WO2002007528A1 - Procédé d'extraction et d'amélioration de la digestibilité des protéines de palmaria palmata. - Google Patents

Procédé d'extraction et d'amélioration de la digestibilité des protéines de palmaria palmata. Download PDF

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Elizabeth Antoine
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Definitions

  • the present invention relates to the use of an enzymatic composition comprising the specific association of two enzymes selected to improve the digestibility of the soluble protein fraction of P. palmata, to a process for extracting proteins from the alga Palmaria palmata, as well as the soluble protein fraction obtained by this process and its use in the food industry.
  • seaweed The overall annual production of seaweed is around 6.5.10 6 tonnes (fresh algae). Seaweed is mainly exploited in the food industry. In particular, in Asian countries, seaweed is very often eaten as vegetables.
  • algae and more particularly brown algae are traditionally used for the production of additives such as alginates or for animal feed (Indegaard et al, Seaweed Resources in Europe, 1991, 21-64).
  • algae are used in human or animal food for their mineral content and the functional properties of the polysaccharides they contain. Algae are more rarely valued for the nutritional value of the proteins they contain. Algae, and in particular red algae, are also used for the production of a particular protein, R-phycoerythrin, which is commonly used as a red pigment in the cosmetic industry and in the medical field as a fluorescent reagent for immunological diagnosis. and which could be used in the food industry. This protein represents up to 12% of the protein fraction of Palmaria palmata.
  • Phycoerythrin can in particular be obtained by grinding dry algae and then by extraction in solution in an aqueous phosphate medium (US 5,358,858). However, such extraction techniques tend to denature R-phycoerythrin.
  • the protein content of algae varies depending on the species. In general, the protein fraction of brown algae is low (3 to 15%) of the dry weight of the alga), while that of red or green algae is higher (10-47%) of the dry weight). In particular, the protein contents of red algae such as
  • Porphyra tenera and Palmaria palmata can reach respectively 47% o and 35%> of the dry weight (Morgan et al., Econ. Bot., 1980, 34, 27-50). These two red algae, also called “Nori” and Dulse "respectively, have higher protein contents than that of soybeans.
  • the protein content of seaweed is subject to seasonal variability.
  • a study of the protein content of P. palmata collected on the French Atlantic coast throughout the year has shown that the average protein content of this alga can vary between 9 and 25% (dry weight).
  • the highest levels are observed in late winter and early spring, the lowest levels are observed in late summer and early fall (Galland-Irmouli et al, J. of Nuir. Biochem., 1999, 10, 353-359).
  • the amino acid composition of algae has been frequently studied and compared to that of other protein-rich foods such as eggs and soy.
  • red algae and in particular P. palmata therefore represent an attractive potential source of proteins usable for human or animal consumption.
  • Different methods of extracting proteins from algae, and in particular from P. palmata have already been proposed.
  • Physico-chemical methods have thus been described, such as, for example, extraction in deionized water (osmotic shock), or in a Tris HC1 buffer, optionally followed by sonication, or else extraction in an alkaline medium. (J. Fleurence et al, J. of Appl. Phycol., 1995, 7, 577-582).
  • proteins must maintain their structural integrity as much as possible and have good digestibility.
  • digestibility is meant the capacity of human digestive juices to degrade proteins when they are ingested.
  • the proteins of P. palmata extracted in water or in a weak ionic buffer are not very sensitive in vitro to the action of human digestive juices (J. Fleurence et al, Biofutur, 1999, 191, 32-36) .
  • the enzymes used are generally polysaccharidases such as cellulases, xylanases, agarases, ⁇ -glucanases, hemicellulases or even carrageenases.
  • the inventors have in fact discovered, surprisingly, that the use of a combination of specifically selected enzymes makes it possible not only to carry out an efficient extraction of the proteins of P. palmata but also to obtain proteins having good properties of digestibility which can therefore be advantageously used in human or animal food.
  • the present invention therefore relates to the use of an enzymatic composition comprising at least a first enzyme chosen from xylanases and at least a second enzyme chosen from cellulases and ⁇ -glucanases in a process for extracting proteins from l alga P. palmata comprising at least one step of enzymatic extraction in an appropriate extraction medium according to which lyophilized fragments of said alga are subjected to the action of said enzymatic composition and a step of recovering the proteins extracted, to improve the digestibility of the soluble protein fraction of P. palmata.
  • the use of such an enzymatic composition during the enzymatic extraction process makes it possible not only to extract the proteins from the P. palmata alga with a recovery rate acceptable but also to improve the digestibility of these same proteins.
  • the subject of the invention is also a method of extracting proteins from the P. palmata alga comprising at least one step of enzymatic extraction and a step of recovering the proteins extracted, characterized in that during step d enzymatic extraction, lyophilized fragments of said alga are subjected, in an appropriate extraction medium, to the action of an enzymatic composition comprising at least a combination of at least two enzymes, the - first enzyme being chosen from Trichoderma reesi xylanases, Aspergillus aculeatus and Aspergillus oryzae xylanases genetically modified for the production of Aspergillus aculeatus xylanase, and the second enzyme being chosen from cellulases and ⁇ -glucanases, to obtain a soluble protein fraction of P. palmata.
  • the enzymatic extraction process in accordance with the invention makes it possible both to extract the proteins from the P. palmata alga with an acceptable recovery rate but also to improve the digestibility of these same proteins.
  • the process according to the invention also makes it possible to extract non-denaturing R-phycoerythrin which can then be advantageously used in the cosmetic, food industries and for biomedical diagnosis.
  • the harvested P. palmata algae are generally freed of their • contaminants and their epiphytes, then the algal material is rinsed with sea water and then with distilled water. The algal material is then lyophilized, without prior grinding operation, and stored after lyophilization in the dark and at room temperature.
  • the algal material thus lyophilized is generally cut into small fragments of homogeneous size, for example in fragments of 1 cm 2 .
