WO2002079510A1

WO2002079510A1 - Gene analysis method and analyzer therefor

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Publication number: WO2002079510A1
Application number: PCT/JP2002/002583
Authority: WO
Inventors: Toshihiko Kondo; Shuzo Abe; Nobuyosi Shikama; Yukihiro Shintani
Original assignee: GL Sciences Inc; Japan Science and Technology Corp
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Priority date: 2001-03-29
Filing date: 2002-03-19
Publication date: 2002-10-10
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Description

明細遺伝子解析方法およびその解析装置技術分野

例えば全自動遺伝子解析装置若しくは全自動遺伝子診断装置に好適で、構成の簡潔化と小形軽量化を図れ、これを安価に製作できるとともに、解析系におけるバルブの使用を可及的に抑制し、クロスコンタミの混入を防止して、種々の DNA検出を迅速かつ高精度に行なえるとともに、異種の試料から同時に複数の遺伝子解析を実現できるようにした、遺伝子解析方法およびその解析装置に関する。 ' 背景技術

近年、遺伝情報を担うデォキシリポ酸（DNA)の遺伝子情報解析技術の進歩はめざましぐその遺伝子診断や医療分野への利用が期待されている。

前記遺伝子情報の解析は、一般に血液、細胞等の生体試料の DNAを採取し精製する DMA抽出工程と、目的の DNAを大量に増やす DNA増幅工程と、 D NAの成分を分離し検出する DNA検出工程と、その解析工程とに分かれ、それらの主要な工程を遺伝子解析装置が連続かつ一貫して行なっている。

例えば特開平 6— 327476号公報の遺伝子解析装置は、分注要素や容器搬送要素、遠心分離要素、混合要素、容器反転要素、加温、乾燥要素、ゲル電気泳動要素を備え、これらの作動をコンピュータによって制御し、一連の処理工程を全自動化している。

しかし、この従来の装 Sは、前記遠心分離要素やゲル電気泳動要素に加え、試料液を処理工程に基いて順次移動させる際、プログラム制御した種々の機構を要するため、装置が複雑かつ大形重量化して高価になり、また試料液の流路に種々のバルブを配置しているため、それらによるクロスコンタミの問題を生じて分析精度に不安があった。

しかも、電気泳動は分離に時間が掛かるとともに、分離精度が概して良くない等の問題があった。同様な問題は、特開平 7— 75544号公報の遺伝子解析装置にも共通していた。

このような問題を解決するものとして、例えぱ特開平 1 0— 239300号公報の遺伝子解析装置は、塢基配列特異的熱溶出クロマトグラフ法（SSTEC法）、つまり固相化 DNAカラムに PCR増幅した DNAを注入し、固相化 DNAと相補的な DNAをトラップし、送液しながらカラムの ¾度を昇温することにより、融解点の差で一部分相補的でない塩基配列との分離解析する方法の下で開発された。前記 SSTEC法に基づく遺伝子解析装置は、遺伝子試料の調製からカラム注入までの一連の操作を行なうオートサンプラーユニットと、少なくとも緩衝液と反応液とを送液する送液用グラジェントユニットと、固相 DNAプローブを充填したカラムと温度センサ一並びに温度調節機構とを備えたサーマルコントローラ —ユニットと、測定手段を備えたフロー式モニターユニットと、試料分離のためのフラクションコレクターと、これらのユニットの制御機構とを備えていた。

しかし、前記 SSTEC法に基づく遺伝子解析装置は、一塩基の違いでも分離可能であるが、 PCR増幅後の DNAを一旦加熱して二本鎖を解離し、その冷却過程で余剰のプライマ一を排出し、冷却後再度ヒートブロックを昇温して、固相 DNAプローブと相補の D NAを分離するため、煩雑で手間が掛かり、しかも固相化 D NAカラムの昇温に時間が掛かるという問題があった。

また、前記従来の遺子解析装置は、同一の試料から同時に複数の遺伝子解析を実現できる力異種の試料からは同時に複数の遺伝子解析が困難になリ、その遺伝子解析に限界があった。

しかも、前記従来の遺伝子解析装置は、複数のカラムの上下流位置に高圧バルブを介挿し、これらのバルブをフロー式モニタ一ユニットの動作に連動して切り換え、前記カラムを直列または並列に切り換えるため、構造が複雑で高価になり、しかも前記バルブによるクロスコンタミの混入の惧れがあった。

—方、従来の遺伝子解.析装置は、前述のようなシステム全体の問題の他に、各処理工程に次のような問題があった。

例えば、前記特開平 6— 327476号公報の DNA抽出工程においては、.チップ台に尖端部を開口した複数のチップを収容し、該チップをチップ取付け部を介してターンテーブル上の容器上方へ移動し、前記チップの尖端を容器内部の液体に浸潰して吸入し、これをターンテーブル上の別の容器上方へ移動し、前記液体を吐出後、前記チップを廃棄し、一方、前記液体を収容した容器を遠心分離機へ移送して、前記液体を分離していた。

しかし、前記 DNA抽出工程は、一回の D NA抽出に一本のチップと二本の容器を要し、これらを使い捨てするとともに、前記液体を別の容器に順次移し替え、最後に遠心分離するため、 DNAの抽出精製が複雑で手間が掛かるとともに、クロスコンタミの混入の惧れがあった。このうち、前記クロスコンタミの混入防止手段として、例えば特開平フー 289925号公報では、チップ内の中間部に栓体を付設し、特開平 8— 3597 1号公報では、チップの接続側開口部に薄膜を設けていたが、栓体ゃ薄膜の付設分、チップが高価になるという問題があつた。

また、前記特開平 7— 75544号公報の PCR増幅工程では、変性温度およびアニーリングないし伸長温度に調節可能な二つの金属ブロック型熱交換器を並置し、これらの内部に反応混合物溜に連通する毛管を貫通し、該毛管内にステップモータに連係するピストンを摺動可能に挿入し、該ピストンの変位を介し、前記反応混合物を各熱交換器に移動して加熱するようにしていた。また、前記公報には、円筒熱交換ドラムをその中心軸の回りに回動可能に設け、前記ドラムは周面を複数のセグメントで区画し、各セグメントを所定の PCR加熱温度にカロ熱可能にするとともに、前記ドラムの周面に前記毛管を巻き掛け可能な溝を形成し、前記ドラムを所定角度回動し、一つのセグメントを毛管に接触して内部の反応混合物を加熱し、加熱後ドラムを回動し、別のセグメントを毛管に接触して反応混合物を順次加熱するようにしていた。

しかし、これらの PCR増幅装置は、前者の場合、ピストンの交番動作時には毛管の両側をバルブで閉塞する必要があり、このバルブによるクロスコンタミの問題を生ずるとともに、毛管の一端が反応混合物溜に連通しているため、加熱されて蒸発した反応混合物の一部が反応混合物溜に流出し、反応混合物の塩基濃度が高くなつて、増幅後の DNAを検出できなくなる惧れがあった。

また、後者の場合は種々の機構を要して、構造が複雑になり高価になる等の問題があった。

このような問題を解決するものとして、例えぱ特開平 6— 30776号公報では、反応液を移動させる直線状の反応管の外部に PCR加熱部を配置し、または前記反応管をコイル状に捲回し、該管を PCR加熱温度に調節した複数の恒温槽に浸潰し、該管の内部に反応液を移動させるようにしている。

しかし、この PCR増幅装置は、所定サイクル分の PCR加熱部を要して、反応管が長尺になり、また反応管を全体で 22巻きに捲回するため、反応管が長尺になって大形重量化し、その送液に大形かつ高価なポンプを要するとともに、その洗浄に多量の洗浄液と時間を要する等の問題があった。

更に、前記特開平 6— 327476号公報の検出工程は、ゲル電気泳動法によつているため、高価で分析に時間が掛かり、分離が悪い上に使用ゲルをその都度交換しなければならなかった。また、前記 SSTEC法の検出工程は、前述のように固相化 DNAカラムの昇温に時間が掛かる等の問題があった。

このため、本発明の主な目的は、前記問題を解決し、例えば全自動遺伝子解析装置若しくは全自動遺伝子診断装置に好適で、構成の簡潔化と小形軽量化を図れ、これを安価に製作できるとともに、解析系におけるバルブの使用を可及的に抑制し、クロスコンタミの混入を防止して、種々の DNA検出を迅诔かつ高精度に行なえるとともに、異種の試料から同時に複数の遺伝子解析を実現できるようにした遺伝子解析方法およびその解析装置を提供することでめる。

本発明の他の目的は、種々の DNA検出を迅速かつ高精度に行なえるとともに、異種の試料から同時に複数の遺伝子解析を実現し、しかも被検 DNAの二本鎖形成位置を速やかに検出し得る遺伝子解析方法およびその解析装置を提供することである。

本発明の別の目的は、前記固相 DNAプローブを被検 DNAの分析毎に昇温かつ降温し、固相 DNAプローブの合理的な使用と、種々の DNA検出の迅速かつ高精度な実現と、異種の試料から同時に複数の遺伝子解析を実現し得る遺伝子解析方法およびその解析装置を提供することである。

