WO2002064760A2 - Expression der rekombinanten proteinase k aus tritirachium album in hefe - Google Patents

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Johann-Peter Thalhofer
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Stephan Glaser
Werner Hoelke
Helmut Schoen
Thomas Kirschbaum
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F Hoffmann La Roche AG
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/58—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi

Definitions

  • the present invention relates to a process for the production of recombinant proteinase K in soluble and active form in economically interesting amounts
  • Proteinase K (EC 3.4.21.64, also known as endopeptidase K) is an extracellular endopeptidase that is synthesized by the fungus tritirachium albumen. It belongs to the class of serine proteases with the typical catalytic triad Asp 39 -His 69 -Ser 224 (Jany, KD et al. (1986) FEBS Letters Vol. 199 (2), 139-144). Since the sequence of the 279 amino acid long polypeptide chain (Gunkel, PA and Gassen, HG (1989) Eur. ⁇ . Biochem. Nol. 179 (1), 185-194) and the three-dimensional structure (Betzel, C. et al. (1988 ) Eur. J.
  • Biochem. Nol. 178 (1), 155-71) has a high homology with the bacterial subtilisins, proteinase K is counted among the subtilisin family (Pahler, A. et al. (1984) EMBOJ. Vol. 3 ( 6), 1311-1314; Jany, KD and Mayer, B. (1985) Biol. Chem. Hoppe-Seyler, Nol. 366 (5), 485-492). Proteinase K was named on the basis of its ability to hydrolyze native keratin and thus enable the fungus to grow on keratin as the only source of C and E (Ebeling, W. et al. (1974) Eur. J. Biochem.
  • proteinase K is one of the most active known endopeptidases (Betzel, C. et al. (1986) I 'FEBS Lett. Nol. 197 (1-2), 105-110) and hydrolyzes non-specifically native and denatured proteins.
  • the proteinase K from Tritirachium album Limber is translated as a preproprotein in the natural host.
  • the gene for preproproteinase K is composed of 2 exons and codes for a 15 amino acid signal sequence, a 90 amino acid prosequence and a 279 amino acid mature proteinase K.
  • a 63 bp intron is located in the prosequence region. The prepeptide is split off during translocation into the endoplasmic reticulum (ER).
  • Proteinase K is characterized by high thermal stability (up to 65 ° C, Bajorath et al. (1988), Eur. J. Biochem. Vol.
  • Proteinase K is obtained commercially in large quantities by fermentation of the fungus Tritirachium alhum Limber (e.g. CBS 348.55, Merck strain No. 2429 or strain ATCC 22563). However, the production of proteinase K is suppressed by glucose or free amino acids. Since protein-containing media also induce the expression of proteases, the only nitrogen source that must be used is proteins such as BSA, milk powder or soybean meal. The secretion of the protease begins as soon as the stationary phase of growth is reached (Ebeling, W. et al. (1974) Eur. J. Biochem. Vol. 47 (1), 91-97).
  • Tritirachium album Limber is a slow-growing fungus that only secretes small amounts of proteases into the medium.
  • the disadvantage is the slower cell cycle compared to yeast. like the lower achievable optical density in the fermenter.
  • T. album also produces other proteases besides proteinase K, which could contaminate the preparation (Samal, BB et al. (1991). Enzyme Microb. Technol. Vol. 13, 66-70).
  • proteinase K in E. coli is possible in principle, but is not carried out in soluble form, but in so-called "inclusion bodies", from which the enzyme must then be solubilized and renatured by certain measures.
  • inclusion bodies from which the enzyme must then be solubilized and renatured by certain measures.
  • the disadvantage of this method is that a lot of protein is lost during solubilization and renaturation.
  • the object of the present invention is therefore to provide a process for producing recombinant proteinase K in economically interesting amounts.
  • Another object of the invention is the purification of the active proteinase K from the medium supernatant.
  • the present invention therefore relates to a method for producing recombinant proteinase K, comprising the steps
  • the host cell is selected from the following group: Pichia species, Hansenula species such as, for example, Hansenula polymorpha, Saccharomyces species, Schizosaccharomyces species, Yarrowia species such as Yar rowia lipolytica, Kluyveromyces species and Aspergillus species. It is particularly preferred according to the invention if Pichia pastoris is used as the host cell.
  • the host cell is transformed with a DNA coding for the zymogenic precursor and the proteinase K is activated autocatalytically at a later time during or immediately after the secretion into the culture medium.
  • the gene coding for the zymogenic precursor of proteinase K is preferably cloned into the following vectors: pPICZ, pPICZ ⁇ , pGAPZ, pGAPZ ⁇ , pPICZ ⁇ A and pPIC9K.
  • the vectors: pPICZ ⁇ A and pPIC9K are particularly preferred.
  • the vector pPICZ ⁇ A is particularly preferred according to the invention.
  • the aforementioned vectors are commercially available (Invitrogen).
  • proteinase K or its zymogenic precursor of proteinase K is induced by methanol (pPIC vectors).
  • pPIC vectors Another possibility is the induction of expression by glyceraldehyde phosphate (pGAP vectors).
  • the secretion of the protein is preferably initiated by the N-terminal fusion of the signal peptide of the ⁇ factor from Saccharomyces cerevisiae.
  • a fusion protein is then generated from the signal peptide at the N-terminus and the target protein.
  • Another possible signal peptide would be the natural signal sequence of proteinase K.
  • the host cell Pichia pastoris is transformed with the expression vectors pPICZ ⁇ A and pPIC9K, which contain a DNA coding for the zymogenic precursor, and the gene is controlled by the AOX1 promoter and, if appropriate, the AOXl Terminators stands.
  • the present invention also relates to a vector containing a DNA coding for the zymogenic precursor of proteinase K, said DNA being upstream of the coding sequence is fused with a sequence in the reading frame which codes for a suitable signal peptide and the coding gene is under the control of a promoter suitable for the host cell and optionally terminator and wherein this vector is suitable for the transformation of this host cell.
  • the host cell is yeast.
  • the invention thus furthermore relates to a recombinant vector which contains one or more copies of the recombinant DNA defined above.
  • the vector is preferably a plasmid which has a promoter strong for the host cell and a signal peptide suitable for the host cell for the secretion of proteins. It is also conceivable, however, to fuse the native signal peptide of preproproteinase K to the N-terminus of the propeptide, as described in SEQ. ID. NO .: 21 (signal sequence 1-15 (15 amino acids); prosequence 16-104 (90 amino acids); sequence of the mature proteinase K 106-384 (279 amino acids)) is shown. Methods which are known to the person skilled in the art and are used, for example, in Sambrook et al. (1989).
  • Another object of the present invention is a host cell transformed with one of the vectors listed above, the host cell being a yeast.
  • the host cell is preferably selected from the following group: Pichia species, Hansenula species such as e.g. Hansenula polymorpha, Saccharomyces species, Schizosaccharomyces species, Yarrowia species such as Yarrowia lipolytica, Kluyveromyces species. and Aspergülus species.
  • Pichia pastoris is particularly preferred as the host cell. It is particularly preferred if several vectors (each with a copy of the ppK-Ge) are integrated into the genome.
  • the present invention comprises a method for purifying the proteinase K.
  • the yeast cells are removed in a first step by means of microfiltration or centrifugation.
  • the resulting clear solution contains the protease.
  • This is followed by buffering via ultrafiltration in order to bind the product to a cation exchanger, for example SP-Sepharose or SP-Sephadex (Pharmacia) or SP-Toyopearl (Tosoh Corporation).
  • a new buffering takes place via ultrafiltration and binding to an anion exchanger, for example DEAE-Sepharose or Q-Sepharose (Pharmacia) or DEAE-Fraktogel (Merck).
  • the pure protease is transferred into a stable buffer system via ultrafiltration (Protein Purification, Principles and Practice, Robert K. Scopes, Springer Verlag, 1982).
  • the method according to the invention has surprisingly succeeded in producing recombinant proteinase K, the enzyme being soluble and actively produced by a heterologous host cell.
  • proteinase K With subsequent secretion of the enzyme into the culture medium, it is particularly advantageous that it is prevented that proteinase K has a highly toxic effect in the cytosol of the host cell.
