WO2002096396A1 - Particules inorganiques fines renfermant un medicament, leur procede de preparation et preparation pharmaceutique renfermant ces particules - Google Patents

Particules inorganiques fines renfermant un medicament, leur procede de preparation et preparation pharmaceutique renfermant ces particules Download PDF

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Yukie Takagi
Megumu Higaki
Rie Igarashi
Yoko Yamaguchi
Michio Kimura
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Definitions

  • the present invention relates to a protein having a medicinal effect, a low molecular weight compound having a medicinal effect, a calcium-containing poorly water-soluble inorganic fine particle in which a gene is encapsulated, a method for producing the same, and a drug-containing inorganic fine particle preparation using the calcium-containing poorly water-soluble inorganic fine particle.
  • TECHNICAL FIELD The present invention relates to a sustained-release preparation, a target sustained-release preparation using calcium-containing poorly water-soluble inorganic fine particles encapsulating a protein, an antigen, a gene having a medicinal effect, and a low-molecular compound having a medicinal effect, and a method for producing the same.
  • the present invention relates to a preparation in which the fine particles are encapsulated in a matrix made of a lactic acid polymer or the like used in regenerative medicine.
  • Targets for macrophages, retinal tissue, neutrophils, vascular endothelial cells, cancer cells, inflammatory sites, infected sites, cancer tissues, and atherosclerotic walls mainly low molecular drugs, active proteins, vaccines, and genes It becomes an increasingly important issue. Disclosure of the invention
  • the present invention provides a method for preparing a drug, which is simple, non-irritating, has many medicinal properties, a low-molecular-weight compound having medicinal properties, a gene that can be applied to a gene, and a protein having such medicinal properties, a low-molecular-weight having medicinal properties. It is an object of the present invention to provide drug-encapsulated inorganic fine particles capable of stabilizing a compound and a gene, and obtain excellent sustained-release effect and target effect, a method for producing the same, and a drug-enclosed inorganic fine particle preparation.
  • the drug-encapsulated inorganic fine particles of the present invention comprise: calcium-containing poorly water-soluble inorganic fine particles; and a biologically active substance encapsulated in the fine particles.
  • Fine particles in which a biologically active substance is encapsulated inside calcium-containing poorly water-soluble inorganic fine particles are easy to produce, have no irritation, and as a biologically active substance, a protein having a medicinal effect, a low molecular compound having a medicinal effect or a gene. Are used. Quality can be stabilized.
  • the present invention considers that the biologically active substance is allowed to coexist before the inorganic fine particles are formed, and that the biologically active substance is bound inside the fine particles. This is called encapsulation, and has the effect of increasing the encapsulation rate of the drug and slowing the elution of the drug as compared with the method of supporting the inorganic microparticle drug by mixing the drug after forming the inorganic microparticles.
  • EPO Erythropoietin
  • G-CSF granulocyte colony-stimulating factor
  • GM-CSF granulocyte-macrophage colony-stimulating factor
  • thrombopoetin interferon, influenza protein 1-ferrona, perokinase, tissue plasminogen factor (t-PA), inu-1 leukin-11 (IL-11), enbrel, fibroblast growth factor (FGF), epidermal growth factor (EGF), hepatocyte Growth factor (HGF), Brain-derived neurotrophic factor (BDNF), Nerve growth factor (NGF), Lebutin, Neutrophin-13 (NT-3), Superoxide dismutase (SOD), Insulin, Human growth Hormones, antibodies and antigens.
  • EPO, G-CSF N- in-Yuichi-feron, FGF EGF, HGF BDNF N NGF leptin, NT-3 and the like are desirable.
  • the biologically active substance is contained in an amount of 0.0001 to 10% by weight based on the calcium-containing poorly water-soluble inorganic substance. Further, a drug whose biologically active substance is capable of binding to calcium is preferable. Generally, a drug having a negative charge is preferable because calcium has a positive charge.
  • low-molecular-weight compounds with medicinal properties include non-inflammatory steroid hormones, anti-inflammatory drugs such as hydrocortisones, antimicrobial drugs, anticancer drugs, vasoactive drugs such as prostaglandin, anti-atherosclerotic drugs, immunosuppressants, Calcitonin, luteinizing hormone-releasing hormone (LHRH) derivative, other pituitary peptides Lumon, vancomycin, ticobranine, parathyroid hormone (FTH) and others.
  • antimicrobial agents such as antibacterial agents and antifungal agents, anti-inflammatory agents, anticancer agents, and vasoactive agents are desirable.
  • a low molecular drug having low calcium binding a low molecular drug in which a conjugate having high calcium binding such as phosphoric acid is covalently bonded to a residue by an ester bond or the like may be used.
  • calcium carbonate As the calcium-containing poorly water-soluble inorganic substance, calcium carbonate, calcium phosphate (apatite, hydroxyapatite, etc.), calcium oxalate, calcium urate and the like are desirable.
  • the present inventors have noted that calcium-containing inorganic substances are poorly water-soluble microparticles, and encapsulated a drug inside the microparticles, injected the drug into the lesion, and released the drug little by little in the body. It is intended to provide a sustained release effect. That is, there is a gap of several tens to several 100 nm in the blood vessel wall in an inflammation site, an infection site, a cancer tissue, an arteriosclerosis wall, etc., and the fine particles of the present invention have a size of 10 nm to ⁇ , nm ⁇ , preferably 10 nm to 500 nm. Is accumulated in the lesion through that gap, causing a target effect and being phagocytosed by inflammatory cells and cancer cells such as macrophages, as well as a double-get effect and a sustained release effect Can be caused.
