WO2002072827A1 - Recepteur specifique de cellule b se liant a traf3 - Google Patents

Recepteur specifique de cellule b se liant a traf3 Download PDF

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traf
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Definitions

  • the present invention relates to a novel TRAF3-binding protein that is a member of the B cell-specific receptor.
  • the present invention also provides a gene encoding the protein, a vector having the gene, a transformant having the gene, an antibody recognizing the protein, a method for screening a drug utilizing the protein, and
  • the present invention relates to a diagnostic method using the protein. Background art
  • TNF tumor necrosis factor
  • L ⁇ lymphotoxin
  • NGF neurotrophic factor
  • TNF receptor superfamily members include P55TNF receptor, p75TNF receptor, TNF receptor-related factor, Fas antigen, CD40, CD27, CD30, 0X40, low affinity p75 and NGF receptor. ing.
  • the function of several TNF receptor families has been elucidated, for example, the Fas antigen and low-affinity NGF receptor and their ligands are involved in programmed cell death, and the CD40 ligand is a T cell. Involved in vesicle-dependent B cell activation.
  • Fas Activation of Fas is triggered by the death domain-containing adapter molecule, FAD D / MORT 1, which binds to the intracellular domain of Fas, which in turn activates the pro-apoptotic protease, caspase 8, and ultimately triggers apoptosis I do.
  • FAD D / MORT 1 the death domain-containing adapter molecule
  • TNFR-1 transmits a wide range of biologically active signals mainly by activating NF- ⁇ B.
  • TNFR-1 binds to the death domain-containing TRADD and the intracellular domain of TNFR_1, and through its association with numerous signaling molecules such as FADD, TRAF2, and RIP, both apoptosis and NF- ⁇ B activation Transmit the other signal. Since the actions of TNF family ligands and TNF family receptors are diverse and affect many biological processes, these receptors, ligands, and signaling molecules associated with them are identified and solved. Analyzing is important in establishing a cure for the disease.
  • TNF receptor-related factor is a family of proteins that was first discovered as a downstream signaling factor in the TNF receptor superfamily
  • TRAFs 1-6 has a coiled-coil TRAF-N domain, and the C-terminal TRAF-C domain is conserved.
  • TRAF—C domain Mediates the interaction between TRAF proteins and the binding of the proteins to factors of the TNFR superfamily [Cheng, G., et al. (1995) Science 267, 1494-1498; Takeuchi, M., et al. (1996) J. Biol. Chem. 271, 19935-19942; and Hsu, H., et al., (1996) Cell 84, 299-308].
  • TRAF 3 was first identified as a molecule that binds to the cytoplasmic domain of the B cell surface marker CD40 and LMP-1, a Epstein-Virgils latent membrane protein [Mosialos, G., et al. 1995) Cell 80, 389-399; Sato, T., et al., (1995) FEBS Lett. 358, 113-118; Hu, HM, et al., (1994) J. Biol. Chem. 269, 30069-30072; ⁇ Cheng, G., et al. (1995) Science 267, 1494-1498].
  • TRAF3 has also been shown to interact with the cytoplasmic terminal portion of other factors in the TNFR family, such as the lymphotoxin receptor [Force, WR, et al., (1997) J. Biol. Chem. 272 , 30835-30840].
  • TRAF family proteins including TRAF 3, are cytoplasmic proteins that appear to lack catalytic activity and are generally thought to function as adapter proteins.
  • TRAF 3 has been shown to interact with other signaling molecules such as NIK :, ASK and TANK [Song, HY, et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 9792-9796; Nishitoh, H., et al. (1995) Mol. Cell 2, 389-395; and Regnier, CH, et al., (1997) Cell 90, 373-383].
  • the mechanism by which TRAF3 mediates signaling has not been fully elucidated. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to identify a signaling molecule that binds to TRAF3. Another object of the present invention is to solve the problem of closing a gene encoding a signaling molecule that binds to TRAF3 and elucidating the structure and function of the gene. Another object of the present invention is to provide a novel drug or diagnostic method using a gene encoding a signal transduction molecule that binds to TRAF3.
  • the present inventors screened protein-protein interaction using yeast. This screening utilizes the recruitment of human S os (hS os) protein to the cell membrane to activate the yeast RAS signal transduction pathway and complement the yeast cdc25 gene deficiency.
  • T3BP TRAF3-binding protein
  • a protein having any one of the following amino acid sequences is provided.
  • a gene encoding the protein of the present invention there is provided a gene encoding the protein of the present invention. Further, according to the present invention, a gene having any one of the following nucleotide sequences is provided. (a) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2;
  • a vector comprising the gene of the present invention. Further, according to the present invention, there is provided a transformant having the gene of the present invention or the vector of the present invention.
  • a method for producing a protein having a binding activity to TRAF3, comprising using the transformant of the present invention.
  • an antibody that recognizes the protein of the present invention there is provided an antibody that recognizes the protein of the present invention. Further, according to the present invention, there is provided a method for screening for a substance that promotes or suppresses the function of the protein or antibody using the protein or antibody of the present invention. Preferably, the substance that promotes or suppresses the function of the protein or antibody of the present invention is a substance that promotes or suppresses intracellular signal transduction via TRAF3.
  • a medicine containing the above substance as an active ingredient containing the above substance as an active ingredient.
  • the medicament of the present invention is preferably used for the prevention or treatment of a disease associated with abnormal TRAF3-mediated intracellular signal transduction.
  • a method for diagnosing a disease associated with an abnormality in TRAF3-mediated intracellular signal transduction which comprises measuring the level of the protein of the present invention in a biological component.
  • FIG. 1A shows the deduced amino acid sequence of T3BP
  • FIG. 1B shows the result of Northern blot analysis of T3BP mRNA.
  • FIG. 2A shows the results of analysis of the binding properties of GST fusion proteins (GST-clone 3, GST-clone 10) to TRAF 2 and TRAF 3 by GST pull-down assay.
  • FIG. 2B shows TRAF 2, TRAF 3, TRAF 5, and TRA of GST-T 3 BP.
  • Fig. 4 shows the results of analysis of the binding property to F6 by GST pull-down assay.
  • FIG. 2C shows the results of analysis of the interaction between TRAF 3 and T3 BP by immunoprecipitation assay.
  • 3A and 3B show the results of mapping the T3BP binding region in TRAF3.
  • FIG. 3C shows a schematic of the primary structure of mouse TRAF3.
  • FIG. 4A shows the results of in vitro assay analysis of the binding properties of GST-fused T3BP truncation mutants to TRAF3.
  • FIG. 4B shows the results of GST analysis of the binding properties of the GST-fused T3BP truncation mutant to TRAF3 by GST-Brudan assay.
  • FIG. 4C shows the primary structure of T 3 BP and its TRAF 3 binding region.
  • FIG. 5A shows morphological changes of cells due to expression of T3BP.
  • FIG. 5B shows the effect of T3BP expression on the cellular distribution of TRAF3.
  • FIG. 6A shows the increase in cellular Factin content by T3BP.
  • FIG. 6B shows the results of observing the cell distribution of Factin in cells expressing T3BP.
  • the present invention relates to a protein having any one of the following amino acid sequences, and a gene encoding the same. '
  • gene of the present invention include a gene having any one of the following nucleotide sequences.
  • ⁇ 1 to several '' in the above ⁇ amino acid sequence in which one to several amino acids are deleted, substituted, and Z or inserted in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 '' is not particularly limited, for example, It means 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 7, more preferably 1 to 5, particularly preferably about 1 to 3.
  • amino acid sequence having 60% or more homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 means that the amino acid sequence has at least 60% homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. % Or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more, and most preferably 98% or more.
  • ⁇ 1 to several '' in the above ⁇ base sequence in which one to several bases are deleted, added or substituted in the base sequence described in SEQ ID NO: 2 '' is not particularly limited, For example, 1 to 60, preferably 1 to 30, more preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and particularly preferably about 1 to 5.
  • base sequence that hybridizes under stringent conditions refers to a method in which DNA is used as a probe and colony hybridization is performed.
  • DNAs that hybridize under stringent conditions include DNAs having a certain degree of homology with the nucleotide sequence of the DNA used as the probe, for example, 70% or more, preferably 80% or more, and more. DNAs having a homology of preferably 90% or more, more preferably 93% or more, particularly preferably 95% or more, and most preferably 98% or more.
  • the above-mentioned "having a binding activity to TRA.F3” means that it can bind to TRAF3 with the same or higher affinity as the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and Refers to being able to participate in intracellular signaling mediated by TRAF 3.
  • the method for obtaining the gene of the present invention is not particularly limited.
  • Appropriate probes and primers are prepared based on the information on the nucleotide sequence and amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 in the sequence listing in this specification, and the cDNA library of mouse or the like is prepared using them.
  • a mouse-derived cDNA library is made from cells, organs or tissues expressing the gene of the present invention. Specific examples of cells expressing the gene include, but are not limited to, WE HI231 cells.
  • DNA having the base sequence described in SEQ ID NO: 2 can also be obtained by PCR. Using a mouse chromosomal DNA or cDNA library as type III, PCR is performed using a pair of primers designed to amplify the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the PCR reaction conditions can be set as appropriate, for example, a reaction consisting of 94 at 30 seconds (deformation), 55 ° C for 30 seconds to 1 minute (annealing), and 72 ° C for 2 minutes (extension). As one cycle of the process, for example, after performing 30 cycles, the reaction may be carried out at 72 ° C. for 7 minutes.
  • the amplified DNA fragment can be cloned into an appropriate vector that can be amplified in a host such as E. coli.
  • a gene having a nucleotide sequence encoding a protein can also be produced by any method known to those skilled in the art, such as chemical synthesis, genetic engineering, or mutagenesis. Specifically, a mutated DNA can be obtained by using a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 and introducing a mutation into these DNAs.
  • the method can be carried out using a method of bringing a DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 2 into contact with a drug as a mutagen, a method of irradiating ultraviolet rays, a genetic engineering technique, or the like.
  • Site-directed mutagenesis which is one of the genetic engineering techniques, is useful because it is a technique that can introduce a specific mutation at a specific position.
  • Molecular Cloning, 2nd edition, Powerent Protozores 'In' Molecular ⁇ Bio It can be performed according to the method described in Logi et al.
  • (C) a base sequence that hybridizes with the base sequence of SEQ ID NO: 2 under stringent conditions and that encodes a protein having a binding activity to TRAF3 as described above in the present specification; As described above, it can be obtained by performing a colony hybridization method, a plaque hybridization method, a Southern blot hybridization method, or the like under a certain hybridization condition.
  • the method for obtaining and producing the protein of the present invention is not particularly limited, and may be any of a naturally-derived protein, a chemically synthesized protein, and a recombinant protein produced by a gene recombination technique. Recombinant proteins are preferred in that they can be produced in large quantities with relatively easy operation.
  • the protein When a naturally-occurring protein is obtained, the protein can be isolated from cells or tissues expressing the protein by appropriately combining isolation and purification methods.
  • the protein of the present invention can be synthesized according to a chemical synthesis method such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method). it can.
  • various commercially available peptide synthesizers for example, Kuwawa Trading Co., Ltd. (U.S.A.)), Parkin Elmer Javan (U.S.A., Perkin-Elmer), Pharmacia Biotech Co., Ltd.
  • the protein of the present invention as a recombinant protein, a DNA having a nucleotide sequence encoding the protein (for example, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2) or a mutant or homologue thereof is obtained and preferably used.
  • the protein of the present invention can be produced. Expression vectors and transformation See later in this specification for the production of the body and the production of the recombinant protein using it.
  • a protein having an amino acid sequence in which one to several amino acids have been deleted, substituted or inserted in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, or 60% or more of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 A protein having an amino acid sequence having homology to a person skilled in the art based on information on the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 2 which is an example of a DNA sequence encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 It can be manufactured or obtained as appropriate.
  • the DNA can be isolated from a mouse or an organism other than a mouse as a DNA probe having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or a part thereof by screening the homologue of the DNA under appropriate conditions.
  • the corresponding cDNA sequence can be obtained from a homology search of the DNA sequence database and prepared by PCR or the like. After cloning the full-length DNA of this homolog DNA, incorporating it into an expression vector and expressing it in an appropriate host, a protein encoded by the homolog DNA can be produced.
  • the gene of the present invention can be incorporated into an appropriate vector and used as a recombinant vector.
  • the type of vector may be an expression vector or a non-expression vector, and can be selected according to the purpose.
  • any phage vector, plasmid vector, etc. can be used.
  • ZAP Express [Stratagene, Strategies, 5, 58 (1992)
  • pBluescript II SK (+) [Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)]
  • Lambda ZAP II (Stratagene), IgtlO, gtll CDNA Cloning, A Practical Approach, 1, 49 ( 1985)
  • ⁇ TriplEx (Clontech), ⁇ ExCell (Pharmacia), pT7T318U (Pharmacia), pcD2 [Mol. Cen.
  • the expression vector those which can replicate autonomously in the host cell or can be integrated into the chromosome of the host cell are preferably used.
  • those containing a promoter at a position where the gene of the present invention can be expressed are used.
  • an expression vector for expressing the gene of the present invention is capable of autonomous replication in the bacterium, and comprises a promoter, a ribosome binding sequence, the above DNA and a transcription termination sequence. It is preferable that the vector be a recombinant vector. A gene that controls the promoter may be included.
  • expression vectors for bacteria include, for example, pBTrP2, pBTacl, pBTac2 (commercially available from Ringerman Ringermanheim), pKK233-2 (Pharmacia), pSE280 (Invitrogen), pGEMEX-KPromega ), PQE-8 (QIAGEN), pQE-30 (QIAGEN), pKYP10 (JP-A-58-110600), ⁇ 200
  • bacterial promoters include, for example, promoters derived from Escherichia coli and phage, such as trp promoter (P trp), lac promoter (Plac), PL promoter, PR promoter, PSE promoter, SP01 promoter, and SP02 promoter. And a penP promoter.
  • yeast expression vectors for yeast include YEpl3 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), Ycp50 (ATCC37419), pHS19, and pHS15.
  • promoters for yeast include PH05 promoter, PGK Promoter, GAP promoter, ADH promoter, gall promoter, gallO promoter, heat shock tanker. Promoters, such as protein promoter, MF QJI promoter and CUP1 promoter.
  • Examples of expression vectors for animal cells include, for example, pcDNAI, pcDM8 (commercially available from Funakoshi), pAGE107 (Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 3-22979; Cytotechnology, 3, 133, (1990)), pAS3-3 (Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2-227075), pCDM8 [Nature, 329, 840, (1987)], pcDNAI / AmP (Invitrogen), REP4 (Invitrogen), AGE103 [J. Blochem., 101, 1307 (1987)], pAGE210, etc. Can be.
  • promoters for animal cells include, for example, the promoter of the immediate early (IE) gene of cytomegalovirus (human CMV), the early promoter of SV40, the promoter of retrovirus / less, the promoter of metallothionein, and the heat promoter. Shock promoter, SRa promoter and the like can be mentioned.
  • Examples of expression vectors for plant cells include pIG121-Hm [Plant Cell Report, 15, 809-814 (1995)], pBI121 CEMBO J. 6, 3901-3907 (1987)] and the like.
  • Examples of promoters for plant cells include the cauliflower mosaic virus 35S promoter CMol.Gen.Genet (1990) 220, 389-392], the rubrose bisphosphite force / repoxylase sumonoresable unit promoter, and the like. be able to.
  • a transformant having a gene encoding a protein having a binding activity to TRAF3 of the present invention can be prepared by introducing the above-described recombinant vector (preferably an expression vector) into a host.
  • bacterial host cells include the genera Escherichia, Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Microbacterium, Serratia, Pseudomonas, Agrobacterium, Alicyclobacillus, Anabaena>, Anacystis, Arthrobacter fe, Azobacter Genus, Erwinia, Methylobacterium, Phormidium, Rhodobacter, Rhodopseudomonas, Rhodospirillum Microorganisms belonging to the genus, Scenedesmun, Streptomyces, Synnecoccus, Zymomonas and the like can be mentioned.
