WO2001038335A1 - Dendrimeres phosphores comme agents de transfevtion - Google Patents

Dendrimeres phosphores comme agents de transfevtion Download PDF

Info

Publication number
WO2001038335A1
WO2001038335A1 PCT/FR2000/003261 FR0003261W WO0138335A1 WO 2001038335 A1 WO2001038335 A1 WO 2001038335A1 FR 0003261 W FR0003261 W FR 0003261W WO 0138335 A1 WO0138335 A1 WO 0138335A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
groups
group
phosphorus
dendrimers
alkyl
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR2000/003261
Other languages
English (en)
Inventor
Jean-Pierre Majoral
Bernard Meunier
Anne-Marie Caminade
Christophe Loup
Maria-Antonietta Zanta-Boussif
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority to US10/130,739 priority Critical patent/US6969528B1/en
Priority to DE60002603T priority patent/DE60002603T2/de
Priority to JP2001540098A priority patent/JP2003514912A/ja
Priority to EP00985306A priority patent/EP1232165B1/fr
Priority to CA002392697A priority patent/CA2392697A1/fr
Priority to AT00985306T priority patent/ATE239749T1/de
Publication of WO2001038335A1 publication Critical patent/WO2001038335A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G83/00—Macromolecular compounds not provided for in groups C08G2/00 - C08G81/00
    • C08G83/002—Dendritic macromolecules
    • C08G83/003—Dendrimers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
    • C07F9/22—Amides of acids of phosphorus
    • C07F9/24—Esteramides
    • C07F9/2454—Esteramides the amide moiety containing a substituent or a structure which is considered as characteristic
    • C07F9/2479—Compounds containing the structure P(=X)n-N-acyl, P(=X)n-N-heteroatom, P(=X)n-N-CN (X = O, S, Se; n = 0, 1)
    • C07F9/2491—Compounds containing the structure P(=X)n-N-acyl, P(=X)n-N-heteroatom, P(=X)n-N-CN (X = O, S, Se; n = 0, 1) containing the structure P(=X)n-N-N (X = O, S, Se; n = 0, 1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/6564—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having phosphorus atoms, with or without nitrogen, oxygen, sulfur, selenium or tellurium atoms, as ring hetero atoms
    • C07F9/6581—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having phosphorus atoms, with or without nitrogen, oxygen, sulfur, selenium or tellurium atoms, as ring hetero atoms having phosphorus and nitrogen atoms with or without oxygen or sulfur atoms, as ring hetero atoms
    • C07F9/65812—Cyclic phosphazenes [P=N-]n, n>=3
    • C07F9/65815—Cyclic phosphazenes [P=N-]n, n>=3 n = 3
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation

Definitions

  • the present invention relates to phosphorous dendrimers and to their applications, as gene transfection agents, in vitro and in vivo, including in the treatment of human and animal diseases.
  • Said agents or vectors are in particular capable of providing suitable target cells with nucleic acid sequences of interest.
  • Gene therapy is based on the therapeutic administration of nucleic acids; it requires the use of efficient and safe vectors for the transfer of therapeutic genes and its success therefore depends on the efficiency of the transfer of genes into the desired cells.
  • compositions capable of transfecting eukaryotic cells with selected genetic material have already been described and belong essentially to two main types of transfection vectors: - viral transfection vectors, which are effective but which have limits of use : tissue non-specificity, need to obtain constructs for each gene of interest, potential risks for the environment which lead to the establishment of costly and restrictive clinical infrastructures for the patient and the staff, problems of immune response , production by homologous recombination of viral particles and potential oncogenic effects;
  • non-viral agents capable of promoting the transfer and expression of chemical substances such as DNA in eukaryotic cells.
  • non-viral vectors there may be mentioned in particular the preparations of canonical lipids, which are particularly cytotoxic (15-18), DNA encapsulation techniques in liposomes (9-11) and polycationic polymers, such as poly (L-lysine), protamine, polyethyleneimine (12) or even cationic dendrimers (polyamidoamines) (13, 14, 27), which associate with DNA by multiple electrostatic interactions generating a cooperative process, which produces particles called polyplexes, each giving variable transfection efficiencies depending on their structure and cell type (25).
  • polycationic polymers such as poly (L-lysine), protamine, polyethyleneimine (12) or even cationic dendrimers (polyamidoamines) (13, 14, 27), which associate with DNA by multiple electrostatic interactions generating a cooperative process, which produces particles called polyplexes, each giving variable transfection efficiencies depending on their structure and cell type (25).
  • polyamidoamine dendrimers are polymers of spherical and branched structure; they are soluble in aqueous solution and have on their surface a layer of primary amines; they are isomolecular and highly charged on their surface.
  • the different dendrimers described present different types of central core (core): ammonium or ethylenediamine (EDA), from which the polymerization process is initiated.
  • core central core
  • EDA ethylenediamine
  • the subject of the present invention is polycationic phosphorous dendrimers, characterized in that they consist of:
  • a central layer in the form of a core Po comprising 2 to 8 functionalized groups and in particular the group of general formula la (also called N 3 P 3 ):
  • L is an oxygen, phosphorus or sulfur atom
  • M represents one of the following groups:
  • R 1 and R 2 which may be identical or different, represent a hydrogen atom or one of the following groups: alkyl, alkoxy, aryl , with or without phosphorus, oxygen, sulfur, nitrogen or halogen atoms with R being most often different from Ri, n is an integer between 1 and 11,
  • E is an oxygen, sulfur or nitrogen atom, said nitrogen atom being able to be linked to an alkyl, alkoxy or aryl group, all these groups being able to incorporate or not atoms of phosphorus, oxygen, nitrogen, sulfur or halogens,
  • R 5 represents a hydrogen atom or one of the following groups: alkyl, alkoxy, aryl, these groups comprising or not phosphorus, oxygen, nitrogen, sulfur or halogens atoms,
  • W represents one of the following groups: alkyl, alkoxy, aryl, all these groups whether or not containing phosphorus, oxygen, nitrogen, sulfur or halogen atoms,
  • R 3 and 4 which may be the same or different, represent a C 1 -C 5 alkyl group
  • X represents a hydrogen atom or a C 1 -C 5 alkyl group or is absent
  • Z represents a halide ion, an alkylCOO " group or any other anionic group comprising carbon, oxygen, sulfur, nitrogen, phosphorus or halogen atoms, or is absent.
  • a preferred group of formula II is in particular the following group:
  • a preferred group of formula III is in particular the following group:
  • R'O- for example methoxy, ethoxy, propoxy, isopropoxy, butoxy, isobutoxy, tertiobutoxy groups.
  • alkyl denotes straight or branched chain radicals containing up to 8 carbon atoms. Among these radicals, mention may be made of methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, hexyl, heptyl, octyl radicals.
  • aryl denotes, for example, a phenyl radical optionally substituted by one or more alkyl or alkoxyl radicals or by a chlorine, bromine or fluorine atom, or a 5 or 6-membered heterocyclic aromatic radical containing 1 to 2 heteroatoms such as nitrogen or oxygen.
  • aryl radicals there may be mentioned the phenyl (o-, m-, or p-), methoxyphenyl (3,4-, 2,6-, 2,3-), dimethoxyphenyl (o-, m-, or p-), tolyl, thienyl, pyridyl.
  • A- [G n ] Several types of products can be obtained, generally designated by the formula A- [G n ], in which A defines the type of terminal unit and G n defines the number of layers of intermediate units PI (corresponding to the number of generations ): - the series of compounds 2- [G n ] has terminal units of preferred formula III, in which X represents a hydrogen atom, p is equal to 2, R 3 and i are identical and represent ethyl groups, Z is a chloride ion and n is an integer between 1 and 11, preferably between 1 and 10 (see Figure 3);
  • the series of compounds 3- [G n ] has terminal units of formula III, in which X is empty, p is equal to 2, R 3 and are identical and represent ethyl groups, Z is empty and n is a number integer between 1 and 11, preferably between 1 and 10 (see Figure 3);
  • the series of compounds 4- [G n ] has terminal units of formula III, in which X represents a methyl group, p is equal to 2, R 3 and are identical and represent ethyl groups, Z is an iodide ion and n is an integer between 1 and 1 1, preferably between 1 and 10 (see Figure 3);
  • n is an integer between 1 and 1 1, preferably between 1 and 10 (see FIG. 3) (intermediate products for the preparation of dendrimers according to l 'invention).
  • the phosphorous dendrimers according to the invention can be obtained, in a reproducible manner, by controlled growth of the dendnmé ⁇ que structure by adding successive layers of H 2 NN (R) -P (S) C1 2 units or units of formula VIII (example of product of formula II).
  • the central block or nucleus of formula VII corresponds to a hexachlorocyclot ⁇ phosphazene unit (C1 6 N 3 P 3 ) modified by t ⁇ ethylammonium of 4-hydroxybenzaldehyde
  • This nucleus which comprises 6 terminal aldehyde functions, is brought into contact with a dichlorophosphonoalkylhydrazide of formula VIII H NN (Alk) -P (S) Cl to produce a dendron having dichlorothiophosphine P (S) C1 2 terminal units, which can be brought back into contact with a 4-hydroxybenzaldehyde salt of formula VI, to produce, by iteration, each generation of dendrimers.
