WO2002061077A1

WO2002061077A1 - Dna encoding novel d-aminoacylase and process for producing d-amino acid by using the same

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Publication number: WO2002061077A1
Application number: PCT/JP2002/000853
Authority: WO
Inventors: Masami Osabe; Katsuyuki Takahashi; Toshifumi Yamaki; Teruo Arii; Toshihiro Oikawa
Original assignee: Mitsui Chemicals Inc
Current assignee: Mitsui Chemicals Inc
Priority date: 2001-02-01
Filing date: 2002-02-01
Publication date: 2002-08-08
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Description

明細書新規な D—アミノアシラーゼをコードする D N Aおよびそれを用いた D—ァミノ酸の製造方法技術分野

本発明は、産業上実用的な基質濃度で高活性を示し、特に N—ァセチル— D L— トリブトファンより D—トリプトフアンを立体選択的に効率よく生成する事を可能とするな新規な D—アミノアシラ一ゼ及びそれを用いた N—ァシルアミノ酸から D —アミノ酸を製造する方法に関する。さらに本発明は、この D—アミノアシラーゼをコードする塩基配列、それを含有するプラスミド及びこのプラスミドにより形質転換された形質転換体に関する。さらに本発明は、この形質転換体を用いた D—ァミノアシラーゼの生産方法に関する。また、本発明は、この形質転換体、その培養液及びこれらの処理物の形で D—アミノアシラーゼを N—ァシルアミノ酸に作用させて N—ァシルアミノ酸から対応する光学活性 D—アミノ酸を製造する方法に関する。

背景技術

D—アミノ酸は様々な農薬、抗生物質、医薬品の中間体として重要な化合物であり、その合成法が盛んに研究されている。現在、 D L—アミノ酸の分割は物理化学的、化学的、酵素的方法で行なう事が出来るが、酵素的方法が最も簡便であり、有利な方法と考えられる。酵素的方法の一つとしで例えば、 D—アミノアシラーゼを用いて N—ァセチル—D L—アミノ酸を加水分解し、対応する D—アミノ酸を直接生産する方法が知られている。

D—アミノアシラーゼの起源としては、シユウドモナス（Pseudomonas) 属（特公昭 6 0— 3 1 4 7 7号公報）、ストレプトミセス（Streptomyses) 属（特公昭 5 3 - 3 6 0 3 5号公報）、アルカリゲネス（Alcal igenes) 属（特公平 0 7— 8 3 7 1 1号公報) ロドコッカス属（Rhodococcus)、ピメロパクター（ melobacter)属（特開平 06— 227789号公報）ァ一スロバクタ一 (Arthrobacter)属、コリネバクテリウム（Corynebacterium)属、エルビニァ（Erwinia)属、エシュリヒア（Eschheria) 属、フラボバクテリゥム（Flavobacterium)属、ノカルディア（Nocardia)属、プロ夕ミノパクター（Protaminobacter) 属、キサントモナス（Xanthomonas)属（特開平 1 1 - 113592号公報）、アミコラトプシス（Amycolatopsis)属（特開平 11—9 8982号公報）、セべキア（Sebekia)属（特開平 11一 318442号公報）、ヒポミセス（Hypomyces)属、フザリウム（Fusarium)属、ォーリクラリア（auricularia) 属、フイシゥム（Pythium)属、メニスポロプシス（Menisporopsis)属（特開平 12— 41684号公報）などの細菌、放線菌またはかびに属する微生物が知られており、これらに由来する D—アミノアシラ一ゼを N—ァシルアミノ酸に作用させて D—ァミノ酸を製造することが報告されている。

しかしながら、これら D—アミノアシラ一ゼは実用的な基質濃度での活性が充分ではなく、産業上実用的な D—アミノアシラーゼが望まれていた。特に N—ァセチルー D—トリプトファンの加水分解については、実用的な基質濃度での酵素の活性は低く、産業上満足のできる酵素とは呼べなかった。近年、 N—ァセチルー D—卜リプトフアンに作用して D—トリブトファンを生成することの出来る D—ァミノァシラ一ゼとして To kuy am aらがヒポミセス（Hypomyces)属の D—アミノアシラ一ゼ（特開平 13— 275688号公報）を Ch i r o t e c h Te c hno l o gy L im i t e d社の Tay 1 o rらがアルカリゲネス（Alcaligenes) 属の D—アミノアシラーゼ（WO00/23598) を報告しているが、どちらの D— アミノアシラーゼも 10 g/ 1程度までの N—ァセチルー D—トリブトファンを加水分解するに過ぎず、実用的な基質濃度での反応を触媒できる酵素とは言い難い。

D—アミノ酸は医薬品原料などとして重要な化合物であり、安価な製法開発が望まれている。しかしながら、 D—アミノ酸を効率よく触媒する事が出来る D—アミノアシラーゼはこれまで一切知られていなかった。発明の開示

本発明の目的は、産業上実用的な基質濃度で充分な高活性を示し、 N—ァシルー D L—アミノ酸より D—アミノ酸を効率よく生成する事が出来る新規な D—ァミノァシラ一ゼ及びそれを用いた N—ァシルアミノ酸からの対応する D—アミノ酸の製造方法を提供することにある。本発明の他の目的は、この D—アミノアシラーゼの生産及び D—アミノアシラーゼを用いた D—アミノ酸の製造に有用な材料としての D—アミノアシラーゼをコードする塩基配列、この塩基配列を組み込んだプラスミド及びこのプラスミドで形質で宿主を形質転換して得られた形質転換体を提供することにある。

本発明者らは上記課題を解決すベく、種々の微生物由来の D—アミノアシラーゼについて、それらの性質を評価した。基質濃度と反応速度の相関性を調べたところ、驚くべき事に公知の D—アミノアシラーゼにおいては、基質濃度が高いほど反応速度は著しく低下するといつた現象、すなわち基質による酵素活性の阻害現象を見出す事が出来た。この現象は特に基質が N -ァセチル— D—トリプトファンの場合が著しく、それゆえに従来の D—アミノアシラーゼにおいては実用的な基質濃度で N 一ァセチルー D L—トリブトファンより D—トリブトファンを効率的に生成する事が困難となっているのではないかと考察するに至った。

そこで、本発明者らは様々な微生物について、 N—ァセチルー D—トリプトファンに対して阻害のかかりにくく、基質濃度が高い場合も高活性を示す新規な D—ァミノアシラーゼの探索した結果、メチロバクテリウム（Methylobacterium) 属に属する微生物及びノカルディオイデス (Nocardioides) 属に属する微生物において、目的に適う新規な D—アミノアシラーゼ活性を有する微生物を発見した。そして、メチロバクテリウム（Methylobacterium) 属に属する微生物由来の D—アミノアシラ一ゼを種々の精製方法を組合せて、配列番号： 3に示される N末端アミノ酸残基の配列の決定に成功した。さらに本発明者等は配列表の配列番号： 1に示される塩基配列を有する D NAを獲得することにより、この塩基配列を有する D NA断片を含んだプラスミドによる形質転換体を取得し、上記の D—アミノアシラ一ゼを活性型として産生させること、さらには実用的な基質濃度において N—ァシルアミノ酸から対応する D—アミノ酸を高効率的で製造することに成功し、本発明を完成するに至った。上記の本発明者らによる新たな知見に基づいて成された本発明は以下の各態様を含むものである。

