WO2002077222A1 - Gene panel participating in liver regeneration - Google Patents

Gene panel participating in liver regeneration Download PDF

Info

Publication number
WO2002077222A1
WO2002077222A1 PCT/JP2002/002372 JP0202372W WO02077222A1 WO 2002077222 A1 WO2002077222 A1 WO 2002077222A1 JP 0202372 W JP0202372 W JP 0202372W WO 02077222 A1 WO02077222 A1 WO 02077222A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gene
expression
liver
genes
liver regeneration
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2002/002372
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Fumihiko Yokoya
Tomohisa Okutsu
Maiko Mori
Yoshiyuki Takahara
Hisao Fukuda
Hiroyuki Aburatani
Ichiro Sonaka
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ajinomoto Co Inc
Original Assignee
Ajinomoto Co Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ajinomoto Co Inc filed Critical Ajinomoto Co Inc
Priority to JP2002576665A priority Critical patent/JPWO2002077222A1/ja
Priority to US10/469,938 priority patent/US20060105329A1/en
Priority to EP02705141A priority patent/EP1375657A4/en
Publication of WO2002077222A1 publication Critical patent/WO2002077222A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
    • G01N33/5088—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of vertebrates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5091—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing the pathological state of an organism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a gene panel consisting of a group of genes whose expression level fluctuates during liver regeneration as compared to normal in liver cells, a method for preparing the same, and a method for preparing the gene panel. It is about usage. These inventions are useful in the fields of diagnosis, medicine and the like.
  • Background Art In partial hepatectomy for liver cancer treatment or partial resection liver transplantation for liver disease treatment, prompt regeneration of the remaining liver or transplanted liver is an important matter, but there are many cases where liver regeneration is poor.
  • Adult livers are often fatty livers, but fatty livers are often poorly regenerated, which can cause problems after partial hepatectomy.
  • liver regeneration is promoted in order to compensate for the damaged liver.However, if regeneration is delayed, it is thought that hepatitis will worsen, sometimes leading to fulminant hepatitis with a poor prognosis. It could be.
  • liver regeneration starts immediately after partial hepatectomy in rats and returns to the size of hepatocytes before resection in approximately one week. Liver regeneration is thought to be driven by the interaction of several related genes, but the full picture of what genes work at what timing during the liver regeneration process is not known. Since a large number of genes are considered to be involved in liver regeneration, it is important to examine a number of important genes that play a role in liver regeneration in order to obtain an overall picture of liver regeneration. However, attempts have been made to reproduce liver regeneration in culture systems that combine genes and proteins that are thought to be involved in liver regeneration. Absent. In addition, there was a report of gene screening using the expression fluctuation as an index during liver regeneration (Xu W et.al., Biochem Biophys Res Commun, 278 (2): 31
  • the present invention has been made in view of the above, and provides a gene panel consisting of a group of genes whose expression level fluctuates during liver regeneration in liver cells as compared to normal, and uses the same for liver regeneration.
  • the problem is to provide a method of screening for a drug to be promoted.
  • the present inventor thought that in order to promote liver regeneration, the behavior of genes involved in liver regeneration should be brought close to the pattern when liver regeneration is promoted. Then, using a rat subjected to partial hepatectomy, the expression profile of various genes in liver regeneration was examined, and expression information on genes involved in liver regeneration was obtained. As a result, the present invention was completed.
  • the present invention is as follows.
  • a gene panel consisting of the names of genes whose expression levels fluctuate during liver regeneration compared to normal in liver cells and the expression profiles of those genes.
  • a method for preparing a gene panel comprising expression profiles of a group of genes whose expression levels fluctuate during liver regeneration compared to normal in liver cells comprising the following steps:
  • (c) a step of identifying a group of genes whose expression levels fluctuate during liver regeneration, and creating an expression profile from each gene name and information on the fluctuations in the expression levels.
  • liver regeneration promoting substance is L-alanine.
  • the gene expression level is analyzed by one or more selected from gene chip method, ATAC-PCR method, or Taqman PCR (SYBR Green) method (10) to (13). the method of.
  • a method for evaluating the state of a liver comprising performing expression profiling of the gene constituting the gene panel of (1) with respect to the liver of the subject.
  • the present invention will be described in detail.
  • the gene panel of the present invention is a gene panel comprising names of genes whose expression levels fluctuate during liver regeneration in liver cells as compared to normal, and expression profiles of those genes.
  • the gene panel of the present invention can be prepared by the following steps.
  • Liver regeneration refers to a phenomenon in which, when some cells in the liver are damaged or lost due to resection, the condition is restored and the liver returns to its normal state. For example, it is a phenomenon observed in the remaining liver or transplanted liver after partial hepatectomy in the treatment of liver cancer or partial resection liver transplantation in the treatment of liver disease.
  • the expression level of a gene is synonymous with the expression level, expression intensity, or expression frequency of the gene, and is usually analyzed based on the production amount of a transcript corresponding to the gene, the activity of its translation product, and the like.
  • the gene expression level can be measured using a method usually used for gene expression analysis.
  • Preferred methods include, for example, gene chip method, genetic Child microarray method and gene macroarray method.
  • a method is used in which gene fragments are arranged and pasted on some plate (usually a slide glass). The chip and the fluorescently labeled mRNA are hybridized, and the type and amount of the mRNA are measured.
  • ATAC-PCR and Taqman PCR (SYBR Green).
  • the ATAC-PCR method is a type of quantitative PCR method developed by Kato et al. (Kato, K. et al., Nucl. Acids Res., 25, 4694-4696, 1997), Is characterized by the ability to quantify the expression of
  • the quantitative quantification of gene expression of dozens of genes has been the limit in the conventional quantitative PCR method, whereas the ATAC-PCR method enables the measurement of the expression of more than 1000 types of genes.
  • Taqman PCR (SYBR Green method) is a general method of quantitative RT-PCR (Schmittgen TD, Methods 25, 383-385, 2001).
  • the feature is that primer design is easy. Moreover, the operation is simple, and the expression of many genes can be measured in a short time (40 to 150 genes / 2 hours).
  • Other gene expression analysis methods include the Body Map method (Gene, 174, 151-158 (1996)) and the Serial analysis is of gene express ion (SAGE) method (US Pat. Nos. 527, 154, 544, 861, European Patent Publication No. 0761 822), MAGE (Micro-analys isof Gene Ex press on) (JP-A-2000-232888), and the like.
  • the outline of the Body Map method is as follows.
  • the mRNA is ligated to the poly T sequence on the vector and the poly A tail at the 3 'end of the mRNA, and cDNA is synthesized using the vector poly T sequence as a primer.
  • the cDNA is digested with the restriction enzyme Mbol. Since there is one Mbol site for every 300 base pairs on the cDNA, the cDNA on the vector is divided into 300 base pairs on average. At this time, the cMA from the poly A tail remains connected to the vector.
  • the vector containing the cDNA fragment is closed and introduced into Escherichia coli to produce a cDNA library.
  • Approximately 1000 clones are arbitrarily selected from the library, and the base sequence of an average of 300 base pairs is determined for each clone. From those sequences, the clones containing the same sequence are grouped together, and the type and appearance frequency of each sequence are calculated to obtain a gene expression profile.
  • Each cDNA sequence is subjected to a homology search (BLAST search) with a data bank, and a clone having the same sequence as a known gene is given the name of the gene. If the sequence is not registered in the databank, It is assumed that no corresponding gene exists.
  • a cDNA fragment of about 300 base pairs in the body map is further reduced to a short fragment of 11 base pairs or more (“tag (t ag) ”), and by linking a large number of these fragments to each other and inserting them into a vector, a library of linked tags is created.
  • the DNA sequence of the linking tag As with the Body Map, about 1000 clones can be selected arbitrarily. However, if the DNA sequence of the linking tag is determined, more gene expression information can be expected with the same number of steps as the Body Map.
  • a tag represents a gene sequence, and the frequency of appearance of the tag indicates the frequency of expression of the gene.
  • the length of a DNA sequence that can be read in one sequence is about 600 base pairs, so that a DNA sequence of up to about 50 tags can be read in one sequence. In other words, gene expression profile analysis can be performed up to 50 times more efficiently than the Body Map method.
  • the SAGE method is a gene expression profile analysis method based on the above idea.
  • the SAGE method is performed as follows.
  • a cDNA was prepared using poly T having a 3'-end of biotin as a primer, and the cDNA was cut with a restriction enzyme such as Mbol (called an anchoring enzyme) in the same way as the body map.
  • Mbol a restriction enzyme
  • the cDNA fragment containing the 3 'end bound with biotin was adsorbed to avidin beads, the beads were bisected, and the cDNA fragment (approximately 13 bp) adsorbed on each bead was combined with two linkers (A or A).
  • Each linker should contain a site for a Class II restriction enzyme (called a “tagging enzyme”) such as BsmFI.
  • the MAGE method is an improvement on the above method, in which cDNA is synthesized from mRNA using a vector primer having a poly-T sequence, the cDNA sequence is tagged on the vector, and the resulting tag is ligated to the end of the tag.
  • the method is not particularly limited as long as it can analyze the expression level of the gene, and any of a currently known method and a method developed in the future can be employed.
  • the gene chip method or the gene microarray method particularly preferred are the gene chip method or the gene microarray method, the ATAC-PCR method, and the Taqman PGR (SYBR Green) method.
  • the analysis of the expression level of the gene may be performed based on the results obtained by a single method, or may be performed by combining the results obtained by a plurality of methods.
  • a single method can perform a certain amount of analysis, a combination of multiple methods can provide more accurate analysis.
  • a correlation coefficient is calculated for the results obtained by a plurality of methods, for example, the gene chip method, and the results obtained by the ATAC-PCR method. Assess that the level has changed.
  • the fluctuation of the gene expression level is determined by measuring the expression levels of various genes in liver cells during normal time and the expression levels of the genes during liver regeneration, and comparing the respective expression levels. Can be analyzed.
  • the gene expression level during liver regeneration is analyzed, for example, by measuring the gene expression level of liver cells after resection using a model animal such as a rat from which a part of the liver has been resected. Normal gene expression levels, on the other hand, are typically measured just prior to excision.
  • the analysis of the gene expression level is preferably performed over time during liver regeneration. As described above, genes whose expression levels fluctuate during liver regeneration are identified. By assigning information on the analyzed fluctuations in the expression level to each identified gene, an expression profile of the gene group is created.
  • genes whose expression levels fluctuate during liver regeneration as compared to normal include genes that are presumed to be involved in L-alanine metabolism.
  • L-alanine is known to promote liver regeneration (Maezono K et. Al., Hepatology 24 (5), 1996; JP-A-5-229940).
  • an increase in plasma L-alanine concentration after hepatectomy in humans (Nijveldt RJ. Etal., Liver 21 (1), 56-63 (2001)), and L-alanine in liver tissues after hepatectomy in rats Accumulation (Brand HS. Et al., J Hepatology 23, 333-340 (1995)).
  • ATA 2 amino acid transporter system A
  • liver regeneration promoting substance may be administered during or before and after liver regeneration.
  • liver regeneration promoting substances include a mixture of liver extract and flavin adenine dinucleotide (liver extract 151, FAD 10 mg / l ml), liver hydrolyzate, Saiko Keishi-to, Sho-saiko-to, diisop dichloroacetate , Placenta hydrolyzate, valine (W00113912), vascular growth factor (VEGF, VPF) (00132213), macrolide compound (JP3240728), TCF II (JP10194986), TGF- / 3 release. (JP8333249), glucose-1-phosphate, dalcose-6-phosphate (JP2202821), and desialylated orosomucoid (JP6122025).
  • liver extract 151 flavin adenine dinucleotide
  • FAD 10 mg / l ml liver hydrolyzate
  • Saiko Keishi-to Sho-saiko-to
  • the gene panel of the present invention includes at least the names of various genes identified as described above and the expression profile of each gene.
  • the name of the gene is not particularly limited as long as it can be distinguished from other genes, but typically, the name of the product encoded by the gene, the accession number on a database such as GenBank, or the gene name Or the name of the probe set on the gene chip Gene names and the like are used.
  • the “expression profile” refers to information on the fluctuation of the expression level of each gene included in the gene panel.
  • the expression level is measured and recorded over time.
  • the expression level of the gene may be represented by an absolute value or a relative value.
  • each gene is classified by the expression level at a certain time after hepatectomy. For example, 1 hour and 6 hours after hepatectomy (early stage of liver regeneration), groups whose expression is significantly increased (groups 1 and 2), conversely decreased (groups 6 and 7), 24 hours and 4 hours Expression increased markedly at 8 hours (middle liver regeneration) (groups 3 and 4), conversely decreased (groups 8 and 9), expression increased significantly 7 days after hepatectomy (late liver regeneration) Dal-Dup (Group 5) is classified into a decreasing group (Group 10).
  • the remarkable expression here is that if the increase or decrease in expression is 3 times or more in the case of Gene chip compared to that before hepatectomy, and if there is a difference in the Taqman-PCR (SYBR Green) It is assumed that there is a difference.
  • each group is ordered by the time that expression is maintained at that level after expression has increased or decreased, or the time that continues to increase or decrease, as listed in Table 1. Can be lined up.
  • the gene panel preferably includes information on liver weight at a certain time after hepatectomy. For example, livers in the early stage of liver regeneration (1 hour and 6 hours after hepatectomy), the middle stage of liver regeneration (24 hours and 48 hours after hepatectomy), and the liver in the late stage of liver regeneration (7 days after hepatectomy) are extracted, respectively. Measuring liver weight,
  • the gene panel of the present invention may include sequence information of a PCR primer group for analyzing the expression level of each gene.
  • the primer include a primer group consisting of all or a part of the oligonucleotides shown in SEQ ID NOs: 1 to 127 and 135 to 192.
  • the base sequence information of the adapter used in the ATAC-PCR method and / or the Taqman PCR (SYBR Green) method may be included.
  • SEQ ID NOS: 1 to 127 are primers for ATAC-PCR
  • SEQ ID NOs: 135 to: L92 are primers for Taqman PCR (SYBR Green).
  • Adapter I As an example of the base sequence, an adapter having the base sequence shown in SEQ ID NO: 128 to 133 can be mentioned.
