WO2002052032A1 - Procede servant a mesurer la mort cellulaire de cellules ciblees - Google Patents

Procede servant a mesurer la mort cellulaire de cellules ciblees Download PDF

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    • G01N2510/00—Detection of programmed cell death, i.e. apoptosis

Definitions

  • the present invention relates to a novel method for measuring cell death of a target cell.
  • a method for detecting cell death that does not involve the handling of RI
  • a method for detecting cytotoxicity by measuring ⁇ -galata tosidase that leaks out of cells due to cell death in the example of JP-A-10-215868 is described. Detects cytotoxic activity dependent on the major tissue-compatibility complex (MHC) of the cells.
  • MHC major tissue-compatibility complex
  • cytotoxic activity of cytotoxic ⁇ cells can be measured even when the amount of MHC-restricted antigen in target cells is small (Christinck ER et al., Nature 352 ( 1991), 67-70), ADCC activity depends on the amount of antigen expressed as a membrane protein in target cells, and ADCC activity cannot be measured when the amount of antigen is small (Ontomo T. et al. Biochemical and Biophysical Research, ommu nications 258 (1999), 583-591). That is, cells containing ADCC activity In order to measure cell death induced by a reaction caused by a membrane protein, target cells must stably express the membrane protein
  • the present invention uses a target cell that expresses a sufficient amount of a membrane protein to induce cell death by a reaction caused by the membrane protein, and that expresses a non-RI marker.
  • An object of the present invention is to provide a method for measuring cell death of a target cell by detecting a marker that leaks out of the cell.
  • the present inventors can stably express both a gene encoding a membrane protein capable of inducing cell death and a gene encoding a marker protein. Transformed cells were successfully constructed, and the present invention was completed.
  • the present invention provides a method for measuring cell death of a target cell, comprising the steps of: injecting a target cell containing a gene encoding a membrane protein capable of inducing cell death and a gene encoding a marker protein; It is intended to provide a method characterized by measuring a marker protein leaking out of a cell.
  • the membrane protein capable of inducing cell death may be any protein capable of inducing cell death by binding of an antibody or a ligand to a cell, and is, for example, an M1.24 antigen (BST-2) protein or a Fas antigen protein.
  • the incubation is preferably performed in the presence of an antibody or a ligand against a membrane protein capable of inducing the cell death.
  • the incubation is preferably carried out in the presence of effector cells.
  • the target cell is preferably a cell from which a stable expression system for a membrane protein can be obtained.
  • the target cells are preferably CH0 cells.
  • the mer The kerr is preferably an enzyme.
  • the marker is preferably j8 galata tosidase.
  • the present invention also provides a method for screening a substance that induces or suppresses cell death of a target cell, comprising a gene encoding a membrane protein capable of inducing cell death and a gene encoding a marker protein.
  • the present invention provides a method comprising incubating a target cell with a test substance and measuring a marker protein which leaks out of the cell due to cell death.
  • the membrane protein capable of inducing cell death is an antibody or a protein. Any substance that induces cell death by binding gand can be used, such as HM1.24 antigen (BST-2) protein or Fas antigen protein.
  • the incubation is preferably performed in the presence of an antibody or a ligand against the membrane protein capable of inducing the cell death.
  • the incubation is preferably performed in the presence of effector cells.
  • the target cell is preferably a cell from which a stable expression system for a membrane protein can be obtained.
  • the target cells are preferably CH0 cells.
  • the marker is preferably an enzyme.
  • the marker is preferably) 3 galactosidase.
  • the present invention also relates to a target cell for use in a method for measuring cell death of a target cell or for screening a substance that induces or suppresses cell death of a target cell, and encodes a membrane protein capable of inducing cell death. It provides a cell containing a gene and a gene encoding a marker protein, and leaking the marker protein by cell death induced by a reaction caused by the membrane protein.
  • the membrane protein capable of inducing cell death may be any protein capable of inducing cell death by binding of an antibody or a ligand, such as HM1.24 antigen (BST-2) protein or Fas antigen protein. .
  • the marker protein is leaked by the incubation in the presence of an antibody or a ligand for the membrane protein.
  • the marker protein is leaked by incubation in the presence of effector cells.
  • the target cell is preferably a cell from which a stable expression system for a membrane protein can be obtained.
  • the target cells are preferably CH0 cells.
  • the marker is preferably an enzyme.
  • the marker is preferably / 3 galata tosidase.
  • FIG. 1 is a graph showing that ⁇ antigen is expressed in cells expressing ⁇ -galactosidase by the introduction of p] 3-gal-IRES2-EGFP-F.
  • FIG. 2 shows the results of transfection of p-galactosidase expressing cells by introduction of pj3-gal-IRES2-EGFP-F.
  • FIG. 3 is a graph showing the activity of] 3 galactosidase in the medium, which shows that] 3 galactosidase is expressed.
  • FIG. 3 is a graph showing that green fluorescent protein (EGFP-F) is expressed in the same cells as in FIG. Comparison of Figures 2 and 3 shows that there is a level correlation between
  • EGFP-F green fluorescent protein
  • FIG. 5 is a graph showing that cytotoxicity, that is, leakage of ⁇ -galata tosidase out of the cell, occurs depending on the concentration of the cells.
  • FIG. 5 shows the experimental system of FIG. FIG. 4 is a graph showing that the marker protein is detected when there are 100 or more lysed cells, and that the marker protein is not leaked out of the cells unless the cells are lysed.
  • FIG. 6 is a graph showing that antibody-dependent cytotoxicity and antibody-independent cytotoxicity can be observed by stimulating commercially available PBMC with IL-2 in the experimental system of FIG. Embodiment of the Invention
  • the membrane protein capable of inducing cell death may be any protein capable of inducing cell death by binding of an antibody or a ligand, such as HM1.24 antigen (BST-2) protein and Fas antigen protein. , IAP, erbB2 and the like.
  • the HM1.24 antigen protein is an antigen recognized by an anti-HM 1.24 antibody (Goto T. et al., Blood 84 (1994), 1922-1930) prepared by Tokushima University Kosaka et al.
  • the anti-HM1.24 antibody is a mouse monoclonal antibody obtained using the human myeloma cell line KPC-32 as an immunogen, and recognizes the HM1.24 antigen highly expressed on the surface of myeloma cells. It has been shown to induce ADCC activity in the presence of one cell and to exhibit antitumor activity (Ozaki S. et al., Blood 90 (1997), 3179-3186).