(1) N—ァシルー D—アミノ酸に作用して対応する D—アミノ酸を生成する反応を触媒する作用を有する D—アミノアシラーゼであって、

水性媒体中で N—ァセチルー D—トリブトファンから D—トリブトファンを生成する反応を触媒する際における N—ァセチル— D—トリブトファンの濃度が 50 g / 1の場合の反応速度が、 N -ァセチルー D—トリブトファンの濃度が 5 g Z 1の場合の反応速度に対して少なくとも 40%である事を特徴とする D—アミノアシラ

■ セ

(2) N—ァセチルー D—トリブトファンの濃度が 100 gZ 1の場合の反応速度が、 N—ァセチルー D—トリブトファンの濃度が 5 g Z 1の場合の反応速度に対して少なくとも 20%である上記項目（1) に記載の D—アミノアシラーゼ。

(3) メチロバクテリウム（Methylobacterium) 属又はノカルディオイデス (Nocardioides) 属に属する微生物由来である上記項目（1) に記載の D—ァミノアシラーゼ。

(4) メチロバクテリウム（Methylobacierimi) 属に属する微生物がメチロバクテリゥム ·メソフイリカム（Methylobacteriummesophilicum) 種、ノカルディオイデス（Nocardioides) 属に属する微生物がノカルディオイデス ·サーモリラシナス

(Nocardioides t ermolilacinus) 種である上記項目（3) に記載の D—アミノアシラーゼ。

(5) ノ力ルディオイァス 'サーモリラシナス (Nocardioides thermolilacinus) 種に属する微生物がノカルディオイデス ·サーモリラシナス（Nocardioides thermolilacinus) ATCC 35863株である上記項目（4) に記載の D—アミノアシラーセ。

(6) N—ァシルー D—アミノ酸に作用して対応する D—アミノ酸を生成する反応を触媒する作用を有する D—アミノアシラーゼであって、

(A) 配列表の配列番号： 2記載のアミノ酸配列または

(B) 該アミノ酸配列に対して前記触媒活性を維持し得る範囲内で 1以上のアミノ酸残基の挿入、欠失または置換を行つて得られる変異ァミノ酸配列を有することを特徴とする D—アミノアシラーゼ。

(7) 水性媒体中で N—ァセチルー D—トリブトファンから D—トリブトファンを生成する反応を触媒する際における N—ァセチルー D—トリブトファンの濃度が 50 g/1の場合の反応速度が、 N—ァセチルー D—トリブトファンの濃度が 5 g Z1の場合の反応速度に対して少なくとも 40%である上記項目（6) に記載の D 一アミノアシラーゼ。

(8) N _ァセチルー D—トリブトファンの濃度が 100 g Z 1の場合の反応速度が、 N—ァセチルー D—トリブトファンの濃度が 5 g / 1の場合の反応速度に対して少なくとも 20%である上記項目（7) に記載の D—アミノアシラーゼ。

(9) N—ァシル—D—アミノ酸に作用して対応する D—アミノ酸を生成する反応を触媒する作用を有する D—アミノアシラーゼをコードする塩基配列であって、

(a) 配列表の配列番号： 1記載の塩基配列または

(b) 配列番号： 1の塩基配列に対して該塩基配列がコードする D—アミノアシラ一ゼの作用が維持される範囲内で 1以上の塩基の挿入、欠失または置換を行って得られる変異塩基配列

からなることを特徴とする D—アミノアシラーゼをコ一ドする塩基配列。

(10) 前記変異塩基配列が、前記配列番号： 1の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダィズするものである上記項目（9) に記載の塩基配列。

(11) D—アミノアシラーゼの水性媒体中で N—ァセチル—D—トリブトファンから D—トリプトファンを生成する反応を触媒する際の N—ァセチル— D—トリプトファンの濃度が 50 g / 1の場合の反応速度が、 N—ァセチルー D—トリブトファンの濃度が 5 gZ 1の場合の反応速度に対して少なくとも 40 %である上記項目（9) に記載の塩基配列。

(12) N—ァセチル—D—トリブトファンの濃度が 100 g/1の場合の反応速度が、 N—ァセチルー D—トリブトファンの濃度が 5 gZ 1の場合の反応速度に対して少なくとも 20%である上記項目（11) に記載の塩基配列。

(13) 上記項目（9) に記載の塩基配列を含むプラスミド。

(14) 上記項目（13) に記載のプラスミドによって形質転換された形質転換体。 (15) 上記項目（14) に記載の形質転換体を培養して、該形質転換体に組み込まれたプラスミドの有する塩基配列によりコ一ドされた D—アミノアシラーゼを生産させることを特徴とする D—アミノアシラーゼの産生方法。

(16) 水性媒体中で N—ァシルアミノ酸に D—アミノアシラ一ゼを作用させて対応する D—アミノ酸を生産する光学活性アミノ酸の生産方法であって、該 D—ァミノアシラーゼが水性媒体中で N -ァセチルー D—トリブトファンから D—トリプトフアンを生成する反応を触媒する際における N—ァセチル— D—トリブトファンの濃度が 50 g Z 1の場合の反応速度が、 N -ァセチル— D—トリブトファンの濃度が 5 g/ 1の場合の反応速度に対して少なくとも 40%であることを特徴とする光学活性アミノ酸の生産方法。

(17) N—ァセチルー D—トリブトファンの濃度が 10 O gZlの場合の反応速度が、 N—ァセチル— D—トリブトファンの濃度が 5 g/ 1の場合の反応速度に対して少なくとも 20%である上記項目 1 6記載の生産方法。

(18) メチロバクテリウム（Methylobacterium) 属又はノカルディオイデス (Nocardioides) 属に属する微生物由来である上記項目 16に記載の生産方法。

(19) メチロバクテリウム（Methylobacterium) 属に属する微生物がメチロバクテリゥム 'メソフイリカム（Methylobacteriummesophilicum) 種、ノカルディォイデス（Nocardioides) 属に属する微生物がノカルディオイデス ·サ一モリラシナス（Nocardioides thermolilacinus) 種である上記項目 18記載の生産方法。

(20) ノカレディ才ィデス *サ一モリラシナス（Nocardioides thermolilacinus) 種に属する微生物がノカルディオイデス 'サ一モリラシナス（Nocardioides thermolilacinus) ATCC 35863株である上記項目 19記載の生産方法。

(21) N—ァシルアミノ酸濃度が 50 gZl以上である上記項目 16に記載の製造方法。

(22) N—ァシルアミノ酸濃度が 100 gZ 1以上である上記項目 21記載の製造方法。

(23) 水性媒体中で N—ァシルアミノ酸に D—アミノアシラ一ゼを作用させて対応する D—アミノ酸を生産する光学活性アミノ酸の生産方法であって、該 D—ァミノァシラーゼが請求項 6に記載の D—アミノアシラ一ゼであることを特徴とする光学活性アミノ酸の生産方法。

