WO2002101384A2 - Verfahren und vorrichtung zur automatischen, optimierten durchführung chromatographischer analysen - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a method and a device for automatically carrying out and optimizing chromatographic examinations with the aid of an electronic data processing device, the method comprising the steps
  • the corresponding device has a chromatographic column or separation column, an inlet chamber for the mixture of substances, an eluent supply, a measuring unit at the exit of the chromatography column, and a data acquisition unit for the automatic and / or manual input of data.
  • the known systems work reliably and quickly if the analytes, that is to say the individual components of the mixture of substances, are sufficiently known. If, for example, it is important to confirm a concrete composition of a mixture of substances, such as a medicament, and / or to rule out that, for example, a certain undesired by-product, which can easily arise in the manufacturing process, is contained in the mixture, one can standardize on this Set certain chromatography conditions based on empirical values and at least partially let them run automatically. Since the components sought, as well as any undesired components, are known, the individual bands can be clearly assigned to the components on the basis of the chromatogram, which was created on the basis of corresponding empirical values.
  • Quantitative estimates based on the area under the bands are also possible are.
  • the parameters to be changed are, for example, the temperature and the composition of the eluent.
  • the eluent can be, for example, a mixture of water and a non-polar solvent, such as, for example, methanol or acetonitrile.
  • the non-polar solvent is also referred to in technical terminology as an "organic modifier".
  • the analytes accumulate on the surface of the solid phase and the flushing or pressing of the eluent through the chromatography column leads to a component being detached from the surface of the solid phase within a certain time and discharged with the eluent at the exit of the chromatography column.
  • the length of time that elapses from the start of the chromatography run until a component appears at the exit of the chromatography column is called the "retention time" of this component.
  • An essential parameter influencing the retention times in the chromatography column is the mixing ratio between water and organic modifier or, in other words, the concentration of the organic modifier in the eluent.
  • the material i.e. the surface quality and the porosity or grain size of the column material, also play an important role.
  • the mixture of substances introduced into an inlet chamber is initially largely adsorbed by the column material.
  • the eluent then detaches the individual components from the column material and gradually transports them to the exit of the chromatography column. Due to the different solubilities and interaction energies between the individual analytes and the eluent on the one hand and between the analytes and the column material on the other hand, the components dissolve at different speeds in the eluent and are therefore transported through and out of the column at different speeds. This leads to a separation of the individual components, which are transported one after the other from the exit of the column and through the measuring cuvette.
  • the solubilities are very different at a given concentration, this is at the expense of the time required for the chromatography run, since the part of the more soluble components may appear relatively quickly at the outlet of the column, while very poorly soluble components take an extremely long time. necessary until they have been released from the eluent and transported to the exit of the column.
  • the chromatogram which is, for example, nothing other than the UV absorption in the cuvette as a function of time, can be stretched very long and thus take a very long time, whereby in addition, the bands or peaks arriving very late can also be flattened to a great extent and are therefore hardly recognizable.
  • the setting of the right parameters in routine chromatography runs with which, for example, only a constant quality of a specific product is to be ensured without major difficulties
  • the setting of the parameters in the case of mixtures of substances whose composition is not or only partially known a significant problem.
  • the optimum parameters are selected on the basis of empirical values, that is to say essentially the column material, the temperature to be set and the concentration of the organic modifier.
  • the "ideal" chromatogram therefore consists of a series of closely sequential bands which have just been completely separated from one another, the first band appearing as early as possible after the start of the chromatographic run.
  • the "bands" or “peaks” can arise, for example, from UV absorption, the eluent emerging from the chromatography column, together with the material dissolved therein, being passed through a measuring cuvette which is irradiated from one side with UV light while a detector for UV light is arranged on the opposite side of the cuvette, with the aid of which the UV absorption of the components of the substance mixture which are contained in the eluent flowing through the cuvette can be detected.
  • Other detection methods for the individual, dissolved components are also conceivable, up to mass spectrometric investigations.
  • the concentration of the organic modifier is selected in many cases. varies during the chromatography run (so-called gradient chromatography). This generally begins with a low concentration of the organic modifier, which, for example, is increased continuously until the end of the chromatography run. However, it is often advisable not to leave the concentration gradient constant, but to vary it more strongly, and for example to change the concentration step by step or to change it continuously only for a limited time, and otherwise to proceed at constant concentrations.
  • the method has so far been automated in that the user of the chromatography device selects and enters a set of parameters and the chromatography device then automatically carries out the chromatography runs with the selected parameters. A lot of test runs are usually necessary here and not all selected parameters lead to meaningful results. The best results have to be found manually from the chromatograms obtained.
  • the present invention has for its object to provide a method and an apparatus for chromatography investigations, which require less human labor and can still ensure complete detection of all or as many components of the substance mixture in a comparatively short time.
  • the method according to the invention generally provides the following steps: i) collecting data comprising at least one of the following information
  • the recorded data can be taken over and / or supplemented in whole or in part from a data storage device and, in the event that data are not available for the information according to a), b) or c), at least a first test run is carried out under isocratic conditions in order to record retention times according to a), and preferably another isocratic test run with a different concentration of the organic modifier is carried out,
  • step iv) performing at least one further chromatography run with the parameters of the retention times optimized according to step iii) and comparison of the actual retention times with the theoretically calculated, optimized retention times,
  • steps i) to iv) if necessary, repeating steps i) to iv) one or more times, if the deviations of the calculated and the measured retention times exceed a predefinable limit value or if the differences of the retention times of two successive chromatography runs fall below a predefinable limit value,
  • the mixture consists of only a few components, the retention times of which are known at certain concentrations of the organic modifier, it is generally relatively easy to adjust the concentration, the course of the concentration and / or the temperature such that each of the components has a clearly different retention time so that the corresponding peaks of the chromatogram are neatly separated from one another, and at the same time the longest retention time of the components is kept as short as possible.
  • the retention times are selected in a model as functions of the adjustable variables, that is to say on the basis of a model which as at least part of the available data Contains parameters or measured values.
  • the retention times are then optimized by varying the concentration of the organic modifier and / or also the temperature in the model, it being understood that the retention times actually measured at given concentrations must be correctly reproduced in the model. This is generally done by adapting model parameters that are assumed to be constant for further optimization.
  • An artificial intelligence module ultimately decides which parameters are considered optimal and gives the appropriate instructions to a control unit.
  • the more difficult application of the method according to the invention is when only a few components of the substance mixture are known, but the majority are not known. Of these components, either specific retention times at certain concentrations of the organic modifier can be known or, alternatively or additionally, the structural formulas of components of the substance mixture.
  • a theoretical model is again used and with this theoretical model the retention times of all known components at different concentrations are calculated and the concentrations of the organic modifier are optimized as a function of time.
  • the temperature can also be used as an additional optimization parameter, in particular if, for example, two components are difficult to separate from one another at a given temperature, but at the same time their retention times show a clearly different temperature response. If no data on structural formulas or retention times are available, a test run is simply carried out under isocratic conditions, i.e. with a constant concentration of the organic modifier.
  • a second test run with a second concentration of the organic modifier is preferably carried out. At least some bands usually appear in the respective chromatogram at both concentrations.
  • the process runs completely automatically and the corresponding device is designed for such an automatic process sequence, that is to say that in addition to the basic components of a chromatography column with an inlet chamber the mixture of substances, an eluent supply and the measuring unit at the exit of the chromatography column, a data acquisition device for the automatic and / or manual entry of data, an associated optimization unit, which, based on the last recorded data of a system, optimizes parameters for a (further) chromatography run calculated and a control device and parameter sensors, which are provided to automatically set the parameters determined in the optimization unit and the parameters according to the automatically determined process flow to control.
  • the optimization unit then in turn calculates optimized parameters for the various components of the system on the basis of the recorded concentration course of the retention times, which are set in a further chromatography run.
  • the retention times actually measured are compared with the previously calculated times and the model parameters used are adjusted in such a way that the model now reproduces the retention times actually measured.
  • optimized parameters of the chromatography run (concentration curve and / or temperature) can be calculated and set again.
  • the respectively calculated, optimized parameters, the retention times calculated therefrom, and the retention times measured thereafter with the same set parameters are automatically recorded in a data acquisition device and stored in such a way that a mixture of substances clearly has the corresponding iterative sequence of chromatography runs, the set parameters and the Measurement results can be assigned.
  • the end of such a series is a chromatography run with optimized parameters, whereby the criterion for finally optimized parameters is, for example, the condition that a maximum number of bands or peaks is recorded separately and a predetermined time limit is not exceeded, the time limit also can be a time dependent on the number of peaks recorded.
  • Data storage may also be limited to the last set of optimized parameters for a given mixture of substances.
  • the condition can be selected that the changes in the retention times and / or parameters that have been obtained due to two or more iterative chromatography runs differ only slightly from one another, so that it can be expected that further iterative optimizations will only continue deliver minor improvements.
