WO2002072878A2

WO2002072878A2 - Verfahren zur fälschungssicheren markierung; fälschungssichere markierung und kit

Info

Publication number: WO2002072878A2
Application number: PCT/EP2002/001058
Authority: WO
Inventors: Georg Bauer; André JOSTEN; Harald Walter; Jörg HASSMANN
Original assignee: November AG Novus Medicatus Bertling Gesellschaft fuer Molekular Medizin
Current assignee: November AG Novus Medicatus Bertling Gesellschaft fuer Molekular Medizin
Priority date: 2001-02-05
Filing date: 2002-02-01
Publication date: 2002-09-19
Anticipated expiration: 2003-08-05
Also published as: DE10105339B4; JP3735607B2; WO2002072878A3; US20030190407A1; DE50213900D1; AU2002244695A1; JP2004521342A; DE10105339A1; EP1358484A2; EP1358484B1; ATE445162T1

Abstract

ZusammenfassungDie Erfindung betrifft eine fälschungssichere Markierung mit einer einen kommunizierenden Porenraum aufweisenden Trägerschicht (1, 1a, 1b) und einer darin aufgenommenen aus einem ersten Biomolekülgebildeten Sonde. Um eine schnelle und zuverlässige Identifizierung der Markierung vor Ort zu er-möglichen ist erfindungsgemäss vorgesehen, dass die Trägerschicht (1, 1a, 1b) eine erste die Sonde ent-haltende Markierungsfläche (6) und eine zweite die Sonde nicht enthaltende Referenzfläche (7) aufweist.

Description

Verfahren zur fälschungssicheren Markierung, fälschungssichere Markierung und Kit

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fälschungssicheren Markierung, eine fälschungssichere Markierung nach dem Oberbegriff des Anspruchs 19 und einen Kit mit einer fälschungs- sicheren Markierung.

Die Erfindung betrifft insbesondere den Sicherheits-, Kodie- rungs- und Identifikationsbereich.

Aus der DE 197 38 816 AI ist es bekannt, an einen Feststoff zur Markierung gebundene Nukleinsäuren zu verwenden. Zur De- tektion müssen die Nukleinsäuren allerdings vom Feststoff durch ein Extraktionsverfahren entfernt werden. Die in Lösung vorliegenden Nukleinsäuren müssen dann mittels einer spezifischen Reaktion, wie der PCR, vervielf ltigt werden. In nachfolgenden Schritten wird die vervielfältigte Nukleinsäurese- quenz analysiert. Das Verfahren ist zeit- und arbeitsaufwen- dig und nicht für einen Nachweis der Echtheit vor Ort geeignet. Zudem ist eine Extraktion der zur Markierung aufgebrachten Nukleinsäuren nicht bei jedem Feststoff möglich oder erwünscht .

Ein weiteres Verfahren zum Identifizieren einer an einem

Festkörper vorgesehenen Markierung ist aus der DE 198 11 730 AI bekannt. Die Markierung weist als Sonde eine an eine feste Phase gebundene Nukleotidsequenz auf. Die Nukleotidsequenz wird mit einer korrespondierenden Nukleotidsequenz in Kontakt gebracht, die an eine weitere feste Phase eines Detektions- mittels gebunden ist. Dieses Verfahren ist nur für plane Oberflächen, die einen engen Kontakt von Markierungs- und De- tektionsseite ermöglichen, geeignet. Das Binden der Sonde und des Detektionsmittels an feste Phasen ist aufwendig. Die an den festen Phasen gebundenen Markierungs- und Detektionsmole-

BESTATIGUNGSKOPIE küle sind gegen mechanische Beanspruchung instabil und gegenüber Verschmutzung anfällig, was eine geringe Stabilität der Markierung in sich birgt.

Aus der gattungsbildenden US 5,139,812 ist es bekannt, eine vorgegebene Nukleinsäure enthaltende Tinte zur f lschungssicheren Markierung von Gegenständen zu verwenden. Die Markierung ist an einer geheimen Stelle eines wertvollen Gegenstandes aufgebracht. Um eine Mehrzahl von Gegenständen unter- scheidbar zu markieren, werden mit der Tinte unterschiedliche Beschriftungen aufgebracht. Die Identifikation einer solchermaßen aufgebrachten Markierung erfolgt durch Bindung einer weiteren Nukleinsäure an die vorgegebene Nukleinsäure, und durch Identifikation der Bindung. Dazu muß die Markierung vom Gegenstand entfernt und mittels eines mehrstufigen Verfahrens, z.B. mittels Antikörper oder durch die Identifizierung einer radioaktiven Markierung, nachgewiesen werden. Die Identifikation der Markierung ist aufwendig. Sie kann nicht vor Ort durchgeführt werden. Ein ähnliches Verfahren ist auch aus der WO 87/06383 bekannt.

Die EP 0 745 690 A2 beschreibt sogenannte "molecular beacons" und deren Anwendung für die Hybridisierung. Eine Verwendung zur Detektion von Markierungen ist aus diesem Dokument nicht bekannt .

Die US 5,866,336 beschreibt mit einem Fluorophor markierte Primer. Die Primer werden mittels der Polymerase-Kettenreak- tion amplifiziert . Im hybridisierten Zustand wird eine Rück- faltung der Primer aufgelöst. Das Fluoreszenzverhalten des am

Primer vorgesehenen Fluorophors ändert sich damit. Das bekannte Verfahren ist für eine schnelle Identifikation einer Markierung ungeeignet, weil es die kosten- und zeitaufwendige Polymerase-Kettenreaktion erfordert . Die DE 199 01 761 offenbart ein Verfahren zum Nachweis der Hybridisierung von DNA mittels Änderung eines Redox^potentials. Eine solche Änderung des Redox-Potentials ist nicht ohne weiteres zu erfassen. Das bekannte Verfahren er- laubt ebenfalls keine schnelle und einfache Identifikation einer Markierung.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Nachteile nach dem Stand der Technik zu beseitigen. Insbesondere sollen ein Verfahren und eine fälschungssichere Markierung angegeben werden, die eine einfache und schnelle Identifizierung der Markierung vor Ort erlaubt.

Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1, 19 und 33 gelöst. Die Ansprüche 2 bis 18, 20 bis 32 und 34 bis 37 geben weitere vorteilhafte Merkmale an.

Nach Maßgabe der Erfindung ist ein Verfahren zur Identifizierung einer auf einem Gegenstand vorgesehenen fälschungssiche- ren Markierung vorgesehen, welche eine einen kommunizierenden

Porenraum aufweisende Trägerschicht mit einer darin aufgenommenen aus ersten Biomolekülen gebildeten Sonde aufweist, wobei die Trägerschicht eine erste die Sonde enthaltende Markierungsfläche und eine zweite die Sonde nicht enthaltende Referenzfläche aufweist mit folgenden Schritten:

aa) Imprägnieren der Trägerschicht mit einem Identifizierungsmittel, welches zumindest abschnittsweise zu den ersten Biomolekülen komplementär ausgebildete zweite Biomoleküle enthält und

bb) Identifizieren einer in der Trägerschicht zwischen den ersten und den zweiten Biomolekülen auftretenden Reaktion, wobei die Markierungsfläche beobachtet und ein davon ausgehendes Fluoreszenzsignal ausgewertet wird, und wo- ω ω IS t μ>

LΠ o cπ o LΠ O (Jl

P-. ^ α IQ rr P- Hi N d P- Φ 3 S α_ Ω •xl fo W H S S α

Φ M μ- Φ d PJ Φ d P Φ μ- Φ PJ 0 0" M φ μ- 0 PJ PJ PJ

3 d φ P P < ri ri Di P P H- i Φ d Hi φ Di H ri CQ

0 ^• IQ 0 Φ φ 0 ? ;v 0 Φ ti Φ ? ?

Φ ü ω P a H J d P μ- PJ Φ ti ri d 3 μ- μ- <J

Φ Φ ? N d P N φ 0 ri φ Φ P Φ Φ o Di tr ω CD o PJ PJ Hi Φ CQ ω d H 0 3 CQ 0 CQ Di i i i d Φ rr N tr P d M P CQ Φ d o N N CQ μ- d d CQ ti μ-

Φ Φ PJ P 01 PJ= rr Φ i CQ < 0 3 CQ Φ Hi Hi φ 0 0 Φ Ω

P P Ω CQ Ω μ- £ PJ rr Φ CQ μ- M 0 M M CQ CQ 03 ^J φ

N 0^J PJ Φ tr Hi Φ P J M rr μ- N PJ= PJ= • Ω CQ μ- d CQ rr d tr^* Φ μ- ri P P CQ Φ Ω 03 Ω Ω ti d 0^J Φ 0

P μ- d rr Φ N rr Di rr ti 0^J 0' μ- tr 0^J PJ= 0 M Hl Φ

D> CQ P 0 0 tr μ- Φ D. rr Φ Hi 0 rr CQ Φ Φ CQ Di PJ d=

P IQ 3 D. Φ Φ rr PJ Φ - 0 0' 0 Φ CQ 0^J « J PJ Φ 0 ri CQ μ- Φ M Φ Φ PJ PJ d ti Φ φ ti 0

Φ M Φ rr P tr d ≤ M 0 CQ ti μ- M d 0 03 μ- 0 et 0

3 CQ μ- μ- J P Φ Di • Φ 0 03 Hi Di Ω 0 φ rr

P CQ '^•ή Ω CQ H PJ Di 0 N φ « P^J Φ £ ti

N Φ Φ Ω M t Di <J Φ o d 3 φ Φ μ- < μ- 0

£, ri Cß tr 0 rr £ Φ 0 CQ 0 <! > 0= μ- μ- Ω 03 φ ti M

Φ 3 d Φ φ P P Hi α Φ d CQ 03 0 ^J Ω ti Di M

H- 0= < 3 H rr i N Φ Φ ü CQ M rr φ rr ^J Hi • Φ rt CQ 0 μ- Φ D. J d H Ü M 03 μ- 0 PJ

Φ M P rr ω d Φ d 0 PJ= PJ Ω Di φ Φ " D.

P H- N 0 P CQ 3 tu CQ CQ ^* μ- μ- μ- M M d

Ω Φ Φ CQ ⁾ Φ Φ 03 φ . Q φ 0 M Φ ri ω ^* Φ μ- P - φ ri CQ Q μ- rr φ Φ 0 Ω

H- rr ti P N μ- μ- tr ? ri CQ d= ö N 0^J

0 Φ 01 0 Φ Φ μ- CQ μ- ^ tr μ- φ 3 i d Φ

3 Φ s 3 μ- CQ P φ μ- Hι φ Φ φ μ- φ μ- 0 ti ω _^

0 μ- PJ cQ tr S i i Ω Hi μ- ri 0 μ- φ Di M φ

M P 4 CQ P Φ J Φ φ 0" rr ω φ rr PJ O φ Φ ;v φ PJ CQ i 0 = Di Φ Φ φ Φ d tr

*^* μ- φ M 0 ? rrl Di tr tö Φ Φ 0 « ti μ- tr PJ d= α φ μ- φ P μ- M Φ Φ φ μ- 0 tr 0 cn 03 0 rr Ω

M Φ H CQ & Φ d 0 μ- Hl 0 PJ 0 0 rr Hl " rr d 0 ⁾ φ H 0 Φ Φ tu Ω rr 0 Φ JU Φ rr

PJ Φ P φ d "i d i O Di i μ- 0^J Di Ω μ- d d IQ rr m Φ P Φ Φ Φ Φ H 0 er 0 Φ co tr 0 0 l-tι rr 01 Φ CQ IQ CQ CQ ri 0 Di rr d M 0 Φ Φ CQ rr μ- Hi P Φ C-. CQ N Φ N Φ Φ 0 M 0 0 ti 0 M 3 μ- Hi Φ 0 ] Hi 0 ri CQ Φ μ- Di H Hi Di