本発明の更に他の目的は、前記反応液を前記固相 DNAプローブの導入前に所定温度に加熱し、予め前記被検 DNAの二本鎖を解離し一本鎖に生成するようにして、前記固相 DNAプローブの温度上昇および降下に必要な時間を短縮し、分析時間の大幅な短縮化を図れる遺伝子解析方法およびその解析装置を提供することである。

本発明の更に別の目的は、前記固相 D N Aプローブの上流側が前記 D N Aの変性温度以上で、かつ前記固相 DNAプローブの下流側が前記 DNAの伸長温度以下の温度勾配に設定し、固相 DNAプローブの上流側で、所定の DNAの二重鎖を解離し得る遺伝子解析方法およびその解析装置を提供することである。発明の開示

本発明は、生体試料から目的の核酸を抽出し、目的の DNAを増幅後、所定の D NAを含む反応液を直列または並列に配置した所定温度の固相 DNAプローブへ導き、該固相 DNAプローブと相補の DNAを分離する遺伝子解析方法において、少なくとも一部を被検 D NAの二本鎖形成温度 (こ設定可能な複数の固相 DNAプローブを備え、該固相 DNAプローブに増幅後の同一若しくは異種の D NAを含む反応液を導入して、種々の DNA検出を迅速かつ高精度に行なえ、また異種の試料から同時に複数の遺伝子解析を実現し、しかも被検 DN Aの二本鎖形成位置を速やかに検出し得る。

また、本発明は、前記固相 DN Aプローブを被検 DNAの分析毎に昇温かつ降温して、固相 DNAプローブの合理的な使用と、種々の DNA検出の迅速かつ高精度な実現と、異種の試料から同時に複数の遺伝子解析を実現する。更に、本発明は、前記反応液を前記固相 DNAプローブの導入前に所定温度に加熱し、予め前記被検 DNAの二本鎖を解離し一本鎖に生成して、前記固相 DNAプローブの温度上昇および降下に必要な時間を短縮し、分析時間の大幅な短縮化を図る。

本発明は、前記固相 D N Aプローブの反応液に対する上流側を高温側とし、下流側を低温側の温度勾配に設定して、 DNA検出時間の短縮化を図るとともに、分離した相補の DNAを確実に検出する。

また、本発明は、前記固相 DNAプローブの上流側が前記 DNAの変性温度以上で、かつ前記固相 DNAプローブの下流側が前記 DNAの伸長温度以下の温度勾配に設定し、固相 DNAプローブの上流側で、所定の DNAの二重鎖を解離する。

したがって、前記 DNAの二重鎖の解離を予め行ない、この後に固相 DNAプローブを昇温する従来の不合理を解消し、迅速な DNA検出を実現するとともに、前記温度分布の所定位置で相補的 DNAの二重鎖を形成させ、前記 D NA の分離位置を精密に検出して、分離位置の/くラツキを確実に捕捉し検出し得る。

また、本発明は、前記温度分布の中間部に、前記相補の DNAが二重鎖を形成可能な一定の ¾度域を設け、前記固相 DNAプローブを段階的に温度分布させ、相補的 DNAの二重鎖の形成を確実に検出する。

更に、本発明は、前記固相 DNAプローブに、同一若しくは異種の DNAを含む反応液を直接導入し、従来のように増幅後の DNAの二重鎖を予め解離し、かつこの後に固相 DNAプローブを昇温する不合理を解消し、 S速な DNA検出を実現する。

本発明は、少なくとも一部を被検 DNAの二本鎖形成温度に設定可能な複数の固相 DNAプローブを備え、該固相 DNAプローブに増幅後の同一若しくは異種の DNAを含む反応液を導入可能にし、種々の DNA検出を迅速かつ高精度に行なえるとともに、異種の試料から同時に複数の遺伝子解析を実現し、しかも被検 DNAの二本鎖形成位置を速やかに検出する。

また、本発明は、前記固相 DNAプローブを被検 D NAの分析毎に昇温かつ降温可能にして、固相 DNAプローブの合理的な使用と、種々の DNA検出の迅速化と高精度化を実現し、異種の試料から同時に複数の遺伝子解析を実現する。

更に本発明は、前記反応液の前記固相 DNAプローブよりも上流側の流路にプレヒートブロックを設け、該プレヒートブロックを、前記被検 D NAの二本鎖を解離し一本鎖に生成可能な所定温度に設定可能にしたから、前記固相 DNAプロ —ブの温度上昇および温度降下に必要な時間を短縮し、分析時間の大幅な短縮化を図る。

本発明は、前記固相 DNAプローブの反応液に対する上流側を高温側とし、下流側を低温側の温度勾配に設定し、 DNA検出時間の短縮化を図るとともに、分離した相補の DNAを確実に検出する。

また、本発明は、前記固相 D NAプローブの上流側が前記 DNAの変性温度以上で、かつ前記固相 DNAプローブの下流側が前記 DNAの伸長温度以下の温度勾配に設定し、固相 DNAプローブの上流側で、所定の D NAの二重鎖を解離する。したがって、前記 DNAの二重鎖の解離を予め行ない、この後に固相 DNA プローブを昇温する従来の不合理を解消し、迅速な DNA検出を実現するとともに、前記温度分布の所定位置で相補的 DNAの二重鎖を形成させ、前記 DNA の分離位置を精密に検出して、分離位置のバラツキを確実に捕捉し検出するし得る。

更に本発明は、前記温度分布の中間部に、前記相補の DNAが二重鎖を形成可能な一定の温度域を設け、前記固相 D NAプローブを段階的に温度分布させ、前記固相 DNAプローブを段階的に温度分布させ、相補的 DNAの二重鎖の形成を確実に検出する。

本発朋は、前記固相 DNAプローブに、同一若しくは異種の DNAを含む反応液を直接導入し、従来のように増幅後の DNAの二重鎖を予め解離し、かっこの後に固相 D NAプローブを昇温する不合理を解消し、迅速な DNA検出を実現する。

また、本発明は、互いに並列に配置した複数のカラムに同一若しくは相異なる複数の固相 D NAプローブを収容し、各カラムに連通する溶離液の各供給路に、前記カラム部の流体抵抗よりも大きな流体抵抗手段を配置し、溶離液の各供給路の流量を減量することで、前記カラム部分の流量変化を抑制し、複数のカラムの並列接続と、それらの DNA検出の並行処理と、単一の送液ポンプによる溶離液の供給を実現し、この種装置の小形軽量化と低廉化を図る。更に本発明は、単一の送液ポンプを介して、前記溶離液を各カラムに供給可肯にし、構成の簡潔化と小形軽量化、並びに設備費の低減化を図るとともに、ポンプによるトラブルの発生を回避し、円滑かつ安定した分析を図る。

本発明は、前記溶離液の各供給路の下流側と DNA検出装置との間に、増幅後の同一若しくは異種の DNAを含む複数の反応液を導入可能にした多ポ —ト切換弁を配置し、該切換弁の所定のポートに、前記溶離液の各供給路と、前記各カラムに連通する通路を接続し、同一若しくは異種の試料から同時に複数の遺伝子解析を実現し、この種分析の合理化と高速化並びに分析コス卜の低廉化を図る。

また、本発明は、前記温度分布を形成可能な管状のヒートブロックを設け、該ヒートプロックの内側に光源を配置し、該ヒートブロックに前記光源の透過手段を設け、該透過手段に臨ませて前記固相 DNAプローブを配置し、前記光源を有効利用し、例えば複数の固相 DNAプローブによる相補的 DMAの検出を合理的に行なう。

更に、本発明は、前記温度分布を形成可能な基板に 1または複数のマイクロチャンネルを形成し、該チャンネル内に 1または複数の固相 DNAプローブを配置し、マイクロチップを利用して一時に複数の DNA検出を実現し、その小形軽量化を図る。

本発明は、前記固相 DNAプローブによる被検 DNAの二本鎖形成位置を検出かつ分析可能な分析装置の表示画面に、各検体の分析パターンを表示可能にし、各検体の分析パターンとそれらの変化を一時かつ容易に把握する。本発明の上述した目的と特徴および利点は、添付図面に基づく以下の詳細な説明から、一層明らかとなろう。図面の簡単な説明

第 1図は、本発明をオートサンプラーを使用した全自動遺伝子解析装置に適用した実施形態を示す説明図である。

第 2図は本発明に適用した核酸抽出工程で使用した有底のサンプリング容器を示す断面図で、生体試料と蛋白質を分解する核酸抽出試薬と、目的の核酸の吸着層への吸着を促す核酸抽出試薬とを収容し、目的の核酸（DNA) を吸着層に吸着させている状況を示している。

第 3図は、第 2図の A— A線に沿う拡大断面図である。

第 4図は、本発明に適用した PCR増幅器の断面図で、複数のヒートブロック間の内面に沿って二つの扱き口ーラを往復動させ、反応管内の反応液を同動させている状況を示している。

第 5図は、第 4図の B— B線に沿う拡大断面図である。

第 6図は、本発明に適用した DNA検出器の概要を示す断面図である。

第 7図は、本発明の第 2の実施形態を示す断面図で、底部に開口部を設けたサンプリング容器に、生体試料と蛋白質を分解する核酸抽出試薬と、目的の核酸の吸着層への吸着を促す核酸抽出試薬とを収容し、目的の核酸（DNA) を吸着層に吸着させている状況を示している。