  • the essentially adjustable parameters are the concentration of the organic modifier and the temperature.
  • the calculation or optimization of the retention times for the other components takes place in the underlying model on the condition that the parameter space spanned by the components available as standards is not exceeded.
  • a parameter space contains, for example, restrictions with regard to the possible concentration of an organic modifier in that in any case the components (at least two) must be recorded within a predetermined time limit.
  • parameter conditions must be excluded in which the two known components would not be clearly separable from one another. The parameters to be set then only need to be searched in the remaining area. The same applies, of course, if more than two components are available as standards.
  • the number of peaks or bands of the chromatogram measured overall is also recorded.
  • the parameters are only changed to the extent that the number of peaks recorded does not decrease as a result. This also imposes considerable restrictions on the available parameter space and thus a significant acceleration of the optimization.
  • a so-called peak tracking strategy is preferably used, which is based on the identification of peaks in a two-dimensional tableau, in which the retention times associated with the peaks are shown as a function of the concentration of the organic modifier. It goes without saying that this does not require a concrete two-dimensional representation, but that such a tableau can also be grasped and analyzed in a purely mathematical abstract.
  • the condition is used that two peaks that were recorded with different parameters are only considered to belong to the same component if the retention time or the natural logarithm of the retention time is a function that decreases with increasing concentration of the organic modifier.
  • peaks are regarded as not being identical or not belonging to the same component if the relative deviations of the peak areas exceed a predetermined limit value for a given change in the concentration of the organic modifier.
  • two peaks can be considered identical if the spectral properties of the components producing these peaks are identical or very similar. Accordingly, two peaks are considered not to be identical or not to belong to the same component if the deviations in the spectral properties exceed a predetermined limit.
  • the method can be improved by calculating the retention times for at least one alternative stationary phase, that is to say an alternative column material, and optimizing them as a function of the variable parameters.
  • This is particularly expedient when a satisfactory result cannot be achieved for the column material initially taken into account, that is, either excessively long retention times have to be accepted or not all components of the substance mixture are recorded.
  • another eluent can also be taken into account and, if necessary, it is possible to switch to a different chromatography column with the same or a different eluent.
  • those based on the first column material and the first organic modifier or eluent can be determined.
  • Some model parameters are transferred or converted to the model parameters for the new column material and the new eluent with certain restrictions.
  • the optimization times for the second column material and / or the second eluent can likewise be shortened considerably. It is therefore expedient for such transitions to other chromatography columns or other eluents to take place initially only theoretically on the basis of the model mentioned, and a switchover is preferably only carried out if the optimizations carried out on this theoretical basis show a significant improvement compared to the chromatography columns or eluents initially used promise.
  • the parameters that is to say the concentration of the organic modifier as a function of time or the temperature, are set automatically in the various chromatography runs which may have to be carried out in the course of the optimization. A user therefore only needs to monitor the system or a corresponding chromatography system at certain time intervals, the stored data expediently being recorded in the form of logs and being displayed on a screen or also on another display medium.
  • a module of artificial intelligence is expediently used, e.g. is able to compromise between peak separation and total duration.
  • Such an artificial intelligence module can also be used for optimization.
  • a so-called Monte Carlo optimization can also be carried out, for example.
  • the coefficients a, b and c are model parameters which are to be set so that the known or measured values are correctly reproduced. Both models can of course also be combined with one another or applied independently of one another to a given system, the solvatic model of course only being applicable if individual components or their structural formulas or molecular parameters are known. The method mentioned is further improved if an artificial intelligence module is used which allows the parameters for the next experiment to be set on the basis of the results of the previous experiments.
  • An initial situation is e.g. characterized in that structural formulas are known for at least some of the components. Then retention times for a particular column type and an organic solvent can be estimated according to the solvatic model. A test run is then carried out with the conditions set accordingly.
  • FIG. 1 shows a chromatogram as determined for seven sulfonamides under isocratic conditions at a first concentration of an organic modifier.
  • Figure 2 shows the results for the same system, but with a second, lower concentration of an organic modifier.
  • only 6 peaks are clearly recognizable.
  • the double structure of the first peak in FIG. 2 and also the irregularities at the second peak in FIG. 1 indicate that at least one further analyte is hidden in the mixture of substances which has not yet been resolved in these chromatograms.
  • the solvatic retention model is used. If the structures are known, the system calculates according to known methods (1. SV Galushko, J. of Chromatography, 552 (1991), 91-102; 2. SV Galushko, AA Kamenchuk, GL Pit, J. of Chromatography A, 660 (1994) 47-59) the values for V and for ⁇ G automatically.
  • the parameters a, b and c which are determined by the solvent or the eluent and the stationary phase, are obtained by calibration with a known standard system of substance mixtures or individual components. The parameters a, b and c remain unchanged for the further calculation, so that the retention times result directly from the structural formulas. Due to the concentration dependency of parameters a, b and c, the optimal concentrations for a mixture of substances consisting of several components can now be calculated if all components are to be recorded separately within a reasonable time.
  • test run is carried out with the correspondingly calculated parameters.
  • the test results are then used to refine the model parameters and to recalculate retention times until the model matches the times measured in reality.
  • the then optimized molecular parameters V and ⁇ G as well as the set parameters for an optimal chromatography run are then saved for future use.
  • the quadratic model can be used, ie the parameter c is now also assumed to be different from 0.
  • a further optimization takes place, starting from the previously determined; optimal isocratic concentrations by determining an optimal gradient profile.
  • the system can generate corresponding gradient profiles in large numbers at random and calculate the associated chromatogram or the position of the bands of the individual components with the previously determined, optimized model parameters, with a suitable optimization criterion (e.g. the product of the distances of all neighboring peaks divided by the square of the longest retention time) and the optimal profile can then be determined using so-called "Monte Carlo methods" at random. Additional boundary conditions, such as the condition that the concentration can only be constant or increasing makes it easier to find an optimal gradient profile.
  • the time required for optimization naturally depends on the number of components or connections to be analyzed. Typically it takes 10-12 hours to optimize the conditions for a mixture of substances with five components on a conventional column. If the molecular parameters V and ⁇ G are known, the optimization can be carried out much faster.
  • the method according to the invention and the corresponding device have the particular advantage that they run automatically without external intervention by operators as soon as a few parameters have been entered and the system has been started.
  • Rinsing time for new solvent 6.0 minutes initial concentration 80% delay time 1.25 minutes.
  • the best isocratic conditions had been determined with a concentration of 8%. After that, runs were run on the entire mix. A selection criterion was a peak area of 30,000 in area units (e.g. ⁇ Vs). In 18 runs the concentration was gradually reduced from 80% to 71%, 63%, 55%, 49%, 45%, 35%, 28%, 25%, 22%, 19%, 16%, 13%, 10%, 7%, 5% and again increased to 8% and 12%. The retention times, the peak widths, the peak areas and the number of theoretical bottoms of the peaks were determined. The pair resolution and the normalized retention time were also determined from the chromatograms. It was then found that an isocratic concentration of 19% gave the best values.
  • a selection criterion was a peak area of 30,000 in area units (e.g. ⁇ Vs). In 18 runs the concentration was gradually reduced from 80% to 71%, 63%, 55%, 49%, 45%, 35%, 28%, 25%, 22%, 19%,
  • FIGS. 1 and 2 Two of the chromatograms that resulted from the abovementioned experiments are shown in FIGS. 1 and 2 already discussed, FIG. 2 showing the optimum for isocratic conditions.
  • the system modifies the test runs by setting eluent gradients. For this purpose, for example, a linear retention model is set up that takes into account the measured retention times, the peak areas and the spectral data. On this basis, multi-level gradients are searched for and used in further runs. Examples of this are shown in FIGS. 3, 4 and 5.
  • the essential criterion is the parameter of the pair resolution.
  • a parameter of the pair resolution for the critical peak pair of 3.511 and a maximum retention time of approximately 17.5 minutes are obtained.
  • a further improved pair resolution with a value of 4.506 is obtained for the gradient curve, as is finally shown in FIG. 5.
  • the maximum retention time of 19.2 minutes determined is in any case still within an acceptable range, so that the chromatography conditions (gradient curve) shown in FIG. 5 have been selected as optimal in the present example after further test runs no better pair resolution and possibly a slight reduction the maximum retention time.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur automatischen Durchführung chromatographischer Untersuchungen. Dabei werden eine oder mehrere der folgenden Informationen erfasst: (a) Retentionszeiten mindestens einer Komponente, (b) die Temperatur, (c) Struckturformeln von einer oder mehreren Komponenten, (d) die Art des Elutionsmittels und (e) Parameter der Trennsäule. Zur weitergehenden Automatisierung ist die Erfindung dadurch gekenzeichnet, dass die erfassten Daten gegebenenfalls durch vorhandene Daten ergänzt werden, dass mindestens ein erster Testlauf unter isokratischen Bedingungen erfolgt und Retentionszeiten erfasst bzw. Auf der Basis eines Modells mit Optimierungsparametern berechnet werden. Die Retentionszeiten werden durch Variation der Parameter optimiert und es erfolgt ein weiterer Chromatographielauf mit den Parametern der optimierten Retentionszeiten sowie Vergleichen mit den gemessenen Retentionszeiten. Die vorgenannten Schritte werden gegebenenfalls zur weiteren Optimierung wiederholt.