  • Methods for introducing a recombinant vector into a bacterial host include, for example, a method using calcium ions and a protoplast method.
  • yeast hosts include Saccharomyces cerevisae, Schizosaccharomyces pombe, Cryveromyces lactis, Luyveromyces lactis, and Trichosporon pullus. Norevis (Schwanniomyces alluvius) and the like. Examples of a method for introducing a recombinant vector into a yeast host include an electoral poration method, a spheroblast method, and a lithium acetate method.
  • Animal cell hosts include Namalba cells, COS1 cells, COS7 cells, CHO cells and the like.
  • a method for introducing the recombinant vector into animal cells for example, an electroporation method, a caneol phosphate method, a lipofection method and the like can be used.
  • a recombinant gene transfer vector and a baculovirus are co-transfected into the insect cell to obtain a recombinant virus in an insect cell culture supernatant.
  • an autographa californica nuclear polyhedrosis virus which is a virus that infects the insects of the family Spodoptera
  • Insect cells include Spodoptera frugiperda ovary cells, Sf9 and Sf21 [Baculoinoles. Expression 'Vectors, A' Laboratory Manual, Double H 'Freeman' and 'Company (WH Freeman and Company) s New York (New York), (1992)], H i F ive (Invitrogen ovarian cells of Trichoplusia ni) and the like can be used.
  • Examples of a method of co-introducing a recombinant gene introduction vector and the above baculovirus into insect cells for preparing a recombinant virus include a calcium phosphate method and a lipofection method.
  • the transformant having the gene of the present invention produced as described above is cultured, the protein of the present invention is produced and accumulated in a culture, and the protein of the present invention is collected from the culture.
  • the recombinant protein can be isolated.
  • the culture medium for culturing these microorganisms contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like which can be utilized by the microorganism.
  • a natural medium or a synthetic medium may be used as long as the medium can efficiently culture the transformant.
  • the cultivation is preferably performed under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture, and the culture temperature is usually 15 to 40, and the culture time is usually 16 hours to 7 days.
  • the pH is maintained between 3.0 and 9.0. The pH is adjusted using inorganic or organic acids, alkaline solutions, urea, calcium carbonate, ammonia and the like. If necessary, an antibiotic such as ampicillin or tetracycline may be added to the medium during the culture.
  • a medium for culturing a transformant obtained using animal cells as host cells As a medium for culturing a transformant obtained using animal cells as host cells, a commonly used RPM11640 medium [The Journal of the American Medical Associati. n, 199,519 (1967)), Eagle's MEM medium [Science, 122,501 (1952)], DMEM medium [Virology, 8, 396 (1959)], 199 medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)] or a medium obtained by adding fetal bovine serum or the like to such a medium. Culture is carried out usually pH6 ⁇ 8, 30 ⁇ 40 ° C, 5% C0 2 present 1 to 7 days in conditions under such lower. If necessary, antibiotics such as kanamycin and penicillin may be added to the medium during the culture.
  • a medium usually used according to the plant species such as an MS medium or an R 2 P medium, is used. Cultivation is usually performed for 1 to 21 days under conditions of pH 6 to 8 and 15 to 35 ° C. If necessary, antibiotics such as kanamycin and hygromycin may be added to the medium during the culture.
  • the cells when the protein of the present invention is expressed in a lysed state in cells, the cells are recovered by centrifugation after cell culture, suspended in an aqueous buffer, and then sonicated with a crusher, french press, and Mentongaulin homogenizer. The cells are disrupted using a Dynomill or the like to obtain a cell-free extract.
  • a normal protein isolation and purification method that is, a solvent extraction method, a salting out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent, Anion-exchange chromatography using resin such as getylaminoethyl (DEAE) Sepharose, DIAION HPA-75 (manufactured by Mitsubishi Kasei), and cation using resin such as S-Sepharose FF (manufactured by Pharmacia) Exchange chromatography, hydrophobic chromatography using resins such as ptinoresepharose, feninoresepharose, gel filtration using molecular sieve, ab init chromatography, chromatofocusing, isoelectric focusing, etc.
  • a purified sample can be obtained using a technique such as electrophoresis alone or in combination.
  • the cells are similarly recovered, crushed, and the protein is recovered by a usual method from the precipitate fraction obtained by centrifugation. Thereafter, the insoluble form of the protein is solubilized with a protein denaturant. After diluting or dialyzing the lysate into a solution that does not contain a protein denaturant or is diluted to such an extent that the protein denaturant does not denature the protein, and after forming the protein into a normal three-dimensional structure, A purified sample can be obtained by the same isolation and purification method. (5) an antibody that recognizes the protein of the present invention
  • the TRAF3-binding protein Since the TRAF3-binding protein has been identified by the present invention, an antibody that recognizes the protein can be produced. Production of such an antibody is useful in studies such as elucidation of the kinetics of the protein or TRAF3.
  • the antibody of the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and can be produced by a conventional method.
  • a polyclonal antibody that recognizes the protein of the present invention is obtained by immunizing a mammal with the protein of the present invention as an antigen, collecting blood from the mammal, and separating and purifying the antibody from the collected blood.
  • the antigen may be administered, for example, two to three times at intervals of 7 to 30 days.
  • the dose can be, for example, about 0.05 to 2 mg per antigen.
  • the route of administration is not particularly limited, and can be appropriately selected from subcutaneous administration, intradermal administration, intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, etc., but by injection intravenously, intraperitoneally or subcutaneously. Preferably, it is administered.
  • the antigen can be used after being dissolved in an appropriate buffer, for example, an appropriate buffer containing a commonly used adjuvant such as complete Freund's adjuvant or aluminum hydroxide. Depending on the administration route and conditions, the antigen can be used. May not be used.
  • the serum of the mammal is sampled, and the antibody titer is measured.
  • booster immunization is performed using, for example, 100; ig to 100 ⁇ g of the antigen.
  • blood is collected from the immunized mammal, and the blood is subjected to, for example, centrifugation, precipitation using ammonium sulfate or polyethylene glycol, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography.
  • Polyclonal antiserum can be separated and purified by standard methods such as chromatography, affinity chromatography, etc. As a result, a polyclonal antibody that recognizes the protein of the present invention can be obtained.
  • the serum may be inactivated by, for example, treating the serum at 56 ° C. for 30 minutes.
  • the globulin type of the monoclonal antibody that recognizes the protein of the present invention is not particularly limited, and examples include IgG, IgM, IgA, IgE, and IgD.
  • the cell line that produces the monoclonal antibody of the present invention is not particularly limited.
  • the cell line can be obtained as a hybridoma by cell fusion between an antibody-producing cell and a Myeoma cell line.
  • the hybridoma producing the monoclonal antibody of the present invention can be obtained by the following cell fusion method.
  • spleen cells As antibody-producing cells, spleen cells, lymph node cells, B lymphocytes and the like from immunized animals are used.
  • the protein of the present invention or its partial peptide is used as the antigen.
  • Mice, rats, etc. can be used as immunized animals, and administration of the antigen to these animals is performed by a conventional method.
  • a suspension or emulsion of an adjuvant such as complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant and the protein of the present invention as an antigen is administered several times to the vein, subcutaneous, intradermal, intraperitoneal, etc. of an animal. Immunize the animal.
  • a spleen cell is obtained as an antibody-producing cell from the immunized animal, and this is fused with a myeloma cell by a known method (G. Kohler et al., Nature, 256 495 (1975)) to produce a hybridoma. can do.
  • myeloma cell lines used for cell fusion include P3X63Ag8, P3U1 strain, and Sp2Z0 strain in mice.
  • Cell fusion is performed using a fusion accelerator such as polyethylene glycol or Sendai virus.Hypoxoma after cell fusion is selected using hypoxanthine 'aminopterin' thymidine (HAT) medium according to standard methods. I do.
  • Hybridomas obtained by cell fusion are cloned by Langkai dilution method or the like.
  • a cell line that produces a monoclonal antibody that specifically recognizes the protein of the present invention can be obtained by performing screening by an enzyme immunoassay using the protein of the present invention.
  • the hybridoma is cultured by a conventional cell culture method or ascites formation method, and the monoclonal antibody is purified from the culture supernatant or ascites.
  • Purification of the monoclonal antibody from the culture supernatant or ascites can be performed by a conventional method. For example, ammonium sulfate fractionation, gel filtration, ion exchange chromatography, affinity chromatography and the like can be used in an appropriate combination.
  • Methods for immunoassaying the TRAF3-binding protein of the present invention using the monoclonal antibody of the present invention include, for example, enzyme immunoassay, radioimmunoassay, fluorescence immunoassay, and luminescence immunoassay. be able to.
  • Antibody fragments include F (ab ') 2 fragments, Fab' fragments and the like.
  • labeled antibodies of the above-mentioned antibodies are also within the scope of the present invention. That is, the antibody of the present invention prepared as described above can be labeled and used.
  • the types of antibody labeling and labeling methods are known to those skilled in the art.
  • enzyme labels such as horseradish peroxidase or alkaline phosphatase
  • fluorescent labels such as FITC (fluorescein isothiocyanate) or TRITC (tetramethylrhodamine B isothiosinate)
  • colloidal metals and colored latex
  • labeling with a coloring substance such as, affinity labeling such as biotin, and isotope labeling such as 125I .
  • Analysis using the labeled antibody of the present invention such as an enzyme antibody method, an immunohistochemical staining method, an immunoblot method, a direct fluorescent antibody method or an indirect fluorescent antibody method, can be performed by methods well known to those skilled in the art.
  • the present invention further relates to a method of screening for a substance that promotes or suppresses the function of the protein or antibody using the TRAF3-binding protein of the present invention or an antibody thereof.
  • a substance that promotes or suppresses intracellular signal transduction via TRAF 3 is selected.
  • Such a screening system can be constructed, for example, as follows. An expression vector having the gene of the present invention is constructed, and this expression vector is introduced into an appropriate host expressing TRAF3. In the resulting transformant, both TRAF 3 and the protein of the present invention are expressed, and intracellular signal transduction proceeds through the interaction of both in the presence of an appropriate ligand.
  • test substance can be added to the screening system constructed as described above. If the progress of intracellular signal transduction is inhibited when a test substance is added, the test substance is a substance that inhibits the interaction between the protein of the present invention and TRAF 3 (that is, the TRAF 3 binding protein of the present invention). (A substance that suppresses the function of). Conversely, if intracellular signal transduction is activated when a test substance is added, the test substance is a substance that activates the interaction between the protein of the present invention and TRAF3 (the TRAF3-binding substance of the present invention). (A substance that promotes the function of a protein).
  • test substance any substance can be used, and its type is not particularly limited.
  • specific examples of the test substance may be a low-molecular-weight synthetic compound, a natural product extract, or a compound library, a phage display library, or a combinatorial library. Construction of compound libraries is known to those skilled in the art, and commercially available compound libraries can also be used.
  • the TNF ligand family is known as one of the most versatile cytokines that induces a number of cellular responses, including cytotoxicity, antiviral activity, immunomodulatory activity, and transcriptional regulation of several genes.
  • the response of cells to TNF ligands involves not only normal physiological responses, but also enhanced apoptosis or inhibition of apoptosis.
  • Abnormal apoptosis regulation has many etiologies.
  • Diseases associated with cell proliferation or inhibition of apoptosis include cancer, autoimmune diseases, and viral Diseases associated with enhanced apoptosis include AIDS, neurodegenerative disease, myelodysplastic syndrome, ischemic disease, including infection, inflammation, graft-versus-host disease, acute graft rejection, and chronic graft rejection.
  • the TRAF 3 binding protein of the present invention does not belong to the TNF receptor superfamily, it binds to TRAF 3 and thus is involved in chronic and acute inflammation involving the TNF receptor Z ligand superfamily, arthritis, sepsis, and autoimmunity. disease
  • the substance that promotes or suppresses the function of the TRAF3-binding protein of the present invention obtained by the above-mentioned screening method is useful as a medicament for treating and / or preventing such diseases.
  • the present invention also relates to a medicament containing, as an active ingredient, a substance that promotes or suppresses the function of the TRAF3-binding protein of the present invention obtained by the above-described screening method.
  • the medicament of the present invention can be used, for example, for preventing or treating a disease associated with abnormal intracellular signal transduction via TRAF3.
  • the medicament of the present invention generally contains, as an active ingredient, a substance that promotes or suppresses the function of the TRAF3-binding protein of the present invention, and further contains a pharmaceutical additive (eg, a carrier, an excipient, etc.) ) Is provided in the form of a pharmaceutical composition comprising:
  • the route of administration of the medicament of the present invention is not particularly limited, and may be oral administration or parenteral administration (for example, intramuscular administration, intravenous administration, subcutaneous administration, intraperitoneal administration, mucosal administration to the nasal cavity, etc., or inhalation administration). Either may be used.
  • parenteral administration for example, intramuscular administration, intravenous administration, subcutaneous administration, intraperitoneal administration, mucosal administration to the nasal cavity, etc., or inhalation administration. Either may be used.
  • the form of the medicament of the present invention is not particularly limited, and examples of preparations for oral administration include tablets, capsules, fine granules, powders, granules, solutions, syrups, and the like.
  • Formulations for parenteral administration include, for example, injections, drops, suppositories, inhalants, transmucosal absorbers, transdermal absorbers, nasal drops, ear drops, and the like.
  • the dose of the medicament of the present invention can be appropriately selected in consideration of the gender, age or weight of the patient, the severity of symptoms, the administration purpose such as prevention or treatment, or the presence or absence of other complications.
  • the dosage is generally between 0.000 lg / kg body weight Z days and 1 000 ⁇ g / kg body weight Z days, preferably between 0.001 g / kg body weight / day and 100 ug / kg body weight / day. It is.
  • a method for diagnosing a disease by measuring the level of the protein of the present invention further comprises measuring the level of the protein of the present invention in a biological component, and further comprises intracellular signal transduction via TRAF3.
  • the present invention relates to a method for diagnosing a disease associated with abnormalities of the body.
  • the protein of the present invention may be involved in various diseases related to apoptosis enhancement or apoptosis inhibition. Therefore, by measuring the activity or the amount of the protein of the present invention in a living body, it becomes possible to diagnose a disease related to abnormal TRAF3-mediated intracellular signal transduction.
  • the level of the protein of the present invention can be measured according to a conventional method known to those skilled in the art. For example, the level of the protein of the present invention may be measured by an immunological method using an antibody that recognizes the protein of the present invention. May be performed by measuring the amount of nRNA.
  • A- 1 Screening of protein-protein interaction using yeast DNA encoding full-length TRAF 3 was used as a bait in the CytoTrap® two-hybrid system (Stratagene, La Jolla. CA).
  • the yeast cdc 2511 strain (a temperature-sensitive mutant of the dc25 gene) used in this system has the following genotypes: MAT aura 3, lys 2, leu 2, trpl, his 200, adel 01, cdc 25—2, GAL +.
  • a library of hybrid proteins of the myristylation signal sequence and cDNA fragments from WE HI 231 cells was constructed in plasmid pMry. Screening was performed without modification as recommended by the manufacturer.
  • yeast strain was grown at 25 ° C in YPAD medium or Burkholder's minimal medium (BMM) supplemented with appropriate additives [Sato, T., et al., (1995) FEBS Lett. 358, 113-118] and by the lithium acetate method.
  • the yeast transformants were grown on BMMZ galactose plates at 25 ° C for 2 days, followed by growth at 37 ° C. Pick up colonies that grew at 37, which are thought to express a myristylated protein that interacts with TRAF 3, and grew at 37 ° C on BM MZ glucose plates and BMM / galactose plates. Tested.
  • a library plasmid (pMry incorporating cDNA) was isolated from a clone exhibiting galactose-dependent growth (expression of cDNA integrated into pMyr depends on galactose) at 37 ° C., and plasmid pS os " Cdc 25 H cells were re-transformed with pSosZ collagenase as TRAF 3 or as a negative control Sequence of a plasmid that suppresses the cdc 25H phenotype only in the presence of pSos / TRAF 3 DNA sequencing was performed on an Applied Biosystems automated DNA sequencer, ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Foster, CA) A-2 Northern Blot Hybridization
  • RNA prepared from mouse tissues (C 3H / He n C rj) by the acidic guanidine phenol chromatography method was separated on a 1% agarose gel containing formaldehyde, and Hybond (20 XS SC) was used.