  • the enzymes used according to the process according to the invention preferably come from microorganisms, these microorganisms possibly being genetically modified.
  • the DAspergillus aculeatus and Aspergillus oryzae xylanases genetically modified for the production of Aspergillus aculeatus xylanase are particularly preferred according to the invention.
  • the cellulases are preferably chosen from the cellulases of Trichoderma reesi and Trichoderma viride.
  • the ⁇ -glucanases are preferably chosen from the ⁇ -glucanases of Aspergillus niger and Humicola insolens.
  • the first enzyme is chosen from the xylanases of Aspergillus aculeatus and Aspergillus oryzae genetically modified for the production of xylanase from Aspergillus aculeatus and the second enzyme is chosen from the cellulases of Trichoderma reesi.
  • the first enzyme is chosen from the Aspergillus aculeatus and Aspergillus oryzae xylanases genetically modified for the production of Aspergillus aculeatus xylanase and the second enzyme is chosen from the ⁇ -glucanases of insolic Humicola.
  • the total quantity of enzymes present in the enzymatic composition used according to the process in accordance with the invention varies according to the quantity by weight of the algae fragments to be treated. It is expressed in units / g of algae (U / g). According to the invention, and by way of reference, 1 U unit corresponds to the amount of enzyme capable of releasing 1 ⁇ mole of dares in 1 minute at a temperature of 40 ° C.
  • the first enzyme preferably represents from 0.01 to 10% by weight of the weight of the fragments of the alga to be treated and even more preferably from 0.1 to 2% by weight.
  • the second enzyme preferably represents from 0.3 to 10% by weight of the weight of the fragments of the alga to be treated and even more preferably from 2 to 8% by weight.
  • the total amount of enzymes is preferably between 5 and 20 U / g of alga fragment to be treated and even more preferably between 10 and 15 U / g.
  • the extraction medium used according to the method according to the invention is preferably a buffer compatible medium with enzymatic activity used, said buffer can be chosen from sodium acetate, phosphate buffers such as sodium phosphate , sodium oxalate, etc. According to an advantageous embodiment of the process according to the invention, the buffer used is sodium acetate.
  • the algae fragments preferably represent from 1 to 15% by weight of the total weight of the extraction medium and even more preferably from 2 to 10% by weight.
  • the enzymatic extraction step is preferably carried out at a temperature between 35 and 50 ° C and even more particularly between 37 and 45 ° C.
  • the enzymatic extraction reaction is generally carried out for a period which can vary between 1 and 24 hours and preferably between 4 and 12 hours.
  • the pH of the extraction medium must of course be compatible with the optimal activity of the enzymes used, it is preferably between 3 and 8 and even more preferably between 4 and 7. It can be adjusted using alkalizing agents or conventional acidifiers and is maintained at a substantially stable value throughout the duration of the enzymatic extraction thanks to the presence of a buffer such as those mentioned above.
  • the proteins thus obtained can be recovered in the supernatant from the extraction medium by different separation or concentration techniques such as, for example, centrifugation, filtration, dialysis, etc.
  • the soluble protein fraction thus obtained can then be stored, for example in lyophilized form.
  • a subject of the invention is also the soluble protein fraction of P. palmata directly obtained by implementing the method according to the present invention.
  • the protein fraction thus obtained can thus be used in the food industry, in particular as a nutritional supplement in human or animal food, which constitutes another object of the invention.
  • this soluble protein fraction contains R-phycoerythrin which can then be separated from the rest of the total protein fraction by conventional separation methods such as preparative electrophoresis (Galland-Irmouli et al, 2000, Journal of Chromatography B, 739, 117-123) or by chromatography on an ion exchange gel (Hilditch et al, J. Appl. Phycol, 1991, 3, 345).
  • the R-phycoerythrin thus obtained has good structural integrity because it is not denatured during the enzymatic extraction step. It can therefore be advantageously used in the food or cosmetic industry and in the biomedical field.
  • the invention also comprises other arrangements which will emerge from the description which follows, which refers to an example of demonstration of the improvement in the digestibility of P. palmata proteins, as well as to Figure 1 attached which shows in schematic form the general principle of the enzymatic treatment used in the example which follows.
  • the harvested specimens are stripped of their contaminants and of their epiphytes then the algal material is rinsed according to the procedure described by Fleurence et al, J. of Appl. Phycol, 1995, 7, 393-397.
  • the algal material is then lyophilized, without prior grinding operation, and stored after lyophilization in the dark and at room temperature.
  • the enzymes tested are as follows: Cellulases: - Celluclast® from Trichoderma reesi sold by the company Novo
  • a control hydrolysis was carried out under the same conditions but without an enzyme. The hydrolysis was followed for 24 hours, samples
  • the pellet is eliminated and the supernatant is kept (FIG. 1), the latter is representative of the water-soluble protein fraction.
  • the supernatant is then lyophilized.
  • the supernatant is then dialyzed against demineralized water for 1 night at 4 ° C.
  • the solution thus freed of its salts is then lyophilized, the algal powder thus obtained is stored at room temperature away from light.
  • the assay of the proteins dissolved in the supernatant of the reaction medium was carried out by the reaction with bicinchonic acid (Pierce, Rockford, IL, USA) according to the procedure recommended by the supplier.
  • Bovine serum albumin (BSA) is used as a reference protein for the development of the standard curve.
  • the assay of the proteins released in the supernatant makes it possible to follow the hydrolysis and to compare the efficiency of the different enzymes. For this comparison, the protein concentrations obtained after 8 hours of hydrolysis, which corresponds to the maximum time of enzymatic activity, have been considered.
  • composition of certain essential amino acids (valine, metliionine, threonine and leucine) of proteins is determined by the Waters AccQT ® analysis method.
  • This method is based on a pre-column derivation of free amino acids by 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimyl carbamate (AQC) and their analytical separation is carried out by high performance liquid chromatography (HPLC) on a reverse phase column of the type Cl 8 AccQTag® (Waters).
