WO2001044469A1 - PROCEDE DE PRODUCTION DE PEPTIDE KiSS-1 - Google Patents

PROCEDE DE PRODUCTION DE PEPTIDE KiSS-1 Download PDF

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amino acid
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Masato Suenaga
Takao Yamada
Osamu Nishimura
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Takeda Pharmaceutical Co Ltd
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    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones

Definitions

  • the present invention provides a KiS S-1 by producing a fusion protein or polypeptide and then subjecting the fusion protein or polypeptide to a peptide bond cleavage reaction.
  • the peptide When a peptide is produced using a gene recombination technique, the peptide is often expressed in the form of a fusion protein because the peptide is susceptible to degradation in a cell.
  • the target peptide can be cleaved from the fusion protein by a method of chemically cleaving with bromcian (Itaku et al., Science, 198, 1056 (1977)) or a method of enzymatically cleaving with Xafar (Nagai et al., Methods in Enzymology, 153, 46 (1987)).
  • the present inventors have proposed a novel bioactive peptide, KiSS-1 peptide, or the like. After diligent studies on a method for efficiently producing a salt of a protein or polypeptide, a fusion protein or polypeptide in which a KiSS-1 peptide was linked to the N-terminus of a protein or polypeptide having a cystine at the N-terminus was produced, and then It has been found that by subjecting this to a reaction for cleaving a peptide bond, the KiSS-1 peptide or a salt thereof can be produced efficiently.
  • a protein or peptide having a cysteine at the N-terminus, a fusion protein in which a KiSS-1 peptide is linked to the N-terminus, a peptide or a salt thereof is cleaved at a peptide bond on the amino group side of the cysteine residue.
  • KiSS-1 peptide is a peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
  • the Ki SS-1 peptide is: (1) a peptide having an amino acid sequence consisting of the 40th to 54th amino acids from the N-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and (2) represented by SEQ ID NO: 1.
  • a protein or peptide having a cysteine at the N-terminus is a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 and a cysteine residue added to the N-terminus, and the KiSS-1 peptide is represented by SEQ ID NO: A peptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; and the produced Ki SS-1 peptide is a peptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in which the C-terminus is an amide.
  • Ki containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 at the N-terminus of a protein having a cysteine residue added to its N-terminus
  • FERM BP Provides Escherichia coli MM2 94 (DE 3) / pTFC-K i SS—l, represented by 6907. Further, the present invention provides
  • FIG. 1 shows a reaction mechanism in the reaction step of the present invention.
  • FIG. 2 shows the DNA fragment used in Example 1.
  • FIG. 3 shows a schematic diagram for producing the human K i S S-1 peptide having a double chain structure obtained in Example 1.
  • FIG. 4 shows a construction diagram of the plasmid pTFC-KiSS-1 obtained in Example 2.
  • KiSS-1 peptide used in the method of the present invention for example, the human KiSS-1 peptide described in WO00Z24890 (International Patent Application PCTJJP99Z090505) is used.
  • SEQ ID NO: 1 of the present application a peptide comprising the 47th to 54th amino acid sequence from the N-terminus and comprising 8 to 54 amino acid residues is exemplified.
  • the “peptide comprising the amino acid sequence at positions 47 to 54 from the N-terminal in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and consisting of 8 to 54 amino acid residues” is as follows: SEQ ID NO: 1 In the amino acid sequence represented by Any peptide may be used as long as it contains the 47th to 54th amino acid sequence and consists of 8 to 54 amino acid residues.
  • the Ki SS-1 peptide includes (1) the peptide represented by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 of the present application, and (2) the N-terminal of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 of the present application. And a peptide represented by the amino acid sequence consisting of the 40th to 54th amino acids, 3 represented by the amino acid sequence consisting of the 45th to 54th amino acids from the N-terminal of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • Peptide peptide represented by the amino acid sequence consisting of the 46th to 54th amino acids from the N-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 of the present application, ⁇ ⁇ amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 of the present application And a peptide represented by an amino acid sequence consisting of the 47th to 54th amino acids from the N-terminus.
  • the K i SS-1 peptide described above was used for the receptor protein OT7T175 described in WO0Z2490 (International Patent Application PCT / JP99Z0905), Has ligand activity.
  • the peptide has a N-terminus (amino terminus) at the left end and a C-terminus (carboxyl terminus) at the right end in accordance with the convention of peptide labeling.
  • SEQ ID NO: C-terminus of the peptide represented by 1 the amide was in - (C00R) (- C0NH 2 ), carboxyl group (- - C00H), Cal Pokishireto (C00 one), alkylamino de (-C0NHR) or ester You may.
  • the R of the ester or alkylamino de, for example methyl, Echiru, n - propyl, isopropyl, n - C i-e alkyl Le group such as butyl, cyclopentyl, C 3, such as cyclohexyl - 8 cycloalkyl group, Hue nil , alpha - C 6, such as naphthyl - 1 2 Ariru group, benzyl, phenethyl, phenylene Lou C Bok 2 alkyl, such as Ben Zuhidoriru, Moshikuwahi one naphthylmethyl How Fei one Nafuchiru C Bok 2 c, such as an alkyl 7 - 14
  • Viva Roy Ruo carboxymethyl group which is generally used as oral esters.
  • a salt with a physiologically acceptable base for example, an alkali metal or the like
  • an acid organic acid or inorganic acid
  • Acid addition salts are preferred.
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid) Acids, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like are used.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid
  • the protein or peptide having a cysteine at the N-terminal used in the method of the present invention is not specified.
  • cysteine may be provided at the N-terminal by a method known per se.
  • the protein or peptide having a cysteine at the N-terminus preferably has a molecular weight of 100 to: L00000, and more preferably has a molecular weight of 300 to 50,000.
  • the protein or peptide having a cysteine at the N-terminus is preferably one having 1 to 1,000 amino acids, more preferably one having 3 to 500 amino acids.
  • the protein or peptide examples include various growth factors such as interferons, inter-kinds, fibroblast growth factors (aFGF, bFGF, etc.), (pro) perkinases, lymphotoxin, Tumor Necrosis Factor (TNF ), Enzymatic proteins such as 3-galactosidase, storage proteins, streptavicin, protein A, protein G, Tissue Plasminogen Act ivator (TPA), muteins of these, or parts (fragments) of these. Some have a cysteine at the end. Among them, fibroblast growth factor (aFGF, bFGF, etc.) or a mutein thereof or a part (fragment) thereof (eg, bFGFCS23 mutin) is preferably used.
  • fibroblast growth factor aFGF, bFGF, etc.
  • a mutein thereof or a part (fragment) thereof eg, bFGFCS23 mutin
  • the DNA encoding the fusion protein (including the fusion peptide) used in the method of the present invention may be obtained by (1) chemically synthesizing the entire nucleotide sequence, or (2) the nucleotide sequence of the nucleotide sequence encoding the protein.
  • the DNA may be constructed by arranging a base sequence encoding cysteine at the terminal side and further arranging a base sequence encoding the KiSS-1 peptide at the N-terminal side.
  • the DNA may be constructed by replacing the amino acid residue immediately after the desired fragment with cysteine by a technique such as site-directed mutagenesis.
  • a known method such as a phosphoramidite method, a phosphoric acid triester method, a diester method, or a hydrogen phosphonate method may be used. After splitting and synthesizing, it can be created by linking using T4 DNA ligase.
  • DNA encoding a C-terminal protein can be obtained by digesting a chromosome or cDNA with an appropriate restriction enzyme and ligating to a vector, or Get cDN A. Cleavage with a restriction enzyme so that the N-terminus becomes cysteine, or binding of the synthetic DNA to the 5'-end of the whole protein or a part of the DNA so that the N-terminus becomes cysteine. Will change.
  • a DNA encoding the protein of interest is connected.
  • Specific examples of DNA encoding the fusion protein thus obtained include, for example,
  • the nucleotide sequence represented by R is represented by the nucleotide sequence encoding cysteine in the DNA nucleotide sequence encoding the peptide containing the human (KI) SS-1 peptide (SEQ ID NO: 2). Indicates that they are connected.
  • the DNA encoding the KiSS-1 peptide may be the DNA represented by the above formula (I) or the DNA encoding the matured KiSS-1 peptide represented by SEQ ID NO: 15 or a modification thereof. It can also be produced using DNA (for example, J. Natl. Cancer Inst., 88, 1731, 1996; WO 98/39448) according to a method known per se.
  • a DNA (plasmid) having an ATG at the 5 ′ end and a region encoding the fusion protein downstream thereof, and a translation stop codon, is a known protein produced by chemical synthesis or genetic engineering. CDNA or the chromosome-derived DNA of the protein, and then processed.
  • DN encoding a fusion protein or peptide of the present invention in which a KiSS-1 peptide is linked to the N-terminus of a protein or peptide having a cysteine at the N-terminus A can be converted to DNA encoding the mutin of interest using conventional DNA techniques, such as site-directed mutagenesis.
  • a plasmid used as a vector includes, for example, pBR322 derived from Escherichia coli [Gene, 2, 95 ( 1 9 7 7)], pBR 3 1 3 [Gene,, 7 5 (1 9 7 7)], pBR 324, pBR 3 2 5 [Gene, A, 1 24 (1 9 7 8)], pBR 3 2 7, pBR 328 [gene, _9, 287 (1980)], pBR 3 29 [gene, 17, 79 (1 982)], ⁇ ⁇ 2 289 [gene, 3, 1 ( 1 9 7 8)], ⁇ 2700 [Biochemistry, 52,
  • bacteriophages for example, Agt-based Agt ⁇ ⁇ C using ⁇ phage [Proc. Natl. Acad. Sci. USA_1, 45779 (1974)], ⁇ B (Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the DNA preferably has a promoter upstream of the ATG, and the promoter may be any promoter as long as it is suitable for the host used for the production of the transformant.
  • the t ⁇ promoter in Escherichia coli, the t ⁇ promoter, the lac promoter, the rec A promoter, the APL promoter, the lpp promoter, the T7 promoter, etc., and the Bacillus subtilis SP ⁇ 1 promoter, SP ⁇ 2 promoter, penP promoter, etc.
  • yeast Sacharomyces cerevisiae
  • PH ⁇ 5 promoter in yeast
  • PGK promoter PH ⁇ 5 promoter
  • GAP promoter GAP promoter
  • ADH promoter in animal cells
  • SV40-derived promoter In animal cells, SV40-derived promoter etc. You. If necessary, an SD (Shine and Dalgarno) sequence may be inserted downstream of the promoter.
  • the T7 promoters include 17 promoters found on T7 DNA [JL Oakley et al., Pro Natl. Acad. Sci, USA , 74: 426 6 -42 7 0 (1 9 7 7), MD Rosa, Cell 16: 8 15-825 (1 9 7 9), N. Panayotatos et al., Nature, _280_: 3 5 (1 97 9), JJ Dunn et al., J. Mol. Biol., 16:47 7-535 (1983)] but may be any of the 10 promoters [AH Rosenberg et al., Gene, 56:12]. 5-1 35 (1 98 7)] is preferred.
  • a terminator that operates in an E. coli system, preferably a ⁇ evening terminator [FW Studier et al., J. Mo I. Biol., 189: 113-130 (1986)] Is used.
  • the ⁇ 7 RNA polymerase gene includes the ⁇ 7 gene [FW Studier et al., J. Mol. Biol., 189: 113-130 (11986)].
  • the vector is preferably constructed by incorporating the T7 promoter and the T7 promoter into the above vector, and such vectors include pET-1, pET-2, pET-3, and pET-3. ET-4, pET-5 [AH Rosenberg, Gene 5 6_: 1 2 5-1 3 5 (1 987)], TB 960-2 [EP-A-49 99 90], etc.
  • pTB960-2 is used.
  • the transformant of the present invention comprises a plasmid for expression obtained by the above method, which is known per se.
  • Examples of the host of the microorganism to be transformed include Escherichia, Bacillus, yeast, and animal cells.
  • Escherichia bacteria examples include Escherichia coli (Escherichia coli). Specifically, Escherichia coli K12 DH1 [Procedures of National Academy of Sciences] ⁇ Sciences (Proc. Natl. Acad. Sci.
  • Bacillus subtilis examples include Bacillus subtilis. Specifically, Bacillus subtilis M11114 (Gene, 24, 255 (1983)), 207-21 (Journal ') Journal of Biochemistry, 95, 87 (1 984)].
  • yeast examples include Saccharomyces cerevisiae. Specifically, Saccharomyces cerevisiae AH
  • monkey cells COS-7 Cell, 23, 175 (1 981)]
  • Vero (Japanese clinical ⁇ J_, 1209 (1963)]
  • Chiny's Hams Yuichi cell CH ⁇ [Journal, Obexperimental Medicine (J Exp. Med.), 108, 945 (1985)
  • mouse L cells [L Nat. Cancer Inst., ⁇ , 16 5 (1 9 4 3)]
  • human FL cells Procedings of the Society, Experimental Biology, and 'Medicine (Proc. Soc. Exp. Biol. Med. ), 9_4, 532 (1957)] and hamster C cells.
  • the host of the transformant may be ⁇ 7 RNA polymerase gene ( ⁇ 7 gene 1) [FW Studier et al., J. Mol. Biol. E. coli strains that have incorporated 3-1330 (1966)] such as MM294, DH-1, C600, JM109, BL21, or T7 RNA polymerase gene ( An E. coli strain in which the T7 gene 1) has been integrated together with another plasmid is used.