  • the 1 st , 2 nd , 3 rd , 4 th , and 5 th generations of dend ⁇ mère respectively comprise 6, 12, 24, 48 and 96 Cl 2 terminal units, which can be treated with N, N-dialkylethylenediamine, to produce cationic dendrimers after protonation 2- [G ⁇ ] to 2- [G 5 ], in accordance with FIG. 3.
  • These polycationic phosphorus dendrimers have 12, 24, 48, 96 or
  • methylated forms (5- [G ⁇ ] to 5- [G 5 ]) are prepared from the corresponding neutral terminal amines (3- [G ⁇ ] to 3- [G 5 ]) by methylation in the presence of methyl iodide , followed by a lodides / acetates exchange using a suitable resin (see example 1)
  • the dendrimers according to the invention can be prepared in the following manner (1) reaction of a product of formula V (also called N 3 P 3 )
  • the present invention also relates to a composition capable of acting as an agent for transfection of a nucleic acid sequence into a eukaryotic cell, characterized in that it comprises a nucleic acid and a polycationic phosphorus dendrimer as defined above, coupled to said nucleic acid.
  • the composition also comprises at least one pharmaceutically acceptable vehicle.
  • the N / P ratio in which N corresponds to the terminal cationic groups of the dendrimer (charged amines) and P corresponds to the phosphate groups of said nucleic acid, is between 5 and 10.
  • composition further comprises a membrane permeabilization agent capable of transporting said nucleic acid through the cytoplasmic or endosomal membranes of said eukaryotic cell.
  • said polycationic phosphorus dendrimer is associated in a non-covalent manner with said nucleic acid.
  • This phenomenon may be linked to a high density of stable positive charges, which can cause the cell membrane to burst and thus lead to cell death.
  • the charge density reduction is not possible for the alkylated products without degradation of the dendrimers, while the charge density of the 2- [Gn] series can be modulated by micro-environmental modifications of the pH at the level of the cellular membrane.
  • the possibility of modulating the charge density of this series of dendrimers can constitute a key factor in the release of the gene transported in the endosomes.
  • These dendrimers thus perhaps act as a proton reservoir in the cell compartments, their charge density being controlled by ATPase-dependent proton pumps and by changes in the intracellular chloride concentration.
  • the possibility of reducing the cationic charge density of these dendrimers outside and inside the cells should be favorable for their use in vivo.
  • FIG. 1 illustrates the structure of the central nucleus P 0 (N 3 P 3 ) and a dendrimer according to the invention of type 3- [G 2 ];
  • FIG. 2 illustrates a dendrimer according to the invention of type 2- [G 4 ];
  • FIG. 3 illustrates a process for preparing the dendrimers according to the invention;
  • FIG. 4 illustrates the gene transfer properties of type 2- [G n ] dendrimers, in the presence of serum (right parts of Figures 4A and 4B) or in the absence of serum (left parts of Figures 4A and 4B );
  • - Figure 5 illustrates the gene transfer properties of dendrimers of type 5- [G n ], in the presence of serum (right parts of Figures 5 A and 5B) or in the absence of serum (left parts of Figures 5 A and 5B).
  • the number 1 corresponds to a dendrimer with ends Cl, 2, 3, 4 or 5 for ends -NH (Et) 2 + Cl " , -N (Et) 2 , -NMe (Et) + Y or -NMe (Et) 2 + OAc " , respectively and n corresponds to the number of generations of the dendrimer (number of intermediate layers).
  • iodide methyl and N, N-diethylethylenediamine were supplied by Aldrich and the AG1-X8 resin, with strong anion exchange power, by Biorad.
  • the first generation of 2- [Gj] dendrimer is obtained with a yield of 80%.
  • ⁇ 1.3 (br s, 288 H, CH 2 CH 3 ), 3.1 (s, 144 ⁇ , + N-C ⁇ 3 ), 3.1- 3.6 (m, 510 H, CH3-NP l j2j3 , CH 2 ), 5.5 (br s, 48 H, NH), 7.0-7.4 (m, 84 H, C 0 2 -H,
  • HZY3 1 150.7 (br s, C 0 1 , C ⁇ 1 , C 2 l).
  • the paste obtained was washed with 20 ml of a pentane / ether mixture (1/1, v / v) to obtain a white powder of methylated dendrimers, in acetate form, called 5- [Gford].
  • 8 to 10% of the terminal branches are modified during the exchange of counterions with the resin and have been provisionally attributed to a demethylated form since the NMR results were identical to those of the neutral dendrimers carrying tertiary amines (3- [ G n ].
  • These minor terminal ramifications have been indicated by an asterisk in the NMR results presented below and the yields correspond to those of the total dendrimer.
  • transfections carried out in the presence of serum lead to lower toxicity.
  • a higher level of expression is observed for the transfections carried out in the presence of serum compared to those carried out without serum (FIGS. 4A and 4B), right and left panels, respectively).
  • third to fifth generation dendrimers have been shown to be as effective as the linear PEI used under optimal conditions.
  • the methylated forms 5- [G n ] have been shown to be rather toxic and not very effective in transfecting nucleic acids in eukaryotic cells (FIGS. 5A and 5B). This phenomenon can be explained by a stable positive charge density which can disturb the cell membrane and cause cell death.
  • the decrease in the charge density of the methylated forms cannot be achieved without degrading the dendrimer, on the other hand the charge density of the chloride derivatives (2- [G n ]) can be modulated by micro-environmental modifications of the pH when they approach the cell membrane.
  • the possibility of modulating the charge density of the chloride derivatives of the dendrimers could play a key role in the release of the luciferase gene from the endosome.
  • dendrimers may behave like proton reservoirs in cell compartments, their charge density being controlled on the one hand by proton pumps coupled to ATPases, and on the other hand by intracellular changes in the concentration of chlorides.
  • the 22 kDa linear PEI (ExGen 500) was supplied by Euromedex (Souffelweyersheim, France).
  • the NIH3T murine fibroblasts come from ATCC (Rockville, MA, USA) and are cultured in Dulbecco medium modified by Eagle (DMEM). The culture media are supplemented with 10% fetal calf serum (D. Dutscher, Brunath, France), 2 mM L-glutamine (Gibco-BRL), 100 units / ml of penicillin (Gibco-BRL) and 100 ⁇ g / ml streptomycin (Gibco-BRL). The cells are maintained at 37 ° C., in a humid atmosphere containing 5% of CO.
  • DMEM Dulbecco medium modified by Eagle
  • the culture media are supplemented with 10% fetal calf serum (D. Dutscher, Brunath, France), 2 mM L-glutamine (Gibco-BRL), 100 units / ml of penicillin (Gibco-BRL) and 100 ⁇ g / ml streptomycin (Gib
  • PCMV-luc coding for Photinus pyralis luciferase, under the control of the cytomegalovirus promoter / enhancer sequences were kindly provided by Dr. M. Scarpa (CRIBI, padua, Italy).
  • the plasmids were purified on Qiagen columns (Rockford, USA) from the XL1 strain of E. Coli transformed.
  • the adherent cells were seeded in 24-well plates (Costar, D. Dutscher, France), the day before the transfection, so as to reach 60 to 70% confluence on the day of the transfection. All the experiments were carried out in triplicate. The cells were rinsed before transfection and 1 ml of medium with or without serum was added to each well. 2 ⁇ g of plasmid (1.5 solution mg / ml in a 10 mM Tris-1 mM EDTA buffer, pH 7.4) were diluted in 50 ⁇ l of 0.15 M NaC1.
  • Mw average molecular weight
  • M 330 nucleic acid phosphate
  • the cationic vector was added, all at once, to the plasmid solution [and not in reverse order (12)], then the mixture was vortexed and centrifuged.
  • the quantities and volumes indicated above correspond to one well and have in fact been multiplied by three and distributed in three wells.
  • the mixture was added to the cells and the supernatant was distributed homogeneously by a slight horizontal manual rotation.
  • the culture plate was centrifuged (Sigma 3K10, Bioblok, France), for 5 min at 1500 rpm (280 g). After 2 to 3 hours of incubation, 1 10 ⁇ l of fetal calf serum was added to the wells without serum. The cells were cultured for 24 h, then the expression of the reporter gene was tested. - Measurement of luciferase
  • the expression of the luciferase gene was measured by luminescence.
  • the culture medium was removed and the cell lysate was harvested after incubation, for 30 min, at room temperature in lx lysis buffer (Promega, USA).
  • the lysate was gently vortexed and centrifuged at 140,000 rpm (17,530 g), for 5 min, at 4 ° C.
  • 20 ⁇ l of lysate were diluted in 100 ⁇ l of luciferase reaction buffer (Proméga, USA) and the luminescence was measured for 10 sec (Mediators PhL, Vienna, Austria). The results were expressed in luminescence units per mg of protein (measurement by the BCA test, Pierce).
  • EXAMPLE 3 Percentages of viability of cells transfected in accordance with Example 2.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Macromolecular Compounds Obtained By Forming Nitrogen-Containing Linkages In General (AREA)
  • Luminescent Compositions (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Dendrimères phosphorés et leurs applications, comme agents de transfection de gènes, <i>in vitro</i> et <i>in vivo</i>, y compris dans le traitement des maladies humaines et animales. Lesdits agents ou vecteurs sont notamment aptes à dispenser à des cellules cibles convenables, des séquences d'acide nucléique d'intérêt.