  • Hybond (20 XS SC) was used.
  • Hybrida I See Chillon probe was prepared from the gel purified DNA fragments were radiolabeled with the random primed method with [shed one 32 P] d CT P (Amersham Pharmacia).
  • Blots were hybridized at 42 ° C in a solution containing 5X SSC, 5X Denhardt, 0.1% SDS, 50% deionized formamide, and 100 ⁇ g Zm1 salmon sperm DNA. I let it. After hybridization, the blot was incubated at room temperature with 2XSSC and 0.1% SDS, followed by 0.133 at 65 ° C. Washed with 0.1% SDS. The blot was dried and analyzed using BAS 2500 (Fuji Ltd., Tokyo. Japan).
  • T3BP T3BP expression construct
  • the appropriate region of mouse T3BP is amplified with PCR and utilizes the EcoRI and XhoI restriction sites to generate pcDNA 3.1 (-) myc his version B. (Invitrogen, Carlsbad, CA) to obtain pcDNA / T3BP.
  • T3BP was expressed as a C-terminally labeled MYC fusion protein.
  • the full-length coding region was amplified with PCR and pEGFP_N2 (Clontech, California, CA) using EcoRI and XhoI restriction sites. ) To obtain pEGFP / T3BP.
  • Mammalian expression vectors encoding FLAG-labeled mouse TRAF 2 and TRAF 3 were generated by a PCR-based method.
  • the human fetal kidney-derived 293 cells consisted of 10% pup serum (HyClone, Logan, UT), 100 OU / m1 penicillin and 100 ⁇ g / m1 streptomycin (GIBC0-BRL , Grand Island, NY) in Eagle's minimal essential medium. WEH I 2 3 1 Cells 1 0% fetal ⁇ Shi serum (HyClone), 5. 5 X 1 0 5 M 2-mercapto Toetanonore, 1 0 0U / m 1 penicillin and 1 0 0 g / m 1 scan Maintained in RPM 1 -164 medium containing treptomycin (GIBC0-BRL).
  • the cells were seeded in 10 cm culture dishes at a concentration of 10 6 cells / dish, and cultured 2-3 days. Subsequently, the cells were transfected using a standard calcium phosphate co-precipitation method using a commercial solution (Eppendorf-5 Prime, Inc., Boulder, CO).
  • the GST fusion protein was expressed in E. coli (BLR) using the pGEX vector (Amersham Pharmacia) after IPTG induction and purified on daltathione beads (Amersham Pharmacia).
  • FLAG-labeled TRAF 2, TRAF 3, TRAF 5, and TRAF 6 were expressed in 293 cells.
  • Cell lysates were prepared from transfection cells by using E1A buffer (50 raM HEPES [pH 7.6], 250 mM NaCl, 0.1% NP-40 and 5 mM EDTA) as lysing agent. The cell lysate was cleared and incubated with 2 ⁇ g of GST or GST fusion protein immobilized on daltathione beads.
  • the glutathione beads were thoroughly washed with E1A buffer. Samples were subjected to 10% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and transferred to PVDF membrane. After blocking, the membrane was treated with an anti-FLAG M2 antibody, and a 5,000-fold diluted horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody (Bio-Pharma) according to enhanced chemiluminescence protocol (ECL, Amersham Pharmacia). Rad) was used to detect immunoreactive proteins. TRAF 3 invitro transcription and translation and 35-S methionine labeling were detected by fluorography using the T7 link transcription and translation system (Amersham Pharmacia).
  • the cells were detached from the plate in PBS containing 5 mM EDTA, and washed three times using the same buffer.
  • the cells were lysed in 1 ml of E1A buffer at 4 ° C. for 10 minutes.
  • the cell lysate was centrifuged and the supernatant was used as a cell extract.
  • the cell extract was incubated with anti-FLAG M2 antibody, anti-MYC9E10 antibody or control antibody at 4 for 2 hours, followed by treatment with Protein G Sepharose FF (Amersham Pharmacia). Use these Sepharose beads as E Washed thoroughly with 1 A buffer. Samples were subjected to 10% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and immunoreactive proteins were detected using anti-FLAG M2 or anti-MYC9E10 antibodies as described above.
  • HEK293 cells cultured on cover slips were transfected with various constructs. After 24 hours, the cells were fixed in PBS containing 3.7% formalin for 10 minutes at room temperature. Cells were washed three times with PBS and treated with 0.2% Triton X-100 in PBS for 5 minutes at room temperature. After blocking with skim milk, it is combined with various primary antibodies such as anti-FLAG M2 monoclonal antibody or anti-MYC 9E10 antibody (Sigma), and then with Cy5 binding secondary antibody (Jackson ImmunoReseach Laboratories, Inc.). The cells were incubated together. Cells were washed three times with PBS and mounted on glass slides.
  • the bound FITC-phalloidin was extracted with methanol for 1 hour on ice.
  • the fluorescence intensity was measured using a spectrometer F-3010 (Hitachi Ltd., Tokyo, Japan) at an excitation wavelength of 488 nm and an emission wavelength of 51 Onm. The results are compared to the control transfection And expressed as a relative fluorescence intensity calculated from the ratio of the fluorescence intensity of the cells.
  • the Saccharomyces cerevisiae cdc 25H strain contains a temperature-sensitive point mutation in the cdc 25 gene, which inhibits host growth at 37 ° C, but has a permissive temperature (25 ° C). C) is normal.
  • the cdc25 gene encodes a guanyl nucleotide converting factor that binds to RAS and activates cells to induce cell growth.
  • the system used in this example utilizes the ability of human S os to complement the cdc 25 defect and activate the yeast RAS signaling pathway; hS os fusion protein (h S os -TRAF 3 ) Is expressed and localized to the plasma membrane via protein-protein interaction, the cdc 25H strain also grows at 37.
  • Yeast containing plasmid pSos / TRAF3 was transformed using a WEHI I 231 cell cDNA expression library that was localized to the plasma membrane by fusing to the myristylation signal. Approximately 2 ⁇ 10 5 transformants were grown on BMM / galactose plates at 25 ° C. for 2 days and then transferred to a 37 ° C. incubator.
  • Colonies that grew at 37 ° C were picked and tested for growth on BMMZ glucose and BMMZ galactose plates at 37 ° C.
  • Library plasmids were isolated from clones that exhibited galactose-dependent growth at 37 ° C and retransformed into cdc 25H cells using pSos / TRAF3 or pSos / collagenase as a negative control.
  • Nine cDNAs were obtained that suppressed the cdc 25H phenotype only in the presence of pSos / TRAF3.
  • clone 3 coded for part of the novel protein.
  • FIG. 1A shows the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence of full-length T3BP cDNA. The sequence encoded by clone 3 is underlined. Shaded boxes indicate putative transmembrane domains.
  • T3 BP cDNA identified a sequence reported as a flanking proviral sequence acquired by somatic cells in mouse leukemia and lymphoma (AF 193161). It turned out to include.
  • human B cell maturation factor (BCMA) had significant sequence similarity to T3BP, with 28% identity and 42% similarity to T3BP.
  • Hydropathy plots generated using the Tmpread program suggested that T3BP had a putative transmembrane region (amino acids 77-97).
  • PROS ITE analysis identified an N-glycosylation site (amino acids 23-26) and an N-myristoylation site (amino acids 81-86).
  • PSORT analysis suggested that this protein had a type I membrane protein conformation and was located at the plasma membrane.
  • T3BP The expression pattern of T3BP was examined by Northern blot hybridization using WEH I 231 cells of six kinds of tissues. The results are shown in FIG. 1B.
  • the blot was hybridized with a 200 b T3BPc DNA probe. The position of the ribosome RNA is shown on the left.
  • the T3BP gene showed about 2 kb mRNA in WEH I 231 cells. However, T3BP mRNA was not detected in the other mouse tissues tested.
  • clones 3 and 10 were expressed as GST fusion proteins and tested for binding to TRAF 2 or TRAF 3 in a GST pull-down assay.
  • Cell lysates of 293 cells overexpressing FLAG-labeled TRAF 2 or TRAF 3 were incubated with GST-clone 3, GST-clone 10, or GST alone, and the TRAF bound to the GST fusion protein was converted to daltathione-sepharose. And settled.
  • the TRAF was separated by SDS-PAGE and detected by immunoblotting using an anti-FLAG M2 antibody.
  • the expression level of FLAG-tagged TRAF in the cell lysates was also monitored by ImNob titration with an anti-FLAG M2 antibody. The results are shown in FIG. 2A.
  • clone 3 binds preferentially to TRAF 3 over TRAF 2.
  • G'ST clone 10 interacts similarly with TRAF 2 and TRAF 3. Sequence analysis of clone 10 reveals that this clone contains the consensus sequence of the TRAF binding domain (PXQXT / S, amino acids 583-587), mnb protein kinase homolog mp86 (D yrk; MMU 58497, amino acids 284-763) Turned out to code part. However, clone 3 does not contain this sequence.
  • GST pull-down assay was performed in the same manner. As shown in Fig. 2B, GST-T3 BP (clone 3) bound the most strongly to TRAF 3 compared to other TRAFs.
  • TRAF 3 and T3BP were analyzed by co-immunoprecipitation assay in mammalian cells. The results are shown in FIG. 2C.
  • 293 cells were transiently transfected with an expression vector encoding MYC-labeled T3BP (full-length T3BP containing a C-terminal MYC peptide epitope) and FLAG-labeled TRAF3.
  • Cell extracts were prepared and immunoprecipitated (IP) using anti-MYC9E10 antibody, anti-FLAG M2 antibody (anti-FLAG monoclonal antibody), or control mouse IgG.
  • Coprecipitate FLAG—TRAF 3 or MYC—T 3 BP Detection was performed by immunoblotting analysis using anti-FLAG M2 antibody (top of FIG. 2C) or anti-MYC 9E10 antibody (bottom of FIG. 2C), respectively.
  • the expression levels of T3BP and TRAF3 in the cell lysates were also measured by immunoblotting using anti-MYC 9E10 or anti-FLAG M2 antibodies, respectively.
  • FIG. 2C shows the location of T3BP and TRAF3. The positions of the heavy and light chains of Ig are also shown.
  • the anti-MYC antibody shows multiple bands (35-50 kDa) larger than those predicted from the amino acid sequence in lysates of transfected cells with the MYC-labeled T3BP expression plasmid.
  • T3BP precipitated by FLAG-labeled TRAF3 is detected at a position of about 40 kDa (figure below).
  • TRAF3 precipitated by MYC-labeled T3BP is detected at a position of about 64 kDa. (Upper figure).
  • FIG. 3C shows a schematic of the primary structure of mouse TRAF3.
  • T3BP T3BP binding protein
  • various truncation mutants of T3BP were expressed in Escherichia coli as GST fusion proteins and jinvitro-transcribed 'translated, 35S-methionine-labeled TRAF3.
  • T3BP bound to the GST fusion protein was precipitated with daltathione sepharose, separated by SDS-PAGE and detected by fluorography.
  • FIG. 4A it was found that the C-terminal portion including the 151st and subsequent amino acids of T3BP was required for interaction with TRAF3.
  • FIG. 4C shows the primary structure of T 3 BP and its TRAF 3 binding region (TM is transmembrane region).
  • T3BP To examine the function of T3BP, its organelle localization was examined by fluorescence microscopy.
  • the 293 cells cultured on the cover glass were temporarily transfected with pEGFP-N2 (control plasmid; left) or PEGFP / T3BP (£ 0? Labeled 3: 6? Expression plasmid; right). . After 24 hours, cells were fixed in 3.7% formalin.
  • the fluorescence of EGFP was imaged using a confocal laser single-scanning microscope. The results are shown in FIG. 5A. As shown in FIG. 5A, the expression of EGFP-labeled T3BP induced a morphological change.
  • FIG. 5B-b FLAG-labeled TRAF3 was visualized around the nucleus in cells co-expressing EGFP and FLAG-labeled TRAF3 (FIG. 5B-b).
  • FLAG-labeled TRAF3 was observed on the cell surface and spike where EGFP-labeled T3BP was localized (Fig. 5B—e).
  • FIG. 6B To confirm that T3BP increases cellular Factin content, the cellular distribution of Factin in cells expressing MYC-labeled T3BP was observed (FIG. 6B). Specifically, 293 cells cultured on a cover glass were transformed into pEGFP-N2 and pcDNA (Fig. 6B-a), or pEGFP-N2 and pcDNA / MYC-T3BP (Fig. 6B-b). ). After 24 hours, cells were fixed in 3.7% formalin and treated with 0.2% TritonX-100. After blocking, cells were stained with Rhodamine-Phalloidin. The fluorescence from EGFP (green) and the fluorescence from rhodamine (red) were imaged using a confocal laser single-scanning microscope. The bar is 50m.
  • MYC-labeled T3BP expression caused a change in cell shape, and the spikes induced by T3BP were stained with rhodamine-monophaloidin.
  • T3BP TRAF3-binding protein
  • MIP-T3 is identified as a TRAF3-specific TRAF-binding protein, and TRAF3 binds to microtubules by binding MIP-T3 to microtubules and collecting TRAF3 into microtubules (Ling , L., other, (2000) J. Biol. Chem . 275, 23852-23860) 0 nucleoporins also T RAF 3 It was identified as a specific TRAF binding protein (Gamper, C., et al., (2000) Mol. Immunol.
  • TRAF-binding proteins specific to a single factor in the TRAF family is likely to involve excessive or specific TRAFs, especially in the signaling cascade, and the diversity of the roles of individual TRAF proteins Important from the point of view.
  • T3BP has significant sequence similarity to human B CMA belonging to TNFR superfamily as the 17th factor [Madry C., et al., (2000) Int. Immunol. 10, 1693 1702] .
  • T3BP expression was restricted to specific stages of the B cell lineage, as in the case of B CMA [Laabi, Y., et al. (1992) EMBO J. 11, 3897-3904; Laabi, Y., et al. (1994) Nucleic Acid Res. 22, 1147-1154], and may be distributed on the cell surface (Fig. 1B and Fig. 5B).
  • T3BP tumor necrosis factor receptor
  • the novel TRAF 3 binding protein revealed by the present invention is a recently reported specific receptor for BAFF [B cell activation factor from the TNF family (BAFF)] [Thompson, JS, et al., (2001) Science 293, 2108-2111].
  • BAFF B cell activation factor from the TNF family (BAFF)]
  • Thompson, JS et al., (2001) Science 293, 2108-2111.
  • BAFF B cell activation factor from the TNF family (BAFF)]
  • BAFF B cell activation factor from the TNF family
  • mice expressing BAFF at high levels express mature B cell hyperplasia and whole body.
  • Symptoms of systemic lupus erythematosus suggest that it is related to autoimmune diseases by the proliferation of autoreactive B cells [Mackay, F., et al., (1999) J. Exp. Med.
  • TRAF 3 has an important function in the intracellular signal transduction system of 8-cell proliferation via 8.
  • Therapeutic agents for autoimmune diseases that not only regulate the interaction between BAFF and TRAF3-binding B-cell-specific receptor but also regulate the interaction between TRAF3-binding B-cell-specific receptor and TRAF3 The development of is expected.
  • a novel signaling molecule that binds to TRAF3 has been identified.
  • a gene encoding a signal transduction molecule that binds to TRAF 3 was cloned.