  • the 1.24 antigen protein recognized by this antibody is a membrane protein with a molecular weight of 29-33 kDa.
  • BST- is highly expressed in stoma cells from myeloma or rheumatoid arthritis patients. 2 (Ishikawa J. et al., Genomics 26 (1995), 527-534) became apparent (Ohtomo T. et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 258 (1999)). , 583-591).
  • Fas antigen protein / CD95 is a protein belonging to the TNF-family of receptors that exists on the cell membrane and has a Death Domain in the cell (Yonehara S. et al., J. Exp. Med. 169 ( 1989) 1747-1756), Fas Zigand (Cheng J. et al., Science 263 (1994) 1759) and apoptosis by an anti-Fas antibody with agonism (Cifone MG et al., J. Exp. Med. 180 (1994) 1547) It is known as a protein that induces
  • the target cell of the present invention is a cell that can induce cell death, for example, a cell that undergoes cell death, for example, apoptosis and dies by the marauding 1.24 antigen (BST-2) protein, Fas antigen protein, or the like.
  • Animal cells such as CH0 cells, 293 cells, L cells, NIH / 3T3 cells, and the like can be preferably used.
  • the marker protein of the present invention can be expressed in the target cell simultaneously with the protein capable of inducing the cell death, and is a marker that leaks out of the cell upon cell death and is itself detectable. Any substance that has a function or can be labeled with a detectable marker may be used.
  • marker protein examples include enzymes such as i3 galactosidase, / luciferase, phenol rephosphatase, and phenol oxidase; and luminescent substrates such as noresiferin and CSPD (TR0PIX). , Galacton star (TR0PIX) or the like can be used.
  • Detection of 3 galactosidase can be performed, for example, as follows.
  • This chemiluminescence can be measured using an optical instrument such as ARV0- S x5 (WALLAC).
  • the membrane protein capable of inducing cell death is the band 1.24 antigen (BST-2) protein
  • target cells capable of expressing this protein and marker protein An antibody against the HM1.24 antigen (BST-2) protein and an effector cell
  • BST-2 an antibody against the HM1.24 antigen
  • effector cell Incubate in the presence of
  • target cells capable of simultaneously expressing this protein and a marker protein are incubated in the presence of a ligand of the Fas antigen protein. do it.
  • effector cells peripheral blood mononuclear cells (PBMC), NK cells, cytokine-stimulated monocyte cells, and the like are used.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • NK cells cytokine-stimulated monocyte cells, and the like are used.
  • PBMC is prepared as follows.
  • a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, a chimeric antibody, a humanized antibody, an antibody fragment and the like can be used. It can be obtained or prepared according to a conventional method.
  • Antibodies to the HM1.24 antigen, particularly monoclonal antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies, etc., have already been described.
  • anti-HM1.24 antibodies Goto T. et al., Blood 84 (1994), 1922-1930
  • chimeric and humanized anti-HM1.24 antibodies W098 / 14580
  • the above-mentioned anti-HM1.24 antibody can be obtained by the method described in the above-mentioned literature. Was.
  • an anti-human Fas monoclonal antibody CH-11 (Institute for Medical Biology, No. SY-001) capable of inducing cell death is available.
  • the target cells of the present invention can be cultured, for example, according to a conventional method for culturing animal cells.
  • Cells adhered to the surface of the incubator are peeled off by a conventional method such as trypsin treatment, and the cell suspension is removed. Can be obtained.
  • Measurement of cell death of the present invention for example, cultured as described above, suspended cells to a concentration of more than 10 3 / ml, for example prepared in a -MEM medium, antibodies or ligands for the previous Kimaku protein This is performed by adding and incubating, followed by adding effector cells so as to have a concentration of 8/1 to 100/1 as a ratio of fefecta / cell / target cell, followed by incubating.
  • the incubation can be performed in the co-presence of the antibody or ligand and the effector cells.
  • I Nkyubeshi ® down time is 4 hours to 24 hours, the temperature is, for example, 37 D C. This incubation causes cell death, which results in the leakage of marker proteins from the cells into the medium. Therefore, the degree of cell death can be determined by collecting the culture supernatant and measuring the marker protein present therein as described above.
  • the measurement of cell death according to the present invention can be performed by screening a ligand for a membrane protein (that is, determining whether a test substance is a ligand) or screening an agonist or antagonist for a membrane protein (that is, screening a ligand). It is particularly useful for determining whether a test substance is an antagonist or an agonist.
  • the incubation of the target cell and the antibody or ligand and / or effector cell against the target cell may be performed in the presence of the test substance.
  • test system that is, the leakage amount of the marker protein
  • control cell death in the system without the test substance
  • the leakage of the marker protein in the test system is higher than that in the control system.
  • the test substance is determined to be a ligand or agonist, and vice versa.
  • HM1.24 antigen BST-2
  • CH0 # 30 CH0 # 30 cells expressing HM1.24 antigen protein a membrane protein that induces cell death
  • a DHFR-deficient CHO cell line was transformed into an expression vector encoding the HM1.24 antigen.
  • 19 introduced (supra) were selected 500 mu g / ml of G418, was obtained CH0 # 30 cell lines Ri by the further limiting dilution.
  • a plasmid (pCMV / j3-gal) containing the galactosidase gene under the control of the cytomegalovirus promoter (No. AV20C from PE Biosystems) was digested with BamHI, and the ⁇ -galactosidase gene was digested with BamHI.
  • pIRES2-EGFP-F (Clontech) was digested with the DNA fragment containing the 3 galactosidase gene described above, and ⁇ -galactosidase linked by IRES2 and green fluorescent protein (EGFP-F ) was constructed under the control of the CMV promoter to construct plasmid-gal-IRES2-EGFP-F.
  • This plasmid also contains the neomycin resistance gene under the control of the SV40 promoter so that drug selection of the transformed cells is possible.
  • This plasmid was expanded using E. coli DH5a (Toyobo) and the recovered plasmid was used. Is purified using a Qiagen Maxi column (Qiagen), a DNA fragment of about 2.2 kbp is generated by Sac digestion, The structure was confirmed by confirming the base sequence. As a result, p] 3-gal-IRES2-EGFP-F was obtained.
  • GFP green fluorescent protein
  • trypsin-EDTA washed with phosphate buffer (PBS), and added to PBS. Suspended. Then use EPICS-ELITE (BECKMAN COULTER)! Then, cells that emit fluorescence due to bowing from the expression of GFP were sorted. The collected cells were washed with a medium containing 10% fetal calf serum (FCS) and supplemented with 10% FCS and 0.5 mg / mL dienethecin (G418: Gibco) in a 6-well plate. The cells were cultured and stored in a MEM (containing nucleic acid) medium containing.
