WO2002016556A1

WO2002016556A1 - Stem cell culture medium and culture method by using the same

Info

Publication number: WO2002016556A1
Application number: PCT/JP2001/007261
Authority: WO
Inventors: Seiji Sakano; Mick Bhatia
Original assignee: Robarts Research Institute; Asahi Kasei Corp; Asahi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Robarts Research Institute; Asahi Kasei Corp; Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 2000-08-25
Filing date: 2001-08-24
Publication date: 2002-02-28
Anticipated expiration: 2003-02-25
Also published as: EP1312668A4; US20040023324A1; EP1312668A1; CA2420416A1; AU2001280149A1

Description

明細書

幹細胞培養媒体及びそれを使用する培養方法

技術分野

本発明は、ヒト幹細胞の培養媒体及びそれを使用する培養方法に関するものである。

背景技術

ヒトの血液、リンパ液中には多種類の細胞があり、それぞれが重要な役割を担つている。例えば、赤血球は体内での酸素運搬を、血小板は止血作用を、白血球ゃリンパ球は感染を防御している。これらの多様な細胞は骨髄中の造血幹細胞に由来する。造血幹細胞は体内の種々のサイトカインゃ環境要因によって刺激されて、各種血液細胞、破骨細胞、肥満細胞などに分化することが近年明らかにされてきた。このサイト力インとして、赤血球への分化についてはエリスロポエチン

(EP0) が、白血球への分化については顆粒球コロニー刺激因子 (G-CSF) が、血小板產生細胞である巨核球への分化については血小板増殖因子（TP0) が発見されて、前者 2つは現在すでに臨床応用がなされている。

各種血液疾患の治療法として行われる骨髄移植とは、この造血幹細胞を移植することを意味し、最近では末梢血もしくは臍帯血由来の造血幹細胞を用いる方法もとられる様になって来ており、現在はこれらを総称して造血幹細胞移植とされている。これらの中でも、臍帯血由来造血幹細胞移植は、提供者への負担が少なく、さらに造血幹細胞の質が高い点から、将来は骨髄移植を完全に代替すると考えられている。

しかしながら、 500 例を超える小児患者への臍帯血由来造血幹細胞移植の結果、移植後の正常造血能への回復期間は移植細胞数と負の相関を持ち、体重と正の相関を持つ（Rubinstein P. et al.， New England J. Med.， 339， 1565- 77， 1998)。この点から臍帯血由来造血幹細胞移植を成人へ適応すると、その回復期間が極めて長くなり、感染症などのリスクの増大と長期間の入院を余儀なくされる。したがつて、これらの臍帯血由来造血幹細胞を体外で培養増幅できれば、入院期間の短縮化と成人への臍帯血由来造血幹細胞移植をより安全に行うことが出来ると期待される。

また、骨髄移植においては、通常は 500mlから 1 リットルを正常ドナ一より採取するが、この際ボランティアであるドナ一は全身麻酔と数日間の入院が必要で、なおかつ、この採取時に可能性は極めて少ないが麻酔事故などにより、最悪の場合死亡することもありえる。もし、骨髄検査で行われている程度の少量の採取ですませて、培養で造血幹細胞の増幅が可能となれば、骨髄提供者にとって全身麻酔、入院の必要性はなくなり、この様な事故は起こり得なくなる。これらの観点から、骨髄由来造血幹細胞の増幅にはメリットがある。

さらに、血液細胞を対象とした遺伝子治療への応用のためには、造血幹細胞を体外で培養する必要があり、さらに増幅することが可能となれば、遺伝子導入造血幹細胞数を高めることができ、疾患治癒の頻度を上げることが出来ると期待される。しかしながら、現時点での造血幹細胞培養の条件はまだ満足行くものではない。

発明の開示

本発明の課題は、この様な世の中のニーズに対して、造血幹細胞の新しい培養媒体及びそれを使用する造血幹細胞の培養方法を提供することにある。

ノッチ（Notch) はショウジョゥバエで発見された神経細胞の分化制御に関わるリセプター型膜蛋白質であり、無脊椎動物、脊椎動物の分類を越えた広い動物種から見いだされている。このノツチリセプターを活性化して細胞の分化を抑制するシグナルを伝達するリガンド分子としては、ショウジョゥバエノツチのリガンドとしてショウジヨウバエデルタ（Del ta) およびショウジヨウバエセレイト（Ser rate)の 2つが見いだされており、リセプ夕一のノツチと同様に広い動物種からノッチリガンドホモログが見いだされている（Artavanis- Tsakonas et al. , Scie nce 285, 770-776, 1999) 。

特にヒト分子の遺伝子クロ一ニングに関して、ヒトノツチホモログは 4種類の分子が報告され、ヒトノッチリガンドに関しては 5種類の分子が報告されている c 詳細には、デルタ型リガンドとしてヒトデルタ一 1 (別名ヒト DLL1。本願ではヒトデルター 1 とする）、ヒトデルタ一 2 (別名ヒト DLL4。本願ではヒトデルター 2とする）、ヒトデルター 3 (別名ヒト DLL3。本願ではヒトデル夕一 3とする）が、セレイト型リガンドとしてヒトジャグドー 1 (別名ヒトセレイト一 1。本願ではヒトジャグドー 1 とする）、ヒトジャグドー 2 (別名ヒトセレイト一 2。本願ではヒトジャグドー 2とする）が 2000年 6月末時点までに報告されている。代表的な引用文献として、ヒトデルター 1は、国際公開番号 W097/19172 および Gray et al. , Am. J. Pathol. 154, 7 85-795, 1999 がある。ヒトデルター 2は、国際公開番号 W098/51799 および Shutter et al. , Genes Dev. 14, 1313- 1318， 20 00がある。ヒトデルタ一 3は、日本公開特許公報特開平 11- 299493及び Bulman etal. , Nature Genet ics 24， 438-441， 2000がある。また、ヒトジャグドー 1は国際公開番号 W096/27610、国際公開番号 W097/19172及び Oda et al. , Genomics 43， 376-379, 1997 がある。ヒトジャグドー 2は国際公開番号 W098/02458及び Luo et al. , Mol. Cel l. Bi ol. 17, 6057- 6067， 1997がある。

これらノツチリガンド分子について、色々な細胞の分化を抑制することが知られている。たとえば、ラットノッチリガンドの一っラットジャグドー 1は筋肉未分化細胞株の分化抑制作用を有していることが示されている（Lindsel l et al. , C el l 80, 909-917, 1995)。

