23) 蛋白質がァクチビン受容体に対する結合能を有する蛋白質である第 (22) 項記載の蛋白質、
(24)蛋白質がァクチビンのシグナル伝達を抑制しない蛋白質である第（2 3) 項記載の蛋白質、
(25) 蛋白質が、 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列、 配列番号： 2で表 されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上（好ましくは、 2個以上 10個以下） のアミノ酸配列が欠失したアミノ酸配列、配列番号： 2で表されるアミノ酸配 列中に 1または 2個以上 （好ましくは、 2偭以上 10個以下） のアミノ酸配列 が付加または挿入されたアミノ酸配列、 あるいは配列番号： 2で表されるアミ ノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 2個以上 10個以下） のァミノ 酸配列が他のアミノ酸と置換されたアミノ酸配列を含有する第（ 1 )項記載の 蛋白質およびその塩、
(26) 酵母を用いる第 （14) 項記載のツーハイブリッド法、
(27) 標識した第 （1) 項記載の蛋白質またはその塩をァクチビン受容体に 接触させた場合と、 標識した第 （1) 項記載の蛋白質またはその塩および被験 化合物をァクチビン受容体に接触させた場合における、 標識した第 （1) 項記 載の蛋白質またはその塩のァクチビン受容体に対する結合量を測定し、比較す ることを特徴とする、 第 （1) 項記載の蛋白質またはその塩とァクチビン受容 体との結合を阻害または促進する化合物またはその塩のスクリーニング方法、 (28) 標識した第 （1) 項記載の蛋白質またはその塩を第 （12) 項記載の 蛋白質またはその塩に接触させた場合と、 標識した第 （1) 項記載の蛋白質ま たはその塩および被験化合物を、 第 （1 2) 項記載の蛋白質またはその塩に接 触させた場合における、標識した第（ 1 )項記載の蛋白質またはその塩の第（ 1 2)項記載の蛋白質またはその塩に対する結合量を測定し、 比較することを特 徴とする、 第 （1) 項記載の蛋白質またはその塩と第 （1 2) 項記載の蛋白質 またはその塩との結合を阻害または促進する化合物またはその塩のスクリー ニング方法、
(29) ァクチビン受容体を発現した細胞に第 （1) 項記載の蛋白質またはそ の塩を導入した場合と、 ァクチビン受容体を発現した細胞に第 （1) 項記載の 蛋白質またはその塩および被験化合物を導入した場合における、 第 （1) 項記 '載の蛋白質またはその塩の該細胞内におけるァクチビン受容体に対する結合 量を測定し、 比較することを特徴とする、 第 （1) 項記載の蛋白質またはその 塩とァクチビン受容体との結合を阻害または促進する化合物またはその塩の スクリーニング方法、
(30) 標識した第 （1) 項記載の蛋白質またはその塩をァクチビン受容体を 発現した細胞の膜画分に接触させた場合と、 標識した第 （1) 項記載の蛋白質 またはその塩および被験化合物をァクチビン受容体を発現した細胞の膜画分 に接触させた場合における、 標識した第 （1) 項記載の蛋白質またはその塩の 該細胞の膜画分に対する結合量を測定し、 比較することを特徴とする、標識し た第（ 1 )項記載の蛋白質またはその塩とァクチビン受容体との結合を阻害ま たは促進する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(3 1) ァクチビン受容体を発現した細胞に第 （1) 項記載の蛋白質またはそ の塩を導入した場合と、 ァクチビン受容体を発現した細胞に第 （1) 項記載の 蛋白質またはその塩および被験化合物を導入した場合における、ァクチビン受 容体を介した細胞刺激活性を測定し、 比較することを特徴とする、 第 （1) 項 記載の蛋白質またはその塩とァクチビン受容体との結合を阻害または促進す る化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(32) 第 （27) 項〜第 （3 1) 項のいずれかに記載のスクリーニング方法 により得られる化合物またはその塩、
( 33 ) 第 （32) 項記載の化合物またはその塩を含有することを特徴とする 医薬組成物、 および
(34) 第 （12) 項記載の蛋白質もしくはその塩、 ァクチビン受容体または ァクチビン細胞内情報伝達分子に関連した神経細胞異常または脳疾患の予 防 ·治療剤である第 （33) 項記載の医薬に関する。
さらに、 本発明は、
(35) 外来性の第 （3) 項記載の DNAまたはその変異 DNAを有する非ヒ 卜哺乳動物、
(36) 非ヒト哺乳動物がげつ歯類動物である第 （35) 項記載の非ヒト哺乳 動物、
(37) げっ歯類動物がマウスである第 （36) 項記載の非ヒト哺乳動物、 (38) げっ歯類動物がラットである第 （36) 項記載の非ヒト哺乳動物、 お よび
(39) 外来性の第 （3) 項記載の DNAまたはその変異 DNAを含有し、 哺 乳動物において発現しうる組換えベクターを提供する。 図面の簡単な説明
図 1は、本発明の新規蛋白質をコードする c DN Aの全塩基配列とそれにコ ードされるアミノ酸配列 （配列番号： 2) を示す。
図 2は、本発明の新規蛋白質をコードする c DN Aの全塩基配列とそれにコ ードされるアミノ酸配列 （配列番号： 2) を示し、 図 1の続きである。 発明を実施するための最良の形態
本発明の配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配 列を含有する蛋白質としては、 例えば、 ヒトゃ温血動物 （例えば、 モルモット、 ラット、 マウス、 ニヮトリ、 ゥサギ、 ブタ、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） の細胞 [例えば、 肝細胞、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 塍臓 /3細胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム細胞、 ランゲルハンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 内皮細胞、 繊 維芽細胞、 繊維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例えば、 マクロファージ、 T細胞、 B細胞、 ナチュラルキラー細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸 球、 単球など） 、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 もしくは間質細胞、 またはこれらの細胞の前駆細胞、 幹細胞もしく はガン化細胞など] もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組識 [例えば、 脳、 脳の各部位 （例えば、 嗅球、 扁桃核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 大脳皮質、 延髄、 小脳など） 脊髄、 下垂体、 胃、 滕臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 （例えば、 大腸、 小腸 など） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 前立腺、 睾丸、 卵巣、 胎 盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋など] または血球系の細胞もしくはその培養細胞 株など （特に脳） に由来する蛋白質であってもよく、 合成蛋白質であってもよ い。
配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有 する蛋白質とは、 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と約 7 0 %以上、 好ま しくは約 8 0 %以上、 より好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 % 以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する蛋白質などが挙げられる。
本発明の配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配 列を含有する蛋白質とは、 例えば、 前記の配列番号： 2で表されるアミノ酸配 列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、 配列番号： 2で表されるアミノ酸配 列を含有する蛋白質と実質的に同一の生理活性を有する蛋白質などが好まし い。
実質的に同一の生理活性としては、 例えば、 受容体親和性、 シグナル情報伝 達能、 臓器発現分布などの質的要素が挙げられる。 実質的に同一とは、 それら の生理活性が生物学的または生理学的に同質であることを示す。したがって、 受容体親和性の強さなどの活性が同等 （例えば、 約 0 . 1〜2 0倍、 好ましく は約 0 . 5〜2倍） であることが好ましいが、 これらの活性の強弱、 蛋白質の 分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
例えば、 受容体親和性の測定は、 自体公知の方法に準じて行うことができる が、 例えば、 後述するスクリーニング方法に従って測定することができる。 また、 本発明の蛋白質としては、 例えば、 配列番号： 2で表されるアミノ酸 配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1から 1 0偭程度、 より好ましくは 1力 ^ら 5個程度、 さらに好ましくは 1から 3個） のァミノ酸が欠失したアミノ 酸配列、 配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好まし くは、 1から 10個程度、 より好ましくは 1から 5個程度、 さらに好ましくは 1から 3個） のアミノ酸が付加または挿入されたアミノ酸配列、 配列番号： 2 で表わされるアミノ酸配列中の 1または 2個以上（好ましくは、 1から 10個 程度、 より好ましくは 1から 5個程度、 さらに好ましくは 1から 3個） のアミ ノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはそれらを組み合わせた アミノ酸配列を含有する蛋白質などのいわゆるムティンも含まれる。
本明細書における蛋白質は、 ペプチド表記の慣例に従って左端が N末端（ァ ミノ末端） 、 右端が C末端 （力ルポキシル末端） である。 配列番号： 2で表さ れるアミノ酸配列を含有する蛋白質をはじめとする、本発明の蛋白質は、 C末 端が通常力ルポキシル基（一 COOH) またはカルボキシレート （一 COO一） であるが、 C末端がアミド （― CONH2) またはエステル （― COOR) で あってもよい。
ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n—プロピ ル、 イソプロピルもしくは n—ブチルなどの Ci eアルキル基、 例えば、 シク 口ペンチル、 シクロへキシルなどの C3_8シクロアルキル基、 例えば、 フエ二 ル、 ひ—ナフチルなどの c6 12ァリール基、 例えば、 ベンジル、 フエネチル、 a―ナフチルメチルなどの C6_127リール— C i_2アルキル基のほか、 経口 れる。
本発明の蛋白質が C末端以外に力ルポキシル基 （またはカルポキシレート） を有している場合、力ルポキシル基がアミド化またはエステル化されているも のも本発明の蛋白質に含まれる。 この場合のエステルとしては、 例えば、 上記 した C末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明の蛋白質には、 N末端のメチォニン残基のァミノ基が保護基
(例えば、 ホルミル基、 ァセチル基などの ァシル基など） で保護されて いるもの、生体内で切断されて生成する N末端のグルタミン酸残基がピロダル 夕ミン化したもの、 分子内のアミノ酸の側鎖上にある、 例えば、 〇H、 COO H、 N H 2、 S Hなどが適当な保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基など の ァシル棊など） で保護されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわ ゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。
本発明の蛋白質の具体例としては、配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を 含有する蛋白質などが用いられる。
本発明の蛋白質の部分べプチドとしては、前記した本発明の蛋白質の部分べ プチドであって、 本発明の蛋白質が有する生理活性、 例えば、 受容体親和性、 シグナル情報伝達能などの活性、臓器発現分布などを有するものであればいず れのものでもよい。例えば、本発明の蛋白質の構成アミノ酸配列のうち 2 0個 以上、 好ましくは 5 0個以上、 さらに好ましくは 8 0個以上、 より好ましくは 1 0 0個以上、 最も好ましくは 1 2 0個以上のアミノ酸配列を有し、 受容体親 和性、 シグナル情報伝達能などを有するペプチドなどが用いられる。
また、本発明の部分べプチドは、そのアミノ酸配列中の 1または 2個以上（好 ましくは 1から 1 0個程度、 さらに好ましくは 1から 3個） のアミノ酸が欠失 し、 または、 そのアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1から 1 0 個程度、 より好ましくは 1から 5個程度、 さらに好ましくは 1から 3個） のァ ミノ酸が付加し、 または、 そのアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましく は、 1から 1 0個程度、 より好ましくは 1から 5個程度、 さらに好ましくは 1 から 3個程度） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
また、 本発明の部分ペプチドは C末端が通常カルボキシル基 （一 C O O H) またはカルボキシレート （一 c〇〇—） であるが、 前記した本発明の蛋白質の ごとく、 C末端がアミド （_ C〇N H 2 ) またはエステル （_ C〇〇R ) であ つてもよい。
さらに、 本発明の部分ペプチドには、 前記した本発明の蛋白質と同様に、 N 末端のメチォニン残基のァミノ基が保護基で保護されているもの、 N端側が生 体内で切断されて生成したダルタミル基がピログルタミン化したもの、分子内 のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは 糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。 本発明の蛋白質またはその部分べプチドの塩としては、とりわけ生理学的に 許容される酸付加塩が好ましい。 この様な塩としては、 例えば無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 シユウ酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸） と の塩などが用いられる。 また、 無機塩基 （例えば、 ナトリウム、 カリウムなど のアルカリ金属、 カルシウム、 マグネシウムなどのアルカリ土類金属、 アルミ ニゥムまたはアンモニゥムなど） との塩、 有機塩基 （例えば、 トリメチルアミ ン、 トリェチルァミン、 ピリジン、 ピコリン、 2， 6—ルチジン、 エタノール ァミン、 ジエタノールァミン、 トリエタノールァミン、 シクロへキシルァミン、 ジシクロへキシルァミン、 N， N ' —ジベンジルエチレンジァミンなど） との 塩なども用いられる。
本発明の蛋白質またはその塩は、前述したヒトゃ温血動物の細胞または組織 から自体公知の方法によっても製造することもできるし、後述する該蛋白質を コ一ドする D N Aを含有する形質転換体を培養することによつても製造する ことができる。 また、 後述のペプチド合成法に準じて製造することもできる。 ヒトゃ哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトゃ哺乳動物の組織 または細胞をホモジナイズした後、 酸などで抽出を行い、 該抽出液を逆相クロ マトグラフィ一、イオン交換クロマトグラフィ一などのクロマトグラフィーを 組合せることにより単離精製することができる。
本発明の蛋白質、その部分ペプチドもしくはそれらの塩またはそれらのアミ ド体の合成には、 通常市販の蛋白質合成用樹脂を用いることができる。 そのよ うな樹脂としては、 例えば、 クロロメチル樹脂、 ヒドロキシメチル樹脂、 ベン ズヒドリルァミン樹脂、 アミノメチル樹脂、 4 _ベンジルォキシベンジルアル コール樹脂、 4一メチルベンズヒドリルァミン樹脂、 P A M樹脂、 4—ヒドロ キシメチルフエニルァセトアミドメチル樹脂、 ポリアクリルアミド樹脂、 4— ( 2 ' , 4 ' —ジメトキシフエ二ルヒドロキシメチル） フエノキシ樹脂、 4 _ ( 2， ， 4 ' —ジメトキシフエニル— F m o cアミノエチル） フエノキシ樹脂 などを挙げることができる。 このような樹脂を用い、 Q!—アミノ基と側鎖官能 基を適当に保護したアミノ酸を、 目的とする蛋白質の配列通りに、 自体公知の 各種縮合方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後に樹脂から蛋白質を切 り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィ ド結合形成反応を実施し、 目的の蛋白質、 その部分ペプチドまたはそれらのァ ミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、蛋白質合成に使用できる各種活性 化試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミド類がよい。 カルポジィ ミド類としては、 D C C、 Ν， Ν' —ジイソプロピルカルポジイミド、 Ν—ェ チル— N' - ( 3—ジメチルァミノプロピル） カルポジイミドなどが用いられ る。 これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 H〇B t、 H O O B t ) とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するか、 または、 対称酸無水物 または H O B tエステルあるいは H O O B tエステルとしてあらかじめ保護 アミノ酸の活性化を行った後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、蛋白質縮 合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、 N , N—ジメチルホルムアミド、 N , N—ジメチルァセトアミド、 N—メチル ピロリ ドンなどの酸アミド類、 塩化メチレン、 クロ口ホルムなどのハロゲン化 炭化水素類、 トリフルォロエタノールなどのアルコール類、 ジメチルスルホキ シドなどのスルホキシド類、 ピリジン、 ジォキサン、 テトラヒドロフランなど のエーテル類、 ァセトニトリル、 プロピオ二トリルなどの二トリル類、 酢酸メ チル、酢酸ェチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用い られる。反応温度は蛋白質結合形成反応に使用され得ることが知られている範 囲から適宜選択され、通常約一 2 0 °Cから 5 0 °Cの範囲から適宜選択される。 活性化されたアミノ酸誘導体は通常 1 . 5から 4倍過剰で用いられる。 ニンヒ ドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行 うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行うことができる。反 応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはァセチル イミダゾ一ルを用いて未反応アミノ酸をァセチル化することができる。