Description

DENDRIMERES PHOSPHORES COMME AGENTS DE TRANSFECTION
La présente invention est relative à des dendrimères phosphores et à leurs applications, comme agents de transfection de gènes, in vitro et in vivo, y compris dans le traitement des maladies humaines et animales. Lesdits agents ou vecteurs sont notamment aptes à dispenser à des cellules cibles convenables, des séquences d'acide nucléique d'intérêt.
La thérapie génique est fondée sur l'administration thérapeutique d'acides nucléiques ; elle nécessite l'utilisation de vecteurs efficaces et sûrs pour le transfert des gènes thérapeutiques et son succès dépend donc de l'efficacité du transfert des gènes dans les cellules souhaitées.
De nombreuses compositions aptes à transfecter des cellules euca- ryotes avec un matériel génétique sélectionné ont déjà été décrites et appartiennent essentiellement à deux grands types de vecteurs de transfection : - les vecteurs de transfection viraux, qui sont efficaces mais qui présentent des limites d'utilisation : non-spécificité tissulaire, nécessité d'obtenir des constructions pour chaque gène d'intérêt, risques potentiels pour l'environnement qui conduisent à la mise en place d'infrastructures cliniques coûteuses et contraignantes pour le malade et le personnel, problèmes de réponse immunitaire, de production par recombinaison homologue de particules virales et d'effets oncogènes potentiels ;
- des agents non-viraux (vecteurs synthétiques), capables de promouvoir le transfert et l'expression de substances chimiques telles que l'ADN dans les cellules eucaryotes.
Ces vecteurs synthétiques doivent avoir essentiellement deux fonc- tions : condenser l'ADN à transfecter et promouvoir sa fixation cellulaire ainsi que son passage à travers la membrane plasmique et éventuellement les membranes nucléaires ; pour être efficaces, de tels vecteurs doivent donc mimer le fonctionnement des virus. Toutefois, il apparaît que les différents vecteurs proposés dans l'art antérieur ne présentent pas ces deux fonctions de manière optimale et peuvent en outre, selon les cas, être toxiques pour les cellules.
Parmi ces vecteurs non-viraux, on peut notamment citer les préparations de lipides canoniques, qui sont particulièrement cytotoxiques (15-18), les techniques d'encapsulation de l'ADN dans des liposomes (9-11) et les polymères polycationiques, tels que la poly(L-lysine), la protamine, le polyéthylèneimine (12) ou encore les dendrimères cationiques (polyamidoamines) (13, 14, 27), qui s'associent à l'ADN par des interactions électrostatiques multiples engendrant un processus de coopérativité, ce qui produit des particules appelées polyplexes, chacune donnant des efficacités de transfection variables suivant leur structure et le type cellulaire (25).
De manière plus précise, les dendrimères de type polyamidoamines (PAMAM) sont des polymères de structure sphérique et branchée ; ils sont solubles en solution aqueuse et présentent à leur surface une couche d'aminés primaires ; ils sont isomoléculaires et fortement chargés à leur surface. Les différents dendrimères décrits présentent différents types de noyau central (core) : ammonium ou éthylènediamine (EDA), à partir desquels le processus de polymérisation est initié. Ces dendrimères PAMAM contiennent un nombre défini de groupes aminés à la surface du polymère qui sont chargés positivement à pH physiologique. Il a été montré que de telles molé- cules interagissent avec des anions tels que les acides nucléiques et que les complexes ADN/dendrimères sont capables de transfecter des cellules d'une manière similaire à celle observée avec les complexes ADN/polylysine, mais avec une efficacité meilleure, liée à leur solubilité et à leur structure. En particulier des dendrimères PAMAM G -G5, comprenant comme noyau central, soit des groupes NH3, soit des groupes EDA, sont capables de former des complexes stables avec de l'ADN dans des conditions physiologiques, et les dendrimères G5-Gιo sont capables de transfecter des gènes. Le fait que la capacité de transfection soit limitée à ce groupe de dendrimères est sans doute liée au nombre de groupes aminés présents à leur surface et à leur forme sphérique. L'efficacité de ces derniers dépend des modifications chimiques de la structure dendrimérique initiale, par un traitement thermique qui conduit à une population de composés hétérodispersés (15, 21).
Depuis environ dix ans, la recherche sur la chimie des dendrimères s'est considérablement développée, du fait de leur structure (polymères polyfonctionnels ordonnés) et de leurs propriétés particulières liées à la présence d'un nombre important de fonctionnalités à leurs extrémités, qui fournissent un grand nombre de surfaces et d'interfaces et à la présence de zones vides, qui permettent l'encapsulation de molécules diverses ; cette recherche a conduit à la synthèse d'autres structures correspondant à des dendrimères contenant du phosphore, telles que celles décrites par C. Galliot et al. (18), par C. Larré et al. (19) ou par D. Prévôté et al. (28).
Toutefois, il ressort de la littérature que ces dendrimères phosphores, non solubles dans l'eau, ne peuvent être utilisés comme agents de transfection. Dans le cadre de leur recherche, les Inventeurs ont maintenant montré que de nouveaux dendrimères contenant du phosphore, qui sont fonctionnalisés au niveau des couches internes et qui comprennent des aminés tertiaires protonées comme terminaisons présentent des propriétés particulièrement intéressantes, en tant que vecteurs de transfert d'acides nucléiques. La présente invention a pour objet des dendrimères phosphores polycationiques, caractérisés en ce qu'ils sont constitués :
- d'une couche centrale sous la forme d'un noyau Po comprenant 2 à 8 groupements fonctionnalisés et notamment le groupement de formule générale la (aussi dénommé N3P3) :
Figure imgf000004_0001
(la) / ou le groupement de formule générale Ib : S=PY~ - de n couches intermédiaires, identiques ou différentes, chacune desdites couches intermédiaires étant constituée d'unités PI répondant à la formule II : L— M — C = N — N— P
(II)
R. R2 E
dans laquelle :
L est un atome d'oxygène, de phosphore ou de soufre,
M représente l'un des groupes suivants :
• un groupe aromatique di-, tri- ou tétrasubstitué par des groupes alkyles, des groupes alcoxy, des groupements insaturés du type oléfinique en Cι-Cj2, azoïque, acétylènique, tous ces groupes pouvant incorporer ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, d'azote, de soufre ou des halogènes, ou • un groupe alkyle ou alcoxy comportant plusieurs substituant tels que définis lorsque M est un groupe aromatique, Ri et R2, qui peuvent être identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou l'un des groupes suivants : alkyle, alcoxy, aryle, comportant ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, de soufre, d'azote ou des halogènes avec R étant le plus souvent différent de Ri, n est un nombre entier compris entre 1 et 11,
E est un atome d'oxygène, de soufre ou d'azote, ledit atome d'azote pouvant être lié à un groupe alkyle, alcoxy ou aryle, tous ces groupes pouvant incor- porer ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, d'azote, de soufre ou des halogènes,
- une couche externe constituée d'unités P2, identiques ou différentes, et répondant à la formule III :
Figure imgf000005_0001
dans laquelle :
R5 représente un atome d'hydrogène ou l'un des groupes suivants : alkyle, alcoxy, aryle, ces groupes comportant ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, d'azote, de soufre ou des halogènes,
W représente l'un des groupes suivants : alkyle, alcoxy, aryle, tous ces groupes comportant ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, d'azote, de soufre ou des halogènes,
R3 et 4, qui peuvent être identiques ou différents, représentent un groupe alkyle en C1-C5,
X représente un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en C1-C5 ou est absent, et Z représente un ion halogénure, un groupe alkylCOO" ou tout autre groupement anionique comportant des atomes de carbone, d'oxygène, de soufre, d'azote, de phosphore ou d'halogènes, ou est absent.
Un groupe de formule II préféré est notamment le groupe suivant :
Figure imgf000006_0001
Un groupe de formule III préféré est notamment le groupe suivant :
Figure imgf000006_0002
De tels composés représentent des dendrimères et sont notamment représentés aux figures 1 à 3. L'expression « alcoxy » désigne les radicaux de formule générale
R'O-, par exemple les groupements méthoxy, éthoxy, propoxy, isopropoxy, butoxy, isobutoxy, tertiobutoxy.
L'expression « alkyle » désigne les radicaux à chaîne linéaire ou ramifiée contenant jusqu'à 8 atomes de carbone. Parmi ces radicaux, on peut citer les radicaux méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle, isobutyle, sec-butyle, tert- butyle, pentyle, hexyle, heptyle, octyle.
L'expression « aryle » désigne, par exemple, un radical phényle éventuellement substitué par un ou plusieurs radicaux alcoyle, alcoxyle ou par un atome de chlore, de brome ou de fluor, ou un radical aromatique hétérocyclique à 5 ou 6 chaînons contenant 1 à 2 hétéroatomes tels que l'azote ou l'oxygène. Parmi ces radicaux aryles, on peut citer les radicaux phényle (o-, m-, ou p-), méthoxyphényle (3,4-, 2,6-, 2,3-), diméthoxyphényle (o-, m-, ou p-), tolyle, thiényle, pyridyle.
On peut obtenir plusieurs types de produits désignés de manière générale par la formule A-[Gn], dans laquelle A définit le type d'unité terminale et Gn définit le nombre de couches d'unités intermédiaires PI (correspondant au nombre de générations) : - la série des composés 2-[Gn] présente des unités terminales de formule III préférée, dans lesquelles X représente un atome d'hydrogène, p est égal à 2, R3 et i sont identiques et représentent des groupes éthyle, Z est un ion chlorure et n est un nombre entier compris entre 1 et 11 , de préférence entre 1 et 10 (voir la figure 3) ;
