WO2002060409A1 - Membrane pour chambre d'encapsulation de cellules produisant au moins une substance biologiquement active et organe bio-artificiel comprenant une telle membrane. - Google Patents

Membrane pour chambre d'encapsulation de cellules produisant au moins une substance biologiquement active et organe bio-artificiel comprenant une telle membrane. Download PDF

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WO2002060409A1
WO2002060409A1 PCT/FR2002/000347 FR0200347W WO02060409A1 WO 2002060409 A1 WO2002060409 A1 WO 2002060409A1 FR 0200347 W FR0200347 W FR 0200347W WO 02060409 A1 WO02060409 A1 WO 02060409A1
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cells
biologically active
encapsulation chamber
membrane
semi
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Gilbert Legeay
Patrick Bertrand
Alain Belcourt
Laurence Kessler
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Universite Catholique de Louvain UCL
Association pour les Transferts de Technologies du Mans
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K9/5021—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/5031—Organic macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, poly(lactide-co-glycolide)

Definitions

  • Membrane for cell encapsulation chamber producing at least one biologically active substance and bioartificial organ comprising such a membrane
  • the present invention relates to a membrane for cell encapsulation chamber producing at least one biologically active substance of interest having improved permeability and biocompatibility characteristics.
  • the invention also relates to a cell encapsulation chamber containing at least one such membrane as well as to a bio-artificial organ comprising at least one cell encapsulation chamber.
  • Such devices are, for example, bio-artificial organs which contain cells producing one or more biologically active substances of interest.
  • the cells contained in a bio-artificial organ are confined in internal spaces or encapsulation chambers delimited by at least one semi-permeable membrane.
  • Such a semi-permeable membrane must allow the passage of the biologically active substances of interest which must be accessible to the target cells targeted in the patient's body, while being impermeable to the patient's cells, more particularly the cells of the immune system, as well as to antibodies and other toxic substances.
  • Such bio-artificial organs comprising a semi-permeable membrane are for example described in PCT application No. W0 94/18 906 published on September 1, 1994 or in US patents No. 4,323,457 issued on April 6, 1982 and US No. 6,023,009 issued February 8, 2000.
  • a polycarbonate membrane has also been envisaged, among many other types of membranes, in PCT application No. WO 94 / 18.906.
  • the preferred embodiment described in this PCT application consists in the use of a porous membrane an acrylic copolymer with a porosity of 50,000 to 80,000 Daltons, such as the XM membrane manufactured by the Amicon Division of the Company GRACE & Cie.
  • the semi-permeable membranes for bio-artificial organs recommended in the state of the art have certain drawbacks.
  • semi-permeable polyacrylonitrile membranes for example membranes of the “AN69” type, naturally have pores having a cutoff threshold of approximately 60,000 Daltons and are generally used in ultrafiltration devices.
  • the “AN69” membranes are sodium polyacrylonitrilemethallylsulfonate membranes, sold by the company HOSPAL.
  • a semi-permeable membrane for bio-artificial organ having all the desired properties listed above is provided according to the invention.
  • the subject of the invention is therefore a semi-permeable membrane for cell encapsulation chamber producing at least one biologically active substance of interest, characterized in that it comprises a biocompatible film of porous polycarbonate modified on the surface by creation of sites polar and covered by a layer of at least one hydrophilic polymer.
  • a porous polycarbonate membrane whose surface energy has been increased by creation of polar sites and covered by a layer of at least one hydrophilic polymer has excellent resistance properties mechanical.
  • These excellent mechanical properties make the semi-permeable membrane of the invention easy to handle, without special precautions.
  • these mechanical resistance properties give the semi-permeable membrane characteristics of resistance to the various stresses undergone by an implant of a bio-artificial organ, when the latter is introduced for a long period of time into the body of a host organism.
  • the semi-permeable membrane according to the invention because it has on its surface a layer of at least one hydrophilic polymer, has a reduced capacity for adsorption of proteins present in the surrounding medium as well as a reduced capacity for adhesion to cells of the host organism present at the place of implantation.
  • the inventors have shown, by measurements of X-ray photoelectron spectroscopy (XPS for "X-ray photoelectron spectroscopy”) and TOF-SIMS ("Time of Flight Secondary ion Mass Spectroscopy”) that proteins like albumin and insulin are weakly adsorbed on the surface of the semipermeable membrane of the invention, on the one hand, and that, on the other hand, these proteins were not stably adsorbed and could consequently be spontaneously desorb from the surface of the membrane.
  • XPS X-ray photoelectron spectroscopy
  • TOF-SIMS Time of Flight Secondary ion Mass Spectroscopy
  • the low adhesiveness of the proteins to the surface of the semipermeable membrane of the invention makes it possible to considerably reduce the deterioration of the permeability properties due to the absence of obstruction of the pores of this membrane, contrary to what is observed with state-of-the-art semi-permeable membranes.
  • a semi-permeable membrane of porous polycarbonate not covered with hydrophilic polymer does not have the biocompatibility properties or the maintenance of the long-term permeability characteristics of the membrane according to the invention.
  • the semi-permeable membrane according to the invention is characterized in that the layer of at least one hydrophilic polymer is maintained durably on the surface of the polycarbonate film thanks to the creation of polar sites which increases the surface energy. polycarbonate film and thus allows the adhesion of the layer of at least one hydrophilic polymer via numerous weak bonds, such as hydrogen bonds, ionic bonds or even by Van der Waals forces.
  • the layer of at least one hydrophilic polymer adheres without chemical grafting to the surface of the biocompatible polycarbonate film by the formation of non-covalent bonds between the polar sites created on the surface of the polycarbonate film and the hydrophilic groups of the polymer, without bond covalent between the hydrophilic polymer and the polycarbonate film.
  • the grafting of hydrophilic monomeric or polymeric compounds to the surface of a support is never complete and may consequently lead to the production of finished products comprising free, ungrafted monomers, which, for example in the case of halogenated monomeric compounds, can cause irritation reactions after implantation in the body of a host organism.
  • Such drawbacks are therefore not encountered with the semi-permeable membrane of the invention.
  • the presence of the layer of at least one hydrophilic polymer on the surface of the semi-permeable membrane according to the invention makes it possible to obtain an optimal rate of exchange of molecules crossing the membrane because these molecules are not adsorbed, even transiently, on the surface of the semi-permeable membrane.
  • the biologically active substances produced by the cells of the bio-artificial organ are quickly accessible to the target cells of the host organism.
  • the activation of the flow of exchanges between the outside and the inside of the bioartificial organ also allows increased accessibility of nutrients to the cells contained in the implant, promoting their long-term survival and therefore long-term functioning. term of the bio-artificial organ.
  • the presence of the layer of at least one hydrophilic polymer on the surface of a semi-permeable membrane therefore gives this membrane excellent hydrodynamic properties never before achieved with the membranes of the prior art.
  • polar sites on the surface of the biocompatible polycarbonate film corresponds mainly to the increase in the proportion of carbonyl, hydroxy or amino groups, and of free radicals. Free radicals recombine with each other, or with oxygen in the air, creating polar sites.
  • the polar sites present on the surface of the biocompatible polycarbonate film constituting the semi-permeable membrane of the invention include the following sites:
  • the semi-permeable membrane according to the invention is characterized in that the pore size of the polycarbonate film is between 5 and 30 nanometers, preferably between 5 and 15 nanometers.
  • the semi-permeable membrane according to the invention is also characterized in that it has a cutoff threshold of between 10,000 and 50,000 Daltons, preferably between 10,000 and 30,000 Daltons, and most preferably between 10,000 and 15,000 Daltons.
  • the semi-permeable membrane according to the invention has a pore density of between 10 9 and 10 11 pores / cm 2 .
  • the semi-permeable membrane of the invention has a thickness of between 5 ⁇ m and 25 ⁇ m, preferably between 10 ⁇ m and 20 ⁇ m.
  • the layer of at least one hydrophilic polymer has a thickness of between 10 and 100 nanometers, preferably between 10 and 50 nanometers and very preferably between 10 and 30 nanometers.
  • the layer of at least one hydrophilic polymer can cover both sides of the biocompatible film of polycarbonate.