  • a decisive advantage of the method according to the invention is thus that a way is provided for the soluble and active production of a recombinant proteinase K. It is very surprising and cannot be explained that the surface proteins of the host cells according to the invention are not hydrolyzed by a secreted proteinase K. In the event of the expected hydrolysis of the surface proteins by proteinase K, the host cell would be disturbed in its life cycle.
  • a proteinase K is obtained by the method according to the invention which is homogeneous and is therefore particularly suitable for analytical and diagnostic applications.
  • the zymogenic precursor of proteinase K according to the invention can optionally contain further N-terminal modifications, in particular sequences which facilitate purification of the target protein ("affinity tags").
  • the zymogenic precursor can contain sequences which increase the efficiency of translation, which increase the folding efficiency and / or also those sequences which lead to secretion of the target protein into the culture medium (natural pre-sequence and other Signalpepti.de).
  • Proteinase K in the sense of the invention includes both those in SEQ. ID. NO .: 1 given sequence according to Gassen et al. (1989), as well as other variants of the proteinase K from Tritirachium album Limber, such as those in Ch. Betzel et al. (Biochemistry 40 (2001), 3080-3088) disclosed amino acid sequence and in particular proteinase T (Samal, BB et al. (1989) Gene Vol. 85 (2), 329-333; Samal, BB et al. (1996) Adv. Exp. Med. Biol. Vol. 379, 95-104) and Proteinase R (Samal, BB et al. (1990) Mol. Microbiol. Vol.
  • SEQ. ID. NO .: 1 comprises a prosequence (1-90; 90 amino acids) and the sequence of the mature proteinase K (91-368; 279 amino acids).
  • the by Betzel et al. Biochemistry 40 (2001), 3080-3088) described proteinase K amino acid sequence has in particular position 207 of the active protease aspartate instead of a serine test.
  • Pro-proteinase K in the sense of the invention means in particular a proteinase K which has its prosequence according to SEQ at the N-terminus. ID. NO .: 1 is linked.
  • subtilisin E which is closely related to proteinase K, and corresponding variants
  • the prosequence has an essential influence on the folding and formation of active protease (Ikemura, H. et al. (1987) Biol. Chem. Vol. 262 (16), 7859- 7864).
  • the prosequence acts as an intramolecular chaperone (Inouye, M. (1991) Enzyme Vol. 45, 314-321).
  • the processing to the mature subtilisin protease takes place by the propeptide being cleaved off autocatalytically (Ikemura, H. and Inouye, M. (1988) J. Biol. Chem. Vol.
  • the present invention thus encompasses both the 90 amino acid long prosequence according to SEQ. ID. NO .: 1, as well as other variants that fulfill a folding-promoting function. Also included is a propeptide that is added exogenously to the folding of mature proteinase K and performs the functions set out above.
  • the main advantage of the method according to the invention is therefore that the recombinant proteinase K is soluble and actively secreted into the culture medium by an expression host.
  • the expression host used in the method according to the invention is not damaged or negatively influenced in any other way by the very active and unspecific protease, ie in particular that the growth continues without problems and increased cell lysis is not observed.
  • the expression host according to the invention is easier to handle than Tritirachium album and is characterized by higher growth rates.
  • Expression plasmid pPICPK-1 A sequence coding for the zymogenic proform of proteinase K clones into the starting vector pPICZ ⁇ A (Invitrogen).
  • Expression plasmid pPICPK-2 A sequence coding for the zymogenic proform of proteinase K clones into the starting vector pPIC9K (Invitrogen).
  • the gene for the mature proteinase K from Tritirachium album Limber without signal sequence and without intron was generated by means of gene synthesis.
  • a nucleic acid sequence optimized for expression in both E. coli and yeast was created.
  • the amino acid sequence is in SEQ. ID. NO .: 1, the nucleotide sequence in SEQ. ID. NO .: 2 shown.
  • the gene was divided into 18 fragments of sense and reverse, complementary counter-strand oligonucleotides in an alternating sequence (SEQ. ID. NO .: 3-20). An area of at least 15 bp in length was appended to the 5 'and 3' ends, each overlapping with the neighboring oligonucleotides. Restriction endonuclease recognition sites were appended to the 5 'and 3' ends of the synthetic gene outside the coding region for later cloning in expression vectors.
  • the 5 'primer was that in SEQ. ID. NO .: 3 oligonucleotide used, which contains an EcoRI site.
  • SEQ. ID. NO .: 20 shows the 3 'primer with HindIII interface. The 3 'primer contains an additional stop codon after the natural stop codon in order to ensure a reliable termination of the translation.
  • the oligonucleotides were linked to one another by means of a PCR reaction and the resulting gene was amplified.
  • the gene was first divided into three fragments of 6 oligonucleotides each and the three sections were linked together in a second PCR cycle.
  • Fragment 1 consists of the oligonucleotides as in SEQ. ID. NO .: 3-8 shown, fragment 2 from oligonucleotides as in SEQ. ID. NO .: 9-14 and fragment three from oligonucleotide as in SEQ. ID. NO .: 15-20 shown together.
  • PCR reaction 1 generation of the three sections
  • the PCR mixture was applied to an agarose gel and the approximately 1130 bp PCR fragment was isolated from the agarose gel (Geneclean II kit from Bio 101, Inc. CA USA). The fragment was cut with the EcoRI and HindIII restriction endonucleases (Röche Diagnostics GmbH, Germany) for 1 hour at 37 ° C. At the same time, the pUC18 plasmid (Röche Diagnostocs GmbH, Germany) was cut with the EcoRI and HindIII restriction endonucleases at 37 ° C. for 1 hour, the mixture was separated by agarose gel electrophoresis and the 2635 bp vector fragment was isolated. The PCR fragment and the vector fragment were then ligated together using T4 DNA ligase.
  • the cloned gene was examined by restriction analysis and by multiple sequencing of both strands.
  • the synthetic gene had to be isolated again from the pUC plasmid.
  • 1 ⁇ g of plasmid DNA were first incubated with the restriction endonuMease HindIII (Röche Diagnostics GmbH) according to the manufacturer's instructions and then the restriction endonuMease was inactivated by heating to 65 ° C. for 20 min. Subsequently, resulting DNA overhangs were filled with Klenow polymerase according to the manufacturer's instructions (Röche Diagnostics GmbH) and the Klenow polymerase was then inactivated by incubation at 75 ° C. for 10 min.
  • the vector pPICZ ⁇ A (Invitrogen) was cut with the restriction endonuMease Asp718I (Röche Diagnostics GmbH) according to the manufacturer's instructions and restriction endonuMease was inactivated by heating the incubation batch to 65 ° C. for 20 min. Subsequently, resulting DNA overhangs were filled with Klenow polymerase according to the manufacturer's instructions (Röche Diagnostics GmbH) and the Klenow polymerase was then inactivated by incubation at 75 ° C. for 10 min.
  • the now linearized vector fragment of pPICZ ⁇ A was cut with the restriction endonuMease EcoRI (Röche Diagnostics GmbH) according to the manufacturer's instructions, the restriction mixture was applied to a 1% agarose gel and the fragments were separated in size by applying current (100 VI 150 mA). The approximately 3550 bp vector fragment was isolated from the agarose gel (QIAquick Gel Extraction Kit / Qiagen).
  • the fragments thus obtained were ligated together using the standard method (Sambrook et al. 1989).
  • the ppk gene is under the control of the AOX 1 promoter (promoter for alcohol oxidase 1 from Pichia pastoris, inducible with methanol) and is strategy in the correct reading frame behind the signal peptide of the ⁇ factor from Saccharomyces cerevisiae Moniert.
  • the gene fragment inserted in this way was then examined by restriction analysis and sequencing for an error-free base sequence.
  • the resulting expression vector, which contains the ppk gene which codes for the proproteinase K was called pPICPK-1 (see FIG. 1).
  • the ppk gene was also cloned in pPIC9K (Invitrogen).
  • the vector pPICPK-1 was cut with the restriction endonuMeasen Pmel and Notl (Röche Diagnostics GmbH) according to the manufacturer's instructions, the fragments from the restriction batch were separated in size in a 1% agarose gel and the approx. 1960 bp fragment containing the 3rd 'Part of the AOX1 promoter region, the sequence for the signal peptide of the ⁇ factor and the ppk gene, isolated from the gel (QIAquick Gel Extraction Kit / Qiagen).