- la série des composés 3-[Gn] présente des unités terminales de formule III, dans lesquelles X est vide, p est égal à 2, R3 et sont identiques et représentent des groupes éthyle, Z est vide et n est un nombre entier compris entre 1 et 11, de préférence entre 1 et 10 (voir la figure 3) ; - la série des composés 4-[Gn] présente des unités terminales de formule III, dans lesquelles X représente un groupe méthyle, p est égal à 2, R3 et sont identiques et représentent des groupes éthyle, Z est un ion iodure et n est un nombre entier compris entre 1 et 1 1, de préférence entre 1 et 10 (voir la figure 3) ;
- la série des composés 5-[Gn] présente des unités terminales de formule III, dans lesquelles X représente un groupe méthyle, p est égal à 2, R3 et R4 sont identiques et représentent des groupes éthyle, Z est un groupe CH3COO" et n est un nombre entier compris entre 1 et 1 1, de préférence entre 1 et 10 (voir la figure 3).
- la série des composés l-[Gn] présente des unités terminales Cl et n est un nombre entier compris entre 1 et 1 1, de préférence entre 1 et 10 (voir la figure 3) (produits intermédiaires pour la préparation des dendrimères selon l'invention).
Les dendrimères phosphores polycationiques selon l'invention présentent un certain nombre d'avantages par rapport aux dendrimères de l'art antérieur utilisés comme vecteurs de gènes :
- ils sont isomoléculaires et sont de ce fait reproductibles (degré de pureté élevé),
- ils sont chargés, ce qui leur confère une affinité particulière vis-à- vis des acides nucléiques à transférer et donc une bonne qualité de transporteur,
- ils sont fonctionnalisables aussi bien en surface qu'au niveau des couches internes, - ils sont solubles dans l'eau sans dégradation dans une large gamme de pH (3 à 12) (stabilité en solution aqueuse pendant plusieurs mois). Ceci représente un net avantage par rapport aux dendrimères de type PAMAM qui doivent être dégra- dés thermiquement (étape peu reproductible) pour donner des composés actifs en transfection,
- ils sont peu cytotoxiques (viabilité des cellules transfectées supérieure à 80 %). Les dendrimères phosphores selon l' invention peuvent être obtenus, de manière reproductible, par croissance contrôlée de la structure dendnméπque par ajout de couches successives de motifs ou unités H2N-N(R )-P(S)C12 de formule VIII (exemple de produit de formule II). Le bloc ou noyau central de formule VII (voir figures 1 et 2) correspond à une unité hexachlorocyclotπphosphazene (C16N3P3) modifiée par le tπéthylammonium de 4-hydroxybenzaldéhyde Ce noyau, qui comprend 6 fonctions aldéhydes terminales, est mis en contact avec un dichlorophosphonoalkylhydrazide de formule VIII H N-N(Alk)-P(S)Cl pour produire un dendron comportant des unités terminales dichlorothiophosphine P(S)C12, qui peuvent être mises en contact à nouveau avec un sel de 4-hydroxybenzaldéhyde de formule VI, pour produire, par itération, chaque génération de dendrimères. Les lere, 2eme, 3eme, 4eme, et 5eme générations de dendπmère comprennent respectivement 6, 12, 24, 48 et 96 unités terminales Cl2, qui peuvent être traitées avec du N,N- dialkyléthylènediamine, pour produire des dendrimères cationiques après protonation 2-[Gι] à 2-[G5], conformément à la figure 3. Ces dendrimères phosphores polycationiques ont 12, 24, 48, 96 ou
192 charges positives périphériques respectivement pour les lere, 2eme, 3eme, 4eme, et 5 me générations de dendπmère.
Les formes méthylées (5-[Gι] à 5-[G5]) sont préparées à partir des aminés terminales neutres correspondantes (3-[Gι] à 3-[G5]) par une méthylation en présence d'iodure de méthyle, suivie d'un échanges lodures/acétates à l'aide d'une résine convenable (voir exemple 1)
La pureté et l'intégrité des dendrimères est vérifiées par une analyse spectrale (RMN Η, I3C et 31P)
Seulement 8 à 10 % des branches terminales des dendrimères méthylés (5-[Gι] à 5-[G5]) présentent un déficit en groupes méthyles
De manière plus précise, les dendrimères selon l'invention peuvent être préparés de la manière suivante (1) réaction d'un produit de formule V (aussi dénommé N3P3)
Figure imgf000009_0001
(V) dans lequel Ri représente un groupement comprenant une fonction aldéhyde, de formule VI *
(VI) pour obtenir un produit de formule VII * N3P (OCôH4CHO)6 comprenant 6 fonctions aldéhydes (couche centrale constituée d'un noyau P0 ; figure 3),
(2) réaction du produit de formule VII obtenu en (1) avec un dichlorophosphonohydrazide de formule VIII H2N-N(R2)-P(S)C12 pour produire un dendron de type l-[Gn] comportant des unités terminales Cl
(3) réitération des étapes (1) et (2) sur le produit obtenu en (2) pour produire un nombre n de couches intermédiaires , les lere, 2eme, 3eme, 4eme, et 5eme générations de dendπmère comprennent respectivement 6, 12, 24, 48 et 96 unités terminales Cl et
(4) traitement desdites unités terminales Cl avec du N,N-dιalkyl- éthylènediamine, pour produire des dendrimères canoniques selon l'invention après protonation.
La présente invention a également pour objet une composition capable d'agir comme agent de transfection d'une séquence d'acide nucléique vers une cellule eucaryote, caractérisée en ce qu'elle comprend un acide nucléique et un dendrimère phosphore polycationique tel que défini ci-dessus, couplé audit acide nucléique.
Selon un mode de réalisation avantageux de ladite composition, elle comprend en outre au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite composition, le rapport N/P, dans lequel N correspond aux groupes cationiques terminaux du dendrimère (aminés chargées) et P correspond aux groupes phosphates dudit acide nucléique, est compris entre 5 et 10.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite composi- tion, elle comprend en outre un agent de perméabilisation de la membrane capable de transporter ledit acide nucléique à travers les membranes cytoplasmiques ou endoso- males de ladite cellule eucaryote.
Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de ladite composition, ledit dendrimère phosphore polycationique est associé de manière non- covalente avec ledit acide nucléique.
De manière avantageuse, les dendrimères phosphores polycatio- niques selon l'invention, sélectionnés dans la série 2-[Gn] dans laquelle n = 3-5 sont particulièrement intéressants comme vecteurs de transfert d'acide nucléique, alors que les dendrimères de la série 5-[Gn] sont toxiques et relativement inefficaces dans la transfection d'acides nucléiques dans des cellules eucaryotes aussi bien en l'absence qu'en présence de sérum.
Ce phénomène est peut-être lié à une forte densité en charges positives stables, qui peuvent entraîner l'éclatement de la membrane cellulaire et conduire ainsi à une mort de la cellule. La diminution de la densité de charge n'est pas possible pour les produits alkylés sans dégradation des dendrimères, tandis que la densité de charge de la série 2-[Gn] peut être modulée par des modifications micro-environnementales du pH au niveau de la membrane cellulaire. De plus, la possibilité de moduler la densité de charge de cette série de dendrimères peut constituer un facteur clé dans la libération du gène transporté dans les endosomes. Ces dendrimères agissent ainsi peut-être comme un réservoir de protons dans les compartiments cellulaires, leur densité de charge étant contrôlée par les pompes à protons dépendant de l'ATPase et par des modifications de la concentration intracellulaire en chlorures. La possibilité de réduire la densité de charge cationique de ces dendrimères à l'extérieur et à l'intérieur des cellules devrait être favorables pour leur utilisation in vivo.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels :
- la figure 1 illustre la structure du noyau central P0 (N3P3) et un dendrimère selon l'invention de type 3-[G2] ;
- la figure 2 illustre un dendrimère selon l'invention de type 2-[G4] ; - la figure 3 illustre un procédé de préparation des dendrimères selon l'invention ;
- la figure 4 illustre les propriétés de transfert de gène des dendrimères de type 2-[Gn], en présence de sérum (parties droites des figures 4A et 4B) ou en l'absence de sérum (parties gauches des figures 4A et 4B) ; - la figure 5 illustre les propriétés de transfert de gène des dendrimères de type 5-[Gn], en présence de sérum (parties droites des figures 5 A et 5B) ou en l'absence de sérum (parties gauches des figures 5 A et 5B).
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
EXEMPLE 1 : Préparation des dendrimères selon l'invention.
- Méthodes générales et produits utilisés
Toutes les manipulations ont été réalisées par des techniques courantes dans des conditions sous vide poussé ou sous argon. Les spectres RMN du !H, du 31P et du 13C ont été enregistrés sur des spectrometres de la marque Brucker (AC80, AC200 et AC250). Les déplacements chimiques en RMN du 31P des réactifs sont exprimées en ppm par rapport à 85% de H P0 . La numérotation utilisée pour la RMN est détaillée sur la figure 1. Les dendrimères l-[Gn] ont été synthétisés selon les protocoles publiés (16, 17). Dans l'abréviation 1-[G„], le chiffre 1 correspond à un dendrimère avec des extrémités Cl, 2, 3, 4 ou 5 pour des extrémités -NH(Et)2 + Cl", -N(Et)2, -NMe(Et) + Y ou -NMe(Et)2 + OAc", respectivement et n correspond au nombre de générations du dendrimère (nombre de couches intermédiaires). L'iodure de méthyle et la N, N-diéthyléthylènediamine ont été fournis par Aldrich et la résine AG1-X8, au fort pouvoir échangeur d'anion, par Biorad.
- Procédures générales pour la synthèse des produits de type 2-[Gn]
De la N,N-diéthyléthylènediamine (n=l , 93μl, 0,66 mmol ; n=2, 71 μl, 0,5 mmol ; n=3, 68 μl, 0,48 mmol ; n=4, 61 μl, 0,43 mmol ; n=5, 60 μl,