(24) 前記 D—アミノアシラ一ゼが水性媒体中で N—ァセチルー D—トリブトファンから D—トリプトフアンを生成する反応を触媒する際の N—ァセチル— D― トリプトファンの濃度が 50 g Z 1の場合の反応速度が、 N—ァセチルー D—トリブトファンの濃度が 5 g/ 1の場合の反応速度に対して少なくとも 40 %である上記項目 23に記載の生産方法。

(25) N—ァセチルー D—トリブトファンの濃度が 100 gZ 1の場合の反応速度が、 N—ァセチル— D—トリブトファンの濃度が 5 gZlの場合の反応速度に対して少なくとも 20 %である上記項目 24に記載の生産方法。

(26) D_アミノアシラーゼを、請求項 14に記載の形質転換体を培養して得られる培養液、該培養液から分離された形質転換体又はそれらの処理物の形で N— ァシルアミノ酸に作用させる上記項目 23に記載の生産方法。

(27) N—ァシルアミノ酸濃度が 50 gZ 1以上である上記項目 23に記載の製造方法。

(28) N—ァシルアミノ酸濃度が 100 g/ 1以上である上記項目 27記載の製造方法。

本発明にかかる D—ァシルアミラーゼを用いることで産業上実用的な基質濃度を用いて改善された反応速度での N—ァシルァミノ酸からの対応する D—アミノ酸の製造が可能となる。更に、本発明によれば、この有用な D—ァシルアミラーゼの遺伝子組み換え技術を用いた生産に有用な塩基配列、それを組み込んだプラスミド及びこのプラスミドで宿主を形質転換した形質転換体を提供することができる。図面の簡単な説明

図 1は組替えプラスミド pUSD A 3の物理的地図を示す図である。図中、 ori はプラスミドの複製開始点を、 Amp^rはアンピシリン耐性マ一カーを、 Sacl， Hindi, Pstl, Xho Iは各々制限酵素認識部位をそれぞれ示す。また、太矢印は D—アミノアシラ一ゼの O R Fの位置と向きを示す。発明を実施するための最良の形態

本発明にかかる D—アミノアシラーゼは、 N—ァシルー D—アミノ酸に作用して対応する D—アミノ酸を生成する反応を触媒する作用を有する酵素であり、特に N 一ァセチルー D—トリプトフアンに対して阻害がかかりにくく、基質濃度が高い場合も高活性を示すことに特徴を有するものである。この N—ァセチルー D—トリプトフアンによる阻害作用は、以下に記載する基質濃度と反応速度との関係により規定することができる。

I . 水性媒体中において N—ァセチル— D—トリブトファンの濃度が 50 g / 1の場合の反応速度が、 N—ァセチルー D—トリブトファンの濃度が 5 gZ 1の場合の反応速度に対して少なくとも 40%である。

II. N—ァセチルー D—トリブトファンの濃度が 100 g/ 1の場合の反応速度が、 N—ァセチル—D_トリブトファンの濃度が 5 g/ 1の場合の反応速度に対して少なくとも 20%である。

本発明にかかる D—アミノアシラーゼは上記の阻害に関する特性 Iを有するものであり、上記阻害に関する特性 I及び IIの両方を有するものが好ましい。従って、少なくとも上記阻害に関する特性 Iの D—アミノアシラーゼ活性を有する酵素であれば、いかなる微生物由来であっても、もしくは公知の D—アミノアシラーゼを遺伝子組換により改変したものであっても、本発明に包含されるものとする。

更に、上記特性 Iに関しては、 N—ァセチルー D—トリブトファンの濃度が 50 gZ 1の場合の反応速度が、 N—ァセチルー D—トリブトファンの濃度が 5 g/1 の場合の反応速度に対して少なくとも 50 %、特に少なくとも 60 %である事が更に好ましい。また、上記特性 IIに関しては、 N—ァセチル— D—トリブトファンの濃度が 100 g Z 1の場合の反応速度が、 N―ァセチルー D—トリブトファンの濃度が 5 gZ 1の場合の反応速度に対して少なくとも 25 %、特に少なくとも 30 % である事が更に好ましい。 ·

また本発明における基質濃度と反応速度の関係は次の様にして確認する事ができる。例えば、 10gZl、 50gZl、 100gZl、 2008 1の基質（^^_ ァセチル— D—トリプトファン）をそれぞれ含む 100 mMのリン酸緩衝液 200 1に反応に十分な活性量の酵素液を 200 ^ 1添加し 30 °Cにおいて適当な時間反応させる。この反応によって生成する D—トリブトファンの量を HP LC法などで測定する事により、各基質濃度における酵素活性（反応速度）を比較する事ができる。本発明において反応速度を測定する際の水性媒体は、酵素反応を進行させることができるものであれば特に限定されず、水はもちろんの事、リン酸、トリス、クェン酸、酢酸、ホウ酸、グリシン、 HEPES、 M〇PS、 MES、 CAPS、 CHES、 P I PESなどから適宜一種または二種以上選択して成る成分を水に含有させた緩衝液を用いることができる。反応温度は D—アミノアシラーゼが活性を発現できる、至適温度を含む温度範囲から選択することができ、例えば 30°C〜6 0°Cに維持する事が特に望ましい。また反応 pHも、 D—アミノアシラ一ゼが活性を維持できる範囲であればよく、特に至適 pHを含む pH6〜l 1に維持する事が望ましい。また酵素は菌体の培養液そのものゃ該培養液より遠心分離などによって分離、回収して得られる菌体、また該菌体の抽出物、磨砕物、分離精製物を使用できる。また本発明において反応速度を測定する際の酵素の使用量や反応時間は有意に反応速度が測定できる条件、例えば反応速度の測定時間内で反応が飽和状態に達しない条件であればよく、基質となる N—ァセチルー D—トリブトファンの濃度が 5 g/lの場合に D—トリブトファンの生成蓄積濃度が 0. 2 gZ 1〜 1 gZ 1程度の条件である事が望ましい。

本発明にかかる D—アミノアシラ一ゼの物性は以下のとおりである。

至適 pH : pH8〜10 (最適は pH9)

至適温度： 60°C

熱安定性： 40°CZ20時間の熱処理で 80 %の残存活性を示す。

本発明における D—アミノアシラーゼのー態様は、配列表の配列番号： 2に記載のァミノ酸配列、あるいは配列番号： 2に記載のアミノ酸配列に 1もしくは 2以上、好ましくは数個のアミノ酸が D—アミノアシラーゼ活性が維持し得る範囲内で置換、欠失、修飾または揷入または付加されたアミノ酸配列を有する。

本発明における D—アミノアシラーゼをコ一ドするポリヌクレオチドは配列表の配列番号： 1に記載の塩基配列を含む。配列番号： 1に示す塩基配列は、配列番号：

2に示すタンパク質をコードする。ただし、配列番号： 2に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列には、配列番号： 1に示す塩基配列のみならず、異なるコドンに基づくあらゆる塩基配列が含まれる。更に適宜置換、欠失、修飾または挿入または付加を導入する事によりポリヌクレオチドのホモログを得る事も可能である。本発明におけるポリヌクレオチドのホモログは配列番号： 1に示す塩基配列に対して、これによりコードされる D—ァシルアミラーゼが所定の酵素活性を維持し得る範囲内で塩基の置換、欠失または付加を行って得られるものである。このホモログには、例えば、配列番号： 1の塩基配列の相補配列を有するポリヌクレオチドとス卜リンジェントな条件でハイブリダイズできる塩基配列を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。