  • the vector pPIC9K was cut with the restriction endonuMeasen Pmel and Notl (Röche Diagnostics GmbH) according to the manufacturer's instructions, the fragments from the restriction mixture were separated in size in a 1% agarose gel and the approximately 8450 bp vector fragment was isolated from the gel (QIAquick Gel extraction kit / Qiagen).
  • the fragments thus obtained were then ligated together using the standard method (Sambrook et al. 1989).
  • the ppk gene is also under the control of the AOX 1 promoter (promoter for alcohol oxidase 1 from Pichia pastoris, inducible with methanol).
  • the vector pPIC9K differs from the vector pPICZ ⁇ A by the selection marker and by three integration possibilities into the Pichia genome known to the person skilled in the art, depending on the vector linearization before the transformation, while the integration of pICZ ⁇ A in the AOXl locus is fixed.
  • the inserted gene fragment was then examined for error-free base sequence by means of restriction analysis and sequencing.
  • the resulting expression vector which contains the ppk gene which codes for the proproteinase K, was called pPICPK-2 (see FIG. 2).
  • the vector was first linearized with Pmel (Röche Diagnostics GmbH). The transformation was carried out by means of electroporation with the Gene Pulser II (Biorad). For this purpose, a colony of Pichia pastoris wild-type strain was inoculated in 5 ml of YPD medium (according to the Invitrogen catalog) and incubated at 30 ° C. overnight with shaking. The overnight culture was then inoculated 1: 2000 in 200 ml of fresh YPD medium (according to the Invitrogen catalog) and incubated overnight at 30 ° C. with shaking until an OD 6 o ⁇ of 1.3-1.5 was reached.
  • the cells were centrifuged (1500 xg / 5 minutes) and the pellet resuspended in 200 ml ice-cold, sterile water (0 ° C). The cells were again centrifuged (1500 xg / 5 minutes) and resuspended in 100 ml ice-cold, sterile water (0 ° C). The cells were centrifuged again, resuspended in 10 ml ice cold (0 ° C) 1 M sorbitol (ICN). The cells were centrifuged again, resuspended in 0.5 ml ice cold (0 ° C) 1 M sorbitol (ICN). The cells obtained in this way were kept on ice and immediately used for transformation.
  • the vector was initially used for variant 1 with Pmel (Röche Diagnostics GmbH) for integration into the AOXI locus and for variant II with Sall (Röche Diagnostics GmbH) - linearization in the His4 locus.
  • the transformation was carried out by means of electroporation with the Gene Pulser II (Biorad).
  • a colony of Pichia pastoris GS115 wild-type strain was inoculated in 5 ml of YPD medium (according to the Invitrogen catalog) and incubated at 30 ° C. overnight with shaking. The overnight culture was then inoculated 1: 2000 in 200 ml of fresh YPD medium (according to the Invitrogen catalog) and incubated overnight at 30 ° C. with shaking until an OD ⁇ oo of 1.3-1.5 was reached. The cells were centrifuged (1500 xg / 5 minutes) and the pellet resuspended in 200 ml ice-cold, sterile water (0 ° C).
  • the cells were again centrifuged (1500 xg / 5 minutes) and resuspended in 100 ml ice-cold, sterile water (0 ° C). The cells were centrifuged again, resuspended in 10 ml ice cold (0 ° C) 1 M sorbitol (ICN). The cells were centrifuged again, resuspended in 0.5 ml ice cold (0 ° C) 1 M sorbitol (ICN). The cells obtained in this way were kept on ice and immediately used for transformation.
  • Clones of Pichia pastoris GS115 that have a defective His4 gene (histidinol dehydrogenase) due to mutation can only grow on these plates if you have integrated the vector pPICPK-2, which has the functional His4 gene as an insert and thus the deficiency in which abolishes histidine biosynthesis.
  • the shake flasks were incubated at 30 ° C. with shaking, samples were taken every 24 hours, the OD 60 o was determined, an activity test for expression of proteinase K was carried out, and each was replenished with 0.5% methanol (Mallinckrodt Baker BN.) For further induction. The expression experiments ran over 168 hours.
  • Solution 1 50 mmol / 1 Tris base; 10 mmol / L CaCl 2 pH 8.2
  • Solution 2 125 mg Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-p ⁇ A dissolved in 1 ml DMSO
  • the cells are centrifuged (5 min 10000 rpm Eppendorf table centrifuge) and the supernatant diluted 1: 500 in solution 1.

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Abstract

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur löslichen Expression eines für die Proteinase K kodierenden Gens in Hefe, z.B. in Pichia pastoris, mit anschließender Sekretion in das Kulturmedium. Des weiteren wird ein Aufreinigungsverfahren der heterolog exprimierten und sekretierten Proteinase K beschrieben.

Description

Expression der rekombinanten Proteinase K aus Tritirachium aϊbum in Hefe
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanter Proteinase K in löslicher und aktiver Form in wirtschaftlich interessanten Mengen
Proteinase K (E.C. 3.4.21.64, bekannt auch als Endopeptidase K) ist eine extrazelluläre Endopep- tidase, die von dem Pilz Tritirachium älbum Li ber synthetisiert wird. Sie gehört zur Klasse der Serinproteasen mit der typischen katalytischen Triade Asp39-His69-Ser224 (Jany, K.D. et al. (1986) FEBS Letters Vol. 199(2), 139-144). Da die Sequenz der 279 Aminosäuren langen Polypeptidkette (Gunkel, P.A. und Gassen, H.G. (1989) Eur. }. Biochem. Nol. 179(1), 185-194) und die dreidimensionale Struktur (Betzel, C. et al. (1988) Eur. J. Biochem. Nol. 178(1), 155-71) eine hohe Homologie mit den bakteriellen Subtilisinen aufweist, wird Proteinase K zur Subtilisinfamilie gezählt (Pahler, A. et al. (1984) EMBOJ. Vol. 3(6), 1311-1314; Jany, K.D. und Mayer, B. (1985). Biol. Chem. Hoppe-Seyler, Nol. 366(5), 485-492). Benannt wurde die Proteinase K auf Grund ihrer Fähigkeit, natives Keratin zu hydrolysieren und somit dem Pilz ein Wachstum auf Keratin als einziger C- und Ν-Quelle zu ermöglichen (Ebeling, W. et al. (1974) Eur. J. Biochem. Nol. 47(1), 91-97). Proteinase K ist mit einer spezifischen Aktivität von über 30 U/mg eine der aktivsten bekannten Endopeptidasen (Betzel, C. et al. (1986) I 'FEBS Lett. Nol. 197(1-2), 105-110) und hydrolysiert unspezifisch native sowie denaturierte Proteine.
Die Proteinase K aus Tritirachium album Limber wird im natürlichen Wirt als Präproprotein translatiert. 1989 wurde durch Gunkel, F.A. und Gassen, H.G. (1989) Eur. J. Biochem. Nol. 179(1), 185-194 die Sequenz der cDΝA des Gens, das für die Proteinase K codiert, entschlüsselt. Demnach setzt sich das Gen für die Präproproteinase K aus 2 Exons zusammen und codiert für eine 15 Aminosäuren lange Signalsequenz, eine 90 Aminosäuren lange Prosequenz und eine 279 Aminosäuren lange reife Proteinase K. Ein 63 bp langes Intron befindet sich im Bereich der Prosequenz. Das Präpeptid wird bei der Translokation in das endoplasmatische Retikulum (ER) abgespalten. Über die daran anschließende Prozessierung zur reifen Proteinase K unter Abspaltung des Propeptids ist heute noch sehr wenig bekannt. Die reife Proteinase K besteht folglich aus 279 Aminosäuren. Die kompakte Struktur wird durch zwei Disulfidbrücken und zwei gebundene Calciumionen stabilisiert. Dies erklärt, warum Proteinase K im Vergleich zu anderen Subtilisinen eine deutlich höhere Stabilität gegenüber extremen pH-Werten, hohen Temperaturen, chaotropen Substanzen und Detergenzien zeigt (Do- lashka, P. et al. (1992) Int. J. Pept. Protein. Res. Vol. 40(5), 465-471). Proteinase K zeichnet sich durch eine hohe Thermostabilität (bis 65°C, Bajorath et al. (1988), Eur. J. Biochem. Vol. 176, 441- 447) und einen weiten pH-Bereich (pH 7,5-12,0, Ebeling, W. et al. (1974) Eur. /. Biochem. Vol. 47(1), 91-97) aus. Die Aktivität wird in Anwesenheit von denaturierenden Substanzen wie Harnstoffoder SDS gesteigert (Hilz, H. et al. (1975) /. Biochem. Vol. 56(1), 103-108; Jany, K.D. und Mayer, B. (1985) Biol. Chem. Hoppe-Seyler, Vol. 366(5), 485-492).
