WO2002097442A2 - Dispositif de presentation de polypeptides, utilisable comme 'puce' pour la detection miniaturisee de molecules. - Google Patents

Dispositif de presentation de polypeptides, utilisable comme 'puce' pour la detection miniaturisee de molecules. Download PDF

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peptide
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Oleg Melnyk
Hélène Gras-Masse
Christophe Olivier
Jean-Olivier Durand
Claude Auriault
Xavier Duburcq
Ahmed Bouzidi
Jean-Michel Garcia
Ouafâa EL-MAHDI
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Lille 2 Droit et Sante
Institut Pasteur de Lille
SEDAC-Therapeutics
Institut Pasteur
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Universite Lille 2 Droit et Sante
Institut Pasteur de Lille
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent

Definitions

  • the invention relates to a device for presenting peptides or proteins, which can be used as a "polypeptide chip" for the miniaturized detection of molecules which are structurally or functionally complementary to said polypeptides.
  • This device consists of a flat support on which the polypeptides are covalently linked, this connection between the polypeptides and the support resulting from the formation of a semicarbazone bond.
  • the semicarbazone link results in particular from the reaction between polypeptides carrying an aldehyde or ketone function and a support functionalized by semicarbazide groups.
  • polypeptide will be used below to designate peptides (comprising at least 2 amino acids, which may be of the L or D series, alpha-amino acids, beta-amino acids, alpha-ydrazino acids, alpha-amin ⁇ proteinogenic acids or not), peptidomimetics (mimes of secondary structure, beta elbow mimes for example), and proteins or fragments of proteins.
  • polypeptide chip corresponds to the English terms “peptide arrays, peptide microarrays or peptide chips”, commonly used in the literature.
  • the invention also relates to the process for preparing supports and for fixing the polypeptides on these supports as well as their use as polypeptide chips.
  • Such chips are particularly favorable for the detection, in various liquid biological media, of antibodies or specific parts thereof, antigens (including viral, bacterial or parasitic), receptors, sequences responsible for binding to a molecule (enzyme, receptor, antibody), studying the specificity of enzymes, developing receptors artificial ...
  • Biochips were first developed and developed for the detection of nucleic acids. Similar products based on polypeptides are the subject of much research but have not yet been optimized. It is therefore especially in the publications and patents relating to DNA chips that the relevant prior art is found.
  • microarrays Apart from the Affymetfix photolithography and ProtoGene inkjet technology, which involve the synthesis of oligonucleotides in si tu, the manufacture of "microarrays” most often uses “spotters” with needles and blades of glass as supports. The needles take the prepared probes from wells of microtiter plates and strike the surface of the material which serves as a support.
  • DNA microarrays produced by depositing probes on a support suffer from many limitations. Some are linked to the apparatus itself (reproducibility- of the volume deposited), but- most are the consequence of the organic / inorganic and interface chemistry involved: too much background noise, sensitivity, efficiency of immobilization, degradation of the probes due to the different treatments necessary for immobilization, stability of the probe-support link during the various washes and during the microarray recycling step, quality of the support (uniformity of treatment, stability over time ), non-specific adsqrption on the support, false positives.
  • polypeptide arrays In addition to these known problems related to nucleotide binding, the design of polypeptide arrays involves specific problems due to the existence on the polypeptides of various reactive functions located on side chains of amino acids which can interfere with immobilization methods, which entails fixation by multiple links or the formation of lateral bonds between polypeptides, which risks decreasing the - reactivity of the polypeptides fixed with respect to the biological liquids which will be tested on these chips.
  • nucleotide chips are not directly transferable to the production of the polypeptide chips, they require the development work of chemoselective coupling methods.
  • thiols have been used - but it has significant limitations: oxidation of thiols during their preparation, their conservation and their deposition on the supports (problem all the more important since during deposition, the surface film contact with air is important).
  • this chemistry has been used to anchor RGD ' type peptides on silica (Portê-Durrieu, MC et al. J. Colloid Interface Science 1990, 134, 368-375), or antibodies on quartz ( eiping, Q. et al. Supramolecular Science 1998, 5, 701-703, disulfide formation). Mention may also be made of the formation of thioethers, and of the Hg-S bond formation (Rao, SV ' et al. Mi rochim. Acta 1998, 128, 127-143).
  • the basic chemistry is of the Boc / benzyl type.
  • the glass slide is silanized amino, then the first amino acid is coupled in the traditional way.
  • the tBoc group is deprotected by irradiation (400 nm) in the presence of triarylsulfonium hexafluoroantimonate or diaryl iodium hexafluoroantimonate.
  • the coupling of the following amino acid is done in the traditional way.
  • a porous polymer is deposited on a series of electrodes.
  • an Fmoc-amino acid-OH is coupled to the porous polymer.
  • the Fmoc group is removed by applying a potential - on a given electrode in the presence of azobenzene.
  • the biochip is then immersed in a solution containing the next activated amino acid.
  • the support is used for the immobilization of amino aldehydes, then for the solid phase synthesis of protected aldehyde peptides in the form of semicarbazide.
  • Semicarbazone is exchanged • in solution with pyruvic acid to release the aldehyde peptide.
  • Murphy, AM et al. describe the reaction of an amino aldehyde in homogeneous phase with a semicarbazide functionalized by a carboxylic acid function.
  • the synthon is anchored to a solid support (beads) and is used for the synthesis of aldehyde peptides in solid phase.
  • the devices according to the invention comprise flat supports, of solid, organic or inorganic material which can be, for example, glass, silicon or its derivatives, natural or synthetic polymer, etc., having a "flat" surface.
  • a group such as a semicarbazide group to immobilize in a controlled manner selected polypeptides by taking advantage of the formation of a semicarbazone bond. This is obtained by the use of polypeptides previously functionalized by an aldehyde or ketone group, and preferably alpha-oxoaldehyde or alpha-oxoketone.
  • the aldehyde or ketone group is introduced during synthesis either at the N-terminal end, or at the C-terminal end, or on a side chain (from Lys or Cys).
  • aldehyde groups are generated by oxidation of the polysaccharide residues.
  • the aldehyde or ketone function can be located on a spacer arm.
  • the deposition of functionalized polypeptides on the semicarbazide support is accompanied by the spontaneous binding of the peptide to the support, under selected pH, temperature and humidity conditions.
  • Semicarbazide slides can be printed, for example, with a needle “spotter”. After the deposition of the polypeptides on the slide, the latter can be soaked, when necessary, in a solution containing a polyethylene glycol derivatized by an ⁇ -oxoaldehyde or ketone function. Thus, all the reactive sites present between the spots are covalently linked to a PEG, via the same semicarbazone link used to immobilize the polypeptides, which further reduces the non-specific absorption of the test samples. So the immobilization strategy
  • 5 - involves surfaces functionalized by a stable, non-hydrolyzable function; involves' very reactive functions, compensating for the low concentration of the polypeptides in the deposit;
  • the quality of the functionalization of the support according to the invention can be controlled by its capacity to fix a synthetic peptide probe, fluorescent, derivatized by an ⁇ -oxoaldehyde function.
  • the invention also relates to the process for preparing the polypeptide presentation devices which comprises the following steps:
  • step 2 3- deposition in the form of spots of polypeptide samples obtained by step 1 on the functionalized support of step 2, under pH and humidity conditions ensuring the reaction between the aldehyde function or ketone and the semicarbazide function - to create the semicarbazone link.
  • Step 1 can be carried out during the synthesis of a polypeptide using an automatic synthesizer. It can include the introduction of a spacer arm between the last amino acid of the polypeptide sequence and the aldehyde or ketone function.
  • Step 1 can be carried out by oxidation of a polysaccharide of a natural glycoprotein or of a fragment thereof or by transamination of an N-terminal amino acid of a non-glycosylated natural protein or of a fragment thereof, or by the action of a bifunctional agent.
  • Stage 2 includes
  • step 2 can be carried out in a single reaction of a silane carrying a semicarbazide group which is preferably protected by the Fmoc.
  • Stage 3 preferably comprises - the preparation of solutions of the polypeptides of stage 1 at 10 -3 or 10 ⁇ 4 M in an 0.1M acetate buffer at pH 5.5, - their distribution in a container suitable for their collection, of the microtitra ion plate well type, their collection using a "spotter", - and their deposit on the semicarbazide support. ; incubating the slides overnight at 37 ° C in a humid atmosphere and washing and saturation of nonspecific reactive sites.
  • the invention also relates to the use of polypeptide display devices as "polypeptide chips" as a diagnostic tool.
  • This use includes the detection of antigen -anti body type responses by the use of labeled, fluorescent, radioactive or chemically labeled reagents, as in non-miniaturized diagnostic tests.
  • the devices according to the invention can also be used as polypeptide chips for the screening of molecules and for the analysis of the relationships between molecules, of ligand-receptor type.
  • Figure 1 comparative test of sera on the HCVpc21-2 peptide in ELISA (measurement of OD) and in semicarbazide slides (measurement of fluorescence / 20000).
  • Figure 2 Study of the correlation between the OD and fluorescence measurements, presented in Figure 1.
  • Figure 3 comparative test of sera on 3 peptides ⁇ CVpc21 "small linker”, “large linker” and N-terminal (HCVpc21 3.2 and 1); fluorescence measurement.
  • Figure 4 comparison of the responses of 30 positive sera with the peptides HCVpc21, NS4 and a pc2l / NS4 mixture (1 in 10); fluorescence measurement.
  • Stage A washing, pickling and silanization
  • Pre-cleaned commercial slides (Esco), with ground edges and frosted margin are immersed in a “piranha” solution (hydrogen peroxide / sulfuric acid, 50/50) overnight.
  • Pre-rinses of three minutes are carried out with deionized water (3 times) then with methanol (1 time), before immersing the slides in a bath at 3% of aminopropyl-trimethoxysilane in 95% methanol for 30 minutes with ultrasound.
  • the slides are rinsed successively by baths of 3 minutes in methanol.
  • Step C Functionalization with a semicarbazide. These slides are then quickly drained before being directly immersed in the solution containing Fmoc-NH-JNH 2 (prepared according to Zhang et al. Anal. Biochem. 1991, 195, 160-170) at 22 mmol / 1 in DMF and treated for 2 hours with ultrasound.
  • Fmoc-NH-JNH 2 prepared according to Zhang et al. Anal. Biochem. 1991, 195, 160-170
  • the slides are then rinsed successively by two 3-minute baths in DMF.
  • the "" - slides previously obtained are immersed in a DMF solution containing piperidine (0.2% by volume) and diazabicyclo-undecene (2% by volume) for 30 minutes. The slides are then rinsed successively by baths for 3 minutes in DMF (1 time), with deionized water (2 times) and finally with methanol (1 time) before being dried and stored in a desiccator under empty.
  • the semicarbazide silanization and functionalization steps are coupled in a single reaction, by prior preparation of the reagent.
  • Step A preparation of the reagent Fmoc-NH-NH-CO-NH- (CH 2 ) 3 -Si (0Et) 3 ) •
  • the preparation of the reagent is carried out according to the following scheme:
  • Stage B.-Preparation of the slides Pre-cleaned slides (Esco), with ground edges and frosted margin are immersed overnight with stirring in a freshly prepared solution of piranha (H2SO 4 / H 2 O 2 ).
