WO2001069246A1 - Test paper - Google Patents

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WO2001069246A1
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Yoshiyuki Komagoe
Osamu Takehiro
Noboru Asai
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Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd
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Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
    • G01N33/525—Multi-layer analytical elements

Definitions

  • the present invention relates to a test paper for quantitatively or qualitatively analyzing and measuring a specific component in a liquid sample by coloring in the field of clinical chemistry and the like.
  • test papers utilizing color development due to chemical reaction as described in U.S. Pat.Nos. 3,050,373 and 3,061,523, only one layer of test paper containing a reagent in filter paper etc. The sample was added to the same layer with paper to develop color and measured visually or with a simple reflectometer.
  • test papers having a multilayer structure Japanese Patent Application Laid-Open No. 4-304899, Japanese Patent Publication No. 6-104077, etc. disclose test papers having a reagent layer and a developing layer. This is a sample addition site located upstream, and color development and determination were performed in the reagent layer.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 9-184837 discloses a test piece having an independent detection layer.This independent detection layer is used to improve the detection in a low concentration range by using a colored pigment. In this case, the sample was moved in the direction perpendicular to the reagent layer and adsorbed.
  • the measurement sensitivity is good in the low concentration range, but the color development of the dye peaks out in the high concentration range, and if the sample contains more than the expected analyte in the sample, re-measurement is performed. It is not enough from the viewpoint of quantitative measurement, for example, because it has to be performed.
  • JP-A-57-53661 discloses a blood analysis method using a glass fiber layer
  • JP-A-63-177059 discloses a soluble agglutinin
  • test papers using a color reaction had problems such as a narrow concentration range in which quantitative measurement was possible and poor measurement reproducibility.
  • problems such as a narrow concentration range in which quantitative measurement was possible and poor measurement reproducibility.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and has as its object to improve the measurement reproducibility and to quantitatively detect an analyte in a wide range from low to high concentrations, and Another object of the present invention is to provide a test strip capable of measuring an analyte in a small amount of a whole blood sample. Disclosure of the invention
  • test papers using a color reaction require different characteristics of a carrier for sample addition, retention of a color reagent, measurement of a color reaction, and measurement of color. Separation of the layer from the reagent layer into separate layers, using the best carrier for each layer, and diffusing and developing the coloring substance developed in the reagent layer into the color developing layer to determine the concentration at which quantitative measurement is possible.
  • the range can be expanded and measurement reproducibility can be improved. Further, in some cases, a configuration was adopted in which the sample addition layer was separated from the reagent layer, and a configuration in which a sample absorption layer was provided next to the color developing layer.
  • the reagent layer and / or sample addition layer should have an erythrocyte agglutinating agent to provide a red blood cell filtration function.
  • plasma separation membrane By installing a plasma separation membrane between the two layers, plasma separation can be performed more completely, plasma separation and measurement can be performed simultaneously, and the concentration range for quantitative measurement can be expanded and measurement reproducibility can be improved. It was made possible.
  • the concentration range for quantitative measurement can be expanded and measurement reproducibility can be improved. It was made possible.
  • the test paper for measuring the color of the substance to be analyzed by the coloring reagent By adopting the configuration of the present invention, quantitative measurement in a wide concentration range from low concentration to high concentration and good reproducibility were realized. Especially when using blood samples, separation and measurement of blood cells are performed simultaneously, realizing quantitative measurement and good reproducibility in a wide concentration range, and enabling measurement with a small amount of whole blood samples. . BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • FIG. 1 is an exploded perspective view of a three-layer test paper in which a sample addition layer, a reagent layer, and a color developing layer are attached to a support with a certain overlap.
  • FIG. 2 is a plan view (A) and a side view (B) of a three-layer test paper in which a sample addition layer, a reagent layer, and a color developing layer are attached to a support with a certain overlap.
  • FIG. 3 is an exploded perspective view of a two-layer test paper in which a reagent layer having a sample addition site and a color developing layer are attached to a support with a certain overlap.
  • FIG. 4 is a plan view (A) and a side view (B) of a two-layer test paper in which a reagent layer having a sample addition site and a color developing layer are attached to a support with a certain overlap.
  • FIG. 5 is an exploded perspective view of a four-layer test paper in which a reagent layer having a sample addition site, a plasma separation membrane, a color developing layer, and a sample absorbing layer are attached to a support with a certain overlap. .
  • Fig. 6 is a plan view of a four-layer test paper in which a reagent layer having a sample addition site, a plasma separation membrane, a color development layer, and a sample absorption layer are attached to a support with a certain overlap (A). And a side view (B).
  • Figure 7 is a calibration curve with the concentration of the 3-hydroxybutyric acid aqueous solution plotted on the horizontal axis and the reciprocal of the reflectance plotted on the vertical axis.
  • the reciprocal of the reflectance is proportional to the color density.
  • the range with linearity in the concentration of color development (the reciprocal of the reflectance) and the concentration of the aqueous solution of 3-hydroxybutyric acid is a quantitative measurement range.
  • FIG. 8 is a calibration curve in which the concentration of the aqueous glucose solution is plotted on the horizontal axis, and the reciprocal of the reflectance is plotted on the vertical axis.
  • the reciprocal of the reflectance is proportional to the color density.
  • Color density (reflectance The range where the reciprocal number) and the concentration of the aqueous glucose solution are linear is the quantitative measurement range.
  • Fig. 9 is a calibration curve with the concentration of 3-hydroxybutyrate-added whole blood plotted on the horizontal axis and the reciprocal of the reflectance plotted on the vertical axis.
  • the reciprocal of the reflectance is proportional to the color density.
  • the linear range between the color density (the reciprocal of the reflectance) and the concentration of 3-hydroxybutyric acid is the quantitative measurement range.
  • FIG. 10 is a calibration curve in which the concentration of '3-hydroxybutyric acid-added whole blood is plotted on the ordinate and the K / S value is plotted on the abscissa.
  • the test paper of the present invention is basically a test paper in which the color developing layer 2 is separated from the reagent layers 3 and 5, as shown in FIGS.
  • the color-developing layer 2 is a site that is determined by diffusing and developing the color-forming substance that has developed in the reagent layers 3 and 5.
  • a test paper in which the sample addition layer 4 and the reagent layer 3 are not separated that is, a test layer 5 having a sample addition site.
  • a plasma separation membrane 7 may be incorporated between the reagent layer 3 and the color developing layer 2.