  • FCS fetal calf serum
  • G418 0.5 mg / mL dienethecin
  • the expression level of galactosidase in cells into which -ga IRES2-EGFP-F was introduced was measured. That is, the cultured CH0 # 30 cells were detached with trypsin-EDTA, and spread on a round bottom 96-well plate to give lxlO 4 cells / lOO / z L / well. And I Nkyube bets in among - (MEM 10% FCS a) 100 ⁇ L were added 4 hours C0 2 Inkyubeta single cell lysate (Galacton- star Atsusiki' g) a 100 mu L or medium to each of the plates Ueru.
  • reaction solution was taken in 96-well white plates in 20 ⁇ L aliquots, and 100 ⁇ L of a reaction buffer containing Galacton-star was obtained. After reacting for 1 hour at room temperature, the luminescence was measured with ALV0-sx5.
  • GFP-positive cells were collected from a DO.5L3 cell cultured for about 3 weeks after gene transfer using a cell sorter. As a result, about 300 GFP-positive cells were recovered from about 100,000 cells (recovery rate of about 0.3%), and the recovered cells were cultured for 2 weeks and increased, resulting in a GFP-positive rate of about 30%. became.
  • GFP-positive cells recovered by the cell sorter were enriched
  • the cells were cultured in 10% FCS and 0.5 mg / mL of dienethecin-containing MEM (with nucleic acid), detached with trypsin-EDTA, washed with PBS, and counted.
  • the cells were suspended in a human MEM (containing nucleic acid) medium containing 10% FCS and 0.5 mg / mL of dienethecin so as to give cells / mL.
  • the nature of the CH0 # 30 is likely to change other than the expression of a moth Rata Toshidaze and EGFP-F. Then, it was confirmed whether the expression of the ⁇ antigen in the CH0 # 30 cell line was lost. That is, the cells of the galactosidase stably expressing cell line selected above were detached with trypsin-EDTA, and then washed with PBS.
  • mononuclear cells separated from peripheral blood of a healthy individual by specific gravity centrifugation were used. That is, an equal volume of PBS was added to peripheral blood of a healthy person, layered on Ficoll-PaquePLUS (Pharmacia), and centrifuged at 500 g for 30 minutes. Was fractionated mononuclear phase, washed three times with RPMII1640 containing 10% FCS, with 10% FCS cell number Fukumuhi -MEM was by Uni prepared becomes 5xl0 6 ZmL.
  • B-C (% ⁇ —galactosidase) Calculated as B-C.
  • A is ⁇ -galactosidase activity released in the presence of antibody (RLU / sec)
  • B is / 3 galactosidase activity released by cell lysis buffer (RLU / sec)
  • C contains antibody.
  • Fig. 4 shows the results. It was confirmed that in each of the [3] galactosidase stably expressing cell lines, / 3 galactosidase was released depending on the anti-HM1.24 antibody concentration, and cell death occurred depending on the antibody concentration.
  • Example 5 Appearance of activity based on lysis of a / 3 galactosidase high expression strain
  • the ⁇ galactosidase high expression CH0 # 30 strain was reduced to 100, 625, 1000, 1250, 2500, 10000, and 20000Z at a density of 100 L / well.
