WO2003014287A1 - Hopfenextrakte, verfahren zu ihrer herstellung und verwendung - Google Patents

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    • C12C3/08—Solvent extracts from hops
    • C12C3/10—Solvent extracts from hops using carbon dioxide

Definitions

  • the present invention relates to hop extracts, processes for their production and use of o-fenext clock cycles for the prophylaxis and therapy of disease states which are caused by a lack of estrogens or by dysregulations of the sex hormone metabolism, in particular the estrogen metabolism ,
  • hops because of its bitter and aromatic substances, it is crucial for the taste of the beer. In addition, because of their antimicrobial properties, these substances have a certain importance in the preservation of beer.
  • Xanthohumol 1 numerous other flavon-type compounds were found in the hop plant (JF Stevens et al., Phytochemistry 44, 1575-1585 (1997), JF Stevens et al., J. Chromat. A 832 (1-2), 97-107 ( 1999)). These are primarily isoprenylated flavonoids such as. B. 6- or 8-prenylnaringenin 2 and 3 and isoxanthohumol 4. Stevens et al. (Phytochemistry 53, 759-775 (2000)) also examined the chemotaxonomy of hop species and hop taxa.
  • JP 08 165238 (ref. CA 125: 158632) describes the estrogen-agonistic activity of a number of 8-prenylated flavone derivatives, including 8-prenylnaringenin.
  • hop flavonoids especially xanthohumol 1
  • xanthohumol 1 can affect cell metabolism. They are able to positively influence enzyme reactions that play an important role in the formation of tumor cells. These compounds can thus be viewed as cancer preventives (conference of the German Society for Hop Research, state of knowledge on the hop ingredient xanthohumol, March 24, 1998, Aschheim).
  • Miranda et al. Food Chem. Tox. 37 (4), 271-285 (1999) reported strong antiproliferative activity of xanthohumol 1 and isoxanthohumol 4 on human MCF-7 breast cancer cells, as well as on HAT-29 colon and A-2780 ovarian cancer cell lines ,
  • WO 83/00701 A1 claims a process for the production of estrogen-active substances from hops, characterized in that a carbon dioxide extract is first prepared from hops with the addition of water as an entrainer and then the estrogen-active substances are obtained therefrom by means of ether extraction or chromatographic processes , Furthermore, the use of these substances as an additive to animal feed, for cosmetic products or as a bath additive is claimed. No information is given about the nature of these estrogenic substances.
  • WO 01/30961 AI claims a process for obtaining stable beer brewing additives, characterized in that the hop droppings residue from the carbon dioxide extraction is extracted with a polar solvent, preferably hot water, and the extract is then acidified with a non-polar solvent , preferably hexane, washed and - if necessary after drying - used as a brewing additive. The remaining spent grain is discarded.
  • a polar solvent preferably hot water
  • the object of the present invention is to provide plant extracts which are suitable for the production of medicaments for the prophylaxis and therapy of disease states which are caused by a lack of estrogens or by dysregulations of the sex hormone metabolism, in particular the estrogen metabolism.
  • Another object of the invention is to provide a method for producing such extracts and these comprehensive pharmaceutical preparations which are suitable for the treatment of the abovementioned disease states.
  • the present invention is based, inter alia, on the surprising finding that extracts which still contain the phloroglucinol-like hop bitter acids are obtained from hop drug after removal of lipophilic and hydrophilic fiber, and at the same time free and / or bound chalcones and flavones such as xanthohumol, isoxanthohumol and 6- and 8-prenylnaringenin, however, contained in an enriched form.
  • Particularly surprising is the fact that the content of 6- and 8-prenylnaringenin depends on the temperature of the water pre-extraction (see Example 3) and can be increased up to a factor of about 2.
  • Figure 1 illustrates the dependence of the concentration of the analyzed ingredients on the temperature of the water pre-extraction.
  • Such an extract can be selected by one or more extraction with a C 5 ⁇ C 7 alkane or with supercritical C0 2 (degreasing stage), subsequent extraction of the remaining drug residue with water and subsequent extraction of the remaining drug residue with a medium polar solvent group consisting of alcohols, aqueous alcohols, ketones, aqueous ketones, esters and possibly subsequent liquid-liquid distribution.
  • a medium polar solvent group consisting of alcohols, aqueous alcohols, ketones, aqueous ketones, esters and possibly subsequent liquid-liquid distribution.
  • the hop bitter acids do not completely, but only partially, in the lipophilic extract, while on the other hand, the chalcones and flavones remain almost completely in the drug residue during water extraction. This makes it possible to obtain a hop extract that contains all the pharmacologically relevant ingredients (bitter acids, chalcones, flavones) in a balanced ratio. Due to this favorable combination of several therapeutic principles, this extract can be used ideally for disease conditions that are caused by
  • the hop extracts according to the invention are suitable for the prophylaxis and treatment of symptoms associated with the menopause or postmenopause in women, the symptoms including hot flashes, depression, anxiety, mental confusion, sleeplessness and serious health problems associated with postmenopause such as osteoporosis, cardiovascular disease. diseases, stroke, dementia and tumor diseases. Other diseases which are based on dysregulation of the sex hormone metabolism and can be treated with the extract according to the invention are, for example, amenorrhea, anovulatory cycles, menometrorrhea, premenstrual complaints and postpartum depression. Likewise, these extracts can be used to treat sex hormone-dependent diseases in men, such as benign prostatic hyperplasia or prostate cancer.
  • the surprisingly high estrogenic activity of the hop extracts according to the invention was demonstrated both in a competitive receptor binding assay for the human estrogen receptors alpha and beta and in a recombinant yeast assay compared to the activity of 17 ⁇ -estradiol.