一方、血液細胞に関しては、これら 5種のヒトノッチリガンドが血液細胞の分化を抑制することは、国際公開番号 W097/19172、国際公開番号 W098/02458 、国際公開番号 W098/51799、日本公開特許公報特開平 11- 299493 に示され、コロニーを形成する血液未分化細胞、 LTC - 1 Cで測定される血液未分化細胞に対する作用が示され、造血幹細胞の体外培養に関する用途について開示されている。また、これらの公報において、ヒトノッチリガンド蛋白質の作製方法は示されている。しかしながら、ヒトノッチリガンドの造血再構築能を有する造血幹細胞に対する作用は十分に示されておらず、またヒトノツチリガンドを利用した造血再構築能を有する造血幹細胞の望ましい培養条件に関しても不明であった。また、はじめに述べたように、臨床上の利用用途から見た場合、造血幹細胞の体外培養においては、患者の造血再構築能を有している造血幹細胞を増幅することが最も望まれている。しかしながら、このような評価をヒトで行うことは事実上不可能である。したがって、ノッチリガンドを用いた体外培養に関して最も望ましい有効性を示す代表的な評価方法として、免疫不全マウス、羊の胎児などにヒト造血幹細胞を移植する異種移植モデルによる評価があげられる。これらのことから、本発明ではヒトノッチリガンドの造血再構築能を有する造血幹細胞の評価方法として、免疫不全マウス、すなわち N0D/SCIDマウスを用いた評価手法で検討を行った。

また、別の造血幹細胞の評価系として、造血幹細胞の細胞表面蛋白の発現による評価も行った。ヒト造血幹細胞の細胞表面蛋白質としては CD34抗原が知られており、特により未分化な表面抗原として CD34抗原陽性、 CD38抗原陰性、細胞分化抗原陰性があることが知られている。また、ヒト臍帯血由来造血幹細胞を用いた過去の検討から CD34抗原陽性、 CD38抗原陰性、細胞分化抗原陰性のタイプの細胞にのみ高頻度に NOD/SC I Dマウスで検出される造血再構築能を有する造血幹細胞が存在することが明らかとされている（Bhat ia et al.， Pro Nat l. Acad. Sci. U. S. A. 94， 5320-5325， 1997)。したがって、この表面抗原を有している細胞の増幅を調ベることにより、造血再構築能を有する造血幹細胞の質的な変動を調べることが出来る。これらのことから、本発明ではヒトノッチリガンドの造血再構築能を有する造血幹細胞の評価方法として、 CD34抗原陽性、 CD38抗原陰性細胞分化抗原陰性細胞群の細胞数頻度をフ口一サイトメ一夕一で検出する評価手法でも検討を行つた。また、以下本願において CD34抗原陰性、細胞分化抗原陰性細胞は CD34+CD3 8一細胞とする。

これらの評価方法を用いて、鋭意工夫を重ねた結果、ヒトノッチリガンドを利用した培養条件下において、上記の NOD/SC I Dマウスを用いる方法および上記の細胞表面抗原を調べる方法で調べた結果、ヒトノツチリガンドを含まない条件に比ベて造血再構築能を有する造血幹細胞を増幅することが可能であることが明らかとなり、本発明を完成した。 '

本発明はヒトノツチリガンド蛋白質を有効成分としヒト幹細胞を含む細胞を培養してヒト幹細胞の数もしくは頻度を維持もしくは増幅する活性を有する培養媒体に関する。

さらに、この培養媒体を用いるヒト幹細胞とヒトノッチリガンド蛋白質が接触する条件でヒト幹細胞を含む細胞を培養して、ヒト幹細胞の数もしくは頻度を維持もしくは増幅する培養方法に関する。

本発明における前記培養媒体及ぴ培養方法において使用されるヒト幹細胞には、ヒト造血幹細胞、 SRC(Scid Repopulating Cells) 活性陽性であるヒト細胞、ヒト CD34抗原陽性 CD38抗原陰性細胞等がある。また、ヒトノッチリガンド蛋白質として、ヒトデルタ一 1 蛋白質、ヒトデル夕一 2蛋白質、ヒトデルター 3 蛋白質、ヒトジャグド一 1 蛋白質及ぴヒトシヤグド一 2蛋白質からなる群より選ばれる少なくとも 1種のヒトノッチリガンド蛋白質が用いられる。

さらに、ヒト幹細胞を培養する培養媒体に増殖因子が含まれていてもよい。増殖因子としては、ステムセルファクタ一（SCF) 、エフエルティ一 3 リガンド（FLT -3D. インタ一ロイキン 3(IL-3) 、インターロイキン 6(IL- 6) 、顆粒球コロニー刺激因子 (G-CSF) 、およびフアイプロネクチンからなる群から選択される少なくとも 1種の増殖因子がある。

すなわち、本発明は、次の培養媒体及びそれを用いるヒト幹細胞の培養方法に関する；

(1) ヒトノッチリガンド蛋白質を有効成分として含有し、ヒト幹細胞を含む細胞を培養してヒト幹細胞の数もしくは頻度を維持もしくは増幅する活性を有する培養媒体。

(2) さらに増殖因子が含まれる前記 (1)の培養媒体。

(3) ヒトノッチリガンド蛋白質が、ヒトデルタ一 1蛋白質、ヒトデルター 2蛋白質、ヒトデル夕一 3蛋白質、ヒトジャグド一 1蛋白質およびヒトジャグド一2 蛋白質からなる群より選択される少なくとも 1種のヒトノツチリガンド蛋白質である前記 ( 1 )または (2)に記載の培養媒体。

(4) ヒト幹細胞が造血再構築能を有するヒト造血幹細胞である前記 (1)〜 )のいずれかの培養媒体。

(5) ヒト幹細胞が、 SRC(Scid depopulating Cells) 活性陽性細胞及びヒト CD34 抗原陽性 CD38抗原陰性分化抗原陰性細胞よりなる群から選択される少なくとも 1種のヒト幹細胞である前記 (1)〜 )のいずれかの培養媒体。

(6) 増殖因子が、ステムセルファクタ一（SCF) 、エフエルティ一 3 リガンド（FLT -3D, インタ一ロイキン 3(IL- 3) 、インターロイキン 6GL- 6) 、顆粒球コロニ一刺激因子 (G-CSF) 及びフアイプロネクチンからなる群より選択される少なくとも 1種の増殖因子である前記 (2)〜(5)のいずれかの培養媒体。