  • Each of these layers has a continuity structure by allowing the sample to move by giving a certain amount of overlap or contact. Further, it is preferable that each of these layers is adhered on the support 1 having water resistance.
  • glass fiber, cellulose, polypropylene, filter paper, or the like can be used for the sample addition layer 4 and the reagent layers 3 and 5, and is preferably 0.2 mm to 2.0 mm in thickness and 0.1 g / cm in density. It is a glass fiber of 3 to 0.5 g / cm 3 .
  • the color developing layer 2 it is possible to use nitrocellulose, nylon, polyvinylidene disulfide, or the like, and preferably nitrocellulose.
  • the characteristic of nitrocellulose is a thickness of 100 ⁇ ! ⁇ 200; um, flow rate 10sec / crr! It is preferably 80 sec / cm.
  • the plasma separation membrane 7 a commercially available polyester or polyethersulfone plasma separation membrane or the like can be used.
  • sample absorption layer 8 glass fiber, cellulose, filter paper, or the like can be used.
  • the support 1 having water resistance can be made of plastic (polyethylene terephthalate, polyethylene, vinyl chloride, acrylic, ABS resin, styrene resin, polycarbonate, etc.), glass, metal, etc., and is preferably made of plastic. is there.
  • the water-resistant support 1 is preferably transparent.
  • the reagents necessary for color development are held in the reagent layers 3 and 5 in a dry state.
  • the liquid sample added to the material addition layer 4 flows in the order of sample addition layer 4, reagent layer 3, and color developing layer 2. .
  • the liquid sample added to the reagent layer 5 having the sample addition site flows in the order of the reagent layer 5 and the color developing layer 2. That is, the analyte in the sample that has moved or is added to the reagent layers 3 and 5 reacts with the reagent contained in the reagent layers 3 and 5 to form a color-forming substance, and the color-forming substance is transferred to the color developing layer 2.
  • Spread out and launch The measurement or judgment is performed in the color developing layer 2.
  • the effects of the color developing layer 2 are as follows: (1) By dispersing the dye formed in the reagent layers 3 and 5 in the color developing layer 2 and measuring, it is possible to avoid the color plateau in high-concentration samples and to reduce the quantitative range.
  • the color developing layer 2 does not require a reagent-retaining ability, so it is possible to select a smooth and homogeneous material that is optimal for color measurement, and the color unevenness and unevenness are uniform when the dye is dispersed. Quantitative measurement with high reproducibility is possible. (3) By selecting the material and size, the color dispersion can be adjusted by controlling the dispersion of the dye, and if necessary, the quantification range can be reduced to the low concentration side.
  • the reaction can be performed in the reagent layer as whole blood, and plasma separation can be performed after the completion of the color reaction.
  • the volume is only for the bed volume of the reagent layer. It is only necessary to obtain plasma that satisfies the color developing layer having a small size, so that the amount of whole blood sample to be added can be reduced.
  • a sample absorbing layer 8 can be provided next to the color developing layer 2.
  • the effects of the sample absorption layer 8 include: (1) the flow of the sample continues even after the color developing layer 2 is saturated with the sample, which is effective for uniform color development; and (2) the volume of the sample and the capacity of the sample absorption layer 8 By adjusting the balance, it is possible to stop the flow of the sample at an arbitrary time, and (3) to prevent the sample from overflowing from the test paper when excessive sample is added.
  • Color development methods include the method in which the analyte in the sample directly oxidizes or reduces the dye precursor to form a dye, and the method in which the analyte in the sample reduces oxidized coenzyme in the presence of an enzyme.
  • Examples of the method include a method in which the reduced coenzyme reduces a dye precursor via an electron transfer agent to form a dye.
  • a method of visually judging a change in the color tone or color and density of the color developing layer 2 a change in the color tone or Z and the density is measured by a reflectance measuring device using reflected light, or Measured with an absorbance measuring device using transmitted light, A method for measuring the concentration of the analyte is described.
  • the 3-hydroxybutyrate dehydrogenase method can be used.
  • 3-hydroxybutyrate dehydrogenase, nicotinic acid adenosine dinucleotide (NAD +), diaphorase, and nitrotetrazolium rubble are used as the reagents in the reagent layers 3 and 5.
  • NAD + nicotinic acid adenosine dinucleotide
  • diaphorase nitrotetrazolium rubble
  • nitrotetrazolium rubble are used as the reagents in the reagent layers 3 and 5.
  • 3-Hydroxybutyric acid in the sample becomes acetate in reagent layers 3 and 5, and NAD + is reduced to NADH.
  • NADH nitrotetrazolium blue is developed by diaphorase.
  • the purple color developed in the color developing layer 2 reflects the amount of 3-hydroxybutyric acid.
  • the glucose oxidase / peroxidase method can be used.
  • glucose oxidase, peroxidase, aminoantipyrine and phenol are used as reagents in the reagent layers 3 and 5.
  • Glucose in the sample becomes daltonolactone in the reagent layers 3 and 5, generating hydrogen peroxide.
  • the hydrogen peroxide, aminoantipyrine and phenol form a quinone dye.
  • the red color developed in the color developing layer 2 reflects the amount of glucose.
  • the reagent layer In the measurement of blood glucose concentration by the glucose dehydrogenase method, the reagent layer
  • Glucose dehydrogenase, NAD +, diaphorase, and nitrotetrazolium blue are used as reagents in 3 and 5.
  • Glucose in the sample becomes dalconolaton in reagent layers 3 and 5, and NAD + is reduced to NADH.
  • NADH nitrotetrazolium blue is developed by diaphorase.
  • the purple color developed in 2 reflects the amount of glucose.
  • the reagent layers 3, 5 and / or the sample addition layer 4 must have the function of retaining red blood cells and filtering plasma, and / or the separation of plasma between the reagent layers 3, 5 and the color developing layer 2.
  • red blood cells are separated.
  • a carrier with a filtering function has the effect of agglutinating red blood cells.
  • a carrier with a filtering function is a glass filter, which is a depth filter that captures particles on the surface and inside the fibrous structure and is less likely to cause clogging than a screen filter with a uniform pore size that captures particles on the surface.
  • c fiberglass, etc. are preferred fibers, the clear pore size for having a random structure but not be specified, thickness 0.2 Mm ⁇ 2.0Mm, fiberglass density 0.1 g / cm 3 ⁇ 0.5 g / cm 3 Those capable of holding particles having a diameter of 1 ⁇ or more are preferable.