  • conventional standard hop extracts show much weaker activity or no activity at the same dosage.
  • FIG. 2 shows the activity of a comparative extract and two hop extracts according to the invention in a yeast reporter gene assay.
  • a hop extract is provided with a content of free and / or bound chalcones and flavones, in particular 6- and 8-prenylnaringenin, xanthohumol and isoxanthohumol, which is higher than that of conventional, in particular aqueous-alcoholic extracts, and which at the same time also contains ⁇ - and possibly ⁇ -bitter acids ( Humulon or Lupulon and its derivatives) contains.
  • ⁇ - and possibly ⁇ -bitter acids Humulon or Lupulon and its derivatives
  • step (b) extracting the drug residue from step (a) one or more times with water and separating the
  • step (c) extracting the drug residue from step (b) one or more times with a solvent selected from the group consisting of alcohols, aqueous alcohols, ketones, aqueous ketones and esters and filtering the extraction solution obtained; and
  • step (d) removing the solvent from the combined extract solutions obtained in step (c) and drying the residue obtained.
  • the drug to solvent ratio ranges from about 1: 7 to about 1:12 in each extraction step.
  • the extraction with a C 5 -C 7 alkane or supercritical CO 2 in step (a) is preferably carried out once, twice or three times, in particular three times.
  • the C 5 -C alkane in step (a) is preferably a C ⁇ -C n alkane from the group consisting of n-pentane, n-hexane and n-heptane, n-heptane being very particularly preferred.
  • the extraction in step (b) is preferably carried out at a temperature between 60 and 95 ° C., preferably at 90 ° C., the extraction time being one or more hours.
  • the solvent in step (c) is preferably selected from the group consisting of ethanol, aqueous ethanol, methanol, aqueous methanol, acetone, aqueous acetone and ethyl acetate, 80 to 96% (g / g) ethanol, 74 to 99% (g /G) Methanol or 60 to 99% (g / g) acetone is preferred and 92% (g / g) ethanol is particularly preferred.
  • the hop (dry) extract according to the invention is characterized by a content of ⁇ -bitter acids of at least 0.5%, preferably at least 0.8% and in particular at least 1%, of xanthohumol of at least 2%, preferably at least 3% and in particular at least 4 % and of prenylated flavones of at least 0.5%, preferably at least 0.7%.
  • the prenylated flavones preferably include 6-prenylnaringenin, 8-prenylnaringenin and isoxanthohumol.
  • xanthohumol is not to be counted among the prenylated flavones. The percentages relate to the weight of the dry hop extract.
  • the extracts obtained can be processed together with customary pharmaceutically acceptable excipients to form pharmaceutical preparations such as capsules, film-coated tablets and coated tablets.
  • pharmaceutical preparations such as capsules, film-coated tablets and coated tablets.
  • Common fillers, binders, disintegrants, lubricants and coating agents for film-coated tablets and dragees, as well as oils and fats, are used as fillers for soft gelatin capsules as pharmaceutical auxiliaries.
  • the extracts according to the invention can be used for the prophylaxis and therapy of disease states which are caused by a lack of estrogens or by other hormonal dysregulations, such as in particular climacteric complaints, sex hormone-dependent cancers, benign prostatic hyperplasia, osteoporosis, Alzheimer's disease and cardiovascular diseases.
  • the extracts according to the invention can be used in particular for Prophylaxis and therapy for breast cancer, uterine cancer and prostate cancer can be used.
  • the dosage of the extracts according to the invention is in the range of 0.005 g to 2 g of extract 1 to 4 times a day, preferably in the range of 0.02 g to 1 g 1 to 2 times a day.
  • the dosage in individual cases depends on the clinical picture and the individual circumstances of the patient and can be adjusted by the treating specialist according to the respective needs.
  • the hop drug (“Hallertauer Magnum” variety) were mixed with 500 g of 96% (g / g) ethanol and comminuted with the Ultraturrax. It was extracted at 60 ° C for 1 h. It was then filtered through a Seitz 1500 filter. The drug was extracted another 2 times in the same way.
  • the combined extract solutions were freed from ethanol on a rotary evaporator and dried overnight in a vacuum drying cabinet at 50 ° C.
  • the content of characteristic ingredients is determined from the dry matter using the HPLC method below. This HPLC method is also used to determine the ingredients in the other examples.
  • HPLC content of hops ⁇ -bitter acids 19.8%
  • HPLC content of hops ⁇ -bitter acids 4.2%
  • HPLC content of xanthohumol 1.3%
  • Example la Preparation of a hop extract (extraction with C0 2 and then water pre-extraction at 90 ° C)
  • Example lb Preparation of a hop extract (extraction with CO 2 and then water pre-extraction at 90 ° C)
  • HPLC content of hops ß-bitter acids 0.5%
  • Example 2 Preparation of a hop extract (extraction with CO 2 and then water pre-extraction at 60 ° C)
  • a hop drug ("Hallertauer Magnum” variety) which had previously been pre-extracted with supercritical C0 2 (conditions: grinding to 10 mm grain size, extraction with C0 2 at 250 bar / 50 ° C, separation of the extract with a yield of 30%) were extracted with 964 g of water first for 5 minutes on an Ultra-Turrax, then with stirring for 1 hour at 60 ° C.
  • the water extract was then extracted via a Seitz Supra Filter 1500 filtered.
  • the still slightly moist drug residue was then extracted with 2 times 800 g of 92% (g / g) ethanol, first for 5 minutes on an Ultra-Turrax, then with stirring at 60 ° C. for 1 hour each. It was then filtered through Seitz Supra 1500 and the extract solution was freed of ethanol on a rotary evaporator at a water bath temperature of 55-65 ° C. and dried in a drying cabinet at 60 ° C.