  • a drug involved in hepatic regeneration can be screened by administering a drug to a model animal or liver tissue or cells and performing expression profiling of the genes constituting the gene panel of the present invention. That is, a drug whose expression profile is similar to the expression profile in the gene panel by administration of the drug is considered to promote liver regeneration.
  • Screening for a drug that further increases the expression of the gene of this gene panel or a drug that further decreases the decrease in the expression of the gene of the present gene panel can also be used to screen for a substance promoting liver regeneration.
  • screening can be performed by focusing on the changes in the expression of about six types of genes. An example of a screen based on this concept is shown in Examples below.
  • Gene expression profiling methods include DNA microarray method using a slide glass or nylon membrane on which the gene fragments constituting the gene panel are fixed, MA macroarray method, ATAC-PCR method, Taqman probe. Or a quantitative PCR method using SYBR Green. Expression pro The firing may be performed by a single method or a combination of a plurality of methods. An example of a specific screening procedure will be described below.
  • cultured hepatocytes are treated with the drug to be screened, or the drug is administered to rats, and RNA is prepared from cells or liver after a certain period of time.
  • Conditions for culturing hepatocytes include ordinary culturing, and a method in which a substance that damages hepatocytes such as galactosamine, heavy metal ions, or carbon tetrachloride is added to the medium.
  • a substance that damages hepatocytes such as galactosamine, heavy metal ions, or carbon tetrachloride.
  • a candidate drug that is expected to show a liver regeneration promoting action in the primary screening is administered to rats that have undergone partial hepatectomy at regular intervals, for example, at the beginning of liver regeneration (1 hour, 6 hours after hepatectomy)
  • the liver in the middle stage of liver regeneration (24 hours and 48 hours after hepatectomy) and the liver in the late stage of liver regeneration (7 days after hepatectomy) are removed.
  • RNA is extracted from the liver and the change in gene expression is measured.
  • the above-mentioned screening can be performed using an experimental animal other than a rat. In this case, it is preferable to regenerate a gene panel for a homolog corresponding to the rat gene and carry out screening.
  • the following drug screening can be performed using the gene panel.
  • Gene groups that fluctuate in the early stage of liver regeneration (for example, groups 1, 2, 6, and 7) are considered to be important gene groups for the initiation of liver regeneration. Therefore, by chemical treatment, By screening for drugs that show a similar pattern to those described above, it can be expected that drugs that are effective in initiating liver regeneration will be obtained.
  • genes that begin to change during the middle stage of liver regeneration are considered to be genes that act on liver regeneration initiation and promote hepatocyte proliferation or differentiation. Can be Therefore, it can be expected that a drug that positively affects the proliferation or differentiation of hepatocytes can be obtained by screening for drugs that exhibit similar patterns to these by drug treatment.
  • Genes that begin to fluctuate late in liver regeneration are considered to be genes that are important for termination of liver regeneration or normal hepatocyte function after regeneration is completed. Therefore, by screening for drugs showing similar patterns to these by drug treatment, drugs that negatively affect hepatocyte proliferation or drugs that are effective for normal hepatocyte function after regeneration is completed can be obtained. Can be expected. Drugs that have a negative effect on hepatocyte proliferation can be used for the purpose of suppressing hepatocyte hyperproliferation, and may be used as drugs for liver cancer and the like.
  • the gene panel of the present invention is considered to be useful for screening of a drug that is effective in each process of liver regeneration (for example, cascade, cell growth, differentiation, cell growth arrest, etc.) By combining the drugs obtained as a result, it is thought that a more effective therapeutic agent for liver regeneration can be created.
  • L-alanine is known to have a liver regeneration effect.
  • L-alanine is easily metabolized in the body and disappears, so that sufficient drug efficacy cannot be obtained. Therefore, a drug that has the same medicinal properties as L-alanine and has better properties, for example, improved pharmacokinetics, and a longer-lasting effect is required.
  • a drug that has the same medicinal properties as L-alanine and has better properties for example, improved pharmacokinetics, and a longer-lasting effect is required.
  • This gene panel can be used in a system for evaluating In addition, by examining the gene variation pattern of each patient, it is possible to administer a drug suitable for each patient. For example, a series of drugs that specifically or positively regulate a specific gene (group) of the present gene panel are screened. Here, by examining the gene expression of the gene panel in each liver disease patient, it is possible to select drugs necessary for liver regeneration. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • FIG. 1 is a diagram showing the structure of an adapter.
  • FIG. 2 to 4 show the relative expression of L-alanin metabolism-related genes whose expression fluctuates when L-alanine is administered during liver regeneration.
  • FIG. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples.
  • Example 1
  • F344 / DvCrj (Fischer) rats Anesthetized with ether at 10 weeks of age, the abdomen was incised, and the left and middle lobes were extruded from the incision.
  • the left lobe, middle lobe and right lobe, and ridge were tied with sutures, and the right lobe and ridge were left in the body, and the left lobe and middle lobe were cut off. Thereafter, the incision was sewn with suture.
  • the individual at 0 hours after resection was not sutured, and the remaining liver was subsequently removed. At 1 hour, 6 hours, 12 hours, 24 hours, and 168 hours after hepatectomy, resection was performed, and the remaining liver (regenerated liver) was removed.
  • the weight of the remaining liver (right lobe, tail lobe) was about 30% of the weight of the whole rat liver (right lobe, left lobe, middle lobe, tail lobe).
  • Three liver regeneration model rats were prepared, and the weight of the remaining liver at the time of removal was measured.It was 2 ⁇ 0.3 g (1.6 g) at 0 hours after resection, and 1.7 ⁇ 0.3 g (1.4 g) at 1 hour after resection. g), 2.1 ⁇ 0.5 g (2.1 g) at 6 hours after resection, 2.5 ⁇ 0.5 g (3.0 g) at 24 hours after resection, 2.5 ⁇ 0.5 g (2.0 g) at 48 hours after resection, 7 after resection 5.6 ⁇ 0.3 in days g (5.8 g) (however, the value in parentheses is the weight of the regenerated liver used for the measurement with the Gene Chip described later).
  • Gene expression analysis by GeneChip was performed according to the protocol recommended by Affymetrix. The procedure is shown below.
  • double-stranded cDNA was synthesized from the total RNA prepared in ⁇ 2> using a SUPERSCRIPT Choice System manufactured by Gibco BRL. 15 g of total RNA and T7- (dT) 24 primer lOOpmo 1 were dissolved in DEPC-treated water to give 11 zxl. After reacting at 70 ° C for 10 minutes, cool on ice. 5Xlst strand cDNA buffer (manufactured by Gibco BRL) 41, 0.1XDTT (dithiothreitol, manufactured by Gibco BRL) 21 1, 10mM dNTP mix (Gibco BRL) 1 liter) and kept at 42 ° C for 2 minutes.
  • a biotin-labeled cRNA probe was synthesized from the double-stranded cDNA synthesized above using a Bio Array High Yield RNA Transcript Labeling Kit manufactured by Enzo.
  • the RNeasy rain i spin column that had been adsorbed with a biotin-labeled cRNA probe as described above was transferred to a new tube.
  • This RNeasy mini spin column was added with 30 il of DEPC-treated water, and left at room temperature for 1 minute. The mixture was centrifuged at 8000 rpm for 15 seconds to elute the purified biotin-labeled cRNA probe solution.
  • the purified biotin-labeled cRNA probe solution was fragmented.
  • Mix the biotin-labeled cRNA probe solution and 5X fragmentation buffer add 1/5 of the final solution volume, adjust the concentration of the biotin-labeled cRNA probe to 0.5 g / l, and react at 94 ° C for 35 minutes. I let it. 1% agarose gel electrophoresis was performed to confirm that the probe was fragmented to a length of about 100 bases.
  • test chip TEST2 Chip
  • Rat chipsets RG-U34A, RG-U34B, RG-U34C
  • Hybridization was performed by the following procedure for both the test chip and the rat chip set.
  • the hybridization cocktail was heat denatured by heating at 99 ° C for 5 minutes, placed at 45 ° C for 5 minutes, and centrifuged at 15000 rpm at room temperature for 5 minutes. The supernatant was collected for a test chip (TEST2 Chip) at 801 and a rat chip set (RG-U34A, RG-U34B, RG-U34C) for 2001 minutes, and used for hybridization.
  • the Genechip was returned to room temperature and prehybridized in 1XMES buffer (Test2 chip: 801, rat chip set: 2001) at 45 ° C for 10 minutes at 60 rpm. Next, the pre-hybridization solution was removed, and the above-mentioned heat-denatured hybridization cocktail was added, and hybridization was carried out at 45 ° C. for 16 hours at 60 rpm.
  • Hybridization data analysis was performed using the GeneChip Analysis Suite.
  • the expression level of each gene was expressed as a relative value (Average Differences) with the average value of the expression of all genes as 100 (Table 1 (1) to (11)).
  • the gene tip probe set name is the management number corresponding to each gene, which is named by affymetrix.
  • the “unigene” is a collection of DNA sequences registered in GenBank for each gene (transcript) and each species.
  • the Ohr column in the table shows the gene expression level measured in the rat liver at 0 hours after partial hepatectomy.
  • the lhr, 6hr, 24hr, 48hr, and 7d columns show 1 hour after partial hepatectomy, respectively.
  • Gene expression levels in rat liver at 6, 24, 48 and 7 days. 0hr / 0hr, lhr / Ohr, 6hr / 0hr, 24hr / 0hr, 48r / 0hr, 7d / 0hr are 0 hours, 1 hour, 6
  • the second decimal point is rounded off.
  • the value of the expression level was 0 or less, the value was set to 1 for convenience in obtaining the expression ratio.
  • Gene panels were prepared using known genes (gene sequence structures including all 0RFs were registered on GenBank Database overnight, excluding those with clear partial sequences such as ESTs).
  • ATAC-PCR is a technique developed by Kikuya Kato et al. (Kato, K. et al., Ucl. Acids Res., 25, 4694-4696, 1997), and uses competitive primers with fluorescent primers. Based on RT-PCR. ATAC-PCR can easily and quantitatively analyze the expression of many genes.
  • the experimental procedure of the ATAC-PCR method performed here conforms to the method of Kato et al. (Kato, K. et al., Noel. Acids Res., 25, 4694-4696, 1997).
  • double-stranded DNA was synthesized from cDNA synthesized using a 5'-biotinylated oligo dT primer, and cut with a specific restriction enzyme (here, an example using Mbol was described).
  • a specific restriction enzyme here, an example using Mbol was described.
  • an adapter (preparing six types with different lengths) having the same sequence at the end as the site cleaved by the restriction enzyme and a double-stranded DNA cleaved with the restriction enzyme MboI Ligation was linked.
  • Three of the six adapters were bound to control cDNA (cDNA prepared from rat liver before hepatectomy) and mixed at a ratio of 10: 3: 1.
  • CDNA prepared from rat liver at 1, 6, 24, 48, and 7 days after hepatectomy was bound to the remaining three adapters.
  • the 3 'fragment of double-stranded cDNA is recovered using streptavidin-coated beads, and competitive RT-PCR is performed using a primer having a sequence common to each adapter.
  • This PCR product was analyzed by ABI PRISM 3700 DNA Analyzer. This device can separate fragments by their length by capillary electrophoresis, and can detect the fluorescence intensity in proportion to the expression level.
  • a calibration curve was created from the fluorescence intensity of the PCR product obtained from the control, and this was used to calculate the gene expression change in the resected liver to be measured.
  • the base sequence of the adapter used is shown below.
  • Table 1 shows the names of restriction enzymes used for those whose expression variation was examined by ATAC-PCR using restriction enzymes other than Mbol.
  • the adapter sequence used had a different terminal sequence from that in the case of using Mbol.
  • Figure 1 shows the arrangement of the different parts (in bold). 5> Application of Gene Panel to Screening for Candidates for Promoting Liver Regeneration
  • L-alanine is known to have a liver regeneration promoting effect (Maezono K et.a
  • liver was excised, weighed, cryopreserved, and subjected to mRNA expression measurement by ATAC-PCR. Liver specimens were prepared and liver PCNA (proliferating cell nuclear antigen) levels were measured.
  • PCNA proliferating cell nuclear antigen
  • the gene expression in the rat liver of each group was measured by ATAC-PCR.
  • the method for preparing RNA and the method for ATAC-PCR are as described above.
  • ATAC-PCR was measured using 117 genes that can be measured by ATAC-PCR using the restriction enzyme Mbol from the genes in the gene panel (Nos. 12, 49, 52, 55, 58, 59, 61, 69 in Table 1). , 73, 77, 83, 90, 93, 101, 102, 108, 130, 134, 135, 136).
  • rat liver to which L-alanine was administered was stained with an anti-PCNA antibody (antibody to Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA), a replication factor that promotes the activity of DNA polymerase ⁇ 5), and the PCNA Labeling Index was determined.
  • PCNA Protein to Proliferating Cell Nuclear Antigen
  • Table 2 shows the measurement results of the PCNA Labeling Index.
  • the administration of L-alanine increased the PCNA Labeling Index in the liver compared to non-administered liver (Table 2).
  • a la + indicates a group administered with L-alanine
  • Ala- indicates a group without L-alanine. In other words, the effect of promoting L-arabin administration on hepatocyte proliferation was observed.
  • Group 1 The gene expression in Groups 1 and 2 was compared by measuring the expression of the genes in the gene panel by ATAC-PCR. Expression was calculated from the relative value of the second group to the first group (Al a + / Al a- in Table 3). As a result, seven types were found to have a three-fold or more difference in expression between L-alanine administration and non-administration (Table 3). Table 3
  • RNA was purified from the remaining liver (regenerated liver) at 0, 1, 6, 24, 48, and 168 hours after partial hepatectomy in rats. Changes in the expression levels of various genes were examined using the Taqman PCR (SYBR Green) method.
  • Primers used for Taqman PCR were obtained from the external database Primer3. (http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/priier/priier3_www.cgi). Table 6 shows the name of each gene, its Unigene No., and the nucleotide sequence of the primer. Note that only genes whose expression was found to vary as a result of analysis by Taqman PCR (SYBR Green) are described.
  • Taqman PCR was performed by the SYBR Green method (Schmittgen TD. Etal., Analytical Biochem. 285, 194-204, 2000). Specifically, the reaction was performed as follows. Reaction solutions having the compositions shown in Table 5 were mixed in a PCR tube for Taqman, and a PCR reaction was performed using ABI7700 Prism Sequence Detector (ABI). The reaction conditions were as follows. Reaction conditions: 50 ° C 2 minutes ⁇ 95 10 minutes— (95 ° C 15 seconds ⁇ 60 ° C 1 minute) 40 cycles. Table 5 Composition of PCR reaction solution (per tube) template cMA (equivalent to 2.5 ng of total RNA) 0.1 xl
  • Dissection was performed 24 hours after partial hepatectomy. After exsanguination and sacrifice under anesthesia, the liver was excised, weighed, cryopreserved, and subjected to mRNA expression measurement by Taqman PCR (SYBR Green) method.
  • Total RNA was purified in the same manner as in Example 1 from the remaining liver of 70% partially hepatectomized rats in the L-alanine administration group (group 1) and the control group (group 2).
  • Primers used for Taqman PCR were designed using the external database Primer3 (hi tp: //www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_ww.cgi) .
  • Table 7 shows the name of each gene, its Unigene No., and the nucleotide sequence of the primer. Note that only genes whose expression was found to vary as a result of analysis by Taqman PCR (SYBR Green) are described.
  • Taqman PCR (SYBR Green) Taqman PCR (SYBR Green) was performed in the same manner as in Example 2.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)

