WO2002063036A2 - Vektorsystem zum screening von wirkstoffen - Google Patents

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Definitions

  • the invention relates to a vector system for screening active substances which influence translation in the cell.
  • Fields of application of the invention are the pharmaceutical industry, medicine and molecular biology.
  • eukaryotic translation initiation factor elF-4E For example, an increased expression of the eukaryotic translation initiation factor elF-4E was found in colon cancer. (Rosenwald et al., 1999; Oncogene 18: 2507). This initiation factor binds the 5 'CAP structure of eukaryotic mRNAs and thus plays a crucial role in the initiation of translation. It had previously been shown that the overexpression of elF-4E converts normal rodent cells into tumor cells and leads to an increase in transformation parameters in human cells. On the other hand, switching off elF-4E suppresses the transformation by the ras oncogene. This indicates a fundamental role of translation regulation in the development of cancer.
  • the EIF2AK3 gene codes for a kinase which translates the Initiation factor elF2alpha phosphorylated
  • the invention has for its object to build a vector system which allows direct observation of translation processes in the cell.
  • the invention is implemented according to the main claim, the subclaims are preferred variants.
  • the core of the invention is a new recombinant reporter plasmid construct (vector system), which is characterized in more detail below. It consists of a number of modules. These modules serve i) as control elements which influence the initiation of translation or the function of ribosomes, ii) for the determination of regulatory processes and for internal comparison (e.g. transcription vs. translation), iii) for simplified measurement with high sample throughput ( Secretion of the translation products from cells and immobilization in microformat, cleaning and detection with the help of antigenic "tags”)
  • the construct contains translation control elements. These elements are essentially 5 'from the detection cassette (see below), but can also be 3' or inside the detection cassette.
  • the control elements control the differential expression of different protein reporter constructs which are encoded in the detection cassette.
  • the construct contains a detection cassette.
  • This detection cassette codes for two or more protein reporter constructs in the same or in different reading frames. Differential initiation of translation leads to a shift in the reporter sets, which thus reflect differential translation. Regulation processes that lead to a general change in translation, however, cause a similar shift in reporter expression. Both types of regulation can be offset against each other and summarized in mathematical models. This enables a computer-controlled evaluation of the results and automation of the process.
  • the reporter constructs contain signal sequences for ejection from the cell. Reporter proteins can thus be determined either in cell lysates or in the supernatant. The latter property is used in particular for high throughput analysis of potential active substances.
  • the reporter constructs contain various antigenic sites, with the aid of which reporter proteins can be immobilized and differentially detected. One antigenic site is used to immobilize the reporter proteins, another, and different antigenic site in the respective reporter proteins is used for differential reporter detection (see Example 1). With the aid of this modularly constructed recombinant reporter plasmid construct Translation Control Reporter System (TCRS) substances are examined for their effects, to intervene in processes of differential initiation of translation as well as in various processes in translation.
  • the TCRS construct is introduced into cells transiently or stably. The cells are then charged with substances and the resulting reporter quantities derived from the construct are determined and compared with one another. Translational control processes are determined from the determined data.
  • TCRS Translation Control Reporter System
  • the basis is created for the rapid finding and optimization of active substances which influence translational control processes and can be used for the pharmacological correction of diseases.
  • the system is also suitable for the scientific analysis of translational regulatory processes.
  • the eukaryotic expression vector is constructed as follows: approx. 50 base pairs of the initial sequence (“leader sequence”) from the beta-globin mRNA. This is followed 3 ′ by the upstream open reading frame (uORF) of the rat C / EBP alpha gene as a translational control element with the initiation site, " ⁇ . This is followed by the detection cassette with the two reporter genes PR and SR. "A” denotes the initiation point of the PR reading frame. PR contains a signal sequence (pre-pro trypsin), which leads to the rejection of the primary reporter protein (PR). The FLAG sequence and then a hemagglutinin (HA) epitope are closed as the antigenic epitope The latter serves to immobilize the reporter protein.