  • the layer of at least one hydrophilic polymer covers only one of the two faces of the biocompatible polycarbonate film, preferably the face of the polycarbonate film which is located on the external side of the organic organ -artificial and which is in contact with the environment surrounding the place of implantation of this organ.
  • biocompatible polycarbonate film constituting a semi-permeable membrane of the invention can, for example, be manufactured in accordance with the teaching of American patent n ° US 4,956,219 issued on September 11, 1990.
  • This American patent describes a polycarbonate film, the pores of which were formed by electron bombardment or by bombardment of heavy ions, before a chemical erosion step.
  • the density of heavy ions bombarded on the surface of the polycarbonate film determines the density of the pores while the chemical erosion treatment time determines the size of the pores created.
  • the implementation of such a technique allows obtaining of porous biocompatible polycarbonate film having a great homogeneity in the distribution of the pores as well as a great homogeneity in the size of the pores.
  • a hydrophilic polymer within the meaning of the invention, a polymer, which, after application to a porous polycarbonate film has an angle value of less than 25 °, preferably less than 22 ° after measurement according to the "drop test" sessile ”described in Example 2.
  • the hydrophilic polymer is soluble in water.
  • the use of organic solvents is excluded because their total elimination is difficult, and their presence, even in small quantities, n is not compatible with therapeutic or surgical use in humans or animals.
  • the hydrophilic polymer material is chosen from the following hydrophilic polymers:
  • HPMC hydroxypropyl methylcellulose
  • HPMC E4M hydroxypropyl methylcellulose
  • PVP polyvinylpyrrolidone
  • BASF / Laserson such as Kollidon
  • hydrophilic poly (meth) acrylates such as those sold by the companies DEGALAN or DEGUSSA;
  • hydrophilic polymer according to the invention means both a polymer material consisting of one of the hydrophilic polymers as defined above and a mixture of several of the above hydrophilic polymers, in general a mixture of two or more three of the above hydrophilic polymers.
  • the invention also relates to a cell encapsulation chamber producing at least one biologically active substance of interest, characterized in that it comprises at least one semi-permeable membrane as defined above.
  • An encapsulation chamber according to the invention can have the characteristics of any cell encapsulation chamber known from the prior art, and more particularly cell encapsulation chambers which are constitutive of the bio-artificial organs described. in the state of the art.
  • an encapsulation chamber according to the invention such an encapsulation chamber is as illustrated in FIG. 1A.
  • the encapsulation chamber is of cylindrical shape and comprises a support (4) on which the external edge of the semi-permeable membrane is fixed as defined above.
  • the encapsulation chamber comprises at least two semi-permeable membranes, respectively an upper semi-permeable membrane (1) and a lower semi-permeable membrane (2) which, in combination with the edges of the external support (4) delimiting the enclosure of the encapsulation chamber in which are contained cells producing at least one biologically active substance of interest.
  • the encapsulation chamber according to the invention can also comprise a third semi-permeable membrane (3) in accordance with the invention so that said encapsulation chamber comprises two separate closed enclosures each containing cells producing a biologically active substance active interest.
  • the invention therefore also relates to a cell encapsulation chamber producing at least one biologically active substance of interest, characterized in that it comprises two semi-permeable membranes according to the invention, respectively lower and upper, the external edges are secured to a support, the two membranes defining a space likely to contain cells producing at least one biologically active substance of interest.
  • the encapsulation chamber according to the invention can be circular in shape.
  • the cells producing at least one biologically active substance of interest can be, for example, islet cells from Langherans, which produce insulin when the encapsulation chamber is intended for the manufacture of a bio-artificial pancreas.
  • the cells can also be liver cells when the encapsulation chamber is intended for the production of a bio-artificial liver.
  • the cells are transfected or transformed with at least one nucleic acid allowing the expression of a biologically active substance of interest.
  • biologically active substances of interest there may be mentioned, by way of illustration, insulin, cytokines, peptide hormones, growth hormone and calcitonin.
  • a wide variety of cells can be used, including immortalized cell lines as primary cultures of dividing cells.
  • the cells can for example be myoblasts, which are precursor cells of muscle cells derived from populations of stem cells of the mesoderm, and which can be easily transformed with a nucleic acid allowing the expression of the biologically active substance of interest.
  • myoblasts which are precursor cells of muscle cells derived from populations of stem cells of the mesoderm, and which can be easily transformed with a nucleic acid allowing the expression of the biologically active substance of interest.
  • Those skilled in the art can advantageously refer for example to PCT applications published under the numbers WO 94/02129, WO 93/03768 and WO 90/15863.
  • the cells can also be islet beta cells
  • Langherans of the pancreas or hepatocytes preferably of human origin.
  • the cells contained in an encapsulation chamber according to the invention are included in a matrix, such as a type IV collagen matrix, where appropriate in combination with laminin, entactin and heparan sulfate as the matrix sold under the name of Matrigel.
  • a matrix such as a type IV collagen matrix, where appropriate in combination with laminin, entactin and heparan sulfate as the matrix sold under the name of Matrigel.
  • Cells producing at least one biologically active substance of interest can also be encapsulated in an alginate matrix.
  • the wetting indices represented by the values of the angle theta taken at the point of connection of a drop of liquid with the surface of the material tested were measured by comparing the polycarbonate film before or after treatment with plasma, and after treatment by plasma then covering with the hydrophilic polymer.
  • the angle value is approximately 29 °.
  • the creation of polar sites on the surface of the polycarbonate film therefore greatly increased the surface energy and the hydrophilicity of this film.
  • an angle value of approximately 22 ° can be measured.
  • the capacity for the exchange of small molecules through the semi-permeable membrane of the invention is still significant after 24 hours (see Table 1).
  • the supports on which the proteins were adsorbed consisted on the one hand of a film of bisphenol A polycarbonate (PC), 15 micrometers thick, coming from the company GENERAL ELECTRIC (Lexan 8800) and, on the other hand, hydrophilic membranes 10 micrometers thick, from SA WATHMAN (Louvain-la-Neuve, Belgium), having pores 400 nm in diameter with a density of 6.10 8 pores / cm 2 .
  • Some membranes had been treated with argon plasma (50 W, 10 min) and then soaked in a solution of polyvinylpyrrolidone.
  • a bio-artificial pancreas comprising several semi-permeable membranes in accordance with the invention was constructed as illustrated in FIG. 1.
  • the structure of the bio-artificial pancreas comprising a silicone support is sold by the company STATICE.
  • a bio-artificial pancreas containing 20,000 islets of pancreatic Langherans has been manufactured for implantation in pigs.
  • the bio-artificial pancreas was removed in order to analyze its mechanical resistance as well as the condition of its surface by scanning electron microscopy.

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Abstract

Membrane semi-perméable pour chambre d'encapsulation de cellules produisant au moins une substance biologiquement active d'intérêt, caractérisée en ce qu'elle est constituée d'un film biocompatible de polycarbonate poreux modifié en surface par création de sites polaires et recouvert par une couche d'au moins un polymère hydrophile .

Description

Membrane pour chambre d'encapsulation de cellules produisant au moins une substance biologiquement active et organe bioartificiel comprenant une telle membrane
La présente invention concerne une membrane pour chambre d'encapsulation de cellules produisant au moins une substance biologiquement active d'intérêt ayant des caractéristiques de perméabilité et de biocompatibilité améliorées. L'invention est également relative à une chambre d'encapsulation de cellules contenant au moins une telle membrane ainsi qu'à un organe bio- artificiel comprenant au moins une chambre d'encapsulation de cellules.
Le traitement de pathologies nécessitant un apport continu à l'organisme en substances biologiquement actives a rendu nécessaire la mise au point de dispositifs capables de libérer ces substances biologiquement actives de manière efficace et qui puissent être implantés chez le patient, parfois pendant de longues périodes de temps. De tels dispositifs sont, par exemple, des organes bio-artificiels qui renferment des cellules produisant une ou plusieurs substances biologiquement actives d'intérêt. Les cellules contenues dans un organe bio-artificiel sont confinées dans des espaces internes ou chambres d'encapsulation délimitées par au moins une membrane semi-perméable. Une telle membrane semi-perméable doit laisser passer les substances biologiquement actives d'intérêt qui doivent être accessibles aux cellules cibles visées dans le corps du patient, tout en étant imperméable aux cellules du patient, plus particulièrement les cellules du système immunitaire, ainsi qu'aux anticorps et autres substances toxiques. De tels organes bio-artificiels comprenant une membrane semi- perméable sont par exemple décrits dans la demande PCT N°W0 94/18 906 publiée le 1er Septembre 1994 ou encore dans les brevets US N°4,323,457 délivré le 6 Avril 1982 et US N°6,023,009 délivré le 8 Février 2000.