Description

Verfahren und Vorrichtung zur automatischen, optimierten Durchführung chromatographischer Analysen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur automatischen Durchführung und Optimierung chromatographischer Untersuchungen mit Hilfe einer elektronischen Datenverarbeitungseinrichtung, wobei das Verfahren die Schritte aufweist
i) Erfassen von Daten, die zumindest eine der folgenden Informationen umfassen
a) Retentionszeiten von mindestens einer Komponente des Stoffgemisches, vorzugsweise für mindestens zwei verschiedene Konzentrationen eines organischen Modifi- kators, b) die Temperatur, bei welcher die Retentionszeiten ermittelt wurden, c) Strukturformeln von Komponenten des Stoffgemisches, d) Art des Elutionsmittels und Konzentration eines organischen Modifikators hierin, e) Parameter bzw. Typ und Art der Trennsäule.
Die entsprechende Vorrichtung weist eine chromatographische Säule bzw. Trennsäule auf, eine Einlaßkammer für das Stoffgemisch, eine Eluentenzufuhr, eine Meßeinheit am Ausgang der Chromatographiesäule, sowie eine Datenerfassungseinheit für die automatische und/oder manuelle Eingabe von Daten.
Entsprechende Verfahren und Vorrichtungen sind im Stand der Technik bekannt und werden beispielsweise von der Firma Merck KGaA unter der Bezeichnung "LaChrom" angeboten und ertrieben.
Die bekannten Systeme arbeiten im Prinzip zuverlässig und schnell, wenn die Analyte, das heißt die einzelnen Komponenten des Stoffgemischs, hinreichend bekannt sind. Wenn es beispielsweise gilt, eine konkrete Zusammensetzung eines Stoffgemischs, wie z.B. eines Arzneimittels zu bestätigen und/oder auszuschließen, daß z.B. ein bestimmtes unerwünschtes Nebenprodukt, welches im Herstellungsprozeß leicht entstehen kann, in dem Gemisch enthalten ist, so kann man hierfür stan- dardmäßig auf der Basis von Erfahrungswerten bestimmte Chromatographiebedingungen einstellen und zumindest teilweise auch automatisch ablaufen lassen. Da die gesuchten Komponenten, ebenso wie etwaige unerwünschte Komponenten bekannt sind, kann man anhand des Chromato- gramms, welches auf der Basis entsprechender Erfahrungswerte erstellt wurde, die einzelnen Banden den Komponenten eindeutig zuordnen, wobei quantitative Abschätzungen aufgrund des unter den Banden gegebenen Flächeninhaltes ebenfalls möglich sind. Die zu verändernden Parameter sind dabei beispielsweise die Temperatur und die Zusammensetzung des Eluenten. Im Falle der sogenannten "Umkehrphasen-Chromatographie", die in der Praxis die größte Bedeutung hat, kann der Eluent beispielsweise eine Mischung von Wasser und einem unpolaren Lösungsmittel, wie z.B. Methanol oder Acetonitril sein. Das unpolare Lösungsmittel wird dabei in der Fachsprache auch als "organischer Modifikator" bezeichnet. Die sogenannte "stationäre Phase", das heißt das in der Chromatographiesäule enthaltene Material, ist im allgemeinen ein hochporöser Festkörper bzw. eine Schüttung aus einem Festkörpergranulat oder Partikeln, wobei die Oberfläche dieser Festphase ebenfalls unpolar und für diesen Zweck gegebenenfalls mit einem unpolaren Material beschichtet ist. Die Analyte lagern sich an der Oberfläche der festen Phase an und das Durchspülen bzw. Hindurchpressen des Eluenten durch die Chromatographiesäule führt dazu, daß innerhalb einer gewissen Zeit eine Komponente von der Oberfläche der festen Phase abgelöst und mit dem Eluenten am Ausgang der Chromatographiesäule ausgetragen wird. Die Zeitdauer, die vom Beginn des Chromatographielaufs bis zum Auftreten einer Komponente am Ausgang der Chromatographiesäule verstreicht, nennt man "Retentionszeit" dieser Komponente. Ein wesentlicher, die Retentionszeiten in der Chromatographiesäule beeinflussender Parameter, ist dabei das Mischungsverhältnis zwischen Wasser und organischem Modifikator oder anders ausgedrückt, die Konzentration des organischen Modifikators in dem Eluenten. Schließlich spielt als weiterer Parameter noch das Material, das heißt die Oberflächenbeschaffenheit, sowie die Porosität bzw. Korngröße des Säulenmaterials eine wichtige Rolle.
Das in eine Einlaßkammer eingegebene Stoffgemisch wird zunächst von dem Säulenmaterial weitgehend adsorbiert. Der Eluent löst dann je nach Wechselwirkung mit den einzelnen Komponenten und deren Wechselwirkung mit der Säule die einzelnen Komponenten von dem Säulenmaterial ab und transportiert sie allmählich zum Ausgang der Chromatographiesäule. Aufgrund der unterschiedlichen Löslichkeiten und Wechselwirkungsenergien zwischen den einzelnen Analyten und dem Eluenten einerseits und andererseits zwischen den Analyten und dem Säulenmaterial lösen sich die Komponenten unterschiedlich schnell in dem Eluenten und werden insofern auch unterschiedlich schnell durch die Säule hindurch- und heraustransportiert. Dies führt zu einer Trennung der einzel- nen Komponenten voneinander, die zeitlich nacheinander aus dem Ausgang der Säule und durch die Meßküvette hindurch transportiert werden. Wenn die Löslichkeiten bei einer gegebenen Konzentration sehr unterschiedlich sind, so geht dies zu Lasten der Zeitdauer für den Chromatographielauf, da zwar möglicherweise der Teil der besser löslichen Komponenten relativ schnell am Ausgang der Säule erscheint, während sehr schlecht lösliche Komponenten eine extrem lange Zeit be- nötigen, bis sie von dem Eluenten gelöst und zum Ausgang der Säule transportiert worden sind. In diesem Fall kann das Chromatogramm, das z.B. nichts anderes ist als die UV-Absorption in der Küvette als Funktion der Zeit, sehr langgestreckt werden und damit sehr viel Zeit benötigen, wobei außerdem die zeitlich sehr spät eintreffenden Banden bzw. Peaks auch noch stark abgeflacht sein können und damit kaum erkennbar sind.
Dem begegnet man im allgemeinen mit einer Erhöhung der Konzentration des sogenannten organi- sehen Modifikators. Durch Erhöhung der Konzentration des organischen Modifikators erhöht sich die Wahrscheinlichkeit, daß die Komponenten des Stoffgemisches von der Chromatographiesäule abgetrennt und durch den Eluenten transportiert werden. Dies kann allerdings auch dazu führen, daß verschiedene Komponenten nahezu gleichzeitig am Ausgang der Chromatographiesäule erscheinen, so daß die entsprechenden Banden nicht mehr klar voneinander trennbar sind und insbe- sondere die Fläche unter den Banden auch nicht mehr hinreichend genau erfaßt werden kann.
Während die Einstellung der richtigen Parameter bei routinemäßigen Chromatographieläufen, mit denen beispielsweise lediglich eine gleichbleibende Qualität eines konkreten Produktes sichergestellt werden soll, ohne größere Schwierigkeiten zu bewerkstelligen sind, stellt die Einstellung der Parameter im Falle von Stoffgemischen, deren Zusammensetzung nicht oder nur teilweise bekannt ist, ein erhebliches Problem dar. Bei bekannten Substanzen bzw. Routineuntersuchungen werden die optimalen Parameter aufgrund von Erfahrungswerten ausgewählt, das heißt im wesentlichen das Säulenmaterial, die einzustellende Temperatur und die Konzentration des organischen Modifikators.
Als "optimal" werden dabei Parameter angesehen, die dazu führen, daß jede Komponente des Stoffgemisches einzeln als von den durch andere Komponenten erzeugten Banden deutlich getrennte, separate Bande auf dem Chromatogramm zu erkennen ist und wobei weiterhin die für einen Chromatographielauf insgesamt benötigte Zeit möglichst kurz ist.