  • leader sequence initial sequence from the beta-globin mRNA. This is followed 3 ′ by the upstream open reading frame (uORF) of the rat C / EBP alpha gene as a translational control element with the initiation site, " ⁇ .
  • PR contains a signal
  • SR is encoded by the initiation site (B). SR is shifted by one nucleotide after 3 'compared to PR. When reading the ribosomes started at "A", there is no meaningful SR product due to the reading frame shift. Initiation at B, on the other hand, creates a secondary reporter protein (SR) that is different from PR. SR, like PR, has a pre-pro-trypsin signal sequence at the N-terminus. It closes a GenelO antigen epitope as well an HA epitope. Both reporter constructs are terminated 3 'overlapping. Reporter protein expression from the A or B initiation site is influenced by the control element (uORF, K).
  • the construct (Fig. 1) was transfected into cells and the reporter protein was determined after 24 and 48 hours. It was shown that reporter proteins with the desired properties (size, secretion, antigenic properties) are produced.
  • the present TCRS construct is therefore suitable for high throughput screening of substances which influence the translation by the control element.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Vektorsystem zum Screening von Wirkstoffen, welche die Translation in der Zelle beeinflussen. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die pharmazeutische Industrie, die Medizin und die Molekularbiologie. Das Vektorsystem besteht aus Kontrollelementen der Translation, die im wesentlichen 5' von der Detektionskassette liegen, ggf. aber auch in 3'-Stellung oder innerhalb der Detektionskassette, einer Detektionskassette, die für zwei oder mehrere Protein-Reporterkonstrukte in unterschiedlichen Leserastern kodiert, wobei die Reporterkonstrukte Signalsequenzen zum Ausschleusen aus der Zelle und verschiedene antigene Stellen, mit deren Hilfe Reporterproteine immobilisiert und differentiell detektiert werden können, enthalten.

Description

Vektorsystem zum Screening von Wirkstoffen
Die Erfindung betrifft ein Vektorsystem zum Screening von Wirkstoffen, welche die Translation in der Zelle beeinflussen. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die pharmazeutische Industrie, die Medizin und die Molekularbiologie.
Die Kontrolle der Boten RNA Translation in Proteine ist ein wichtiger biologisch- regulatorischer Vorgang, dessen Deregulation Ursache vieler Krankheiten ist. Es gibt bereits einige Arbeiten, die sich mit der Pathologie der Translationsregulation von Proteinen in der Zelle beschäftigen.
Beispielsweise wurde eine erhöhte Expression des eukaryontischen Translations- Initiationsfaktors elF-4E beim Darmkrebs gefunden. (Rosenwald et al., 1999; Oncogene 18:2507). Dieser Initiationsfaktor bindet die 5' gelegene CAP-Struktur eukaryontischer mRNAs und spielt somit bei der Initiation der Translation eine entscheidende Rolle. Zuvor war bereits gezeigt worden, dass die Überexpression von elF-4E normale Nagerzellen in Tumorzellen umwandelt und zu einer Verstärkung von Transformationsparametern in menschlichen Zellen führt. Andererseits unterdrückt die Ausschaltung von elF-4E die Transformation durch das ras Onkogen. Dies weist auf eine grundsätzliche Rolle der Translationsregulation bei der Entstehung von Krebs hin. In diesem Zusammenhang wurde kürzlich festgestellt, dass die mTOR Kinase, der eine grundlegende Funktion in der Translationsregulation zukommt, auch eine Schlüsselrolle bei der Transformation durch die Oncogene P3K und Akt spielt (Aoki et al., 2001 ; PNAS, 98:136). Neben der Tumorigenese spielt die Regulation der Translation auch bei metabolischen Syndromen eine Rolle. Beim autosomal rezessiven „Wolcott-Rallison" Syndrom z. B. wurden als Ursache Mutationen im EIF2AK3 Gen gefunden (Delepine et al., 2000; Nat. Gen. 25:406). Das EIF2AK3 Gen kodiert für eine Kinase, die den Translations- Initiationsfaktor elF2alpha phosphoryliert. Eine Reihe weiterer Funktionen der translationalen Kontrolle im Metabolismus, bei der Embryonalentwicklung, der Zelldifferenzierung und der Infektabwehr sind inzwischen recht gut bekannt und in dem kürzlich erschienenen Band „Translational Control of Gene Expression", (ed. by Sonenberg, Hershey and Mathews, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, N.Y., 2000; ISSN 0270-1847; 39) zusammengefasst.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Vektorsystem aufzubauen, welches eine unmittelbare Beobachtung von Translationsvorgängen in der Zelle erlaubt. Die Erfindung wird gemäß dem Hauptanspruch realisiert, die Unteransprüche sind Vorzugsvarianten.