原料のァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 B o c、 t e r t—ペンチ ルォキシカルボニル、 イソポルニルォキシカルボニル、 4ーメトキシベンジル ォキシカルボニル、 C 1 一 Z、 B r— Z、 ァダマンチルォキシカルボニル、 ト リフルォロアセチル、 フタロイル、 ホルミル、 2—二トロフエニルスルフエ二 ル、 ジフエニルホスフイノチオイル、 Fmo cなどが用いられる。
カルボキシル基は、 例えば、 アルキルエステル化 （例えば、 メチル、 ェチル、 プロピル、 ブチル、 t e r t _プチル、 シクロペンチル、 シクロへキシル、 シ クロへプチル、 シクロォクチル、 2—ァダマンチルなどの直鎖状、 分枝状もし くは環状アルキルエステル化） 、 ァラルキルエステル化、 （例えば、 ベンジル エステル、 4一二トロべンジルエステル、 4—メトキシベンジルエステル、 4 —クロ口べンジルエステル、 ベンズヒドリルエステル化） 、 フエナシルエステ ル化、 ベンジルォキシカルボニルヒドラジド化、 t e r t _ブトキシカルボ二 ルヒドラジド化、 トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。 セリンの水酸基は、 例えば、 エステル化またはエーテル化によって保護する ことができる。 このエステル化に適する基としては、 例えば、 ァセチル基など の低級アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジルォキシカル ポニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられ る。 また、 エーテル化に適する基としては、 例えば、 ベンジル基、 テトラヒド ロビラニル基、 t e r t—ブチル基などである。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 例えば、 B z 1、 C 1 2 — B z l、 2—ニトロベンジル、 B r— Z、 t e r t—ブチルなどが用いられ る。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、 例えば、 To s、 4—メトキ シ— 2, 3, 6—トリメチルベンゼンスルホニル、 DNP、 ベンジルォキシメ チル、 Bum、 B o c、 T r t、 F m o cなどが用いられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応する酸無 水物、 アジド、 活性エステル [アルコール （例えば、 ペン夕クロ口フエノール、 2 , 4， 5 _トリクロ口フエノール、 2， 4—ジニトロフエノール、 シァノメ チルアルコール、 パラニトロフエノール、 H O N fe、 N—ヒドロキシスクシミ ド、 H O B t ) とのエステル] などが用いられる。 原料のァミノ基の活性化さ れたものとしては、 例えば、 対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 例えば、 P d黒あるいは P d—炭素な どの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メ タンスルホン酸、 トリフルォロメタンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるいは これらの混合液などによる酸処理や、 ジイソプロピルェチルァミン、 トリェチ ルァミン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また、 液体アンモニ ァ中ナトリゥムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、 一般に約一 2 0 °Cから 4 0 の温度で行われるが、 酸処理においては、 例えば、 ァニソール、 フエノール、 チオア二ソール、 メタクレゾール、 パラクレゾール、 ジメチルスルフイ ド、 1 , 4—ブタンジチオール、 1 , 2—エタンジチオール などのようなカチオン補足剤の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダ ゾール保護基として用いられる 2 , 4—ジニトロフエニル基はチォフエノール 処理により除去され、 トリブトフアンのィンドール保護基として用いられるホ ルミル基は上記 1 , 2 _エタンジチオール、 1 , 4一ブタンジチオールなどの 存在下の酸処理による脱保護以外に、 希水酸化ナトリウム溶液、 希アンモニア などによるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保 護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段 から適宜選択しうる。
蛋白質またはその部分ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、例えば、 まず、カルボキシル末端アミノ酸の α _力ルポキシル基をアミド化して保護し た後、 アミノ基側にペプチド （蛋白質） 鎖を所望の鎖長まで延ばした後、 該ぺ プチド鎖の Ν末端のひーァミノ基の保護基のみを除いた蛋白質 （部分べプチ ド）と C末端のカルボキシル基の保護基のみを除去した蛋白質（部分ペプチド） とを製造し、 この両蛋白質 （部分ペプチド） を上記したような混合溶媒中で縮 合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた 保護蛋白質を精製した後、 上記方法によりすベての保護基を除去し、 所望の粗 蛋白質 （部分ペプチド） を得ることができる。 この粗蛋白質 （部分ペプチド） は既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望 の蛋白質 （部分ペプチド） のアミド体を得ることができる。
蛋白質またはその部分ペプチドのエステル体を得るには、例えば、 カルボキ シル末端アミノ酸の α—力ルポキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミ ノ酸エステルとした後、 蛋白質 （部分ペプチド） のアミド体と同様にして、 所 望の蛋白質 （部分ペプチド） のエステル体を得ることができる。
本発明の部分ペプチドまたはそれらの塩は、自体公知のペプチドの合成法に 従って、あるいは本発明の蛋白質を適当なぺプチダーゼで切断することによつ て製造することができる。 ペプチドの合成法としては、 例えば、 固相合成法、 液相合成法のいずれによってもよい。すなわち、 本発明の蛋白質を構成し得る 部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有 する場合は保護基を脱離することにより目的のぺプチドを製造することがで きる。 公知の縮合方法や保護基の脱離としては、 例えば、 以下の①から⑤に記 載された方法が挙げられる。
① M. B o d a n s z k yおよび Μ. A. Ο η d e t t i , ぺプチド シンセ シス (P e p t i d e S yn t h e s i s) , I n t e r s c i e n c e P u 1 i s h e r s, New Yo r k (1966年）
② S c h r o e d e rおよび L u e b k e、ザ ぺプチド （T h e P e p t i d e) ， Ac a d em i c P r e s s, New Yo r k. (1 965年)
③泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 （株） （1 975年）
④矢島治明および榊原俊平、 生化学実験講座 1、 タンパク質の化学 IV、 205、 ( 1977年）
⑤矢島治明監修、 続医薬品の開発 第 14巻 ペプチド合成 広川書店
また、 反応後は通常の精製法、 例えば、 溶媒抽出、 蒸留、 カラムクロマトグ ラフィ一、 液体クロマトグラフィー、 再結晶などを組合せて本発明の蛋白質ま たはその部分ペプチドを単離精製することができる。上記方法で得られる該蛋 白質またはその部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当 な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によつ て遊離体に変換することができる。 本発明の蛋白質をコードする DN Aとしては、前述した本発明の蛋白質をコ 一ドする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、 ゲノム DNA、 ゲノム DNAライブラリー、 前記した細胞 ·組織由来の c DN A、 前記した細胞 ·組織由来の c DNAライブラリーより自体公知の方法によ り単離されたもの、 合成 DNAのいずれでもよい。
ライブラリーに使用するベクターは、 バクテリオファージ、 プラスミド、 コ スミド、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また、 前記した細胞 '組織 より t o t a 1 RNA画分または mRNA画分を調製したものを用いて、直接 R e v e r s e T r an s c r i p t a s e P o l yme r a s e C h a i n Re a c t i on (以下、 R T— P C R法と略称する） によって単離す ることもできる。
本発明の蛋白質をコードする DNAとしては、 例えば、 ①配列番号： 3で表 される塩基配列を含有する DNA、 または②配列番号： 3で表される塩基配列 を有する DNAとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする DN Aを有し、配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と同質の生理 活性、 例えば、 受容体親和性、 シグナル情報伝達能などの活性、 臓器発現分布 などを有する蛋白質をコードする DN Aであればいずれのものでもよい。
配列番号： 3で表される塩基配列を有する DN Aとハイストリンジェントな 条件下でハイブリダィズできる DNAとしては、 例えば、 配列番号： 3で表さ れる塩基配列と約 70 %以上、好ましくは約 80 %以上、 さらに好ましくは約 90%以上、最も好ましくは約 95 %以上の相同性を有する塩基配列を含有す る DN Aなどが用いられる。
ハイブリダィゼーシヨンは、 自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例 えば、 モレキュラー 'クローニング （Mo 1 e c u 1 a r C I on i n g) 2 n d (J. S amb r o o k e t a 1. , Co l d S p r i n g H a r b o r L a b. P r e s s, 1 989 ) に記載の方法などに従って行うこと ができる。 また、 市販のライブラリーを使用する場合、 添付の使用説明書に記 載の方法に従って行うことができる。 より好ましくは、 ハイストリンジェント な条件に従って行うことができる。
ハイストリンジェン卜な条件とは、例えば、 ナトリウム濃度が約 1 9から 4 0mM、 好ましくは約 1 9から 2 OmMで、 温度が約 50から 70°C、 好まし くは約 60から 65 °Cの条件を示す。特に、 ナトリウム濃度が約 1 9mMで、 温度が約 65°Cの場合が最も好ましい。
より具体的には、配列番号： 2のアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードす る DNAとしては、 配列番号： 3で表される塩基配列を有する DNAなどが用 いられる。
本発明の部分ペプチドをコードする DN Aとしては、前述した本発明の部分 ぺプチドをコ一ドする塩基配列を含有するものであればいかなるものであつ てもよい。 また、 ゲノム DNA、 ゲノム DNAライブラリ一、 前記した細胞 · 組織由来の c DNA、 前記した細胞 ·組織由来の c DNAライブラリーより自 体公知の方法により単離されたもの、 合成 DNAのいずれでもよい。
本発明の部分ペプチドをコードする DNAとしては、例えば、①配列番号： 3で表される塩基配列を含有する DNA、 または②配列番号： 3で表される塩 基配列を有する DNAとハイストリンジェントな条件下でハイブリダィズす る DNAを有し、配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と同質 の活性を有する蛋白質をコードする DN Aの部分塩基配列を有する DN Aな どが用いられる。
ハイブリダィゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件は前記 と同様のものが用いられる。
本発明の蛋白質またはその部分べプチド（以下、本発明の蛋白質と略記する） をコードする DN Aのクローニングの手段としては、本発明の蛋白質の部分配 列をコードする塩基配列を有する合成 DN Aプライマーを用いて P CR法に よって増幅するか、 または適当なベクターに組み込んだ DNA、 また、 ゲノム
DNA、 ゲノム DNAライブラリー、 前記した細胞 ·組織由来の c DNA 前 記した細胞'組織由来の c DN Aライブラリーより自体公知の方法により単離 されたものを本発明の蛋白質の一部あるいは全領域をコードする DNA断片 もしくは合成 DN Aを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによ つて単離することができる。 ハイブリダィゼ一シヨンの方法は、 例えば、 モレ キュラー クロ一ニング（Mo l e c u l a r C l o n i n g) 2 n d ( J.
S amb r o o k e t . a 1. , C o l d S p r i n g Ha r b o r L a b. P r e s s, 1 989 ) に記載の方法などに従って行うことができる。 ま た、市販のライブラリ一を使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従 つて行うことができる。
DNAの塩基配列の変換は、 公知のキット、 例えば、 Mu t a n t TM— s u p e r Ex p r e s s Km (宝酒造 （株） ） 、 Mu t a n t™-K (宝 酒造 （株） ） などを用いて、 ODA— LA PCR法、 Gu p p e d d u p l e x法、 Ku n k e 1法などの自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に 従って行うことができる。
クローン化された本発明の蛋白質をコードする DN Aは目的によりそのま ま、 または所望により制限酵素で消化したり、 リンカ一を付加したりして使用 することができる。該 DN Aはその 5 '末端側に翻訳開始コドンとしての AT
Gを有し、 また 3 ' 末端側には翻訳終止コドンとしての TAA、 TGAまたは
TAGを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは適当 な合成 DN Aアダプターを用いて付加することもできる。
本発明の蛋白質の発現ベクターは、 例えば、 （ィ） 本発明の蛋白質をコード する DNAから目的とする DNA断片を切り出し、 （口） 該 DNA断片を適当 な発現べクタ一中のプロモーターの下流に連結することにより製造すること ができる。
ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミド （例、 pBR 322， p BR 3 25, pUC 12, pUC 1 3) 、 枯草菌由来のプラスミド （例、 pUB 1 1 0, pTP 5, p C 194) 酵母由来プラスミド （例、 p SH 1 9, p SH 1 5) 、 λファージなどのバクテリオファージ、 レトロウイルス， ワクシニア ウィルス、 バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどの他、 ρΑ 1 _ 1 1、 XT 1、 pRc/CMV、 pR cZRSV、 p c D N A I /N e oなどが用い られる。
本発明で用いられるプロモー夕一としては、遺伝子の発現に用いる宿主に対 応して適切なプロモー夕一であればいかなるものでもよい。例えば、 動物細胞 を宿主として用いる場合は、 SV40由来のプロモーター、 レトロウイルスの プロモータ一、 メタ口チォネインプロモーター、 ヒートショックプロモーター、 サイトメガロウィルスプロモーター、 S R αプロモー夕一などが挙げられる。 これらのうち、 サイトメガロウィルスプロモ一夕一、 S R αプロモーターなど を用いるのが好ましい。宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 t r pプロモ —夕一、 l a cプロモーター、 r e cAプロモ一夕一、 A PLプロモーター、 1 p pプロモー夕などが、 宿主がバチルス属菌である.場合は、 S P 0 1プロモ 一夕一、 S P 02プロモーター、 p e n Pプロモーターなど、 宿主が酵母であ る場合は、 pHO 5プロモーター、 PGKプロモーター、 GAPプロモーター、 ADHプロモー夕一などが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合には、 ポリへ ドリンプロモーター、 P 10プロモーターなどが好ましい。
発現ベクターには、 以上の他に、 所望によりェンハンサー、 スプライシング シグナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカー、 SV40複製オリジン （以下、 S V40 o r iと略称する場合がある）などを含有しているものを用いること ができる。 選択マーカーとしては、 例えば、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （以下、 d h f rと略称する場合がある） 遺伝子 [メソトレキセ一ト （MTX) 耐性] 、 アンピシリン耐性遺伝子 （以下、 Amp「と略称する場合がある） 、 ネオマイ シン耐性遺伝子 （以下、 Ne oと略称する場合がある、 G418耐性） などが 挙げられる。 特に、 CH〇 (d h f r -) 細胞を用いて d h f r遺伝子を選択 マーカーとして使用する場合、目的遺伝子を含有する形質転換体をチミジンを 含まない培地によっても選択することができる。
また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 本発明の蛋白質の N末 端側に付加することもできる。宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 アル力 リフォスファタ一ゼ*シグナル配列、 OmpA ·シグナル配列などが、 宿主が バチルス属菌である場合は、 α—アミラーゼ ·シグナル配列、 サブチリシン · シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、 メイティングファクタ一ひ · χ シグナル配列、 インベル夕ーゼ ·シグナル配列など、 宿主が動物細胞である場 合には、 例えばインシュリン ·シグナル配列、 α _インターフェロン ·シグナ ル配列、 抗体分子 ·シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明の蛋白質をコードする DNAを含有する ベクターを用いて、 形質転換体を製造することができる。