  • Seed 8 wells at a time add 4 wells to the lysis solution attached to the galactosidase detection kit (PE Biosystems, Cat. No. BM300S), and add? 83 to the remaining 4 wells at 100 / well and add 37 ° C. C.
  • the cells were cultured in the presence of 5% C02 for 1.5 hours.
  • Example 6 Effect of ⁇ ⁇ ratio on cytotoxic activity of commercially available human peripheral blood mononuclear cell fraction stimulated with IL-2

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Description

明 細 書 標的細胞の細胞死の測定方法 発明の分野
本発明は標的細胞の細胞死の新規な測定方法に関する。 背景技術
抗体依存性細胞傷害活性 （ADCC活性） のよ うな膜蛋白質に起因す る反応により誘起される細胞死を測定する方法と しては、 51 Crを取 り込ませた細胞を標的細胞と して用い、 細胞傷害によ り細胞外に漏 出する51 Cr量を測定する方法がある。 しかし、 一般に、 ラジオアイ ソ トープ（RI)を使用する方法では、 実験施設が RI管理区域内に制限 され、 51Crの年間使用量の制限、 実験者の RI従事者登録など汚染防 止、 実験従事者保護の立場から厳重な管理下での実施が要求される
RIの取り扱いを含まない細胞死の検出方法としては、 特開平 10- 2 15868号公報の実施例において、 細胞死によ り細胞外に漏出する β ガラタ トシダーゼを測定することによ り細胞傷害性 Τ細胞の主要組 織適合性複合体（MHC)に依存する細胞傷害活性を検出している。
しかし、 細胞傷害性 Τ細胞の細胞傷害活性 （CTL活性） は標的細 胞の MHCに拘束された抗原量がわずかな場合でも測定が可能である のに対し (Christinck E. R. et al. , Nature 352(1991) , 67-70) 、 ADCC活性は標的細胞に膜蛋白質として発現している抗原の量に依 存し、 抗原量が少ない場合は ADCC活性を測定することはできない （ Ontomo T. et al.， Biochemical and Biophysical Research し ommu nications 258(1999), 583-591) 。 すなわち、 ADCC活性を含む細胞 の膜蛋白質に起因する反応により誘起される細胞死を測定するため には、 標的細胞が膜蛋白質を安定に発現していることが必要である
発明の開示
本発明は、 膜蛋白質に起因する反応によ り細胞死を誘起するのに 充分な量の膜蛋白質を発現しているとともに、 非 R Iマーカーを発 現している標的細胞を用い、 細胞死によ り細胞外に漏出するマーカ 一を検出することにより概標的細胞の細胞死を測定する方法を提供 することを目的とする。
上記の課題を解決すべく種々検討した結果、 本発明者らは、 細胞 死を誘起し得る膜蛋白質をコー ドする遺伝子及びマーカー蛋白質を コー ドする遺伝子の両者を安定して発現することができる形質転換 された細胞を構築することに成功し、 本発明を完成した。
従って本発明は、 標的細胞の細胞死を測定する方法において、 細 胞死を誘起し得る膜蛋白質をコー ドする遺伝子及びマーカー蛋白質 をコードする遺伝子を含有する標的細胞をィンキュペートし、 細胞 死によ り細胞外に漏出するマーカー蛋白質を測定することを特徴と する方法を提供する。
前記細胞死を誘起し得る膜蛋白質は、 抗体又はリガンドの結合に よ り細胞に細胞死を誘起するものであればよく、 例えば M1. 24抗原 (BST-2)蛋白質又は Fas抗原蛋白質である。 前記イ ンキュベーショ ン は、 好ましくは前記細胞死を誘起し得る膜蛋白質に対する抗体又は リ ガン ドの存在下で行われる。 前記イ ンキュベーショ ンは、 好まし くはエフヱクタ一細胞の存在下で行われる。
前記標的細胞は、 好ましくは膜蛋白質の安定発現系が得られる細 胞である。 前記標的細胞は、 好ましく は CH0細胞である。 前記マー カーは、 好ましくは酵素である。 前記マーカーは、 好ましく は j8ガ ラタ トシダーゼである。
本発明はまた、 標的細胞の細胞死を誘起又は抑制する物質のスク リ一二ング方法において、 細胞死を誘起し得る膜蛋白質をコー ドす る遺伝子及びマーカー蛋白質をコー ドする遺伝子を含有する標的細 胞を、 被検物質と共にインキュベートし、 細胞死によ り細胞外に漏 出するマーカー蛋白質を測定することを特徴とする方法を提供する 前記細胞死を誘起し得る膜蛋白質は、 抗体又はリ ガンドの結合に より細胞に細胞死を誘起するものであればよく、 例えば HM1. 24抗原 (BST- 2 )蛋白質又は Fas抗原蛋白質である。 前記イ ンキュベーショ ン は、 好ましく は前記細胞死を誘起し得る膜蛋白質に対する抗体又は リガンドの存在下で行われる。 前記イ ンキュベーショ ンは、 好まし くはエフェクター細胞の存在下で行われる。
前記標的細胞は、 好ましく は膜蛋白質の安定発現系が得られる細 胞である。 前記標的細胞は、 好ましくは CH0細胞である。 前記マー カーは、 好ましくは酵素である。 前記マーカーは、 好ましくは）3ガ ラク トシダーゼである。
本発明はまた、 標的細胞の細胞死の測定又は標的細胞の細胞死を 誘起もしくは抑制する物質のスク リーニング方法に使用するための 標的細胞であって、 細胞死を誘起し得る膜蛋白質をコードする遺伝 子及びマーカー蛋白質をコー ドする遺伝子を含有し、 該膜蛋白質に 起因する反応によ り誘起される細胞死によ り前記マーカー蛋白質を 漏出する細胞を提供する。
前記細胞死を誘起し得る膜蛋白質は、 抗体又はリガンドの結合に より細胞に細胞死を誘起するものであればよく、 例えば H M 1. 24抗 原（BST- 2 )蛋白質又は Fas抗原蛋白質である。 好ましくは、 前記膜蛋白質に対する抗体又はリガンドの存在下で のインキュベーシ ョ ンによ り前記マーカー蛋白質が漏出する。
好ましくは、 エフェクター細胞の存在下でのインキュベーショ ン により前記マーカー蛋白質を漏出する。
前記標的細胞は、 好ましくは膜蛋白質の安定発現系が得られる細 胞である。 前記標的細胞は、 好ましく は CH0細胞である。 前記マー カーは、 好ましく は酵素である。 前記マーカーは、 好ましく は /3ガ ラタ トシダーゼである。 図面の簡単な説明
図 1 は p ]3 - gal- IRES2-EGFP- Fの導入によ り β ガラク ト シダーゼが 発現する細胞に、 ΗΜ抗原の発現していることを示すグラフである。