Das "ideale" Chromatogramm besteht demzufolge aus einer Reihe dicht aufeinanderfolgender Banden, die soeben noch vollständig voneinander getrennt sind, wobei die erste Bande möglichst früh nach dem Beginn des Chromatographielaufes erscheinen sollte. Die "Banden" oder "Peaks" können beispielsweise durch UV-Absorption entstehen, wobei der aus der Chromatographiesäule austre- tende Eluent zusammen mit dem darin gelösten Material durch eine Meßküvette geführt wird, die von einer Seite her mit UV-Licht bestrahlt wird, während auf der gegenüberliegenden Seite der Kü- vette ein Detektor für UV-Licht angeordnet ist, mit dessen Hilfe die UV-Absorption der Komponenten des Stoffgemisches erfaßt werden kann, die in dem durch die Küvette hindurchfließenden Eluenten enthalten sind. Selbstverständlich sind auch andere Nachweismethoden für die einzelnen, gelösten Komponenten denkbar, bis hin zu massenspektrometrischen Untersuchungen.
Um sowohl eine allzu lange Zeitdauer für das Chromatogramm als auch eine mangelhafte Bandentrennung zu vermeiden, wird in vielen Fällen die Konzentration des organischen Modifikators wäh- rend des Chromatographielaufes variiert (sogenannte Gradientenchromatographie). Dabei beginnt man im allgemeinen mit einer niedrigen Konzentration des organischen Modifikators, die z.B. kontinuierlich bis zum Ende des Chromatographielaufes gesteigert wird. Es ist jedoch häufig zweckmäßig, den Konzentrationsgradienten nicht konstant zu lassen, sondern stärker zu variieren, und z.B. die Konzentration stufenweise zu verändern oder auch nur zeitlich begrenzt kontinuierlich zu ändern und ansonsten bei konstanten Konzentrationen zu verfahren.
Da außerdem auch noch die Temperatur als Variationsparameter zur Verfügung steht, wird die Steuerung von Chromatographieläufen zunehmend komplizierter, je mehr Komponenten in einem Stoffgemisch enthalten sind und je weniger über das Stoffgemisch bekannt ist. Bei weitgehend unbekannten Stoffgemischen sind oftmals aufwendige und langdauernde Testläufe erforderlich, wobei der Benutzer einer solchen Chromatographieeinrichtung aufgrund von Zwischenergebnissen und aufgrund möglicherweise langjähriger Erfahrung entscheidet, welche Parameter wann verändert werden. Dies ist nicht nur ein sehr zeitaufwendiger Vorgang, der gleichzeitig sehr viel menschliche Arbeitskraft beansprucht, sondern überdies auch eine sehr fehlerträchtige Vorgehensweise, da die intuitive und auf Erfahrungen beruhende Änderung von Parametern, die häufig vorgenommen wird, um die lange Zeitdauer für einen Chromatographielauf zu begrenzen und den Vorgang zu beschleunigen, sehr oft dazu führt, daß Banden unbemerkt zusammenfallen, so daß bestimmte Komponenten überhaupt nicht identifiziert bzw. gefunden werden.
Im Stand der Technik wurde das Verfahren bisher insofern automatisiert, daß der Benutzer der Chromatographieeinrichtung einen Satz Parameter auswählt und eingibt und die Chromatographieeinrichtung dann die Chromatographieläufe mit den ausgewählten Parametern automatisch ausführt. Hierbei sind üblicherweise sehr viele Testläufe notwendig und nicht alle ausgewählten Para- meter führen zu sinnvollen Ergebnissen. Aus den erhaltenen Chromatogrammen müssen die besten Ergebnisse manuell herausgefunden werden.
Gegenüber diesem Stand der Technik liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung für Chromatographieuntersuchungen zu schaffen, welche weniger menschliche Arbeitskraft in Anspruch nehmen und dennoch in vergleichsweise kurzer Zeit eine vollständige Erfassung aller oder möglichst vieler Komponenten des Stoffgemisches gewährleisten können.
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1 und eine Vorrichtung gemäß Anspruch 16 gelöst.
Das erfindungsgemäße Verfahren sieht im allgemeinen die folgenden Schritte vor: i) Erfassen von Daten, die zumindest eine der folgenden Informationen umfassen
a) Retentionszeiten von mindestens einer Komponente des Stoffgemisches, vorzugsweise für mindestens zwei verschiedene Konzentrationen eines organischen Modifi- kators, b) die Temperatur, bei welcher die Retentionszeiten ermittelt wurden, c) Strukturformeln von einer oder mehrerer der Komponenten des Analyten, d) die Art des Elutionsmittels sowie die Konzentration eines organischen Modifikators in diesem, e) Parameter bzw. Typ der Trennsäule,
wobei die erfaßten Daten ganz oder teilweise auch aus einer Datenspeichereinrichtung übernommen und/oder ergänzt werden können und wobei für den Fall, daß Daten weder zu den Informationen gemäß a), b) oder c) verfügbar sind, mindestens ein erster Testlauf unter isokratischen Bedingungen erfolgt, um Retentionszeiten gemäß a) zu erfassen, und wobei vorzugsweise ein weiterer isokratischer Testlauf mit einer anderen Konzentration des organischen Modifikators erfolgt,
ii) Berechnen von Retentionszeiten als Funktion einstellbarer Parameter auf der Basis eines Modells, welches einen funktionellen Zusammenhang mindestens eines Teils der unter i) erfaßten Daten wiedergibt, wobei die erfaßten Daten durch Einstellung von Modellparametern reproduzierbar sind,
iii) Optimieren der Retentionszeiten in dem Modell durch Variation der Konzentration des orga- nischen Modifikators und/oder der Temperatur,
iv) Durchführen mindestens eines weiteren Chromatographielaufs mit den Parametern der gemäß Schritt iii) optimierten Retentionszeiten und Vergleichen der tatsächlichen Retentionszeiten mit den theoretisch berechneten, optimierten Retentionszeiten,
v) gegebenenfalls ein- oder mehrfaches Wiederholen der Schritte i) bis iv), falls die Abweichungen der berechneten und der gemessenen Retentionszeiten einen vorgebbaren Grenzwert überschreiten oder falls die Differenzen der Retentionszeiten zweier aufeinanderfolgender Chromatographieläufe einen vorgebbaren Grenzwert unterschreiten,
wobei mit Ausnahme einer anfänglichen Dateneingabe alle vorgenannten Schritte unter der Steuerung einer Datenverarbeitungseinrichtung mit einem Modul künstlicher Intelligenz automatisch und selbsttätig ablaufen. Es ist dem Fachmann bekannt, daß Retentionszeiten auch durch andere Parameter beeinflußt werden können, wie z.B. pH-Wert oder lonenstärke. Diese Parameter werden erfindungsgemäß zusammenfassend als Optimierungsparameter bezeichnet.
Wenn das Stoffgemisch nur aus wenigen Komponenten besteht, deren Retentionszeiten bei bestimmten Konzentrationen des organischen Modifikators bekannt sind, so ist es im allgemeinen relativ einfach, die Konzentration, den Konzentrationsverlauf und/oder die Temperatur so einzustellen, daß jede der Komponenten eine eindeutig unterschiedliche Retentionszeit hat, so daß die ent- sprechenden Peaks des Chromatogramms sauber voneinander getrennt sind, und gleichzeitig aber die längste Retentionszeit der Komponenten so kurz wie möglich gehalten wird.
Wenn allerdings die Zahl der Komponenten relativ groß wird und die Retentionszeiten unterschiedliche, teilweise deutlich ausgeprägte Konzentrations- und/oder Temperaturabhängigkeiten haben, so wird das gesamte System sehr schnell unübersichtlich und ist auch bei großer Erfahrung durch Entscheidungen des Benutzers nur mit Glück zu optimieren. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird für diesen Fall vorgeschlagen, eine Optimierung mit Hilfe mathematischer Verfahren durchzuführen, indem in einem Modell die Retentionszeiten als Funktionen der einstellbaren Variablen gewählt werden, das heißt auf der Basis eines Modells, welches mindestens einen Teil der verfügba- ren Daten als Parameter bzw. Meßwerte enthält. Durch Variation der Konzentration des organischen Modifikators und/oder auch noch der Temperatur in dem Modell werden die Retentionszeiten anschließend optimiert, wobei es sich versteht, daß die bei gegebenen Konzentrationen tatsächlich gemessenen Retentionszeiten in dem Modell richtig wiedergegeben sein müssen. Dies erfolgt im allgemeinen durch Anpassen von Modellparametern, die für die weitere Optimierung als konstant angenommen werden. Ein Modul künstlicher Intelligenz entscheidet letztlich, welche Parameter als optimal angesehen werden und gibt entsprechende Anweisungen an eine Steuereinheit.
