WO2001077166A1 - Nouveaux peptides a activite physiologique et leur utilisation - Google Patents

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Tetsuya Ohtaki
Satoshi Kumano
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Takeda Chemical Industries Ltd
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Definitions

  • the present invention relates to an activity factor (ligand peptide or the like) for a galaene 'receptor. '' Conventional technology
  • Galanin is a biologically active peptide consisting of 29 amino acid residues first found in porcine small intestine extract (FEBS Lett.), 164, PP124-128 (1983)), In addition to stag, it is found in many mammals, birds, reptiles and fish.
  • the amino acid sequence of galanin is human (FEBS Lett., 283, PP189-194 (1991)), pesi (FEBS Lett., 234, pp400-406 (1988)), rat (J. Biol. Chem., 262, pp 16755-16758 (1987)), Higgie (Peptides, 12, pp855-859)
  • Porcine galanin has a precursor protein consisting of 123 amino acid residues
  • Physiological effects of galanin include: ⁇ ⁇ Acetylcholine release inhibitory effect in hippocampus (Brain Research, 709, pp81-87 (1996)), and phagocytic activity in the hypothalamus (Obesity Research, 3, pp5735-5895 (1995)) ), Pituitary honolemon release-stimulating action in the moon pituitary gland (Neuroscience Letter, 75, pp49-54 (1987); Endocrinology, 134, pp529-536 (1994); Peptides, 7, pp51-53, (1986)), Insulin secretion inhibitory action in the Kurakura (Acta Physiol. Scand., 139, ⁇ 591_596 (1990)) is known, and its physiological action is thought to be exerted through the galanin receptor. Have been.
  • the galanin receptor has three subtypes (GALR1, GALR2, and GALR3).
  • GALR1 human, rat and mouse (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, pp3845-3849 ( 1993); J. Mol. Neurosci., 6, pp33-41 (1995); FEBS Lett., 411, pp225-230 (1997)), and for GALR2, rats (FEBS Lett.
  • Galanin has been confirmed to bind to the galayun 'receptor of all three subtypes. Galanin has the strongest binding affinity for GALR1, followed by GALR2 and GALR3, and its affinity for GALR3 is about 10-fold weaker than that for GALR1 (J. Biol. Chem. 272, 31949- 31952, 1997). Galanin also inhibits cAMP production in GALR1-expressing cells (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 3845-3849, 1993), and induces cAMP production inhibition in GALR2-expressing cells (Mol. Pharmacol. , 52, ⁇ 337-343 (1997)), and increased inositol 'phosphate metabolism and increased intracellular calcium ion concentration (J. Biol. Chem. 272, 24612-24616, 1997). I have.
  • selecting candidate agonists and antagonists selecting and deciding candidate compounds while recognizing the presence or absence of species differences is an indispensable item in drug discovery.
  • the present invention relates to a mouse homolog ligand (hereinafter referred to as “peptide of the present invention”) of a human-derived ligand (WO99 / 48920) specific to a useful galayun receptor. In some cases).
  • the present inventors constructed a galanin receptor GALR2-expressing cell and a galanin 'receptor GALR1-expressing cell, and by using these, a simple method for measuring agonist activity against each subtype of galanin' receptor '. Atsusi method, i.e., to complete the [3 5 S] GTP y S binding assay method. As a result of screening the GALR2 agonist by this Atsey method, we succeeded in finding a novel mouse-derived active factor that has a different activation effect on galaene receptors from the galayun receptor. Furthermore, the present inventors have found that it is possible to screen for a compound that alters the binding between the novel activator and galanin receptor based on this finding.
  • a peptide or a precursor thereof, or an amide or ester thereof or a salt thereof comprising an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1;
  • a medicament comprising the peptide or precursor according to the above (1), an amide thereof, an ester thereof, or a salt thereof;
  • Agent for example, an appetite regulating agent, a uterine function regulating agent, a kidney function regulating agent, a prostate function regulating agent, a testis function regulating agent or a skeletal muscle function regulation containing the compound or the salt thereof according to the above (14).
  • a method for improving memory function, controlling appetite, controlling uterine function, controlling renal function, controlling prostate function, controlling testis function, or controlling skeletal muscle function which comprises administering the antibody described in a mammal to a mammal.
  • FIG. 3 is a diagram comparing the amino acid sequences of mouse Ga1R2 ligands of the present invention.
  • the term “actually identical” refers to substantially the activity of a protein, for example, an agonist activity for a receptor, that is, an activity of activating a receptor possessed by a ligand, a binding activity of a ligand to a receptor, or the like. Mean the same thing. Substitutions, deletions, additions or insertions of amino acids often do not result in significant changes in the physiological or chemical properties of the peptide, in which case the substitutions, deletions, additions or insertions may be made. The resulting peptides will be substantially identical to those without such substitutions, deletions, additions or insertions.
  • Substantially the same amino acid substitution in the amino acid sequence can be selected, for example, from other amino acids in the class to which the amino acid belongs.
  • Non-polar (hydrophobic) amino acids include alanine, leucine, isoleucine, parin, proline, pheualanine, tryptophan, methionine, and the like.
  • Polar (neutral) amino acids include glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine, Glutamine and the like.
  • Examples of positively charged (basic) amino acids include arginine, lysine, and histidine.
  • Examples of negatively charged (acidic) amino acids include aspartic acid and glutamic acid.
  • the peptide of the present invention is a peptide capable of binding to a galanin receptor.
  • it is a known ligand peptide other than galanin which has an activity of acting on a galanin receptor.
  • the galanin receptor is as described below. .
  • the peptides of the present invention include, for example, an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: A peptide or the like having the ability to bind to a receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by 13 (preferably the ability to activate or activate the receptor protein) is used.
  • SEQ ID NO: 11 is the entire amino acid sequence of rat GALR1 (Galayun receptor type 1)
  • SEQ ID NO: 12 is rat GALR2 (Galayun receptor type 2).
  • SEQ ID NO: 13 shows the entire amino acid sequence of rat GALR3 (galanin receptor type 3).
  • the peptide of the present invention is described in more detail below.
  • the origin of the peptide of the present invention is a mouse, and its tissue (for example, pituitary gland, overgrowth, brain, kidney, liver, gonad, thyroid, gall bladder, bone marrow, adrenal gland, skin, muscle, lung, digestive tract, blood vessel, It may be a peptide derived from a heart, a testis, etc.) or a cell, or may be a synthetic peptide.
  • the peptide of the present invention includes an amino acid sequence having about 90% or more (preferably 95% or more, more preferably 98% or more) homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. And the peptides contained.
  • “Substantially the same activity” includes, for example, the activity of binding to the galanin receptor GALR1, GALR2 or GALR3, the activity of activating the galanin receptor GALR1, GALR2 or GALR3, or the accompanying release of arachidonic acid, intracellular Activates signal transduction system such as Ca 2+ release, inhibition of intracellular cAMP production, inositol phosphate production (inhibition), fluctuation of cell membrane potential, phosphorylation of intracellular protein, and change of cell pH. Show that they are homogeneous in their ability to transform Therefore, the quantitative factors such as the molecular weight of the peptides having low and high activity may be different.
  • a peptide containing an amino acid sequence that has been lost or added, or an amino acid sequence that has been inserted, can be mentioned as a peptide that contains substantially the same amino acid sequence.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or one to ten or less, preferably one or more and five or less, more preferably one or more and three or less in the partial sequence thereof (2) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial sequence thereof has 1 to 10 amino acids, preferably 1 to 5 amino acids, and more preferably Amino acid sequence to which one or more and three or less amino acids have been added (or inserted). (3) One or more amino acids in the S sequence or its partial sequence represented by SEQ ID NO: 1 Or less, preferably 1 or more and 5 or less, more preferably 1 or more and 3 or less amino acids are substituted with another amino acid, and the like.
  • the “substantially the same amino acid sequence” includes an amino acid sequence having 90% or more, more preferably 95% or more, and further preferably 98% or more homology with the sequence.
  • the left end is the N-terminus (amino terminus) and the right end is the C-terminus (carboxyl terminus) according to the convention of peptide designation.
  • the C-terminus is usually a carboxyl group (one COOH) or carboxylate (one CO ⁇ —), but the C-terminal may be an amide (one CONH 2 ) or an ester (one COOR). .
  • R of the ester such as methyl, Echiru, n- propyl, ⁇ Bok 6 alkyl group such as isopropyl or n- butyl, cyclopentyl, C 3, such as cyclohexyl - 8 Shikuroanorekiru group, Hue - Le, alpha-naphthyl C 2 Ariru group, benzyl, phenethyl, other phenylene route C DOO 2 alkyl, or C 7 one Ararukiru groups such as ⁇ - naphthyl one C i-2 alkyl, such as Fei one naphthylmethyl such Benzuhidori Le, oral For esters And a piperoyloxymethyl group widely used.
  • the peptide of the present invention has a carboxyl group or a carboxylate other than the C-terminus, those in which those groups are amidated or esterified are also included in the peptide of the present invention.
  • the ester at this time for example, the same esters as the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
  • salts are preferred.
  • examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid), or organic acids (eg, drunkic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid) Acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, drunkic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid
  • Acid tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid.
  • the peptide of the present invention can be produced by a method for purifying the peptide from tissues or cells of a human warm-blooded animal, or can be produced according to the peptide synthesis method described later.
  • the peptide of the present invention can also be produced by culturing a transformant containing DNA encoding the peptide.
  • DNA encoding the peptide can be prepared according to a known cloning method (eg, a method described in Molecular Cloning (2nd ed .; J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989)). it can.
  • the closing method includes: (1) using a DNA probe or a DNA primer designed based on the amino acid sequence of the peptide, containing a DNA encoding the peptide from a cDNA library by a hybridization method; Or (2) a method using a DNA primer designed based on the amino acid sequence of the peptide to obtain a transformant containing DNA encoding the peptide by a PCR method. .
  • the peptide of the present invention is produced from human or warm-blooded animal tissues or cells
  • the human or warm-blooded animal tissues or cells are homogenized, and then extracted with an acid or alcohol, and the extract is subjected to salting out.
  • Dialysis, gel filtration, reverse phase chroma Purification and isolation can be achieved by a combination of chromatography such as ion exchange chromatography and affinity chromatography.
  • the peptide of the present invention is produced by (1) a method for synthesizing a peptide known per se, or (2) by cleaving a peptide containing the peptide of the present invention with an appropriate peptide. be able to.
  • any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, it is possible to produce the desired peptide by condensing a partial peptide or amino acid capable of constituting the peptide of the present invention with the remaining portion and, if the product has a protecting group, removing the protecting group. it can. Examples of known condensation methods and elimination of protecting groups include the methods described in the following 1 to 2.
  • the peptide of the present invention can be purified and isolated by a combination of ordinary purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, and recrystallization.
  • the peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted into an appropriate salt by a known method, and when obtained by a salt, it can be converted into a free form by a known method. it can.
  • a commercially available resin for peptide synthesis suitable for amide formation can be used.
  • resins include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, Hydroxymethylmethylphenylacetamidemethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ', 4'-dimethoxyphenol-hydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2', 4'-dimethylethoxyphenyl Fraoc amino Ethyl) phenoxy resin and the like.
  • an amino acid having an ⁇ -amino group and a side chain functional group appropriately protected is condensed on the resin in accordance with the sequence of the desired peptide in accordance with various known condensation methods.
  • the protecting group is removed at the same time as the cleavage of the tide, and if necessary, an intramolecular disulfide bond formation reaction is carried out in a highly diluted solution to obtain the target peptide.
  • carbodiimides are preferred.
  • carbodiimides include DCC, N, N'-diisopropylpropylcarbodiimide, N-ethyl-N '
  • the protected amino acid is directly added to the resin together with a racemization inhibitor (eg, H0Bt, HOOBt, etc.), or the amino acid is previously protected as a symmetric acid anhydride or HOBt ester or HOOBt ester.
  • the amino acid can be added to the resin after the activation.
  • the solvent used for activating the protected amino acid and for condensing with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for peptide condensation reactions.
  • acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform, alcohols such as trifluoroethanol , Sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, tertiary amines such as pyridine, ethers such as dioxane and tetrahydrofuran, etrinoles such as acetonitrile and propionitrile, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, or an appropriate one of these. A mixture or the like is used.
  • the reaction temperature is appropriately selected from the range known to be usable for peptide bond formation reactions, and is usually suitably selected from the range of about 120 ° C to about 50 ° C.
  • the activated amino acid derivative is usually used in about 1-5 to about 4-fold excess.
  • Examples of the protecting group for the amino acid of the starting amino acid include Z, Boc, tertiary-pentino-reoxycanolepo-nore, isobonoleninolenooxycanoleponinole, and 4-methoxybenzinoreoxycanoleboninole. , CI-Z, Br-Z, adamantyloxycanoleboninole, trif-noreoloacetyl, phthaloinole, honoleminole, 2-nitrofeninolenes-no-refine, Phenylphosphinochioil, Fmoc and the like.
  • the protecting group of the carboxyl group for example an alkyl group Flip above as R, C 3 one 8 cycloalkyl group, C 7 - 1 other 4 Ararukiru group, 2-Adamanchiru, 4 twelve Torobenjiru, 4 single lens Tokishibenjiru, 4 Monoclonal benzyl, phenacyl group and benzyloxycarbonyl hydrazide, tertiary ethoxycarbyl hydrazide, trityl hydrazide and the like.
  • the hydroxyl groups of serine and threonine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • Suitable groups for this esterification include, for example, lower (C ⁇ e) alkanol groups such as acetyl groups, aroyl groups such as benzoyl groups, and groups derived from carbonic acid such as benzyloxycarbonyl group and ethoxycarbonyl group. can give.
  • groups suitable for etherification include, for example, a benzyl group, a tetrahydrovinyl group, a tertiary butynol group, and the like.
  • phenolic hydroxyl-protecting group of tyrosine examples include Bzl, Cl 2 -Bzl, 212-benzyl, Br-Z, tert-butyl and the like.
  • Examples of the protecting group for histidine imidazole include Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, pendinoleoxymethyl, Bum, Boc, Trt, and Fmoc.
  • the activated carboxyl groups of the raw materials include, for example, the corresponding acid anhydrides, azides, active esters [alcohols (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichloromouth phenol, 2,4-dinitrophenol) , Cyanomethinoleanolone, paranitrophenol, H0NB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimid, HOBt) and the like.
  • the raw material having an activated amino group include a corresponding phosphoric acid amide.
  • Methods for removing (eliminating) the protecting group include catalytic reduction in the presence of a catalyst such as Pd black or Pd carbon in a stream of hydrogen, hydrogen fluoride anhydride, methanesulfonate, trifluoromethanesulfone, and the like.
  • a catalyst such as Pd black or Pd carbon
  • Examples include acid treatment with an acid, trifluoroacetic acid or a mixed solution thereof, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, and the like, and reduction with sodium in liquid ammonia.
  • the elimination reaction by the above-mentioned acid treatment is generally performed at a temperature between
  • cation scavengers such as ethanol, phenol, thioazone, metacresol, paracresol, dimethyls / refide, 1,4-butanedithiol, and 1,2-ethanedithiol Is effective.
  • the 2,4-di-to-mouth phenyl group used as the imidazole protecting group of histidine is removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as the indole protecting group of tryptophan is replaced with 1,2-ethanedithiol, In addition to deprotection by acid treatment in the presence of 1,4-butanedithiol, etc., it is also removed by alkali treatment with dilute sodium hydroxide, dilute ammonium, etc.
  • the peptide chain was extended to the desired chain length on the amino group side. Thereafter, a peptide obtained by removing only the protecting group of the ⁇ -amino group at the N-terminus of the peptide chain and a peptide (or amino acid) obtained by removing only the protecting group of the carboxyl group at the C-terminus are produced,
  • the two peptides are condensed in a mixed solvent as described above. Details of the condensation reaction are the same as described above.
  • the ⁇ - carboxyl group of the carboxy-terminal amino acid is condensed with a desired alcohol to form an amino acid ester, and then the desired peptide is converted to an amide in the same manner as the amide of the peptide.
  • An ester form can be obtained.
  • the peptide of the present invention has the same action as the peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence identical or substantially identical to the partial sequence thereof (eg, GALR1 peptide). Any peptide having a ghost activity, GALR2 agonist activity or GALR3 agonist activity) may be used.
  • Such peptides include, for example,
  • the amino acid sequence represented is a peptide having an amino acid sequence in which 1 to 5 amino acids have been deleted, added (inserted) or substituted from the partial amino acid sequence.
  • the precursor of the peptide of the present invention may be any peptide as long as it encodes the ligand peptide of the present invention as its partial sequence S.
  • a precursor of the peptide of the present invention specifically, for example, a peptide (or polypeptide) containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and the like can give.
  • the “substantially identical amino acid sequence” is 80% or more, more preferably 90% or more, and still more preferably 9% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • Amino acid sequences having a homology of 5% or more, most preferably 98% or more, and the like can be mentioned.
  • the “substantially identical amino acid sequence” includes (i) one or more and twenty or less, preferably one or more and ten or less, more preferably one or more in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the position of the “substitution, deletion, addition (or insertion)” is not particularly limited as long as it is other than the region encoding the ligand peptide of the present invention as a partial sequence thereof.
  • peptide (or polypeptide) containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 include, for example, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (I) 1 to 20 amino acids, preferably 1 to 10 amino acids, more preferably 1 to 5 amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • amino acid sequence in which an amino acid is substituted with another amino acid (ii) one or more and twenty or less, preferably one or more and ten or less, more preferably one or more in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 Has between 1 and 5 amino acids Amino acid sequence, (iii) 1 to 20 amino acids, preferably 1 to 10 amino acids, more preferably 1 to 5 amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (Or peptides or polypeptides having an amino acid sequence). .
  • the peptides of the present invention can be further used as antigens for preparing anti-ligand peptide antibodies.
  • Such peptides as antigens include, in addition to the peptides of the present invention described above, for example, partial peptides such as the N-terminal peptide, C-terminal peptide, and central peptide of the peptide of the present invention. Used.
  • a peptide which individually contains each domain of the peptide of the present invention may be used, but a peptide having a plurality of domains at the same time may be used.
  • the above partial peptide may be used as long as it can be used as an antigen for preparing an anti-ligand peptide antibody.
  • 1 to several (preferably 1 to 5, more preferably 1 or 2) amino acid residues from partial peptides such as the N-terminal peptide, C-terminal peptide and central peptide of the peptide of the present invention.
  • (Iii) one or several (preferably one or less) amino acids constituting a partial peptide such as the N-terminal peptide, C-terminal peptide and central peptide of the peptide of the present invention. And 5 or more preferably 1 or 2) are substituted with other amino acid residues.
  • the partial peptide is, for example, a partial amino acid sequence consisting of the 24th (Pro) to 30th (Asp) from the N-terminal of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the partial peptide herein may also have an amide (—C0NH 2 ) or ester (—C00R) at the C-terminus.
  • ester group are the same as in the case of the peptide described above.
  • the partial peptide has a carboxyl group or carboxy group When it has a rate, those in which those groups are amidated or esterified are also included in the partial peptide of the present invention.
  • the ester at this time for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
  • the partial peptide of the peptide of the present invention may itself have the activity of the peptide of the present invention (for example, an activating action on the galanin receptor).
  • the peptide of the present invention or a partial peptide thereof may be a fusion protein with a protein whose function or quality is well known.
  • the same salts as the aforementioned salts of the peptides are used.
  • the partial peptide of the peptide of the present invention or its amide, ester or salt thereof can be prepared by the same synthetic method as in the case of the above-mentioned peptide, or by cleaving the peptide of the present invention with an appropriate peptide. Can be manufactured.
  • the DNA encoding the peptide of the present invention includes, for example, an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and preferably further comprises SEQ ID NO: 1. 1, the ability to bind to a receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 13 (preferably, to activate the receptor protein) Any DNA may be used as long as it contains a DNA containing a base sequence encoding a peptide or the like having the ability to carry out the above-mentioned steps.
  • any DNA may be used as long as it contains DNA encoding the peptide of the present invention specifically described above.
  • any of the genomic DNA, the genomic DNA library, the above-described cDNA derived from Ito-Koshiori 'cells, the above-described cDNA library derived from tissues and cells, and the synthetic DNA may be used.
  • the vector used in the library may be any of pacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Alternatively, it can also be directly amplified by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using an RNA fraction prepared from the above-mentioned fibroblast cells.
  • DNA encoding a polypeptide is used. Hybridization can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto.
  • DNA containing DNA encoding a peptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 include the base represented by SEQ ID NO: 3
  • DNA containing a sequence examples include DNA containing a sequence.
  • DNA encoding the peptide of the present invention or its partial peptide for example, 1 to 40 (preferably 1 to 30 and more preferably 1 to 20)
  • a DNA fragment containing a partial nucleotide sequence is also preferably used as a DNA detection probe.
  • the DNA encoding the precursor of the peptide of the present invention includes the above-mentioned precursor of the peptide of the present invention, specifically, the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. Any DNA may be used as long as it contains DNA encoding a peptide (polypeptide) or the like containing the amino acid sequence of
  • a specific example of a DNA containing a DNA encoding a peptide (polypeptide) having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is represented by SEQ ID NO: 20 DNA containing the DNA to be used.
  • DNAs encoding the peptides and the like of the present invention can also be produced by the following genetic engineering techniques.
  • the genetic engineering techniques include, for example, Molecular
  • the DNA encoding the peptide or the like of the present invention can be prepared by synthesizing a probe obtained by synthesizing and labeling a DNA fragment based on the amino acid sequence of the peptide or a part thereof with a genomic DNA or cDNA library. It can be sorted out by making it into a distillation.
  • a synthetic DNA primer having a partial nucleotide sequence of the peptide of the present invention is used, and genomic DNA is obtained by a PCR method known per se.
  • genomic DNA is obtained by a PCR method known per se.
  • a DNA that amplifies the target DNA from a cDNA library or the like or a DNA incorporated into an appropriate vector for example, a DNA fragment or a synthetic DNA having a partial or entire region such as the peptide of the present invention can be used. Can be selected by hybridization with those labeled. .
  • the cloned DNA encoding the peptide of the present invention or the like can be used as it is depending on the purpose, or can be used by digesting with a restriction enzyme or adding a linker if desired.