このストリンジェントな条件でのハイブリダィゼーシヨンは、例えば Mo 1 e c u 1 a r C l on i ng : Co l d Sp r i ng Ha r bo r L a b o r a t o ry P r e s s, Cu r r e n t P r o t oc o l s i n M o 1 e c u 1 a r B i o l o gy ;Wi l ey I n t e r s c i enc eに記載の方法によって行なう事ができ、市販のシステムとしては、 Ge n e Ima g eシステム（アマシャム）を挙げる事ができる。具体的には以下の操作によってハイブリダィゼーションを行なう事ができる。試験すべき DN Aまたは RN A分子を転写した膜を製品プロトコールに従って、標識したプロ一ブとプロトコール指定のハイブリダィゼ—ションバッファ一中でハイブリダィズさせる。ハイブリダィゼーションバッファーの組成は、 0. 1重量％SDS、 5重量％デキストラン硫酸、 1Z20溶のキット添付のブロッキング試薬及び 2〜 7 X S S Cからなる。ブロッキング試薬としては例えば、 l O OXDenh a rd t ' s s o l u t i on, 2% (重量/容量） B o v i ne s e r urn a 1 bum i n, 2 % (重量ノ容量） F i c 1 1™400、

2% (重量 Z容量）ポリビニルピロリドンを 5倍濃度で調整したものを 1ノ 20に希釈して使用する事ができる。 20XSSCは、 3 M塩化ナトリウム、 0. 3Mクェン酸溶液であり、 SSCは、より好ましくは 3〜6XSSC、更に好ましくは 4

〜5XSSCの濃度で使用する。ハイブリダィゼーシヨンの温度は 40〜80°C、より好ましくは 50〜70°C、更に好ましくは 55〜65°Cの範囲であり、数時間から一晚のィンキュベーションを行なつた後、洗浄パッファ一で洗浄する。洗浄の温度は、好ましくは室温、より好ましくはハイプリダイゼ一ション時の温度である。洗浄バッファーの組成は6.ズ33。+0. 1重量％SDS溶液、より好ましくは 4 XSSC+0. 1重量％SDS溶液、更に好ましくは: L XS SC+0. 1重量％ S DS溶液、最も好ましくは 0. 1 XSSC + 0. 1重量％SDS溶液である。このような洗浄バッファーで膜を洗浄し、プローブがハイプリダイズした D N A分子または RNA分子をプローブに用いた標識を利用して識別する事ができる。

本発明による新規な D—アミノアシラーゼには、 Methylobacterium mesophilicum MT 10894株由来のもの及び Nocardioides ihermolilacinus ATCC 358 63株由来のものが含まれる。 Methylobacterium mesophilicum MT 10894株は千葉県茂原市の土壌から分離した。その菌学的性質を示すと表 1の通りである。

培養温度 30。C 細胞形態桿菌 (0.8X 1.5 urn) グラム染色

胞子

+

コロニー形態円形

全縁なめらか

凸状

光沢

淡黄色

カタラーゼ +

ォキシダーゼ +

0/F試験発酵的に分解されない。硝酸塩; IS兀

インドール産生

プドウ糖酸性化 ¹

アルギニンジヒドロラーゼ

ゥレアーゼ +

エスクリン加水分解

ゼラチン加水分解

iS一ガラクトシダーゼ

Ma c Conke y寒天での生育

42 °Cでの生育

ブドウ糖 +

Lーァラビノース +

D—マンノース

化 D—マンニトール

能 N—ァセチルー D—ダルコサミン

マルト一ス

ダルコン酸カリウム +

n—力プリンサン

アジピン酸

d 1一リンゴ酸 +

クェン酸ナトリウム

酢酸フエニル以上の菌学的緖性質を「バ一ジェイーズ ·マニュアル ·ォブ ·システマチック · バクテリオ口ジー第 1巻（1984)ウィリアムス&ウィルキンス [Bergey's Manual of Systematic Bacteriology Vol.1 (1984) WilliamsCTilkins] J 、「バージエイ一ズ'マニュアル ·ォブ 'デターミティブ ·パクテリォロジ一第 9版（1994) ゥィリアムス&ウイリレキンス [Bergey s Manual of Determinative Bacteriology Ninth Edition (1994) Williams&Wilkinsjj 、「ジ一アイバロー &アールケィェィフェルタム版：コーェンアンドスチ一ルスマニュアルフォ一ザァイデンティフィケーシヨンォブメディカルバクテリア第 3版ケンブリツジュニバ一シティプレス（ 1 993) [G. I Barrow and R. K. A.Feltham ed.， Cowan&Steel s Mannual for the Identification of Medical Bacteria 3^rd .ed, Cambridge univ. press, (1993)]」の分類に当てはめて本株の同定を行った結果、本菌株は Methylobacterium mesophilicumに属すると考えられた。この菌株 M T 10894は受託番号 F ERM P— 17771として茨城県つくば巿東 1丁目 1番 1号経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業研究所に 2000年 3月 8日付けで寄託され、平成 14年 1月 21日付けのブ夕ぺスト条約に基づく国際寄託への移管により寄託番号は FERM BP- 7856に変更された。

本発明の新規な D—アミノアシラーゼをコードする DNAは、例えば、以下の様な方法によって単離することができる。微生物からゲノム DNAを精製し、制限酵素によって消化した後に得られた D N Aを超遠心分離もしくは電気泳動等によって、その長さによって分画する。その分画試料の DNAを回収してプラスミドに組み込むことによってプラスミドライブラリーを作成し、その中から D—アミノアシラーゼ活性を持つクローンを選抜して D—アミノアシラーゼ遺伝子をコードする DNA を含むプラスミドを取得する。そのプラスミドの塩基配列を解析することによって、目的の D—アミノアシラーゼ遺伝子をコ一ドする DN Aの塩基配列が判明し、 DN Aの塩基配列からコードされている D—アミノアシラーゼのァミノ酸配列を推定することが出来る。

上記のようにして単離された本発明の D—アミノアシラーゼをコードする D N A を、例えば宿主が大腸菌の場合、 pUC 18 pKK223— 3、 pBR322、

B l u e s c r i p t ll SK (十）、 pSC I O 1などに代表される発現用のプラスミドに組み込むことにより、 D—アミノアシラ一ゼ発現プラスミドが提供される。尚、形質転換に使用する宿主生物としては、組換えベクターが安定、かつ自律的に増殖可能で、さらに外来性 D NAの形質が発現できるものであればよく、例として大腸菌が挙げられるが、特に大腸菌に限定されるものではない。

そして、本発明においては該プラスミドで形質転換して得られた形質転換体を公知の情報に基づいて、培養することができ、本発明の D—アミノアシラーゼを産生させることができる。培地としては炭素源、窒素源、無機物及びその他の栄養素を適量含有する培地ならば合成培地または天然培地のいずれでも使用可能である。培養は前記培養成分を含有する液体培地中で振とう培養、通気攪拌培養、連続培養、流加培養などの通常の培養方法を用いて行なう事が出来る。培養条件は、培養の種類、培養方法により適宜選択すればよく、菌株が生育し D—アミノアシラーゼを産生できる条件であれば特に制限はない。