Φ Hl PJ= K φ φ M Hi CQ ri M rr CQ Ω Φ Di PJ= Φ rr Ω PJ w PJ= tsi rr PJ: PJ= μ- ri i i ^J φ M Hi

Φ Φ !-r 0 rr ü Ω ω PJ CQ Ω Hi d Φ Φ rr Φ 0 03

P μ- φ Φ μ- μ- 0 Φ ^* μ- 0 H CQ 0 rr Ω fö

P CQ rr Hi Φ iQ Di •i Φ N Di φ rr μ- 0^{^} Φ

Φ Φ PJ φ Hi P Φ CQ = μ- Pd CQ 0 tr Hi d Hl

P ι-i d ü Φ d P> CQ Ω φ Di Φ Φ rr P⁾ μ- 0 Φ ω PJ: ü i P M p- μ- r Φ Hl 3 0^J M N CQ H

CQ N CQ et μ- Φ i CQ μ- CQ d ü Φ Φ PJ rr μ- CQ φ

TJ s; Φ φ 0 CQ φ Ω rr P H 03 M Φ φ CQ 0 φ μ- fT Φ N Di Φ M tr CQ s Φ 03 rr 0 ü μ- N

N ω φ "i > μ- 3 tr rr ⁾ φ 0 Φ Φ Di d Ω Hi μ- Ω P Hi d φ φ ω M Di 03 N 0 0 Φ 0 0^{^} M l-h t Q, 0 CQ Φ CQ rr d M φ 03 Hi Φ D. CQ φ PJ=

H- Φ φ M 3 ii ja CQ 3 CQ ri d M P Φ 3 i Ω

0 P ' Φ φ Φ Φ 0 PJ= PJ D. Φ P^J

H 1 P CQ ri Φ Φ

1 ti

> DO DO (-> o LΠ O cπ o LΠ

i 2 to Φ CQ

Φ PJ Φ μ- Ω

0 Hi J 0 tr

• t CQ Φ Φ μ- Φ CQ φ 0 to

H N 21 Φ d μ- J PJ

0 φ CQ tr

CQ 0 Ω rt tr μ-

<! CQ 0

Φ Cd Ω 0

Hi 03 tr

£ Hj μ-

Φ μ- μ- 0

0 03 rt

Di rt rt Φ

Φ Φ μ- rt μ- 03 0

Φ 0 Φ

0 03 0 ti tr Di

Φ Φ Φ CQ ri 03 Hi rt

03 0 d rt Hi

Φ Di Φ Φ

0 Φ CQ •*

Hi ω φ tu μ- LΠ μ- μ- 0

0 0 0 03

3 μ- ISl tr o Ω d Φ

M 0" Hl 03

Φ rt d= o t CQ 0 d= Φ φ Di

M Hi 0 Φ

Φ Hi 03 ri

0 Φ

<! ti €

0 D. φ d

0 Φ μ- ti rt rt

Di M Φ Φ

Φ μ- Hj Hj

Hi Ω Φ

_0f Hi S!

H_ Φ ti Ω CQ

PJ= D. tr M

CQ μ- Φ PJ

Φ φ 3 03 ti μ- 03

1 ISl CQ d d Ω 0 ti tr CQ

Φ

Hj

Die Trägerschicht wird zweckmäßigerweise aus einem der folgenden Materialien hergestellt: Zellulose, Nitrozellulose, Nylon, Polyacrylamidgel , poröses Si02, Glasfaserflies.

Die Markierungsfläche kann mit einem die Sonde enthaltenden Gemisch unterschiedlicher Biomoleküle versehen sein. Das erhöht die Fälschungssicherheit der Markierung. Potentiellen Fälschern ist nicht bekannt, welches der in der Trägerschich

t aufgenommenen Biomoleküle als Markierung benutzt wird. Außer- dem lassen sich die Biomoleküle kaum analysieren bzw. identifizieren.

Die Sonde ist zweckmäßigerweise aus einem der folgenden Biopolymere gebildet: synthetische einzelsträngige Nukleinsäuren oder deren natürliche und/oder synthetische Analoga, Antige-

ne, Proteine, wie Antikörper, Antikδrperfragmente, Derivate von Antikörpern oder Antikörperfragmenten, Nukleinsäure- bindende Proteine, Rezeptoren, Liganden. Auch ähnlich wirkende Biomoleküle können selbstverständlich zur Herstellung der Sonde benutzt werden.

Nach einer weiteren Ausgestaltung kann die Sonde in einer

vorgegebenen geometrischen Anordnung auf der Trägerschicht aufgebracht werden. Sie kann mittels eines Druckverfahrens,

> DO _o H H o o O cn

03 3 T ≥i H N Hl 12! 2 £ Hj tr Hl 2 μ- M 03 Di φ 03 £ . Φ CQ CQ tr D_ α rt μ- rt φ J PJ d μ- PJ PJ φ d PJ φ PJ D. PJ= 0 μ. ti μ- J μ- Φ Φ Φ μ- PJ Φ 03 μ- 0 0 Ω Φ t 0 Ω Hj M 0 0 Hj Hi Φ CQ M Φ Q Ω Ω 0 0 Φ Φ CQ M rt

H) 0 tr 0 i 0- tr Ω CQ Di 0 pr 0 03 Ω rt - tr φ 0 μ- 03 • rt 03 rt CQ d μ- 0- φ Φ μ- rt μ- 0^{^} CQ Φ φ 3 3 CQ £ J Hi

PJ Φ i Φ μ- 0 0 £ Φ Φ £ M 0 φ μ- CQ Φ 0 Hj £ 3 0 Φ d Di tr α ti μ- PJ μ- Hi 0 CQ Φ ti μ- 0 Hi Hi pr 0 Di φ φ CQ Φ φ Hj Hi φ PJ μ- rt 0 03 0 μ- i 03 μ- d 03 H d d μ- Φ 2 Di μ- 0 μ- rt 0 rt Di 0 0 Φ μ- φ N Φ CQ rt 0 μ- Di 0 0 N μ- PJ Φ Φ rt μ- Φ Φ Di rt 0 Q H ti μ- Φ Φ LQ 0 21 Di CQ μ- rt H 2 φ Hι CQ 0 Φ μ- ?.