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon at its 5 'end and TAA, TGA or TAG as a translation termination codon at its 3' end. These translation initiation codon and translation termination codon can be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
  • Expression vectors such as the peptide of the present invention include, for example, (a) cutting out a target DNA fragment from DNA encoding the peptide of the present invention, and (mouth) placing the DNA fragment downstream of a promoter in an appropriate expression vector It can be manufactured by linking.
  • Escherichia coli-derived plasmids eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13
  • Bacillus subtilis-derived plasmids eg, pUB110, pTP5, pC194
  • Yeast-derived plasmids eg, PSH19, pSH15
  • bacteriophages such as phage
  • animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, and baculovirus.
  • the promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression.
  • the host used for the transformation is an animal cell, use an SV40-derived promoter, a retrovirus / less promoter, a metamouth thionein promoter, a heat shock promoter, a cytomegaloinores promoter, an SRa promoter, etc. it can.
  • the host is a genus Escherichia, trp promoter, T7 promoter, lac promoter, recA promoter, PL promoter, 1 pp promoter, etc. If the host is a Bacillus genus, SPO1 promoter, SP02 promoter
  • the host is an yeast, such as the penP promoter, the PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH1 promoter, GAL promoter and the like are preferable.
  • a polyhedrin promoter, a P10 promoter and the like are preferable.
  • the expression vector may contain, if desired, an enhancer, a splicing signal, a poly-A addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori), and the like.
  • a selection marker include dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dh fr) gene [methotrexate (MTX) resistance], ampicillin phosphorus resistant gene (hereinafter sometimes abbreviated as Am p r), neomycin resistance gene (hereinafter sometimes referred to as Ne o r, G418 resistance), and the like.
  • dh fr dihydrofolate reductase
  • Am p r ampicillin phosphorus resistant gene
  • Ne o r neomycin resistance gene
  • a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the peptide or its partial peptide.
  • the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia
  • the phoA 'signal sequence and the OmpA signal sequence are included.
  • the host is a bacterium belonging to the genus Bacillus
  • the ⁇ _amylase' signal sequence and the subtilisin signal sequence are included.
  • the host is an animal cell, for example, the inulin signal sequence, interferin signal sequence, antibody molecule, etc. A signal sequence or the like can be used.
  • a vector containing the DN encoding the peptide constructed in this manner was prepared.
  • the transformant can be used to produce a transformant.
  • Escherichia bacteria for example, Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, yeast, insects or insect cells, animal cells, and the like are used.
  • Examples of the genus Escherichia include Escherichia coli K12, DH1 [Processing, ob, the, nachonanole, academia, op, san, en, op, the, proc-natl] Acad. Sci. USA), 60 vol., 160 (1968)], JM103 [Nucleic Acids Research, (Nucleic Acids Research), 9 vol., 309 (1981)], JA221 ⁇ Journal of Molecular Biology], 120 volumes, 517 (1978)], HB 101 [Journal of Ob 'Morekiura I. Biology, 41 volumes, .459 (1969)], C600 [ Genetics, 39, 440 (1954)].
  • Bacillus bacteria examples include, for example, Bacillus subtilis MI114 [Gene, 24, 255 (1983)], 207-21 [Journal of Biochemistry, 95, , 87 (1
  • yeast for example, Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R—, ⁇ 87-11A, DKD-5D, 20B-12 and the like are used.
  • insects for example, silkworm larvae are used [Maeda et al.
  • insect cells for example, when the virus is Ac NPV, a cell line derived from a larva of night moth (Spodoptera frugiperda cell; Sf cell); High Five TM cells,
  • Sf cells derived from Mamestra brassicae or cells derived from Estigmena acrea are used.
  • viruses When the virus is BmNPV, a silkworm-derived cell line (Bombyx mori N; BmN cell) is used.
  • Sf cells include, for example, Sf9 cells (ATCC CRL1711), Sf21 cells [Vaughn, J.L., et al.
  • animal cells include monkey COS-7 cells, Vero cells, Chinese hamster one-cell CHO, DHFR gene-deficient Chinese hamster one-cell CHO (CHO / dhfr-cells), mouse L cells, mouse 3T3 cells, mouse myeloma cells Human 293 cells, human FL cells, 293 cells, C127 cells, BALB 3T3 cells, S ⁇ 22 2 ⁇ cells, and the like are used.
  • Transformation of insect cells or insects is performed, for example, according to the method described in Bio / Technology, Vol. 6, pages 47-55 (1988).
  • Methods for introducing an expression vector into cells include, for example, a lipofection method.
  • the above-described method of selecting cells in which the expression vector introduced into the animal cells is integrated into the chromosome by clone selection is used. is there. Specifically, a transformant is selected using the above-mentioned selection marker as an indicator. Furthermore, a stable animal cell line having a high expression ability of the peptide or the like of the present invention can be obtained by repeatedly performing clonal selection on the animal cell obtained using the selection marker as described above. .
  • the DNA encoding the peptide of the present invention is amplified together with the dhfr gene in cells by culturing the MTX concentration gradually and selecting resistant strains. By doing so, an animal cell line with higher expression can be obtained.
  • -Producing the peptide of the present invention by culturing the above-mentioned transformant under conditions capable of expressing the DNA encoding the peptide of the present invention, and producing and accumulating the peptide of the present invention; Can be.
  • a liquid medium is suitable as the medium used for the culturing, and a carbon source necessary for the growth of the transformant is contained therein.
  • the inorganic or organic substance include, for example, calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride and the like.
  • yeast extract, vitamins and growth promoting factors may be added.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • M9 medium containing glucose and casamino acid As a medium for culturing the genus Escherichia, for example, M9 medium containing glucose and casamino acid [Miller, Journal of Journal of Experiments in Molecular Gelatins]
  • the promoter can work efficiently. To do this, it is possible to add a drug, for example 3 / 3-indolyl allylic acid.
  • cultivation is usually performed at about 15 to 43 ° C for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be added.
  • the cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be added.
  • the medium When culturing a transformant in which the host is an animal cell, the medium may be, for example, a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, 122, 501, (1952)] ], DMEM medium [Virology, 8 volumes, 396 (1959)], RPMI 1640 medium [Journal of the American Medical Association (The Journal of the American Medical)
  • the pH is about 6-8.
  • Culture is usually Perform at about 30 ° C to 40 ° C for about 15 to 60 hours, and add aeration and stirring as needed.
  • a DMEM medium containing dialyzed fetal serum containing almost no thymidine.
  • the peptide of the present invention and the like can be separated and purified from the above culture by, for example, the following method.
  • the cells or cells are collected by a known method, and the cells are suspended in an appropriate buffer solution. After disrupting bacterial cells or cells by Z or freeze-thawing, a method of obtaining a crude peptide extract by centrifugation or filtration may be used as appropriate.
  • the buffer may contain a protein denaturing agent such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100 (registered trademark; sometimes abbreviated as TM). . '
  • the supernatant is separated from the cells or cells by a method known per se, and the supernatant is collected.
  • Purification of the culture supernatant or the peptide of the present invention contained in the extract thus obtained can be carried out by appropriately combining known separation and purification methods.
  • These known separation and purification methods include methods utilizing solubility such as salting-out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, mainly molecular weight.
  • Method using difference in charge method using difference in charge such as ion exchange chromatography, method using specific affinity such as affinity chromatography, hydrophobicity such as reversed-phase high-performance liquid chromatography, etc.
  • a method using the difference between isoelectric points such as isoelectric focusing, chromatofocusing, etc. is used.
  • the thus obtained peptide or the like of the present invention when obtained in a free form, it can be converted into a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and conversely, when it is obtained in a salt form, It can be converted to a free form or another salt by a method known per se or a method analogous thereto.
  • the peptide of the present invention produced by the transformant may be purified before or after purification.
  • an appropriate protein-modifying enzyme any modification can be made or the peptide can be partially removed.
  • the protein modifying enzyme for example, trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like are used.
  • the presence of the thus-produced peptide or the like of the present invention can be measured by enzyme immunoassay using a specific antibody or the like.
  • the DNA encoding the peptide or the like of the present invention or the peptide of the present invention can be obtained by (1) synthesizing a part or full length of a ligand of a galanin 'receptor protein, (2) searching for a physiological action of the peptide or the like of the present invention, 3Preparation of synthetic oligonucleotide probe or PCR primers 4Ligand of G protein-coupled receptor protein ⁇ Acquisition of DNA encoding precursor protein 5Use of recombinant receptor protein expression system Development of binding assays and screening of drug candidates, ⁇ Acquisition of antibodies and antisera, ⁇ Development of diagnostic agents using DNA, RNA, antibodies or antisera, 8Improvement of memory function (nootropic agents) ), Appetite regulator, antidiabetic, pituitary function improver, child function regulator, renal function regulator, prostate function regulator, testis function regulator or Skeletal muscle function regulators (preferably, memory function improvers (cognitive drugs), appetite regulators,
  • G protein-coupled receptor agonist or antagonist specific to a warm-blooded animal such as a human by using a receptor-binding attesting system using a recombinant G protein-coupled receptor protein expression system described below.
  • the agonist or antagonist can be used as an agent for preventing or treating various diseases. .
  • the peptide of the present invention or DNA encoding the same is expressed in hippocampus, hypothalamus, ovary, kidney, prostate, skeletal muscle, knee, testis, spleen, heart, pituitary, etc.
  • Galanin 'receptor (GA LR) protein is recognized as a ligand, so it is useful as a safe and low toxic drug.
  • memory function improvers include memory function improvers (cognitive drugs), appetite regulators, antidiabetic drugs, Pituitary function improver, appetite Regulator, child function regulator, renal function regulator, prostate function regulator or skeletal muscle function regulator (preferably, memory function improver (cognitive agent), appetite regulator, uterine function regulator, renal function regulator , A prostate function regulator or a skeletal muscle function regulator).
  • the polypeptide of the present invention or a DNA encoding the same has a specific action of increasing blood LH concentration (LH secretion promoting action), and has high homology with the polypeptide of the present invention. Since galanin does not show an LH secretion promoting action, the LH secretion promoting action is a polypeptide-specific action of the present invention that is not found in galanin.
  • LH secretion-regulating agents containing the polypeptide of the present invention or the DNA encoding the polypeptide of the present invention are used as LH secretagogues as infertility, irregular menstruation, dysmenorrhea, and amenorrhea.
  • LH secretion modulators containing the polypeptide of the present invention or the DNA encoding the polypeptide of the present invention are particularly suitable for various diseases caused abnormally by the lebutin receptor (specifically, obesity, It is considered to be effective as a preventive and remedy for infertility.
  • the polypeptide of the present invention since the polypeptide of the present invention has a high affinity for its receptor protein, when the dose of the polypeptide of the present invention or the DNA encoding the same is increased, desensitization to LH secretion occurs. It also has the effect of suppressing LH secretion.
  • the LH secretion regulator containing the polypeptide of the present invention or a DNA encoding the same may be used as an LH secretion inhibitor, in various diseases related to LH hypersecretion (specifically, prostate cancer, benign prostatic hyperplasia) , Premature puberty or LH-producing pituitary tumors) can be used as prophylactic agents.
  • the DNA of the present invention or the DNA encoding each of them is used as the above-mentioned medicine, it can be carried out according to a conventional method.
  • tablets, capsules, elixirs, microcapsules, etc. coated with sugar coating or enteric coating as needed It can be used orally or parenterally in the form of injections, such as sterile solutions or suspensions in water or other pharmaceutically acceptable liquids.
  • a unit required for generally accepted pharmaceutical practice in which the compound or its salt is physiologically recognized as a carrier, flavoring agent, excipient, vehicle, preservative, stabilizer, binder, etc. It can be manufactured by mixing in dosage form. The amount of the active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose in the specified range can be obtained.
  • the DNA may be used alone or after being inserted into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, or the like, and then used in a conventional manner. it can.
  • an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, or the like.
  • binders such as gelatin, corn starch, tragacanth gum, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid
  • a leavening agent such as magnesium stearate
  • a sweetening agent such as sucrose, lactose or phosphorus
  • a flavoring agent such as peppermint, cocoa oil or cherry, and the like
  • a liquid carrier such as oils and fats can be further contained in the above-mentioned type of material.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to standard pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending the active substance in a vehicle such as water for injection, or naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil, etc. .
  • Aqueous liquids for injection include, for example, saline, isotonic nights containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.).
  • Agents such as alcohols (eg, ethanol), polyalcohols (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), and nonionic surfactants (eg, polysorbate 80 ( ⁇ ), HCO-50) Good.
  • examples of the oily liquid include sesame oil and soybean oil, which may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
  • buffers eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer
  • soothing agents eg, benzalcoium chloride, proforce hydrochloride, etc.
  • stabilizers eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • Preservatives eg, benzyl (Alcohol, phenol, etc.) and antioxidants.
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • the preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, so they can be used, for example, in humans and mammals (eg mice, rats, guinea pigs, egrets, sheep, pigs, pigs, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be administered.
  • mammals eg mice, rats, guinea pigs, egrets, sheep, pigs, pigs, cats, dogs, monkeys, etc.
  • the dose of the peptide of the present invention or the DNA encoding the same varies depending on the symptoms and the like.
  • the peptide when the peptide is orally administered, generally, for an adult (assuming a body weight of 60 kg), it should be administered daily. It is about 0.1 to 10 Omg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 2 Omg.
  • the peptide is administered parenterally (for example, by intravenous injection), the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like.
  • the amount is about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 2 Omg, more preferably about 0.1 to 1 Omg per day.
  • the above dose per 60 kg can be administered in terms of the weight of the animal.
  • human warm-blooded animals for example, warm-blooded mammals (for example, egrets, sheep, sheep, goats, rats, mice, guinea pigs, horses, horses, stags), birds) (E.g., chicks, pigeons, ducks, geese, zebras), any tissue (e.g., pituitary, musculus, brain, kidney, liver, gonad, thyroid, gall bladder, bone marrow, bone marrow, adrenal gland, skin, muscle, lung, A G protein-coupled receptor protein derived from the gastrointestinal tract, blood vessels, heart, etc.) or cells, etc., wherein GALR1 is SEQ ID NO: 11, GALR2 is SEQ ID NO: 12, and GALR3 is SEQ ID NO: : Any amino acid sequence having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by 13 may be used.
  • warm-blooded mammals for example, egrets, sheep, sheep, goats, rats, mice
  • the receptor protein in addition to the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11, 12 or 13, and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11, 12 or 13, Contains an amino acid sequence having 99.9% homology and is substantially the same as a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11, 12, or 13 And proteins having the same activity.
  • the activities exhibited by these proteins include, for example, ligand binding activity and signal transduction activity. Substantially the same means that their activities are the same in nature. Therefore, the quantitative factors such as the strength of the ligand binding activity and the signal transduction activity and the molecular weight of the receptor protein may be different.
  • the receptor protein, Met protecting group of the N-terminal e.g., formyl group, etc. C i_ 6 Arukanoiru group such Asechiru group
  • a protecting, glutamine residue N-terminal pyroglutamic Sani A molecule in which the side chain of the amino acid of the molecule is protected by an appropriate protecting group (for example, a C ⁇ 6 alkanol group such as a formyl group or an acetyl group), or a sugar chain is bound.
  • an appropriate protecting group for example, a C ⁇ 6 alkanol group such as a formyl group or an acetyl group
  • complex proteins such as so-called glycoproteins are also included.
  • receptor protein salt examples include the same salts as the above-mentioned peptide salts. .
  • the receptor protein or a salt thereof or a partial peptide thereof can be produced from a human warm-blooded animal tissue or cell by a known protein purification method, or contains the above-described peptide-encoding DNA. It can also be produced by the same method as that for culturing the transformant to be produced. Further, it can be produced according to the above-mentioned peptide synthesis method. '
  • the partial peptide of the receptor protein for example, a site of the G protein-coupled receptor protein molecule that is exposed outside the cell membrane is used. In other words, it is a peptide containing a portion analyzed as an extracellular region (hydrophilic (HydropMlic) site) in the hydrophobicity plot analysis of the G protein-coupled receptor protein. In addition, a peptide partially containing a hydrophobic (Hydrophobic) site can be used similarly. A peptide containing individual domains may be used, but a peptide containing a plurality of domains simultaneously may be used.
  • salt of the partial peptide of the receptor protein the same as the above-mentioned salt of the peptide can be used.
  • the DNA encoding the galanin receptor protein includes an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, 12, or 13. It may be any as long as it contains a base sequence encoding a galanin receptor protein having the same. In addition, they may be any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from Ito and cells, cDNA library derived from tissues and cells, and synthetic DNA.
  • the vector used for the library may be any of pacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid, etc.
  • the RNA can be amplified directly by RT-PCR known per se using an RNA fraction prepared from tissues and cells.
  • the DNA encoding the galayun 'receptor containing the amino acid sequences of 11, 12 and 13 is, for example, a DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17, 18 or 19, respectively.
  • SEQ ID NO: 17 is the nucleotide sequence of rat GALR 1 (galanin receptor 'type 1) cDNA
  • SEQ ID NO: 18 is the nucleotide sequence of rat GALR 2 (galanin receptor type 2) cDNA
  • SEQ ID NO: 19 shows the nucleotide sequence of rat GALR3 (galanin receptor 'type 3) cDNA.
  • GALR 2 galanin 'receptor' type 2 is widely distributed in hippocampus, hypothalamus, pups, kidney, prostate, skeletal muscle, etc., and therefore, the peptide of the present invention which is an agonist having GALR2 activity (Or an antagonist against GALR2 and a neutralizing antibody against the peptide of the present invention) can be used as a memory function improving agent, an appetite improving agent, or a uterine, kidney, prostate or skeletal muscle function improving agent.
  • GALR 1 (galanin 'receptor' type 1) is widely distributed in the hypothalamus, hippocampus, spirosa, etc., and is therefore an agonist capable of activating GALR 1 '14.
  • an antagonist to GALR1 and a neutralizing antibody to the peptide of the present invention can be used as an antiobesity agent, a cognitive enhancer, and an insulin secretion agent.
  • GALR 3 (galanin 'receptor' type 3) is distributed in the testis, spleen, heart, hypothalamus, pituitary, etc., and therefore, the peptide of the present invention which is an agonist having GALR 3 activity (or Antagonists against GALR3 and neutralizing antibodies against the peptide of the present invention) are testis, spleen, and heart function improvers. Can be used. '
  • the present invention provides: (1) bringing a test substance into contact with a cell membrane fraction expressing the galanin 'receptor, which is obtained by culturing a transformant (cell) containing DNA encoding the galanin receptor; the case, 2 in case the absence of the test substance, for example, 3 5 S mark f Hara guanosine - 5 '- 0-3 - measuring the amount binding in Chio triphosphate for the cell membrane fraction, that compare A method for screening for a galanin receptor activator (agonist) or a salt thereof, and (2) culturing a transformant (cell) containing the DNA encoding the galanin 'receptor described above.
  • galanin or the peptide of the present invention (1) contacting galanin or the peptide of the present invention with the cell membrane fraction expressing the galanin 'receptor, and (2) contacting galanin or the peptide of the present invention in the presence of a test substance.
  • a test substance for example, 3 5 S-labeled guanosine - 5 '- 0 - 3 - Chio triphosphate and measuring the binding amount with respect to the cell membrane fraction of the acid, galanin receptor activation inhibitor (antagonist), characterized in that comparison to Or provide a method for screening the salt.
  • the galanin 'receptor protein includes any one of GALR1, GALR2, or GALR3 as long as it contains a galanin receptor protein or a partial peptide thereof and has a receptor function.
  • a cell membrane fraction prepared from cultured cells expressing the galanin receptor protein in a large amount by using a transformant (cell) (the preparation method thereof will be described later) and the like are preferable.
  • the cell containing the galanin 'receptor protein refers to a host cell that expresses a galanin receptor protein.
  • the host cell include the aforementioned yeast, insect cells, and animal cells. Animal cells are preferred.
  • the membrane fraction refers to a fraction abundant in cell membrane obtained by disrupting cells and then obtained by a method known per se.
  • Cells can be disrupted by crushing the cells with a Potter-Elvehjem homogenizer, crushing with a Pelling Blender ⁇ polytron (manufactured by Kinematica), crushing with ultrasonic waves, pressing the cells while applying pressure with a French press, etc. Crushing by making a thin nozzle emerge.
  • fractionation by centrifugal force such as differential centrifugation or density gradient centrifugation The law is mainly used.
  • the cell lysate is centrifuged at a low speed (500 rpm to 3000 rpm) for a short time (typically about 1 to 10 minutes), and the supernatant is centrifuged at a higher speed (1500 rpm to 30000 rpm) for 30 min. Centrifuge for 1 minute to 2 hours, and use the resulting precipitate as the membrane fraction.
  • the membrane fraction is mainly composed of a membrane protein and a phospholipid constituting a cell membrane, and includes a G protein originally expressed in the cell together with the expressed galaene 'receptor.
  • the amount of galanin receptor in the cell or membrane fraction containing the galanin receptor is preferably 1 to 100 pmol, more preferably 5 to 20 pmol per mg of membrane fraction protein. .
  • the membrane fraction of cells containing the galanin 'receptor is suspended in a buffer suitable for screening.
  • the buffer may be a phosphate buffer containing about 1 to 5 mM magnesium ion having a pH of about 4 to about 10 (preferably, a pH of about 6 to about 8) or a tris monochloride buffer.
  • Phosphoric acid (GDP) is added in an amount of about 0.1 nM to 100 ⁇ , preferably about 0 :! to 1 ⁇ .
  • a protease inhibitor such as PMSF, oral diptin, E-64 (manufactured by Peptide Research Laboratories), and pipstatin may be added for the purpose of suppressing the degradation of the test substance by the oral protease.
  • a certain amount 5000 c ⁇ ! To 50,000 cpm
  • 35 S-labeled guanosine-5′-0-3-thiothiophosphate and a test substance to the receptor solution of L Oml.
  • a reaction system subject group to which only the 35 S-labeled guanosine-5'-0-3-thiothiophosphate was added without adding the test compound.
  • the reaction is carried out at about 0-50 ° C, preferably about 4 ° C-37 ° C, for about 20 minutes to 24 hours, preferably for about 30 minutes to 3 hours.