Description

明細書 肝再生に関与する遺伝子パネル 技術分野 本発明は、 肝臓細胞中で、 正常時に比べて肝再生時に発現レベルが変動する遺 伝子の群からなる遺伝子パネル、 その作成方法、 同遺伝子パネルの利用に関する ものである。 これらの発明は、 診断、 医薬分野等で有用である。 背景技術 肝癌治療における部分肝切除、 又は肝疾患治療における部分切除肝移植時にお いて、 残存肝又は移植肝の速やかな再生は重要事項であるが、 肝再生が不良であ る場合は少なくない。 また、 成人肝は脂肪肝になっている場合が多いが、 脂肪肝 は再生不良である場合が多く、 これが部分肝切除後の問題を引き起こす。 さらに、 肝炎においては、 障害を受けた肝臓を補うため、 肝再生が促進されることが重要 であるが、 再生が遅れると肝炎の悪化が生じると考えられ、 時には予後不良の劇 症肝炎へ移行しかねない。
したがって、 肝再生を促進する医療が要求されており、 肝再生を促進させる薬 剤のスクリーニングは重要であるといえる。 このような要求があるにも関わらず、 肝再生を促進させる有効な治療薬は見つかっておらず、 肝再生を促進させる薬物 の効率的なスクリーニング法は知られていない。
ラット部分肝切除を行うと速やかに肝再生が開始され、 およそ 1週間で切除前 の肝細胞サイズに戻ることが知られている。 肝再生は関連する複数の遺伝子の相 互作用により促されると考えられているが、 肝再生過程においていかなる遺伝子 がいかなるタイミングで働いているかの全体像は分かっていない。 肝再生には多 数の遺伝子が関与していると考えられることから、 肝再生の全体像をつかむため には、 肝再生に働く重要遺伝子を多数調べることが重要であると考えられる。 し かし、 これまで肝再生に関与すると考えられている遺伝子、 タンパクを組み合わ せた培養系において、 肝再生を再現する試みがなされているが、 未だ成功してい ない。 また、 肝再生時に発現変動が見られることを指標とした遺伝子スクリー二 ングの報告はあったが （Xu W et.al., Biochem Biophys Res Commun, 278 (2) :31
8- 25, 2000; Kar S and Carr BI, Biochem Biophys Res Commun, 212(1) :21-6, 1995; ohn KL, et. al., Mol Cell Biol, 11 (1) :381-90, 1991; Sobczak J et. al.， Exp Cell Res, 169 (1) :47-56, 1987; Huber BE et.al., Hepatology, 6(2)2
09- 19, 1986) 、 せいぜい数種の遺伝子の発現変動を見たものに過ぎなかった。 発明の開示 本発明は、 上記観点からなされたものであり、 肝臓細胞中で、 正常時に比べて 肝再生時に発現レベルが変動する遺伝子の群からなる遺伝子パネル、 及びそれを 利用して肝再生を促進させる薬物をスクリーニングする方法を提供することを課 題とする。
本発明者は、 肝再生を促進させるには、 肝再生に関与する遺伝子の挙動を、 肝 再生が促進されている時のパターンに近づけてやればよいと考えた。 そして、 部 分肝切除を施したラットを用いて、 肝再生における各種遺伝子の発現プロフアイ ルを調べ、 肝再生に関与する遺伝子に関する発現情報を取得した結果、 本発明を 完成するに至った。
すなわち本発明は、 以下のとおりである。
(1) 肝臓細胞中で、 正常時に比べて肝再生時に発現レベルが変動する遺伝子 の名称及びそれらの遺伝子の発現プロファイルからなる遺伝子パネル。
(2) 前記遺伝子の発現レベルの変動が、 モデル動物における正常時の発現レ ベルに対する、 肝臓の部分切除後における発現レベルの変動である（1)の遺伝子 パネル。
(3) 前記発現プロファイルが、 肝再生における経時的な発現プロファイルを 含む（1)又は（2)の遺伝子パネル。
(4) 前記遺伝子の発現プロファイルを解析するための P CRプライマ一群の 配列情報を含む（1)〜（3)のいずれかの遺伝子パネル。
(5) 前記モデル動物がラットである（2)〜（4)のいずれかの遺伝子パネル。 (6) 表 1、 表 6及び表 7の番号 1〜 166に示す 166種の遺伝子のうち、 少 なくとも 6種類の遺伝子の発現プロフアイルを含む（1)〜（5)のいずれかに記載の 遺伝子パネル。
( 7 ) 前記少なくとも 6種類の遺伝子が、 表 1及び表 6の番号 1〜 1 51に示す 1 5 1種の遺伝子から選ばれる（6)の遺伝子パネル。
( 8 ) 前記少なくとも 6種類の遺伝子が、 表 1及び表 6の番号 1〜 1 37に示す 1 37種の遺伝子から選ばれる（6)の遺伝子パネル。
(9) 前記少なくとも 6種の遺伝子が、 表 1の番号 5、 1 7、 36、 46、 67、 68の各遺伝子である（6)〜（8)のいずれかの遺伝子パネル。
(1 0) 肝臓細胞中で、 正常時に比べて肝再生時に発現レベルが変動する遺伝 子の群の発現プロファイルからなる遺伝子パネルの作成方法であって、 以下のス テツプを含む方法：
(a) 正常時におけるモデル動物の肝臓細胞中における各種遺伝子の発現レべ ルと、 肝再生時における前記遺伝子の発現レベルを測定するステップと、
(b) それぞれの発現レベルを比較するステップと、
(c) 肝再生時に発現レベルが変動する遺伝子群を同定し、 各々の遺伝子名と 発現レベルの変動に関する情報から発現プロファイルを作成するステップ。
(1 1) 前記ステップ （a) において、 肝再生時における前記遺伝子の発現レ ベルを経時的に解析することを特徴とする（10)の方法。
(1 2) 肝再生時又はその前後に肝再生促進物質を投与することを特徴とする (11)の方法。
(1 3) 前記肝再生促進物質が Lーァラニンである（12)の方法。
(14) 前記遺伝子発現レベルの解析を、 遺伝子チップ法、 ATAC— PCR 法又は Ta qman PCR (SYBR G r e e n ) 法から選ばれる 1種又は 2種以上により行う（10)〜（13)のいずれかの方法。
(1 5) 前記遺伝子発現レベルの解析を、 遺伝子チップ法及び ATAC— PC R法により行うことを特徴とする（14)の方法。
(1 6) 前記遺伝子発現レベルの解析を、 Ta qman PCR (SYBR G r e e n) 法により行うことを特徴とする（14)の方法。 ( 1 7 ) モデル動物または肝臓の組織もしくは細胞に薬剤を投与し、 （1)の遺伝 子パネルを構成する遺伝子の発現プロフアイリングを行うことを特徴とする、 肝 再生に関与する薬剤のスクニーニング方法。
( 1 8 ) 被検者の肝について、 （1)の遺伝子パネルを構成する遺伝子の発現プロ フアイリングを行うことを特徴とする、 肝の状態の評価方法。
( 1 9 ) (10)の遺伝子パネルの作成方法、 （17)のスクリーニング方法、 又は（18) の評価方法に用いられるプライマー群であって、 配列番号 1〜 1 2 7、 及び 1 3 5〜 1 9 2に示すオリゴヌクレオチドの全部又は一部からなるプライマー群。 以下、 本発明を詳細に説明する。
< 1 >本発明の遺伝子パネル
本発明の遺伝子パネルは、 肝臓細胞中で、 正常時に比べて肝再生時に発現レべ ルが変動する遺伝子の名称及びそれらの遺伝子の発現プロファイルからなる遺伝 子パネルである。
本発明の遺伝子パネルは、 下記ステップにより作成することができる。
( a ) 正常時におけるモデル動物の肝臓細胞中における各種遺伝子の発現レベル と、 肝再生時における前記遺伝子の発現レベルを測定するステップと、
( b ) それぞれの発現レベルを比較するステップと、
( c ) 肝再生時に発現レベルが変動する遺伝子群を同定し、 各々の遺伝子名と発 現レベルの変動に関する情報から発現プロファイルを作成するステップ。
肝再生とは、 肝臓における一部の細胞が障害された場合、 または切除等により 失われた場合、 その状態を修復し、 もとの正常な肝臓の状態へ戻る現象をいう。 例えば、 肝癌治療における部分肝切除、 又は肝疾患治療における部分切除肝移植 後に、 残存肝又は移植肝において観察される現象である。
遺伝子の発現レベルとは、 遺伝子の発現量、 発現強度又は発現頻度と同義であ り、 通常、 遺伝子に対応する転写産物の生成量、 又はその翻訳産物の活性等によ り解析される。
遺伝子の発現レベルは、 通常遺伝子の発現解析に利用されている方法を用いて 測定することができる。 好ましい方法としては、 例えば、 遺伝子チップ法、 遺伝 子マイクロアレイ法、 及び遺伝子マクロアレイ法等がある。 これらの方法では、 遺伝子断片を何等かの板の上（通常はスライドガラス）に並べて張り付けたものが 用いられる。 このチップと蛍光ラベルした mRNAをハイブリダィズさせて、 mRNAの 種類と量を測定する。
また、 本発明において好ましい方法として、 ATAC- PCR法及び Taqman PCR (SYBR Green) が挙げられる。 ATAC- PCR法は加藤ら (Kato, K. et al .， Nuc l . Ac i ds R es .， 25, 4694-4696, 1997) によって開発された、 定量的 PCR法の一種であり、 微量サンプルの発現定量を行える点が特徴である。 またこれまでの定量的 PCR法 ではせいぜい数十種の遺伝子発現定量が限界であつたのに対し、 ATAC- PCR法では 1000種以上の遺伝子の発現測定を可能としている。 また、 Taqman PCR (SYBR Gre en法） は、 定量的 RT- PCR法の一般的方法である （Schmi t tgen TD, Me thods25, 38 3-385, 2001) 。 プライマ一設計が容易である点が特徴である。 又，操作が簡便で あり、 短時間で多くの遺伝子の発現測定が可能である （40〜150遺伝子 /2時間） 。 その他、 遺伝子発現解析法として、 Body Map法 （Gene, 174, 151 -158 (199 6) ) 、 Ser i al analys i s o f gene express i on (SAGE) 法 （米国特許第 527， 154号、 第 544, 861号、 欧州特許公開第 0761 822号) 、 MAGE (Mi cro-analys i s o f Gene Ex press i on) (特開 2000- 232888号) 等が挙げられる。
Body Map法の概略は以下の通りである。 mRNAをべクタ一上のポリ T配列と mRNA の 3'末端にあるポリ Aテールを結合させ、 ベクタ一ポリ T配列をプライマーとし て cDNAを合成する。 更に、 制限酵素 Mbolで cDNAを切断する。 Mbolサイトは cDNA上 で平均 300塩基対に一つあるため、 ベクター上の cDNAは平均 300塩基対に分断され る。 このとき、 最もポリ Aテールよりの cMAは、 ベクタ一に結合したまま残る。 この cDNA断片を持つベクタ一を閉環させ、 それを大腸菌に導入して cDNAライブラ リーを作製する。 ライブラリ一から約 1000クローンを任意に選択して、 それぞれ について平均 300塩基対の塩基配列を決定する。 それらの配列の中から同じ配列 を含むクローン毎にまとめて、 それぞれの配列の種類と出現頻度を算出して遺伝 子発現プロファイルを得る。 各 cDNA配列はデータバンクとのホモロジ一検索 （BL AST検索） を行い、 既知の遺伝子と同一の配列を有するクローンにはその遺伝子 の名称を与える。 配列がデータバンクに登録されていない場合は、 その配列に該 当する遺伝子は存在しないものとする。
BLAST検索によりホモロジ一検索を行なうためには、 最低 1 1塩基対の情報が必 要である。 10塩基からなる配列の種類は約百万種であり、 人で存在すると予想さ れる遺伝子の種類 10万種を遙かに越える。 すなわち、 11塩基対の情報があれば、 その配列を持つ遺伝子は特定することができ、 遺伝子発現プロファイル解析が可 能である。 したがって、 多量のシークェンスを必要とする Body Mapによる遺伝子 発現プロファイル解析を効率化するために、 Body Mapにおける約 300塩基対の cDN A断片を、 更に 1 1塩基対以上の短い断片（ 「タグ （t ag) 」 と呼ばれる）とし、 更に この断片同士を多数連結してベクタ一に挿入することにより、 連結タグのライブ ラリーを作製し、 Body Mapと同様に約 1000クロ一ンを任意に選択して、 連結タグ の DNA配列を決定すれば、 Body Mapと同じ手数でより多くの遺伝子発現情報を得 ることが期待できる。 タグは遺伝子配列を代表し、 タグの出現頻度はその遺伝子 の発現頻度を現す。 通常、 1回のシークェンスで判読出来る DNA配列の長さは約 6 00塩基対であるから、 1回のシークェンスで最大 50個程度のタグの DNA配列を判 読出来る。 すなわち、 Body Map法に比べて最大約 50倍の効率で、 遺伝子発現プロ ファイル解析を行うことが可能になる。
SAGE法は、 上記の考えに基づいた遺伝子発現プロファイル解析法である。 SAGE 法は、 以下のようにして行われる。 ピオチンが 3'末端に結合したポリ Tをプライ マ一として cDNAを作製し、 Body Mapと同様に Mbo l等の制限酵素 （ 「アンカリング 酵素（anchor ing enzyme) ] と呼ばれる） で cDNAを切断した後、 ピオチンが結合し た 3'末端を含む cDNA断片をアビジンビーズに吸着させ、 ビーズを二分して、 それ ぞれのビーズに吸着した cDNA断片 （約 13bp) に 2種のリンカ一 （A又は B ) の一 方づっを結合させる。 各リンカ一には BsmF Iのような C l as s I I制限酵素 （ 「タグ 化酵素（t agging enzyme)」 と呼ばれる） のサイトを含ませておく。 タグ化酵素で cDNA断片をビーズから切り出し、 切断部位を平滑化し、 Aリンカ一に接続する夕 グと Bリンカ一に接続するタグ.を連結させる。 これは、 ダイタグ （d i t ag) と称 される。 Aリンカーと Bリンカーを認識するプライマーを用いて PCRによりダイ タグを増幅する。 増幅されたダイタグ同士を多数連結させてベクターに組み込み、 シークェンスする。 1シークェンスで最大 50程度のタグシークェンスを得ること ができる。 このタグシークェンス情報を集計して、 遺伝子発現頻度を導き出す。
MAGE法は、 上記方法に対する改良法であり、 ポリ T配列を有するベクターブラ イマ一を用いて mRNAから cDNAを合成し、 同ベクター上で cDNA配列をタグ化し、 得 られたタグを、 タグの末端が識別できるような配列を介在させて連結することに よりコンカテマ一を形成させ、 このコンカテマ一の塩基配列を解析することによ つて、 効率よく、 しかも高精度で遺伝子の発現頻度を解析することができる方法 である。
本発明においては、 遺伝子の発現レベルを解析することができる方法であれば 特に制限されず、 現在知られている方法、 及び将来開発される方法のいずれも採 用することができる。 上記方法のうち、 特に好ましいのは、 遺伝子チップ法もし くは遺伝子マイクロアレイ法、 ATAC-PCR法、 及び Taqman PGR (SYBR Green) 法で ある。
本発明において、 遺伝子の発現レベルの解析は、 単独の方法で得られた結果に 基づいて行つてもよく、 複数の方法により得られた結果を組み合わせて行つても よい。 単独の方法でもある程度の解析が可能であるが、 複数の方法を組み合わせ ると、 より精度の高い解析を行うことができる。 具体的には、 複数の方法、 例え ば遺伝子チップ法により得られた結果と、 ATAC- PCR法により得られた結果につい て相関係数を算出し、 相関係数が一定以上の遺伝子について、 発現レベルが変動 したと評価する。