図 2は、 p j3 -gal- IRES2- EGFP-Fの導入によ り ]3ガラク トシダーゼ を発現する細胞を Galacton- star mammal ian kitに従い 細胞溶解し た場合と、 細胞溶解を行わなかった場合の培地中の ]3ガラク トシダ ーゼの活性を示すグラフであり、 ]3ガラク トシダーゼが発現してい ることを示している。
図 3は、 図 2の場合と同じ細胞において、 緑色蛍光蛋白質（EGFP - F)が発現していることを示すダラフである。 図 2 と図 3の比較にお いて、 |3ガラク トシダーゼの発現量と、 EGFP - Fの発現量との間に順 位相関があることが示される。
図 4は、 膜蛋白質 HMを発現する細胞に p j3 -gal- IRES2- EGFP- Fを導 入した細胞を、 抗 HM抗体とエファクター細胞の存在下にィンキュベ ー ト した場合に、 抗 HM抗体の濃度に依存して細胞傷害すなわち βガ ラタ トシダーゼの細胞外への漏出が生ずることを示すグラフである 図 5は、 図 4の実験系で、 細胞を界面活性剤で溶解したときに、 溶解された細胞が 100個以上有れば、 マーカー蛋白質が検出される こと、 及び細胞が溶解されなければマーカー蛋白質が細胞外に漏出 されないことを示すグラフである。
図 6は、 図 4の実験系で、 市販の PBMCを IL-2刺激することにより 、 抗体依存的な細胞障害活性と抗体非依存的な細胞障害活性が観察 できることを示すグラフである。 発明の実施の形態
細胞死を誘起し得る膜蛋白質と しては、 抗体又はリガンドの結合 によ り細胞に細胞死を誘起するものであればよく、 例えば HM1.24抗 原（BST- 2)蛋白質、 Fas抗原蛋白質、 IAP、 erbB2等が挙げられる。
HM1.24抗原蛋白質は、 徳島大学 小阪等によって作製された抗 HM 1.24抗体（Goto T. et al. , Blood 84(1994), 1922- 1930)の認識す る抗原である。 抗 HM1.24抗体は、 ヒ ト ミエローマ細胞株 KPC- 32を免 疫'原と して用い得られたマウスモノクローナル抗体であり、 骨髄腫 細胞表面に高発現する HM1.24抗原を認識し、 ェフユクタ一細胞存在 下で ADCC活性を誘導し、 抗腫瘍作用を示すことが明らかにされてき た（Ozaki S. et al. , Blood 90(1997)， 3179 - 3186)。
この抗体が認識する丽 1.24抗原蛋白質は、 分子量 29-33kDaの膜蛋 白質であり、 その遺伝子クローニングの結果、 骨髄腫又は関節リ ュ ゥマチ患者由来のス ト口一マ細胞に高発現する BST- 2(Ishikawa J. et al. , Genomics 26(1995)， 527- 534)と同一の分子であることが 明ら力 となった (Ohtomo T. et al. , Biochemical and Biophysical Research Communications 258(1999) , 583-591)。
Fas抗原蛋白質 /CD95は、 細胞膜に存在する TNF—受容体ファミ リ 一に属する蛋白質であり細胞内に Death Domainを有しており （Yone hara S. et al. , J. Exp. Med. 169(1989)1747-1756) 、 Fasジガン ド (Cheng J. et al. , Science 263(1994)1759) やァゴ-ス ト作用を 持つ抗 Fas抗体（Cifone M. G. et al.， J. Exp. Med. 180(1994)1547) によ りアポトーシスを誘導する蛋白質として知られている。
本発明の標的細胞は、 細胞死を誘起することができる蛋白質、 例 えば上記の匪 1.24抗原（BST- 2)蛋白質、 Fas抗原蛋白質等によ り細胞 死、 例えばアポトーシスを起こして死亡する細胞であればよいが、 好ましくは動物細胞、 例えば CH0細胞、 293細胞、 L細胞、 N I H/3T3 細胞、 等を使用することができる。 - 本発明のマーカー蛋白質は、 前記の細胞死を誘起することができ る蛋白質と同時に前記標的細胞中で発現され得、 細胞死の際に細胞 外に漏出し、 且つそれ自体が検出可能なマーカー機能を有するか、 又は検出可能なマーカーによ り標識され得るものであればよい。 こ のよ うなマーカー蛋白質と しては、 酵素、 例えば i3ガラク トシダー ゼ、 /レシフェラーゼ、 ァノレ力 リ フォスファターゼ、 ぺノレオキシダ一 ゼ等 ； 発光基質と して例えば、 ノレシフェ リ ン、 CSPD (TR0PIX社） 、 Galacton star (TR0PIX社） 等を用いることができる。
]3ガラク トシダーゼの検出は、 例えば次のようにして行う ことが できる。 ；3ガラタ トシダーゼ活性を高感度で検出 · 定量する方法と して、 発光基質を用いた方法が知られている。 即ち、 j3ガラク ト シ ダーゼ 1 U (=約 11^=約105分子） - lOOmUを発光基質液、 例えば G alacton - starと反応させることにより、 ]3ガラク トシダーゼ量に応 じた発光量が得られる。 この化学発光は、 ARV0-Sx5 (WALLAC社） 等 の光学機器を用いて測定することができる。
本発明において、 細胞死を生じさせるには、 細胞死を誘起させる ことができる膜蛋白質が匪 1.24抗原（BST-2)蛋白質である場合、 こ の蛋白質及びマーカー蛋白質を発現させることができる標的細胞を 、 該 HM1.24抗原（BST- 2)蛋白質に対する抗体及びエフ クタ一細胞 の存在下にインキュベー トすればよい。 また、 細胞死を誘起させる ことができる膜蛋白質が Fas抗原蛋白質である場合、 この蛋白質及 びマーカー蛋白質を同時に発現させることができる標的細胞を、 Fa s抗原蛋白質のリガン ドの存在下にィンキュベー トすればよい。 エフ クタ一細胞と しては末梢血単核細胞（PBMC )、 NK細胞、 サイ トカイン刺激した単球細胞等が使用され、 例えば PBMCは次のように して調製される。
健常人の末梢血よ り比重遠心法で分離した単核細胞を用いる場合 、 健常人の末梢血に等量の PBSを加え、 Fi co l l- Paque PLUS (Pharma c ia)に積層し、 500gで 30分間遠心し分離することができる。 単核球 相を分取し、 10%FBS ( GIBC0社）を含む RPMI 1640 ( GIBC0社）で 3回洗 浄後、 同培養液で細胞数を調製すればよい。