  • Example 3 Preparation of a hop extract (extraction with n-heptane and then water at 90 ° C.)
  • hop drug Hallertauer Magnum
  • 247.6 g of hop drug (“Hallertauer Magnum” variety) were extracted with the 7-fold weight first for 5 minutes on an Ultra-Turrax, then with stirring for 1 hour with n-heptane
  • the drug residue obtained was then freed of heptane in a vacuum drying cabinet, and the dry drug residue (205 g) was then mixed with 12 times the amount by weight of water and at 90 ° C. for 1 hour held.
  • the mixture was then filtered off again and the still slightly moist drug residue was extracted twice with 10 times the amount by weight of 92% (g / g) ethanol at 60 ° C. with stirring. It was then filtered off through Seitz Supra 1500 and the extract solution was freed of ethanol on a rotary evaporator at a water bath temperature of 55-65 ° C. and dried in a drying cabinet at 60 ° C.
  • Example 4 Dependence of the content of 6 -prenyl-, 8-prenylnaringenin and isoxanthohumol on the temperature of the water extract ion
  • results shown graphically in FIG. 1 show a clear dependency of the concentration of the analyzed prenylated ingredients on the temperature of the water pre-extraction.
  • a competitive receptor binding assay was carried out to test individual extract ingredients, a comparative extract and an extract according to the invention for interactions with the human estrogen receptor alpha (ER- ⁇ ) or beta (ER- ⁇ ).
  • Radioactive labeled estradiol is first bound to the human estrogen receptor and then treated with the test substance to be examined. A proportion of labeled estradiol corresponding to the estrogenic potency of the sample is thereby displaced. Excess estradiol is washed out after the complex has bound to hydroxyapatite.
  • the estrogen receptors ER- ⁇ and ER-ß were purchased commercially as recombinant human receptors.
  • test batches each consisted of 1000 ⁇ l TEDG buffer (10 mM Tris, 1.5 raM EDTA, 10% glycerol, pH 7.5), 5 ⁇ l receptor (200 nM), 10 ⁇ l 3H estradiol and 10 ⁇ l ethanol (control value), 10 ⁇ l diethylstilestrol (100 mM, positive control) or 10 ⁇ l extract or extract ingredient.
  • the batches are mixed thoroughly and added for approx. 16 hours Incubated room temperature in the dark. After incubation
  • HAP hydroxyapatite
  • the binding capacities of the test substances are characterized by determining the ED 50 values from the dose-response curves of the estradiol displacement.
  • the extract according to the invention proved to be significantly more effective than would be expected on the basis of the activities of the individual ingredients.
  • the comparative extract showed activity on both
  • Extracts were also tested for estrogenic properties using a reporter gene assay using yeast cells (Saccharomyces).
  • yeast cells Sacharomyces
  • the cells are stably transfected with the human ⁇ -estrogen receptor and an expression plasmid which contains an estrogen response element and the gene for the enzyme ⁇ -galactosidase. All samples were dissolved in a concentration of 20 mg / ml in DMSO and undiluted or after dilution with DMSO in the ratio 1/10, 1/100 or 1/1000 in a volume of 1 ⁇ l to 100 ⁇ l culture medium in 96-well flat-bottom Given microtiter plates. Then 100 ⁇ l of yeast suspension and the chromogenic substrate chlorophenol red- ⁇ -D-galactopyranoside were added.

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Abstract

Beschrieben sind neue Hopfenextrakte mit erhöhtem Gehalt an prenylierten Chalkonen und Flavonen, Verfahren zu ihrer Herstellung, pharmazeutische Zubereitungen umfassend solche Hopfenextrakte sowie die Verwendung dieser Hopfenextrakte zur Prophylaxe und Therapie von Krankheitszuständen, die durch einen Mangel an Östrogenen oder durch Dysregulationen des Geschlechtshormonstoffwechsels hervorgerufen werden.

Description

Hopfenextrakte, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung
Die vorliegende Erfindung betrifft Hopfenextrakte, Verfahren zu ihrer—Herstellung- -und - die -Verwendung -vo - ΗOp-fenextTakten- zur Prophylaxe und Therapie von Krankheitszuständen, die durch einen Mangel an Östrogenen oder durch Dysregulationen des Geschlechtshormonstoffwechsels, insbesondere des Östrogenstoffwechseis, hervorgerufen werden.
Die größte Bedeutung des Hopfens liegt nach wie vor in seiner Verwendung bei der Bierherstellung. Aufgrund seiner Bitterund Aromastoffe ist er für den Geschmack des Bieres ausschlaggebend. Darüber hinaus haben diese Stoffe wegen ihrer antimikrobiellen Eigenschaften eine gewisse Bedeutung bei der Konservierung des Bieres.
Das zu Beginn der achtziger Jahre vorliegende wissenschaftliche Erkenntnismaterial zum Hopfen führte zu einer positiven Monographie durch die Kommission E des damaligen Bundesgesundheitsamtes (Banz. vom 5. Dezember 1985 bzw. 13. März 1990) . Damit ist die Verwendung des Hopfens bei EinschlafStörungen, Unruhe und Angstzuständen grundsätzlich zugelassen.