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the preparation of standard amino acids H (Pierce, cited above) is used to determine the amino acid concentrations of the samples.
  • a 30-minute predigestion at 37 ° C of the substrate to be studied is carried out in 0.01 M phosphate buffer at pH 1.9 with pig pepsin (SIGMA).
  • the digestion cell is marketed by the company SERNA (Quebec, Canada).
  • a Marie bath makes it possible to maintain the temperature of the cell and of the buffer replacing the volume withdrawn at 37 ° C.
  • a peristaltic pump is used to recover the digestas.
  • Fractions are collected continuously every hour for 6 hours, which makes it possible to describe the kinetics of nitrogen release and especially to assess the amount of nitrogen released during 6 hours of digestion, this amount is considered to represent the protein digestibility.
  • the nitrogen determination is carried out by microKjeldahl.
  • the total nitrogen content of each protein fraction obtained according to the process according to the invention was also evaluated by this method.
  • the purpose of this measurement is to then weigh an amount of sample from each of these protein fractions which contains 20 mg of nitrogen and which is then subjected to proteolytic digestion.
  • Pepsin is used in the enzyme / substrate proportion of 1/250 (mg of nitrogen / mg of nitrogen) and pancreatin in the proportion of 1/25.
  • the percentage of nitrogen released is calculated using the following equation:
  • % of nitrogen released : - amount of initial nitrogen (20 or 13.5 mg)
  • the reference content of total amino acids in P. palmata is 192.24 mg / g.
  • results obtained after enzymatic hydrolysis are grouped in Table II below, the determination of amino acids having been carried out on the supernatant. The results are expressed as% of the total amino acid fraction.
  • This table shows that the best results in terms of protein digestibility are obtained with the combinations of enzymes in accordance with the invention, that is to say containing at least one xylanase as the first enzyme and at least one cellulase and / or at least one ⁇ -glucanase as the second enzyme.
  • Ultraflow® which corresponds to the combination in accordance with the invention of a xylanase and a ⁇ -glucanase gives excellent results in terms of digestibility whereas the results obtained with this same association in terms of extraction were not completely satisfactory (see Table I).

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Abstract

La présente invention est relative à l'utilisation d'une composition enzymatique comprenant l'association spécifique de deux enzymes sélectionnées pour améliorer la digestibilité de la fraction protéique soluble de <i>P. palmata</i>, à un procédé d'extraction des protéines de l'algue <i>Palmaria palmata</i>, ainsi qu'à la fraction protéique soluble obtenue par ce procédé et son utilisation dans l'industrie alimentaire.

Description

PROCÉDÉ D'EXTRACTION ET D'AMÉLIORATION DE LA DIGESTIBILITÉ DES PROTÉINES DE PALMARIA PALMATA
La présente invention est relative à l'utilisation d'une composition enzymatique comprenant l'association spécifique de deux enzymes sélectionnées pour améliorer la digestibilité de la fraction protéique soluble de P. palmata, à un procédé d'extraction des protéines de l'algue Palmaria palmata, ainsi qu'à la fraction protéique soluble obtenue par ce procédé et son utilisation dans l'industrie alimentaire.
La production annuelle globale d'algues marines est d'environ de 6,5.106 tonnes (algues fraîches). Les algues marines sont principalement exploitées dans l'industrie agro-alimentaire. En particulier, dans les pays asiatiques, les algues marines sont très souvent consommées comme légumes.
En Europe, les algues et plus particulièrement les algues brunes sont traditionnellement utilisées pour la production d'additifs tels que les alginates ou pour l'alimentation animale (Indegaard et al, Seaweed Ressources in Europe, 1991, 21-64).
Dans la plupart des cas, les algues sont utilisées dans l'alimentation humaine ou animale pour leur teneur en éléments minéraux et les propriétés fonctionnelles des polysaccharides qu'elles renferment. Les algues sont plus rarement valorisées pour la valeur nutritionnelle des protéines qu'elles renferment. Les algues, et en particulier les algues rouges sont également utilisées pour la production d'une protéine particulière la R-phycoérythrine qui est couramment utilisée comme pigment rouge dans l'industrie cosmétique et dans le domaine médical à titre de réactif fluorescent pour le diagnostic immunologique et qui pourrait être utilisée dans l'industrie alimentaire. Cette protéine représente jusqu'à 12% de la fraction protéique de Palmaria palmata. La phycoérythrine peut notamment être obtenue par broyage d'algues sèches puis par extraction en solution en milieu aqueux phosphaté (US 5 358 858). Cependant de telles techniques d'extraction ont tendance à dénaturer la R-phycoérythrine.
La teneur en protéines des algues varie en fonction des espèces. En général, la fraction protéique des algues brunes est faible (3 à 15%) du poids sec de l'algue), alors que celle des algues rouges ou vertes est plus élevée (10-47%) du poids sec). En particulier, les teneurs en protéines des algues rouges telles que
Porphyra tenera et Palmaria palmata peuvent atteindre respectivement 47%o et 35%> du poids sec (Morgan et al., Econ. Bot., 1980, 34, 27-50). Ces deux algues rouges, également dénommées "Nori" et Dulse" respectivement, ont des teneurs en protéines plus élevées que celle du soja.
La teneur en protéines des algues marines est soumise à une variabilité saisonnière. Une étude de la teneur en protéines de P. palmata ramassée sur la côte atlantique française tout au long de l'année a montré que la teneur moyenne en protéines de cette algue peut varier entre 9 et 25% (poids sec). Les teneurs les plus importantes sont observées à la fin de l'hiver et au début du printemps, les teneurs les plus faibles sont observées à la fin de l'été et au début de l'automne (Galland-Irmouli et al, J. of Nuir. Biochem., 1999, 10, 353-359).
La composition en acides aminés des algues a été fréquemment étudiée et comparée à celle d'autres aliments riches en protéines tels que les œufs et le soja.