0,42 mmol) a été ajoutée goutte à goutte, à la seringue, à une solution contenant
100 mg de dendrimère l -[Gn] (n=l , 55 μmol ; n=2, 21 μmol ; n=3, 10 μmol ; n=4,
4,5 μmol ; n=5, 2,2 μmol) dans 15 ml de THF distillé (THFΔ), sous forte agitation.
Après une nuit d'agitation à température ambiante (RT), le solvant a été éliminé par filtration. La poudre blanche obtenue a été lavée deux fois avec 20 ml de THF distillé et séchée par évaporation. Les protons produits pendant la réaction de couplage ont été piégés par les résidus aminés tertiaires terminaux, par conséquent les dendrimères 2-
[Gn] ont été obtenus sous forme de chlorures.
La première génération de dendrimère 2-[Gj] est obtenue avec un rendement de 80 %. Les données RMN sont les suivantes : 1p { lH} RMN (CD3OD): δ = 7.9 (P0), 69.6 (P]).
]H RMN (OUSO-d(,)→. δ = 1.3 (t, 3JHH = 6.3 Hz, 72 H, CH2CH3), 3.0-3.5 (m, 1 14 Η,
CΗ3-N-P] , CH2), 5.7 (br m, 12 H, N-H), 7.1 (d, JHH - 8.4 Hz, 12 H, C0 2-H), 7.9
(s, 6 H, CH=N), 7.9 (d, 3JHH - 8.4 Hz, 12 H, C0 3-H), 10.8 (br s, 12 H, +N-H). 1 3C { --H} RMN (CD3OD): δ = 9.7 (s, CH2CH3), 33.3 (d, 2JCp] = 10.3 Hz, CH3-N- Pj), 37.9 (s, CH2-N-P1 ), 49.5 (s, CΗ2CH3), 53.9 (d, 3JCP 1 = 6.2 Hz, CH2-CH2-N- Pj), 122.6 (s, C0 2), 129.8 (s, C0 3), 135.0 (s, C0 4), 139.3 (d, 3jcp ι = U.6 Hz, CH=N), 152.4 (d, 2JCP0 = 7.3 Hz, CQ 1 ). UV-vis (H2O): λmax (ε, M' 1 x cm" 1 ) 284 nm (1.2 x 105). Deuxième génération de dendrimère 2-[G ] (rendement = 95% ) : 1p { lH} RMN (CD3OD): δ = 8.5 (P0), 62.0 (Pj ), 69.6 (P2).
*H RMN (OMSO-d6): δ = 1.3 (br s, 144 H, CH2CH3), 3.0-3.6 (br m, 246 Η, CΗ3-N- pl,2> CH2), 5.6 (br m, 24 H, N-H), 7.0-7.4 (br m, 36 H, C0 2-H, C] -H), 7.7-8.2 (m, 54 H, CH=N, C0 3-H, Cj3-H), 10.7 (br s, 24 H, +N-H).
13C { *H} RMN (CD3OD): δ = 9.6 (s, CH2CH3), 33.0 (d, 2JCp2 = 10.6 Hz, CH3-N- P2), 34.2 (d, JCpι = 11.8 Hz, CH3-N-P1), 37.8 (s, CH2-N-P2), 49.2 (s, CH2CH3), 53.9 (d, 3Jcp2 = 6.3 Hz, CH2-CH2-N-P2), 122.8 (s, C0 2), 123.0 (d, 3 cp ι = 3.0 Hz, C]2), 129.7 (s, C]3), 130.0 (s, C0 3), 134.3 (s, C0 4), 135.0 (s, C]4), 139.1 (d, cp2 = 12.5 Hz, CH=N), 141.3 (d, 3J pι = 15.4 Hz, CH=N), 152.6 (d, 2JCpi = 7.3 Hz, C] !), 152.6 (s, CQ1). UV-vis (H2O): λmax (ε, M'1 x cm"1) 284 nm (3.1 x 105).
Troisième génération de dendrimère 2-[G3] (rendement = 95%) : 31P { 1H} RMN (CD3OD): δ = 8.6 (P0), 61.5 (Pj), 62.3 (P2), 69.5 (P3).
]H RMN (DMSO- 6): δ = 1.3 (br s, 288 H, CH2CH3), 3.0-3.5 (br m, 510 Η, CΗ3-N- p 1,2,3» CH2), 5.7 (br s, 48 H, N-H), 7.0-7.5 (br m, 84 H, C0 2-H, Cj2-H, C2 2-H), 7.7-8.2 (br m, 126 H, CH≈N, C0 3-H, C^-H, C 3-H), 10.8 (br s, 48 H, +N-H). 13C { ]H} RMN (CD3OD): δ = 9.6 (s, CH CH3), 33.1 (d, 2JCP3 = 9.4 Hz, CH3-N- P3), 34.2 (m, CH3-N-P1 >2), 37.6 (s, CH2-N-P3), 49.2 (s, H2CH3), 53.7 (d, 3 Cp3 = 6.3 Hz, CH2-CH2-N-P3), 123.2 (br s, C0 2, Cj2, C2 2), 129.6 (br s, C0 3, C]3, C2 3), 134.0 (s, C0 4, C]4), 134.8 (s, C2 4), 139.0 (br s, C2 4-CH=N), 141.4 (br s, CH=N), 152.4 (d, JCP2 = 7.3 Hz, C21), 152.8 (br s, CQ 1 , C] ]). UV-vis (H2O): λmax (ε, M"1 x cm" 1) 286 nm (7.3 x 105). Quatrième génération de dendrimère 2-[G4] (rendement = 95%) :
31p { lH} RMN (CD3OD): δ = 8.4 (P0), 62.0 (P1 2,3), 69.4 (P4). }H RMN (DMSO-c?6): δ = 1.3 (br s, 576 H, CH7CH3), 3.0-3.5 (m, 1038 Η, CΗ3-N- pl,2,3,4> CH2), 5.6 (br s, 96 H, N-H), 7.0-7.5 (br m, 180 H, CQ2-H, Cj2-H, C2 2-H, C32-H), 7.7-8.2 (m, 270 H, CH=N, C0 3-H, C^-H, C2 3-H, C3 3-H), 10.8 (br s, 96 H, +N-H). 13C {ÏH} RMN (CD3OD): δ = 9.7 (s, CH2CH3), 33.2 (d, JCP4 = 9.2 Hz, CH3-N- P4), 34.3 (d, 2JCp = 10.1 Hz, C^-N-Pi^), 37.7 (s, CH2-N-P4), 49.2 (s, CH2CH3), 53.8 (d, 3JCp4 = 5.5 Hz, CH2-CH2-N-P4), 123.1 (br s, C0 2, C]2, C2 2, C32), 129.7 (br s, C0 3, Ci3, C23, C33), 134.2 (s, C0 4, 4, C2 4), 134.9 (s, C34), 139.2 (br s, C3 4-CΗ=N), 141.5 (br s, CH=N), 152.5 (d, 3Jcp3 = 7.4 Hz, C31), 153.0 (br s, C0 1, Cι l , C2l ). UV-vis (H2O): λmax (ε, M"1 x cm" 1) 288 nm (1.7 x 106).'
Cinquième génération de dendrimère 2-fGs] (rendement = 95%) :
31p { lH} RMN (CD3OD): δ ≈ 62.0 (P] ,2,3,4). 69-3 (p5)- 1H RMN (DMSO-ύ?6): δ = 1.3 (br s, 1 152 H, CH2CH3), 2.9-3.5 (br m, 2094 H, CH3- N-pl,2,3,4,5> CH2), 5.6 (br s, 192 H, N-H), 7.0-7.5 (m, 372 H, C0 2-H, Cι2-H, C2 2- H, C3 2-H, C 2-H), 7.7-8.2 (m, 558 H, CH=N, C0 3-H, Cι3-H, C2 3-H, C3 3-H, C43-
H), 10.8 (br s, 192 H, +N-H).
13C { lU} RMN (CD3OD): δ = 9.7 (s, CH2CH3), 33.2 (br s, CH3-N-P5), 34.3 (br s, CH3-N-Pi;2j354), 37.8 (s, CH2-N-P5), 49.2 (s, CH2CH3), 53.8 (s, CH2-CH2-N-P5),
123.1 (br s, C0 2, Ci2, C2 2, C32, C42), 129.7 (br s, C0 3, Ci , C2 3, C33, C43), 134.2
(s, C0 4, C]4, C2 4, C34), 134.9 (s, C44), 139.2 (br s, C4 4-CH=N), 141.5 (br s,
CH=N), 152.5 (8, 04!), 153.0 (br s, C0 1, Cι 1, C 1 Y31).
UV-vis (H2O): λmax (ε, M"1 x cm" 1) 286 nm (3.3 x 106). - Procédures générales pour la synthèse des produits de type S-[Gn]
Une solution de soude normale (n=l, 372 ml, 0,37 mmol ; n=2, 312 ml, 0,31 mmol ; n=3, 288 ml, 0,29 mmol ; n=4, 288 ml, 0,28 mmol ; n=5, 288 ml, 0,28 mmol) a été ajoutée goutte à goutte à une solution contenant 100 mg de dendrimère 2-[Gn] dans 30 ml d'eau distillée (n=l, 31 mmol ; n=2, 13 mmol ; n=3, 6 mmol ; n=4, 3 mmol ; n=5, 1,5 mmol), sous agitation forte. Le précipité a été isolé par centri- fugation et dissous dans du chloroforme, puis la couche organique a été séchée sur du sulfate de sodium. Le produit est enfin filtré et séché par évaporation. Dendrimère 3-[Gj] (rendement = 80%) : 3 1P { !H} RMN (CDCI3): δ = 8.2 (P0), 68.3 (P-j).
!H RMN (CD2C12): δ = 0.9 (t, 3JHH = 7.0 Hz, 72 H, CH2CH3), 2.3-2.5 (m, 72 Η, CH2-N(CH -CΗ3)2), 2.9 (m, 24 H, CH2-N-Pι), 3.1 (d, 3JHPι = 9.4 Hz, 18 H, CH3- N-Pj), 4.0 (m, 12 H, N-H), 6.9 (d, 3JHH = 8-5 Hz, 12 H, C0 2-H), 7.5 (s, 6 H, CH=N), 7.5 (d, 3JHH = 8.5 Hz, 12 H, C0 3-H).
13C { JH} RMN (CDCI3): δ = 1 1.4 (s, CH2CH3), 30.5 (d, 2JCpι = 10.7 Hz, CH3-N- Pl), 38.4 (s, CH2-N-Pι), 46.3 (s, CH2CH3), 52.9 (d, 3J Pj = 7.8 Hz, CH -CH2-N- Pj), 120.8 (s, C0 2), 127.3 (s, C0 3), 132.7 (s, C0 4), 135.4 (d, 3 Cp ι = 12.5 Hz, CH=N), 150.4 (d, JCP0 = 5.1 Hz, CQ1 ).
Dendrimère 3-[G2] (rendement = 95%) : 1p { lH} RMN (CDCl3): δ *= 8.4 (P0), 62.9 (Pj), 68.1 (P2). lH NMR (CD2C1 ): δ = 0.9 (t, 3JHH - 7 Hz, 144 H, CH2CH3), 2.2-2.5 (m, 144 Η, CH2-N(CH2CΗ3)2), 2.9 (m, 48 H, CH2-N-P2), 3.0 (d, 3JHP2 = 9.2 Hz, 36 H, CH3- N-P2), 3.2 (d, 3jHp ι = 10 Hz, 18 H, CH3-N-P1), 4.0 (br m, 24 H, N-H), 6.9-7.1 (m, 36 H, C0 2-H, Cι2-H), 7.4-7.7 (m, 54 H, CH=N, C0 3-H, Cj3-H). 13C { iH} RMN (CDCI3): δ = 1 1.4 (s, CH2CH3), 30.6 (d, 2JCp2 = 10.8 Hz, CH3-N- P2), 32.9 (d, 2JCpι = 11.8 Hz, CH3-N-P , 38.3 (s, CH2-N-P2), 46.3 (s, CH2CH3), 52.9 (d, 3JCP2 = 7.8 Hz, CH2-CH2-N-P2), 121.1 (s, C0 2, Cj2), 127.4 (s, Ci3), 128.1 (s, C0 3), 132.0 (s, C0 4), 133.1 (s, Ci4), 135.1 (d, 3JCp = 12.4 Hz, CH=N), 138.6 (d, 3JCPι = 15.4 Hz, CH=N), 150.3 (d, 2JCpι = 7.3 Hz, Ci ]), 151.1 (s, CQ1)-
Dendrimère 3-[G3] (rendement = 95%) :
31p { lH} RMN (CDCI3): δ = 8.5 (P0), 62.9 (Pl j2), 68.1 (P3).
]H RMN (CD2C12): δ = 0.9 (t, 3JHH - 6.4 Hz, 288 H, CH2CH3), 2.2-2.5 (br m, 288 Η, CH2-N(CH2CΗ3)2), 2.9 (br m, 96 H, CH2-N-P3), 3.0 (d, 3JHP3 = 9.2 Hz, 72 H, CH3-N-P3), 3.2-3.4 (br m, 54 H, CH3-N-Pij2), 4.0 (br s, 48 H, N-H), 6.9-7.3 (br m, 84 H, C0 2-H, Cι2-H, C2 2-H), 7.4-7.7 (br m, 126 H, CH=N, C0 3-H, Cι3-H, C2 3-H). 13C { !H} RMN (CDCI3): δ = 1 1.4 (s, CH2CΗ3), 30.6 (d, 2JCP3 = 10.3 Hz, CH3-N- P3), 32.5 (d, JCP = 12.7 Hz, C^-N-Pj^), 38.4 (s, CH2-N-P3), 46.4 (s, CH2CH3), 53.0 (d, 3JCP3 = 7.9 Hz, CH2-CH2-N-P3), 121.4 (s, C0 2, Cj2, C2 2), 127.5 (s, C2 3), 128.2 (s, C0 3, Ci3), 132.0 (s, C0 4), 132.3 (s, Ci4), 133.1 (s, C2 4), 135.2 (d, 3JCP3 = 12.1 Hz, CH=N), 138.8 (d, 3J p ≈ 12.1 Hz, CH=N), 150.4 (d, 2JCP2 = 6.8 Hz, C2 ]),
151.2 (d, 2JCP = 6.3 Hz, Cn1, C] *).
Dendrimère 3-[G4] (rendement = 95%) : 3 1P { iH} RMN (CDCI3): δ = 8.4 (P0), 62.4 (Pi^), 68.0 (P ). lH RMN (CD2C12): δ = 0.8 (br s, 576 H, CH2CH3), 2.4 (br s, 576 Η, CH2- N(CH2CΗ3)2), 2.6-3.4 (br m, 462 H, CH3-N-Pij2j3)4, CH -N-P4), 4.0 (br m, 96 H, N-H), 7.0-7.7 (m, 450 H, C6H4, CH≈N).
13C { ! H} RMN (CDCI3): δ = 1 1.6 (s, CH2CH3), 30.6 (d, 2JCp4 ≈ 10.4 Hz, CH3-N- P4), 33.0 (d, JCP = 12.6 Hz, C^-N-P^), 38.5 (s, CH2-N-P4), 46.4 (s,
CΗ2CH3), 53.1 (d, 3JCP4 = 7.7 Hz, CΗ2-CH2-N-P4), 121.5 (s, C32), 121.8 (s, CQ2,
CI 2, C2 2), 127.5 (s, C33), 128.3 (s, C0 3, Cj3, C2 3), 132.2 (s, C0 4, C} 4, C2 4), 133.2
(s, C34), 135.1 (d, 3J p4 = 12.0 Hz, CH≈N), 138.7 (br s, CH≈N), 150.5 (d, 2Jcp =
7.4 Hz, C31), 151.3 (br m, CQ1 , C] ], C2 ]). Dendrimère 3-[Gs] (rendement = 95%) :
31P {iH} RMN (CDCI3): δ = 62.4 (Pl,2,3,4), 68.0 (P5).
*H NMR (CD2Cl2): δ = 1.0 (br s, 1 152 H, CH2CH3), 2.4 (br s, 1 152 Η, CH2- N(CH2CΗ3)2), 2.7-3.5 (br m, 942 H, CH3-N-Pi;2,3,4,5, CH2-N-P5), 4.1 (m, 192 H, N-H), 7.0-7.8 (m, 930 H, C6H4, CH≈N). 13C { iH} RMN (CDCI3): δ ≈ 11.5 (s, CH2CH3), 30.5 (d, 2JCP5 = H . l Hz, CH3-N- P5), 33.0 (d, 2JCp = 12.3 Hz, CH3-N-P 1^3,4), 38.4 (s, CH2-N-P5), 49.4 (s,
CH2CH3), 53.0 (d, 3JCP5 = 8.1 Hz, CH2-CH2-N-P5), 121.4 (s, C42), 121.7 (s, Q)2,
Ci2, C2 2», C32), 127.4 (s, C43), 128.1 (s, C0 3, Ci3, C2 3, C33), 132.1 (s, C0 4, Ci4,
C2 4, C34), 133.1 (s, C44), 135.1 (d, 3JCP5 = 12.1 Hz, CH≈N), 138.7 (br s, CH≈N), 150.5 (d, 2JCP3 = 6.6 Hz, C41), 151.2 (d, 2J p = 6.2 Hz, CQ1 , CI 1 , C-21, C31).
- Procédures générales pour la synthèse des produits de type 4-[Gn] Une solution comprenant 100 mg de dendrimères neutres 3-[Gn] (n≈l, 36 mmol ; n≈2, 15 mmol ; n=3, 7 mmol ; n≈4, 3,3 mmol ; n=5, 1,6 mmol) et de l'iodure de méthyle (n≈l, 27 μl, 0,43 mmol ; n=2, 22 μl, 0,36 mmol ; n=3, 21 μl, 0,34 mmol ; n=4, 20 μl, 0,32 mmol ; n=5, 19 μl, 0,31 mmol) dans 15 ml de DMF a été agitée toute la nuit à température ambiante. La solution a été séchée par évaporation. La pâte obtenue a été lavée avec 20 ml d'un mélange pentane/éther (1/1, v/v) pour obtenir une poudre jaune de dendrimères méthylés dénommés 4-[Gn]. Dendrimère 4-[Gj] (rendement = 90%) : 3 1P { JH} RMN (DMSO-^6): δ = 7.3 (P0), 68.1 (?]).