Die oben genannten Eigenschaften machen die Proteinase K insbesondere bei solchen biotechnologischen Anwendungen interessant, bei denen ein unspezifischer Proteinabbau erforderlich ist. Besonders zu erwähnen ist hier die Nukleinsäureisolierung (DNA oder RNA) aus Rohextrakt und die Probenvorbereitung bei der DNA- Analytik (Goldenberger, D. et al. (1995) PCR Methods Appl. Vol. 4(6), 368-370; US 5,187,083; US 5,346,999). Weitere Anwendungen liegen im Bereich der Proteinanalytik wie z.B. der Strukturaufklärung.
Proteinase K wird kommerziell in großen Mengen durch Fermentation des Pilzes Tritirachium alhum Limber (z.B. CBS 348.55, Merck Stamm No. 2429 oder Stamm ATCC 22563) gewonnen. Die Produktion der Proteinase K wird dabei jedoch durch Glucose oder freie Aminosäuren sup- primiert. Da proteinhaltige Medien darüber hinaus die Expression der Proteasen induzieren, müssen als einzige Stickstoffquelle Proteine wie BSA, Milchpulver oder Sojabohnenmehl verwendet werden. Die Sekretion der Protease beginnt, sobald die stationäre Phase des Wachstums erreicht ist (Ebeling, W. et al. (1974) Eur. J. Biochem. Vol. 47(1), 91-97).
Da demzufolge Tritirachium album Limber für eine Fermentation in großem Maßstab schlecht geeignet ist und darüber hinaus genetisch schwer manipulierbar ist, wurden verschiedene Versuche unternommen, eine Überexpression von rekombinanter Proteinase K in anderen Wirtszellen zu erreichen. Wegen mangelnder Expression, Bildung von inaktiven "inclusion bodies" oder Problemen bei der Naturierung konnten jedoch bei diesen Versuchen keine signifikante Aktivität nachgewiesen werden (Gunkel, F.A. und Gassen, H.G. (1989) Eur. J. Biochem. Vol. 179(1), 185-194; Samal, B.B. et al. (1996) Adv. Exp. Med. Biol. Vol. 379, 95-104).
Tritirachium album Limber ist ein langsam wachsender Pilz, der nur geringe Mengen an Proteasen in das Medium sezerniert. Nachteilig ist der im Vergleich zu Hefe langsamere Zellzyklus so- wie die geringere erreichbare optische Dichte im Fermenter. Außerdem ist es bekannt, daß T. album außer Proteinase K auch andere Proteasen produziert, welche die Präparation verunreinigen könnten (Samal, B.B. et al. (1991). Enzyme Microb. Technol. Vol. 13, 66-70).
Die Expression der Proteinase K in E. coli ist zwar prinzipiell möglich, erfolgt jedoch nicht in löslicher Form, sondern in sogenannten "inclusion bodies", aus denen das Enzym anschließend durch bestimmte Maßnahmen solubilisiert und renaturiert werden muß. Der Nachteil dieser Methode ist, daß bei der Solubilisierung und Renaturierung viel Protein verloren geht.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur Herstellung von rekombi- nanter Proteinase K in wirtschaftlich interessanten Mengen zur Verfügung zu stellen.
Es hat sich überraschenderweise gezeigt, daß es möglich ist, eine rekombinante Proteinase K als zymogene Vorstufe in löslicher Form in Hefe zu exprimieren und zu sekretieren, wobei eine autokatalytische Aktivierung zur aktiven Proteinase K erfolgt. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Aufreinigung der aktiven Proteinase K aus dem Mediumüberstand.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung von rekombi- nanter Proteinase K umfassend die Schritte
a) Transformation einer Wirtszelle mit einem Vektor enthaltend eine für diezymogene Vorstufe der Proteinase K kodierende DNA, wobei diese stromaufwärts der kodierenden Sequenz mit einer Sequenz im Leserahmen fusioniert ist, welche für ein Signalpeptid kodiert und unter Kontrolle eines für die Wirtszelle geeigneten Promotors steht, b) Expression der zymogenen Vorstufe der Proteinase K c) Sekretion und autokatalytische Aktivierung der Proteinase K d) Isolierung und Reinigung der Proteinase K, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Wirtszelle um Hefezellen handelt und das Protein in löslicher Form von diesem Expressionswirt sekretiert wird.
In einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Wirtszelle aus der folgenden Gruppe ausgewählt: Pichia Spezies, Hansenula spezies wie z.B. Hansenula poly- morpha, Saccharomyces Spezies, Schizosaccharomyces spezies, Yarrowia spezies wie z.B. Yar- rowia lipolytica, Kluyveromyces spezies und Aspergillus spezies. Besonders bevorzugt ist erfindungsgemäß, wenn Pichia pastoris als Wirtszelle verwendet wird.
Als vorteilhaft hat sich für das erfindungsgemäße Verfahren ferner herausgestellt, wenn die Wirtszelle mit einer für die zymogene Vorstufe kodierende DNA transformiert wird und die Proteinase K zu einem späteren Zeitpunkt während oder unmittelbar nach der Sekretion in das Kulturmedium autokatalytisch aktiviert wird.
Bei Verwendung von Pichia pastoris als Wirtszelle, wird das für die zymogene Vorstufe der Proteinase K kodierende Gen bevorzugt in folgende Vektoren Moniert: pPICZ, pPICZα, pGAPZ, pGAPZα, pPICZαA und pPIC9K . Besonders bevorzugt sind in diesem Fall die Vektoren: pPICZαA und pPIC9K. Insbesondere bevorzugt ist erfindungsgemäß der Vektor pPICZαA. Die vorstehend genannten Vektoren sind kommerziell erhältlich (Invitrogen).
Weiterhin ist gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von rekombinanter Proteinase K bevorzugt, wenn die Expression der Proteinase K bzw. deren zymogene Vorstufe der Proteinase K durch Methanol (pPIC- Vektoren) induziert wird. Eine andere Möglichkeiten ist die Induzierung der Expression durch Glycerinaldehydphosphat (pGAP- Vektoren).
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von rekombinanter Proteinase K wird die Sekretion des Proteins bevorzugt durch die N-terminale Fusionierung des Signalpeptides des α-Faktors aus Saccharomyces cerevisiae eingeleitet. Das bedeutet beispielsweise bei den oben genannten Vektoren, die mit α gekennzeichnet sind, daß diese die Nukleotidsequenz für das Sig- nalpeptid des α-Faktors aus Saccharomyces cerevisiae besitzen. Bei der Translation wird dann ein Fusions-Protein aus Signalpeptid am N-Terminus und Zielprotein erzeugt. Ein weiteres mögliches Signalpeptid wäre die natürliche Signalsequenz der Proteinase K.
Als besonders bevorzugt hat sich ferner erwiesen, wenn zur Herstellung der rekombinanten Proteinase K die Wirtszelle Pichia pastoris mit dem Expressionsvektoren pPICZαA und pPIC9K, welche eine für die zymogene Vorstufe kodierende DNA enthalten, transformiert wird und das Gen unter Kontrolle des AOX1 -Promotors und gegebenenfalls des AOXl-Terminators steht.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ebenfalls ein Vektor enthaltend eine für die zymogene Vorstufe der Proteinase K kodierende DNA, wobei diese stromaufwärts der kodierenden Sequenz mit einer Sequenz im Leserahmen fusioniert ist, welche für ein geeignetes Signalpeptid kodiert und wobei das kodierende Gen unter Kontrolle eines für die Wirtszelle geeigneten Promotors und gegebenenfalls Terminators steht und wobei dieser Vektor für die Transformation dieser Wirtszelle geeignet ist. Erfindungsgemäß ist die Wirtszelle Hefe.