第 8図は、本発明の第 3の実施形態に適用した PCR増幅器を示す断面図で、複数の磁性体（磁性流体）をヒートブロック間の内面に沿って往復動させ、反応管内の反応液を同動させている状況を示している。

第 9図は、本発明の第 4の実施形態に適用した DNA検出器の要部を拡大して示す断面図で、 1本の細管に相異なる固相 DNAプローブを直列に配置している。

第 1 0図は、本発明の第 5の実施形態に適用した DNA検出器の要部を拡大して示す断面図で、管状のヒートブロックの外周面に複数の細管を管軸方向に配置し、該管の内部に固相 D NAプローブを充填している。

第 1 1図は、第 1 0図の応用例を示す説明図で、管状のヒートブロックの外周面に前記細管をスパイラル状に捲回している。

第 1 2図は、第 1 0図の更に別の応用例を示す説明図で、管状のヒートブロックの外周面に前記細管を管軸方向と直交方向に捲回している。

第 1 3図は、本発明の第 6の実施形態に適用した DNA検出器の要部を示す斜視図で、マイクロチップに複数のマイクロチャンネルを形成し、該チャンネルの内部に固相 DNAプローブを充填している。

第 1 4図は、第 1 3図の C一 C線に沿う拡大断面図である。

第 1 5図は、本発明の第フの実施形態およびその応用形態に適用した全自動 DNA診断装置を示す説明図で、一部を断面図示している。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を DNAまたは RNA等の核酸の抽出、実施形態では DNAの抽出から、 DNAの増幅、 DNA検出'分析に亘る一連の工程を自動的に行なう全自動遺伝子解析装置に適用した図示の実施形態について説明すると、第 1図 1乃至第 6図において 1は遺伝子解析装置で、該装置 1はオートサンプラー 2を含む核酸抽出装置 3と、 DNA増幅装置 4と、 DNA検出装 S5と、制御 ·分析装置 6とを備えている。

前記核酸抽出装置 3は、複数の核酸抽出試薬収納容器 7a〜フ eを有し、それらに所定の核酸抽出試薬 8a〜8e、例えばプロテアーゼ、カオトロピック剤、フエノールまたはクロ口ホルム、 70%エタノール、溶離液と DNA合成材料とプライマ一との混合液、蒸留水等を収容している。

前記各収納容器 7a〜7eに試薬導管 9a〜9eの下端部が配管され、該導管 9a〜9eの上端部が第 1切換弁 1 0の空気ポート" 1 1を除く他のポートに接続されている。図中、 1 2は前記収納容器 7a~ 7eの開口部を閉塞する蓋板で、前記試薬導管⁹ a〜9eの揷通孔 (図示略)が設けられている。前記第 1切換弁 1 0 は 6ポ一卜を備え、その各ポートと連通可能な注入管 1 3が前記オートサンブラ一 2に接続されている。

図中、 1 4は前記注入管 1 3に介挿された三方弁で、該弁 1 4のポ

一卜に連通する通路 1 5に、送液手段であるシリンジポンプ 1 6が設けられている。前記シリンジポンプ 1 6の作動時期および作動変位は、本発明による遺伝子解析システムおよび核酸の抽出システムを記憶した、前記制御'分析装置 6 に装備のコンピュータによて制御され、前記核酸抽出試薬 8a〜8eをサンプリング容器 1 7へ順次注入可能にしている。

前記オートサンプラー 2は、サンプリング機能とインジェクション機能を備え、その前部にサンプリング容器 1 7を収容可能なサンプリングラック 1 8を有し、該ラック 1 8にサンプリング容器 1 7を挿入可能な複数の通孔 1 9が形成されている。

前記サンプリングラック 1 8の直下に力, !3熱ブロック 20が配置され、該ブロック 2 0は所定温度、実施形態では 58°Cに調節可能にされ、その上面にサンプリング容器 1 7の下端部を収容可能な多数の凹孔 21を形成している。

前記サンプリング容器 1 7は、ポリプロピレン等の合成樹脂で有底筒状に成形され、その略下半部は亍ーパ状に形成され、該テーパ状部 1 7aを含む前記容器 1 7の内面の所定位置に、薄厚の吸着層 22を帯状に形成している。

前記吸着層 22の表面は、所定の DNA、つまリ錶型 DNAを吸着可能な粗面に形成され、実施形態では粉末状のガラスビーズまたはシリカゲルビーズを、前記容器 1 7内面の円周方向へ帯状に熱溶着している。

前記吸着層 22の下端部位置は、サンプリング容器 1 7に収容される生体試料である、血液（血漿、赤血球を含む、いわゆる全血） 23の液面より上方で、かつ該血液 23に滴下する蛋白質を分解可能な核酸抽出試薬 8aであるプロテァ一ゼの混合液面よりも上方に位置している。

そして、前記混合液に目的の核酸の吸着層 22への吸着を促す核酸抽出試薬 8 bである、カオトロピック剤 8bを滴下した際、それらの混合液面が前記吸着層 22の少なくとも下端部を越えるように、層幅が形成されている。この場合、前記混合液面は吸着層 22の上端部を越えてもよい。

図中、 24はサンプリング容器 1 7の上端部に着脱可能に取り付けたキャップである。

前記サンプリングラック 1 8に、 DNAポリメラ一ゼ、プライマー DNA、 dNTPを含む合成剤を収容した容器 (図示略)が設けられ、その所要量を錶型 DNAを抽出した前記サンプリング容器 1 7へ注入し、その反応液 Lを送液管 25および第 2切換弁 26を介して、 PCR増幅器 27へ移送可能にしている。前記第 2切換弁 26は三方弁で構成され、その所定位置に導管 28が接続され、該管 28に三方弁 29を介して移送手段であるシリンジポンプ 30が接続されている。

前記シリンジポンプ 30の作動時期および作動変位は、本発明による遺伝子解析システムおよび核酸の抽出シス亍厶を記憶した、前記制御'分析装置 6のコンピュータによって制御され、前記反応液を PCR増幅器 27へ移送可能にするとともに、 PCR増幅後、洗浄用の溶離液 31を給液管 32を介して、 PCR増幅器 27へ供給可能にしている。

前記 PCR増幅器 27は筐体 34の内部に設置され、これはアルミニウム合金製の中空円筒状のシリンダーブロック 35と、該ブロック 35の内面に沿って転動かつ往復動可能に収容した、移動子である複数の扱きローラ 36a, 36bとを備え、該ローラ 36a, 36bとして実施形態では、ペリスタポンプを構成するペリスタローラを用いている。

前記シリンダブロック 35は、その内面に反応管として、柔軟な弾性チューブ 3 7が周回され、その周回幅分の軸方向高さを備えている。実施形態では、弾性チューブ 37を 1周回以下の略 270° に周回させている。

前記シリンダブロック 35は、略扇形断面の 3つのヒートブロック 38〜40と、それらの間に着脱可能に取り付けた略扇形断面の連結ブロック 41とで構成されている。

実施形態ではシリンダブロック 35の内面に、同一若しくは異種の被検体の D

N Aを含む反応液 Lが移動する 8本の弾性チューブ 37が周回され、その周回幅分の軸方向高さに形成されている。

したがって、 PCR増幅器 27に 8本の送液管 25が導入され、これに応じて同数の第 2切換弁 26と導管 28、シリンジポンプ 30が配置されている。

前記ヒートブロック 38 ~40は、 PCR増幅を実現可能な所定の加熱温度に調節可能にされ、このうちヒートブロック 38は略 95°Cに加熱され、弾性チューブ 3 7内の反応液 L中の DNAの 2本鎖を解離させ、 1本鎖の DNAを生成する変性工程を担っている。

また、ヒートブロック 39は略 60°Cに加熱され、前記 1本鎖 DNAに 2種類のプライマーを結合し、アニーリングさせるアニーリング工程を担っている。

更に、前記ヒートブロック 40は略 72°Cに加熱されて、耐熱性の DNAポリメラーゼを介し 2本鎖 DNAを合成し、相補的 DNAを複製する伸長工程を担っている。

これらのヒートブロック 38〜40は、前記反応液 Lに対する加熱時間に応じて加熱部、つまり内周面の長さを決定され、かつその加熱順に配置されている。前記連結ブロック 41は、隣接するヒートブロック 38, 40若しくは筐体 34にビス止め等で着脱可能にされ、その両端部に弾性チューブ 37の出入口溝 42, 4 3を形成していて、連結ブロック 41の取り外し時に、弾性チューブ 3フの出し入れと配管を可能にしている。したがって、連結ブロック 41の内面に弾性チューブ 37を配置していない。

それゆえ、連結ブロック 41の内面は弾性チューブ 37の扱き分、厚肉で平滑に形成し、扱きローラ 36a， 36bの移動の円滑化を図ることが望ましい。図中、 44はヒートブロック 38〜40および連結ブロック 41の間に配置した断熱材である。