  • the solution is filtered through a glass fiber filter paper, etc., washed with an appropriate amount of the same buffer, and the radioactivity of 35 S-labeled guanosine-5′-0-3-thiotriphosphate remaining on the glass fiber filter paper is measured using a liquid. Measure with a scintillation counter. Test compound If the compound increases the radioactivity when the test compound is added compared to the radioactivity when no compound is added, the compound is selected as a candidate compound having the ability to activate the galanin 'receptor. be able to.
  • a cell membrane fraction is prepared in the same manner as in the case of the above-described screening of the agost. ! 0 0 0 c ⁇ ⁇ ⁇ 5 0 0 0 0 cpm) of 3 5 S-labeled guanosine - 5 '-0-3- Chio triphosphate and 1 0 one 4 ⁇ 1 0- 6 M galanin some stomach, Is to add a peptide according to the present invention and a test substance.
  • 3 5 S-labeled guaiacolsulfonate Noshin - 5 '- 0 - 3 - Chio triphosphate and galanin or the invention the reaction system by adding peptides without added test arsenide compound according (control group) is also prepared.
  • a reaction is performed in the same manner as described above, and if a test compound is not added, the compound having a large decrease in radioactivity when the test compound is added compared to the radioactivity in the case is treated with the galanin 'receptor.
  • the compound can be selected as a compound capable of inhibiting activation.
  • test substance examples include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, and animal tissue extracts. These compounds are novel compounds. Or a known compound.
  • the galanin receptor agonist has the same action as the physiological activity of the peptide of the present invention on the galanin receptor, and thus is useful as a safe and low toxic drug like the peptide of the present invention.
  • galanin 'receptor' antagoest can suppress the physiological activity of the peptide of the present invention on the galaun 'receptor protein, and is therefore useful as a safe and low-toxic drug for suppressing the receptor activity.
  • a pharmaceutically acceptable salt or the like is used as a salt of a substance obtained by using the above-mentioned screening method.
  • examples include salts with inorganic bases, salts with organic bases, salts with inorganic acids, salts with organic acids, salts with basic or acidic amino acids, and the like.
  • Preferable examples of the salt with an inorganic base include, for example, alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt, alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt, and aluminum salt and ammonium salt.
  • Preferred examples of the salt with an organic base include, for example, trimethylamine, triethylamine, pyridine, picoline., '2,6'-leutidine, ethanolanolamine, diethanoleamine, triethanolanolamine, cyclohexynoleamine, dicyclohexynoleamine. Min, N, N'—Salts with dibenzylethylenediamine and the like.
  • salts with inorganic acids include salts with hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, phosphoric acid, and the like. .
  • Suitable examples of salts with organic acids include, for example, formic acid, acetic acid, propionic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, citric acid, succinic acid, malic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, benzoic acid And the like.
  • salts with a basic amino acid include, for example, salts with arginine, lysine, orchium
  • preferable examples of the salt with an acidic amino acid include, for example, salts with aspartic acid, glutamic acid, and the like. can give.
  • the above-mentioned method can be carried out in the same manner as when the above-mentioned peptide of the present invention is used as a medicine.
  • An antibody for example, a polyclonal antibody or a monoclonal antibody
  • an antiserum against the peptide of the present invention can be produced according to a method for producing an antibody or antiserum known per se using the peptide of the present invention as an antigen.
  • a polyclonal antibody can be produced according to the method described below.
  • the polyclonal antibody against the peptide of the present invention can be produced by a method known per se or a method analogous thereto.
  • a complex of an immunizing antigen (antigen such as a peptide) and a carrier protein is formed, and a warm-blooded animal (for example, a mammal warm-blooded animal (eg, a heron, a sheep, a goat, a rat) is produced in the same manner as in the method for producing a monoclonal antibody described below.
  • mice Immunize mice, guinea pigs, pests, pests, pigs), birds (eg, -petrels, pigeons, ducks, geese, pizzerias, etc.), and obtain antibody-containing substances against the peptide of the present invention from the immunized animals. It can be produced by rubbing and separating and purifying the antibody.
  • the mixing ratio between the carrier and the hapten is such that the antibody can be efficiently produced against the hapten immunized by cross-linking with the carrier.
  • Any kind of cross-linking may be performed in any ratio.
  • a method in which force coupling is performed at a ratio of about 0.1 to 20, preferably about 1 to 5 with respect to 1 is used.
  • various condensing agents can be used for coupling the hapten and the carrier.
  • an active ester reagent containing a daltaraldehyde dicarbodiimide, a maleimide active ester, a thiol group, or a dithiopyridyl group is used.
  • the condensation product is administered to the above-mentioned warm-blooded animal at a site where antibody production is possible, or together with a carrier or diluent.
  • Complete Freund's adjuvant ⁇ Incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration. The administration is usually performed once every about 2 to 6 weeks, for a total of about 3 to about 10 times.
  • the polyclonal antibody is preferably collected from blood, ascites, or the like of a mammal immunized by the above method.
  • the antibody titer to the peptide of the present invention in the antiserum can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer of the hybridoma culture supernatant described below.
  • Antibody separation and purification can be carried out according to the same immunoglobulin separation and purification method as the monoclonal antibody separation and purification described below.
  • a monoclonal antibody can be produced according to the method described below. [Preparation of monoclonal antibody]
  • the peptide of the present invention may be a warm-blooded animal (for example, a mammal warm-blooded animal (eg, a heron, a sheep, a goat, a rat, a mouse, a guinea pig, a horse, a horse, a pig), a bird (eg, a chicken, a pigeon, a duck).
  • a mammal warm-blooded animal eg, a heron, a sheep, a goat, a rat, a mouse, a guinea pig, a horse, a horse, a pig
  • a bird eg, a chicken, a pigeon, a duck
  • Complete Freund's adjuvant / incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production during administration. Administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of 2 to 10 times. It is.
  • a monoclonal antibody-producing hybridoma When preparing monoclonal antibody-producing cells, select an individual with an antibody titer from the warm-blooded animal immunized with the antigen, such as a mouse, and collect the spleen or lymph nodes 2 to 5 days after the final immunization Then, a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared by fusing the antibody-producing cells contained therein with myeloma cells.
  • the antibody titer in the antiserum can be determined, for example, by reacting the peptide labeled with the labeling agent described below or a partial peptide thereof with the antiserum, and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody. 'And made by.
  • the fusion operation can be carried out according to a known method, for example, the method of Koehler and Milstein [Nature, 256, 495 (1975)] and the like.
  • the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, and PEG is preferably used.
  • myeloma cells examples include NS-1, P3U1, SP2 / 0, AP-1, and the like.
  • P3U1 is preferably used.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG1000 to PEG6000) is used at a concentration of about 10 to 80%.
  • Cell fusion can be carried out efficiently by adding and incubating at 20 to 40 ° C, preferably 30 to 37 ° C for 1 to 10 minutes.
  • a solid phase eg, a microplate containing the peptide antigen of the present invention adsorbed directly or together with a carrier
  • anti-immunoglobulin antibody labeled with a radioactive substance or enzyme anti-mouse immunoglobulin antibody is used if the cells used for cell fusion are mice
  • protein A protein A
  • a method for detecting a monoclonal antibody against the peptide of the present invention bound to a solid phase adding a hybridoma culture supernatant to a solid phase to which an anti-immunoglobulin antibody or protein A has been adsorbed, A peptide of the present invention labeled with a substance, an enzyme, or the like is added, and a monoclonal nanoparticle is applied to the peptide of the present invention bound to a solid phase.
  • a method for detecting a body, and the like Such as a method for detecting a body, and the like.
  • the selection of the monoclonal antibody against the peptide of the present invention can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto.
  • Normal HAT hyperxanthine, (Minopterin, thymidine) in an animal cell culture medium.
  • any medium can be used so long as hybridomas can grow.
  • RPMI 1640 medium containing 1 to 20%, preferably 10 to 20% fetal bovine serum, GIT medium containing 1 to 10% fetal bovine serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) Co., Ltd.) or serum-free medium for hybridoma culture (SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.).
  • the cultivation temperature is usually 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C.
  • the culture time is generally 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks. Culture is usually performed under 5% carbon dioxide.
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer to the peptide of the present invention in the antiserum.
  • Separation and purification of the monoclonal antibody against the peptide of the present invention can be carried out in the same manner as in the separation and purification of a general polyclonal antibody, by the method of immunoglobulin separation and purification [e.g., salting-out method, alcohol precipitation, isoelectric focusing, electrophoresis, etc. Method, adsorption and desorption with an ion exchanger (eg, DEAE), ultracentrifugation, gel filtration, antigen-binding solid phase or active adsorbent such as protein A or protein G to collect only antibodies and dissociate Specific Purification Method for Obtaining Antibody).
  • an ion exchanger eg, DEAE
  • ultracentrifugation eg, gel filtration
  • antigen-binding solid phase or active adsorbent such as protein A or protein G
  • the present invention provides, for example,
  • An antibody that reacts with the peptide of the present invention is allowed to competitively react with a test solution and a labeled peptide of the present invention, and the percentage of the labeled peptide of the present invention bound to the antibody is measured.
  • a method for quantifying the peptide of the present invention in a test solution characterized in that:
  • one antibody is an antibody that recognizes the N-terminal of the peptide of the present invention, and the other antibody is other than the N-terminal of the peptide of the present invention. Characterized in that it is an antibody that reacts with a site (eg, C-terminal)
  • the present invention provides a method for quantifying the peptide of the present invention.
  • the peptide of the present invention can be measured using a monoclonal antibody that recognizes the peptide of the present invention, and can also be detected by tissue staining or the like.
  • the antibody molecule itself may be used, or F (ab ') 2 , Fab', or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the measurement method using the antibody of the present invention is not particularly limited, and the amount of the antibody, antigen or antibody-antigen complex corresponding to the amount of antigen (eg, the amount of ligand peptide) in the test solution is determined. Any measurement method may be used as long as it is detected by physical or physical means and calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen. For example, nephrometry, a competitive method, an immunometric method, and a sandwich method are preferably used, but in terms of sensitivity and specificity, a sandwich method described later is particularly preferable.
  • Examples of the labeling agent used in the measurement method using the labeling substance include a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, and a luminescent substance.
  • Radioisotopes for example, [1 2 5 I], [1 3 1 I], [3 H], and [1 4 C], the serial enzymes, large preferably stable ratio activity,
  • fluorescent substances such as fluorescamine and fluorescein isothiosinate
  • Nole luminol derivatives, luciferin, lucigenin and the like, respectively.
  • a biotin-avidin system can be used for binding the antibody or antigen to the labeling agent.
  • the insolubility of an antigen or an antibody physical adsorption may be used, or a method using a chemical bond usually used for insolubilizing and immobilizing a protein or an enzyme may be used.
  • the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose; synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon; and glass.
  • a test solution is reacted with an antibody against the insoluble peptide of the present invention (primary reaction), and further reacted with a labeled antibody against the peptide of the present invention (secondary reaction).
  • primary reaction an antibody against the insoluble peptide of the present invention
  • secondary reaction a labeled antibody against the peptide of the present invention
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at staggered times.
  • the labeling agent and the method of insolubility can be based on those described above.
  • the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody does not necessarily need to be one kind, and a mixture of two or more kinds of antibodies is used for the purpose of improving measurement sensitivity and the like. May be used.
  • the antibodies against the peptide of the present invention used in the primary reaction and the secondary reaction are antibodies having different binding sites of the peptide of the present invention. It is preferably used. That is, the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is, for example, when the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal of the peptide of the present invention, the antibody used in the primary reaction is Preferably, an antibody that recognizes other than the C-terminal portion, for example, the N-terminal portion is used.
  • the antibody against the peptide of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method, or a nephrometry.
  • a competition method the antigen in the test solution and the labeled antigen are allowed to react competitively with the antibody, and then the unreacted labeled antigen is separated from (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody.
  • a soluble antibody is used as an antibody
  • B / F separation is performed using polyethylene glycol
  • a liquid phase method using a second antibody against the antibody or a solid phase antibody is used as the first antibody.
  • an immobilization method using a soluble first antibody and an immobilized antibody as the second antibody is used.
  • the antigen in the test solution and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction with a fixed amount of the labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated.
  • the antigen is allowed to react with an excess amount of the labeled antibody, and then the immobilized antigen is added to bind the unreacted labeled antibody to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated.
  • the amount of label in either phase is measured to determine the amount of antigen in the test solution.
  • the amount of insoluble sediment resulting from the antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured.
  • Part A ibid.Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B)), ibid.Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C)), ibid.
  • the peptide of the present invention can be quantified with high sensitivity.
  • the concentration of the peptide or the like of the present invention using the antibody of the present invention, it can be used as a diagnostic agent. That is,
  • the antibody of the present invention can be used for detecting the peptide of the present invention or the like present in a subject such as a body fluid or a tissue.
  • preparation of an antibody column used for purifying the peptide of the present invention, etc., the peptide of the present invention in each fraction at the time of purification, etc. can be used to detect the activity of the peptide of the present invention in test cells.
  • a transgenic animal expressing the peptide of the present invention can be prepared.
  • animals include mammals (for example, rats, mice, rats, sheep, pigs, mice, cats, dogs, monkeys, etc.), and particularly, mice, rats, and the like are preferable.
  • mammals for example, rats, mice, rats, sheep, pigs, mice, cats, dogs, monkeys, etc.
  • mice, rats, and the like are preferable.
  • Such an animal is very useful for functional analysis of the peptide of the present invention, research on diseases related thereto, and the like.
  • the DNA of the present invention In transferring the DNA of the present invention to an animal, it is generally advantageous to use the DNA as a gene construct linked downstream of a promoter capable of being expressed in animal cells.
  • a gene construct linked to the downstream of various promoters capable of expressing the DNA of the present invention derived from an animal having high homology to animal cells can be used, for example.
  • a DNA-transferred animal that highly produces the receptor protein of the present invention can be produced.
  • a ubiquitous expression promoter such as a virus-derived promoter or meta-mouth thionein can be used, but it is preferable to use an NGF gene promoter or a genolase gene promoter which is preferably specifically expressed in the brain.
  • an NGF gene promoter or a genolase gene promoter which is preferably specifically expressed in the brain.
  • Transfer of the DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target animal.
  • the presence of the peptide of the present invention in the germinal cells of the animal produced after the transfer of DNA means that all the offspring of the animal produced have the peptide of the present invention in all of its germ cells and somatic cells.
  • Progeny of this type of animal that has inherited the gene have the peptide of the present invention in all of its germ cells and somatic cells.
  • the DNA-transferred animal of the present invention After confirming that the DNA-transferred animal of the present invention stably retains the gene by mating, it can be reared in a normal breeding environment as the DNA-bearing animal. Furthermore, by crossing male and female animals having the target DNA, homozygous animals having the transgene on both homologous chromosomes are obtained, and by crossing the male and female animals, all progeny can obtain the DNA. Breeding can be subcultured to have. The animal to which the DNA of the present invention has been transferred has the peptide of the present invention highly expressed. Therefore, it is useful as an animal for agonist or antagonist listening to the peptide of the present invention.
  • the DNA-transferred animal of the present invention can also be used as a cell source for tissue culture.
  • tissue culture For example, by directly analyzing DNA or RNA in the tissue of the DNA-transferred mouse of the present invention, or by analyzing the tissue in which the peptide of the present invention expressed by a gene is present, the peptide of the present invention can be obtained. Can be analyzed. Cells of a tissue having the peptide of the present invention can be cultured by standard tissue culture techniques, and these can be used to study the function of cells from generally difficult-to-culture tissues, such as those from brain or peripheral tissues. it can. In addition, by using the cells, for example, it is possible to select a medicine that enhances the function of various tissues. In addition, if there is a high expression cell line, the peptide of the present invention can be isolated and purified therefrom.
  • a knockout animal in which the gene encoding the peptide of the present invention is disrupted and its function is lost can be produced.
  • Such knockout animals are also very useful for functional analysis of the peptide of the present invention.
  • Y thymine or cytosine
  • N Thymine, cytosine, adenine or guanine
  • R adenine or guanine
  • M cytosine or adenine W thymine or adenine
  • a rg or R anoreginin H is or H
  • Fmo c N—9—Funoleoreninoleme Toxicanorepo
  • sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences.
  • FIG. 1 shows an amino acid sequence of a mature mouse GALR2 ligand of the present invention.
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of the mouse GALR 2 ligand cDNA of the present invention.
  • the base sequence of a primer used for PCR for cloning cDNA of mouse GALR2 ligand is shown.
  • the base sequence of the primer used for the PC scale for cloning the cDNA of mouse GALR2 ligand is shown.
  • the nucleotide sequence of the primer used for PCR for closing the cDNA of mouse GALR2 ligand is shown.
  • rat GALR 2 galanin 'receptor' type 2
  • rat GALR3 galanin.receptor 'type 3
  • 1 shows the amino acid sequence of a porcine galanin receptor ligand (described in W099 / 48920).
  • FIG. 1 shows an amino acid sequence of a rat-type galanin receptor ligand (described in WO 99/48920).
  • Fig. 3 shows the amino acid sequence of a human galanin receptor ligand (described in W099 / 48920).
  • the nucleotide sequence of the rat GALR3 (galanin 'receptor' type 3) cDNA is shown.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of cDNA of the mouse GALR 2 ligand precursor of the present invention.
  • the transformant Escherichia coli T0P10 / GR2ML1 obtained in Example 1 described below was deposited with the Fermentation Research Institute (IFO) as a deposit number IF0 16361 on February 2, 2000, and It has been deposited as a deposit number FERM BP-7092 on March 16, 2000 at the Institute for Patent Organism Depositary (I POD, Tsukuba East 1-chome, 1-Chuo No. 6 Ibaraki, Japan).
  • IFO Fermentation Research Institute
  • PCR was carried out using mouse testis Marathon-Ready cDNA (derived from BALB mouse, CL0NTECH) as a type III primer F / R120 and R / R120 (described in WO 99/48920).
  • F / R120 5-AGGCTGGACCCTCAATAGTGCTGGTTAC-3 '(SEQ ID NO: 4)
  • R / R120 5-CCATCTATGGCCTTCCACAGGTCTAGGA-3 '(SEQ ID NO: 5)
  • the composition of the PCR reaction solution was 0.5 ⁇ l of ExTaq (Takara Shuzo Co., Ltd.), 5 ⁇ l of the attached 10x PCR buffer, 4 ⁇ m of 2.5 mM dNTP mixture, 0.5 ⁇ l each of the primers F / R120 and R / R120 (10 ⁇ each).
  • Yopi ⁇ cDNA to 1 mu 1, distilled water 3 4.5 a mixture of papermaking work, after initial denaturation of reaction conditions 94 ° C '30 seconds, -72 ° 94 ° 030 seconds _62 '30 seconds 60
  • the 35-second sitar reaction and a final extension reaction of 72 ° 010 min were used.
  • the obtained DNA fragment was cloned using a T0P0 TA Cloning Kit (Invitrogen) according to the method described in the attached manual.
  • the sequence of the cloned DNA was decoded using ABI 377 DNA sequencer, and the sequence of SEQ ID NO: 6 was obtained.
  • PCR reaction solution RACE is Taq (Takara Shuzo Co., Ltd.) and 0.5 1, accompanying 10x PCR buffer (500 mM KC1-25 mM MgCl 2 - 100 mM Tris ⁇ HC1, pH 8. 3) 5 ⁇ 1, 2.5 mM dNTP mixture 4 ⁇ 1, 25 mM MgCl 2 3 ⁇ 1, 10 ⁇ ⁇ Primer
  • F / R120 (3, for RACE) or 10 ⁇ M primer R / R120 (5, for RACE) for 11, 10; uM primer API (Primer API is included in CLONTECH's Marathon-Ready cDNA Kit. 11), 5 ⁇ l of type I cDNA (CLONTECH, mouse testis Marathon-Ready cDNA), and 31 of distilled water.
  • the reaction conditions were as follows: 94 ° C, 30 seconds-72 ° C, 120 seconds 5 cycles after initial denaturation at 94 ° C, 60 seconds, 94 ° C, 30 seconds-70 ° C-
  • the cycle reaction of 120 seconds was performed 5 times, and the cycle reaction of 94 ° C. 30 seconds-68 ° C. ′ for 120 seconds was performed 25 times, and the final extension reaction was performed at 68 ° C. ′ for 10 minutes.
  • a nested PCR was performed using the reaction solution of the PCR reaction as a type III.
  • the reaction solution was Taq (Takara Shuzo Co., Ltd.) 0.5 ⁇ l, and the attached 10x PCR buffer (500 mM KC1-25 mM MgCl 2 -100 mM TrisHC1, pH 8.3) 5 ⁇ l, 2.5 4 ⁇ l of mM dNTP mixture, 3 ⁇ l of 25 mM MgCl 2 , 1 ⁇ M of primer 1F / M120 (3, for RACE) or 1 ⁇ m of primer 1R / M120 (for 5'RACE) ⁇ 1, 10 Primer ⁇ 2 (primer ⁇ 2 is attached to CLONTECH's Marathon-Ready cDNA Kit), 1 ⁇ l, Type DNA DNA (50-fold dilution of the PCR reaction solution), 5 ⁇ l, and distilled water It was prepared by mixing 31 ⁇ .
  • the reaction conditions were 94 ° C for 60 seconds, initial
  • the obtained DNA fragment was cloned using a T0P0 TA Cloning Kit (Invitrogen) according to the method described in the attached manual. Cloned DNA sequence The sequence was decoded, and the information on the 5, 5, and 3 ends was obtained. Primer 1F / M 65 0 From this sequence information, was created 1R / M650.
  • Single strand DNA was synthesized using Supersrcipt II reverse transcriptase (GIBCO / BRL). PCR was performed using this DNA as type I and primers F / M650 and R / M650.
  • the PCR reaction solution was 1 ⁇ 1 of Pfu DM polymerase (Stratagene), 5 ⁇ l of the attached 10x PCR buffer, 4 ⁇ of 2.5 mM dNTP mixture, 2.5 ⁇ l each of 10 zM primer F / M650 and ⁇ R / M650. It was prepared by mixing 1 ⁇ l of ⁇ and ⁇ type DNA and 34.5 of distilled water.