細胞死を誘起することができる蛋白質に対する抗体と しては、 ポ リ ク ローナル抗体、 モノ ク ローナル抗体、 キメ ラ抗体、 ヒ ト型化抗 体、 抗体断片等を使用することができ、 これらは常法に従って入手 、 又は調製することができる。 HM1. 24抗原に対する抗体、 特にモノ ク ローナル抗体、 キメラ抗体、 ヒ ト型化抗体などはすでに記載され ており、 例えば抗 HM1. 24抗体 （Goto T. et al . , Bl ood 84 ( 1994 ) , 1922-1930) 、 キメ ラ及びヒ ト型化抗 HM1. 24抗体 （W098/14580) 等 が挙げられ、 上記の抗 HM1. 24抗体は、 上記の文献に記載の方法によ り得ることができた。
ヒ ト Fas抗原蛋白質のリガンドとしては、 細胞死を誘導できる抗 ヒ ト Fasモノク ローナル抗体 CH-11 ( (株） 医学生物学研究所、 No. S Y - 001) 等が入手可能である。
本発明の標的細胞の培養は、 例えば動物細胞を培養するための常 法に従って、 培養することができる。 培養器の表面に付着した細胞 は、 例えば、 ト リ プシン処理など常法に従って剥がし、 細胞懸濁液 を得ることができる。
本発明の細胞死の測定は、 例えば上記のごとく培養し、 懸濁した 細胞を 103個/ ml以上の濃度に、 例えば a -MEM培地中に調製し、 前 記膜蛋白質に対する抗体又はリガンドを添加してィンキュベート し 、 さらにェフエクタ一細胞/標的細胞比として 8/1〜100/1の濃度と なるよ うにエフェクター細胞を加えてィンキュベートすることによ り行う。 あるいは、 前記抗体又はリガンド及びエフアクター細胞の 共存下でィ ンキュベーショ ンを行うこ ともできる。 ィ ンキュベーシ ョ ンの時間は 4時間〜 24時間であり、 温度は例えば 37DCである。 こ のィンキュベーショ ンによ り細胞死が生じ、 その結果マーカー蛋白 質が細胞から培地中に漏出する。 従って、 培養上清を採取し、 その 中に存在するマーカー蛋白質を、 前記のようにして測定することに よ り、 細胞死の程度を測定することができる。
本発明の細胞死の測定は、 前記膜蛋白質に対するリガンドのスク リーユング （すなわち、 ある被検物質がリガンドであるか否かの決 定） 、 又は膜蛋白質に対するァゴニス ト又はアンタゴニス トのスク リーユング （すなわち、 ある被検物質が、 アンタゴニス ト又はァゴ 二ス トであるか否かの決定） のために特に有用である。 このスク リ 一二ングにおいては、 上記の細胞死の測定方法において、 標的細胞 と、 それに対する抗体もしくはリガンド及び/又はエフェクター細 胞とのインキュベーショ ンを、 被検物質の存在下で行えばよい。 被検物質を加えた系 （試験系） での細胞死、 すなわちマーカー蛋 白質の漏出量と、 被検物質を加えない系 （対照） での細胞死、 すな わちマーカー蛋白質の漏出量とを比較することにより、 被検物質が リガン ドであるか否か、 あるいはァゴニス ト もしくはアンタゴニス トであるか否かを知ることができる。
すなわち、 対照系に比べて試験系でのマーカー蛋白質の漏出が多 い場合は、 被検物質はリガンド又はァゴニス ト と判定され、 その逆 の場合はアンタゴニス 卜と判定される。 実施例
次に実施例によ り本発明をさらに具体的に説明する。
実施例 1. HM1.24抗原（BST- 2)を発現する細胞 CH0#30の作製 細胞死を誘導する膜蛋白質である HM1.24抗原蛋白質を発現する CH 0#30細胞を次のよ うにして作製した（Ohtomo T. et al.， Biochemic al and Biophysical Research し ommunications 258(1999 ， 583-59 1)。 即ち、 DHFRを欠損した CHO細胞株に、 HM1.24抗原をコードする 発現ベクター p3.19 (上記文献） を導入し、 500 μ g/mlの G418で選択 し、 さらに限界希釈法によ り CH0#30細胞株を得た。
実施例 2. マーカー遺伝子を含む発現べクターの構築
サイ トメガロウィルスプロモーターの制御下に ガラク トシダー ゼ遺伝子を含んで成るプラスミ ド（pCMV/j3 - gal)(PEバイオシステム ズよ り入手 No. AV20C)を BamHIにより消化し、 β ガラク トシダーゼ遺 伝子を含む DNA断片を得た。 pIRES2- EGFP-F (ク ロ ンテック社） を消 化し、 これに前記の ]3ガラク トシダーゼ遺伝子を含む DNA断片を 組み込んで、 IRES2により連結された β ガラ ク トシダーゼと緑色蛍 光蛋白質（EGFP- F)とをコー ドする遺伝子を CMVプロモーターの制御 下に含んで成るプラスミ ド - gal-IRES2-EGFP- Fを構築した。 この プラスミ ドにはさらに、 形質転換細胞の薬剤選択が可能なよ うに SV 40プロモーターの制御下にネオマイシン耐性遺伝子が含まれている このプラスミ ドを大腸菌 DH5a (東洋紡） を用いて増やし、 回収 したプラスミ ドを Qiagen Maxiカラム （Qiagen社） により精製し、 S acl消化により約 2.2kbpの DNA断片が生ずること、 及び連結部位の塩 基配列の確認によ り構造を確認した。 その結果、 p ]3 - gal- IRES2- EG FP - Fを得た。
実施例 3. CH0#30細胞への p β - gal IRES2-EGFP- Fの導入及びク ローニング
( 1 ) 形質転換
CH0#30細胞を 1X105 細胞を 12ゥエルプレートにプレートし、 血 清を含むひ- MEM培地 （核酸含有 ： Gibco社） 中で一晩培養した後、 血清を含まない OPTI-MEM(Gibco社） 0.5mLあたり （ 1 ) 3マイ ク ロ L のリ ポフエクタミ ン（Lipofectamin)/0.25 μ gの pIRES2_EGFP - F(Moc と して） 、 （ 2 ) 3 μ Lのリ ポフエクタ ミ ン/ 0· 25 w gの p ]3 - gal - IRE S2 - EGFP- F(D0.25/L3)、 （ 3 ) 3 μ Lのリ ポフエクタミ ン /0.5 μ gの p j8 - gal- IRES2 - EGFP- F(D0.5/L3)、 又は （ 4) 5 iLのリ ボフエタタ ミ ン/ 25 μ gの ρ β -gal-IRES2-EGFP-F(D0.25/L5)を培地を除き洗浄 した前記細胞に添加し 4時間培養した後、 血清を含む α-ΜΕΜ (核酸 含有 ： Gibco社） を 1.5mL追加し培養を行い、 遺伝子導入を行った。
( 2 ) マーカー遺伝子の発現の確認
導入遺伝子のマーカーと しての緑色蛍光プロティン（GFP)の発現 を調べるため、 上記の培養細胞を ト リ プシン— EDTAにより ゥエルか ら剥がし、 リ ン酸緩衝液（PBS)により洗浄し、 PBSに懸濁した。 次に EPICS-ELITE(BECKMAN COULTER社）を用！ヽて、 GFPの発現こよ り弓食く 蛍光を発する細胞を分取した。 回収した細胞は、 10%ゥシ胎児血清 (FCS)を含むひ- MEM (核酸添加） 培地で洗浄し、 6 ゥエルプレート 中、 10% F C S及び 0.5mg/mLのジエネテシン （G418： Gibco社） を 含有する MEM (核酸添加） 培地中で培養 · 保存した。