また、本発明における D—アミノ酸の製造方法においては、 D—アミノアシラーゼを、上記の D—アミノアシラーゼ生産菌の培養液そのものや、該培養液より遠心分離によって分離'回収して得られる形質転換菌体、該形質転換菌体の菌体処理物の形で利用することもできる。ここでいぅ菌体処理物とは、該形質転換菌体の抽出物ゃ磨碎物、該抽出物ゃ磨碎物の D—アミノアシラーゼ活性画分を分離 ·精製して得られる分離物、該形質転換菌体ゃ該形質転換菌体の抽出物、磨砕物、分離物を適当な担体を用いて固定化した固定化物の事を示している。また宿主微生物由来の活性成分が該培養液そのものや、該培養液より遠心分離によって分離 ·回収して得られる形質転換菌体、該形質転換菌体の菌体処理物の本来の目的とする反応の反応性や選択性に悪影響を及ぼす場合が考えられる。この場合、該培養液そのものや、該培養液より遠心分離によって分離 '回収して得られる形質転換菌体、該形質転換菌体の菌体処理物を反応に先立ってか、もしくは反応と同時に、有機溶媒処理または熱処理を施す事によって反応性や選択性を改善する事が可能である。有機溶媒としてはメタノール、エタノールなどのアルコール類やアセトン、 TH F、 DM F、 D M I、 DM S〇などの水溶性の有機溶媒やトルエンやベンゼンなどの芳香族系有機溶媒、酢酸ェチルや酢酸ブチルなどのエステル類、へキサンやヘプタンなどの炭ィ匕水素類、ジクロロメタンやクロ口ホルムなどのハロゲン化炭化水素類、ジェチルェ一テルなどのエーテル類などから、適宜一種または二種以上選択して使用する事ができる。有機溶媒の使用量は D—アミノアシラーゼ活性の安定な範囲で使用すれば良い。また熱処理を行なう場合、 40 ：〜 70°C程度で行なう事ができる。 D—ァミノアシラーゼの安定性を考慮すれば 45°C〜55 °Cで行なう事が望ましい。熱処理時間は D—アミノアシラーゼ活性の安定な範囲であればよく、 30分〜 100分も行なえば充分である。

本発明の D—アミノアシラーゼを N—ァシル一D—アミノ酸に作用させる際には、 D—アミノアシラーゼの活性や安定性など反応性にとつて好ましい条件を選択することが望ましい。

反応に用いる媒体としては、水あるいは各種緩衝液からなる水性媒体を用いることができる。緩衝液としては、リン酸、トリス、クェン酸、酢酸、ホウ酸、グリシン、 HEPES、 M〇PS、 MES、 CAPS, CHES、 P I PESなどから適宜一種または二種以上選択して成る成分を水に含有させた緩衝液を挙げることがでさる。

また、反応効率や生産物の収率を更に向上させるために各種の添加剤を必要に応じて用いることができる。 D—アミノアシラーゼには金属イオン、例えば Zn ²⁺や Co ²⁺などで活性化されるものもあるため、これら 2価金属を反応液に添加する事もできる。また逆に金属イオンにより阻害を受ける場合には EDT Aなどのキレー卜剤を添加する事もできる。

本発明における D—アミノ酸の製造に用いる原料（N—ァシルアミノ酸）としては、 N—ァシル—D—アミノ酸を含むものであって、 DL体、 D体の割合の多い光学活 1生体、 D体のみからなるものなどを用いることができる。

出発原料の濃度は特に制限はないが通常 l g/l〜300 gZl程度の濃度で用いられる。とりわけ反応性や経済性を鑑みれば、好ましくは 5 O'g/1以上、より好ましくは l O O gZl以上で、好ましくは 200 gZ 1以下の濃度が好適である。反応温度は D—アミノアシラ一ゼがその活性を発現できる温度に維持する事が好ましく、特に 30〜 60°Cに維持する事が望ましい。また反応 pHも、 D—アミノアシラーゼがその活性を発現できる pHに維持する事が好ましく、特に pH6〜l 1 に維持する事が望ましい。本発明の新規な D—アミノアシラーゼは種々の N—ァシルアミノ酸の D体から対応する D—アミノ酸を生じる性質を有しており、本発明の D—アミノアシラーゼを用いて N—ァシル—DL—アミノ酸より光学活性アミノ酸を工業的に有利に製造する事が可能である。適応可能な N—ァシルー DL—アミノ酸としては特に制限されず、広い範囲の化合物から選択できる。代表的な好ましい N—ァシルー DL—アミノ酸としては、 N—ァシルー DL—メチォニン、 N—ァシル— DL—ロイシン、 N 一ァシル—DL—トリブトファン、 N—ァシル一DL— 5—ヒドロキシトリプトフアン、 N—ァシル—DL—フエ二ルァラニン、 N—ァシルー DL—フエニルダリシン、 N—ァシル一DL—ホモフエ二ルァラニン、 N—ァシルー DL—ビスホモフエ二ルァラニン、 N—ァシルー DL_p—二トロフエ二ルァラニン、 N—ァシル— D L - p—フルオロフェニルァラニン、 N—ァシル—DL— p—クロ口フエ二ルァラニン、 N—ァシル—DL— p—ブロモフエ二ルァラニン、 N—ァシルー DL_p'— メトキシフエ二ルァラニン、 N—ァシルー DL—チロシン、、 N—ァシル— DL— P_シァノフエ二ルァラニン、 N—ァシルー DL— 2—ピリジルァラニン、 N—ァシル—DL— 3—ピリジルァラニン、 N—ァシル _ D L— 4 _ピリジルァラニン、 N—ァシルー DL— 0—べンジルセリン、 N—ァシルー D L— S—フエニルシスティン、 N—ァシル _DL— 1—ナフチルァラニン、 N—ァシル—DL— 2—ナフチルァラニンなどを挙げることが出来る。更に好ましい N—ァシルー DL—アミノ酸としては N—ァセチル— DL—アミノ酸が挙げられ、とりわけ N—ァセチルー D—フェニルァラニン、 N—ァセチルー D—トリプトファンに対して高い基質特異性を示す。

【実施例】

以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

尚、反応性及び光学純度は、反応で生成する D—アミノ酸及び残存する N—ァシルアミノ酸を高速液体クロマトグラフィ法（カラム： CROWNPAK CR (-) (ダイセル化学工業製) 、カラム温度 40°C、移動相： HC 1 O ₄水溶液 pHl. 5、 0〜15%メタノ一ル（v/v) 、流速 0. 8mlZmi n、検出 210 nm) で測定し、評価した。実施例 1 ：メチ口パクテリゥムメソフイリカム（Methylobacterium mesophilicum) MT 10894 (FERM BP— 7856) の培養