  • MM294 strain and BL21 strain in which ⁇ phage into which T7 gene 1 has been incorporated are lysogenized are used.
  • the promoter of T7 gene 1 1 ac promoter whose expression is induced by isopropyl-111- ⁇ -D-galactovyranoside (sometimes abbreviated as IPTG) is used. .
  • Transformation of a bacterium belonging to the genus Bacillus as a host can be performed according to a known method such as, for example, Molecular 'General' and 168, 111 (1979).
  • Transformation using yeast as a host is performed, for example, by using Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75, 1929 (1978) Can be done.
  • Transformation using an animal cell as a host can be performed, for example, according to a known method such as Virology (Virology, 52, 456 (1973)).
  • the fusion protein can be produced by culturing the above transformant in a medium and collecting the produced fusion protein.
  • the pH of the medium is preferably about 6-8.
  • a medium for culturing the genus Escherichia for example, an M9 medium containing glucose and casamino acid (Miller, Journal of Experimen 'in', Molecular Genetics, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431- 433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972)].
  • a drug such as 3 i3-indolyl acrylate or isopropyl) 3-D-thiogalactopyranoside (IPTG) can be added to make the promoter work efficiently.
  • IPTG 3 i3-indolyl acrylate or isopropyl) 3-D-thiogalactopyranoside
  • culturing is usually carried out at about 15 to 43 ° C for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be applied.
  • cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C for about 6 to 24 hours. Aeration and stirring may be added as necessary.
  • the medium When culturing a transformant in which the host is yeast, for example, the medium may be Burkholder's minimum medium [Bostian, KL et al., Processings 'Ob' National Academy of Sciences (Proc. Natl. Acad. Sci.) USA, 77, 4505 (1980)]. It is preferable to adjust the pH of the medium to about 5 to 8. Le Culture is usually performed at about 20 ° C to 35 ° C for about 24 to 72 hours, and aeration and stirring are added as necessary.
  • the medium When culturing a transformant in which the host is an animal cell, the medium may be, for example, a MEM medium containing about 0.2 to 20%, preferably about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, 122 , 501 (1952)), DME medium (Virology, 8, 396 (1959)), RPMI 1640 medium [Journal of the American-Medical 'Association (The Journal of the American Medical) Association), 199, 519 (1967)], 199 medium [Proceeding of the ' Proceeding of the Society for the Biologcal Medicine, 73, 1 (1950)].
  • H is preferably about 6-8. Culture is usually performed at about 30 to 40 ° C for about 15 to 60 hours, and aeration and agitation are added as necessary.
  • the fusion protein can be produced by culturing the above transformant, producing and accumulating the fusion protein in a culture, and collecting this.
  • M9 medium containing glucose and casamino acid Miller, J., Experment 'in', Molecular in Genetics, 43 1-433 (Cold Spring Horbor Laborator t, New York 1) 972)
  • 2 XYT medium Messing, Methods in Enzymology, ⁇ 01, 20 (1983)] LB medium and the like.
  • Culture is usually performed at about 15 to 43 ° for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be added.
  • the culture is carried out at about 15 to 36 ° C, preferably about 30 to 36 ° C.
  • the inactivation of the AcIts repressor is preferably performed at about 37 ° (: ⁇ 42 ° C.
  • a drug such as mitomycin C, naldixic acid, or the like may be added, ultraviolet light may be applied, or the pH of the culture solution may be changed to a higher level.
  • T7 promoter system When the T7 promoter system is used, (1) When expressing the T7 gene (RNA polymerase gene) linked downstream of the lac promoter, add IPTG, etc. Or (2) When expressing the ⁇ ⁇ ⁇ 7 gene (RNA polymerase gene) linked downstream of the ⁇ PL promoter, increase the temperature of the culture, etc. to generate ⁇ 7 phage RN ⁇ polymerase 1 Activate the T7 promoter specifically.
  • T7 gene RNA polymerase gene
  • the cells After culturing, the cells are collected by a known method, suspended in a buffer, for example, treated with a protein denaturant, treated with an enzyme such as lysozyme, sonicated, treated with glass beads, The cells are disrupted by French press treatment, freeze-thaw treatment, etc., and the supernatant is obtained by a known method such as centrifugation.
  • a buffer for example, treated with a protein denaturant, treated with an enzyme such as lysozyme, sonicated, treated with glass beads.
  • the cells are disrupted by French press treatment, freeze-thaw treatment, etc., and the supernatant is obtained by a known method such as centrifugation.
  • a generally known protein purification method may be used. For example, gel filtration, ion-exchange chromatography, adsorption chromatography, high-performance liquid chromatography, affinity chromatography, hydrophobic chromatography, electrophoresis, etc. can be performed in an appropriate combination. Further, the fusion protein may proceed to the next reaction step without purification or in a partially purified state.
  • the thus obtained fusion protein or peptide is subjected to a cleavage reaction of a peptide bond on the amino group side of the cysteine residue.
  • the cleavage reaction include an S-isocyanation reaction and a hydrolysis reaction.
  • the cleavage reaction includes, for example,
  • the S-cyanation reaction is carried out by reacting a starting compound with an S-cyanation reagent.
  • S-cyanating reagents examples include 2-nitro-5-thiocyanobenzoic acid (N
  • the amount of the S_cyanation reagent may be about 2 to 50 times, and preferably about 5 to 10 times the amount of all thiol groups in moles.
  • the reaction temperature may be any temperature as long as it is between about 0 ° C. and 80 ° C., and more preferably between about 0 ° C. (: and up to 50 ° C.).
  • any buffer may be used, but examples thereof include Tris-HCl buffer, Tri-acetate buffer, phosphate buffer, borate buffer, and the like.
  • the reaction is preferably performed at pH 1 to 12. Especially when NTCB is used] DH 7 to 1 0, When using DMAP-CN, the pH is preferably between 2 and 7 in order to prevent the SS exchange reaction, and a denaturant such as guanidine hydrochloride may be present in the reaction solution. .
  • ammonolysis or hydrolysis reaction includes, for example, You can do it.
  • the alkali treatment is carried out by adjusting the pH of the aqueous solution containing the starting compound to 7 to 14.
  • the pH is adjusted by, for example, using a solution of ammonia, sodium hydroxide, an amino compound described below, trizumabase (tris [hydroxymethyl] monoaminomethane), dibasic sodium phosphate, potassium hydroxide, barium hydroxide, or the like as a starting compound.
  • the reaction is performed by adding an appropriate amount to an aqueous solution containing, but ammonia is particularly preferable.
  • the concentration of the solution in the above reaction is, for example, about 0.01 to 15 N, preferably about 0.1 to 3 N in the case of ammonia or an amino compound, and about 0.01 to 3 N in the case of sodium hydroxide.
  • ⁇ 2 N preferably about 0.05-: LN, about lmM to 1 M, preferably about 20 mM to 200 mM, for Trizuma base, about 1 ⁇ to 1 ⁇ , preferably for sodium phosphate sodium
  • potassium hydroxide about 0.01 to 4N, preferably about 0.1 to 2N is used.
  • the reaction temperature may be any as long as it is between about 120 ° C. and 80 ° C., and more preferably between about ⁇ 10 ° C. and 50 ° C.
  • the reaction time is preferably about 1 to 60 minutes for the S-cyanation reaction, preferably about 15 to 30 minutes, and the hydrolysis reaction is about 5 to 100 hours, preferably 10 to 15 minutes.
  • the time is about 5 minutes to 24 hours, preferably about 10 to 180 minutes for ammonolysis.
  • R 1 - (NR 2) - H As the Amino compounds, for example, the formula R 1 - (NR 2) - H ( In the formula, R 1 Contact and R 2 are the same or different, (i) a hydrogen atom, (iD ⁇ -. 2 alkyl groups, C 3 - 8 cycloalkyl group, C 6 - 14 Ariru (aryl) group, or a C 6 - 14 Ariru - C i _ 3 alkyl groups (which are either not substituted or 1-3 amino groups, hydroxyl And the like may be present on a carbon atom), (iii) an optionally substituted amino group, (iv) a compound represented by a hydroxyl group or (: represents an alkoxy group), and the like.
  • a hydrogen atom iD ⁇ -. 2 alkyl groups, C 3 - 8 cycloalkyl group, C 6 - 14 Ariru (aryl) group, or a C 6 - 14 Ariru -
  • reaction shown in FIG. 1 occurs by the S-cyanation and ammonolysis or hydrolysis.
  • the C-terminal of the KiSS-1 peptide obtained by the production method of the present invention is as described above.
  • the Ami de (-C0NH 2), carboxyl group, carboxylate (-C00-), may be an alkyl amide (-C0NHR) or ester (-C00R), among others amido, carboxyl group (-C00H) or alkylamino And amides or alkylamides are particularly preferable.
  • the C-terminal of the KiSS-1 peptide obtained by the production method of the present invention may be one CO-X shown in FIG. 1.
  • X represents R 1 — (NR 2 ) — (wherein each symbol has the same meaning as described above) or ⁇ H.
  • alkyl examples include, for example, methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, sec-butyl, pentyl, isopentyl, neopentyl, 1-ethylpentyl, hexyl, isohexyl, heptyl, octyl, nonanyl, decanyl, ndeneforce Nil, dodecanyl, tetradecanyl, pendecanyl, hexadenicil, hepdecane decanyl, octadecanyl, nonadecanyl and eicosanil.
  • Examples of the c 3 _ 8 cycloalkyl e.g., cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, the cycloalkyl heptyl, etc. Shikurookuchiru the like cyclohexylene.
  • Examples of the above C 6 alkoxy include, for example, methoxy, ethoxy, propoxy, butoxy, pentyloxy, hexyloxy and the like.
  • Examples of the above-mentioned optionally substituted amino group of (Hi) include amino acid and a peptide consisting of 2 to 10 amino acids.
  • the amino acids may be L- or D-forms.
  • Examples of such amino acids are Ala, Arg, Asp, Asn, Glu, Gin, Gly, His, lie, Met, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser. Thr, Trp, Tyr, Val and the like.
  • Examples of the peptide for example, HD-Leu- Leu- Arg- Pro- NH - C 2 H 5, H- Val-Ala-Leu-D-Ala-Ala-Pro-Leu-Ala-Pro-Arg-OH and the like.
  • R 2 is a hydrogen atom
  • R 1 is a hydrogen atom
  • Alkyl groups are preferred.
  • the isolated target peptide may be isolated according to a generally known method for purifying a peptide. For example, gel filtration, ion exchange chromatography, high performance liquid chromatography, affinity chromatography, hydrophobic chromatography, thin layer chromatography, electrophoresis and the like can be appropriately combined.
  • the Ki SS-1 peptide or a salt thereof obtained in this manner can be isolated and purified from the reaction solution by a known purification means, for example, extraction, salting out, partitioning, recrystallization, chromatography, etc.
  • a known purification means for example, extraction, salting out, partitioning, recrystallization, chromatography, etc.
  • SP—Sepharose Pharmacia Biotech Co., Ltd.
  • DEAE-5 PW Tokyo Soichi Co., Ltd.
  • SP—5 PW Tokyo Soichi Co., Ltd.
  • purification methods such as ion exchange chromatography.
  • KiSS-1 peptide or a salt thereof can be lyophilized to a powder if necessary.
  • stabilizers such as sorbitol, mannitol, dextrose, maltose, trehalose, and glycerol can be added.
  • the KiSS-1 peptide or a salt thereof produced by the method of the present invention can be mixed with sterilized water, human serum albumin (HSA), physiological saline or other known physiologically acceptable carriers. It can be administered parenterally or topically to mammals (eg, humans). For example, the daily dose per person may be about 0.0 lmg-50 mg, preferably about 0.1 mg-10 mg, given parenterally, such as by intravenous or intramuscular injection. Can be administered.
  • HSA human serum albumin
  • Formulations containing KiSS-1 peptide or a salt thereof produced by the method of the present invention may include salts, diluents, adjuvants, other carriers, buffers, binders, surfactants, and preservatives. It may also contain other physiologically acceptable active ingredients.
  • a sterile aqueous solution or a suspension sample in a physiologically acceptable solvent, or a sterile powder (usually a peptide solution) that can be used after dilution with a physiologically acceptable diluent is used. Lyophilized).
  • the Ki SS-1 peptide or its salt obtained by the production method of the present invention has a cancer metastasis inhibitory activity, it can be used for any cancer (eg, lung cancer, stomach cancer, liver cancer, Teng cancer, colorectal cancer, rectal cancer, colon cancer, prostate). It is useful as a preventive or therapeutic agent for cancer, ovarian cancer, uterine cancer, breast cancer, etc.).
  • cancer eg, lung cancer, stomach cancer, liver cancer, Teng cancer, colorectal cancer, rectal cancer, colon cancer, prostate. It is useful as a preventive or therapeutic agent for cancer, ovarian cancer, uterine cancer, breast cancer, etc.).
  • Ki SS-1 peptide or its salt since Ki SS-1 peptide or its salt has a placental function regulating action, it can induce choriocarcinoma, hydatidiform mole, invasive mole, miscarriage, fetal growth deficiency, abnormal glucose metabolism, abnormal lipid metabolism or labor. Useful as a prophylactic or therapeutic agent.
  • amino acids, peptides, protecting groups, active groups, and others are indicated by abbreviations, they are based on the abbreviations by IUPAC-IUB (Commission on Biochemical Nomenclature) or abbreviations commonly used in the art. The following is an example.