  • the reaction conditions were: initial denaturation at 94 ° 030 seconds, 30 cycles of 94 ° C for 30 seconds-67 ° ⁇ 30 seconds to 72 ° C for 4 minutes, and a final extension reaction of 72 ° C for 10 minutes. .
  • the obtained DNA fragment was cloned using pCRII Blunt T0P0 vector (Invitrogen) according to the method described in the attached manual.
  • the cloned DNA sequence was sequenced according to a standard method, and a 180 bp mouse GALR2 ligand full-length peptide was encoded.
  • P GR2ML1 having DNA fragments (SEQ ID NO: 3).
  • E. coli T0P10 transformed with the plasmid was named T0P10 / pGR2MLl.
  • the amino acid sequence deduced from the base sequence of 180 base pairs is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the mature part is shown in SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence of the mature portion is expressed as follows: epta small intestine galanin (galanin), porcine GalR2 ligand (P—GALR2L)
  • the peptide of the present invention or its precursor or its amide or its ester or its salt has the ability to activate the galanin 'receptor. Therefore, medical agents such as functional modulators with less side effects in the hypothalamus, pituitary gland, uterus, kidney, prostate or skeletal muscle where galanin receptors are distributed in large amounts. It can be used for drug development.

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Description

明 細 書 新規生理活性べプチドおよびその用途
発明の分野
本発明は、 ガラエン'レセプターに対する活性ィヒ因子 （リガンドペプチド等） に関する。 ' 従来の技術
ガラニン (galanin)は、 ブタ小腸抽出液中に最初に見出された 2 9アミノ酸残 基からなる生理活性ペプチドであり 〔フエブス ·レター （FEBS Lett. ) , 164, PP124-128 (1983) ) 、 プタ以外にも、 多くの哺乳類、 鳥類、 爬虫類、 魚類にわた つて見出されている。 ガラニンのアミノ酸配列は、 ヒト（FEBS Lett.， 283, PP189-194 (1991) )、 ゥシ (FEBS Lett. , 234, pp400 - 406 (1988) )、 ラット（J. Biol. Chem.， 262, pp 16755-16758 (1987) )、 ヒッジ (Peptides, 12， pp855 - 859
(1991) )などで報告されており、 N末端からの 1 5アミノ酸残基は種間で保存さ れている。
ブタ ·ガラニンには、 123アミノ酸残基からなる前駆体蛋白質
[preprogalanin (1-123) ； Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, pp6287— 6291 (1986)〕 、 また、 ガラユンに比べて N端に 9残基長い前駆体 preprogalanin (24 -
61) amide, ガラエンの N端 4残基を欠落した preprogalanin (37- 61) amideが知ら れている（Peptides, 13, ppl055 - 1060 (1992) )。
ガラニンの生理作用としては、 ϋ海馬でのァセチルコリン遊離阻害作用 (Brain Research, 709, pp81-87 (1996) ) 、 脳視床下部での節食中枢促進作用 (Obesity Research, 3， pp5735 - 5895 (1995) ) 、 月 下垂体での下垂体ホノレモン 放出促進作用 (Neuroscience Letter, 75, pp49-54 (1987)； Endocrinology, 134, pp529- 536 (1994)； Peptides, 7, pp51- 53， （1986) ) 、 膝蔵でのインスリ ン分泌阻害作用 (Acta Physiol. Scand. , 139, ρρ591_596 (1990) ) などが知ら れており、 その生理作用はガラニンレセプターを介して発揮されるものと考えら れている。
ガラニン . レセプターには、 3種類のサブタイプ （GALR1、 GALR2、 GALR3) が存 在しており、 GALR1についてはヒト、 ラットおよびマウス （Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 90, pp3845-3849 (1993)； J. Mol. Neurosci.， 6, pp33-41 (1995)； FEBS Lett. , 411, pp225 - 230 (1997) ) 、 GALR2 についてはラット（FEBS Lett. ,
405, pp285 - 290 (1997)； Mol. Pharmacol.， 52, pp337-343 (1997)； J. Biol. Chem. , 272, pp24612- 24616 (1997) )、 GALR3についてはラット（J. Biol. Chem.， 272, pp31949-31952 (1997) )の各遺伝子がクローユングされている。 また、 これ ら 3種類のガラニン'レセプターは、 Gタンパク質共役型レセプターに特徴的な 7 個の疎水的領域 （膜貫通ドメ.イン） を有しており、 Gタンパク質を活性化するこ とにより細胞内情報伝達系を刺激するものと考えられる。
ガラニンは、 これら 3種類のいずれのサブタイプのガラユン ' レセプターとも 結合することが確認されている。 ガラニンの結合親和性は GALR1に対して最も強 く、 次いで GALR2、 GALR3の順に強く、 GALR3に対する親和性は GALR1に対する親和 性に比べて約 1 0倍弱い （J. Biol. Chem. 272, 31949-31952， 1997) 。 また、 ガラニンは、 GALR1発現細胞では cAMPの産生阻害を引き起こすこと （Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90， 3845-3849, 1993) 、 GALR2発現細胞では cAMPの産生阻害を 引き起こすこと （Mol. Pharmacol. , 52, ρρ337-343 (1997) ) 、 イノシトール' りん酸代謝系の亢進や細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を引き起こすこと （J. Biol. Chem. 272， 24612 - 24616， 1997) が報告されている。
発明の目的
従来、 G蛋白質共役型レセプターと生理活性物質 （即ち、 リガンド） との結合 を阻害する物質や、 結合して生理活性物質 （即ち、 リガンド） と同様なシグナル 伝達を引き起こす物質は、 これらレセプターの特異的なアンタゴ-ストまたはァ ゴニストとして、 生体機能を調節する医薬品として活用されてきた。 従って、 こ のように生体内での生理発現において重要であるばかりでなく、 医薬品開発の標 的ともなりうる G蛋白質共役型レセプター蛋白質を新規に見出し、 その新規 G蛋 白質共役型レセプター蛋白質の特異的リガンドを見出すことは、 ァゴニスト、 ァ ンタゴ二ストを見出す際に、 非常に重要な手段となる。
さらにその際、 レセプターの生理機構を明らかにするため、 ヒ トレセプター遺 伝子あるいはリガンド遺伝子に対する例えばマウス等のカウンタ—パート遺伝子 を取得し、 その遺伝子産物の蛋白化学的諸性質、 生物学的諸活生を検索し、 また 動物体内での質的、 量的動態や生理機構を詳細に調べて、 ヒトにおける機能を推 定することは、 有効な医薬を創製する上でも重要な事柄である。
さらに候補となるァゴニスト、 アンタゴニストを選択する際に、 種差の有無を 認識しながら、 候補化合物を選定、 決定することは、 医薬品の創製上欠くベから ざる項目となっている。
本発明は、 上記のように、 有用なガラユンレセプターに対する特異的なヒ ト由 来のリガンド （WO 9 9 / 4 8 9 2 0号） の、 マウスホモログリガンド （以下、 「本発明のペプチド」 と称する場合がある） を提供するものである。
発明の概要
本発明者らは、 ガラニン. レセプター GALR2発現細胞およぴガラニン ' レセプ ター GALR1発現細胞を構築し、 これらを用いることにより、 ガラニン ' レセプタ ' 一のそれぞれのサブタイプに対するァゴニスト活性を測定する簡便なアツセィ法、 即ち、 [3 5S] GTP y S結合試験法を完成した。 このアツセィ法により、 GALR2ァゴ ニストをスクリーニングした結果、 ガラエン · レセプターのそれぞれのサプタ ィプに対する活性化作用がガラユンとは異なる、 マウス由来の新規活性ィヒ因子を 見出すことに成功した。 さらに、 本発明者らは、 この知見に基づきこの新規活十生 化因子とガラニン · レセプターとの結合性を変化させる化合物のスクリーニング が可能であることを見出した。
すなわち、 本発明は、
( 1 ) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ 酸配列を含有することを特徴とするぺプチドもしくはその前駆体またはそのァミ ドもしくはそのエステルまたはその塩、
( 2 ) 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ 酸配列を含有することを特徴とする上記 （1 ) 記載の前駆体、 (3) 上記 (1) 記載のペプチドもしくは前駆体をコードする DNAを含有する DNA、
(4) 配列番号： 3または配列番号： 20で表される塩基配列を含有する上記 (3) 記載の DNA、
(5) 上記 (3) 記載の DN Aを含有する組み換えベクター、
(6) 上記 (5) 記載の組み換えベクターで形質転換された形質転換体、
(7) 上記 (6) 記載の形 W転換体を培養し、 上記 (1) に記載のペプチドもし くは前駆体またはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を生成 ·蓄積せ しめることを特徴とする、 上記 (1) に記載のペプチドもしくは前駆体またはそ のアミ ドもしくはそのエステルまたはその塩の製造方法、
(8) 上記 （1) 記載のペプチドもしくは前駆体に対する抗体、
(9) 上記 (8) 記載の抗体を含有してなる医薬、
(10) 上記 (8) 記載の抗体を含有してなる診断薬、
(1 1) 上記 (1) 記載のペプチドもしくは前駆体またはそのアミドもしくはそ のエステルまたはその塩を含有してなる医薬、
(12) 記憶機能改善剤、 食欲調節剤、 子宮機能調節剤、 腎臓機能調節剤、 前立 腺機能調節剤、 精巣機能調節剤または骨格筋機能調節剤である上記 （1 1) 記載 の医薬、
(13) 上記 (1) 記載のペプチドもしくはその前駆体またはそのアミドもしく はそのエステルまたはその塩を用いることを特徴とする、 配列番号： 1 1、 配列 番号： 12または配列番号：' 13で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のァミノ酸配列を含有するレセプター蛋白質に対するァゴニストまたは アンタゴニストのスクリーニング方法、
(14) 上記 （13) 記載のスクリーニング方法によって得られる化合物または その塩、 .
(15) 上記 （14) 記載の化合物またはその塩を含有する記憶機能改善剤、 食 欲調節剤、 子宮機能調節剤、 腎臓機能調節剤、 前立腺機能調節剤、 精巣機能調節 剤または骨格筋機能調節剤、.
(16) 記憶機能改善作用、 食欲調節作用、 子宮機能調節作用、 腎臓機能調節作 用、 前立腺機能調節作用、 精巣機能調節作用または骨格筋機能調節作用を有する 医薬を製造するための①上記 (1) 記載のペプチドもしくはその前駆体またはそ のアミドもしくはそのエステルまたはその塩、 ②上記 (3) 記載の DNA、 また は③上記 (8) 記載の抗体の使用、 および
(17) ①上記 （1) 記載のペプチドもしくはその前駆体またはそのアミドもし くはそのエステルまたはその塩、 ②上記 （3) 記載の DNA、 または③上記
(8) 記載の抗体を哺乳動物に投与することを特徴とする記憶機能改善、 食欲調 節、 子宮機能調節、 腎臓機能調節、 前立腺機能調節、 精巣機能調節または骨格筋 機能調節方法などに関する。 図面の簡単な説明
図 1は、 ブタ小腸ガラニン （ガラニン） 、 ブタ型 Ga 1 R2リガンド （P— G ALR 2 L) 、 ラット型 Ga 1 R 2リガンド （R— GALR2L) 、 ヒト型 Ga 1 R2リガンド （H— GALR2L) ならびに本発明のマウス型 G a 1 R 2リガ ンドのアミノ酸配列を比較する図である。
発明の詳細な説明
本明細書において、 「実寫的に同一」 とは蛋白質の活性、 例えばレセプターに 対するァゴニスト活性、 即ち、 リガンドの有するレセプターを活性化させる活性、 リガンドのレセプターへの結合活性などが、 実質的に同じことを意味する。 了ミ ノ酸の置換、 欠失、 付加あるいは挿入は、 しばしばペプチドの生理的な特性や化 学的な特性に大きな変化をもたらさないが、 こうした場合その置換、 欠失、 付カロ あるいは挿入を施されたペプチドは、 そうした置換、 欠失、 付加あるいは挿入の されていないものと実質的に同一であるとされるであろう。 該ァミノ酸配列中の アミノ酸の実質的に同一な置換物としては、 例えば、 そのアミノ酸が属するクラ スのうちの他のアミノ酸類から選ぶことができる。 非極性 （疎水性） アミノ酸と しては、 ァラニン、 ロイシン、 イソロイシン、 パリン、 プロリン、 フエエルァラ ニン、 トリプトファン、 メチォニンなどがあげられる。 極性 （中性） アミノ酸と してはグリシン、 セリン、 スレオニン、 システィン、 チロシン、 ァスパラギン、 グルタミンなどがあげられる。 陽電荷をもつ （塩基性） アミノ酸としてはアルギ ニン、 リジン、 ヒスチジンなどがあげられる。 負電荷をもつ （酸性） アミノ酸と しては、 ァスパラギン酸、 グルタミン酸などがあげられる。
本発明のぺプチドは、 ガラニンレセプターに対して結合能を有するぺプチドで ある。 好ましくはガラニンレセプターに対する活性ィ匕作用を有し、 公知のガラニ ン以外のリガンドペプチドである。 なお、 ガラニンレセプターについては後述の とおりである。 .
本発明のぺプチドとしては、 例えば、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列 と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 かつ配列番号： 1 1、 配 列番号： 1 2または配列番号： 1 3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を含有するレセプター蛋白質に対する結合する能力 （好 ましくはレセプター蛋白質を活'生ィヒする能力など） を有するぺプチド等があげら れる。 なお、 配列番号： 1 1はラット型の G A L R 1 (ガラユンレセプター ·タ ィプ 1 ) の全アミノ酸配列を、 配列番号： 1 2はラット型の GA L R 2 (ガラ二 ンレセプター ·タイプ 2 ) の全アミノ酸配列を、 配列番号： 1 3はラット型の G A L R 3 (ガラニンレセプター ·タイプ 3 ) の全アミノ酸配列を示す。
本発明のぺプチド、 その製造法および用途を以下にさらに詳細に説明する。 本発明の上記ペプチドの由来はマウスであり、 その組織 （例えば、 下垂体、 睥 臓、 脳、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管、 血管、 心臓、 精巣など） または細胞などに由来するペプチドであっても よく、 また合成ペプチドであってもよい。
例えば、 本発明のぺプチドとしては、 配列番号： 1で表わされるァミノ酸配列 と約 9 0 %以上 （好ましくは 9 5 %以上、 より好ましくは 9 8 %以上） の相同性 を有するアミノ酸配列を含有するぺプチドなどがあげられる。
「実質的に同質の活性」 としては、 例えばガラニン . レセプター GALR1、 GALR2 または GALR3に結合する活性、 ガラニン · レセプター GALR1、 GALR2または GALR3を 活性化する活性、 またはそれに伴い引き起こされるァラキドン酸遊離、 細胞内 Ca2+遊離、 細胞内 cAMP生成阻害、 イノシトールリン酸産生 （阻害） 、 細胞膜電位 変動、 細胞内蛋白質の燐酸化、 細胞內 pHの変化などのシグナル伝達活性系を活性 化させる能力において同質であることを示す。 従って、 これら活性の強弱ゃぺプ チドの分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
本発明のぺプチドとして馬体的には、 次のようなものがあげられる。
配列番号： 1で表されるアミノ酸配列もしくはその部分配列と同一もしくは実 質的に同一のァミノ酸配列を含有するぺプチドもしくはその部分ぺプチドに対し て、 1もしくは複数個のアミノ酸が置換、 欠失、 付カ卩あるいは揷入されているァ ミノ酸配列を含有するぺプチドは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するぺプチ ドとしてあげられる。 例えば、 （1 ) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列もし くはその部分配列中の 1個¾上 1 0個以下、 好ましくは 1個以上 5個以下、 より 好ましくは 1個以上 3個以下のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 （2 ) 配列番 号： 1で表されるアミノ酸配列もしくはその部分配列に 1個以上 1 0個以下、 好 ましくは 1個以上 5個以下、 より好ましくは 1個以上 3個以下のァミノ酸が付加 した （または揷入された） ァミノ酸配列、 （ 3 ) 配列番号： 1で表されるァミノ 酸酉 S列もしくはその部分配列中の 1個以上 1 0個以下、 好ましくは 1個以上 5個 以下、 より好ましくは 1個以上 3個以下のアミノ酸が他のアミノ酸で置換された ァミノ酸配列を含有するペプチドなどがあげられる。
「実質的に同質のァミノ酸配列」 としては、 その配列と 9 0 %以上、 より好ま しくは 9 5 %以上、 さらに好ましくは 9 8 %以上の相同性を有するァミノ酸配列 があげられる。
本明細書におけるペプチドは、 ペプチド標記の慣例に従って左端が N末端 （ァ ミノ末端） 、 右端が C末端 （カルボキシル末端） である。
本発明のペプチドは、 C末端が通常カルボキシル基 （一 C O O H) またはカル ボキシレート （一 C O〇—） であるが、 C末端がアミド （一 C O NH 2) または エステル （一 C O O R) であってもよい。 エステルの Rとしては、 例えばメチル、 ェチル、 n—プロピル、 イソプロピルもしくは n—ブチルなどの〇卜6アルキル 基、 シクロペンチル、 シクロへキシルなどの C 3— 8シクロアノレキル基、 フエ-ル、 α—ナフチルなどの C 2ァリール基、 ベンジル、 フエネチル、 ベンズヒドリ ルなどのフエ二ルー Cト 2アルキル、 もしくはひ一ナフチルメチルなどの α—ナ フチル一 C i— 2アルキルなどの C 7一 ァラルキル基のほか、 経口用エステルと して汎用されるピパロイルォキシメチル基などがあげられる。
本発明のぺプチドが C末端以外にカルボキシル基またはカルボキシレートを有 している場合、 それらの基がアミド化またはエステル化されているものも本発明 のペプチドに含まれる。 この時のエステルとしては、 例えば上記した C末端のェ ステルと同様なエステルなどが用いられる。
本発明のペプチドの塩どしては、 生理学的に許容される塩基 （例えばアルカリ 金属など） や酸 （有機酸、 無機酸） との塩が用いられるが、 とりわけ生理学的に 許容される酸付加塩が好ましい。 このような塩としては例えば無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 醉酸、 ギ 酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リン ゴ酸、 シユウ酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩な どが用いら; る。
本発明のペプチドは、 ヒトゃ温血動物の組織または細胞からペプチドを精製す る方法によって製造することもできるし、 後述のぺプチド合成法に準じて製造す ることもできる。
また、 本発明のペプチドは、 それをコードする D NAを含有する形質転換体を 培養することによつても製造することができる。 該ペプチドをコードする D N A は、 公知のクローニング方法 〔例えば、 Molecular Cloning ( 2 nd ed. ； J. Sambrook et al.， Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法など〕 に従って作成することができる。
該ク口一二ング方法とは、 （ 1 ) 該ぺプチドのァミノ酸配列に基づきデザィン した D N Aプローブまたは D N Aプライマーを用い、 c D N Aライブラリーから ハイブリダイゼーション法により該ぺプチドをコードする D N Aを含有する形質 転換体を得る方法、 または （2 ) 該ペプチドのアミノ酸配列に基づきデザインし た D NAプライマーを用い、 P C R法により該ペプチドをコードする D NAを含 有する形質転換体を得る方法があげられる。
本発明のペプチドをヒトゃ温血動物の組織または細胞から製造する場合、 ヒト や温血動物の組織または細胞をホモジナイズした後、 酸、 またはアルコールなど で抽出を行い、 該抽出液を、 塩析、 透析、 ゲル濾過、 逆相クロマ イオン交換クロマトグラフィー、 ァフィ二ティ一クロマトグラフィーなどのク口 マトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
上記したように本発明のぺプチドは、 （ 1 ) 自体公知のぺプチドの合成法に従 つて、 または （2 ) 本発明のペプチドを含有するペプチドを適当なぺプチダーゼ で切断することによって製造することができる。
ペプチドの合成法としては、 例えば固相合成法、 液相合成法のいずれによって も良い。 すなわち、 本発明のペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはァミノ 酸と残余部分とを縮合させ、 生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離するこ とにより目的のぺプチドを製造することができる。 公知の縮合方法や保護基の脱 離としてはたとえば、 以下の①〜②に記載された方法があげられる。
(DM. Bodanszkyおよぴ M. A. Ondetti, ペプチド シンセシス （P印 tide Synthes is) , Interscience Publishers, New York (1966年)
② Schroederおよび Luebke、 ザ ペプチド（The Peptide) , Academic Press, New Y ork (1965年） .