  • the size of the microparticles is 100 nm to 200 m in diameter, it is useful as a sustained-release preparation for subcutaneous injection or intramuscular injection.
  • PLA lactic acid polymer
  • the preparation of the final preparation is performed by adding pharmaceutically acceptable additives to the obtained drug-encapsulated inorganic fine particles, such as proteins such as human serum albumin (HSA), acidic mucopolysaccharide, and lactic acid-glycolic acid polymer (PLGA).
  • pharmaceutically acceptable additives such as proteins such as human serum albumin (HSA), acidic mucopolysaccharide, and lactic acid-glycolic acid polymer (PLGA).
  • Lactic acid polymer, surfactant Ingredients, dispersants such as mannitol, stabilizers and preservatives are added and the final preparation is made by drying or freeze-drying. This is suspended in water or a buffer solution to make it isotonic and administered to humans. It can also be used by suspending it in hyaluronic acid or the like to prevent pain, etc., and to further improve dispersion.
  • a suspension containing a dispersant or the like can be directly used as a final preparation.
  • the final preparation is in a form suitable for subcutaneous injection, intramuscular injection and intravascular injection.
  • the method for producing the drug-encapsulated inorganic fine particles of the present invention comprises: (1) preparing an aqueous solution of a calcium salt such as calcium chloride, calcium bromide, or calcium acetate;
  • aqueous solution of a biologically active substance is added to and mixed with this solution, and then (3) a carbonate such as sodium carbonate and potassium carbonate, and a phosphate such as sodium phosphate, sodium hydrogen phosphate and potassium phosphate.
  • a carbonate such as sodium carbonate and potassium carbonate
  • a phosphate such as sodium phosphate, sodium hydrogen phosphate and potassium phosphate.
  • an aqueous solution of carbonate, phosphate, oxalate or urate is prepared, and (2) an aqueous solution of a biologically active substance is added to this solution and mixed.
  • FIG. 1 is a graph showing the amounts of EPO in the compositions of Example 1 and Test Example 1.
  • FIG. 2 is a diagram showing the amount of G-CSF in the compositions of Example 2 and Test Example 2.o
  • FIG. 3 is a diagram showing the amounts of HyC (Pos.) In the compositions of Example 3 and Test Example 3.
  • FIG. 4 is a graph showing the release of G-CSF from the composition of Example 4, and also a graph showing the stability of G-CSF in a buffer solution as a control.
  • FIG. 5 is a graph showing changes in EPO blood concentration after intramuscular injection of the preparation of Example 5 into mice.
  • FIG. 6 is a diagram showing that the preparation of Example 6 significantly migrates to the spleen after intravenous injection of a mouse as compared to a control.
  • FIG. 7 is a diagram observing that the preparation of Example 7 was incorporated into macrophages.
  • 5M CaCL (Wako) 650 1 and lmg / ml EPO (Chugai Pharmaceutical) 1251 were mixed with stirring.
  • 2.5 ml of 1M NCO 3 (Wako) was added thereto, and the mixture was stirred for 10 minutes to generate CaCOs particles, and EPO was sealed inside the CaCO 3 particles.
  • 6.25 ml of IL0 was added to the obtained sediment, and 1 ml was dispensed into four 1.5 ml test tubes. The four tubes were centrifuged at 2,000 rpm for 5 minutes, and the supernatant was removed.
  • EPO encapsulated in CaCO 3 particles was measured by dissolving CaCOa particles with hydrochloric acid, releasing EPO and using ELISA.
  • 5M CaCL650 ⁇ 1 and 500 ⁇ g / ml G-CSF (Chugai Pharmaceutical) 2501 were mixed with stirring.
  • 2.5 ml of 1 M Na 2 COa was added thereto, and the mixture was stirred for 10 minutes to prepare CaCOa particles.
  • 6.25 ml of H 2 O was added to the sediment, and 1 ml was dispensed into four 1.5 ml test tubes. The four tubes were centrifuged at 2,000 rpm for 5 minutes to remove supernatant. Two of which were subjected to ELISA measurement to quantify the G-CSF which is enclosed in CAC0 3 particles.
  • G-CSF encapsulated in CaCOs particles was obtained by dissolving CaCOs particles with hydrochloric acid and measuring released G-CSF using G-CSF ELISA (IBL).
  • H 2 O H 2 O
  • H 2 O H 2 O
  • Hydrochloric acid was added to this to completely dissolve the CaCO 3 particles, and used for ELISA measurement.
  • the mouse liver homogenate solution was mixed at a ratio of 1: 1 and incubated at 37 ° C. for 2 hours to hydrolyze HyC (Phos.) To obtain free HyC, which was used for measurement.
  • Liver homogenate is added to H 2 0 5 ml relative collected one individual component of from liver mice were homogenate Ichito poly preparative port down. The mixture was centrifuged at 15,000 rpm and 5 ⁇ , and the supernatant was recovered and used as a liver homogenate solution.
  • the total amount of HyC in the suspension, which is not bound or encapsulated in the particles, is more than 70% for the sample of Example 3 and 20% for the sample of Test Example 3. It was proved that low-molecular-weight drugs were also encapsulated in CaCOs particles.