Différents types de membranes semi-perméables pour organes bio- artificiels ont été décrits dans l'état de la technique, tel que par exemple des membranes de polyacrylonitrile, de polyéthersulfone, de résine acrylique, d'acétate de cellulose, de nitrate de cellulose, de polyamide, ou encore d'hydroxypropylméthylcellulose (HPMC).
L'utilisation d'une membrane de polycarbonate a également été envisagée, parmi de nombreux autres types de membranes, dans la demande PCT N°WO 94/18.906. Toutefois, le mode de réalisation préférentiel décrit dans cette demande PCT consiste en l'utilisation d'une membrane poreuse d'un copolymère acrylique d'une porosité de 50.000 à 80.000 Daltons, telle que la membrane XM fabriquée par la Division Amicon de la Société GRACE & Cie. Les membranes semi-perméables pour organes bio-artificiels préconisées dans l'état de la technique présentent certains inconvénients. Ainsi, les membranes semi-perméables en polyacrylonitrile, par exemple les membranes du type « AN69 », possèdent naturellement des pores ayant un seuil de coupure d'environ 60.000 Daltons et sont généralement utilisées dans des dispositifs d'ultrafiltration. Les membranes « AN69 » sont des membranes de polyacrylonitrileméthallylsulfonate de sodium, commercialisées par la Société HOSPAL.
Ces membranes se détériorent rapidement si elles ne sont pas impérativement manipulées dans de l'eau ou dans une solution aqueuse.
Les difficultés de manipulation des membranes de polyacrylonitrile ci- dessus se retrouvent de manière générale pour toutes les membranes semi- perméables à base d'hydrogel.
A la connaissance du demandeur, il n'a pas été décrit dans l'état de la technique de membrane semi-perméable qui combine les propriétés suivantes: . - une bonne résistance à la manipulation sans détérioration lorsqu'elles sont manipulées en dehors d'une solution aqueuse, par exemple à l'air ;
- d'excellentes propriétés de perméabilité aux substances biologiquement actives produites à l'intérieur des organes bio-artificiels ainsi qu'une bonne perméabilité aux divers composés nutriments de l'organisme nécessaires à la viabilité des cellules contenues dans l'organe bio-artificiel; - une imperméabilité aux molécules de grande taille produites par l'organisme, plus particulièrement les immunoglobulines, ainsi qu'aux cellules du système immunitaire, afin de protéger les cellules de l'organe bio-artificiel d'une réaction immunitaire de l'organisme hôte pouvant conduire au rejet de l'implant. - une capacité réduite à adsorber à sa surface les protéines présentes dans l'organisme au lieu d'implantation de l'organe bio-artificiel;
- une faible adhésion des cellules à sa surface;
- une rapidité des échanges de molécules passant à travers la membrane, assurant une biodisponibilité rapide des substances biologiquement actives d'intérêt produites par l'organe bio-artificiel ainsi qu'une bonne accessibilité des nutriments de l'organisme aux cellules contenues dans cet organe artificiel, y compris des molécules produites par l'hôte pouvant constituer des signaux nécessaires à la régulation de la synthèse des substances biologiquement actives par les cellules contenues dans l'organe bio-artificiel. Une membrane semi-perméable pour organe bio-artificiel possédant l'ensemble des propriétés recherchées énumérées ci-dessus est fournie selon l'invention.
L'invention a donc pour objet une membrane semi-perméable pour chambre d'encapsulation de cellules produisant au moins une substance biologiquement active d'intérêt, caractérisée en ce qu'elle comprend un film biocompatible de polycarbonate poreux modifié en surface par création de sites polaires et recouvert par une couche d'au moins un polymère hydrophile.
Il a en effet été montré selon l'invention qu'une membrane de polycarbonate poreux dont l'énergie de surface a été accrue par création de sites polaires et recouvert par une couche d'au moins un polymère hydrophile possédait d'excellentes propriétés de résistance mécanique. Ces excellentes propriétés mécaniques rendent la membrane semi-perméable de l'invention aisément manipulable, sans précaution particulière. De plus, ces propriétés de résistance mécanique confèrent à la membrane semi-perméable des caractéristiques de résistance aux diverses contraintes subies par un implant d'organe bio-artificiel, lorsque ce dernier est introduit pendant une longue période de temps dans le corps d'un organisme hôte.
La membrane semi-perméable selon l'invention, du fait qu'elle possède à sa surface une couche d'au moins un polymère hydrophile, possède une capacité réduite d'adsorption des protéines présentes dans le milieu environnant ainsi qu'une capacité réduite d'adhésion aux cellules de l'organisme hôte présentes au lieu d'implantation. En particulier, les inventeurs ont montré, par des mesures de spectroscopie photo-électronique à rayons X (XPS pour « X-ray photoelectron spectroscopy ») et de TOF-SIMS (« Time of Flight Secondary ion Mass Spectroscopy ») que des protéines comme l'albumine et l'insuline sont faiblement adsorbées à la surface de la membrane semi-perméable de l'invention, d'une part, et que, d'autre part, ces protéines n'étaient pas stablement adsorbées et pouvaient en conséquence se désorber spontanément de la surface de la membrane. En outre, le demandeur a montré qu'une valeur plateau d'adsorption de ces protéines était atteinte pour une faible valeur de concentration protéique, de l'ordre du mg/ml, ce qui semble indiquer que les protéines sont adsorbées tout au plus sous forme d'une monocouche.
La faible adhésivité des protéines à la surface de la membrane semi- perméable de l'invention permet de réduire considérablement la détérioration des propriétés de perméabilité du fait de l'absence d'obstruction des pores de cette membrane, contrairement à ce qui est observé avec des membranes semi-perméables de l'état de la technique.
De plus, il va sans dire que les caractéristiques de biocompatibilité qui dépendent principalement des interactions entre les protéines du milieu environnant et la surface de la membrane semi-perméable sont considérablement améliorées.
En particulier, une membrane semi-perméable de polycarbonate poreux non recouvert de polymère hydrophile ne possède pas les propriétés de biocompatibilité ni de maintien des caractéristiques de perméabilité à long terme de la membrane selon l'invention.
En outre, la membrane semi-perméable selon l'invention est caractérisée en ce que la couche d'au moins un polymère hydrophile est maintenue durablement à la surface du film de polycarbonate grâce à la création de sites polaires qui accroît l'énergie de surface du film de polycarbonate et permet ainsi l'adhérence de la couche d'au moins un polymère hydrophile par l'intermédiaire de nombreuses liaisons faibles, telles que les liaisons hydrogène, des liaisons ioniques ou encore par des forces de Van der Waals.
La couche d'au moins un polymère hydrophile adhère sans greffage chimique à la surface du film biocompatible de polycarbonate par la formation de liaisons non-covalentes entre les sites polaires créés à la surface du film de polycarbonate et les groupements hydrophiles du polymère, sans liaison covalente entre le polymère hydrophile et le film de polycarbonate.
En général, le greffage de composés monomères ou polymères hydrophiles à la surface d'un support n'est jamais complet et peut en conséquence conduire à l'obtention de produits finis comportant des monomères libres non greffés, lesquels, dans le cas par exemple de composés monomères halogènes, peuvent entraîner des réactions d'irritation après implantation dans le corps d'un organisme hôte. De tels inconvénients ne sont donc pas rencontrés avec la membrane semi-perméable de l'invention. La présence de la couche d'au moins un polymère hydrophile à la surface de la membrane semi-perméable selon l'invention permet l'obtention d'une vitesse optimale d'échanges de molécules traversant la membrane du fait que ces molécules ne sont pas adsorbées, même de manière transitoire, sur la surface de la membrane semi-perméable. Les substances biologiquement actives produites par les cellules de l'organe bio-artificiel sont rapidement accessibles aux cellules cibles de l'organisme hôte. De plus, l'activation du flux des échanges entre l'extérieur et l'intérieur de l'organe bioartificiel permet également une accessibilité accrue des nutriments aux cellules contenues dans l'implant, favorisant leur survie à long terme et donc le fonctionnement à long terme de l'organe bio-artificiel. La présence de la couche d'au moins un polymère hydrophile à la surface d'une membrane semi- perméable confère donc à cette membrane d'excellentes propriétés hydrodynamiques encore jamais atteintes avec les membranes de l'état de la technique.