  • the L isomer when there is an optical isomer for an amino acid or the like, the L isomer is indicated unless otherwise specified.
  • Glx Glutamine or glutamic acid
  • sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences.
  • Example 1 shows the base sequence of the oligomer used in Example 1 for preparing the structural gene of the iSS-1 peptide.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of an oligomer used in the preparation of the structural gene for iS S-1 peptide in Example 1.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of an oligomer used in the preparation of the structural gene for iS S-1 peptide in Example 1.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of an oligomer used in the preparation of the structural gene for iS S-1 peptide in Example 1.
  • Example 1 shows the base sequence of the oligomer used in Example 1 for preparing the structural gene of the KiSS-1 peptide. '
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of an oligomer used in the preparation of the structural gene for iS S-1 peptide in Example 1.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of an oligomer used in the preparation of the structural gene for iS S-1 peptide in Example 1.
  • Example 1 shows the base sequence of the oligomer used in Example 1 for preparing the structural gene of the iSS-1 peptide.
  • BSA serum albumin
  • ImM ATP 10 units T4 polynucleotide kinase (Takara Shuzo)] at 37 ° C for 1 hour to phosphorylate the 5 'end of each oligomer. Oxidized. After the phenol treatment, a 2-fold amount of ethanol was added, the mixture was cooled to 17 O :, and DNA was precipitated by centrifugation.
  • the DNA fragment obtained in a) above was combined with # 1 and # 8 to give 120 ⁇ l.
  • the mixture was kept at 90 at 10 minutes, and then gradually cooled to room temperature for annealing.
  • a ligation reaction was performed using TaKaRa DNA Ligation Kit ver.2 (Takara Shuzo).
  • Ligation Kit II solution 30I was added to the annealing solution 301 and mixed well, then Ligation Kit I solution 60xl was added, and the mixture was reacted at 37 ° C for 1 hour to perform ligation.
  • the aqueous layer was collected, twice the amount of ethanol was added, and the mixture was cooled to -70 ° C, and then DNA was precipitated by centrifugation.
  • the thus obtained DNA fragment was subjected to phosphorylation with T4 polynucleotide kinase (Takara Shuzo) and then subjected to the following (d).
  • Ki SS-1 peptide expression vector (Fig. 4) As an expression vector, PTFC (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-270871, Japanese Patent Application No. 11-080303) was digested with Nde I and Ava I (Takara Shuzo) at 37 t: 4 hours, and then 1% A 4.4 kb DNA fragment was extracted by agarose gel electrophoresis using QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) and dissolved in 251 TE buffer.
  • PTFC Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-270871, Japanese Patent Application No. 11-080303
  • a ligation reaction was carried out using the NdeI and AvaI fragments of pTFC and the structural gene of the KiSS_1 peptide prepared as described above using TaKaRa DNA ligation kit ver.2 (Takara Shuzo).
  • Escherichia coli JM109 competent cells (Toyobo) were transformed with 10 1 of this reaction solution, seeded on LB agar medium containing 10 agZm 1 of tetracycline, cultured at 37 ° C for 1 ⁇ , and the resulting tetracycline-resistant colonies I chose.
  • the transformant was cultured in an LB medium, and a plasmid pTFC-KiSS-1 was prepared using QIAprep8MiniprepKit (Qiagen).
  • the nucleotide sequence of the KiSS_1 structural gene was confirmed using an Applied Biosystems model 377 DNA sequencer.
  • Escherichia coli MM294 (DE3) was transformed with the plasmid pTFC-KiSS-1 to obtain a KiSS-1 peptide-CS23 fusion protein expression strain M294 (DE3) / pTFC-KiSS-1 (FIG. 4).
  • Escherichia coli MM294 (DE3) / pTFC-KiSS-l was deposited with the Ministry of International Trade and Industry, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Institute of Biotechnology and Industrial Technology on October 4, 1999 under the accession number FERM BP-6907. Also, deposited on September 16, 1999 with the Fermentation Research Institute (IF0) under the accession number IF016321.
  • MM 294 (DE 3) ZpTFC—K i SS—1 in a volume of 2 L using 1 L (1% peptone, 0.5% yeast extract, 05% sodium chloride) in LB medium containing OmgZL tetracycline
  • the cells were shake-cultured at 37 ° C for 8 hours in a flask.
  • the obtained culture solution was diluted with 19 L of the main fermentation medium (1.68% sodium monohydrogen phosphate, 0.3% potassium dihydrogen phosphate, 0.1% ammonium chloride, 0.05% sodium chloride, 0.15% sodium chloride).
  • KiSS-1 peptide-CS23 fusion protein fraction fraction with a gradient of 100 minutes and an elution time of about 100 minutes.
  • the mixture was further concentrated while adding 0.1 M acetic acid, and a 0.1 M acetic acid solution of KiSS-1 peptide-CS23 fusion protein was added.
  • urea was added to this solution to a final concentration of 6 M, about 10 Omg of DMAP—CN1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate) was added, and the mixture was reacted at room temperature for 15 minutes.
  • the reaction mixture was passed through a Sephadex®-25 column (46 iM IDX 600 mmL, Pharmacia) equilibrated with 5 OmM monopotassium phosphate, and the 5 OmM phosphoric acid used for equilibration was used.
  • the sphere was developed at a flow rate of 6 ml Zmin to obtain an S-cyanated KiSS-1 peptide_CS23 fusion protein fraction.
  • the eluate was concentrated and desalted using a Pellicon mini cassette (Millipore) to obtain a desalted solution of the KiSS-1 peptide-CS23 fusion protein.
  • the fraction was further passed through C4P-50 (2 1.5 mm I DX 300 minL, Showa Denko) equilibrated with 0.1% trifluoroacetic acid, adsorbed and washed, and then washed with 20-50% B (B: Elution was performed with a step gradient of 80% acetate nitrile Z (0.1% trifluoroacetic acid), and the KiSS-1 peptide (amide) fraction (60 minutes gradient, elution time about 45 minutes) was pooled. After that, lyophilization was carried out to obtain about 4 Omg of lyophilized Ki SS-1 peptide (amide).
  • Amino acid composition was determined using an amino acid analyzer (Hitachi L-850OA Amino Acid Analyzer). As a result, the amino acid composition agreed with the amino acid composition predicted from the DNA base sequence of the KiSS_1 peptide [Table 1].
  • N-terminal amino acid sequence was determined using a gas phase protein sequencer (PE Applied Biosystems model 492). As a result, it was consistent with the N-terminal amino acid sequence predicted from the DNA sequence of the KiSS-1 peptide [Table 2]. (Table 2)
  • the C-terminal amino acid was analyzed using an amino acid analyzer (Hitachi L-850 A Amino Acid Analyzer), but was not detected because the C-terminal was amidated [Table 3].
  • Example 5 Production of 133-1-peptide (non-amide)
  • Example 2 To 100 g of the cells obtained in Example 1, 300 ml of a 1 OmM EDTA (pH 6.0) solution was added, and the mixture was subjected to sonication (BRAN SON SON IFIER MODEL 450), followed by centrifugation (10000 rpm, 60 minutes). ). The supernatant was pooled, and the same operation was performed again using the precipitate. The pooled supernatant was adjusted to pH 6.0 and equilibrated with 5 OmM phosphate buffer (pH 6.0).
  • the eluate was concentrated and desalted using a Pellicon mini force set (Millipore) to obtain a desalted solution of the KiSS-1 peptide CS23 fusion protein.
  • urea was added to this desalted solution to a final concentration of 6 M
  • INN aOH was further added to a 0.05 N NaOH concentration, and reacted at 0 ° C for 15 minutes.
  • the pH was adjusted to 6.0 with acetic acid to obtain a KiSS_l peptide (non-amide).
  • the reaction solution was passed through a Sephadex G-25 column (46 L DX600 L) equilibrated with 5 OmM potassium phosphate, and the 50 mM potassium phosphate used for equilibration was added at 6 ml / min.
  • the peptide was developed at a flow rate of 1 to obtain a KiSS-1 peptide fraction (non-amide form).
  • This fraction was passed through SP-5PW (21.5 mmI DX1 50 mmL, Tosoichi) equilibrated with 5 M mM MES containing 3 M urea + 3 M urea (pH 4.5), and adsorbed.
  • Elution was performed with a step gradient of 0% B (B: 80% acetonitrile Z 0.1% trifluoroacetic acid), and the KiSS-1 peptide (non-amide form) fraction (elution time was about 60 minutes). After pooling (fraction of 45 minutes), lyophilization was performed to obtain about 3 Omg of lyophilized powder of Ki SS-1 peptide (non-amide form).
  • the amino acid composition was determined using an amino acid analyzer (Hitachi L-850A Amino Acid Analyzer). As a result, the amino acid composition was consistent with the amino acid composition predicted from the DNA sequence of KiSS-1 peptide [Table 4].
  • KiSS-1 per mole Base sequence of 'chito'
  • N-terminal amino acid sequence was determined using a gas phase protein sequencer (PE Applied Biosystems model 492). The results were consistent with the N-terminal amino acid sequence predicted from the DNA sequence of KiSS-1 peptide [Table 5] [Table 5]
  • the C-terminal amino acid was analyzed using an amino acid analyzer (Hitachi L-850 A Amino Acid Analyzer). [Table 6].
  • any cancer for example, lung cancer, stomach cancer, liver cancer, ⁇ cancer, colon cancer, rectal cancer, colon cancer, prostate cancer, ovarian cancer, cervical cancer, breast cancer, etc.
  • any cancer for example, lung cancer, stomach cancer, liver cancer, ⁇ cancer, colon cancer, rectal cancer, colon cancer, prostate cancer, ovarian cancer, cervical cancer, breast cancer, etc.