  • 5M CaCL650 jU1 and lmg / ml EPO1251-1 were mixed with stirring.
  • 2.5 ml of 1M NasCOa was added thereto and stirred for 10 minutes to prepare CaCO 3 particles.
  • 5 ml of H 2 O was added and centrifuged at 2,000 rpm for 5 minutes to remove EPO in the supernatant.
  • 3 ml of ILO was added to the sediment, and 1 ml was transferred to a 1.5 ml test tube. The mixture was centrifuged at 2,000 rpm for 5 minutes, and the supernatant was completely removed.
  • HyC Phos.
  • HyC Phos.
  • mice 10 minutes and 1 hour after administration were collected from mice 10 minutes and 1 hour after administration, and spleen 48 hours after administration.
  • mouse liver homogenate was allowed to act at 37 V for 2 hours in order to decompose HyC (Phos.) Remaining in the blood as phosphate ester into HyC.
  • the spleen was homogenized sufficiently, the cells were disrupted, and a mouse liver homogenate solution was allowed to act, followed by extraction with DMSO and ELISA measurement.
  • mice were injected intraperitoneally with 2.0 ml of 10% proteose peptone, and three days later, exuded peritoneal macrophages were collected.
  • the cell suspension was adjusted to 5 ⁇ 10 5 cells / ml, and 0.1 ml of the cell suspension was placed in a 24-wells plate containing a cover glass and cultured to allow macrophages to adhere. After removing the non-adherent cells and replacing the culture medium, 0.375 ml of HyC (Phos.)-Encapsulated CaCOa was added and incubated at 37 ° C. Twenty-four hours later, the cover glass was taken out, air-dried and stained with Giemsa, and the phagocytosis of CaCOs particles was observed under a microscope.
  • HyC Phos.

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Description

明細書 薬物封入無機物微粒子、 その製造法及び薬物封入無機物微粒子製剤 ' 技術分野
本発明は、 薬効を有するタンパク質、 薬効を有する低分子化合物、 遺伝 子を封入せしめたカルシウム含有水難溶性無機物微粒子、 その製造法及び そのカルシウム含有水難溶性無機物微粒子を用いた薬物封入無機物微粒子 製剤、 詳しくは薬効を有するタンパク質、 抗原、 遺伝子、 薬効を有する低 分子化合物を封入せしめたカルシウム含有水難溶性無機物微粒子を用いた 徐放製剤、 ターゲッ ト徐放製剤、 及びその製造法に関する。
さらに同微粒子を再生医学に用いる乳酸重合体などからなるマトリ ック スに封入した製剤に関する。 背景技術
従来の技術としてカルシウム含有無機物質を薬物の担体として用いた報 告はあり、 ハイ ドロォキシァパタイ トの微細結晶の表面に抗癌剤などを担 持させ、 動物に注射する方法は考案されている。 このほか、 多孔性のァパ 夕イ トを用いた徐放製剤も考えられている。 しかし、 リン酸カルシウム以 外のカルシウム含有水難溶性無機物微粒子を用いた報告や特許は炭酸カル シゥムを用いた点鼻薬としての特許（特開平 07-165613，特開平 08-027031 ) があるのみである。
又微粒子の表面に薬物をつけるということは行われていたがカルシウム 含有水難溶性無機物微粒子の内部に薬物を封入するということは行われて いなかった。