  • any agglutinating agent means that the glass fiber has a particle retention capacity of 1 ⁇ or more for red blood cells with a diameter of about 7 / m, but the particle retention rate for particles with a diameter of 1 ⁇ m or more is 100 ⁇ m. Instead of%, red blood cells can be deformed.
  • a method of including a flocculant there is a method of impregnating an aqueous solution of the flocculant into a filter and then drying the filter.
  • the latter plasma separation membrane has already been explained, but it can be used alone or in combination with the former filtration function.
  • the effect of the flocculant This avoids clogging of the plasma separation membrane, and increases the amount of plasma separation more than when used alone, which is preferable.
  • a test paper was prepared by successively attaching 5 mm x 10 mm ditrocellulose color developing layers with an overlap width of 2 mm each.
  • 10 mg / ml of nicotinic acid amido adenine dinucleotide, 50 units / ml of 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase, and 200 units / ml of diaphorase were previously prepared in 40 mM phosphate buffer pH 8.0.
  • 10mg / ml ⁇ A solution containing sera albumin and 4.5 mg / ml of ditrotetrazolium blue was added with ⁇ ⁇ l / cm 2 (25 i 1 / test) and dried under reduced pressure.
  • Example addition layer Millipore (USA) Cat. No. AP2029325 Glass fiber (reagent layer): Millipore (USA) Cat. No. SA3J763H8 Nitrocellulose (color developing layer): Millipore ( USA) Cat. No. STHF04000 Comparative Example 1
  • a test paper was prepared by attaching a single layer of 5 mm x 8.3 mm filter paper on a 5 mm x 65 mm white polyethylene terephthalate support.
  • 10 mg / ml of amide amide adenine dinucleotide, 50 units / ml of 3-hydroxybutyrate dehydrogenase, and 200 units of / ml of diaphorase, 10 mg / ml of serum albumin, and 4.5 mg / ml of nitrotetrazole solution were added to 60 ⁇ l / cm 2 (25 ⁇ l / test). And dried under reduced pressure.
  • Filter paper Cat. No. 3001902 manufactured by Whatman (GB)
  • Example 1 To the test paper of the present invention of Example 1 and the test paper of Comparative Example 1, 25 ⁇ l of an aqueous solution of 3-hydroxybutyric acid having a concentration of 1000 ⁇ was added, and 2 minutes later, the reflectance was measured at 530 nm using a reflectance measuring apparatus. The reflectivity was measured. The results are shown in Table 1. As is clear from Table 1, it was found that the test paper of the present invention had less variation in color development than the comparative test paper.
  • test paper of the present invention (Example 1) and the comparative test paper (Comparative Example 1) were given 0, 1000, 2000, 25 ⁇ l of an aqueous solution of 3-hydroxybutyric acid at a concentration of 4000 or 6000 M was added, and 2 minutes later, the reflectance at 530 nm was measured with a reflectance measuring apparatus.
  • a calibration curve was prepared by plotting the concentration of the aqueous solution of 3-hydroxybutyric acid on the horizontal axis and the reciprocal of the reflectance on the vertical axis. The results are shown in FIG.
  • test paper of the present invention can be expanded to 0-6000 ⁇ or more.
  • a 5 mm x 0 mm glass fiber reagent layer with a sample addition site of 5 mm x 0 mm, and a 5 mm x 0 mm nitrocell mouth color development layer were sequentially attached on a 5 mm x 65 mm white polyethylene terephthalate support with an overlap width of 2 mm. Paper was made.
  • reagent layer 10 mg / ml of amide amide adenine dinucleotide, 50 units / ml of glucose dehydrogenase, 200 units / ml of diaphorase, and ml of ⁇ shea serum albumin, and 4.5 mg / ml what was contained Nitorote Torazori Umuburu, ⁇ ⁇ l / cm 2 ( 50 i 1 / test) was dried by addition and under reduced pressure.
  • test paper was prepared by applying a single layer of filter paper.
  • a solution containing 10 mg / ml of serum albumin and 4.5 mg / ml of ditrotetrazolium blue was added to 60 ⁇ l / ( ⁇ 2 (50 ⁇ l / test)) and dried under reduced pressure.
  • Filter paper Cat. No. 3001902 manufactured by Whatman (GB)
  • test paper of the present invention of Example 2 and the test paper of Comparative Example 2 30 ⁇ l of an aqueous glucose solution having a concentration of 31 mg / dl was added, and after 2 minutes, the reflectance at 530 nm was measured with a reflectance measuring apparatus. did.
  • Table 2 As is clear from Table 2, it was found that the test paper of the present invention had less variation in color development than the comparative test paper.
  • Example 2 To a test paper of the present invention (Example 2) and a comparative test paper (Comparative Example 2), 30 // 1 of an aqueous glucose solution having a concentration of 0, 7.8, 15.6, 31.25, 62.5, or 125 mg / dl was added, and the mixture was added for 2 minutes. Thereafter, the reflectance at 530 nm was measured by a reflectance measuring device. A calibration curve was prepared by taking the concentration of the aqueous glucose solution on the horizontal axis and the reciprocal of the reflectance on the vertical axis. The results are shown in FIG.
  • the test paper of the present invention has a linear concentration range of the calibration curve.
  • test paper of the present invention could be expanded to 0 to L25 mg / dl or more.
  • test papers were prepared by pasting them sequentially.
  • reagent layer 10 mg / ml of amide amide adenosine dinucleotide in 50 mM phosphate buffer (pH 8.0), 50 units / ml of 3-hydroxybutyrate dehydrogenase, and 200 units / ml of diaphorase , 4.5 mg / ml ditrotetrazolium blue, 10 mg / ml serum albumin, 10 mg / ml sucrose, and 4% anti-human red blood cell heron antibody
  • Example 3 To the test paper of the present invention (Example 3), 30 ⁇ l of whole blood having a concentration of 12, 114, 545, 1179, 1491, 4765, 6930 by adding 3-hydroxybutyric acid was added, and 2 minutes later, The reflectance at 530 nm was measured with a reflectance measuring device.
  • the sample absorption layers were sequentially applied with an overlap width of 6 mm, 2 mm, and 2 mm, respectively.
  • a test paper was prepared by covering the test paper with a 5 x 25 mm white top paper top laminate, leaving a sample application site of 5 mm x 4 mm.