  • the slides are then rinsed with stirring in the following successive baths: water deionized (3 times 3 minutes), absolute ethanol (1 time 3 minutes) then dried with a vane pump. They are then immersed for 2 hours in a 1 mg / ml solution of silanization reagent (Fmoc-NH-NH- CO-NH- (CH 2 ) 3 -Si (OEt) 3 ) - in a mixture of 10% THF in toluene at 47 ° C and under ultrasound. The slides are then rinsed with stirring in toluene (2 times 3 minutes) before being drained, then dried for 15 minutes in an oven at 120 ° C and stored in a vacuum desiccator.
  • silanization reagent Fmoc-NH-NH- CO-NH- (
  • the slides previously obtained are immersed in a DMF solution for 3 minutes before being stirred in a bath containing piperidine (0.2% by volume) and due to diazabicyclo-undecene (2% by volume) in DMF for 30 minutes with stirring.
  • the slides are then rinsed successively by baths of 3 minutes in DMF (1 time 3 minutes), in deionized water (2 times 3 minutes) and finally in methanol (1 time 3 minutes), before being dried and stored in a vacuum desiccator.
  • the quality of the slides is therefore controlled using the same reaction as that which will be used to fix the polypeptides: 'We use a small synthetic peptide functionalized by an ⁇ -oxoaldehyde group and labeled with rhodamine (fluorescent marker), and, • as a negative control, the same peptide but in which the ⁇ -oxoaldehyde function is replaced by an amide group.
  • the rhodamine peptide functionalized by an ⁇ -oxoaldehyde group of sequence (5) -6-carboxytetramethylrhodamine- Lys-Arg-NH- (CH 2 ) 3 -NH-CO-CHO was synthesized from the linker IPT (2, 3- O-isopropylidene-D-tartrate), described by JS Fruchart et al. H. Gras-Masse, O. Melnyk (A new linker for the synthesis of C-terminal peptide ⁇ -oxoaldehydes, - Tet. Lett.; 40; 6225-6228-1999), and in, patent application PCT / FR00 / 01035.
  • the slides functionalized by a semicarbazide group are soaked for 1 hour at 37 ° C. in a bath of the rhodamine peptide (functionalized on the C-terminal side by an -oxoaldehyde or control - not functionalized) at a concentration of 0.1 mM in a buffer. 100 mM acetate and at pH 5.5.
  • the slides are then rinsed by passing them through a deionized water bath. They are then transferred to a solution of K 2 HP0 4 at 5% in water for 2 hours and treated with ultrasound. The slides are then rinsed.
  • This peptide is synthesized in solid phase from the C-terminal end to the N-terminal end according to an Fmoc strategy, on an F oc-PAL-PEG-PS resin.
  • This peptide is synthesized '' in solid phase from the C-terminal end to the N-terminal end according to an Fmoc strategy on a “methyl-2,3-0 isopropylidene-D-tartryl-Val-PEGA resin, prepared as described in “Peptides for the new millenium”, proceeding of the 16th american peptide symposium, (kluwer academy publishers, Dordrecht, .2000, pl04-106).
  • This peptide is synthesized in solid phase from the C-terminal end to the N-terminal end according to an Fmoc strategy on a methyl-2,3-0-isopropylidene-D-tartryl-Val-PEGA resin.
  • This peptide is synthesized in solid phase from the C-terminal end to the N-terminal end according to an Fmoc strategy on a methyl-2,3-0-isopropylidene-D-tartryl-Val-PEGA resin. The synthesis is carried out according to the same protocol as that of the HCVpc21-2 peptide. 2 - EBV virus peptide
  • This peptide was synthesized by solid phase from the end 'C-terminal towards the N-terminus as claimed in one • Fmoc strategy on methyl-2 resin, 3-0- isopropylidene-D-Val-PEGA-tartryl following the same protocol as for the HCVpc21-2 peptide.
  • the functionalized peptides are first of all dissolved (at 10 " 3M or 10 " 4M) in 0.1 M acetate buffer, pH 5.5. They are then distributed in the wells of a 384-well ELISA plate (Microtest TM, Becton Dickinson, NJ USA). Using a 32-needle manual “Spotter” (Microarray Printer XMM 47832-Xenopore, Hawthorne, US), the peptides are taken from the ELISA plate and deposited on a semicarbazide glass slide. "
  • the slides are then incubated for 1 night at 37 ° C. under a humid atmosphere.
  • the slides are then incubated in the presence of lOO ⁇ l of patient serum diluted to l / 50 and in the dilution buffer (PBS + 2.5% semi-skimmed milk powder + 0.5% Tween 20) under a coverslip. glass cover glass (24x60mm).
  • the incubation - of the slides - is carried out for 2 hours at 37 ° C under a humid atmosphere. 4 successive washings are then carried out for 3 minutes in PBS solution supplemented with 0.05% Tween 20.
  • the reaction of the antibodies of patients on the polypeptides fixed on the slide is detected by the fixing, on the latter, of fluorescent human anti-Ig antibodies.
  • the fluorescence emitted is then detected using a slide scanner (L35 / PMT 50, Affymetrix 418 Array Scanner, M G).
  • the ELISA tests are carried out on COSTAR carbobind plates, with the same peptide HCVpc21-2.
  • the table below expresses the mean fluorescence 'observed 9 different blades, with respect to the same serum identified HCV positive by ELISA. On each blade 120 spots of the HCVpc21-2 w large linker "peptide were produced at a concentration of 10 " 4 M.
  • the standard deviation on the 9 slides is 1891, a standard deviation of 4.5%.
  • the fluorescence is higher with the HCV peptide "large linker".
  • the results are comparable for the peptide l small linker "and HCVpc21-l.
  • the fluorescence gain mean on the 5 blades is 9.9% in favor of the "large linker” compared to the w small linker "and is 11.11% for the n large linker” compared to the HCVpc21-l peptide (COCHO function on the N-terminal position ).
  • the HCVpc21 peptide is "spotted” according to the protocol described in Example 4 at a concentration of 10 "4 M, the NS4 peptide is spotted at 10 " 3 M.
  • the NS4 peptide is at a concentration of 0, 5 10 " 3M and the peptide HCVpc21 at a concentration of 0.5 10 " 4 M (ratio 10/1).
  • Each peptide is spotted 16 times per slide. The results expressed correspond to the average fluorescence of the 16 spots.
  • results presented in FIG. 4 relate to 30 sera referenced HCV positive according to the test of the company Abbott. These sera were numbered from PI to P30.
  • the test according to the invention made it possible to detect all the positive sera. 10 negative control sera were tested, for which no fluorescence was detected (fluorescence corresponding to the background noise). The test was therefore found to be sensitive and specific at 100% on the samples tested.
  • a fresh blood sample (patient negative for HCV and positive for EBV), of 100 ⁇ l taken at the fingertip was diluted in 50 ⁇ l of dilution buffer (PBS buffer, Tween 0.1%, semi-skimmed milk 2, 5%). These 150 ⁇ l are then placed on the slide and incubated for 2 hours at 37 ° C under a coverslip.
  • dilution buffer PBS buffer, Tween 0.1%, semi-skimmed milk 2, 5%
  • the HCV fluorescence is zero, the EBV fluorescence is 22991 (average of the 16 spots, standard deviation of 8.1% on these 16 spots).
  • the background noise after contact with the serum and the fluorescent antibody is on average 50, namely 0.1% of the maximum signal observed (statistical study on 100 sera referenced). This background noise is 16 times lower than that obtained on Carbobind ® plates with the same peptides. On the other hand, for negative sera, no fluorescence is observed at the peptide spots, apart from that attributed to background noise.
  • HCVpc21-Met A peptide derived from HCVpc21 was synthesized in solid phase from the N-terminal end according to an F oc / tBu strategy, on an Fmoc-PAL-P ⁇ G-PS resin. Part of the product (HCVpc21-Met) will be used as a control:
  • Each peptide is deposited at a concentration of 10 "4 M.
  • a fluorescent antibody As a model for fixing a glycosylated protein on the semicarbazide slides, a fluorescent antibody is used, which allows its direct detection.
  • An anti-IgG-AM rhodamine antibody is oxidized to generate an aldehyde function according to the procedure described by olfe and Hage (Anal. Bioch.; 231; 123-130 1995): 440 ⁇ l of antibody (1.5 g / ml), diluted in a 0.02M 0.15M sodium acetate NaCl buffer at pH 5.5 are placed at 4 ° C for 15 minutes. A 20mM sodium periodate solution in the same buffer is also placed at 4 ° C, protected from light. 275 ⁇ l of the sodium periodate " solution are added to 275 ⁇ l of the antibody solution protected from light, with stirring: solution A.
  • the excess reagent is eliminated by a series of 4 centrifugations carried out without drying the membrane (3,000 revolutions per minute, 60 minutes then 10,000 revolutions per minute, 20 minutes) by rediluting each time in the acetate buffer solution at pH 5.5 (addition of 200 ⁇ l of buffer). These two solutions were taken using a 1 ⁇ l minicaps (Hirschmann Laborgerate) and spotted 8 times on a ⁇ A
  • the slide is then incubated for 6 hours at 37 ° C. in a humid atmosphere. It is then washed by soaking in a 0.1% Tris acetate 0.1 M Tween 20 solution for 60 minutes under ultrasound. The slide is then rinsed with water and dried with ethanol. Fluorescence is revealed with a slide scanner.
  • Example 8 epitopi ⁇ u ⁇ screening.
  • a library of 24 decapeptides was synthesized in parallel to cover 3 loops exposed to the solvent of the NS3 protein.
  • the synthesis was carried out in solid phase from the C-terminal end to the N-terminal end according to the classic Emoc / fcer-butyl strategy and an in situ PyBOP / DIEA activation on the resin "Gly-4, 7, 10 - trioxa-1, 13-dLamino-tridecanyl-methyl-2 ', 3' -O-is ⁇ pryldene-D-tartryl- Val-PBGA ", prepared as described for the peptide HCVpc21-2.
  • the synthesis of the 24 peptides was carried out on an automatic multiple synthesizer of 96 channels of the ACT 496 MDS type from Advanced Chemtech. The syntheses were undertaken on a scale of 0.02 mmol and 15 eq. activated acid were used for each coupling step (simple couplings). The peptidyl-resins were acetylated with the Ac 2 O / DIEA / NMP mixture (3/0, 3/86, 7) after each coupling.
  • the resins were transferred into syringes fitted with frits (of the ABIMED brand) and deprotected at te mp e raturea mb ianteav 1 ' mldu TFA / H 2 0 / etha ⁇ edithiol mixture (95 / 2.5 / 2.5 per vol.) for 2 hours.
  • the resins were then washed with CH 2 C1 2 , methanol and finally ethyl ether and dried.
  • the resins were conditioned in a solution of acetic acid at 10% in water, then treated with 6 eq. NaI0 4 (25.7 mg) dissolved in 500 ⁇ l of water for 2 minutes.
  • the oxidative cut was stopped by adding 24 equivalents of ethanolamine (29 ⁇ l). After two washes with 1 ml of water, the filtrates were mixed and desalted by RP-HPLC (column C3-Zorbax, 0% B to 100% B, flow rate 5 ml. Min- 1 , detection 230 nm). After lyophilization, the peptides were analyzed by analytical RP-HPLC and by ornate mass spectrum MALDI-TOF. The results obtained are collated in the following table. The generic formula of the peptides is shown in the figure below.