即ち、 カルシウム含有水難溶性無機物微粒子を形成する際に生物学的活 性物質を共存させて、 無機物微粒子が形成されると同時に生物学的活性物 質をその無機物微粒子中に封入せしめたという技術は行われていなかった 近年、 バイオ技術の進歩によりタンパク医薬品は多くなつた。 しかし夕 ンパク医薬品は注射によらなければ投与できず、 また半減期の短いものが 多い。 従って、 簡単な方法により半減期を長くする工夫が必要となってく る。
またマクロファージ、 網内系組織、 好中球、 血管内皮細胞、 ガン細胞、 炎症部位、 感染部位、 ガン組織、 動脈硬化壁への主として低分子薬物、 活 性蛋白、 ワクチン、 遺伝子のターゲッ トは今後ますます重要な課題となつ てくる。 発明の開示
そこで、 本発明は、 製剤作製方法が簡単で、 刺激性がなく、 多くの薬効 を有するタンパク質、 薬効を有する低分子化合物、 遺伝子に応用出来、 か つ当該薬効を有するタンパク質、 薬効を有する低分子化合物、 遺伝子を安 定させることが出来、 そして優れた徐放効果、 ターゲット効果の得られる 薬物封入無機物微粒子、 その製造法及び薬物封入無機物微粒子製剤を提供 することを目的とするものである。
前記目的を達成するため、 本発明の薬物封入無機物微粒子はカルシウム 含有水難溶性無機物微粒子と、 当該微粒子の内部に封入された生物学的活 性物質と、 からなる。
カルシウム含有水難溶性無機物微粒子の内部に生物学的活性物質を封入 した微粒子は製造が簡単で、 刺激性がなく、 又生物学的活性物質としては 薬効を有するタンパク質、 薬効を有する低分子化合物又は遺伝子が用いら れるが、 これらの薬効を有するタンパク質等、 特に薬効を有するタンパク 質を安定させることが出来る。
カルシウム含有水難溶性無機物微粒子を形成する際に、 生物学的活性物 質を共存させてから無機物微粒子を形成させ、 当該微粒子の内部に生物学 的活性物質が結合していることを本発明においては封入といい、 無機物微 粒子を形成させた後に薬物を混和することにより無機物微粒子薬物を担持 させる方法よりも薬物の封入率が高くかつ薬物の溶出が緩徐であるという 効果を生じるものである。
薬効を有するタンパク質としては、 エリスロポエチン（EPO )、 顆粒球 コロニー刺激因子（G — CSF )、 顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子 ( GM— CSF )、 トロンボポェチン、 インターフェロンひ、 イン夕一フエ口 ン ?、 インタ一フエロンァ、 ゥロキナーゼ、 組織プラスミノ一ゲンァクチ ベー夕一（t-PA)、 イン夕一ロイキン- 11(IL-11 )、 ェンブレル、 繊維芽細胞 増殖因子（FGF )、 上皮増殖因子（EGF )、 肝細胞増殖因子（HGF)、 脳由来 神経栄養因子（BDNF)、 神経成長因子（NGF )、 レブチン、 ニュートロフィ ン一 3 ( NT-3) 、 スーパ一ォキシドジスム夕ーゼ（SOD )、 インスリン、 ヒ ト成長ホルモン、 抗体および抗原などが挙げられる。 特に EPO、 G一 CSFN イン夕一フエロンひ、 FGF EGF、 HGF BDNFN NGF レプチン 、 NT-3などが望ましい。
又、 生物学的活性物質が前記カルシウム含有水難溶性無機物に対し 0.0001 〜 10 重量％含有されていることが望ましい。 さらに生物学的活性 物質がカルシウムに結合性のある薬物が良く、 一般的にはカルシウムが陽 性のチヤ一ジをもっているので陰性のチヤージをもったものが好ましい。 薬効を有する低分子化合物としては、 非抗炎症性ステロイ ドホルモン、 ヒドロコルチゾン類などの抗炎症薬、 抗微生物薬、 抗ガン剤、 プロスタグ ランジンなどの血管作動薬、 抗動脈硬化薬、 免疫抑制剤、 カルシトニン、 黄体形成ホルモン放出ホルモン（LHRH)誘導体、 他の脳下垂体ぺプチドホ ルモン、 バンコマイシン、 ティコブラニン、 副甲状腺ホルモン（FTH)な どが挙げられる。 特に、 抗菌剤、 抗カビ剤などの抗微生物薬、 抗炎症剤、 抗ガン剤、 血管作動薬などが望ましい。 又カルシウム結合性の低い低分子 薬物の場合は残基にリン酸などカルシウム結合性の高い結合物をエステル 結合などで共有結合させた低分子薬物を用いると良い。
カルシウム含有水難溶性無機物としては、 炭酸カルシウム、 リン酸カル シゥム （ァパタイ ト、 ハイ ドロォキシァパタイ トなど） 、 シユウ酸カルシ ゥム、 尿酸カルシウムなどが望ましい。
本発明者らは、 カルシゥム含有無機物が水難溶性の微粒子であることに 着目し、 その微粒子内部に薬物を封入し、 注射することにより病巣部への 夕ーゲッ ト効果と体内で少しずつ薬物が放出される徐放効果を狙ったもの である。 即ち、 炎症部位、 感染部位、 ガン組織、 動脈硬化壁などでは血管 壁に数 10から数 lOOnmのギャップがあり、 本発明の微粒子のうち 10nm 〜 Ι,ΟΟΟηπι好ましくは 10nm〜 500nmの大きさの微粒子はそのギヤ プ を通り病巣に蓄積されることになるので、 ターゲッ ト効果を生じさせ、 か つマクロファージなどの炎症細胞やガン細胞に貪食されるという二重の夕 ーゲッ ト効果、 また徐放効果を生じさせることが出来るのである。
又、 当該微粒子の大きさが直径 lOOnm〜 200 mの場合は徐放製剤と して皮下注射又は筋肉内注射において有用である。