Der schwierigere Anwendungsfall des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt vor, wenn nur wenige Komponenten des Stoffgemisches bekannt sind, die Mehrzahl jedoch nicht bekannt ist. Von diesen Komponenten können entweder konkrete Retentionszeiten bei bestimmten Konzentrationen des organischen Modifiers bekannt sein oder alternativ hierzu oder zusätzlich die Strukturformeln von Komponenten des Stoffgemisches. Auf der Basis dieser Daten wird wiederum ein theoretisches Modell zugrundegelegt und mit diesem theoretischen Modell werden die Retentionszeiten aller bekannten Komponenten bei unterschiedlichen Konzentrationen berechnet und die Konzentrationen des organischen Modifikators als Funktion der Zeit optimiert. Als zusätzlicher Optimierungsparameter kann auch die Temperatur verwendet werden, insbesondere wenn z.B. zwei Komponenten bei einer gegebenen Temperatur schlecht voneinander trennbar sind, gleichzeitig jedoch ihre Retentionszeiten einen deutlich unterschiedlichen Temperaturgang zeigen. Wenn keinerlei Daten über Strukturformeln oder Retentionszeiten verfügbar sind, so erfolgt einfach ein Testlauf bei isokratischen Bedingungen, das heißt mit einer konstanten Konzentration des organischen Modifikators.
Vorzugsweise erfolgt noch ein zweiter Testlauf mit einer zweiten Konzentration des organischen Modifikators. Üblicherweise erscheinen bei beiden Konzentrationen zumindest einige Banden in dem jeweiligen Chromatogramm. Von dem Zeitpunkt der Eingabe eines Stoffgemisches in eine entsprechende Einlaßkammer und der Eingabe der gegebenenfalls vorab verfügbaren Daten an läuft das Verfahren vollständig automatisch ab und die entsprechende Vorrichtung ist für einen solchen automatischen Verfahrensablauf ausgelegt, das heißt sie weist neben den Grundbestandteilen einer Chromatographiesäule mit Einlaßkammer für das Stoffgemisch, einer Eluentenzufuhr und der Meßeinheit am Ausgang der Chromatographiesäule noch eine Datenerfassungseinrichtung für die automatische und/oder manuelle Eingabe von Daten, eine zugeordnete Optimierungseinheit, wel- ehe auf der Basis der zuletzt erfaßten Daten eines Systems optimierte Parameter für einen (weiteren) Chromatographielauf berechnet und eine Steuereinrichtung sowie Parametersensoren auf, die dafür vorgesehen sind, die in der Optimiereinheit ermittelten Parameter automatisch einzustellen und die Parameter entsprechend dem automatisch ermittelten Verfahrensablauf zu steuern.
Wenn zwei Testläufe durchgeführt worden sind, so kann man versuchen, gemessene Banden der beiden Chromatogramme einander bzw. einer bestimmten Komponente zuzuordnen. Eine eindeutige Zuordnung erreicht man dadurch, daß Standards für jede einzelne Komponente des Stoffgemisches eingesetzt werden und die Experimente nur mit den jeweiligen Einzelstandards durchgeführt werden. Vorzugsweise werden hierfür Standards der Einzelkomponenten mit einer Reinheit > 80% eingesetzt. Das Verfahren kann weiter verbessert werden, indem intelligente Peakverfolgungsstra- tegien eingesetzt werden. Zweckmäßigerweise geht in der bevorzugten Ausführungsform ein entsprechendes Modell davon aus, daß die Retentionszeiten mit zunehmender Konzentration des organischen Modifikators abnehmen. Eine weitere Hilfe bietet die unter einer Bande des Chromatogramms vorhandene Fläche. Dies setzt selbstverständlich voraus, daß jeweils gleiche Mengen des Stoffgemisches in die Chromatographiesäule eingegeben werden oder daß zumindest die eingegebenen Mengen genau bekannt sind und das Stoffgemisch eine gleichbleibende Zusammensetzung hat. Eine Zuordnung der Peaks kann auch über spektrale Eigenschaften der Komponenten erfolgen. Durch diese Peakverfolgungsstrategien kann die Zahl der notwendigen Standards auf zwei reduziert werden und die Optimierungsexperimente erfolgen sowohl zunächst mit den Standards als auch danach mit der Stoffmischung.
Die Optimierungseinheit berechnet dann auf der Basis des erfaßten Konzentrationsganges der Retentionszeiten für die verschiedenen Komponenten des Systems wiederum optimierte Parameter, die in einem weiteren Chromatographielauf eingestellt werden. Die dabei tatsächlich gemessenen Retentionszeiten werden mit den zuvor berechneten Zeiten verglichen und die zugrunde gelegten Modellparameter werden in der Weise angepaßt, daß das Modell nunmehr die tatsächlich gemessenen Retentionszeiten wiedergibt. Auf der Basis der so angepaßten Modell-"Konstanten" können erneut optimierte Parameter des Chromatographielaufes (Konzentrationsgang und/oder Temperatur) berechnet und eingestellt werden. Die jeweils berechneten, optimierten Parameter, die daraus berechneten Retentionszeiten, sowie die daraufhin gemessenen Retentionszeiten bei denselben eingestellten Parametern werden in einer Datenerfassungseinrichtung automatisch erfaßt und in der Weise geordnet abgelegt, daß einem Stoffgemisch eindeutig die entsprechende iterative Folge von Chromatographieläufen, die eingestellten Parameter und die Meßergebnisse zugeordnet werden können. Das Ende einer solchen Serie ist ein Chromatographielauf mit optimierten Parametern, wobei als Kriterium für endgültig optimierte Parameter z.B. die Bedingung gewählt wird, daß eine maximale Anzahl von Banden bzw. Peaks getrennt erfaßt wird und dabei ein vorgegebenes Zeitlimit nicht überschritten wird, wobei das Zeitlimit auch eine von der Anzahl der erfaßten Peaks abhängi- ge Zeit sein kann. Die Datenspeicherung kann eventuell auch auf den letzten Satz von optimierten Parametern für ein gegebenes Stoffgemisch beschränkt werden.
Als weiteres Optimierungskriterium kann die Bedingung gewählt werden, daß die Änderungen in den Retentionszeiten und/oder Parametern, die man aufgrund zweier oder mehrerer iterativer Chromatographieläufe erhalten hat, nur noch geringfügig voneinander abweichen, so daß zu erwarten ist, daß auch weitere iterative Optimierungen nur noch geringfügige Verbesserungen liefern.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann mit Ausnahme einer anfänglichen Eingabe bekannter Daten, wie z.B. der bekannten Strukturformeln von Komponenten des Stoffgemisches, des Trennsäu- lentyps und etwa bereits bekannter Retentionszeiten vollständig automatisch ablaufen. Wie bereits erwähnt, sind die im wesentlichen einstellbaren Parameter dabei die Konzentration des organischen Modifikators und die Temperatur.
Soweit nur wenige Komponenten des Stoffgemisches als Standards verfügbar sind, so erfolgt in dem zugrunde liegenden Modell eine Berechnung bzw. Optimierung der Retentionszeiten für die übrigen Komponenten unter der Bedingung, daß der von den als Standards vorhandenen Komponenten aufgespannte Parameterraum nicht überschritten wird. Ein solcher Parameterraum enthält z.B. Einschränkungen hinsichtlich der möglichen Konzentration eines organischen Modifikators dadurch, daß auf jeden Fall die Komponenten (mindestens zwei) innerhalb eines vorgegebenen Zeit- limits erfaßt werden müssen. Weiterhin sind Parameterbedingungen auszuschließen, bei denen die beiden bekannten Komponenten nicht eindeutig voneinander trennbar wären. Die einzustellenden Parameter brauchen dann nur noch in dem verbleibenden Bereich gesucht zu werden. Analoges gilt selbstverständlich, wenn mehr als zwei Komponenten als Standards verfügbar sind. Bei der Durchführung der Testläufe und auch bei weiteren Chromatographieläufen im Verlaufe der Iterationen wird auch die Anzahl der insgesamt gemessenen Peaks bzw. Banden des Chromatogramms erfaßt. Ausgehend von einer dabei festgestellten Maximalzahl von Peaks werden zur Op- timierung die Parameter nur noch insoweit geändert, als dadurch die Anzahl der erfaßten Peaks nicht absinkt. Auch dies bedingt erhebliche Einschränkungen des verfügbaren Parameterraumes und damit eine deutliche Beschleunigung der Optimierung.
Zur Berechnung und Optimierung der Retentionszeiten wird bevorzugt eine sogenannte Peak- Verfolgungsstrategie verwendet, die auf der Identifikation von Peaks in einem zweidimensionalen Tableau beruht, in welchem die zu den Peaks gehörigen Retentionszeiten als Funktion der Konzentration des organischen Modifikators dargestellt sind. Es versteht sich, daß es hierfür nicht einer konkreten zweidimensionalen Darstellung bedarf, sondern daß ein solches Tableau auch rein mathematisch abstrakt erfaßt und analysiert werden kann. Dabei wird unter anderem die Bedingung genutzt, daß zwei Peaks, die bei verschiedenen Parametern erfaßt wurden, nur dann als zu derselben Komponente gehörig angesehen werden, wenn die Retentionszeit bzw. der natürliche Logarithmus der Retentionszeit eine mit zunehmender Konzentration des organischen Modifikators abnehmende Funktion ist.