また、 反応後は通常の精製法、 例えば、 溶媒抽出、 蒸留、 カラムクロマトグラ フィ一、液体クロマトグラフィー、 再結晶などを組み合わせて本発明のぺプチド を精製単離することができる。 上記方法で得られるぺプチドが遊離体である場合 は、 公知の方法によって適当な塩に変換することができ、 逆に塩で得られた場合 は、 公知の方法によって遊離体に変換することができる。
本発明のぺプチドのァミド体は、 ァミ ド形成に適した市販のぺプチド合成用樹 脂を用いることができる。 そのような樹脂としては例えば、 クロロメチル樹脂、 ヒドロキシメチル樹脂、 ベンズヒドリルアミン榭脂、 アミノメチル樹脂、 4一べ ンジルォキシベンジルアルコール樹脂、 4—メチルベンズヒドリルァミン樹脂、 PAM樹脂、 4—ヒ ドロキシメチルメチルフエ二ルァセトアミ ドメチル榭脂、 ポリ アクリルアミド樹脂、 4— ( 2 ' , 4 ' -ジメ トキシフエ-ルーヒドロキシメチル） フエノキシ樹脂、 4 - ( 2 ' , 4 ' -ジメ トキシフエ二ルー Fraocアミノエチル) フエ ノキシ樹脂などをあげることができる。 このような樹脂を用い、 α—ァミノ基と 側鎖官能基を適当に保護したァミノ酸を、 目的とするぺプチドの配列通りに、 自 体公知の各種縮合方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後に樹脂からぺプ チドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、 必要に応じて高希釈溶液中で分子 内ジスルフィ ド結合形成反応を実施し、 目的のペプチドを取得する。
上記した保護されたァミノ酸の縮合に関しては、 ぺプチド合成に使用できる各 種活性化試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミド類がよレ、。 カルボ ジィミ ド類としては DCC、 N, N' -ジィソプロピルカルボジィミド、 N-ェチル - N'一
(3 -ジメチルァミノプロリル） カルポジイミドなどがあげられる。 これらによる 活性ィ匕にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 H0Bt、 HOOBtなど）とともに保護された アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、 対称酸無水物または HOBtエステルある いは HOOBtエステルとしてあらかじめ保護されたアミノ酸の活性ィ匕を行ったのち に樹脂に添加することができる。 保護されたァミノ酸の活性化や樹脂との縮合に 用いられる溶媒としては、 ペプチド縮合反応に使用しうることが知られている溶 媒から適宜選択されうる。 たとえば N， N—ジメチルホルムアミ ド、 N, N—ジ メチルァセトアミ ド、 N—メチルピロリ ドンなどの酸アミド類、 塩化メチレン、 クロ口ホルムなどのハロゲン化炭化水素類、 トリフルォロエタノールなどのアル コール類、 ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、 ピリジンなどの三級ァ ミン類、 ジォキサン、 テトラヒドロフランなどのエーテル類、 ァセトニトリル、 プロピオ二トリルなどのェトリノレ類、 酢酸メチル、 酢酸ェチルなどのエステル類 あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。 反応温度はぺプチド結合形成 反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、 通常約一 2 0 °C 〜約 5 0 °Cの範囲から適宜選択される。 活性化されたァミノ酸誘導体は通常約 1 - 5ないし約 4倍過剰で用いられる。 ニンヒ ドリン反応を用いたテストの結果、 縮 合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことによ り十分な縮合を行うことができる。 反応を繰り返しても十分な縮合が得られな 、 ときには、 無水酢酸またはァセチルイミダゾールを用いて未反応ァミノ酸をァセ チル化して、 後の反応に影響を及ぼさないようにすることができる。
原料アミノ酸のァミノ基の保護基としては、 たとえば、 Z、 Boc、 ターシャリ 一ペンチノレォキシカノレポ-ノレ、 イソボノレニノレオキシカノレポ二ノレ、 4ーメ トキシべ ンジノレォキシカノレボニノレ、 CI- Z、 Br- Z、 ァダマンチルォキシカノレボニノレ、 トリフ ノレオロアセチル、 フタロイノレ、 ホノレミノレ、 2—ニ トロフエニノレスノレフエ二ノレ、 ジ フエニルホスフイノチオイル、 Fmocなどがあげられる。 カルボキシル基の保護基 としては、 たとえば Rとして上記したじ アルキル基、 C 3一 8シクロアルキル 基、 C 7— 1 4ァラルキル基の他、 2—ァダマンチル、 4一二トロベンジル、 4一 メ トキシベンジル、 4一クロ口ベンジル、 フエナシル基およびベンジルォキシカ ルボニルヒドラジド、 ターシャリープトキシカルボュルヒドラジド、 トリチルヒ ドラジドなどがあげられる。
セリンおよびスレオニンの水酸基は、 たとえばエステル化またはエーテル化に よって保護することができる。 このエステルイ匕に適する基としては例えばァセチ ル基などの低級 （C ^e) アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベ ンジルォキシカルボニル基、 エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基 などがあげられる。 また、 エーテル化に適する基としては、 たとえばベンジル基、 テトラヒドロビラ-ノレ基、 ターシャリーブチノレ基などである。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 たとえば Bzl、 Cl 2- Bzl、 2一二トロベンジル、 Br - Z、 ターシャリ一ブチルなどがあげられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、 Tos、 4 -メ トキシ -2， 3， 6 -トリ メチルベンゼンスルホニル、 DNP、 ペンジノレオキシメチル、 Bum、 Boc、 Trt、 Fmoc などがあげられる。
原料のカルボキシル基の活性ィヒされたものとしては、 たとえば対応する酸無水 物、 アジド、 活性エステル [アルコール (たとえば、 ペンタクロロフエノール、 2, 4, 5 -トリクロ口フエノール、 2, 4 -ジニトロフエノール、 シァノメチノレアノレコー ノレ、 パラニトロフエノール、 H0NB、 N-ヒ ドロキシスクシミ ド、 N -ヒ ドロキシフタ ルイミ ド、 HOBt) とのエステル] などがあげられる。 原料のァミノ基の活性ィ匕さ れたものとしては、 たとえば対応するリン酸アミ ドがあげられる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 たとえば Pd黒あるいは Pd炭素などの触媒 の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メタンスルホ ン酸、 トリフルォロメタンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるいはこれらの混合 液などによる酸処理や、 ジイソプロピルェチルァミン、 トリェチルァミン、 ピぺ リジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニア中ナトリウムによ る還元などもあげられる。 上記酸処理による脱離反応は一般に一 2 0 °C〜 4 0 °C の温度で行われるが、 酸処理においてはァ-ソール、 フエノール、 チオアエソー ノレ、 メタクレゾール、 パラクレゾール、 ジメチルス/レフイド、 1， 4-プタンジチォ ール、 1, 2-エタンジチオールのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのィミダゾール保護基として用いられる 2， 4-ジ-ト口フエニル基はチ オフェノール処理により除去され、 トリプトファンのインドール保護基として用 いられるホルミル基は上記の 1, 2 -エタンジチオール、 1， 4-ブタンジチオールなど の存在下の酸処理による脱保護以外に、 希水酸ィ匕ナトリウム、 希アンモエアなど によるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護および保護基、 ならぴにその保護 基の脱離、 反応に関与する官能基の活性ィヒなどは公知の基あるいは公知の手段か ら適宜選択しうる。
本発明のペプチドのアミ ド体を得る別の方法としては、 まず、 カルボキシノレ末 端ァミノ酸のひ一カルボキシル基をァミド化した後、 ァミノ基側にぺプチド鎖を 所望の鎖長まで延ばした後、 該ぺプチド鎖の N末端の α—アミノ基の保護基のみ を除いたぺプチドと C末端のカルボキシル基の保護基のみを除いたぺプチド （ま たはァミノ酸） とを製造し、 この両ぺプチドを上記したような混合溶媒中で縮合 させる。 縮合反応の詳細については上記と同様である。 縮合により得られた保護 ペプチドを精製した後、 上記方法によりすベての保護基を除去し、 所望の粗ぺプ チドを得ることができる。 この粗ぺプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製 し、 主要画分を凍結乾燥することで所望のぺプチドのァミド体を得ることができ る。
本発明のぺプチドのエステル体を得るにはカルボキシ末端アミノ酸の α—カル ボキシル基を所望のアルコール類と縮合しァミノ酸エステルとした後、 ぺプチド のァミド体と同様にして所望のぺプチドのエステル体を得ることができる。
本発明のペプチドとしては、 上記した配列番号： 1で表されるアミノ酸配列も しくはその部分配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するぺプ チドと同様の作用 （例、 GALR1ァゴ-ス ト活性、 GALR2ァゴニスト活性または GALR3ァゴニスト活性など） を有しているものであれば、 どのようなぺプチドで あってもよい。 このようなペプチドとしてはたとえば、 上記した配列番号： 1で 表されるァミノ酸配列もしぐはその部分酉己列、 から 1ないし 5個以下のァミノ酸 が欠失、 付加 （揷入） または置換したアミノ酸配列を有するペプチドをあげるこ とができる。
本発明のぺプチドの前駆体とは、 本発明のリガンドぺプチドをその部分酉 S列と してコードするぺプチドであればいかなるものであってもよい。
本発明のペプチドの前駆体として、 具体的には、 例えば、 配列番号： 2で表さ れるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するぺプチ ド （またはポリペプチド） などがあげられる。
ここで、 「実質的に同一のアミノ酸配列」 としては、 配列番号： 2で表される アミノ酸配列と 8 0 %以上、 'より好ましくは 9 0 %以上、 さらに好ましくは 9
5 %以上、 最も好ましくは 9 8 %以上の相同性を有するァミノ酸配列などがあげ られる。
また、 「実質的に同一のアミノ酸配列」 としては、 （i)配列番号： 2で表され るアミノ酸配列中の 1個以上 2 0個以下、 好ましくは 1個以上 1 0個以下、 より 好ましくは 1個以上 5個以下のァミノ酸が他のァミノ酸で置換されたァミノ酸配 列、 （ii) 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列中の 1個以上 2 0個以下、 好ま しくは 1個以上 1 0個以下、 より好ましくは 1個以上 5個以下のアミノ酸が欠失 したアミノ酸配列、 （iii) 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列に 1個以上 2 0 個以下、 好ましくは 1個以上 1 0個以下、 より好ましくは 1個以上 5個以下のァ ミノ酸が付加 （または挿入） したアミノ酸配列などがあげられる。 「置換、 欠失、 付カ卩 （または挿入） 」 の位置は本発明のリガンドペプチドをその部分配列として コードする領域以外であれば、 特に限定はされない。
配列番号： 2で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸 配列を含有するペプチド （またはポリペプチド） の具体例としては、 例えば、 配 列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有し、 （i)配列番号： 2で表されるアミ ノ酸配列中の 1個以上 2 0個以下、 好ましくは 1個以上 1 0個以下、 より好まし くは 1個以上 5個以下のァミノ酸が他のァミノ酸で置換されたァミノ酸配列、 (ii) 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列中の 1個以上 2 0個以下、 好ましく は 1個以上 1 0個以下、 より好ましくは 1個以上 5個以下のアミノ酸が欠失した アミノ酸配歹¾、 (iii) 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列に 1個以上 2 0個以 下、 好ましくは 1個以上 1 0個以下、 より好ましくは 1個以上 5個以下のァミノ 酸が付カ卩 （または揷入） したァミノ酸配列を有するぺプチド またはポリぺプチ ド） などがあげられる。 .
本発明のぺプチドは、 さらに抗リガンドぺプチド抗体の調製のための抗原とし て用いることができる。 このような抗原としてのぺプチドは上記した本発明のぺ プチドの他に、 例えば、 上記本発明のペプチドの N末端ペプチド、 C末端べプチ ド、 中央部分のぺプチドなどの部分べプチドなどが用いられる。
部分べプチドとしては、 本発明べプチドの個々のドメインを個別に含むぺプチ ドも用い得るが、 複数のドメインを同時に含む部分のペプチドでも良い。
また、 上記の部分ペプチドは、 抗リガンドペプチド抗体の調製のための抗原と して用いることができればよいため、 （i)上記本発明のぺプチドの N末端べプチ ド、 C末端ぺプチド、 中央部分のぺプチドなどの部分べプチドに 1ないし数個 (好ましくは 1ないし 5個，より好ましくは 1または 2個） の他のアミノ酸残基 が付加 （または挿入） した部分ペプチド、 （ii)上記本発明のペプチドの N末端べ プチド、 C末端ぺプチド、 中央部分のぺプチドなどの部分べプチドから 1ないし 数個 （好ましくは 1ないし 5個，より好ましくは 1または 2個） のアミノ酸残基 が欠失した部分ペプチド、 （iii) 上記本発明のペプチドの N末端ペプチド、 C 末端べプチド、 中央部分のぺプチドなどの部分ぺプチドの構成ァミノ酸の 1ない し数個 （好ましくは 1ないし 5個，より好ましくは 1または 2個） が他のアミノ 酸残基で置換された部分ぺプチドなども含まれる。
上記の部分ペプチドとしてより具体的には、 例えば、 配列番号： 1で表される アミノ酸配列の N末端から第 2 4番目 （P r o ) 〜第 3 0番目 （A s p ) からな る部分アミノ酸配列、 第 3 .2番目 （G l y ) 〜第 3 7番目 （S e r ) からなる部 分アミノ酸配列、 第 5 5番目 （H i s ) 〜第 6 0番目 （T h r ) からなる部分ァ ミノ酸配列を含有するぺプチドなどがあげられる。
本明細書における部分ペプチドも C末端がアミド （- C0NH2)またはエステル (- C00R)であってもよい。 ここでエステル基の例としては上記したぺプチドの場合 と同様である。 該部分べプチドが C末端以外にカルボキシル基またはカルボキシ レートを有している場合、 それらの基がアミ ド化またはエステルイ匕されているも のも本発明の部分ペプチドに含まれる。 この時のエステルとしては、 例えば、 上 記した C末端のエステルなどが用いられる。
本発明のぺプチドの部分ぺプチドはそれ自体で本発明のぺプチドが有する活性 (例えば、 ガラニンレセプターに対する活性化作用など） を有していてもよい。 本発明のペプチドまたはその部分ペプチドは、 さらに、 機能あるいは'生質がよく 知られているタンパク質との融合タンパク質であってもよい。
本発明のぺプチドの部分べプチドの塩としては、 前述のぺプチドの塩と同様の ものが用いられる。
本発明のぺプチドの部分ぺプチドまたはそのァミ ド、 エステルもしくはその塩 は、 上記したペプチドの場合と同様の合成法に従って、 あるいは本発明のぺプチ ドを適当なぺプチダーゼで切断することによって製造することができる。
本発明のペプチドをコードする D NAとしては、 例えば、 配列番号： 1で表わ されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有し、 好ま しくは、 さらに配列番号： 1 1、 配列番号： 1 2または配列番号： 1 3で表され るァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するレセプタ 一蛋白質に対する結合する能力 （好ましくはレセプター蛋白質を活性ィ匕する能力 など） を有するぺプチドなどをコードする塩基配列を含有する D N Aを含有する D N Aであればいかなるものであってもよい。
さらには上記に具体的に記載された本発明のぺプチドをコ一ドする D NAを含 有する D N Aであればいかなるものであっていてもよい。
また、 ゲノム D NA、 ゲノム D NAライブラリー、 前記した糸且織 '細胞由来の c D NA、 前記した組織 ·細胞由来の c D NAライブラリー、 合成 D NAのいず れでもよい。 ライプラリーに使用するベクターはパクテリオファージ、 プラスミ ド、 コスミ ド、 ファージミ ドなどいずれであってもよい。 また、 前記した糸且織' 細胞より R N A画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (以下、 R T- P C R法と略称する）によって増幅す ることもできる。
より具体的には、 (1)配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ 酸配列を含有するペプチドをコードする DNAを含有する DNA (2)ストリンジ ェントな条件下で（1)で規定された配列とハイブリダイズする哺乳動物由来の D N A、 (3)遺伝コ一ドの縮重のため（1)および (2)に定められている配列とハイプ リツド形成しないが、 同一アミノ酸配列をもつポリペプチドをコードする DNA などが用いられる。 ハイブリダィゼーシヨンは、 自体公知の方法あるいはそれに 準じた方法に従って行うことができる。 上記ストリンジヱントな条件としては、 例えば 42° (、 50%ホルムアミド、 4XS SPE(1 XS SPE = 150mM NaCl, lOmM NaH2P04 ·Η20， ImM EDTA pH7.4)、 5 Xデンハート溶液、 0. 1 % S D Sで ある。
配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸 配列を含有するぺプチドをコ一ドする DNAを含有する DNAの具体例としては、 配列番号： 3で表される塩基配列を含有する DNAなどがあげられる。
また、 本発明のぺプチドまたはその部分べプチドをコ一ドする DNAの中で例 えば 1個以上 40個以下 （好ましくは 1個以上 30個以下、 さらに好ましくは 1 個以上 20個以下） の部分塩基配列を含有する DNA断片は DNA検出プローブ としても好ましく用いられる。
本発明のぺプチドの前駆体をコードする DNAとしては、 上記の本発明のぺプ チドの前駆体、 具体的には、 配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列と同一もし くは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチド （ポリペプチド） などをコ 一ドする DNAを含有する DNAであればいかなるものであってもよい。
配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸 配列を含有するペプチド （ポリペプチド） をコードする DN Aを含有する DN A の具体例としては、 配列番号： 20で表される DNAを含有する DNAなどがあ げられる。
本発明のぺプチドなどをコードする DNAは、 以下の遺伝子工学的手法によつ ても製造することができる。 該遺伝子工学的手法は、 例えば Molecular
Cloning (2nd ed. ； J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などがあげられる。 また、 市販のライプラリーやキットを使 用する場合には、 添付の使用説明書に記載の方法に従って行えばよい。
本発明のぺプチドなどをコードする DNAは、 そのべプチドのアミノ酸配列ま たはその一部に基づき D N A断片を合成し標識したプローブを、 ゲノム DNAま たは c DN Aのライブラリ一等とハイプリダイゼーシヨンにすることよって選別 することができる。
本発明のぺプチドなどを 全にコ一ドする DNAのクローニングの手段として は、 本発明のぺプチドの部分塩基配列を有する合成 DN Aプライマーを用いて、 自体公知の PC R法によってゲノム DN Aまたは cDN Aのライブラリ一等から 目的とする D N Aを増幅するカ または適当なベクターに組み込んだ D N Aを例 えば本発明のぺプチドなどの一部あるいは全領域を有する DN A断片もしくは合 成 D N Aを用いて標識したものとのハイプリダイゼーシヨンによつて選別するこ とができる。 .