(7) ヒト幹細胞とヒトノツチリガンド蛋白質とが接触する条件で前記 (1)〜(6)のいずれかの培養媒体を用いてヒト幹細胞を含む細胞を培養してヒト幹細胞の数もしくは頻度を維持もしくは増幅する培養方法。

(8) ヒト幹細胞が、造血再構築能を有するヒト造血幹細胞である前記 (7)の培養方法。

(9) ヒト幹細胞が、 SRCCScid Repopulat ing Cel ls)活性陽性細胞及ぴヒト CD34抗原陽性 CD38抗原陰性分化抗原陰性細胞より選択される少なくとも 1種のヒト幹細胞である前記 (7)の培養方法。

以下、本発明を詳細に説明する。

遺伝子操作に必要な cDNAの作製、ノーザンプロットによる発現の検討、ハイブリダィゼーシヨンによるスクリーニング、組換え DNAの作製、 DNA の塩基配列の決定、 cDNAライブラリーの作製等の一連の分子生物学的な実験は通常の実験書に記載の方法によって行うことができる。前記の通常の実験書としては、たとえば、 Maniat isらの編集した Molecular Cloning, A laborartory manual, 1989, Eds. , Sambrook, J. , Fr i tsch, B. F. , and Maniatis, T. , Cold Spring Harbor Loboratory Press を挙げることができる。

本発明で記載する「ヒト幹細胞」とはヒト胎児もしくは成人組織由来であり、複数の細胞系列に分化可能な細胞として定義され、このなかにはヒト神経幹細胞、ヒト間葉系幹細胞、ヒト造血幹細胞、ヒト肝臓系幹細胞などが含まれる。また、

「ヒト造血幹細胞」とはヒト胎児もしくは成人組織由来であり、血液を構成するあらゆる血液細胞に分化可能な細胞として規定される。これには、造血再構築能を有するヒト造血幹細胞が含まれる。また、このヒト幹細胞をより機能的に定義した rSRCCScid Repopulating Cells)活性陽性であるヒト細胞」とは本発明の実施例もしくは Bhat ia et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94, 5320-5325, 1997 ; D ick et al.， Stem Cel ls 15 Suppl. l, 199-203 ; 204-207， 1997 および Eaves et a し Ann. NY Acad. Sci. 872， 1-8， 1999に記載されている手法で検出されるヒト幹細胞として定義される。またさらに、このヒト幹細胞を具体的に細胞膜蛋白質を用いて定義した「ヒト CD34+ CD38" 細胞」は本発明の実施例に示した方法などで市販の抗体を用いて測定されたヒト幹細胞である。また、本発明で記載する「造血前駆細胞」とは、本発明実施例で示した方法、すなわち血液コロニーアツセィなどで同定が可能な特定の血液系列に分化することが運命づけられた血液細胞群の総称である。

また、本発明で記載する増殖因子とは、細胞の増殖を促す因子の総称であり、その形態として遊離型蛋白質、細胞膜蛋白質などの形態によらないが、何らかの細胞の増殖を促す作用が文献上などで記述されている因子を意味する。たとえば、増殖因子としては、ステムセルファクタ一（SCF) 、エフエルティ一 3 リガンド（F LT-3L)、インタ一ロイキン 3(IL-3) 、インタ一ロイキン 6(IL- 6) 、顆粒球コロニ —刺激因子 (G- CSF) などが挙げられる。また、本発明においては、一般に接着分子、細胞外マトリックス分子として総称される分子群も、それらの機能が細胞増殖に関連していることから広義の増殖因子として、本発明においては増殖因子に含まれる。たとえば、ファイブロネクチンが代表的な例として挙げられる。

また、本発明においてヒトノツチリガンド蛋白質とは哺乳類で見出されている少なくとも 4種類のノツチリセプ夕一（ノッチ一 1〜4 ) を通して、いわゆるノツチシグナルの伝達を行う蛋白質の総称である。より具体的には実施例に示した分子を含むヒトデルタ一 1、ヒトデルタ一 2、ヒトデルター 3、ヒトジャグド一 1、ヒトジャッグドー 2などが含まれる。また、特にヒトノッチリガンド蛋白質と示した場合、その分子形態としては国際公開番号 W097/19172、国際公開番号 WO 98/02458、国際公開番号 W098/51799、および日本公開特許公報特開平 11- 299493 に記述されている細胞外蛋白質（ポリペプチド）、細胞外部分蛋白質（ポリぺプチド）、 DSLドメイン（ポリペプチド）などの総称として示され、上記のノッチシグナルの伝達を起こすことが出来る蛋白質として規定される。この場合、ノッチシグナルの伝達とは、ノツチリセプターを介して細胞に何らかの変化を起こすことをノツチシグナルとして示すことが出来る。

さらに、ノッチリガンド蛋白質の存在形態について、多量体構造を有する構造体もある。例えば、本発明で使用したヒト IgGの Fc部分とのキメラ蛋白質は、国際公開番号 W097/19172、国際公開番号 W098/02458、国際公開番号 W098/51799、および日本公開特許公報特開平 11-299493 に記載されているように二価の蛋白質となっている。この様に複数価、すなわち多量体として存在する分子は一般的に一価、すなわち単量体として存在する分子よりその活性が強いと期待できる。これらの方法として、ヒト IgG の Fc部分とのキメラ蛋白質として発現させて抗体のヒンジ部分によりジスルフィド結合をした多量体として発現させる方法、また、抗体認識部位を C末端もしくは N末端に発現するキメラ蛋白質として発現させ、発現させたヒトノツチリガンド蛋白質の細胞外部分を含むポリペプチドを C末端もしくは N末端の抗体認識部位を特異的に認識する抗体と反応させることにより多量体を形成させる方法が挙げられる。

さらに、別の方法として、抗体のヒンジ領域部分のみとの融合蛋白質を発現させて、ジスルフイド結合にて 2量体を形成させる方法、もしくはその他のヒトノツチリガンド蛋白質の活性に何等影響を与えない方法でジスルフィド結合を生じさせる形のぺプチドを C末端、 N末端もしくはその他の部位に発現するように作成された融合蛋白質から構成された二量体以上の高い比活性を有する多量体型ヒトノッチリガンドを得ることもできる。また、さらにヒトノッチリガンド蛋白質の群の中から選ばれる 1つ以上の蛋白質を遺伝子工学的に 2つ以上直列にもしくは並列に並べ多量体構造を発現させる方法などもある。その他、現在知られている二量体以上の多量体構造を持たせるあらゆる方法が適応可能である。したがつて、遺伝子工学的な技術により作製される二量体もしくはそれ以上の形態を有する形のヒトノッチリガンド蛋白質に関しても本発明に含まれる。