Der Hopfen besitzt schon seit langer Zeit eine arzneiliche Bedeutung als mildes Sedativum in der Volksmedizin. Verantwortlich für diese Wirkung sind wahrscheinlich die oxidationsempfindlichen α- und ß-Bittersäuren. Für diese Inhaltsstoffe wurden in jüngerer Zeit auch Radikalfängereigenschaften sowie die Lipidperoxidation hemmenden Eigenschaften nachgewiesen (M. Tagashira et al . , Biosci. Biotech. Biochem. 59, 740-742 (1995)). In der EP 0 677 289 A2 werden außerdem pharmazeutische Zusammensetzungen zur Behandlung der Osteoporose beschrieben, die Verbindungen aus der Gruppe der α-Bittersäuren und der α-iso-Bittersäuren enthalten.
In den letzten Jahren wurden neben den α- und ß-Bittersäuren
(J. Hδlzl, Zeitschrift für Phytotherapie 13, 155-161 (1992)) verstärkt auch die phenolischen Inhaltsstoffe des Hopfens untersucht und es wurden neben dem schon länger bekannten
Xanthohumol 1 zahlreiche weitere Verbindungen vom Flavontyp in der Hopfenpflanze gefunden (J. F. Stevens et al., Phytochemistry 44, 1575-1585 (1997), J. F. Stevens et al . , J. Chromat. A 832 (1-2), 97-107 (1999)). Es handelt sich hierbei in erster Linie um isoprenylierte Flavonoide wie z. B. 6- oder 8-Prenylnaringenin 2 und 3 sowie Isoxanthohumol 4. Stevens et al . (Phytochemistry 53, 759-775 (2000)) untersuchten auch die Chemotaxonomie von Hopfenarten und - taxa.
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Figure imgf000004_0002
Immer wieder wurde beobachtet, dass bei Hopfenpflückerinnen Menstruationsstörungen auftraten, die auf östrogene Substanzen im Hopfen zurückgeführt wurden, ohne dass diese Effekte aber eindeutig einem oder mehreren Inhaltsstoffen zugeordnet werden konnten. Inzwischen konnte diese östrogene Aktivität des Hopfens bestätigt werden. Dabei zeigte sich, dass 8-Prenylnaringenin 3 im wesentlichen für diese Wirkungen verantwortlich ist (S. R. Milligan et al . , J. Clin. Endocrinol . Metab. 84, 2249-2252 (1999)). Die in-vi tro östrogene Aktivität dieser Verbindung zeigte sich an ihrer relativen Bindungsaffinität an Östrogenrezeptoren und wurde insbesondere anhand der Stimulation der alkalischen Phosphatase in Ishikawa-Var-I-Zellen getestet. Dabei zeigte sich, dass 8-Prenylnaringenin wesentlich aktiver war als bisher bekannte Phytoostrogene wie Coumestrol, Genistein oder Daidzein, und nur wenig schwächer wirkte als 17ß-Östradiol . Milligan et al. (J.Endocrin.Metabol . 85, 4912-4915 (2000)) berichteten auch über die Bindung verschiedener phenolischer Hopfeninhaltsstoffe an einen von Hefezellen exprimierten humanen Östrogenrezeptor. Dabei zeigte wiederum 8- Prenylnaringenin die stärkste östrogene Aktivität . Schwächere östrogene Eigenschaften zeigten 6-Prenylnaringenin, 6,8- Diprenylnaringenin und 8-Geranylnaringenin. Miyamoto et al . (Planta Med. 64, 516-519 (1998)) konnten zeigen, dass 8- Prenylnaringenin das Uterusgewicht und die Knochendichte bei ovariectomierten Ratten normalisiert. Weiterhin wird in der JP 08 165238 (ref. CA 125:158632) die Östrogen-agonistische Aktivität einer Reihe von 8-prenylierten Flavonderivaten, darunter auch 8-Prenylnaringenin, beschrieben.
In neueren Studien konnte nachgewiesen werden, dass einige Flavonoide des Hopfens, insbesondere Xanthohumol 1, auf den Stoffwechsel von Zellen einwirken können. Sie sind in der Lage, Enzymreaktionen, die bei der Entstehung von Tumorzellen eine wichtige Rolle spielen, positiv zu beeinflussen. Damit können diese Verbindungen als Krebspräventiva angesehen werden (Tagung der deutschen Gesellschaft für Hopfenforschung, Stand der Erkenntnisse zum Hopfen- inhaltsstoff Xanthohumol, 24. März 1998, Aschheim). Miranda et al. (Food Chem. Tox.37(4), 271-285 (1999)) berichteten über starke antiproliferative Aktivität von Xanthohumol 1 und Isoxanthohumol 4 an humanen MCF-7 Brustkrebszellen, sowie an HAT-29 Dickdarm- und A-2780 Ovar-Krebszelllinien .
Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass Xanthohumol 1 Knochenschwund hemmend beeinflusst. Seine Verwendung als Therapeutikum gegen Osteoporose ist in der EP 0 679 393 Bl beschrieben. Obwohl die Erfinder östrogene Eigenschaften von
Xanthohumol postulieren, werden diese aber nicht demonstriert. Im Gegenteil schlössen S.R. Milligan et al .
(Pharm. Pharmacol . Lett 7, 83-86 (1997)) eindeutig aus, dass die Osteoporose-hemmende Aktivität von Xanthohumol auf einer östrogenen Wirkung beruht, da sie entsprechende Aktivitäten weder an der humanen Endometrium-Karzinomzelllinie Ishikawa noch in einem Hefe-Reportergen-Assay (S.R. Milligan et al . ,
J. Clin. Endocrinol. Metabol . 84, 2249-2252 (1999)) nachweisen konnten. Entgegen diesen Untersuchungen wird in der vorliegenden Erfindung demonstriert, dass Xanthohumol 1 und Isoxanthohumol 4 mit vergleichbarer Aktivität an die
Östrogenrezeptoren alpha und beta binden.