  • reagent layer 20 mg / ml amido adenine dinucleotide dicotinate, 50 units / ml of 3-hydroxyhydroxybutyrate dehydratase, 200 units / ml of 75 ⁇ l / cm containing diaphorase, 100 units / ml of ascorbate oxidase, 0.05% Triton X-100, 10 mg / ml of serum albumin, and 2.25 mg / ml of nitrotetrazolium blue 2 (30; u1 / test) was added and dried under reduced pressure.
  • Glass fiber (reagent layer): GFF Conjugate Pad Cat. No. SA3J763H8 manufactured by Millipore (USA)
  • the red blood cells in the whole blood were stopped in the glass fiber reagent layer having the sample addition site and the plasma separation membrane, and the color development could be determined by the color developing layer without being affected by the color of the red blood cells.
  • the calibration curve was prepared by plotting the 3-hydroxybutyric acid concentration in whole blood on the vertical axis and the K / S value on the horizontal axis. The results are shown in FIG. 10 and Table 6.
  • the test paper of the present invention was good correlation coefficient 1 2 d 1 0 to 5,600 mu Micromax or approximate curve in a whole blood sample. There was little variation in color development, and the CV% of the measured values in five measurements was within 10% over a wide concentration range of 50 to 5600 ⁇ .

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Description

明 細 書
試験紙 技術分野
本発明は臨床化学の分野等で、 液体試料中の特定の成分を、 発色により定量的 または定性的に分析、 測定する試験紙に関するものである。 背景技術
従来、化学反応による発色を利用する試験紙においては、米国特許第 3, 050, 373 号、 同 3,061, 523号等に記載されているように、 ろ紙等に試薬を含ませた一層だけ の試験紙で、 同一の層に試料を添加して発色させ、 目視または簡単な反射率計な どで測定していた。
多層構造を有する試験紙としては、 特開平 4-304899号、 特公平 6- 104077号等に、 試薬層と展開層をもつ試験紙が開示されているが、 これらの展開層は、 試薬層の 上流に位置する試料添加部位であり、試薬層において発色及び判定を行っていた。 また、 特開平 9- 184837号には、 独立した検出層を備える試験片が開示されている 力 、 この独立した検出層は、 低濃度域での検出を向上させるために、 発色した色 素を試薬層に対して垂直方向に移して吸着させ判定するものであった。このため、 低濃度域での測定感度は良好である一方、 高濃度域で色素の発色が頭打ちになつ てしまい、 試料中に予想以上の分析対象物質が含有されていた場合には、 再測定 を余儀なく されてしまう等、 定量的測定という観点からは、 十分でない。
また、 これらの従来技術においては、 発色した色素の偏りにより、 定量的測定 という観点からの問題のみならず、 測定再現性が悪いという問題があった。
一方、 赤血球等の固形成分を除く処理を行っていない血液試料 （以下全血試料 と略す） 中の特定成分を検出するには、 試験紙によって分析対象物質を検出する 操作を行う前に、 全血試料から赤血球等の固形成分を除く という前処理工程が必 要である'。 このような前処理工程もしくは前処理工程を含む分析法として、 特開 昭 57-53661号には、 ガラス繊維層を使用した血液分析法が、 特開昭 63- 177059号 には、 可溶性凝集素を保持したフィルターによる血漿分離装置が、 それぞれ開示 されている。
従来、 発色反応を用いた試験紙では、 定量的測定が可能な濃度範囲が狭い、 測 定再現性が悪いなどの問題があった。 また、 特に全血試料を用いる場合には、 上 記の問題に加え、 試薬層の前に血球分離層が存在することから、 全血試料が少量 の場合は測定が困難であるという問題があった。
本発明は、 上記の問題点に鑑みてなされたものであり、 その目的は、 測定再現 性を改善し、 低濃度から高濃度までの広範囲に渡って分析対象物質を定量的に検 出できると共に、 少量の全血試料中の分析対象物質を測定可能な試験紙を提供す ることにある。 発明の開示
本発明者らは、 発色反応を用いた試験紙では、 試料の添加、 発色試薬の保持、 発色反応、 発色の測定のために、 担体には異なった特性が求められることに着目 し、 発色展開層を試薬層から別の層に分離し、 それぞれに最適の担体を用い、 試 薬層で発色した発色物質を発色展開層に拡散展開させて判定することにより、 定 量的測定が可能な濃度範囲の拡大、 測定再現性の改善を可能にした。 更に、 場合 によっては、 試料添加層を試薬層から分離する構成、 発色展開層の次に検体吸収 層を設ける構成を採用した。 また、 全血試料を用いる場合は、 上記構成に加え、 試薬層及び/又は試料添加層に赤血球凝集剤を含有させる等により赤血球濾過機 能を持たせること、 及びノ又は、 試薬層と発色展開層との間に血漿分離膜を設置 することにより、 血漿の分離をより完全に行い、 血漿分離と測定を同時に行うと ともに、 定量的測定が可能な濃度範囲の拡大、 測定再現性の改善を可能と した。 このように分析対象物質を発色試薬により発色させて測定する試験紙において、 本発明の構成を採用することにより、 低濃度から高濃度までの広い濃度範囲での 定量的測定と、 良好な再現性を実現した。 また、 特に血液試料を用いる場合には、 血球の分離と測定を同時に行い、 広い濃度範囲での定量的測定と良好な再現性を 実現すると共に、 少量の全血試料での測定を可能とした。 図面の簡単な説明