ヒトゃマウス等の動物の遺伝子チップ、 遺伝子マイクロアレイ及び遺伝子マク ロアレイは各種市販されており、 本発明においてはそれらを使用してもよい。 本発明においては、 遺伝子の発現レベルの変動は、 正常時における肝臓細胞中 における各種遺伝子の発現レベルと、 肝再生時における前記遺伝子の発現レベル を測定し、 それぞれの発現レベルを比較することによって、 解析することができ る。 肝再生時における遺伝子の発現レベルは、 例えば、 肝臓の一部を切除したラ ット等のモデル動物を用いて、 切除後に肝臓細胞の遺伝子の発現レベルを測定す ることによって解析される。 一方、 正常時の遺伝子の発現レベルは、 典型的には 切除直前に測定される。 遺伝子の発現レベルの解析は、 肝再生時に経時的に行う ことが好ましい。 上記のようにして、 肝再生時に発現レベルが変動する遺伝子群が同定される。 同定された遺伝子毎に、 解析された発現レベルの変動に関する情報を割り当てる ことにより、 遺伝子群の発現プロファイルを作成する。
また、 本発明において、 正常時に比べて肝再生時に発現レベルが変動する遺伝 子、 すなわち肝再生に関与すると考えられる遺伝子の候補として、 Lーァラニン の代謝に関与すると推定される遺伝子が挙げられる。
Lーァラニンは肝再生を促進することが知られている （Maezono K et.al., He patology 24 (5), 1996; 特開平 5- 229940号） 。 また、 ヒトの肝切除後の血漿中 L —ァラニン濃度の上昇 （Nijveldt RJ. Et al.， Liver 21 (1), 56-63 (2001)) 、 ラットの肝切除後の肝組織への Lーァラニンの蓄積 （Brand HS. et al.， J Hepa tology 23, 333-340(1995)) 等が報告されている。 これを裏付けるデータとして、 後述するように、 肝再生モデルである 70%部分肝切除ラットにおいて L一ァラニ ンを輸送する amino acid transporter system A (ATA 2) の niRNAレベルが上昇す ることが認められた （本明細書実施例） 。 また、 同様の肝再生モデルにおいて、 L—ァラニンの輸送活性の上昇も認められており （Joan-Vicenc et al.， FEBS L ETTERS 329 (1, 2), 189—193 (1993) ; Freeman TL. et al. , BBRC 278, 729-732 (200 0〉）、 肝再生時の肝細胞内への L—ァラニンの取り込みが増加する可能性が考え られている。
さらに、 MeAIB (nonmetabol izable, System A-speci f ic substrate, alpha- (m ethylamino)isobutyric acid) 処理により ATA2の Ala輸送活性を阻害した場合に は、 DNAへの [3H] thymidineの取り込みが低下することから （Freeman TL. Et al., Hepatol ogy 30(2), 437-444(1999)) 、 L—ァラニンの肝細胞中への輸送を阻害 すると、 肝再生促進が抑制されることが示唆される。 このことからも、 ATA2 (A1 a) が肝再生促進に関与することが強く示唆される。
また、 外科手術の分野では、 肝切除のような侵襲状態において、 肝臓において 著明なエネルギー代謝の亢進が起こり、 主に筋タンパク質の分解により、 Lーァ ラニンを代表とするアミノ酸が供給され、 糖新生 （Felig P. et al., etabolis m 22, 179-207 (1973)) やタンパク質合成の基質として利用されることが古くか ら報告されている。 このように肝再生時には、 Lーァラニンは糖新生によりエネ ルギーを供給していると考えられているのが一般的である。 実際、 肝再生モデル ラットにおいて、 肝切除後 9あるいは 18時間に L—ァラニンの酸化が抑制され、 血漿グルコース濃度の増加、 肝グリコゲンの蓄積、 Fruc tose- 1 , 6- Diphosphatase や PEPCKの活性上昇も報告されている （Kl ain GJ. et al .， J. Nut r. Bi oc em. 1 (Nov. ) , 578-584 (1990) ) 。
以上の知見から、 Lーァラニンが肝再生を促進することがわかり、 またその作 用メカニズムは、 Lーァラニンが肝再生時のエネルギー供給を亢進していること によるという仮説を立てた。 そこで、 後述の実施例で示すように、 Lーァラニン の代謝に関連するラットの遺伝子 59種について、 肝再生時における発現を解析し たところ、 17種の遺伝子において発現の変動が認められた。 したがって、 本発明 の遺伝子パネルの作成において、 前記ステップ （a ) に先立って、 Lーァラニン の代謝に関与する遺伝子を選択してもよい。
肝再生時に発現変動が観察されない遺伝子であっても、 実施例 3に示すように、 肝再生時又はその前後に Lーァラニンを投与することによって、 発現変動が認め られる場合がある。 そのような遺伝子も、 遺伝子パネルに含めてもよい。 さらに、 Lーァラニン以外の肝再生を促進する作用を有する物質 （肝再生促進物質） を、 肝再生時又はその前後に投与してもよい。 そのような肝再生促進物質としては、 肝臓エキス ·フラビンアデニンジヌクレオチドの混合物 (肝臓エキス 15 1、 FAD 10mg/l ml) 、 肝臓加水分解物、 柴胡桂枝湯、 小柴胡湯、 ジクロロ酢酸ジィソプ 口ピルァミン、 胎盤加水分解物、 バリン （W00113912) 、 血管増殖因子 （VEGF，VP F) ( 00132213) 、 マクロライド化合物 (JP3240728) 、 TCF I I (JP10194986) 、 T GF- /3放出 .活性化 ·合成抑制剤 （JP8333249) 、 グルコース -1-リン酸、 ダルコ ース- 6-リン酸 （JP2202821) 、 脱シアル化ォロソムコイド （JP6122025) 等が挙 げられる。
本発明の遺伝子パネルは、 上記のようにして同定される各種遺伝子の名称と、 それぞれの遺伝子の発現プロファイルを少なくとも含む。 遺伝子の名称は、 他の 遺伝子と区別することができる限り特に命名法は制限されないが、 典型的には、 その遺伝子によってコードする産物の名称、 GenBank等のデータベース上のァク セッション番号や遺伝子名など、 あるいは遺伝子チップ上のプローブセット名ゃ 遺伝子名等が用いられる。
本発明において 「発現プロファイル」 とは、 遺伝子パネルに含まれる各々の遺 伝子の発現レベルの変動に関する情報をいう。 好ましい態様においては、 発現レ ベルは、 経時的に測定、 記録される。 発現プロファイルにおいて、 遺伝子の発現 レベルは、 絶対値で表されてもよく、 相対値で表されてもよい。
本発明の遺伝子パネルの好ましい形態においては、 各遺伝子は、 肝切除後一定 時間における発現レベルによって分類される。 例えば、 肝切除後 1時間、 6時間 (肝再生初期） に発現が顕著に上昇するグループ （グループ 1、 2 ) 、 逆に減少 するグループ （グループ 6、 7 ) 、 肝切除後 2 4時間、 4 8時間 （肝再生中期） に発現が顕著に上昇するグループ （グループ 3、 4 ) 、 逆に減少するグループ (グループ 8、 9 ) 、 肝切除後 7日 （肝再生後期） に発現が顕著に上昇するダル —プ （グループ 5 ) 、 逆に減少するグループ （グループ 1 0 ) に分類される。 こ こでいう顕著とは、 発現の増減が、 肝切除前のそれと比べ Gene ch ipの場合は 3 倍以上、 Taqman- PCR (SYBR Green) 法の場合は有意差検定で差があれば、 発現に 差があるものとする。
本発明の遺伝子パネルのある形態では、 各グループは、 表 1でリストアップさ れているように、 発現増減後の発現がそのレベルで維持される時間、 あるいは増 減を続ける時間が長いものの順に並べることができる。
さらに遺伝子パネルは、 好ましくは、 肝切除後一定時間における肝臓重量に関 する情報を含む。 例えば、 肝再生初期 （肝切除後 1時間、 6時間） 、 肝再生中期 (肝切除後 24時間、 48時間） 、 肝再生後期 （肝切除後 7日） の肝臓を摘出し、 そ れぞれの肝重量を測定する、
本発明の遺伝子パネルは、 それぞれの遺伝子の発現レベルを解析するための P C Rプライマー群の配列情報を含んでいてもよい。 前記プライマーとしては、 配 列番号 1〜1 2 7、 及び 1 3 5〜1 9 2に示すオリゴヌクレオチドの全部又は一 部からなるプライマー群が挙げられる。 また、 プライマ一群の配列情報に加えて、 ATAC- PCR法及び/又は Taqman PCR (SYBR Green) 法に用いるアダプターの塩基配 列情報を含んでいていてもよい。 配列番号 1〜1 2 7は ATAC- PCR法、 配列番号 1 3 5〜： L 9 2は Taqman PCR (SYBR Green) 法用のプライマーである。 アダプタ一 の塩基配列としては、 配列番号 1 28〜133に示す塩基配列を有するアダプタ 一が挙げられる。
< 2 >本発明のスクリーニング法
本発明の遺伝子パネルをもとにして、 遺伝子パネルに含まれる遺伝子の発現を 定量的、 半定量的に測定するシステムを構築することにより、 各種スクリーニン グが可能となる。
例えば、 モデル動物または肝臓の組織もしくは細胞に薬剤を投与し、 本発明の 遺伝子パネルを構成する遺伝子の発現プロフアイリングを行うことにより、 肝再 生に関与する薬剤のスクリーニングを行うことができる。 すなわち、 薬剤の投与 によって、 各遺伝子の発現プロファイルが遺伝子パネルにおける発現プロフアイ ルと類似するような薬剤は、 肝再生を促進すると考えられる。
また、 本遺伝子パネルの遺伝子の発現増加をさらに増加させる薬剤、 もしくは 発現減少をさらに減少させる薬剤をスクリーニングすることによつても、 肝再生 促進物質のスクリーニングが可能である。 この場合、 6種程度の遺伝子の発現変 化に注目することにより、 スクリーニングが可能である。 この考えに基づいたス クリーニングの例を、 後記実施例に示した。
前記 6種の遺伝子としては、 例えば、 表 1 ((1)〜（1 1)) に示す遺伝子パネ ルの 1 37種の遺伝子のうち、 番号 5 (ァミノアシッドトランスポーターシステ ム A： amino acid transporter system A (ATA2) ) 、 1 7 (ハイモビリティグル ーププロテイン 2 ： high mobility group protein 2) 、 36 (ニュークリア一 R NAヘリカーゼ： nuclear RNA helicase) 、 46 (リバ一ニュークリア一プロティ ン p47： liver nuclear protein p47) 、 67 (リュ一ケミアァソシエイテツドサ ィ卜ゾリックフォスフォプロテインス夕スミン： Leukemia— associated cytosol i c phosphoprotein stathmin) 、 68 (デォキシ UTPァーゼ： dUTPase) の各遺伝 子が挙げられる。
遺伝子の発現プロフアイリングの方法としては、 遺伝子パネルを構成する遺伝 子の断片を固定したスライドガラス又はナイロンメンブレン等を用いた DNAマイ クロアレイ法、 MAマクロアレイ法、 あるいは ATAC- PCR法、 Taqmanプローブを利 用した方法、 又は SYBR Greenを利用した定量的 PCR法等が挙げられる。 発現プロ フアイリングは、 単独の方法で行ってもよく、 複数の方法を組み合わせてもよレ^ 以下に、 スクリーニングの具体的手順の一例を示す。
第一次スクリーニングとして、 スクリーニング対象薬剤で培養肝細胞を処理、 あるいは薬剤をラットに投与し、 一定時間後の細胞あるいは肝臓から RNAを調製 する。 薬剤処理前後の遺伝子発現レベルを測定し、 その発現プロファイルが遺伝 子パネルに相似した薬剤をスクリーニングする。 薬剤処理後の肝細胞における遺 伝子発現パターンをグループ化し、 遺伝子発現パネルのグループ化と相似した薬 剤をスクリーニングする。 グループ化は、 遺伝子パネルの作成におけるのと同様 にして、 一定時間における発現レベルによって分類することによって行われる。 肝細胞の培養条件としては、 通常の培養、 又は、 培地にガラクトサミン、 重金 属イオン、 四塩化炭素など肝細胞に障害を与える物質を加える、 等の方法が挙げ られる。 通常の条件で培養することにより、 肝再生促進物質、 又は培養肝細胞の 細胞増殖を促進する物質がスクリーニングされることが期待される。 また、 肝細 胞に傷害を与える物質の存在下で培養することにより、 細胞障害時に肝再生によ る肝機能回復を促す物質がスクリーニングされることが期待される。
第二次スクリーニングとして、 一次スクリーニングで肝再生促進作用を示すと 予想される候補薬物を、 部分肝切除したラットに投与し、 一定時間毎、 例えば肝 再生初期 （肝切除後 1時間、 6時間） 、 肝再生中期 （肝切除後 2 4時間、 4 8時 間） 、 肝再生後期 （肝切除後 7日） の肝臓を摘出する。 この肝重量を測定すると ともに、 これから RNAを抽出し遺伝子発現変化を測定する。 これらのデータを、 薬剤を投与しない部分肝切除ラッ卜の肝重量変化と遺伝子発現変化データと比較 し、 薬剤の肝再生に対する効果を評価する。
上記スクリーニングは、 ラット以外の実験動物を利用しても可能であり、 その 場合、 ラット遺伝子に対応するホモログについて遺伝子パネルを作り直し、 スク リ一二ングを実施することが好ましい。
遺伝子パネルと同じ発現変動を示す薬剤のスクリーニング以外にも、 遺伝子パ ネルを利用して、 以下のような薬剤スクリーニングが可能である。 肝再生初期に 変動が見られる遺伝子群 （例えば前記グループ 1、 2、 6、 7 ) は、 肝再生のィ ニシエーシヨンに重要な遺伝子群と考えられる。 従って、 薬剤処理により、 これ らと相似のパターンを示す薬剤をスクリーニングすることにより、 肝再生のィニ シエーシヨンに効く薬剤が得られると期待できる。
また、 肝再生中期に変動が始まる遺伝子群 （例えば前記グループ 3、 4、 8、 9 ) は、 肝再生のイニシエーションを受けて、 肝細胞の増殖又は分化の促進に働 く遺伝子群であると考えられる。 従って薬剤処理により、 これらと相似のパター ンを示す薬剤をスクリーニングすることにより、 肝細胞の増殖又は分化にプラス に作用する薬剤が得られると期待できる。
肝再生後期に変動が始まる遺伝子群 （例えば前記グループ 5、 1 0 ) は、 肝再 生の終結、 あるいは再生完了後の正常な肝細胞機能に重要な遺伝子群であると考 えられる。 従って、 薬剤処理により、 これらと相似のパターンを示す薬剤をスク リーニングすることにより、 肝細胞の増殖にマイナスに作用する薬剤、 あるいは 再生完了後の正常な肝細胞機能に有効な薬剤が得られると期待できる。 肝細胞の 増殖にマイナスに作用する薬剤は、 肝細胞の過増殖を抑える目的に使用可能であ り、 肝癌等の薬剤として使用できる可能性が考えられる。
以上のように、 本発明の遺伝子パネルは、 肝再生の各過程 （例えばィユシェ一 シヨン、 細胞増殖、 分化、 細胞増殖停止など） において有効な薬剤のスクリー二 ングにも有用であると考えられ、 その結果得られた薬剤を組み合わせることによ り、 より有効な肝再生治療薬を創出することも可能であると考えられる。