Kumai und Okamoto (Toxicology Letters 21, 203-207 (1984)) berichteten über hochmolekulare Kohlehydratfraktionen aus rein wässrigen Hopfenextrakten, die bei mit PMS-Gonadotropin vorbehandelten jungen Ratten das Ovargewicht verringerten. Okamoto und Kumai (Acta Endocrinologica 127, 371-377 (1992) bestätigten diese Befunde aufgrund der Beobachtung von erniedrigten 17ß-Östradiol- und LH-Blutspiegeln, verursacht durch Gabe von rein wässrigem Hopfenextrakt .
In der DE 199 39 350 AI wird ein Hopfenextrakt mit einem erhöhten Xanthohumolgehalt beschrieben. Dieser Extrakt soll Bier sowie fruchtsafthaltigen Erfrischungsgetränken zugesetzt werden. Über die Anwesenheit von prenylierten Naringeninen in diesem Extrakt ist nichts bekannt. Gemäß dem Ausführungsbeispiel wird das Xanthohumol mit 50 Gew.-% Ethanol aus dem Hopfen extrahiert. Dies führt aber nicht zu einer optimalen Extraktion des Xanthohumols, da dies erst mit hochprozentigem Ethanol (>80% Gew.) mit hoher Wiederfindung in den Extrakt übergeht . In der WO 83/00701 AI wird ein Verfahren zur Gewinnung östrogenwirksamer Stoffe aus Hopfen beansprucht, dadurch gekennzeichnet, dass zunächst ein Kohlendioxid-Extrakt aus Hopfen unter Zusatz von Wasser als Schleppmittel hergestellt wird und anschließend daraus die östrogenwirksamen Stoffe mittels Etherextraktion oder chromatographischer Verfahren erhalten werden. Ferner wird die Verwendung dieser Stoffe als Zusatz zu Futtermitteln, für kosmetische Mittel oder als Badezusatz beansprucht. Über die Natur dieser östrogenwirksamen Stoffe werden keinerlei Angaben gemacht.
In der WO 01/30961 AI wird ein Verfahren zur Gewinnung von stabilen Bierbrauzusätzen beansprucht, dadurch gekennzeichnet, dass der Hopfentreber-Rückstand der Kohlendioxid-Extraktion mit einem polaren Lösungsmittel, vorzugsweise heißem Wasser, extrahiert wird, der Extrakt anschließend angesäuert, mit einem unpolaren Lösungsmittel, vorzugsweise Hexan, gewaschen und - ggf. nach Trocknung - als Brauzusatz verwendet wird. Der übrigbleibende Treber wird verworfen .
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Pflanzenextrakte bereitzustellen, die zur Herstellung von Arzneimitteln zur Prophylaxe und Therapie von Krankheitszuständen geeignet sind, die durch einen Mangel an Östrogenen oder durch Dysregulationen des Geschlechts- hormonstoffwechseis, insbesondere des Östrogenstoffwechseis, verursacht werden.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung solcher Extrakte sowie diese umfassende pharmazeutische Zubereitungen, die zur Behandlung der vorstehend genannten Krankheitszustände geeignet sind.
Diese Aufgaben werden erfindungsgemäß durch den Hopfenextrakt gemäß Patentanspruch 1 und 2, die Verfahren gemäß den Patentansprüchen 3-12, die pharmazeutische Zubereitung gemäß Patentanspruch 13 sowie die Verwendung der Extrakte oder der pharmazeutischen Zubereitung gemäß den Patentansprüchen 14-16 gelöst.
Die vorliegende Erfindung beruht unter anderem auf dem überraschenden Befund, dass aus Hopfendroge nach Entfernung von lipophilen und hydrophilen Ballaststoffen Extrakte erhalten werden, welche die phloroglucinolartigen Hopfenbittersäuren nach wie vor enthalten, gleichzeitig freie und/oder gebundene Chalkone und Flavone wie Xanthohumol, Isoxanthohumol sowie 6- und 8-Prenylnaringenin dagegen in angereicherter Form enthalten. Insbesondere überraschend ist die Tatsache, dass der Gehalt an 6- und 8-Prenylnaringenin von der Temperatur der Wasservorextraktion abhängt (s. Beispiel 3) und bis zu ca. einem Faktor 2 gesteigert werden kann.
Figur 1 veranschaulicht die Abhängigkeit der Konzentration der analysierten Inhaltsstoffe von der Temperatur der Wasservorextraktion.
Ein solcher Extrakt kann durch ein- bis mehrmalige Extraktion mit einem C5~C7-Alkan oder mit überkritischem C02 (Entfettungsstufe) , nachfolgende Extraktion des verbleibenden Drogenrückstandes mit Wasser und daran anschließende Extraktion des übrig bleibenden Drogenrückstandes mit einem mittelpolaren Lösungsmittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Alkoholen, wässrigen Alkoholen, Ketonen, wässrigen Ketonen, Estern und ggf. nachfolgende Flüssig- Flüssig-Verteilung erhalten werden. Überraschenderweise gehen die Hopfenbittersäuren nicht vollständig, sondern nur zu einem Teil in den lipophilen Extrakt über, während auf der anderen Seite die Chalkone und Flavone bei der Wasserextraktion nahezu vollständig im Drogenrückstand verbleiben. Dadurch ist es möglich, einen Hopfenextrakt zu erhalten, der alle pharmakologisch relevanten Inhaltsstoffe (Bittersäuren, Chalkone, Flavone) in einem ausgeglichenen Verhältnis enthält . Durch diese günstige Zusammensetzung aus mehreren therapeutischen Wirkprinzipien ist dieser Extrakt in idealer Weise bei Krankheitszuständen einsetzbar, die durch einen Mangel an Östrogenen oder durch andere hormoneile Dysregulationen verursacht werden.