第 1図は、 試料添加層、 試薬層、 発色展開層を、 一定の重なりを持たせて支持 体上に貼付した三層式試験紙の分解斜視図である。
第 2図は、 試料添加層、 試薬層、 発色展開層を、 一定の重なりを持たせて支持 体上に貼付した三層式試験紙の平面図 （A ) 及び側面図 （B ) である。
第 3図は、 試料添加部位を有する試薬層、 発色展開層を、 一定の重なりを持た せて支持体上に貼付した二層式試験紙の分解斜視図である。
第 4図は、 試料添加部位を有する試薬層、 発色展開層を、 一定の重なりを持た せて支持体上に貼付した二層式試験紙の平面図 （A ) 及び側面図 （B ) である。 第 5図は、 試料添加部位を有する試薬層、 血漿分離膜、 発色展開層および検体 吸収層を、 一定の重なりを持たせて支持体上に貼付した四層式試験紙の分解斜視 図である。
第 6図は、 試料添加部位を有する試薬層、 血漿分離膜、 発色展開層および検体 吸収層を、 一定の重なりを持たせて支持体上に貼付した四層式試験紙の平面図 ( A ) 及び側面図 （B ) である。
第 7図は、 3-ヒ ドロキシ酪酸水溶液の濃度を横軸にとり、 反射率の逆数を縦軸 に取った検量線である。 反射率の逆数は発色の濃度に比例する。 発色の濃度 （反 射率の逆数） と 3-ヒ ドロキシ酪酸水溶液の濃度に直線性のある範囲が定量性のあ る測定範囲である。
第 8図は、 グルコース水溶液の濃度を横軸にとり、 反射率の逆数を縦軸に取つ た検量線である。 反射率の逆数は発色の濃度に比例する。 発色の濃度 （反射率の 逆数） とグルコース水溶液の濃度に直線性のある範囲が定量性のある測定範囲で ある。
第 9図は、 3-ヒ ドロキシ酪酸添加全血の濃度を横軸にとり、 反射率の逆数を縦 軸に取った検量線である。反射率の逆数は発色の濃度に比例する。発色の濃度（反 射率の逆数） と 3-ヒ ドロキシ酪酸の濃度に直線性のある範囲が定量性のある測定 範囲である。
第 1 0図は、' 3-ヒ ドロキシ酪酸添加全血の濃度を縦軸にとり、 K/S値を横軸に 取った検量線である。 K/S値は反射率 (R)から Kubelka-Munkの式 K/S = (1-R)2 / 2R により得られる。 K/S値から 近似式 Y=-514.06X5+2722.7X4-4189.2X3+ 2322.7Χ2+1375.8Χ-27.357により 3-ヒ ドロキシ酪酸の濃度が求められる。
なお、 図中の符号は、 それぞれ、 1 ： 支持体、 2 ：発色展開層、 3 ：試薬層、 4 ：試料添加層、 5 ：試料添加部位を有する試薬層、 6 ： 両面テープ、 7 ： 血漿 分離膜、 8 ：検体吸収層、 9 ： トップラミネート、 X ： 液体試料の添加、 Υ ：反 射率測定である。 発明を実施するための最良の形態
本発明の試験紙は、 基本的には、 第 1図〜第 6図に示すように、 発色展開層 2 が試薬層 3、 5から分離された試験紙である。 発色展開層 2は、 試薬層 3、 5で 発色した発色物質を拡散展開させて判定する部位である。 ここで、 少量の全血試 料に対応するためには、 試料添加層 4と試薬層 3を分離しない試験紙 （つまり、 試料添加部位を有する試薬層 5とする） とすることが好ましいが、 通常、 試料中 の不純物を除くなどの前処理が必要な場合や試料の容量が多い場合は、 図 1およ び図 2に示すように、 試料添加層 4と試薬層 3を分離した試験紙とすることが好 ましい。 また、 図 5および図 6に示すように、 発色展開層 2の次に検体吸収層 8 を設けることで検体の流れをより良くすることも出来る。 更に、 赤血球の分離を より良くするためには、 図 5および図 6に示すように、 試料添加部位を有する試 薬層 5と発色展開層 2の間に血漿分離膜 7を組みこむことが効果的である。 もち ろん、 本発明によれば、 試薬層 3と発色展開層 2の間に血漿分離膜 7を組みこん でも良い。
これらの各層は、 一定の重なりを持たせるか接触させる等により、 試料の移動 を可能にし連続性のある構造となっている。 また、 これらの各層は、 耐水性を備 えた支持体 1上に貼付されていることが好ましい。
上記各層の材質については、 試料添加層 4および試薬層 3、 5には、 グラスフ アイバ一、 セルロース、 ポリプロピレン、 ろ紙等が使用でき、 好ましくは、 厚さ 0.2 mm〜2.0mm、 密度 0.1 g/cm3〜0.5 g/cm3のグラスファイバ一である。 また、 発色展開層 2には、 ニ トロセルロース、 ナイロン、 ポリ ビニリデンジフライ ド等 が使用でき、 好ましくは、 ニ トロセルロースである。 ここで、 ニ トロセルロース の特性としては、 厚さ 100 μ π！〜 200 ;u m、 流速 10sec/crr！〜 80sec/cmであることが 好ましい。 血漿分離膜 7としては、 市販されているポリエステル製、 ポリエーテ ルスルホン製血漿分離膜などが使用可能である。 検体吸収層 8には、 グラスファ ィバー、 セルロース、 ろ紙等が使用できる。 耐水性を備えた支持体 1には、 プラ スチック （ポリエチレンテレフタレー ト、 ポリエチレン、 塩化ビニル、 アク リル、 ABS樹脂、 スチロール樹脂、 ポリカーボネートなど） 又は、 ガラス、 金属などが 使用でき、 好ましくはプラスチックである。 試験紙の裏側からの反射光の測定や 透過光での測定のためには、 耐水性の支持体 1は透明であることが好ましい。 本発明の試験紙は、 発色に必要な試薬が、 試薬層 3、 5に乾燥状態で保持され ている。 試料添加層 4を備えた試験紙 （図 1または図 2に示すもの） では、 資料 添加層 4に添加された液体試料は、 試料添加層 4、 試薬層 3、 発色展開層 2の順 に流れる。 また、 試料添加部位を有する試薬層 5 (図 3〜図 6に示すもの） に添 加された液体試料は、 試薬層 5、 発色展開層 2の順に流れる。 即ち、 試薬層 3、 5に移動した又は添加された試料中の分析対象物質が、 試薬層 3、 5に含まれる 試薬と反応して発色物質を形成し、 該発色物質が発色展開層 2に拡散展開し、 発 色展開層 2において測定もしくは判定を行う。