La création de sites polaires à la surface du film biocompatible de polycarbonate correspond principalement à l'augmentation de la proportion de groupements carbonyle, hydroxy ou aminé, et des radicaux libres. Les radicaux libres se recombinent entre eux, ou avec l'oxygène de l'air, créant ainsi des sites polaires.
De préférence, les sites polaires présents à la surface du film biocompatible de polycarbonate constitutif de la membrane semi-perméable de l'invention comprennent les sites suivants:
CH3O, C2H3O, C3H3O, C3H7O, O, OH, C2OH, C8H50, NH4 +, C2H8N+, R-OH (alcool), (R)3-NH (aminé) et R-CO-NH (amide), dans lesquels le substituant R représente un radical constitutif du polymère de polycarbonate du film de polycarbonate poreux.
De manière tout à fait préférée, la membrane semi-perméable selon l'invention est caractérisée en ce que la taille des pores du film de polycarbonate est comprise entre 5 et 30 nanomètres, de préférence entre 5 et 15 nanomètres.
La membrane semi-perméable selon l'invention est aussi caractérisée en ce qu'elle possède un seuil de coupure compris entre 10.000 et 50.000 Daltons, de préférence entre 10.000 et 30.000 Daltons, et de manière tout à fait préférée entre 10.000 et 15.000 Daltons.
Selon encore une autre caractéristique, la membrane semi-perméable selon l'invention possède une densité de pores comprise entre 109 et 1011 pores/cm2.
Les caractéristiques à la fois de taille des pores et de leur densité impliquent que le pourcentage de surface ouverte de la membrane semi- perméable selon l'invention est très faible et ne provoque pas de diminution significative des propriétés mécaniques de résistance qui sont observées pour un film de polycarbonate non poreux.
Avantageusement, la membrane semi-perméable de l'invention possède une épaisseur comprise entre 5 μm et 25 μm, de préférence entre 10 μm et 20 μm.
Selon une autre caractéristique avantageuse de la membrane semi- perméable de l'invention, la couche d'au moins un polymère hydrophile possède une épaisseur comprise entre 10 et 100 nanomètres, préférentiellement entre 10 et 50 nanomètres et de manière tout à fait préférée entre 10 et 30 nanomètres.
Selon un premier mode de réalisation, la couche d'au moins un polymère hydrophile peut recouvrir les deux faces du film biocompatible de polycarbonate.
Dans un second mode particulier de réalisation, la couche d'au moins un polymère hydrophile ne recouvre qu'une seule des deux faces du film biocompatible de polycarbonate, préférentiellement la face du film de polycarbonate qui est située du côté externe de l'organe bio-artificiel et qui est en contact avec le milieu environnant le lieu d'implantation de cet organe.
Le film biocompatible de polycarbonate constitutif d'une membrane semi-perméable de l'invention peut par exemple être fabriqué conformément à l'enseignement du brevet américain n°US 4,956,219 délivré le 11 Septembre 1990.
Ce brevet américain décrit un film de polycarbonate dont les pores ont été formées par bombardement électronique ou par bombardement d'ions lourds, avant une étape chimique d'érosion. La densité des ions lourds bombardés à la surface du film de polycarbonate détermine la densité des pores tandis que le temps de traitement d'érosion chimique détermine la taille des pores créées. La mise en oeuvre d'une telle technique permet l'obtention de film de polycarbonate biocompatible poreux possédant une grande homogénéité dans la distribution des pores ainsi qu'une grande homogénéité dans la taille des pores. Ces caractéristiques confèrent à la membrane semi- perméable de l'invention une excellente reproductibilité dans la valeur du seuil de coupure ainsi que dans le volume des échanges des fluides à travers la membrane.
Constitue un polymère hydrophile au sens de l'invention, un polymère, lequel, après application sur un film de polycarbonate poreux présente une valeur d'angle inférieure à 25°, de préférence inférieure à 22° après mesure selon le test de la « goutte sessile » décrit à l'exemple 2.
Préférentiellement, le polymère hydrophile est soluble dans l'eau. En effet, du fait de l'implantation de l'organe bio-artificiel dans le corps d'un organisme hôte, l'utilisation de solvants organiques est exclu car leur élimination totale est difficile, et leur présence, même en faibles quantités, n'est pas compatible avec une utilisation thérapeutique ou chirurgicale chez l'homme ou l'animal.
De préférence, le matériau polymère hydrophile est choisi parmi les polymères hydrophiles suivants :
- les celluloses et leurs dérivés, tels que j'hydroxypropyl méthylcellulose (HPMC), par exemple la HPMC E4M commercialisée par la Société DOW
CHEMICALS, ou celle dénommée Aqualon commercialisée par la Société Hercules, ou encore la carboxyméthylcellulose commercialisée par la Société DOW CHEMICALS;
- les polyacrylamides et leurs copolymères, tels que ceux commercialisés par la Société SIGMA (UPSALA, Suède):
- la polyvinylpyrrolidone (PVP) et ses copolymères, tels que ceux commercialisés par la Société BASF/Laserson, comme le Kollidon;
- les copolymères de l'acétate de vinyle, tel que le copolymère de polyacétate de vinyle et d'alcool polyvinylique commercialisé sous le nom de Mowiol par la Société HOECHST/CLARIANT;
- les polyéthylène glycols, tels que ceux commercialisés par la Société SIGMA;
- les propylène glycols ;
- les poly(méth)acrylates hydrophiles, tels que ceux commercialisés par les Sociétés DEGALAN ou DEGUSSA;
- les polyosides ; - les chitosans, tels que ceux commercialisés par la Société SIGMA. On entend par polymère hydrophile selon l'invention, aussi bien un matériau polymère constitué de l'un des polymères hydrophiles tels que définis ci-dessus qu'un mélange de plusieurs des polymères hydrophiles ci-dessus, en général un mélange de deux ou de trois des polymères hydrophiles ci-dessus. L'invention a également pour objet une chambre d'encapsulation de cellules produisant au moins une substance biologiquement active d'intérêt caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une membrane semi-perméable telle que définie ci-dessus. Une chambre d'encapsulation selon l'invention peut avoir les caractéristiques de toute chambre d'encapsulation de cellules connue de l'état de la technique, et plus particulièrement des chambres d'encapsulation de cellules qui sont constitutives d'organes bio-artificiels décrits dans l'état de la technique. A titre illustratif, mais non limitatif, d'un mode de réalisation d'une chambre d'encapsulation de cellules selon l'invention, une telle chambre d'encapsulation est telle qu'illustrée à la figure 1A.
Selon ce mode de réalisation particulier, la chambre d'encapsulation est de forme cylindrique et comprend un support (4) sur lequel vient se solidariser le bord externe d'une membrane semi-perméable telle que définie ci-dessus. La chambre d'encapsulation comprend au moins deux membranes semi-perméables, respectivement une membrane semi-perméable supérieure (1) et une membrane semi-perméable inférieure (2) lesquelles, en combinaison avec les bords du support externe (4) délimitant l'enceinte de la chambre d'encapsulation dans laquelle sont contenues des cellules produisant au moins une substance biologiquement active d'intérêt.
La chambre d'encapsulation selon l'invention peut également comprendre une troisième membrane semi-perméable (3) conforme à l'invention de telle manière à ce que ladite chambre d'encapsulation comprenne deux enceintes closes distinctes contenant chacune des cellules produisant une substance biologiquement active d'intérêt.
L'invention a donc encore pour objet une chambre d'encapsulation de cellules produisant au moins une substance biologiquement active d'intérêt caractérisée en ce qu'elle comprend deux membranes semi-perméables conformes à l'invention, respectivement inférieures et supérieures, dont les bords externes sont solidaires d'un support, les deux membranes délimitant un espace susceptible de contenir les cellules produisant au moins une substance biologiquement active d'intérêt.