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Description

明 細 書
TRAF 3結合性 B細胞特異受容体 技術分野
本発明は、 B細胞特異的受容体の一員である新規な TRAF 3結合性タンパク 質に関する。 本発明はまた、 該タンパク質をコードする遺伝子、 該遺伝子を有す るベクター、 該遺伝子を有する形質転換体、 該タンパク質を認識する抗体、 該タ ンパク質を利用した医薬のスクリ一ユング法、 並びに該タンパク質を利用した診 断方法に関する。 背景技術
生物学的作用はある刺激に対する反応によって制御されている。 即ち、 多くの サイト力インは受容体に結合し、 細胞内反応を引き起こす。 例えば、 腫瘍壊死因 子 （TNF) は、 TNF受容体を経て作用し、 感染およびショックの誘導および 炎症性疾患に対する保護などの生物学的過程を調節する。 TNFは TNF—リガ ンドスーパーフアミリーに属し、 そのリガンドである TNF受容体スーパーファ ミリ一とともに作用する。 リガンドとしては、 TNF— α、 リンホトキシン （L Τ) — o;、 LT— /3、 F a sし、 CD 40 L, CD 27 L, CD 30 L, OX4 O Lおよび神経栄養因子 （NGF) などが知られている。 TNF受容体スーパー ファミリ一としては、 P 55TNF受容体、 p 75TNF受容体、 TNF受容体 関連因子、 F a s抗原、 CD40、 CD27、 CD30、 0X40、 低親和性 p 75および NGF受容体などが知られている。 数種の TNF受容体フアミリ一の 機能はすでに解明されており、 例えば、 F a s抗原や低親和性 NGF受容体とそ れらのリガンドは、 プログラムされた細胞死に関係し、 CD40リガンドは T細 胞依存性 B細胞活性化に関与する。
生理学的過程の一つであるプログラムされた細胞死は正常な発育および多細胞 生物の恒常性にとって必須であり、 アポトーシスの混乱は癌、 神経変性疾患、 お よび後天性免疫不全症候群（A I DS)を含むヒトの疾患の病因に関与している。 F a sの活性化はデスドメイン含有アダプター分子である FAD D/MORT 1 が F a sの細胞内ドメインに結合し、 これが次にプロアポトーシスプロテアーゼ であるカスペース 8を活性化し、 最終的にアポトーシスを実行する。 一方、 TN FR- 1は主に NF— κ Bを活性化することにより一連の広範な生物学的活性の シグナルを伝達する。 TNFR— 1はデスドメインを含む TRADDと TNFR _ 1の細胞内ドメインで結合し、 FADD、 TRAF 2、 および R I Pなど多数 のシグナル伝達分子との会合を通じて、 アポトーシスと NF— κ B活性化との両 方のシグナルを伝達する。 このように TNFフアミリーリガンドと TNFフアミ リー受容体の作用は多様であり、 多くの生物学的プロセスに影響を与えるため、 これらの受容体、 リガンドぉょぴそれらに関するシグナル伝達分子を同定して解 析することは疾患の治療法を確立する上で重要である。
TNF受容体関連因子 （TRAF) は、 TNF受容体スーパーファミリーの下 流シグナル伝達因子として最初に発見されたタンパク質ファミリーである
[Rothe,M.他、 (1994) Cell 78, 681 - 692; Hu, H.M. ,他、 (1994) J. Biol. Chem. 269, 30069- 30072;及ぴ Cheng, G.，他、 (1995) Science 267, 1494-1498]。 現在までに、 TRAFファミリ一としては 6種の因子が同定されている [Rothe,M.他、 （1994) Cell 78, 681-692； Hu, Η·Μ.，他、 (1994) J. Biol. Chem. 269, 30069-30072； Cheng, G.，他、 (1995) Science 267, 1494-1498; Cao, Z. ,他、 (1996) Nature (London) 383， 443-446； Mosialos, G.，他、 (1995) Cell 80, 389-399； Sato, T.，他、 (1995) FEBS Lett. 358， 113-118； Regnier, C. H. ,他、 (1995) J. Biol. Chem. 270, 25715-25721; Ishida, T. K. , 他、 (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 9437-9442； Nakano, H. , 他、 （1996) J. Biol. Chem. 271, 14661- 14664;及ぴ Ishida, Τ.Κ·， 他、 （1996) J. Biol. Chem. 271， 28745-28748]。 TRAF 1—6は何れも、 コイルドコイルの TRAF-Nドメインを有し、 C末端の TRAF— Cドメインが保存されている。
[Cao, Z.，他、 (1996) Nature (London) 383, 443 - 446]。 TRAF— Cドメイン は、 TRAFタンパク質間の相互作用、 ならびに該タンパク質と TNFRスーパ 一ファミリーの因子との結合を仲介する [Cheng, G.，他、 （1995) Science 267, 1494-1498； Takeuchi, M. , 他、 （1996) J. Biol. Chem. 271, 19935- 19942;及ぴ Hsu, H. , 他、 （1996) Cell 84, 299-308]。
TRAF 3は、 B細胞表面マーカーである CD 40およぴェプスタイン一バー ゥィルス潜在性膜タンパク質である L M P— 1の細胞質ドメインに結合した分子 として最初に同定された [Mosialos, G.，他、 (1995) Cell 80， 389-399; Sato, T. , 他、 (1995) FEBS Lett. 358, 113 - 118; Hu, H.M.，他、 (1994) J. Biol. Chem. 269, 30069-30072； 及ぴ Cheng, G.， 他、 （1995) Science 267, 1494-1498]。 また、 T RAF 3は、 リンフォトキシン 受容体などの TNFRフアミリーの他の因子の 細胞質末端部分と相互作用することが示された [Force, W. R. , 他、 （1997) J. Biol. Chem. 272, 30835-30840]。 TRAF 3を含む TRAFファミリータンパ ク質は、 触媒活性を欠損すると思われる細胞質タンパク質であり、 一般にァダプ タータンパク質として働くと考えられている。 これに関連して、 TRAF 3は N I K：、 A S Kおよび T A N Kなどの他のシグナル伝達分子と相互作用することが 判明している [Song, H.Y. , 他、 (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 9792-9796； Nishitoh, H. , 他、 (1995) Mol. Cell 2, 389-395;及ぴ Regnier, C. H,， 他、 (1997) Cell 90， 373- 383]。 しかしながら、 T R A F 3がシグナル伝達を仲介する機構は 完全には解明されていない。 発明の開示
本発明は、 TRAF 3に結合するシグナル伝達分子を同定することを解決すベ き課題とした。 本発明はまた、 T R A F 3に結合するシグナル伝達分子をコード する遺伝子をクローユングし、 その遺伝子の構造と機能を解明することを解決す べき課題とした。 本発明はさらに、 TRAF 3に結合するシグナル伝達分子をコ 一ドする遺伝子を利用して新規な医薬または診断方法を提供することを解決すベ き課題とした。 本発明者らは上記課題を解決するナこめに、 酵母を用いてタンパク質一タンパク 質相互作用のスクリーニングを実施した。 このスクリーニングは、 ヒ ト由来 S o s (h S o s) 蛋白質を細胞膜にリクルートさせることによって酵母 RASシグ ナル伝達経路を活性化させ、 酵母 c d c 25遺伝子欠損を相補させることを利用 するものである。 本発明者らは、 WEH I 231細胞由来の cDNA発現ライブ ラリーおょぴ h S o sに融合した完全長 TRAF 3を用いる上記スクリーニング 法により、 新規な TRAF 3結合タンパク質 （以下、 T 3 BPとも称する） を同 定し、 さらにこの T 3 BPタンパク質の構造と機能を解明した。 本発明はこれら の知見に基づいて完成したものである。
即ち、 本発明によれば、 下記の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質が提 供される。
( a ) 配列番号 1に記載のァミノ酸配列；
(b) 配列番号 1に記載のアミノ酸配列において 1から数個のアミノ酸が欠失、 置換及び Zまたは挿入したァミノ酸配列であって、 TR AF 3に対する結合活性 を有するアミノ酸配列；または、
( c ) 配列番号 1に記載のァミノ酸配列と 60 %以上の相同性を有するアミノ酸 配列であって、 TRAF 3に対する結合活性を有するアミノ酸配列：
さらに本発明によれば、本発明のタンパク質をコードする遺伝子が提供される。 さらに本発明によれば、下記の何れかの塩基配列を有する遺伝子が提供される。 ( a ) 配列番号 2に記載の塩基配列；
(b)配列番号 2に記載の塩基配列において 1から数個の塩基が欠失、付加または 置換されている塩基配列であって、 TRAF 3に対する結合活性を有するタンパ ク質をコードする塩基配列；または
( c )配列番号 2に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズ する塩基配列であって、 TRAF 3に対する結合活性を有するタンパク質をコー ドする塩基配列：
さらに本発明によれば、 本発明の遺伝子を含むベクタ が提供される。 さらに本発明によれば、 本発明の遺伝子または本発明のベクターを有する形質 転換体が提供される。
さらに本発明によれば、 本発明の形質転換体を用いることを特徴とする、 TR AF 3に対する結合活性を有するタンパク質の製造方法が提供される。
さらに本発明によれば、 本発明のタンパク質を認識する抗体が提供される。 さらに本発明によれば、 本発明のタンパク質または抗体を用いて、 該タンパク 質または抗体の機能を促進または抑制する物質をスクリーニングする方法が提供 される。 好ましくは、 本発明のタンパク質または抗体の機能を促進または抑制す る物質は、 TRAF 3を介した細胞内シグナル伝達を促進または抑制する物質で ある。
さらに本発明によれば、 本発明のスクリーニング方法により得られる、 本発明 のタンパク質の機能を促進または抑制する物質が提供される。
さらに本発明によれば、 上記物質を有効成分として含む医薬が提供される。 本 発明の医薬は、 好ましくは、 TRAF 3を介する細胞内シグナル伝達の異常に関 連する疾患の予防または治療のために使用される。
さらに本発明によれば、 生体由来成分における本発明のタンパク質のレベルを 測定することを含む、 TRAF 3を介する細胞内シグナル伝達の異常に関連する 疾患の診断方法が提供される。
図面の簡単な説明
図 1Aは、 T 3 B Pの推定アミノ酸配列、 図 1 Bは T3 BP mRNAのノー ザンブロット分析の結果を示す。
図 2Aは、 GST融合タンパク質 （GST—クローン 3， GST—クローン 1 0) の TRAF 2， TRAF 3に対する結合特性の G STプルダウンアツセィに よる分析結果を示す。
図 2Bは、 GST— T 3 B Pの TRAF 2， TRAF 3, TRAF 5, TRA F 6に対する結合特性の GSTプルダウンアツセィによる分析結果を示す。
図 2Cは、 TRAF 3と T3 BPとの相互作用の免疫沈降ァッセィによる分析 結果を示す。
図 3 A及ぴ図 3 Bは、 TRAF 3中の T 3 B P結合領域のマッピングの結果を 示す。
図 3Cは、 マウス TRAF 3の一次構造の概略を示す。
図 4 Aは、 GST融合 T3BPトランケーシヨン突然変異体の TRAF 3に 対する結合特性の in vitroァッセィによる分析結果を示す。
図 4Bは、 GST融合 T3BPトランケーション突然変異体の TRAF 3に対 する結合特性の G S Tブルダゥンアツセィによる分析結果を示す。
図 4 Cは T 3 B Pの一次構造とその TRAF 3結合領域を示す。
図 5 Aは、 T3 BPの発現による細胞の形態変化を示す。
図 5Bは、 TRAF 3の細胞分布に及ぼす T 3 B P発現の影響を示す。
図 6 Aは、 T3 B Pによる細胞性 Fァクチン含量の増大を示す。
図 6 Bは、 T 3 B Pを発現する細胞中における Fァクチンの細胞分布を観察し た結果を示す。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明の実施態様及び実施方法について詳細に説明する。
(1) 本発明のタンパク質及び遺伝子 '
本発明は、 下記の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質、 並びにそれをコ ードする遺伝子に関する。 '
( a ) 配列番号 1に記載のァミノ酸配列；
(b) 配列番号 1に記載のァミノ酸配列において 1から数個のァミノ酸が欠失、 置換及び Zまたは揷入したアミノ酸配列であって、 T R A F 3に対する結合活性 を有するアミノ酸配列；または、
( c ) 配列番号 1に記載のァミノ酸配列と 60 %以上の相同性を有するァミノ酸 配列であって、 T R A F 3に対する結合活性を有するアミノ酸配列：
本発明の遺伝子の具体例としては、 下記の何れかの塩基配列を有する遺伝子が 挙げられる。
( a ) 配列番号 2に記載の塩基配列；
( b )配列番号 2に記載の塩基配列において 1から数個の塩基が欠失、付加または 置換されている塩基配列であって、 T R A F 3に対する結合活性を有するタンパ ク質をコードする塩基配列；または
( c )配列番号 2に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズ する塩基配列であって、 T R A F 3に対する結合活性を有するタンパク質をコー ドする塩基配列：
上記した 「配列番号 1に記載のアミノ酸配列において 1から数個のアミノ酸が 欠失、 置換及び Zまたは揷入したアミノ酸配列」 における 「1から数個」 の範囲 は特には限定されないが、 例えば、 1から 2 0個、 好ましくは 1から 1 0個、 よ り好ましくは 1から 7個、 さらに好ましくは 1から 5個、 特に好ましくは 1から 3個程度を意味する。
上記した 「配列番号 1に記載のァミノ酸配列と 6 0 %以上の相同性を有するァ ミノ酸配列」 とは、 該アミノ酸配列と配列番号 1に記載のアミノ酸配列との相同 性が少なくとも 6 0 %以上であり、好ましくは 7 0 %以上、より好ましくは 8 0 % 以上、 さらに好ましくは 9 0 %以上、 特に好ましくは 9 5 %以上であり、 最も好 ましくは 9 8 %以上であることを意味する。
上記した「配列番号 2に記載の塩基配列において 1から数個の塩基が欠失、付カロ または置換されている塩基配列」 における 「1から数個」 の範囲は特には限定さ れないが、 例えば、 1から 6 0個、 好ましくは 1から 3 0個、 より好ましくは 1 から 2 0個、 さらに好ましくは 1から 1 0個、 特に好ましくは 1から 5個程度を 意味する。
上記した 「ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列」 とは、 DNA をプローブとして使用し、 コロニー 'ハイブリダィゼーシヨン法、 ブラー クハイプリダイゼーシヨン法、 あるいはサザンブロットハイプリダイゼーション 法等を用いることにより得られる D NAの塩基配列を意味し、 例えば、 コロニー あるいはプラーク由来の D N Aまたは該 D N Aの断片を固定化したフィルターを 用いて、 0 . 7〜 1 . 0 Mの N a C 1存在下、 6 5 °Cでハイブリダィゼーシヨン を行った後、 0 . 1〜2 3 3。溶液 （1 ズ 3 3じ溶液は、 1 5 0 mM塩化ナト リウム、 1 5 mMクェン酸ナトリウム） を用い、 6 5 °C条件下でフィルターを洗 浄することにより同定できる D NA等を挙げることができる。 ハイブリダィゼー ション fま、 Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.，1989. 以後 "モレキュラークロー ユング第 2版" と略す） 等に記載されている方法に準じて行うことができる。
ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする D NAとしては、 プローブと して使用する D N Aの塩基配列と一定以上の相同性を有する D N Aが挙げられ、 例えば 7 0 %以上、 好ましくは 8 0 %以上、 より好ましくは 9 0 %以上、 さらに 好ましくは 9 3 %以上、 特に好ましくは 9 5 %以上、 最も好ましくは 9 8 %以上 の相同性を有する D N Aが挙げられる。