Kernstück der Erfindung ist ein neues rekombinantes Reporterplasmidkonstrukt (Vektorsystem), welches im folgenden näher charaktrisiert wird. Es besteht aus einer Reihe von Modulen. Diese Module dienen i) als Kontrollelemente, welche die Initiation der Translation oder die Funktion von Ribosomen beinflussen, ii) zur Feststellung von Regulationsvorgängen und zum internen Abgleich (z. B. Transkription vs. Translation), iii) zur vereinfachten Messung mit hohem Probendurchsatz (Sezernierung der Translationsprodukte aus Zellen und Immobilisierung im Microformat, Reinigung und Detektion mit Hilfe von antigenen „Tags").
1. Das Konstrukt enthält Kontrollelemente der Translation. Diese Elemente liegen im wesentlichen 5' von der Detektionskassette (s. u.), können aber auch 3' oder innerhalb der Detektionskassette liegen. Die Kontrollelemente steuern die differentielle Expression unterschiedlicher Protein- Reporterkonstrukte, die in der Detektionskassette kodiert sind.
2. Das Konstrukt enthält eine Detektionskassette. Diese Detektionskassette kodiert für zwei oder mehrere Protein-Reporterkonstrukte in gleichen oder in unterschiedlichen Leserastern. Differentielle Initiation der Translation führt zur Verschiebung der Reportermengen, die somit differentielle Translation widerspiegeln. Regulationsvorgänge, die zu einer allgemeinen Veränderung der Translation führen, bewirken hingegen eine gleichartige Verschiebung der Reporterexpression. Beide Typen der Regulation können gegeneinander verrechnet und in mathematischen Modellen zusammengefasst werden. Dies ermöglicht eine computergesteuerte Auswertung der Ergebnisse und eine Automatisierung des Verfahrens.
3. Die Reporterkonstrukte enthalten Signalsequenzen zum Ausschleusen aus der Zelle. Somit können Reporterproteine wahlweise in Zelllysaten oder im Überstand bestimmt werden. Die letztere Eigenschaft dient insbesondere zur High Throughput Analyse potentieller Wirkstoffe.
4. Die Reporterkonstrukte enthalten verschiedene antigene Stellen, mit deren Hilfe Reporterproteine immobilisiert und differentiell detektiert werden können. Eine antigene Stelle dient zur Immobilisierung der Reporterproteine, eine weitere, und in den jeweiligen Reporterproteinen verschiede antigene Stelle dient zur differentellen Reporter-Detektion (siehe Beispiel 1 ). Mit Hilfe dieses modular aufgebauten rekombinanten Reporterplasmidkonstrukts Translation Control Reporter System (TCRS) werden Substanzen auf ihre Wirkung hin untersucht, in Vorgänge der differentiellen Initiation der Translation sowie in vielfältige Vorgänge bei der Translation einzugreifen. Das TCRS Konstrukt wird in Zellen transient oder stabil eingebracht. Sodann werden die Zellen mit Substanzen beschickt und die resultierenden, von dem Konstrukt stammenden Reportermengen bestimmt und miteinander verglichen. Aus den ermittelten Daten werden translationelle Kontrollvorgänge eruiert.
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Systems wird die Grundlage für das schnelle Auffinden und Optimieren von Wirksubstanzen geschaffen, die translationelle Kontrollvorgänge beeinflussen und zur pharmakologischen Korrektur von Krankheiten dienen können. Darüberhinaus eignet sich das System zur wissenschaftlichen Analyse translationeller Regulationsvorgänge.