また、その他の方法として、化学的な架橋剤を用いて多量体化する方法が挙げられる。例えば、リシン残基を架橋するジメチルスべ口イミデート 2塩酸塩など、システィン残基のチオール基で架橋する Ν-( γ—マレイミドプチリルォキシ）スクシンイミドなど、ァミノ基とアミノ基を架橋するグルタールアルデヒドなどが挙げられ、これらの架橋反応を利用して、二量体以上の多量体を形成させることができる。したがって、化学的な架橋剤により作製される二量体もしくはそれ以上の多量体の形態を有す形のヒトノッチリガンド蛋白質も本発明に含まれる。本発明において培養媒体とは、細胞培養で直接細胞に接触するものの総称を意味し、具体的には培養培地、培養容器が含まれる。また、細胞培養時に添加するセルロースゃァガロースで構成される培養担体なども含まれる。ノッチリガンド蛋白質の存在形態としては、上記に述べたような分子形態を持つ蛋白質が、細胞培養用の培地中に溶けて存在する場合と固体表面などに存在する場合がある。固定化の方法としては、静電的な蛋白質の吸着による方法と蛋白質のアミノ基、力ルポキシル基を利用したり、適当なスぺ一サーを用いたり、上記の多量体化で用いられる架橋剤を使用したりして、培養容器に蛋白質を共有結合させることができる。

実施例 4並びに 5に示した様に、ヒトノッチリガンド蛋白質を有効成分として含みヒト幹細胞を含む細胞を培養してヒト幹細胞の数もしくは頻度を維持もしくは増幅する活性を有する培養媒体の例として、これら実施例で使用した培地が挙げられる。さらに、上記で示した色々な形態を有するヒトノツチリガンド蛋白質が利用できる。

この効果に関しては実施例 4に示した様にヒト造血幹細胞マーカー、すなわち CD34⁺ CD38- で特徵づけられるヒト幹細胞の数もしくは頻度を増やす事が出来る。また、実施例 5で示した様に N0D/SCIDマウス移植モデルでヒト幹細胞として検出されるヒト幹細胞の数もしくは頻度を増やす事が出来る。

本発明において「数もしくは頻度」と規定しているが、この「数」とは絶対数を意味し、個数として数えられるものである。また、「頻度」とは確率的な存在頻度を意味し、確率的に規定されるものである。たとえは'、「頻度」が 10分の 1 であったものが、 5分の 1になれば「頻度」が増加した、すなわち存在確率が増加したこととなる。

図面の簡単な説明

図 1は、実施例 1のヒトデル夕一 1蛋白質（hDel ta- l lgG)とヒトデルタ一 2蛋白質（hDel ta- 2IgG)の電気泳動（SDS-PAGE)ならびにウエスタンブロット（WB ant i -IgG) の結果を示す。

図 2は、実施例 1のヒトジャグドー 1蛋白質（Wagged- l lgG)の電気泳動（SDS- PAGE)

ならびにウエスタンブロット（WB ant i-IgG) の結果を示す。

図 3は、実施例 3のヒトデルタ一 1蛋白質及びヒトデルタ一 2蛋白質のヒト臍帯血由来細胞に対する結合特性を示す。

図 4は、実施例 3のヒトジャグドー 1蛋白質のヒト臍帯血由来細胞に対する結合特性を示す。

図 5は、実施例 4のヒトデルター 1蛋白質の添加条件下での CD34+CD38— 紬胞培養における全細胞数、全 CD34⁺CD38_細胞数、全造血前駆細胞数の経時的変化を示す。

図 6は、実施例 4のヒトデルター 2蛋白質の添加条件下での CD34+CD38— 細胞培養における全細胞数、全 CD34+CD38—細胞数、全造血前駆細胞数の経時的変化を示す。

図 7は、実施例 4のヒトジャグドー 1蛋白質の添加条件下での CD34+CD38— 細胞培養における全細胞数、全 CD34+CD38—細胞数、全造血前駆細胞数の経時的変化を示す。

図 8は、実施例 5のヒトデルタ一 1蛋白質で処理した細胞を移植された N0D/SC IDマウスの骨髄細胞のキメリズムのサザンプロットデ一夕を示す。

図 9は、実施例 5のヒトジャグド一 1蛋白質で処理した細胞を移植された NOD/ SCIDマウスの骨髄細胞のキメリズムの経時的変化を示す。

図 1 0は、実施例 5のヒトジャグド一 1蛋白質で処理した細胞を移植された NO D/SCIDマウスの骨髄細胞のキメリズムのサザンブロットデータを示す。

発明を実施するための最良の形態

以下に発明を実施する形態について実施例を示すが、必ずしもこれらに限定されるものではない。

〔実施例 1〕

ヒトノッチリガンド細胞外蛋白質の作製

ヒトノッチリガンドの細胞外部分とヒト IgGlの Fc部分との融合蛋白質はヒトデルター 1については国際公開番号 W097/19172に記述の方法に従い、ヒトデルタ一 2 に関しては W098/51799に記述の方法に従い、またヒトジャグドー 1に関しては国際公開番号 W097/19172に記述の方法に従い、各々作製、.精製した。