さらに、 近年進歩の著しい再生医療に用いる成長因子の徐放にも大きな 威力を発揮するものである。 又再生医療に用いる場合は、 微粒子がやや大 きめの粒子をそのまま使う他、 乳酸重合体 （PLA) などからなるマトリヅ クスに封入することが望ましい。
最終製剤の作製は、 得られた薬物封入無機物微粒子に製剤学的に受容可 能な添加物、 即ちヒ ト血清アルブミン （HSA) などのタンパク質、 酸性 ムコ多糖体、 乳酸グリコール酸重合体 （PLGA) 、 乳酸重合体、 界面活性 剤、 マンニトールなどの分散剤、 安定化剤、 防腐剤を入れ、 乾燥または凍 結乾燥により最終製剤を作る。 これを等張になるように水または緩衝溶液 などで懸濁しヒ トに投与する。 また疼痛などを防ぐ意味、 また分散をさら に優れたものにするためヒアルロン酸などに懸濁して用いることも可能で ある。 あるいは分散剤などを入れた懸濁液をそのまま最終製剤にすること も可能である。
又当該最終製剤は皮下注射、 筋肉内注射、 血管内注射に適した形態のも のである。
本発明の薬物封入無機物微粒子の製造方法は、 （ 1 ) 塩化カルシウム、 臭化カルシウム、 酢酸カルシウム等のカルシウム塩の水溶液を準備し、 （
2 ) この溶液に、 生物学的活性物質水溶液を添加混合し、 次いで （ 3 ) 炭 酸ナト リウム、 炭酸カリウム等の炭酸塩、 リン酸ナトリウム、 リン酸水素 ナトリウム、 リン酸カリウム等のリン酸塩、 シユウ酸ナト リウム、 シユウ 酸カリウム等のシユウ酸塩、 または尿酸ナトリウム、 尿酸カリウム等の尿 酸塩の水溶液を添加混合することにより生物学的活性物質をカルシウム含 有水難溶性無機物微粒子に封入せしめることである。
又、 （ 1 ) 炭酸塩、 リン酸塩、 シユウ酸塩または尿酸塩の水溶液を準備 し、 （ 2 ) この溶液に、 生物学的活性物質水溶液を添加混合し、 次いで （
3 ) 塩化カルシウム、 臭化カルシウム、 酢酸カルシウム等のカルシウム塩 の水溶液を添加混合することにより生物学的活性物質をカルシウム含有水 難溶性無機物微粒子に封入せしめることである。
さらに、 生物学的活性物質を封入せしめたカルシウム含有水難溶性無機 物微粒子が生成中に凝集することを防止するため、 反応液にタンパク質、 酸性ムコ多糖体、 界面活性剤、 マンニトールを添加すること、 又、 生物学 的活性物質を封入せしめたカルシウム含有水難溶性無機物微粒子が生体内 で凝集することを防止するため、 また生体内での貪食作用を回避するため 、 薬物封入無機物微粒子にタンパク質、 酸性ムコ多糖体、 乳酸グリコール 酸重合体、 乳酸重合体を添加することが望ましい。
なお、 製造法において、 二つまたはそれ以上の無機物を混合する場合は 、 pH7前後で攪拌しながら混和することが好ましく、 無機物濃度、 薬物 濃度、 攪拌スピード、 作用時間、 温度により粒子サイズを調整させること ができる。 ス夕一ラーによる通常の攪拌では 1 m〜； 100 z mの微粒子 しかできないが、 ボルテックス、 ポリ トロン、 超音波などによりさらに攪 拌カを増す事により、 10nm〜 100〃 mの微粒子を作ることも出来る。 又、 水溶液はできるだけ中性とし、 イオン強度をできるだけ低くし、 力 ルシゥムと結合しない緩衝液を使用することが望ましい。 図面の簡単な説明
図 1は、 実施例 1と試験例 1の組成物中の EPO量を示す図である。
図 2は、 実施例 2と試験例 2の組成物中の G - CSF量を示す図である o
図 3 は、 実施例 3と試験例 3の組成物中の HyC ( P os.) 量を示す図で ある。 - 図 4は、 実施例 4の組成物からの G - CSFの放出性を示した図であり 、 対照とした緩衝液中の G— CSFの安定性を合わせ示す図である。
図 5 は、 実施例 5の製剤のマウス筋注後の EPO血中濃度推移を示す図 である。
図 6 は、 実施例 6の製剤が、 マウス静注後、 コントロールに比し、 脾 臓に有意に移行することを示す図である。
図 7 は、 実施例 7の製剤が、 マクロファ一ジに取り込まれていること' を観察した図である。 発明を実施するための最良の形態
以下に本発明の実施例、 試験例について記述する。'
(実施例 1)
5M CaCL (和光） 650 1と lmg/ml EPO (中外製薬） 125 1を攪拌を 行いながら混和した。 そこに 1M N C03 (和光） 2.5mlを添加し攪拌を 10 分行って CaCOs粒子を生成させ、 CaCO3粒子内部に EPOを封入せしめた 。 これに H20 5mlを加えて、 2,000rpm , 5minの遠心をかけ、 上清を除去 した。 得られた沈渣に IL0 6.25ml加えて、 1.5ml試験管に 1mlずつ 4本に 分注した。 4本を 2，000rpm, 5minの遠心にかけ、 上清を取り除いた。 う ち 2本は CaCOa粒子に封入されている EPOを定量するため ELISA測定 に供した。 残りの 2本を lM Na2CO3 0.9ml加えて、 攪拌を行い、 静置し、 表面に結合している EPOを遊離させた。 10分間静置した後に遠心をかけ 、 上清を除去した。 再度、 同様の作業を行い、 N COs処理で遊離した EPOを遠心にて除去した。 残った沈渣を ELISA測定用とした。 CaCO3粒 子中に封入された EPOは、 CaCOa粒子を塩酸で溶解し、 EPOを遊離させ ELISAを用いて測定した。
(試験例 1 )
5M CaCL 650〃 1と 1M