前記弾性チューブ 37は柔軟で耐熱性を有する、例えばシリコンチューブで構成され、その一端を送液管 25の下流側に接続し、他端を後述の移送管に接続している。

前記弾性チューブ 37は、第 4図のように入口溝 42からシリンダーブロック 37 内に導入され、これをヒートブロック 38, 39, 40の内面に沿って同一平面上に配管し、出口溝 43からシリンダーブロック 37の外部に引き出されている。

したがって、弾性チューブ 37は連結ブロック 41を除いて、シリンダーブロック 3 7内を略 270° 、つまり 1周回以下に配置されている。それゆえ、弾性チューブ 37の短小化を図れ、また前述のように弾性チューブ 37を 8本使用しても、その周回幅は弾性チューブ 37径の 8倍分で洚み、シリンダーブロック 37の小形軽量化を図れることになる。

前記扱きローラ 36a, 36bは、シリンダーブロック 37の高さと略同長の円筒状に形成され、それらを所定距離離間して点対称位置に配置し、その両端部を連結杆 45に突設したピン 46を介して、回転自在に支持されている。前記連結杆 45, 45は回動軸 47に連結され、該軸 47を正逆転可能なモータ 48に連係している。

前記モータ 48は、ヒートブロック 38~40による PCR増幅工程時、つまり扱きローラ 36a, 36bが正転周回時は、各工程による加熱毎に駆動を停止し、所定の加熱時間経過後、駆動を再開して、各工程の増幅作用を実行させている。

そして、前記 PCR増幅工程の 1サイクル終了後は、停止時間を挟んで逆転し、扱きローラ 36a, 36bを原位置に戻して、 PCR増幅工程を再開し、この往復角運動を PCR増幅に必要なサイクル分、実施形態では 30サイクル実行可能にしている。

前記扱きローラ 36a， 36bの往復動角度は、第 4図のように略 90° に設定され、当該角度分シリンダーブロック 27の内面に沿って正逆方向に周回し、その間弾性チューブ 37の両端部を気密に閉塞し、内部の反応液 Lの漏出と水蒸気の漏洩を防止している。図中、 49は PCR増幅器 27に設けた排液管で、開閉弁 50が介揷されている。

前記各弾性チューブ ³フの下流側に移送管 5 1が接続され、該管 5 1の他端が検出器 5、実施形態では UV検出器に導入され、該検出器 5内の移送管 5 1 に、細管であるカラム 52が着脱可能に取り付けられている。

したがって、実施形態では検出器 5内に 8本の移送管 5 1が導入され、それらに所定のカラム 52が取り付けられている。前記カラム 52は、透明で小径なガラス管内に所定の固相 DNAプロ一ブ 53を充填し、または前記ガラス管内壁に所定の固相 DNAプローブ 53をコーティングして構成されている。

前記カラム 52は移送管 51に取り付られ、 PCR増幅した被検 DNAを含む反応液を直接導入可能にしている。図中、 54はカラム 52の直上に配置した光源である UVランプ、 55はカラム 52と UVランプ 54との間に配置した光フィルターである。

前記カラム 52の近接位置、実施形態では直下位置に、カラム 52と略同長のヒートブロック 56が配置されている。前記ヒートブロック 56の両側に、ペルチェ効果を奏する高温ブロック 57と低温ブロック 58と力《設けられ、それらの発熱および熱伝導作用によって、ヒートブロック 56の長さ方向に沿って一定の温度分布を形成している。この場合、必要に応じて低温ブロック 58側にファン等の適宜な冷却手段を設けることも可能である。

前記温度分布は、カラム 52を移動する被検 DNAの二重鎖形成温度を含み、実施形態では高温ブロック 57側を被検 DNAの二重鎖形成温度よりも高温の 95°C、低温ブロック 58側を被検 DNAの二重鎖形成温度よりも低温の 30°C に設定していて、図示のように被検 DNAの移動方向に漸減する温度勾配を形成し、被検 D NAの確実な検出を図っている。

この場合、ヒートブロック 56の中間位置に所定温度に加熱可能な加熱ブロック（図示略）を取り付け、ヒー卜ブロック 56の長さ方向の中間部に 50°C〜60°C の温度領域を設け、第 6図の鎖線のように 95°Cから 50°C〜 0°C、 30°Cの三段階に段階的に変化する温度分布を形成することも可能である。

このようにヒートブロック 56の温度分布を段階的に形成し、その中間部に被検 D NAの二重鎖形成温度とされる 50°C〜60°Cの温度領域を広域に設けることで、前記被検核酸を確実に検出でき、検出の信頼性を向上できる。

図中、 59は検出器 5の上流側に設けた蛍光液であるインターカレントダィの導入管で、前記被検 DNAの分離後、つまリニ重鎖形成後、前記インタ一カレントダイをカラム 52へ導入し、被検 DNAの二重鎖形成位置を蛍光表示可能にしている。

前記被検 DNAの二重鎖形成位置は、インターカレントダイの導入後、 UVランプ 54を照射し前記カラム 52をスキャニングして蛍光検出され、その信号を制御'分析装置 6のコンピュータへ入力して、前記固相 DNAプローブ 53と相補的な目的 DMAの有無と、ピーク位置およびピーク値を演算し、分析するようにしている。

このように構成した遺伝子解析装置は、大別すると核酸抽出装置 3と PCR增幅装置 4と、 DNA検出装置 5とで構成され、このうち核酸抽出装置 3のサンプリング容器 1 8は、内面に吸着層 22を形成し、所定の DNAまたは RNAの抽出に、 1本の容器 1 8を使用するだけで済み、従来のように 1回のサンプリングに 4 〜6本のサンプリング容器を要しない。

前記サンプリング容器 1 8の製作は、従来の合成樹脂製有底容器内面の所定位置に、粉状のガラスビーズ若しくはシリカゲルビーズを帯状に熱溶着して、薄厚で帯状の吸着層 22を形成すれば良ぐ構成が簡単で特別な設備を要することなく、容易かつ安価に製作できる。

前記 DNA増幅装置 4は、連結ブロック 41がヒートブロック 38~40に取り外し可能に構成され、該ブロック 41を取り外して、弾性チューブ 37をシリンダ一プロック 35の内面に配管する。

その際、前記シリンダーブロック 35の内面に、目的の DNAの増幅に必要な 1 本の弾性チューブ 37を基本サイクル分、実施形態では略 270° 周回させるしたがって、従来のように弾性チューブ 37を複数サイクル分周回ないし捲回する必要がないから、弾性チューブ 37の短小化を図れ、シリンダーブロック 35 ないしヒートブロック 38〜40の小形軽量化を図れ、その設置スペースのコンパクト化を図れる。

また、前記 PCR増幅装置 4は、弾性チューブ ³フ内の反応液 Lの移動手段として、一定角度往復動可能な複数の极きローラ 36a, 36bを設け、これらのローラ 36a, 36bで弾性チューブ 37内の反応液 Lの両端を気密に閉塞して移動させている。

したがって、従来のように弾性チューブの両端部をバルブで閉塞する必要がなく、それだけ部品点数が低減し構成が簡潔化するとともに、前記バルブの介揷によるクロスコンタミの混入や、反応液しの加熱に伴う蒸発を防止し得る。 .

—方、前記 D NA検出装置 5は、固相 DNAプローブ 53を充填若しくは内壁にコーティングしたカラム 52の近接位置に、長さ方向に温度勾配を形成するヒートブロック 56を配置したから、従来のようにヒートブロックを所定の温度勾配で昇温するものに比べ、被検 DNAの二重鎖形成温度を速やかに得られる。

しかも、ヒートブロック 56が前記被検核酸温度の上下に葛って、その長さ方向に温度勾配を形成しているから、被検 DNAを確実に検出できる。

このような遺伝子解析装置によって目的の遺伝子を解析する場合は、先ずサンプリング容器 1 7に目的の核酸、実施形態では錶型 DNAを抽出する。

すなわち、オートサンプラー 2のサンプルラック 1 8に、例えば一回の DNA抽出に使用する 8本のサンプル容器 1 7を用意し、これらに生体試料である同一または異質の血液 23を所定量注入する。この場合、血液 23の液面は吸着層 22 の下端部の下方に位置している。この状況は第 2図のようである。

また、これと前後して核酸抽出試薬収納容器 7a〜7eに各種の核酸抽出試薬 8a〜8e、例えばプロテアーゼ、カオ卜口ピック剤、フエノールまたはクロ口ホル厶、 7096エタノール、蒸留水等を収容して置く。

そして、前記各サンプリング容器 1 7に蛋白質を分解可能な核酸抽出試薬 8a である、例えばプロ亍ァーゼをシリンジポンプ 1 6を介して、前記吸着層 22に非接触に注入し、かっこれをヒートブロック 20で 58°Cに加熱して、前記血液 23中の蛋白質を分解するとともに、 DNA抽出に寄与しない血球成分を溶解する。この場合、血液 23とプロテアーゼ 8aの混合後の液面は、第 2図のように吸着層 22の下端部の下方に位置している。

次に、各サンプリング容器 1 7に、目的の核酸の吸着層 22への吸着を促す核酸抽出試薬 8bである、例えばカオトロピック剤をシリンジポンプ 1 6を介して注入し、血液 23中の目的の DNAの吸着層 22への吸着を促す。