Alors que chez la plupart des algues, notamment chez les algues brunes, les acides aspartique et glutamique constituent ensemble une large part de la fraction en acides aminés (22-44%), cette teneur est plus faible chez les algues rouges telles que Porphyra tenera (19%>) et P. palmata (14%>) (Indegaard et al, pré-cité). En ce qui concerne l'espèce P. palmata, la leucine, la valine et la méthionine représentent une partie importante de la fraction en acides aminés essentiels.
Les teneurs moyennes de ces acides aminés sont proches de celles observées dans l'ovalbumine. D'autre part, les teneurs en isoleucine et en thréonine sont similaires à celles des légumineuses. Sauf pour l'histidine, la nature et les teneurs en acides aminés constituant les protéines de P. palmata sont assez proches de celles observées pour les légumineuses.
Compte tenu de leur forte teneur en protéines et de leur composition variée en acides aminés, les algues rouges et en particulier P. palmata représentent donc une source potentielle intéressante de protéines utilisables pour l'alimentation humaine ou animale. Différents procédés d'extraction des protéines d'algues, et en particulier de P. palmata ont déjà été proposés. Il a ainsi été décrit des méthodes physico-chimiques telles que par exemple l'extraction dans de l'eau déionisée (choc osmotique), ou dans un tampon Tris HC1 éventuellement suivie d'une sonication, ou bien encore l'extraction en milieu alcalin (J. Fleurence et al, J. of Appl. Phycol., 1995, 7, 577-582).
Si de telles méthodes permettent d'extraire d'importantes quantités de protéines, elles sont cependant assez agressives et ont pour conséquence de dénaturer les protéines ainsi extraites. Cette dénaturation a bien entendu des conséquences négatives sur les propriétés nutritionnelles des protéines ainsi obtenues.
Par conséquent, pour être utilisées dans l'industrie alimentaire humaine ou animale, les protéines doivent conserver au maximum leur intégrité structurale et présenter une bonne digestibilité.
Selon l'invention, par digestibilité, on entend la capacité qu'ont les sucs digestifs humains à dégrader les protéines lorsque celles-ci sont ingérées.
De récentes études ont montré que la digestibilité relative à la pepsine et à la pancréatine des protéines d'une poudre de P. palmata (exprimée par rapport à la caséine) est d'environ 56% (Galland-Irmouli et al, pré-cité).
De plus, les protéines de P. palmata extraites dans l'eau ou dans un tampon faiblement ionique sont peu sensibles in vitro à l'action des sucs digestifs humains (J. Fleurence et al, Biofutur, 1999, 191, 32-36).
D'autres techniques d'extraction des protéines algales, telles que des techniques d'extraction enzymatiques ont également été proposées.
Les enzymes utilisées sont en général des polysaccharidases telles que des cellulases, des xylanases, des agarases, des β-glucanases, des hémicellulases ou bien encore des carraghénases.
Différentes études ont été effectuées concernant l'extraction enzymatique des protéines algales et ont montré que le rendement d'extraction de ces protéines peut varier dans de larges proportions en fonction de l'espèce des algues et de la nature des enzymes utilisées.
C'est ainsi par exemple que sur l'algue Chondrus crispus, l'utilisation d'un mélange de carraghénase et de cellulase permet d'extraire une fraction protéique beaucoup plus importante que chacune des fractions protéiques extraites avec les mêmes enzymes utilisées séparément.
De la même façon, sur l'algue Gracilaria verrucosa, l'utilisation d'un mélange d'agarase et de cellulase donne de meilleurs résultats en terme d'extraction protéique que chacune des enzymes utilisées séparément.
Par contre, sur l'algue P. palmata, c'est l'utilisation isolée de xylanase ou de cellulase qui conduit, en terme d'extraction, aux meilleurs résultats, la fraction protéique obtenue avec un mélange de xylanase et de cellulase étant beaucoup plus faible et pratiquement identique à celle qui est obtenue pour une extraction réalisée sans l'aide d'enzyme (Fleurence et al, J. of Appl. Phycol., 1995, 7, 393-397).
Ces techniques d'extractions enzymatiques nécessitent par conséquent une grande adaptation en fonction de chaque variété d'algue (J. Fleurence,
J. of Appl. Phycol, 1999, 11, 313-314). De plus, les enzymes ou mélanges d'enzymes donnant les meilleurs résultats en terme d'extraction protéique ne permettent pas d'améliorer simultanément la digestibilité des protéines de façon satisfaisante.
C'est afin de remédier à ces problèmes que, de façon surprenante, les Inventeurs ont mis au point ce qui fait l'objet de l'invention.
Les Inventeurs ont en effet découvert, de façon surprenante, que l'utilisation d'une combinaison d'enzymes spécifiquement sélectionnées permet non seulement de réaliser une extraction efficace des protéines de P. palmata mais également d'obtenir des protéines présentant de bonnes propriétés de digestibilité qui peuvent par conséquent être avantageusement utilisées dans l'alimentation humaine ou animale.
La présente invention a donc pour objet l'utilisation d'une composition enzymatique comprenant au moins une première enzyme choisie parmi les xylanases et au moins une seconde enzyme choisie parmi les cellulases et les β-glucanases dans un procédé d'extraction des protéines de l'algue P. palmata comprenant au moins une étape d'extraction enzymatique dans un milieu d'extraction approprié selon laquelle on soumet des fragments lyophilisés de ladite algue à l'action de ladite composition enzymatique et une étape de récupération des protéines extraites, pour améliorer la digestibilité de la fraction protéique soluble de P. palmata. Ainsi que cela est démontré dans l'exemple ci-après, l'utilisation d'une telle composition enzymatique au cours du procédé d'extraction enzymatique permet non seulement d'extraire les protéines de l'algue P. palmata avec un taux de récupération acceptable mais également d'améliorer la digestibilité de ces mêmes protéines.