宿主としては、 例えば、 ェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫細胞、 昆虫、 動物細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌の具体例としては、 ェシエリヒア ·コリ （E s c h e r i c h i a c o l i ) K 1 2 - DH l 〔プロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショ ナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスエー （P r o c . a t l . Ac a d. S c i . USA) , 60巻， 160 (1968) 〕 ， J M 103 〔ヌクイレックァシッズ ' リサーチ， （Nu c l e i c Ac i d s R e s e a r c h) , 9巻， 309 (1 98 1) ， J A 22 1 〔ジャーナ ル ·ォブ ·モレキユラ一 ·バイオロジー （J o u r n a l o f M o 1 e c u 1 a r B i o l o gy) 〕 ， 1 20巻， 5 1 7 (1 978) 〕 ， HB 10 1 〔ジャーナル'ォブ 'モレキュラー 'バイオロジー， 41巻， 459 ( 196 9) 〕 ， C 600 〔ジエネティックス （Ge n e t i c s) , 39巻， 440 ( 1954) 〕 などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス 'サチルス （B a c i l l u s S - u b t i l i s) M I 1 14 〔ジーン， 24巻， 255 (1 983) 〕 ， 20 7— 22 1 〔ジャーナル ·ォブ ·バイオケミストリー（ J o u r n a 1 o f B i o c h em i s t r y) , 95巻. 87 (1 984) 〕 などが用いられる。 酵母としては、 例えば、 サッカロマイセス セレピシェ （S a c c h a r o my c e s c e r e v i s i a e ) AH 22 , AH 22 R", NA 87 - 1 1 A， DKD— 5D， 20 B— 1 2、 シゾサッカロマイセス ボンべ （S c h i z o s a c c h a r omy c e s p omb e) NCYC 1 9 13, NCYC 2036、 サッカロマイセス ピキア ノ°ストリス （S a c c h a r omy c e s p i c j i a p a s t o r i s ¾ど力 S用レ られる。
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが Ac NPVの場合は、 夜盗蛾の幼虫 由来株化細胞（S p o d o p t e r a f r u g i p e r d a c e 1 1 ； S f 細胞） 、 T r i c h o p l u s i a n iの中腸由来の MG 1細胞、 T r i e h o p 1 u s i a n iの卵由来の H i g h F i v e TM細胞、 M am e s t r a b r a s s i c a e由来の細胞または E s t i g m e n a a c r e a 由来の細胞などが用いられる。 ウィルスが BmNP Vの場合は、 蚕由来株化細 胞 （B omb y x mo r i N細胞； BmN細胞） などが用いられる。 該 S f 細胞としては、 例えば、 S f 9細胞 （ATCC CRL 1 71 1) 、 S f 2 1 細胞 （以上、 Va u ghn, J . L. ら、 イン · ヴイボ （ i n v i v o) , 1 3， 2 1 3 - 2 1 7, 1977) などが用いられる。
昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、 ネィチヤ - (Na t u r e) , 31 5巻， 592 (1 985) 〕 。
動物細胞としては、 例えば、 サル細胞 COS— 7, V e r 0, チャイニーズ ハムスター細胞 CH〇， DHFR遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞 CH 〇 （d h f r— CH〇細胞） ， マウス L細胞， マウス A t T— 20, マウスミ エローマ細胞， ラット GH3, ヒト F L細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌を形質転換するには、 例えば、 プロシージングズ ·ォブ · ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスェ — (P r o c. Na t 1. Ac a d. S c i . USA) , 69巻， 2 1 1 0 (1 972) やジーン （Ge n e) , 1 7巻， 1 07 ( 1 982) などに記載の方 法に従って行うことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、 例えば、 モレキュラー ·アンド ·ジエネ ラリレ ' ジェネティックス (Mo 1 e c u 1 a r &G e n e r a 1 Ge n e t i c s) 1 68巻， 1 1 1 ( 1 979) などに記載の方法に従って行うことが できる。
酵母を形質転換するには、 例えば、 メッソズ ·イン ·ェンザィモロジ一 （M e t h o d s i n E n z ymo l o gy) , 1 94巻， 1 82— 1 8 7 ( 1 99 1) 、 プロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サ イエンシィズ'ォブ 'ザ ·ユーエスエー （P r o c. Na t 1. Ac a d. S c に USA) 7 5巻， 1 92 9 ( 1 9 78 ) などに記載の方法に従って行う ことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ Zテクノロジー（B i o /Te c h n o l o g y) , 6, 47— 5 5 ( 1 988) などに記載の方 法に従って行うことができる。
動物細胞を形質転換するには、 例えば、 細胞工学別冊 8 新 細胞工学実験 プロトコール. 26 3— 267 ( 1 995) (秀潤社発行） 、 ヴィロロジー （V ]： 0 1 08 ) ， 5 2巻， 456 (1 97 3) に記載の方法に従って行うこ とができる。
このようにして、蛋白質をコードする DN Aを含有する発現ベクターで形質 転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がェシエリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培 養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体' の生育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物その他が含有せしめられる。 炭素源と しては、 例えば、 グルコース、 デキストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖など、 窒素 源としては、 例えば、 アンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コーンスチープ · リカ一、 ペプトン、 カゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液などの無機または 有機物質、 無機物としては、 例えば、 塩化カルシウム、 リン酸二水素ナトリウ ム、 塩化マグネシウムなどが挙げられる。 また、 酵母抽出物、 ビタミン類、 生 長促進因子などを添加してもよい。 培地の pHは約 5から 8が望ましい。
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えば、 グルコース、 カザ ミノ酸を含む M9培地 〔ミラー （M i 1 1 e r) , ジャーナル ·ォブ ·ェクス ペリメンッ ·イン 'モレキュラー ·ジエネティックス （J o u r n a l o f Ex p e r i me n t s i n Mo l e c u l a r Ge n e t i c s) , 4 3 1 -433, Co l d S p r i n g Ha r b o r L a b o r a t o r y, New Yo r k 1 972〕 が好ましい。 ここに必要によりプロモータ一を効 率よく働かせるために、 例えば、 3 -インドリルアクリル酸のような薬剤を 加えることができる。
宿主がェシエリヒア属菌の場合、培養は通常約 1 5から 43°Cで約 3から 2 4時間行い、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約 30から 40 で約 6から 24時 間行い、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 バーク ホールダー （Bu r kh o l d e r) 最小培地 〔B o s t i a n, K. L. ら、 プロシ一ジングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィ ズ ·ォブ ·ザ ·ュ一エスエー （P r o c. Na t l . Ac a d. S c i . US A) , 77巻， 4505 (1 980) 〕 や 0. 5 %カザミノ酸を含有する S D 培地 〔B i t t e r， G. A. らプロシ一ジングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ' ァカテミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスエー （P r o c. N a t 1. Ac a d. S c i . USA) , 8 1巻， 5330 ( 1984) ] が挙 げられる。培地の pHは約 5から 8に調整するのが好ましい。培養は通常約 2 0°Cから 35でで約 24から 72時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。 宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、 G r a c e s I n s e c t Me d i um (G r a c e， T. C. C.，ネイチ ヤー （Na t u r e) , 195巻， 788 ( 1 962) ) に非動化した 1 0 % ゥシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地の pHは約 6. 2から 6. 4に調整するのが好ましい。培養は通常約 27 で約 3から 5日間 行い、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 約 5から 20 %の胎児牛血清を含む MEM培地 〔サイエンス （S c i e n c e) , 122卷， 50 1 (1 952) 〕 ， DMEM培地 〔ヴィロロジー （V i r o 1 o gy) , 8巻. 396 (1 959) 〕 ， RPM I 1640培地 〔ジャーナ ル ·ォブ ·ザ ·アメリカン 'メディカル ·ァソシェ一ション （ J o u r n a 1 o f t h e Ame r i c a n Me d i c a l A s s o c i a t i o n) l 99巻. 5 1 9 (1 967) 〕 ， 1 99培地 〔プロシージング ·ォブ ·ザ ·ソ サイエティ ·フォー ·ザ ·バイオロジカル ·メディスン （P r o c e e d i n g o f t h e S o c i e t y f o r t h e B i o l o g i c a l Me d i c i n e) , 73巻， 1 (1950) 〕 などが用いられる。 pHは約 6か ら 8であるのが好ましい。培養は通常約 30でから 40 で約1 5から 60時 間行い、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、本発明の蛋白'質を培養培地中あるいは形質転換体中に生 成せしめることができる。
上記培養物から本発明の蛋白質を分離精製するには、例えば、 下記の方法に より行うことができる。
本発明の蛋白質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、 リゾチームおよび Zまたは凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊し たのち、遠心分離やろ過により蛋白質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いら れる。緩衝液の中に尿素や塩酸グァニジンなどの蛋白質変性剤や、 トリトン X - 100 (商品名） などの界面活性剤が含まれていてもよい。 培養液中に蛋白 質が分泌される場合には、培養終了後、 それ自体公知の方法で菌体あるいは細 胞と上清とを分離し、 上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる蛋白質の精 製は、 自体公知の分離 ·精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。 こ れらの公知の分離、精製法としては、塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を利用す る方法、 透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法、 および SDS—ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロ マトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、ァフィ二ティーク口マトダラ フィ一などの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィー などの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用 する方法などが用いられる。
かくして得られる蛋白質が遊離体で得られた場合には、自体公知の方法ある いはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場 合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩 に変換することができる。 ，
なお、 組換え体が産生する蛋白質を、 精製前または精製後に適当な蛋白修飾 酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、 ポリペプチドを部分的 に除去することもできる。 蛋白修飾酵素としては、 例えばトリプシン、 キモト リプシン、 アルギニルエンドべプチダーゼ、 プロテインキナーゼ、 グリコシダ ーゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明の蛋白質またはその塩の活性は、標識したリガンド との結合実験および特異抗体を用いたェンザィムィムノアッセィなどにより 測定することができる。 本発明の蛋白質、その部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体は、 本発 明の蛋白質、その部分ペプチドまたはそれらの塩を認識し得る抗体であれば、 ポリクロ一ナル抗体、 モノクローナル抗体の何れであってもよい。
本発明の蛋白質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩 （以下、 本発明の蛋白 質と略記する） に対する抗体は、 本発明の蛋白質を抗原として用い、 自体公知 の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
[モノクローナル抗体の作製]
( a ) モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明の蛋白質は、温血動物に対して投与することにより抗体産生が可能な 部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体 産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュ バントを投与してもよい。 投与は通常 2から 6週毎に 1回づつ、 計 2から 1 0 回程度行われる。 用いられる温血動物としては、 例えば、 サル、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモット、 マウス、 ラット、 ヒッジ、 ャギ、 ニヮトリなどが挙げられるが、 マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物、 例えば、マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2から 5日後 に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞 と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイプリ ドーマを調製する ことができる。 抗血清中の抗体価の測定は、 例えば、 後記の標識化蛋白質と抗 血清とを反応させた後、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行 うことができる。 融合操作は既知の方法、 例えば、 ケーラーとミルスタインの 方法 [ネイチヤー （Na t u r e) , 2 56, 49 5 ( 1 9 7 5) ] に従い実 施できる。 融合促進剤としては、 例えば、 ポリエチレングリコール （PEG) やセンダイウィルスなどが挙げられるが、 好 しくは P E Gが用いられる。 骨髄腫細胞としては、 例えば、 NS— 1、 P 3U 1、 S P 2/0, AP— 1 などが挙げられるが、 P 3 U 1が好ましく用いられる。 用いられる抗体産生細 胞 （脾臓細胞） 数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 ： 1から 20 ： 1程度 であり、 PEG (好ましくは PEG 1 000から PEG 6 0 00) が 1 0から 80 %程度の濃度で添加され、 20から 40°C、 好ましくは 30から 37 で 1から 1 0分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施でき る。
抗蛋白質抗体産生ハイプリ ドーマのスクリーニングには種々の方法が使用 できるが、例えば、蛋白質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例 えば、 マイクロプレート） にハイプリ ドーマ培養上清を添加し、 次に放射性物 質や酵素などで標識した抗免疫グロプリン抗体（細胞融合に用いられる細胞が マウスの場合、 抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる） またはプロテイン Aを加え、 固相に結合した抗蛋白質モノクローナル抗体を検出する方法、 抗免 疫グロプリン抗体またはプロティン Aを吸着させた固相にハイプリ ドーマ培 養上清を添加し、 放射性物質や酵素などで標識した該蛋白質を加え、 固相に結 合した抗蛋白質モノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