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Description

WO 01/44469 j PCT/JPOO/08837 明 細 書
K i S S - 1ペプチドの製造法 技術分野
本発明は、 融合蛋白質またはポリペプチドを製造し、 次いで該融合蛋白質ま たはポリペプチドをペプチド結合の切断反応に付すことにより、 K i S S - 1
またはその塩を製造する方法に関する。 背景技術
遺伝子組換え技術を用いて、 ペプチドを製造するに際しては、 ペプチドが細 胞内で、 分解を受けやすいために、 融合蛋白質の形で発現させることがしばし ば行なわれている。融合蛋白質からの目的ペプチドの切り出しには、 ブロムシ アンを用い化学的に切断する方法 （イタク ら、 Science, 198, 1056 (1977)) 、 ファフター Xaを用い酵素的に切断する方法（ナガイら、 Methods in Enzymology, 153, 46 (1987)) が知られている。
さらに、 蛋白質中のペプチド結合を切断する方法として、 2—二トロー 5— チオシァノ安息香酸によるァシルシスティン結合の切断が知られている （「生 化学実験講座」 1， タンパク質の化学 II, 日本生化学会編， 東京化学同人発行， 第 247〜 250頁 1 976年） 。 しかしながら、 蛋白質からの目的ペプチド の切り出しについては、 開示されていない。
従来知られている技術において、融合蛋白質からの目的ペプチドの切り出し に際し、 ブロムシアンを用いる場合には、 メチォニンを含有するペプチドの製 造には適用することはできないし、 切り出し時の収率等に問題が多い。
このように、融合蛋白質またはポリペプチドから目的とするペプチドを効率 良く切り出す方法が望まれている。 発明の開示
本発明者らは、新規生理活性ペプチドである K i S S— 1ペプチドまたはそ の塩を効率良く製造する方法について鋭意検討を加えたところ、 N末端にシス ティンを有する蛋白質またはポリペプチドの N末端に K i S S - 1ペプチド を連結した融合蛋白質またはポリペプチドを製造し、次いでこれをペプチド結 合を切断する反応に付すことにより、 K i S S - 1ペプチドまたはその塩を効 率良く製造できることを見い出した。
すなわち、 本発明は、
( 1 ) N末端にシスティンを有する蛋白質またはペプチドの N末端に、 K i S S - 1ぺプチドを連結した融合蛋白質、ぺプチドまたはその塩を該システィン 残基のアミノ基側のペプチド結合の切断反応に付すことを特徴とする K i S S— 1ペプチドまたはその塩の製造法、
(2) N末端にシスティンを有する蛋白質またはペプチドの N末端に、 K i S S— 1ペプチドを連結した融合蛋白質またはペプチドをコードする DN Aを 有するベクターを保持する形質転換体を培養して融合蛋白質、ペプチドまたは その塩を発現させ、発現された融合蛋白質、 ペプチドまたはその塩を該システ イン残基のアミノ基側のペプチド結合の切断反応に付すことを特徴とする K i S S - 1ペプチドまたはその塩の製造法、
(3) K i S S— 1ペプチドの C末端がアミドである第（1 )項または第（2) 項記載の製造法、
(4)切断反応が S—シァノ化反応、 次いでアンモノリシスまたは加水分解反 応に付す反応である第 （1 ) 項または第 （2) 項記載の製造法、
(5) K i S S - 1ペプチドが配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有す るペプチドである第 （1 ) 項または第 （2) 項記載の製造法、
(6) K i S S - 1ペプチドが、 ①配列番号： 1で表されるアミノ酸配列の N 末端から第 4 0〜 5 4番目からなるアミノ酸配列を有するペプチド、②配列番 号： 1で表されるアミノ酸配列の N末端から第 4 5〜 54番目からなるアミノ 酸配列を有するペプチド、③配列番号： 1で表されるアミノ酸配列の N末端か ら第 4 6〜5 4番目からなるアミノ酸配列を有するペプチドまたは④配列番 号： 1で表されるアミノ酸配列の N末端から第 4 7〜54番目からなるアミノ 酸配列を有するペプチドである第 （1 ) 項または第 （2) 項記載の製造法、 (7) N末端にシスティンを有する蛋白質またはペプチドが、 N末端にシステ インを有するインターフェロン類、 インターロイキン類、繊維芽細胞成長因子、
(プロ） ゥロキナーゼ類、 リンホトキシン、 Tumor Necrosis Factor (TNF) 、 /3—ガラクロシダーゼ、 貯蔵タンパク類、 ストレプトアビシン、 プロテイン A、 プロテイン G、 Tissue Plasminogen Activator (TP A) またはそのムテイン もしくは断片である第 （1 ) 項または第 （2) 項記載の製造法、
(8) N末端にシスティンを有する蛋白質またはペプチドが、 配列番号： 3で 表されるアミノ酸配列を含有し、その N末端にシスティン残基が付加した蛋白 質またはペプチドである第 （1 ) 項または第 （2) 項記載の製造法、
(9) N末端にシスティンを有する蛋白質またはペプチドが配列番号： 3で表 されるアミノ酸配列を含有し、その N末端にシスティン残基が付加した蛋白で あり、 K i S S— 1ペプチドが配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を有する ペプチドであり、製造される K i S S - 1ペプチドが C末端がアミドである配 列番号： 1で表されるアミノ酸配列を有するペプチドである請求項 1または 2 記載の製造法、
( 1 0) N末端にシスティンを有する蛋白質またはべプチドの N末端に、 K i S S— 1ペプチドを連結した融合蛋白質、 ペプチドまたはその塩、
( 1 1) 配列番号： 3で表されるアミノ酸配列を含有し、 その N末端にシステ イン残基が付加した蛋白質の N末端に、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列 を含有する K i S S - 1ペプチドを連結した第（1 0)項記載の融合蛋白質、 ぺプチドまたはその塩、
( 1 2) 第 （ 1 0) 項記載の融合蛋白質またはペプチドをコ一ドする DNAを 含有する DNA、
( 1 3) ①配列番号： 4で表される塩基配列または②配列番号： 5で表される 塩基配列を有する第 （1 2) 項記載の DNA、
( 1 4) 第 （1 2) 項記載の DNAを有するベクタ一、
(1 5) 第 （1 4) 項記載のベクタ一を含有する形質転換体、 および
( 1 6) FERM B P— 6 9 0 7で表示されるエシュリヒア ·コリ MM2 94 (DE 3) /pTFC-K i S S— lを提供する。 さらに、 本発明は、
(1 7) 次の①〜④の工程；
① N末端にシスティンを有する蛋白質またはべプチドの N末端システィンに、 K i S S— 1ペプチドを連結した融合蛋白質またはペプチドをコードする D NAを作製する、
②該 DN Aを有するベクターを作製する、
③該ベクターを保持する形質転換体を培養して融合蛋白質、ペプチドまたはそ の塩を発現させる、
④発現された融合蛋白質、ぺプチドまたはその塩を該システィン残基のアミノ 基側のぺプチド結合の切断反応に付す、
からなる第 （2) 項記載の製造法を提供する。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明の反応工程における反応メカニズムを示す。
図 2は、 実施例 1で用いられた DN Aフラグメントを示す。
図 3は、実施例 1で得られた 2重鎖構成のヒト K i S S— 1ぺプチドを製造 する模式図を示す。
図 4は、実施例 2で得られたプラスミド pTFC— K i S S— 1の構築図を 示す。 発明を実施するための最良の形態
本発明の方法に用いられる K i S S— 1ペプチドとしては、例えば W〇 00 Z248 90 (国際特許出願 P CTZJ P 9 9Z0 5 90 5号） に記載のヒ ト K i S S— 1ペプチドが用いられ、 具体的には、 本願の配列番号： 1で表さ れるアミノ酸配列において、 N末端から第 47〜 54番目のアミノ酸配列を含 有し、 8乃至 54個のアミノ酸残基からなるペプチドなどがあげられる。
「本願の配列番号： 1で表されるアミノ酸配列において、 N末端から第 47 〜 54番目のアミノ酸配列を含有し、 8乃至 54個のアミノ酸残基からなるぺ プチド」 としては、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列において、 N末端か ら第 4 7〜 5 4番目のアミノ酸配列を含有し、かつ 8乃至 5 4個のアミノ酸残 基からなるぺプチドであればいかなるものであってもよいが、 ぺプチド活性
(例えば、 ペプチドと受容体の結合活性、 ペプチドによって引き起こされる受 容体発現細胞の細胞刺激活性など） などが、 実質的に同じであることを意味す る。 具体的には、 ①本願の配列番号： 1で表されるアミノ酸配列で表されるぺ プチド、 ②本願の配列番号： 1で表されるアミノ酸配列において、 N末端から 第 4 7〜5 4番目のアミノ酸配列を C末端に有し、 8乃至 1 5個のアミノ酸残 基からなるペプチドなどが用いられる。
より具体的には、 K i S S— 1ペプチドとしては、 ①本願の配列番号： 1で 表されるアミノ酸配列で表されるペプチド、②本願の配列番号： 1で表される アミノ酸配列の N末端から第 4 0〜 5 4番目からなるアミノ酸配列で表され るペプチド、③本願の配列番号： 1で表されるアミノ酸配列の N末端から第 4 5〜 5 4番目からなるアミノ酸配列で表されるぺプチド、④本願の配列番号： 1で表されるアミノ酸配列の N末端から第 4 6〜 5 4番目からなるアミノ酸 配列で表されるペプチド、 ⑤本願の配列番号： 1で表されるアミノ酸配列の N 末端から第 4 7〜5 4番目からなるアミノ酸配列で表されるペプチドなどが あげられる。
上記 K i S S - 1ペプチドは、 WO 0 0 Z 2 4 8 9 0 (国際特許出願 P C T/ J P 9 9 Z 0 5 9 0 5号）に記載のレセプター蛋白質 O T 7 T 1 7 5に対 し、 リガンド活性を有する。
本明細書におけるペプチドはペプチド標記の慣例に従って左端が N末端（ァ ミノ末端） 、 右端が C末端 （カルボキシル末端） である。 配列番号： 1で表さ れるペプチドの C末端は、 アミド （- C0NH2 )、 カルボキシル基 （- C00H)、 カル ポキシレート（- C00一）、 アルキルアミ ド （-C0NHR) またはエステル（- C00R)で あってもよい。 エステルまたはアルキルアミ ドの Rとしては、 例えばメチル、 ェチル、 n —プロピル、 イソプロピルもしくは n —ブチルなどの C i— eアルキ ル基、 シクロペンチル、 シクロへキシルなどの C 3— 8シクロアルキル基、 フエ ニル、 α —ナフチルなどの C 6— 1 2ァリール基、 ベンジル、 フエネチル、 ベン ズヒドリルなどのフエ二ルー C卜2アルキル、 もしくはひ 一ナフチルメチルな どのひ一ナフチルー C卜2アルキルなどの c 7— 14ァラルキル基のほか、 経口 用エステルとして汎用されるビバロイルォキシメチル基などがあげられる。 本発明の K i S S - 1ペプチドの塩としては、 生理学的に許容される塩基 (例えばアルカリ金属など） や酸 （有機酸、 無機酸） との塩が用いられるが、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては例 えば無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有 機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 シユウ酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベン ゼンスルホン酸） との塩などが用いられる。
本発明の方法に用いられる N末端にシスティンを有する蛋白質またはぺプ チドとしては、 特定されるものではない。 その N末端にシスティンを有しない 蛋白質またはべプチドの場合は、自体公知の方法により N末端にシスティンを 有するようにすればよい。
該 N末端にシスティンを有する蛋白質またはべプチドとしては、分子量が 1 00〜： L 00000のものが好ましく、 さらに、 分子量が 300〜 50000 のものが好ましい。 また、 N末端にシスティンを有する蛋白質またはペプチド としては、 1〜 1 000個のアミノ酸を有するものが好ましく、 さらに 3〜5 00個のアミノ酸を有するものが好ましい。
該蛋白質またはペプチドとしては、 例えばインターフェロン類、 インター口 ィキン類、 線維芽細胞成長因子 （ a F G F、 b F G Fなど） 等各種成長因子類、 (プロ）ゥロキナ一ゼ類、 リンホトキシン、 Tumor Necrosis Factor(TNF)、 3—ガラトシ夕ーゼなどの酵素タンパク類、 貯蔵タンパク類、 ストレプトアビ シン、 プロテイン A、 プロテイン G、 Tissue Plasminogen Act ivator (T P A) , これらのムテイン又はこれらの一部（断片） などの Ν末端にシスティンを有す るものがあげられる。 なかでも、 線維芽細胞成長因子 （a FGF、 bFGFな ど） またはそのムテインまたはこれらの一部 （断片） （例えば、 bFGF C S 23ムティンなど） などが好ましく用いられる。
bFGF CS 23ムティンとしては、 例えば、
Pro-Ala-Leu-Pro-Glu-Asp-Gly-Gly-Ser-Gly-Al -Phe-Pro-Pro-Gly-His-Phe- Lys-Asp-Pro-Lys-Arg-Leu-Tyr-Cys-Lys-Asn-Gly-Gly-Phe-Phe-Leu-Arg-I le- His-Pro-Asp-Gly-Arg-Val-Asp-Gly-Val-Arg-Glu-Lys-Ser-Asp-Pro-His-I le- Lys- Leu- Gin- Leu- Gin- Ala- Glu- Glu-Arg- Gly-Va卜 Va卜 Ser- lie- Lys-Gly- Va卜 Ser-Ala-Asn-Arg-Tyr-Leu-Al -Met-Lys-Glu-Asp-Gly-Arg-Leu-Leu-Ala-Ser- Lys-Ser- Val- Thr-Asp- Glu- Cys-Phe-Phe- Phe- Glu- Arg- Leu- Glu- Ser- Asn- Asn- Tyr-Asn-Thr-Tyr-Arg-Ser-Arg-Lys-Tyr-Thr-Ser-Trp-Tyr-Val-Ala-Leu-Lys- Arg-Thr- Gly- Gin- Tyr- Lys- Leu- Gly- Ser- Lys- Thr- G - Pro- Gly- Gin- Lys- Ala- Ile- Leu-Phe- Leu- Pro- Me卜 Ser- Ala-Lys- Ser (配列番号： 3)で表されるァミノ 酸配列を含有し、その N末端にシスティン残基が付加した蛋白質などがあげら れる。
本発明方法で用いられる融合蛋白質 （融合ペプチドを含む） をコードする D NAは、 （1)全塩基配列を化学的に合成してもよいし、 （2)蛋白質をコードす る塩基配列の N末端側にシスティンをコ一ドする塩基配列を配置し、さらにそ の N末端側に K i S S - 1ペプチドをコードする塩基配列を配置することに より該 DNAを構築してもよい。 また、 （3) 該ペプチドのフラグメントを得 るのが目的の場合には、 所望のフラグメントの直後のアミノ酸残基を site - directed mutagenesis 等の手法でシスティンに置換した該 D N Aを構築すれ ばよい。