L'invention a également pour objet un procédé d'extraction des protéines de l'algue P. palmata comprenant au moins une étape d'extraction enzymatique et une étape de récupération des protéines extraites, caractérisé par le fait que lors de l'étape d'extraction enzymatique, on soumet, dans un milieu d'extraction approprié, des fragments lyophilisés de ladite algue à l'action d'une composition enzymatique comprenant au moins une combinaison d'au moins deux enzymes, la - première enzyme étant choisie parmi les xylanases de Trichoderma reesi, les xylanases d'Aspergillus aculeatus et d'Aspergillus oryzae modifié génétiquement pour la production de xylanase d'Aspergillus aculeatus, et la seconde enzyme étant choisie parmi les cellulases et les β-glucanases, pour obtenir une fraction protéique soluble de P. palmata.
Le procédé d'extraction enzymatique conforme à l'invention permet à la fois d'extraire les protéines de l'algue P. palmata avec un taux de récupération acceptable mais également d'améliorer la digestibilité de ces mêmes protéines. Le procédé conforme à l'invention permet également d'extraire de façon non dénaturante la R-phycoérythrine qui peut ensuite être avantageusement utilisée dans les industries cosmétique, alimentaire et pour le diagnostic biomédical.
Selon l'invention et avant l'étape d'extraction enzymatique proprement dite, les algues P. palmata récoltées sont en général débarrassées de leurs • contaminants et de leurs épiphytes puis le matériel algal est rincé à l'eau de mer puis à l'eau distillée. Le matériel algal est ensuite lyophilisé, sans opération préalable de broyage, et conservé après lyophilisation à l'obscurité et à température ambiante.
Au moment de la procédure d'extraction enzymatique, le matériel algal ainsi lyophilisé est en général découpé en petits fragments de taille homogène, par exemple en fragments de 1 cm2. Les enzymes utilisées selon le procédé conforme à l'invention sont de préférence issues de microorganismes, ces microorganismes pouvant éventuellement être génétiquement modifiés.
Les xylanases DAspergillus aculeatus et dAspergillus oryzae modifié génétiquement pour la production de xylanase dAspergillus aculeatus sont particulièrement préférées selon l'invention.
Les cellulases sont de préférence choisies parmi les cellulases de Trichoderma reesi et Trichoderma viride.
Les β-glucanases sont de préférence choisies parmi les β-glucanases dAspergillus niger et d'Humicola insolens.
Selon une forme de réalisation avantageuse du procédé conforme à l'invention, la première enzyme est choisie parmi les xylanases dAspergillus aculeatus et dAspergillus oryzae modifié génétiquement pour la production de xylanase dAspergillus aculeatus et la seconde enzyme est choisie parmi les cellulases de Trichoderma reesi.
Selon une autre forme de réalisation avantageuse du procédé conforme à l'invention, la première enzyme est choisie parmi les xylanases dAspergillus aculeatus et d'Aspergillus oryzae modifié génétiquement pour la production de xylanase dAspergillus aculeatus et la seconde enzyme est choisie parmi les β-glucanases d'Humicola insolens.
La quantité totale d'enzymes présentes dans la composition enzymatique utilisée selon le procédé conforme à l'invention varie en fonction de la quantité en poids des fragments d'algue à traiter. Elle est exprimée en unités/g d'algue (U/g). Selon l'invention, et à titre de référence, 1 unité U correspond à la quantité d'enzyme capable de libérer 1 μmole d'osés en 1 minute à une température de 40°C.
La première enzyme représente de préférence de 0,01 à 10 % en poids du poids des fragments de l'algue à traiter et encore plus préférentiellement de 0,1 à 2 % en poids. La deuxième enzyme représente de préférence de 0,3 à 10 % en poids du poids des fragments de l'algue à traiter et encore plus préférentiellement de 2 à 8 % en poids.
La quantité totale d'enzymes est de préférence comprise entre 5 et 20 U/g de fragment d'algue à traiter et encore plus préférentiellement entre 10 et 15 U/g.
Le milieu d'extraction utilisé selon le procédé conforme à l'invention est de préférence un milieu tampon compatible avec les activités enzymatiques utilisées, ledit tampon pouvant notamment être choisi parmi l'acétate de sodium, les ' tampons phosphate tels que le phosphate de sodium, l'oxalate de sodium, etc. Selon une forme de réalisation avantageuse du procédé conforme à l'invention, le tampon utilisé est l'acétate de sodium.
Les fragments d'algue représentent de préférence de 1 à 15 % en poids du poids total du milieu d'extraction et encore plus préférentiellement de 2 à 10 % en poids. Selon le procédé conforme à l'invention, l'étape d'extraction enzymatique est de préférence réalisée à une température comprise entre 35 et 50°C et encore plus particulièrement entre 37 et 45°C.
La réaction d'extraction enzymatique est en général conduite pendant une durée pouvant varier entre 1 et 24 heures et de préférence entre 4 et 12 heures.
Le pH du milieu d'extraction doit bien entendu être compatible avec l'activité optimale des enzymes utilisées, il est de préférence compris entre 3 et 8 et encore plus préférentiellement entre 4 et 7. Il peut être ajusté au moyen d'agents alcalifiants ou acidifiants classiques et est maintenu à une valeur sensiblement stable durant toute la durée de l'extraction enzymatique grâce à la présence d'un tampon tel que ceux mentionnés ci-dessus.
Une fois la réaction d'extraction enzymatique terminée, les protéines ainsi obtenues (fraction protéique soluble) peuvent être récupérées dans le surnageant du milieu d'extraction par différentes techniques séparatives ou de concentration telles que par exemple la centrifugation, la filtration, la dialyse, etc.
La fraction protéique soluble ainsi obtenue peut ensuite être conservée par exemple sous forme lyophilisée. L'invention a également pour objet la fraction protéique soluble de P. palmata directement obtenue en mettant en œuvre le procédé conforme à la présente invention.
De part sa digestibilité améliorée, la fraction protéique ainsi obtenue peut ainsi être utilisée dans l'industrie alimentaire, notamment à titre de complément nutritionnel dans l'alimentation humaine ou animale, ce qui constitue un autre objet de l'invention.