]H RMN (OMSO-d6): δ = 1.3 (t, 3JHH ≈ 6.4 Hz, 72 H, CH2CH3), 3.1 (s, 36 Η, +N- CΗ3), 3.2 (d, 3JHP1 = 10.4 Hz, 18 H, CH3-N-P1), 3.3-3.7 (br s, 96 H, CH2), 5.5 (br m, 12 H, N-H), 7.1 (d, 3JHH = 8.1 Hz, 12 H, C0 2-H), 8.0 (s, 6 H, CH=N), 8.0 (d, 3JHH = 8.1 Hz, 12 H, Co3-H). 13C { JH} RMN (OMSO-d6): δ = 7.8 (s, CH CH3), 32.6 (d, 2JCPι = 9.5 Hz, CH3-N-
Pl), 34.9 (s, CH -N-Pj), 47.3 (s, +N-CH3), 56.4 (s, CH2CH3), 58.8 (s, CH2-CH2-N-
Pl), 120.7 (s, C0 2), 128.3 (s, C0 3), 133.2 (s, C0 4), 137.4 (d, 3JCP1 = 14.2 Hz,
CH≈N), 149.9 (s, CQ1).
Dendrimère 4-[G2] (rendement quantitatif) : 31P { 1H} RMN (DMSO-d6): δ = 7.3 (P0), 61.7 (Pj), 68.1 (P2).
]H RMN (DMSO-^6): δ = 1.3 (t, 3JHH = 6.2 Hz, 144 H, CH2CH3), 3.1 (s, 72 Η, +N- CΗ3), 3.2-3.6 (m, 246 H, CH3-N-P1 2, CH2), 5.7 (br s, 24 H, N-H), 7.0-7.4 (m, 36 H, C0 2-H, Cι2-H), 7.7-8.2 (m, 54 H, CH≈N, C0 3-H, Cι3-H).
13C { JH} RMN (DMSO-^6): ≈ 7.8 (s, CH2CH3), 32.2 (d, 2JCp2 = 8.9 Hz, CH3-N-
P2), 33.5 (d, 2Jcpi = 12.9 Hz, CH3-N-P1), 34.9 (s, CH2-N-P2), 47.3 (s, +N-CH3),
56.4 (s, H2CH3), 58.8 (d, 3JCp2 = 3.3 Hz, CH -CH2-N-P2), 121.3 (s, Ci2, C0 2), 128.2 (s, C}3), 128.6 (s, C0 3), 132.3 (s, C0 4), 133.2 (s, Ci4), 137.1 (d, 3JCP2 ≈ 12.3
Hz, CH≈N), 140.7 (br s, CH≈N), 150.1 (d, 2JCPι = 6 Hz, Ci 1), 150.5 (s, CQ1 ). Dendrimère 4-[G3] (rendement quantitatif) :
31p {lH} RMN (OMSO-d6): δ = 6.9 (P0), 61.9 (P1 >2), 68.1 (P3).
ÎH RMN (DMSO- ): δ = 1.3 (br s, 288 H, CH2CH3), 3.1 (s, 144 Η, +N-CΗ3), 3.1- 3.6 (m, 510 H, CH3-N-Pl j2j3, CH2), 5.5 (br s, 48 H, N-H), 7.0-7.4 (m, 84 H, C0 2-H,
Cι2-H, C2 2-H), 7.7-8.2 (m, 126 H, CH≈N, C0 3-H, Cι3-H, C2 3-H).
13C { !H} RMN (OMSO-d6): δ ≈ 7.7 (s, CH2CH3), 32.2 (d, 2JCp3 = 9.4 Hz, CH3-N-
P3), 33.5 (m, CH3-N-Pi52), 34.9 (s, CH2-N-P3), 47.3 (s, +N-CH3), 56.4 (s,
CH2CH3), 58.8 (d, 3Jcp3 = 4.8 Hz, CH2-CH2-N-P3), 121.0 (br s, C0 2, Ci2, C2 2), 128.5 (br s, C0 3, Ci3, C2 3), 132.3 (s, C0 4, Ci4), 133.2 (s, C2 4), 137.1 (d, 3JCP3 =
12.1 Hz, CH≈N), 141.0 (br s, CH≈N), 150.1 (d, 2JCP2 ≈ 6.2 Hz, C21), 150.7 (br s,
Figure imgf000018_0001
Dendrimère 4-[G ] (rendement quantitatif) :
3 1P { ÎH} RMN DMSO-d6): δ = 6.3 (P0), 61.6 (Pι>2j3), 68.0 (P4). JH RMN (OMSO-d6): δ ≈ 1.3 (br s, 576 H, CH2CH3), 3.1 (s, 288 H, +N-CH3), 3.1- 3.6 (m, 1038 H, CH3-N-P1 >2s3j4, CH2), 5.5 (br s, 96 H, N-H), 7.1-8.5 (m, 450 H, C6H4, CH≈N).
13C { ]H} RMN (DMSO-d6): δ = 7.8 (s, CH2CΗ3), 32.2 (d, 2JCP4 = 9.5 Hz, CH3-N-
P4), 33.6 (d, 2JCP = 7.6 Hz, CH3-N-P1 j2j3), 34.9 (s, CH2-N-P4), 47.3 (s, +N-CH3), 56.4 (s, CH2CH3), 58.7 (d, 3JCP4 ≈ 4.8 Hz, CΗ -CH2-N-P4), 121.2 (br s, CQ2, Cj2, C2 2, C32), 128.2 (br s, C0 3, Ci3, C2 3 , C33), 132.2 (s, C0 4, Cj4, C2 4), 133.2 (s,
C34), 137.1 (d, 3JCP4 ≈ 9.4 Hz, CH≈N), 140.8 (br s, CH≈N), 150.0 (d, 2JCp2 = 6.2
HZY31), 150.7 (br s, C0 1, Cι 1, C2l).
Dendrimère 4-[G5] (rendement quantitatif) : 3 1P { JH} RMN (DMSO- 6): δ = 61.6 (P j253;4), 68.0 (P5).
!H RMN (DMSO-^6): δ = 1.3 (br s, 1152 H, CH2CH3), 3.1 (s, 576 Η, +N-CΗ3), 3.1- 3.6 (m, 2094 H, CT^-N-Pi^^, CH2), 5.4 (m, 192 H, N-H), 7.2-8.5 (m, 930 H, C6H4 , CH≈N).
13C { JH} RMN (OMSO-d6): δ = 7.8 (s, CH2CH3), 32.3 (br s, CH3-N-P5), 33.5 (br s, CH3-N-Pι?2)3j4), 34.9 (s, CH2-N-P5), 47.3 (s, +N-CH3), 56.4 (s, CH2CH ), 58.8 (d,
3JCp = 5.0 Hz, CH2-CH2-N-P5), 121.3 (br s, C0 2, Ci2, C2 2, C32, C42), 128.2 (br s,
C0 3, Ci3, C2 3, C33, C43), 132.2 (s, C0 4, Ci4, C2 4, C34), 133.2 (s, C44), 137.2 (d,
3JCP4 = 9.7 Hz, CH≈N), 141.2 (br s, CH≈N), 150.1 (d, 2JCP2 = 6.0 Hz, C4 ] ), 150.7
(br s, C0 1, Cι 1, C2l, C3 l). - Procédures générales pour la synthèse des produits de type 5-[G,
La résine à fort pouvoir échangeur d'anions AG1-X8 a été ajoutée à une suspension de 100 mg de dendrimères méthylés 4-[Gn], (sous forme d'iodures), (n≈l, 22 μmol ; n=2, 10 μmol ; n=3, 4,7 μmol ; n≈4, 21 μmol ; n=5, 1 ,1 μmol) dans l'eau distillée (n≈l, 25 ml ; n≈2, 23 ml ; n=3, 22 ml ; n=4, 21 ml ; n=5 ; 20 ml), dans les proportions indiquées (n≈l, 1,24 g ; n=2, 1,13 g ; n=3, 1,06 g ; n=4, 1,03 g ; n=5, 1 g) et mélangée doucement pendant une heure. La pâte obtenue a été lavée avec 20 ml d'un mélange pentane/ether (1/1, v/v) pour obtenir une poudre blanche de dendrimères méthylés, sous forme acétate, dénommés 5-[G„]. 8 à 10 % des ramifications terminales sont modifiées lors de l'échange de contre-ions avec la résine et ont été provisoirement attribués à une forme deméthylée puisque les résultats de RMN étaient identiques à ceux des dendrimères neutres portant des aminés tertiaires (3-[Gn]. Ces ramifications terminales mineures ont été indiquées par une astérisque dans les résultats de RMN présentés ci-dessous et les rendements correspondent à ceux du dendrimère total.
Dendrimère 5-[Gj] (rendement ≈ 90%) :
31p { lH} RMN (CD3OD): δ = 7.8 (P0), 69.8 (?ι*), 70.3 (Pj). H RMN (OMSO-d6): δ ≈ 1.0 (t, 3JHH = 6.9 Hz, 6 H, CH2CH3*), 1.3 (t, 3JΗΗ = 6.5
Hz, 66 H, CH2CH3), 1.7 (s, 33 Η, CΗ3COO-), 2.5 (m, 6 H, CH *-N(CH2*CH3)2),
3.1 (s, 33 H, +N-CH3), 3.2 (d, 3JHPj = 8.3 Hz, 18 H, CH3-N-Pj), 3.3-3.7 (m, 90 H,
CH2), 7.1 (d, 3JHH = 8.3 Hz, 12 H, C0 2-H), 7.6 (b, 12 H, N-H), 7.8 (s, 6 H, CH≈N),
7.8 (d, 3 HH ≈ 8.3 Hz, 12 H, C0 3-H). 13C { JH} RMN (OMSO-d6): δ = 7.6 (s, CH7CH3), 1 1.9 (s, CH2C*H3), 25.6 (s, CH3COO-), 32.2 (d, 2JCP 1 = 9.5 Hz, CH3-N-P1), 38.8 (s, CH2-N-Pι), 46.6 (s, C*H2CH3), 47.0 (s, +N-CH3), 54.5 (s, C*H2-CH2-N-Pι), 56.2 (s, CH2CH3), 59.1 (d, 3JCPi = 5.3 Hz, CΗ2-CH2-N-P}), 120.6 (s, C0 2), 127.9 (s, C0 3), 133.7 (s, C0 4), 135.8 (d, 2JCP0 = 10.8 Hz, CH≈N), 149.8 (s, CQ1 ), 173.7 (s, CH3COO-). UV-vis (H2O): λmax (ε, M"1 x cm"1) 284 nm (1.2 x 105).
Dendrimère 5-[G2] (rendement = 95%) : 1P { iH} RMN (CD3OD): δ = 8.4 (P0), 62.3 (Pj), 69.5 (P2*), 70.1 (P2). ]H NMR (OMSO-d6): δ = 1.0 (br t, 12 H, CH2CH3*), 1.3 (br s, 132 Η, CΗ2CH3), 1.7 (s, 66 Η, CΗ3COO-), 2.5 (br m, 12 H, CH2*-N(CH2*CH3)2), 3.1 (s, 66 H, +N- CH3), 3.2-3.6 (m, 234 H, C^-N-P^, CH2), 7.1-7.3 (br m, 36 H, CQ2-H, Cι2-H), 7.6 (br s, 24 H, N-H), 7.7 (s, 12 H, CH≈N), 7.8-8.1 (br m, 42 H, CH≈N, C0 3-H,
Figure imgf000020_0001
H). 13C {]H} RMN DMSO-d6): δ = 7.6 (s, CH2CH3), 1 1.9 (s, CH2C*H3), 25.6 (s,
CΗ3COO-), 32.1 (d, 2JCP2 = 9.3 Hz, CH3-N-P2), 33.2 (d, 2Jcpι = 13.4 Hz, CH3-N- Pi), 35.0 (s, CH2-N-P2), 46.6 (s, C*H2CH3), 47.0 (s, +N-CH3), 54.5 (s, C*H2-CH2- N-P ), 56.2 (s, CH2CH3), 59.1 (d, 3JCp2 = 5.3 Hz, CH2-CH2-N-P2), 121.3 (s, C0 2, Ci2), 127.9 (s, Ci3), 128.5 (s, C0 3), 132.3 (s, C0 4), 133.8 (s, Ci4), 135.7 (br s, CH≈N), 149.8 (d, 2JCpι = 6.5 Hz, Ci 1), 150.7 (s, CQ1 ), 173.7 (s, CH3COO-). UV-vis (H2O): λmax (ε, M"1 x cm'1) 284 nm (4.1 x 105). Dendrimère 5-[G3] (rendement = 95%) : 1p { lH} RMN (CD3OD): δ = 8.4 (P0), 62.3 (Pij2), 69.5 (P3*), 70.1 (P3). !H RMN (DMSO-dβ): δ = 1.0 (br t, 30 H, CH2CH3*), 1.3 (br s, 258 Η, CΗ2CH3), 1.7 (s, 129 Η, CΗ3COO-), 2.5 (br m, 30 H, CH?*-N(CH2*CH3)2), 3.1 (s, 129 H, +N- CH3), 3.1-3.6 (m, 480 H, C^-N-Pj^, CH2), 7.1-7.5 (br m, 108 H, CQ2-H, Cι2-H, C2 2-H, N-H), 7.5-8.1 (br m, 126 H, CH≈N, C0 3-H, Cι3-H, C2 3-H).
13C { !H} RMN (DMSO-tf6): δ = 7.6 (s, CH2CH3), 1 1.9 (s, CH2C*H3), 25.2 (s, CH3COO-), 32.1 (d, 2JCP3 = 9.0 Hz, CH3-N-P3), 33.2 (br m, C^-N-P^), 35.0 (s, CH2-N-P3), 46.6 (s, C*H2CH3), 47.1 (s, +N-CH3), 54.5 (s, C*H -CH2-N-P3), 56.3 (s, CH CH3), 59.1 (d, 3JCP3 = 5.7 Hz, CH2-CH2-N-P3), 121.3 (br s, C0 2, C\2, C2 2), 128.0 (s, C2 3), 128.5 (s, C0 3, Ci3), 132.4 (s, C0 4, Ci4), 133.8 (s, C2 4), 136.3 (br d, C2 4- H≈N), 141.0 (br m, CH≈N), 150.1 (d, 2JCP2 ≈ 6.3 Hz, C2 ]), 151.0 (d, 2JCp = 7.1 Hz, CQ 1 , Cj ]), 173.7 (s, CH3COO-). UV-vis (H2O): λmax (ε, M"1 x cm'1) 286 nm (7.4 x 105). Dendrimère 5-[G4] (rendement = 95%) : 3 1P H} RMN (CD3OD): δ ≈ 8.2 (P0), 62.2 (Pj^), 69.9 (P4).
]H RMN (OMSO-d6): δ ≈ 1.0 (br m, 60 H, CH2CH3*), 1.3 (br s, 516 Η, CΗ2CH3), 1.7 (s, 258 Η, CΗ3COO-), 2.5 (m, 60 H, CH2*-N(CH2*CH3)2), 3.1 (s, 258 H, +N- CH3), 3.1-3.6 (m, 978 H, CYL N-P 1 ^,3,4, CH2), 7.0-8.2 (m, 546 H, C6H4, CH≈N, N-H). ] c { iH} RMN (OMSO-d6): δ = 7.6 (s, CH2CH3), 1 1.9 (s, CH2C*H3), 24.7 (s, CH3COO-), 32.1 (d, 2JCp4 = 9.6 Hz, CH3-N-P4), 33.2 (d, 2JCp = 1 1.2 Hz, CH3-N- p 1 ,2,3). 35-° (s > CH2-N-P4), 46.6 (s, C*H2CH3), 47.0 (s, +N-CH3), 54.5 (d, 3JCP4 ≈ 3.9 Hz, C*H2-CH2-N-P4), 56.3 (s, CH2CH3), 59.2 (d, 3JCP4 = 5.7 Hz, CH2-CH2-N- P4), 121.2 (s, C32), 121.6 (s, C0 2, Cj2, C2 2), 127.9 (s, C33), 128.5 (s, C0 3, Cj 3, C 3), 132.3 (s, Co4, C} 4, C2 4), 133.7 (s, C34), 135.8 (br s, C3 4-CH=N), 141.0 (br s, CH≈N), 149.9 (d, JCP3 = 6.3 Hz, C31), 151.0 (br m, CfΛCi 1 , C2 1), 173.7 (s, CH3COO-).
UV-vis (H20): λmax (ε, M"1 x cm"1 ) 288 nm (1.6 x 106). Dendrimère 5-[G5] (rendement = 95%) : 31p { 1H} RMN (DMSO-rf6): δ ≈ 62.2 (Pi ^3,4), 69.9 (P5).
1H RMN (DMSO-^6): δ ≈ 1.0 (m, 1 14 H, CH2CH3*), 1.3 (m, 1038 Η, CΗ2CH3), 1.7
(s, 519 Η, CΗ3COO-), 2.5 (m, 1 14 H, CH *-N(CH2*CH3)2), 3.1 (s, 519 H, +N- CH3), 3.1-3.6 (m, 1980 H, C^-N-Pi^^, CH2), 7.0-8.2 (m, 1 122 H, C6H4, CH≈N, N-H). 13C { iH} RMN (DMSO-rf6): δ ≈ 7.6 (s, CH2CH3), 1 1.9 (s, CH2C*H3), 24.7 (s,
CH3COO-), 32.1 (d, 2JCP5 = 9.6 Hz, CH3-N-P5), 33.2 (d, 2Jcp = 1 1.2 Hz, CH3-N- pl ,2,3,4)» 35.0 (s, CH2-N-P5), 46.6 (s, C*H2CH3), 47.0 (s, +N-CH3), 54.5 (d, 3JCP5 = 3.9 Hz, C*H2-CH2-N-P5), 56.3 (s, CH2CH3), 59.2 (d, 3JCP5 = 5.7 Hz, CH -CH2- N-P5), 121.2 (s, C0 2, Ci2, C2 2, C32, C42), 127.9 (s, C43), 128.5 (s, C0 3, Ci3, C2 , C33), 132.3 (s, C0 4, Cj4, C2 4, C34), 133.7 (s, C44), 135.9 (br s, C4 4-CH=N), 141.0 (br s, CH≈N), 149.9 (d, 2JCP3 = 6.5 Hz, C41), 151.0 (br m, CQ 1 , C\ 1, C2 l , C31), 173.7 (s, CH3COO-). UV-vis (H2O): λmax (ε, M" 1 x cm" 1) 284 nm (3.7 x 106).
EXEMPLE 2 : Expériences de transfection. Les résultats obtenus avec ces différents dendrimères phosphores polycationiques ont toujours montré une efficacité optimale avec un rapport de charges N/P compris entre 5 (figure 4) et 10 (figure 5) (rapport N/P=nombre d'atomes d'azote terminaux du dendrimère par phosphate de l'ADN). Ainsi, il a été décidé, de façon arbitraire, de comparer l'efficacité de transfection de différentes générations de dendrimères phosphores (P-dendrimères) avec celle du PEI linéaire ExGen 500, possédant 5 à 10 équivalents aminés par nucléotide.