抗蛋白質モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法 に従って行うことができる。 通常 H A T (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジン） を添加した動物細胞用培地で行うことができる。選別および育種用 培地としては、ハイプリドーマが生育できるものならばどのような培地を用い てもよい。 例えば、 1から 2 0 %、 好ましくは 1 0から 2 0 %の牛胎児血清を 含む R P M I 1 6 4 0培地、 1から 1 0 %の牛胎児血清を含む G I T培地（和 光純薬工業 （株） ） あるいはハイプリ ドーマ培養用無血清培地 （S F M— 1 0 1、 日水製薬 （株） ） などを用いることができる。 培養温度は、 通常 2 0から 4 O , 好ましくは約 3 7 °Cである。 培養時間は、 通常 5日から 3週間、 好ま しくは 1週間から 2週間である。培養は、 通常 5 %炭酸ガス下で行うことがで きる。ハイプリドーマ培養上清の抗体価は、 上記の抗血清中の抗蛋白質抗体価 の測定と同様にして測定できる。
( b ) モノクローナル抗体の精製
抗蛋白質モノクローナル抗体の分離精製は、 自体公知の方法、 例えば、 免疫 グロブリンの分離精製法 [例えば、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等電点沈殿法、 電気泳動法、 イオン交換体 （例えば、 D E A E ) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロティン Aあるいはプロテイン Gなどの 活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製 法] に従って行うことができる。
[ポリクローナル抗体の作製]
本発明のポリク口一ナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法に 従って製造することができる。 例えば、 免疫抗原 （蛋白質抗原） とキャリアー 蛋白質との複合体を作り、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動 物に免疫を行い、該免疫動物から本発明の蛋白質に対する抗体含有物を採取し て、 抗体の分離精製を行うことにより製造できる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキヤリァ一蛋白質との複 合体に関し、キヤリァー蛋白質の種類およびキ リァ一とハプテンとの混合比 は、キヤリァ一に架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率よくできれ ば、 どのようなものをどのような比率で架橋させてもよいが、 例えば、 ゥシ血 清アルブミンゃゥシサイログロプリン、へモシァニンなどを重量比でハプテン 1に対し、 約 0 . 1から 2 0、 好ましくは約 1から 5の割合でカップルさせる 方法が用いられる。
また、 ハプテンとキヤリア一のカツプリングには、種々の縮合剤を用いるこ とができるが、 ダルタルアルデヒドやカルポジイミド、 マレイミド活性エステ ル、 チオール基、 ジチォピリジル基を含有する活性エステル試薬などが用いら れる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるい は担体、 希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投与しても よい。 投与は、 通常約 2から 6週毎に 1回づつ、 計約 3から 1 0回程度行われ る。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、 好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定 と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、 上記のモノクロ ーナル抗体の分離精製と同様の免疫グロプリンの分離精製法に従って行うこ とができる。 本発明の蛋白質または部分べプチドをコードする D N Aまたは m R N Aに 実質的に相補的な塩基配列を有するアンチセンス D N Aとしては、本発明の蛋 白質または部分べプチドをコ一ドする D N Aまたは m R N Aの塩基配列また はその一部の塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有し、該蛋白質または部 分べプチドの発現を抑制し得る作用を有するオリゴヌクレオチドまたはその 誘導体であれば、 いずれのアンチセンス D N Aであってもよい。 該 DNAまたは mRNAに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、該 DN Aまたは mRNAに相補的な塩基配列（すなわち、 該 DNAまたは mRNAの 相補鎖） の全塩基配列または部分塩基配列と約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 より好ましくは約 90 %以上、 さらに好ましくは約 95 %以上の相 同性を有する塩基配列などが挙げられる。特に、本発明の DNAまたは mRN Aの相補鎖の全塩基配列のうち、本発明の蛋白質などの N末端部位をコードす る部分の塩基配列 （例えば、 開始コドン付近の塩基配列など） の相補鎖と約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 より好ましくは約 90 %以上、 さらに好 ましくは約 95 %以上の相同性を有するアンチセンス DNAが好適である。こ れらのアンチセンス DN Aは、公知の DN A合成装置などを用いて製造するこ とができる。 本発明の蛋白質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩 （以下、 本発明の蛋白 質と略記する場合がある） 、本発明の蛋白質またはその部分ペプチドをコード する DNA (以下、 本発明の DNAと略記する場合がある） 、 本発明の蛋白質 に対する抗体（以下、 本発明の抗体と略記する場合がある） およびアンチセン ス DNAは、①本発明の蛋白質に対する結合蛋白質の決定方法、②組換え型蛋 白質の発現系の構築、③ two— hy b r i d法を用いたアツセィ系の開発と 医薬品侯補化合物のスクリーニング、④構造的に類似したリガンド ·レセプ夕 一との比較に基づいたドラッグデザィンの実施、⑤遺伝子診断におけるプロ一 ブ、 P CRプライマーの作成等における試薬として用いることができ、 また、 ⑥遺伝子治療等の薬物として用いることができる。
特に、 two_hy b r i d法を用いた本発明の蛋白質に対する結合蛋白質 の取得、 さらに、本発明の蛋白質とァクチビン受容体または取得した他の受容 体を用いた結合アツセィ系によって、ヒトなどの温血動物に特異的な情報伝達 系の促進薬または阻害薬をスクリーニングすることができ、該促進薬または阻 害薬を各種疾病の予防 ·治療剤などとして使用することができ、以下により具 体的に説明する。 ( 1 ) 本発明の蛋白質に対する結合蛋白質の決定方法
本発明の蛋白質は、本発明の蛋白質に対する結合蛋白質を探索し、 または決 定するための試薬として有用である。
すなわち、 本発明は、本発明の蛋白質と相互作用する結合蛋白質をスクリー ニングすることを特徴とする本発明の蛋白質に対する結合蛋白質の決定方法 を提供する。
具体的には、本発明の結合蛋白質の決定方法は、宿主細胞発現ベクター上に 転写因子の D N A結合領域に本発明の蛋白質を融合させたベクターと被験蛋 白質と転写活性化領域融合ライブラリーとを該転写因子結合領域をプロモー 夕一上に保持しているレポーター遺伝子を持つ宿主細胞に導入し、 2種の蛋白 の結合により上昇するレポーター遺伝子の発現量の変化により、該蛋白質と相 互作用する蛋白質またはその塩を決定する方法である。
本発明の結合蛋白質決定方法においては、本発明の蛋白質と被験蛋白質との 相互作用を特定のレポーター遺伝子の発現に変換することにより検出する t w o _ h y b r i d法を用いることを特徴とする。
本発明の結合蛋白質決定方法の具体的な説明を以下にする。
まず、結合蛋白質決定方法に用いる本発明の蛋白質をコードする D N Aとし ては、本発明の配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のァミノ 酸配列を含有する蛋白質をコードする塩基配列またはその部分ペプチドをコ ―ドする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、 温血動物（例、 ヒトなど） のゲノム D N A、 温血動物（例、 ヒトなど） のゲノム D N Aライブラリ一、 温血動物（例、 ヒトなど） の組織 ·細胞由来の c D N A、 温血動物（例、 ヒトなど） の組織 ·細胞由来の c D N Aライブラリーより自体 公知の方法により単離された D N A、合成または半合成 D N Aのいずれでもよ い。 ライブラリーに使用するベクターはバクテリオファージ、 プラスミド、 コ スミド、 ファージミドなどのいずれであってもよい。 一方、 組織 ·細胞より m R N A画分を調製したものを用いて直接 R T— P C R法によって単離するこ ともでき、 あるいは、 部分的な塩基配列をそれぞれ化学的に合成し、 それらを 連結させることによって製造することもできる。
スクリーニングする被験蛋白質ライブラリーとしては、 市販の各種動物の 種々臓器由来の cDN Aライブラリー（C 1 o n t e c h社製 MATCHM AKER cDNAなど） などが用いられる。
DN A結合領域と被験蛋白質の融合蛋白質を発現させるベクターとしては、 PAS 2— 1、 pGBT9、 pKAD_09、 p SD 09、 pEG 202、 p BTM 1 16などが用いられる。
転写因子の活性化領域と蛋白質の融合蛋白質を発現させるベクターとして は、 pGAD424、 ACT 2, pKT l OGa l— VP、 p J G4— 5、 p VP 1 6などが用いられる。
転写因子としては、 GAL4、 L e xA、 SRFなどが用いられる。
レポ一夕一遺伝子としては、 β—ガラクトシダーゼ遺伝子 （L a c Z) 、 ヒ スチジン遺伝子 （H I S 3) 、 ルシフェラーゼ遺伝子、 クロラムフエ二コール ァセチル転移酵素遺伝子などが用いられる。
宿主細胞としては、 酵母 （S a c c h a r omy c e s c e r e v i s i a e) 、 大腸菌などが用いられ、 その中でも CG— 1 945、 Y 1 90、 Υ 1 87、 HF 7 c、 S FY526、 L40、 EGY48、 H I S/L 1 , 62 L 酵母株などが用いられる。
具体的には、該蛋白質に結合する蛋白質の決定方法は、 まず該蛋白質をコー ドする塩基配列を含む DNA断片とプラスミド （例えば、 pAS 2 _ l) 上の DN A結合領域をコードする塩基配列を含む DN A断片と同じ続き枠に結合 したプラスミド、 およびプラスミド （例えば、 PACT2) 上の転写因子 （例 えば、 GAL4) の転写活性化領域をコードする塩基配列を含む DNA断片と 結合し、 融合蛋白質の形で発現される cDNAライブラリーを、 例えば、 モレ キユラー クローニング（Mo l e c u l a r C l on i n ) 2 n d ( J. S amb r o o k e t . a 1. , C o l d S p r i n g Ha r b o r L a b. P r e s s, 1 989) に記載の方法などに従って作成することができる。 上記の 2種のプラスミドを宿主細胞（例えば、サッカロミマイセス セレビ シェ Y 190) に導入するには、 これらで同時に形質転換してもよいし、 ま たは一方のプラスミドを先に導入した後に他方を逐次導入してもよく、例えば、 メッソズ ·イン ·ェンザィモ口ジ一 （Me t h o d s i n En z ymo l o g y) ， 1 94巻， 1 82— 187 ( 1 99 1 ) 、 プロシ一ジングズ ·ォブ · ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスェ — (P r o. c. a t l . Ac a d. S c i . USA) 75巻， 1929 (1 978) などに記載の方法に従って行うことができる。
形質転換体のレポーター遺伝子の発現、 レポーター酵素の発色物質、 蛍光物 質の生成量あるいは発光量等に変換して検出できる。 より具体的には、宿主細 胞が酵母の場合、 レポーター遺伝子の発現 （例えば、 3—ガラクトシダーゼ活 性） は、 レプリカプレート法またはフィルタ一法を、 好ましくはフィル夕一法 を用いて青 Z白の呈色スクリーニングにより検出することができる。
フィル夕一法で呈色 （例えば、 青色） したコロニーは、 例えば、 ァ ·プラク チカル ·アプローチ （A P r a c t i c a l Ap p r o a c h) (B a r t e l , P. L . e t a 1. , O f o r d Un i v e r s i t y P r e s s, Ox f o r d ; 1 53 - 1 79, 1 993 a) などに記載の方法に従い処 理されることにより、ポジティブクローンの単一コロニーを分離することがで さる。
分離した単一の形質転換体より、 例えば、 ジーン （Ge n e) , 57巻， 2 67 ( 1 987 ) 、 バイオ 'テクニクス （B i o Te c hn i q u e s) , 14巻， 552 ( 1 993) などに記載の方法に従い、 プラスミド DNAを回 収し、 その DN Aの塩基配列の決定により、本発明の蛋白質に対する受容体を 決定することができる。
また、 市販のキット、 例えば、 MATCHMAKER GAL 4 Two— H yb r i d Sy s t ems (C 1 o n t e c h社製） などを使用しても本発 明の蛋白質に対する結合蛋白質を決定することができ、 その場合は、添付の使 用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
( 2 ) 本発明の蛋白質欠乏症の予防 ·治療剤 上記 （1 ) の方法において、 本発明の蛋白質に対する結合蛋白質が明らかに なれば、該結合蛋白質の発現部位および該結合蛋白質を介した本発明の蛋白質 が有する作用などを明らかにすることができる。 これらの知見を基に、本発明 の蛋白質をコードする D N Aは、 該結合蛋白質を介した疾患の予防，治療剤と して使用することができる。 また、本発明の蛋白質はァクチビン受容体への結 合活性を示すことより、 ァクチビン受容体を介した疾患の予防 ·治療剤として 使用することができる。
例えば、 本発明の蛋白質の遺伝子が心臓、 脳、 肝臓、 骨格筋、 腎臓、 精巣、 肺、 脾臓などに発現することから、 これら臓器において、 該結合蛋白質または ァクチビン受容体に関連した疾患を発症している患者がいる場合に（ィ）本発 明の蛋白質をコードする D N Aを該患者に投与し発現させることによって、あ るいは（口） これら臓器の細胞などに本発明の蛋白質をコードする D N Aを挿 入し発現させた後に、該細胞を該患者の臓器に移植することなどによって、 該 患者のこれら臓器における本発明の蛋白質の作用を充分に発揮させることが できる。 従って、 本発明の蛋白質をコードする D N Aは、 安全で低毒性な本発 明の蛋白質に対する結合蛋白質を介した疾患の予防'治療剤として使用するこ とができる。
本発明の D N Aを上記治療剤として使用する場合は、該 D N Aを単独あるい はレトロウイルスベクター、 アデノウイルスベクター、 アデノウイルスァソシ エーテツドウィルスベクターなどの適当なベクタ一に挿入した後、常套手段に 従って実施することができる。 例えば、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カブ セル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水 もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤な どの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、本発明の D N Aを生理学的 に認められる担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤など とともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和するこ とによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示され た範囲の適当な容量が得られるようにするものである。 錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えばゼラ チン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セ ルロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのよう な膨化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサ ッカリンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのような 香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、 前記タイ プの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のため の無菌組成物は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、胡麻油、 椰子油など のような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施 にしたがって処方するとができる。注射用の水性液としては生理食塩水、 ブド ゥ糖やその他の捕助薬を含む等張液（例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニ トール、 塩化ナトリウムなど） などがあげられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例えば、 エタノール） 、 ポリアルコール （例えば、 プロピレング リコール、 ポリエチレングリコール） 、 非イオン性界面活性剤 （例えば、 ポリ ソルベート 8 0 (商品名） 、 H C O— 5 0 ) などと併用してもよい。 油性液と してはゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