D'autre part, cette fraction protéique soluble renferme de la R-phycoérythrine qui peut être ensuite séparée du reste de la fraction protéique totale par des méthodes classiques de séparation telles que l'électrophorèse préparative (Galland-Irmouli et al, 2000, Journal of Chromatography B, 739,117-123) ou par chromatographie sur gel échangeur d'ions (Hilditch et al, J. Appl. Phycol, 1991, 3, 345).
La R-phycoérythrine ainsi obtenue présente une bonne intégrité structurale car elle n'est pas dénaturée lors de l'étape d'extraction enzymatique. Elle peut donc être avantageusement utilisée dans l'industrie alimentaire ou cosmétique et dans le domaine biomédical.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, laquelle se réfère à un exemple de démonstration de l'amélioration de la digestibilité des protéines de P. palmata, ainsi qu'à la figure 1 annexée qui représente sous forme schématique le principe général du traitement enzymatique utilisé dans l'exemple qui va suivre.
Il doit être bien entendu toutefois que cet exemple est donné uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont il ne constitue en aucune manière une limitation.
EXEMPLE : DÉMONSTRATION DE L'AMÉLIORATION DE LA DIGESTIBILITÉ DES PROTÉINES DE P. PALMATA. I) Matériel et méthodes 1.1 Échantillonnage Les échantillons de P. palmata utilisés dans cet exemple ont été récoltés sur le site de Belle Ile en mer (Morbihan), au lieu dit "le Gros Rocher" en mai 1999. 1.2 Préparation des échantillons
Les spécimens récoltés sont débarrassés de leurs contaminants et de leurs épiphytes puis le matériel algal est rincé selon la procédure décrite par Fleurence et al, J. of Appl. Phycol, 1995, 7, 393-397. Le matériel algal est ensuite lyophilisé, sans opération préalable de broyage, et conservé après lyophilisation à l'obscurité et à température ambiante.
1.3 Nature des enzymes testées
Les enzymes testées sont les suivantes : Cellulases : - Celluclast® de Trichoderma reesi vendu par la société Novo
- Cellulyve TR 400® de Trichoderma reesi vendu par la société Lyven
Xylanases :
- Feedlyve AXC® de Trichoderma reesi vendu par la société Lyven - Panlyve HCB 10® dAspergillus niger vendu par la société Lyven
- Shearzyme® dAspergillus oryzae modifié génétiquement pour la production de xylanase dAspergillus aculeatus, vendu par la société Novo β-glucanases : - Finizym® d'Aspergillus niger vendu par la société Novo
- Ultraflow® d'Humicola insolens vendu par la société Novo Combinaisons d'enzymes :
- cellulase + xylanase (Celluclast® + Shearzyme®)
- cellulase + β-glucanase (Celluclast® + Ultraflow® et Celluclast® + Finizym®)
- xylanase + β-glucanase (Shearzyme® + Ultraflow®)
1.4 Procédure de traitement enzymatique
10 grammes d'algues lyophilisées, mais non broyées, sont découpés en petits fragments homogènes d'environ 1 cm2 (Figure 1). Les morceaux obtenus sont ensuite placés un réacteur enzymatique à double enveloppe pourvu d'un agitateur magnétique contenant le milieu d'extraction, à raison de 10 g d'algue pour 300 ml d'acétate de sodium 0,05 M à pH 5. La quantité de poudre enzymatique à utiliser est calculée en fonction des activités spécifiques de chaque enzyme données par les fournisseurs afin d'être dans des conditions d'activité optimale (Vmax). Conditions d'hydrolyse :
- Température : 40°C (Cellulyve®, Feedlyve®, Panlyve® et combinaisons d'enzymes) ;
45°C (Shearzyme®, Celluclast®, Ultraflow® et Finizym®)
- Tampon d'extraction : Acétate de sodium 50 mM, pH 5
- Agitation : 250 t/mn - Matière première : algue lyophilisée
- Rapport matière première/tampon : 3,3%
- Rapport enzyme/substrat : 12 U/g environ
Une hydrolyse témoin a été effectuée dans les mêmes conditions mais sans enzyme. L'hydrolyse a été suivie pendant 24 heures, des prélèvements
(aliquotes) ont été effectués régulièrement dans le temps dans le surnageant du milieu réactionnel Après une incubation de 24 heures, l'homogénat est récupéré et soumis à une centrifugation de 20000g (20 mn, 4°C).
Le culot est éliminé et le surnageant est conservé (Figure 1), ce dernier est représentatif de la fraction protéique hydrosoluble.
Le surnageant est ensuite lyophilisé.
Le surnageant est ensuite dialyse contre de l'eau déminéralisée pendant 1 nuit à 4°C. La solution ainsi débarrassée de ses sels est ensuite lyophilisée, la poudre algale ainsi obtenue est conservée à température ambiante à l'abri de la lumière.
Ce lyophilisât est utilisé comme matériel de départ pour l'évaluation de la digestibilité in vitro des protéines algales solubilisées et l'analyse de leur composition en acides aminés. L'étude de ces 2 caractéristiques permet d'évaluer la valeur nutritionnelle de la fraction protéique extraite par le traitement enzymatique. 1.5 Dosage des protéines
L'évaluation de la teneur en protéines a été réalisée en utilisant la méthode de dosage de l'azote total par la méthode de Kjeldahl. Le dosage de l'azote a été effectué sur l'algue de départ lyophilisée, sur le surnageant lyophilisé et sur le culot lyophilisé. Cette mesure permet de calculer la quantité de protéines obtenues (% N x 6,25 = % protéines).