La chambre d'encapsulation selon l'invention peut être de forme circulaire. Les cellules produisant au moins une substance biologiquement active d'intérêt peuvent être, par exemple, des cellules des îlots de Langherans, qui produisent de l'insuline lorsque la chambre d'encapsulation est destinée à la fabrication d'un pancréas bio-artificiel.
Les cellules peuvent aussi être des cellules hépatiques lorsque la chambre d'encapsulation est destinée à la fabrication d'un foie bio-artificiel.
Dans un mode de réalisation particulier, les cellules sont transfectées ou transformées par au moins un acide nucléique permettant l'expression d'une substance biologiquement active d'intérêt. Parmi les substances biologiquement actives d'intérêt, on peut citer, à titre illustratif, l'insuline, les cytokines, les hormones peptidiques, l'hormone de croissance et la calcitonine.
De manière générale, on entend par « substance biologiquement active » au sens de l'invention, une substance qui est libérée ou sécrétée par la cellule qui la produit et exerce son effet sur une cellule cible ou sur une molécule cible dans l'organisme hôte, comme par exemϋle un neurotransmetteur, une hormone, un facteur de croissance ou une cytokine.
Une grande diversité de cellules peut être utilisée, incluant des lignées cellulaires immortalisées comme des cultures primaires de cellules en division.
Les cellules peuvent être par exemple des myoblastes, qui sont des cellules précurseurs des cellules musculaires dérivées des populations de cellules souches du mésoderme, et qui peuvent être facilement transformées par un acide nucléique permettant l'expression de la substance biologiquement active d'intérêt. L'homme du métier pourra avantageusement se référer par exemple aux demandes PCT publiées sous les numéros WO 94/02129, WO 93/03768 et WO 90/15863. Les cellules peuvent aussi être des cellules bêta des îlots de
Langherans du pancréas ou encore des hépatocytes, de préférence d'origine humaine.
De préférence, les cellules contenues dans une chambre d'encapsulation selon l'invention sont incluses dans une matrice, telle qu'une matrice de collagène de type IV, le cas échéant en association avec de la laminine, de l'entactine et de l'héparane sulfate comme la matrice commercialisée sous le nom de Matrigel.
Les cellules contenues dans une chambre d'encapsulation conforme à l'invention peuvent, de manière générale, être incluses dans une matrice composée de tout produit ou combinaison de produits permettant l'immobilisation de ces cellules sous une forme viable.
Les cellules produisant au moins une substance biologiquement active d'intérêt peuvent être également encapsulées dans une matrice d'alginate.
Selon un autre aspect, l'invention est également relative à un organe bio-artificiel caractérisé en ce qu'il comprend une chambre d'encapsulation ou une pluralité de chambres d'encapsulation telles que définies ci-dessus.
Les caractéristiques d'un organe bio-artificiel selon l'invention peuvent être de toute nature connue en soi dans l'état de la technique.
Pour la réalisation d'un organe bio-artificiel de l'invention, dont la caractéristique essentielle est de comprendre au moins une chambre d'encapsulation de cellules dotées d'une membrane semi-perméable telle que définie dans la présente description, l'homme du métier pourra avantageusement se référer aux brevets US N° 5,981 ,211 délivré le 9 Novembre 1999. US 4.578.191 délivré le 25 Mars 1986. US 5.837.234 délivré le 17 Novembre 1998, US 6,023,009 délivré le 8 Février 2000, US 5,605,835 délivré le 25 Février 1997 et US N°4,323,457 délivré le 6 Avril 1982.
Dans un mode de réalisation particulier de l'organe bio-artificiel selon l'invention, cet organe bio-artificiel comprend une pluralité de chambres d'encapsulation de cellules, comme cela est illustré à la figure 1B. Un tel organe bio-artificiel comprend un support (4) comprenant une pluralité de chambres d'encapsulation (6). Le support (4) peut être constitué par exemple en silicone.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, l'organe bioartificiel est un pancréas bioartificiel contenant des cellules des îlots de Langherans , de préférence encapsulées au sein d'une matrice.
Selon un second mode particulier de réalisation de l'invention, l'organe bio-artificiel est un foie artificiel contenant des cellules hépatiques.
A titre illustratif, un organe bio-artificiel selon l'invention peut être implanté de manière intra-péritonéale ou encore au-dessus de la capsule rénale. Un autre objet de l'invention consiste en un procédé d'obtention d'une membrane semi-perméable pour chambres d'encapsulation de cellules produisant au moins une substance biologiquement active d'intérêt, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) création de sites polaires à la surface d'un film biocompatible de polycarbonate poreux; b) trempage du film de polycarbonate ainsi traité dans une solution aqueuse d'au moins un polymère hydrophile; et c) séchage. De manière préférentielle, la création de sites polaires à la surface du film biocompatible de polycarbonate est réalisée par un traitement par plasma, par décharge couronne ou encore par décharge électromagnétique à pression atmosphérique ou sous vide.
De manière préférentielle, le support est traité par un plasma radio- fréquence d'argon. Il peut être traité à une puissance d'émission du réacteur à plasma comprise entre 3 et 10 watts par litre de capacité du réacteur, durant entre environ 1 et 20 minutes. Le traitement peut aussi être effectué par un plasma micro-onde, à la même, puissance, mais durant 5 secondes à 20 minutes. Ue manière préférée, le traitement par plasma est effectué sous vide.
Pour la mise en oeuvre d'un procédé de traitement par plasma, l'homme du métier pourra avantageusement se référer à l'ouvrage, de André Ricard intitulé « Plasmas réactifs » et publié aux éditions SVF en 1995.
Le traitement peut aussi être effectué par décharge couronne. La tension de traitement est avantageusement comprise entre 50 et 500 volts, l'intensité étant variable selon le dispositif de traitement et les supports traités. La durée du traitement est de l'ordre de quelques dixièmes de seconde, préférentiellement compris entre 0,1 et 1 seconde. En cas de traitement en continu, la durée d'exposition est telle que le matériau à traiter passe à travers le dispositif de traitement à une vitesse de quelques centimètres à plusieurs décimètres par seconde.
En outre, le film biocompatible de polycarbonate peut être traité à plusieurs reprises afin d'augmenter l'efficacité du traitement.
Le traitement par décharge couronne peut être effectué à l'aide de dispositifs à électrodes parallèles en vis-à-vis, à électrodes parallèles côte à côte (arc électrode d'environ 5 mm de hauteur), ou à arc soufflé (électrodes parallèles côte à côte avec courant gazeux entre elles, créant ainsi un arc électrique d'environ 10 cm de hauteur).
Pour la réalisation d'un procédé de traitement par décharge couronne ou par décharge électromagnétique, l'homme du métier pourra avantageusement se référer à l'ouvrage de André RICHARD (1995) cité ci- dessus.
De manière tout à fait préférée, la création de sites polaires est réalisée par une étape de traitement par plasma d'argon effectuée à la puissance de 50 watts pendant dix minutes. Dans ce mode de réalisation particulier, il a été observé à la surface du film biocompatible de polycarbonate, par mesure de spectrométrie de masse des ions secondaires, la composition suivante, en sites polaires quantifiée par l'intensité des ions secondaires détectés aux rapports masse/charge (m/z) suivants:
- en mode positif: 31 (CH30), 43 (C2H30), 55 (C3H3O), 59 (C3H70), 18(NH4 +) et 46 (C2H8N+); et
- dans le mode négatif : 16(0), 17(OH), 41(C2OH), 117 (C8H50); Grâce au traitement par plasma du film biocompatible de polycarbonate, on obtient une oxydation stable dans le temps, notamment par la création, de groupes oxydants tels que des groupements alcool, acide et carbonyle ce qui accroît l'hydrophilicité de la surface du film de polycarbonate et donc également son énergie de surface. Par exemple, l'indice de mouillage correspondant à la valeur de l'angle (thêta) pris au point de raccordement d'une goutte de liquide avec la surface du film de polycarbonate sur laquelle elle est déposée passe de 74° environ avant traitement par plasma (Es=41 mJ.m"2) à 29°.
Il a été montré selon l'invention que le recouvrement du film biocompatible de polycarbonate, après création de sites polaires, par une couche d'au moins un polymère hydrophile augmentait considérablement ces propriétés d'hydrophilicité, puisque l'indice de mouillage observé après recouvrement par la PVP est d'environ 22°, à comparer avec la valeur d'indice de mouillage de 74° observée pour le film de polycarbonate avant traitement.