この場合、血 23とプロテアーゼ Saとカオトロピック剤 8bとの混合後の液面は、第 2図のように吸着層 22の下端部の上方へ位置し、前記目的の DNAが吸着層 22に吸着される。

このようにプロテアーゼ 8aの注入時には、目的の DNAと吸着層 22との接触を回避し、カオトロピック剤の注入時に目的の DNAを吸着層 22に吸着させて、前記 DNAのサンプリング効率を高めている。

すなわち、前記プロテア一ゼ 8aの注入時に、溶解した血球成分が吸着層 22 に接触すると、 DNAを分解する酵素が放出され、分析目的である DNAを分解してしまラ。

そして、この状態で前記カオトロピック剤を注入すると、約 50%位の DNAし力、サンプリングできなくなる。このゆえに、吸着層 22をサンプリング容器 1 7の底部一帯に形成せず、底部から離間した所定位置に吸着層 22を形成している。この後、各サンプリング容器 1 7に核酸抽出試薬 8cである、例えばフエノールまたはおよびクロ口ホルムをシリンジポンプ 1 6を介して注入し、溶解した血球成分等の不要物質を洗浄するとともに、これを系外に排出する。

更に、核酸抽出試薬 8dの 70%エタノールを各サンプリング容器 1 7に注入し、該容器 1 7内の洗浄液等の残留液を系外に排出する。

こうして、各サンプリング容器 1 7を洗浄し清浄にしたところで、前記容器 1 7にシリンジポンプ 1 6を介して溶離液である蒸留水 8dを注入し、吸着層 22から D NAを分離し、目的の錶型 DNAを抽出する。

そして、前記容器 1 7に DNAポリメラーゼ、プライマ一 DNA、 dNTPを含む合成剤を注入し、各反応液しを送液管 25および第 2切換弁 26を介して、 PCR 増幅器 2フへ移送する。前記 PCR 増幅器 27は、反応液しの導入時には扱きローラ 36a, 36bが第 4図の実線位置より若干反時計方向に位置し、弾性チューブ 37の入口部を開放している。

したがって、反応液 Lは弾性チューブ 37に導かれて扱きローラ 36b側へ移動し、該チューブ 37内に所要量充填されたところで、この状況がホトカブラ等のセンサ (図示略)で検出され、その信号がモータ 48へ入力されて、該モータ 48が正転駆動する。

このため、扱きローラ 36a， 36bが回転しながら、シリンダーブロック 35内を第 4図上時計方向へ周回し、扱きローラ 36a, 36bが弾性チューブ 37の両端部を押し潰し、かつ内部の反応液 Lを扱いて、ヒートブロック 38〜40の順に移動し加熱する。

前記ヒートブロック 38〜40は、予め所定の PCR増幅温度 95°C、 60°C、 7 2°Cに加熱され、これらのブロック 38〜40に沿って反応液 Lが移動する度に、目的の DNAが熱変性され、アニーリングされ、伸長されて増幅される。

その際、前記モータ 48は、扱きローラ 36a, 36bが各ヒートブロック 38 ~40 の境界部へ移動する度に駆動を停止し、一定時間経過後に駆華を再開して、各ヒートブロック 38~40による加熱時間、つまり各 PCR増幅工程を一定時間実行させ、その増幅動作を確保する。

そして、扱きローラ 36a， 36bが第 4図の鎖線方向へ移動し、前記 PCR工程の基本サイクルを終了したところで、モータ 48が駆動を停止し、一定時間経過後、逆転駆動する。

このため、前扱きローラ 36a, 36bは回転しな力《ら、シリンダーブロック 35 内を第 4図上反時計方向へ一気に周回し、かつその際、扱きローラ 36a, 36b が弾性チューブ 37の両端部を押し潰し、内部の反応液 Lを扱いて往動始期の原位置へ移動する。

この後、モータ 48が正転駆動し、扱きローラ 36a, 36bが回転しながら往動を再開し、シリンダーブロック 35内を第 4図上時計方向へ周回し、内部の反応液 Lを扱いて、ヒートブロック 38〜40の順に間欠的に移動し加熱する。

以後、モータ 48が間欠的に正転し、 PCR増幅工程を順次実行し、 1サイクル分の増幅工程を終了後、逆転駆動して扱きローラ 36a, 36bを原位置に復帰させる。

このような往復角運動を繰り返し、前記増幅工程を所定サイクル分、実施形態では 30サイクル実行後、 PCR増幅を終了する。

このよう (こ前記 PCR増幅は、扱きローラ 36a, 36bによって、弾性チューブ 3 7の両端部を閉塞し、その内部に反応液を気密に密封して移動させるから、弾性チューブの両端部をバルブで閉塞する必要がなぐそれだけ部品点数を低減し構成を簡潔にする。

また、前記バルブの介揷によるクロスコンタミの混入や、反応液しの加熱に伴う水蒸気の漏出を防止し、分析の信頼性を向上する。し力、も、扱きローラ 36a, 36bは反応液 Lに接触していないから、前記ローラ 36a, 36bによるクロスコンタミ混入の問題を生じない。

前記 PCR増幅後、増幅された DNAを含む反応液 Lは、二重鎖状態の DNAと過剰のプライマーを含み、これが各弾性チューブ 37から移送管 51を経て検出器 5へ移動する。

前記検出器 5 ('こは、カラム 52が取り付けられ、該カラム 52内の固相 DNAプローブ 53を前記反応液 Lが移動する。

前記固相 D NAプローブ 53は、カラム 52に近接配置したヒートブロック 56を介して、一定の温度勾配に加熱され、その温度勾配はカラム 52の長さ方向、つまり反応液 Lの移動方向に漸減する温度分布を形成している。

すなわち、ヒートブロック 56は、両端部の高温ブロック 57と低温ブロック 5 8を介して、両端部を 95°Cと 30°Cに加熱若しくは冷却し、その中間部はそれらの熱伝導によって、長さ方向に漸減する温度勾配を形成していて、カラム 52内の固相 DNAプローブ 53も、同様な温度分布を形成している。

したがって、ヒートブロックを所定の温度勾配で昇温するものに比べて、被検 DNAの二本鎖形成温度を速やかに得られ、被検 DNAの検出を確実に行なえる。し力、も、前記増幅した DNAを含む反応液 Lを、そのままカラム 52へ移送して目的 DNAを分離している。

したがって、従来のように PCR増幅後の DNAを一旦加熱して二本鎖を解離し、その冷却過程で余剰のプライマーを排出し、冷却後再度ヒートブロックを昇温して目的 DNAを分離する、煩雑で手間の掛かる工程がない。

このような状況の下で、前記増幅された反応液 Lが固相 DNAプローブ 53を移動すると、先ず高温側で固相 DNAプローブ 53と相補の被検 D NAが二本鎖を解離し、変性後次第に冷却されてァニール工程へ移行し、該工程の 50°C~ 6 0°Cの温度域で、前記被検 DNAが二本鎖を形成し始める。

そして、被検 DNAが二本鎖を形成開始後、インターカレントダイを導入管 59 からカラム 52へ送り込み、前記二本鎖形成位置を蛍光標識させ、これを UVランプ 54照射下でスキャニングし蛍光検出する。

したがって、前記被検 DNAの二本鎖形成位置およびその光強度が正確に検出され、その信号が制御.分析装置 6へ入力される。なお、前記反応液 L中の余剰のプライマー等は、そのまま固相 D NAプローブ 53を通過し、カラム 52 の外部に排出される。

前記検出信号は制御'分析装置 6のコンピュータへ入力され、該装置 6で目的の核酸の有無と分離位置およびピーク値を演算し分析する。

こうして一連の DNAを解析後、シリンジポンプ 30を介して、洗浄液 31を PCR 増幅器 27へ送り込み、弾性チューブ 37を洗浄する。この場合、弾性チューブ 3 フは 1周回以下で短小であるから、少量の洗浄液で足りる。

なお、前記ヒートブロック 56を加熱し、カラム 52ないし固相 DNAプローブ 53 の全域を 95°Cに加熱して、フローバッファ一を流し洗浄すれば、前記プローブ 5 3を繰り返し使用できる。

また、全体を 95°Cに加熱したヒートブロックを別途に設け、該ヒートブロックにより迅速に加熱すれば、洗浄時間の短縮を図ることもできる。

なお、前述の PCR増幅器 27は、弾性チューブ 37をシリンダーブロック 35の内面に略 270° 周回して配置しているが、これを 1周回以上に配置してもよぐそのようにすることで増幅サイクル数を低減し、増幅時間の短縮化を図れる。また、弾： T生チューブ 37をリング状の代わりに直線状に配置し、該チューブ 37 の外側の一側に、 1サイクル若しくは複数サイクル分のヒートブロック 38〜40 を配置し、また前記チューブ 37の外側の他側に複数の扱きローラ 36a， 36bを配置し、該ローラ 36a, 36bを直線的に往復動させ、前記チューブ 37内の反応液 L中の DNAを加熱し増幅することも可能である。