上記した 「T RA.F 3に対する結合活性を有する」 とは、 配列番号 1に記載の アミノ酸配列を有するタンパク質と同程度またはそれ以上の親和性で T R A F 3 と結合することができ、 それによつて T R A F 3が仲介する細胞内シグナル伝達 に関与できることを言う。
本発明の遺伝子の取得方法は特に限定されない。本明細書中の配列表の配列番号 1および配列番号 2に記載した塩基配列及びァミノ酸配列の情報に基づいて適当 なブローブやプライマーを調製し、 それらを用いてマウスなどの c D NAライブ ラリーをスクリーニングすることにより本発明の遺伝子を単離することができる。 マウスの由来の c D NAライブラリ一は、本発明の遺伝子を発現している細胞、 器官または組織から作製することが好ましレ、。 当該遺伝子を発現している細胞の 具体例としては WE H I 2 3 1細胞などが挙げられるが、 これに限定されるわけ ではない。 P C R法により配列番号 2に記載した塩基配列を有する D N Aを取得すること もできる。 マウスの染色体 DNAまたは cDNAライブラリーを铸型として使用 し、 配列番号 2に記載した塩基配列を増幅できるように設計した 1対のプライマ 一を使用して PC Rを行う。
PCRの反応条件は適宜設定することができ、-例えば、 94 で 30秒間 （変 性）、 55 °Cで 30秒〜 1分間 （アニーリング）、 72 °Cで 2分間 （伸長） からな る反応工程を 1サイクルとして、 例えば 30サイクル行った後、 72 °Cで 7分間 反応させる条件などを挙げることができる。 次いで、 増幅された DNA断片を、 大腸菌等の宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。 上記したブローブまたはプライマーの調製、 c DNAライブラリーの構築、 c DN Aライブラリーのスクリーユング、 並びに目的遺伝子のクローユングなどの 操作は当業者に既知であり、例えば、モレキュラークローユング第 2版、 Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜 38, John Wiley & Sons (1987-1997) (以下、 カレント ·プロトコールズ ·イン 'モレキュラー 'バイオ口 ジ一と略す） 等に記載された方法に準じて行うことができる。
本明細書中上記した、 （b) 配列番号 2に記載の塩基配列において 1から数個 の塩基が欠失、 付加または置換されている塩基配列であって、 TRAF 3に対す る結合活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子 （変異遺伝 子） は、 化学合成、 遺伝子工学的手法または突然変異誘発などの当業者に既知の 任意の方法で作製することもできる。 具体的には、 配列番号 2に記載の塩基配列 を有する DNAを利用し、 これら DNAに変異を導入することにより変異 DNA を取得することができる。
例えば、 配列番号 2に記載の塩基配列を有する DNAに対し、 変異原となる薬 剤と接触作用させる方法、 紫外線を照射する方法、 遺伝子工学的手法等を用いて 行うことができる。 遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定 の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、 モレキュラー クローユング第 2版、 力レント ·プロ トコーゾレズ 'イン 'モレキュラー♦バイオ ロジ一等に記載の方法に準じて行うことができる。
本明細書中上記した、 （ c )配列番号 2に記載の塩基配列とストリンジェントな 条件下でハイブリダィズする塩基配列であって、 T R A F 3に対する結合活性を 有するタンパク質をコードする塩基配列は、 上述の通り、 一定のハイプリダイゼ ーション条件下でコロニー ·ハイブリダイゼーション法、 プラークハイブリダィ ゼーション法、 あるいはサザンブロットハイブリダィゼーシヨン法などを行うこ とによ'り得ることができる。
次に、 本発明のタンパク質の入手'製造方法について説明する。 本発明のタン パク質の入手 ·製造方法は特に限定されず、 天然由来のタンパク質でも、 化学合 成したタンパク質でも、 遺伝子組み換え技術により作製した組み換えタンパク質 の何れでもよい。 比較的容易な操作でかつ大量に製造できるという点では、 組み 換えタンパク質が好ましい。
天然由来のタンパク質を入手する場合には、 該タンパク質を発現している細胞 または組織からタンパク質の単離 ·精製方法を適宜組み合わせて単離することが できる。 化学合成タンパク質を入手する場合には、 例えば、 Fmoc法 (フルォレニ ルメチルォキシカルボニル法)、 tBoc法 (t—ブチルォキシカルボニル法)等の化学 合成法に従って本発明のタンパク質を合成することができる。 また、 各種の市販 のペプチド合成機 （例えば、 桑和貿易 (米国 Advanced Chem Tech社製)、 パーキ ンエルマージャバン (米国 Perkin- Elmer社製)、フアルマシアバイ才テク（スゥェ 一テン Pharmacia Biotech社 )、 ァロカ (米国 Protein Technology Instrument 社製)、 クラボウ (米国 Synthecell-Vega社製)、 日本パーセプティブ'リミテツド（ 米国 PerSeptive社製)、 島津製作所等） を利用して本発明のタンパク質を合成す ることもできる。
本発明のタンパク質を組み換えタンパク質として産生するには、 該タンパク質 をコードする塩基配列 （例えば、 配列番号 2に記載の塩基配列） を有する D NA またはその変異体または相同体を入手し、 これを好適な発現系に導入することに より本発明のタンパク質を製造することができる。 発現ベクターおよび形質転換 体の作成およびそれを用いた組み換えタンパク質の産生については本明細書中後
. なお、配列番号 1に記載のァミノ酸配列において 1から数個のァミノ酸が欠失、 置換または挿入したアミノ酸配列を有するタンパク質、 または配列番号 1に記载 のァミノ酸配列と 6 0 %以上の相同性を有するァミノ酸配列を有するタンパク質 は、 配列番号 1に記載のァミノ酸配列をコ一ドする D N A配列の一例示す配列番 号 2に記載の塩基配列の情報に基づいて当業者であれば適宜製造または入手する ことができる。
例えば、 配列番号 2に記載の塩基配列またはその一部を有する D N Aプローブ としてマウスまたはマウス以外の生物より、 該 D N Aのホモログを適当な条件下 でスクリーニングすることにより単離することができる。 或いは D N A配列デー タベースのホモロジ一検索から対応 c D NA配列を取得し、 P C R等で調製する こともできる。 このホモログ D NAの全長 D NAをクローニング後、 発現べクタ 一に組み込み適当な宿主で発現させることにより、 該ホモログ D NAによりコー ドされるタンパク質を製造することができる。
( 2 ) 本発明の遺伝子を有するベクター
本発明の遺伝子は適当なベクター中に組み込んで組み換えベクターとして使用 することができる。 ベクターの種類は発現ベクターでも非発現ベクターでもよく、 目的に応じて選ぶことができる。
クローユングベクターとしては、 大腸菌 K 1 2株中で自律複製できるものが好 ましく、 ファージベクター、 プラスミドベクター等いずれでも使用できる、 具体 的には、 ZAP Express 〔ス トラタジーン社製、 Strategies, 5, 58 (1992)〕、 pBluescript II SK (+) [Nucleic Acids Research, 17, 9494(1989)]、 Lambda ZAP II(ス トラタジーン社製)、 I gtlO, gtll CDNA Cloning, A Practical Approach, 1， 49(1985)〕、 λ TriplEx(クローンテック社製)、 λ ExCell (ファルマシァ社製)、 pT7T318U (フアルマシア社製）、 pcD2 [Mol. Cen. Biol" 3, 280 (1983)〕、 pMW218(和光純薬社製)、 pUC118(宝酒造社製)、 pEG400 CJ.Bac, 172， 2392 (1990)〕、 pQE-30 (QIAGEN社製)等をあげることができる。
発現ベクターとしては、 好ましくは宿主細胞において自立複製可能であるか、 あるいは宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものを使用する。 また、 発現べ クタ一としては、 本発明の遺伝子を発現できる位置にプロモーターを含有してい るものが使用される。
細菌を宿主細胞として用いる場合は、 本発明の遺伝子を発現させるための発現 ベクターは該細菌中で自立複製可能であると同時に、 プロモータ一、 リボソーム 結合配列、 上記 DNAおよぴ転写終結配列より構成された組換えべクターである ことが好ましい。 プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
細菌用の発現ベクターとしては、 例えば、 pBTrP2、 pBTacl、 pBTac2(レ、ずれ もべ一リンガーマンハイム社より市販）、 pKK233-2(Pharmacia 社製）、 pSE280(Invitrogen社製)、 pGEMEX-KPromega社製)、 pQE-8(QIAGEN社製)、 pQE-30(QIAGEN 社 製 ） 、 pKYP10( 特 開 昭 58-110600)、 ρΚΥΡ200
[Agrc.Biol.Chem., 48, 669(1984)〕、 PLSA1 [Agrc. Biol. Chem., 53, 277(1989)〕、 pGELl [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)〕、 pBluescriptll SK+、 pBluescriptll SK (-) (Stratagene社製)、 pTrS30(FERMBP-5407), pTrS32(FERM BP-5408), pGEX(Pharmacia社製)、 ET-3(Novagen社製)、 Term2(US4686191, US4939094, US5160735)、 pSupex、 pUB110、 pTP5、 pC194、 pUC18 [Gene, 33, 103(1985)〕、 pUC19 [Gene, 33, 103(1985)〕、 pSTV28(宝酒造社製）、 pSTV29(宝酒造社製)、 pUC118(宝酒造社製)、 pQE-30(QIAGEN社製)等が挙げら れる。 細菌用のプロモーターとしては、 例えば、 trpプロモーター (P trp)、 lacプ 口モーター (P lac), PLプロモーター、 PRプロモーター、 PSEプロモーター等の、 大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、 SP01プロモーター、 SP02プロモ 一ター、 penPプロモーター等を挙げることができる。
酵母用の発現ベク ター と して、 例えば、 YEpl3(ATCC37115)、 YEp24(ATCC37051), Ycp50(ATCC37419), pHS19、 pHS15等を例示すること ができる。 酵母用のプロモーターとしては、 例えば、 PH05プロモーター、 PGK プロモーター、 GAPプロモーター、 ADHプロモーター、 gallプロモーター、 gallO プロモーター、 ヒートショックタンハ。ク質プロモーター、 MF QJ Iプロモーター、 CUP1プロモーター等のプロモーターを挙げることができる。
動物細胞用の発現ベクターとして、 例えば、 pcDNAI、 pcDM8(フナコシ社より 市販)、 pAGE107 〔特開平 3-22979; Cytotechnology, 3, 133，(1990)〕、 pAS3-3(特 開平 2-227075)、 pCDM8 [Nature, 329, 840,(1987)〕、 pcDNAI/AmP(Invitrogen 社製)、 REP4(Invitrogen 社製)、 AGE103 [J.Blochem., 101， 1307(1987)〕、 pAGE210 等を例示することができる。 動物細胞用のプロモーターとしては、 例 えば、 サイ トメガロウイ^^ス（ヒ ト CMV)の IE(immediate early)遺伝子のプロモ 一ター、 SV40 の初期プロモーター、 レトロウイ/レスのプロモーター、 メタロチ ォネインプロモーター、 ヒートショックプロモーター、 SR aプロモーター等を挙 げることができる。
植物細胞用の発現ベクターとしては、例えば、 pIG121-Hm [Plant Cell Report, 15, 809-814(1995)〕、 pBI121 CEMBO J. 6, 3901-3907(1987)] 等を例示すること ができる。 植物細胞用のプロモーターとしては、 例えば、 カリフラワーモザイク ウィルス 3 5 Sプロモーター CMol.Gen.Genet (1990) 220, 389-392〕、 ルブロー スビスフォスフエ一ト力/レポキシラーゼスモーノレサブュニットプロモーター等を 挙げることができる。
( 3 ) 本発明の遺伝子を有する形質転換体
本発明の T R A F 3に対する結合活性を有するタンパク質をコードする遺伝子 を有する形質転換体は、 上記した組み換えベクター （好ましくは発現ベクター） を 宿主に導入することにより作製することができる。
細菌の宿主細胞の具体例としては、 Escherichia 属、 Corynebacterium 属、 Brevibacterium属、 Bacillus属、 Microbacterium属、 Serratia属、 Pseudomonas 属、 Agrobacterium 属、 Alicyclobacillus 属、 Anabaena >、 Anacystis 属、 Arthrobacter fe、 Azobacter属、 Chromatium属、 Erwinia属、 Methylobacterium 属、 Phormidium属、 Rhodobacter属、 Rhodopseudomonas属、 Rhodospirillum 属、 Scenedesmun属、 Streptomyces属、 Synnecoccus属、 Zymomonas属等に 属する微生物をあげることができる。 細菌宿主へ組換えベクターを導入する方法 としては、 例えば、 カルシウムイオンを用いる方法やプロトプラスト法等を挙げ ることができる。
酵母宿主の具体例としては、 サッカロミセス ·セレビシェ (Saccharomyces cerevisae)、 シゾサッカ口ミセス .ボンべ (Schizosaccharomyces pombe)、 クリュ ィベロミセス · ラタチス（ luyveromyces lactis)、 トリコスポロン .プルランス (Trichosporon pullulans) シュヮ二才 ¾セス · /ノレビヮス (Schwanniomyces alluvius)等を挙げることができる。酵母宿主への組み換えベクターの導入方法と しては、 例えば、 エレクト口ポレーシヨン法、 スフエロブラスト法、 酢酸リチウ ム法等を挙げることができる。
動物細胞宿主としては、 ナマルバ細胞、 COS1細胞、 COS7細胞、 CHO細胞等 を挙げることができる。 動物細胞への組み換えベクターの導入方法としては、 例 えば、 エレク トロポーレーシヨン法、 リン酸カノレシゥム法、 リポフエクシヨン法 等を用いることができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、 組換え遺伝子導入ベクターおよぴバキ ュロウィルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えゥィルスを得 た後、 さらに組換えウィルスを昆虫細胞に感染させ、 タンパク質を発現させるこ と力 Sできる (ィ列 ま、 Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual； 及び力レン ト . プロ トコーノレズ ' イン ' モレキュラー ' バイオ口ジー、 Bio/Technology, 6, 47 (1988)等に記載）。
バキュロウィルスとしては、 例えば、 ョトウガ科昆虫に感染するウィルスであ るアウトグラファ 'カリフォルニ力 ·ヌクレア一 'ポリへドロシス ' ウィルス (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等を用レヽること力 Sでさる。 昆虫細胞としては、 Spodoptera frugiperda の卵巣細胞である S f 9、 S f 2 1 〔バキュロウイノレス .エクスプレッション 'ベクターズ、 ァ ' ラボラトリー · マニュアル、ダブリユー'ェイチ'フリーマン'アンド'カンパニー（W. H. Freeman and Company) s ニューヨーク（New York)、 （1992)〕、 Trichoplusia niの卵巣細胞 である H i F i v e (インビトロジェン社製)等を用いることができる。
組換えウィルスを調製するための、 昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクターと 上記バキュロウィルスの共導入方法としては、 例えば、 リン酸カルシウム法また はリポフエクション法等を挙げることができる。