また、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸ナトリウム緩衝液） 、 無痛化 剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロ力インなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコールなど） 、 保存剤 （例えば、 ベン ジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤などと配合してもよい。 調製 された注射液は通常、 適当なアンプルに充填される。 このようにして得られる 製剤は安全で低毒性であるので、 例えば哺乳動物 （例えば、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 ヒトなど） に対して投与することが できる。 該 D N Aの投与量は、 症状などにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に成人 （6 0 K gとして） においては、 一日につき約 0 . 1から 1 0 0 m g、 好ましくは約 1 . 0から 5 O m g、 より好ましくは約 1 . 0から 2 0 m gである。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 例えば注射剤の形では通常成人 （6 0 Kgとして） においては、 一日につき約 0. 0 1から 3 Omg程度、 好まし くは約 0. 1から 2 Omg程度、 より好ましくは 0. 1から 1 0mg程度を静 脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、 60 Kg当たり に換算した量を投与することができる。
(3)本発明の蛋白質とその結合蛋白質との結合を阻害あるいは促進する化合 物のスクリーニング方法
本発明の蛋白質またはその塩を用いる力、、または組換え型結合蛋白質の発現 系を構築し、該発現系を用いた蛋白質競合的結合アツセィ系を用いることによ つて本発明の蛋白質と結合蛋白質との結合を阻害あるいは促進する化合物（例 えば、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、合成化合物、 発酵生産物など） またはぞの塩をスクリーニングすることができる。 さらに、本発明の蛋白質を コードする DN Aを導入した形質転換体での 2種の蛋白質の相互作用による レポ一夕一遺伝子の発現系（two _hy b r i d法） を用いることによって も、 本発明の蛋白質と結合蛋白質 （例えば、 ァクチビン受容体） との結合を阻 害あるいは促進する化合物 （例えば、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物など） またはその塩をスクリーニングすることができ る。
このような化合物には、 結合蛋白質を介して細胞刺激活性 （例えば、 増殖促 進、細胞内蛋白質のリン酸化などを促進あるいは抑制する活性など） を有する 化合物（いわゆる本発明の蛋白質に対するァゴニスト） と該細胞刺激活性を有 しない化合物（いわゆる本発明の蛋白質に対するアン夕ゴニスト）などが含ま れる。
すなわち、 本発明は、 1) ( i ) 本発明の蛋白質に対する結合蛋白質に、 本 発明の蛋白質またはその塩を接触させた場合と （ii)本発明の蛋白質に対する 結合蛋白質に、本発明の蛋白質またはその塩および被験化合物を接触させた場 合との比較を行なうこと、 または、 2) ( i ) 本発明の蛋白質および本発明の 蛋白質に対する結合蛋白質 （例えば、 ァクチビン受容体） をコードする DNA を導入した形質転換体と （i i )被験化合物を接触させた場合の該形質転換体と の比較を行なうことを特徴とする、本発明の蛋白質と本発明の蛋白質に対する 結合蛋白質との結合を阻害あるいは促進する化合物またはその塩のスクリー ニング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法においては、 1 ) ( i ) 本発明の蛋白質に対す る結合蛋白質に、 本発明の蛋白質またはその塩を接触させた場合と （i i ) 本発 明の蛋白質に対する結合蛋白質に、本発明の蛋白質またはその塩および被験化 合物を接触させた場合における、例えば、本発明の蛋白質の結合蛋白質に対す る、 該蛋白質またはその塩の結合量、細胞刺激活性などを測定して比較するこ と、 または、 2 ) ( i ) 本発明の蛋白質および本発明の蛋白質に対する結合蛋 白質 （例えば、 ァクチビン受容体） をコードする D N Aを導入した形質転換体 と （i i ) 試験化合物を接触させた該形質転換体における、 例えば、 呈色度など によるレポーター遺伝子の発現の程度を比較することを特徴とする。
より具体的には、 本発明は、
①標識した本発明の蛋白質またはその塩を、本発明の蛋白質に対する結合蛋白 質に接触させた場合と、標識した本発明の蛋白質またはその塩および被験化合 物を本発明の蛋白質に対する結合蛋白質に接触させた場合における、標識した 本発明の蛋白質またはその塩の該結合蛋白質に対する結合量を測定し、比較す ることを特徴とする、本発明の蛋白質またはその塩と該結合蛋白質との結合を 阻害あるいは促進する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
②本発明の蛋白質に対する結合蛋白質が膜結合型の蛋白質（例えば、膜貫通型 受容体、 チャンネル等） の場合、 標識した本発明の蛋白質またはその塩を、 本 発明の蛋白質に対する結合蛋白質を含有する細胞または該細胞の膜画分に接 触させた場合と、標識した本発明の蛋白質またはその塩および被験化合物を本 発明の蛋白質に対する結合蛋白質を含有する細胞または該細胞の膜画分に接 触させた場合における、標識した本発明の蛋白質またはその塩の該細胞または 該膜画分に対する結合量を測定し、 比較することを特徴とする、本発明の蛋白 質またはその塩と該結合蛋白質との結合を阻害あるいは促進する化合物また はその塩のスクリーニング方法、
③標識した本発明の蛋白質またはその塩を、本発明の蛋白質に対する結合蛋白 質 （例えば、 ァクチビン受容体） をコードする D N Aを含有する形質転換体を 培養することによって細胞内に発現した結合蛋白質に接触させた場合と、標識 した本発明の蛋白質またはその塩および被験化合物を本発明の蛋白質に対す る結合蛋白質をコードする D N Aを含有する形質転換体を培養することによ り細胞内に発現した結合蛋白質に接触させた場合における、標識した本発明の 蛋白質またはその塩の該結合蛋白質に対する結合量を測定し、比較することを 特徴とする、本発明の蛋白質またはその塩と該結合蛋白質との結合を阻害ある いは促進する化合物またはその塩のスクリーニング方法、 および
④本発明の蛋白質の遺伝子を発現せしめるプラスミドと本発明の蛋白質に対 する結合蛋白質 （例えば、 ァクチビン受容体） の遺伝子を発現せしめるプラス ミドとを導入された宿主細胞と、該宿主細胞を被験化合物に接触させた場合に おける、該宿主細胞内での本発明の蛋白質および本発明の蛋白質に対する結合 蛋白質の相互作用により発現が制御されている遺伝子群の発現、あるいは生理 学的反応（例えば、該結合蛋白質がァクチビン受容体の場合、 F S Hの分泌等） を比較することを特徴とする本発明の蛋白質またはその塩と該結合蛋白質と の結合を阻害あるいは促進する化合物またはその塩のスクリーニング方法を 提供する。
本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。
まず、 本発明のスクリーニング方法に用いる結合蛋白質 （例えば、 ァクチビ ン受容体） としては、 該結合蛋白質またはそれらの塩を含有するものであれば 何れのものであってもよいが、温血動物の臓器の抽出物が好適である。 しかし、 特にヒト由来の臓器は入手が極めて困難なことから、スクリーニングに用いら れるものとしては、遺伝子組換技術を用いて大量発現ざせた結合蛋白質または その塩が適している。
結合蛋白質を製造するには、 前述の方法が用いられるが、 例えば、 該蛋白質 をコードする D N Aを哺乳動物細胞や昆虫細胞で発現することにより行うこ とができる。目的部分をコードする DNA断片には相補 DNAが用いられるが、 必ずしもこれに制約されるものではなく、 例えば、遺伝子断片や合成 DNAを 用いてもよい。該結合蛋白質をコードする DN A断片を宿主動物細胞に導入し、 それらを効率よく発現させるためには、該 DN A断片を昆虫を宿主とするバキ ュロウィルスに属する核多角体病ウィルス （nu c l e a r p o l yh e d r o s i s v i r u s ; NPV) のポリへドリンプロモー夕一、 S V 40由 来のプロモーター、 レトロウイルスのプロモー夕一、 メタ口チォネインプロモ 一夕一、 ヒト ·ヒートショックプロモー夕一、 サイトメガロウィルスプロモ一 夕一、 S Rひプロモ夕一などの下流に組み込むのが好ましい。発現した結合蛋 白質の量と質の検査はそれ自体公知の方法で行うことができる。例えば、 文献 [N amb i . P. ら、 ザ ·ジャーナル ·ォブ ·バイオロジカル ·ケミストリ — (J. B i o l . Ch em. ) ， 267卷， 19555〜 19559頁， 1 992年〕 に記載の方法に従って行うことができる。
したがって、本発明のスクリーニング方法において、結合蛋白質またはその 塩を含有するものとしては、それ自体公知の方法に従って精製した結合蛋白質 またはその塩であってもよいし、 該蛋白質を含有する細胞を用いてもよく、 ま た該蛋白質が膜結合蛋白質の場合、それを含有する細胞の膜画分を用いてもよ い。
本発明のスクリーニング方法において、結合蛋白質を含有する細胞を用いる 場合、 該細胞をダルタルアルデヒド、 ホルマリンなどで固定化してもよい。 固 定化方法はそれ自体公知の方法に従って行うことができる。
結合蛋白質を含有する細胞としては、結合蛋白質を発現した宿主細胞をいう が、 該宿主細胞としては、 大腸菌、 枯草菌、 酵母、 昆虫細胞、 動物細胞などが 挙げられる。
膜画分としては、細胞を破砕した後、 それ自体公知の方法で得られる細胞膜 が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、 P o t t e r— E 1 V e h j em型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ヮーリングブレン ダ一やポリトロン （K i n e l l ma t i c a社製） のよる破砕、 超音波によ る破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させる ことによる破砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、 分画遠心分離法や密度 勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細 胞破砕液を低速 （5 0 0から 3 0 0 0 r pm) で短時間 （通常、 約 1から 1 0 分） 遠心し、 上清をさらに高速 （1 5 0 0 0から 3 0 0 0 0 r pm) で通常 3 0分から 2時間遠心し、 得られる沈澱を膜画分とする。 該膜画分中には、 発現 した結合蛋白質と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれ る。
該結合蛋白質を含有する細胞や膜画分中の結合蛋白質の量は、 1細胞当たり 1 02から 1 08分子であるのが好ましく、 1 05から 1 07分子であるのが好適 である。なお、発現量が多いほど細胞抽出物あるいは膜画分当たりの本発明の 蛋白質との結合活性 （比活性） が高ぐなり、 高感度なスクリーニング系の構築 が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。 本発明の蛋白質と本発明の蛋白質に対する結合蛋白質との結合を阻害する 化合物をスクリーニングする前記の①〜③を実施するためには、適当な結合蛋 白質画分と、 標識した本発明の蛋白質が必要である。該結合蛋白質画分として は、 天然型の結合蛋白質画分か、 またはそれと同等の活性を有する組換え型結 合蛋白質画分などが望ましい。 ここで、 同等の活性とは、 本発明の蛋白質に対 する同等の結合活性などを示す。
標識した本発明の蛋白質としては、標識した本発明の蛋白質、標識した本発 明の蛋白質アナログ化合物などが用いられる。 例えば〔3H〕 、 〔125 I〕 、 C1 4C〕 、 〔135S〕 など標識された本発明の蛋白質などを利用することができる。 具体的には、本発明の蛋白質と本発明の蛋白質に対する結合蛋白質との結合 を阻害する化合物のスクリーニングを行うには、 まず、 該結合蛋白質を含有す る細胞または細胞の膜画分を、スクリーニングに適した緩衝液に懸濁すること により結合蛋白質標品を調製する。 緩衝液には、 pH4から 1 0 (望ましくは PH 6から 8) のリン酸緩衝液、 卜リス—塩酸緩衝液などの本発明の蛋白質と 本発明の蛋白質に対する結合蛋白質との結合を阻害しない緩衝液であればい ずれでもよい。 また、 非特異的結合を低減させる目的で、 CHAP S、 Twe e n— 80 (商品名） （花王—アトラス社製） 、 ジギトニン、 デォキシコレー トなどの界面活性剤を緩衝液に加えることもできる。 さらに、 プロテア一ゼに よる結合蛋白質や本発明の蛋白質の分解を抑える目的で PMS F、ロイべプチ ン、 E— 64 (ペプチド研究所製） 、 ぺプス夕チンなどのプロテアーゼ阻害剤 を添加することもできる。 0. 01から 10m 1の該結合蛋白質溶液に、 一定 量（5000から 500000 c pm) の標識した本発明の蛋白質を添加し、 同時に 10— 4から 10— 1QMの試験化合物を共存させる。 非特異的結合量 （N S B)を知るために大過剰の未標識の本発明の蛋白質を加えた反応チューブも 用意する。反応は 0から 50°C、望ましくは 4から 37 で 20分から 24時 間、 望ましくは 30分から 3時間行う。 反応後、 ガラス繊維濾紙等で濾過し、 適量の同緩衝液で洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シン チレ一ションカウンターまたはァ—カウンターで計測する。拮抗する物質がな い場合のカウント（B 0)から非特異的結合量（NSB)を引いたカウント（B 0— NS B)を 100 %とした時、特異的結合量（B—NS B)が例えば 50 % 以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することが でき、 一方、 特異的結合量 （B— NSB) が例えば 1 50%以上になる被験化 合物を結合促進能力のある候補化合物として選択することができる。
本発明の蛋白質と本発明の蛋白質に対する結合蛋白質との結合を阻害ある いは促進する化合物スクリーニングする前記の④の方法を実施するためには、 本発明の蛋白質の遺伝子を発現せしめるプラスミドと本発明の蛋白質に対す る結合蛋白質 （例えば、 ァクチビン受容体） の遺伝子を発現せしめるプラスミ ドとを導入された宿主細胞内での、本発明の蛋白質および本発明の蛋白質に対 する結合蛋白質の相互作用により発現が制御されている遺伝子群の発現、ある いは生理学的反応 （例えば、 該結合蛋白質がァクチビン受容体の場合、 F SH の分泌等） を公知の方法を用いて測定することができる。 具体的には、 宿主細 胞が酵母の場合、 まず、 酵母細胞に本発明の蛋白質と転写制御因子の DNA結 合領域とを融合させた蛋白質を発現せしめるプラスミドと本発明の蛋白質に 対する結合蛋白質 （例えば、 ァクチビン受容体） と転写制御因子の活性化領域 とを融合させた蛋白質を発現せしめるプラスミドとを導入した形質転換体を 前述と同様の方法にて作製する。スクリーニングを行なうにあたっては、 この 形質転換体を 1 0— 4から 1 O— 1 GMの被験化合物を含む寒天培地上で 3 o で 2から 4日間培養する。寒天培地としては、 トリブトファン/ロイシン/ヒ スチジン欠損 S D培地、 トリブトファン Zロイシン欠損 S D培地などが用いら れる。その後、 レポ一夕一遺伝子の発現を i3—ガラクトシダ一ゼ活性によるコ ロニーの呈色として検出するために、 フィルタ一法などを用いて検出する。検 出は、 形質転換体が付着したフィルター上に、 Z緩衝液 ZX_g a 1 (C 1 o n t e c h社）で湿らせたヮットマン# 5フィルターまたは VWRグレード 4 10フィルターを置き、 30 で 30分から 8時間保温した後、 フィル夕一上 のコロニーの呈色を、被験化合物を含まないコントロールとしての形質転換体 との呈色の度合いを比較する。 この時、 コントロールと比して、 より濃い呈色 を示すコロニーの培養培地に加えた被験化合物を結合促進能力のある候補化 合物として、 また、 より薄い呈色を示すコロニーの培養培地に加えた被験化合 物を結合阻害能力のある候補化合物として選択することができる。 また、 レポ 一ター遺伝子の発現を /3—ガラクトシダーゼ活性として、基質の分解により生 成する o—ニトロフエノール量を測定することにより定量することもできる。 まず、形質転換体を 10_4から 10—1 QMの被験化合物を含む液体培地上で 3 0 °Cで 8から 24時間振盪培養する。液体培地としては、 トリブトファン ロ イシン Zヒスチジン欠損 SD培地、 トリプトファン ロイシン欠損 SD培地な どが用いられる。好ましくは一夜培養した後、培養液の一部を YPD培地に植 菌し、 OD600が 0. 5から 1. 0となるように 30 で 3から 5時間振盪培 養する。その培養液の一部を遠心した残渣の Z緩衝液ノ3—メルカプトェ夕ノ —ル混合物中に o_ニトロフエ二ルガラクトシド溶液（S i gma社） を加え 反応させる。反応は、 0から 5 Ot:で、 3分から 24時間、望ましくは、 30 で、 30分から 15時間行い、 黄色に着色した上清の 420 nmの吸光度 （O D 420) を測定する。 ）3—ガラクトシダーゼ活性は、 得られた吸光度 （OD4 2。） より以下の計算式を用いて、 ミラー単位 （M i 1 1 e r u n i t ) とし て算出する。
被験化合物を培地に添加することにより、 /3—ガラクトシダーゼ活性値が約 1 0 %以上、 好ましくは約 2 0 %以上、 より好ましくは約 3 0 %以上、 最も好 ましくは約 5 0 %以上増加した場合、該被験化合物を本発明の蛋白質と本発明 の蛋白質に対する結合蛋白質との結合を促進する能力のある候補化合物とし て選択することができる。 一方、 被験化合物を培地に添加することにより、 /3 —ガラクトシダ一ゼ活性値が約 1 0 %以上、好ましくは約 2 0 %以上、 より好 ましくは約 3 0 %以上、最も好ましくは約 5 0 %以上低下した場合、 該被験化 合物を本発明の蛋白質と本発明の蛋白質に対する結合蛋白質との結合を阻害 する能力のある候補化合物として選択することができる。
レポーター遺伝子の発現活性を測定してスクリーニングを行なうには、本発 明の蛋白質に対する結合蛋白質 （例えば、 ァクチビン受容体） をコードする D N Aが必要である。本発明の蛋白質に対する結合蛋白質をコードする D N Aと しては、該 D N Aを含有する D N Aまたはそれらとハイストリンジェントな条 件下でハィブリダイズする D N Aなどが望ましい。
被験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などが挙 げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であつ てもよい。
本発明の蛋白質と本発明の蛋白質に対する結合蛋白質との結合を阻害ある いは促進する化合物またはその塩のスクリーニング用キットは、本発明の蛋白 質またはその塩、 その部分ペプチドまたはその塩、本発明の蛋白質に対する結 合蛋白質を含有する細胞、本発明の蛋白質に対する結合蛋白質を含有する細胞 の抽出画分、あるいは本発明の蛋白質と転写制御因子の D N A結合領域を融合 させた蛋白質を発現せしめるプラスミドと本発明の蛋白質に対する結合蛋白 質と転写制御因子の活性化領域を融合させた蛋白質を発現せしめるプラスミ ドとを導入した形質転換体を含有するものである。 本発明のスクリーニング用キッ卜の例としては、 次のものが挙げられる。 1. スクリーニング用試薬
①形質転換体
本発明の蛋白質と転写制御因子の DN A結合領域を融合した蛋白質を発現 せしめるプラスミ ドとァクチビン ΠΑ受容体蛋白質と転写制御因子の活性化 領域を融合した蛋白質を発現せしめるプラスミドとを導入し、形質転換した酵 母 Y 1 90株
②液体培養培地
トリブトファン/口イシン ヒスチジン欠損 SD培地：酵母窒素源（D i f c o社） 水溶液をオートクレープで滅菌後、 L—イソロイシン、 Lーバリン、 L—アデニンへミ硫酸塩、 L—アルギニン塩酸塩、 L_リジン塩酸塩、 L—メ チォニン、 L—フエ二ルァラニン、 L—スレオニン、 L—チロシン、 L—ゥラ シルよりなるオートクレープで滅菌し 4 °Cで保存したドロップァゥト溶液を 加える。 さらに、 フィルターで濾過滅菌した 40 %デキストロース Zストック 溶液 （S i gma社） を加え、 2%になるように調整し、 4 :で保存するか、 あるいは用時調製してもよい。