Figure imgf000009_0001
2.5mlを先に混和して CaCO3粒子を作製 し、 H20にて洗浄を行った後に lmg/ml EPO 125 jU 1加えサンプルを調製 した。 これに H20 5mlを加えて、 2，000rpm , 5minの遠心をかけ、 上清を 除去した。 以下実施例 1と全く同じ操作を行い CaCOs粒子表面に存在す る EPOを測定した。
結果は図 1 に示したように、 試験例 1の粒子表面に EPO を結合させた サンプルとは異なり、 本発明方法に基づく実施例 1の封入法による微粒子 サンプルでは Na2C03処理で EPO はほとんど遊離せず、 粒子内にほぼ全 て封入されていることが明らかになった。 (実施例 2 )
5M CaCL650〃 1と 500〃 g/ml G - CSF (中外製薬） 250 1を攪拌 を行いながら混和した。 そこに 1M Na2COa 2.5mlを添加し攪拌を 10分行 つて CaCOa粒子を調製した。 これに H20 5mlを加えて、 2，000rpm , 5min の遠心をかけ、 上清を除去した。 沈渣に H20 6.25ml加えて、 1. 5ml試験 管に 1mlずつ 4本に分注した。 4本を 2，000rpm， 5minの遠心にかけ、 上 清を取り除いた。 うち 2本は CaC03粒子に封入されている G— CSFを定 量するため ELISA測定に供した。 残りの 2本を 1M a COs 0.9ml加えて 、 攪拌を行い、 静置し、 表面に結合している G - CS を遊離させる作業 を行った。 10分間静置した後に遠心をかけ、 上清を除去した。 再度、 同 様の作業を行い、 N COa処理で遊離した G— CSFを遠心にて除去した。 残った沈渣を ELISA測定用とした。 CaCOs粒子中に封入された G― CSF は CaCOs粒子を塩酸にて溶解し、 遊離した G— CSFを G— CSF ELISA (IBL社） を用いて測定した。
(試験例 2 )
5M CaCL 650〃 1と 1M Ν¾0Ο3 2.5mlを先に混和して CaCOs粒子を作製 し、 H2Oにて洗浄を行った後に 500 g/ml G - CSF 250〃 1加えたサン プルを調製した。 これに H20 5mlを加えて、 2,000rpm , 5minの遠心をか け、 上清中の G — CSFを除去した。 以下実施例 2と全く同じ操作を行い CaCOs粒子に存在する G— CSFを測定した。
結果は図 2に示したように、 試験例 2の粒子表面に G— CSFを結合さ せたサンプルとは異なり、 実施例 2の封入法によるサンプルでは N COs 処理で G — CSFは多少は遊離するもののかなりの量は粒子内に封入され ていることが証明された。
(実施例 3)
5M CaCl2650〃 1と 5 %のリン酸ヒドロコルチゾン [HyC (Phos . ) ]を 含有する製剤 （水溶性ハイ ドロコ一トン、 萬有製薬） 375 U 1をボルテツ クスにて攪拌を行いながら混和した。 そこに 1M Na2C032.5mlを添加し攪 拌を 10分行って CaC03粒子を調製した。 これに H20 5ml を加えて、 2,000rpm， 5min の遠心をかけ、 CaC03粒子に封入されていない HyC ( Phos.) を除去した。 この一部を ELISA測定用とした。 また、 沈渣に H20 6.25ml加えて、 その lmlを 1.5ml試験管に移した。 これに塩酸を加 えて CaCO3粒子を完全に溶かし、 ELISA測定用とした。 ELISA測定前に 、 マウスの肝臓ホモジネート液を 1： 1の割合で混和し、 37 °Cで 2時間ィ ンキュペートして HyC (Phos. ) の加水分解を行いフリーの HyC とし、. 測定に供した。 肝臓ホモジネート液は、 マウスより肝臓を採取し一個体分 に対して H20 5mlを加えて、 ポリ ト口ンでホモジネ一トした。 15，000rpm , 5πώιの遠心をかけ、 その上清を回収し、 これを肝臓ホモジネート液と した。
(試験例 3 )
5Μ CaCls 650 1と 1M Na2CO32.5mlを先に混和して CaCO3粒子を作製 し、 ΉΌ にて洗浄を行った後に HyC (Phos.) 375 ju 1加えサンプルを調 製した。 これに H20 5mlを加えて 2，000rpm， 5minの遠心をかけ、 CaCOs 粒子に結合していない HyC (Phos.) を除去した。 以下実施例 3と全く同 じ操作を行い CaCOs粒子に存在する HyCを測定した。
結果は図 3 に示したごとく、 懸濁液中の総 HyC量のうち粒子に結合な いし封入されている HyC量は、 実施例 3のサンプルが 70 %以上、 試験例 3のサンプルが 20 %程度であり、 低分子薬剤も CaCOs粒子中に封入され ることが証明された。
(実施例 4)