上記の（1)の場合の製造法としては、 例えば、 自体公知のホスホアミダイ ド 法、 リン酸トリエステル法、 ジエステル法、 ハイドロジェンホスホネート法な どを用いて、 短いものなら一度に、 長いものでは分割して合成した後に T 4 D NAリガーゼを用いて連結して作成することが可能である。
上記の（2)の場合の製造法としては、 例えば、 C末端側の蛋白質をコードす る DNAは、 染色体または c DNAから適当な制限酵素で切断し、 ベクタ一に 連結して得るか、 もしくは cDN Aを取得する。 しかる後に N末端がシスティ ンになるように制限酵素で切断するか、 もしくは、 合成 DNAを全蛋白もしく はその一部の DN Aの 5 '—末端に結合し N末端がシスティンになるように改 変する。その 5 ' 一末端に目的の蛋白質をコ一ドする DN A (化学合成したもの でも、 生体よりクローニングしてきたものでもよい）をつなげる。 このようにして得られる融合蛋白質をコードする DN Aの具体例としては、 例えば式
Figure imgf000009_0001
TCTTTCGGTCTGCGTTTC-TGC または TGT- R (I)
〔式中、 Rは
CCCGAGGATGGCGGCAGCGGCGCCTTCCCGCCCGGCCACTTCAAGGAC CCCAAGCGGCTGTACTGCAAAAACGGGGGCTTCTTCCTGCGCATCCACCCCGACGGCCGA GTTGACGGGGTCCGGGAGAAGAGCGACCCTCACATCAAGCTACAACTTCAAGCAGAAGAG AGAGGAGTTGTGTCTATCAAAGGAGTGAGCGCTAATCGTTACCTGGCTATGAAGGAAGAT
TCTAATAACTACAATACTTACCGGTCAAGGAAATACACCAGTTGGTATGTGGCACTGAAA CGAACTGGGCAGTATAAACTTGGATCCAAAACAGGACCTGGGCAGAAAGCTATACTTTTT CTTCCAATGTCTGCTAAGAGCTGC (b F GF C S 2 3ムティンの断片）からなる塩基 配列を示す。 〕 で表わされる DNAなどがあげられる。
上記式 （ I ) はヒト （human) K i S S— 1ペプチドを含有するペプチドを コードする DNA塩基配列 （配列番号： 2) にシスティンをコードする塩基配 列を介して Rで示される塩基配列が結合していることを示す。
K i S S— 1ぺプチドをコードする DNAは、 上記式 （ I ) で表される DN Aや配列番号： 1 5で表される K i S S - 1ペプチド成熟体をコードする DN Aまたはその改変 DNA (例えば、 J. Natl. Cancer Inst. , 88, 1731, 1996； WO 98/39448) を用いて、 自体公知の方法に従って製造することもで さる。
5'末端に ATGを有し、 その下流に該融合蛋白質をコードする領域、 つい で翻訳終止コドンを有する DNA (プラスミド）は、化学合成で、 あるいは遺伝 子工学的に製造された公知の該蛋白質の cDNA、 もしくは、 染色体由来の該 蛋白質の DN Aを加工することにより製造することができる。
本発明の N末端にシスティンを有する蛋白質またはべプチドの N末端に K i S S— 1ペプチドを連結した融合蛋白質またはペプチドをコードする DN Aを、 従来の DNA技術、 例えば特定部位指向性変異誘発技術を用いて目的の ムティンをコードする DN Aに変換することができる。
特定部位指向性変異誘発技術は周知であり、アール'エフ ·レイザー（Lather, R. F.)及びジエイ · ピ一 · レコック（Lecoq, J. P.)、 ジエネティック ·ェンジ ニァリング（Genetic Engineering), ァカデミックプレス社（1 98 3年）第 3 1 - 50頁に示されている。 オリゴヌクレオチドに指示された変異誘発はェ ム ·スミス（Smith, M.) 及びエス ·ギラム（Gil lam, S.)、 ジエネティック ·ェ ンジニアリング：原理と方法、 プレナムプムス社（1 9 8 1年） 3巻 1ー 32 頁に示されている。
該融合蛋白質をコードする領域を有する DNAを有するプラスミドを製造 するにあたって、 ベクターとして用いられるプラスミ ドとしては、 例えば大腸 菌 （Escherichia coli) 由来の pB R 322 〔ジーン（Gene), 2 , 9 5 (1 9 7 7)〕 ， pBR 3 1 3 〔ジーン， , 7 5 ( 1 9 7 7)] , pB R 324, pB R 3 2 5 〔ジーン， A, 1 24 (1 9 7 8)] , pBR 3 2 7, pBR 32 8 〔ジーン, _9 , 2 87 (1 9 80)〕 ， pB R 3 29 〔ジーン， 1 7 , 7 9 ( 1 982)] ， ρ ΚΥ 2 289 〔ジーン， 3， 1 (1 9 7 8)] , ρΚΥ 2700 〔生化学， 52，
7 7 0 ( 1 98 0)〕 ， pACYC l 7 7 , pAC YC 1 84 〔ジャーナル'ォブ - バクテリオロジー（Journal of Bacteriology), J_34, 1 1 4 1 (1 9 78)] , p RK 248 , p RK 646 , pD F 〔メソッズ 'イン 'ェン ジ一モロジ一 (Methods in Enzymology), 6 8—, 2 68 (1 9 7 9)〕 ， pUC 1 8 , pUC 1 9 〔ャニシュ一ペロンら， ジーン（Gene), 3 3， 1 0 3 (1 98 5)〕 などがあ げられる。 また、 バクテリオファージ、 例えば λファージを使用した Agt系の Agt · λ C [Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.A. _ 1 , 45 7 9 (1 9 74)] ， い λ B (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.A. 7 2， 346 1 (1 9 7 5)〕 ， AD am 〔ジ一ン， 丄， 2 5 5 (1 97 7 )] ゃシヤロンべクタ一 〔サイエンス， (Science), 1 96, 1 6 1 ( 1 9 7 7) ; ジャーナル · ォブ · ビ一ロロジー (Journal of Virology), 2 9, 5 5 5 (1 9 7 9)〕 ， 繊維状ファージを使用 した即系の即 1 8, 即 1 9 〔ャニシュ一ペロンら， ジーン（Gene), 3 3， 1 0 3 ( 1 98 5)] ベクターなどもあげられる。 上記 DNAは、 ATGの上流にプロモータ一を有しているのが好ましく、 該 プロモーターは、形質転換体の製造に用いる宿主に対応して適切なプロモー夕 一であればいかなるものでもよい。
例えば大腸菌（Escherichia coli)では t卬プロモーター， lacプロモ一夕一， rec Aプロモーター， A PLプロモーター， lppプロモータ一， T 7プロモ一 タ一など、 枯草菌（Bacillus subtilis)では S P〇 1プロモーター， S P〇 2 ブロモーター， penPフロモ一タ一など、 酵母 (Saccharomyces cerevisiae)で は PH〇 5プロモーター， PGKプロモー夕一， GAPプロモーター， ADH プロモータ一など、動物細胞では S V 40由来のプロモータ一などがあげられ る。必要により SD (シャインアンドダルガーノ）配列をプロモーターの下流に 挿入してもよい。
T 7プロモータ一の系を用いる場合には、 T 7プロモ一夕一としては、 T 7 DNA上で見い出されている 1 7種のプロモー夕一 〔J. L. Oakley ら， Pro Natl. Acad. Sci, U. S.A, 74 : 426 6 -42 7 0 (1 9 7 7 ) , M. D. Rosa, Cell 1 6 ： 8 1 5 - 82 5 (1 9 7 9), N. Panayotatos ら， Nature, _280_ : 3 5 (1 97 9), J. J. Dunn ら， J. Mol. Biol., 1 6 6 : 47 7 - 53 5 (1 98 3)〕 のいずれでもよいが 1 0プロモー夕一 〔A. H. Rosenberg ら， Gene, 56 ： 1 2 5— 1 3 5 (1 98 7)〕 が好ましい。
転写ターミネータ一としては、 大腸菌の系で作動するターミネータ一、 好ま しくは Τφ夕一ミネーター 〔F. W. Studier ら， J. Mo I. Biol. , 1 89 : 1 1 3 - 1 3 0 (1 986)] が用いられる。
Τ 7 RNAポリメラーゼ遺伝子としては Τ 7遺伝子 〔F. W. Studier ら， J. Mol. Biol., 1 8 9 : 1 1 3— 1 3 0 ( 1 9 86)〕 をあげることが出来る。 ベクターは上記ベクターに T 7プロモー夕一， T 7夕一ミネ一夕一を組み込 んで構築されるのが好ましく、 このようなベクターとしては、 pET— 1， p ET— 2， pET— 3， ET- 4, pET- 5 [A. H. Rosenberg, Gene 5 6_： 1 2 5— 1 3 5 (1 987)〕 、 TB 96 0 - 2 〔EP - A— 49 99 90〕 などをあげることができるが、 好ましくは pTB 960 - 2が用いられる。 本発明の形質転換体は、上記方法で得られる発現用プラスミ ドを自体公知の 方法 〔例、 コーェン S, N， ら， プロシージング ·ォブ 'ナショナル ·ァ力デミ — 'ォブ 'サイエンス（Pro Natl. Acad. Sci. U. S. A.), 69， 2 1 10 ( 1 972 )〕 で宿主を形質転換することにより製造することができる。
形質転換される微生物の宿主としては、例えば、ェシエリシァ（Escherichia) 属菌， バチリス（Bacillus)属菌， 酵母， 動物細胞などがあげられる。
上記ェシェリシァ属菌の例としては、 ェシエリシァ ·コリ（E. coli)があげ られ、 具体的にはェシエリシァ 'コリ（Escherichiacoli)K 12 DH 1 〔プロ シ一ディングス ·ォブ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシズ（Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.)， 60， 160 (1 968)) , JM— 1 03 〔ヌ クレイック 'ァシッズ' リサーチ， （Nucleic Acids Research), 9， 309 (1 98 1)], J A22 1〔ジャーナル'ォブ'モレキュラー 'バイオロジー（Journal of Molecular Biology), 1 20, 5 1 7 (1 978)] , HB 1 0 1 〔ジャー ナル 'ォ ブ ·モレ キユラ一 ·バイオロジー， 41 , 459 (1 969)〕 ， C 600 〔ジエネティックス（Genetics), 39 , 440 (1954)〕 ， N 483 0 〔セル（Cell), 25 , 7 1 3 (1 98 1)〕 ， K— 12 MM 294 〔プロシ一 ディングス ·ォブ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシズ， _^, 4
1 74 ( 1 976)3 B L _ 2 1などがあげられる。
上記バチルス属菌としては、例えばバチルス.サチルス（Bacillus subtil is) があげられ、 具体的にはバチルス ·サチルス M 1 1 14 (ジーン， 24， 25 5 ( 1983))， 207 - 2 1〔ジャーナル'ォブ'バイオケミストリ一（Journal of Biochemistry), 95 , 87 (1 984)] などがあげられる。
上記酵母としては、例えばサッカロマイセス 'セレビシァェ（Saccharomyces cerevisiae)があげられ、 具体的には、 サッカロマイセス ·セレビシァェ AH
22 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75， 1 929 ( 1 978)〕 ， X S B 5 2 - 23 C [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77— 2 1 73 ( 1 98
0)〕 ， BH- 64 1 A(ATCC 28339), 20 B - 1 2 [Genetics, 85， 23 ( 1 976)] , GM3 C— 2 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
78 2258 (1 98 1)〕 などがあげられる。
動物細胞としては、 例えばサル細胞 COS— 7 〔セル（Cell), 23， 1 75 (1 9 8 1)〕 ， Vero 〔（日本臨床 ^J_， 1 2 0 9 (1 9 6 3)〕 ， チヤィニー ズハムス夕一細胞 CH〇 〔ジャーナル，ォブ ·ェクスペリメンタル ·メデイシ ン（J. Exp. Med.), 1 0 8, 9 4 5 (1 9 8 5)〕 ， マウス L細胞 〔ジャーナル · ォブ ·ナショナル ·キャンサ一 ·インスティチュート（L Nat. Cancer Inst.), ±, 1 6 5 (1 9 4 3)〕 ， ヒト FL細胞 〔プロシーデイングス ·ォブ ·ザ ·ソ サエティ ·フォー ·エキスペリメンタル ·バイオロジー，アンド 'メディシン (Proc. Soc. Exp. Biol. Med.), 9_4 , 5 3 2 (1 9 5 7)] ， ハムスター C細 胞などがあげられる。
T 7プロモーターの系を用いる場合には、その形質転換体の宿主としては、 Τ 7 RNAポリメラ一ゼ遺伝子（Τ 7遺伝子 1)〔F. W. Studierら， J. Mol. Biol. 1 8 9 : 1 1 3— 1 3 0 (1 9 8 6)〕 を組み込んだ大腸菌株、 例えば MM 2 9 4， DH— 1， C 6 0 0, J M 1 0 9, B L 2 1 , あるいは T 7 RNAポリメ ラーゼ遺伝子（T 7遺伝子 1 )を他のプラスミドと共に組込んだ大腸菌株など が用いられる。好ましくは T 7遺伝子 1を組み込んだ λファージが溶原化した MM 2 9 4株および B L 2 1株が用いられる。この場合 T 7遺伝子 1のプロモ —ターとしては、 イソプロピル一 1一チォ— β _D—ガラク卜ビラノシド（I P T Gと略することがある。）で発現が誘導される 1 acプロモー夕一が用いられ る。
ェシエリヒア属菌を形質転換するには、 例えば、 プロシージングズ *ォブ - ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンジィズ ·ォブ ·ザ ·ュ一エスェ ― (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 6 9巻， 2 1 1 0 ( 1 9 7 2)ゃジー ン （Gene) ， 1 7巻， 1 0 7 ( 1 9 8 2 )などに記載の方法に従って行なうこと ができる。
バチルス属菌を宿主として形質転換するには、 例えば、 モレキュラー 'アン ド · ジェ不ラ レ - ジェネティックス (Molecular and General Genetics), 168, 111 (1979)など公知の方法に従って行なうことができる。