Ein weiteres Kriterium für die Identität von Peaks ist die Ähnlichkeit der unter einem Peak enthaltenen Flächen. Demnach werden zwei Peaks als nicht identisch bzw. nicht zur selben Komponente gehörend angesehen, wenn die relativen Abweichungen der Peakflächen bei einer gegebenen Konzentrationsänderung des organischen Modifikators einen vorgegebenen Grenzwert überschreiten. Darüber hinaus können zwei Peaks als identisch angesehen werden, wenn die spektralen Ei- genschaften der diese Peaks erzeugenden Komponenten identisch oder sehr ähnlich sind. Demnach werden zwei Peaks als nicht identisch bzw. nicht zur selben Komponente gehörend angesehen, wenn die Abweichungen der spektralen Eigenschaften einen vorgegebenen Grenzwert überschreiten.
Das Verfahren kann verbessert werden, indem die Retentionszeiten auch für mindestens eine alternative stationäre Phase, das heißt ein alternatives Säulenmaterial berechnet und in Abhängigkeit von den variablen Parametern optimiert werden. Dies ist insbesondere dann zweckmäßig, wenn für das zunächst berücksichtigte Säulenmaterial ein zufriedenstellendes Ergebnis nicht zu erzielen ist, das heißt entweder übermäßig lange Retentionszeiten in Kauf genommen werden müssen oder aber nicht alle Komponenten des Stoffgemisches erfaßt werden. In diesem Fall kann auch ein anderer Eluent berücksichtigt werden und es kann gegebenenfalls auf eine andere Chromatographiesäule mit dem gleichen oder einem anderen Eluenten umgeschaltet werden. Dabei können die auf der Basis des ersten Säulenmaterials und des ersten organischen Modifikators bzw. Eluenten ermit- telten Modellparameter mit gewissen Einschränkungen auf die Modellparameter für das neue Säulenmaterial und den neuen Eluenten übertragen bzw. umgerechnet werden. Hierdurch kann man für das zweite Säulenmaterial und/oder den zweiten Eluenten die Optimierungszeiten ebenfalls beträchtlich verkürzen. Zweckmäßigerweise erfolgen daher solche Übergänge auf andere Chromato- graphiesäulen bzw. andere Eluenten zunächst nur theoretisch auf der Basis des angesprochenen Modells und eine Umschaltung erfolgt vorzugsweise nur dann, wenn die auf dieser theoretischen Basis erfolgten Optimierungen eine deutliche Verbesserung gegenüber den zunächst verwendeten Chromatographiesäulen bzw. Eluenten versprechen. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden bei den verschiedenen Chromatographieläufen, die gegebenenfalls im Verlaufe der Optimie- rung durchzuführen sind, die Parameter, das heißt Konzentration des organischen Modifikators als Funktion der Zeit oder die Temperatur automatisch eingestellt. Ein Benutzer braucht daher lediglich in gewissen Zeitabständen das System bzw. eine entsprechende Chromatographieanlage zu überwachen, wobei zweckmäßigerweise die gespeicherten Daten in Form von Protokollen festgehalten werden und auf einem Bildschirm oder auch einem anderen Wiedergabemedium dargestellt wer- den.
Für die Entscheidung über Chromatographieläufe und die einzustellenden Parameter wird zweckmäßigerweise ein Modul künstlicher Intelligenz verwendet, das z.B. in der Lage ist, Kompromisse zwischen der Peaktrennung und der Gesamtdauer zu schließen. Auch für die Optimierung kann ein solches Modul künstlicher Intelligenz eingesetzt werden. Bei der Suche nach optimalen Parametern kann beispielsweise auch eine sogenannte Monte-Carlo-Optimierung durchgeführt werden.
Die Berechnung der Retentionszeiten erfolgt dabei je nachdem, ob bestimmte Daten bekannt sind, nach verschiedenen Modellen. Ein Modell, welches auch als solvatisches Modell bezeichnet wird, wird dabei definiert durch die Gleichung In k' = a(V2/3) + b(ΔG) + c, wobei k' der sogenannte Kapazitätsfaktor ist, der einer um die Totzeit korrigierten Retentionszeit entspricht, V das Volumen des Moleküls einer gesuchten Komponente ist, ΔG der Wechselwirkungsenergie des Moleküls mit Wasser entspricht, und a, b und c Parameter des Sorbens/Eluens-Systems sind. Während a, b und c durch Kalibrierungen von Sorbens-/Eluens-Systemen erhalten werden, werden V und ΔG im Verlaufe des Optimierungsprozesses mit Hilfe der gemessenen Werte angepaßt. Daneben kann auch ein empirisches Modell für die Retentionszeiten verwendet werden einfach durch Anpassung mit Hilfe von Polynomen gemäß der Gleichung In k' = a + bx + ex2 + ..., wobei k' wiederum der bereits erwähnte Kapazitätsfaktor ist und x je nach Chromatographieverfahren folgendermaßen definiert ist: Umkehrphasenchromatographie x = C (C = Konzentration)
Normalphasenchromatographie x = In (C) lonenaustauschchromatographie x = In (C) pH-Wert eines Puffers x = pH
Temperatur x = 1/T
Die Koeffizienten a, b und c sind Modellparameter, die so einzustellen sind, daß die bekannten bzw. gemessenen Werte korrekt wiedergegeben werden. Beide Modelle können selbstverständlich auch miteinander kombiniert bzw. unabhängig voneinander auf ein gegebenes System angewendet werden, wobei das solvatische Modell selbstverständlich nur dann anwendbar ist, wenn einzelne Komponenten bzw. deren Strukturformeln oder Molekülparameter bekannt sind. Das erwähnte Verfahren wird weiter verbessert, wenn ein Modul künstlicher Intelligenz verwendet wird, das erlaubt, auf der Basis der Ergebnisse der vorhergehenden Experimente die Parameter für das nächste Experi- ment einzustellen.
Auch ohne weitere Ausführungen wird davon ausgegangen, daß ein Fachmann die obige Beschreibung im weitesten Umfang nutzen kann. Die bevorzugten Ausführungsformen und Beispiele sind deswegen lediglich als beschreibende, keineswegs als in irgendeiner Weise limitierende Offenba- rung aufzufassen.
Die vollständige Offenbarung aller vor- und nachstehend aufgeführten Anmeldungen, Patente und Veröffentlichungen, sowie der korrespondierenden Anmeldung DE 101 28 546.9 sind durch Bezugnahme in diese Anmeldung eingeführt.
Weitere Vorteile, Merkmale und Anwendungsmöglichkeiten der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der folgenden Darstellung eines Ausführungsbeispiels.
Grundsätzlich gibt es mehrere verschiedene Startbedingungen. Eine Ausgangssituation ist z.B. gekennzeichnet dadurch, daß zumindest von einem Teil der Komponenten Strukturformeln bekannt sind. Dann können gemäß dem solvatischen Modell Retentionszeiten für einen bestimmten Säulentyp und ein organisches Lösungsmittel abgeschätzt werden. Danach erfolgt ein Testlauf mit entsprechend eingestellten Bedingungen.
Gemäß einem anderen Szenario sind keinerlei Strukturformeln für Komponenten verfügbar und das Stoffgemisch ist im wesentlichen unbekannt. Hier kann zunächst ein Versuch mit einem typischen Säulenmaterial und einem typischen organischen Lösungsmittel erfolgen. Ist dieser Versuch nicht erfolgreich, so werden unterschiedliche Säulentypen und organische Lösungsmittel ausprobiert, zunächst unter isokratischen Bedingungen, das heißt jeweils mit einer festen Konzentration eines organischen Lösungsmittels, wobei diese Konzentration nicht zu niedrig gewählt werden sollte und wobei außerdem vorzugsweise zwei Testläufe durchgeführt werden sollten, jeweils mit einer deutlich unterschiedlichen Konzentration des organischen Modifikators.
Figur 1 zeigt beispielsweise ein Chromatogramm, wie es für sieben Sulfonamide unter isokratischen Bedingungen bei einer ersten Konzentration eines organischen Modifikators ermittelt wurde. Allerdings sind nur 6 Peaks eindeutig zu unterscheiden. Figur 2 zeigt die Ergebnisse für dasselbe System, jedoch mit einer zweiten, niedrigeren Konzentration eines organischen Modifikators. Auch hier sind nur 6 Peaks eindeutig erkennbar. Die Doppelstruktur des ersten Peaks in Figur 2 und auch die Unregelmäßigkeiten am zweiten Peak in Figur 1 deuten jedoch an, daß sich mindestens ein weiterer Analyt in dem Stoffgemisch verbirgt, der in diesen Chromatogrammen noch nicht aufgelöst wurde.