Die erfindungsgemäßen Hopfenextrakte sind zur Prophylaxe und Behandlung von mit dem Klimakterium oder der Postmenopause bei Frauen einhergehenden Beschwerden geeignet, wobei die Symptome unter anderem Hitzewallungen, Depressionen, Angstzustände, geistige Verwirrtheit, Schlaflosigkeit sowie mit der Postmenopause zusammenhängende ernsthafte Gesundheitsprobleme wie Osteoporose, Herz-Kreislauf- erkrankungen, Schlaganfall, Demenz und Tumorerkrankungen umfassen. Andere Erkrankungen, die auf einer Dysregulation des Geschlechtshormonstoffwechsels beruhen und mit dem erfindungsgemäßen Extrakt behandelt werden können, sind z.B. Amenorrhoe, anovulatorische Zyklen, Menometrorragie, premenstruelle Beschwerden und postpartale Depressionen. Desgleichen können diese Extrakte zur Behandlung Geschlechtshormon-abhängiger Krankheiten beim Mann verwendet werden, wie z.B. der benignen Prostatahyperplasie oder dem Prostatakarzinom. Die überraschend hohe östrogene Aktivität der erfindungsgemäßen Hopfenextrakte wurde sowohl mit einem kompetetiven Rezeptorbindungsassay für die humanen Östrogenrezeptoren alpha und beta als auch in einem rekombinanten Hefe-Assay im Vergleich zur Aktivität von 17ß- Östradiol nachgewiesen. Im Gegensatz dazu zeigen herkömmliche Standard-Hopfenextrakte bei gleicher Dosierung wesentlich schwächere oder keinerlei Aktivität .
Figur 2 zeigt die Aktivität eines Vergleichsextraktes und zweier erfindungsgemäßer Hopfenextrakte in einem Hefe- Reportergenassay.
Erfindungsgemäß wird ein Hopfenextrakt mit einem gegenüber herkömmlichen, insbesondere wässrig-alkoholischen Extrakten erhöhtem Gehalt an freien und/oder gebundenen Chalkonen und Flavonen, insbesondere 6- und 8-Prenylnaringenin, Xanthohumol und Isoxanthohumol bereitgestellt, der gleichzeitig noch α- und eventuell ß-Bittersäuren (Humulon bzw. Lupulon und dessen Derivate) enthält.
Weiter wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Herstellung dieser Hopfenextrakte bereitgestellt, umfassend die Schritte:
(a) ein- oder mehrmaliges Extrahieren einer Hopfendroge mit einem C5-C7-Alkan oder überkritischem C02 und Abtrennen des Drogenrückstandes von der Extrakt ionslösung ;
(b) ein- oder mehrmaliges Extrahieren des Drogenrückstandes aus Schritt ( a) mit Wasser und Abtrennen des
Drogenrückstandes ; (c) ein- oder mehrmaliges Extrahieren des Drogenrückstandes aus Schritt (b) mit einem Lösungsmittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Alkoholen, wässrigen Alkoholen, Ketonen, wässrigen Ketonen und Estern sowie Filtrieren der erhaltenen Extraktionslδsung; und
(d) Entfernen des Lösungsmittels aus den in Schritt (c) erhaltenen vereinigten Extraktlösungen und Trocknen des erhaltenen Rückstands .
Das Verhältnis Droge zu Lösungsmittel liegt bei jedem Extraktionsschritt im Bereich von etwa 1 : 7 bis etwa 1 : 12.
Die Extraktion mit einem C5-C7-Alkan oder überkritischem C02 in Schritt (a) wird vorzugsweise ein-, zwei- oder dreimal, insbesondere dreimal, durchgeführt.
Die Extraktion mit überkritischem C02 ist besonders bevorzugt .
Das C5-C -Alkan in Schritt (a) ist vorzugsweise ein CΞ-C -n- Alkan aus der Gruppe bestehend aus n-Pentan, n-Hexan und n- Heptan, wobei n-Heptan ganz besonders bevorzugt ist.
Die Extraktion in Schritt (b) wird vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen 60 und 95 °C, vorzugsweise bei 90 °C, durchgeführt wobei die Extraktionsdauer eine oder mehrere Stunden betragen kann.
Das Lösungsmittel in Schritt (c) ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ethanol, wässrigem Ethanol, Methanol, wässrigem Methanol, Aceton, wässrigem Aceton und Ethylacetat, wobei 80 bis 96% (g/g) Ethanol, 74 bis 99% (g/g) Methanol bzw. 60 bis 99% (g/g) Aceton bevorzugt ist und 92% (g/g) Ethanol besonders bevorzugt ist.
Der erfindungsgemäße Hopfen (trocken) extrakt ist gekennzeichnet durch einen Gehalt an α-Bittersäuren von mindestens 0,5%, vorzugsweise mindestens 0,8% und insbesondere mindestens 1%, an Xanthohumol von mindestens 2%, vorzugsweise mindestens 3% und insbesondere mindestens 4% und an prenylierten Flavonen von mindestens 0,5%, vorzugsweise mindestens 0,7%. Die prenylierten Flavone umfassen vorzugsweise 6-Prenylnaringenin, 8-Prenylnaringenin und Isoxanthohumol. Xanthohumol ist im Sinne der vorliegenden Erfindung nicht zu den prenylierten Flavonen zu zählen. Die Prozentangaben beziehen sich auf das Gewicht des Hopfentrockenextraktes .