  • peptides 14 and 15 are of interest " for the detection of anti-NS3 antibodies, and that, in general, peptide biochips constitute an interesting tool for screening epitopes.
  • Example 9 - study of li and receptor relationships: the ligand is a biotinylated peptide and the receptor is streptavidin or an anti-biotin antibody.
  • the synthesis was carried out on Novasyn TGR resin (Novabiochem, lot A 23633, load 0.2 mmol / g) on a scale of 0.1 mmol.
  • Oxidation is carried out with 6 eq. of NaI0 4 and 8 eq. of methionine at a concentration of 0.5 mM in 100 mM phosphate pH 6.6 / MeOH: 1/1 in flight for 15 min.
  • the reaction is stopped with 12 eq. ethanolamine, diluted with water and purified on column C18 Nucleosil (0-23% 20 min, 23-23% 5 min, 23-35%, 35 min) to give the expected product.
  • Biochip test
  • the pep-biotin peptide is "spotted" according to the protocol described in example 4 paragraph 1 at the concentrations of 10 _3 M, 10 _4 M, 10 ⁇ 5 M and 10 ⁇ 5 M. Each concentration is spotted 6 times per slide.
  • the slides are then incubated in the presence of 150 ⁇ l of ligand (Rhodamine Conjugated affinity Purified anti-Biotin [goat] solution (Rockland, Gilbertsville, PA, USA) or Streptavidin Tetramethyl Rhodamine conjugate solution (Molecular Probes, Oregon, USA)) diluted in 0.01 M PBS buffer, pH 7.2 (ligand concentrations: 10 ⁇ 1 mg / ml, 10 -2 mg / ml 10 _3 mg / ml, 10 _4 mg / ml) under a glass coverslip -object (24x60mm).
  • ligand Rhodamine Conjugated affinity Purified anti-Biotin [goat] solution (Rockland, Gilbertsville,
  • the slides are incubated for 2 hours at 37 ° C in a humid atmosphere. A series of 4 successive washes in PBS solution with 0.05% Tween 20 is carried out. The slides are then rinsed using a wash bottle of deionized water and then ethanol at 95 ° for 1 minute, then dried for 15 minutes in ambient air. The fluorescence is then detected using a slide scanner (L35 / PMT50, Affymetrix 418 Array Scanner, MG). The results expressed in the following table correspond to the average fluorescence and to the standard deviation of the 6 spots of each concentration obtained after incubation of rhodamine streptavidin and rhodamine anti-biotin antibody respectively.
  • the pep-biotin peptide is "spotted" according to the protocol described in example 4 paragraph 1 at the concentrations of 10-3 M, 10 -6 M, 10-5 M and 10-6. Each concentration is spotted 6 times per slide.
  • the slides are then incubated in the presence of 150 ⁇ l of a 10 -3 mg / ml solution of rhodamine streptavidin (streptavidin Tetramethyl Rhodamine conjugate solution (Molecular Probes, Oregon, USA)) diluted in 0.01 M PBS buffer, pH 7.2 in the presence of different concentrations of biotin (10- 3 M, 10-4M, -10-5M, et.0M 10-7M) as .a glass slide covers and ob "(24x60mm).
  • the slides are incubated for 2 hours at 37 ° C. in a humid atmosphere. A series of 4 successive washes in PBS solution with 0.05% Tween 20 is carried out.
  • the slides are then rinsed, - dried and analyzed as The results expressed in the following table correspond to the average fluorescence and to the standard deviation of the 6 spots of each concentration obtained after incubation.

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Abstract

L'invention concerne un dispositif de présentation de peptides ou de protéines, qui est utilisable comme "puce à polypeptides" pour la détection miniaturisée de molécules structurellement ou fonctionnellement complémentaires desdits polypeptides. Ce dispositif consiste en un support plat sur lequel les polypeptides sont liés de manière covalente, cette liaison entre le polypeptides et le support résultant de la formation d'un lien semicarbazone. Le lien semicarbazone résulte en particulier de la réaction entre- des polypeptides portant une fonction aldéhyde ou cétone et son support fonctionnalisé par des groupements semi-carbazides. L'invention concerne également le procédé de préparation des supports et de fixation des polypeptides sur ces supports ainsi que l'utilisation des dispositifs ainsi obtenus comme puces à polypeptides.

Description

Dispositif de présentation de polypeptides, utilisable CQΠHE " puce " pour la détection πύmaturisée de molécules.
L'invention concerne un dispositif de présentation de peptides ou de protéines, qui est utilisable comme « puce à polypeptides » pour la détection miniaturisée de molécules structurellement ou fonctionnellement complémentaires desdits polypeptides. Ce dispositif consiste en un support plat sur lequel les polypeptides sont liés de manière covalente, cette liaison entre les polypeptides et le support résultant de la formation d'un lien semicarbazone.
Le lien semicarbazone résulte en particulier de la réaction entre des polypeptides portant une fonction aldéhyde ou cétone et un support fonctionnalisé par des groupements sémi- carbazides .
On utilisera ci-après le terme général de « polypeptide » pour désigner des peptides (comprenant au moins 2 acides aminés, qui peuvent être de la série L ou D, des alpha-aminoacides, des beta-aminoacides, des alpha- ydrazinoacides, des alpha-aminαacides protéinogéniques ou non) , des peptidomimétiques (mimes de structure secondair , mimes de coude beta par exemple) , et des protéines ou fragments de protéines.
Le terme de « puce à polypeptides » correspond aux termes anglais « peptide arrays, peptide microarrays ou peptide chips », courants, dans la littérature.
L'invention concerne également le procédé de préparation des supports et de fixation des polypeptides sur ces supports ainsi que leur utilisation comme puces à polypeptides .
De telles puces sont particulièrement favorables à la détection, dans divers milieux biologiques liquides, d'anticorps ou de parties spécifiques de ceux-ci, d'antigènes (notamment viraux, bactériens ou parasitaires) , de récepteurs, de séquences responsables de la liaison à une molécule (enzyme, récepteur, anticorps), à l'étude de la spécificité d'enzymes, à la mise au point de récepteurs artificiels...
Les biopuces ont d'abord été mises au point et développées pour la détection d'acides nucléiques. Des produits similaires à- base de polypeptides font l'objet de nombreuses recherches mais ne sont pas encore optimisés . C'est donc surtout dans les publications et les brevets concernant les puces à ADN qu'on trouve l'art antérieur pertinent.
Hormis la technologie de photolitόgraphie d'Affymetfix et de jet d'encre de ProtoGene, qui mettent en jeu la synthèse d' oligonucléotides in si tu, la fabrication de « microarrays » utilise le plus souvent des « spotters » à aiguilles et- des lames de verre comme supports. Les aiguilles prélèvent les sondes préparées dans des puits de plaques de icrotitration et viennent frapper la surface du matériau qui sert de support .
Il est maintenant communément admis que les microarrays à ADN élaborés par dépôt de sondes sur un support souffrent de nombreuses limitations. Certaines sont liées à l'appareillage lui-même (reproductibilité- du volume déposé) , mais- la plupart sont la conséquence de la chimie organique/inorganique et d'interface mise en jeu : bruit de fond trop important, sensibilité, rendement d'immobilisation, dégradation des sondes due aux différents' traitements nécessaires à l'immobilisation,, stabilité du lien sonde-support lors des différents lavages et lors de l'étape de recyclage du microarray, qualité du support (uniformité du traitement, stabilité dans le temps) , adsqrption non spécifique sur le support, faux positifs. En plus de ces problèmes connus, liés à la fixation des nucléotides, la conception de puces à polypeptides comporte des problèmes spécifiques dus à l'existence, sur les polypeptides, de diverses fonctions réactives situées sur des chaînes latérales des acides aminés qui peuvent interférer avec les méthodes d'immobilisation, ce qui entraîne la fixation par des liens multiples ou la formation de liaisons latérales entre polypeptides, ce qui risque de diminuer la - rëactivité des polypeptides fixés vis-à-vis des liquides biologiques qui seront testés sur ces puces .
Les méthodes mises au point pour fabriquer des puces à nucléotides ne sont donc pas directement transposables à la fabrication des puces à polypeptides, celles-ci nécessitant la mise en' œuvre de méthodes de couplage chimiosélectives .
Diverses méthodes de couplage plus ou moins prometteuses ont déjà été décrites.
- Ainsi, la chimie des thiols a été utilisée- mais elle présente des limitations importantes : oxydation des thiols lors de leur préparation, de leur conservation et de leur dépôt sur les supports (problème d'autant plus important que lors du dépôt, la surface de contact du film avec l'air est importante) . Par exemple, cette chimie a été utilisée pour ancrer des peptides de type RGD ' sur de la silice (Portê-Durrieu, MC et al. J. Colloid Interface Science 1990, 134, 368-375) , ou des anticorps sur du quartz ( eiping, Q. et al. Supramolecular Science 1998, 5, 701- 703, formation de disulfures) . On peut également citer la formation de thioethers, et la formation de liaison Hg-S (Rao, S.V.'et al. Mi rochim. Acta 1998, 128, 127-143) .
- De nombreux laboratoires ont immobilisé des protéines via la formation d'un lien hydrazone entre un aldéhyde et un hydrazide. Cependant, ces méthodologies présentent aussi de nombreuses limitations. Le lien hydrazone n'est pas très stable et s 'hydrolyse rapidement (King, TP et al. Biochemistry 1986, 25, 5774-5579) . Pour cette raison, de nombreux auteurs réduisent ce lien avec un borohydrure pour stabiliser la liaison (voir, par ex King, TP et al. Biochemistry 1986, 25, 5774-5579, Ruhn, P. F. et al. J. Chromâtography A 1994, 669, 9-19) . D'autre part, la réaction d'un hydrazide avec un aldéhyde est relativement lente .
- Falipou, S. et al . (Bioconjugate Chem 1999, 10, .346- 53) décrivent, la silanisation de billes de Si02 ou de lames de verre avec du 3-cyanopropyldιmethylchlorosilane . fiés surfaces ainsi traitées permettent d'immobiliser des anticorps (via les hydroxyles des parties glycosylées) de façon non covalente.