下記の組成の液体培地にあらかじめブイヨン寒天プレートに生育させた菌体を接種し 30 ：、 40時間振とう培養して D—アミノアシラーゼの活性を有する菌体を得た。

(培地組成）

N—ァセチルー DL—ロイシン： 5 g/L

グルコース： l OgZL

ペプトン： 10 gZL

リン酸 2水素カリウム： 1 g/L

リン酸 1水素カリウム： 1 gZL

硫酸マグネシゥム 7 Z和物： 0. 1 gノ L

ィーストエキス： 0. 5 g/L

pH7. 0 (KOHで調整）。

実施例 2 ：ノカルディオイデス ' サ一モリラシナス（Nocardioides thermolilacinus) (ATC C 35863) の培養

下記の組成の液体培地にあらかじめブイョン寒天プレートに生育させた菌体を接種し 30°C、 100時間振とう培養して D—アミノアシラーゼの活性を有する菌体を得た。

(培地組成）

N—ァセチルー DL—ロイシン： 5 g/L

C z a p e k— D o x L i qu i d me d i um mod i f i ed (Oxo i d) ： 5 g/L

ィ一ス卜エキス： 2 g/L

ビタミンアツセィカザミノ酸： 10 g/L

H 7. 2 (KOHで調整）。

実施例 3 ：メチロバクテリウムメソフイリカム（Methylobacterium mesophilicum) MT 10894 (FERM BP— 7856) 及びノカルディオイデス 'サ一モリラシナス（Nocardioides thermolilacinus) (ATCC 35863) 由来 D—アミノアシラーゼの基質濃度と反応速度の相関性

(粗酵素溶液）

実施例 1及び 2で示した方法により得られたメチロバクテリウムメゾフィリカム（Methylobacteriummesophilicum) MT 10894 (FERM BP- 7856) 及びノカルディオイデス 'サ一モリラシナス（Nocardioides thermolilacinus) (A TCC 35863) を用いて菌体溶液 (0.1 g/0.1Mリン酸バッファ一（pH 7.8) lml) を調製し、超音波菌体破碎機により破碎、冷却遠心機にて破碎菌体を沈殿させた上清を粗酵素溶液とする。

(基質溶液）

N—ァセチル一D—トリプトファンの濃度が 200 g/ 1となるように 0.1M リン酸バッファー（PH7.8) に溶解したものを基質溶液とした。

(測定）

基質溶液を 0.1Mリン酸バッファー（pH 7.8) で容量希釈して 5、 25、 5 0, 100 g/1の基質溶液を 200 1調製した。粗酵素溶液を 200 1添加、 30°Cで 1時間反応後、 1Mリン酸 0.4mlを添加して反応を停止した。 1 N水酸化ナトリウム 0.4m 1を添加して析出した未反応ァセチル体を溶解し、遠心分離にて菌体破碎物除去後、反応液中の生成 D—トリブトファンを H PLCにて測定した。基質濃度 5 g/ 1としたときの反応速度を 100とし、 25、 50、 100 g/ 1 としたときの各菌株由来の D—アミノアシラーゼによる D—トリブトファン生成速度の相対値を表 2に示す。表 2

N—ァセチルーメチロパクテリゥムノカルディオイデス

D—トリブトファンメゾフィリカムサーモリラシナス濃度 (g/1) (FERM BP- 17771) (ATCC 35863)

5 100 100

25 122 110

50 91 108

100 42 103 比較例 1 ：公知の菌株由来 D—アミノアシラーゼの基質濃度と反応速度の相関性公知の D—アミノアシラーゼ保有菌株であるアル力リゲネスデニトリフィカンスサブスゥピ一シーズキシロースォキシダンス MI 4 (A l c a l i gen e s den i t r i f i c an s s ub s p. xy l o s odans M I 4) (FERM P— 9413) 、ストレプトマイセスツイルス（S t r e p t om y c e s t u i r u s) ( I FO 13418) 由来の D—アミノアシラーゼの基質濃度と反応速度の関係について調べた。それぞれの菌株の調製方法について以下に記す。アルカリゲネスデニトリフィカンスサブスゥピーシーズキシロースォキシダンス M I 4 (A l c a l i g e n e s d e n i t r i f i c an s s ub s p. xy l o s od an s MI 4) (FERM P— 9413) は実施例 1記載の方法と同様に行なった。ストレブトマイセスツイルス（S t r e p t omy c e s t u i r u s) ( I FO 13418) は下記の組成の液体培地にて 30 °Cで 48時間培養を行なった。

(培地組成）

D -バリン： 4 g/L

グルコース： 10 g/L

ペプトン： 10 g/L

リン酸 2水素カリウム： 1 gZL

リン酸 1水素カリウム： 1 gZL

硫酸マグネシウム 7水和物： 0. 5 gZL

ィーストエキス： 10 gZL

塩化コバルト： lmg/m 1

pH7. 0 (K〇Hで調整）

粗酵素液の調製方法、基質液の調製方法、酵素活性の測定方法は実施例 3に記載の通りに行なった。基質濃度 5 gZlとしたときの反応速度を 100とし、 25、 50、 100 g/ 1としたときの各菌株由来の D—アミノアシラ一ゼによる D—トリブトファン生成速度の相対値を表 3に示す。表 3

N—ァセチレー D—トアル力リゲネスス

リブトファン濃度デニトリフイカンスツイルス

(g. サブスゥピーシ一ズ (I FO 3418) キシ口一スォキシダンス M

I 4

(FERM P

- 9413)

5 100 00

25 36 45

50 13 22

00 4 6 実施例 4 ：メチロバクテリウムメソフイリカム（Methylobacterium mesophilicum) MT 10894 (FERM P- 17771) 由来 D—アミノアシラ —ゼの N末端アミノ酸配列決定

実施例 1に示される方法でメチロバクテリウムメゾフィリカムを培養して菌体を回収し、 ImM DTT (Dithiothreitol) を添加した 0.1Mリン酸バッファ一 (pH7.8) に懸濁した。懸濁液の状態で超音波破碎機によって菌体を破碎し、冷却遠心分離にて菌体破碎物を除去し、粗酵素溶液を得た。この粗酵素溶液に対して硫安を添加し、 30〜 60%の沈殿画分を脱塩後、 DEAEトヨパ一ルカラムに通してパス画分を回収した。この画分をさらにフエニルトヨパール、 Q—セファロースによるクロマトグラフィーに供し、 D—アミノアシラ一ゼ活性を持つ画分を得た。この画分についてドデシル硫酸ナトリゥムーポリァクリルアミドゲル電気泳動を行い、分子量約 56 kD aの位置にバンド確認した。この 56 kD aタンパク質について N末端アミノ酸配列の分析を行ったところ、配列番号： 3に示す様に Thr- Asp- Ser- Thr- Arg-と決定された。

実施例 5 ：メチロバクテリゥムメソフイリカム（Methylobactrium mesophilicum) MT 10894 (FERM P— 17771) のゲノミック DN Aライブラリー作成