すなわち、上記の公報に記載されている方法に従い、各種発現べクタ一を作製した。それらはヒトデルター 1 とヒト IgGFc キメラ蛋白質（以下、 DlFcとする）の発現べクタ一、ヒトデルタ一 1 と FLAGキメラ蛋白質（以下、 D1FLAGとする）の発現ベクター、ヒトデルター 2とヒト IgGFc キメラ蛋白質（以下、 D2Fcとする）の発現べクタ一、ヒトデルタ一 2と FLAGキメラ蛋白質（以下、 D2FLAGとする）の発現べクタ一、ヒトジャグドー 1 とヒト IgGFc キメラ蛋白質（以下、 JlFcとする ) の発現べクタ一、およびヒトジャグド一 1と FLAGキメラ蛋白質（以下、 J1FLAG とする）の発現べクタ一である。これら発現ベクターにはネオマイシン耐性遺伝子を有しているため、遺伝子導入細胞はネオマイシンを添加した培地中で選別した。これら発現べクタ一を CH0 細胞にエレクトロボレ一シヨン法にて遺伝子導入した。これらの細胞を無血清培地にて培養し、その上清を集めた。この集められた上清を ProteinAセファロ一スゲル（アマシャムフアルマシア社製）もしくは an t i-FLAG抗体が固定化されたセファロ一スゲル（シグマ社製）で作成されたカラムに流して、濃縮精製した。このようにして濃縮精製したリガンド蛋白質を更にゲル濾過にて精製し、同時に PBS (-）に buffer置換を行い、精製分離されたヒトノツチリガンド細胞外蛋白質を得た。これら精製蛋白質のヒト IgG キメラ蛋白質の SDS- PAGE結果と ant i-hmnanig羊抗体によるゥヱスタンブロット結果を図 1並びに図 2に示す。なお、図中のマーカ一は、アマシャム—フアルマシアバイオテク社のレインポーマーカ一を使用した。

〔実施例 2〕

臍帯血由来造血幹細胞の精製

ヒト臍帯血を - MEM (Gibco BRし社製）にて数倍に希釈し、フイコールパック (スエーデン国フアルマシア社製）による比重遠心分離法により低密度細胞画分 (く 1. 077g/ml)を分画して、臍帯血単核細胞を分離した。また、これらの細胞から分化抗原を発現している細胞を SteraCel l Technologies社製の Human Primi t ive Progenitor Enrichment Cocktai lを用い、磁気ビーズによるカラム法 StepSep^TM で分化抗原陰性細胞（Lin— 細胞）を濃縮した。これらの LIN— 舳胞を Fluoresce in iso- thiocyanate(FITC)標識した CD34抗体 (Becton Dickinson社製）と al loph ycocyanin(APC)標識した CD38抗体（Becton Dickinson社製）で染色し、フローサィトメ一ター Vantage SE™ (Becton Dickinson社製）を用いて、 CD34+、 CD38-細胞を分離した。以下、この細胞を CD34+CD38—細胞とし、以下の解析に用いた。〔実施例 3〕

臍帯血単核細胞に対するノッチリガンド細胞外蛋白質の結合

実施例 1に示した方法で作製されたヒトノッチリガンド細胞外蛋白質の臍帯血単核細胞に対する結合実験を行った。なお、本結合実験を行う溶液の希釈と洗浄には 25 g/mlカルシウム、 1 %BSA(Sigma社製）を含む PBS〔-）溶液（以下、希釈洗浄液とする）を用いて行った。

始めに、細胞に反応させる溶液として、最終濃度が 10 g/nilの D1FLAG、 D2FLAG もしくは J1FLAG蛋白、最終濃度が 10 g/mlの anti- FLAGM2 抗体（Sigma社製）および添付の説明書に指示された希釈倍率で P E標識抗マウス IgG抗体 (Becton Dick inson社製）を次の Blocking溶液に希釈して調製した。 Blocking溶液は精製ヒト IgGl c (The Binding Si te 社製）を 1 πιΜ含む希釈洗浄液を調製して作製した。この細胞を反応させる溶液は細胞に反応させる前にあらかじめ調製し、氷中で 1時間放置して反応させた。

この様にして調製された細胞に反応させる溶液に臍帯血単核細胞を加え、氷中で 1時間反応させた。その後、希釈洗浄液を加えて遠心分離機で洗浄を行い、 Be cton Dickinson社製フ π—サイトメ一夕 FACScalibur で測定をおこなった。

—方、これらの実験系に対し、ヒトノッチリガンド蛋白質のヒト IgGFc キメラ蛋白質、すなわち実施例 1で作製された DlFc、 D2Fcもしくは JlFcの添加を行い、同様に測定を行った。これは上記の FLAGキメラ蛋白質の臍帯血単核細胞への結合が非特異的なものでないことを保証するためのものである。

さらに、カルシウムイオンの結合への寄与を調べるため、二価イオンをキレ一トする EDTAを最終濃度が lOraMとなるように添加して、これら結合がカルシウムィォン依存性であることの確認を行つた。

また、対象細胞として臍帯血単核細胞だけではなく、それらから分離された LI N一細胞でも同様に行った。

これらの結果を図 3にはヒトデルタ一 1 とヒトデルタ一 2に関して示し、図 4 にはヒトジャグド一 1に関して示した。

ヒトデルタ一 1は 15%程度の臍帯血単核細胞に結合し、ヒトデルタ一 2は 60% 程度の細胞に結合した。また、この結合は未標識のリガンド、すなわちヒト Jッチリガンド蛋白質のヒト IgGFc キメラ蛋白質の添加でほぼ完全にその結合が阻害された。同様に、 EDTA添加においても阻害された（図 3 ) 。また、臍帯血単核紬胞から分離された Lin-細胞に対してはヒトデルタ一 1は 10%程度、ヒトデルタ一 2は 20%程度の細胞に結合が確認された（図 3の内側の図）。

一方、臍帯血単核細胞から分離された Lin-細胞に対するヒトジャグドー 1の結合も同様に確認された（図 4 ) 。

なお、これらデータは図 3においては未染色細胞の比較区の細胞に対しての陽性細胞比率を縦軸として示し，図 4では平均蛍光強度を縦軸として示した。

これらの結果から、血液細胞に対する結合が認められ、分化抗原を発現していない臍帯血単核細胞、すなわち Lin -細胞に対してヒトノツチリガンドは結合することが明らかとなった。

〔実施例 4〕

無血清培地での CD34+CD38—細胞の培養におけるヒトノッチリガンドの効果実施例 2の方法で精製された CD34+CD38—細胞を無血淸培地で培養を行い、ヒトノッチリガンドの添加と未添加条件下で、時間を追って全細胞数、 CD34+CD38— 細胞数、および造血前駆細胞数を測定した。培養は、最初の細胞数を 500個から 2 500 個 Zゥェルとして、 96穴プレート（Becton Dickinson 社製）にて、 37で、 5 % C0₂の条件下で培養した。培養に用いた 96穴プレートはあらかじめヒトフアイブロネクチン（Becton Di ckinson 社製）に添付の説明書にしたがってコーティングを行った。また、培地は StemCel l Technologies 社製の BIT9500 を 20%含むィスコフ改変 MEM培地（IMDM)に 10 Μ ,β - メルカプトエタノール、 2mM L-グルタミンを添加したものを用いた。なお、 BIT9500 は、 BSA(Pre- buffered wi th NaHC0₃ ) 、牛脬臓由来インシュリン、鉄飽和ヒトトランスフヱリンを IMDMベースに溶解したものである。また、増殖因子として 300ng/ml ヒト Fl t3- L(R&D Systems社製 ) 、 10ng/ml ヒ ML-3CR&D Systems社製) 、 10ng/ral ヒ h IL-6(R&D Systems社製 ) 、編 g/mlヒ h SCF (Amgen社製) 、 50ng/ml ヒト G - CSF (Amgen社製) を添加した。