Dans le brevet US4874813, il est décrit que le couplage d'IgG (après oxydation périodique pour générer une fonction aldéhyde) à un support hydrazide s'effectue avec un rendement de 53% seulement. Cette chimie n'est pas bien adaptée à la technologie biopuces, où les réactions doivent être très rapides pour compenser la faible concentration de substance à fixer et sa mobilité au cours du séchage du dépôt. Dans le même brevet, il est décrit que 1' incorporâtidh au niveau du support d'une aminé tertiaire
(pKa<8) permet d'accélérer la liaison au support. Il s'agit typiquement d'une accélération due aux interactions non spécifiques induites par l'ammonium. Ce phénomène est bien discuté par Robberson et al. (Biochemistry 1972, 11, 533- 536) dans- le cadre de l'immobilisation d'ARN' sur un gel d'agarose hydrazide, et est probablement dû à la modification des propriétés de diffusion des biomolécules suite à la réduction de dimensionnalité (Adam, G. et al. 1968, in Structural Chemistry and Molecular Biology, Rich, A. Davidson, N. Ed., San Francisco, WH Freeman) . Cependant une telle adsorption non spécifique est justement ce qu'il faut éviter au maximum dans le cadre des biopuces . - L'immobilisation d'IgG oxydée au periodate sur une silice hydrazide est décrite: par Ruhn,. AF et al. (J. Chromât dgraphy A 1994, 669, 9-19) . La réaction prend 1 jour à 4°C ; ce support se décompose à plus haute température et donne lieu à une adsorption non spécifique importante qui s'élève à 20% de la valeur obtenue par liaison covalente. Ce type de chimie n'est pas favorable pour la réalisation de biopuces . -
- Dans le brevet US 4801726, il' est décrit un support (silice) hydrazide pour l'immobilisation de toxines de nature non peptidique par un lien non hydrazone. Le support
(uniquement des gels de silice, pas de surfaces planes) est préparé par réaction avec un silane époxyde puis ouverture de l' époxyde avec un dihydrazide. Or, la réaction de dinucléophiles . sur un support est connue pour donner de nombreuses réactions de pontage . Ce - point est bien documenté dans l'article de Ruhn, PF et al. J. Chromât ography A 1994,- 669, 9-19. Ainsi, ' la densité de fonction de surface est fortement diminuée. Les réactions de pontage sont également la source de problèmes de reproductibilité.
- Plusieurs travaux font appel à la synthèse in situ des polypeptides sur le support :
« Ashfield, C. et al . " Synthesis of peptides in picoliter virtual flasks " (16h American Peptide Symposium Mirmeapolis, Minnesota, june 26-july 1, 1999 Poster 823) décrivent la' synthèse in situ de peptides sur semiconducteur. Des électrodes sont couvertes d'un polymère poreux, au sein duquel s'effectue la synthèse peptidique. Un linker comportant une fonction -NH-Fmoc est lié au polymère. Le groupement Fmoc est enlevé en générant in si tu une base grâce à l'application d'un potentiel redox. La fonction aminé ainsi libérée est mise en réaction avec des acides aminés activés de façon -traditionnelle.
• Pellois, J. P. et al. (J. Comb. Chem. 2000, 2, 355-360) décrivent la synthèse in si tu sur lame de verre.
La chimie de base est de type Boc/benzyl . La lame de verre est silanisée aminé, puis le premier acide aminé est couplé de manière traditionnelle. La déprotection du groupement tBoc s'effectue par irradiation (400 nm) en présence de triarylsulfonium hexafluoroantimonate ou de diaryl iodiûm hexafluoroantimonate. Le couplage de l'acide aminé suivant est fait de manière traditionnelle.
• Dans le Brevet WO 0053625, un mode de synthèse in situ de biopuce est décrit .
Un polymère poreux est déposé sur une série d'électrodes.
Dans un premier temps, un Fmoc-acide aminé-OH est couplé au polymère poreux. Le groupement Fmoc est enlevé grâce à l'application d'un potentiel - sur une électrode donnée en présence d'azobenzène. La biopuce est ensuite immergée dans une solution contenant l'acide aminé suivant activé.
La synthèse in situ souffre de nombreuses limitations :
- elle nécessite l'utilisation de groupements protecteurs photolabiles ou de réactifs activés par l'application d'un potentiel électrique ; cette technologie est peu efficace actuellement (limitation de la taille des peptides, coût élevé, peu flexible - cf commentaires de Pellois, J.P. J. Comb. Chem.
2000, 2, 355-360) , - la caractérisation des peptides liés au support est difficile.
Dans un tout autre domaine, l'utilisation de billes de résines de polystyrène fonctionnalisées par des fonctions semicarbazides a été décrite pour réaliser la synthèse, pas à pas, de peptides aldéhydes . :
• Siev, DV et al. (Org. Lett 2000, 2, 19-22) décrivent une résine polystyrène hydrazino-carbonyl-aminomethylé (billes) pour la synthèse de peptides et peptidomimétiques aldéhyde. • Patterson, JA et al. (Tetrahedron Lett..1999, 40, 6121- 6124) décrivent, à partir d'une résine de type polystyrène aminé, la formation de l'isocyanate avec du triphosgène et la réaction de l'isocyanate avec Fmoc-NH-NH2 (préparée selon Fhang, Z.E. et al. Anal. Bioche . 1991, 195, 160- 170). Le support sert à l'immobilisation d'aldéhydes aminés, puis à la synthèse en phase solide de peptides aldéhydes protégés sous forme de semicarbazide. La semicarbazone est échangée • en solution par de l' acide pyruvique pour libérer le peptide aldéhyde. Murphy, AM et al. (J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 3156- 3157) décrivent la réaction d'un aldéhyde aminé en phase homogène avec un semicarbazide fonctionnalisé par une fonction acide carboxylique. Après la formation de la semicarbazone, le synthon est ancré à un support solide (billes) et s'ert à la synthèse de peptides aldéhydes en phase solide .
Un progrès significatif dans l'élaboration de biopuces à peptides a .été présenté par Falsey et al. (16tiL American Peptide Symposium - Minneapolis 1999 - Poster n° 822) .
Ces auteurs ont lié des peptides fonctionnalisés par une hydroxylamine H2N-0- ou un beta-aminothiol (cystéine N-
- terminale) à des lames de verre fonctionnalisées par une fonction alpha-oxoaldéhyde. La lame de verre a été silanisée aminé, puis les fonctions aminés ont été dérivatisées par une Fmoc-Ser-OH. Après .déprotection du groupement Fmoc à la pipéridine, les lames ont été traitées par du periodate de sodium (oxydation du beta-aminoalcool en alpha-oxoaldéhyde) . L'inconvénient majeur de cette méthodologie est l' adsorption non spécifique de polypeptides- à la surface, menant à un bruit de fond important .
Les Demanderesses ont cherché à résoudre les principales * limitations des dispositifs développés précédemment, et en particulier :
- les problèmes de bruit de fond dus à l' adsorption non spécifique des échantillons à tester ; la fonctionnaiisation trop faible ou irrégulière de "la surface du support ; l'ancrage peu efficace des sondes (polypeptides) .
Ainsi, les dispositifs selon l'invention comprennent des supports plats, en matériau solide, organique ou inorganique qui peuvent être par exemple en verre, en silicium ou ses dérivés, en polymère naturel .ou de synthèse..., présentant une surface" plane fonctionnalisée par un groupement tel qu'un groupement semicarbazide pour immobiliser de façon contrôlée des polypeptides choisis en tirant parti de la formation d'une liaison semicarbazone. Celle-ci est obtenue par l'utilisation de polypeptides préalablement fonctionnalisés par un groupement aldéhyde ou cétone, et de préférence alpha-oxoaldéhyde ou alpha- oxocétone . Dans le cas de polypeptides de synthèse , le groupement aldéhyde ou cétone est introduit en cours de synthèse soit à l ' extrémité N-terminale, soit à l ' extrémité C-terminale , ou sur une chaîne latérale (de Lys ou Cys) . Dans le cas de polypeptides naturels glycosylés on génère des groupements aldéhyde par oxydation des résidus polysaccharidiques .
Dans le cas de polypeptides (fragments de protéines) naturels (glycosylés ou non) on peut générer une fonction cétone ou aldéhyde par transamination du résidu N- terminal ou une fonction aldéhyde ou cétone grâce à l ' utilisation d'un agent bifonctionnel .
La fonction aldéhyde ou cétone peut être située sur un bras espaceur.
Le dépôt des polypeptides fonctionnalisés sur le support semicarbazide s ' accompagne de la liaison spontanée du peptide au support , dans des conditions de pH, de température et d' humidité choisies .
Les lames semicarbazides peuvent être imprimées par exemple avec un « spotter » à aiguilles . Après le dépôt des polypeptides sur la lame, celle-ci peut être trempée, lorsque cela est nécessaire, dans une solution contenant un polyéthylènegïycol dérivatisé par une fonction α- oxoaldéhyde ou cétone . Ainsi , tous les sites réactifs présents entre les spots sont liés de manière covalente à un PEG, via le même lien semicarbazone utilisé pour immobiliser les polypeptides , ce qui réduit encore l ' dsorption non spécifique des échantillons-tests . Ainsi la stratégie d' immobilisation
- est simple au niveau expérimental et d' une grande reproductibilité ; - s'applique aux peptides polyfonctionnels, y compris les polypeptides comprenant des cystéines ;
- met en jeu des polypeptides modifiés par une fonction stable et facile à introduire ;
5 - met en jeu des surfaces fonctionnalisées par une fonction stable, non hydrolysable ; fait intervenir' des fonctions très réactives, compensant la faible concentration des polypeptides au niveau du dépôt ;
10 - permet d'obtenir une grande densité de fixation de surface ce qui assurera un rapport signal sur bruit de fond très élevé ; respecte la structure 'du' polypeptide (liaison spécifique au support par un seul point d' ancrage) ; 15 - permet un contrôle qualité de toutes les étapes.
La chimie de ligation hydrazone a été fortement développée dans le domaine de l'ingénierie des protéines pour la synthèse convergente de macromolécules grâce à la liaison
20. contrôlée de fragments totalement déprotégés et purifiés. Les deux groupements fonctionnels, présents sur chacun des fragments, se reconnaissent mutuellement avec une grande sélectivité dans des conditions très douces (voir par exemple J.'P. Tarn et al . Biomed. Peptide Protein & Nucleic
25 Acids 1995, T, 123-132) . Les liaisons semicarbazones sont beaucoup plus stables que les hydrazones et ont été choisies pour cette raison pour la fixation des polypeptides selon la présente invention.
30 De plus il est apparu, de manière surprenante, que la liaison des groupements semicarbazides sur le support se réalisait de manière dense, homogène et reproductible. Cette densité de fonctionnalisâtion est apparue comme une des clefs de la réussite des biopuces selon l'invention : en effet elle augmente la sensibilité du test ce qui est essentiel pour travailler avec des microquantités et permet ainsi de mesurer des réponses (sonde-cible, antigène- anticorps...) sans avoir recours à des artifices d'amplification. Elle assure1 également un bruit de fond extrêmement faible et donc un rapport signal sur bruit de fond très élevé ce qui augmente la sensibilité du test et sera particulièrement favorable dans le cas de tests mettant en- œuvre des liquides biologiques très riches en protéines diverses .
La qualité de la fonctionnalisation du support selon l'invention (densité et homogénéité) peut être contrôlée par sa capacité de fixer une sonde peptidique de synthèse, fluorescente, dérivatisée par une fonction α-oxoaldéhyde .
L' invention concerne également le procédé de préparation des dispositifs de présentation des polypeptides qui comprend les étapes suivantes :
1- introduction d'une fonction aldéhyde ou cétone, par synthèse ou par modification d'une fonction naturelle, à l'une des extrémités N ou C ou sur une chaîne latérale d'un polypeptide- de synthèse ou naturel ;
2- fonctionnalisation d'un support solide par des groupements semicarbazides ;
3- dépôt sous forme de spots d'échantillons de polypeptides obtenus par l'étape 1 sur le support fonctionnalisé de l'étape 2, dans des conditions de pH et d'humidité assurant la réaction entre la fonction aldéhyde ou cétone et la fonction semicarbazide -pour créer le lien semicarbazone .
L'étape 1 peut être effectuée en cours de synthèse d'un polypeptide à l'aide d'un synthétiseur automatique. Elle peut comprendre l' introduction- d'un bras espaceur entre le dernier acide aminé de la séquence du polypeptide et la fonction aldéhyde ou cétone.