Avec 5 équivalents de charges positives par phosphate de l'ADN, les 5 différentes générations de dendrimères protonés de type 2-[Gn], testés sous forme de chlorhydrates, ont permis d'obtenir une expression significative du transgène. Une augmentation de 105 à presque 109 unités relatives de luminescence (RLU)/mg de protéine a été observée. L'efficacité de transfection augmente avec la taille du dendrimère (nombre de génération) mais atteint un plateau à partir de la troisième génération, avec des valeurs comprises entre 108 et 109 RLU (Fig. 4). Par conséquent, 2-[G4] a été choisi pour étudier plus en détail l'efficacité de transfection de ces nouveaux dendrimères cationiques phosphores, dont la structure est présentée sur la figure 2.
Il faut remarquer que les transfections effectuées en présence de sérum conduisent à une plus faible toxicité. De ce fait, un niveau d'expression plus élevé est observé pour les transfections effectuées en présence de sérum par rapport à celles effectuées sans sérum (Fig. 4A et 4B), panneaux droits et gauches, respective- ment).
Sans essayer d'optimiser davantage leurs conditions de transfection, les dendrimères de la troisième à la cinquième génération se sont révélés aussi efficaces que le PEI linéaire utilisé en conditions optimales.
En revanche, les formes méthylées 5-[Gn] se sont montrées plutôt toxiques et peu efficaces pour transfecter des acides nucléiques dans des cellules eucaryotes (Fig 5A et 5B). Ce phénomène peut s'expliquer du fait d'une densité de charge positive stable qui peut perturber la membrane cellulaire et provoquer la mort cellulaire. La diminution de la densité de charge des formes méthylées n'est pas réalisable sans dégrader le dendrimère, en revanche la densité de charge des dérivés chlorures (2-[Gn]) peut être modulée par des modifications micro-environnementales du pH lorsqu'ils approchent la membrane cellulaire. De plus, la possibilité de moduler la densité de charge des dérivés chlorures des dendrimères pourrait jouer un rôle clé dans le relargage du gène luciférase à partir de l'endosome. Ces dendrimères se comportent peut-être comme des réservoirs à protons dans les compartiments cellulaires, leur densité de charge étant contrôlée d'une part par des pompes à protons couplées à des ATPases, et d'autre part par des modifications intracellulaires de la concentration en chlorures. La possibilité de réduire la densité de charge cationique de ces dendrimères phosphores, à l'intérieur ou à l'extérieur des cellules, serait un avantage pour la réalisation d'expériences in vivo, comme cité précédemment (26).
- Produits chimiques
Le PEI linéaire de 22 kDa (ExGen 500) a été fourni par Euromedex (Souffelweyersheim, France).
- Lignées et culture cellulaires.
Les fibroblastes murins NIH3T proviennent de l'ATCC (Rockville, MA, USA) et sont cultivés en milieu Dulbecco modifié par Eagle (DMEM). Les milieux de culture sont supplémentés avec 10 % de sérum de veau fœtal (D. Dutscher, Brunath, France), 2 mM de L-glutamine (Gibco-BRL), 100 unités/ml de pénicilline (Gibco-BRL) et 100 μg/ml de streptomycine (Gibco-BRL). Les cellules sont maintenues à 37°C, en atmosphère humide contenant 5 % de CO . Lorsque les cellules atteignent 80 % de confluence, elles sont décollées par une solution saline de trypsine- EDTA (Gibco-BRL), diluées d'un facteur dix et cultivées dans un nouveau flacon. - Plasmides
PCMV-luc, codant pour la luciférase de Photinus pyralis, sous le contrôle des séquences promoteur/enhanceur du cytomégalovirus ont été gracieusement fournies par le Dr. M. Scarpa (CRIBI, padoue, Italie). Les plasmides ont été purifiés sur des colonnes Qiagen (Rockford, USA) à partir de la souche XL1 d'E. Coli transformée.
- Transfection .des cellules
Les cellules adhérentes ont été ensemencées dans des plaques à 24 puits (Costar, D. Dutscher, France), la veille de la transfection, de façon à atteindre 60 à 70 % de confluence le jour de la transfection. Toutes les expériences ont été réalisées en triple. Les cellules ont été rincées avant la transfection et 1 ml de milieu avec ou sans sérum a été ajouté dans chaque puits. 2 μg de plasmide (solution à 1,5 mg/ml dans un tampon 10 mM Tris-1 mM EDTA, pH 7,4) ont été dilués dans 50 μl de NaC1 0,15 M.
Le rapport N/P (azote/phosphate) correspond à la quantité de polymère nécessaire pour avoir un résidu aminé (43Da=poids moléculaire moyen (Mw) pour le PEI ; pour les dendrimères la molarité en azote des résidus aminés a été calculée en divisant le Mw par le nombre de charges pour chaque génération) par phosphate d'acide nucléique (M 330) (12). La quantité nécessaire de PEI linéaire (ExGen500) et de dendrimères (à partir de solutions stock de PEI et de dendrimères correspondant à 10 mM d'azote, sous forme aminé, dans l'eau MilliQ stérile) a été diluée dans 50 μl de NaCl 0, 15 M, vortexee doucement et centrifugée. Après 15 min, le vecteur cationique a été ajouté, en une seule fois, à la solution de plasmide [et pas dans l'ordre inverse, (12)] puis le mélange a été vortexé et centrifugé. Les quantités et les volumes indiqués ci-dessus correspondent à un puits et ont en fait été multipliés par trois et distribués dans trois puits. Après 10 min, le mélange a été ajouté sur les cellules et le surnageant a été réparti de façon homogène par une légère rotation manuelle horizontale. Tout de suite après, la plaque de culture a été centrifugée (Sigma 3K10, Bioblok, France), pendant 5 min à 1500 rpm (280 g). Après 2 à 3 heures d'incubation, 1 10 μl de sérum de veau foetal a été ajouté aux puits sans sérum. Les cellules ont été cultivées pendant 24 h, puis l'expression du gène rapporteur a été testée. - Mesure de la luciférase
L'expression du gène luciférase a été mesurée par luminescence. Le milieu de culture a été enlevé et le lysat cellulaire a été récolté après incubation, pendant 30 min, à température ambiante dans le tampon de lyse lx (Promega, USA). Le lysat a été vortexé doucement et centrifugé à 140 000 rpm (17 530 g), pendant 5 min, à 4°C. 20 μl de lysat ont été dilués dans 100 μl de tampon de réaction luciférase (Proméga, USA) et la luminescence a été mesurée pendant 10 sec (Mediators PhL, Vienne, Autriche). Les résultats ont été exprimés en unité de luminescence par mg de protéine (mesure par le test BCA, Pierce). EXEMPLE 3 : Pourcentages de viabilité des cellules transfectées conformément à l'exemple 2.
Figure imgf000026_0001
PEI linéaire : 5 équivalents : 69 ; 10 équivalents : 84 PEI réticulé : 5 équivalents : 102 ; 10 équivalents : 91
REFERENCES
[1] A. D. Miller, Nature 1992, 357, 455-460. [2] J. M. Wilson, New Engl. J. Med. 1996, 334, 1185-1 187. [3] P. Briand, A. Kahn, Path. Biol. 1993, 41, 663-671.
[4] B. Y. Roessler, J. W. Hartman, D. K. Vallance, Y. M. Latta, J. L. Janich , B. L.
Davidson, Hum. Gène. Ther. 1995, 6, 307-316. [5] C. J. Wheeler, J. H. Felgner, Y. J. Tsai, J. Marshal, L. Sukhu, S. G. Doh, J.
Hartikka, J. Νietsupski, M. Manthorpe, M. Νichols, M. Plewe, X. Liang, J. Norman, A. Smith, S. H. Cheng, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, 1 1454-
1 1459. [6] J. P. Behr, Bioconjugate Chem. 1994, 5, 382-389. [7] J. P. Vigneron, N. Oudrhiri, M. Fauquet, L. Vergely, J. C. Bradley, M. Bassville,
P. Lehn, J. M. Lehn, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, 9682-9686. [8] G. Byk, C. Dubertret, V. Escriou, M. Frédéric, G. Jaslin, R. Rangara, B. Pitard,
J. Crouzet, P. Wils, B. Schwartz, D. Scherman, J. Med. Chem. 1998, 41, 224-
235. [9] A. W. Miller, Angew. Chem. Inter. Ed. Engl. 1998, 37, 1768-1785. [10] T. Hara, Y. Tan, L. Huang, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94, 14547-14552. [1 1] I. Koltover, T. Salditt, J. O. Radier, C. R. Safinya Science 1998, 281, 78-81. [12] O. Boussif, M. A. Zanta, A. Adib, J. P. Behr, Gène Ther. 1996, 3, 1074-1080. [13] J. Haensler, F. C. Szoka, Bioconjugate Chem. 1993, 4, 372-379. [14] A. Bielinska, J. F. Kukowska-Latallo, J. Johnson, D. A. Tomalia, J. R. Baker, Nucleic Acids Res. 1996, 24, 2176-2182. [15] M. X. Tang, C. T. Redemann, F. C. Szoka, Bioconjugate Chem. 1996, 7, 703-
714. [16] N. Launay, A. M. Caminade, R. Lahana, J. P. Majorai, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1994, 33, 1589-1592.
[17] N. Launay, A. M. Caminade, J. P. Majorai, J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 3282-
3283. [18] C. Galliot, C. Larré, A. M. Caminade, J. P. Majorai, Science 1997, 277, 1981- 1984. [19] C. Larré, B. Donnadieu, A. M. Caminade, J. P. Majorai, J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 4029-4030. [20] D. A. Tomalia, H. D Durst, Topics Cuir. Chem. 1993, 165, 193-313. [21] F. Zeng, S. C. Zimmerman, Chem. Rev. 1997, 97, 1681-1712. [22] K. W. Pollak, J. W. Léon, J. M. J. Fréchet, M. Maskus, H. D. Abruna, Chem. Mater. 1998, 10, 30-38.
[23] E. Wagner, M. Cotten, R. Foisner, M. L. Birnstiel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
1991, 88, 4255-4259. [24] E. Wagner, C. Plank, K. Zatloukal, M. Cotten, M. L. Birnstiel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89, 7934-7938. [25] J. F. Kukowska-Latallo, A. U. Bielinska, J. Johnson, R. Spindler, D. A. Tomalia, J. R. Baker, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, 4897-4902. [26] J. S. Remy, A. Kichler, V. Mordinov, F. Schuber, J. P. Behr, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 1995, 92, 1744-1748. [27] Demande Internationale PCT WO 95/02397. [28] D. Prévôté et al., J. Org. Chem., 1997, t52, 14, 4834-4841.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en œuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.