Konkret geht man, sofern Strukturformeln bekannt sind, von dem solvatischen Retentionsmodell aus. Wenn die Strukturen bekannt sind, so berechnet das System nach bekannten Verfahren (1. S.V. Galushko, J. of Chromatography, 552 (1991), 91-102; 2. S.V. Galushko, A.A. Kamenchuk, G.L. Pit, J. of Chromatography A, 660 (1994) 47-59) die Werte für V und für ΔG automatisch. Die Parameter a, b und c, die durch das Lösungsmittel bzw. den Eluenten und die stationäre Phase be- stimmt sind, erhält man durch eine Kalibrierung mit einem bekannten Standardsystem von Stoffgemischen bzw. einzelnen Komponenten. Für die weitere Berechnung bleiben dann die Parameter a, b und c unverändert, so daß sich aus den Strukturformeln unmittelbar die Retentionszeiten ergeben. Aufgrund der Konzentrationsabhängigkeit der Parameter a, b und c können nunmehr auch die optimalen Konzentrationen für ein aus mehreren Komponenten bestehendes Stoffgemisch berech- net werden, wenn alle Komponenten getrennt voneinander innerhalb angemessener Zeit erfaßt werden sollen.
Danach erfolgt mit den entsprechend berechneten Parametern ein Testlauf. Die Testergebnisse werden dann für die Verfeinerung der Modellparameter und eine erneute Berechnung von Retenti- onszeiten verwendet, bis das Modell mit den in der Realität gemessenen Zeiten übereinstimmt. Die dann optimierten Molekülparameter V und ΔG sowie die eingestellten Parameter für einen optimalen Chromatographielauf werden dann für künftige Verwendung gespeichert.
Wenn die Strukturen nicht bekannt sind, so wird das empirische Modell verwendet. Zunächst wird unter isokratischen Bedingungen ein erster Lauf durchgeführt. Dann wird ein zweiter Lauf mit einer anderen Konzentration des organischen Modifikators durchgeführt, wobei die zweite Konzentration in Abhängigkeit der Ergebnisse des ersten Laufs entweder deutlich höher oder deutlich niedriger gewählt wird. Nachdem auch der zweite Lauf durchgeführt worden ist und die Daten erfaßt sind, wird zunächst ein lineares Modell verwendet, das heißt in dem oben erwähnten Polynom In k' = a + bx + ex2 + ... werden nur die Koeffizienten a und b als von 0 verschieden angenommen.
Daraus werden erneut optimierte Bedingungen berechnet und ein weiterer Testlauf durchgeführt. Auf der Basis der dann insgesamt vorliegenden drei Meßergebnisse kann das quadratische Modell angewendet werden, das heißt auch der Parameter c wird nunmehr als von 0 verschieden angenommen. Eine weitere Optimierung erfolgt, ausgehend von den zuvor ermittelten; optimalen isokratischen Konzentrationen durch die Ermittlung eines optimalen Gradientenprofils. Das System kann entsprechende Gradientenprofile in großer Zahl nach dem Zufallsprinzip erzeugen und mit den zu- vor ermittelten, optimierten Modellparametern jeweils das zugehörige Chromatogramm bzw. die Lage der Banden der einzelnen Komponenten berechnen, wobei ein geeignetes Optimierungskriterium (z.B. das Produkt der Abstände aller benachbarten Peaks dividiert durch das Quadrat der längsten Retentionszeit) auszuwählen ist und das optimale Profil dann unter Verwendung sogenannter "Monte-Carlo-Verfahren" nach dem Zufallsprinzip ermittelt werden kann. Zusätzliche Rand- bedingungen, wie z.B. die Bedingung, daß die Konzentration nur konstant oder ansteigend sein kann, erleichtern das Auffinden eines optimalen Gradientenprofils.
Im Ergebnis erhält man im Verlaufe einer Optimierung mindestens einen Teil der folgenden Daten
1) optimale isokratische Bedingungen,
2) optimale Bedingungen mit linearem Gradienten,
3) verschiedene Gradientenprofile mit schrittweise variierendem Gradienten auf der Basis der verschiedenen Retentionsmodelle.
Es zeigt sich dabei, daß die optimalen Bedingungen sehr häufig zeitweise isokratische Bedingungen sind, wobei der Übergang von einer anfänglich niedrigen Konzentration auf eine höhere Konzentration mit einem sehr steilen Gradienten und nahezu sprunghaft erfolgt.
Die für eine Optimierung erforderliche Zeit hängt selbstverständlich von der Anzahl der zu analysie- renden Komponenten bzw. Verbindungen ab. Typischerweise benötigt man für eine Optimierung der Bedingungen für ein Stoffgemisch mit fünf Komponenten auf einer konventionellen Säule 10-12 Stunden. Wenn die Molekülparameter V und ΔG bekannt sind, kann die Optimierung noch wesentlich schneller erfolgen. Das erfindungsgemäße Verfahren und die entsprechende Vorrichtung haben vor allem den Vorteil, daß sie ohne äußere Eingriffe durch Bedienpersonen automatisch ablaufen, sobald einige wenige Parameter eingegeben wurden und das System gestartet worden ist.
Nachstehend wird noch ein Ausführungsbeispiel wiedergegeben, welches die automatisierte Optimierung einer Chromatographie von sieben Sulfonamiden unter Verwendung von nur zwei Stan- dards zeigt. Die beiden Standards waren Sulfathiazol und Sulfameracil. Als Sorbens wurde verwendet Purospher STAR RP18e, als Eluent 0,005 M Phosphatpuffer pH = 3,5.
Detektion bei 270 nm Temperatur 30°C
Fließgeschwindigkeit 1 ,0 ml/min Injektionsvolumen 10 μl Totzeit bei 0,4 Minuten
Spülzeit auf neues Lösungsmittel 6,0 Minuten Ausgangskonzentration 80% Verzögerungszeit 1 ,25 Minuten.
Mit diesen Testbedingungen wurden nacheinander für Sulfathiazol und Sulfameracil neun Testläufe durchgeführt, wobei von Lauf zu Lauf die Konzentration des Eluenten herabgesetzt wurde, ausge- hend von 80% über 60, 40, 25, 19, 13, 8, bis auf 6%, wobei ein weiterer Lauf mit 12% durchgeführt wurde. Es wurde jedesmal die Laufzeit bis zum Durchlauf eines Peaks gemessen und es wurden jeweils die Peakauflösungsfaktoren und der Faktor k'max, das heißt die maximale normierte Laufzeit (T-T0)/T0 mit T = Retentionszeit und T0 = Totzeit gemessen.
Bis herab zur Konzentration von 8% wurden jeweils beide Peaks gefunden, wobei sich der Auflösungsfaktor RS kontinuierlich verbesserte von 0,08 über 0,19, 0,82, 0,96, 1 ,62, 2,46 bis auf 3,82. Eine weitere Reduzierung der Konzentration auf 6% führte dazu, daß der Peak für Sulfathiazol nicht gefunden wurde. Eine Erhöhung der Konzentration gegenüber den vorherigen 8% führte zu einer leichten Reduzierung des Auflösungsfaktors und zu einer Erniedrigung der maximalen normierten Retentionszeit k'max.
Demnach hatte man die besten isokratischen Bedingungen mit einer Konzentration von 8% bestimmt. Danach wurden Läufe mit der gesamten Mischung durchgeführt. Ein Aussonderungskriterium war eine Peakfläche von 30000 in Flächeneinheiten (z.B. μVs). In 18 Läufen wurde die Konzen- tration schrittweise herabgesetzt von 80% über 71%, 63%, 55%, 49%, 45%, 35%, 28%, 25%, 22%, 19%, 16%, 13%, 10%, 7%, 5% und nochmals erhöht auf 8% und 12%. Dabei wurden sowohl die Retentionszeiten, die Peakbreiten, die Peakflächen und die Zahl der theoretischen Böden der Peaks ermittelt. Ebenso wurden aus den Chromatogrammen auch die Paarauflösung als auch die normierte Retentionszeit ermittelt. Danach ergab sich, daß eine isokratische Konzentration von 19% die besten Werte lieferte.
Erst danach werden z.B. lineare Retentionsmodelle aufgebaut, unter Berücksichtigung z.B. der Fläche, der Retentionszeit und spektraler Daten der Peaks. Zwischen jedem der Läufe erfolgt immer ein Auswaschen mit einer 80%-igen Konzentration für etwa 250 Sekunden.
Zwei der Chromatogramme, die sich aus den vorgenannten Versuchen ergaben, sind in den bereits diskutierten Figuren 1 und 2 dargestellt, wobei Figur 2 das Optimum für isokratische Bedingungen zeigt. Anschließend modifiziert das System die Testläufe durch Einstellen von Gradienten des Eluenten. Hierzu wird beispielsweise ein lineares Retentionsmodell aufgebaut, das die gemessenen Retentionszeiten, die Peakflächen und die Spektraldaten berücksichtigt. Auf dieser Basis werden mehrstufige Gradienten gesucht und in weiteren Läufen angewandt. Beispiele hierfür sind in den Figuren 3, 4 und 5 dargestellt.