L'étape b) de recouvrement du film de polycarbonate après création des sites polaires par une couche d'au moins un polymère hydrophile peut être réalisée par trempage. Quel que soit le type de polymère hydrophile utilisé, la quantité de ce polymère, en poids total de la solution, est de préférence ajustée de manière à obtenir une solution aqueuse de polymère hydrophile ayant une viscosité comprise entre 1 et 10 centipoises. Par exemple, une valeur de viscosité de l'ordre de 5 à 10 centipoises
(cPs) est obtenue pour une concentration de 1% en poids de PVP (Kollidon K90 commercialisé par la Société BASF) pour une concentration de 0,2% en poids de HPMC (E4M commercialisée par DOW CHEMICALS). Les mesures de viscosité sont réalisées à l'aide d'une aiguille de type DIN 30D, à température ambiante et pour une vitesse de rotation de 300 à 500 t/min.
A titre illustratif, lorsque le polymère hydrophile est de l'hydroxypropyl méthylcellulose (HPMC), de la polyvinylpyrrolidone (PVP) ou encore un mélange de ces deux polymères, le pourcentage en poids du polymère hydrophile, par rapport au poids total de la solution aqueuse de polymère, est avantageusement compris entre 0,1% et 1%. La durée de l'étape de trempage du film de polycarbonate dans une solution de polymère hydrophile est ajustée de telle manière à obtenir une couche de polymère d'une épaisseur comprise entre 10 et 100 nanomètres.
De manière tout à fait préférée, la durée de l'étape du trempage est comprise entre 5 secondes et 10 minutes.
Avantageusement, l'étape de trempage a lieu dans une solution aqueuse de polymère hydrophile à une température comprise entre 15°C et 25°C de préférence à température du laboratoire.
L'étape de séchage c) peut être réalisée par tout moyen connu de l'état de la technique.
Préférentiellement, l'ensemble des étapes du procédé d'obtention d'une membrane semi-perméable selon l'invention est réalisée dans des conditions d'asepsie et en utilisant des matériaux stériles et si possible apyrogènes. Avantageusement, le procédé selon l'invention comprend une étape supplémentaire de stérilisation de la membrane semi-perméable, qui peut être réalisée indifféremment à froid ou à chaud selon des techniques bien connues de l'homme du métier.
A titre illustratif, l'étape de stérilisation peut être réalisée à l'aide d'une autoclave, par exemple à la température de 121 °C pendant 20 minutes sans entraîner d'altération significative des caractéristiques avantageuses de la membrane semi-perméable.
La membrane semi-perméable peut être conservée stérilement avant usage, par exemple dans une solution saline physiologique telle qu'une solution à 0,9% en poids de chlorure de sodium.
Selon un autre aspect, la membrane semi-perméable de l'invention peut être conservée à sec, préférentiellement à une température d'environ 4°C.
L'invention est en outre illustrée, sans pour autant être limitée, par les figurés et les exemples suivants.
FIGURES
La figure 1 illustre une chambre d'encapsulation de cellules produisant une substance biologiquement active selon l'invention ainsi qu'un organe bio- artificiel comprenant une pluralité de chambres d'encapsulation.
La figure 1A illustre une coupe transversale d'une chambre d'encapsulation.
La figure 1B illustre une vue du dessus d'un organe bio-artificiel comprenant 20 chambres d'encapsulation selon l'invention.
EXEMPLES
EXEMPLE 1 - Fabrication d'une membrane semi-perméable selon l'invention.
Pour la fabrication d'une membrane semi-perméable selon l'invention, on a utilisé des films biocompatibles de polycarbonate de différentes caractéristiques:
- épaisseur de 10, 16 et 20μm; - densité de pores de 2.106, 4,5 108, 2.109, 4.109 et 8 109 pores/cm2;
- diamètre de pore 20 à 2000 nanomètres.
Le film biocompatible de polycarbonate a été traité par plasma d'argon dans une enceinte de volume de 20 litres à la puissance de 50 watts pendant
10 minutes à la pression d'environ 1 mbar et à température proche de la température ambiante. La décharge est du type capacitif, à la fréquence de
13,56 Mhz. Après création de sites polaires à la surface du film de polycarbonate par le traitement par plasma, le film de polycarbonate est soumis à un trempage pendant 1 minute dans une solution aqueuse à 1% en poids de polyvinylpyrrolidone de grade pharmaceutique (Kollidon K90) puis est séché en étuve ventilée pendant 1 heure à une température comprise entre 40°C et 60°C.
EXEMPLE 2 - Etude des indices de mouillage des membranes semi- perméables hydrophiles selon l'invention.
Matériel et méthodes.
1. Mesure du mouillage
L'indice de mouillage est donné par la valeur de l'angle (thêta) pris au point de raccordement d'une goutte de liquide avec la surface du support sur lequel elle est déposée. Le chiffre correspondant à cet angle déterminé d'un côté par la droite correspondant à la surface de l'objet, et de l'autre côté, par la tangente à la goutte au point de raccordement goutte/surface du support. Pour une surface hydrophile : la goutte est plate : l'angle est faible ;
Pour une surface hydrophobe : la goutte ressemble à une bille : l'angle est élevé.
Origine de l'eau L'eau utilisée pour les mesures est :
- soit déminéralisée par des résines échangeuses d'ions ;
- soit distillée fraîchement ;
- soit d'origine commerciale : préparation injectable (ppi), eau pure. Cette eau doit être conservée dans des récipients fermés en quartz et à l'abri de la lumière et de la chaleur.
Dépôt de la goutte
Le volume de la goutte est de quelques microlitres. Dans ces conditions, le poids de la goutte est faible, de sorte que la goutte ne se déforme pas de façon importante sous l'effet de la gravité. Cette goutte peut être produite soit avec une micropipette (type Pasteur), soit avec une microseringue. Appareil utilisé
La taille de la goutte ne permet pas de mesurer directement l'angle de contact. Il est nécessaire d'utiliser un appareil optique. Sont proposés :
- un appareil photographique avec objectif macro ;
- un système de projection sur un écran disposant d'un système de graduation des angles ;
- un goniomètre à lunette grossissante : on trouve sur le marché des équipements tels que ceux commercialisés par la Société Ramé-Hart aux
Etats-Unis, par la Société Kruss en Allemagne ou par la Société Kyowa au Japon ;
- un goniomètre avec caméra et informatique commercialisé par la Société Kruss ou par la Société GBX Instruments en France (Digidrop). II est souhaitable que l'équipement soit localisé dans un local à une température constante, proche de 20°C.
Les mesures présentées dans les exemples ci-après sont faites avec l'équipement Digidrop, selon la technique détaillée ci-dessous.
La goutte est formée à l'extrémité de la seringue (ou de la micropipette), puis le support est rapproché lentement de la goutte (goutte sessile). L'image de la goutte et de la surface apparaît immédiatement sur l'écran : le travail de mesure de l'angle se fait sur cette image. La mesure est faite soit automatiquement, soit de façon manuelle en pointant avec la souris de l'ordinateur les deux points de raccordement goutte/surface ainsi que le sommet de la goutte : l'ordinateur calcule automatiquement la valeur de l'angle de contact. Il est préférable de réaliser la mesure de façon manuelle, des problèmes de reflets venant parfois perturber complètement la lecture de l'image par la caméra lorsque celle-ci travaille en mode automatique.
La mesure est effectuée environ 5 secondes après le dépôt de la goutte. En effet, dans le cas de certaines surfaces hydrophiles, un étalement progressif au cours du temps peut être constaté. Par ailleurs, une évaporation de l'eau a lieu, ce qui n'est cependant pas perceptible dans les 5 secondes après le dépôt. Pour chaque surface, un minimum de trois mesures est réalisé et la valeur moyenne est calculée ainsi que la valeur de l'écart type.
Les images et les valeurs des angles sont enregistrées par l'ordinateur.
Les indices de mouillage, représentés par les valeurs de l'angle thêta pris au point de raccordement d'une goutte de liquide avec la surface du matériau testé ont été mesurés en comparant le film de polycarbonate avant ou après traitement par plasma, et après traitement par plasma puis recouvrement par le polymère hydrophile.