5M CaCL650〃 1と 500〃 g/ml G一 CSF 250〃 1を攪拌を行いながら混 和した。 そこに 1M Na2C03 2.5mlを添加し攪拌を 10分行つて CaC03粒子 を調製した。 H20 5mlを加えて 2,000rpm, 5minの遠心をかけ、 上清を 除去した。 沈渣に H20 12.5ml加えて、 1mlを 2.0ml試験管に移した。 こ れに 2，000rpm, 5minの遠心をかけ、 上清を ELISA測定用とした。 沈渣 に 1 % BSA/Tris 一 HC1 (pH7. 2) を 1ml加えて室温で振とうした。 24 時間ごとに 2,000rpm, 5min.の遠心をかけ上清を回収、 沈渣に再び 1 % BSA/Tris 一 HC1 (pH7. 2) を 1ml加えてこの作業を 7日間行った。 最後 の沈渣は塩酸にて溶解させて ELISA測定用とした。 G― CSFの測定には IBL社の ELISA Kitを使用し、 G - CSFが封入された CaCO3製剤から放 出される G— CSF量を総和 （累積） で示した。 また、 対照として、 同時 に 100 ju g/ml G— CSF 30〃 1と 1 % BSA/Tris― HC1 (pH7. 2) 5mlを 試験管内で混和し、 室温で振とうした。 24時間ごとに一部を採取し、 G 一 CSFの量を ELISAにて測定し、 室温での G— CSFの安定性を検討し た。
結果を図 4に示した。 G— CSFの CaC03粒子からの放出試験で、 7日 以上に亘り G — CSFが徐々に放出されることが明らかとなった。 7 日後 の沈査の G— CSF量を合計すると 0. 7〃 gとなり使用した G— CSF量 ( 10 g)と比べかなり低いがこれは緩衝溶液中に溶出した G— CSFの不 安定性に基づくものと思われる。 緩衝溶液中の G— CSFの不安定性はフ リーの G— CSF溶液を室温で放置した時の失活曲線 （白丸、 破線） から も明らかである。 CaC03粒子中の G— CSFの方が溶液中の G— CSFよ りもはるかに安定していることが明らかとなった。
(実施例 5)
5M CaCL650 jU 1と lmg/mlEPO 125〃 1を攪拌を行いながら混和した 。 そこに 1M NasCOa 2.5mlを添加し攪拌を 10分行って CaCO3粒子を調製 した。 H2O 5mlを加えて、 2,000rpm， 5minの遠心をかけ、 上清中の EPO を除去した。 沈渣に ILO 3ml加えて、 1mlを 1.5ml試験管に移した。 2,000rpm , 5min の遠心をかけ、 上清を完全に取り除いた。 2 %コンドロ ィチン硫酸 Aナトリウム （CS-A， 和光） 0.3ml と 5%Mannitol (和光） 2.1ml を加えて攪拌を行いサンプルを調整した。 コン トロールとして lmg/ml EPO 30〃 1と 5 % Mannitol 1.77mlを混和させたサンプルも調製 した。 これらを 5ヶ月齢ォスの C3H Heマウスの筋肉に 200〃 1投与し、 投与後 4時間、 1， 2 , 3 , 4日ごとに眼窩採血を行い、 EPOの血中濃度を ELISAにて測定を行った。
結果は図 5に示したが、 凝集や組織結合を防ぐ意味で CS— Aを作用さ せた EPO-CaCO3製剤を筋注した場合、 in vivoでは徐放効果が得られた。 (実施例 6)
5M CaCL650〃 1と 5%の HyC (Phos . ) を含有する製剤 375〃 1を攪 袢を行いながら混和した。 そこに 1M Na2C032.5mlを加え攪拌を行って CaCOa粒子を調製した。 作製された CaCOs粒子どうしで結合するのを防 く、ために、 2%CS_Aを 3.525ml加え、 10分攪拌を行った。 ILO 5mlを加え て、 2,000rpm, 5minの遠心をかけ、 CaCOs粒子に結合していない HyC (Phos . ) を除去した。 沈渣に l%CS_A/5% Mannitolを 1.397ml加えてラ ヅ ト投与用とした。 またコントロールとして、 HyC (Phos . ) 300 〃 1 と 0.1%Tween80/0.5%BSA/5%Mannitol 818 jU 1を混和して調整し 500〃 1を 10周齢ォスの Wistar ラットに静脈内投与した。 投与後 10分および 1時 間後にマウスから血液を、 48 時間後に脾臓を採取した。，なお血液はリン 酸エステルのまま残っている HyC (Phos . ) を HyCに分解するためにマ ウス肝臓ホモジネート液を 37 V , 2時間作用させた。 脾臓は十分ホモジ ネートし、 細胞を破砕する作業を行ったのち、 マウス肝臓ホモジネート液 を作用させ、 その後 DMSOで抽出して ELISA測定を行った。 未投与のラ ッ トの値を引き HyC量とした。 ELISAは CortisolEIA (IBL社） を使用し た。 結果は図 6に示したように、 CaC03粒子製剤の場合は、 炎症巣やガン 組織と同様血管壁にギャップのある脾臓に HyC が多く夕ーゲッ トされる ことがわかった。
(実施例 7)
5M CaCL650 ju 1と 5%の HyC (Phos . ) を含有する製剤 375〃 1を攪 拌を行いながら混和した。 そこに 1M N&COs 2.5mlを加え攪拌を行って CaCOa粒子を調製した。 作製された CaCO3粒子どうしで結合するのを防 く、ために、 2%CS-Aを 3.525ml加え、 10分攪拌を行った。 H20 5mlを加え て、 2，000rpm， 5min の遠心をかけ、 CaCOs粒子に結合していない HyC (Phos . ) を除去した。 沈渣に l%CS-A/5%Mannitolを 12.5ml加えてサン プルを調整した。 マウスの腹腔内に 10%プロテオースペプトン 2.0ml注射 し、 3 日後に浸出腹腔マクロファ一ジを採取した。 5X105cells/ml に調整し 、 この細胞懸濁液 0.1mlをカバ一グラスを入れた 24wells プレートに入れ 培養し、 マクロファージを付着させた。 付着しない細胞を除去し培養液を 入れ換えた後に、 HyC (Phos . ) 封入 CaCOa 0.375.mlを加えて、 37 °Cで インキュベートした。 24 時間後、 カバ一グラスを取り風乾後にギムザ染 色して、 CaCOs粒子の貪食の様子を顕微鏡で観察した。