L'étape 1 peut être effectuée par oxydation d'un polysaccharide d'une glycoprotéine naturelle ou d'un fragment de celle-ci ou par transamination d'un acide aminé N-terminal d'une protéine naturelle non glycosylee ou d"'un fragment de celle-ci, ou par l'action d'un agent bifonctionnel .
L'étape 2 comprend
- une réaction de silanisation du support, introduisant une fonction aminé ; - la transformation de la fonction a iné en fonction isocyanate ;
- la réaction de la fonction isocyanate avec un dérivé d'hydrazine pour former le groupement semicarbazide.
Alternativement, l'étape 2 peut être effectuée en- une seule réaction d'un silane portant un groupement semicarbazide qui est, de préférence protégé par le Fmoc.
L' étape 3 comprend de préférence - la préparation de solutions des polypeptides de l'étape 1 à 10-3 ou 10~4M dans un tampon acétate 0,1M à pH 5,5, - leur distribution dans un récipient approprié à leur prélèvement, de type puits de plaque de microtitra ion, leur prélèvement à l'aide d'un « spotteur », - et leur dépôt sur le support semicarbazide . ; l'incubation des lames pendant une nuit à 37 °C sous atmosphère humide et leur' lavage et la saturation des sites réactifs non spécifiques .
L'invention concerne également l'utilisation des dispositifs de présentation des polypeptides comme « puces à polypeptides » en tant qu'outil de diagnostic. Cette utilisation comprend la détection des réponses de type antigêne -anti corps par l'utilisation de réactifs marqués, fluorescents, radioactifs ou marqués chimiquement, comme dans les tests de diagnostic non miniaturisés .
Les dispositifs selon l'invention peuvent également être utilisés comme puces à polypeptides pour le criblage de molécules et pour l'analyse des relations entre molécules, de type ligand- récepteur .
Les exemples qui suivent illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. Les figures suivantes y sont annexées :
Figure 1 : test comparatif de sérums sur le peptide HCVpc21-2 en ELISA (mesure de la DO) et en lames semicarbazides (mesure de la fluorescence/20000) . Figure 2 : étude de la corrélation entre les mesures de la DO et de la fluorescence, présentées dans la figure 1.
Figure 3 : test comparatif de sérums sur 3 peptides ΞCVpc21 « petit linker », « grand linker » et N-terminal (HCVpc21 3. 2 et 1) ; mesure de la fluorescence.
Figure 4 : comparaison des réponses de 30 sérums positifs avec les peptides HCVpc21, NS4 et un mélange pc2l/NS4 (1 pour 10) ; mesure de la fluorescence.
Exemple- 1 - Fonctiormalisation de lames de verre
La liaison covalente de groupements semicarbazides sur des lames de verre a été réalisée selon 2 stratégies.
Première variante
Etape A : lavage, décapage et silanisation Des lames porte-objets commerciales (Esco) prénettoyées, à bords rodés et à marge dépolie sont plongées dans une solution « piranha » (eau oxygénée/acide sulfurique, 50/50) pendant une nuit. Des rinçages préalables de trois minutes sont effectués par de l'eau desionisée (3 fois) puis par du méthanol (1 fois) , avant de plonger les lames dans un bain à 3% d' aminopropyl-triméthoxysilane dans du méthanol à 95% pendant 30 minutes aux ultrasons. Les lames sont rincées successivement par des bains de 3 minutes dans du .méthanol
(1 fois) , par de l'eau desionisée (2 fois) et .enfin par du méthanol (1 fois) . Les lames sont ensuite égouttées pendant quelques minutes, séchées 15 minutes dans une êtuve à 110°C puis stockées dans un dessiccateur sous vide. Etape B : formation d'un isocyanate
Les lames précédemment silanisées sont plongées pendant 2 heures dans une solution de 1, 2-dichloroéthane contenant du triphosgène (100 mmol/1) et de la DIEA (800 mmol/1) .
Etape C : f onctionnalisation par un semicarbazide. Ces lames sont ensuite rapidement égouttées avant d'être directement plongées dans la solution contenant le Fmoc- NH-JNH2 (préparé selon Zhang et al. Anal. Biochem. 1991, 195, 160-170) à 22 mmol/1 dans le DMF et traitées pendant 2 heures aux ultrasons .
Les lames sont ensuite rincées successivement par deux bains de 3 minutes dans du DMF.
Etape D : déprotection
Les""- lames précédemment obtenues sont plongées dans une solution de DMF contenant de la pipéridine (0,2% en volume) et du diazabicyclo-undecène (2% en volume) pendant 30 minutes . Les lames sont alors rincées successivement par des bains de 3 minutes dans du DMF (1 fois), par de l'eau desionisée (2 fois) et enfin par du méthanol (1 fois) avant d'être séchées et stockées dans un dessiccateur sous vide.
Deuxième variante
Les étapes de silanisation et de fonctionnalisation semicarbazide sont couplées en une seule réaction, par préparation préalable du réactif.
Etape A préparation du réactif Fmoc-NH-NH-CO-NH- (CH2) 3-Si (0Et)3) • La préparation du réactif est effectuée selon le schéma suivant :
1°) Préparation du réactif
Figure imgf000018_0001
515 mg de Fmoc-NHNH2 (2.03 mmoles) sont mis en suspension dans 15 ml d'éthanol absolu. Le mélange est porté au reflux
(75-80°C) . 570 ml d' isocyanopropyltriethoxysilane (2,28 mmoles, 1,2 eq) sont alors ajoutés en une fois. Après disparition de la suspension (15-20 minutes), 1 ' ethanol- est évaporé. • Le solide blanc est dissous . dans un minimum de dichloromethane sec, puis précipité grâce à du pentane sec.
Après filtration sous argon, on récupère 841 mg (83%) d'un solide pur.
Etape B .-préparation des lames Des lames porte-objets (Esco) prénettoyées, à bords rodés et à marge dépolie sont plongées pendant une nuit sous agitation dans une solution fraîchement préparée de piranha (H2SO4/H2O2) . Les lames sont ensuite rincées sous agitation dans les bains successifs suivants : eau desionisée (3 fois 3 minutes) , éthanol absolu (1 fois 3 minutes) puis séchêes à la pompe à palettes. Elles sont ensuite plongées pendant 2 heures dans une solution à lmg/ml de réactif de silanisation (Fmoc-NH-NH- CO-NH- (CH2)3-Si (OEt) 3)- dans un mélange de THF à 10% dans du toluène à 47°C et sous ultrasons. Les lames sont ensuite rincées sous agitation dans du toluène (2 fois 3 minutes) avant d'être égouttées, puis séchées 15 minutes dans une êtuve à 120°C et stockées- dans un dessiccateur sous vide.
Etape C : dêprotection
Les lames, précédemment obtenues sont plongées dans une solution de DMF pendant 3 minutes avant d'être mises sous agitation dans un bain contenant de la pipéridine (0,2% en volume) et dû diazabicyclo-undecène (2% en volume) dans du DMF pendant 30 minutes sous agitation. Les lames sont alors rincées successivement par des bains de 3 minutes dans du DMF (1 fois 3 minutes), dans de l'eau desionisée (2 fois 3 minutes) et enfin dans du méthanol (1 fois 3 minutes), avant d'être séchées et stockées dans un dessiccateur sous vide.
Exemple 2 - Contrôle de qualité des lames semicarbazide
II est important de vérifier "que la fonctionnalisation des lames est homogène et reproductible pour garantir une fixation homogène des polypeptides.
La qualité des lames est donc, contrôlée en utilisant la même réaction que celle qui sera utilisée pour fixer les polypeptides:' On utilise un petit peptide de synthèse fonctionnalisé par un groupe α-oxoaldéhyde et marqué à la rhodamine (marqueur fluorescent) , et, • comme contrôle négatif, le même peptide mais dans lequel la fonction α- oxoaldéhyde est remplacée par un groupe amide .
Le peptide rhodamine fonctionnalisé par un groupe α- oxoaldéhyde de séquence (5) -6-carboxytetraméthylrhodamine- Lys-Arg-NH- (CH2)3-NH-CO-CHO a été synthétisé à partir du linker IPT (2 , 3-O-isopropylidène-D-tartrate) , décrit par J.S. Fruchart et al. H. Gras-Masse, O. Melnyk (A new linker for the synthesis of C-terminal peptide α-oxoaldéhydes ,- Tet. Lett. ; 40 ; 6225-6228-1999) , et dans, la demande de brevet PCT/FR00/01035.
On synthétise comme peptide de contrôle : (5) -6- carboxytétraméthyl-rhodamine-Lys-Arg-NH2.
Révélation :
Les lames fonctionnalisées par un groupe semicarbazide sont trempées pendant 1 heure à 37° C dans un bain du peptide rhodamine (fonctionnalisé du coté C-terminal par un -oxoaldéhyde ou témoin - non fonctionnalisé) à une concentration de 0,1 mM dans un tampon acétate 100 mM et à pH 5,5. Les lames sont ensuite rincées par un passage dans un bain d'eau desionisée. Elle sont ensuite transvasées dans une solution de K2HP04 à 5% dans l'eau pendant 2 heures et traitées aux ultrasons . Les lames sont ensuite rincées .par des bains sous agitation d'eau desionisée (2 fois 3 minutes) puis sont trempées pendant 30 minutes aux ultrasons dans une solution de Tris-acétate (lOOmM) à pH 5,5 en présence de T een 20 (0,1 %) . Les lames sont ensuite rincées successivement par bains dans de l'eau desionisée (2 fois 3 minutes) et enfin dans du méthanol (1 fois 3 minutes) . Les lames sont ensuite séchées dans un dessiccateur sous vide. Les lames sont ensuite passées au scanner MWG (L30 PMT45) . On quantifie la fluorescence de l'ensemble de la lame en utilisant une grille de 32 lignes et 10 colonnes de spots sur le logiciel ScanAlyse. Les valeurs de fluorescence sont présentées dans le tableau suivant :
Figure imgf000021_0002
10 Exemple 3 - Synthèse de peptides tests
Les peptides . suivants ont été synthétisés (sur un synthétiseur automatique de type Pioneer PerSeptive Biosystem) .
15
1 - Peptides du virus de l'hépatite C
• Peptide HCVpc21-l fonctionnalisé par un groupe α- oxoaldéhyde du côté N-terminal :
Figure imgf000021_0001
Ce peptide est synthétisé en phase solide depuis l'extrémité C-terminale vers l'extrémité N-terminale selon une stratégie Fmoc, sur une résine F oc-PAL-PEG-PS
25 (Perseptive Biosystems) . • Peptide HCVpc21 -2 fonctionnalisé par -. un groupe 4 , 7 , 10 - trioxa- 1 , 13 -diamino-tridecanyl -a- oxoaldêhyde du. côté C- terminal , " grand linker " :
H-^NRRPQDVKFPGGGQIVGG\ αiPRRGPRLG-NH-(CH2)3-0(-(CH2)2-0)2-(CH2)3- H-C-C0
O H
Ce peptide est synthétisé' ' en phase solide depuis l'extrémité C-terminale vers l'extrémité N-terminale selon une stratégie Fmoc sur une résine « méthyl-2, 3-0- isopropylidène-D-tartryl-Val-PEGA, préparée comme décrit dans « Peptides for the new millenium », proceeding of the 16th american peptide symposium, (kluwer académie publishers, Dordrecht, .2000, pl04-106) .