YPD培地： D i f c o ペプトンに酵母抽出物の水溶液をオートクレーブ で滅菌後、フィルターで濾過滅菌した 40 %デキストロースを加え最終濃度を 2%に調整し、 4°Cで保存するか、 あるいは用時調製してもよい。
③緩衝液
Z緩衝液： Na2HP〇4 ' 7H2〇、 NaH2P〇4 ' H2〇、 KC 1、 Mg S04 * 7H2〇を含み、 pHを 7付近に調整後、 オートクレープで滅菌し、 4t:で保存するか、 あるいは用時調製してもよい。
Z緩衝液 Z/3—メルカプトエタノール： Z緩衝液 100に対して /3—メルカ プトエタノールを 0. 27の割合で加えたもの。
④ i3—ガラクトシダーゼの基質
o—ニトロフエ二ルガラクトシド溶液（S i gma社） を Z緩衝液に溶解し、 4mgZm 1の濃度に調整したもので用時調製する。 ⑤反応停止液
4°Cで保存した 1M 炭酸ナトリウム溶液を用いるか、 あるいは用時調製し てもよい。
2. 測定法
① 10—3から 1 0— 10Mの被験化合物溶液を 5 1加えた lm lのトリプトフ アン ロイシン欠損 SD培地で酵母形質転換体を 30 で一夜振盪培養する。
②培養液 0. 4m lを 1. 6m 1の YPD培地中に加え、 〇D6。。が 0. 5か ら 1. 0となるように 30 で 3から 5時間振盪培養する。
③ 0. 3m 1の培養液を 14000 r pmで 30秒間遠心し、 残渣を 0. 3 m 1の Z緩衝液に懸濁し、 再度遠心後、 沈殿を 0. 1 m 1の Z緩衝液に懸濁する。
④液体窒素にて一旦凍結後、 37t:で 30秒から 1分間かけて溶解する。 0. 7m 1の Z緩衝液 Z )3—メルカプトエタノール混液と 0. 16m 1の o—ニト 口フエ二ルガラクトシド溶液を加え、 30 で溶液が黄色になるまで保温し、 この後 0. 4m 1の 1M 炭酸ナトリウム溶液を加える。
⑤ 14000 r pmで 1 0分間遠心し、その上清の 420 nmにおける吸光度 を測定し、 /3—ガラクトシダ一ゼ活性をミラー単位（M i l l e r un i t) として次の式 〔数 1〕 で求める。
〔数 1〕
)3—ガラクトシダーゼ活性 = 1000 XOD 420 / ( t X VXOD 600 ) OD 420 ： 420 nmにおける吸光度
t ：反応時間 （分）
V：反応に用いた、 形質転換体の Z緩衝液の懸濁液量 X希釈倍 率
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得ら れる化合物またはその塩は、本発明の蛋白質（なかでも PDZドメインを有し、 心臓、 脳、 肝臓、 骨格筋、 腎臓、 精巣、 肺、 脾臓で発現する蛋白質） と本発明 の蛋白質に対する結合蛋白質 （例えば、 ァクチビン受容体） との結合を阻害す る化合物または促進する化合物 （以下、 促進化合物） である。 本発明の蛋白質と本発明の蛋白質に対する結合蛋白質（例えば、 ァクチビン 受容体） との結合を阻害する化合物には、①本発明の蛋白質に対する結合蛋白 に結合することによって、本発明の蛋白質と本発明の蛋白質に対する結合蛋白 との結合を阻害し、それ自体が結合蛋白質を介して細胞刺激活性を有する化合 物またはその塩 （いわゆるァゴニスト） 、 ②本発明の蛋白質に対する結合蛋白 に結合することによって、本発明の蛋白質と本発明の蛋白質に対する結合蛋白 との結合を阻害するが、それ自体は結合蛋白質を介した細胞刺激活性を有しな い化合物またはその塩 （いわゆるアン夕ゴニスト） 、 ③本発明の蛋白質に対す る結合蛋白に結合することなく、本発明の蛋白質と本発明の蛋白質に対する結 合蛋白との結合を阻害する化合物 （以下、 阻害化合物と略記） またはその塩な どが含まれる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得ら れる化合物またはその塩と本発明の蛋白質に対する結合蛋白質との結合性の 有無は、 上記した結合活性の測定法に従って確認することができる。
結合蛋白質を介した細胞刺激活性は、それ自体公知の方法あるいはそれに準 じる方法に従って測定することができる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得ら れる化合物としては、 ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であつてもよいし、 公知の化合物であってもよい。
該ァゴニストおよび促進化合物は、本発明の蛋白質が有する生理活性と同様 の作用を有する力、、あるいはその生理活性を増強する作用を有しているので、 該蛋白質活性に応じて安全で低毒性な医薬組成物、 特に心臓、 脳、 肝臓、 骨格 筋、 腎臓、 精巣、 肺、 脾臓などにおける、 該結合蛋白質またはァクチビン受容 体に関連した疾患 （例えば、 アルツハイマー病、 パーキンソン病、 てんかん症、 ハンチントン舞踏症などの神経細胞異常または脳疾患など） の予防 ·治療薬の 予防治療薬として有用である。
逆に、 該アン夕ゴニストまたは阻害化合物は、 本発明の蛋白質が有する生理 活性を抑制することができるので、該蛋白質活性を抑制する安全で低毒性な医 薬組成物、 特に心臓、 脳、 肝臓、 骨格筋、 腎臓、 精巣、 肺、 脾臓における、 該 結合蛋白質またはァクチビン受容体に関連した疾患（例えば、 アルツハイマー 病、 パーキンソン病、 てんかん症、 ハンチントン舞踏症などの神経細胞異常ま たは脳疾患など） の予防治療薬として有用である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得ら れる化合物またはその塩を上述の医薬組成物として使用する場合、常套手段に 従って実施することができる。 例えば、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カブ セル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水 もしくは、 それ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤 などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物またはその塩を 生理学的に認められる担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結 合剤などとともに一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混 和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は 指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えばゼラ チン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セ ルロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのよう な膨化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサ ッカリンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのような 香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、 前記タイ プの材科にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のため の無菌組成物は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、胡麻油、 椰子油など のような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施 にしたがって処方するとができる。
注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬 を含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナトリウ ムなど） などがあげられ、 適当な溶解補助剤、 たとえばアルコール （たとえば エタフール） 、 ポリアルコール （たとえばプロピレングリコール、 ポリエチレ ングリコール）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート 80 (TM)、 HCO— 50) などと併用してもよい。 油性液としてはゴマ油、 大豆油などが あげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと併 用してもよい。 また、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸ナトリウム緩衝 液） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロ力インなど） 、 安 定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコールなど） 、 保存剤 (例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤などと配合し てもよい。 調整された注射液は通常、 適当なアンプルに充填される。 このよう にして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば温血哺乳動物（例えば、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 ヒトなど） に対し て投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与 の場合、 一般的に成人 （60Kgとして） においては、 通常、 一日につき約 0. 1から 10 Omg、 好ましくは約 1. 0から 5 Omg、 より好ましくは約 1. 0から 2 Omgである。非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対 象、 対象臓器、 症状投与方法などによっても異なるが、 例えば、 注射剤の形で, は通常成人 （60 Kgとして） においては、 通常、 一日につき約 0. 01から 3 Omg程度、 好ましくは約 0. 1から 2 Omg程度、 より好ましくは約 0. 1から 1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合である。ヒト以外の 動物の場合も、 6 OKg当たりに換算した時に同等となるような量を投与する ことができる。
(4) 本発明の蛋白質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩の定量
本発明の蛋白質抗体は、本発明の蛋白質等を特異的に認識することができる ので、被検波中の本発明の蛋白質等の定量、特にサンドィツチ免疫測定法によ る定量などに使用することができる。
すなわち、 本発明は、
( i )本発明の蛋白質等に反応する抗体と、被検液および標識化された本発明 の蛋白質等とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された本発明の蛋 白質等の割合を測定することを特徴とする、被検波中の本発明の蛋白質等の定
( i i )被検波と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の 抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性 を測定することを特徴とする被検液中の本発明の蛋白質等の定量法において、 一方の抗体が本発明の蛋白質等の N端部あるいは C端部を認識する抗体で、他 方の抗体が配列番号： 2のァミノ酸配列に反応する抗体であることを特徴とす る、 被検波中の本発明の蛋白質等の定量法を提供する。
本発明の蛋白質等を認識するモノクローナル抗体（以下、抗蛋白質抗体と称 する場合がある） を用いて本発明の蛋白質等の測定を行なえるほか、組織染色 等による検出を行なうこともできる。 これらの目的には、抗体分子そのものを 用いてもよく、 また、 抗体分子の F ( a b ' ) 2、 F a ' あるいは F a b画 分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いる本発明の蛋白質等の測定法は、特に制限されるべきも のではなく、 被測定液中の抗原量（例えば本発明の蛋白質量） に対応した抗体、 抗原もしくは抗体一抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、 これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測 定法であれば、 いずれの測定法を用いてもよい。 例えば、 ネフロメトリー、 競 合法、 ィムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、 特異性の点で、 後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。 ， 標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、放射性同位元素、 酵 素、 蛍光物質、 発光物質などが挙げられる. 放射性同位元素としては、 例えば 〔' 2 5 I〕 、 〔1 3 1 I〕 、 〔3 H〕 、 〔1 4 C〕 などが、 上記酵素としては、 安定 で比活性の大きなものが好ましく、例えば i3 -ガラクトシダーゼ、 /3 -ダルコシ ダーゼ、 アルカリフォスファタ一ゼ、 パーォキシダーゼ、 リンゴ酸脱水素酵素 等が、 蛍光物質としては、 フルォレスカミン、 フルォレツセンイソチオシァネ ートなどが発光物質としては、 ルミノール、 ルミノール誘導体、 ルシフェリン、 ルシゲニンなどがそれぞれ挙げられる。 さらに、抗体あるいは抗原と標識剤と の結合にピオチン一アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、 また通常 蛋白質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる 方法でもよい。 担体としては、 ァガロース、 デキストラン、 セルロースなどの 不溶性多糖類、 ポリスチレン、 ポリアクリルアミド、 シリコン等の合成樹脂、 あるいはガラス等が挙げられる。
サンドイッチ法においては不溶化した抗蛋白質抗体に被検液を反応させ（1 次反応） 、 さらに標識化した抗蛋白質抗体を反応させ （2次反応） たのち、 不 溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検波中の本発明の蛋白質 量を定量することができる. 1次反応と 2次反応は逆の順序に行っても、 また、 同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶 化の方法は前記のそれらに準じることができる。 また、 サンドイッチ法による 免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ず しも 1種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で 2種類以上の 抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドィツチ法による本発明の蛋白質等の測定法においては 1次 反応と 2次反応に用いられる抗蛋白質抗体は本発明の蛋白質等の結合する部 位が相異なる抗体が好ましく用いられる。即ち、 1次反応および 2次反応に用 いられる抗体は、 例えば、 2次反応で用いられる抗体が、 本発明の蛋白質等の
C端部あるいは N端部を認識する場合、 1次反応で用いられる抗体は、好まし くは配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を認識する抗体が用いられる。
本発明の蛋白質等に対する抗体をサンドィツチ法以外の測定システム、例え ば、競合法、 ィムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることが できる。
競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させ たのち、 末反応の標識抗原と （F ) と抗体と結合した標識抗原 （B ) とを分離 し （B / F分離） 、 B、 Fいずれかの標識量を測定し、 被検液中の抗原量を定 量する。 本反応法には、 抗体として可溶性抗体を用い、 BZF分離をポリェチ レンダリコール、 前記抗体に対する第 2抗体などを用いる液相法、 および、 第 1抗体として固相化抗体を用いるか、 あるいは、 第 1抗体は可溶性のものを用 い第 2抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
ィムノメトリック法では、被検波中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化 抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、 あるいは、 被検液中 の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標 識化抗体を固相に結合させたのち、 固相と液相を分離する。 次に、 いずれかの 相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、 ネフロメトリーでは、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生 じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、 少量の 沈降物しか得られない場合にもレーザ一の散乱を利用するレーザ一ネフロメ トリーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の測定方法に適用するにあたっては、 特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の 条件操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明の蛋白質等の測定系 を構築すればよい。 これらの一般的な技術手段の詳細については、 総説、 成書 などを参照することができる〔例えば、入江寛編「ラジオィムノアツセィ」 （講 談社、 昭和 49年発行） 、 入江寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭 和 54年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （医学書院、 昭和 53年発 行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （第 2版） （医学書院、 昭和 57年発 行） 、 石川栄治ら縞 「酵素免疫測定法」 （第 3版） （医学書院、 昭和 62年発 行 「Me t h o d s i n En z ymo l o gy」 Vo l . 70 ( I mm u n o c h em i c a l Te c hn i q u e s (P a r t A) ) 、 同書 Vo l . 73 ( 1 mm u n o c h em i c a 1 Te c hn i q u e s (P a r t' B))、 同書 V o 1. 74 ( I mmu n o c h em i c a l Te c hn i q u e s (P a r t C) ) 、 同書 V o 1. 84 ( I mmu n o c h em i c a l Te c h n i q u e s (S e l e c t e d I mmu n o a s s ay s (P a r t D))、 同書 V o 1. 92 ( I mmu n o c h em i c a 1 Te c hn i q u e s (M o n o c 1 o n a 1 An t i b o d i e s a n d Ge n e r a l I mm u n o a s s ay Me t h o d s (P a r t E) )、 同書 V o 1. 12 1 ( I mm u n o c h em i c a 1 Te c hn i q u e s (Hyb r i d oma T e c h n o 1 o g y a n d Mo n o c l o n a l An t i b o d i e s (P a r t I) ) (以上、 アカデミックプレス社発行） など参照〕 。