酵母菌を宿主として形質転換するには、 例えば、 プロシージングズ ·ォブ - ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンジィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスェ 一 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 75, 1929 (1978)などの公知の方法に従つ て行なうことができる。
動物細胞を宿主として形質転換するには、例えば、ヴィーロロジー（Virology, 52, 456 (1973)などの公知の方法に従って行なうことができる。
融合蛋白は、 上述の形質転換体を培地に培養し、 産生された融合蛋白を採取 することにより製造することができる。
培地の pHは約 6〜 8が望ましい。
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えばグルコース、 カザミ ノ酸を含む M 9培地 〔Miller, ジャーナル ·ォブ ·ェクスペリメンッ 'イン ' モレキュラー · ジェネティックス (Journal of Experiments in Molecular Genetics), 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972)] が 好ましい。 ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、 例えば 3 i3—インドリル アクリル酸やイソプロピル )3— D—チォガラクトピラノ シド （ I PTG) のような薬剤を加えることができる。
宿主がェシエリヒア属菌の場合、培養は通常約 1 5〜43°Cで約 3〜24時 間行い、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約 3 0〜 40 °Cで約 6〜 24時間行 レ 必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えばバークホ ールダ一（Burkholder)最小培地 〔Bostian， K. L. ら、 プロシージングス 'ォ ブ'ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci.) USA, 77, 4505 (1980)] があげられる。 培地の pHは約 5〜 8に調整するのが好まし レ^ 培養は通常約 20°C〜 3 5°Cで約 24〜 7 2時間行い、 必要に応じて通気 や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば約 0. 2〜20 %好ましくは約5〜2 0 %の胎児牛血清を含む MEM培地〔サイェン ス（Science), 122, 501 (1952)) ， DME培地 〔ヴイロロジー（Vi rology)， 8, 396 (1959)〕 ， R PM I 1 640培地 〔ジャーナル ·ォブ ·ザ ·アメリカン - メァィカル ' アソシエーション (The Journal of the American Medical Association), 199， 519 (1967)] ， 1 9 9培地 〔プロシーディング ·ォブ 'ザ · ソサイエティ · フォー ·ザ ·バイオロジカル · メディスン（Proceeding of the Society for the Biologcal Medicine), 73, 1 (1950)] などがあげられる。 Hは約 6〜 8であるのが好ましい。 培養は通常約 30〜40°C、 培養時間は約 1 5〜60時間行い、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
融合蛋白質は、 上記形質転換体を培養し、 培養物中に該融合蛋白質を生成， 蓄積せしめ、 これを採取することにより製造することができる。
培地としては、 例えばグルコース、 カザミノ酸を含む M 9培地 〔ミラー， J., ェクスペリメンッ 'イン 'モレキユラ一 · ジエネティクス（Experiments in Molecular Genetics), 43 1— 433 (Cold Spring Horbor Laborator t, New York 1 972)) , 2 X YT培地 〔メシング， メソッド ·イン .ェンザィモロ ジー（Methods in Enzymology) , 丄 0 1， 20 (1 983)] LB培地などがあ げられる。
培養は通常約 1 5〜43°じで約3〜24時間行い、 必要により、 通気や撹拌 を加えてもよい。
Ac I tsリブレッサーと、 λ P L—プロモー夕一を含有する発現ベクターと を有する組換え体を使用する場合には、培養は約 1 5〜 36 °C好ましくは約 3 0°C〜 36°Cの温度で行い、 Ac I tsリプレッサーの不活化は約 37° (：〜 4 2 °Cで行うのが好ましい。 また recAプロモーターをより効率良く働かせるた め、 すなわち recA遺伝子発現抑制機能を低下せしめるため、 必要によりマイ トマイシン C， ナルジキシン酸などのような薬剤を添加したり、 紫外線を照射 する、 あるいは培養液の pHをアル力リ側に変化させてもよい。
T 7プロモーターの系を用いている場合には、 （ 1 ) lacプロモー夕一の下流 に連結されている T 7遺伝子（RN Aポリメラ一ゼ遺伝子）を発現させる時は I PTGなどを添加する、もしくは（2) λ P Lプロモーターの下流に連結され ている Τ 7遺伝子（RNAポリメラーゼ遺伝子） を発現させる時は培養の温度 を上昇させることなどにより、生成する Τ 7ファージ RN Αポリメラ一ゼ 1に より特異的に T 7プロモーターを作動させる。
培養後、 公知の方法で菌体を集め、 例えば緩衝液に懸濁したのち、 例えば、 蛋白変性剤処理， 超音波処理ゃリゾチームなどの酵素処理， グラスビーズ処理， フレンチプレス処理， 凍結融解処理などを行って菌体を破砕し、 遠心分離など 公知の方法によって上清を得る。
上記により得られた上清から、 融合蛋白質を単離するには、 通常知られてい る蛋白質の精製法に従えばよい。 例えば、 ゲル濾過法， イオン交換クロマトグ ラフィー， 吸着クロマトグラフィー， 高速液体クロマトグラフィー， ァフィ二 ティ一クロマトグラフィー， 疎水クロマトグラフィー， 電気泳動等を適切に組 み合せて行うことができる。 また、 該融合蛋白質は、 精製することなく、 ある いは部分精製の状態で、 次の反応工程に進んでもよい。
次に、 このようにして得られる融合蛋白質やペプチドをシスティン残基のァ ミノ基側のペプチド結合の切断反応に付す。 該切断反応としては、 例えば、 S 一シァノ化反応次いで加水分解反応があげられる。 K i S S— 1ぺプチドのァ ミドまたはその塩を最終物として得る場合には、 該切断反応としては、 例えば、
S —シァノ化反応次いでアンモノリシスを行うことがあげられる。該 S —シァ ノ化反応は、 原料化合物に、 S —シァノ化試薬を作用させることにより行なう。
S —シァノ化試薬としては例えば 2—二トロ— 5—チオシァノ安息香酸（N
T C B ) , 1—シァノ一 4ージメチルァミノピリジゥム塩（D M A P— C N) , C N—イオンなどがあげられる。該 S _シァノ化試薬の量は、 モル数で全チォ —ル基の約 2倍から 5 0倍量であればよく、好ましくは約 5倍〜 1 0倍量であ る。
反応温度は約 0 °C〜8 0 °Cの間であれば、 いずれでもよく、 約 0 ° (：〜 5 0 °C の間がより好ましい。 用いる溶媒としては、 S —シァノ化試薬と反応しないも のであれば、 いずれの緩衝液でもよいが、 例えば、 トリスー塩酸緩衝液， トリ スー酢酸緩衝液， リン酸緩衝液， ホウ酸緩衝液， などがあげられる。 また、 有 機溶媒は、 S —シァノ化試薬と反応しないものであれば、 存在していてもよい。 該反応は、 pH 1〜 1 2の間で行なうのが良い。 特に、 N T C Bを用いる場 合には] D H 7〜 1 0， D M A P— C Nを用いる場合には S— S交換反応を防止 するため、 pH 2〜 7の間が好ましい。 また、 反応液中には、 塩酸グァニジン 等の変性剤が存在していてもよい。
上記アンモノリシスまたは加水分解反応としては、例えばアル力リ処理に付 すことがあげられる。
該ァルカリ処理としては、原料化合物を含有する水溶液の pHを 7〜 1 4に、 調整することにより行なわれる。
該 pHの調整は、 例えばアンモニア、 水酸化ナトリウム， 後述するァミノ化 合物， トリツマベース （トリス 〔ヒドロキシメチル〕 一ァミノメタン） ， リン 酸第 2ナトリウム， 水酸化カリウム， 水酸化バリウム等の溶液を原料化合物を 含有する水溶液に適当量加えて行うが特にアンモニアなどが好ましい。
上記反応の際の溶液の濃度としては、たとえばアンモニアまたはァミノ化合 物の場合は約 0. 0 1〜 1 5 N好ましくは約 0. 1〜 3 N、水酸化ナトリウムの 場合は約 0. 0 1〜2 N好ましくは約0. 0 5〜： L N、 トリツマベースの場合は 約 lmM〜 1 M好ましくは約 2 0mM〜2 0 0mM、 リン酸第 2ナトリゥムの場 合は約 1πιΜ〜 1 Μ好ましくは約 1 OmM〜 l 0 OmM、 水酸化カリウムの場合 は約 0. 0 1〜4N好ましくは約0. 1〜2 Nがあげられる。反応温度は約一 2 0°C〜8 0°Cの間であればいずれでもよく、約— 1 0°C〜5 0°Cの間がより好 ましい。
反応時間は、 好ましくは、 S—シァノ化反応は約 1〜6 0分好ましくは約 1 5〜 3 0分が、加水分解反応は約 5分〜 1 0 0時間好ましくは 1 0分〜 1 5時 間が、アンモノリシスは約 5分〜 2 4時間好ましくは約 1 0〜 1 8 0分があげ られる。
該ァミノ化合物としては、 例えば、 式 R 1 —（NR 2)— H (式中、 R 1お よび R 2は同一または異なって、 （i)水素原子、 （iD ^— 2。アルキル基， C3 —8シクロアルキル基， C6— 14ァリール（aryl)基または C6— 14ァリール— C i _3アルキル基 （これらは置換基を有していないかあるいは 1〜 3個のアミノ 基， 水酸基などを炭素原子上に有していてもよい） 、 （iii)置換されていても よいアミノ基、 （iv)水酸基または (：ェ アルコキシ基を示す。 ） で表される化 合物などがあげられる。
上記の S—シァノ化およびアンモノリシスまたは加水分解により、 〔図 1〕 に示される反応が起こると考えられる。
本発明の製造法で得られる K i S S— 1ペプチドの C末端は、前記したよう にアミ ド （-C0NH2)、 カルボキシル基、 カルボキシレート（-C00— )、 アルキル アミド （-C0NHR) またはエステル（-C00R)であってもよく、 なかでもアミド、 カルボキシル基（-C00H)またはアルキルアミ ドが好ましく、 特にアミドまたは アルキルアミドが好適である。 具体的には、 本発明の製造法で得られる K i S S— 1ペプチドの C末端は、 〔図 1〕 に示される一 CO— Xであってよい。 X は R 1— (NR 2)— （式中、 各記号は前記と同意義を示す。 ） または〇Hを示 す。
上記 C卜2。アルキルの例としては、 例えば、 メチル， ェチル， プロピル， イソプロピル， ブチル， sec-ブチル， ペンチル， イソペンチル， ネオペンチル, 1—ェチルペンチル， へキシル， イソへキシル， ヘプチル， ォクチル， ノナニ ル， デカニル， ゥンデ力ニル， ドデカニル， テトラデカニル， ペン夕デカニル, へキサデ力ニル， ヘプ夕デカニル， ォクタデカニル， ノナデカニルおよびエイ コサニルなどがあげられる。
上記 c3_8シクロアルキルの例としては、 例えば、 シクロプロピル， シクロ ブチル， シクロペンチル， シクロへキシル， シクロへプチル， シクロォクチル などがあげられる。
上記 c6— 14ァリールの例としては、 フエニル， ナフチル， アンスリル， フ ェナンスリル， ァセナフチレニルなどがあげられる。
上記 c6— 14ァリ一ルー c^— 3アルキルの例としては、 例えばベンジル， フ エネチル， 3—フエニルプロピル， （1—ナフチル）メチル， （2—ナフチル） メチルなどがあげられる。
上記 C卜6アルコキシの例としては、 例えばメトキシ， エトキシ， プロポキ シ， ブトキシ， ペンチルォキシ， へキシルォキシなどがあげられる。
上記（Hi)の置換されていてもよいァミノの置換基の例としては、 例えばァ ミノ酸， 2〜 10個のアミノ酸からなるペプチドなどがあげられる。
上記アミノ酸としては、 L一体でも D—体でもよく、 その例としては、 例え ば、 Ala, Arg, Asp, Asn, Glu， Gin, Gly, His, lie, Met, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser.Thr, Trp, Tyr, Val などがあげられる。
上記ペプチドの例としては、 例えば、 H-D-Leu- Leu- Arg- Pro- NH - C2H5， H- Va l -Al a-Leu-D-Al a-Al a-Pro-Leu-Al a-Pro-Arg-OH などがあげられる。
上記した中でも、 R 2としては水素原子、 R 1としては水素原子または
—2。アルキル基が好ましい。
上記アンモノリシス反応において、アンモニアまたはァミノ化合物を用いた 場合には、 対応するアミ ド体が得られる。
切り出された目的べプチドを単離するには、通常知られているべプチドの精 製法に従えばよい。 例えば、 ゲル濾過法， イオン交換クロマトグラフィー， 高 速液体クロマトグラフィー， ァフィ二ティ一クロマトグラフィー， 疎水クロマ トグラフィー， 薄層クロマトグラフィー， 電気泳動等を適宜組み合せて行うこ とができる。
このようにして得られる K i S S— 1ぺプチドまたはその塩は、 公知の精 製手段、 例えば、 抽出、 塩析、 分配、 再結晶、 クロマトグラフィーなどによ り、 反応溶液から単離 ·精製することもできるが、 好ましい例として、 例え ば、 S P—セファロ一ス （フアルマシア バイオテク（株）） 、 D E A E - 5 P W (東ソ一（株）） 、 あるいは S P— 5 P W (東ソ一（株）） を介したイオン 交換クロマトグラフィーなどによる精製法があげられる。
得られる K i S S— 1ペプチドまたはその塩は、必要によりこれを凍結乾燥 により粉末とすることもできる。 凍結乾燥に際しては、 ソルビトール， マンニ トール， デキストロース， マルト一ス， トレハロース， グリセロールなどの安 定化剤を加えることができる。
本発明の方法で製造される K i S S— 1ぺプチドまたはその塩は滅菌水， ヒ ト血清アルブミン（H S A) ,生理食塩水その他公知の生理学的に許容される担 体と混合することができ、 哺乳動物 （例、 ヒ卜） に対して非経口的に又は局所 に投与することができる。 たとえば、 その 1日投与量は 1人あたり、 約 0 . 0 l mg— 5 0 mg、 好ましくは、 約 0 . 1 mg— 1 0 mgを、 静注または筋注などによ り非経口的に投与することができる。