Gegenstand der Erfindung ist somit ferner ein rekombinanter Vektor, der eine oder mehrere Kopien der vorstehend definierten rekombinanten DNA enthält. Der Vektor ist bevorzugt ein Plasmid, welches einen für die Wirtszelle starken Promotor und ein für die Wirtszelle geeignetes Signalpeptid zur Sekretion von Proteinen besitzt. Denkbar ist aber darüber hinaus die Fusion des nativen Signalpeptides der Präproproteinase K an den N-Terminus des Propeptides, wie es in SEQ. ID. NO.: 21 (Signalsequenz 1-15 (15 Aminosäuren); Prosequenz 16-104 (90 Aminosäuren); Sequenz der reifen Proteinase K 106-384 (279 Aminosäuren)) dargestellt ist. Zur Herstellung des Expressionsvektors werden Methoden verwendet, die dem Fachmann geläufig sind und zum Beispiel bei Sambrook et al. (1989) beschrieben sind.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Wirtszelle transformiert mit einem der oben aufgeführten Vektoren, wobei die Wirtszelle eine Hefe ist. Bevorzugterweise wird die Wirtszelle ausgewählt aus der folgenden Gruppe: Pichia spezies, Hansenula spezies wie z.B. Hansenula polymorpha, Saccharomyces spezies, Schizosaccharomyces spezies, Yarrowia spezies wie z.B. Yarrowia lipolytica, Kluyveromyces spezies. und Aspergülus spezies. Besonders bevorzugt ist als Wirtszelle Pichia pastoris. Insbesondere ist bevorzugt, wenn mehrere Vektoren(mit jeweils einer Kopie des ppK-Ge ) in das Genom integriert werden.
Ferner umfaßt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Reinigung der Proteinase K. Für die Aufreinigung der Protease werden in einem ersten Schritt die Hefezellen über Mikrofiltration bzw. Zentrifugation entfernt. Die resultierende klare Lösung enthält die Protease. Anschließend folgt eine Umpufferung über Ultrafiltration, um das Produkt an einen Kationenaustauscher, beispielsweise SP-Sepharose oder SP-Sephadex (Pharmacia) oder SP-Toyopearl (Tosoh Corporation) zu binden. Nach der Elution erfolgt eine erneute Umpufferung über Ultrafiltration und die Bindung an einen Anionenaustauscher, beispielsweise DEAE-Sepharose oder Q-Sepharose (Pharmacia) oder DEAE-Fraktogel (Merck). Nach der erneuten Elution wird die reine Protease über Ultrafiltration in ein stabiles Puffersystem überführt (Protein Purification, Principles and Prac- tice, Robert K. Scopes, Springer Verlag, 1982). Der Fachmann kann jedoch auch andere Methoden zur Reinigung verwenden, die zum Stand der Technik gehören. Durch das erfindungsgemäße Verfahren ist es überraschenderweise gelungen, rekombinante Proteinase K herzustellen, wobei das Enzym löslich und aktiv von einer heterologen Wirtszelle produziert wird. Bei der Expression der Proteinase K mit anschließender Sekretion des Enzyms in das Kulturmedium ist insbesondere von Vorteil, daß verhindert wird, daß die Proteinase K im Cytosol der Wirtszelle eine stark toxische Wirkung entfaltet. Weiterhin wird die korrekte Ausbildung der zwei Disulfidbrücken gewährleistet, die im reduzierenden Milieu des Cytosols auch nicht ohne weiteres stattfinden könnte. Somit ist ein entscheidender Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens, daß ein Weg für die lösliche und aktive Produktion einer rekombinanten Proteinase K bereitgestellt wird. Es ist sehr überraschend und nicht erklärlich, daß die Ober- flächenproteine der erfindungsgemäßen Wirtszellen durch eine sekretierte Proteinase K nicht hydrolysiert werden. Bei der zu erwartenden Hydrolyse der Oberflächenproteine durch Proteinase K würde die Wirtszelle in ihrem Lebenszyklus gestört.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird eine Proteinase K erhalten, welche homogen ist und daher in besonderem Maße für analytische und diagnostische Anwendungen geeignet ist. Die erfindungsgemäße zymogene Vorstufe der Proteinase K kann gegebenenfalls weitere N- terminale Modifikationen enthalten, und zwar insbesondere Sequenzen, die eine Reinigung des Zielproteins erleichtern ("affinity tags"). Ferner kann die zymogene Vorstufe Sequenzen enthalten, welche die Effizienz der Translation erhöhen, welche die Faltungseffizienz steigern und/oder auch solche Sequenzen, die zu einer Sekretion des Zielproteins in das Kulturmedium führen (natürliche Präsequenz und andere Signalpepti.de).
Unter Proteinase K im Sinne der Erfindung sind sowohl die in SEQ. ID. NO.: 1 angegebene Sequenz nach Gassen et al. (1989), als auch andere Varianten der Proteinase K aus Tritirachium album Limber, wie die in Ch. Betzel et al. (Biochemistry 40 (2001), 3080-3088) offenbarte Aminosäuresequenz sowie insbesondere Proteinase T (Samal, B.B. et al. (1989) Gene Vol. 85(2), 329- 333; Samal, B.B. et al. (1996) Adv. Exp. Med. Biol. Vol. 379, 95-104) und Proteinase R (Samal, B.B. et al. (1990) Mol. Microbiol. Vol. 4(10), 1789-1792; US 5,278,062) und darüber hinaus mit rekombinanten Mitteln erzeugte Varianten (wie zum Beispiel in der WO 96/28556 beschrieben) zu verstehen. SEQ. ID. NO.: 1 umfaßt eine Prosequenz (1-90; 90 Aminosäuren) und die Sequenz der reifen Proteinase K (91-368; 279 Aminosäuren). Die von Betzel et al. (Biochemistry 40 (2001), 3080-3088) beschriebene Proteinase-K-Aminosäuresequenz weist insbesondere in Position 207 der aktiven Protease Aspartat anstatt eines Serintestes auf. Pro-Proteinase K im Sinne der Erfindung bedeutet insbesondere eine Proteinase K, die am N- Terminus mit ihrer Prosequenz gemäß SEQ. ID. NO.: 1 verknüpft ist. Bei dem mit Proteinase K eng verwandten Subtilisin E und entsprechenden Varianten hat die Prosequenz einen essentiellen Einfluß auf die Faltung und Bildung von aktiver Protease (Ikemura, H. et al. (1987) Biol. Chem. Vol. 262(16), 7859-7864). Es wird insbesondere vermutet, daß die Prosequenz als intramolekulares Chaperon wirkt (Inouye, M. (1991) Enzyme Vol. 45, 314-321). Nach der Faltung findet die Prozessierung zur reifen Subtilisin-Protease statt, indem das Propeptid autokatalytisch abgespalten wird (Ikemura, H. und Inouye, M. (1988) J. Biol. Chem. Vol. 263(26), 12959-12963). Dieser Prozeß findet bei Subtilisin E (Samal, B.B. et al. (1989) Gene Vol. 85(2), 329-333; Volkov, A. und Jordan, F. (1996) J. Mol. Biol. Vol. 262, 595-599), Subtilisin BPN' (Eder, J. et al. (1993) Biochemistry Vol. 32, 18-26), Papain (Vernet, T. et al. (1991) J. Biol. Chem. Vol. 266(32), 21451- 21457) und Thermolysin (Marie-Claire, C. (1998) J. Biol. Chem. Vol. 273(10), 5697-5701) intramolekular statt.
Für die Funktion als Chaperon scheinen nur bestimmte, meist hydrophobe Kernbereiche der Prosequenz notwendig zu sein, da Mutationen in weiten Bereichen ohne Einfluß auf die Aktivität bleiben (Kobayashi, T. und Inouye, M. (1992) /. Mol Biol Vol. 226, 931-933). Außerdem ist bekannt, daß Propeptide zwischen verschiedenen Subtilisinvarianten austauschbar sind. So erkennt zum Beispiel Subtilisin BPN' auch die Prosequenz von Subtilisin E (Hu, Z. et al. (1996) /. Biol. Chem. Vol. 271(7), 3375-3384).