( 4 ) 本発明の形質転換体を用いた組み換えタンパク質の製造
本発明においては、 上記のようにして作製した本発明の遺伝子を有する形質転 換体を培養し、 培養物中に本発明のタンパク質を生成蓄積させ、 該培養物より本 発明のタンパク質を採取することにより組み換えタンパク質を単離することがで きる。
本発明の形質転換体が大腸菌等の原核生物、 酵母菌等の真核生物である場合、 これら微生物を培養する培地は、 該微生物が資化し得る炭素源、 窒素源、 無機塩 類等を含有し、 形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、 合成 培地のいずれでもよい。 培養は、 振盪培養または深部通気撹拌培養などの好気的 条件下で行うことが好ましく、培養温度は通常 15〜40でであり、培養時間は、通 常 1 6時間〜 7日間である。培養中、 pHは 3.0〜9.0に保持する。 pHの調整は、 無機あるいは有機の酸、 アルカリ溶液、 尿素、 炭酸カルシウム、 アンモニアなど を用いて行う。 また培養中必要に応じて、 アンピシリンやテトラサイクリン等の 抗生物質を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、 一般 に使用されている RPM11640 培地 〔The Journal of the American Medical Associati。n,199，519(1967)〕、 Eagleの MEM培地 [Science, 122, 501(1952)〕、 DMEM培地 〔Virology, 8， 396(1959)]、 199培地 [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1(1950)〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加し た培地等が用いられる。 培養は、 通常 pH6〜8、 30〜40°C、 5%C02存在下等の条 件下で 1〜7 日間行う。 また、 培養中必要に応じて、 カナマイシン、 ペニシリン 等の抗生物質を培地に添加してもよレ、。 植物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、 M S 培地、 R 2 P培地等、 その植物種に応じて通常用いられる培地が用いられる。 培 養は、 通常 p H 6〜8、 1 5〜3 5 °C等の条件下で 1〜 2 1日間行う。 また、 培 養中必要に応じて、 カナマイシン、 ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加 してもよレ、。
形質転換体の培養物から、 本発明のタンパク質を単離精製するには、 通常のタ ンパク質の単離、 精製法を用いればよい。
例えば、 本発明のタンパク質が、 細胞内に溶解状態で発現した場合には、 培養 終了後、 細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、 超音波破碎機、 フレ ンチプレス、 マントンガウリンホモゲナイザー、 ダイノミル等により細胞を破砕 し、 無細胞抽出液を得る。 該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上 清から、 通常のタンパク質の単離精製法、 即ち、 溶媒抽出法、 硫安等による塩析 法、 脱塩法、 有機溶媒による沈殿法、 ジェチルアミノエチル (DEAE)セファロー ス、 DIAION HPA-75(三菱化成社製)等レジンを用いた陰イオン交換クロマトダラ フィ一法、 S-Sepharose FF (フアルマシア社製)等のレジンを用いた陽ィオン交換 クロマトグラフィ一法、 プチノレセファロース、 フエ二ノレセファロース等のレジン を用いた疎水性クロマトグラフィー法、 分子篩を用いたゲルろ過法、 アブイニテ ィークロマトグラフィー法、 クロマトフォーカシング法、 等電点電気泳動等の電 気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、 精製標品を得ることができ る。
また、 該タンパク質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、 同様に細胞 を回収後破砕し、 遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、 通常の方法 により該タンパク質を回収後、 該タンパク質の不溶体をタンパク質変性剤で可溶 化する。 該可溶化液を、 タンパク質変性剤を含まないあるいはタンパク質変性剤 の濃度がタンパク質が変性しない程度に希薄な溶液に希釈、 あるいは透析し、 該 タンパク質を正常な立体構造に構成させた後 > 上記と同様の単離精製法により精 製標品を得ることができる。 ( 5 ) 本発明のタンパク質を認識する抗体
本発明により T R A F 3結合性タンパク質が同定されたことにより、 該タンパ ク質を認識する抗体を作製することができる。 このような抗体の作製は、 当該タ ンパク質または T R A F 3の動態の解明などの研究において有用である。 本発明 の抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、 その作製は定法 により行なうことができる。
例えば、 本発明のタンパク質を認識するポリクローナル抗体は、 本発明のタン パク質を抗原として哺乳動物を免疫感作し、 該哺乳動物から血液を採取し、 採取 した血液から抗体を分離 ·精製することにより得ることができる。 例えば、 マウ ス、 ハムスター、 モノレモット、 ニヮトリ、 ラット、 ゥサギ、 ィヌ、 ャギ、 ヒッジ、 ゥシ等の哺乳動物を免疫することができる。 免疫感作の方法は当業者に公知であ り、 例えば抗原を 1回以上投与することにより行うことができる。 抗原投与は、 例えば 7〜3 0日間隔で 2〜3回投与すればよい。 投与量は 1回につき、 例えば 抗原約 0 . 0 5〜2 m g程度とすることができる。 投与経路も特に限定されず、 皮下投与、 皮内投与、 腹膜腔内投与、 静脈内投与、 筋肉内投与等を適宜選択する ことができるが、 静脈内、 腹膜腔内もしくは皮下に注射することにより投与する ことが好ましい。 また、 抗原は適当な緩衝液、 例えば完全フロイントアジュバン トまたは水酸化アルミニウム等の通常用いられるアジュバントを含有する適当な 緩衝液に溶解して用いることができるが、 投与経路や条件等に応じてアジュバン トを使用しない場合もある。
免疫感作した哺乳動物を一定期間飼育した後、 該哺乳動物の血清をサンプリン グし、 抗体価を測定する。 抗体価が上昇してきたら、 例えば 1 0 0 ;i g〜1 0 0 0 μ gの抗原を用いて追加免疫を行なう。 最後の投与から 1〜2ヶ月後に免疫感 作した哺乳動物から血液を採取して、 該血液を、 例えば遠心分離、 硫酸アンモニ ゥムまたはポリエチレングリコールを用いた沈澱、ゲルろ過クロマトグラフィー、 イオン交換クロマトグラフィー、 ァフィ二テイクロマトグラフィ一等のクロマト グラフィ一等の常法によつて分離 ·精製することにより、 ポリクロ一ナル抗血清 として、本発明のタンパク質を認識するポリクローナル抗体を得ることができる。 なお血清は、 たとえば、 5 6 °Cで 3 0分間処理することによつて捕体系を不活性 化してもよい。
本発明のタンパク質を認識するモノクローナル抗体のグロブリンタイプは特に 限定されず、 例えば I g G、 I g M、 I g A、 I g E、 I g D等が挙げられる。 本発明のモノクローナル抗体を産生する細胞株は特に制限されないが、 例えば、 抗体産生細胞とミエ口一マ細胞株との細胞融合によりハイブリ ドーマとして得る ことができる。 本発明のモノクローナル抗体を産生するハイプリ ドーマは、 以下 のような細胞融合法によって得ることができる。
抗体産生細胞としては、 免疫された動物からの脾細胞、 リンパ節細胞、 Bリン パ球等を使用する。 抗原としては、 本発明のタンパク質またはその部分ペプチド を使用する。 免疫動物としてはマウス、 ラット等を使用でき、 これらの動物への 抗原の投与は常法により行う。 例えば完全フロインドアジュバント、 不完全フロ インドアジュバントなどのアジュバントと抗原である本発明のタンパク質との懸 濁液もしくは乳化液を動物の静脈、 皮下、 皮内、 腹腔内等に数回投与することに よって動物を免疫化する。 免疫化した動物から抗体産生細胞として例えば脾細胞 を取得し、 これとミエローマ細胞とを公知の方法 （G. Kohl er et al . , Nature, 256 495 (1975) ) により融合してハイブリ ドーマを作製することができる。
細胞融合に使用するミエローマ細胞株としては、 例えばマウスでは P 3 X 6 3 A g 8、 P 3 U 1株、 S p 2 Z 0株などが挙げられる。 細胞融合を行なうに際し ては、 ポリエチレングリコール、 センダイウィルスなどの融合促進剤を用い、 細 胞融合後のハイプリ ドーマの選択にはヒポキサンチン 'アミノプテリン'チミジ ン （HA T) 培地を常法に従って使用する。 細胞融合により得られるハイプリ ド 一マは琅界希釈法等によりクローニシグする。 さらに必要に応じて、 本発明のタ ンパク質を用いた酵素免疫測定法によりスクリーニングを行なうことにより、 本 発明のタンパク質を特異的に認識するモノクローナル抗体を産生する細胞株を得 ることができる。 このようにして得られたハイブリ ドーマから目的とするモノクローナル抗体を 製造するには、通常の細胞培養法や腹水形成法により該ハイプリ ドーマを培養し、 培養上清あるいは腹水から該モノクローナル抗体を精製すればよい。 培養上清も しくは腹水からのモノクローナル抗体の精製は、常法により行なうことができる。 例えば、 硫安分画、 ゲルろ過、 イオン交換クロマトグラフィー、 ァフィ二ティー クロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて使用できる。
本発明のモノクローナル抗体を用いて本発明の TRAF 3結合性タンパク質を 免疫測定するための方法としては、 .例えば酵素免疫測定法、 ラジオイムノアッセ ィ、 蛍光免疫測定法、 発光免疫測定法等を挙げることができる。
また、 上記した抗体の断片も本発明の範囲内である。 抗体の断片としては、 F (a b ') 2フラグメント、 F a b' フラグメント等が挙げられる。
さらに、 上記した抗体の標識抗体も本発明の範囲内である。 即ち、 上記のよう にして作製した本発明の抗体は標識して使用することができる。 抗体の標識の種 類及ぴ標識方法は当業者に公知である。 例えば、 西洋ヮサビペルォキシダーゼま たはアルカリホスファターゼなどの酵素標識、 F I TC (フルォレセインイソチ オシァネート） または TR I TC (テトラメチルローダミン Bイソチオシァネー ト） 等の蛍光標識、 コロイド金属および着色ラテックスなどの呈色物質による標 識、 ビォチンなどのァフィ二ティー標識、 あるいは125 Iなどの同位体標識など を挙げることができる。本発明の標識抗体を用いた酵素抗体法、免疫組織染色法、 免疫ブロット法、 直接蛍光抗体法または間接蛍光抗体法等の分析は当業者に周知 の方法により行うことができる。
(6) 本発明のタンパク質を用いたスクリーニング法
本発明はさらに、 本発明の TRAF 3結合性タンパク質またはその抗体を用い て、 該タンパク質または抗体の機能を促進または抑制する物質をスクリーニング する方法にも関する。 当該スクリーニング方法により、 好ましくは、 TRAF 3 を介した細胞内シグナル伝達を促進または抑制する物質が選択される。 このよう なスクリーニング系は、 例えば以下の通り構築することができる。 本発明の遺伝子を有する発現ベクターを構築し、 この発現ベクターを TRAF 3を発現する適当な宿主に導入する。 得られる形質転換体においては TRAF 3 と本発明のタンパク質の両方が発現し、 両者の相互作用を介して、 適切なリガン ドの存在下においては細胞内シグナル伝達が進行する。
上記のように構築したスクリーニング系に被験物質を添加することができる。 被験物質を添加した場合に細胞内シグナル伝達の進行が阻害されれば、 その被験 物質は、 本発明のタンパク質と TRAF 3との相互作用を阻害する物質 （即ち、 本発明の TRAF 3結合性タンパク質の機能を抑制する物質） の候補物質として 選択することができる。 反対に、 被験物質を添加した場合に細胞内シグナル伝達 が活性化されれば、 その被験物質は、 本発明のタンパク質と TRAF 3との相互 作用を活性化する物質 （本発明の TRAF 3結合性タンパク質の機能を促進する 物質） の候補物質として選択することができる。
上記スクリーニング系で使用することができる発現ベクター、 宿主細胞などは 当業者であれば適宜選択することができ、 本明細書中上記したものを使用しても よい。
被験物質としては任意の物質を使用することができ、 その種類は特に限定され ない。 被験物質の具体例としては、 低分子合成化合物でもよいし、 天然物抽出物 でもよく、 あるいは化合物ライブラリー、 ファージディスプレーライブラリーも しくはコンビナトリアルライブラリーでもよレ、。 化合物ライブラリーの構築は当 業者に公知であり、 また市販の化合物ライブラリ一を使用することもできる。
(7) 本発明の医薬
TNFリガンドファミリ一は細胞毒性、 抗ウィルス活性、 免疫調節活性おょぴ 数種の遺伝子の転写制御を含む多数の細胞反応を誘導する最も多面的なサイトカ インの一つとして知られている。 TNFリガンドに対する細胞の応答は正常な生 理学的反応のみならず、 アポトーシスの増強またはアポトーシスの阻害にも関係 する。 アポトーシス調節の異常は多数の病因となる。 細胞増加に関連する疾患ま たはアポトーシスの阻害に関する疾患としては、 癌、 自己免疫疾患、 ウィルス感 染症、 炎症、 移植片対宿主疾患、 急性移植片拒絶、 および慢性移植片拒絶などが 挙げられ、 アポトーシスの増強に関連する疾患には、 A I DS、 神経変性疾患、 骨髄形成異常症候群、 虚血性損傷、 トキシン誘導性肝疾患、 敗血症ショック、 悪 液質および食欲不振などが挙げられる。
本発明の TRAF 3結合性タンパク質は、 TNF受容体スーパーフアミリーに は属さないものの、 TRAF 3に結合することから TNF受容体 Zリガンドス一 パーファミリーが関与する慢性および急性炎症、 関節炎、 敗血症、 自己免疫疾患
(例えば、全身性エリテマトーデス、慢性関節リューマチ、炎症性腸疾患、乾癬）、 移植拒絶反応、 移植片対宿主病、 感染症、 卒中、 虚血、 急性呼吸器疾患症候群、 再狭窄、 脳損傷、 A I'DS、 骨疾患、 癌 （例えば、 リンパ球増殖性疾患）、 ァテロ ーム性動脈硬化症およびアルツハイマー病およびその他の疾患へ関与するものと 考えられる。
従って、 上記したスクリーニング法により得られる、 本発明の TRAF 3結合 性タンパク質の機能を促進または抑制する物質は、 このような疾患の治療および Zまたは予防のための医薬として有用である。
即ち、 本発明は、 上記したスクリーニング法により得られる本発明の TRAF 3結合性タンパク質の機能を促進または抑制する物質を有効成分として含む医薬 にも関する。 本発明の医薬は、 例えば、 TRAF 3を介する細胞内シグナル伝達 の異常に関連する疾患の予防または治療のために使用することができる。 ― 本発明の医薬は.一般的には、 本発明の TRAF 3結合性タンパク質の機能を促 進または抑制する物質を有効成分として含み、 さらに製剤用添加物 （例えば、 担 体、 賦形剤など） を含む医薬組成物の形態で提供される。
本発明の医薬 投与経路は特に限定されず、 経口投与または非経口投与 （例え ば、 筋肉内投与、 静脈内投与、 皮下投与、 腹腔内投与、 鼻腔などへの粘膜投与、 または吸入投与など） の何れでもよい。
本発明の医薬の形態は特に限定されず、経口投与のための製剤としては例えば、 錠剤、カプセル剤、細粒剤、粉末剤、顆粒剤、液剤、シロップ剤などが挙げられ、 非経口投与のための製剤としては例えば、 注射剤、 点滴剤、 座剤、 吸入剤、 経粘 膜吸収剤、 経皮吸収剤、 点鼻剤、 点耳剤などが挙げられる。
本発明の医薬の形態、 使用すべき製剤用添加物、 製剤の製造方法などは、 いず れも当業者が適宜選択可能である。
本発明の医薬の投与量は、 患者の性別、 年齢または体重、 症状の重症度、 予防 または治療といった投与目的、 あるいは他の合併症状の有無などを総合的に考慮 して適宜選択することができる。 投与量は、 一般的には、 0. O O l g/k g 体重 Z日〜 1 000 μ g/k g体重 Z日、 好ましくは 0. 001 g/k g体重 /日〜 l O O ^u g/k g体重/日である。
( 8 ) 本発明のタンパク質のレベルを測定することによる疾患の診断方法 本発明はさらに、 生体 ¾来成分における本発明のタンパク質のレベルを測定す ることを含む、 TRAF 3を介する細胞内シグナル伝達の異常に関連する疾患の 診断方法に関する。
上記した通り、 本発明のタンパク質は、 アポトーシス増強またはアポトーシス 阻害に関係する様々な疾患に関与している可能性がある。 従って.、 生体内におけ る本発明のタンパク質の活性またはその量を測定することにより、 TRAF 3を 介する細胞内シグナル伝達の異常に関連する疾患を診断することが可能になる。 本発明のタンパク質のレベルの測定は、 当業者に公知の常法に従って行うこと ができ、 例えば、 本発明のタンパク質を認識する抗体を用いる免疫学的方法で行 つてもよいし、 本発明のタンパク質をコードする! nRNAの量を測定することに よって行ってもよレヽ。 実施例