発色展開層 2の効果としては、 ①試薬層 3 、 5で発色した色素を発色展開層 2 で分散させて測定することにより、 高濃度の試料での発色の頭打ちを回避し、 定 量範囲を高濃度域まで広げられる、②発色展開層 2は試薬の保持能が不要なため、 発色測定に最適な平滑で均質な素材を選択でき、 また色素が分散する際に発色の むらや偏りが均一化され、 再現性の良い定量測定が可能である、 ③材質やサイズ を選ぶことで、 色素の分散を制御して発色の濃さを調整でき、 必要に応じて定量 範囲を低濃度側にも高濃度側にも変えられる、 ④特に全血試料を用いる場合に、 全血のまま試薬層での反応を行わせ、 血漿分離は発色反応終了後に行うことが可 能なので、 必要な全血検体量は試薬層のベッ ドボリューム分だけであり、 ベッ ド ボリユームの小さい発色展開層を満たすだけの血漿が得られれば良いので、 添加 する全血検体量を少なく出来る等が挙げられる。 尚、 これらは、 本発明に伴う必 須の効果だけでなく、 付加的効果をも含んでいる。
また、 発色展開層 2の次には、 検体吸収層 8を設けることもできる。 検体吸収 層 8の効果としては、①発色展開層 2が検体で飽和した後も検体の流れが継続し、 発色の均一化に効果的であること、 ②検体量と検体吸収層 8の容量のバランスを 調整することで、 任意の時間で検体の流れを止めることが出来ること、 ③過剰な 検体が添加された場合に試験紙から検体が溢れるのを防止すること、 などがあげ られる。
発色方法としては、 試料中の分析対象物質が直接色素前駆物質を酸化または還 元して色素を形成する方法の他に、 試料中の分析対象物質が酵素存在下で酸化型 補酵素を還元し、 この還元型補酵素が、 電子伝達剤を介して色素前駆物質を還元 して色素を形成する方法等が例示される。
測定もしくは判定方法としては、 発色展開層 2の色調またはノおよび濃度の変 化を目視判定する方法、 色調または Zおよび濃度の変化を、 反射光を用いて反射 率測定装置で測定し、 または、 透過光を用いて吸光度測定装置で測定し、 試料中 の分析対象物質の濃度を測定する方法が例示される。
例えば、 分析対象物質が、 血中 3—ヒ ドロキシ酪酸であるときには、 3—ヒ ド ロキシ酪酸脱水素酵素法を使用することができる。 その場合においては、 試薬層 3、 5中の試薬として、 3—ヒ ドロキシ酪酸脱水素酵素、 ニコチン酸アミ ドアデ ニンジヌクレオチド （NAD+) 、 ジァホラーゼ、 及びニトロテトラゾリ ゥムブル 一を用いる。 試料中の 3—ヒ ドロキシ酪酸は、 試薬層 3、 5中でァセ ト酢酸にな り、 NAD+は還元され NADHとなる。 この NADHを利用して、 ジァホラーゼによ りニトロテトラゾリ ゥムブルーを発色させる。 発色展開層 2に展開されてくる紫 色の発色は 3—ヒ ドロキシ酪酸量を反映する。
また、 分析対象物質が、 血中グルコースであるときには、 グルコースォキシダ ーゼ /パーォキシダーゼ法を使用することができる。 その場合においては、 試薬層 3、 5中の試薬として、 グルコースォキシダーゼ、 パーォキシダーゼ、 アミノア ンチピリンおよびフエノールを用いる。 試料中のグルコースは、 試薬層 3、 5中 でダルコノラク トンになり、 過酸化水素を発生する。 この過酸化水素、 アミノア ンチピリ ン、 およびフエノールによりキノン色素が生成する。 発色展開層 2に展 開されてくる赤色の発色は、 グルコース量を反映する。
血中グルコース濃度のグルコース脱水素酵素法による測定においては、 試薬層
3、 5中の試薬として、 グルコース脱水素酵素、 NAD+、 ジァホラーゼ、 及び二 トロテトラゾリ ゥムブルーを用いる。 試料中のグルコースは、 試薬層 3、 5中で ダルコノラタ トンになり、 NAD+は還元され NADHとなる。 この NADHを利用し て、 ジァホラーゼによりニトロテトラゾリゥムブルーを発色させる。 発色展開層
2に展開されてくる紫色の発色はグルコース量を反映する。
また、 特に全血試料を使用する場合は、 発色展開層 2への赤血球の移行を防ぐ 必要がある。 そのためには、 試薬層 3、 5及び/又は試料添加層 4に赤血球を保 持し血漿を濾過する機能をもたせること、 及びノ又は、 試薬層 3、 5と発色展開 層 2の間に血漿分離膜 7を設けることで、 赤血球の分離を行うことになる。 前者の場合、 濾過機能のある担体に、 赤血球を凝集する作用のある、
抗赤血球抗体、 又は陽ィォン性ポリ'マー等の凝集剤を含有させて使用するのが好 ましい。 ここで、 濾過機能のある担体は、 表面で粒子を捕捉する孔径が均一'なス クリーンフィルターよりも、 繊維状の構造の表面および内部で粒子を捕捉して目 詰まりを起こしにくいデプスフィルターであるグラスファイバーなどが好ましい c グラスファイバーの場合、 ランダムな構造を持っため明確なポアサイズは規定で きないが、 厚さ 0.2 mm〜2.0mm、 密度 0.1 g/cm3〜0.5 g/cm3のグラスファイバー で、 直径 1 μ ηι以上の粒子を保持できるものが好ましい。 また、 何らかの凝集剤 を使用するのは、 赤血球の直径約 7 / mに対し、 グラスファイバーの粒子保持能は 直径 1 μ ιη以上であるが、 直径 1 μ m以上の粒子保持率は 1 0 0 %ではなく、 ま た赤血球は変形可能なためである。
尚、 凝集剤を含有させる方法としては、 凝集剤の水溶液をフィルターに含浸さ せた後、 乾燥させる方法等がある。
後者の血漿分離膜については説明済みであるが、 単独でも、 前者の濾過機能と の併用も可能であり、 特に凝集剤を含有させた前者の濾過手段と併用した場合に は、 凝集剤の効果により血漿分離膜の目詰まりが避けられ、 単独で使用した場合 よりも血漿分離量が増大し好ましい。 実施例
実施例 1
5mmx65mmの白色ポリエチレンテレフタレート支持体上に、 5mmx8mmのグ ラスファイバー試料添加層、 5mmx5mmのグラスファイバー試薬層、 及び