0,1 mmole de résine sont conditionnés dans un réacteur de phase solide par des lavages au DCM (2 fois 2 minutes) puis au DMF (2 fois 2 minutes) . On additionne alors sur la résine presque sèche un mélange de 1,688 ml de 4,7,10
Trioxa-1, 13-tridecane-diamine (7,7 mmoles) et de DFM
(812 il) . Après 45 minutes d'agitation, la résine est lavée par deux lavages successifs au DMF. Le premier aminoacide de la séquence est couplé dans le réacteur et on additionne à la résine presque sèche 10 eq des réactifs suivants :
Fmoc-Gly-OH, HBTU, HOBt et 30 eq de DIEA dans du DMF
(2,5ml). La -solution est agitée pendant 45 minutes avant d'être lavée au DMF (4x2min) puis au DCM (4x2min) . Les aminoacides suivants sont alors greffés en transférant la résine obtenue sur un synthétiseur automatique de peptide de type Pioneer PerSeptive Biosystem.
• Peptide HCVpc21-3 fonctionnalisé par un groupe 1-3- diaminopropyl-α-oxoaldéhyde du côté C-terminal λX petit linker " :
Figure imgf000023_0001
Ce peptide est synthétisé en phase solide depuis l'extrémité C-terminale vers l'extrémité N-terminale selon une stratégie Fmoc sur une résine méthyl-2 , 3-0- isopropylidène-D-tartryl-Val-PEGA.
0,1 mmole de résine sont conditionnés dans un réacteur de phase solide par des lavages au DCM (2 fois 2 minutes) puis au DMF (2 fois 2 minutes) . On additionne alors sur la résine presque sèche un mélange de 649 μl de 1,3 diaminopropane (7,7 mmoles) et de DMF (351 μl) . Après 20 minutes d'agitation, la résine est lavée par deux lavages successifs au DMF. On additionne alors à la résine presque sèche 10 eq des réactifs suivants : Fmoc-Gly-OH, HBTU, HOBt et 30 eq de DIEA dans du DMF. La solution est agitée pendant 45 minutes avant d'être lavée au DMF (4x2min) puis au DCM (4x2min) . Les autres aminoacides sont ensuite greffés successivement.
• Dérivé du peptide NS4 fonctionnalisé par un groupe 4,7, 10-trioxa-l, 13-diamino-tridecanyl- -oxoaldéhyde du côté C-terminal :
Figure imgf000023_0002
Ce peptide est synthétisé en phase solide depuis l'extrémité C-terminale vers l'extrémité N-terminale selon une stratégie Fmoc sur une résine méthyl-2, 3-0- isopropylidène-D-tartryl-Val-PEGA. La synthèse est effectuée selon le même protocole que celle du peptide HCVpc21-2. 2 - Peptide du virus EBV
• Dérivé du peptide VCA pl8 (EBV) fonctionnalisé par un groupe 4, 7, 10-trioxa-l, 13-diamino-tridecanyl-α-oxoaldéhyde du côté C-terminal :
H-AVDTGSGGGGQPHDTAPRGARKKQ-NH-('CH2)3-0(-(CH2)2-O)2-(CH2)3-NH-C-C0
Ô H
Ce peptide est synthétisé en phase solide depuis l' extrémité ' C-terminale vers l'extrémité N-terminale selon une • stratégie Fmoc sur la résine méthyl-2, 3-0- isopropylidène-D-tartryl-Val-PEGA suivant le même protocole que pour le peptide HCVpc21-2.
Exemple 4 - Protocole d utilisation des lames semicarbazides
1 - Licration des peptides
Les peptides fonctionnalisés sont tout d'abord solubilisés (à 10"3 M ou 10"4 M) dans du tampon acétate 0 , 1M pH 5,5. Ils sont alors distribués dans les puits d'une plaque ELISA de 384 puits (Microtest TM, Becton Dickinson, NJ USA) . A l'aide d'un « Spotteur » manuel à 32 aiguilles (Microarray Printer XMM 47832-Xenopore, Hawthorne, US) , les peptides sont prélevés depuis la plaque ELISA et déposés sur une lame de verre semicarbazide. "
Les lames sont alors mises à incuber 1 nuit à 37°C sous atmosphère humide .
Ces lames sont ensuite lavées, par passage de 60 minutes sous ultrasons dans une solution de Tris-acétate (0,1M Tris (hydroxyméthyl) -aminométhane -Merck, Darmstadt, Allemagne-) . Les lames sont ensuite lavées 4 fois pendant 3 minutes en solution de PBS (Tampon phosphate 0,01M additionné à 1,8% de NaCl pH 7,4) en présence de 0,05% de Tween 20.
2 - Mise n contact des sérums-tests
Les lames sont alors incubées en présence de lOOμl de sérum de patients dilué au l/50etne dans le tampon de dilution (PBS + 2,5% de lait demi-écrémé en poudre + 0,5% de Tween 20) sous une lamelle de verre couvre-objet (24x60mm) . L' incubation -des lames- s'effectue pendant 2 heures à 37°C sous atmosphère humide. On réalise alors 4 lavages successifs pendant 3 minutes en solution de PBS additionné de 0,05% de Tween 20.
3 - Détection d'anticorps spécifiques dans les sérums par mesure de la fluorescence
La réaction des anticorps de patients, sur les polypeptides fixés sur la lame est détectée par la fixation, sur ceux- ci, d'anticorps anti-Ig humaines fluorescents.
100 μl de solution d'anticorps anti-IgG-A-M humaines marqués à la' rhodamine (TRITC) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Baltimore, US) diluée au l/l00è e dans le tampon de dilution (PBS + 2,5% de lait demi-écrémé en poudre + 0,5% de Tween 20) sont ensuite déposés sur chaque lame. On recouvre alors chaque lame par une lamelle (24x60 mm) et on la laisse incuber 1 heure à 37°C sous atmosphère humide. Une série de 4 lavages successifs en solution de PBS additionné de 0,05% de Tween 20 est réalisée. Les lames sont ensuite rincées à l'aide d'une pissette d'eau Q puis •d'éthanol 95° pendant 1 minute, puis séchées 15 minutes à 1 ' air ambiant .
La fluorescence émise est ensuite détectée à l'aide d'un scanner à lame (L35/PMT 50, Affymetrix 418 Array Scanner, M G) .
Exemple 5 - Utilisation des lames comme « puces- » à polypeptides pour la détection d anticorps présents dans des sérums
1 - Etude sur le peptide HCVpc21
Des «sérums de patients dont la sérologie est connue (c'est- à-dire vérifiée avec des tests de référence) ont été comparés en test ELISA et par les « biopuces » selon l'invention :
30' sérums positifs numérotés de PI à P30 " 10 sérums négatifs- numérotés de NI à N10 Les lames selon l'invention sont utilisées avec 16 spots du peptide HCVpc21-2 (décrit dans l'exemple 3).
Les tests ELISA sont effectués sur des plaques COSTAR carbobind, avec le même peptide HCVpc21-2.
Les résultats du test ELISA,' exprimés en densité optique, et les résultats du test « biopuces » exprimés en fluorescence/2,0000 (moyenne de la mesure de la fluorescence des 16 spots par échantillon) sont présentés sur la figure 1.
Le test biopuces s'est révélé sensible et spécifique à 100% pour cette étude sur ces sérums HCV référencés, puisqu'il a permis de détecter tous les positifs et aucun négatif. 2 - Comparaison entre la densité optique obtenue avec le test ELISA et la fluorescence des lames semicarbazides pour le peptide HCVpc21
Les résultats de l'étude précédente ont été reportés sur la figure 2 qui montre la corrélation entre fluorescence et densité optique.
On n'observe pour les sérums négatifs aucune fluorescence (fluorescence correspondant au bruit de fond), ce qui n'est pas le cas pour 1 'ELISA où les négatifs ont une valeur. Dès qu'une fluorescence est observée avec la technique biopuce on sait que c'est un positif, ce' qui n'est pas le cas en ELISA où une faible valeur de DO peut correspondre à -un négatif. Ceci implique en ELISA la définition d'une valeur seuil qui correspond à la moyenne des sérums négatifs + 3 fois leur écart type ; avec les biopuces, la valeur seuil est la moyenne du bruit de fond + 3 fois l'écart type, ce qui correspond à une valeur très faible contrairement à 1' ELISA. Par conséquent, le différentiel entre sérums négatifs et positifs est beaucoup plus important pour les biopuces que pour 1 'ELISA.
De plus il est encore possible d'augmenter le gain de sensibilité en augmentant la puissance du scanner. Ainsi on garde toujours une valeur de fluorescence correspondant au bruit de fond pour les sérums négatifs, par contre on augmente la valeur de fluorescence des spots positifs ; ceci est particulièrement intéressant dans le cas de sérums faiblement positifs que l'on détecte alors sans aucune ambiguité . 3 - Etude de reproductibilité
Le tableau suivant exprime la fluorescence moyenne' observée sur 9 lames différentes, vis à vis d'un même sérum identifié HCV positif par le test ELISA. Sur chaque lame ont été réalisés 120 spots du peptide HCVpc21-2 w grand linker " à la concentration de 10"4 M.
La moyenne de fluorescence observée sur les 9 lames est de
41095.
L'écart type sur les 9 lames est de 1891, soit un écart type de 4,5%.
Tableau I
Figure imgf000028_0001
4 - Comparaison entre les différents types de peptides HCVpc21
Cette étude a été réalisée sur 5 lames différentes (5 sérums différents, 1 sérum par lame, sérums HCV positifs par le test ELISA carbobind HCVpc21 et par le test EIA 3.0 de Abbott, actuellement sur le 'marché) .
Sur chaque lame, 8 spots par peptide HCVPc21 ont été déposés à la concentration de'lO"4 M.
3 types de peptides différents (tels que décrits dans l'exemple 3) ont été étudiés, HCVpc21-l, HCVpc21-2,
HCVpc21-3. Les résultats sont présentés sur la figure 3.
La fluorescence est plus élevée avec le peptide HCV " grand linker " . Les résultats sont comparables pour le peptide l petit linker " et HCVpc21-l. Le gain de fluorescence moyen sur les 5 lames est de 9.9% en faveur du " grand linker " par rapport au w petit linker " et est de 11.11% pour le n grand linker " par rapport au peptide HCVpc21-l (fonction COCHO sur la position N-terminale) .
5 - Etude de sérums avec les peptides HCVpc21, NS4 , et un mélancre HCVpc21/NS4
Le peptide HCVpc21 est « spotté » selon le protocole décrit dans l'exemple 4 à la concentration de 10"4 M, le peptide NS4 est spotté à 10"3 M. Pour le mélange, le peptide NS4 est à une concentration de 0,5 10"3M et le peptide HCVpc21 à une concentration de 0,5 10"4M (ratio 10/1) . Chaque peptide est spotté 16 fois par lame. Les résultats exprimés correspondent à la fluorescence moyenne des 16 spots.