そのようにすることで、ヒートブロック 38 ~40の構成が簡単になり、その分 PC R増幅器 27を容易かつ安価に製作できる。

第 7図乃至第 1 5図は本発朋の他の実施形態を示し、前述の実施形態と対応ずる構成部分に同一の符号を用いている。

このうち、第 7図は本発明の第 2の実施形態を示し、この実施形態はサンプリング容器 1 7の他の形態であるサンプリングチップを示し、該チップ" 1 7は合成樹脂によって先細の管状に成形され、その先細側の開口部 60にキャップ 61を着脱可能に装着し、チップ 1 7の所定位置内面に前記吸着層 22を前述と同様な方法で形成している。

そして、 D NA抽出時、キャップ ⁶1を開口部 60に被着し、該開口部 60を下向きにしてチップ 1 7を立設し、その内部に先ず血液 23を収容し、次いでプロテアーゼ 8a、カオトロピック剤 8bを順次注入し、カオトロピック剤 8bの注入時に、当該液面を吸着層 22の下端部以上に位置付け、目的の DNAを吸着層 22に吸着させている。

前記吸着層 22に DNAを吸着後、キャップ 61を取り外し、開口部 60からプロテア一ゼ 8a、カオトロピック剤⁸ bを排出するとともに、この後各種の洗浄試薬をチップ 1 7の上方から注入し、混合した後、これを開口部 60から排出する、いわゆる垂れ流し状態として、それらを上方からいちいち吸入し除去する面倒な作業を排除している。

なお、洗浄後は開口部 60にキャップ 61を被着し、蒸留水を注入して目的の D NAを吸着層 22から分離し、これに DNAポリメラーゼ、プライマー、 dNTP等の合成液を注入し、これらを PCR増幅器 27へ移送する。以降の増幅および検出工程は前述と同様である。

第 8図は本発明の第 3の実施形態を示し、この実施形態は PCR増幅器 27の他の形態を示し、これは弾性チューブ 37の内部に移動子として、磁性流体等の複数の磁性体 62を離間して配置し、該磁性体 62の間に錶型 DNAを含む反応液 Lを導入する。

一方、シリンダーブロック 35の内部に、前記磁性体 62を吸引可能な円筒状の複数のマグネット 63を等角度位置に配置し、これらのマグネット 63を連結杆 47を介して回動軸 47に連結し、該回動軸 47をモータ 48に連係する。

そして、前記マグネット 63を往復角回動し、これに磁性体 62を同動させて、磁性体 62, 62の間に収容した反応液 Lをヒートブロック 38〜 40の内面に沿つて移動し、該反応液しを加熱して目的の DNAを増幅する。

この PCR増幅器 27は、マグネット 63を弾性チューブ 37と非接触若しくは軽圧接触させ、弾性チューブ 37の磨耗や損傷を防止するようにしている。

第 9図は本発明の第 4の実施形態を示し、この実施形態は検出器 5の他の形態を示し、これはカラム 52内に相異なる複数の固相 DNAプローブ 64〜66 を互いに離間して直列的に充填し、若しくはカラム 52の内壁に相異なる複数の固相 DNAプローブ 64〜65を直列的にコーティングし、また前記カラム 52の外側に前記 DNAプローブ 64〜66と略同長のヒートブロック 67〜69を近接して配置している。これらのヒートブロック 67~ 69 は、その両端部に高温ブロック 57と低温ブロック 58 (図示略)が設けられ、各ヒートブロック 67 ~ 69に長さ方向に沿って温度が漸減し、若しくは前述の実施形態のように段階的に変化する温度分布を形成させ、カラム 52を移動する反応液し中の複数の DNAを一度に検出可能にしている。前記温度分布は前述の実施形態と同様である。

第 1 0図乃至第 1 2図は本発明の第 5の実施形態を示し、この実施形態は光源 54である水銀ランプの外側に、管軸方向に温度勾配を形成したアルミニゥム管製のヒートブロック 56を配置し、該ブロック 56の周面に管軸方向に沿つて、透過手段である複数のスリット 70を形成し、該スリット 70の外側に複数のカラム 52を配置し、前記スリット 70を介して光源 54の光をカラム 52へ照射可能にしている。すなわち、この実施形態は光源 54を有効利用し、複数の核酸の検出を実現している。

第 1 1図は第 1 0図の応用例で、ヒートブロック 56の外周面に、単一若しくは複数のスリット 70をスパイラル状に形成し、該スリット 70に沿ってカラム 52を捲回し、該カラム 52の長さを長尺化することで、 D NAの検出精度を向上させている。

第 1 2図は第 1 0図の更に別の応用例で、ヒートブロック 56の外周面に、複数のスリット 70を前記スパイラル状の代わりに、ヒートブロック 56の管軸方向と交差方向、図示の場合は直交方向に捲回し、ヒートブロック 56の短小化ないし小形軽量化とカラム 52の長尺化を図り、 DNAの検出精度を向上させている。第 1 3図乃至第 1 4図は本発明の第 6の実施形態を示し、この実施形態は検出器 5をマイクロチップで構成し、その小形軽量化を図るとともに、前記 D NAの検出をマイクロチップで実現し、マイクロ化学分析を実現させている。

すなわち、前記マイクロ化学分析用の検出器 5は、例えば縦 25mm、横 50m m、厚さ 2m mの薄板状に形成され、これはシリコンウェハー等の基板 7 1の表面をエッチング処理して、複数のマイクロチャンネル 72(微細流路）を形成している。前記マイクロチャンネル 72 は、実施形態の場合、 il 50 m、深さ 20 At m、ピッチ 1 25〃 mに形成されている。

前記基板 7 1上に石英ガラス製のカバー 73を熱溶着して、前記マイクロチヤンネル 72の開口部を閉塞し、該マイクロチャンネル 72内に同一若しくは相異なる固相 DNAプローブ 64〜66を充填し、若しくはマイクロチャンネル 72の内壁に同一若しくは相異なる固相 DNAプローブ 64〜66をコーティングし、または各マイクロチャンネル 72内に長さ方向に沿って、相異なる複数の固相 DNAプローブ 64〜66を間隔を置いて充填している。

前記基板 7 1の下面にアルミフイルム状のヒー卜ブロック 56を溶着し、該ブロック 56の下面にシリコンウェハー等の底板 74を熱溶着している。

前記ヒートブロック 56に、反応液の流れ方向に沿って加熱温度が漸減する温度勾配が形成され、固相 DNAプローブ 64~ 66と相補的な DNAを分離可能にしている。このようにして、この実施形態はマイクロチップで構成した検出器 5によって、複数の DNAを一度に検出可能にしている。

なお、前述の実施形態では、核酸抽出装置 3で DNAを抽出しているが、 RNA を抽出する場合も実質的に同一の操作で良ぐ抽出された RNAは逆転写して DNAに変換し、これに前記 DNAポリメラーゼを含む合成剤を添加して反応液 L を作製し、これを PCR増幅器 27へ移送すれば良い。

第 1 5図は本発明の第 7の実施形態を示し、この実施形態は前記オートサンブラ一 2で生成した同一または異種の試料からなる所要量の反応液 Lを、互いに離間して単一の送液管 25へ連続して送り込み、この反応液 Lを DNA増幅装置 4へ導入している。

前記 DNA増幅装置 4は、前記 PCR増幅器 27の扱きローラ 36a, 36bとモータ 48ヒートブロック 38， 39, 40を省略し、代わりモータ 75, 76を介して回動可能な一対の円板状のバルブヘッド 77， 78を対向配置している。

前記モータ 75, 76はコンピュータ（図示略）によって作動制御され、被検体である反応液 Lに応じてバルブヘッド 77, 78を所定角度回動し、該バルブへッド 77, 78内部に形成した複数の流路を、後述の出入口バルブと供給バルブに連通可能にしている。

すなわち、前記バルブヘッド 77， 78の中央に出入口バルブ 79， 80が設けられ、このうち入口バルブ 79に前記送液管 25の下流側端部が接続され、出口バルブ 80に前記移送管 5 1の上流衡端部が接続されている。

前記出入口バルブ 79， 80の外側の略等角度位置に、複数の供給バルブ 8 1 , 82が配置され、これらの供給バルブ 81 , 82は前記バルブヘッド 77， 78内部の流路を介して、出入口バルブ 79, 80に連通している。

前記出入口バルブ 79, 80と供給バルブ 81 , 82は、後述のコンピュータ（図示略）を介して作動制御され、それらを開閉可能にしている。

前記供給バルブ 8 1 , 82間に反応管である複数のキヤピラリーチューブ 83が接続され、各チューブ 83内の反応液 Lを所定温度に一斉に加熱し、各反応液しに含まれる目的の DNAを増幅可能にしている。

すなわち、前記バルブヘッド 77, 78の間に加熱器 84が配置され、該加熱器 84ί 上方に段階的に拡径する中空筒状に形成され、その内部に前記複数のキヤビラリ一チューブ 83が配管されていて、その下方にファン 85が設置され、該ファン 85の直下にヒートブロック 86が配置されている。