ノッチリガンドは実施例 1の方法で精製された DlFc， D2Fc ， JlFc を各々別々に、 2もしくは 10 z g/mlの濃度で添加し、未添加の朱処理区との比較を行った。

培養後の全細胞数は顕微鏡での計測法で測定した。また、全 CD34+CD38—細胞数は、実施例 2に示した方法で CD34+CD38—細胞の比率を測定して、全細胞数にその比率をかけ合わせてもとめた。また、造血前駆細胞数はメチルセルロース培地中でのコロニー形成法にて測定した。

コロニー形成法では、 50ng/ml ヒト SCF, 10ng/ml ヒト GM- CSF、 10ng/ral ヒト IL - 3および 3units/ml ヒトエリスロポエチンを含む StemCell Technologies社製のメチルセルロース培地 H4434にて、 37°C、 5 % C0₂の条件で 10- 14日間培養し、顕微鏡下でコロニー数とコロニー種類を峻別して計測した。コロニー種類は単球コロニー（CFU- M) 、顆粒球コロニー（CFU- G) 、顆粒球単球コロニー（CFU- GM)、赤芽球コロニ一（BFU-E) 及び混合コ αニー（CFU- GE丽）に峻別した。この値に全細胞数をかけ合わせて全コロニー形成細胞すなわち全造血前駆細胞数を求めた。

これらの結果のヒトデルタ一 1については図 5および表 1に、ヒトデルタ一 2 については図 6および表 2に、そしてヒトジャグド— 1については図 7および表 3に示した。 CO

n e

図 5に示した様に、ヒトデルタ一 1の添加により、全細胞数は特に変化は認められなかった（図 5Α) 。しかしながら、全 CD34+CD38—細胞数は未添加より多くなり、特に培養期間が 18日、 21日でその増加は顕著であった（図 5Β) 。さらに、全造血前駆細胞数は 15日までは若干少なくなる傾向が見うけられたが、 18日以降未添加より顕著に多くなつた（図 5C) 。また、表 1に示す様にこれら造血前駆細胞のコロニータイプの詳細を見ると、未添加の場合は培養期間が長くなると CFU- Μ,

CFU- Gの比率が高くなるが、ヒトデルター 1添加は逆に BFU- Ε の比率が高くなる傾向が認められた。

〔表 1〕培 * 添加 CFU-M CFU-G CFU-GM CFU- 播種効率

GE匪

〔曰） ) (%) (%) (%)

2 未添加 11.6 42.8 1.7 43.1 0.8 10.8土 6.8 Delta-1 20.5 50.0 0 28.6 1.4 47.0土 27.9

4 未添加 14.6 44.6 1.2 39.1 0.7 12.8土 5.7 hDelta-1 11.5 41.0 0.8 46.9 0 18.3土 6.8

6 未添加 27.7 35.4 2.6 33.3 1.3 30.3+ 20.3 hDelta-1 31.7 38.1 1.6 25.4 3.2 20.3土 1.9 12 未添加 34.4 20.0 5.1 30.8 9.7 32.0土 7.0 hDelta-1 24.1 26 5 1 6 43 5 4 3 26 8 5

15 未添加 18.5 58.7 4.3 18.7 0 239.0±161.0 hDelta-1 78 50 6 0 ii 7 0

18 未添加 31.7 39.4 1.0 26.9 1.0 166.5土 83.5 hDelta-1 3.9 14.1 0 79.9 2.1 43.0土 5.0

21 未添加 21.5 34.0 1.0 42.1 1.4 520.5 ±479.5 hDelta-1 11.1 20.2 0.4 66.7 1.6 140.0土 98.0

25 未添加 54.2 1 ；D4 ^.8 1.9 27.7 1.3 229.5 ± 48.5 hDelta-1 9.9 8.9 0.2 77.9 3.2 65.0土 3.0 また、図 6に示した様に、ヒトデルター 2の添加により、全細胞数は特に変化は認められなかった（図 6A) 。しかしながら、全 CD34+CD38—細胞数は、培養期間が 15日以降に顕著な増加が認められた（図 6B) 。さらに、全造血前駆細胞数は 12 曰までは若干少なくなる傾向が見うけられたが、 15日以降、未添加より多くなる傾向が確認された（図 6C) 。また、表 2に示す様にこれら造血前駆細胞のコロニ一タイプの詳細を見ると、ヒトデル夕一 1 とは異なり、ヒトデルター 2添加による違いは認められなかった。

〔表 2〕

培養添加 CFU-M BFU-B CFU- 播種効率曰数 GE隨

〔曰） (¾) (¾) (%)

4 未添加 6.3 25.6 1.8 65.4 0.9 79.8士 73.4 hDelta-2 11.5 19.7 1.0 64.9 3.3 244.3±218·9

6 未添加 11.7 23.6 1.1 50.6 13.0 18.0士 4.7 hDelta-2 12.5 21.6 1.1 64.0 0.8 38.7土 16.0

9 未添加 9.8 35.1 1.0 51.2 3.1 33.5土 10.6 hDelta-2 8.9 39.0 1.0 47.5 3.7 24.3土 4.5

12 未添加 12.7 33.0 8.7 32.0 13.5 52.0土 12.9 hDelta-2 11.6 43.6 1.3 42.3 1.3 121.7土 89.5

15 未添加 18.5 58.7 4.3 18.5 0 239.0±161.0 hDelta-2 12.7 45.8 0.3 40.0 1.2 37.0± 4.0

18 未添加 21.7 38.1 0.7 39.1 0.3 86.0土 28.0 hDelta-2 12.5 37.1 0.4 49.4 0.6 40.0± 3.0 21 未添加 21.5 34.0 1.0 42.1 1.4 520.5± 479.5 hDelta-2 18.8 33.8 0.4 44.9 2.1 112.5土 57.5