Les résultats présentés sur la figure 4 concernent 30 sérums référencés HCV positifs selon le test de la société Abbott. Ces sérums ont été numérotés de PI à P30. Le test selon l'invention a permis la détection de tous les sérums positifs. 10 sérums témoins négatifs ont été testés, pour lesquels aucune fluorescence n'a été détectée (fluorescence correspondant au bruit de fond) . Le test s'est donc révélé sensible et spécifique à 100% sur les échantillons testés.
6 - Essai sur le sang total pour le virus EBV
Sur une lame de verre semicarbazide, 16 spots du peptide EBV (10"4 M) et 16 spots du peptide HCV (10~4 M) ont été réalisés.
Un échantillon de sang frais (patient négatif pour HCV et positif pour EBV) , de 100 μl prélevés au bout du doigt a été dilué dans 50 μl de tampon de dilution (tampon PBS, Tween 0,1%, lait demi-écrémé 2,5%). Ces 150 μl sont alors déposés sur la lame et mis à incuber 2 heures à 37°C sous une lamelle .
Le protocole de révélation des lames est le même que précédemment décrit.
Résultats : La fluorescence HCV est nulle, la fluorescence EBV est de 22991 (moyenne des 16 spots, écart type de 8,1% sur ces 16 spots) .
7 - Mise en évidence de la sensibilité des biopuces à polypeptides
Pour une puissance de scanner L35/PMT50, le bruit de fond après la mise en contact avec le sérum et l'anticorps fluorescent est en moyenne de 50, à savoir 0.1% du signal maximum observé (étude statistique sur 100 sérums référencés) . Ce bruit de fond est 16 fois inférieur à celui obtenu sur plaques Carbobind® avec les mêmes peptides. D'autre part, pour les sérums négatifs, aucune fluorescence n'est observée au niveau des spots de peptides, hormis celle attribuée au bruit de fond.
Exemple 6 - Utilisation d'un peptide fonctionnalisé par un groupement cétone '
Un peptide dérivé du HCVpc21 a été synthétisé en phase solide depuis l'extrémité N-terminale selon une stratégie F oc/tBu, sur une résine Fmoc-PAL-PΞG-PS . Une partie du produit (HCVpc21-Met) sera utilisé comme contrôle :
H-MTNRRPQD FPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLG-NH2 Une partie du produit a subi une transamination pour donner le dérivé suivant (HCVpc21-TA) :
Figure imgf000031_0001
Là réaction est effectuée selon le protocole suivant : Une partie du produit précédent (m=10,45 mg) est solubilisée dans 1165 μl d'eau ,- on ajoute à cette solution 1,165 ml d'une solution aqueuse à pH 5,5 contenant : acétate de sodium 2M, acide acétique 0,2M, sulfate de cuivre 2,5 mM, acide glyoxylique- 0>1M. Après 5 heures -de- réaction, on additionne 1,165 ml d'EDTA 7mM sous agitation. La solution obtenue est purifiée par HPLC préparative et les fractions correspondant au produit sont lyophilisées.
Les 2 peptides HCVpc21-Met (non transaminé) et pc21-TA (transaminé) ainsi que le peptide HCVpc21-2 (décrit dans l'exemple 3) ont été fixés sur des lames semicarbazides à raison de 16 spots de chaque peptide par lame.
Chaque peptide est déposé à la concentration de 10"4M.
Les lames sont incubées en présence de 4 sérums positifs et de 2 sérums négatifs. Les résultats présentés dans le tableau suivant montrent que
* le peptide transaminé se lie correctement à la lame semicarbazide,
* le peptide contrôle pc21-Met donne une réponse. faible correspondant à une adsorption non covalente
(non spécifique) .
Tableau II Fluorescence Moyenne + (E.T. %)
Figure imgf000032_0001
Exemple 7 - Fixation d'une protéine glycosylee sur les lames semicarbazides
A titre de modèle de fixation d'une protéine glycosylee sur les lames semicarbazides, on utilise un anticorps fluorescent, ce qui permet sa détection directe.
Un- anticorps anti-IgG-A-M rhodamine, est oxydé pour générer une fonction aldéhyde selon le mode opératoire décrit par olfe et Hage (Anal. Bioch. ; 231 ; 123-130 1995) : 440 μl d'anticorps (1,5 g/ml) , dilués dans un tampon 0,02M acétate de sodium 0,15M NaCl à pH 5,5 sont placés à 4°C pendant 15 minutes. Une solution de periodate de sodium 20mM dans le même tampon est également placée à 4°C à l'abri de la lumière. 275 μl de la solution de periodate "de sodium sont additionnés à 275 μl de la solution d'anticorps à l'abri de la lumière, sous agitation : solution A.
275 μl de la solution de tampon 0 , 1M acétate de sodium 0,15M NaCl à pH 5,5 sont additionnés à 275 μl de la solution d'anticorps à l'abri de la lumière, , sous agitation : solution B. Les deux solutions sont placées à 4°C pendant 20 minutes. On additionne alors à chacune d'elles 137 μl d'éthylène glycol (0,25 ml par millilitre d'échantillon) sous agitation. Ces deux solutions sont alors transvasées dans un tube à dialyse (Nariosep, Microconcentrators, GelmanSciences, Filtron Brand) .
L'excès de réactif est éliminé par une série de 4 centrifugations effectuées sans sécher la membrane (3 000 tours par minute, 60 minutes puis 10 000 tours par minute, 20 -minutes) en rediluant chaque fois dans la solution de tampon acétate à pH 5,5 (ajout de 200 μl de tampon) . Ces deux solutions ont été prélevées à l'aide d'un minicaps de 1 μl (Hirschmann Laborgerate) et spottées 8 fois sur une ΎA
lame de verre fonctionnalisé par des groupes semicarbazides comme écrit précédemment.
La lame est ensuite mise à incuber 6- heures à 37°C sous atmosphère humide. Elle est alors lavée par trempage dans une solution de Tris acétate 0,1 M Tween 20 0,1% pendant 60 minutes sous ultra-sons. La lame est ensuite rincée à l'eau et séchée à l'éthanol. La fluorescence est révélée au scanner à lames.
Les valeurs de fluorescence obtenues pour l'anticorps oxydé (solution A) et l'anticorps non oxydé (solution B) sont présentées dans le tableau suivant :
Figure imgf000034_0001
Exemple 8 , criblage épitopiσuβ .
Synthèse :
Une chiirάothèque de 24 décapeptides a été synthétisée en parallèle afin de couvrir 3 boucles exposées au solvant de la protéine NS3. La synthèse a été réalisée en phase solide depuis l ' extrémité C-terminale vers l ' extrémité N-terminale selon la stratégie classique Emoc/fcer- butyle et une activatiαn in situ PyBOP/DIEA sur la résine "Gly-4, 7, 10- trioxa-1, 13-dLamino-tridecanyl-méthyl-2 ' , 3 ' -O-isσpryldene-D-tartryl- Val-PBGA" , préparée coirme décrit pour le peptide HCVpc21-2.
La synthèse des 24 peptides a été effectuée sur un synthétiseur automatique multiple de 96 canaux de type ACT 496 MDS de Advanced Chemtech. Les synthèses ont été entreprises sur une échelle de 0, 02 mmole et 15 eq. d' acide activé ont été utilisés pour chaque étape de couplage (simples couplages) . Les peptidyl-résines ont été acétylées avec le mélange Ac20/DIEA/NMP (3/0, 3/86, 7) après chaque couplage. En fin de synthèse, les résines ont été transférées dans des seringues munies de frittes ( de marque ABIMED ) et déprotégées à t e mp é r a t u r e a mb i a n t e a v e c 1 ' m l d u mélange TFA/H20/éthaήedithiol (95/2,5/2,5 par vol.) pendant 2 heures. Les résines ont ensuite été lavées avec du CH2C12, du méthanol et finalement- de 1 ' é-ther éthylique et séchées . Les résines ont été conditionnées dans une solution d'acide acétique à 10% dans l'eau, puis traitées par 6 eq. de NaI04(25,7 mg) dissous dans 500 μl d'eau pendant 2 minutes. La coupure oxydante a été stoppée par ajout de 24 équivalents d ' éthanolamine (29 μl) . Après deux lavages par 1 ml d'eau, les filtrats ont été mélangés et dessalés par RP- HPLC (colonne C3-Zorbax, 0% B à 100% B, débit 5 ml. min-1, détection 230 nm) . Après- lyophilisation-, les peptides ont été analysés par RP-HPLC analytique et par spectr orné trie de masse MALDI-TOF. Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau suivant. La formule générique des peptides est indiquée dans la figure ci-dessous .
Figure imgf000035_0001
Rdt Pureté [M+HJ+ m/z observé
Peptide Séquences
% HPLC cale. Pic Principal
1 YGKAIP EAI 30 89% 1431,67 1453,64 (+Na)
2 GKAIPLEAIK 32 90% 1396,67 1418,75 (+Na)
3 KAIPLEAIKG 30 91% 1396,67 1418,77 (+Na)
4 AIPLEAIKGG 30 80% 1325,54 1347,70 (+Na)
5 IPLEAIKGGR 30 76% 1410,65 1410,99
6 PLEAIKGGRH 35 81% 1434,63 1435,98 (+H)
7 LEAIKGGRHL 31 76% 1450,68 1451,02
8 EAIKGGRHLI 34 75% 1450,68 1451,98 (+H)
9 ELAAKLSGLG 32 72% 1315,50 1337,86 (+Na)
10 LAAKLSGLGI 27 75% 1299,55 1321,91 (+Na)
11 AAKLSGLGIN 30 72% 1300,49 1322,87 (+Na)
12 AKLSGLGINA 29 72% 1300,49 1322,86 (+Na)
13 KLSGLGINAV 23 72% 1328,55 1350,87 (+Na)
14 LSGLGINAVA 29 65% 1271,45 1293,88 (+Na)
15 SGLGINAVAY 60 86% 1321,47 1343,83 (+Na)
16 GLGINAVAYY 6 15% 1397,57 1419,90 (+Na)
17 GLDVSVTPTS 29 36% 1344,50 1366,84 (+Na)
18 LDVSVIPTSG 28 78% 1344,5 1366,85 (+Na)
19 DVSVIPTSGD 26 63% 1346,43 1368,80 (+Na)
20 VSVIPTSGDV 28 60% 1330,47 1352,77 (+Na)
21 SVIPTSGDW 30 64% 1330,47 1352,67 (+Na)
22 VIPTSGDVW 26 86% 1342,53 1364,70 (+Na)
23 IPTSGDWW 21 40% 1342,53 1364,68 (+Na)
24 PTSGDWVVA 17 46% 1300,45 1322,65 (+Na)
Test sur biopuce
Ces peptides dérivés de la protéine NS3 de HCV ont été imprimés sur lame de verre semicarbazide et testés avec 4 sérums référencés NS3+ (Recombinant I-mmunoBlot Assay, DECISCAN HCV PLUS) et un sérum référencé HCV- avec le même test comme indiqué dans l'exemple 4 (Protocole' d'utilisation des lames semicarbazide) .
Cette expérience permet d'identifier, dans la collection de 24 peptides, ceux qui sont les plus intéressants pour la détection d'anticorps dirigés contre NS3.
Les résultats de -sérodétection rassemblés dans le tableau ci-dessous montrent que. les peptides 14 et 15 sont intéressants "pour la détection d'anticorps anti-NS3. , et que de manière générale, les biopuces à peptides constituent un outil intéressant pour le screening d'épitopes.