Die erhaltenen Extrakte können zusammen mit üblichen pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoffen zu pharmazeutischen Zubereitungen wie Kapseln, Filmtabletten und Dragees verarbeitet werden. Als pharmazeutische Hilfsstoffe werden übliche Füll, Binde-, Spreng-, Schmier- und Überzugsmittel für Filmtabletten und Dragees sowie Öle und Fette als Füllmassen für Weichgelatinekapseln verwendet.
Die erfindungsgemäßen Extrakte können zur Prophylaxe und Therapie von Krankheitszuständen verwendet werden, die durch einen Mangel an Östrogenen oder durch andere hormoneile Dysregulationen verursacht werden, wie insbesondere klimakterische Beschwerden, geschlechtshormonabhängige Krebserkrankungen, benigne Prostatahyperplasie, Osteoporose, Alzheimerische Krankheit und Herz-Kreislauferkrankungen. Im Falle der geschlechtshormonabhängigen Krebserkrankungen können die erfindungsgemäßen Extrakte insbesondere zur Prophylaxe und Therapie von Brustkrebs, Gebärmutterkrebs und Prostatakrebs verwendet werden.
Die Dosierung der erfindungsgemäßen Extrakte liegt im Bereich von 0.005 g bis 2 g Extrakt 1 bis 4 mal täglich, vorzugsweise im Bereich von 0.02 g bis 1 g 1 bis 2 mal täglich. Die Dosierung im Einzelfalle ist abhängig vom Krankheitsbild und den individuellen Umständen des Patienten und kann von dem behandelnden Fachmann entsprechend den jeweiligen Bedürfnissen angepasst werden.
Die nachstehend angegebenen Beispiele erläutern die Erfindung und sind nicht beschränkend aufzufassen. Alle Prozentangaben beziehen sich auf das Gewicht, falls nichts anders angegeben ist.
Vergleichsbeispiel : Herstellung eines 96% (g/g)
Ethanolextraktes ohne vorherige Entfettung
50 g der Hopfendroge (Sorte "Hallertauer Magnum") wurden mit 500 g 96% (g/g) Ethanol versetzt und mit dem Ultraturrax zerkleinert. Es wurde 1 h bei 60°C extrahiert. Anschließend wurde über einen Seitz 1500 Filter filtriert. Die Droge wurde noch weitere 2 Male auf dieselbe Weise extrahiert. Die vereinigten Extraktlösungen wurden am Rotationsverdampfer vom Ethanol befreit und über Nacht im Vakuumtrockenschrank bei 50°C getrocknet. Aus der Trockenmasse wird der Gehalt an charakteristischen Inhaltsstoffen per nachstehender HPLC- Methode ermittelt . Diese HPLC-Methode wird zur Bestimmung der Inhaltsstoffe auch bei den weiteren Beispielen angewendet.
Figure imgf000014_0001
Ausbeute (96% (g/g) Ethanol-Extrakt) : 18,38 g => 36, 8!
HPLC-Gehalt an Hopfen α-Bittersäuren: 19,8% HPLC-Gehalt an Hopfen ß-Bittersäuren: 4,2% HPLC-Gehalt an Xanthohumol: 1,3%
HPLC-Gehalt an 6- und 8-Prenylnaringeninen, sowie an Isoxanthohumol : unterhalb der Nachweisgrenze (< 0,01%)
Beispiel la: Herstellung eines Hopfenextraktes (Extaktion mit C02 und anschließend Wasservorextraktion bei 90°C)
Serielle Extraktion mit überkritischem C02, Wasser und 92% (g/g) Ethanol :
80,6 g einer Hopfendroge (Sorte „Hallertauer Magnum"), die zuvor mit überkritischem C02 vorextrahiert worden war
(Bedingungen: Vermahlung auf 10 mm Korngröße, Extraktion mit
C02 bei 250 bar/50°C, Abtrennung des Extraktes mit einer
Ausbeute von 30%) , wurden mit 960 g Wasser zunächst 5 Min. am Ultra-Turrax, dann unter Rühren 1 Stunde bei 90°C extrahiert. Anschließend wurde der Wasserextrakt über ein Seitz Supra Filter 1500 abfiltriert. Der noch leicht feuchte Drogenrückstand wurde dann mit je 2 mal 800 g 92% (g/g) Ethanol jeweils 1 Stunde bei 60°C extrahiert. Es wurde dann über Seitz Supra 1500 abfiltriert und die Extraktlösung am Rotationsverdampfer bei einer Wasserbadtemperatur von 55-65°C von Ethanol befreit und im Trockenschrank bei 60°C getrocknet .
Ausbeuten:
Rückstand aus Wasserextraktion: 18,96 g (23,5%)
Rückstand aus 92% (g/g) EtOH-Extraktion: 9,83 g (12,2%)
HPLC-Gehalte (bezogen auf den 92% (g/g) EtOH-Extrakt) :
HPLC-Gehalt an Hopfen α-Bittersäuren: 2% HPLC-Gehalt an Hopfen ß-Bittersäuren: 0,5%
HPLC-Gehalt an Xanthohumol 5,83%
HPLC-Gehalt an 6-Prenylnaringenin 0,63%
HPLC-Gehalt an 8-Prenylnaringenin 0,21%
HPLC-Gehalt an Isoxanthohumol 0,42%
Beispiel lb: Herstellung eines Hopfenextraktes (Extraktion mit C02 und anschließend Wasservorextraktion bei 90°C)
Serielle Extraktion mit überkritischem C02, Wasser und 92% (g/g) Ethanol:
504,26 g einer Hopfendroge (Sorte „Hallertauer Magnum"), die zuvor mit überkritischem C02 vorextrahiert worden war (Bedingungen: Vermahlung auf 10 mm Korngröße, Extraktion mit C02 bei 250 bar/50 °C, Abtrennung des Extraktes mit einer Ausbeute von 30%) , wurden mit 6 kg Wasser zunächst 5 Min. am Ultra-Turrax, dann unter Rühren 1 Stunde bei 90°C extrahiert. Anschließend wurde der Wasserextrakt über ein Seitz Supra Filter 1500 abfiltriert. Der noch leicht feuchte Drogenrückstand wurde dann mit je 2 mal 5 kg 92% (g/g) Ethanol jeweils 1 Stunde bei 60°C extrahiert. Es wurde dann über Seitz Supra 1500 abfiltriert und die Extraktlösung am Rotationsverdampfer bei einer Wasserbadtemperatur von 55-65°C von Ethanol befreit und im Trockenschrank bei 60°C getrocknet .