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、 本発明は以下の実施 例により特に限定されるものではない。
(A) 材料および方法
A- 1. 酵母を用いたタンパク質-タンパク質相互作用のスクリーニング 完全長 TRAF 3をコードする DNAを、 CytoTrap (登録商標）ツーハイプリッ ド系 （Stratagene, La Jolla. CA) においてベイト （bait) として使用した。 こ の系で使用した酵母 c d c 2511株（。 d c 25遺伝子の温度感受性突然変異株） は以下に示す遺伝子型を有する ： MAT a u r a 3、 l y s 2、 l e u 2、 t r p l、 h i s 200 , a d e l 01、 c d c 25— 2、 GAL+。 ミリスチル 化シグナル配列と WE H I 231細胞由来の c DNA断片とのハイプリッドタン パク質のライブラリーを、 プラスミド pMr y中で構築した。 製造業者の推奨通 り、 変更を加えずにスクリーニングを実施した。
簡単に説明すると、 上記酵母株を、 適切な添加物質を補充した YPAD培地も しくは Burkholderの最少培地（B MM)中 25 °Cで増殖させ [Sato, T. ,他、（1995) FEBS Lett. 358, 113-118]、 酢酸リチウム法で形質転換した。 その酵母形質転換 体を BMMZガラクトースプレート上で 25°Cにて 2日間増殖させ、 続いて 3 7°Cで増殖させた。 TRAF 3と相互作用を有するミリスチル化タンパク質を発 現していると考えられる 37 で増殖したコロニーを拾い、 37°Cにおける BM MZグルコースプレートおよぴ BMM/ガラク トースプレート上での増殖にっレ、 て試験した。 37°Cでガラクトース依存性増殖 （pMy rに組み込まれた cDN Aの発現はガラクトースに依存）を示すクローンからライブラリープラスミド（c DNAが組み込まれた pMr y) を単離し、 プラスミド p S o s "T R A F 3も しくは陰性対照として p S o sZコラゲナーゼを用いて c d c 25 H細胞に再度 形質転換した。 p S o s/TRAF 3の存在下でのみ c d c 25 H表現型を抑制 するプラスミドの配列を決定した。 DNAの配列決定は、 Applied Biosystems自 動 DNAシーケンサー、 ABI PRISM 310遺伝子解析機 (Foster, CA) で行った。 A— 2. ノーザンブロットハイブリダィゼーシヨン
マウス組織 (C 3H/He n C r j ) から酸性グァニジンフエノールクロ口 ホルム法により調製した 10 μ gの全 RNAを、 ホルムアルデヒド含有 1%ァガ ロースゲル上で分離し、 20 X S SC中で Hybond (登録商標） - N+ (Amersham Pharmacia, Uppsala, Sweden)に卜ランスファーし、そして U V架橋 (Stratagene) により固定化した。 ハイブリダィゼーシヨンプローブは、 [ひ一32 P] d CT P (Amersham Pharmacia) によりランダムプライム法で放射標識したゲル精製 D N A断片から作製した。ブロットを、 5 X S S C、 5 Xデンハルトの溶液、 0. 1 % S D S、 5 0%脱イオン化ホルムアミ ド、 および 1 0 0 μ gZm 1サケ精子 DN Aを含有する溶液中で 4 2 °Cにてハイブリダィズさせた。 ハイブリダィゼーショ ン後、 該ブロットを室温にて 2 X S S Cおよび 0. 1 %SD S、 続いて 6 5 °Cに て 0. 1 33。ぉょぴ0. 1 %SD Sを用いて洗浄した。該ブロットを乾燥し、 B AS 2 5 00 (Fuji Ltd., Tokyo. Japan) を使用して分析した。
A— 3. 発現プラスミ ドの構築およびトランスフエクシヨン
T 3 B P発現構築物を作製するために、 マウス T 3 B Pの適切な領域を P CR で増幅し、 E c o R Iおよび X h o I制限部位を利用して pcDNA 3.1 (-) myc his version B .(Invitrogen, Carlsbad, CA) 中にサブクローユングして、 p c DNA /T 3 B Pを得た。 T 3 B Pを、 C末端に標識した MYC融合タンパク質として 発現させた。
EGF P標識T 3 B P発現プラスミ ドの構築のために、 完全長コード領域を P CRで増幅し、 E c o R Iおよび Xh o I制限部位を利用して p E G F P _ N 2 (Clontech, California, CA) にライゲートして p E G F P/T 3 B Pを得た。
F LAG標識マウス TRAF 2および TRAF 3をコードする哺乳動物発現べ クタ一を P C Rに基づく方法で作製した。
全ての発現構築物は、 ABI PRISM 310遺伝子解析機を使用して配列決定した。 A-4. 細胞培養およびトランスフエクシヨン
ヒト胎児腎臓由来 2 9 3細胞は、 1 0%仔ゥシ血清 （HyClone, Logan, UT)、 1 0 OU/m 1ぺニシリンおよび 1 0 0 μ g/m 1ス トレプトマイシン（GIBC0 - BRL, Grand Island, NY) を含有するイーグルの最少必須培地中で維持した。 WEH I 2 3 1細胞は、 1 0 %仔ゥシ血清 （HyClone)、 5. 5 X 1 05Mの 2—メルカプ トエタノーノレ、 1 0 0U/m 1ぺニシリンおよび 1 0 0 g/m 1ス トレプトマ イシン （GIBC0- BRL) を含有する R PM 1 — 1 6 4 0培地中で維持した。 2 9 3細 胞を、 10 c m培養皿中に細胞 106個/皿の濃度で接種し、 2〜 3日間培養し た。 続いて該細胞を、 巿販溶液 （Eppendorf- 5 Prime, Inc., Boulder, CO) を使 用した標準リン酸カルシウム共沈法を用いてトランスフエクトした。
' GSTプルダウンアツセィのために、 GST融合タンパク質を、 I PTG誘導 後、 pGEXベクター （Amersham Pharmacia) を使用して大腸菌 （BLR) で発 現させ、 ダルタチオンビーズ (Amersham Pharmacia) で精製した。 FLAG標識 TRAF 2、TRAF 3、TRAF 5、TRAF 6を 293細胞中で発現させた。 細胞溶解物は、 E 1 Aバッファー (50raM HEPES [pH7.6]、 250mMNaCl, 0.1% NP-40 および 5mMEDTA) を溶解剤として使用することにより、 トランスフエクシヨン細 胞から調製した。 該細胞溶解物を透明にして、 ダルタチオンビーズ上に固定化し た 2 μ gの GSTもしくは GST融合タンパク質と共にインキュベートした。 そ のグルタチオンビーズを E 1 Aバッファーで十分に洗浄した。 サンプルを 10% SDS—ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動にかけ、 PVDF膜にトランスファー した。 ブロッキング後、 該膜を抗 FLAG M2抗体で処理し、 強化型化学発光 プロトコ一ノレ (E C L, Amersham Pharmacia) に従って、 5, 000倍に希釈し た西洋ヮサビペルォキシダーゼ結合二次抗体（Bio- Rad) を用いて免疫反応性タン パク質を検出した。 TRAF 3の i n v i t r o転写 ·翻訳， 35— Sメチォ ニン標識は T 7リンク転写 ·翻訳システム （Amersham Pharmacia) に従い、 検出 はフルォログラフィ一にて行った。
A— 6. 免疫沈降アツセィ
上記細胞を 5mMの EDTAを含有する PB S中でプレートから剥がし、 同緩 衝液を用いて 3回洗浄した。 該細胞を 1 m 1の E 1 A緩衝液中に 4°Cにて 10分 間溶解させた。その細胞溶解物を遠心分離し、上清を細胞抽出物として使用した。 該細胞抽出物を、 抗 FLAG M 2抗体、 抗 MY C 9E 10抗体もしくは対照 抗体と共に 4 にて 2時間インキュべ一トし、 続いてプロテイン Gセファロース FF (Amersham Pharmacia) による処理を行った。 このセファロースビーズを E 1 A緩衝液で十分に洗浄した。 サンプルを 1 0 % S D S—ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動に供し、 上述のように免疫反応性タンパク質を抗 F LAG M2抗体 もしくは抗 MY C 9 E 1 0抗体を用いて検出した。
A— 7. 蛍光顕微鏡法
カバーガラス上で培養した HE K 2 9 3細胞を、 種々の構築物を用いてトラン スフエクシヨンした。 24時間後に、 細胞を 3. 7%ホルマリンを含有する P B S中で室温にて 1 0分間固定した。細胞を P B Sで 3回洗浄し、室温にて 5分間、 P B S中 0. 2 %Triton X- 100で処理した。スキムミルクでブロッキングした後、 抗 F LAG M2モノクローナル抗体もしくは抗 MYC 9 E 1 0抗体 （Sigma) などの各種一次抗体と一緒に、 続いて C y 5結合二次抗体 （Jackson ImmunoReseach Laboratories, Inc. ) と一緒に細胞をインキュベートした。 細胞 を P B Sで 3回洗浄し、 スライドガラス上にのせた。
蛍光を Carl Zeiss LSM510共焦点レーザー走查型顕微鏡（Oberkochen, Germany) を使用して可視化した。
A— 8. Fァクチンの定量化
Fァクチン含量測定を既報の通り実施した [Mizuno. , 他、 （1998) J. Pharm. Pharmacol. 50, 645 - 648]。 簡単に説明すると、 リン酸カルシウム法によ り、 1 2ゥエルプレート上で培養した 2 9 3細胞を指示した量の T 3 B P発現プ ラスミドを用いて一時的にトランスフエクシヨンした。 トランスフエタトされた 全 DNA (2 μ g) は、 空のベクターに担持することにより一定に維持した。 2 4時間後に、 そのトランスフエクシヨン細胞を P B S中で 3. 7%ホルマリンを 用いて 3 7°Cにて 1 0分間固定した。 P B S中 0. 2%TritonX- 100を用いて室 温で 1 0分間透過した後、細胞を P B S中 1 0 U/m 1のローダミン-ファロイジ ン (MolecurProbe)で室温にて 1時間染色した。 P B Sで十分に洗浄した後、 結合 した F I TC-ファロイジンをメタノールを用いて氷上で 1時間抽出した。その蛍 光強度を、 分光計 F- 3010 (Hitachi Ltd. , Tokyo, Japan) を使用して 4 8 8 nm の励起波長および 5 1 Onmの発光波長で測定した。 結果を、 対照トランスフヱク ト細胞の蛍光強度の比から算出した相対蛍光強度として表した。
(B) 結果
B— 1. T 3 B Pをコードする c DNAクローンの単離
TRAF 3と直接結合するタンパク質を同定するために、 酵母におけるタンパ ク質一タンパク質相互作用に基づくスクリーニングを実施した。 サッカロミセ ス ·セレビシェ（S. cerevisiae) c d c 25 H株は、 c d c 25遺伝子に温度感受 性点突然変異が含まれているため、 宿主の増殖は 37°Cでは阻害されるが、 許容 温度 ( 25 °C) では正常である。 c d c 25 伝子は、 RASと結合して活' 1·生ィ匕 することにより細胞増殖を導くグァニルヌクレオチド変換因子をコードしている'。 本実施例で使用した系は、 c d c 25欠陥を相補し、 酵母 RASシグナル伝達経 路を活性化するヒト由来 S o sの能力を利用している ； h S o s融合タンパク質 (h S o s -TRAF 3) が発現して、 それがタンパク質一タンパク質相互作用 を介して形質膜に局在化すると、 c d c 25 H株は 37でにおいても増殖する。 プラスミド p S o s/TRAF 3を含む酵母を、 ミリスチル化シグナルに融合 して形質膜に局在化する WEH I 231細胞 cDNA発現ライブラリーを用いて 形質転換した。 約 2 X 105個の形質転換体を、 B MM/ガラクトースプレート 上 25°Cで 2日間増殖させ、 次に 37°Cのインキュベーターに移した。 37°Cで 増殖したコロニーを拾い、 37°Cにおける BMMZグルコースプレートおよび B MMZガラクトースプレート上での増殖について試験した。 ライブラリープラス ミ ドを、 37°Cにおいてガラクトース依存性増殖を示すクローンから単離し、 p S o s/TRAF 3もしくは陰性対照として p S o s /コラゲナーゼを用いて c d c 25 H細胞に再度形質転換後、 p S o s/TRAF 3の存在下においてのみ c d c 25 H表現型を抑制する 9個の c DNAを得た。 これらのうちの 1つであ るクローン 3は新規タンパク質の一部をコードしていた。
クローン 3中に挿入されている完全長 c DNAを単離するために、 部分 c DN Aをプローブとして使用して WEH I 231細胞由来の pMr y c DNAライブ ラリーをスクリーニングし、 陽性クローンを得た。 陽性クローンの DNA配列決 定により、 推定分子量 18, 846ダルトンを有する 1 75アミノ酸のタンパク 質をコードすると予測されるオープンリーディングフレームの存在が明らかにな つた （図 1A、配列表の配列番号 1及ぴ配列番号 2)。 この新規タンパク質を T3 BPと称する。
図 1Aは、 全長 T 3 BP c DNAのヌクレオチド配列から推定されたァミノ 酸配列を示す。 クローン 3によりコードされる配列には下線を付してある。 網掛 けのボックスは推定膜貫通ドメインを示す。
B LASTおよび FAS TAプログラムを利用したデータベース検索により、 T3 BP cDNAが、 マウス白血病おょぴリンパ腫における、 体細胞により獲得 されたプロウィルスのフランキング配列として報告された配列 （AF 1 9316 1) を含むことが判明した。 また、 ヒ ト B細胞成熟因子 （BCMA) が T3BP に対し有意な配列類似性を有し、 T 3 B Pに対して 28 %の同一性および 42 % の類似性を有していた。 Tmp r e dプログラムを用いて作製したヒドロパシー プロットにより、 T3BPが推定膜貫通領域 （アミノ酸 77— 97) を有するこ とが示唆された。 PROS I TE解析によって、 N—グリコシル化部位 （ァミノ 酸 23— 26) および N—ミリストイル化部位 （アミノ酸 8 1 -86) が同定さ れた。 PSORT解析によって、 このタンパク質が I型膜タンパク質立体構造を 有し、 形質膜に位置すると推測された。
T 3 B Pの発現パターンを、 6種の組織おょぴ WEH I 231細胞を用いたノ 一ザンブロットハイプリダイゼーシヨンにより調べた。 結果を図 1 Bに示す。 図 1 Bでは、 ブロットを 200 bの T 3 B P c D N Aプローブを用いてバイブリダ ィズした。 リボソーム R N Aの位置を左側に示す。
図 1 Bに示すように、 T3BP遺伝子は WEH I 231細胞中に約 2 k bの m RNAを示した。 しかしながら、 T 3 B PmRNAは試験した他のマウス組織で は検出されなかった。
B— 2. TRAF 3と特異的に相互作用する T 3 B P
酵母でのアツセィで観察された TRAF 3と T 3 B Pとの相互作用を確認する ために、クローン 3お iびクローン 10を GST融合タンパク質として発現させ、 TRAF 2もしくは TRAF 3に対する結合を G S Tプルダウンアツセィで試験 した。 FLAG標識 TRAF 2もしくは TRAF 3を過剰発現する 293細胞の 細胞溶解物を、 GST—クローン 3、 GST—クローン 10もしくは GST単独 と一緒にインキュベートし、 GST融合タンパク質に結合した TRAFを、 ダル タチオン一セファロースで沈降させた。 該 TRAFを SD S— PAGEにより分 離し、 抗 FLAG M2抗体を用いたィムノブロッテイングで検出した。 該細胞 溶解物における F LAG標識 TRAFの発現レベルもまた、 抗 FLAG M2抗 体を用いたィムノブ口ッティングでモニター'した。 結果を図 2 Aに示す。
図 2Aで示すように、 GST—クローン 3は、 TRAF 2よりも TRAF 3に 優先的に結合する。 一方、 G'ST—クローン 10は TRAF 2および TRAF 3 に対して同様に相互作用する。クローン 10の配列解析により、このクローンが、 TRAF結合ドメインのコンセンサス配列 （PXQXT/S、 アミノ酸 583— 587) を含む、 mn bプロテインキナーゼ相同体 mp 86 (D y r k ； MMU 58497、 アミノ酸 284— 763) の一部をコードすることが判明した。 し かし、 クローン 3にはこの配列を含まない。