Le dosage des protéines solubilisées dans le surnageant du milieu réactionnel a été réalisé par la réaction avec l'acide bicinchonique (Pierce, Rockford, IL, USA) selon la procédure préconisée par le fournisseur. L'albumine sérique bovine (BSA) est utilisée comme protéine de référence pour l'élaboration de la courbe étalon. Le dosage des protéines libérées dans le surnageant permet de suivre l'hydrolyse et de comparer l'efficacité des différentes enzymes. Pour cette comparaison, on a considéré les concentrations en protéines obtenues au bout de 8 heures d'hydrolyse qui correspond au temps maximum d'activité enzymatique.
1.6 Détermination et dosage des acides aminés
Il est effectué sur le surnageant du milieu réactionnel.
La composition de certains acides aminés essentiels (valine, métliionine, thréonine et leucine) des protéines est déterminée par la méthode d'analyse Waters AccQT®.
Cette méthode est basée sur une dérivation pré-colonne des acides aminés libres par le carbamate de 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimyle (AQC) et leur séparation analytique est réalisée par chromato graphie liquide haute performance (HPLC) sur colonne en phase inverse du type Cl 8 AccQTag® (Waters). La préparation d'acides aminés standard H (Pierce, pré-cité) est utilisée pour déterminer les concentrations en acides aminés des échantillons.
1.7 Digestibilité in vitro de l'algue brute et de la fraction protéique solubilisée par le procédé enzymatique La méthode a été décrite par Savoie et Gauthier, J. of the Food Se, .
1986, 51, 494-498 et Savoie et al, Plant Foods for Human Nutrition, 1989, 39,
93-107.
Il s'agit d'une méthode multi enzymatique de mesure de la digestibilité des protéines. Elle est effectuée à l'aide d'une cellule de digestion comprenant deux compartiments concentriques séparés par une membrane de dialyse dont la limite d'exclusion moléculaire est de 1000 Da. Dans le compartiment interne sont réalisées les protéolyses. Des prélèvements en continu sont effectués dans le compartiment externe pour déterminer la quantité d'azote libéré.
Une prédigestion de 30 minutes à 37°C du substrat à étudier est opérée dans du tampon phosphate 0,01 M a pH 1,9 par de la pepsine de porc (SIGMA
1/60000 ; activité : 3200 U/mg) suivie d'une digestion enzymatique de 6 heures par la pancréatine de porc (Sigma, 18F-0809) dans du tampon phosphate 0,01 M à pH 7,5.
La cellule de digestion est commercialisée par la société SERNA (Québec, Canada).
Un bain Marie permet de maintenir à 37°C la température de la cellule et du tampon venant remplacer le volume prélevé. Une pompe péristaltique est utilisée pour récupérer les digestas.
Des fractions sont collectées en continu toutes les heures pendant 6 heures, ce qui permet de décrire une cinétique de libération de l'azote et surtout d'évaluer la quantité d'azote libéré pendant 6 heures de digestion, cette quantité est considérée comme représentant la digestibilité protéique.
Le dosage de l'azote est réalisé par microKjeldahl. Le contenu en azote total de chaque fraction protéique obtenue selon le procédé conforme à l'invention a également été évalué par cette méthode. Cette mesure a pour but de permettre de peser ensuite une quantité d'échantillon de chacune de ces fractions protéiques qui contient 20 mg d'azote et qui est ensuite soumise à la digestion protéolytique
Dans le cas de Celluclast® et de Ultraflow®, la quantité d'azote a - été 13,5 mg et non de 20 mg, car il y avait trop peu d'échantillon.
La pepsine est utilisée dans la proportion enzyme/substrat de 1/250 (mg d'azote/mg d'azote) et la pancréatine dans la proportion de 1/25. Le pourcentage d'azote libéré est calculé selon l'équation suivante :
„ , ,. ^ ,.-, , , quantité d'azote dans le dialysat prélevé x 100
% d'azote libère = : - quantité d'azote initial (20 ou 13,5 mg)
Les résultats sont donnés sous deux formes : l'azote libéré au cours d'une, deux, trois, quatre, cinq et six heures d'hydrolyse et l'azote libéré par fraction d'une heure. La digestibilité relative des protéines algales est également estimée au regard de la protéolyse de la caséine dans le même système opératoire, la digestion de la caséine représentant alors le 100% de la digestibilité. m RÉSULTATS 2.1 Teneur en protéines totales
Le dosage de l'azote total était de 3,61%, par conséquent la teneur en protéines totales de l'algue utilisée dans cet exemple était de 6,25 x 3,61 = 22,6%.
L'hydrolyse ayant été réalisée sur 10 g d'algue, la fraction protéique contenue était donc de 2,26 g.
La quantité de protéines extraites dans le surnageant au bout de 8 heures en fonction de la nature de l'enzyme ou de la combinaison d'enzymes utilisées au cours de l'hydrolyse a également été étudiée. Les résultats apparaissent dans le Tableau I ci-après, l'action des enzymes étant classée par ordre croissant d'activité :
Tableau I
Figure imgf000014_0001
On constate qu'en terme d'extraction protéique, les meilleurs résultats (12000 μg/ml) sont obtenus avec la combinaison enzymatique de Celluclast® + Ultraflow® qui correspond à l'association d'une cellulase de Trichoderma reesi et d'une β-glucanase d'Humicola insolens. De très bons résultats sont également obtenus avec Finizym® qui est une β-glucanase dAspergillus niger (11000 μg/ml), avec la combinaison enzymatique de Celluclast® + Shearzyme® qui correspond à l'association d'une cellulase de Trichoderma reesi et d'une xylanase d'Aspergillus oryzae modifié génétiquement pour la production de xylanase d'Aspergillus aculeatus ou bien encore avec Ultraflow® qui correspond à la β-glucanase d'Humicola insolens utilisée seule. 2.2 Détermination et dosage des acides aminés essentiels
La teneur de référence en acides aminés totaux de P. palmata est de 192,24 mg/g.
Les résultats obtenus après hydrolyse enzymatique sont regroupés dans le Tableau II ci-après, le dosage des acides aminés ayant été effectué sur le surnageant. Les résultats sont exprimés en % de la fraction totale en acides aminés.