Lーァラニンは肝再生効果があることが知られている。 しかし、 Lーァラニン 体内で容易に代謝し、 消失してしまうため、 充分な薬効が得られない。 そこで、 L—ァラニンと同様の薬効を持つ薬剤で、 よりよい特性、 たとえば体内動態が改 善され、 効果の持続性等を付加された物質が求められる。 また、 生薬のように、 原料を確保することが難しく、 複数の成分の混合物として作用するために、 薬効 は解っているが医薬として利用するには不十分な物質が存在する。 そのため、 肝 再生作用を有し、 供給が十分が物質が求められている。 本発明によれば、 医薬と して有用な物質を、 高感度、 かつ、 高効率でスクリーニングすることが可能とな る。
< 3 >本発明の肝の状態の評価法
肝炎、 肝硬変などの肝疾患において、 疾患肝が再生方向に向かっているか否か を評価する系に、 本遺伝子パネルを用いることが出来る。 また、 各患者の遺伝子 変動パターンを調べることにより、 患者ごとに適した薬剤投与を行うことが可能 である。 例えば、 本遺伝子パネルのある特定の遺伝子 （群） を特異的に正または 負に制御する一連の薬剤をスクリーニングする。 ここで、 各肝疾患患者における 遺伝子パネルの遺伝子発現を調べれば、 肝再生に必要な薬剤を選択することが可 能である。 図面の簡単な説明
図 1は、 アダプタ一の構造を示す図である。
図 2〜 4は、 肝再生時において Lーァラニンを投与したときに発現が変動する L—ァラニンの代謝に関連する遺伝子の相対発現量 （]3- Act inの相対発現量を 10 00としたときの発現量） を示す図。 発明の実施するための最良の形態 以下、 本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。 実施例 1
<1>再生肝の作製
F344/DvCrj (Fischer) ラット 10週齢にエーテル麻酔をかけ、 腹部を切開し、 切開部より左葉、 中間葉を押し出した。 縫合糸で左葉、 中間葉と右葉、 尾条葉の 間を縛り、 右葉、 尾条葉を体内に残し、 左葉、 中間葉を切り取った。 その後、 切 開部を縫合糸で縫い合わせた。 ただし切除後 0時間の個体は縫合をせず、 引き続 いて残存肝を摘出した。 肝切除 1時間後、 6時間後、 12時間後、 24時間後、 168時 間後に再切開し、 残存肝 （再生肝） を摘出した。 残存肝 （右葉、 尾条葉） 重量は、 ラット全肝 （右葉、 左葉、 中間葉、 尾条葉） 重量の約 30%であった。
各々 3個体ずつの肝再生モデルラットを作製し、 摘出時の残存肝重量を測定し たところ、 切除後 0時間では 2±0.3g (1.6g) 、 切除後 1時間では 1.7±0.3g (1.4g) 、 切除後 6時間では 2.1±0.5g (2.1g) 、 切除後 24時間では 2· 5± 0.5 g (3.0g) 、 切除後 48時間では 2.5±0.5g (2.0g) 、 切除後 7日では 5.6±0.3 g (5.8g) であった （ただし、 かっこ内の数値は、 後述する Gene Chipでの測定 に用いた再生肝の重量である） 。
<2>全 RNAの精製
ラット肝臓 1グラムに対し、 10m 1の IS0GEN (日本ジーン） を加え、 ホモジェ ナイズした。 得られたホモジネ一トを遠心し、 上清を回収した。 この上清に、 加 えた ISOGENlmlにっき 200 1のクロ口ホルムを加え、 軽く撹拌した。 室温に 2分 放置後、 15000回転、 4°Cで 10分間遠心分離し、 水層を新しい遠心チューブに移し た。 この水層に、 それと等量の 2-プロパノ一ルを加え、 室温に 5分放置後、 150 00回転、 4°Cで 15分間遠心した。 上清を捨て、 沈殿したペレットに 70%エタノー ルを加え、 15000回転、 4°Cで 15分間遠心後、 70%エタノールを除去することによ り、 ペレットをリンスした。 リンスしたペレットを室温で 5分間乾燥させ、 これ に DEPC (ジェチルピロカーボネート） 処理水を加え、 ペレットを溶解させた。 こ うして得られた全 RNA画分が精製されたことを、 1 %ァガロースゲル電気泳動に より確認した。
上記のようにして、 ラット部分肝切除後 0時間、 1時間、 6時間、 24時間、 48時 間、 168時間における残存肝 （再生肝） からそれぞれ全 RNAを精製し、 各種遺伝子 発現量の推移を、 GeneChip (Af fymetrix社製） 及び ATAC-PCRを利用して調べた。 < 3 >GeneChipによる遺伝子発現解析
GeneChipによる遺伝子発現解析は、 Af fymetrix社が推奨するプロトコールに準 拠して行った。 以下に手順を示す。
(1) プローブ合成
( i ) 二本鎖 cDNA合成
まず、 <2>で調製した全 RNAから、 Gibco BRL社製の SUPERSCRIPT Choice Sys temを用い、 二本鎖 cDNA合成を行った。 全 RNA 15 g、 T7-(dT)24 primer lOOpmo 1を DEPC処理水に溶解し、 11 zxlとした。 70°Cで 10分間反応後、 氷冷し、 5Xlst s trand cDNA buffer (Gibco BRL社製） 4 1、 0.1XDTT (ジチォスライトール、 G ibco BRL社製） 2 1、 10mM dNTP mix (Gibco BRL社製） 1 lを加え、 42°C、 2分 間保温した。 これに逆転写酵素 （Superscript II RT) 2 gを加えた後、 42°Cで 1 時間反応させた。 前記反応液に、 DEPC処理水、 5X2nd strand reaction buffer 30 K lOmM dN TP 3 し DNAリガ一ゼ 10U/ 1 l^K DNAポリメラ一ゼ I 10U/ 1 4 1、 RNaseH 2U/ 1を加えて混合した後、 16°Cで 2時間反応させた。 この後、 T4 DNAポリメ ラーゼ 5U/ 1 2 Ιを加え、 16 で 5分反応させた。 これに、 0.5M EDTA Ι Ι を加えた。 この反応液に等量の （フエノール：クロ口ホルム =1： 1) 溶液を加え、 これらが入ったチューブを上下に振って混ぜ合わせた。 この混合液を、 15000rpm、 4°Cで 10分間遠心分離し、 水層を新しい遠心チューブに移した。 この水層に、 3M の酢酸ナトリウムを 1/10量、 100%エタノールを 3倍量加え、 よく混合した。 - 80 °Cで 10分放置したのち、 15000rpm、 4°Cで 10分間遠心した。 沈殿したペレットを 7 0%エタノールで 2回リンスし、 室温で 5分間乾燥した後、 DEPC処理水を 12 1加 えた。
(Π) ピオチン標識 cRNAプローブの合成
次に上記で合成した二本鎖 cDNAから、 Enzo社製 Bio Array High Yield RNA Tra nscript Labeling Kitを使用して、 ピオチン標識 cRNAプローブを合成した。 二本 鎖 cDNA 5 1、 DEPC処理水 17 1、 10XHY buffer 4 1、 10Xピオチン標識リポ ヌクレオチド （Biotin labeled ribonucleotides) K 10XDTT 4/ K 10XRN ase inhibitor mix Afi 20XT7 MAポリメラーゼ 2〃 1を混合し、 37でで 4時間 反応させた。
次に、 上記のようにして合成したピオチン標識 cRNAプローブ溶液から、 未反応 の Biotin labeled ribonucleotidesを、 Qiagen社製 RNeasyを使用して除いた。 ピ ォチン標識 cRNAプローブ溶液に、 DEPC処理水 160 1を加え、 RLT buffer 700 1 を混合し、 ついで 100%エタノール 500 1を加え、 よく混合した。 この溶液を、 7 00 lずつ RNeasy mini spin columnに加え、 8000rpmで 15秒間遠心した。 溶出液 を、 再度 RNeasy mini spin columnに加え、 8000rpmで 15秒間遠心した。 次に、 RP E buffer 500 1を easy mini spin columnに加え、 8000i"pmで 15秒間遠心した。 再度 RPE buffer 500 1を RNeasy mini spin columnに加え、 15000rpmで 2分間遠 心した。
上記のようにしてピオチン標識 cRNAプローブを吸着させ、 洗浄した RNeasy rain i spin columnを、 新し 遠 、チューブ ίこ移した。 この RNeasy mini spin column に DEPC処理水 30 ilを加え、 室温で 1分間放置した。 8000rpmで 15秒間遠心し、 精 製されたピオチン標識 cRNAプローブ溶液を溶出させた。
次に、 精製されたピオチン標識 cRNAプローブ溶液の断片化を行った。 ピオチン 標識 cRNAプローブ溶液、 5XFragmen tion buffer (最終溶液量の 1/5量を加え る） を混合して、 ピオチン標識 cRNAプローブ濃度が 0.5 g/ lとなるよう調整 し、 94°Cで 35分間反応させた。 1 %ァガロースゲル電気泳動を行い、 プローブが おおよそ 100塩基前後の長さに断片化されているのを確認した。
(2) 八イブリダィゼーション
ハイブリダィゼーシヨンは、 まずテストチップ （TEST2 Chip) で断片化ビォチ ン標識 cRNAプロ一ブの出来を評価し、 問題がないことを確認した後に本試験を行 つた。 本試験には、 ラットチップセット （RG-U34A, RG-U34B, RG-U34C) を用い た。 これら 3種のラットチップセットには、 計 7000種のラット既知遺伝子と、 17 000種の未知遺伝子が含まれている。 テストチップ、 ラットチップセットのいず れも、 以下の手順でハイブリダィゼーションを行った。
断片化ピオチン標識 cRNAプローブ 60 g、 コントロール oligonucleotied B2 (5nM) 12 1、 lOOXcontrol cRNA カクテル 1 K 二シン精子 DNA (lOmg/ral) U ァセチル化 BSA (50ing/mg) U 2XMESハイブリダィゼ一シヨンバッフ ァ 600 /1を加え、 DEPC処理水で 1200 1に調整した （以下、 「ハイブリダィゼー シヨンカクテル」 と呼ぶ） 。 ハイブリダィゼーシヨンカクテルを 99°C、 5分加熱 して熱変性を行い、 45 に 5分間置いた後、 15000rpm、 室温で 5分間遠心した。 上清を、 テストチップ （TEST2 Chip) では 80 1、 ラットチップセット （RG- U34A， RG-U34B, RG-U34C) では 200 1分取し、 ハイブリダィゼーシヨンに使用した。
Genechipを室温にもどし、 1XMES buffer (Test2 chipは 80 1、 ラットチップ セットは 200 1) 、 45°Cで 10分、 60rpmでプレハイブリダィゼーシヨンを行った。 次に、 プレハイブリダィゼ一シヨン液を除去し、 前記の熱変性させたハイブリダ ィゼ一シヨンカクテルを添加し、 45°C、 16時間、 60rpmでハイブリダィゼ一ショ ンを行った。
(3) 洗浄、 染色及びスキャニング
Genechipからハイブリダィゼーシヨンカクテルを除去し、 non stringent wash bufferを入れ、 Fluidic station (Af fimetrix社製） にて洗浄及び染色を行った。 洗浄及び染色は、 Test2 Chipでは Fluidic stationの Minし euklプロトコールに従 い、 ラットチップセットでは EukGE- WS2プロトコ一ルに従って行った。 洗浄及び 染色終了後、 スキャナ一にてチップのスキャニングを行い、 画像データを取り込 んだ。
(4) データ解析
ハイブリダィゼーシヨンのデータ解析は、 GeneChipアナリシススイートによつ て行った。 各遺伝子の発現量は、 全遺伝子の発現の平均値を 100とし、 それに対 する相対値 （Average Differences) で表した （表 1 (1)〜（1 1)) 。 表中、 ジ ーンチッププローブセット名は、 affymetrix社によって命名された、 各遺伝子に 対応する管理用背番号である。 ュニジーンは GenBankに登録された DNA配列を、 遺 伝子 （転写産物） 種ごと、 及び生物種ごとにまとめたものである。
表中の Ohrのカラムは、 部分肝切除後 0時間のラット肝臓において調べた遺伝子 発現量であり、 同様に lhr, 6hr, 24hr, 48hr, 7dのカラムは、 それぞれ部分肝切 除後 1時間、 6時間、 24時間、 48時間、 7日のラット肝臓における遺伝子発現量で ある。 0hr/0hr， lhr/Ohr, 6hr/0hr, 24hr/0hr, 48 r/0hr, 7d/0hrは、 それぞれ 部分肝切除後 0時間における遺伝子発現量に対する、 部分肝切除後 0時間、 1時間、 6時間、 24時間、 48時間、 7日における遺伝子発現量の相対値である。 ただし、 少数点第 2桁を四捨五入して表してある。 また発現量の数値が 0以下のものにつ いては、 発現比を求める都合上、 数値を 1とした。
遺伝子パネル作製には、 既知遺伝子 （全 0RFを含む遺伝子配列構造が GenBankデ 一夕ベースに登録済みのものであり、 ESTなどの部分配列のみ明らかなものを除 いたもの） を用いた。
正常時肝臓における発現に比べ、 再生肝における発現増加が著しい （約 3倍以 上増加、 表 1で太字で表示） 既知遺伝子は 77種であり、 正常時肝臓における発現 に比べ、 再生肝における発現減少が著しい（約 1Z 3倍以下に減少、 表 1で斜字 で表示） 既知遺伝子は 60種であった。 これらのうち、 肝再生の間に著しい発現増 加に加え、 減少も見られた既知遺伝子は 7種存在した。 すなわち 137種の既知遺 伝子に、 肝再生時における著しい （肝切除前に対し 3倍以上の増減） 発現変動が
Figure imgf000021_0001
表 1(2)
Figure imgf000022_0001
表 1 (3)
Figure imgf000023_0001
表 1(4)
Figure imgf000024_0001
表 1 (5)
肝切除前 (Ohr)に対する切除 ATAC-PCR用プライ 遺伝子発現強度 肝切除前（Ohr)に対する切除後の発現釐比 (ATAC)
後の発現置比（GeneChip) マーに関する情報 グ GeneChip 使用した制 ジーンチップ 基配列 番号 Ohr 1 hr 6hr 24hr 48hr 7d Ohr 1hr 6hr 24hr 48hr 7d ル Ohr 1 hr 6hr 24hr 48hr 7d dataとの 塩
限酵素 (空 プローブセット名
—プ 相関性 12列番号棚は Mbol)
1 U17254_g_at 26 765 112 6 60 32 1 29 4.3 0.2 2.3 1.2 1.0 14.9 1.3 1.3 3.2 0.8 0.985 1
1
2 J05460_s_at 168 1042 1 180 157 636 1 6.2 0 1.1 0.9 3.8 2
1
3 E01524cds_s.at 111 530 596 147 95 124 1 4.8 5.4 1.3 0.9 1.1 1.0 6.4 7.1 2.6 2.3 1.8 0.982 3
1
4 39 461 533 171 275 275 1 12 14 4.4 7.1 7.1 4
at 1
5 ro_AI171231.at 94 966 1330 92 129 218 1 10 14 1 1.4 2.3 1 1.0 11.2 13.1 3.5 1.2 1.8 0.975 5
6 rc.A1070318.at 53 202 437 118 99 88 1 3.8 8.2 2.2 1.9 1.7 1 1.0 4.3 4.1 8.4 3.0 1.3 0.225 6