5mmxl0mmの二トロセルロース発色展開層を 2mmずつの重なり幅を持たせて順 次貼付して試験紙を作製した。 尚、 試薬層には、 あらかじめ、 40mMリン酸緩衝 液 pH8.0中に、 10mg/mlのニコチン酸アミ ドアデニンジヌクレオチド、 50units/ml の 3—ヒ ドロキシ酪酸脱水素酵素、 200units/mlのジァホラーゼ、 10mg/mlのゥ シ血清アルブミン、及び 4.5mg/mlの二トロテトラゾリ ゥムブルーを含有させたも のを、 ΙΟΟ μ l/cm2(25 i 1/test)添力□し減圧下で乾燥させた。
グラスフアイバー (試料添加層）： Millipore社 (USA)製 Cat. No. AP2029325 グラスフアイバー (試薬層）： Millipore社 (USA)製 Cat. No. SA3J763H8 二 卜ロセルロース（発色展開層）： Millipore社 (USA)製 Cat. No. STHF04000 比較例 1
5mmx65mmの白色ポリエチレンテレフタ レート支持体上に、 5mmx8.3mmの 濾紙の単一層を貼付して試験紙を作製した。 尚、 該単一層には、 実施例 1 と同様 に、 40mMリン酸緩衝液 pH8.0中に、 10mg/mlのニコチン酸アミ ドアデニンジヌ クレオチド、 50units/mlの 3—ヒ ドロキシ酪酸脱水素酵素、 200units/mlのジァ ホラーゼ、 10mg/mlのゥシ血清アルブミン、 及び 4.5mg/mlのニトロテトラゾリ ゥ ムブル一を含有させたものを、 60 μ 1/ cm2(25 μ 1/test)添加して減圧下で乾燥させ た。
濾紙： Whatman社 (GB)製 Cat. No. 3001902
試験例 1
上記実施例 1の本発明の試験紙および比較例 1の試験紙に、 1000 μ Μの濃度の 3-ヒ ドロキシ酪酸水溶液を 25 μ 1添加し、 2分後、反射率測定装置で 530nmでの反 射率を測定した。 その結果を表 1に示すが、 表 1から明らかなように、 本発明の 試験紙は、 比較の試験紙に比べて発色のばらつきが少ないことがわかった。
表 1 3-ヒ ドロキシ酪酸 同時再現性試験
Figure imgf000011_0001
試験例 2
本発明の試験紙（実施例 1 ) および比較の試験紙（比較例 1 ) に、 0， 1000, 2000, 4000, 6000 Mの濃度の 3-ヒ ドロキシ酪酸水溶液を 25 μ 1添加し、 2分後、 反射率 測定装置で 530nmでの反射率を測定した。 3-ヒ ドロキシ酪酸水溶液の濃度を横軸 にとり、 反射率の逆数を縦軸にとり、 検量線を作成した。 その結果を図 7及び表 2に示す。
表 2 3-ヒ ドロキシ酪酸 検量線
Figure imgf000012_0001
図 7から明らかなように、 本発明の試験紙は検量線の直線性のある濃度範囲が 広く、 0 μ Μから 6000 // Μの範囲で検量線の相関係数 R2=0.9936となり、 比較の試 験紙の相関係数 R2=0.5786に比べて良好であった。
定量的測定が可能な測定範囲も、 比較の試験紙の 0 〜2000 / M に対し、 本発 明の試験紙は、 0〜6000 μ Μ以上に拡大できることがわかった。
実施例 2
5mmx65mmの白色ポリエチレンテレフタレート支持体上に、 5mmxl0mmの試 料添加部位を有するグラスファイバー試薬層、 及び 5mmxl0mmの二トロセル口 ース発色展開層を、 2mmずつの重なり幅を持たせて順次貼付して試験紙を作製し た。 尚、 試薬層には、 あらかじめ、 40mMリン酸緩衝液 pH8.0中に、 10mg/mlの ニコチン酸ァミ ドアデニンジヌク レオチド、 50units/mlのグルコース脱水素酵素、 200units/mlのジァホラーゼ、 10mg/mlのゥシ血清アルブミン、 及び 4.5mg/mlの ニトロテ トラゾリ ゥムブルーを含有させたものを、 ΙΟΟ μ l/cm2(50 i 1/test)添加し 減圧下で乾燥させた。
グラスフアイバー (試薬層）： Millipore社 (USA)製 Cat. No. SA3J763H8 二トロセルロース（発色展開層）： Millipore社 (USA)製 Cat. No. STHF04000 比較例 2
5mmx65mmの白色ポリエチレンテレフタレー ト支持体上に、 5mmxl6.7mmの 濾紙の単一層を貼付して試験紙を作製した。 尚、 該単一層には、 実施例 2と同様 に、 40mMリン酸緩衝液 pH8.0中に、 10mg/mlのニコチン酸アミ ドアデニンジヌ クレオチド、 50units/mlのグルコース脱水素酵素、 200units/mlのジァホラーゼ、 10mg/mlのゥシ血清アルブミン、及び 4.5mg/mlの二トロテトラゾリ ゥムブルーを 含有させたものを、 60 μ 1/ (πη2(50 μ 1/test)添加し減圧下で乾燥させた。
濾紙： Whatman社 (GB)製 Cat. No. 3001902
試験例 3
上記実施例 2の本発明の試験紙および比較例 2の試験紙に、 31mg/dlの濃度の グルコース水溶液を 30 μ 1添加し、 2分後、 反射率測定装置で 530nmでの反射率 を測定した。 その結果を表 2に示すが、 表 2から明らかなように、 本発明の試験 紙は比較の試験紙に比べて、 発色のばらつきが少ないことがわかった。
表 3 グルコース 同時再現性試験
Figure imgf000013_0001
試験例 4
本発明の試験紙 （実施例 2 ) および比較の試験紙 （比較例 2 ) に、 0, 7.8, 15.6, 31.25, 62.5, 125mg/dlの濃度のグルコース水溶液を 30 // 1添加し、 2分後、 反射率 測定装置で 530nmでの反射率を測定した。 グルコース水溶液の濃度を横軸にとり、 反射率の逆数を縦軸にとり、検量線を作成した。 その結果を図 8及び表 4に示す。
表 4 グルコース 検量線
Figure imgf000013_0002
図 8から明らかなように、 本発明の試験紙は検量線の直線性のある濃度範囲が 広く、 Omg/dlから 125mg/dlの範囲で検量線の相関係数 R2=0.9923となり、 比較の 試験紙の相関係数 R2=0.8452に比べて良好であった。
定量的測定が可能な測定範囲も、 比較の試験紙の 0〜31.25mg/dlに対し、 本発 明の試験紙は、 0〜： L25mg/dl以上にまで拡大できることがわかった。
実施例 3