25 未添加 19.4 25.3 13.4 36.0 5.9 175.0士 49.0 hDelta-2 17.1 25.5 0.5 55.6 1.4 99.0土 54.0 一方、図 7に示した様に、ヒトジャグドー 1の添加により、全細胞数は培養期間 9日目で、有意差を持って、未添加に比べて増幅していることが確認できたが、他の培養期間では特に違いは認められなかった（図 7A) 。また、全 0034+0038_細胞数は、同様に 9日目で顕著な増幅が確認でき、さらに長い培養期間である 18日、 21日でも顕著な増加が認められた（図 7B) 。同様に、全造血前駆細胞数も 9日目で未添加より多くなる傾向が確認されたが、 15日以降では差は認められなかつた（図 7C) 。また、表 3に示す様にこれら造血前駆細胞のコロニータイプの詳細を見ると、ヒトデルタ一 1 とは異なり、ヒトジャグドー 1添加による違いは認められなかった。

〔表 3〕

培養無血清 CFU-M CFU-G CFU-GM 播種効率曰数培地へ

(曰）の添加 (¾) ω (%)

4 未添加 12.8 25.5 0.4 57.1 4.3 5.0士 1.2 hJaggea-1 12.8 28.5 0.5 55.6 2.8 6.0土 1.2

6 未添加 15.8 11.2 1.1 68.2 3.7 7.0土 1.0 hJaggea-1 13.9 13.2 1.0 69.2 2.3 16.0土 3.1

' 9 未添加 24.9 24.1 1.4 46.8 3.0 35.0土 2.5

Jagged-1 16.2 20.7 0.4 59.9 2.8 44.5土 18.4

12 未添加 19.1 28.0 1.9 50.0 1.1 75.3± 8.3 hJagged-1 14.9 43.5 1.8 39.5 0.4 110.0土 45.0

15 未添加 22.9 42.4 0.6 33.8 1.0 108.0土 59.0 hJagged-1 12.9 49.8 0.2 35.8 1.3 55.3土 18.6

18 未添加 18.5 41.9 0.5 36.1 3.1 114.0士 53.4 hJagged-1 14.0 34.1 0.7 47.7 3.4 38.3± 5.5

21 未添加 26.6 . 29.9 0.6 33.8 1.0 108.0土 59.0 hJagged-1 12.9 49.8 0.4 41.1 2.1 73.0土 22.0 25 未添加 25. 3 39. 2 3. 3 21. 1 0. 0 108. 0土 59. 0 hJagged-1 31. 7 41. 6 2. 4 30. 2 2. 2 130. 0土 31. 0 これらの結果から、ヒトノッチリガンドの添加は CD34⁺CD38—細胞数を増幅させることが明らかとなった。

〔実施例 5〕

CD34+CD38—細胞の培養における N0D/SCIDマウス造血再構築能を用いた評価手法でのヒトノッチリガンドの効果

実施例 4に示す方法で培養を行った細胞を免疫不全マウス NOD/SC IDマウスに移植を行い、およそ 60日後にヒト細胞の存在比率をサザンブロット法にて検出して評価を行った。

詳細には、 8週齢の NOD/ Sz- scid/scid(NOD/SCID)マウス（米国 Jackson研究所より購入し、 The John P. Robarts Research Inst i tute 内で維持、作製）を半致死量の放射線照射 (355 cGy) を行い、実施例 4の条件で培養を行ったヒト臍帯血由来 CD34+CD38— 細胞を尾静脈より移植した。マウス一匹に移植した細胞は培養前の細胞として 500から 2500個の CD34+ CD38— 細胞に相当する。また、 Bonnet ら（Bone Marrow Transplant 23、 203-209、 1999) の方法にしたがって、同時に放射線照射（1500rads)を行った分化抗原陽性 (LIN+) 細胞のアクセサリー細胞を移植した。

移植後 8週間経過した後、移植したマウスから骨髄細胞を取り出し、染色体 DNAを定法にて分離し分析に用いた。分離された MAの 1-2 g を制限酵素 EcoRI にて消化し、ァガロースゲルにて電気泳動し、定法にしたがってサザンプロット分析を行った。使用したプローブはヒトク口モゾ一ム 17番特異的なひーサテライ卜プローブ（pl2H8) aapidot et al. Science 255, 1134-1141, 1992) を用いた。このプローブを用いると 2. 7kb のバンドが検出される。また、キメリズムの割合を調べるため、別途調製したマウス染色体 DNAとヒト染色体 DNAを比率を変えて混合し、同様に処理を行い、キメリズムの標準データとして、同時にサザンブロットを行った。この標準キヌリズムの割合とサンプルのバンドの濃さを比較してキメリズムの割合を測定した。検出下限としては 0. 05%のキメリズムとなる。

上記の方法で求めたキメリズムデータを基にヒト細胞が検出されたマウスの割合を、ヒトデルター 1、ヒトデルタ一 2に関して表 4に示す。これらのデ一夕はヒト紬胞陽性 N0D/SCIDマウスの固体数/全移植マウス数として示した。 4日間の培養でヒトデルター 1処理区では 17匹中 9匹がヒト細胞陽性であつたが、未処理区では 17匹中 4匹の陽性にとどまり、明らかにヒトデルター 1処理によりヒト細胞移植効率が高まった。しかしながら、 6日間の培養ではこのような違いは認められなかった。また、ヒトデルタ一 2では 4日間、 6日間の培養では違いが認められなかった。

〔表 4〕

培養 4曰培養 6曰

ヒトヒトヒト細胞ヒトヒトヒト細胞細胞細胞移植効率細胞細胞移植効率陽性数陰性数（陽性数/ 陽性数陰性数（陽性数 Z 全移植数）全移植数）

% % 未処理 4 13 4/17 4 5 4/9

(23¾) (44¾) h Del ta - 1 9 8 9/17 ネ 4 6 4/10

(53¾) (40¾) 未処理 10 2/12 1 5 1/6

(17%) (17%) h Del ta - 2 2 10 2/12 0 5 0/5

(17%) ( 0¾) また、別の実験としてヒトデルタ一 1添加培養後の細胞を希釈してマウスに移植した実験結果をサザンプロットデータとして図 8に示す。この実験は、 2500個の CD34+CD38— 細胞をヒトデルター 1添加および未添加で 4日間培養し、培養後に各々 4分割して 4匹のマウスに移植してキメリズムを調べた。過去の研究から、 2500個中には平均して 2個の SRCが存在することが明らかとされている（Bhat i a et al. , J. Exp. Med. , 186, 619-624, 1997)。したがって、一般に培養前細胞を用いれば 4匹中 2匹のマウスにヒト細胞が検出される。この結果、ヒトデル夕一 1未添加では 4匹中 1匹のみヒト遺伝子が検出されたが、ヒトデルター 1添加では 4匹中 4匹ともヒト遺伝子が検出され、移植が成立していた。