Claims

REVENDICATIONS
1°) Dendrimères phosphores polycationiques, caractérisés en ce qu'ils sont constitués :
- d'une couche centrale sous la forme d'un noyau central P0 compre- nant 2 à 8 groupements fonctionnalisés,
- de n couches intermédiaires, identiques ou différentes, chacune desdites couches intermédiaires étant constituée d'unités Pi répondant à la formule II :
L— M — C ≈ N — N — P / I I II (II)
R, R2 E
dans laquelle :
L est un atome d'oxygène, de phosphore ou de soufre, M représente l'un des groupes suivants :
• un groupe aromatique di-, tri- ou tétrasubstitué par des groupes alkylés, des groupes alcoxy, des groupements insaturés du type oléfinique en C,-Cι2, azoïque, acétylènique, tous ces groupes pouvant incorporer ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, d'azote, de soufre ou des halogènes, ou
• un groupe alkyle ou alcoxy comportant plusieurs substituant tels que définis lorsque M est un groupe aromatique,
Rj et R2, qui peuvent être identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou l'un des groupes suivants : alkyle, alcoxy, aryle, comportant ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, de soufre, d'azote ou des halogènes avec R2 étant le plus souvent différent de Ri, n est un nombre entier compris entre 1 et 11,
E est un atome d'oxygène, de soufre ou d'azote, ledit atome d'azote pouvant être lié à un groupe alkyle, alcoxy ou aryle, tous ces groupes pouvant incor- porer ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, d'azote, de soufre ou des halogènes,
- une couche externe constituée d'unités P2, identiques ou différentes, et répondant à la formule III :
Figure imgf000029_0001
dans laquelle :
R5 représente un atome d'hydrogène ou l'un des groupes suivants : alkyle, alcoxy, aryle, ces groupes comportant ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, d'azote, de soufre ou des halogènes,
W représente l'un des groupes suivants : alkyle, alcoxy, aryle, tous ces groupes comportant ou non des atomes de phosphore, d'oxygène, d'azote, de soufre ou des halogènes.
R3 et R4, qui peuvent être identiques ou différents, représentent un groupe alkyle en Ci -C5,
X représente un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en C1-C5 ou est absent, et
Z représente un ion halogènure, un groupe alkylCOO" ou tout autre groupement anionique comportant des atomes de carbone, d'oxygène, de soufre, d'azote, de phosphore ou d'halogènes, ou est absent.
2°) Dendrimères selon la revendication 1, caractérisés en ce que le noyau central P0 est sélectionné dans le groupe constitué par le groupement de formule générale la :
Figure imgf000029_0002
(la) / ou le groupement de formule générale Ib : S≈PY" 3°) Dendrimères selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisés en ce qu'ils présentent des unités terminales de formule III, dans lesquelles X représente un atome d'hydrogène, R5 est un atome d'hydrogène, W représente un groupe (CH2)2, R3 et R4 sont identiques et représentent des groupes éthyle, Z est un ion chlorure et n est un nombre entier compris entre 1 et 1 1.
4°) Dendrimères selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisés en ce qu'ils présentent des unités terminales de formule III, dans lesquelles X représente un groupe méthyle, R5 est un atome d'hydrogène, W représente un groupe (CH2)2, R3 et R4 sont identiques et représentent des groupes éthyle, Z est un groupe CH COO" et n est un nombre entier compris entre 1 et 11.
5°) Composition capable d'agir comme agent de transfection d'une séquence d'acide nucléique vers une cellule eucaryote, caractérisée en ce qu'elle comprend un acide nucléique et un dendrimère phosphore polycationique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, couplé audit acide nucléique.
6°) Composition selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
7°) Composition selon la revendication 5 ou la revendication 6, caractérisée en ce que le rapport N/P, dans lequel N correspond aux groupes canoniques terminaux du dendrimère (aminés chargées) et P correspond aux groupes phosphates dudit acide nucléique, est compris entre 5 et 10.
8°) Composition selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un agent de perméabilisation de la membrane capable de transporter ledit acide nucléique à travers les membranes cyto- plasmiques ou endosomales de ladite cellule eucaryote.
9°) Composition selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisée en ce que ledit dendrimère phosphore polycationique est associé de manière non-covalente avec ledit acide nucléique.
PCT/FR2000/003261 1999-11-25 2000-11-23 Dendrimeres phosphores comme agents de transfevtion Ceased WO2001038335A1 (fr)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10/130,739 US6969528B1 (en) 1999-11-25 2000-11-23 Phosphorus-containing dendrimers as transfection agents
DE60002603T DE60002603T2 (de) 1999-11-25 2000-11-23 Phosphor-enthaltende dendrimere als transfektionsagente
JP2001540098A JP2003514912A (ja) 1999-11-25 2000-11-23 トランスフェクション薬剤としてのリン含有デンドリマー
EP00985306A EP1232165B1 (fr) 1999-11-25 2000-11-23 Dendrimeres phosphores comme agents de transfection
CA002392697A CA2392697A1 (fr) 1999-11-25 2000-11-23 Dendrimeres phosphores comme agents de transfevtion
AT00985306T ATE239749T1 (de) 1999-11-25 2000-11-23 Phosphor-enthaltende dendrimere als transfektionsagente

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9914864A FR2801592B1 (fr) 1999-11-25 1999-11-25 Dendrimeres phosphores et leurs applications comme agents de transfection
FR99/14864 1999-11-25

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2001038335A1 true WO2001038335A1 (fr) 2001-05-31

Family

ID=9552551

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2000/003261 Ceased WO2001038335A1 (fr) 1999-11-25 2000-11-23 Dendrimeres phosphores comme agents de transfevtion

Country Status (9)

Country Link
US (1) US6969528B1 (fr)
EP (1) EP1232165B1 (fr)
JP (1) JP2003514912A (fr)
AT (1) ATE239749T1 (fr)
CA (1) CA2392697A1 (fr)
DE (1) DE60002603T2 (fr)
ES (1) ES2194794T3 (fr)
FR (1) FR2801592B1 (fr)
WO (1) WO2001038335A1 (fr)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2834988A1 (fr) * 2002-01-21 2003-07-25 Centre Nat Rech Scient Utilisation de dendrimeres phosphores comme medicaments
FR2873715A1 (fr) * 2004-07-30 2006-02-03 Centre Nat Rech Scient Utilisation de dendrimeres pour stimuler la croissance cellulaire
FR2876916A1 (fr) * 2004-10-25 2006-04-28 Midi Pyrenees Incubateur Produit implantable de surface fonctionnalisee au moyen de dendrimeres a terminaisons anioniques

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2838737B1 (fr) 2002-04-23 2006-02-03 Centre Nat Rech Scient Supports solides fonctionnalises par des dendrimeres phosphores, leur procede de preparation et applications
FR2851565B1 (fr) * 2003-02-26 2005-04-01 Commissariat Energie Atomique Dendrimeres phosphores, leur procede de preparation et leur utilisation pour l'extraction des actinides et des lanthanides
FR2896251B1 (fr) * 2006-01-13 2008-04-11 Univ Rennes 1 Etablissement Pu Composes fluorescents dendrimeriques et utilisation de tels composes dans le cadre de procedes ou dispositifs multiphotoniques.
CN117820605B (zh) * 2023-11-30 2025-07-11 江西坤隆新材料有限公司 一种阻燃环氧树脂的制备方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995002397A1 (fr) * 1993-07-14 1995-01-26 The Regents Of The University Of California Systeme de liberation de polynucleotides a auto-assemblage, comprenant des polycations de dendrimeres

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI955320A7 (fi) * 1994-03-07 1995-11-24 Univ Michigan Bioaktiivisia ja/tai kohdennettuja dendriimikonjugaatteja
US6440405B1 (en) * 1999-06-07 2002-08-27 University Of Delaware Quaternary ammonium functionalized dendrimers and methods of use therefor

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995002397A1 (fr) * 1993-07-14 1995-01-26 The Regents Of The University Of California Systeme de liberation de polynucleotides a auto-assemblage, comprenant des polycations de dendrimeres

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GALLIOT C.: "Regioselective stepwise growth of dendrimer units in the internal voids of a main dendrimer", SCIENCE., vol. 277, 26 September 1997 (1997-09-26), AAAS. LANCASTER, PA., US, pages 1981 - 1984, XP000929654 *
LARRÉ C.: "Phosphorus-containing dendrimers: chemoselective functionalization of internal layers", JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY., vol. 120, no. 16, 29 April 1998 (1998-04-29), AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, WASHINGTON, DC., US, pages 4029 - 4030, XP002144558, ISSN: 0002-7863 *
LOUP C.: "Preparation of water-soluble cationic phosphorus-containing dendrimers as DNA transfecting agents", CHEMISTRY - A EUROPEAN JOURNAL., vol. 5, no. 12, December 1999 (1999-12-01), VCH PUBLISHERS., US, pages 3644 - 3650, XP002144560, ISSN: 0947-6539 *
MARAVAL V.: "Rapid synthesis of phosphorus-containing dendrimers with controlled molecular architectures: first example of surface-block, layer-block, and segment-block dendrimers issued from the same dendron", JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY., vol. 122, no. 11, 22 March 2000 (2000-03-22), AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, WASHINGTON, DC., US, pages 2499 - 2511, XP002144561, ISSN: 0002-7863 *
PRÉVOTÊ D.: "Phosphate-, phosphite-, ylide-, and phosphonate-terminated dendrimers", JOURNAL OF ORGANIC CHEMISTRY., vol. 62, no. 14, 11 July 1997 (1997-07-11), AMERICAN CHEMICAL SOCIETY. EASTON., US, pages 4834 - 4841, XP002144559, ISSN: 0022-3263 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2834988A1 (fr) * 2002-01-21 2003-07-25 Centre Nat Rech Scient Utilisation de dendrimeres phosphores comme medicaments
WO2003061673A1 (fr) * 2002-01-21 2003-07-31 Centre National De La Recherche Scientifique Utilisation de dendrimeres phosphores comme medicaments.
FR2873715A1 (fr) * 2004-07-30 2006-02-03 Centre Nat Rech Scient Utilisation de dendrimeres pour stimuler la croissance cellulaire
WO2006024769A1 (fr) * 2004-07-30 2006-03-09 Centre National De La Recherche Scientifique Utilisation de dendrimeres pour stimuler la croissance cellulaire
US8815834B2 (en) 2004-07-30 2014-08-26 Centre National De La Recherche Scientifique Use of dendrimers to stimulate cell growth
FR2876916A1 (fr) * 2004-10-25 2006-04-28 Midi Pyrenees Incubateur Produit implantable de surface fonctionnalisee au moyen de dendrimeres a terminaisons anioniques

Also Published As

Publication number Publication date
ES2194794T3 (es) 2003-12-01
DE60002603D1 (de) 2003-06-12
FR2801592B1 (fr) 2002-02-22
US6969528B1 (en) 2005-11-29
ATE239749T1 (de) 2003-05-15
JP2003514912A (ja) 2003-04-22
EP1232165B1 (fr) 2003-05-07
EP1232165A1 (fr) 2002-08-21
FR2801592A1 (fr) 2001-06-01
DE60002603T2 (de) 2004-02-26
CA2392697A1 (fr) 2001-05-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Loup et al. Preparation of water‐soluble cationic phosphorus‐containing dendrimers as DNA transfecting agents
CA2290664C (fr) Composes, leur preparation et leur utilisation pour le transfert d&#39;acides nucleiques dans les cellules
CA2717778C (fr) Polymere derive de la polyethylenimine lineaire pour le transfert de gene
CA2182118A1 (fr) Composition contenant des acides nucleiques, preparation et utilisations
FR2730637A1 (fr) Composition pharmaceutique contenant des acides nucleiques, et ses utilisations
JP2009532564A (ja) 生分解性のカチオン性ポリマー
FR2759382A1 (fr) Nouveaux composes et compositions les contenant utilisables pour le transfert d&#39;au moins une substance therapeutiquement active, notamment un polynucleotide, dans une cellule cible et utilisation en therapie genique
Mahato et al. Tetramethylguanidinium‐polyallylamine (Tmg‐PA): a new class of nonviral vector for efficient gene transfection
Kumar et al. Prolonged drug delivery system of PEGylated PAMAM dendrimers with a anti-HIV drug
EP1232165B1 (fr) Dendrimeres phosphores comme agents de transfection
WO1999005183A1 (fr) Polymeres cationiques, complexes associant lesdits polymeres cationiques et des substances therapeutiquement actives comprenant au moins une charge negative, notamment des acides nucleiques, et leur utilisation en therapie genique
EP0956050A1 (fr) Nouveaux complexes lipidiques pour le transfert d&#39;au moins une substance therapeutiquement active, notamment un polynucleotide, dans une cellule cible et utilisation en therapie genique
JP4772686B2 (ja) 分解性の架橋を有するカチオン性ポリマー
FR2739292A1 (fr) Composition pharmaceutique utile pour la transfection d&#39;acides nucleiques et ses utilisations
JP5277440B2 (ja) 核酸内包高分子ミセル複合体
WO2007010080A2 (fr) Nouveaux dendrimeres carbosilanes, leur preparation et leur utilisation
FR2759298A1 (fr) Formulation de particules agent(s) de transfection cationique(s)/acides nucleiques stabilisees
CN104755534B (zh) 用于递送生物活性材料的低分子量支化聚胺
WO2004043970A1 (fr) Nouveaux composes lipophiles et leurs utilisations
WO2009050372A2 (fr) Nouvelles compositions lipophiles et leurs utilisations
FR2820434A1 (fr) Utilisation d&#39;oligonucleotides pour ameliorer la transfection des plasmides dans les cellules, procede et kit de transfection
EP1068188A1 (fr) Nouveaux agents de transfert d&#39;acides nucleiques, compositions les contenant et leurs applications
EP1390345A1 (fr) Derives lipidiques de polythiouree
FR2777017A1 (fr) Nouveaux agents de transfert d&#39;acides nucleiques, compositions les contenant et leurs applications

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): CA JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE TR

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
ENP Entry into the national phase

Ref country code: JP

Ref document number: 2001 540098

Kind code of ref document: A

Format of ref document f/p: F

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2392697

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2000985306

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10130739

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2000985306

Country of ref document: EP

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: 2000985306

Country of ref document: EP