Φ α Φ pr 3 t 0 PJ φ φ pr 0 CQ PJ Hj rt Φ < Hj Hi J o

0 μ- Φ tr Hj o PJ= φ INI CQ d LQ 3 N Hj <; μ- μ- o Hj φ μ- o μ- d 0 φ 0 φ d Hi W t d φ Hi φ μ- d rt 0 φ Ω 0 pr Hi O 0 Hj H μ] N Ω rt t rt CQ P Hi φ et 3 0 rt Hj ti ri P' Di μ- Di CQ 0 Hj μ- ^* H J ^ μ- 0 CQ Φ 0 2 Hj PJ= Di rr £ d rt Φ φ 2 φ Φ PJ= φ o

M PJ ti 0 03 03 J Φ CΛ> μ- Di Φ H Φ O 0 Hi PJ H ö CQ Di LQ Hj D. M rt Ti μ- Di 3 . Hi ΪA> Hi φ φ M i Hi Hi CQ Φ Φ d tΛ PJ Φ φ Φ d d M

Φ μ- N Φ μ- 0 PJ= Q Hi PJ Hi 03 Φ Di rt 0 0 0 CQ Φ 03 tr ti Hj 0 r Φ

Hj M μ- Hi rt 0 M PJ Φ d < 0 Φ pr rt rt CQ PJ μ- Φ 03 CQ Ω d M Φ 03 rt Di 03 tr 0 Ω 0 <! PJ t 0 3 PJ ¹ tr σ 0 H 0 P - Ω CQ tr Di

0 PJ ti Φ μ- Ω Φ 0^* Hi 0 d μ- μ- 0 PJ PJ < Φ Φ Di Φ PJ tr 3 φ Q ti d < M φ tr PJ Hj Hi Hi rt 0 M M 0 Hj φ . μ- μ- Φ Hi φ 0 0 Hj d i Hi 0 et £ μ- Cd et et r Hj D. 0 2 μ- Ω rt μ-

PJ CQ Hj φ 0 Φ d= CQ φ φ t i 03 Φ Φ Φ Φ CQ Φ fϋ rt Φ M tr rt 0 < d pr 03 rt 0 0 CQ ti Hj Φ μ- 0 μ- M μ- 0 0 Φ Hi μ- μ- 0 M t Φ φ Φ

Hl J 3 Φ Hj Di 03 CQ M D. φ μ- 03 Di Di 03 >d Hi CQ PJ M ti Q 0 μ- μ- CQ Φ CQ Cd Di PJ tr μ- Hj 03 Hi Φ Φ Φ Cd Φ μ- Φ Hj PJ C tr φ 0 r M φ 03 μ- ti μ- 0 PJ CQ d rt Hi PJ tr Hj rt tsl φ d pr φ M

0 rt tr CQ Ω Hi φ CQ Hi φ 0 M Ω td 2 Φ Hl rt μ- Di 03 PJ μ- Φ

0 N Φ J Φ N tr μ- Φ rt Hj CQ d 0^{^} Φ J 0 μ- Φ φ Φ pr LQ 0 rt μ-

3 . M Hi - £ φ 0 tr 0 φ μ- 0 * Hl H "- 0 ti 03 PJ φ 0 Hl rt oo

3 tu rt Φ φ ti Di Φ Φ 0 0 <! Ω ti φ pr i J d 0 tr PJ= d

Φ μ- Φ 0 μ- φ d PJ 0 PJ o tr Φ 03 ti μ- Di d d 0 H 0 μ- 3 0" 0

0 0 0 rt 0 0 L ) 3 et CQ Ω Φ Φ PJ 0 Hi LQ D. M μ- μ- CQ

£ Φ LQ 03 > d Ω N tr 0 Hj tr⁾ CQ CQ 03 Φ J Di rt CQ

03 μ- Φ 03 2 τ> d 03 0- 3 Φ φ 0 ISl d φ 3 0 d Φ rt PT D.

Φ φ μ- d PJ μ- ri CQ CQ Φ PJ Hi 0 Φ Hi 0 Di μ- 0 μ- rt Ω rt Φ φ Φ μ- 0 CQ tu Hi 03 d Hi φ 3 Hi Hi ISl M M CQ μ- 03 G rt μ- 0^{^} Φ M μ- 03

0 φ Φ CQ μ- pr r Ω d= CQ μ- pr 0 o M PJ= 03 Φ rt 3 rt Hi 03 rt μ- Hj Φ 0 μ- 0- ^{^} rt 03 μ- ti Ό Ω Hi 3 Φ μ- Φ 03 H

0 CQ 3 Φ Φ rt Hi PJ Ω Φ D- et d M μ. tr Φ M N μ- d Φ 3 D. φ f . rt 0 Hi μ- Φ d M 0- Hj Φ μ- 0 Φ f_: Hi φ 0 μ- 0 Hl μ- Φ Φ J PJ M d 0 0 rt Φ rt ti 03 Di Ω PJ= μ- pr φ Hl rt 0 CQ 0