Figure imgf000037_0001
Exemple 9, - étude de relations li and-réceptβur : le ligand est un peptide biotinylé et le récepteur est la streptavidine ou un anticorps anti-biotine.
Synthèse du peptide
H-Lys (Biotine-G2 ) AYVLAG-NH (CH2 ) 30 (CH2 ) 20 (CH2 ) 20 (CH2 ) 3NHC0CH0
La synthèse a été effectuée sur résine Novasyn TGR (Novabiochem, lot A 23633, charge 0.2 mmol/g) sur une échelle de 0,1 mmole.
Cette résine a été traitée comme décrit pour le' peptide HCVpc21-2, la résine PEGA étant remplacée par la résine Novasyn TGR. Après le couplage de la Fmoc-Gly-OH, la synthèse a été poursuivie sur synthétiseur Pionneer de Perseptive 'Biosystems, en utilisant la stratégie Fmoc/tert- butyle. Les acides suivants ont été couplés successivement
(10 éq, , simple couplage, activation TBTU/HOBt/DIEA) : Fmoc-
L-Ala-OH, Fmoc-L-Leu-OH, Fmoc-L-Val-OH, Fmoc-L-Tyr (OtBu) -OH,
Fmoc-L-Ala-OH, Boc-L-Lys (Fmoc) -OH, Fmoc-Gly-OH deux fois, biotine.
La déprotection et la coupure du peptide de la résine a été effectuée avec 10 ml du mélange TFA95/H20 2 , 5/diméthylsulfure 2,5 (lh à température ambiante). Le peptide a été précipité dans 1 ' éther éthylique /pentane : 1/1 (par vol.), centrifugé,' repris dans AcOH à 30% dans l'eau et lyophilisé (.69. mg) . Le peptide. est purifié sur colonne C18 Nucléosil (A : H20 0,05% TFA, B : CH3CN/H20 : 4/1 en vol. 0,05% TFA 0-25% 20 min, 25-25% 5 min, 25-35% 40 min.). On obtient 35,72 mg de produit pur.
L'oxydation est réalisée avec 6 éq. de NaI04 et 8 éq. de méthionine à une concentration de 0,5 mM dans phosphate 100 mM pH 6,6/MeOH : 1/1 en vol pendant 15 min. La réaction est arrêtée avec 12 éq. d' éthanolamine , diluée à l'eau et purifiée sur colonne C18 Nucléosil (0-23% 20 min, 23-23% 5 min, 23-35%, 35 min) pour donner le produit attendu. Test sur biopuces
Le peptide pep-biotine est "spotté" selon le protocole décrit dans l'exemple 4 paragraphe 1 aux concentrations de 10_3M, 10_4M, 10~5M et 10~5M. Chaque concentration est spottée 6 fois par lame. Les lames sont ensuite incubées en présence de 150 μl de ligand (solution de Rhodamine Conjugated affinity Purified anti-Biotin [goat] (Rockland, Gilbertsville, PA, USA) ou solution de Streptavidin Tetramethyl Rhodamine conjugate (Molecular Probes, Oregon, USA)) dilué dans un tampon PBS 0,01 M, pH 7,2 (concentrations de ligand : 10~1mg/ml, 10-2mg/ml 10_3mg/ml, 10_4mg/ml) sous une lamelle de verre couvre-objet ( 24x60mm) . L'incubation des lames s'effectue pendant 2 heures à 37°C sous atmosphère humide. Une série de 4 lavages successifs en solution de PBS additionné de 0,05% de Tween 20 est réalisée. Les lames sont ensuite rincées à l'aide d'une pissette d'eau desionisée puis d'éthanol à 95° pendant 1 minute, puis séchées 15 minutes à l'air ambiant. La fluorescence est ensuite détectée à l'aide d'un scanner à lame (L35/PMT50, Affymetrix 418 Array Scanner, M G) . Les résultats exprimés dans le tableau suivant correspondent à la fluorescence moyenne et à l'écart type des 6 spots de chaque concentration obtenus après incubation de la streptavidine rhodaminée et de l'anticorps anti-biotine rhodamine respectivement .
type
Figure imgf000039_0001
[Ac anti-biotine rhodaminée]
10-1mg/ml 10-2mg/ml 10Jmg/m! lO^mg/ml [pep-Biotine] Moyenne Ecart type Moyenne Ecart type Moyenne Ecart type Moyenne Ecart type lO^mg/ml 15350 1172 13113 637 6828 883 2271 348 lO^mg/ml 14721 .1443 9121 1974 4981 1065 1535 51
10"smg/mi 10932 1475 6849 933 3377 292 1249 67 lO^mg/ml 6606 125 2947 825 791 87 385 39
Bruit de fond 1424 109 243 13 167 19 170 12 Etude de compétition sur la biotine montrant la spécificité de 1 ' interaction ligand récepteur :
Le peptide pep-biotine est "spotté" selon le protocole décrit dans 1 ' exemple 4 paragraphe 1 aux concentrations de 10-3 M, IO-^M, 10-5M et 10-6 . Chaque concentration est spottée 6 fois par lames .
Les lames sont ensuite incubées en présence de 150 μl d'une solution à 10-3 mg/ml de streptavidine rhodaminée (solution de streptavidin Tetramethyl Rhodamine conjugate (Molecular Probes, Oregon, USA) ) diluée dans un tampon PBS 0,01 M, pH 7,2 en présence de différentes concentrations de biotine (10-3 M, 10-4M, -10-5M, 10-7M et.0M) sous .une lamelle de verre couvre-ob et" (24x60mm) . L'incubation des lames s'effectue pendant 2 heures À 37°C sous atmosphère humide. Une série de 4 lavages successifs en solution de PBS additionné de 0,05% de Tween 20 est réalisée. Les lames sont ensuite rincées, - séchées et analysées comme indiqué -précédemment. Les résultats exprimés dans le tableau suivant correspondent à la fluorescence moyenne et à l'écart type des 6 spots de chaque concentration obtenus après incubation.
[Biotine] en compétition
0 M 10"7 M • 10^ M lO^ lO^
M ET M ET M ET M ET M ET
[pep-
Biotine]
KT3 mg/mi 29836 1515 17132 7141 ; • 16683 1615 2237 394 376 78 10"4 mg/mi 24666 , 2886 12178 4067 9414 686 961 65 207 25 •to-5 mg/ml 20902 ' 2554 6129 1701 " 3588 840 322 42 107 10 10"6 mg/ml 10737 887 26.11 441 2350 496 189 8 78 13
Bruit de fond 580 337 116 15 146 8 95 7 75 6
M : moyenne de fluorescence _
ET: écart :-type sur la fluorescence

Claims

REVENDICATIONS
1. Dispositif de présentation de polypeptides, utilisable comme « puce » pour la détection miniaturisée de molécules structurellement ou fonctionnellement complémentaires, et consistant en un, support , • plat sur lequel lesdits polypeptides sont liés de manière covalente, caractérisé en ce que la liaison entre les polypeptides et le support résulte de la formation d'un lien semicarbazone.
-2. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que le lien semicarbazone résulte de la réaction entre des polypeptides portant une fonction aldéhyde ' ou cétone - et un support fonctionnalisé par des groupements semicarbazides .
3. Dispositif selon la revendication 1 ou 2 , caractérisé en ce que le support est constitué en un matériau solide, organique ou inorganique, de type verre, silicium ou ses dérivés, polymères synthétiqu s, et présentant une surface plane.
4. Dispositif selon la revendication 2 ou 3 , caractérisé en ce que le support est fonctionnalisé de manière dense, homogène et reproductible par les groupements semicarbazides .
5. .Dispositif selon la revendication 4, caractérisé en ce que la qualité de la fonctionnalisation du support (densité et homogénéité) est contrôlée par sa capacité de fixer une sonde peptidique de synthèse, fluorescente, dérivâtisée par une fonction α-oxoaldéhyde.
6. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisé en ce que les fonctions aldéhyde ou cétone portées par les polypeptides ;sont des α-oxoaldéhyde ou - oxocétone, et sont situées du côté C-terminal ou du côté N- tërminal , ou sur une chaîne latérale .
7. Dispositif selon la revendication 6 caractérisé en ce que la fonction aldéhyde ou cétone est située sur un bras espaceur.
8. Procédé de préparation d'un dispositif selon -l'une quelconque des revendications 2 à 7 caractérisé' en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
1- introduction d'une fonction aldéhyde ou cétone, par synthèse ou par modification d'une fonction naturelle, à l'une des extrémités N ou C ou sur une chaîne latérale d'un polypeptide de synthèse ou naturel ,-
2- fonctionnalisation d'un support solide par des groupements semicarbazides ;
3- dépôt sous forme de spots d'échantillons de polypeptides obtenus par l'étape 1 sur le support fonctionnalisé de l'étape 2, dans des conditions de pH et d'humidité assurant la réaction entre la fonction aldéhyde ou cétone et la fonction semicarbazide pour créer le lien semicarbazone .
-9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'étape 1 est effectuée en cours de synthèse d'un polypeptide à l'aide d'un synthétiseur automatique.
10. Procédé selon la revendication 8 ou 9, caractérisé en ce que l'étape 1 comprend en outre l'introduction d'un bras espaceur entre le dernier acide aminé de la séquence du polypeptide et la fonction aldéhyde ou cétone.
11. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'étape 1 est effectuée par oxydation d'un polysaccharide d'une glycoprotéine naturelle ou d'un fragment- de celle-ci.
12. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'étape 1 est effectuée par transamination d'un acide aminé N-terminal d'une protéine 'naturelle, glycosylee ' ou non, ou d'un fragment de celle-ci.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 12, caractérisé en ce que l'étape 2 ' comprend une réaction de silanisation du support, introduisant une fonction aminé ; - la transformation de la fonction aminé en fonction isocyanate ; la réaction de' la fonction isocyanate avec un dérivé d'hydrazine pour former le groupement semicarbazide.
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 12, caractérisé en ce que l'étape 2 est effectuée en une seule réaction d'un silane portant un groupement semicarbazide .
15. Procédé selon la revendication 14 caractérisé en ce que le groupement semicarbazide est de préférence protégé par le Fmoc .
16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 15, caractérisé en ce que l'étape 3 comprend la préparation de solutions des polypeptides de l'étape 1 à- 10"3 ou 10"M dans un tampon acétate 0 , 1M à pH 5,5, leur distribution dans un récipient approprié à leur prélèvement, de type puits de plaque de microtitration, - leur prélèvement à l'aide d'un « spotteur », et leur dépôt sur le support semicarbazide ; l'incubation des lames pendant une nuit à 37°C sous atmosphère humide et leur lavage et là saturation des sites réactifs non spécifiques .
17. Utilisation de dispositifs selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 comme puces à polypeptides en tant qu'outil de diagnostic'
18. Utilisation de dispositifs selon la revendication 17, caractérisée en ce qu'elle comprend la détection des réponses de type antigêne-anticorps ' par l'utilisation de réactifs marqués, fluorescents, radioactifs ou marqués chimiquement, comme dans les tests de diagnostic non miniaturisés .
19. Utilisation de dispositifs selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 comme puces à polypeptides pour le criblage de molécules.
20. Utilisation de dispositifs selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 comme puces à polypeptides pour l'analyse des relations entre molécules, de type ligand - récepteu .
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