5mmx65mmの白色ポリエチレンテレフタ レ一ト支持体上に、 5mmxl0mmの試 料添加部位を有するグラスファイバ一試薬層、 及び 5mmxl0mmの二トロセル口 ース発色展開層を、 2mmずつの重なり幅を持たせて順次貼付して試験紙を作製し た。 尚、 試薬層には、 あらかじめ、 40mMリン酸緩衝液 pH8.0中に 10mg/mlの二 コチン酸アミ ドアデニンジヌクレオチド、 50units/mlの 3 —ヒ ドロキシ酪酸脱水 素酵素、 200units/mlのジァホラーゼ、 4.5mg/mlの二トロテトラゾリ ゥムブルー、 10mg/mlのゥシ血清アルブミン、 10mg/ml蔗糖、 及び 4%抗ヒ ト赤血球ゥサギ抗体
(0.18mg/ml抗ヒ ト赤血球ゥサギ抗体 IgG画分） を含有させたものを、 100 μ l/cm2(50 1/test)添加し減圧下で乾燥させた。
グラスフアイバー (試薬層）： Millipore社 (USA)製 Cat. No. SA3J763H8 二卜ロセルロース（発色展開層）： Millipore社 (USA)製 Cat. No. STHF04000 試験例 5
本発明の試験紙（実施例 3 )に 3-ヒ ドロキシ酪酸を添加して 12, 114, 545, 1179， 1491, 4765, 6930 の濃度にした全血を 30 μ 1添加し、 2分後、 反射率測定装 置で 530nmでの反射率を測定した。
全血中の赤血球は試料添加部位を有するグラスファイバー試薬層中に止まり、 発色展開層で判定が可能であった。全血中の 3-ヒ ドロキシ酪酸濃度を横軸にとり、 反射率の逆数を縦軸にとり、検量線を作成した。 その結果を図 9及び表 5に示す。 図 9から明らかなように、 本発明の試験紙は、 全血試料でも 0〜7000 μ Μまで 検量線の直線性が良く相関係数 R2=0.9929と良好で、 広い濃度範囲で定量的測定 ができることがわかった。 表 5 全血での 3-ヒ ドロキシ酪酸 検量線
Figure imgf000015_0001
実施例 4
5mm X 65mmの透明ポリエチレンテレフタレート支持体上に、 5mm x 8mmの 試料添加部位を有するグラスフアイバー試薬層、 5mm X 12mmの血漿分離膜、 5mm x 9mmの二トロセルロース発色展開層及び 5mm x 10mmのろ紙検体吸収層 を、 それぞれ 6mm, 2mm, 2mmずつの重なり幅を持たせて順次貼付した。 5 x 25mmの白色ュポ紙トップラミネートで試料添加部位 5mm x 4mmを残して試験 紙をカバーして試験紙を作製した。
尚、 試薬層には、 あらかじめ、 40mMリン酸緩衝液 pH8.0中に、 20mg/mlの二 コチン酸アミ ドアデニンジヌク レオチド、 50units/mlの 3 —ヒ ドロキシ酪酸脱水 素酵素、 200units/mlのジァホラーゼ、 100units/mlのァスコルビン酸酸化酵素、 0.05%の トライ トン X- 100、 10mg/mlのゥシ血清アルブミン、 及び 2.25mg/mlの二 トロテトラゾリ ゥムブルーを含有させたものを、 75 μ l/cm2(30 ;u 1/test)添加し減 圧下で乾燥させた。
グラスファイバー (試薬層）： Millipore社 (USA)製 GFF Conjugate Pad Cat.No. SA3J763H8
二トロセルロース（発色展開層）： Millipore社 (USA)製 Hi-Flow Plus
Nitrocellulose Membrane Cat. No. SHF180
ろ紙 （検体吸収層） ： Whatman社 (GB)製 3MM chr Cat.No.3030 909 試験例 6
本発明の試験紙 （実施例 4 ) に、 3-ヒ ドロキシ酪酸を添加して 5, 58, 108, 422， 1062, 2084, 3348, 5610 μ Μ の濃度にした全血を 30 μ 1添加し、 2分後、 試験紙の 裏から判定するタィプの反射率測定装置で 635nmの反射率を測定した。 各濃度で 5回測定を繰り返した。 反射率 (R)を Kubelka-Munkの式 K/S = (1-R)2 / 2R によ り K/S値に換算した。
全血中の赤血球は試料添加部位を有するグラスフアイバー試薬層及び血漿分離 膜中に止まり、 発色展開層で赤血球の色に影響されずに発色の判定が可能であつ た。 全血中の 3-ヒ ドロキシ酪酸濃度を縦軸にとり、 K/S値を横軸にとり、 検量線 を作成した。 その結果を図 1 0及び表 6に示す。
表 6 全血での 3-ヒ ドロキシ酪酸 検量線
Figure imgf000016_0001
図 1 0から明らかなように、 本発明の試験紙は、 全血試料でも 0〜5600 μ Μま で近似曲線の相関係数 1 2ニ1と良好であった。発色のばらつきも少なく、 50〜5600 μ Μの広い濃度範囲で、 5回測定での測定値の C V%は 10%以内であった。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 液体試料を添加可能な試料添加部位を備えかつ該液体試料中の.;分析対象物 質に基づいて発色物質を形成する試薬を含ませた試薬層と、 該試薬層に接触して 設けられると共に該発色物質を拡散展開させる発色展開層とを備えていることを 特徴とする試験紙。
2 . 液体試料を添加可能な試料添加層と、 この試料添加層に接触して設けられ ると共に該試料添加層に添加された液体試料中の分析対象物質に基づいて発色物 質を形成する試薬を含ませた試薬層と、 該試薬層に接触して設けられると共に該 発色物質を拡散展開させる発色展開層とを備えていることを特徴とする試験紙。
3 . 発色展開層に接触して設けられる検体吸収層を備えていることを特徴とす る、 請求項 1または請求項 2のいずれかに記載の試験紙。
4 . 試薬層と発色展開層の間に、 血漿分離膜が接触して設けられていることを 特徴とする、 請求項 1〜請求項 3のいずれかに記載の試験紙。 '
5 . 発色展開層が、 ニ トロセルロース、 ナイロン、 及びポリ ビユリ ンジフラ イ ドからなる群から選択される材質で作られていることを特徴とする、 請求項 1
〜請求項 4のいずれかに記載の試験紙。
6 . 試薬層、 試料添加層、 もしくは試薬層と試料添加層の両者に、 赤血球を凝 集する作用のある、 レクチン、 抗赤血球抗体、 及び陽イオン性ポリマーからなる 群から選択される 1以上の凝集剤を含有することを特徴とする、 請求項 1〜請求 項 5のいずれかに記載の試験紙。
7 . 耐水性支持体上に貼付されていることを特徴とする請求項 1〜請求項 6の いずれかに記載の試験紙。
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