Wesentlich ist dabei, daß die Chromatographiebedingungen so gewählt werden müssen, daß alle sieben Peaks, die in vorangehenden Versuchen gefunden wurden, auf jeden Fall erhalten bleiben, in akzeptabler Zeit erscheinen und gut voneinander trennbar und auflösbar sind. Wesentliches Kriterium ist daher neben der Anzahl der Peaks der Parameter der Paarauflösung. Für den in Figur 3 dargestellten Gradientenverlauf erhält man neben den deutlich erkennbaren sieben Peaks einen Parameter der Paarauflösung für das kritische Peakpaar von 3,511 und eine maximale Retentionszeit von etwa 17,5 Minuten. Im Falle des Gradientenverlaufs nach Figur 4 ergibt sich eine maximale Retentionszeit von knapp 19 Minuten, aber auch ein verbesserter Parameter der Paarauflösung von 4,341. Eine nochmals verbesserte Paarauflösung mit einem Wert von 4,506 erhält man für den Gradientenverlauf, wie er schließlich in Figur 5 dargestellt ist. Die dabei ermittelte maximale Retentionszeit von 19,2 Minuten liegt auf jeden Fall noch in einem akzeptablen Bereich, so daß die in Figur 5 dargestellten Chromatographiebedingungen (Gradientenverlauf) im vorliegenden Beispiel als optimal ausgewählt wurden, nachdem weitere Testläufe keine bessere Paarauflösung und allenfalls eine geringfügige Absenkung der maximalen Retentionszeit erbrachten.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Verfahren zur automatischen Durchführung chromatographischer Untersuchungen mit Hilfe einer elektronischen Datenverarbeitungseinrichtung und mit den folgenden Schritten
i) Erfassen von Daten, die zumindest eine der folgenden Informationen umfassen
a) Retentionszeiten von mindestens einer Komponente des Stoffgemisches, vorzugsweise für mindestens zwei verschiedene Konzentrationen eines organischen Modifikators, b) die Temperatur, bei welcher die Retentionszeiten ermittelt wurden, c) Strukturformeln von einer oder mehreren der Komponenten des Stoffgemisches, d) die Art des Elutionsmittels sowie die Konzentration eines organischen Modifikators in diesem, e) Parameter bzw. Typ der Trennsäule,
wobei die erfaßten Daten ganz oder teilweise auch aus einer Datenspeichereinrich- tung übernommen und/oder ergänzt werden können und wobei für den Fall, daß Daten weder zu den Informationen gemäß a), b) oder c) verfügbar sind, mindestens ein erster Testlauf unter isokratischen Bedingungen erfolgt, um Retentionszeiten gemäß a) zu erfassen, und wobei vorzugsweise ein weiterer isokratischer Testlauf mit einer anderen Konzentration des organischen Modifikators erfolgt,
ii) Berechnen von Retentionszeiten als Funktion von Optimierungsparametern auf der
Basis eines Modells, welches einen funktionellen Zusammenhang mindestens eines Teils der unter i) erfaßten Daten wiedergibt, wobei die erfaßten Daten durch Einstellung von Modellparametern reproduzierbar sind,
iii) Optimieren der Retentionszeiten in dem Modell durch Variation der Optimierungsparameter,
iv) Durchführen mindestens eines weiteren Chromatographielaufs mit den Parametern der gemäß Schritt iii) optimierten Retentionszeiten und Vergleichen der tatsächlichen
Retentionszeiten mit den theoretisch berechneten, optimierten Retentionszeiten, v) gegebenenfalls ein- oder mehrfaches Wiederholen der Schritte i) bis iv), falls die
Abweichungen der berechneten und der gemessenen Retentionszeiten einen vorgebbaren Grenzwert überschreiten oder falls die Differenzen der Retentionszeiten zweier aufeinanderfolgender Chromatographieläufe einen vorgebbaren Grenzwert unterschreiten,
wobei die Entscheidung für konkret für einen nächsten Lauf einzustellende Parameter vorzugsweise durch ein Modul künstlicher Intelligenz vorgenommen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei auf der Grundlage der manuell eingegebenen Anfangsdaten, wie z.B. der Strukturformeln von Komponenten des Stoffgemisches, des Trennsäulentyps und bereits bekannter Retentionszeiten und Parameter die Schritte i) bis v) mit Ausnahme einer anfänglichen Eingabe von Daten automatisch ablaufen.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die ermittelten optimierten
Werte, vorzugsweise einschließlich der in Zwischenstufen ermittelten Werte in einer Datenbank gespeichert werden.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß vor dem Schritt ii) die erfaßten Daten mit gespeicherten Daten verglichen werden.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Optimierungsparameter die Konzentration des organischen Modifiers, der pH-Wert und die Temperatur T verwendet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, gekennzeichnet durch den Schritt
Festlegen eines maximal verfügbaren Parameterraumes durch Testläufe mit mindestens zwei Standards durch die Bedingung, daß die Standards voneinander getrennt innerhalb ei- ner vorgebbaren Maximalzeit erfaßbar sind.
7. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei in dem Schritt iii) zusätzlich eine maximale Anzahl von Peaks als Optimierungskriterium verwendet wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß zur Berechnung und Optimierung der Retentionszeiten eine Peak-Verfolgungsstrategie verwendet wird, die auf der Identifikation von Peaks in einem zweidimensionalen Tableau beruht, in wel- chem die zu den Peaks gehörenden Retentionszeiten gegenüber den Optimierungsparametern dargestellt sind.
9. Verfahren nach Anspruch 8, daß Peaks nur dann als identisch einander zugeordnet werden, wenn für ihre Verbindungslinie in der zweidimensionalen Darstellung Retentionszeit ys Konzentration des organischen Modifikators gilt: d InT/dC < 0, wobei C die Konzentration des organischen Modifikators ist.
10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß Peaks nicht als identisch angesehen werden, wenn die relativen Abweichungen der Peakflächen einer scheinbar identischen Komponente einen vorgegebenen Grenzwert überschreiten.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß Peaks nicht als identisch angesehen werden, wenn Abweichungen von spektralen Parametern einen vorgegebenen Grenzwert überschreiten.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 , welches weiterhin den Schritt aufweist, daß die Retentionszeiten in Abhängigkeit von den variablen Parametern für mindestens eine alternative stationäre Phase (alternatives Säulenmaterial) berechnet und/oder optimiert wer- den.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß eine automatische Umschaltung auf eine andere Säule und/oder einen anderen Eluenten erfolgt, wenn das Modell vorhersagt, daß die Optimierungskriterien hierdurch besser erfüllt werden als mit dem ersten Säulenmaterial und/oder Eluenten.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß vorgegebene Daten und Parameter sowie die zugehörigen Retentionszeiten, die Peakanzahl und die Peakflächen zu allen Testläufen und optimierten Chromatographieläufen gespeichert wer- den, und zwar in Zuordnung zueinander, soweit sie dasselbe System (Stoffgemisch, Eluent,
Säule) betreffen.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß ein Vergleich der eingegebenen Daten und/oder Ergebnisse eines Laufs mit den gespeicherten Daten er- folgt, wobei im Falle einer Übereinstimmung der Daten innerhalb vorgegebener Grenzen für den nächstfolgenden Lauf die gespeicherten Daten des besten Laufs zu diesem System verwendet werden.
16. Vorrichtung für die automatische Durchführung und Optimierung chromatographischer Untersuchungen mit
a) einer Chromatographie-Trennsäule, b) einer Einlaßkammer für das Stoffgemisch, c) einer Zufuhreinrichtung für den Eluenten, d) einer Detektions- und Meßeinheit am Ausgang der Chromatographiesäule, e) einer Datenerfassungseinheit für die automatische und/oder manuelle Erfassung von Daten,
dadurch gekennzeichnet, daß
f) der Datenerfassungseinheit eine Optimierungseinheit zugeordnet ist, welche auf der Basis der zuletzt erfaßten Daten eines Systems optimierte Parameter für einen (wei- teren) Chromatographielauf berechnet und daß g) eine Steuereinrichtung und Parametersensoren vorgesehen sind, wobei die Steuerungseinrichtung mit der Optimierungseinheit in der Weise verbunden ist, daß durch die Steuerungseinrichtung die berechneten optimierten Parameter automatisch eingestellt werden und mit dieser Einstellung ein automatischer Chromatographielauf erfolgt.
17. Vorrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß für die Optimierung und/oder Entscheidung für optimierte Daten ein Modul aufweist, das nach den Prinzipien der künstlichen Intelligenz arbeitet.
18. Vorrichtung nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Suche nach optimierten Parametern eine sogenannte Monte-Carlo-Optimierung durchgeführt wird.
19. Vorrichtung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß ein Modul vorgesehen ist, das die Kriterien maximale Anzahl der Peaks, Trennung der Peaks und gesamtes Zeitlimit einer
Parameterauswahl bewertet und daraus konkrete Parameter ableitet.
20. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß Umschalteinrichtungen für den Übergang auf ein anderes Säulenmaterial und/oder einen anderen Eluenten vorgesehen sind.
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