クローン化された本発明のペプチドなどをコードする DN Aは目的によりその まま、 または所望により制限酵素で消化したり、 リンカ一を付加したりして使用 することができる。 該 DNAはその 5' 末端側に翻訳開始コドンとしての ATG を有し、 また 3' 末端側には翻訳終止コドンとしての TAA、 TGAまたは TA Gを有していてもよい。 これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、 適当な合 成 DNAアダプターを用いて付加することもできる。
本発明のペプチドなどの発現ベクターは、 例えば、 （ィ） 本発明のペプチドを コードする DNAから目的とする DNA断片を切り出し、 （口） 該 DNA断片を 適当な発現ベクター中のプ モーターの下流に連結することにより製造すること ができる。
ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミド （例、 pBR322， p BR 32 5， pUC 12, pUC 13) 、 枯草菌由来のプラスミド （例、 pUB 110， p TP 5, p C 194) 酵母由来プラスミ ド （例、 p S H 1 9， p SH1 5) 、 えファージなどのバクテリオファージ、 レトロウィルス, ワクシニアウィルス， バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどが用いられる。 . 本発明で用いられるプロモーターとしては、 遺伝子の発現に用いる宿主に対応 して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。 形質転換する際の宿主が動物細胞である場合には、 SV40由来のプロモータ 一、 レトロウイ/レスのプロモーター、 メタ口チォネインプロモーター、 ヒートシ ョックプロモーター、 サイ トメガロウイノレスプロモーター、 SRaプロモーター などが利用できる。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 t r pプロモーター、 T7プロモーター、 l a cプロモーター、 r e cAプロモーター、 PLプロモ 一ター、 1 p pプロモーターなどが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 SPO 1プロモーター、 SP02プロモーター、 p e n Pプロモーターなど、 宿主が酵 母である場合は、 PHO 5プロモーター、 PGKプロモーター、 GAPプロモー ター、 ADH1プロモーター、 GALプロモーターなどが好ましい。 宿主が昆虫 細胞である場合は、 ポリヘドリンプロモーター、 P 10プロモーターなどが好ま しい。
発現ベクターには、 以上の他に、 所望によりェンハンサー、 スプライシングシ ダナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカー、 S V40複製オリジン (以下、 S V40 o r iと略称する場合がある） などを含有しているものを用いることがで きる。 選択マーカーとしては、 例えば、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （以下、 dh f r と略称する場合がある） 遺伝子 〔メソトレキセート （MTX) 耐性〕 、 アンピシ リン耐性遺伝子 （以下、 Am prと略称する場合がある） 、 ネオマイシン耐性遺 伝子 （以下、 Ne o rと略称する場合がある、 G418耐性） 等があげられる。 特に、 CHO (dh f r-) 細胞を用いて DHFR遺伝子を選択マーカーとして 使用する場合、 チミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 ペプチドまたはその部分 ペプチドの N末端側に付加する。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 phoA' シグナル配列、 OmpA ·シグナル配列などが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 α _アミラーゼ 'シグナル配列、 サブチリシン ·シグナル配列などが、 宿主が酵 母である場合は、 メイティングファクター （MF α) · シグナル配列、 インベル ターゼ ·シグナル配列など、 宿主が動物細胞である場合には、 例えばインシユリ ン ·シグナル配列、 ーィンターフェ口ン · シグナル配列、 抗体分子 ·シグナル 配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築されたぺプチドをコ一ドする DN Αを含有するベクターを 用いて、 形質転換体を製造することができる。
宿主としては、 たとえばェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫または 昆虫細胞、 動物細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌としては、 ェシエリヒア ' コリ （Escherichia coli) K 1 2 · DH 1 〔プロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナノレ ·ァカデミ一 ·ォプ ·サ イエンシィズ'ォプ'ザ 'ユーエスエー (Proc- Natl. Acad. Sci. U S A) , 60卷， 160 (1968)〕 ， J M 103 〔ヌクイレック 'ァシッズ' リサーチ, (Nucleic Acids Research) , 9卷， 309 (1981)〕 ， JA221 〔ジャー ナノレ ·才フ ·モレキュラー ·ノ ィ才ロジ一 (Journal of Molecular Biology) 〕 ， 120卷， 51 7 (1978)〕 ， HB 101 〔ジャーナル'ォブ 'モレキユラ 一.バイオロジー， 41卷， .459 (1969)〕 ， C600 〔ジェネティックス (Genetics) ， 39巻， 440 (1954)〕 などが用いられる。
バチルス属菌としては、 たとえばバチルス .サチルス （Bacillus subtilis) MI 114 〔ジーン， 24卷， 255 (1983)〕 ， 207— 21 〔ジャーナ ノレ ·ォプ ·ノ ィオケミストリー （Journal of Biochemistry) ， 95卷， 87 (1
984)〕 などが用いられる。
酵母としては、 たとえばサッカロマイセス セレピシェ （Saccharomyces cerevisiae) AH22, AH22R— , ΝΑ87— 1 1A, DKD— 5D, 20 B- 12などが用いられる。
昆虫としては、 例えばカイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、 ネイチヤー
(Nature) , 315卷， 592 (1985)〕 。
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが Ac NPVの場合は、 夜盗蛾の幼虫由 来株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell； S f 細胞） 、 Trichoplusia niの中 腸由来の MG1細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High Five™細胞、
Mamestra brassicae 由来の細胞または Estigmena acrea 由来の細胞などが用い られる。 ウィルスが BmNP Vの場合は、 蚕由来株化細胞 （Bombyx mori N； B mN細胞） などが用いられる。 該 S f細胞としては、 例えば、 S f 9細胞 （ATCC CRL1711) 、 S f 21細胞 〔以上、 Vaughn, J. L.ら、 イン' ヴィト口 （in
Vitro) , 13卷， 213— 21 7頁 （1977年） 〕 などが用いられる。 動物細胞としては、 たとえばサル COS— 7細胞、 Vero細胞、 チャイニーズ ハムスタ一細胞 C H O、 DHFR遺伝子欠損チャイニーズハムスタ一細胞 CHO (CHO/d h f r—細胞） 、 マウス L細胞、 マウス 3 T 3細胞、 マウスミエ ローマ細胞、 ヒ ト ΗΕΚ293細胞、 ヒ ト FL細胞、 293細胞、 C 127細胞、 BALB 3T3細胞、 S ρ二 2 Ζθ細胞などが用いられる。
ェシェリヒァ属菌を形質転換するには、 たとえばプロシージングズ ·ォブ · ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンジィズ ·ォプ ·ザ ·ユーエスエー (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 69卷， 2110 (1972)やジーン (Gene) ， 17卷， 107 (1982)などに記載の方法に従って行なわれる。 バチルス属菌を形質転換するには、 たとえばモレキュラー 'アンド'ジエネラ ノレ ·ジェ不ティックス (Molecular & General Genetics; , 168^, 11 1 (1979)などに記載の方¾に従って行われる。
酵母を形質転換するには、 たとえばプロシージングズ 'ォブ 'ザ 'ナショナ ル ·アカデミー ·ォプ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスエー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 75卷， 1929(1 978 )に記載の方法に従って行な われる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、 たとえばバイォ Ζテクノロジー (Bio/Technology) ， 6卷， 47— 55頁 （1988年） などに記載の方法に従 つて行なわれる。
動物細胞を形質転換するには、 たとえばヴィロロジ一 （Virology) , 52卷，
456 (1973)に記載の方法に従って行なわれる。
発現べクターの細胞への導入方法としては、 例えば、 リポフエクション法
[Feigner, P. L. et al. プロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·ァカデミ 一 ·ォブ ·サイェンジィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスエー (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America) , 84卷,
7413頁 （1987年） 〕 、 リン酸カルシウム法 〔Graham， F. L. and van der Eb， A. J.ヴィロロジー （Virology) , 52巻， 456— 467頁 （197 3年） 〕 、 電気穿孔法 〔Nuemann， E. et al. ェンボ 'ジャーナル （EMB0 J. ) ， 1卷， 841— 845頁 （1982年） 〕 等があげられる。 このようにして、 本発明のぺプチドなどをコードする D N Aを含有する発現べ クタ一で形質転換された形質転換体が得られる。
なお、 動物細胞を用いて、，本発明のぺプチド等を安定に発現させる方法として は、 上記の動物細胞に導入された発現ベクターが染色体に組み込まれた細胞をク ローン選択によって選択する方法がある。 具体的には、 上記の選択マーカーを指 標にして形質転換体を選択する。 さらに、 このように選択マーカーを用いて得ら れた動物細胞に対して、 繰り返しクローン選択を行なうことにより本発明のぺプ チド等の高発現能を有する安定な動物細胞株を得ることができる。 また、 d h f r遺伝子を選択マーカーとして用いた場合、 MT X濃度を徐々に上げて培養し、 耐性株を選択することにより、 d h f r遺伝子とともに、 本発明のぺプチドなど をコードする D N Aを細胞内で増幅させて、 さらに高発現の動物細胞株を得るこ ともできる。 - 上記の形質転換体を本発明のぺプチド等をコードする D N Aが発現可能な条件 下で培養し、 本発明のペプチド等を生成、 蓄積せしめることによって、 本発明の ぺプチド等を製造することができる。
宿主がェシエリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培養 に使用される培地としては液体培地が適当であり、 その中には該形質転換体の生 育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物その他が含有せしめられる。 炭素源としては、 たとえばグルコース、 デキストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖など、 窒素源としては、 たとえばアンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コーンスチープ' リカー、 ペプトン、 力 ゼイン、 肉エキス、 大豆粕、'バレイショ抽出液などの無機または有機物質、 無機 物としてはたとえば塩化カルシウム、 リン酸ニ水素ナトリゥム、 塩化マグネシゥ ムなどがあげられる。 また、 酵母エキス、 ビタミン類、 生長促進因子などを添カロ してもよレ、。 培地の p Hは約 5〜 8が望ましい。
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えばグルコース、 カザミノ 酸を含む M 9培地 〔ミラー （Miller) ， ジャーナル'ォブ.ェクスペリメンッ · イン ·モレキュラー ·ジェ不ティックス (Journal of Experiments in
Molecular Genetics) ， 4 3 1—4 3 3 , Cold Spring Harbor Laboratory, New- York 1 9 7 2 ) が好ましい。 ここに必要によりプロモーターを効率よく働力 ¾： るために、 たとえば 3 /3—インドリルアタリル酸のような薬剤を加えることがで さる。
宿主がェシェリヒア属菌め場合、 培養は通常約 1 5〜 43 °Cで約 3〜 24時間 行い、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 30-40 °Cで約 6〜 24時間行な い、 必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 たとえばバークホ 一ノレダー （Burkholder) 最小培地 〔Bostian， K. L. ら、 「プロシージングズ · ォプ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーェ スエー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 77卷， 4505 (1 9 80)〕 や 0. 5%カザミノ酸を含有する SD培地 〔Bitter， G. A. ら、 「プロシージング ズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル 'アカデミー ·ォプ ·サイェンシィズ ·ォブ 'ザ .ュ 一エスエー （proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 8 1卷， 5330 (1 98 4) 〕 があげられる。 培地の pHは約 5〜8に調整するのが好ましい。 培養は通 常約 20 °C〜 35 °Cで約 24〜 72時間行い、 必要に応じて通気や撹拌を加える。 宿主が昆虫細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 Grace's Insect Medium (Grace, T.C.C. ,ネイチヤー (Nature) , 195, 788(1962)) に非働 ィ匕した 1 0%ゥシ血清等の添加物を適: 1¾卩えたものなどが用いられる。 培地の ρ Ηは約 6. 2〜 6. 4に調整するのが好ましレ、。 培養は通常約 27 °Cで約 3〜 5 日間行い、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 たとえば約 5 〜 20%の胎児牛血清を含む MEM培地 〔サイエンス （Science) ， 1 22卷， 50 1 (1 9 5 2)〕 ， DMEM培地 〔ヴイロロジー （Virology) ， 8卷， 3 96 (1 95 9)〕 ， RPMI 1 640培地 〔ジャーナル ·ォブ ·ザ ·アメリカン' メアイカル ·ァソシエーション (The Journal of the American Medical
Association) 1 9 9卷， 5 1 9 (1 967)〕 ， 1 99培地 〔プロシージング · オフ、、 ·ザ ·ソサイエティ ·フォー ·ザ ·バイオロジカル ·メディスン
(Proceeding of the Society for the Biological Medicine) , 7 ύ , 1 (1 9 50)〕 などが用いられる。 pHは約 6〜8であるのが好ましい。 培養は通常 約 3 0 °C〜 4 0 °Cで約 1 5〜 6 0時間行い、 必要に応じて通気や撹拌を加える。 特に C HO (dhfr-) 細胞おょぴ dhfr遺伝子を選択マーカーとして用いる場合 には、 チミジンをほとんど含まない透析ゥシ胎児血清を含む DMEM培地を用い るのが好ましい。 ·
上記培養物から本発明のぺプチドなどを分離精製するには、 例えば下記の方法 により行なうことができる。
本発明のぺプチドなどを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、 培養 後、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩衝液に懸濁し、 超音 波、 リゾチームおよぴ Zまたは凍結融解などによつて菌体ぁるいは細胞を破壊し たのち、 遠心分離やろ過によりぺプチドの粗抽出液を得る方法などが適宜用い得 る。 緩衝液の中に尿素や塩酸グァニジンなどのたんぱく変性剤や、 トリ トン X— 1 0 0 (登録商標。 以下、 TMと省略することがある。 ） などの界面活性剤が含 まれていてもよい。 '
培養液中にペプチドが分泌される場合には、 培養終了後、 自体公知の方法で菌 体あるいは細胞と上清とを分離し、 上清を集める。
このようにして得られた培養上清、 あるいは抽出液中に含まれる本発明のぺプ チドなどの精製は、 自体公知の分離 ·精製法を適切に組み合わせて行なうことが できる。 これらの公知の分離、 精製法としては、 塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度 を利用する方法、 透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法、 および S D S—ポリアクリ ルァミ ドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、 ィオン交換 クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、 ァフィ二ティークロマトグ ラフィ一などの特異的親和性を利用する方法、 逆相高速液体ク口マトグラフィー などの疎水性の差を利用する方法、 等電点電気泳動法ゃクロマトフオーカシング などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
かくして得られる本発明のペプチドなどが遊離体で得られた場合には、 自体公 知の方法あるいはそれに準 る方法によつて塩に変換することができ、 逆に塩で 得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、 遊離体また は他の塩に変換することができる。
なお、 形質転換体が産生する本発明のペプチドなどを、 精製前または精製後に 適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、 任意に修飾を加えたり、 ペプチド を部分的に除去することもできる。 蛋白修飾酵素としては、 例えば、 トリプシン、 キモトリプシン、 アルギニルェンドぺプチダーゼ、 プロティンキナーゼ、 グリコ シダーゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明のぺプチドなどの存在は特異抗体を用いたェンザィム ィムノアツセィなどにより測定することができる。
本発明のぺプチドなどをコードする D NAまたは本発明のぺプチドは、 ①ガラ ニン ' レセプター蛋白質のリガンドの一部、 あるいは全長の合成、 ②本発明のぺ プチドなどの有する生理作用の探索、 ③合成オリゴヌクレオチドプローブあるい は P C Rのプライマーの作成、 ④ G蛋白質共役型レセプター蛋白質のリガンドゃ 前駆体蛋白質をコードする D N Aの入手、 ⑤組換え型レセプター蛋白質の発現系 を用レ、たレセプタ一結合ァッセィ系の開発と医薬品候補化合物のスクリ一ユング、 ⑥抗体および抗血清の入手、 ⑦ D NA、 R NA、 抗体または抗血清を用いた診断 薬の開発、 ⑧記憶機能改善剤 （向知能薬） 、 食欲調節剤、 糖尿病治療薬、 下垂体 機能改善薬、 子宫機能調節剤、 腎臓機能調節剤、 前立腺機能調節剤、 精巣機能調 節剤または骨格筋機能調節剤 （好ましくは、 記憶機能改善剤 （向知能薬） 、 食欲 調節剤、 子宮機能調節剤、 腎臓機能調節剤、 前立腺機能調節剤、 精巣機能調節剤 または骨格筋機能調節剤） などの医薬の開発、 ⑨遺伝子治療等に用いることがで きる。
特に、 後述の組換え型 G蛋白質共役型レセプター蛋白質の発現系を用いたレセ プター結合アツセィ系によって、 ヒトなどの温血動物に特異的な G蛋白質共役型 レセプターァゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングすることができ、 該ァゴニストまたはアンタゴニストを各種疾病の予防 ·治療剤などとして使用す ることができる。 .
また、 上記⑧に関し、 本発明のペプチドまたはそれをコードする D NAは、 海 馬、 視床下部、 子宫、 腎臓、 前立腺、 骨格筋、 膝臓、 精巣、 脾臓、 心臓、 下垂体 などで発現しているガラニン'レセプター （GA L R) 蛋白質がリガンドとして 認識するものであるので、 安全で低毒性な医薬として有用であり、 例えば、 記憶 機能改善剤 （向知能薬） 、 食欲調節剤、 糖尿病治療薬、 下垂体機能改善薬、 食欲 調節剤、 子宫機能調節剤、 腎臓機能調節剤、 前立腺機能調節剤または骨格筋機能 調節剤 （好ましくは、 記憶機能改善剤 （向知能薬） 、 食欲調節剤、 子宮機能調節 剤、 腎臓機能調節剤、 前立腺機能調節剤または骨格筋機能調節剤） などとして用 いることができる。
さらに、 本発明のポリペプチドまたはそれをコードする D NAは、 血中 L H濃 度の特異的な上昇作用 （L H分泌促進作用） を有し、 本発明のポリペプチドと高 レ、相同性を持つガラ二ンでは L H分泌促進作用は見られないことから、 L H分泌 促進作用は、 ガラニンにはない本発明のポリべプチド特異的な作用である。
本発明におけるぺプチドまたはそれをコードする D NAは、 L Hの分泌促進作 用を有するため、 LH分泌不全に関係する各種疾患 （具体的には、 不妊症、 月経 不順、 月経困難症、 無月経症、 月経前症候群、 更年期障害、 下垂体機能不全また は肥満症など） の予防 ·治療薬として用いることができる。 即ち、 本発明のポリ ぺプチドまたは本発明のポリべプチドをコ一ドする D N Aを含有する L H分泌調 節剤は、 L H分泌促進剤として、 不妊症、 月経不順、 月経困難症、 無月経症、 月 経前症候群、 更年期障害、 下垂体機能不全または肥満症などの予防 ·治療薬とし て用いることができる。 また、 本発明のポリペプチドまたは本発明のポリぺプチ ドをコードする D NAを含有する L H分泌調節剤は、 特に、 レブチン受容体に異 常に起因する各種疾患 （具体的には、 肥満症、 不妊症など） の予防 ·治療薬とし て有効であると考えられる。
一方、 本発明のポリペプチドは、 そのレセプター蛋白質との親和性が高いため、 本発明のポリべプチドまたはそれをコードする D N Aの投与量が増えると L H分 泌に対し脱感作が起こる結果、 L H分泌を抑制する作用も有する。 この場合、 本 発明のポリぺプチドまたはそれをコードする D N Aを含有する L H分泌調節剤は、 L H分泌抑制剤として、 L H過剰分泌に関係する各種疾患 （具体的には、 前立腺 癌、 前立腺肥大症、 思春期早発症または L H産生下垂体腫瘍など） の予防 '治療 薬として用いることができる。
本発明のぺプチドまたはぞれをコードする D NAを上述の医薬として使用する 場合、 常套手段に従って実施することができる。 例えば、 必要に応じて糖衣や腸 溶性被膜を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤などと して経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性 溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。 例えば、 該ィ匕 合物またはその塩を生理学的に認められる担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防 腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に認められた製薬実施に要求される単位 用量形態で混和することによって製造することができる。 これら製剤における有 効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
本発明の D N Aを用いる場合は、 該 D N Aを単独またはレトロウイルスベクタ 一、 アデノウイルスベクター、 アデノウイルスァソシエーテツドウィルスベクタ 一などの適当なベクターに揷入した後、 常套手段に従って実施することができる。 錠剤、 カプセノレ剤などに混和することができる添加剤としては、 例えばゼラチ ン、 コーンスターチ、 トラガントガム、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セ ルロースのような賦开剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような 膨化剤、 ステアリン酸マグネシゥムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッ力 リンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのような香味剤 などが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 前記タイプの材料 にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成 物は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然 産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施にしたがって処方 することができる。
注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を 含む等張夜 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナトリウムな ど） などがあげられ、 適当な溶解補助剤、 たとえばアルコール （たとえばェタノ ール) 、 ポリアルコール (たとえばプロピレングリコール、 ポリエチレングリコ ール） 、 非イオン性界面活性剤 （たとえばポリソルベート 8 0 (ΤΜ) 、 H C O - 5 0 ) などと併用してもよい。 油性液としてはゴマ油、 大豆油などがあげられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと併用してもよい。 また、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸ナトリウム緩衝液） 、 無痛化剤 (例えば、 塩化ベンザルコユウム、 塩酸プロ力インなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒ ト血清アルブミン、 ポリエチレングリコールなど） 、 保存剤 （例えば、 ベンジル アルコール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤などと配合してもよい。 調製された 注射液は通常、 適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えばヒトや哺乳動 物 （例えば、 マウス、 ラット、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 など） に対して投与することができる。
本発明のぺプチドまたはそれをコードする DNAの投与量は、 症状などにより 差異はあるが、 該ペプチドを経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 60 k gと して） においては、 一日につき約 0. 1から 10 Omg、 好ましくは約 1. 0力 ら 50mg、 より好ましくは約 1. 0から 2 Omgである。 該ペプチドを非経口 的に投与する （例えば、 静脈注射で投与する） 場合は、 その 1回投与量は、 投与 対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 たとえば注射剤の形 では成人 （体重 6 Ok gとして） においては、 一日につき約 0. 01から 30m g程度、 好ましくは約 0. 1から 2 Omg程度、 より好ましくは約 0. 1から 1 Omg程度である。
他の動物の場合も、 上記 60 k g当たりの投与量をその動物の体重に換算した 量を投与することができる。
上記本発明において、 ガラニン'レセプターとしては、 ヒトゃ温血動物 （例え ば、 哺乳温血動物 （例、 ゥサギ、 ヒッジ、 ャギ、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥシ、 ゥマ、 プタ） 、 鳥類 （例、 ニヮトリ、 ハト、 ァヒル、 ガチョウ、 ゥズラ） など） のあらゆる組織 （例えば、 下垂体、 睦臓、 脳、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状 腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管、 血管、 心臓など） または細 胞などに由来する G蛋白質共役型レセプター蛋白質であって、 GALR1として は配列番号： 1 1、 GALR 2としては配列番号： 12、 GALR 3としては配 列番号： 13で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸 配列を含有するものであれば如何なるものであってもよい。 即ち、 該レセプター 蛋白質としては、 配列番号： 11、 12または 13で表わされるアミノ酸配列を 含有する蛋白質などの他に、 配列番号： 1 1、 12または 13で表わされるアミ ノ酸配列と約 90〜 99. 9 %の相同性を有するァミノ酸配列を含有し、 配列番 号： 11、 12または 13で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的 に同質の活性を有する蛋白質などがあげられる。
これらの蛋白質が示す活性としては、 例えばリガンド結合活性、 シグナル伝達 活性などがあげられる。 実質的に同質とは、 それらの活性が性質的に同質である ことを示す。 従つて、 リガ ド結合活性やシグナル伝達活性の強さなどの強弱、 レセプター蛋白質の分子量などの量的要素は異なつていてもよレ、。
さらに、 該レセプター蛋白質には、 N末端の Metが保護基 （例えば、 ホルミル 基、 ァセチル基などの C i_6アルカノィル基など） で保護されているもの、 N末 端のグルタミン残基がピログルタミン酸ィ匕したもの分子內のァミノ酸の側鎖が適 当な保護基 （例えば、 ホルミ'ル基、 ァセチル基などの C ^6アルカノィル基な ど） で保護されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複 合蛋白質なども含まれる。
該レセプター蛋白質の塩としては、 上記したペプチドの塩と同様のものがあげ られる。 .