この結果、 遺伝子導入後 2 日 目にフローサイ トメ一ターにより GF Pの一過性発現を解析した場合、 pIRES2- EGFP-Fを導入した CH0#30細 胞（ Mo c )において約 40 %の GFP陽性細胞が観察され、 p j8 - ga 1 - IRES2 - EGFP - Fを導入した細胞において約 10 %の GFP陽性細胞が観察され、 遺伝子導入時の条件（DO.25/L3、 DO.05/L3, 又は DO.25/L5)によ り殆 んど差がなかった。 また、 GFPの発現 （EGFP- Fとして） は蛍光顕微 鏡においても観察された。
他方、 - ga卜 IRES2- EGFP- Fを導入した細胞における ガラク ト シダーゼの発現量を測定した。 すなわち、 培養した CH0#30細胞をト リ プシン一EDTAで剥がし、 lxlO4 細胞/ lOO/z L/ゥエルとなるよう に丸底 96ゥエルプレー トにまいた。 プレー トの各ゥエルに細胞溶解 液 （Galacton- starアツセィキッ ト） を 100 μ Lまたは培地（10%FCS a - MEM) 100 μ Lを加え 4時間 C02 ィンキュベータ一の中においてィ ンキュベー ト した。 反応液を 20 μ Lずつ 96well white pi ateにと り 、 Galacton-starを含む反応緩衝液を lOOw L力 Dえた。 室温で、 1時 間反応させた後、 発光量を ALV0- sx5で測定した。
その結果、 培地中で前記ィ ンキュペートした際に自然漏出した；3 ガラタ トシダーゼ活性が 4109.5RLU (相対発光ュニッ ト） であるの に対して、 細胞溶解液中でィ ンキュペートした際の最大漏出量は 25 280.5RULであった。
しかし、 遺伝子導入後 6 日 目にフローサイ トメ一ターで EGFP- Fの 発現を解析すると M0C細胞、 及び ρ |3 - ga卜 IRES2-EGFP- F導入細胞で は、 どちらも GFP陽性細胞は約 1 %しか残っていなかった。 そこで 、 遺伝子導入後 3週間程度培養した DO.5L3の細胞から GFP陽性細胞 をセルソーターによ り回収した。 その結果、 約 10万個の細胞から約 300個の GFP陽性細胞が回収され （回収率約 0.3%) 、 回収された細 胞を 2週間培養し増やした結果、 GFP陽性率は約 30%になった。
( 3 ) 限界希釈法による J3ガラク トシダーゼ陽性細胞の単クローン 化
前記セルソーターによ り回収された、 GFP陽性細胞が濃縮された 細胞群を 10%FCS及び 0.5mg/mLのジエネテシンを含有するひ -MEM ( 核酸添加） 中で培養し、 ト リプシン一 EDTAにより剥がし、 PBSによ り洗浄した後、 細胞数を測定し、 1細胞/ mLとなるように、 10%FC S及び 0.5mg/mLのジエネテシンを含有するひ - MEM (核酸添加） 培地 に懸濁した。 この細胞懸濁液を 96ゥエルプレートの各ゥエルに 100 Lづっ分配し、 各ゥエル中の生育してきた細胞を活性測定用及び 植え継ぎ用の 2つに分けて 90ゥエルプレー トで培養し、 活性測定用 培養物を用いて 3ガラク トシダーゼ活性を測定した。
なお、 ]3ガラク トシダーゼの測定は、 培養細胞をゥエルから ト リ プシン EDTAで剥がし、 培地を加え 100 /zLと し、 Galacton- screanを 1 00 xLずつ加え室温で 1時間反応させた後発光量を ALV0-sx5で測定 した。 その結果、 ガラク トシダーゼ高発現株と して、 CH0#30-20， C腿 30- 21， C画 30- 40の 3株力 得られた。
( 4 ) ガラク トシダーゼ高発現株の HM抗原発現量。
P iS - ga!l- IRES2-EGFP- Fの遺伝子導入によ り、 CH0#30の性質が ガ ラタ トシダーゼと EGFP-Fの発現以外で変化する可能性がある。 そこ で CH0#30細胞株の ΗΜ抗原の発現が失われていないかを確認した。 す なわち、 前記において選択した ガラク トシダーゼ安定発現細胞株 の細胞をト リ プシン一 EDTAで剥がした後、 PBSで洗浄した。 フルォ レセィンで標識した IgG(FITC- IgG)またはフルォレセィンで標識し た抗ー HM抗体（FITC-AHM)4^ gと ともに 4でで 1時間反応させ PBSで 洗浄した後、 EPICS- XL- MCLでフルォレセィ ン（FITC)を指標と して解 析した。 その結果、 CH0#30- 20,CH0#30- 21及び CH0#30- 40細胞株にお いて HM1.24抗原の発現が確認された （図 1 ) 。
( 5 ) J3ガラク トシダーゼ安定発現株の j3ガラク トシダーゼ活性と EGFP- F発現量
βガラク トシダーゼ高発現株と して得られた、 3株の ガラク ト シダーゼ発現量と EGFP F発現量を比較した。 その結果、 ]3ガラク ト シダーゼ発現量と EGFP- F発現量は CH0#30-20>CH0#30-40>CH0#30_21 の様になり、 βガラク トシダーゼ発現量と EGFP - F発現量には順位相 関が見られた （図 2及び図 3 ) 。
なお、 図 2に示す j8ガラク トシダーゼの発現量は、 1 xlO3 細胞 にっき、 前記 （ 2 ) に記載したのと同様にして測定した細胞であり 、 図 3に示す EGFP- Fの発現量は EPICS- XL-MCLを用いて波長 525mnの 蛍光を検出することにより測定したものである。
( 6 ) βガラ ク トシダーゼ高発現 CH0#30株の発現安定性
CH0#30- 20株を長期培養した際の βガラク トシダーゼ発現量を比 較した。 その結果 CH0#30-20株を単ク口ーン化した後の継代培養は 、 約 2ヶ月間にわたって安定して ]3ガラク トシダーゼを発現した （ 平均 16432.2RLU/lxl03 cells, %CV13.4) 。
実施例 4 . P B M Cを用いた ADCC活性測定法
エフェクター細胞として健常人の末梢血よ り比重遠心法で分離し た単核球を用いた。 すなわち、 健常人の末梢血に等量の PBSを加え 、 Ficoll- PaquePLUS(Pharmacia)に積層し、 500gで 30分間遠心した 。 単核球相を分取し、 10%FCSを含む RPMII1640で 3回洗浄後、 10% FCSを含むひ -MEMで細胞数が 5xl06 ZmLになるよ うに調製した。
ト リプシン一 EDTAで剥がし、 10%FCSを含む a -MEMで懸濁した 2x1 05 細胞 ZmLの j8ガラク トシダーゼ安定発現( 110#30細胞株50 しと、 様々な濃度の抗 HM1.24抗体 50 を 96ゥエル U底プレー トに加え、 4 °Cで 15分間反応させた。 ついでエフェクター細胞 100 Lを加え、 37°Cで 4時間培養した。 培養後、 20 AI Lの培養上清を採取し、 βガ ラク トシダーゼ活性を測定した。 最大遊離酵素量は Galactone- star アツセィキッ トの細胞溶解緩衝液によ り遊離される酵素量と した。 細胞傷害活性は、 A - C