これらの結果から、ヒトデルタ一 1を含む培地で培養する事により、 SRCで検出されるヒト幹細胞の数もしくは頻度が増えている事は明らかである。

次に、同様の方法でもとめたヒトジャグドー 1に関してのデータのまとめを図 9に示す。

左の図（i) は培養前細胞が 2500個から 1000個の臍帯血由来 CD34⁺CD38— 細胞の結果で右の図（i i)は 1000以下から 500個の細胞の結果である。縦軸はヒトキメリズム割合 (%) で横軸は培養日数である。また、〇は未添加のサイト力インのみで、秦はヒトジャッグド一 1添加のデータである。また、各デ一夕のヒト遺伝子が検出された割合（％) を下に示した。

前述の様に過去の研究から、 2500個中には平均して 2個の SRCが存在することが明らかとされている。 4日間、 6日間の培養では大きな差は得られなかったが、より長い培養期間 12日、 15日間ではヒトジャグド一 1の添加により、ヒト細胞が検出される割合が著しく増加した。すなわち、 2500-1000 個の細胞を移植した場合、未添加では 12日で 53%、 15日で 28%にとどまったが、ヒトジャグド一1添加では 12日で 100 %、 15日で 87%にヒト細胞が検出された。また、 1000-500個を移植した場合、未添加では 12日で 17%、 15日で 0 %にとどまったが、ヒトジャグドー 1添加では 12日で 83%、 15日で 71 %にヒト細胞が検出された。

また、別の実験としてヒトジャグド一 1添加培養後の細胞を希釈してマウスに移植した実験結果をサザンプロットデータとして図 1 0に示す。この実験は、 25 00個の CD34+CD38—細胞をヒトジャグドー 1添加および未添加で 12日間もしくは 15 日間培養し、培養後に各々 4分割して 4匹のマウスに移植してキメリズムを調べた。前述の様に、過去の研究から、 2500個中には平均して 2個の SRCが存在することが明らかとされている。したがって、一般に培養前細胞を用いれば 4匹中 2 匹のマウスにヒト細胞が検出される。この結果、 12日間の培養で、ヒトジャグド ― 1未添加では 4匹中 2匹のみヒト遺伝子が検出されたが、ヒトジャグドー 1添加では 4匹中 4匹ともヒト遺伝子が検出された。また、 15日間の培養においては、未添加では 4匹中 2匹のみヒト遺伝子が検出されたが、ヒトジャク 'ド一 1添加では 4匹中 3匹ともヒト遺伝子が検出された。また、サザンプロットのバンドの濃さはヒトジャグドー 1添加の方が明らかに濃い。このことは、ヒト細胞が検出されたマウスの各々により高頻度にヒト細胞が存在していた事が判る。これらの結果から、ヒトジャグドー 1を含む培地で培養する事により、 SRC で検出されるヒト幹細胞の数もしくは頻度が増えている事は明らかである。

また、これらのノッチリガンド存在下で培養した細胞を移植されたマウスの骨髄のヒト由来細胞を各種ヒト抗原を認識する抗体で定法にしたがって染色し、 FA CSを用いて観察した。その結果、各種ノツチリガンド添加においてもリンパ球系（CD19, CD20)、顆粒球系（CD15， CD33)、未分化細胞 (CD34, CD38) などの系統の細胞もすベて生み出されていることが確認された。

産業上の利用可能性

本発明によれば、造血再構築能を有するヒト幹細胞の数もしくは頻度を増幅でき、ヒト幹細胞の体外増幅が可能となる。

Claims

請求の範囲 . ヒトノッチリガンド蛋白質を有効成分として含有し、ヒト幹細胞を含む細胞を培養してヒト幹細胞の数もしくは頻度を維持もしくは増幅する活性を有することを特徵とする培養媒体。

. さらに増殖因子が含まれる請求の範囲 1記載の培養媒体。

. ヒトノッチリガンド蛋白質が、ヒトデルタ一 1蛋白質、ヒトデルタ一 2蛋白質、ヒトデルタ一 3蛋白質、ヒトジャグド一 1蛋白質およびヒトジャグドー 2 蛋白質からなる群より選択される少なくとも 1種のヒトノツチリガンド蛋白質である請求の範囲 1または 2に記載の培養媒体。

. ヒト幹細胞が造血再構築能を有するヒト造血幹紬胞である請求の範囲 1〜 3 のいずれかに記載の培養媒体。

. ヒト幹細胞が、 SRCCScid Repopulat ing Cells)活性陽性細胞及びヒト CD34抗原陽性 CD38抗原陰性分化抗原陰性細胞よりなる群から選択される少なくとも 1 種のヒト幹細胞である請求の範囲 1〜3のいずれかに記載の培養媒体。

. 増殖因子が、ステムセルフアクター（SCF) 、エフエルティ一 3 リガンド (FLT -3D. インタ一ロイキン 3(IL-3) 、インタ一ロイキン 6GL-6) 、顆粒球コロニ一刺激因子（G- CSF) 及びファイブロネクチンからなる群より選択される少なくとも 1種の増殖因子である請求の範囲 2〜 5のいずれかに記載の培養媒体。. ヒト幹細胞とヒトノッチリガンド蛋白質とが接触する条件で請求の範囲 1〜 6記載のいずれかの培養媒体を用いてヒト幹細胞を含む細胞を培養してヒト幹細胞の数もしくは頻度を維持もしくは増幅することを特徴とする培養方法。. ヒト幹細胞が、造血再構築能を有するヒト造血幹細胞である請求の範囲 7記載の培養方法。

. ヒト幹細胞が、 SRCCScid Repopulat ing Cel ls)活性陽性細胞及びヒト CD34抗原陽性 CD38抗原陰性分化抗原陰性細胞より選択される少なくとも 1種のヒト幹細胞である請求の範囲 7記載の培養方法。