7 M58587— at 86 343 416 69 94 114 1 4 4.8 0.8 1.1 1.3 1 1.0 1.5 1.5 1.0 0.9 1.3 0.875 7
8 AF036335 at 12 36 114 56 54 37 1 3 9.5 4.7 4.5 3.1 1 1.0 140.5 676.2 261.9 258.2 311.3 0.958 8
9 D12769_g_at 189 713 482 118 220 259 1 3.8 2.6 0.6 1.2 1.4 1 1.0 2.2 1.3 0.8 0.4 1.5 0.814 9
10 rc.AH03604.at 166 978 99 279 267 237 1 5.9 0.6 1.7 1.6 1.4 1 1.0 0.3 0.9 1.0 0.9 0.5 -0.787 10
11 rc— M900505— at 28 222 133 91 193 83 1 7.9 4.8 3.3 6.9 3 1 1.0 4.4 2.0 2.1 4.1 5.0 0.579 11
12 M849767一 at 71 589 328 307 161 145 1 8.3 4.6 4.3 2.3 2 12 Nla III
13 rc_AI137820— at 44 244 103 71 91 58 1 5.5 2.3 1.6 2.1 1.3 13
14 rc.AA849718_g.at 162 705 612 586 558 964 1 4.4 3.8 3.6 3.4 6 14
15 rc— AI101099一 at 264 1421 1374 236 137 502 1 5.4 5.2 0.9 0.5 1.9 15
16 60921_at 155 547 566 257 221 270 1 3.5 3.7 1.7 1.4 1.7 1.0 18.4 16.8 3.5 4.0 3.8 0.984 16
17 rc_AI008836.s_at 4 40 33 t66 245 112 1 10 8.3 42 61 28 1.0 0.3 0.2 1,0 1.6 2.2 0.562 17
18 S74351.s.at 159 667 165 69 74 15 1 4.2 1 0.4 0.5 0.1 1.0 5.8 1.1 0.3 1.0 3:8 0.730 18
19 D37920— at 17 57 124 36 28 97 1 3.4 7.3 2.1 1.6 5.7 1.0 3.7 4.4 4.4 4.0 3.8 0.516 19
20 M58634.at 100 986 924 37 1 241 1 9.9 9.2 0.4 0 2.4 1.0 20.9 9.5 1.2 3.6 5.7 0.882 20
表 1(6)
Figure imgf000026_0001
表 1(7)
Figure imgf000027_0001
一 表 1 (8)
ATAC-PGR用プライ 肝切除前 (Ohr)に対する切除
遗伝子発現強度 肝切除前 (Ohr)に対する切除後の発現量比 (ATAC) マーに関する 情 後の発現量比（GeneChip)
報
ク GeneChip 1£fflし Γ:制 ジーンチップ 塩基 IB列 番号 — Ohr 1 hr 6hr 24hr 48hr 7d Ohr 1hr 6hr 24hr 48hr 7d 6hr 24hr 48hr 7d dataとの
ノ π υーーづノ 、ッ"に卜々! 6 ル Ohr Ihr 限酵素 (空 ープ 相関性 梱は Mbol)
61 S80431.s.at 36 66 17 285 356 208 1 1.8 0.5 7.9 9.9 5.8 3 58 Bfa I
62 J03786— s— at 84 183 162 416 555 170 1 2.2 1.9 5 6.6 2 3 1.0 3.5 5.8 6.6 12.3 7.2 0.841 59
63 rc— AI639082— s— at 41 36 27 19t 100 76 1 0.9 0.7 4.7 2.4 1.9 3 1.0 0.7 1.1 0.7 3.0 2.7 0.027 60
64 rc— AA818524— at 21 26 57 234 197 267 1 1.2 2.7 11 9.4 13 3 1.0 1.7 1.9 2.6 2.5 4.7 0.852 61
65 rc_AA998683 at 73 181 65 394 259 37 1 2.5 0.9 5.4 3.5 0.5 3 1.0 0.9 0.7 1.7 3.9 1.2 0.516 62
66 M33329— f— at 180 406 134 633 633 896 1 2.3 0.7 3.5 3.5 5 3 1.0 1.5 0.4 0.9 1.3 2.6 0.795 63
67 rc.AI231821.at 37 56 13 227 385 179 1 1.5 0.4 6.1 10 4.8 3 1.0 1.4 0.4 4.6 1.1 0.7 0.308 64
68 U64030_at 29 38 28 207 233 97 1 1.3 1 7.1 8 3.3 3 1 0.4 0.3 0.9 0.6 0.4 0.270 65
69 M22670cds_g_at 64 71 105 210 54 47 1 1.1 1.6 3.3 0.8 0.7 3 66 Nla III
70 D14014— at 180 189 79 713 553 261 1 1.1 0.4 4 3.1 1.5 3 1.0 1.6 2.5 1.5 3.9 0.8 0.258 67
71 L15079mRNA.s.at 129 144 69 513 486 184 1 1.1 0.5 4 3.8 1.4 3 1 2.3 1.1 3.5 1.9 1.4 0.740 68
72 V01227_s.at 48 59 79 135 156 97 1 1.2 1.6 2.8 3.3 2 4 69
73 M37584— at 173 156 162 447 693 450 1 0.9 0.9 2.6 4 2.6 4 70 Sfa l
74 ro.AA946368.at 34 45 79 86 157 191 1 1.3 2.3 2.5 4.6 5.6 4 71
75 rc_AI230970.f.at 462 1181 856 1227 1031 1606 1 2.6 1.9 2.7 2.2 3.5 5 1.0 1.4 1.1 0.9 0.7 2.6 0.678 72
76 rc— M925864— at 22 4 50 55 64 358 1 0.2 2.3 2.5 2.9 16 5 1.0 1.4 1.5 2.7 3.3 2.7 0.458 73
77 D14989—f— at 147 296 101 414 334 586 1 2 0.7 2.8 2.3 4 5 74 Nla III
78 rc— AI234295— at 180 44 18 282 500 226 1 0.2 0.1 1.6 2.8 1.3 6 75
79 rc.AI234100.f.at 240 68 17 148 256 237 1 0.3 0.1 0.6 1.1 1 6 1.0 2.6 2.8 0.8 0.8 0.9 -0.883 76
80 1 1794cds#2.f at 1181 289 1 902 593 912 1 0.2 0 0.8 0.5 0.8 6 1.0 5.3 19.8 2.6 1.2 3.9 -0.775 77
Figure imgf000029_0001
表 1 (1 0)
ATAC-PCR用プライ 肝切除前 (Ohr)に対する切除
遣伝子発現強度 肝切除前 (Ohr)に対する切除後の発現 fi比 (ATAC) マーに関する 情 後の発現置比（GeneChip)
報
グ GeneChip fe用した制 ジーンチップ
番号 Ohr 1 hr 6hr 24hr 48hr 7d Ohr 1hr 6hr 24hr 48hr 7d ル Ohr 1 hr . 6hr 24hr 48hr 7d dataとの 塩基配列
限酵素 (空 ブローフセッ卜名 相関性 配列番号
-プ 襴は Mbol)
101 D17370.at 742 559 182 861 844 1039 1 0.8 0.2 1.2 1.1 1.4 7
102 AJ01 1656cds_s.at 262 389 53 406 354 266 1 1.5 0.2 1.5 1.4 1 7
103 ro.AI177004.s.at 172 164 21 92 134 280 1 1 0.1 0.5 0.8 1.6 7 1.0 1.4 0.3 1.7 0.4 1.9 0.649 97
104 ro.AI172293.at 284 286 85 192 182 491 1 1 0.3 0.7 0.6 1.7 7 1.0 1.3 0.2 1.2 0.5 1.3 0.788 98
105 rc.AA957498.at 249 154 1 65 72 46 1 0.6 0 0.3 0.3 0.2 7 99
106 roJM232087.at 1152 1002 557 344 570 264 1 0.9 0.5 0.3 0.5 0.2 8 100
107 18363ods_s.at 1447 1228 11 13 358 599 342 1 0.8 0.8 0.2 0.4 0.2 8 1.0 1.4 1.0 0.1 0.2 1.6 0.326 101
108 J02585.at 1386 899 1001 165 357 1453 1 0.6 0.7 0.1 0.3 1 8 102 Nla III
109 rc— A1044610— s_at 482 447 294 100 389 357 1 0.9 0.6 0.2 0.8 0.7 8 1.0 1.3 0.9 0.1 1.4 1.3 0.828 103
110 X06150cdsふ at 1605 1313 1 180 51 1 972 1203 1 0.8 0.7 0.3 0.6 0.7 8 1.0 1.4 2.9 0.8 2.1 1.8 0.079 104
111 J05031_g_at 470 428 366 1 15 179 233 1 0.9 0.8 0.2 0.4 0.5 8 1.0 1.6 1.1 0.6 1.0 1.5 0.499 105
112 ro.AA925393.at 966 386 1465 162 311 860 1 0.4 1.5 0.2 0.3 0.9 8 106
113 rc.AA926200.at 1060 1588 602 120 684 983 1 1.5 0.6 0.1 0.6 0.9 8 1.1 1.4 0.9 0.4 1.8 2.9 0.370 107
114 AF037072.at 909 787 627 91 148 140 1 0.9 0.7 0.1 0.2 0.2 8 1.0 1.1 0.6 0.0 0.4 0.8 0.822 108
115 rc一 AA819899— at 340 268 236 104 73 152 1 0.8 0.7 0.3 0.2 0.4 8 1.0 2.3 1.4 1.1 1.0 1.1 0.407 109
1 16 M22359mRNA.s.at 481 724 375 149 99 247 1 1.5 0.8 0.3 0.2 0.5 8 1.0 1.6 1.1 0.3 0.2 1.8 0.629 110
117 K00996mRNA.s.at 935 796 522 215 299 511 1 0.9 0.6 0.2 0.3 0.5 8 1.0 1.6 6.7 3.0 3.4 5.3 -0.433 111
118 M59861— at 611 565 31 1 178 283 425 1 0.9 0.5 0.3 0.5 0.7 8 1.0 1.7 1.0 0.3 1.1 1.9 0.582 112
119 rc.AI169656.at 1437 1303 786 482 485 61 1 0.9 0.5 0.3 0.3 0 8 1 13
120 XI 4552— at 151 271 100 52 108 14 1 1.8 0.7 0.3 0.7 0.1 8 114
表 1(11)
Figure imgf000031_0001
相関係数が 0.7以上のもの 34.000 45% 相関係数が 0.5以上のもの 50.000 67¾ ATAG-PCRで測定した遺伝子
75.000 数
< 4 >ATAC- PCRによる遺伝子発現解析
ATAC- PCRは、 加藤菊也らによって開発された技術であり （Kato， K. et al .， uc l . Ac i ds Res. , 25, 4694-4696, 1997) 、 蛍光プライマーを用いた競合的 RT - P CRを基としている。 ATAC- PCRは、 多数の遺伝子の発現解析を簡便に定量的に行う ことができる。 ここで行った ATAC- PCR法の実験手順は、 加藤らの方法に準拠する (Ka t o, K. et al .， Noe l . Ac i ds Res. , 25, 4694-4696, 1997) 。
まず、 5'ピオチン化オリゴ dTプライマーを用いて合成した cDNAから二本鎖 DNA を合成し、 これを特定の制限酵素 （ここでは Mbolを用いた例について述べる） で 切断した。 次に、 この制限酵素で切断された部位と共通の配列を末端に持つァダ プター （長さの異なる 6種類を用意する） と、 制限酵素 Mbo lで切断した二本鎖 DN Aを、 MAライゲースにより連結した。 尚、 6種類のアダプタ一のうち、 3種類を コントロール cDNA (肝切除前のラット肝臓から調製した cDNA) に結合し、 10 : 3 ： 1の比率で混合した。 残る 3種類のアダプタ一に、 肝切除後 1時間、 6時間、 24 時間、 48時間、 7日のラット肝臓から調製した cDNAを結合させた。
それぞれの連結反応物を混合した後、 ストレプトアビジンコートされたビーズ を用いて二本鎖 cDNAの 3'断片を回収し、 各アダプターに共通する配列を持つブラ イマ一を用いて競合的 RT- PCRを行った。 この PCR産物を、 ABI PRISM 3700 DNA An alyzerにより解析した。 この装置は、 キヤピラリー電気泳動により、 断片の長さ 毎に分離することができ、 発現量に比例した蛍光強度を検出することができる。
コントロールから得られた PCR産物の蛍光強度より検量線を作成し、 それを用 いて、 測定を行う切除肝における遺伝子発現変化量を算出した。
以下に、 用いたアダプターの塩基配列を示す。
(アダプタ一 1、 配列番号 1 2 8 )
5' -GTACATATTGTCGTTAGAACGCG-3'
3' -CATGTATAACAGCAATCTTGCGCCTAG-5'
(アダプタ一 2、 配列番号 1 2 9 )
5' -GTACATATTGTCGTTAGAACGCGACT-3'
3' -CATGTATAACAGCAATCTTGCGCTGACTAG-5' (アダプター 3、 配列番号 130)
5 ' -GTACATATTGTCGTTAGAACGCGCATACT-3'
3 ' -CATGTATAACAGCAATCTTGCGCGTATGACTAG-5 '
(アダプター 4、 配列番号 131)
5 ' -GTACATATTGTCGTTAGAACGCGATCCATACT-3'
3' -CATGTATAACAGCAATCTTGCGCTAGGTATGACTAG 5'
(アダプター 5、 配列番号 132)
5'-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTCAATCCATACT-3'
3'-CATGTATAACAGCAATCTTGCGCAGTTAGGTATGACTAG-5'
(アダプター 6、 配列番号 133)
5'-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTACTCAATCCATACT-3'