前記ヒートブロック 86は、前述のコンピュータを介して目的の DNAの増幅に必要な加熱温度、つまり目的の DNAの変性温度（略 95°C)と、アニーリング温度（略 60°C)と、伸長温度（略 72°C)と、およびそれらの加熱時間と加熱回数 (加熱サイクル）を制御され、その暖気をファン 85を介して加熱器 84内へ送り込み、キヤビラリ一チューブ 83を加熱可能にしている。

前記出口バルブ. SOに移送管 51の一端が接続され、該管 51に三方弁 87 を介してシリンジポンプ 88が介挿され、該ポンプ 88の下流側に三方弁 89介して、多ポート切換弁、実施形態では 1 3ポート切換弁 90が接続されている。前記三方弁 89は、その切り換え操作を介して、 PCR増幅後の反応液 Lを前記多ポート切換弁 90、またはドレン容器 91へ排出可能にしている。

前記多ポート切換弁 90は、.相隣接し連通する複数組の出入口ポートを備え、このうちのポー卜 P₄の各入口ポートに導入管 92〜95の一端を接続し、その各出口ポートに導出管 96~ 99の一端を接続している。

前記導入管 92〜95の他端部は筐体 1 00内に配管され、該筐体 1 00内の導入管 92〜95に流体抵抗手段である抵抗管 1 01が接続されている。前記抵抗管 1 01は同一の流体抵抗を有し、その抵抗値は DNA検出装置 5に配置したカラム 52a〜52d圧力、つまり流体抵抗（内部に充填し若しくはコーティングした固相 DNAプローブ 53の流体抵抗を含む）よりも大き実施形態では略倍に設定されている。

前記導入管 92〜95の他端に給液管 1 02の一端が接続され、該管 1 02の他端が溶離液収納容器 1 03に連通している。前記給液管 1 03に単一の送液ポンプ 1 04が介挿され、前記容器 1 03内の溶離液を前記導入管 92〜95へ供給可能にしている。

前記導出管 96〜99の下流側部にカラム 52a〜52dが介挿され、該カラム 5 2a〜52dに同一または相異なる固相 DNAプローブ 53a〜53dが、充填若しくはカラム内壁にコーティングされている。

前記カラム 52a~52dに隣接してヒートブロック 56a〜56dが配置され、これらのヒートブロック 56a〜56dは、前述のように反応液 Lの移動方向に沿って、所定の温度勾配を形成する代わりに、その全域を順次一様な温度に設定可能にしている。

すなわち、ヒートブロック 56a〜56dはコンピュータを介して、加熱かつ降温可能に制御され、 DNAの分折当初は DNAの変性温度である略 95°Cに加熱され、その後 DNAの二重鎖形成温度付近の略 40°Cに降温され、該温度の下で熱溶出を行ない固相 D N Aプローブと結合した被検 D N Aを検出可能にしている。

前記導出管 96〜99の下流側端部は、前述のコンピュータを内蔵したマルチチャンネル型の UVモニタ 1 05を介して、フラクションコレクタ 1 06若しくはドレインに接続され、反応液 L中の余剰のプライマー等を分集し若しくは外部へ排出可能にしている。

前記 UVモニタ 1 05は、各検体の検出'分析信号入力を条件に、前述のコンピュータに予め記憶した情報に基いて、目的の核酸の有無と分離位置およびピーク値を演算し、その処理結果を SSTECパターンの分析パターン丁，〜"^として、モニタ画面 1 07に同時かつ一覧表示可能にしている。

前記モニタ画面 1 07は横軸にリテンションタイムとして表わされてくる温度

(°C)を設け、縦軸に吸光度を設け、これらに各検体の分析パターン L〜丁 ₄を表示している。この分析パターン丁，〜"^におけるピークの位置は、被検 D NA の融解温度（Tm値）を示している。

すなわち、この実施形態は、前記オートサンプラー 2で生成した同一または異種の試料からなる所要量の反応液 Lを、シリンジ 1 5を介して送液管 25へ間欠的に送り出し、この反応液 Lを DNA増幅装置 4の入口バルブ 79へ順次導入する。

前記 DNA増幅装置⁴は、前記オートサンプラー 2からの反応液 Lの送出を条件に、コンピュータに記憶された情報を基に、入口バルブ 79と供給バルブ 8 1を開弁し、またバルブヘッド 77， 78を回動して、内部の各流路を介し入口バルブ 79と所定の供給バルブ 8 1を連通し、更に対応する供給バルブ 81 , 82をキヤピラリーチューブ 83を介して連通する。

そして、最初に送出された反応液 Lを、入口バルブ 79からバルブヘッド 77内の流路を介して、所定の供給/ ルブ 82からキヤピラリーチューブ 83へ移動し、加熱器 84内の中央へ移動したところで停止する。

次いで二番目に送出された反応液 Lを、入口バルブ 79からバルブへッド 77内の流路を介して、所定の供給バルブ 82からキヤビラリ一チューブ 83へ移動し、加熱器 84内の中央へ移動したところで停止する。

以後、順次反応液 Lを入口バルブ 79から所定の供給バルブ 82を介して、キャビラリ一チューブ 83へ移動し、加熱器 84内の中央へ移動したところで停止する。

そして、前記各反^液 Lを各キヤピラリーチューブ 83へ送出し、その中央部へ移動して静止後、前記コンピュータを介しヒートブロック 86を目的の D NAの増幅に必要な所定温度に所定時間加熱し、その暖気をファン 85を介して加熱器 84内へ送り込み、各キヤビラリ—チューブ 83を一斉に加熱する。

すなわち、ヒートブロック 86を先ず目的の DNAの変性温度（略 95°C)に加熱し、前記各キヤピラリーチューブ 83内の反応液 L中の D NAの二本鎖を一斉に解離し、一本鎖の DNAを生成する。

次に、ヒートブロック 86を目的の DNAのアニーリング温度（略 60°C)に降温し、前記各反応液 L中の一本鎖の DNAに 2種類のプライマーを結合してァニーリングする。この後、ヒートブロック 86を目的の DNAの伸長温度（略フ2¾)に加熱し、耐熱性の DNAポリメラーゼを介して二本鎖の DNAを合成し、相補的 DN Aを複製する。

こうして、目的の DNAの変性工程とアニーリング工程と伸長工程の分析の基本サイクル終了後、再度ヒートブロック 86を変性温度とアニーリング温度と、伸長温度に所定時間加熱する。以後、前記操作を繰り返し、これを所定サイクル、実施形態では 30サイクル実行して、各反応液 L中の目的の DNAを一斉に所定量増幅し、 PCR増幅工程を終了する。

このように前記 PCR増幅は、試料である反応液 Lを特定のキヤビラリーチユーブ 83の定位置に静止させて加熱しているから、共用の反応管に反応液 Lを移動させて加熱する方法に比べ、正確かつ安定した増幅状態を得られ、異種の試料を増幅する場合に有利になる。また、単一のヒートブロック 86で複数のキヤビラリ一チューブ 83を加熱してし、るから、複数の加熱部を要する従来の増幅法に比べ、構成の簡潔化と合理化、並びに熱源消費の節減と増幅コストの低減を図れる。

しかも、複数の試料を同一温度に加熱し、各試料の DNAの変性工程とァニ一リング工程と伸長工程を同時に実行させているから、これらを別々に行なう場合に比べ、増幅時間の短縮化を図れる。

そして、前記 PCR増幅後、前記コンピュータに記憶された情報を基に、出口バルブ 80と所定の供給バルブ 82を開弁し、バルブヘッド 78内部の各流路を介して、各キヤビラリ一チューブ 83を移送管 5 1へ連通し、各キヤビラリーチユーブ 83内の増幅後の反応液 Lを、シリンジ 88を介して多ポート切換弁 90の所定ポートへ順次移動する。

前記多ポ一卜切換弁 90は、送液ポンプ 1 04から DNA検出装置 5に至る溶離液の供給路の中流域に配置され、該供給路の上流側に被検体と同数の複数の抵抗管 1 01が並列に接続され、各抵抗管 1 01に前記溶離液が分流する。前記溶離液は抵抗管 1 01を経て多ポート切換弁 90へ移動し、その移動過程で前記ポートに導入された増幅後の反応液しと合流し、これらが所定の導出管 96〜99を移動して、所定のカラム 52a~52dの固相 DNAプローブ 53a〜5 3dへ移動する。

以後、増幅後の反応液 Lを多ポート切換弁 90の所定ポートへ順次導入し、該反応液 Lを対応する導入管 92〜95の溶離液を介して、導出管 96~ 99および所定のカラム 52a〜52dを経由し、所定の,固相 DNAプローブ 53a〜53d へ移動する。

そして、各固ネ目 D NAプローブ 53a〜53dに、増幅後の同一若しくは異種の反応液しを移動させたところで、各ヒートブロック 56a〜56dを一斉に加熱し、それらを先ず目的の DNAの変性温度（略 95°C)に加熱して、反応液 L中の DNAの二本鎖を一斉に解離し、一本鎖の DNAを生成する。この後、ヒートブロック 86を二本鎖形成温度（ハイブリダィゼーシヨン温度）の略 40°Cに降温し、当該温度の下で熱溶出し、固相 DNAプローブと結合した被検 DNAを検出して初期状態へ戻す。