本発明の方法で製造される K i S S— 1ぺプチドまたはその塩を含有する 製剤は、 塩， 希釈剤， アジュバント， 他の担体， バッファー， 結合剤， 界面活 性剤，保存剤のような生理的に許容される他の活性成分も含有していてもよい。 非経口的投与製剤は、滅菌水溶液又は生理学的に許容される溶媒との懸濁液ァ ンプル、または生理学的に許容される希釈液で用時希釈して使用しうる滅菌粉 末（通常ペプチド溶液を凍結乾燥して得られる）アンプルとして提供される。 本発明の製造法によって得られる K i S S— 1ペプチドまたはその塩は癌転移 抑制活性を有するため、 あらゆる癌 （例えば、 肺癌、 胃癌、 肝癌、 滕癌、 大腸癌、 直腸癌、 結腸癌、 前立腺癌、 卵巣癌、 子宮類癌、 乳癌等） の予防または治療薬と して有用である。
また、 K i S S— 1ペプチドまたはその塩は胎盤機能調節作用を有するため、 絨毛癌、 胞状奇胎、 侵入奇胎、 流産、 胎児の発育不全、 糖代謝異常、 脂質代謝異 常または分娩誘発の予防または治療薬として有用である。 本明細書および図面において、 アミノ酸， ペプチド， 保護基， 活性基， その 他に関し略号で表示する場合、 それらは I UP AC— I UB (Commission on Biochemical Nomenclature)による略号あるいは当該分野における慣用略号に 基づくものであり、 その例を次にあげる。 また、 アミノ酸などに関し光学異性 体がありうる場合は、 特に明示しなければ L体を示すものとする。
DN A デォキシリポ核酸
A アデニン
T チミン
G グァニン
C シ卜シン
NA リボ核酸
EDTA ミン四酢酸
Gly グリシン
Ala ァラニン
Val バリン
し eu ロイシン
I Ie イソロイシン
Ser セリン
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Glx ： グルタミンまたはグルタミン酸
ATP ： アデノシン三リン酸
本願明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す
[配列番号： 1]
20 K i S S - 1ぺプチドのアミノ酸配列を示す。
[配列番号： 2 ]
K i S S - 1ぺプチドをコードする DNAの塩基配列を示す。
[配列番号： 3 ]
b F GF C S 23ムティンのアミノ酸配列を示す。
25 [配列番号： 4 ]
式（I)で表される融合蛋白質をコ一ドする DNAの断片の塩基配列を示す, 己列番号： 5 ]
式（I) で表される融合蛋白質をコードする DNAの断片の塩基配列を示す < [配列番号： 6 ] b F GFC S 2 3ムティンの断片をコードする DNAの塩基配列を示す。
[配列番号： 7 ]
実施例 1において i S S— 1ペプチドの構造遺伝子の調製に用いたオリ ゴマーの塩基配列を示す。
[配列番号： 8 ]
実施例 1において i S S— 1ぺプチドの構造遺伝子の調製に用いたオリ ゴマ一の塩基配列を示す。
[配列番号： 9 ]
実施例 1において i S S— 1ぺプチドの構造遺伝子の調製に用いたオリ ゴマーの塩基配列を示す。
[配列番号： 1 0]
実施例 1において i S S— 1ぺプチドの構造遺伝子の調製に用いたオリ ゴマーの塩基配列を示す。
[配列番号： 1 1 ]
実施例 1において K i S S— 1ペプチドの構造遺伝子の調製に用いたオリ ゴマーの塩基配列を示す。 '
[配列番号： 1 2]
実施例 1において i S S— 1ぺプチドの構造遺伝子の調製に用いたオリ ゴマーの塩基配列を示す。
[配列番号： 1 3]
実施例 1において i S S— 1ぺプチドの構造遺伝子の調製に用いたオリ ゴマーの塩基配列を示す。
[配列番号： 1 4]
実施例 1において i S S— 1ペプチドの構造遺伝子の調製に用いたオリ ゴマーの塩基配列を示す。
[配列番号： 1 5]
K i S S— 1ぺプチド成熟体のアミノ酸配列を示す。 以下に実施例をあげて、 本発明をさらに詳しく説明するが、 本発明はこれら に限定ざれるものではない。
実施例
実施例 1 K i S S _ 1ペプチドをコードする DNAの製造
(a) DNA断片の合成
〔図 2〕 に示す 8種の DN A断片 （# 1、 # 4， # 5, # 8 : アマシャム - フアルマシア 'バイオテク社、 # 2、 # 3， # 6， # 7 ：キコ一テック社） （配 列表中、 配列番号： 7〜 1 4) を用いて K i S S— 1ペプチドの構造遺伝子を 調製した （図 3) 。
(b) DNAオリゴマーのリン酸化
5 ' になるべき # 1 (配列番号： 7) および # 8 (配列番号： 1 4) を除い た 6種の DNAオリゴマー （# 2〜# 7) (配列番号： 8〜 1 3) 各々を、 2 5 1のリン酸化反応液 〔DNAオリゴマー 1 0 /ig, 5 OmM Tris-HCl, p H 7. 6, l OmM MgCし， ImMスペルミジン， l OmM ジチオスレイト一 ル （以後 DTTと略記） ， 0. lmg/mlゥシ血清アルブミン （以後 B SAと略 記） ， ImM ATP， 1 0ユニット T 4ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造） 〕 中で 3 7°C 1時間反応させ、 各オリゴマーの 5 ' 末端をリン酸化した。 フエ ノール処理を行った後、 2倍量のエタノールを加え、 一 7 O :に冷却した後、 遠心で DN Aを沈殿させた。
(c) DN Aフラグメントの連結
上記 a)で得られた DNAフラグメントと # 1および # 8を合わせ 1 2 0 μ 1 とした。 この混合液を 9 0でで 1 0分間保った後、 室温まで徐冷しァニーリ ングを行った。 TaKaRa DNA Ligation Kit ver.2 (宝酒造） を用いてライゲ一 ション反応を行った。 ァニ一リング液 3 0 1に Ligation Kit II液 3 0 I を加えよく混合した後、 Ligation Kit I液 6 0 x l を加え、 3 7°C、 1時間 反応させ、 ライゲーシヨンを行った。 フエノール処理を行った後、 水層を回収 し 2倍量のエタノールを加え、 — 7 0°Cに冷却した後、 遠心で DN Aを沈殿さ せた。この様にして得られた DNAフラグメントを T 4ポリヌクレオチドキナ ーゼ （宝酒造） によるリン酸化を行った後、 以下の（d)に供した。
(d) K i S S— 1ペプチド発現べクタ一の構築 〔図 4〕 発現用べクタ一としては P TF C (特開 2000— 27087 1、特願平 1 1— 080303号） を Nd e Iおよび A v a I (宝酒造） で 37 t: 4時間 消化した後、 1 %ァガロースゲル電気泳動により 4.4kbの D N A断片を QIAquick Gel Extraction Kit (キアゲン社） を用いて抽出し、 25 1の T E緩衝液に溶解した。 この pTFCの Nd e I、 Av a I断片と上記により調 製した K i S S _ 1ペプチドの構造遺伝子を TaKaRa DNA ligation kit ver.2 (宝酒造） を用いてライゲーシヨン反応を行った。
この反応液を 10 1用いて大腸菌 JM109コンビテントセル （東洋紡） を 形質転換し、 10 a gZm 1のテトラサイクリンを含む LB寒天培地上に播き、 37°Cで 1晚培養し、 生じたテトラサイクリン耐性コロニー選んだ。 この形質転 換体を LB培地でー晚培養し、 QIAprep8MiniprepKit (キアゲン社） を用いてプ ラスミド pTFC-KiSS- 1を調製した。 この K i S S _ 1構造遺伝子部分の塩基配列 をアプライドバイオシステムズ社モデル 377 DNAシーケンサ一を用いて確認 した。 プラスミド pTFC- KiSS- 1で大腸菌 MM294 (DE 3) を形質転換し、 K i S S- 1ペプチド一 CS 23融合タンパク質発現株 M294(DE3)/pTFC-KiSS-lを 得た （図 4) 。
Escherichia coli MM294(DE3)/pTFC-KiSS-lは受託番号 FERM BP-6907で 1999 年 10月 4日付で通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託された。 また 1999年 9月 16日付で受託番号 IF016321 として財団法人発酵研究所 （IF0) に寄 託された。
(d) K i S S— 1ぺプチドの製造
MM 294 (DE 3) ZpTFC— K i S S— 1を 5. OmgZLのテトラ サイクリンを含む LB培地に 1 L ( 1 %ペプトン、 0. 5 %酵母エキス、 05 % 塩化ナトリウム） を用いて 2 L容フラスコ中で 37 °C、 8時間振とう培養した。 得られた培養液を 1 9 Lの主発酵培地（ 1. 68 %リン酸 1水素ナトリウム、 0. 3 %リン酸 2水素カリウム、 0. 1 %塩化アンモニゥム、 0. 05 %塩化 ナトリウム、 0. 025 %硫酸マグネシウム、 0. 02 %消泡剤、 0. 000 25%硫酸第1鉄、 0. 0005 %塩酸チアミン、 1. 5 %ブドウ糖、 1. 5% カザミノ酸） を仕込んだ 50 L容発酵槽へ移植して、 30°Cで通気攪拌を開始 した。 培養液の濁度が 5 0 0クレット単位になったところで、 イソプロピル— β—D—チォガラクトピラノシドの最終濃度が 1 2mg/Lになるように添 加し、 さらに 6時間培養を行った。 培養終了後、 培養液を遠心分離し、 約 6 0 0 gの湿菌体を取得し、 一 8 0°Cで保存した。
実施例 2
実施例 1で得た菌体 1 0 0 gに 1 OmM EDTA ( H 6. 0 ) 溶液 3 0 Oml を加え、超音波処理（B RAN S ON S ON I F I ER MODE L 4 5 0) した後、 遠心分離 （ 1 0 0 0 0 rpm、 6 0分） を行った。 上澄液はプールし、 沈殿物を用いて再び同様の操作を行った。プールした上澄液は pH 6. 0に調整 し、 5 OmM リン酸緩衝液（pH 6. 0)で平衡化した AF- HeparinToyopearl 6 5 0 Mカラム （ 1 1. 3 cm I DX 1 3. 5 cmL、 東ソ一） に通液し、 吸着、 洗浄した後、 0— 1 0 0 %B (B= 5 OmM リン酸緩衝液 + 2 M NaCl、 p H 6. 0) の段階勾配で溶出を行い、 K i S S- 1ペプチド— C S 2 3融合タン パク質画分を得た （1 0 0分間の勾配で溶出時間約 1 0 0分の画分） 。 この溶 出液をペリコンミニカセット （ミリポア社） で濃縮した後、 さらに 0. 1 M酢 酸を加えながら濃縮を行い、 K i S S— 1ペプチド— C S 2 3融合タンパク質 の 0. 1 M酢酸溶液を得た。 この溶液に最終濃度 6 Mとなるように尿素を添加 し た 後 、 D M A P — C N l-cyano-4-dimethylaminopyr idinium tetrafluoroborate) 約 1 0 Omgを加えて、 室温で 1 5分間反応した。 反応終 了後、反応液を 5 OmMリン酸 1カリウムで平衡化した Sephadex 〇ー 2 5カ ラム （46iM I D X 6 0 0mmL、 フアルマシア） に通液し、 平衡化に用いた 5 OmMリン酸 1力リゥムを 6mlZmin の流速で展開し、 S—シァノ化された K i S S— 1ペプチド _ C S 2 3融合タンパク質画分を得た。この溶出液をペリ コンミニカセット （ミリポア社） で濃縮 ·脱塩を行い、 K i S S— 1ペプチド -C S 2 3融合タンパク質の脱塩液を得た。この脱塩液に最終濃度 6 Mとなる ように尿素を添加した後、 さらに、 3Mアンモニア濃度となるように 2 5 %ァ ンモニァ水を加え、 室温で 1 5分間反応した。 反応終了後、 酢酸で pH 6. 0 に調整し、 K i S S— 1ペプチド （アミ ド体） を得た。 この反応液を 5 OmM リン酸 1力リゥムで平衡化した Sephadex G— 2 5カラム（4 6mm I D X 6 0 OmmL) に通液し、 平衡化に用いた 5 OmMリン酸 1カリゥムを 6 mlZminの流 速で展開し、 K i S S— 1ペプチド画分 （アミド体） を得た。 この画分を、 3 M尿素を含む 5 OmM ME S + 3 M尿素 （pH4. 5) で平衡化した S P— 5 PW (2 1. 5mml DX 1 5 OmmL, 東ソ一） に通液し、 吸着、 洗浄した後、 0 - 30 %B (B= 5 OmM リン酸緩衝液 + 1 M NaCl+ 3M尿素、 pH 4. 5) の段階勾配で溶出を行い、 K i S S— 1ペプチド （アミド体） 画分を得た (60分間の勾配で溶出時間約 30分の画分） 。 この画分を、 さらに 0. 1 % トリフルォロ酢酸で平衡化した C 4 P - 50 (2 1.5mmI DX 300minL、 昭和電工） に通液し、 吸着、 洗浄した後、 20— 50%B (B ： 80 %ァセト 二トリル Z 0. 1 %トリフルォロ酢酸） の段階勾配で溶出を行い、 K i S S— 1ペプチド （アミド体） 画分 （60分間の勾配で溶出時間約 45分の画分） を プールした後、 凍結乾燥を行い、 K i S S— 1ペプチド （アミド体） 凍結乾燥 粉末約 4 Omgを得た。
実施例 3 (K i S S— 1ペプチドの特徴の決定）
a) アミノ酸組成分析
アミノ酸組成をアミノ酸分析計 （日立 L— 8 5 0 O A Amino Acid Analyzer) を用いて決定した。 その結果、 K i S S _ 1ペプチドの D N A塩基 配列から予想されるアミノ酸組成と一致した 〔表 1〕 。
〔表 1〕
1モル当たりの KiSS-ΐΛ"プチト'の塩基配列
アミノ酸 残 基 数 から予測される値
A s X 3. 5 4
Th r 0. 9
S e r 7. 3 8
G 1 x 7. 0 7
P r o 8. 1 8
G 1 y 4. 9 5
A 1 a 2. 9 3
C y s 0 0 V a 1 2 0 2
Me t 0 0
I 1 e 0 9 1
L e u 5 5
Ty r 1 D 1
P h e 1 9 2
H i s 1
L y s 0 1
A r g 3. 8 4
T r p 0 4 1
酸加水分解（6N HCl-4%thioglycolic acid 24-48hr加水分解の平均値)
*) 0時間に外挿した値 '
b) N末端アミノ酸配列分析
N末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー（P Eアプライドバイオ システムズ モデル 492) を用いて決定した。 その結果、 K i S S— 1ぺプ チドの DNA塩基配列から予想される N末端アミノ酸配列と一致した 〔表 2〕 。 〔表 2〕
N末端アミノ酸配列分析
検出された KiSS - 1へ。フ。チドの塩基配列
残基 N o PTH*) -アミノ酸 から予測されるアミノ酸
1 G 1 y (28) G 1 y
2 Th r (24) Th r
3 S e r (12) S e r
4 L e u (14) L e u
5 S e r (9) S e r
6 P r o (16) P r o
7 P r o (17) P r o
8 P r o (14) P r o 9 G 1 u (7) G 1 u
10 S e r (4) S e r
1 1 S e r (6) S e r
100 pmo 1を用いた，
*) フェニー
c) C末端アミノ酸分析
C末端アミノ酸をアミノ酸分析計 （日立 L— 8 5 0 0 A Amino Acid Analyzer) を用いて分析したが、 C末端はアミド化されているため、 不検出で あった 〔表 3〕 。
〔表 3〕
C末端アミノ酸分析
C末端アミノ酸 回収率
KiSS-1へ。フ。チド （％)
P h e - 気相ヒドラジン分解法（100°C，3.5hr).