実施例 1に示した培養方法でメチロバクテリウムメソフイリカム (Methylobactrium mesophilicum) を 2日間培養し、遠心分離で菌体を回収し、リン酸バッファー（PH7.8) で洗浄した。この菌体より「基礎生化学実験法 2 抽出 -分離 ·精製阿南功一他著丸善株式会社出版」記載によるバクテリアゲノム DNAの分離方法に従い、ゲノム DNAを調製した。調製したゲノム DNAを制限酵素 Sac Iで完全消化して超遠心分離法にて DNAの長さによって分画し、 3 kb 以上の DNAを回収した。それらの DNAと、制限酵素 Saclで消化して 5' 末端を脱リン酸化したベクター pUC 18とを DNA連結反応に供し、プラスミドライブラリ一を作成した。このプラスミドライブラリーによって大腸菌 DH5ひを形質転換したものを 50 g/m 1のアンピシリンを添加した LB (Luria-Bertani) ァガロース培地に塗布して静置培養し、コロニーを出現させた。

実施例 6 ：プラスミドライブラリーからの D—アミノアシラーゼ活性スクリ一二ング

実施例 5で出現した個々のコロニーを LB培地（1%バクトトリプトン、 0.5% バクトイ—ストエキストラクト、 1%塩化ナトリウム、 pH7.0) で 37°C—晚液体振盪培養し、遠心分離によって形質転換体を沈殿させ、 0.1Mリン酸バッファ一 (PH7.8) にて一回洗浄後、再び遠心分離にて菌体を回収した。回収した菌体を破碎したものを粗酵素溶液とし、基質である N—ァセチル— D—トリブトファンと反応させて D—トリプトファンを生成する D—アミノアシラーゼ活性を有する形質転換体を選抜した。以下にその測定法を示す。

(粗酵素溶液）

上記回収菌体を 0. lmg/m 1の濃度になるように 0.1Mのリン酸バッファー (PH7.8) に懸濁し、超音波菌体破碎機にて菌体を破碎した後、冷却遠心機にて破碎菌体を沈殿させた上清を粗酵素溶液とした。

N—ァセチルー D—トリブトファンの濃度が 10 gZ 1となるように 0.1Mリン酸バッファー（ρΗ7· 8) に溶解したものを基質溶液とした。

(測定)

基質溶液 200 ^ 1に対し粗酵素溶液 200 1添加、 30°C、 1時間反応後、

1Mリン酸 0.4mlを添加して反応を停止した。遠心分離にて菌体破碎物除去後、反応液中の生成 D—トリブトファンを H PLCにて測定した。

実施例 7 ： D—アミノアシラーゼ遺伝子をコードする DNAの塩基配列決定実施例 6より得られた D—アミノアシラーゼ活性を有する形質転換体よりプラスミドを抽出し、その物理的地図を調べたところ、図 1の様であることが判明した。さらにその塩基配列の解析を行った。塩基配列の決定は PEAppUedBiosystems社、 BigDye Teminator Cycle Sequencing kitを用い、同社製 Genetic Analyzer 310にて行った。その結果配列番号 1に示す D—アミノアシラーゼ遺伝子をコードする D N Aの塩基配列が得られた。該 D—アミノアシラーゼ遺伝子の塩基配列をアミノ酸翻訳したものを配列番号 2に示す。その N末端のァミノ酸配列は実施例 2に示した N—末端アミノ酸配列分析の結果と一致した。また、該アミノ酸配列から D—アミノアシラーゼの分子量は約 53 k D aと推定された。

実施例 8 ：メチロバクテリウムメソフイリカム（Methylobacterium mesophilicum) MT 10894 (FERM P— 17771) 由来 D—アミノアシラーゼ遺伝子を含む DNAによって形質転換した大腸菌を用いた N—ァセチル— DL 一トリブトファンを基質としたときの反応評価

(菌体懸濁液の調製）

実施例 7の図 1で示されるプラスミドで形質転換した大腸菌をアンピシリン（ 5 0 ^g/ml) を含む LB培地で終夜 37°C振とう培養を行なった。培養後、遠心分離により集菌、 0.1Mのリン酸バッファ一（pH7.8) で洗浄後に菌体を 0. 1Mのリン酸バッファー（pH7.8) に懸濁した。

(N—ァセチルー DL—トリブトファン溶液の調製）

N—ァセチルー D—トリブトファンの濃度が 200 g/ 1となるように 0.1M リン酸バッファー（PH7.8) に溶解したものを基質溶液とした。

(測定）

上記菌体懸濁液 2.5mlと基質溶液 2.5mlをあらかじめ 40°Cに保温し、この 2つの溶液を混合した後 40°Cで反応を行った（反応基質濃度： 100 g/ 1 )。反応開始 20時間後に反応液 100^ 1を採取し、同量の INNaOHを添加して反応を停止した。その後、 HPLC移動相で 1 200に希釈して、遠心分離によつて菌体を沈殿させ、上清を HPLCによって分析し、生成した D—および Lートリブトフアン、そして基質である N—ァセチルー DL—トリプ農度を測定した。その結果を表 4に示す。表 4

* (生成 D—トリブトファン [mM] ) ÷ (生成 D—トリプ卜ファン [mM] +生成 L一トリブトファン [mM] +残存 N—ァセチルー DL—トリブトファン [mM] )。実施例 9 ：メチロバクテリウムメソフイリカム（Methylobacterium mesophilicum) MT 10894 (FERM BP— 7856) 由来 D—アミノアシラーゼ遺伝子を含む DNAによって形質転換した大腸菌の N—ァセチル— DL—ァミノ酸に対する基質特異性

実施例 7の図 1で示されるプラスミドで形質転換した大腸菌の N—ァセチルー D L一アミノ酸に対する基質特異性を比較した。本実施例においては、基質である N —ァセチルー DL—アミノ酸濃度を 5 gZ 1に設定して 40°Cで 16時間反応を行つた。 N—ァセチル— DL—トリブトファンを基質とした時の D—アミノアシラ一ゼ活性を 100として、各種 N—ァセチルー DL—アミノ酸に対する相対活性を、またその時の光学純度及び反応収率を求めた。その結果を表 5に示す。

表 5

M] +残存 N—ァセチル _DL—アミノ酸 [mM] )

産業上の利用可能性

本発明により、メチロバクテリウムメソフイリカム（Methylobacterium mesophilicura) MT 10894 (FERM B P— 7856 ) などに由来する新規な D—アミノアシラーゼ及びそれをコードする DNAが提供される。本発明の D― アミノアシラーゼは産業上の有用性に優れた酵素であり、 N—ァシルァミノ酸から対応する D—アミノ酸を高効率で製造することができる。

Claims

請求の範囲

1 . N—ァシルー D—アミノ酸に作用して対応する D—アミノ酸を生成する反応を触媒する作用を有する D—アミノアシラーゼであって、

水性媒体中で N—ァセチル— D—トリブトファンから D—トリブトファンを生成する反応を触媒する際における N—ァセチルー D—トリブトファンの濃度が 5 0 g / 1の場合の反応速度が、 N—ァセチルー D—卜リブトファンの濃度が 5 g / 1の場合の反応速度に対して少なくとも 4 0 %である事を特徴とする D—アミノアシラ

■ ^セ

2 . N—ァセチル— D—トリブトファンの濃度が 1 0 0 g / 1の場合の反応速度が、 N—ァセチルー D—トリブトファンの濃度が 5 g / 1の場合の反応速度に対して少なくとも 2 0 %である請求項 1記載の D—アミノアシラーゼ。