このようにこの実施形態は、各ヒートブロック 56a〜56dの全域を昇温かつ降温して順次一様に^度設定するから、各ヒートブロック 56_a〜56dを温度勾配に形成して被検 DNAを検出する前述の方法に比べ、簡単かつ安価な設備で容易に分析できる。

この場合、各抵抗管 1 01の流体抵抗は略同一で、カラム 52a〜52dの圧力、つまり流体抵抗よりも大きく、実施形態では略 5倍に設定されている。したがって、抵抗管 1 01を配置しない場合に比べ、導入管 92~ 95内の溶離液量は略 1 /5になり、カラム 52a〜52dの流量変化も、抵抗管 1 01を配置しない場合に比べて略 1 Z5に抑えられる。

つまり、前記抵抗管 1 01を設けることで、カラム 52a〜52dの流量変化を抑制できるから、カラム 52a〜52d毎に高価な送液ポンプを配置し、高精密に流量制御する必要がない。

それゆえ、実施形態のように DNA検出装置 5に複数のカラム 52a〜52dを並列に配置しても、それらの流量変化を抑制し、これを単一の送液ポンプ 1 03で対応できることとなる。

したがって、その分設備費の低減を図れ、しかも比較的トラブルの多い送液ポンプを一台とすることで、トラブルの発生を未然に防止し、分析の安定性と円滑性を図れる。

そして、このようにカラム 52a〜52dの溶離液量を抑制し減量しても、分析パターン丁〜丁 ₄のリテンションタイムは、温度依存性であり、流量ないし流速変化の影響を殆ど無視できるから、分析の正確性と信頼性を維持できる。

し力、も、 DNA検出装置 5に複数のカラム 52a〜52dを配置し、複数の検体を並行処理できるから、 1検体当たりの分析時間が短縮し、その高速化と分析コストの低減を図れる。更に、モニタ画面 1 07に各検体の分析パターン！^〜丁

₄が同時に刻々と表示されるから、それらの動静や推移、変化や相違を容易に把握できる利点がある。

なお、前記第 7の実施形態の応用形態として、第 1 5図のように各ヒートブロック 56a〜56dと、多ポート切換弁 90との間の導出管 96~ 99に臨ませて、プレヒートブロック 1 08を配置し、該ブロック 1 08を一定温度に加熱可能にしている。

この応用形態では、プレヒー卜ブロック 1 08を、目的の DNAの二本鎖を解離し、かつ一本鎖に生成可能な変性温度（略 95°C)に加熱可能にし、ヒートプロック 56a〜56clを、二本鎖形成温度の略 40°Cに設定可能にしている。

このようにすることで、ヒートブロック 56a〜56ciを二様に温度制御する複雑を解消し、これを単純かつ容易化するとともに、ヒートブロック 56a〜56dとプレヒートブロック 1 08を分けて加熱することで、それらの温度設定を円滑かつ確実に行なえる。

そして、反応液 L中の被検 D NAをヒートブロック 56a〜56dの導入前に、プレヒートブロック 1 08で予め一本鎖の状態にして置くことで、ヒートブロック 56a〜 56dではハイブリダィゼーシヨン反応だけを行ない、その温度下で熱溶出を行なうだけで済むから、温度の上昇および降下に要する分析時間を大幅に短縮でき、分析の高速化を図れる。産業上の利用可能性

以上のように、本発明の遺伝子解析方法およびその解析装置は、全自動遺伝子解析装置若しくは全自動遺伝子診断装置に適している。

Claims

請求の範囲

1 . 生体試料（23)から目的の核酸を抽出し、目的の DNAを増幅後、所定の DNAを含む反応液（L)を直列または並列に配置した所定温度の固相 DN

Aプローブ（53)へ導き、該固相 DNAプローブ（53)と相補の DNAを分離する遺伝子解析方法において、少なくとも一部を被検 DNAの二本鎖形成温度に設定可能な複数の固相 DNAプローブ（64〜66)を備え、該固相 D NAプローブ（64〜66)に増幅後の同一若しくは異種の DNAを含む反応液を導入することを特徴とする遺伝子解析方法。

2. 前記固相 DNAプローブ（64~ 66)を被検 DNAの分析毎に昇温かつ降温する請求項 1記載の遺伝子解析方法。

3. 前記反応液（L)を前記固相 DNAプローブ（64~ 66)の導入前に所定温度に加熱し、予め前記被検 DNAの二本鎖を解離し一本鎖に生成する請求項 1記載の遺伝子解析方法。

4. 前記固相 D NAプローブ（ 64 ~ 66 )の反応液（ L)に対する上流側を高温側とし、下流側を低温側の温度勾配に設定する請求項 1記載の遺伝子解析方法。

5. 前記固相 DNAプロ—ブ（ 64~ 66 )の上流側が前記 D NAの変性温度以上で、かつ前記固相 DNAプローブ（64〜66)の下流側が前記 DNAの伸長温度以下の温度勾配に設定する請求項 4記載の遺伝子解析方法。

6. 前記温度分布の中間部に、前記相補の DNAが二重鎖を形成可能な一定の温度域を設け、前記固相 DNAプローブ（64〜66)を段階的に温度分布させる請求項 4記載の遺伝子解析方法。

7.前記固相 DNAプローブ（64〜66)に、同一若しくは異種の DNAを含む反応液（L)を直接導入する請求項 4記載の遺伝子解析方法。

8. 生体試料（23)から目的の核酸を抽出し、目的の DNAを増幅後、所定の DNAを含む反応液（L)を直列または並列に配置した所定温度の固相 D NAプローブ（53)へ導き、該固相 DNAプローブ（53)と相補の DNAを分離する遺伝子解析装置において、少なくとも一部を被検 DNAの二本鎖形成温度に設定可能な複数の固相 DNAプローブ（64~ 66)を備え、該固相 DNAプローブ（53)に増幅後の同一若しくは異種の DNAを含む反応液 ( L)を導入可能にしたことを特徴とする遺伝子解析装置。

9.前記固相 DNAプローブ（64〜66)を被検 D NAの分析毎に昇温かつ降温可能にした請求項 8記載の遺伝子解析装置。

1 0.前記反応液（L)の前記固相 DNAプローブよりも上流側の流路にプレヒートブロック（1 08)を設け、該プレヒートブロック（1 08)を、前記裨検 DNAの二本鎖を解離し一本鎖に生成可能な所定温度に設定可能にした請求項 8記載の遺伝子解析装置。

1 1 .前記固相 DNAプローブ（64~ 66)の反応液（L)に対する上流側を高温側とし、下流側を低温側の温度勾配に設定する請求項 8記載の遺伝子解析装置。

1 2.前記固相 DNAプローブ（64〜66)の上流側が前記 DNAの変性温度以上で、かつ前記固相 D N Aプローブの下流側が前記 D N Aの伸長温度以下の温度勾配に設定する請求項 1 1記載の遺伝子解析装置。

1 3.前記温度分布の中間部に、前記相補の DNAが二重鎖を形成可能な一定の温度域を設け、前記固相 DNAプローブ（64〜66)を段階的に温度分布させる請求項 1 1記載の遺伝子解析装置。

1 4.前記固相 DNAプローブ（64〜66)に、同一若しくは異種の DNAを含む反応液（L)を直接導入する請求項 1 1記載の遺伝子解析装置。

1 5.互いに並列に配置した複数のカラム（52a~ 52d)に同一若しくは相異なる複数の固相 DNAプローブ（64~ 66)を収容し、各カラム 52a〜52d)に連通する溶離液の各供給路【こ、前記カラム（52a〜52d)部分の流体抵抗よりも大きな流体抵抗手段（1 01 )を配置した請求項 8記載の遺伝子解析装置。

1 6.単一の送液ポンプ（1 04)を介して、前記溶離液を各カラム（52a〜52d) に供給可能にした請求項 1 5記載の遺伝子解析装置。

1 7.前記溶離液の各供給路の下流側と DNA検出装置との間に、増幅後の同一若しくは異種の DNAを含む複数の反応液（し)を導入可能にした多ポート切換弁（90)を配置し、該切換弁（90)の所定のポ—ト，〜に、前記溶離液の各供給路と、前記各カラム（52a~ 52d)に連通する通路を接続した請求項 8記載の遺伝子解析装置。

1 8.前記温度分布を形成可能な管状のヒートブロック（56)を設け、該ヒートブロック（ 56)の内側に光源（ 54)を配置し、該ヒートブロック（ 56)に前記光源（54)の透過手段を設け、該透過手段に臨ませて前記固相 DNAプロ一ブ（64〜66)を配置した請求項 1 1記載の遺伝子解析装置。

1 9.前記温度分布を形成可能な基板（71 )に 1または複数のマイクロチャンネル（72)を形成し、該チャンネル（72)内に 1または複数の固相 DNAプロ一ブ（⁶4~ 66)を配置した請求項 1 1記載の遺伝子解析装置。

20.前記固相 DNAプローブ（64~ 66)による被検 DNAの二本鎖形成位置を検出かつ分析可能な分析装置の表示画面（1 07)に、各検体の分析バターン（"^〜丁を表示可能にした請求項 8または請求項 1 1載の遺伝子解析装置。