2 . M Φ 0 Hi CQ d Hi Φ M Ω PJ 0 CQ 03 PJ Hj PJ Hj φ 03 rt μ- μ- rt pr CQ t^ PJ= φ 0 0 μ- 0- 3 d Φ φ φ Φ 0 d Ω ⁾ Hj d μ- φ M d d= μ- M 0 CQ 2 Ω φ μ- Hi Hj μ- μ- 0 0 tr LQ 0 Hi

0 M 0 M d rt 03 Φ φ Ω tr ti rt £ d 03 0 0 CQ Φ Hl ^ CQ μ- φ PJ CQ 0 Ω < 0 rt Φ Φ 0 Ω Φ PJ 03 M PJ N ti Φ α 3 tr φ tr CQ 2 tr μ- Di tr t tr 3 2! PJ= Ti φ μ- μ- φ Di 0 μ- d Hj Di 0 Φ φ φ 0 03 μ- Φ μ- φ Ω μ- Hi Φ

0 Φ rt φ r 0 £ Φ Di 0 μ- rt tr rt Φ Ω Hi ti rt μ- tr M Hi H J 03 0- μ- LQ μ- Hj Φ 03 p tr . μ- tr PJ= et ra Φ M o d φ d PJ 0 Φ 03 φ 0 rt φ 0 Hi 0 rt M PJ φ φ PJ M 0 μ- Hi M Φ μ- 03 03 2 PJ Di 1 Φ 03 d M PJ Hj CQ CQ

0 CQ μ- rt Hj 0 μ- φ PJ ISl 0 03 φ ISl PJ Ω Ω 03 φ d Φ Φ CQ φ φ rt Φ φ Ω 0 Hj d Di 0 0 d Cd ISl 0 tr tr μ- Hi 0 3 ti 0 03 0 Φ i 0- pr M <! μ- £ d PJ 0 LQ PJ • μ-

0 Di μ- Φ μ- tr Φ Ω φ 0 Φ Φ 0 μ- d φ Φ d rt

3 Φ 0 φ Hj φ Φ 0 tr H φ μ- μ- CQ 0 Hi CQ Hl 1

1 03 H Φ 1 1 rt Φ 1 rt 0 03 1 Φ

1 1 Φ φ 1 1

Nachfolgend werden Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:

Fig. la eine Draufsicht auf eine zweite fälschungssi- chere Markierung,

Fig. lb eine Querschnittsansicht nach Fig. la,

Fig. 2a eine Draufsicht auf eine zweite fälschungssi- chere Markierung,

Fig. 2b eine Querschnittsansicht nach Fig. 2a,

Fig. 3 eine Draufsicht auf eine dritte fälschungssi- chere Markierung,

Fig. 4 die Signalstärke in Abhängigkeit unterschiedlicher DNA-Sequenzen,

Fig. 5 die Reproduzierbarkeit des Fluoreszenzsignals,

Fig. 6 die Reproduzierbarkeit der in den Träger eingebrachten Menge an Identifizierungsmittel,

Fig. 7 eine schematische Querschnittsansicht einer fälschungssicheren Markierung sowie eines Identifizierungsmittels und

Fig. 8a - d den Verfahrensablauf in schematischen Quer- Schnittsansichten.

In den in Fig. la bis 3 sind verschiedene Ausführungsformen fälschungssicherer Markierungen gezeigt. Die fälschungssicheren Markierungen sind dabei jeweils nach Art eines Etiketts ausgeführt. ω DO K) μ¹ μ>

LJ1 o o o

der zweiten Kreisfläche eine kreisrunde Ausnehmung 4 auf, welche die Auftragflache 5 bildet. Im vorliegenden Beispiel enthält lediglich die Markierungsfläche 6 das erste Biomolekül . Die Auftragflache 5 und die Referenzfläche 7 enthalten nicht das erste Biomolekül. Im vorliegenden Ausführungsbeispiel sind die Markierungsfläche 6 und die Referenzfläche 7 vollflächig abgedeckt mit der Schutzschicht 3. Darin zur Identifizierung bzw. zur Referenz enthaltende Biomoleküle sind besonders gut geschützt. - Beim Aufbringen eines flüssi- gen Identifizierungsmittels auf die Auftragflache 5 wird dieses mittels Kapillarkräften sowohl in die Markierungsfläche 6 als auch in die Referenzfläche 7 gesaugt. Es kommt dort ggf. zur Reaktion des ersten Biomoleküls mit einem im Identifizierungsmittel enthaltenen dazu korrespondierenden zweiten Bio- molekül, welches z.B. als molecular beacon ausgebildet sein kann. Bei der Reaktion auftretendes Fluoreszenzlicht wird durch die transparente Schutzschicht 3 ausgekoppelt und kann als Identifizierungssignal beobachtet werden.

Bei der in den Fig. 2a und b gezeigten zweiten fälschungssicheren Markierung steht eine erste Auftragfläche 5a in Verbindung mit der Markierungsfläche 6. Eine zweite Auftragflache 5b steht in Verbindung mit der Referenzfläche 7. Die erste Auf ragflache 5a und die Markierungsfläche 6 sind Be- standteil einer ersten Trägerschicht la, die zweite Auftragfläche 5b und die damit verbundene Referenzfläche 7 sind Bestandteil einer zweiten Trägerschicht lb. Die erste Trägerschicht la und zweite Trägerschicht lb sind voneinander getrennt. Bei dieser Ausführungsform ist es möglich, die erste Auftragflache 5a und zweite Auf ragflache 5b mit unterschiedlichen Identifizierungssubstanzen zu beaufschlagen.

Fig. 3 zeigt eine Draufsicht einer dritten fälschungssicheren Markierung. Die Auftragflache 5 ist hier über erste Wege 8 mit einer Mehrzahl an Markierungsflächen verbunden. Sie ist ferner verbunden über zweite Wege 9 mit einer Mehrzahl an Referenzflächen 7. Ein auf die Auftragflache 5 aufgebrachtes flüssiges Identifizierungsmittel wird mittels Kapillarkräften über die ersten 8 und die zweiten Wege 9 zu den Markierungs- 6 und Referenzflächen 7 transportiert. Die Markierungs- 7 und Referenzflächen 8 sind jeweils vollflächig mit der Schutzschicht 3 überdeckt .