Die vorliegende Erfindung umfaßt somit sowohl die 90 Aminosäuren lange Prosequenz nach SEQ. ID. NO.: 1, als auch andere Varianten, die eine faltungsfördernde Funktion erfüllen. Ebenfalls umfaßt ist ein Propeptid, das exogen zu der Faltung von reifer Proteinase K gegeben wird und die oben ausgeführten Funktionen erfüllt.
Der wesentliche Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist daher, daß die rekombinante Proteinase K löslich und aktiv von einem Expressionswirt in das Kulturmedium sekretiert wird. Darüber hinaus wird der bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Expressionswirt durch die sehr aktive und unspezifische Protease nicht geschädigt oder in sonstiger Weise negativ beeinflußt, d.h. insbesondere, daß das Wachstum weiter problemlos erfolgt und eine verstärkte Zell-Lyse nicht zu beobachten ist. Zudem ist der erfindungsgemäße Expressionswirt im Vergleich zu Tritirachium album leichter handhabbar und zeichnet sich durch höhere Wachstumsraten aus. Figurenbeschreibung Figur 1
Expressionsplasmid pPICPK-1. Eine für die zymogene Proform der Proteinase K kodierende Sequenz kloniert in den Ausgangsvektor pPICZαA (Invitrogen).
Figur 2
Expressionsplasmid pPICPK-2. Eine für die zymogene Proform der Proteinase K kodierende Sequenz kloniert in den Ausgangsvektor pPIC9K (Invitrogen).
Beispiele
Beispiel 1 Gensynthese
Das Gen für die reife Proteinase K aus Tritirachium album Limber ohne Signalsequenz und ohne Intron wurde mittels Gensynthese generiert. Als Vorlage wurde die 368 Aminosäuren lange Sequenz (ohne natives Signalpeptid) von Gunkel und Gassen, 1989 verwendet. Durch Rücktranslation der Aminosäuresequenz wurde eine für die Expression sowohl in E.coli wie auch Hefe co- don-optimierte Nukleinsäuresequenz erstellt. Die Aminosäuresequenz ist in SEQ. ID. NO.: 1, die Nukleotidsequenz in SEQ. ID. NO.: 2 dargestellt.
Für die Gensynthese wurde das Gen in 18 Fragmente aus Sinn- und reversen, komplementären Gegenstrangoligonukleotiden in alternierender Folge unterteilt (SEQ. ID. NO.: 3-20). Am 5'- und 3'-Ende wurde jeweils ein mindestens 15 bp- langer Bereich angehängt, der jeweils mit den benachbarten Oligonukleotiden überlappt. An die 5'- und 3'-Enden des synthetischen Gens wurden außerhalb des codierenden Bereichs zur späteren Klonierung in Expressionsvektoren Erkennungsstellen für Restriktionsendonukleasen angehängt. Für die Klonierung des pro-Proteinase K-Gens wurde als 5'-Primer das in SEQ. ID. NO.: 3 dargestellte Oligonukleotid verwendet, das eine EcoRI-Schnittstelle enthält. SEQ. ID. NO.: 20 zeigt den 3'-Primer mit Hindlll-Schnittstelle. Der 3'-Primer enthält ein zusätzliches Stoppcodon nach dem natürlichen Stoppcodon, um eine gesicherte Termination der Translation zu gewährleisten.
Die Oligonukleotide wurden mittels PCR-Reaktion miteinander verknüpft und das daraus resultierende Gen amplifiziert. Dabei wurde das Gen zunächst in drei Fragmente zu je 6 Oligonukleotiden unterteilt und in einem zweiten PCR-Zyklus die drei Teilstücke miteinander verknüpft. Fragment 1 setzt sich aus den Oligonukleotiden wie in SEQ. ID. NO.: 3-8 dargestellt, Fragment 2 aus Oligonukleotide wie in SEQ. ID. NO.: 9-14 dargestellt und Fragment drei aus Oligonukleotid wie in SEQ. ID. NO.: 15-20 dargestellt, zusammen.
Folgende PCR-Parameter wurden angewandt: PCR-Reaktion 1 (Generierung der drei Teilstücke)
5 min 95°C hotstart
30 Zyklen
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final extension
PCR-Reaktion 2 (Verknüpfung der Teilstücke zum Gesamtgen)
5 min 95°C hotstart
1,5 min 95°C
2 min 48°C 6 Zyklen (ohne endständige Primer)
2 min 72°C
Zugabe der enständigen Primer
1,5 min 95°C
1,5 min 60°C >- 25 Zyklen (mit endständigen Primern)
2 min 72°C
7 min 72°C final extension
Beispiel 2
Klonierung des synthetischen Proteinase K-Fragmentes aus der Gensynthese
Der PCR- Ansatz wurden auf ein Agarosegel aufgetragen und das ca. 1130 Bp große PCR-Fragment wurde aus dem Agarosegel (Geneclean II Kit von Bio 101, Inc. CA USA) isoliert. Das Fragment wurde mit den EcoRI- und Hindlll-Restriktionsendonukleasen (Röche Diagnostics GmbH, Germany) 1 Stunde bei 37°C geschnitten. Gleichzeitig wurde das pUC18-Plasmid (Röche Diagnostocs GmbH, Germany) mit den EcoRI- und Hindlll-Restriktionsendonukleasen 1 Stunde bei 37°C geschnitten, der Ansatz mittels Agarosegelelektorphorese aufgetrennt und das 2635 Bp große Vektorfragment isoliert. Anschließend wurden das PCR-Fragment und das Vektorfragment mittels T4-DNA-Ligase miteinander ligiert. Dazu wurden 1 ul (20 ng) Vektorfragment und 3 μl (100 ng) PCR-Fragment, 1 μl 10 x Ligase-Puffer (Maniatis et al., 1989 B.27), 1 μl T4-DNA-Ligase, 4 μl steriles H2O bidest. pipettiert, vorsichtig gemischt und über Nacht bei 16°C inkubiert.
Das Monierte Gen wurde mittels Restriktionsanalyse und durch mehrfache Sequenzierung beider Stränge untersucht.
Beispiel 3 Vektorkonstruktion
Das synthetische Gen mußte zunächst wieder aus dem pUC-Plasmid isoliert werden. Zu diesem Zweck wurden 1 μg Plasmid-DNA zunächst mit der RestriktionsendonuMease Hindlll (Röche Diagnostics GmbH) nach den Herstellerangaben inkubiert und anschließend die RestriktionsendonuMease durch Erwärmung auf 65°C für 20 min inaktiviert. Anschließend wurden dabei entstehenden DNA-Überhänge mit Klenow-Polymerase nach Herstellerangaben (Röche Diagnostics GmbH) aufgefüllt und die Klenow-Polymerase dann durch Inkubation bei 75°C für 10 min inaktiviert. Zuletzt wurde das nun linearisierte Vektorfragment des o.a. pUC-Plasmides mit der RestriktionsendonuMease EcoRI (Röche Diagnostics GmbH) nach den Herstellerangaben geschnitten, der Restriktionsansatz auf ein l%iges Agarosegel aufgetragen und die Fragmente der Größe nach durch Anlegen von Strom (100 VI 150 mA) voneinander getrennt. Das ca. 1120 bp große Fragment, enthaltend das Gen für die Proproteinase K (ppk-Gen) wurde aus dem Agarosegel isoliert (QIAquick Gel Extraction Kit/Qiagen).
Der Vektor pPICZαA (Invitrogen) wurde mit der RestriktionsendonuMease Asp718I (Röche Diagnostics GmbH) nach den Herstellerangaben geschnitten und RestriktionsendonuMease durch Erwärmung des Inkubationsansatzes auf 65°C für 20 min inaktiviert. Anschließend wurden dabei entstehenden DNA-Überhänge mit Klenow-Polymerase nach Herstellerangaben (Röche Diagnostics GmbH) aufgefüllt und die Klenow-Polymerase dann durch Inkubation bei 75°C für 10 min inaktiviert. Zuletzt wurde das nun linearisierte Vektorfragment von pPICZαA mit der RestriktionsendonuMease EcoRI (Röche Diagnostics GmbH) nach den Herstellerangaben geschnitten, der Restriktionsansatz auf ein l%iges Agarosegel aufgetragen und die Fragmente der Größe nach durch Anlegen von Strom (100 VI 150 mA) voneinander getrennt. Das ca. 3550 bp große Vektorfragment wurde aus dem Agarosegel isoliert (QIAquick Gel Extraction Kit/Qiagen).