以上のように、本発明の蛋白質等に対する抗体を用いることによって本発明 の蛋白質等を感度良く定量することができる。
さらには、本発明の蛋白質等に対する抗体を用いて本発明の蛋白質等の濃度 を定量することによって、例えば、本発明の蛋白質等が関与する疾病の診断を 行うことができる。
また、本発明の抗体は、体液や組織などの被験体中に存在する本発明の蛋白 質等を検出するために使用することができる。 また、本発明の蛋白質等を精製 するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各画分中の本発明の蛋白質等 の検出、被験細胞内における本発明の蛋白質等の挙動の分析などのために使用 することができる。
(5) 遺伝子診断剤
本発明の DN Aは、 例えば、 プローブとして使用することにより、 ヒトまた は温血動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 トリ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） における本発明の 蛋白質またはその部分ペプチドをコードする遺伝子異常を検出することがで きるので、例えば、該 DNAの突然変異あるいは mRNAの異常蓄積あるいは 異常減少などの遺伝子診断剤として有用である。
本発明の DNAを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、 自体公知のノーザン ハイブリダイゼーシヨンや PCR— S S CP法（ゲノミックス （Ge n om i c s) , 第 5巻， 874〜 879頁（1989年） 、 プロシージングズ ·ォブ · ザ'ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ .ユーエスエー（ P r o c e e d i n g s o f t h e Na t i on a l Ac a d e m v o f S c i e n c e s o f t h e Un i t e d S t a t e s o f Am e r i c a) , 第 86巻， 2 7 66〜 27 70頁 （1 9 8 9年） ） などにより実施 することができる。
(6) アンチセンス DNAを含有する DNA
本発明の蛋白質等をコードする DNAまたは mRNAに相補的に結合し、該 mRN Aの転写あるいは翻訳を抑制することができるアンチセンス DN Aは、 本発明の蛋白質等をコードする遺伝子の異常発現を抑制することができる。従 つて、 該アンチセンス DNAは、 例えば、 本発明の蛋白質等をコードする遺伝 子の異常発現に起因する疾病の予防 ·治療剤として使用することができる。 該アンチセンス DNAを上記の予防 ·治療剤として使用する場合、 前記した 本発明の DN Aを含有する医薬と同様にして製造することができる。例えば、 該アンチセンス DNAを単独あるいはレトロウイルスベクタ一、アデノウィル スベクタ一、アデノウィルスァソシエーテツドウィルスベクターなどの適当な ベクターに挿入した後、常套手段に従ってヒトまたは温血動物に投与すること ができる。 該アンチセンス DNAは、 そのままで、 あるいは摂食促進のために 補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイド 口ゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
さらに、該アンチセンス DNAは、組織や細胞における本発明の DNAの存 在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして 使用することもできる。
(7) DN A転移動物の作製
本発明は、 外来性の本発明の蛋白質をコードする DNA (以下、 本発明の外 来性 DNAと略記する） またはその変異 DNA (本発明の外来性変異 DNAと 略記する場合がある） を有する非ヒド哺乳動物を提供する。
すなわち、 本発明は、
( i )本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを有する非ヒト哺乳動物、
(ii) 非ヒト哺乳動物がげつ歯類動物である第 （ i ) 記載の非ヒト哺乳動物、
(iii) げっ歯類動物がマウスである第 （ii) 記載の非ヒト哺乳動物、 (iv) げっ歯類動物がラットである第 （i i) 記載の非ヒト哺乳動物、 および (V)本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを含有し、哺乳動物におい て発現しうる組換えベクターを提供するものである。
本発明の外来性 DN Aまたはその変異 DN Aを有する非ヒト哺乳動物（以下、 本発明の DNA転移動物と略記する） は、 未受精卵、 受精卵、 精子およびその 始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、 非ヒト哺乳動物の発生に おける胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でか つ一般に 8細胞期以前） に、 リン酸カルシウム法、 電気パルス法、 リボフェク シヨン法、 凝集法、 マイクロインジェクション法、 パーティクルガン法、 DE AE—デキストラン法、レトロウイルス法などにより目的とする DNAを転移 することによって作出することができる。 また、 該 DNA転移方法により、 体 細胞、 生体の臓器、組織細胞などに目的とする本発明の外来性 DNAを転移し、 細胞培養、 組織培養などに利用することもでき、 さらに、 これら細胞を上述の 胚芽細胞と自体公知の細胞融合法により融合させることにより本発明の DN A転移動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、 例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ハムス夕 ―、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌなどが用いられる。 なかでも、 病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、 また、 繁殖が容易なげつ歯動物、 とりわけマウス （例えば、 純系として、 C 5 7 BLZ6系統、 DBA2系統など、 交雑系として、 B 6 C 3 F 系統、 BD 系統、 B 6D 2 Fi系統、 BALBZc系統、 I CR系統など） またはラ ット （例えば、 W i s t e r, SDなど） などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける 「哺乳動物」 としては、 上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどが挙げられる。
本発明の外来性 DN Aとは、非ヒト哺乳動物が本来有している本発明の DN Aではなく、 いったん哺乳動物から単離 ·抽出された本発明の蛋白質をコード する DNAをいう。
本発明の変異 DN Aとしては、元の本発明の DN Aの塩基配列に変異（例え ば、 突然変異など） が生じたもの、 具体的には、 塩基の付加、 欠損、 他の塩基 への置換などが生じた DNAなどが用いられ、 また、 異常 DNAも含まれる。 該異常 DNAとしては、異常な本発明の蛋白質を発現させる遺伝子を含有す る DNAを意味し、 例えば、 正常な本発明の蛋白質の機能を抑制する蛋白質を 発現させる遺伝子を含有する DN Aなどが用いられる。
本発明の外来性 DN Aは、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺 乳動物由来のものであってもよい。本発明の蛋白質をコードする DN Aを対象 動物に転移させるにあたっては、該 DN Aを動物細胞で発現させうるプロモー 夕一の下流に結合した DN Aコンストラクトとして用いるのが一般に有利で ある。 例えば、 本発明の DNAを転移させる場合、 これと相同性が高い本発明 の DNAを有する各種哺乳動物 （例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラット、 マウスなど） 由来の DNAを発現させうる各種プロモー 夕一の下流に、 本発明の DNAを結合した DNAコンストラクト （例えば、 ベ クタ一など） を対象哺乳動物の受精卵、 例えば、 マウス受精卵へマイクロイン ジェクションすることによって本発明の DN Aを高発現する DN A転移哺乳 動物を作出することができる。
該コンストラクトを保持するべクタ一としては、大腸菌由来のプラスミド、 枯草菌由来のプラスミド、 酵母由来のプラスミド、 λファージなどのバクテリ オファージ、 モロニ一白血病ウィルスなどのレトロウイルス、 ワクシニアウイ ルスまたはバキュロウィルスなどの動物ウィルスなどが用いられる。なかでも、 大腸菌由来のプラスミ ドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いら れる。
上記 DNA発現調節を行うプロモーターとしては、 例えば、 ウィルス （例え ば、 シミアヌィルス、 サイトメガロウィルス、 モロニ一白血病ウィルス、 J C ウィルス、 乳癌ウィルス、 ポリオウイルスなど） に由来するプロモー夕一、 各 種哺乳動物 （ヒト、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラット、 マウスなど） 由来のものとしては、 アルブミン、 インスリン II、 ゥロプラキン II、 エラスターゼ、 エリスロポエチン、 エンドセリン、 筋クレアチンキナーゼ、 グリア線維性酸性蛋白質、 ダル夕チオン S—トランスフェラーゼ、 血小板由来 成長因子 /3、 ケラチン K l、 K 1 0および Κ 1 4、 コラーゲン I型および II 型、 サイクリック AMP依存蛋白質キナーゼ /3 Iサブュニット、 ジストロフィ ン、 酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、 心房ナトリウム利尿性因子、 内 皮レセプターチ口シンキナーゼ （一般に T i e 2と略される） 、 ナトリゥムカ リウムアデノシン 3リン酸酸化酵素 （N a, K-ATP a s e) 、 ニューロフ イラメント軽鎖、 メタ口チォネイン Iおよび IIA、 メタ口プロティナーゼ 1組 織インヒビター、 MHCクラス I抗原 （H— 2 L) 、 H— r a s、 レニン、 ド —パミン /3—水酸化酵素、 甲状腺ペルォキシダ一ゼ、 ポリペプチド鎖延長因子 l a (E F— 1 ひ） 、 βァクチン、 αおよび /3ミオシン重鎖、 ミオシン軽鎖 1 および 2、 ミエリン基礎蛋白質、 チォグロブリン、 Th y— 1、 免疫グロプリ ン、 H鎖可変部 （VNP) 、 血清アミロイド Pコンポーネント、 ミオグロビン、 トロポニン C、 平滑筋 αァクチン、 プレブ口エンケフアリン Α、· バソプレシン などのプロモーターなどが用いられるが、好ましくは全身で高発現することが 可能なサイトメガロウィルスプロモーター、ヒトポリべプチド鎖延長因子 1 α (E F - 1 ) のプロモーター、 ヒトおよびニヮトリ i3ァクチンプロモーター などを用いることができる。
上記べクタ一は、 DN A転移哺乳動物において目的とする mRN Aの転写を 終結する配列（一般に夕一ミネ一夕一と呼ばれる） を有していることが好まし く、 例えば、 ウィルス由来および各種哺乳動物由来の各 DNAの配列を用いる ことができ、 好ましくは、 シミアンウィルスの S V 4 0夕一ミネ一夕一などが 用いられる。
その他、目的 DN Aをさらに高発現させる目的で各 DN Aのスプライシング シグナル、 ェンハンサー領域、 真核 DNAのイントロンの一部などをプロモー 夕一領域の 5 ' 上流、 プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の 3 ' 下流に連結することも目的により可能である。
正常な本発明の蛋白質の翻訳領域は、 各種哺乳動物 （例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラット、 マウス、 ヒトなど） 由来の肝臓、 腎 臓、 甲状腺細胞、 線維芽細胞由来ゲノム DNAおよび市販の各種ゲノム DNA ライブラリ一よりゲノム DNAのすベてあるいは一部として、 または肝臓、 腎 臓、 甲状腺細胞、 線維芽細胞由来 RN Aより公知の方法により調製された相補 DNAを原料として、 自体公知の方法で取得することができる。 また、 外来性 の異常 DNAは、本発明の蛋白質の変異を起因とする疾病を発症した上記の細 胞または組織より得ることができる。 また、 上記の細胞または組織より得られ た正常な蛋白質の翻訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻訳領域を作 製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうる DNAコンストラクトとして、前 記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる 通常の DN A工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 DN Aの転移は、対象哺乳動物の胚 芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。 DNA転移後の作 出動物の胚芽細胞において、 本発明の外来性 DNAが存在することは、作出動 物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性 DN Aを保持することを意味する。本発明の外来性 DN Aを受け継いだこの種の動 物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の DN Aを有する。 本発明の外来性正常 DN Aを転移させた非ヒト哺乳動物は、交配により DN Aを安定に保持することを確認して、該 DNA保有動物として通常の飼育環境 で継代飼育することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 DN Aの転移は、対象哺乳動物の胚 芽細胞および体細胞のすべてに過剰に存在するように確保される。 DN A転移 後の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性 DN Aが過剰に存在するこ とは、作出動物の子孫がすべてその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の 外来性 DN Aを過剰に有することを意味する。本発明の外来性 DNAを受け継 いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外 来性 DN Aを過剰に有する。導入 DN Aを相同染色体の両方に持つホモザィゴ 一卜動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該 D N Aを過剰に有するように繁殖継代することができる。
本発明の正常 DNAを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常 DNAが高発 現させられており、内在性の正常 DN Aの機能を促進することにより最終的に 本発明の蛋白質の機能亢進症を発症することがあり、その病態モデル動物とし て利用することができる。 例えば、 本発明の正常 DN A転移動物を用いて、 本 発明の蛋白質の機能亢進症や、本発明の蛋白質が関連する疾患の病態機序の解 明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行うことが可能である。
また、本発明の外来性正常 DNAを転移させた哺乳動物は、本発明の蛋白質 の増加症状を有することから、本発明の蛋白質に関連する疾患に対する治療薬 のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、 本発明の外来性異常 DNAを有する非ヒト哺乳動物は、交配により外 来性 DN Aを安定に保持することを確認して該 DN A保有動物として通常の 飼育環境で継代飼育することができる。 さらに、 目的とする外来性 DNAを前 述のプラスミドに組み込んで原料として用いることができる。プロモーターと の DNAコンストラクトは、通常の遺伝子工学的手法によって作製することが できる。受精卵細胞段階における本発明の異常 DNAの転移は、対象哺乳動物 の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。 DN A転移後 の作出動物の胚芽細胞において本発明の異常 D N Aが存在することは、作出動 物の子孫がすべてその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の異常 DN A を有することを意味する。 DNAを受け継いだこの種の動物の子孫は、 その胚 芽細胞および体細胞のすべてに本発明の異常 DN Aを有する。導入 DN Aを相 同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配す ることによりすべての子孫が該 D N Aを有するように繁殖継代することがで きる。
本発明の異常 DNAを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の異常 DN Aが高発 現させられており、内在性の正常 DN Aの機能を阻害することにより最終的に 本発明の蛋白質の機能不活性型不応症となることがあり、その病態モデル動物 として利用することができる。例えば、本発明の異常 DN A転移動物を用いて、 本発明の蛋白質の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患の治 療方法の検討を行うことが可能である。
また、 具体的な利用可能性としては、 本発明の異常 D N A高発現動物は、 本 発明の蛋白質の機能不活性型不応症における本発明の異常蛋白質による正常 蛋白質の機能阻害 （d o m i n a n t n e g a t i v e作用） を解明するモ デルとなる。 また、 本発明の外来異常 I3 N Aを転移させた哺乳動物は、 本発明 の蛋白質の増加症状を有することから、本発明の蛋白質の機能不活性型不応症 に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。
また、上記 2種類の本発明の D N A転移動物のその他の利用可能性として、 例えば、
①組織培養のための細胞源としての使用、
②本発明の D N A転移哺乳動物の組織中の m R N Aを直接分析するか、発現し た蛋白質組織を分析することによる、本発明の蛋白質により特異的に発現ある いは活性化する蛋白質との関連性についての解析、
③上記①記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるあるいは抑制す るような薬剤のスクリーニング、 および