Fig. 4 zeigt im Vergleich die Stärke eines Fluoreszenzsi- gnals, welche auf der Y-Achse in mV angegeben ist. Dargestellt sind die Ergebnisses des Hintergrunds, einer Hybridisierung mit einem moleculare beacon, wobei entweder 6, 4, 2 oder 0 Basenfehlpaarungen entlang des hybridisierten Abschnitts auftreten. Bereits eine Fehlpaarung von 2 Basen ist mit dem vorliegenden Verfahren unterscheidbar. Eine Fehlpaarung von 4 Basen führt zu einem drastisch niedrigeren Signal . Das belegt die hohe Spezifität des erfindungsgemäßen Verfahrens .

In Fig. 5 ist die Signalintensität auf der Y-Achse in mV wiedergegeben. Geprüft worden ist hier die Reproduzierbarkeit eines Signals bei wiederholter Verwendung eines Identifikationsmittels mit ein und demselben molecular beacon. Es zeigt sich, daß das auftretende Signal eine Schwankung von 4,7% ge- genüber einem Mittelwert aufweist.

In Fig. 6 ist die Reproduzierbarkeit der Befüllung einer vorgegebenen Trägerschicht gezeigt. Auf der Y-Achse aufgetragen ist das in der Trägerschicht jeweils aufgenommene Volumen an Identifizierungsmittel. Der Befüllungsgrad ist gravimetrisch bestimmt worden. Er zeigt eine mittlere Abweichung von 7,2% gegenüber einem Mittelwert.

Fig. 7 zeigt eine schematische Querschnittsansicht eines Aus- führungsbeispiels des Verfahrens. Dabei ist ein flüssiges OJ ω O DO H

LΠ o LΠ O cπ O LΠ

Hj 0 Hj 3 0 <! H d Φ Φ μ- Φ 0 Di

0 Hj 0 rt Hj 0 Φ

CQ ISI rt 0

03 > Hi Φ 2 μ> rr

Hi 0 M M μ- μ-

M Hj PJ= φ ^■ Hi

PJ= Φ Ω Φ 0 M μ-

Ω CQ tr 0 φ N tr d Φ rt PJ μ-

Φ 0 ^{^} μ- d Φ

CQ -j PJ= 0 Hi Hj n CQ M CQ d

M Φ rt φ Φ 0 φ μ- μ- μ- 0 CQ

0 Ω 0 ESJ 0 0 03 rt tr CQ £ φ 3 3

0 et φ Φ 3 3 μ-

PJ >Q 03 Ω φ rr

M d PJ pr CQ 0 rt et Φ d 3 rt Φ

Φ M CQ PJ= μ- M

0 M rt tΛ Hi α

Φ Φ Φ μ- rt μ- μ-

0 CQ φ 0 μ> H φ CQ

Φ DO Di ti Φ ?=. Φ

Hj Φ £ 0^{^} PJ μ-

03 tr 0 φ PJ Ti 0 rt φ rt μ- M μ- Φ

Φ CQ μ- 03 rt M Hj ω

0 rt Hi Φ Φ M ti μ- 0 PJ « tu PJ N μ- Hi PJ μ- tr μ- 0 03 Φ Ti

0 M φ Φ μ-

3 rt Hj φ μ- M

0 • d μ- 0 o M

M 0 0 • PJ

Φ α Q φ tr ti pr μ- 03 Hj α PJ Φ d= φ 3 PJ 0

M μ- t i 03 0 μ>

Φ μ- rt O o rt 0 H N tr Φ N i μ-

^ D M Φ φ tu 0 tr Φ 0 0 •

Hj Hj £ rt rt Φ μ- μ- i μ- 0 μ-

Di 2 Hj PJ Hi J 0 μ- J Di rt μ- Ω φ

03 Hj μ- ISl tr Hj μ- pr 3 0 μ-

Φ μ- μ- 0 Φ 2

Hj φ rt ti Hj Φ φ 1 < d r 0

0 Φ 0 0 CQ μ- 0 CQ φ Φ

1 03 μ-

1 I

DO μ^>

LΠ o LΠ o LΠ tr α φ 03 pr 03 LQ tu Hj tu 3 J Φ μ- Ω μ- Ti Φ μ- Φ μ- μ-

Hj ti LQ tr φ Hj Hi o 0 0 rt

Φ Φ 0 M Hj d d= 3 D- 3

0 0 Φ PJ d Ω tr 0 0 μ- et CQ 0 tr ti M N M 0 tu H Φ Q rt Φ d Φ

PJ Di 03 0 • pr pr D.

0 φ μ- Φ < td d= Q_ d= Φ

Di 0 Ω 0 Q α M Φ M ri

CQ rt tr < 3 PJ Φ 0 Φ φ μ- Φ μ- 03 0 f

Hj Hi tr Hj 3 03 03 Φ Di

PJ= μ- Φ Hl PJ rt 3 μ- Hj Φ rt ISI Hj PJ Hj 0 0 03 £ 0 μ- <: tr pr tr M Di rt Φ rt