Die so gewonnenen Fragmente wurden nach Standardmethode (Sambrook et al. 1989) miteinander ligiert. In diesem Vektor steht das ppk-Gen unter Kontrolle des AOX 1 -Promotors (Promotor für die Alkoholoxidase 1 aus Pichia pastoris, mit Methanol induzierbar) und wird mit dieser Klo- nierungsstrategie im korrekten Leserahmen hinter das Signalpeptid des α-Faktors aus Saccharomyces cerevisiae Moniert. Das so insertierte Genfragment wurde dann mittels Restriktionsanalyse und Sequenzierung auf fehlerfreie Basensequenz untersucht. Der so entstandene Expressionsvektor, der das ppk-Gen, das für die Proproteinase K kodiert, enthält, wurde pPICPK-l(s. Fig. 1) genannt.
Anschließend wurde das ppk-Gen ebenfalls in pPIC9K (Invitrogen) Moniert. Dazu wurde der Vektor pPICPK-1 mit den RestriktionsendonuMeasen Pmel und Notl (Röche Diagnostics GmbH) nach den Herstellerangaben geschnitten, die Fragmente aus dem Restriktionsansatz in einem l%igen Agarosegel der Größe nach aufgetrennt und das ca. 1960 bp große Fragment, enthaltend den 3 '-Teil der AOXl -Promotor- Region, die Sequenz für das Signalpeptid des α-Faktors und das ppk-Gen, aus dem Gel isoliert (QIAquick Gel Extraction Kit/Qiagen). Gleichzeitig wurde der Vektor pPIC9K mit den RestriktionsendonuMeasen Pmel und Notl (Röche Diagnostics GmbH) nach den Herstellerangaben geschnitten, die Fragmente aus dem Restriktionsansatz in einem l%igen Agarosegel der Größe nach aufgetrennt und das ca. 8450 bp große Vektorfragment aus dem Gel isoliert (QIAquick Gel Extraction Kit/Qiagen).
Anschließend wurden die so gewonnenen Fragmente nach Standardmethode (Sambrook et al. 1989) miteinander ligiert. In diesem Vektor steht das ppk-Gen ebenfalls unter Kontrolle des AOX 1 -Promotors (Promotor für die Alkoholoxidase 1 aus Pichia pastoris, mit Methanol induzierbar). Der Vektor pPIC9K unterscheidet sich von dem Vektor pPICZαA durch den Selektionsmarker und durch drei dem Fachmann bekannten Integrationsmöglichkeit in das Pichia Genom je nach Vektorlinearisierung vor der Transformation während die Integration von pICZαA in den AOXl-Locus festgelegt ist. Das insertierte Genfragment wurde dann mittels Restriktionsanalyse und Sequenzierung auf fehlerfreie Basensequenz untersucht.
Der so entstandene Expressionsvektor, der das ppk-Gen, das für die Proproteinase K kodiert, enthält, wurde pPICPK-2 (s. Fig. 2) genannt.
Beispiel 4
Transformation vonpPICPK-1 in Pichia pastoris
Zur Transformation von pPICPK-1 in Pichia pastoris X-33 mit anschließender Integration in das Genom wurde der Vektor zunächst mit Pmel (Röche Diagnostics GmbH) linearisiert. Die Transformation wurde mittels Elektroporation mit dem Gene Pulser II (Biorad) durchgeführt. Dazu wurde eine Kolonie von Pichia pastoris Wildtypstamm in 5 ml YPD-Medium (nach Invi- trogen-Katalog) angeimpft und bei 30°C über Nacht unter Schütteln inkubiert. Die Übernachtkultur wurde anschließend 1:2000 in 200 ml frisches YPD-Medium (nach Invitrogen-Katalog) überimpft und über Nacht bei 30°C unter Schütteln inkubiert, bis eine OD6oα von 1,3 - 1,5 erreicht war. Die Zellen wurden abzentrifügiert (1500 x g / 5 Minuten) und das Pellet in 200 ml eiskaltem, sterilen Wasser (0°C) resuspendiert. Die Zellen wurden wiederum abzentrifügiert (1500 x g/5 Minuten) und in 100 ml eiskaltem, sterilen Wasser (0°C) resuspendiert. Die Zellen wurden wiederum abzentrifügiert, in 10 ml eiskaltem (0°C) 1 M Sorbitol (ICN) resuspendiert. Die Zellen wurden wiederum abzentrifügiert, in 0,5 ml eiskaltem (0°C) 1 M Sorbitol (ICN) resuspendiert. Die so gewonnenen Zellen wurden auf Eis gehalten und sofort zur Transformation eingesetzt.
80 μl der Zellen wurden mit ca. 1 μg linearisierter pPICPK-1 -Vektor-DNA versetzt und der gesamte Ansatz in eine eiskalte (0°C) Elektroporationsküvette transferiert und weitere 5 Minuten auf Eis inkubiert. Anschließend wurde die Küvette in den Gene Pulser II (Biorad) überführt und die Transformation bei 1 kV, 1 kΩ und 25μF durchgeführt. Nach der Elektroporation wurde der Ansatz mit 1 ml IM Sorbitol (ICN) versetzt und anschließend 100 - 150 μl auf eine YPDS-Agar- platte (nach Invitrogen-Katalog) mit lOOμg/ml Zeocin® (Invitrogen) ausplattiert. Die Platten wurden anschließend 2 - 4 Tage bei 30 °C inkubiert.
Die Klone wurden auf Raster-MD (= minimal Dextrose) -Platten überimpft und weiter analysiert.
Gewachsene Klone wurden gepickt, in 20 μl steriles Wasser resuspendiert, mit 17,5 U Lyticase (Röche Diagnostics GmbH) aufgeschlossen (1 Stunde, 37°C) und direkt mittels PCR auf die korrekte Integration der ppk- Expressionskassette untersucht.
Klone, die die komplette Expressionskassette bei der Transformation in das Genom integriert haben, wurden dann in Expressionsversuchen eingesetzt.
Beispiel 5
Transformation von pPICPK-2 in Pichia pastoris
Zur Transformation von pICPK-2 in Pichia pastoris GS115 mit anschließender Integration in das Genom wurde der Vektor zunächst für Variante 1 mit Pmel (Röche Diagnostics GmbH) zur Integration in den AOXI-Locus und für Variante II mit Sall (Röche Diagnostics GmbH) zur Inte- gration in den His4-Locus linearisiert. Die Transformation wurde mittels Elektroporation mit dem Gene Pulser II (Biorad) durchgeführt.
Dazu wurde eine Kolonie von Pichia pastoris GS115 Wildtypstamm in 5 ml YPD-Medium (nach Invitrogen-Katalog) angeimpft und bei 30°C über Nacht unter Schütteln inkubiert. Die Übernachtkultur wurde anschließend 1:2000 in 200 ml frisches YPD-Medium (nach Invitrogen-Katalog) überimpft und über Nacht bei 30°C unter Schütteln inkubiert, bis eine ODßoo von 1,3 - 1,5 erreicht war. Die Zellen wurden abzentrifügiert (1500 x g / 5 Minuten) und das Pellet in 200 ml eiskaltem, sterilen Wasser (0°C) resuspendiert. Die Zellen wurden wiederum abzentrifügiert (1500 x g/5 Minuten) und in 100 ml eiskaltem, sterilen Wasser (0°C) resuspendiert. Die Zellen wurden wiederum abzentrifügiert, in 10 ml eiskaltem (0°C) 1 M Sorbitol (ICN) resuspendiert. Die Zellen wurden wiederum abzentrifügiert, in 0,5 ml eiskaltem (0°C) 1 M Sorbitol (ICN) resuspendiert. Die so gewonnenen Zellen wurden auf Eis gehalten und sofort zur Transformation eingesetzt.