さらにクローン 3と他の TRAFファミリー （TRAF 5， 6) との結合特異 性を比較す.るため、 同様に GSTプルダウンアツセィを行ったところ、 図 2Bに 示すように、 GST— T3 BP (クローン 3) は他の TRAFに比較して TRA F 3と一番強く結合した。
TRAF 3と T3 BPとの相互作用を、 哺乳動物細胞における共免疫沈降ァッ セィにより分析した。 結果を図 2Cに示す。 先ず、 293細胞を、 MYC標識 T 3 B P (C末端 MY Cェピトープ標識を含む完全長 T 3 B P) および FLAG標 識 TRAF 3をコードする発現ベクターを用いて一時的にトランスフエクション した。細胞抽出物を調製し、抗 MY C 9E 10抗体、抗 FLAG M2抗体（抗 FLAGモノクローナル抗体）、または対照のマウス I gGを用いて免疫沈降（I P) を行った。 共沈する FLAG— TRAF 3または MYC— T 3 BPを、 それ ぞれ抗 FLAG M2抗体 （図 2Cの上部） または抗 MYC 9 E 10抗体 （図 2Cの下部） を用いたィムノブロッテイング分析で検出した。 該細胞溶解物にお ける T 3 B Pおよび TRAF 3の発現レベルも、 それぞれ抗 MYC 9E 10抗 体または抗 FLAG M 2抗体を用いたィムノブロッテイングで測定した。 図 2 Cには、 T 3 B Pおよび TRAF 3の位置を示す。 I gの H鎖および L鎖の位置 も示した。
図 2 C下図に示す通り、 抗 MY C抗体は、 MY C標識 T 3 BP発現プラスミド によるトランスフエクション細胞溶解物中にアミノ酸配列から推定されたものよ り大きい （35— 50 kDa) 複数のバンドを特異的に認識したが、 対照抗体の 場合には認識しなかった。 F LAG標識 TRAF 3によって沈降される T 3 B P が約 40 kD aの位置に検出され（下図）、逆に MY C標識 T 3 B Pによって沈降 される TRAF 3が約 64 kD aの位置に検出された （上図）。
B— 3. TRAF 3中の T 3 BP結合ドメインのマッピング
T 3 BPとの結合に関与する TRAF 3の領域を決定するために、 F LAG標 識 TRAF 3の種々のトランケーション突然変異体を 293細胞中で発現させ、 GSTプルダウンアツセィを実施した。 先ず、 293細胞を、 FLAG標識 TR AF 3 トランケーシヨン突然変異体を用いて一時的にトランスフエクトした。 細 胞抽出物を調製し、 GST—クローン 3もしくは GST単独と共にインキュベー トした。 GS T融合タンパク質に結合した TRAFを、 グルタチオン一セファロ ースにより沈降させ、 SD S— PAGEにより分離し、 抗 FLAG M2抗体を 用いたィムノブロッテイングで検出した。 細胞溶解物における F L A G標識 T R AF 3 トランケーシヨン突然変異体の発現レベルを抗 F LAG M2抗体を用い たィムノブロッテイングで監視した。 結果を図 3 Aに示す。'図 3 Aから分かるよ うに、 TRAF 3の TRAFドメインが T 3 B Pと相互作用するために必要であ ることが判明した。
これを確認するために、 h S o sに融合させた TRAF 3 トランケーション突 然変異体を作製し、 酵母でのタンパク質一タンパク質相互作用アツセィにおいて T 3 B Pとの相互作用について試験した。 具体的には、 酵母細胞 c d c 25 Hを 指示した構築物を用いてトランスフエクトし、 上述の方法と同様に増殖について アツセィした。 許容温度以上で増殖したコロニーは陽性であり、 許容温度以上で は増殖できないコロニ一は陰性である （図 3 B)。 このアツセィによって、 TRA FCドメインが T 3 B P結合に重要であるごとが示唆された。 図 3Cは、 マウス TRAF 3の一次構造の概略を示す。
B-4. T 3 B P中の TRAF 3結合ドメインのマッピング
TRAF 3との結合に関与する T 3 B Pの領域を決定するため、 T 3 B Pの 種々のトランケーション突然変異体を GST融合蛋白質として大腸菌で発現させ j i n v i t r o転写 '翻訳， 35 S—メチォニン標識した TRAF 3と共にィ ンキュベーシヨンした。 GST融合蛋白質に結合した T 3 BPをダルタチオンセ ファロースにより沈降させ、 SDS—P AGEにより分離しフルォログラフィー にて検出した。 図 4 Aに示すように、 T3 BPの 1 5 1番目以降のアミノ酸を含 む C末端部分が TRAF 3との相互作用に必要であることが判明した。 さらに F LAG標識 TRAF 3を 293細胞中で発現させ、 03丁及ぴ03丁融合丁 3 B Pトランケーシヨン突然変異体による 293細胞溶解物の GSTプルダウンアツ セィを実施したところ、 図 4 Bに示すように抗 FRAG M2抗体で検出される 結合パターンは図 4 Aの i n v i t r o転写 '翻訳産物による結合試験と完全 に一致した。図 4 Cは T 3 B Pの一次構造とその TRAF 3結合領域を示す（T Mは膜貫通領域） 。
B— 5. T 3 BPの細胞分布
T 3 B Pの機能について調べるために、 その細胞小器官局在化を蛍光顕微鏡法 により調べた。 カバーガラス上で培養した 293細胞を、 pEGFP— N2 (対 照プラスミド；左側） もしくは PEGFP/T3BP (£0 ？標識丁3：6?発 現ブラスミド；右側） を用いて一時的にトランスフエクシヨンした。 24時間後 に細胞を 3. 7%ホルマリン中で固定した。 次に EGFPの蛍光を共焦点レーザ 一走查型顕微鏡を用いて画像化した。 結果を図 5 Aに示す。 図 5 Aに示すように、 E G F P標識 T 3 BPの発現により形態の変化が誘導さ れた。 £0??標識丁38?発現細胞にぉぃては、 細胞形状が接着性になり、 細 胞表面から多くのスパイクが発達した。 EGFP融合 T3 B Pの大部分の蛍光が 細胞表面およぴスパイクにおいて観察された。 この観察結果は P SORTによる 予測と一致するものである。
次に、 TRAF 3細胞分布に及ぼす T 3 BP発現の影響を試験した。 カバーガ ラス上で培養した 293細胞を、 p EGF P— N 2および p CR/F LAG— T RAF 3 (図 5B— a， b, c )、 または; p EGF P/T 3 B Pおよび p CR/F LAG-TRAF 3 (図 5 B—d， e， f ) を用いてトランスフエタトした。 2 日後に細胞を 3. 7%ホノレマリン中で固定し、 0. 2 %T r i t o nX_ 1 00 で処理した。 ブロッキング後、 間接免疫蛍光分析を行った。 抗 FLAG M2抗 体を一次抗体として使用し、 続いて Cy 5—結合二次抗体処理を行った。 EGF Pおよび C y 5からの蛍光を、共焦点レーザー走查型顕微鏡を用いて画像化した。 上部； EGF Pの蛍光画像、 中央； C y 5結合二次抗体の蛍光画像、 下部；合併 した画像。 バーは 50 /ζπι。
図 5 B— bから分かるように、 EGF Pおよび F L AG標識 TRAF 3を共発 現する細胞において、 FLAG標識 TRAF 3が核の周辺において可視化された (図 5 B— b)。EGFP標識 T 3 B Pおよび F LAG標識 TRAF 3を共発現す る細胞においては、 E G F P標識 T 3 B Pが局在化していた細胞表面およぴスパ イクにおいて、 FLAG標識 TRAF 3が観察された （図 5B— e)。
B-6. 細胞性 Fァクチン含量に及ぼす T3BPの影響
細胞性 Fァクチンに及ぼす T 3 B Pの影響を調べるために、 p cDNA/T 3 B Pでトランスフエクションした細胞における Fァクチンの細胞含量を測定した。 12ゥエルプレート上で培養した 293細胞を、 指示した量の p c DNA/T 3 BPを用いてトランスフエタトした。 24時間後に、 上述の.方法と同様に F I T C一ファロイジンを用いて Fァクチンレベルを測定した。
結果を図 6 Aに示す。 図 6 Aから分かるように、 T 3 B Pによって濃度依存的 に細胞性 Fァクチン含量が増大した。
T 3 B Pによって細胞性 Fァクチン含量が増大することを確認するために、 M YC標識 T 3 B Pを発現する細胞中における Fァクチンの細胞分布を観察した (図 6B)。具体的には、カバーガラス上で培養した 293細胞を、 pEGFP— N2および p cDNA (図 6 B— a)、または p E G F P— N 2および p c DNA /MYC-T 3 B P (図 6 B— b) を用いてトランスフエクシヨンした。 24時 間後に細胞を 3. 7%ホルマリン中で固定し、 0. 2%T r i t o nX— 100 で処理した。 ブロッキング後、 細胞をローダミン一ファロィジンで染色した。 E GFPからの蛍光 （緑色） およびローダミンからの蛍光 （赤色） を、 共焦点レー ザ一走査型顕微鏡を用いて画像ィ匕した。 バーは 50 m。
図 6 B— bから分かるように、 MY C標識 T 3 BP発現によって細胞形状の変 化が引き起こされ、 T3BPにより誘導されたスパイクはローダミン一ファロィ ジンにより染色された。
(しノ ロ f jffl
.本実施例では、 酵母でのタンパク質一タンパク質相互作用に基づくスクリー二 ングにより新規な TRAF 3結合タンパク質 T 3 B Pが同定された。 T 3 B Pと TRAF 3との結合は、 GS Tプ ダウンアツセィおよび共免疫沈降アツセィに より確認した （図 2C)。 さらに T3 BPと TRAF 3は、 両方のタンパク質を共 発現する細胞中に共局在していた （図 5B)。 T3BPは、 TRAFファミリーの 中で TRAF 3と優先的に相互作用した。 最近の報告によれば、 TRAFフアミ リーの唯一の因子と特異的に相互作用する T R A F結合タンパク質が明らかにな つた [Gamper, C. , 他、（2000) Mo 1. Immunol. 37, 73-84; Ling, L. , 他、（2000) J. Biol. Chem. 275, 23852 - 23860; 及 ぴ Ling， L. , 他 、 （2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 9567-9572]。 M I P— T 3は TRAF 3特異的 TR AF結合タンパク質として同定され、 そして MI P— T 3が微小管に結合し TR AF 3を微小管に集めることによって、 TRAF 3が微小管に結合する（Ling, L. , 他、（2000) J. Biol. Chem. 275, 23852-23860) 0 ヌクレオポリンもまた T RAF 3 特異的 T R A F結合タンパク質として同定された （Gamper, C.， 他、（2000) Mol. Immunol. 37， 73-84)。 T R A Fは特にシグナル伝達カスケードにおいて過剰 にまたは特異的に働くと考えられるので、 T RA Fフアミリーの単一の因子に特 異的な T R A F結合タンパク質の同定および解析は個々の T R A Fタンパク質の 役割の多様性から見て重要である。
T 3 B Pは、 1 7番目の因子として T N F Rスーパーフアミリ一に属するヒト B CMAに対して有意な配列類似性を有する [Madry C. ,他、（2000) Int. Immunol. 10, 1693 1702]。興味深いことに、 T 3 B Pの発現は、 B CMAの場合と同様に B 細胞系統の特定の段階に限定され [Laabi, Y.，他、（1992) EMBO J. 11, 3897-3904； 及ぴ Laabi, Y. , 他、（1994) Nucleic Acid Res. 22, 1147-1154]、 細胞表面に分 布する可能性がある （図 1 Bおよび図 5 B )。 これ以外にも、 T 3 B P遺伝子がマ ウス白血病おょぴリンパ腫におけるマウス白血病レトロウイルスの挿入によって 破壊されることが報告されている [Hansen, G. M. , 他、（2000) Genome Res. 10, 237 - 43]。以上から、 T 3 B Pは B細胞分化において細胞表面受容体として重要な 役割を果たしていると考えられる。 し力 し、 T 3 B Pは推定細胞外領域にシステ インリツチ領域をもたないため J®瘍壌死因子受容体スーパーフアミリーには属さ ない。
本発明によって明らかとなった新規 T R A F 3結合蛋白質は、 最近報告された B A F F [T N Fフアミリーの B細胞活性化因子： B cell activation factor from the TNF family (BAFF) ]の特異的な受容体 [Thompson,. J. S. ,他、 （2001) Science 293, 2108-2111] と一致した。 B A F Fは B細胞の増殖に関係し [Schneider, Ρ· , 他、 （1999) J. Exp. Med. 189, 1747-1756] , B A F Fを高発現させたマウスは成 熟 B細胞の過形成や全身性エリテマトーデス （systemic lupus erythematosus) の症状を呈することから、 自己反応性 B細胞の増殖による自己免疫疾患への関連 が示唆されている [Mackay, F.，他、 (1999) J. Exp. Med. 190， 1697-1710, Batten, M.， 他、 J. Exp. Med. (2000) 192, 1453-1466]。 従って、 8 を介した8細 胞増殖の細胞内情報伝達系に対し T R A F 3は重要な機能を有しているものと推 . 定され、 BAFFと TRAF 3結合性 B細胞特異受容体との相互作用の調節のみ ならず、 T R A F 3結合性 B細胞特異受容体と T R A F 3間の相互作用の調節に よる自己免疫疾患に対する治療薬の開発が期待される。 産業上の利用可能性
本発明により、 TR AF 3に結合する新規なシグナル伝達分子が同定された。 . また、 本発明により TRAF 3に結合するシグナル伝達分子をコードする遺伝子 がクローニングされた。 本発明で同定された新規タンパク質を利用することによ り新規な医薬を開発したり、 疾患の診断方法を提供することが可能になる。

Claims

請 求 の '範 囲
1. 下記の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質。
( a ) 配列番号 1に記載のァミノ酸配列；
( b ) 配列番号 1に記載のァミノ酸配列において 1から数個のァミノ酸が欠失、 置換及び Zまたは挿入したアミノ酸配列であって、 TRAF 3に対する結合活性 を有するアミノ酸配列；または、
(c) 配列番号 1に記載のアミノ酸配列と 60%以上の相同性を有するアミノ酸 配列であって、 T R A F 3に対する結合活†生を有するァミノ酸配列：
2. 請求項 1に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
3. 下記の何れかの塩基配列を有する遺伝子。
(a) 配列番号 2に記載の塩基配列；
(b)配列番号 2に記載の塩基配列において 1から数個の塩基が欠失、付加または 置換されている塩基配列であって、 TRAF 3に対する結合活性を有するタンパ ク質をコードする塩基配列；または
( c )配列番号 2に記載の塩基配列とストリンジヱントな条件下でハイブリダイズ する塩基配列であって、 TRAF 3に対する結合活性を有するタンパク質をコー ドする塩基配列：
4. 請求項 2または 3に記載の遺伝子を含むベクター。
5. 請求項 2または 3に記載の遺伝子または請求項 4に記載のベクターを有す る形質転換体。
6. 請求項 5に記載の形質転換体を用いることを特徴とする、 TRAF 3に対 する結合活性を有するタンパク質の製造方法。
7. 請求項 1に記載のタンパク質を認識する抗体。
8. 請求項 1に記載のタンパク質、 若しくは TRAF 3、 または請求項 7に記 載の抗体を用いて、 該タンパク質または抗体の機能を促進または抑制する物質を スクリーニングする方法。
9. 前記タンパク質が配列番号 1に記載のアミノ酸配列の 151番目から 1 7 5番目までのアミノ酸配列を少なくとも含む、 請求項 8に記載の方法。
10. 前記 TRAF 3が TRAF— Cドメインに相当する配列番号 1に記載の ァミノ酸配列の 414番目から 567番目までのァミノ酸配列を少なくとも含む、 請求項 8に記載の方法。
1 1. 請求項 1に記載のタンパク質、 若しくは TRAF 3、 または請求項 7に 記載の抗体の機能を促進または抑制する物質が、 TRAF 3を介した細胞内シグ ナル伝達を促進または抑制する物質である、 請求項 8ないし 10のいずれか 1項 に記載の方法。
1 2. 請求項 8ないし 1 1のいずれか 1項に記載の方法により得られる、 請求 項 1に記載のタンパク質の機能を促進または抑制する物質。
13. 請求項 12に記載の物質を有効成分として含む医薬。
14. TRAF 3を介する細胞内シグナル伝達の異常に関連する疾患の予防ま たは治療のために使用する、 請求項 13に記載の医薬。
1 5. 生体由来成分における請求項 1に記載のタンパク質のレベルを測定する ことを含む、 TRAF 3を介する細胞内シグナル伝達の異常に関連する疾患の診 断方法。
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