Φ φ 0 Hi μ- Φ Φ Φ M μ- ti Hj Hj Φ Φ μ- Ω ISl 0 Ω Hi

Hi d Hj 0 Hj d £ tr μ-

0 0 PJ rt M φ ω Φ N

M CQ CQ 03 Φ 21 PJ Ω μ- μ-

LQ Φ o 0 P ü pr o N φ

Φ pr 0 £ 03 3 d ü

0 PJ Di μ- Ω Ω tr PJ= o 3 d

• 0 φ Φ 0T Φ 0 M μ- 0

0 ISI CQ <! PJ μ- Φ 0 LQ d Φ 0 Ω CQ pr 03

3 Hj μ- 0 Hj 0 Φ d= Φ 03 μ- Φ 03 CQ 0 Hj M 03 d rt 2 rt J £ φ rt tr

PJ Hl PJ 0 pr Φ 0 CQ

Φ Hj PJ= 0 CQ J μ- PJ rt ^ μ- pr M Di 0 03 PJ tr PJ

0 μ- 03 0 0 Φ d 03 0

Φ φ Ω Φ 03 Ω N

3 ri tr ü Φ 3 J CQ tr d d Hi Hj μ- M Φ 0 H pr 0 o rt 03 tr μ- H

0 CQ CQ ti pr μ- rt

03 03 Di Φ Φ 3 M rt Φ rt < CQ Φ μ- μ- 0 Di 03 0

Φ 0 μ- ri 0 0 M Φ £ rt

0 0 Ω M φ Φ rr Φ tr

CQ tr μ- Cd 3 Ω μ- PJ d= 2 Φ Ω 0 d 03 CQ M

0 J Hi tr rt 3 M μ- Φ rt

03 03 Φ Hi H PJ 0 Φ rt 03 Φ tu Hj D- pr 0 μ- Φ 2 α Hj 1 0 Φ

CQ 0 PJ PJ 0 TI tr Hi 0

Ti Hi ra φ M Φ α Hi tr Hj tr 0 d PJ μ- Φ ISI φ 0 μ- < 0 Ω Φ 03 £

Hj Di φ 0 i ti 0 Ti Φ

03 d μ. Hj Φ 0 0 N o μ- rt pr d CQ Hj S £ 0 rt

Φ rt 0 φ tr PJ Φ Di Φ

M φ CQ 1 2 0 d μ- μ- 0

M 0 P⁾ ti CQ rt Φ 1 Hj 1 Φ 1 1

0

Bezugszeichenliste

1 TrägerSchicht

2 Träger

3 Schutzschicht

4 Ausnehmung

5 Auftragflache

6 Markierungsfläche

7 Referenzfläche

8 erster Weg

9 zweiter Weg

10 Kapillare

11 Identifizierungssubstanz

12 Anregungslichtquelle

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Identifizierung einer auf einem Gegenstand vorgesehenen f lschungssicheren Markierung, welche eine einen kommunizierenden Porenraum aufweisende Trägerschicht (1, la, lb) mit einer darin aufgenommenen aus ersten Biomolekülen gebildeten Sonde aufweist,

wobei die Trägerschicht (1, la, lb) eine erste die Sonde ent- haltende Markierungsfläche (6) und eine zweite die Sonde nicht enthaltende Referenzfläche (7) aufweist,

mit folgenden Schritten:

aa) Imprägnieren der Trägerschicht (1, la, lb) mit einem

Identifizierungsmittel (11) , welches zumindest abschnittsweise zu den ersten Biomolekülen komplementär ausgebildete zweite Biomoleküle enthält und

bb) Identifizieren einer in der Trägerschicht (1, la, lb) zwischen den ersten und den zweiten Biomolekülen auftretenden Reaktion,

wobei die Markierungsfläche (6) beobachtet und ein davon aus- gehendes Fluoreszenzsignal ausgewertet wird, und wobei eine Kontrolle durch Beobachtung der Referenzfläche durchgeführt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Trägerschicht (1, la, lb) beim Schritt lit. bb mit Licht einer vorgegebenen

Wellenlänge bestrahlt, und eine die spezifische Bindung des ersten mit dem zweiten Biomolekül anzeigende Fluoreszenzreaktion beobachtet wird.

3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Trägerschicht (1, la, lb) aus einem lichtdurchlässigen oder einem reflektierenden Material hergestellt ist.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Trägerschicht (1, la, lb) aus einem der folgenden Materialien hergestellt wird: Zellulose, Nitrozellulose, Nylon, Polyacrylamidgel, poröses Si02, Glasfaserflies.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Markierungsfläche mit einem die Sonde enthaltenden Gemisch unterschiedlicher Biomoleküle versehen ist.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Sonde aus einem der folgenden Biopolymere gebildet ist : synthetische einzelsträngige Nukleinsäuren oder deren natürliche und/oder synthetische Analoga, Antigene, Proteine, wie Antikörper, Antikörperfragmente, Derivate von Antikörpern oder Antikörperfragmenten, Nukleinsäure-bindende Proteine, Rezeptoren, Liganden.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Sonde in einer vorgegebenen geometrischen Anordnung auf die Trägerschicht (1, la, lb) aufgebracht wird.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Sonde mittels eines Druckverfahrens, vorzugsweise mittels eines Tintenstrahldruckkopfs, auf die Trägerschicht (1, la, lb) aufgetragen wird.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Trägerschicht (1, la, lb) eine erste Auftragflache (5a) aufweist, die mit der Markierungsfläche (6) oder einer Mehrzahl von Markierungsflächen über einen ersten Weg (8) oder erste Wege verbunden ist.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die erste Auftragflache (5a) mit der Referenzfläche (7) oder einer Mehrzahl an Referenzflächen über einen zweiten Weg (9) oder zweite Wege verbunden ist .

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei eine zweite und/oder weitere Auftragflachen (5, 5a, 5b) vorgesehen sind, welche mit einer oder mehreren Markierungs- (6) und/oder Referenzflächen (7) verbunden sind.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Identifizierungsmittel (11) entlang eines ersten und/oder zweiten Wegs mittels Kapillarkräften von der Auftragflache (5, 5a, 5b) zur Markierungs- (6) und/oder Referenzfläche (7) transportiert wird.

13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Trägerschicht (1, la, lb) zumindest abschnittsweise mit einer Schutzschicht (3) überdeckt ist.

14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Schutzschicht (3) transparent ausgebildet ist.