3'-CATGTATAACAGCAATCTTGCGCATGAGTTAGGTATGACTAG-5' 競合的 PCRに用いたプライマーセットは、 アダプター側は各遺伝子共通で、 下 記塩基配列を有するプライマーを用い、 各遺伝子特異的プライマーは表 1及び配 列表に示した配列を用いた （5'から 3'方向に示してある） 。
(アダプター側プライマー）
5' -GTACATATTGTCGTTAGAACGC-3' (配列番号 1 34)
Mbol以外の制限酵素を用いた ATAC- PCRで発現変動を調べたものについては、 使 用した制限酵素名を表 1に示した。 またその場合使用するアダプター配列は、 Mb olを用いた場合とは末端配列が異なるものを使用した。 図 1に、 異なる部分 （太 字） の配列を示した。 ぐ 5 >肝再生促進物質候補のスクリ一エングへの遺伝子パネルの応用
本発明の遺伝子パネルが、 肝再生促進物質のスクリーニングに有効であること を示すための実験を行った。
Lーァラニンは、 肝再生促進効果があることが知られている （Maezono K et.a
1. , Hepatology 24(5) , 1996, Effect of Alanine on D-Galactosamine - Induced Acute Liver Failure in Rats；特開平 5- 229940号） 。 そこで、 ラット部分肝切 除を行い、 切除 18時間後及び 21時間後に Lーァラニンを経口投与し、 切除後 24時 間における遺伝子発現を調べた。
6週齢の F344系雄性ラット （120g) 5個体を、 6日間、 飼料 CRF- 1 (オリエン タル酵母） と水を供与して予備飼育した後に、 体重が等しくなるように 2群 （第 1群及び第 2群） に分け、 解剖 24時間前に Higgins- Andersonの方法 （Higgins, G.M. and Anderson, R. M. , 1931, Arch. Pathol. 12: 186- 191)にて、 70%部分 肝切除を施行した。 剖検日は、 解剖 6時間前より絶食させた。 解剖 6時間前と 3 時間前に、 2g/10ml/kgの Lーァラニンを、 0.3%カルボキシメチルセルロース (CM 0 水溶液で経口投与した。
解剖は、 麻酔下で放血屠殺した後に行い、 肝臓を摘出、 抨量した後、 凍結保存 して、 ATAC-PCR法による mRNAの発現測定に供した。 また肝標本を作製して、 肝 PC NA (増殖細胞核抗原） 量を計測した。
各群のラット肝臓における遺伝子発現の測定は、 ATAC- PCRにより行った。 RNA の調製法及び ATAC- PCRの方法については、 前述の通りである。 ATAC- PCRの測定は、 遺伝子パネルの遺伝子のうち、 制限酵素 Mbolを利用した ATAC- PCRで測定可能な 11 7種類 （表 1の番号 12， 49, 52, 55, 58， 59, 61, 69, 73, 77, 83, 90, 93, 101, 102, 108， 130, 134, 135, 136以外のもの） について測定した。
一方、 Lーァラニン投与したラット肝臓を、 抗 P CNA抗体 （DNAポリメラ ーゼ <5の活性を促進する複製因子である Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) に対する抗体） を用いて染色し、 PCNA Labeling Indexを、 田中ら の方法 （田中ら、 病理と臨床、 第 9巻第 6号、 第 7 9 1〜7 9 8頁、 1 9 9 1 年） により測定した。
PCNA Labeling Indexの測定結果を表 2に示す。 L—ァラニン投与により、 肝 における PCNA Labeling Indexは、 非投与肝に比べ上昇した （表 2) 。 表 2中、 A la+は Lーァラニン投与群、 Ala-は Lーァラニン非投与群を示す。 すなわち、 L —ァラ二ン投与による肝細胞増殖促進効果が認められた。 表 2
Figure imgf000035_0001
1 - 1〜1 - 3：第 1群
2- 1 , 2- 2：第 1群 また、 第 1群と第 2群における遺伝子発現を、 遺伝子パネルの遺伝子について ATAC- PCRによる発現測定を行い、 比較した。 発現は第 1群に対する第 2群の相対 値 （表 3中の Al a+/Al a-) で算出した。 その結果、 Lーァラニン投与、 非投与と で発現に 3倍以上の差があったものが、 7種見出された （表 3 ) 。 表 3
Figure imgf000035_0002
次に遺伝子パネルの遺伝子の発現変化と、 Lーァラニン投与による遺伝子発現 変化を比較するため、 遺伝子パネルの肝切除後 0時間の発現に対する第 2群の発 現比を算出した。 結果を表 4に示す。 なお、 表 4中の lhr， 6hr, 24hr, 48hr, 7d は、 それぞれ肝切除前の肝臓における遺伝子発現に対する切除後 1， 6， 24, 48時 間、 7日後の残存肝における相対発現値を示している。 ここで、 24hrと Ala+, 24hr とを比較すると、 遺伝子パネルの遺伝子のうち、 第 1群と第 2群の両方で発現レ ベルに顕著な差異 （3倍以上） が認められたものが 7種類 （番号 5， 17, 36, 46， 67， 68， 117) あり （表 4) 、 そのうち 5種（番号 17, 36, 46， 67, 68) は遺伝 子パネルと連動した結果となった。 すなわち、 遺伝子パネルで 24時間において切 除前より発現増加している遺伝子については、 L—ァラニン投与によりその発現 を上回る発現増加が見られ、 逆に遺伝子パネルで 24時間において切除前より発現 減少している遺伝子については、 Lーァラニン投与により、 その発現を下回る発 現減少が見られた。
それ以外の 2種 （番号 5， 117)については、 24時間で見ると、 Lーァラニン投 与による遺伝子パネルの発現変化の増加、 減少という結果は見られないが、 番号 5についてはその発現の極大時間 （6hr，lhr) では Lーァラニン投与により発現増 加がおこり、 その結果 24時間においても、 遺伝子パネルの発現より高い発現を維 持していると解釈できる。 一方、 番号 117については、 24時間において、 Lーァ ラニン非投与に比べて Lーァラニン投与では変動 （発現低下） の量が低下したこ とから、 肝再生促進物質候補のスクリーニングに用いるのに好適ではないと判断 される。 表 4
Ala- Ala+
番号 lhr 6hr 24hr 48hr 7d 24hr
5 10.3 14.1 1 1.4 2.3 4.8
17 10 8.3 41.5 61.3 28 228.3
36 1 3.2 5.6 5.4 3.3 25.8
4 & 1.3 5.4 2.6 4.3 3.2 11.4
67 1.5 0.4 6.1 10.4 4.8 25.6
68 1.3 1 7.1 8 3.3 24.9
117 0.9 0.6 0.2 0.3 0.5 0.6 以上のことから、 本遺伝子パネルを用いたスクリーニングにおいて、 6個程度 の遺伝子が顕著な発現変動 （3倍以上） を示し、 かつそれらが遺伝子パネルと連 動 （遺伝子パネルで発現増加する遺伝子は発現がさらに増加し、 発現減少するも のはさらに発現が減少すること） したものであれば、 肝再生促進物質候補として スクリーニングすることができると考えられる。 実施例 2 肝再生時における L—ァラニンの代謝に関連する遺伝子についての Taq man PCR (SYBR Green) による発現解析
前記 < 1>及び <2>と同様にして、 ラット部分肝切除後 0時間、 1時間、 6 時間、 24時間、 48時間、 1 68時間における残存肝 （再生肝） からそれぞれ 全 RNAを精製し、 各種遺伝子発現量の推移を Taqman PCR (SYBR Green) 法を利用 して調べた。
(1) 錡型の作製
Taqman PCR (SYBR Green) に用いるテンプレートの cDNA合成は、 Superscript First-Strand Synthesis System for RT-PCR (GIBCO BRL社製）を使用して実施し た。 全 RNA 500ng、
Figure imgf000037_0001
Oligo (dT) i 2- 1 8 l lOmM dNTP mix 1 1を05 PC処理水に溶解し、 全量を 10 1とした。 65°Cで 5分間反応後、 氷冷し、 10XRT buffer 2 l、 25mM MgC n 0.1M DTT 2 \, RNase Inhibitor I Iを加え て混合した後、 42°C、 2分間保温し、 逆転写酵素 SUPERSCRIPT II RT \β \ (5 0 units) を添加した。 42°C、 50 分間、 さらに 7 0°C、 1 5分間反応させた。
(2) 候補遺伝子の選択及びプライマーの設計
Lーァラニンの代謝に関連する遺伝子について、 肝再生時における発現プロフ アイルを調べた。 Lーァラニンの代謝に関連するラットの遺伝子を網羅的に抽出 するため、 外部データベース UniGene ( http://www.ncbi.nlni.nih.gov/UniGene ) を用い、 アミノ酸トランスポーター、 TCAサイクル、 呼吸鎖、 及び各種キヤリ ァに関連する keywordを検索し、 遺伝子の配列が既知であるもの、 またプライマ 一が設計可能であったものを 59種選抜した。 これらのうち、 42種は、 実施例 1で GeneChipにより解析を行った遺伝子である。
Taqman PCR (SYBR Green) に用いたプライマーは、 外部データベース Primer3 (http://www-genome. wi. mi t. edu/cgi-bin/pr iier/pr iier3_www. cgi) を用レ て 設計した。 各遺伝子の名称とその Unigene NO.、 プライマーの塩基配列を、 表 6 に示す。 尚、 Taqman PCR (SYBR Green) による解析の結果、 発現の変動が認めら れた遺伝子ついてのみ記載した。
(3) Taqman PCR (SYBR Green)
Taqman PCR (SYBR Green) は、 SYBR Green法 (Schmittgen TD. Et al.， Analy tical Biochem. 285, 194-204, 2000) によって行った。 具体的には、 以下のよ うにして反応を行った。 表 5の組成の反応液を、 Taqman用 PCRチューブ内で混合 し、 ABI7700 Prism Sequence Detector (ABI社） を用いて PCR反応を行った。 反 応条件は以下の通り行った。 反応条件： 50°C 2分→95 10分— (95°C 15秒→60 °C 1分） を 40サイクル。 表 5 PCR反応液組成 （per tube) テンプレート cMA (total RNA 2.5ng相当） 0.1 xl
5uni ts / II 1 Am l iTaq Gold 0.05 1
dNTP mix (各 2.5mM) 0.8 1
25mM MgCh 1.2^1
10XSYBR buffer 1^1
プライマー溶液 （フォヮ-ド） 1 1
プライマー溶液 （リハ'-ス） 1 1
蒸留水
合計 10 1
(3) データ解析
Taqman PCR (SYBR Green) 反応は全て 2連で行い、 閾値を超えるサイクル数 CT を算出した。 CT=30の時の発現量を 1と定義し、 次式から相対発現量を求めた。 ΓΟΤ samplej は、 測定した遺伝子の CTを示す。 相対発現量 =2 (30 -CT s ' さらに、 ι8-ァクチンの相対発現量を 1000としたときの各遺伝子の発現量の相 対値を求めた。 正常時肝臓における発現に比べ、 再生肝における発現変動がみら れた遺伝子について、 結果を表 6に示す。 尚、 実施例 1で再生肝で発現の変動が 認められた遺伝子のうち、 表 1の番号 8 1 (Rn. 29771 ) 及び番号 1 3 1 (Rn. 9 913) の遺伝子では、 発現の変動が再現されなかった。
Figure imgf000039_0001
実施例 3 肝再生時において Lーァラニンを投与したときの Lーァラニンの代謝 に関連する遺伝子についての Taqman PCR (SYBR Green) による発現解析
実施例 2で抽出した Lーァラニンの代謝に関連するラッ卜の遺伝子 59種につ いて、 肝再生時に Lーァラニンを投与したときの発現変動を調べた。
(1) 再生肝の作製
6週齢の F344系雄性ラット （120g) 5個体を、 6日間、 飼料 CRF- 1 (オリエン タル酵母） と水を供与して予備飼育した後に、 体重が等しくなるように 2群 （第 1群及び第 2群） に分け、 解剖 24時間前に Higgins- Andersonの方法 （Higgins, G.M. and Anderson, R.M. , 1931, Arch. Pathol. 12: 186-191)にて、 70%部分 肝切除 （左葉、 中間葉） を施行した。 剖検日は、 解剖 6時間前より絶食させた。 部分肝切除後 1 8および 2 1時間に 2g/10ml/kg BWの L—ァラニンを 0.3%カルボ キシメチルセルロース水溶液で経口投与し （第 1群） 、 コントロールとして 0.3% カルボキシメチルセルロースのみを経口投与した （第 2群） 。
解剖は、 部分肝切除後 24時間に実施した。 麻酔下で放血屠殺した後に肝臓を 摘出、 抨量した後、 凍結保存して Taqman PCR (SYBR Green) 法による mRNAの発現 測定に供した。
(2) 全 RNAの精製
L—ァラニン投与群 （1群） 、 およびコントロール群 （2群） の 70%部分肝 切除ラットの残存肝から、 実施例 1と同様にして全 RNAを精製した。
(3) テンプレートの合成
Taqman PCR (SYBR Green) に用いるテンプレートの cDNA合成は、 実施例 2と同 様にして行った。
(4) プライマーの設計
Taqman PCR (SYBR Green) に用いたプライマーは、 外部データベース Primer3 (hi tp://w w-genome. wi.mi t. edu/cgi-bin/pr imer/pr imer3_ww . cgi) を用いて 設計した。 各遺伝子の名称とその Unigene NO.、 プライマーの塩基配列を、 表 7 に示す。 尚、 Taqman PCR (SYBR Green) による解析の結果、 発現の変動が認めら れた遺伝子ついてのみ記載した。
(5) Taqman PCR (SYBR Green) Taqman PCR (SYBR Green) は、 実施例 2と同様にして行った。
(6) データ解析
Taqman PCR (SYBR Green) 反応は全て 2連で行い、 閾値を超えるサイクル数 CT を算出した。 CT=30の時の発現量を 1と定義し、 次式から相対発現量を求めた。 相対発現量 =2 (3°— eT s amp , e) さらに、 i3-Actinの相対発現量を 1000としたときの各遺伝子の発現量の相対値 を求めた。 Lーァラニン投与により発現量が変動した遺伝子についての結果を図 2〜4にしめす。 これらの遺伝子のうち実施例 2で再生肝で発現が変動した遺伝 子のうち、 4種 （表 6の番号 1 3 9、 140、 1 5 1、 及び表 7の番号 1 6 6) の遺伝子においても、 発現の変動が認められた。 産業上の利用の可能性 本発明より、 肝再生に関与する遺伝子の発現情報が提供される。 同発現情報を 利用して、 肝再生を促進させる薬物等をスクリーニングすることができる。
表:
Figure imgf000042_0001