結果が図 7 に示したように、 マクロファ一ジ内に明らかに HyC ( Phos . ) 封入 CaC03粒子が貪食している像が認められた。
(実施例 8)
5M CaCL2.6mlと 500 g/ml G一 CSFlmlを攪拌しながら混和した。 そこに 1M Na2CO310mlを添加し攪拌を 10分行って CaC03粒子を調製し た。 ILO 20mlを加えて、 2，000rpm， 5minの遠心をかけ、 上清中の G— CSFを除去した。 これに H20 3mlを加え、 バイアル管に移した。 これを 凍結乾燥にかけ粉末を調整した。 G — CSF封入 CaCOs粒子 50mg、 PLGA2.61gs ジクロロメタン 3ml を混和した。 これを 0.1%ポリビニルァ ルコール /0.7%酢酸亜鉛溶液に攪拌しながら混和した。 3 時間攪拌後、 l,000rpmの遠心にかけ沈渣を得た。 ILOで洗浄後 250 mのフィルター を通し、 20% Mannitol 0.7 1を加え乾燥凍結し徐放性製剤を得た。

Claims

請求の範囲
1 . カルシウム含有水難溶性無機物微粒子と、 当該微粒子の内部に封入 された生物学的活性物質と、 からなる薬物封入無機物微粒子。
2 . 前記生物学的活性物質が薬効を有するタンパク質、 薬効を有する低 分子化合物または遺伝子であることを特徴とする請求項 1記載の薬物封入 無機物微粒子。
3 . 前記生物学的活性物質が前記カルシウム含有水難溶性無機物に対し 0.0001〜 10重量％含有されていることを特徴とする請求項 1記載の薬物 封入無機物微粒子。
4 . 前記薬効を有するタンパク質が、 EPO、 G— CSF、 GM-CSF, トロ ンボポェチン、 インターフェロンひ、 イン夕一フエロン/?、 インターフエ ロンァ、 ゥロキナーゼ、 t -PA、 IL-11、 ェンプレル、 FGF、 EGF、 HGF 、 BDNFs NGF、 レプチン、 NT_3、 SOD, インスリン、 ヒ ト成長ホルモ ン、 抗体および抗原であることを特徴とする請求項 1記載の薬物封入無機 物微粒子。
5 . 前記薬効を有する低分子化合物が、 非抗炎症性ステロイ ドホルモン 、 ヒドロコルチゾン類などの抗炎症薬、 抗微生物薬、 抗ガン剤、 プロス夕 グランジンなどの血管作動薬、 抗動脈硬化薬、 免疫抑制剤、 カルシ卜ニン 、 LHRH誘導体、 他の脳下垂体ペプチドホルモン、 バンコマイシン、 テ ィコブラニン、 PTHであることを特徴とする請求項 1記載の薬物封入無 機物微粒子。
6 . 前記カルシウム含有水難溶性無機物が、 炭酸カルシウム、 リン酸力 ルシゥム、 シユウ酸カルシウム、 尿酸カルシウムであることを特徴とする 請求項 1記載の薬物封入無機物微粒子。
7 . 前記カルシウム含有水難溶性無機物微粒子が、 直径 lOOnm〜 200 H m の微粒子であることを特徴とする請求項 1記載の薬物封入無機物微 粒子。
8 . 前記カルシウム含有水難溶性無機物微粒子が、 直径 10nm〜 l，000nmの微粒子であることを特徴とする請求項 1記載の薬物封入無機物 微粒子。
9. 請求項 1記載の薬物封入無機物微粒子に、 製剤学的に受容可能な添 加物を加えたことから成ることを特徴とする薬物封入無機物微粒子製剤。
1 0. 前記製剤学的に受容可能な添加物がタンパク質、 酸性ムコ多糖体 、 乳酸グリコール酸重合体、 乳酸重合体、 界面活性剤、 マンニトール、 防 腐剤、 安定化剤であることを特徴とする請求項 9記載の薬物封入無機物微 粒子製剤。
1 1 . 請求項 9記載の薬物封入無機物微粒子製剤が皮下注射、 筋肉内注 射、 血管内注射に適した形態であることを特徴とする請求項 9または請求 項 1 0記載の薬物封入無機物微粒子製剤。
1 2. ( 1 ) カルシウム塩水溶液を準備し、 （ 2 ) この溶液に、 生物学 的活性物質水溶液を添加混合し、 次いで （ 3 ) 炭酸塩、 リン酸塩、 シユウ 酸塩または尿酸塩水溶液を添加混合することにより生物学的活性物質を力 ルシゥム含有水難溶性無機物微粒子に封入せしめることを特徴とする薬物 封入無機物微粒子の製造法。
1 3. ( 1 ) 炭酸塩、 リン酸塩、 シユウ酸塩または尿酸塩の水溶液を準 備し、 （ 2 ) この溶液に、 生物学的活性物質水溶液を添加混合し、 次いで ( 3 ) カルシゥム塩水溶液を添加混合することにより生物学的活性物質を カルシウム含有水難溶性無機物微粒子に封入せしめることを特徴とする薬 物封入無機物微粒子の製造法。
1 4. 前記生物学的活性物質を封入せしめたカルシウム含有水難溶性無 機物微粒子が生成中に凝集することを防止するため、 反応液にタンパク質 、 酸性ムコ多糖体、 界面活性剤、 マンニトールを添加することを特徴とす る請求項 1 2または請求項 1 3に記載の薬物封入無機物微粒子の製造法。
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