該レセプター蛋白質またはその塩またはその部分ペプチドは、 ヒトゃ温血動物 の組織または細胞から自体公知の蛋白質の精製方法によって製造することもでき るし、 前述のぺプチドをコ一ドする D N Aを含有する形質転換体を培養する方法 と同じ方法によっても製造することができる。 また、 前述のペプチド合成法に準 じて製造することもできる。 '
該レセプター蛋白質の部分ペプチドとしては、 例えば、 G蛋白質共役型レセプ ター蛋白質分子のうち、 細胞膜の外に露出している部位などが用いられる。 すな わち G蛋白質共役型レセプター蛋白質の疎水性プロット解析において細胞外領域 (親水性 （HydropMlic) 部位） であると分析された部分を含むペプチドである。 また、 疎水性 （Hydrophobic) 部位を一部に含むペプチドも同様に用いること力 S できる。 個々のドメインを個別に含むペプチドも用い得るが、 複数のドメインを 同時に含む部分のペプチドでも良い。
該レセプター蛋白質の部分ぺプチドの塩としては、 上記したぺプチドの塩と同 様のものが用いられる。 '
該ガラニン ·レセプター蛋白質をコードする D N Aとしては、 配列番号： 1 1、 1 2または 1 3のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含 有するガラニン · レセプタ 蛋白質をコードする塩基配列を含有するものであれ ばいかなるものであってもよい。 また、 それらは、 ゲノム DNA、 ゲノム DNA ライブラリー、 糸且織 ·細胞由来の cDNA、 組織'細胞由来の c DNAライブラ リー、 合成 DNAのいずれでもよい。 ライブラリ一に使用するベクターはパクテ リオファージ、 プラスミ ド、 コスミ ド、 ファージミ ドなどいずれであってもよレヽ。 また、 組織 ·細胞より RN A画分を調製したものを用いて直接自体公知の RT- P C R法によつて増幅することもできる。
酉 S列番号： 11、 12および 13のアミノ酸配列を含有するガラユン ' レセプ ターをコードする DNAとして具体的には、 それぞれ配列番号： 17、 18およ ぴ 19で表わされる塩基配列を有する DNAなどが用いられる。 なお、 配列番 号： 1 7はラット型の GALR 1 (ガラニンレセプター 'タイプ 1) の cDNA の塩基配列を、 配列番号： 18はラット型の GALR 2 (ガラニンレセプター · タイプ 2) の cDNAの塩基配列を、 配列番号： 19はラット型の GALR 3 (ガラニンレセプター 'タイプ 3) の cDN Aの塩基配列を示す。
GALR 2 (ガラニン ' レセプター 'タイプ 2) は海馬、 視床下部、 子宫、 腎 臓、 前立腺、 骨格筋などに多く分布しており、 従って、 GALR2活性ィヒ能を有 するァゴニストである本発明のペプチド （あるいは GALR 2に対するアンタゴ ュスト、 及ぴ本発明のペプチドに対する中和抗体） は記憶機能改善剤、 食欲改善 剤、 または子宮、 腎臓、 前立腺もしくは骨格筋の機能改善剤として用いることが できる。
GALR 1 (ガラニン' レセプター 'タイプ 1) は、 視床下部、 海馬、 瞎臓な どに多く分布しており、 従って、 GALR 1活 '14化能を有するァゴ-ストである 本発明のペプチド （あるいは GALR 1に対するアンタゴニスト、 及ぴ本発明の ペプチドに対する中和抗体） は、 抗肥満薬、 向知能薬、 インスリン分泌薬として 用いることができる。
GALR 3 (ガラニン ' レセプター 'タイプ 3) は、 精巣、 脾臓、 心臓、 視床 下部、 下垂体などに分布しており、 従って、 GALR 3活性ィ匕能を有するァゴニ ストである本発明のペプチド （あるいは GALR 3に対するアンタゴニスト、 及 び本発明のペプチドに対する中和抗体） は、 精巣、 脾臓、 心臓の機能改善剤とし て用いることができる。 . '
本発明は、 ） 上記のガラニン ·レセプター コードする D NAを含有する 形質転換体 （細胞） を培養して得られる該ガラニン' レセプターを発現している 細胞膜画分に、 ①被検物質を接触させる場合と、 ②被検物質を接触させない場 合における、 例えば 3 5 S標 f哉グアノシン- 5' - 0-3 -チォ三りん酸の該細胞膜画分 に対する結合量を測定し、 比較することを特徴とするガラニンレセプタ一活性化 物質 （ァゴ二スト） またはその塩のスクリーニング方法、 および （2 ) 上記のガ ラニン ' レセプターをコードする D N Aを含有する形質転換体 （細胞） を培養し て得られる該ガラニン'レセプターを発現している細胞膜画分に、 ①ガラニン または本発明ペプチドを接触させる場合と、 ②ガラニンまたは本発明ペプチド を被検物質存在下で接触させる場合における、 例えば 3 5 S標識グアノシン- 5' - 0 - 3 -チォ三りん酸の該細胞膜画分に対する結合量を測定し、 比較することを特徴 とするガラニンレセプター活性化阻害物質 （アンタゴニスト） またはその塩のス クリーニング方法などを提供する。
本発明のスクリ一ユング方法を以下に具体的に説明する。
上記ガラニン' レセプター蛋白質としては、 G A L R 1、 GA L R 2または G A L R 3のいずれのガラニン · レ^プター蛋白質またはその部分ペプチドを含有 し、 そのレセプター機能を有するものであれば何れのものであってもよいが、 形 質転換体 （細胞） を用いて該ガラニン · レセプター蛋白質を大量発現している培 養細胞より調製した細胞膜画分 （その調製法は後述する） などが好ましい。
該ガラニン' レセプター蛋白質を含有する細胞としては、 ガラニン · レセプタ 一蛋白質を発現する宿主細胞をいうが、 該宿主細胞としては、 例えば、 前述の酵 母、 昆虫細胞、 動物細胞などがあげられるが、 動物細胞が好ましい。
該膜画分としては、 細胞を破砕した後、 それ自体公知の方法で得られる細胞膜 が多く含まれる画分のことをいう。 細胞の破砗方法としては、 Potter— Elvehjem 型ホモジナイザ一で細胞を押し潰す方法、 ヮーリングブレンダーゃポリ トロン (Kinematica社製） による破碎、 超音波による破砕、 フレンチプレスなどで加圧 しながら細胞を細いノズルから嘖出させることによる破砕などがあげられる。 細 胞膜の分画には、 分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画 法が主として用いられる。 例えば、 細胞破碎液を低速 （500 r pn！〜 3000 r pm) で短時間 （通常、 約 1分〜 10分） 遠心し、 上清をさらに高速 （150 00 r pm〜30000 r p m) で通常 30分〜 2時間遠心し、 得られる沈澱を 膜画分とする。 該膜画分は主として膜蛋白質と細胞膜を構成するりん脂質から成 り、 発現したガラエン'レセプターと同時に該細胞が本来発現している G蛋白も 含まれている。
該ガラニン · レセプターを含有する細胞や膜画分中のガラニンレセプターの量 は、 膜画分蛋白質 1 mg 当たり 1-100 pmolであるのが好ましく、 5-20 pmolであ るのがより好適である。 該ガラニン' レセプターの発現量が多いほど膜画分当た りのレセプターを活性ィ匕する活性 （リガンド結合活性、 比活性） が高くなり、 高 感度なスクリ一二ング系の構築が可能になるばかりでなく、 同一口ットで大量の 試料を測定できるようになる。
ガラニン . レセプターを活性ィ匕する化合物 （ァゴ二スト） のスクリーニング方 法として具体的には、 まずガラニン'レセプターを含有する細胞の膜画分を、 ス クリーニングに適したバッファーに懸濁することにより該レセプター標品を調製 する。 該バッファ一としては、 pH約 4〜約 10 (望ましくは pH約 6〜約 8) の約 1〜5mMのマグネシウムイオンを含むリン酸バッファーまたはトリス一塩 酸バッファーなどのいずれでも良く、 さらにグアノシン二りん酸 （GDP) を約 0.1 nM〜l 00 μΜ、 好ましくは約 0.：!〜 1 μΜ添加するとよい。 また、 プ 口テアーゼによる該レセプターゃ被検物質の分解を抑える目的で、 PMSF、 口 ィぺプチン、 E—64 (ペプチド研究所製） 、 ぺプスタチンなどのプロテアーゼ 阻害剤を添加してもよい。 約 0.01〜： L Omlの該レセプター溶液に、 一定量 (5000 c ρπ！〜 50000 c p m) の35 S標識グアノシン - 5' - 0 - 3 -チォ三 りん酸、 およぴ被検物質を添加する。 一方、 被検化合物を加えず、 35 S標識グ ァノシン- 5' -0-3 -チォ三りん酸のみを添加した反応系 （対象群） も用意する。 反 応は約 0〜 50 °C、 好ましくは約 4 °C〜 37 °Cで約 20分〜 24時間、 好ましく は約 30分〜 3時間行う。 反応後、 ガラス繊維濾紙等で濾過し、 適量の同パッフ 了一で洗浄した後、 ガラス繊維濾紙に残存する 35 S標識グァノシン- 5' -0-3-チ ォ三りん酸の放射活性を液体シンチレーションカゥンターで計測する。 被検化合 物を加えない場合の放射活性に比べて被検化合物を加えた場合の放射活性の増加 分の高い化合物であれば、 それを該ガラニン' レセプターを活性化する能力のあ る候補化合物として選択することができる。
該ガラニン . レセプターの活性化を阻害する化合物 （アンタゴ-スト） のスク リーユングを行うには、 上記ァゴ-ストのスクリーエングの場合と同様に細胞膜 画分を用意し、 これに一定量 （5 0 0 0 c ρ π！〜 5 0 0 0 0 c p m) の3 5 S標 識グアノシン - 5' -0-3-チォ三りん酸、 および 1 0一4〜 1 0— 6 Mのガラニンある いは本発明によるペプチド、 およぴ被検物質を添加する。 また、 3 5 S標識グァ ノシン- 5' - 0 - 3 -チォ三りん酸とガラニンあるいは本発明によるぺプチドを添加し 被検ィヒ合物を加えない反応系 （対象群） も用意する。 上記と同様に反応を行い、 被検化合物を加えなレ、場合の放射活性に比べて被検化合物を加えた場合の放射活 性の減少の大きい化合物であれば、 それを該ガラニン' レセプターの活性化を阻 害する能力のある候ネ 化合物として選択することができる。
該被検物質としては、 例えばペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合成 化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などがあげられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であってもよい。 ガラニン. レセプター .ァゴニストは、 ガラニン. レセプターに対する本発明 のぺプチドが有する生理活性と同様の作用を有しているので、 本発明のぺプチド と同様に安全で低毒性な医薬として有用である。
逆に、 ガラニン 'レセプター'アンタゴェストは、 ガラユン ' レセプター蛋白 質に対する本発明のぺプチドが有する生理活性を抑制することができるので、 該 レセプター活性を抑制する安全で低毒性な医薬として有用である。
上記のスクリーニング方法を用いて得られる物質の塩としては、 例えば、 薬学 的に許容可能な塩などが用いられる。 例えば、 無機塩基との塩、 有機塩基との塩、 無機酸との塩、 有機酸との塩、 塩基性または酸性アミノ酸との塩などがあげられ る。
無機塩基との塩の好適な例としては、 例えばナトリゥム塩、 力リゥム塩などの アルカリ金属塩、 カルシウム塩、 マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、 な らびにアルミニゥム塩、 アンモニゥム塩などがあげられる。 有機塩基との塩の好適な例としては、 例えばトリメチルァミン、 トリェチルァ ミン、 ピリジン、 ピコリン.、 ' 2， 6ールチジン、 エタノーノレアミン、 ジエタノー ノレアミン、 トリエタノーノレアミン、 シクロへキシノレアミン、 ジシクロへキシノレア ミン、 N， N ' —ジベンジルエチレンジァミンなどとの塩あげられる。
無機酸との塩の好適な例としては、 例えば塩酸、 臭化水素酸、 硫酸、 リン酸な どとの塩があげられる。 .
有機酸との塩の好適な例としては、 例えばギ酸、 酢酸、 プロピオン酸、 フマル 酸、 シユウ酸、 酒石酸、 マレイン酸、 クェン酸、 コハク酸、 リンゴ酸、 メタンス ルホン酸、 ベンゼンスルホン酸、 安息香酸などとの塩があげられる。
塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、 例えばアルギニン、 リジン、 オル チュンなどとの塩があげられ、 酸性アミノ酸との好適な例としては、 例えばァス パラギン酸、 グルタミン酸などとの塩があげられる。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる物質またはその塩を上述の医薬 として使用する場合、 上記の本発明のぺプチドを医薬として実施する場合と同様 にして実施することができる。
本発明のぺプチドに対する抗体 （例えば、 ポリクローナル抗体、 モノクローナ ル抗体） または抗血清は、 本発明のペプチドを抗原として用い、 自体公知の抗体 または抗血清の製造法に従って製造することができる。
例えば、 ポリクローナル抗体は、 後述の方法に従つて製造することができる。
[ポリクローナル抗体の作製]
本発明のぺプチドに対するポリクローナル抗体は、 それ自体公知あるいはそれ に準じる方法にしたがって製造することができる。 例えば、 免疫抗原 （ペプチド 等抗原） とキャリアー蛋白質との複合体をつくり、 後述のモノクローナル抗体の 製造法と同様に温血動物 （例えば、 哺乳温血動物 （例、 ゥサギ、 ヒッジ、 ャギ、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥシ、 ゥマ、 ブタ） 、 鳥類 （例、 -ヮトリ、 ハト、 ァヒル、 ガチョウ、 ゥズラ） など） に免疫を行ない、 該免疫動物から本発明のぺ プチドに対する抗体含有物を揉取して、 抗体の分離精製を行なうことにより製造 できる。
哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体 に関し、 キャリアー蛋白質の種類おょぴキャリアーとハプテン （本発明のぺプチ ドまたはその部分ぺプチド） 'との混合比は、 キヤリァ一に架橋させて免疫したハ プテンに対して抗体が効率良くできれば、 どの様なものをどの様な比率で架橋さ せてもよいが、 例えば、 ゥシ血清アルブミン、 ゥシサイログロプリン、 キーホー ル · リンぺット .へモシァニン等のキャリアー ·タンパク質を重量比でハプテン
1に対し、 約 0 . 1〜 2 0、 好ましくは約 1〜 5の割合で力ップリングさせる方 法が用いられる。
また、 ハプテンとキャリアーのカップリングには、 種々の縮合剤を用いること ができるが、 ダルタルアルデヒドゃカルボジイミ ド、 マレイミ ド活性エステル、 チオール基、 ジチォピリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。 縮合生成物は、 上記温血動物に対して、 抗体産生が可能な部位にそれ自体ある いは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。 投与は、 通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計約 3〜： 1 0回程度行なわれる。
ポリクローナル抗体は、 上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、 腹水など、 好ましくは血液から採取される。
抗血清中の本発明のペプチドに対する抗体価の測定は、 後述のハイブリ ドーマ 培養上清の抗体価の測定と同様にして測定できる。 抗体の分離精製は、 後述のモ ノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロプリンの分離精製法に従って行な うことができる。
また、 モノクローナル抗体は、 後述の方法に従って製造することができる。 〔モノクローナル抗体の作製〕
( a ) モノクロナール抗体産生細胞の作製
本発明のペプチドは、 温血動物 （例えば、 哺乳温血動物 （例、 ゥサギ、 ヒッジ、 ャギ、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥシ、 ゥマ、 ブタ） 、 鳥類 （例、 ニヮトリ、 ハト、 ァヒル、 ガチョウ、 ゥズラ） など） に対して投与により抗体産生が可能な 部位にそれ自体あるいは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産 生能を高めるため、 完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュパン トを投与してもよい。 投与は通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計 2〜1 0回程度行わ れる。
モノクローナノレ抗体産生細胞の作製に際しては、 抗原を免疫された上記の温血 動物、 たとえばマウスなどから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜 5日後に脾臓またはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫 細胞と融合させることにより、 モノクローナル抗体産生ハイプリ ドーマを調製す ることができる。 抗血清中の抗体価の測定は、 例えば後記の標識剤で標識化され たぺプチドまたはその部分べプチドと抗血清とを反応させたのち、 抗体に結合し た標識剤の活性を測定するこ'とによりなされる。 融合操作は既知の方法、 たとえ ばケーラーとミルスタインの方法 〔ネイチヤー （Nature)、 256、 495 (1975)〕 等 に従い実施できる。 融合促進剤としてはポリエチレングリコール （PEG) ゃセ ンダイウィルスなどがあげられるが、 好ましくは PEGが用いられる。
骨髄腫細胞としてはたとえば NS— 1、 P 3U1、 S P 2/0、 AP— 1など があげられるが、 P 3U1が好ましく用いられる。 用いられる抗体産生細胞 （脾 臓細胞） 数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 ： 1〜20 ： 1程度であり、 P EG (好ましくは PEG1000〜PEG6000) が 10〜80%程度の濃度 で添加され、 20〜40°C、 好ましくは 30〜37°Cで 1〜10分間インキュべ ートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
本発明のぺプチドに対する抗体産生ハイプリ ドーマのスクリ一-ングには種々 の方法が使用できるが、 たとえば本発明のぺプチド抗原を直接あるいは担体とと もに吸着させた固相 （例、 マイクロプレート） にハイプリ ドーマ培養上清を添加 し、 次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体 （細胞融合に用 いられる細胞がマウスの場合、 抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる） また はプロティン Aを加え、 固相に結合した本発明のぺプチドに対するモノクローナ ノレ抗体を検出する方法、 抗免疫グロプリン抗体またはプロテイン Aを吸着させた 固相にハイプリ ドーマ培養上清を添カ卩し、 放射性物質や酵素などで標識した本発 明のぺプチドを加え、 固相に結合した本発明のぺプチドに対するモノクローナノレ 抗体を検出する方法などがあげられる。
本発明のぺプチドに対するモノクローナル抗体の選別は、 自体公知あるいはそ れに準じる方法に従って行なうことができる。 通常 HAT (ヒポキサンチン、 ァ ミノプテリン、 チミジン） を添加した動物細胞用培地で行なわれる。 選別および 育種用培地としては、 ハイブリ ドーマが生育できるものならばどのような培地を 用いても良い。 例えば、 1〜 2 0 %、 好ましくは 1 0〜 2 0 %の牛胎児血清を含 む R PM I 1 6 4 0培地、 1〜 1 0 %の牛胎児血清を含む G I T培地 （和光純 薬工業 （株） ) あるいはハイプリ ドーマ培養用無血清培地 ( S FM- 1 0 1、 日 水製薬 （株） ) などを用いることができる。 培養温度は、 通常 2 0〜4 0 °C、 好 ましくは約 3 7 °Cである。 培養時間は、 通常 5日〜 3週間、 好ましくは 1週間〜 2週間である。 培養は、 通常 5 %炭酸ガス下で行なわれる。 ハイプリ ドーマ培養 上清の抗体価は、 上記の抗血清中の本発明のぺプチドに対する抗体価の測定と同 様にして測定できる。
( b ) モノクロナール抗体の精製
本発明のぺプチドに対するモノクローナル抗体の分離精製は通常のポリクロー ナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法 〔例、 塩析法、 アルコ ール沈殿法、 等電点沈殿法、 電気泳動法、 イオン交換体 （例、 D E A E) による 吸脱着法、 超遠心法、 ゲルろ過法、 抗原結合固相あるいはプロテイン Aあるいは プロテイン Gなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、 結合を解離させて抗体 を得る特異的精製法〕 に従って行われる。
上記の （a ) および （b ) の方法に従って製造させる本発明のペプチドに対す る抗体は、 それぞれ本発明のぺプチドを特異的に認識することができるので、 被 検液中の本発明のペプチドの定量、 特にサンドイッチ免疫測定法による定量など に使用することができる。 すなわち、 本発明は、 例えば、
( i ) 本発明のペプチドに反応する抗体と、 被検液および標識した本発明のぺ プチドとを競合的に反応させ、 該抗体に結合した標識した本発明のぺプチドの割 合を測定することを特徴とする被検液中の本発明のぺプチドの定量法、
(ii) 被検液と担体上に不溶化した抗体およぴ標識化された抗体とを同時ある いは連続的に反応させたのち、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特 徴とする被検液中の本発明のペプチドの定量法において、 一方の抗体が、 本発明 のぺプチドの N端部を認識する抗体で、 他方の抗体が本発明のぺプチドの N端部 以外の部位 （例えば、 C端部） に反応する抗体であることを特徴とする被検液中 の本発明のぺプチドの定量法を提 する。
本発明のぺプチドを認識するモノクローナル抗体を用いて本発明のぺプチドの 測定を行なえるほか、 組織染色等による検出を行なうこともできる。 これらの目 的には、 抗体分子そのものを用いてもよく、 また、 抗体分子の F ( a b ' ) 2 、 F a b '、 あるいは F a b画分を用いてもよい。 本発明の抗体を用いる測定法は、 特に制限されるべきものではなく、 被測定液中の抗原量 （例えばリガンドぺプチ ド量） に対応した抗体、 抗原もしくは抗体一抗原複合体の量を化学的または物理 的手段により検出し、 これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲 線より算出する測定法であれば、 いずれの測定法を用いてもよい。 例えば、 ネフ ロメトリー、 競合法、 ィムノメトリック法おょぴサンドィッチ法が好適に用レヽら れるが、 感度、 特異性の点で、 後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好まし い。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、 放射性同位元素、 酵素、 蛍光物質、 発光物質などがあげられる。 放射性同位元素としては、 例えば 〔1 2 5 I〕 、 〔1 3 1 I〕 、 〔3 H〕 、 〔1 4 C〕 などが、 記酵素としては、 安定で比活 性の大きなものが好ましく、 例えば j3—ガラクトシダーゼ、 β一ダルコシダーゼ、 アルカリフォスファターゼ、 パーォキシダーゼ、 リンゴ酸脱水素酵素等が、 蛍光 物質としては、 フルォレスカミン、 フルォレツセンィソチオシァネートなどが、 発光物質としては、 ノレミノ一ノレ、 ルミノール誘導体、 ルシフェリン、 ルシゲニン などがそれぞれあげられる。 さらに、 抗体あるいは抗原と標識剤との結合にピオ チン一アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶ィ匕に当っては、 物理吸着を用いてもよく、 また通常蛋 白質あるいは酵素等を不溶化、 固定ィヒするのに用いられる化学結合を用いる方法 でもよレ、。 担体としては、 ァガロース、 デキストラン、 セルロースなどの不溶性 多糖類、 ポリスチレン、 ポリ.アクリルアミド、 シリコン等の合成樹脂、 あるいは ガラス等があげられる。
サンドィツチ法においては不溶ィ匕した本発明のぺプチドに対する抗体に被検液 を反応させ （1次反応） 、 さらに標識化された本発明のペプチドに対する抗体を 反応させ （2次反応） たのち、 不溶ィヒ担体上の標識剤の活性を測定することによ り被検液中の本発明のペプチド量を定量することができる。 1次反応と 2次反応 は逆の順序に行っても、 また、 同時に行なってもよいし時間をずらして行なって あよい。
標識化剤および不溶ィ匕の方法は前記のそれらに準じることができる。 また、 サ ンドイッチ法による免疫測定法において、 固相用抗体あるいは標識用抗体に用い られる抗体は必ずしも 1種類である必要はなく、 測定感度を向上させる等の目的 で 2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドィツチ法による本発明のぺプチドの測定法においては、 1次反 応と 2次反応に用いられる本発明のぺプチドに対する抗体は本発明のぺプチドの 結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。 即ち、 1次反応および 2次 反応に用いられる抗体は、 例えば、 2次反応で用いられる抗体が、 本発明のぺプ' チドの C端部を認識する場合、 1次反応で用いられる抗体は、 好ましくは C末端 部以外、 例えば N末端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のぺプチドに対する抗体をサンドィツチ法以外の測定システム、 例えば、 競合法、 ィムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。 競合法では、 被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたの ち、 未反応の標識抗原と（F ) と抗体と結合した標識抗原 ( B ) とを分離し （B
/ F分離） 、 B， Fいずれかの標識量を測定し、 被検液中の抗原量を定量する。 本反応法には、 抗体として可溶性抗体を用い、 B /F分離をポリエチレングリコ ール、 前記抗体に対する第 2抗体などを用いる液相法、 および、 第 1抗体として 固相化抗体を用いるか、 あるいは、 第 1抗体は可溶性のものを用い第 2抗体とし て固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
ィムノメ トリック法では、 被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識ィ匕抗 体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するカ あるいは、 被検液中の抗 原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、 次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗 体を固相に結合させたのち、 固相と液相を分離する。 次に、 いずれかの相の標識 量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、 ネフロメトリーでは、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じ た不溶性の沈降物の量を測定する。 被検液中の抗原量が僅かであり、 少量の沈降 物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリ一な どが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の測定方法に適用するにあたっては、 特 別の条件、 操作等の設定は必要とされない。 それぞれの方法における通常の条件、 操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のぺプチドまたはその部分べ プチドの測定系を構築すればよい。 これらの一般的な技術手段の詳細については、 総説、 成書などを参照することができる 〔例えば、 入江 寛編 「ラジオィムノア ッセィ〕 （講談社、 昭和 4 9年発行） 、 入江 寛編 「続ラジオイムノアツセィ〕 (講談社、 昭和 5 4年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （医学書院、 昭 和 5 3年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （第 2版） （医学書院、 昭和 5 7年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （第 3版） （医学書院、 昭和 6 2年発行） 、 iMethods in ENZYM0L0GYJ Vol. 70 (Immunochemical
Techniques (Part A) )、 同書 Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B) )、 问書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C) )、 同書 Vol.