④本発明の変異蛋白質を単離精製およびその抗体作製などが考えられる。
さらに、本発明の D N A転移動物を用いて、本発明の蛋白質の機能不活性型 不応症を含む、本発明の蛋白質に関連する疾患の臨床症状を調べることができ、 また、本発明の蛋白質に関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理 学的所見が得られ、 新しい治療方法の開発、 さらには、 該疾患による二次的疾 患の研究および治療に貢献することができる。
また、 本発明の D N A転移動物から各臓器を取り出し、 細切後、 トリプシン などの蛋白質分解酵素により、遊離した D N A転移細胞の取得、その培養また はその培養細胞の系統化を行うことが可能である。 さらに、本発明の蛋白質産 生細胞の特定化、分化あるいは増殖との関連性、 またはそれらにおけるシグナ ル伝達機構を調べ、それらの異常を調べることなどができ、本発明の蛋白質お よびその作用解明のための有効な研究材料となる。 さらに、本発明の DNA転移動物を用いて、本発明の蛋白質の機能不活性型 不応症を含む、本発明の蛋白質に関連する疾患の治療薬の開発を行うために、 上述の検査法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患治療薬のスクリ 一ニング法を提供することが可能となる。 また、 本発明の DNA転移動物また は本発明の外来性 DN A発現ベクターを用いて、本発明の蛋白質が関連する疾 患の遺伝子治療法を検討、 開発することが可能である。
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 I UP AC - I UB Co mm i s i o n o n B i o c h em i c a l ome n c l a t u r eによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基 づくものであり、 その例を下記する。 またアミノ酸に関し光学異性体があり得 る場合は、 特に明示しなければ L体を示すものとする。
DNA デォキシリポ核酸
c DNA 相補的デォキシリボ核酸
A アデニン
T チミン
G グァニン
C シ卜シン
RNA リポ核酸
mRNA メッセンジャーリポ核酸
d ATP デォキシアデノシン三リン酸
d TTP デォキシチミジン三リン酸
d GTP デォキシグアノシン三リン酸
d CTP デォキシシチジン三リン酸
ATP アデノシン三リン酸
EDTA エチレンジァミン四酢酸
SDS ドデシル硫酸ナトリウム
E I A
G 1 y グリシン A 1 a ァラニン
V a 1 バリン
L e u
I 1 e イソロイシン - S e r セリン
T h r スレオニン
C y s システィン
Me t メチォニン
G 1 u グルタミン酸
As p ァスパラギン酸
L y s リジン
A r g アルギニン
H i s ヒスチジン
P h e フエ二ルァラニン
Ty r チロシン
T r p トリブトファン
P r o プロリン
A s n ァスパラギン
G 1 n グルタミン
p G 1 ピログルタミン酸
Me メチル基
E t ェチル基
B u ブチル基
P h フエニル基
TC チアゾリジン— 4 (R) —カルポキサミド基
また、 本明細書中で繁用される置換基、 保護基および試薬を下記の記号で表 記する。
To s ： p—トルエンスルホニル CHO ホルミル
B z 1 ベンジル
C 12B z 1 2 , 6—ジクロ口べンジル
B om ベンジルォキシメチル
Z ベンジルォキシカルボニル
C 1一 Z 2—クロ口べンジルォキシカルボニル
B r - Z 2—ブロモベンジルォキシカルポニル
B o c t—ブトキシカルボニル
DNP ジニトロフエノール
T r t トリチル
Bum t一ブトキシメチル
F m o c N_ 9—フルォレニルメトキシカルボニル
HOB t 1ーヒドロキシベンズトリアゾ一ル
HOOB t 3， 4—ジヒドロ _ 3—ヒドロキシー 4—ォキソ一
1, 2， 3—ベンゾトリアジン
HONB 1—ヒドロキシ一 5—ノルポルネンー 2， 3—ジカルポ ジィミド
DCC
本願明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
〔配列番号： 1〕
t wo - h y b r i d法に用いる b a i tプラスミドとしてのァクチビン II A受容体蛋白質の細胞内ドメインをコードする DN Aフラグメントの塩基 配列を示す。 '
〔配列番号： 2〕
本発明の蛋白質のアミノ酸配列を示す。 '
〔配列番号： 3〕
本発明の配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする c DN Aの塩基配列を示す。 〔配列番号： 4〕
ノーザンハイプリダイゼーションに用いるプローブとしての DNAの塩基配 列を示す。
後述の実施例 1で得られた形質転換体ェシャリヒア コリ （Escherichia coli) HB 10 lZpACT2 YA 1は、平成 1 1年 1 1月 1日から通商産業 省工業技術院生命工学工業技術研究所（N I BH) に寄託番号 FERM BP - 6927として、 平成 1 1年 10月 14日から財団法人，発酵研究所 （ I F O) に寄託番号 I F〇 16325として寄託されている。
実施例
以下に、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれ に限定されるものではない。なお、酵母を用いた two— hy b r i d法の操 作法は市販のキット （C 1 o n t e c h社製） に添付の説明書に記載されてい る方法に、 また、 大腸菌を用いての遺伝子操作法は、 モレキュラー ·クロー二 ング（Mo 1 e c u 1 a r c l on i n g) に記載されている方法に従った。 実施例 1 本発明の蛋白質をコードする c DNAのクローニング
(1) t wo-hy b r i d法によるァクチビン 11 A受容体蛋白質と相互作用 する蛋白質のスクリーニング
以下の、 c DNAライブラリーからァクチビン IIA受容体蛋白質と相互作用 する蛋白質のスクリーニングには、 キットとして MATCHMAKERTMT wo— Hyb r i d S y s t em 2 (C a t . No. K 1604- 1 ： C 1 o n t e c h社） を用いた。
上記方法に従い、 DNA結合用ベクター p AS 2 _ 1の E c o R I部位と B amH I部位を適切な制限酵素で切断し、 アルカリフォスファタ一ゼ処理 した後精製した。 その後、 配列番号： 1で表されるァクチビン IIA受容体蛋白 質の細胞内ドメインをコードする DN Aフラグメントをライゲ一シヨンし、目 的とする GAL 4 DN A結合ドメインとァクチビン II A受容体細胞内ドメイ ン全体を融合蛋白質として発現するプラスミド （PAS— IIA) を得た。 GA L 4転写活性化領域融合ライブラリープラスミドとしては、市販のマウス脳 M ATCHMAKER c DNA l i b r a r y (C l o n t e c h社） を用い た。
酵母菌株 Y 1 90の単一コロニー （直径 2から 3 mm) を 20m 1のトリプ トフアン欠損 SD培地に植菌し、 18時間 30°Cで振盪培養した。 この培養液 の 1 Om 1を 30 Om 1の YPD培地に〇D6。。= 0. 2から 0. 3なるよう に植え、 30°Cで 3時間振盪培養した。 培養液を滅菌した遠心管に移し、 10 00 X gで 5分間室温で遠心した。 上清を捨て、 細胞を 25m lの滅菌水に懸 濁し、 再度、 1 000 X gで 5分間室温で遠心した。 上清を捨て、 細胞を 1. 5m 1の TE緩衝液 （0. 0 1M T r i s _HC l , 1 mM EDTA, H 7. 5) /0. 1M酢酸リチウム溶液 （pH 7. 5) の混合液に懸濁して次 の形質転換に用いた。
先に作製した 1 0 a gのプラスミド （p AS— IIA) と 2 mgの二シン精巣 キヤリア一 DNA (C 1 o n t e c h社） に上記で作製した細胞懸濁液 1 m 1 を加え、 よく混合した。 さらに、 6m lの PEG (40 %P EG 4000) /TE緩衝液 /0. 1M酢酸リチウム溶液の混合液を加え、 ポルテックスミキ サ一で混合した。 30 、 200 r pmで 30分間振盪後、 700 1の DM SO (最終濃度 10%) を加えて穏やかに攪拌した。 その後、 時々振りながら、 42でで 1 5分間加熱し、 容器を氷冷後、 1000 X gで 5分間遠心した。 上 清を捨て、 細胞を 0. 5m 1の TE緩衝液に懸濁した。 得られた細胞懸濁液 1 00 1をトリプトファン欠損 SD培地上にスプレツドし、 30でで 4日間培 養し、 前記プラスミドを安定に保持する株を得た。 続いて、 GAL4転写活性 化領域融合ライブラリープラスミドも同様の方法にて前記酵母株に導入した。 得られた形質転換体 0. 2 m 1をトリブトファン ロイシン Zヒスチジン欠損 SD培地上にまき、 30 で 8日間培養した後、 H i s +コロニーをトリブト ファン ロイシン ヒスチジン欠損寒天プレート上にストリークした。
シャーレに 5m 1の Z緩衝液 （Na2HP〇4 ' 7H20, N aH2P04 - H 2〇， KC 1 , Mg S 04 · 7 H20, pH 7) ZX— g a l溶液 （5—プロ モ _4_クロ口一 3インドリル一 /3_D—ガラクトシドの 2 %DMF溶液） Z i3—メルカプトエタノール混合液を入れ、滅菌したワットマン # 5フィル夕一 を湿らせた。別のフィルターを前記形質転換体コロニーがある寒天プレート上 に置いた後、 このフィルターを取り上げ、 コロニー面を上にして液体窒素で凍 結させた。 液体窒素中からフィルターを取り出し、 室温で融解した後、 先の湿 らせたフィルター上にコロニー面を上にして置いた。シャーレの蓋を閉めて 3 0°Cで 1時間保温し、青くなつた約 100個のポジティブコロニーを分離した。 得られたそれぞれのポジティブクローンを 3 m 1のロイシン欠損 S D液体培 地に植え、 2日間培養した後、 この培養液を 10000倍に希釈し、 ロイシン 欠損 SDプレートにまき、 30°Cで 3日間保温した。 20から 30個のコロニ —を滅菌した楊枝で拾い、 トリブトファン ロイシン欠損 S Dプレー卜とロイ シン欠損 SDプレートにレプリカした。 ここで、 先のポジティブコロニーより トリプトファン栄養要求性を示すコロニーを選択し、その )3 _ガラクトシダー ゼ活性の検定を行い、 さらに活性を示さない 2個のコロニーを選択した。
得られた真のポジティブコロニーを 2 m 1の YPD液体培地に植え、 30°C で一夜培養した。 培養液を 5秒間室温で遠心し、 上清を捨てた後、 0. 2m l の酵母溶解液（2 %トリトン X— 100, 1 %SDS, 1 0 OmM N a C 1 , 1 OmM T r i s -HC 1 (pH 8. 0) 、 1 mM EDTA) を加え、 懸 濁させた。 0.2m lのフエノール クロ口ホルム Zイソアミルアルコール（2 5 : 24 : 1 ) と酸で洗ったガラスビーズを加え、 2分間ポルテックスミキサ 一で攪拌した。 14000 r pmで 5分間室温で遠心した後、 分離した上清に 1 10量の 3M 酢酸ナトリウム溶液 （pH 5. 2) と 2. 5倍量のェ夕ノ ールを加えた。得られた沈殿物を 70 %エタノールで洗浄した後、 20 1の 滅菌水に溶解した。このうちの 1 1を大腸菌 HB 1 0 1株にエレクトロポレ —シヨン法により導入した後、通常のミニプレップ法でプラスミド DNAを精 製し、 目的とする c DNA (pACT2YA l) を得、 その塩基配列を決定し た。 本発明の蛋白質の全長 c DNAは 888 b pで、 配列番号： 2で表される 1 53個のアミノ酸からなるポリペプチド [図 1および図 2] をコードしてい た。
配列番号： 2で表されるアミノ酸からなるポリペプチドをコードする全長 c DN Aを含むプラスミド pACT2YA lを大腸菌 HB 101に形質転換し、 形質転換体：大腸菌 HB 101/PACT2 YA 1を得た。
実施例 2 マウスの各種臓器由来 p o 1 y (A) +RNAを用いたノーザンハ イブリダィゼーシヨン法による発現の検出
配列番号： 4で表される DN Aを、 D I G— PCR プローブ合成キット（B o e h r i n g e r社） を用いジゴキシゲニンで標識し、 プローブとして用い た。
また、 B a 1 b/cマウスより脳、.肝臓、 脾臓、 肺、 腎臓、 心臓、 精巣、 骨 格筋を摘出し、 TR I z o 1試薬 （G I B CO B RL社） により t o t a 1 RN Aを抽出した。 その後、 P o l yAT t r a c t mRNA I s o l a t i on S y s t em (P r ome g a社） を用いて、 p o 1 y (A) +RN Aを精製した。
各 p o l y (A) +RNAを 1 gづっ用い、 ホルマリンゲル法により 1 % ァガロースゲル電気泳動を行い、 ブロッテイング装置（Ame r s h am- P h a r ma c i a社） を用いたバキュームブロッティング法により、 Hy b o n d N (Ame r s h am— Ph a rma c i a社） にブロットした。 これ を先に作製したプローブ DN Aの各 5 n g/m 1を含むハイブリダイゼーシ ョン緩衝液 （5 XS SC, 0. l %N- l au r oy l s a r c o s i n e, 0. 02 % S D S , 0. 5%b l o c k i n g r e a g e n t (B o e h r i n g e r社） ， 100 g 1サケ精巣 D N A) にて、 65 t:で一夜保温 した。 その後、 0. 1 XS SCおよび 0. 1 %SDSを用い、 65 、 20分 で 3回洗浄した。 さらに、 アルカリホスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体 ( B o e h r i n g e r社）を含む溶液（0. 1M T r i s—HC l pH 7. 5, 0. 1 5M N a C 1 , 1 50 mUZm 1抗体） 中で保持した後、 0. 1 M T r i s -HC 1 (pH 7. 5) 、 0. 1 5M Na C lおよび 0. 1 % Twe e n 20を用い、 1 5分で 3回洗浄した。 最後に、 Lum i _Ph o s 5 3 0 (和光純薬工業社製） を基質とした化学発光を行い、 X線フィルム に露光して検出した結果、 本発明の蛋白質が心臓、 脳、 肝臓、 骨格筋、 腎臓、 精巣などで多く発現していることが確認された。 産業上の利用可能性
本発明の蛋白質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩 （以下、 本発明の蛋白 質と略記する場合がある） 、本発明の蛋白質またはその部分ペプチドをコード する D N A (以下、 本発明の D N Aと略記する場合がある） 、 本発明の蛋白質 に対する抗体 （以下、 本発明の抗体と略記する場合がある） およびアンチセン ス D N Aは、①本発明の蛋白質に対する結合蛋白質の決定、②抗体および血清 の入手、③組換え型蛋白質の発現系の構築、④発現系を用いた結合アツセィ系 および t w o — h y b r i d法を用いたアツセィ系の開発と医薬品侯補化合 物のスクリーニング、⑤構造的に類似したリガンド ·レセプ夕一との比較に基 づいたドラッグデザィンの実施、⑥遺伝子診断におけるプローブ、 P C Rブラ イマ一の作成等における試薬として用いることができ、 また、⑦遺伝子治療等 の薬物として用いることができる。 特に、 本発明の蛋白質の構造'性質の解明 は、 これらの系に作用するユニークな医薬品の開発につながる。

Claims

請求の範囲
I . 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を有する蛋白質またはその塩。
2. 請求項 1記載の蛋白質の部分ペプチドまたはその塩。
3. 請求項 1記載の蛋白質をコードする DN Aを含有する組換え DNA。
4. 配列番号： 3で表される塩基配列またはそれとハイストリンジェントな条 件下でハイブリダイズする塩基配列を有する請求項 3記載の D N A。
5.請求項 2記載の部分ペプチドをコ一ドする DNAを含有する組換え DNA。
6. 請求項 3記載の DNAを含有する組換えベクター。
7. 請求項 6記載の組換えベクターを保持する形質転換体。
8. 請求項 7記載の形質転換体を培養し、 請求項 1記載の蛋白質を生成，蓄積 せしめ、これを採取することを特徴とする請求項 1記載の蛋白質またはその塩 の製造方法。
9. 請求項 1記載の蛋白質、 請求項 2記載の部分ペプチドまたはそれらの塩に 対する抗体。
1 0. 請求項 9記載の抗体に対して、 請求項 1記載の蛋白質、 請求項 2記載の 部分べプチドまたはそれらの塩を含有する被検液および標識化された請求項 1記載の蛋白質、請求項 2記載の部分ペプチドまたはそれらの塩を競合的に反 応させることを特徴とする請求項 1記載の蛋白質、請求項 2記載の部分べプチ ドまたはそれらの塩の定量方法。
I I . 請求項 1記載の蛋白質、請求項 2記載の部分ペプチドまたはそれらの塩 を用いることを特徴とする、請求項 1記載の蛋白質、 請求項 2記載の部分ぺプ チドまたはそれらの塩と結合する蛋白質の決定方法。
1 2. 請求項 1 1記載の方法により得られる、 請求項 1記載の蛋白質、 請求項 2記載の部分ペプチドまたはそれらの塩と結合する蛋白質またはその塩。
1 3. 請求項 1記載の蛋白質、請求項 2記載の部分ペプチドまたはそれらの塩 を含有することを特徴とする、 請求項 1記載の蛋白質、請求項 2記載の部分べ プチドまたはそれらの塩と、請求項 1 2記載の蛋白質またはその塩あるいはァ クチビン受容体蛋白質またはその塩との結合を阻害または促進する化合物ま たはその塩のスクリーニング方法。
1 4 . ツー ハイブリッド（t w o — h y b r i d )法を用いることを特徴とす る請求項 1 1記載の蛋白質の決定方法または請求項 1 3記載のスクリーニン グ方法。
1 5 . 請求項 1記載の蛋白質、 請求項 2記載の部分ペプチドまたはそれらの塩 を含有することを特徴とする、請求項 1記載の蛋白質、 請求項 2記載の部分べ プチドまたはそれらの塩と、請求項 1 2記載の蛋白質またはその塩あるいはァ クチビン受容体蛋白質またはその塩との結合を阻害または促進する化合物ま たはその塩のスクリーニング用キット。
1 6 .請求項 1 3記載のスクリーニング方法または請求項 1 5記載のスクリ一 ニング用キットを用いて得られる、 請求項 1記載の蛋白質、請求項 2記載の部 分ペプチドまたはそれらの塩と、請求項 1 2記載の蛋白質またはその塩あるい はァクチビン受容体蛋白質またはその塩との結合を阻害または促進する化合 物またはその塩。
1 7 . 請求項 1 2記載の蛋白質、請求項 1 6記載の化合物またはそれらの塩を 含有してなる医薬。
1 8 . 請求項 1 2記載の蛋白質もしくはその塩、 ァクチビン受容体またはァク チビン細胞内情報伝達分子に関連した神経細胞異常または脳疾患の予防'治療 剤である請求項 1 7記載の医薬。
1 9 . 哺乳動物に対して請求項 1 2記載の蛋白質、請求項 1 6記載の化合物ま たはその塩を有効量投与することを特徴とする、請求項 1 2記載の蛋白質もし くはその塩、ァクチビン受容体またはァクチビン細胞内情報伝達分子に関連し た神経細胞異常または脳疾患の予防 ·治療方法。
2 0 . 請求項 1 2記載の蛋白質もしくはその塩、 ァクチビン受容体またはァク チビン細胞内情報伝達分子に関連した神経細胞異常または脳疾患の予防'治療 剤を製造するための請求項 1 2記載の蛋白質、請求項 1 6記載の化合物または その塩の使用。
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