On a utilisé comme matériau de départ un film de polycarbonate de 20 μm d'épaisseur, ayant une taille de pore de 30 nm et une densité de pores de 8 X 109/cm2.
Le traitement par plasma et le recouvrement par une couche de polymère ont été réalisés comme décrit à l'exemple 1.
Avant tout traitement, on a mesuré une valeur d'angle d'environ 74° pour le film de polycarbonate, ce qui reflète une hydrophobicité de la surface de ce film.
Après traitement par plasma d'argon, la valeur d'angle est d'environ 29°. La création de sites polaires à la surface du film de polycarbonate a donc fortement augmentée l'énergie de surface et le caractère hydrophile de ce film. Après recouvrement du film de polycarbonate prétraité par plasma d'argon par une couche d'un polymère hydrophile, en l'occurrence la PVP, on peut mesurer une valeur d'angle d'environ 22°.
Ainsi, la couche de polymère hydrophile augmente significativement les propriétés d'hydrophilicité du film de polycarbonate. On a donc montré que la surface d'une membrane semi-perméable conforme à l'invention avait des caractéristiques d'hydrophilicité significativement accrues par rapport au film de polycarbonate non traité.
De plus, la rétention du polymère hydrophile à la surface du film de polycarbonate grâce à la création de sites polaires permet un maintien des caractéristiques d'hydrophilicité pendant une longue période.
EXEMPLE 3: Caractéristiques de perméabilité d'une membrane semi-perméable conforme à l'invention.
a) Matériels et Méthodes - Mesure de la perméabilité au glucose, à l'insuline et aux immunoglobulines (IgG).
1. Test de perméabilité passive
La perméabilité au glucose, à l'insuline, aux immunoglobulines des membranes polycarbonate traitées ou non est évaluée au moyen d'une chambre de diffusion. Cette chambre est composée de deux compartiments de 3 ml chacun séparés par la membrane à tester d'une surface de 3,8 cm2. Les tests sont réalisés à 37°C avec une concentration initiale en glucose de 4 g/1, en insuline humaine de 4 mUI/ml et en IGG bovine à la concentration de 1 mg/ml. Au temps O, 0.5, 1 , 4, 8, 12 et 24 heures, des prélèvements sont effectués dans les deux compartiments pour la mesure du glucose selon une méthode enzymatique de l'insuline par RIA et des immunoglobulines par colorimétrie (Bradford).
2. Test de perméabilité active
La perméabilité active aux IgG est réalisée à température ambiante à l'aide d'une chambre d'ultrafiltration d'un volume de 12 ml équipée de la membrane à tester. La perméabilité aux immunoglobulines est évaluée sous une pression de 1 bar. La concentration en protéine est dosée dans l'ultrafiltrat après une heure par la méthode de Bradford.
b) Résultats
La perméabilité d'une membrane semi-perméable réalisée à partir d'un film de polycarbonate ayant une taille de pore de 30 nanomètres et une densité de pore de 8.109 pore/cm2 commercialisée par la Société Wathman Group a été étudiée à 20°C pendant 1 heure, 8 heures et 24 heures.
Les résultats sont présentés dans le tableau 1 ci-après. TABLEAU 1
Figure imgf000020_0001
Les résultats du tableau 1 montrent que la membrane semi-perméable conforme à l'invention a des propriétés de perméabilité au glucose environ huit fois supérieures au film de polycarbonate après 1 heure, et environ 3 fois supérieures au film de polycarbonate après traitement par plasma d'argon durant la même période de temps.
Ces résultats montrent que la membrane semi-perméable de l'invention permet des échanges rapides de petites molécules de part et d'autre de la membrane. La rapidité du flux des échanges des substances biologiquement actives d'intérêt de nature à permettre un apport rapide de l'organisme en substances biologiquement actives d'intérêt produites par un organe bioartificiel doté d'une membrane semi-perméable conforme à l'invention.
La capacité du flux d'échange de petites molécules à travers la membrane semi-perméable de l'invention est encore significative au bout de 24 heures (voir tableau 1).
Les résultats de perméabilité au glucose mesurés à 37°C sont représentés dans le tableau 2 ci-après. TABLEAU 2
Figure imgf000021_0001
Les résultats du tableau 2 montrent qu'à 37°C, le flux des échanges de petites molécules de part et d'autre d'une membrane semi-perméable conforme à l'invention est supérieur de 50% par rapport au film de polycarbonate poreux non traité, après 1 heure. Des tests de perméabilité aux immunoglobulines (IgG) d'une membrane semi-perméable conforme à l'invention ont été. réalisés à la température de 37°C.
Les résultats montrent qu'au bout de 8 heures de test, la perméabilité aux IgG est de l'ordre de 1 %. L'ensemble des résultats ci-dessus montre que la membrane semi- perméable selon l'invention permet un passage rapide des petites molécules mais est imperméable aux molécules de poids moléculaire de plusieurs centaines de kilo Daltons telles que les IgG.
En conséquence, un organe bio-artificiel doté d'une membrane semi- perméable de l'invention permet une accessibilité rapide des substances biologiquement actives produites par cet organe bio-artificiel aux cibles de l'organisme hôte tout en restant inaccessible aux anticorps et aux cellules du système immunitaire de cet organisme hôte.
En outre, le passage rapide de petites molécules est de nature à permettre une grande accessibilité des différents nutriments nécessaires à une bonne viabilité des cellules contenues dans l'organe bio-artificiel ainsi que, le cas échéant, de molécules signal produites par l'organisme hôte et qui peuvent avoir un rôle dans la régulation de la production des substances biologiquement actives produites par l'organe bio-artificiel, comme par exemple le glucagon qui régule la synthèse d'insuline par les cellules des îlots de Langherans.
EXEMPLE 4: Adsorption des protéines
a) Matériels et Méthodes
Les supports sur lesquels les protéines ont été adsorbées consistaient d'une part en un film de polycarbonate de bisphénol A (PC), de 15 micromètres d'épaisseur, provenant de la firme GENERAL ELECTRIC (Lexan 8800) et, d'autre part, de membranes hydrophiles de 10 micromètres d'épaisseur, provenant de la S.A. WATHMAN (Louvain-la-Neuve, Belgique), présentant des pores de 400 nm de diamètre avec une densité de 6.108 pores/cm2. Certaines membranes avaient été traitées par plasma d'argon (50 W, 10 min) et ensuite trempées dans une solution de polyvinylpyrrolidone.
Les adsorptions ont été réalisées en incubant à 37°C pendant 2 heures les échantillons (disque de 13 mm de diamètre) dans 2 ml de solutions d'albumine bovine (bovine sérum albumin, Sigma - St Louis Ml) et d'insuline humaine (Novo Nordisk, Denmark) de concentration variable (0 < c < 10 mg/ml pour l'albumine et 0 < c 10 μl/ml pour l'insuline). Les échantillons ont été ensuite rincés 3 fois avec du PBS (phosphate buffer saline, ajusté à un pH de 7.4) et 3 fois avec de l'eau ultrapure. Ils ont été ensuite séché sous flux d'azote et stockés avant analyse dans un dessiccateur contenant du P2O5.
b) Résultats
L'adsorption d'albumine sur une membrane semi-perméable conforme à l'invention a été étudiée par corrélation entre les résultats d'analyse de spectroscopie XPS (« X-ray photoelectron spectroscopy ») et Tof-Sims (« Time of flight secondary ion mass spectroscopy ») selon la technique décrite par Rpuxhet L. et Bertrand P. (« Secondary ion mass spectrometry, Sims XII », eds. A. Benninghoven, Bertrand P. H.-N. Migeon et W. Werner (Editors), Elsevier Science B.V. Publ., 2000, 907-910).
Les résultats montrent que l'adsorption d'albumine ou d'insuline atteint rapidement un plateau pour des concentrations en ces protéines de l'ordre du milligramme par millilitre, indiquant que ces protéines couvrent la surface de la membrane semi-perméable sous la forme d'une mono-couche ou encore d'une mono-couche partielle.
Les résultats obtenus montrent que la membrane semi-perméable selon l'invention, du fait de la présence de la couche d'au moins un polymère hydrophile, a une capacité réduite d'adsorption des protéines à sa surface, ce qui est de nature à maintenir ces capacités de perméabilité pendant une longue période de temps.