84 (Immunochemical Techniques (Part De selected I腿 unoassays"、 同書 Vol.
92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods) )、 同書 Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I ^Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies) ) (以上、 ァカテ^ックプ レス社発行）など参照〕 。
以上のように、 本発明のペプチドに対する抗体を用いることによって、 本発明 のべプチドを感度良く定量することができる。
さらには、 本発明の抗体を用いて本発明のぺプチド等の濃度を定量することに よって、 診断薬として用いることもできる。 即ち、
( 1 ) 本発明のペプチド等の濃度の変ィ匕が検出された場合、 例えば、 肥満症、 痴 呆、 糖尿病、 または下垂体腫瘍などの疾病である、 または将来罹患する可能性が 高いと、 と診断することができる。
また、 本発明の抗体は、 体液や組織などの被検体中に存在する本発明のぺプチ ド等を検出するために使用することができる。 また、 本発明のペプチド等を精製 するために使用する抗体カラムの作製、 精製時の各分画中の本発明のぺプチド等 の検出、 被検細胞内における本発明のぺプチドの挙動の分析などのために使用す ることができる。
本発明の D N Aを用いて、'本発明のぺプチドを発現するトランスジエニック動 物を作製することができる。 動物としては、 哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 ラット、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） などが挙げれるが、 特に、 マウス、 ラットなどが好適である。 このような動物は本発明のぺプチドの機能解 析、 それに関連する疾病の研究等に非常に有用である。
本発明の D N Aを对象動物に転移させるにあたっては、 該 D N Aを動物細胞で 発現させうるプロモーターの下流に結合した遺伝子コンストラクトとして用いる のが一般に有利である。 例えば、 マウス由来の本発明の D NAを転移させる場合、 これと相同性が高い動物由来の本発明の D N Aを動物細胞で発現させうる各種プ 口モーターの下流に結合した遺伝子コンストラクトを、 例えば、 マウス受精卵へ マイクロインジェクシヨンすることによって本発明のレセプター蛋白質を高産生 する D NA転移動物を作出できる。 このプロモーターとしては、 例えば、 ウィル ス由来プロモーター、 メタ口チォネイン等のュビキアスな発現プロモーターも使 用しうるが、'好ましくは脳で特異的に発現する N G F遺伝子プロモーターゃェノ ラーゼ遺伝子プロモーターなどが用いられる。
受精卵細胞段階における本発明の D N Aの転移は、 対象動物の胚芽細胞およぴ 体細胞の全てに存在するように確保される。 D N A転移後の作出動物の胚芽細胞 において本発明のぺプチドが存在することは、 作出動物の子孫が全てその胚芽細 胞及ぴ体細胞の全てに本発明のぺプチドを有することを意味する。 遺伝子を受け 継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明のぺプチ ドを有する。
本発明の D NA転移動物は、 交配により遺伝子を安定に保持することを確認し て、 該 D NA保有動物として通常の飼育環境で飼育継代を行うことができる。 さ らに、 目的 D N Aを保有する雌雄の動物を交配することにより、 導入遺伝子を相 同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、 この雌雄の動物を交配する ことによりすべての子孫が該 D N Aを有するように繁殖継代することができる。 本発明の D NAが転移された動物は、 本発明のぺプチドが高発現させられてい るので、 本発明のペプチドに対するァゴニストまたはアンタゴニストのスタリー ニング用の動物などとして有用である。
本発明の D NA転移動物を、 組織培養のための細胞源として使用することもで きる。 例えば、 本発明の D NA転移マウスの組織中の D NAもしくは R NAを直 接分析するか、 あるいは遺伝子により発現された本発明のペプチドが存在する組 織を分析することにより、 本発明のペプチドについて分析することができる。 本 発明のぺプチドを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、 これらを 使用して、 例えば、 脳や末梢組織由来のような一般に培養困難な組織からの細胞 の機能を研究することができる。 また、 その細胞を用いることにより、 例えば、 各種組織の機能を高めるよう'な医薬の選択も可能である。 また、 高発現細胞株が あれば、 そこから、 本発明のペプチドを単離精製することも可能である。
また、 上記した方法と同様の方法を用いて、 本発明のペプチドをコードする遺 伝子を破壊し、 その機能を欠損させたノックアウト動物を作出することもできる。 かかるノックァゥト動物も、 本発明のぺプチドの機能解析等に非常に有用である。 本明細書および図面において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 I
U P A C— I U B Commission on Biochemical Nomenclature による田各号ある いは当該分野における' 用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 またァ ミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示すもの とする。 ' '
D N A ：デォキシリポ核酸
c D NA ：相補的デォキシリボ核酸
A ：アデニン
T ：チミン
G ：グァニン
C ： シトシン
Y ：チミンまたはシトシン
N ：チミン、 シトシン、 アデニンまたはグァニン
R ：アデニンまたはグァニン
M ： シトシンまたはアデニン W チミンまたはアデニン
S シトシンまたはグァニン
イノシン
H アデニン、 チミンまたはシトシン D グァニン、 アデニンまたはチミン B グァニン、 チミンまたはシトシン
RNA リボ核酸
mRNA メッセンジャーリボ核酸 d ATP デォキシアデノシン三リン酸 d TTP デォキシチミジン三リン酸 dGTP デォキシグアノシン三リン酸 d CTP デォキシシチジン三リへン酸^ ATP アデノシン三リン酸
EDTA エチレンジァミン四酢酸
SD S ドデシル硫酸ナトリウム
E I A ェン
G 1 yまたは G グリシン
A 1 aまたは A ァラニン
Va 1または V パリン
L e uまたは L ロイシン
I 1 eまたは I イソロイシン
S e rまたは S セリン
Th rまたは T スレ才ニン
C y sまたは C
Me tまたは M メチ才ニン
G 1 uまたは E グノレタミン酸
A s pまたは D ァスパラギン酸
L y sまたは K リジン
A r gまたは R ァノレギニン H i sまたは H
P h eまたは F フエニノレアラニン
Ty rまたは Y チロシン
T r pまたは W
P r oまたは P プロリン
A s nまたは N
G 1 nまたは Q グノレタミン
p G 1 u ピログノレタミン酸
Me メチル基
E t ェチル基
B u ブチル基
P h フエニル基
TC チアゾリジン一 4 (R) —カルボキサミ ド基
また、 本明細書中で繁用される置換基、 保護基および試薬を下記の記号で表記 する。
T o s ： p—トノレエンスルフォ二ノレ
HONB ： N—ヒドロキシ一 5—ノノレボノレネンー 2， 3—ジカノレボキシイミ ド
B z 1 ：ベンジル
C 12-B z 1 ：ジクロルべンジル
Z ： ベンジノレオキシカノレボニノレ
B r -Z ： 2—ブロモベンジルォキシカルボニル
C 1 -Z ： 2—クロルべンジルォキシカルボニル
B o c ： t一ブチルォキシカルボニル
HOB t ： 1ーヒドロキシベンズトリアゾール
DCC ： N、 N'—ジシクロへキシルカルボジイミ ド
TF A： トリフルォロ酢酸
Fmo c ： N— 9—フノレオレニノレメ トキシカノレポ-ノレ
DNP ： ジニトロフエ二ノレ
Bum : ターシャリーブトキシメチノレ T r t ： トリチル
PAM： フエニルァセトアミ ドメチル
BHA：ベンツヒ ドリルァミン
B om :ベンジルォキシメチル
O c H e ： シク口へキシノレエステル
Me B z 1 ： 4—メチノレべンジル
CHO：ホルミル
NMP ： N—メチルピロリ ドン
本願明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
〔配列番号： 1〕
本発明のマウス型の GALR2リガンド成熟体のァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 2〕
本発明のマウス型の GALR 2リガンド前駆体のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 3〕
本発明のマウス型の GALR 2リガンドの c DNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 4〕
マウス型の GALR 2リガンドの c DNAをクローニングするための P C Rに 使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 5〕
マウス型の GALR 2リガンドの c DNAをクローニングするための PC尺に 使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 6〕
配列番号： 4および 5のプライマーを用いてクローニングされた c DNAの塩 基配列を示す。
〔配列番号： 7〕
マウス型の GALR 2リガンドの c DNAをクローニングするための 5' RA C Eに使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 8〕
マウス型の GALR 2リガンドの c DNAをクローニングするための 3' RA C Eに使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 9〕
マウス型の GALR 2リガンドの cDNAをクローニングするための PC に 使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 10〕
マウス型の GALR 2リガンドの c DNAをクローユングするための PCRに 使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 1ェ〕
ラット型の GALR 1 (ガラニン . レセプター 'タイプ 1) の全アミノ酸配列 を示す。 -
〔配列番号： 12〕
ラット型の GALR 2 (ガラニン ' レセプター 'タイプ 2) の全アミノ酸配列 を示す。
〔配列番号： 13〕
ラット型の GALR3 (ガラニン . レセプター 'タイプ 3) の全アミノ酸配列 を示す。
〔配列番号： 14〕
ブタ型のガラニンレセプターリガンドのアミノ酸配列 （W099/48920 号に記載） を示す。
〔配列番号： 15〕
ラット型のガラニンレセプターリガンドのアミノ酸配列 (WO 99/4892 0号に記載） を示す。
〔配列番号： 16〕
ヒ ト型のガラニンレセプターリガンドのアミノ酸配列 （W099/48920 号に記載） を示す。
〔配列番号： 17〕
ラット型の GALR 1 (ガラニン . レセプター ·タイプ 1) の cDNAの塩基 配列を示す。
〔配列番号： 18〕 ラット型の GALR2 (ガラニン. レセプター 'タイプ 2) の cDNAの塩基 配列を示す。
〔配列番号： 19〕
ラット型の GALR3 (ガラニン' レセプター 'タイプ 3) の cDNAの塩基 配列を示す。
〔配列番号： 20〕
本発明のマウス型の GALR 2リガンド前駆体の c DN Aの塩基配列を示す。 後述の実施例 1で得られた形質転換体 Escherichia coli T0P10/ GR2ML1 は、 財団法人発酵研究所 (I FO) に 2000年 2月 2日から寄託番号 IF0 16361 として、 また、 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター （I POD, 日 本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 ) に 2000年 3月 16日から寄託番 号 FERM BP-7092 として寄託されている。 以下に、 実施例を示し、 本発明をより詳細に説明するが、 これらは本発明の範 囲を限定するものではない。
実施例 1 マウス型リガンドぺプチド cDNAのク口一二ング
マウス精巣 Marathon- Ready cDNA (BALBん mouse由来、 CL0NTECH社）を鎵型とし てプライマー F/R120と R/R120 (WO 99/48920号に記載） を用いて PCRを 実施した。
F/R120: 5-AGGCTGGACCCTCAATAGTGCTGGTTAC-3' (配列番号： 4)
R/R120: 5-CCATCTATGGCCTTCCACAGGTCTAGGA-3' (配列番号： 5)
PCR反応液組成は ExTaq (宝酒造株式会社）を 0.5 μ 1 添付の 10x PCR bufferを 5 μ1、 2.5 mM dNTP mixtureを 4 μ プライマー F/R120および R/R120 (それぞれ 10 μΜ) を各 0.5 μ1、 およぴ铸型 cDNAを 1 μ 1、 蒸留水を 34.5 を混合して作 製し、 反応条件は 94°C' 30秒の初期変性後、 94°030秒_62 '30秒-72° 60秒のサ イタル反応を 35回、 および 72°010分の最終伸長反応とした。 得られた DNA断片を T0P0 TA Cloning Kit (Invitrogen社）を用いて添付のマニュアルに記載された方 法に従ってクローエングした。 クローニングされた DNAの配列を ABI 377DNA sequencerを用いて解読し、 配列番号： 6の配列を得た。
AGGCTGGACC CTCAATAGTG CTGGTTACCT CCTGGGTCCT- GTCCTCCCCG TTTCCTCCAA 60 GGCCGACCAG GGCAGGAAGA GAGACTCAGC TCTTGAGATC CTAGACCTGT GGAAGGCCAT 120 AGATGG 126 (配列番号： 6 )
得られた配列よりプライマー 1F/M120 (配列番号： 7 ) 、 1R/M120 (配列番 号： 8 ) を作成し、 以下に記した 5'RACE及び 3'RACE実験に用いた。
1F/M120 : 5 -TCCAAGGCCGACCAGGGCAGGAAGAGAG -3' (配列番号： 7 )
1R/M120 : 5'-GGTCTAGGATCTCAAGAGCTGAGTCTCT-3' (配列番号： 8 )
5'RACE及び 3，RACEの PCR反応液は Taq (宝酒造株式会社）を 0. 5 1、 添付の 10x PCR buffer (500 mM KC1-25 mM MgCl2 - 100 mM Tris · HC1, pH 8. 3)を 5 μ 1, 2. 5 mM dNTP mixtureを 4 μ 1、 25 mM MgCl2を 3 μ 1、 10 μ Μプライマー
F/R120 (3，RACEの場合）あるいは 10 ^ Mプライマー R/R120 (5，RACEの場合）を 1 1、 10 ； u Mプライマー API (プライマー APIは CLONTECH社の Marathon - Ready cDNA Kit に添付のもの） を 1 1、 錡型 cDNA (CLONTECH社、 マウス精巣 Marathon - Ready cDNA) を 5 μ 1、 及ぴ蒸留水を 31 を混合して作製した。 反応条件は 94°O 60秒 の初期変性後、 94°C · 30秒- 72°C · 120秒のサイクル反応を 5回、 94°C · 30秒- 70°C -
120秒のサイクル反応を 5回、 94°O 30秒- 68°C ' 120秒のサイクル反応を 25回おょぴ 68°C ' 10分の最終伸長反応とした。
続いて、 該 PCR反応の反応液を鎵型として nested PCRを実施した。 反応液は Taq (宝酒造株式会社）を 0. 5 μ 1、 添付の 10x PCR buffer (500 mM KC1-25 mM MgCl2-100 mM Tris · HC1, pH 8. 3)を 5 μ 1、 2. 5 mM dNTP mixtureを 4 μ 1、 25 mM MgCl2を 3 μ 1、 10 μ Mプライマー 1F/M120 (3，RACEの場合）あるいは 10 μ Μブラ イマ一 1R/M120 (5'RACEの場合）を 1 μ 1、 10 プライマー ΑΡ2 (プライマー ΑΡ2 は CLONTECH社の Marathon-Ready cDNA Kitに添付のもの） を 1 μ 1、 铸型 DNA (該 PCR反応液 50倍希釈液） を 5 μ 1、 及び蒸留水を 31 μ ΐを混合して作製した。 反応 条件は 94°C · 60秒の初期変性後、 94°030秒- 72°C . 120秒のサイクル反応を 5回、
94°C · 30秒- 70°C · 120秒のサイ'クノレ反応を 5回、 94°C .30秒 - 68°C · 120秒のサイクル 反応を 25回および 68°C ' 10分の最終伸長反応とした。
得られた DNA断片を T0P0 TA Cloning Kit (Invitrogen社）を用いて添付のマ二 ュアルに記載された方法に従ってクローユングした。 クローニングされた DNA配 列を解読し、 5，端、 3，端の配^情報を得た。 この配列情報よりプライマー 1F/M650、 1R/M650を作成した。
1F/H650: 5-GAAAGACAGTCTCAAATCAAGGACCTGC-3' (配列番号： 9)
1R/H650: 5，— TGAGCTGGAMCGMGGAGGAGTGAGGT— 3， （配歹 U番号： 10) Balb/c mouse由来精巣 poly (A) +RNA (二ツボンジーン社製）から定法により
Supersrcipt II reverse transcriptase (GIBCO/BRL社 )を用いて single strand DNAを合成した。 本 DNAを铸型としてプライマー F/M650と R/M650を用いて PCRを実 施した。 PCR反応液は Pfu DM polymerase(Stratagene社）を 1 ^1、 添付の 10x PCR bufferを 5· μ 1、 2.5 mM dNTP mixtureを 4 μΐ, 10 z Mプライマー F/M650及 ぴ R/M650を各 2.5 μΐ 、 錶型 DNAを 1 μ 1、 及び蒸留水を 34.5 を混合して作製 した。 反応条件は 94°030秒の初期変性後、 94°C'30秒- 67°Ο30秒 _72°C · 4分のサ ィクル反応を 30回、 および 72°C' 10分の最終伸長反応とした。 得られた DNA断片を pCRII Blunt T0P0 vector (Invitrogen社）を用いて添付のマニュアルに記載され た方法に従ってクローニングした。 クローニングされた DNA配列を定法によりシ 一クェンシングし、 マウス GALR2 ligand全長ペプチドをコードする 180 bpの
DNA断片（配列番号 3 )を有する PGR2ML1を得ることができた。 該プラスミドにより トランスフォームさせた大腸菌 T0P10を、 T0P10/pGR2MLlと命名した。 この 180 塩基対の塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号： 2に示す。 また、 そ の成熟部分を配列番号： 1に示す。 該成熟部分のアミノ酸配列を、 プタ小腸ガラ ニン (ガラニン) 、 ブタ型 Ga l R2リガンド （P— GALR2L) 、 ラット型
G a 1 R 2リガンド （R— GALR2L) およぴヒト型 G a 1 R 2リガンド （H -GALR2L) のアミノ酸配列と比較したところ、 該成熟部分のアミノ酸配列 はブタ型 G a 1 R 2リガンド （P— GALR2L) 、 ラット型 G a 1 R 2リガン ド （R— GALR2L) およびヒト型 G a 1 R 2リガンド （H— GALR2L) に対して高い相同性を示した （図 1参照） 。
以上述べたごとく、 本発明のペプチドもしくはその前駆体またはそのアミドも しくはそのエステルまたはその塩は、 ガラニン' レセプターを活性化する能力を 有する。 従って、 ガラニン ·，レセプターが多く分布している視床下部、 下垂体、 子宮、 腎臓、 前立腺または骨格筋における、 副作用の少ない機能調節剤などの医 薬の開発等に用いることができる。
本発明のぺプチドもしくはその前駆体またはそのァミ ドもしくはそのエステノレま たはその塩を用いることによって、 ガラニン · レセプターとの結合性を変化させ る化合物のスクリーニングが可能になる。 配列表フリーテキスト
SEQ ID NO. 4
Designed oligonucleotide Primer to amplify mouse GALR2 ligand.
SEQ ID NO. 5
Designed oligonucleotide Primer to amplify mouse GALR2 丄 igand.
SEQ ID NO. 7
Designed oligonucleotide Primer for 5' RACE to amplify mouse GALR2 ligand.
SEQ ID NO. 8
Designed oligonucleotide Primer for 3' RACE to amplify mouse GALR2 ligand.
SEQ ID NO. 9
Designed ol igonucleotide Primer to amplify mouse GALR2 ligand.
SEQ ID NO. 10
Designed oligonucleotide Primer to amplify mouse GALR2 ligand.

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ 酸配列を含有することを特徴とするペプチドもしくはその前駆体またはそのアミ ドもしくはそのエステ またはその塩。
2 . 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ 酸配列を含有することを特徴とする請求項 1記載の前駆体。
3 . 請求項 1記載のぺプチドもしくは前駆体をコードする D N Aを含有する D N A。
4 . 配列番号： 3または配列番号： 2 0で表される塩基配列を含有する請求項 3記載の D NA。
5 . 請求項 3記載の D NAを含有する組み換えベクター。
6 . 請求項 5記載の組み換えべクタ一で形質転換された形質転換体。
7 . 請求項 6記載の形質転換体を培養し、 請求項 1記載のぺプチドもしくは前 駆体またはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を生成 ·蓄積せしめる ことを特徴とする、 請求項 1記載のペプチドもしくは前駆体またはそのアミドも しくはそのエステルまたはその塩の製造方法。
8 . 請求項 1記載のぺプチドもしくは前駆体に対する抗体。
9 . 請求項 8記載の抗体を含有してなる医薬。
1 0 . 請求項 8記載の抗体を含有してなる診断薬。
1 1 . 請求項 1記載のペプチドもしくは前駆体またはそのアミドもしくはその エステルまたはその塩を含有してなる医薬。
1 2 . 記憶機能改善剤、 食欲調節剤、 子宮機能調節剤、 腎臓機能調節剤、 前立 腺機能調節剤、 精巣機能調節剤または骨格筋機能調節剤である請求項 1 1記載の
1 3 . 請求項 1記載のぺプチドもしくはその前駆体またはそのァミドもしくは そのエステルまたはその塩を用いることを特徴とする、 配列番号： 1 1、 配列番 号： 1 2または配列番号： 1 3で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的 に同一のアミノ酸配列を含有するレセプター蛋白質に対するァゴニストまたはァ ンタゴニストのスクリ一ユング方法。
1 4 . 請求項 1 3記載のスクリーニング方法によって得られる化合物またはそ の塩。
1 5 . 請求項 1 4記載の化合物またはその塩を含有する記憶機能改善剤、 食欲 調節剤、 子宮機能調節剤、 腎臓機能調節剤、 前立腺機能調節剤、 精巣機能調節剤 または骨格筋機能調節剤。
1 6 . 記憶機能改善作用、 食欲調節作用、 子宫機能調節作用、 腎臓機能調節作 用、 前立腺機能調節作用、 精巣機能調節作用または骨格筋機能調節作用を有する 医薬を製造するための①請求項 1記載のぺプチドもしくはその前駆体またはその アミドもしくはそのエステルまたはその塩、 ②請求項 3記載の D NA、 または③ 請求項 8記載の抗体の使用。
1 7 . ①請求項 1記載のペプチドもしくはその前駆体またはそのアミドもしく はそのエステルまたはその塩、 ②請求項 3記載の D NA、 または③請求項 8記載 の抗体を哺乳動物に投与することを特徴とする記憶機能改善、 食欲調節、 子宮機 能調節、 腎 ϋ機能調節、 前立腺機能調節、 精巣機能調節または骨格筋機能調節方 法。
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