Les %> respectifs en valine (Val), méthionine (Met), thréonine (Thr), et leucine (Leu), exprimés par rapport à la fraction totale en acides aminés, ont été déterminés pour chacune des fractions protéiques extraites.
Tableau II
Figure imgf000015_0001
Ces résultats mettent en évidence qu'une des combinaisons enzymatiques préférées selon l'invention, à savoir l'association d'une cellulase et d'une β-glucanase conduit aux meilleurs résultats en terme de %> de valine et de leucine obtenus par rapport à la fraction totale en acides aminés.
Ces résultats montrent également que l'une des combinaisons enzymatiques préférées selon l'invention, à savoir l'association d'une cellulase et d'une xylanase conduit au meilleur résultat en terme de % de méthionine obtenu par rapport à la fraction totale en acides aminés. Ces résultats sont significatifs de la valeur nutritionnelle particulièrement intéressante des fractions protéiques solubles obtenues en mettant en œuvre le procédé conforme à l'invention. 2.3 Digestibilité des protéines
Les résultats obtenus en fonction de la nature des enzymes utilisées lors de l'extraction sont regroupés dans le Tableau III ci-après :
Tableau III
Figure imgf000016_0001
Ce tableau montre que les meilleurs résultats en terme de digestibilité des protéines sont obtenus avec les combinaisons d'enzymes conformes à l'invention, c'est à dire renfermant au moins une xylanase à titre de première enzyme et au moins une cellulase et/ou au moins une β-glucanase à titre de deuxième enzyme.
Ces résultats sont nettement meilleurs que ceux observés par exemple avec Ultraflow® qui correspond à une β-glucanase utilisée seule et qui donnait pourtant de bons résultats en terme d'extraction protéique mais qui de façon surprenante de donne pas de résultat significativement différent de ceux qui sont obtenus avec la caséine témoin.
Ce tableau montre également que la combinaison Shearzyme® +
Ultraflow® qui correspond à l'association conforme à l'invention d'une xylanase et d'une β-glucanase donne d'excellents résultats en terme de digestibilité alors que les résultats obtenus avec cette même association en terme d'extraction n'étaient pas complètement satisfaisants (voir Tableau I).

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'une composition enzymatique comprenant au moins une première enzyme choisie parmi les xylanases et au moins une seconde enzyme choisie parmi les cellulases et les β-glucanases dans un procédé d'extraction des protéines de l'algue P. palmata comprenant au moins une étape d'extraction enzymatique dans un milieu d'extraction approprié selon laquelle on soumet des fragments lyophilisés de ladite algue à l'action de ladite composition enzymatique et une étape de récupération des protéines extraites, pour améliorer la digestibilité de la fraction protéique soluble de P. palmata.
2. Procédé d'extraction des protéines de l'algue P. palmata comprenant au moins une étape d'extraction enzymatique et une étape de récupération des protéines extraites, caractérisé par le fait que lors de l'étape d'extraction enzymatique, on soumet, dans un milieu d'extraction approprié, des fragments lyophilisés de ladite algue à l'action d'une composition enzymatique comprenant au moins une combinaison d'au moins deux enzymes, la première enzyme étant choisie parmi les xylanases de Trichoderma reesi, les xylanases d'Aspergillus aculeatus et d'Aspergillus oryzae modifié génétiquement pour la production de xylanase d'Aspergillus aculeatus, et la seconde enzyme étant choisie parmi les cellulases et les β-glucanases, pour obtenir une fraction protéique soluble de P. palmata.
3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que la première enzyme est choisie parmi les xylanases d'Aspergillus aculeatus et d'Aspergillus oryzae modifié génétiquement pour la production de xylanase d'Aspergillus aculeatus. 4. Procédé selon la revendication 2 ou 3, caractérisé par le fait que la seconde enzyme est choisie parmi les cellulases de Trichoderma reesi et Trichoderma viride et les β-glucanases dAspergillus niger et d'Humicola insolens.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisé par le fait que la première enzyme est choisie parmi les xylanases d'Aspergillus aculeatus et d'Aspergillus oryzae modifié génétiquement pour la production de xylanase d'Aspergillus aculeatus et la seconde enzyme est choisie parmi les cellulases de Trichoderma reesi.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisé par le fait que la première enzyme est choisie parmi les xylanases de d'Aspergillus aculeatus et d'Aspergillus oryzae modifié génétiquement pour la production de xylanase d'Aspergillus aculeatus et la seconde enzyme est choisie parmi les β-glucanases d'Humicola insolens.
I. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, caractérisé par le fait que la première enzyme représente de 0,01 à 10 % en poids du poids des fragments de l'algue à traiter.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 7, caractérisé par le fait que la deuxième enzyme représente de 0,3 à 10 % en poids du poids des fragments de l'algue à traiter.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 8, caractérisé par le fait que la quantité totale d'enzymes est comprise entre 5 et 20 U/g de fragment d'algue à traiter. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 9, caractérisé par le fait que le milieu d'extraction est milieu tampon choisi parmi l'acétate de sodium, les tampons phosphate tels que le phosphate de sodium, et l'oxalate de sodium.
I I. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 10, caractérisé par le fait que les fragments d'algue représentent de 1 à 15 % en poids du poids total du milieu d'extraction.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 11, caractérisé par le fait que l'étape d'extraction enzymatique est réalisée à une température comprise entre 35 et 50°C. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 12, caractérisé par le fait que le pH du milieu d'extraction est compris entre 3 et 8.
14. Fraction protéique soluble de P. palmata obtenue selon l'un quelconque des revendications 2 à 13.
15. Fraction protéique soluble selon la revendication 14, caractérisée par le fait qu'elle renferme de la R-phycoérythrine.
16. Utilisation d'une fraction protéique telle que définie à la revendication 14 dans l'industrie alimentaire, notamment à titre de complément nutritionnel dans l'alimentation humaine ou animale.
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