80 μl der Zellen wurden mit ca. 1 μg linearisierter pICPK-2 -Vektor-DNA versetzt und der gesamte Ansatz in eine eiskalte (0°C) Elektroporationsküvette transferiert und weitere 5 Minuten auf Eis inkubiert. Anschließend wurde die Küvette in den Gene Pulser II (Biorad) überführt und die Transformation bei 1 kV, 1 kΩ und 25μF durchgeführt. Nach der Elektroporation wurde der Ansatz mit 1 ml IM Sorbitol (ICN) versetzt und anschließend 100 - 150 μl auf eine MM-Agarplatte (Minimalmedium nach Invitrogen-Katalog) ohne Histidin ausplattiert. Die Platten wurden anschließend 2 - 4 Tage bei 30 °C inkubiert. Klone von Pichia pastoris GS115, die durch Mutation ein defektes His4-Gen (Histidinoldehydrogenase) besitzen, können auf diesen Platten nur wachsen, wenn Sie den Vektor pPICPK-2 integriert haben, der das funktionsfähige His4-Gen als Insert besitzt und somit die Defizienz in der Histidinbiosynthese aufhebt.
Die Klone wurden auf Raster-MD (= minimal Dextrose)-Platten überimpft und weiter analysiert. Gewachsene Klone wurden gepickt, in 20 μl steriles Wasser resuspendiert, mit 17,5 U Lyticase (Röche Diagnostics GmbH) aufgeschlossen (1 Stunde, 37°C) und direkt mittels PCR auf die korrekte Integration der p fc-Expressionskassette untersucht.
Klone, die die komplette Expressionskassette bei der Transformation in das Genom integriert haben, wurden dann in Expressionsversuchen eingesetzt. Beispiel 6
Expression der Proteinase K
Positive Klone wurden in 10 ml BMGY-Medium (nach Invitrogen-Katalog) angeimpft und über Nacht bei 30°C unter Schütteln inkubiert. Anschließend wurden die OD bei 600 nm bestimmt und so in 10ml BMMY-Medium (nach Invitrogen-Katalog) überimpft, daß eine ODgoo von 1 resultierte. Das BMMY-Medium (nach Invitrogen-Katalog) enthält Methanol (Mallinckrodt Baker BN.), das die Expression der Proteinase K über den AOX 1-Promotor induziert.
Die Schüttelkolben wurden bei 30°C unter Schütteln inkubiert, alle 24 Stunden Proben gezogen, die OD60o bestimmt, ein Aktivitätstest auf Expression der Proteinase K durchgeführt und jeweils mit 0,5% Methanol (Mallinckrodt Baker BN.) zur weiteren Induktion nachgefüttert. Die Expressionsversuche liefen über 168 Stunden.
Beispiel 7
Aktivitätstest der sekretierten rekombinanten Proteinase K
Für den Aktivitätstest der rekombinanten Proteinase K benötigt man CaCl2 x 2H2O (Merck ID-
Νr. 102382), DMSO (Merck ID-Νr. 109678), das Substrat Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pΝA (Röche
Diagnostics ID-Νr. 0716766) und Tris-Base (Röche Diagnostics ID-Νr. 0153265).
Die Lösungen setzen sich wie folgt zusammen:
Lösung 1: 50 mmol/1 Tris-Base; 10 mmol/L CaCl2 pH 8,2 Lösung 2: 125 mg Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pΝA in 1 ml DMSO gelöst
Die Zellen werden abzentrifügiert (5 min 10000 rpm Eppendorf-Tischzentrifuge) und der Überstand 1:500 in Lösung 1 verdünnt.
2 ml von Lösung 1 werden in eine Küvette pipettiert und mit 0,02 ml von Lösung 2 versetzt. Die beiden Lösungen werden vermischt und auf die Reaktionstemperatur von 25°C temperiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 0,05 ml des wie o.a. verdünnten Überstandes und nochmaligen Mischen gestartet, die Absorbtionsänderung bei 405 nm gemessen und das ΔA/min aus dem linearen Bereich gemessen. Die Auswertung erfolgt dann nach folgender Formel:
2,07
Aktivität = ΔA/min [U/ml Probe-Lösung] ε x 1 x 0,05 2,07 = Probevolumen ε 05 = 10,4 [mmol"1 x 1 x cm"1]
1 = Scbichtdicke der Küvette
0,05 = Volumen der zugegebenen Probe

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung von rekombinanter Proteinase K umfassend die Schritte
a) Transformation einer Wirtszelle mit einem Vektor enthaltend eine für die zymogene Vorstufe der Proteinase K kodierende DNA, wobei diese stromaufwärts der kodierenden Sequenz mit einer Sequenz im Leserahmen fusioniert ist, welche für ein Signalpeptid kodiert und unter Kontrolle eines für die Wirtszelle geeigneten Promotors steht, b) Expression der zymogenen Vorstufe der Proteinase K, c) Sekretion und autokatalytische Aktivierung der Proteinase K, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Wirtszelle um Hefezellen handelt und das Protein löslich von diesem Expressionswirt sekretiert wird.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Wirtszelle ausgewählt ist aus der folgenden Gruppe: Pichia sp. Hansenula sp., Saccharomyces sp., Schizosaccharomyces sp, Yarrowia sp., Kluyveromyces sp. und Aspergülus sp.
3. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei es sich bei der Wirtszelle um Pichia pastoris handelt.
4. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei das Gen, das für die zymogene Vorstufe der Proteinase K kodiert in einen der folgenden Vektoren Moniert wird: pPICZ, pPICZα, pGAPZ, pGAPZα, pPICZαA und pPIC9K.
5. Verfahren gemäß Anspruch 3 oder 4, wobei die Wirtszelle mit einem der folgenden Vektoren transformiert wird: pPICPK-1 und pPICPK-2.
6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Expression der zymogenen Vorstufe der Proteinase K durch Methanol induziert wird.
7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Sekretion des Proteins durch die N-terminale Fusionierung eines Signalpeptides eingeleitet wird
8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Sekretion des Proteins durch die N-terminale Fusionierung eines Signalpeptides des α-Faktors aus Saccharomyces cerevisiae eingeleitet wird
9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die WirtszeUe Pichia pastoris mit dem Expressionsvektor pPICZαA, welcher eine für die zymogene Vorstufe der Proteinase K kodierende DNA enthält, transformiert wird und das Gen unter Kontrolle des AOX1 -Promotors steht.
10. Vektor enthaltend eine für die zymogene Vorstufe der Proteinase K kodierende DNA, wobei diese DNA stromaufwärts der kodierenden Sequenz mit einer Sequenz im Leserahmen fusioniert ist, welche für ein geeignetes Signalpeptid kodiert, und das kodierende Gen unter Kontrolle eines für die WirtszeUe geeigneten Promotors steht und dieser Vektor für die Transformation von Hefe geeignet ist.
11. Vektor gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß er für die Transformation von Pichia pastoris geeignet ist.
12. Vektor enthaltend eine für eine zymogene Vorstufe der Proteinase K kodierende DNA gemäß Anspruch 10 oder 11 ausgewählt aus der folgenden Gruppe: pPICZ, pPICZα, pGAPZ, pGAPZα, pPICZαA und pPIC9K.
13. Vektor gemäß einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei der Vektor pPICZαA ist.
14. Vektor gemäß einem der Ansprüche 10-12, wobei der Vektor enthaltend eine für die zymogenen Vorstufe der Proteinase K kodierende DNA pPICPK-1 oder pPICPK-2 ist.
15. WirtszeUe transformiert mit einem Vektor gemäß einem der Ansprüche 10-14 wobei die WirtszeUe eine Hefe ist.
16. Wirtszelle gemäß Anspruch 15, wobei die WirtszeUe ausgewählt ist aus der folgenden Gruppe: Pichia sp., Hansenula sp., Saccharomyces sp., Schizosaccharomyces sp., Yarrowia sp., Kluyveromyces sp. und Aspergülus sp.
7. Wirtszelle gemäß Anspruch 15 oder 16, wobei die WirtszeUe Pichia pastoris ist.
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