Die Erfindung soll nachfolgend durch Ausführungsbeispiele näher erläutert werden.
Beispiel 1
Ein Prototyp des erfindungsgemäßen Konstrukts mit folgenden Eigenschaften liegt vor (vergleiche Abb. 1 ):
Der eukaryontische Expressionsvektor ist folgendermassen aufgebaut: ca 50 Basenpaare der Anfangsequenz („Leadersequence") aus der beta-globin mRNA. Danach folgt 3' der upstream Open Reading Frame (uORF) des Ratten C/EBP alpha Gens als translationelles Kontrollelement mit der Initiationsstelle ,,κ". Danach folgt die Detektionskassette mit den beiden Reportergenen PR und SR. „A" bezeichnet die Initiationsstelle des PR Leserasters. PR enthält eine Signalsequenz (pre-pro- Trypsin), die zur Ausschleussung des primären Reporterproteins (PR) führt. Als antigenes Epitop schliesst sich zuerst eine FLAG Sequenz und dann ein Hämagglutinin (HA) Epitop an. Letzteres dient zur Immobilisierung des Reporterproteins. Von der Initiationsstelle (B) wird SR kodiert. SR ist gegenüber PR um ein Nukleotid nach 3' verschoben. Beim Durchlesen der an „A" gestarteten Ribosomen ergibt sich wegen der Leserasterverschiebung kein sinnvolles SR Produkt. Durch Initiation an B hingegen entsteht ein von PR verschiedenes, sekundäres Reporterprotein (SR). SR besitzt ebenso wir PR eine pre-pro-Trypsin Signalsequenz am N-Terminus. Es schliesst sich ein GenelO Antigenepitop sowie ein HA-Epitop an. Beide Reporterkonstrukte werden 3' überlappend terminiert. Reporterproteinexpression von der A oder B Initiationsstelle wird durch das Kontrollelement (uORF, K ) beinflusst.
Beispiel 2
Das Konstrukt (Abb. 1 ) wurde in Zellen transfiziert und nach 24 und 48 Stunden wurde das Reporterprotein bestimmt. Es zeigte sich, dass Reporterproteine mit den gewünschten Eigenschaften (Grosse, Sezernierung, antigene Eigenschaften) produziert werden. Ein ähnliches Konstrukt, jedoch ohne das translationelle Kontrollelement, produziert im Vergleich mit TCRS andere Mengen eines Reporterproteins. Somit eignet sich das vorliegende TCRS Konstrukt zum High Throughput Screenining von Substanzen, welche die Translation durch das Kontrollelement beeinflussen.

Claims

Patentansprüche
1. Vektorsystem zum Screening von Wirkstoffen, bestehend aus
- Kontrollelementen , der Translation, die im wesentlichen 5' von der Detektionskassette liegen, ggf. aber auch in 3'-Stellung oder innerhalb der Detektionskassette,
- einer Detektionskassette, die für zwei oder mehrere Protein-Reporterkonstrukte in unterschiedlichen Leserastern kodiert,
- wobei die Reporterkonstrukte
- Signalsequenzen zum Ausschleusen aus der Zelle und
- verschiedene antigene Stellen, mit deren Hilfe Reporterproteine immobilisiert und differentiell detektiert werden können, enthalten.
2. Vektorsystem zum Screening von Wirkstoffen nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß es auf abgeleiteten Kontrollelementen mit alternativen Reportergenen wie z. B. GFP, Luciferase zum modifizierten Nachweis gekoppelt ist.
3. Vektorsystem zum Screening von Wirkstoffen gemäß Abbildung 1 (TCRS)
4. Verfahren zum Screening von Wirkstoffen nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Konstrukt in Zellen transient oder stabil eingebracht wird, sodann die Zellen mit Substanzen beschickt werden und die resultierenden, von dem Konstrukt stammenden Reportermengen bestimmt und miteinander verglichen werden.
5. Zelllinien zum Screening von Wirkstoffen, enthaltend ein Vektorsystem gemäß Anspruch 1-3.
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