細胞傷害活性 （％) = X100
(% β —ガラク トシダーゼ） B - C と して計算した。 ここで Aは抗体存在下において遊離された βガラ ク トシダーゼ活性（RLU/sec)、 Bは細胞溶解緩衝液によ り遊離され た /3ガラク トシダーゼ活性（RLU/sec)、 Cは抗体を含まず培養液の みで遊離された β ガラク トシダーゼ活性（RLU/sec)を示す。
結果を図 4に示す。 いずれの ]3ガラク トシダーゼ安定発現細胞株 においても、 抗 HM1.24抗体濃度依存的に /3ガラク トシダーゼが放出 され、' 抗体濃度依存的に細胞死が生ずることが確認された。
実施例 5. /3ガラク トシダーゼ高発現株の溶解に基づく活性の出現 β ガラク トシダーゼ高発現 CH0#30株を 100， 625, 1000, 1250, 25 00， 10000， および 20000Z 100 L / wellの密度に 8 wellsずつ播 き込み、 その内の 4 wellsに ガラク トシダーゼ検出キッ ト（PE Bio systems, Cat. No. BM300S)附属の lysis solution, 残り 4 wellsに ? 83を100 / wellずつ添加し、 37°C、 5%C02存在下で 1.5時間 培養した。 ついで、 その上清 20 μ Lをあらかじめ分注した ]3ガラク トシダーゼ活性検出キッ トの基質 100μ L / wellに加え、 室温で 1 時間培養し、 ALV0- sx5で化学発光を測定した。 その結果、 lysis so lutionを添加したものについては、 播き込んだ細胞数に依存して β ガラク トシダーゼ活性が検出された。 一方、 P B Sを添加したもの では活性は検出されなかった （図 5 ) 。
実施例 6. IL - 2刺激した市販ヒ ト抹消血単核球画分の細胞傷害活性 に対する Ε ΖΤ比の影響
jSガラク トシダーゼ高発現 CH0#30株を 5000/ 50 μ L / wellの密度 に播き、 ついで抗丽 1.24抗体 （終濃度 1または 0 g /mL) を含 むひ一 MEM培地 （核酸添加） を 50 L/ well加え、 更にあらか じめ 150 unit/ mLの IL- 2で 18時間培養した市販のヒ ト抹消血単核球 画分 （BioWhittaker社、 Cat. No. CC-2702) を 0、 6250、 12500、 2 5000 または 50000 cells/ 100 L / well (エフェクター/ター ゲッ ト比 ： 0, 12.5, 25, 50, 100) ずつ添加し、 37°C、 5%C02存在 下で 4時間培養した。 ついで、 その上清 20μ Lをあらかじめ分注し た ]3ガラク トシダーゼ活性検出キッ トの基質 100 μ L / wellに加え 、 室温で 1時間培養し、 ALV0- sx5で化学発光を測定した。 その結果 を図 6に示す。 抗 HM1.24抗体を添加しない場合にもエフェクター Z ターゲッ ト比 （EZT比） に依存して j8ガラク トシダーゼ活性の増 加が見られ、 抗 HM1.24抗体を添加した場合には更に 2倍近い増加が 観察された。 両者の差が ADCC活性に相当する。

Claims

求 の 範 囲
1 . 標的細胞の細胞死を測定する方法において、 細胞死を誘起し 得る膜蛋白質をコードする遺伝子及びマーカー蛋白質をコー ドする 遺伝子を含有する標的細胞をィンキュペートし、 細胞死によ り細胞 外に漏出するマーカー蛋白質を測定することを特徴とする方法。
き卩
2 . 前記イ ンキュベー青シ ョ ンを、 前記細胞死を誘起し得る膜蛋白 質に対する抗体又はリガンドの存在下で行う、 請求項 1に記載の方 法。
3 . 前記ィンキュベーションをエフェクター細胞の存在下で行う 、 請求項 1又は 2に記載の方法。
4 . 前記標的細胞が、 膜蛋 質の安定発現系が得られる細胞であ る請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載の方法。
5 . 前記標的細胞が、 CH0細胞である請求項 4に記載の方法。
6 . 前記マーカーが、 酵素である請求項 1 〜 5のいずれか 1項に 記載の方法。
7 . 前記マーカーが、 ]8ガラク トシダーゼである請求項 6に記載 の方法。
8 . 標的細胞の細胞死を誘起又は抑制する物質のスク リーニング 方法において、 細胞死を誘起し得る膜蛋白質をコードする遺伝子及 びマーカー蛋白質をコー ドする遺伝子を含有する標的細胞を、 被検 物質と共にインキュベート し、 細胞死によ り細胞外に漏出するマー カー蛋白質を測定することを特徴とする方法。
9 . 前記イ ンキュベーシ ョ ンを、 前記細胞死を誘起し得る膜蛋白 質に対する抗体又はリガンドの存在下で行う、 請求項 8に記載の方 法。
1 0 . 前記ィンキュベーショ ンをエフヱクター細胞の存在下で行 う、 請求項 8又は 9に記載の方法。
1 1. 前記標的細胞が、 膜蛋白質の安定発現系が得られる細胞で ある請求項 8〜 1 0のいずれか 1項に記載の方法。
1 2. 前記標的細胞が、 CH0細胞である請求項 1 1に記載の方法
1 3. 前記マーカーが、 酵素である請求項 8〜 1 2のいずれか 1 項に記載の方法。
1 4. 前記マーカーが、 ）3ガラク トシダーゼである請求項 1 3に 記載の方法。
1 5. 標的細胞の細胞死の測定又は標的細胞の細胞死を誘起もし くは抑制する物質のスク リ ーニング方法に使用するための標的細胞 であって、 細胞死を誘起し得る膜蛋白質をコードする遺伝子及びマ 一力一蛋白質をコー ドする遺伝子を含有し、 該膜蛋白質に起因する 反応によ り誘起される細胞死によ り前記マーカー蛋白質を漏出する 細胞。
1 6. 前記蛋白質に対する抗体又はリガンドの存在下のィンキュ ベーシヨ ンによ り前記マーカー蛋白質を漏出する、 請求項 1 5に記 载の細胞。
1 7. ェフエクタ一細胞の存在下でのィ ンキュベーショ ンによ り 前記マーカー蛋白質を漏出する請求項 1 5又は 1 6に記載の細胞。
1 8. 前記標的細胞が、 膜蛋白質の安定発現系が得られる細胞で ある請求項 1 5〜 1 7のいずれかに記載の細胞。
1 9. 前記標的細胞が、 CH0細胞である請求項 1 8に記載の細胞
2 0. 前記マーカーが、 酵素である請求項 1 5〜1 9のいずれか 1項に記載の細胞。
2 1. 前記マーカーが、 ガラク トシダーゼである請求項 2 0に 記載の細胞。
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