EXEMPLE 5: Analyse des sites polaires créés à la surface du film de polycarbonate après traitement par plasma d'argon.
a) Matériels et Méthodes
L'analyse des sites polaires à la surface des différentes membranes étudiées a été réalisée par corrélation entre les résultats d'analyse de spectroscopie XPS et Tof-Sims, comme pour l'exemple 4.
b) Résultats
Un film de polycarbonate commercialisé par la Société Whâtman
Group et ayant une épaisseur de 16 μm, une taille de pore de 30 nanomètres et une densité de pores de 2.109 pores/cm2 a été analysé par XPS et TOF- SIMS avant et après traitement par plasma d'argon.
Avant traitement par plasma d'argon, l'analyse ToF-SIMS a montré les pics caractéristiques du polycarbonate (en mode négatif à m/z= 60, 93, 117, 133, 149, 211 , 227, 255 et en mode positif à m/z = 135, 213, 329, 71 , 91 , 105, 128, 141 , 152, 165, 178, 193). La présence de PVP est également détectée au moyen de ses pics caractéristiques (en mode positif à m/z = 41 , 69, 86, 98, 112, 124, 138, 207, 233 et en mode négatif à m/z = 26 (CN), 42 (CNO), 84, 108). Ceci résulte d'un traitement initial par trempage réalisé par le fabricant de la membrane.
Après traitement par plasma d'argon, les pics suivants ont été observés :
- en mode positif (m/z): 31 (CH30), 43(C2H30), 55(C3H30), 59(C3H70), 18 (NH4 +) et 46(C2H8N+); et
- en mode négatif (m/z): 16 (O), 17(OH), 41 (C2OH), 117(C8H50). Les résultats ci-dessus montrent que le traitement par plasma d'argon a permis la création de nombreux sites polaires à la surface du film de polycarbonate qui permettent, au travers de la création de liaisons faibles, une bonne adhésion de la couche d'au moins un polymère hydrophile et son maintien durable à la surface du film de polycarbonate.
EXEMPLE 6 - Pancréas bio-artificiel comprenant des membranes semi- perméables conformes à l'invention.
Un pancréas bio-artificiel comprenant plusieurs membranes semi- perméables conformes à l'invention a été construit comme illustré à la figure 1.
La structure du pancréas bio-artificiel comprenant un support de silicone est commercialisée par la Société STATICE.
Un pancréas bio-artificiel contenant 20.000 îlots de Langherans pancréatique a été fabriqué pour implantation chez le porc.
Le pancréas bio-artificiel est composé de 20 chambres d'encapsulation comprenant chacune trois membranes semi-perméables de l'invention, chacune des chambres d'encapsulation étant solidaire d'un support flexible en silicone.
Le pancréas bio-artificiel a été implanté dans la cavité péritonéale de porcs miniatures sous anesthésie au moyen d'une laparotomie.
Après un mois d'implantation, le pancréas bio-artificiel a été retiré afin d'analyser sa résistance mécanique ainsi que l'état de sa surface par microscopie électronique à balayage.
Les résultats montrent que le pancréas bio-artificiel n'a pas subi d'altération mécanique: aucune chambre d'encapsulation ne s'est désolidarisée du système ou n'a été ouverte sous l'effet des contraintes mécaniques. En outre, le résultat de l'analyse des clichés de microscopie photonique, après lavage des membranes et coloration histologique, a montré qu'aucune cellule n'avait adhéré sur l'implant, qu'il s'agisse du support en silicone ou de la membrane semi-perméable de l'invention.
Par comparaison, un support en fibres de polyester implanté parallèlement chez le porc miniature était couvert de fibroblastes et de dépôts de fibrine.

Claims

Revendications
1. Membrane semi-perméable pour chambre d'encapsulation de cellules produisant au moins une substance biologiquement active d'intérêt, caractérisée en ce que ladite membrane semi-perméable comprend un film biocompatible de polycarbonate poreux modifié en surface par création de sites polaires et recouvert par une couche d'au moins un polymère hydrophile .
2. Membrane selon la revendication 1 , caractérisée en ce qu'elle possède un seuil de coupure compris entre 10 000 et 50 000 Daltons, de préférence entre 10 000 et 30 000 Daltons.
3. Membrane selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisée en ce que la taille des pores du film de polycarbonate est comprise entre 5 et 30 nanomètres, de préférence entre 5 et 15 nanomètres.
4. Membrane selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle possède un densité de pores comprise entre 109 et 1011 pores/cm2.
5. Membrane selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que la couche d'au moins un polymère hydrophile possède une épaisseur comprise entre 10 et 100 nanomètres.
6. Membrane selon la revendication 1 , caractérisée en ce qu'elle possède une épaisseur comprise entre 5 μm et 25 μm.
7. Membrane selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que le polymère hydrophile est choisi parmi les celluloses et leurs dérivés, les polyacrylamides et leurs copolymères, la polyvinylpyrrolidone (PVP) et ses copolymères, les copolymères de l'acétate de vinyle et de l'alcool vinylique, les polyethylene glycols, les propylène glycols, les propylène glycols, les poly(méth)acrylates hydrophiles, les polyosides et les chitosans.
8. Chambre d'encapsulation de cellules produisant au moins une substance biologiquement active d'intérêt caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une membrane selon l'une des revendications 1 à 7.
9. Chambre d'encapsulation selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle comprend deux membranes, respectivement inférieures (2) et supérieures (1), selon l'une des revendications 1 à 6 dont les bords sont solidaires d'un support (4), les deux membranes délimitant un espace susceptible de contenir les cellules produisant au moins une substance biologiquement active d'intérêt.
10. Chambre d'encapsulation selon la revendication 9, caractérisée en ce que chacune des membranes est de forme circulaire.
11. Chambre d'encapsulation selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisée en ce qu'elle contient des cellules produisant au moins une substance biologiquement active d'intérêt.
12. Chambre d'encapsulation selon la revendication 11, caractérisée en ce que les cellules sont choisies parmi les cellules hépatiques et les cellules des îlots de Langherans..
13. Chambré d'encapsulation selon la revendication 11, caractérisée en ce que les cellules sont transformées par au moins un acide nucléique permettant l'expression d'une substance biologiquement active d'intérêt.
14. Chambre d'encapsulation selon la revendication 11 , caractérisée en ce que la substance biologiquement active d'intérêt est choisie parmi l'insuline, les cytokines, les hormones peptidiques, l'hormone de croissance et la calcitonine.
15. Organe bio-artificiel caractérisé en ce qu'il comprend une chambre d'encapsulation ou une pluralité de chambres d'encapsulation selon l'une quelconque des revendications 8 à 14.
16. Organe bio-artificiel selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un pancréas artificiel contenant des cellules des îlots de Langherans.
17. Organe bio-artificiel selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un pancréas artificiel dans lequel la chambre d'encapsulation ou la pluralité de chambres d'encapsulation comprend des cellules des îlots de Langherans, les cellules étant de préférence inclues dans une matrice de collagène.
18. Procédé d'obtention d'une membrane semi-perméable pour chambre d'encapsulation de cellules produisant au moins une substance biologiquement active d'intérêt, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) création de sites polaires à la surface d'un film biocompatible de polycarbonate poreux ; b) recouvrement du film de polycarbonate ainsi traité par une couche d'au moins un polymère hydrophile ; et c) séchage.
19. Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que l'étape a) est réalisée par un traitement par plasma, par décharge couronne ou encore par décharge électromagnétique à pression atmosphérique ou sous vide.
20. Procédé selon l'une des revendications 18 ou 19, caractérisé en ce que dans l'étape b), le polymère hydrophile est choisi parmi les celluloses et leurs dérivés, les polyacrylamides et leurs copolymères, la polyvinylpyrrolidone (PVP) et ses copolymères, les copolymères de l'acétate de vinyle et de l'alcool vinylique, les polyethylene glycols, les propylène glycols, les propylène glycols, les poly(rnéth)acrylates hydrophiles, lés polyosides et les chitosans.
21. Procédé selon l'une des revendications 18 à 20, caractérisé en ce que l'étape b) est réalisée avec une solution aqueuse d'au moins un polymère hydrophile qui possède une viscosité comprise entre 1 et 10 centipoises.
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