Claims

請求の範囲
1. 肝臓細胞中で、 正常時に比べて肝再生時に発現レベルが変動する遺伝子 の名称及びそれらの遺伝子の発現プロフアイルからなる遺伝子パネル。
2. 前記遺伝子の発現レベルの変動が、 モデル動物における正常時の発現レ ベルに対する、 肝臓の部分切除後における発現レベルの変動である請求項 1記載 の遺伝子パネル。
3. 前記発現プロファイルが、 肝再生における経時的な発現プロファイルを 含む請求項 1又は 2に記載の遺伝子パネル。
4. 前記遺伝子の発現プロファイルを解析するための P CRプライマー群の 配列情報を含む請求項 1〜 3のいずれか一項に記載の遺伝子パネル。
5. 前記モデル動物がラットである請求項 2〜4のいずれか一項に記載の遺 伝子パネル。
6. 表 1、 表 6及び表 7の番号 1〜166に示す 166種の遺伝子のうち、 少なくとも 6種類の遺伝子の発現プロフアイルを含む（1)〜（5)のいずれかに記載 の遺伝子パネル。
7. 前記少なくとも 6種類の遺伝子が、 表 1及び表 6の番号 1〜1 51に示 す 1 5 1種の遺伝子から選ばれる請求項 6記載の遺伝子パネル。
8. 前記少なくとも 6種類の遺伝子が、 表 1及び表 6の番号 1〜 137に示 す 1 37種の遺伝子から選ばれる請求項 6記載の遺伝子パネル。
9. 前記少なくとも 6種の遺伝子が、 表 1の番号 5、 1 7、 36、 46、 6 7、 68の各遺伝子である請求項 6〜 8のいずれか一項に記載の遺伝子パネル。
10. 肝臓細胞中で、 正常時に比べて肝再生時に発現レベルが変動する遺伝子 の群の発現プロフアイルからなる遺伝子パネルの作成方法であつて、 以下のステ ップを含む方法：
(a) 正常時におけるモデル動物の肝臓細胞中における各種遺伝子の発現レべ ルと、 肝再生時における前記遺伝子の発現レベルを測定するステップと、
(b) それぞれの発現レベルを比較するステップと、
(c) 肝再生時に発現レベルが変動する遺伝子群を同定し、 各々の遺伝子名と 発現レベルの変動に関する情報から発現プロファイルを作成するステップ。
1 1. 前記ステップ （a) において、 肝再生時における前記遺伝子の発現レべ ルを経時的に解析することを特徴とする請求項 10記載の方法。 ·
1 2. 肝再生時又はその前後に肝再生促進物質を投与することを特徴とする請 求項 1 1記載の方法。
1 3. 前記肝再生促進物質が Lーァラニンである請求項 12記載の方法。
14. 前記遺伝子発現レベルの解析を、 遺伝子チップ法、 ATAC— PCR法 又は Ta qman PCR (SYBR G r e e n ) 法から選ばれる 1種又は 2 種以上により行う請求項 10〜1 3のいずれか一項に記載の方法。
1 5. 前記遺伝子発現レベルの解析を、 遺伝子チップ法及び ATAC— PCR 法により行うことを特徴とする請求項 14に記載の方法。
1 6. 前記遺伝子発現レベルの解析を、 T a dm a n PCR (SYBR G r e e n) 法により行うことを特徴とする請求項 14に記載の方法。
1 7. モデル動物または肝臓の組織もしくは細胞に薬剤を投与し、 請求項 1記 載の遺伝子パネルを構成する遺伝子の発現プロフアイリングを行うことを特徴と する、 肝再生に関与する薬剤のスクニーニング方法。
1 8. 被検者の肝について、 請求項 1記載の遺伝子パネルを構成する遺伝子の 発現プロフアイリングを行うことを特徴とする、 肝の状態の評価方法。
1 9. 請求項 10に記載の遺伝子パネルの作成方法、 請求項 1 7記載のスクリ —ニング方法、 又は請求項 18記載の評価方法に用いられるプライマ一群であつ て、 配列番号 1〜127、 及び 1 35〜192に示すオリゴヌクレオチドの全部 又は一部からなるプライマー群。
PCT/JP2002/002372 2001-03-13 2002-03-13 Gene panel participating in liver regeneration Ceased WO2002077222A1 (en)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2002576665A JPWO2002077222A1 (ja) 2001-03-13 2002-03-13 肝再生に関与する遺伝子パネル
US10/469,938 US20060105329A1 (en) 2001-03-13 2002-03-13 Gene panel participating in liver regeneration
EP02705141A EP1375657A4 (en) 2001-03-13 2002-03-13 GENE ASSEMBLY PARTICIPATING IN LIVER REGENERATION

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2001-70940 2001-03-13
JP2001070940 2001-03-13

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2002077222A1 true WO2002077222A1 (en) 2002-10-03

Family

ID=18928721

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2002/002372 Ceased WO2002077222A1 (en) 2001-03-13 2002-03-13 Gene panel participating in liver regeneration

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20060105329A1 (ja)
EP (1) EP1375657A4 (ja)
JP (1) JPWO2002077222A1 (ja)
CN (1) CN1509331A (ja)
WO (1) WO2002077222A1 (ja)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102006019480A1 (de) * 2006-04-26 2007-10-31 Sirs-Lab Gmbh Verfahren zur in-vitro Überwachung postoperativer Veränderungen nach Lebertransplantation
CN106754950A (zh) * 2017-02-21 2017-05-31 河南师范大学 一种调节肝再生的c9orf116基因及其siRNA干扰靶点和应用
CN112147336B (zh) * 2019-09-18 2023-04-28 首都医科大学附属北京佑安医院 一种检测和评估肝再生的标志物及其用途

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH05229940A (ja) * 1992-02-26 1993-09-07 Ajinomoto Co Inc 肝再生促進剤

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6913882B2 (en) * 1999-12-22 2005-07-05 Affymetrix, Inc. Methods of screening for B cell activity modulators

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH05229940A (ja) * 1992-02-26 1993-09-07 Ajinomoto Co Inc 肝再生促進剤

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BENNETT, L.M. ET AL.: "Strain-dependent differences in DNA synthesis and gene expression in the regenerating livers of CB57BL/6J and C3H/HeJ mice", MOL CARCINOG., vol. 14, no. 1, September 1995 (1995-09-01), pages 46 - 52, XP002953505 *
KAR, S. ET AL.: "Differential display and cloning for messenger RNAs from the late phase of rat liver regeneration", BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN., vol. 212, no. 1, 6 July 1995 (1995-07-06), pages 21 - 26, XP002953503 *
KATO, K.: "Adaptor-tagged competitive PCR: a novel method for measuring relative gene expression", NUCLEIC ACIDS RES., vol. 25, no. 22, 15 November 1997 (1997-11-15), pages 4694 - 4696, XP002900285 *
RININGER, J.A. ET AL.: "Time course comparison of cell-cycle protein expression following partial hepatectomy and WY14, 643-induced hepatic cell proliferation in F344 rats", CARCINOGENESIS, vol. 18, no. 5, May 1997 (1997-05-01), pages 935 - 941, XP002953504 *
SCHMITTGEN, T.D. ET AL.: "Quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction to study mRNA decay: comparison of endpoint and real-time methods", ANAL BIOCHEM., vol. 285, no. 2, 15 October 2000 (2000-10-15), pages 194 - 204, XP002953506 *
See also references of EP1375657A4 *
XU, W. ET AL.: "Identification and characterization of differ entially expressed genes in the early response phase during liver regeneration", BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN., vol. 278, no. 2, 19 November 2000 (2000-11-19), pages 318 - 325, XP002953502 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP1375657A1 (en) 2004-01-02
CN1509331A (zh) 2004-06-30
JPWO2002077222A1 (ja) 2004-07-15
EP1375657A4 (en) 2005-04-20
US20060105329A1 (en) 2006-05-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7716384B2 (ja) サンプル調製、サンプルシークエンシング、およびシークエンシングデータのバイアス補正と品質管理のためのシステムならびに方法
JP6178356B2 (ja) 固形臓器移植レシピエントにおいて移植片生着を評価するための方法および組成物
US7998687B2 (en) Biomarkers for chronic transplant dysfunction
JP2000308500A (ja) 癌抑制遺伝子ｗｔ１の下流遺伝子
EP1027456A1 (en) Expression profiles in adult and fetal organs
CN107881249B (zh) lncRNA及其靶基因在选育高品质畜禽品种中应用
WO2018119411A1 (en) Classification of diffuse large b-cell lymphoma
BR112019013391A2 (pt) Adaptador de ácido nucleico, e, método para detecção de uma mutação em uma molécula de dna circulante tumoral (ctdna) de fita dupla.
WO2014152355A2 (en) Osteosarcoma-associated risk markers and uses thereof
CN109913458B (zh) circRNA及其在检测缺氧缺血性脑损伤中的应用
US20030134324A1 (en) Identifying drugs for and diagnosis of Benign Prostatic Hyperplasia using gene expression profiles
CN108103206A (zh) 一种肌内脂肪相关的lncRNA及其应用
EP2510114B1 (en) Rna analytics method
CN108893540B (zh) circRNA_14707及其在分子辅助育种中应用
CN108085399B (zh) lncRNA及其反式调控基因WNT11的新用途
CA3085464A1 (en) Compositions and methods for diagnosing lung cancers using gene expression profiles
WO2002077222A1 (en) Gene panel participating in liver regeneration
KR102409747B1 (ko) Snx20 유전자의 메틸화 수준을 이용한 비만의 예측 또는 진단을 위한 조성물 및 이를 위한 정보 제공방법
CN111118157B (zh) 一种长链非编码RNA lncBCBMAT及其作为乳腺癌脑转移分子标记物的应用
JP4879756B2 (ja) イヌの骨関節炎と関連する遺伝子並びに関連する方法及び組成物
KR101992787B1 (ko) Bzrap1-as1 유전자의 메틸화 수준을 이용한 고혈압의 예측 또는 진단을 위한 정보제공방법 및 이를 위한 조성물
Grigoryev et al. Exon-based mapping of microarray probes: recovering differential gene expression signal in underpowered hypoxia experiment
EP1424391A1 (en) Gene panel participating in liver astrocyte activation
CN108103064B (zh) 长链非编码rna及其应用
KR101735762B1 (ko) 유전자의 발현프로필을 이용한 돼지의 산자수 예측방법

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NO NZ OM PH PL PT RO RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2002576665

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2002705141

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 028098021

Country of ref document: CN

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2002705141

Country of ref document: EP

REG Reference to national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: 8642

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2006105329

Country of ref document: US

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10469938

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 10469938

Country of ref document: US

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 2002705141

Country of ref document: EP