実施例 4 (生物活性測定）
実施例 2で取得したヒト K i S S - 1ペプチドを用いて、 WO 99/3397 6の実施例 3に記載の方法 （細胞内カルシウムイオン濃度上昇活性） で活性を測 定し、 ヒト胎盤抽出液より精製した標品と同等の活性を有することを確認した。 実施例 5 ( 1 33— 1ぺプチド （非アミド体） の製造）
実施例 1で得た菌体 1 00 gに 1 OmM EDTA (pH 6.0)溶液 300ml を加え、超音波処理（B RAN S ON SON I F I ER MODE L 450) した後、 遠心分離 （ 10000 rpm、 60分） を行った。 上澄液はプールし、 沈殿物を用いて再び同様の操作を行った。プールした上澄液は pH 6.0に調整 し、 5 OmM リン酸緩衝液（pH 6.0)で平衡化した AF- Heparin Toyopearl 6 50 Mカラム （1 1. 3 cm I DX 1 3. 5 cmL、 東ソ一） に通液し、 吸着、 洗诤した後、 0— 1 00 %B (B= 5 OmM リン酸緩衝液 + 2 M NaCl、 H 6.0) の段階勾配で溶出を行い、 K i S S- 1ペプチド一 CS 23融合タン パク質画分を得た （1 00分間の勾配で溶出時間約 1 0 0分の画分） 。 この溶 出液をペリコンミニカセット （ミリポア社） で濃縮した後、 さらに 0. 1 M酢 酸を加えながら濃縮を行い、 K i S S— 1ペプチド一 C S 2 3融合タンパク質 の 0. 1 M酢酸溶液を得た。 この溶液に最終濃度 6 Mとなるように尿素を添加 した後、 DMAP— CN 約 1 0 Omgを加えて、 室温で 1 5分間反応した。 反 応終了後、反応液を 5 OmMリン酸 1カリウムで平衡化した Sephadex G— 2 5カラム （46mm I D X 6 0 OmmL、 フアルマシア） に通液し、 平衡化に用い た 5 OmMリン酸 1力リゥムを 6mlZmin の流速で展開し、 S—シァノ化され た K i S S— 1ペプチド一 C S 2 3融合タンパク質画分を得た。この溶出液を ペリコンミニ力セット （ミリポア社） で濃縮 ·脱塩を行い、 K i S S— 1ぺプ チドー C S 2 3融合タンパク質の脱塩液を得た。この脱塩液に最終濃度 6Mと なるように尿素を添加した後、 さらに、 0. 0 5N NaOH濃度となるよう に I N N aOHを加え、 0°Cで 1 5分間反応した。 反応終了後、 酢酸で p H6. 0に調整し、 K i S S _ lペプチド （非アミド体） を得た。 この反応液 を 5 OmMリン酸 1カリウムで平衡化した Sephadex G— 2 5カラム （46讓 I DX 600 L) に通液し、 平衡化に用いた 5 0 mMリン酸 1カリウムを 6 ml/minの流速で展開し、 K i S S— 1ペプチド画分 （非アミド体） を得た。 この画分を、 3 M尿素を含む 5 OmM M E S + 3 M尿素 （pH 4. 5 ) で平衡 化した S P— 5 PW (2 1. 5mmI DX 1 50mmL、 東ソ一） に通液し、 吸着、 洗浄した後、 0— 3 0 %B (B= 5 OmM リン酸緩衝液 + 1 M NaC 1+ 3 M 尿素、 pH4. 5) の段階勾配で溶出を行い、 K i S S— 1ペプチド （非アミド 体） 画分を得た （60分間の勾配で溶出時間約 3 0分の画分） 。 この画分を、 さらに 0. 1 %トリフルォロ酢酸で平衡化した C 4 P— 5 0 (2 1. 5i i I D X 30 OmmL, 昭和電工） に通液し、 吸着、 洗浄した後、 2 0— 5 0 %B (B ： 80 %ァセトニトリル Z 0. 1 %トリフルォロ酢酸）の段階勾配で溶出を行レ 、 K i S S— 1ぺプチド （非アミド体） 画分 （ 6 0分間の勾配で溶出時間約 45 分の画分） をプールした後、 凍結乾燥を行い、 K i S S— 1ペプチド （非アミ ド体） 凍結乾燥粉末約 3 Omgを得た。
実施例 6 (K i S S— 1ペプチドの特徴の決定） a) アミノ酸組成分析
アミ ノ酸組成をアミ ノ酸分析計 （日立 L一 8 5 0 O A Amino Acid Analyzer) を用いて決定した。 その結果、 K i S S— 1ぺプチドの DNA塩基 配列から予想されるアミノ酸組成と一致した 〔表 4〕 。
〔表 4〕
アミノ酸組成分析
1モル当たりの KiSS-1ヘ 。チト'の塩基配列
アミノ酸 残 基 数 から予測される値
A s X 3. 3 4
Th r *) 0 9
S e r 7 0 8
G 1 x 7. 0 7
P r o 7. 8 8
G 1 y 4. 7 5
A 1 a 2. 8 3
C y s 0 0
V 1 1. 9 2
Me t 0 0
I 1 e 0.
L e u 5 5
T y r 1. 0 1
P h e 1. 9 2
H i s 0. 9 1
L y s 0. 9
A r g 3. 7 4
Tr p 0. 4, 1
酸加水分解（6N HCl-4¾thioglycolic acid 24- 48hr加水分解の平均値）
*) 0時間に外挿した値 b) N末端アミノ酸配列分析
N末端アミノ酸配列を気相プロティンシーケンサー（P Eアプライドバイオ システムズ モデル 492) を用いて決定した。 その結果、 K i S S— 1ぺプ チドの DNA塩基配列から予想される N末端アミノ酸配列と一致した 〔表 5〕 〔表 5〕
N末端アミノ酸配列分析
検出された KiSS-l チト'の塩基配列
残基 N o . PTH*) -アミノ酸 から予測されるアミノ酸
(pmol)
G 1 y (17) G 1 y
2 Th r (13) Th r
3 S e r (11) S e r
4 L e u (15) Le u
5 S e r (8) S e r
6 P r o (10) P r o
7 P r o (11) P r o
8 P r o (10) P r o
9 G 1 u (5) G 1 u
0 S e r (5) S e r
100 pmo 1を用いた。
*) フェニー
c) C末端アミノ酸分析
C末端アミノ酸をアミノ酸分析計 （日立 L一 8 5 0 0 A Amino Acid Analyzer) を用いて分析した。 〔表 6〕 。
〔表 6〕
C末端アミノ酸分析
C末端アミノ酸 回収率 KiSS- 1へ° フ。 チド (%)
P h e 48, 5 —
気相ヒドラジン分解法（100 ，3.5 ）. 産業上の利用可能性
本発明の製造方法を用いると、 例えば、 あらゆる癌 （例えば、 肺癌、 胃癌、 肝 癌、 脬癌、 大腸癌、 直腸癌、 結腸癌、 前立腺癌、 卵巣癌、 子宮頸癌、 乳癌等） 、 さらには絨毛癌、 胞状奇胎、 侵入奇胎、 流産、 胎児の発育不全、 糖代謝異常、 脂 質代謝異常または分娩誘発の予防または治療薬などとして用いることができるぺ プチドを工業的かつ大量に製造できる。

Claims

請求の範囲
1. N末端にシスティンを有する蛋白質またはべプチドの N末端に、 K i S S - 1ペプチドを連結した融合蛋白質、ぺプチドまたはその塩を該システィン残 基のアミノ基側のぺプチド結合の切断反応に付すことを特徴とする K i S S 一 1ぺプチドまたはその塩の製造法。
2. N末端にシスティンを有する蛋白質またはペプチドの N末端に、 K i S S 一 1ペプチドを連結した融合蛋白質またはペプチドをコードする DNAを有 するベクターを保持する形質転換体を培養して融合蛋白質、ペプチドまたはそ の塩を発現させ、 発現された融合蛋白質、 ペプチドまたはその塩を該システィ ン残基のアミノ基側のペプチド結合の切断反応に付すことを特徴とする K i S S— 1ペプチドまたはその塩の製造法。
3. K i S S— 1ペプチドの C末端がアミドである請求項 1または 2記載の製 造法。
4. 切断反応が S _シァノ化反応、 次いでアンモノリシスまたは加水分解反応 に付す反応である請求項 1または 2記載の製造法。
5. K i S S— 1ペプチドが配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有する ペプチドである請求項 1または 2記載の製造法。
6. K i S S— 1ペプチドが、 ①配列番号： 1で表されるアミノ酸配列の N末 端から第 4 0〜 54番目からなるアミノ酸配列を有するペプチド、 ②配列番 号： 1で表されるアミノ酸配列の N末端から第 4 5〜 5 4番目からなるアミノ 酸配列を有するペプチド、 ③配列番号： 1で表されるアミノ酸配列の N末端か ら第 4 6〜 5 4番目からなるアミノ酸配列を有するペプチドまたは④配列番 号： 1で表されるアミノ酸配列の N末端から第 4 7〜 5 4番目からなるアミノ 酸配列を有するペプチドである請求項 1または 2記載の製造法。
7. N末端にシスティンを有する蛋白質またはペプチド力 N末端にシスティ ンを有するインターフェロン類、 イン夕一ロイキン類、 繊維芽細胞成長因子、
(プロ） ゥロキナーゼ類、 リンホトキシン、 Tumor Necrosis Factor (TNF) 、 3—ガラクロシダ一ゼ、 貯蔵タンパク類、 ストレプトアビシン、 プロテイン A、 プロテイン G、 Tissue Plasminogen Activator (T P A) またはそのムテイン もしくは断片である請求項 1または 2記載の製造法。
8. N末端にシスティンを有する蛋白質またはペプチドが、 配列番号： 3で表 されるアミノ酸配列を含有し、その N末端にシスティン残基が付加した蛋白質 またはペプチドである請求項 1または 2記載の製造法。
9. N末端にシスティンを有する蛋白質またはペプチドが配列番号： 3で表さ れるアミノ酸配列を含有し、その N末端にシスティン残基が付加した蛋白であ り、 K i S S _ 1ペプチドが配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を有するぺ プチドであり、製造される K i S S— 1ペプチドが C末端がアミドである配列 番号： 1で表されるアミノ酸配列を有するペプチドである請求項 1または 2記 載の製造法。
1 0. N末端にシスティンを有する蛋白質またはペプチドの N末端に、 K i S S— 1ペプチドを連結した融合蛋白質、 ペプチドまたはその塩。
1 1. 配列番号： 3で表されるアミノ酸配列を含有し、 その N末端にシスティ ン残基が付加した蛋白質の N末端に、配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を 含有する K i S S— 1ペプチドを連結した請求項 1 0記載の融合蛋白質、ぺプ チドまたはその塩。
1 2.請求項 1 0記載の融合蛋白質またはペプチドをコードする DNAを含有 する DNA。
1 3. ①配列番号： 4で表される塩基配列または②配列番号： 5で表される塩 基配列を有する請求項 1 2記載の DNA。
14. 請求項 1 2記載の DNAを有するベクター。
1 5. 請求項 1 4記載のベクターを含有する形質転換体。
16. FERM BP— 6907で表示されるエシュリヒア ·コリ MM 294 (D E 3) ZpTFC— K i S S— 1。
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