15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Trägerschicht (1, la, lb) mittels eines Klebstoffs oder durch Laminierung am zu markierenden Gegenstand befestigt wird.

16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Trägerschicht (1, la, lb) an ihrer befestigungsseitigen Oberfläche mit einer, vorzugsweise eine abziehbare Schutzfolie aufweisenden, Klebefolie versehen ist.

17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei dem Identifizierungsmittel (11) ein dessen Verbreitung in der Trägerschicht (1, la, lb) anzeigender Farbstoff zugesetzt wird.

18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Identifizierungsmittel (11) mittels einer Kapillare (10) eines Stifts oder einer Pipette auf die auf der Trägerschicht (1, la, lb) ausgebildete Auftragtlache (5, 5a, 5b) aufgegeben wird.

19. Fälschungssichere Markierung mit einer einen kommunizierenden Porenraum aufweisenden Trägerschicht (1, la, lb) und einer darin aufgenommenen aus einem ersten Biomolekül gebil- deten Sonde,

dadurch gekennzeichnet, daß

die Trägerschicht (1, la, lb) eine erste die Sonde enthalten- de Markierungsfläche (6) und eine zweite die Sonde nicht enthaltende Referenzfläche (7) aufweist.

20. Fälschungssichere Markierung nach Anspruch 19, wobei die Trägerschicht (1, la, lb) aus einem lichtdurchlässigen oder einem reflektierenden Material hergestellt ist.

21. Fälschungssichere Markierung nach einem der Ansprüche 19 oder 20, wobei die Trägerschicht (1, la, lb) aus einem der folgenden Materialien hergestellt ist: Zellulose, Nitrozellu- lose, Nylon, Polyacrylamidgel, poröses Si02, Glasfaserflies.

22. Fälschungssichere Markierung nach einem der Ansprüche 19 bis 21, wobei die Markierung aus einem die Sonde enthaltenden Gemisch unterschiedlicher Biomoleküle gebildet ist.

23. Fälschungssichere Markierung nach einem der Ansprüche 19 bis 22, wobei die Sonde aus einem der folgenden Biopolymere gebildet ist: synthetische einzelsträngige Nukleinsäuren oder deren natürliche und/oder synthetische Analoga, Antigene, Proteine, wie Antikörper, Antikδrperfragmente, Derivate von Antikörpern oder Antikörperfragmenten, Nukleinsäure-bindende Proteine, Rezeptoren, Liganden.

24. Fälschungssichere Markierung nach einem der Ansprüche 19 bis 23, wobei die Sonde in einer vorgegebenen geometrischen

Anordnung auf der Trägerschicht (1, la, lb) aufgebracht ist.

25. Fälschungssichere Markierung nach einem der Ansprüche 19 bis 24, wobei die Sonde mittels eines Druckverfahrens, vor- zugsweise mittels eines Tintenstrahldruckkopfs, auf die Trägerschicht (1, la, lb) aufgebracht ist.

26. Fälschungssichere Markierung nach einem der Ansprüche 19 bis 25, wobei die Trägerschicht (1, la, lb) eine erste Auf- tragflache (5a) aufweist, die mit der Markierungsfläche (6) oder einer Mehrzahl von Markierungsflächen über einen ersten Weg (8) oder erste Wege verbunden ist.

27. Fälschungssichere Markierung nach einem der Ansprüche 19 bis 26, wobei die erste Auftragflache (5a) mit der Referenzfläche (7) oder einer Mehrzahl an Referenzflächen über einen zweiten Weg (9) oder zweite Wege verbunden ist.

28. Fälschungssichere Markierung nach einem der Ansprüche 19 bis 27, wobei eine zweite und/oder weitere Auftragflachen (5,

5a, 5b) vorgesehen sind, welche mit einer oder mehreren Markierungs- (6) und/oder Referenzflächen (7) verbunden sind.

29. Fälschungssichere Markierung nach einem der Ansprüche 19 bis 28, wobei die Trägerschicht (1, la, lb) zumindest abschnittsweise mit einer Schutzschicht (3) überdeckt ist.

30. Fälschungssichere Markierung nach einem der Ansprüche 19 bis 29, wobei die Schutzschicht (3) transparent ausgebildet ist .

31. Fälschungssichere Markierung nach einem der Ansprüche 19 bis 30, wobei die Trägerschicht (1, la, lb) mittels eines

Klebstoffs oder einer Laminierung am zu markierenden Gegenstand befestigt ist .

32. Fälschungssichere Markierung nach einem der Ansprüche 19 bis 31, wobei die Trägerschicht (1, la, lb) an seiner befe- stigungsseitigen Oberfläche mit einer, vorzugsweise eine abziehbare Schutzfolie aufweisenden, Klebefolie versehen ist.

33. Kit mit einer fälschungssicheren Markierung nach einem der Ansprüche 19 bis 32 und einem zur Sonde korrespondierenden zweite Biomoleküle enthaltenden Identifizierungsmittel

(11) .

34. Kit nach Anspruch 33, wobei die Sonde aus einem der fol- genden Biopolymere gebildet ist: synthetische einzelsträngige

Nukleinsäuren oder deren natürliche und/oder synthetische Analoga, Antigene, Proteine, wie Antikörper, Antikörperfrag- mente, Derivate von Antikörpern oder Antikörperfragmenten, Nukleinsäure-bindende Proteine, Rezeptoren, Liganden.

35. Kit nach Anspruch 34 oder 35, wobei das Identifizierungsmittel ein zumindest abschnittsweise komplementär zum ersten Biopolymer ausgebildetes molecular beacon ist.

36. Kit nach einem der Ansprüche 33 bis 35, wobei das Identifizierungsmittel (11) in einer Kapillare (10) , einem Stift oder einer Pipette aufgenommen ist.

37. Kit nach einem der Ansprüche 33 bis 36, wobei dem Identifizierungsmittel (11) ein Farbstoff beigemischt ist.