3 . メチロバクテリウム（Methylobacterium) 属又はノカルディオイデス (Nocardioides) 属に属する微生物由来である請求項 1に記載の D—アミノアシラ

4. メチロバクテリウム（Methylobacter ium) 属に属する微生物がメチロバクテリゥム 'メソフイリカム（Methylobacterium mesophi l icum) 種、ノカルディオイデス（Nocardioides) 属に属する微生物がノカルディオイデス ·サーモリラシナス

(Nocardioides thermol i lacinus) 種である請求項 3記載の D—アミノアシラーゼ。

5 . ノカレディオイデス ·サ一モリラシナス (Nocardioides thermol i l acinus) 種に属する微生物がノカルディオイデス *サ一モリラシナス（Nocardioides thermol i lacinus) AT C C 3 5 8 6 3株である請求項 4記載の D—アミノアシラ一ゼ。

6 . N—ァシル—D—アミノ酸に作用して対応する D—アミノ酸を生成する反応を触媒する作用を有する D—アミノアシラーゼであって、

(A) 配列表の配列番号： 2記載のアミノ酸配列または

(B) 該ァミノ酸配列に対して前記触媒活性を維持し得る範囲内で 1以上のアミノ酸残基の挿入、欠失または置換を行って得られる変異アミノ酸配列

を有することを特徴とする D—アミノアシラーゼ。

7 . 水性媒体中で N—ァセチル一 D—トリブトファンから D—トリブトファンを生成する反応を触媒する際における N—ァセチルー D—トリプトファンの濃度が 5 0 g / 1の場合の反応速度が、 N—ァセチル— D—トリブトファンの濃度が 5 g / 1の場合の反応速度に対して少なくとも 4 0 %である請求項 6に記載の D _アミノアシラーゼ。

8 . N—ァセチル— D—トリブトファンの濃度が 1 0 0 g/ 1の場合の反応速度が、 N—ァセチルー D—トリブトファンの濃度が 5 g / 1の場合の反応速度に対して少なくとも 2 0 %である請求項 7に記載の D—アミノアシラーゼ。

9 . N—ァシルー D—アミノ酸に作用して対応する D—アミノ酸を生成する反応を触媒する作用を有する D—アミノアシラーゼをコードする塩基配列であって、

( a ) 配列表の配列番号： 1記載の塩塞配列または

( b) 配列番号： 1の塩基配列に対して該塩基配列がコードする D—アミノアシラ一ゼの作用が維持される範囲内で 1以上の塩基の挿入、欠失または置換を行って得られる変異塩基配列

1 0 . 前記変異塩基配列が、前記配列番号： 1の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものである請求項 9に記載の塩基配列。

1 1 . D—アミノアシラーゼが水性媒体中で N -ァセチル— D—トリブトファンから D—トリプトファンを生成する反応を触媒する際の N—ァセチルー D—トリブトファンの濃度が 5 0 g / 1の場合の反応速度が、 N -ァセチルー D—トリブトファンの濃度が 5 g Z 1の場合の反応速度に対して少なくとも 4 0 %である請求項 9に記載の塩基配列。

1 2 . N—ァセチルー D—トリブトファンの濃度が 1 0 0 g Z lの場合の反応速度が、 N—ァセチルー D _トリブトファンの濃度が 5 g Z 1の場合の反応速度に対して少なくとも 2 0 %である請求項 1 1に記載の塩基配列。

1 3 . 請求項 9に記載の塩基配列を含むプラスミド。

1 4. 請求項 1 3に記載のプラスミドによって形質転換された形質転換体。

1 5 . 請求項 1 4に記載の形質転換体を培養して、該形質転換体に組み込まれたプラスミドの有する塩基配列によりコ一ドされた D—アミノアシラーゼを生産させることを特徴とする D—アミノアシラーゼの産生方法。

16. 水性媒体中で N—ァシルアミノ酸に D—アミノアシラーゼを作用させて対応する D—アミノ酸を生産する光学活性アミノ酸の生産方法であって、該 D—ァミノアシラーゼが、水性媒体中で N—ァセチル— D—トリブトファンから D—卜リブトフアンを生成する反応を触媒する際における N—ァセチルー D—トリブトファンの濃度が 5 Og/1の場合の反応速度が、 N—ァセチルー D—トリブトファンの濃度が 5 gZ 1の場合の反応速度に対して少なくとも 40 %であることを特徴とする光学活性アミノ酸の生産方法。

17. N—ァセチル— D—トリブトファンの濃度が 100 gZlの場合の反応速度が、 N—ァセチルー D—トリブトファンの濃度が 5 gZ 1の場合の反応速度に対して少なくとも 20 %である請求項 1 6記載の生産方法。

18. メチロバクテリウム（Methylobacterium) 属又はノカルディオイデス (Nocardioides) 属に属する微生物由来である請求項 16に記載の生産方法。

19. メチロバクテリウム（Methylobacterium) 属に属する微生物がメチロバクテリゥム 'メソフイリカム（Methylobacteriummesophilicum) 種、ノカルディォイデス（Nocardioides) 属に属する微生物がノカルディオイデス ·サ一モリラシナス (Nocardioides thermoiilacinus) 種である請求項 18記載の生産方法。

20. ノカルディイァス'サ一モリラシナス (Nocardioides thermoiilacinus) 種に属する微生物がノカルディオイデス *サ一モリラシナス（Nocardioides thermoiilacinus) ATCC 35863株である請求項 19記載の生産方法。

21. N—ァシルアミノ酸濃度が 50 gZl以上である請求項 16に記載の製造方法。

22. N—ァシルアミノ酸濃度が 100 g/1以上である請求項 21記載の製造方法。

23. 水性媒体中で N—ァシルアミノ酸に D—アミノアシラーゼを作用させて対応する D—アミノ酸を生産する光学活性アミノ酸の生産方法であって、該 D—ァミノァシラ一ゼが請求項 6に記載の D—アミノアシラーゼであることを特徴とする光学活性ァミノ酸の生産方法。

2 . 前記 D—アミノアシラーゼが水性媒体中で N—ァセチルー D—トリブトファンから D—トリブトファンを生成する反応を角虫媒する際の N _ァセチルー D— トリプトファンの濃度が 5 0 g Z 1の場合の反応速度が、 N -ァセチルー D—トリブトファンの濃度が 5 g Z 1の場合の反応速度に対して少なくとも 4 0 %である請求項 2 3に記載の生産方法。

2 5 . N—ァセチルー D—トリブトファンの濃度が 1 0 0 g / 1の場合の反応速度が、 N—ァセチルー D—トリブトファンの濃度が 5 g / 1の場合の反応速度に対して少なくとも 2 0 %である請求項 2 4に記載の生産方法。

2 6 . D—アミノアシラーゼを、請求項 1 4に記載の形質転換体を培養して得られる培養液、該培養液から分離された形質転換体又はそれらの処理物の形で N— ァシルアミノ酸に作用させる請求項 2 3に記載の生産方法。

2 7 . 基質となる N—ァシルアミノ酸濃度が 5 0 gZ l以上である請求項 2 3 に記載の製造方法。

2 8 . 基質となる N—ァシルアミノ酸濃度が 1 0 0 gZ 1以上である請求項 2 7 記載の製造方法。