Ausbeuten: Rückstand aus Wasserextraktion: 105,9 g (21%)
Rückstand aus 92% (g/g) EtOH-Extraktion: 69,37 g (13,8%)
HPLC-Gehalte (bezogen auf den 92% (g/g) EtOH-Extrakt) :
HPLC-Gehalt an Hopfen α-Bittersäuren: 1%
HPLC-Gehalt an Hopfen ß-Bittersäuren: 0,5% HPLC-Gehalt an Xanthohumol 4,41%
HPLC-Gehalt an 6-Prenylnaringenin 0,49%
HPLC-Gehalt an 8-Prenylnaringenin 0,15%
HPLC-Gehalt an Isoxanthohumol 0,6%
Beispiel 2 : Herstellung eines Hopfenextraktes (Extraktion mit C02 und anschließend Wasservorextraktion bei 60°C)
Serielle Extraktion mit überkritischem C02, Wasser und 92% (g/g) Ethanol:
80,36 g einer Hopfendroge (Sorte „Hallertauer Magnum"), die zuvor mit überkritischem C02 vorextrahiert worden war (Bedingungen: Vermahlung auf 10 mm Korngröße, Extraktion mit C02 bei 250 bar/50°C, Abtrennung des Extraktes mit einer Ausbeute von 30%) , wurden mit 964 g Wasser zunächst 5 Min. am Ultra-Turrax, dann unter Rühren 1 Stunde bei 60°C extrahiert. Anschließend wurde der Wasserextrakt über ein Seitz Supra Filter 1500 abfiltriert. Der noch leicht feuchte Drogenrückstand wurde dann mit je 2 mal 800 g 92% (g/g) Ethanol zunächst 5 Min. am Ultra-Turrax, dann unter Rühren jeweils 1 Stunde bei 60°C extrahiert. Es wurde dann über Seitz Supra 1500 abfiltriert und die Ξxtraktlösung am Rotationsverdampfer bei einer Wasserbadtemperatur von 55-65°C von Ethanol befreit und im Trockenschrank bei 60°C getrocknet .
Ausbeuten:
Rückstand aus Wasserextraktion: 17,91 g (22%)
Rückstand aus 92% (g/g) EtOH-Extraktion: 9,95 g (12,4%)
HPLC-Gehalte (bezogen auf den 92% (g/g) EtOH-Extrakt) :
HPLC-Gehalt an Hopfen α-Bittersäuren: 1,58% HPLC-Gehalt an Hopfen ß-Bittersäuren: 0%
HPLC-Gehalt an Xanthohumol 6,1%
HPLC-Gehalt an 6-Prenylnaringenin 0,4%
HPLC-Gehalt an 8-Prenylnaringenin 0,09%
HPLC-Gehalt an Isoxanthohumol 0,21%
Beispiel 3 : Herstellung eines Hopfenextraktes (Extraktion mit n-Heptan und anschließend Wasser bei 90°C)
247,6 g Hopfendroge (Sorte „Hallertauer Magnum") wurden mit dem 7-fachen Gewicht zunächst 5 Min. am Ultra-Turrax, dann unter Rühren 1 Stunde mit n-Heptan extrahiert . Nach Abfiltrieren der heptanisehen Extraktlδsung über Seitz Supra 1500 wurde noch ein zweites Mal in der gleichen Weise extrahiert. Danach wurde der erhaltende Drogenrückstand im Vakuumtrockenschrank vom Heptan befreit . Der trockene Drogenrückstand (205 g) wurde sodann mit der 12-fachen Gewichtsmenge Wasser versetzt und während 1 Stunde bei 90°C gehalten. Danach wurde erneut abfiltriert und der noch leicht feuchte Drogenrückstand mit der 10-fachen Gewichtsmenge 92% (g/g) Ethanol unter Rühren zweimal bei 60°C extrahiert. Es wurde dann über Seitz Supra 1500 abfiltriert und die Extraktlösung am Rotationsverdampfer bei einer Wasserbadtemperatur von 55-65°C von Ethanol befreit und im Trockenschrank bei 60°C getrocknet.
Ausbeuten: Heptanextrakt : 26,4 g (10,7%)
Wasserextrakt: 41,1 g (16,6%)
92% (g/g) Ethanolextrakt : 52,0 g (21,0%)
HPLC-Gehalte (bezogen auf den 92% (g/g) EtOH-Extrakt) : alpha-Bittersäuren: 0,86% beta-Bittersäuren: 0,05%
Xanthohumol : 3,3%
6-Prenylnaringenin : 0,45%
8-Prenylnaringenin : 0,13%
Isoxanthohumol : 0,25%
Beispiel 4 : Abhängigkeit des Gehaltes an 6 -Prenyl- , 8 - Prenylnaringenin und Isoxanthohumol von der Temperatur der Wasservorextrakt ion
Extraktion: Ca. 80 g einer mit C02 vorextrahierten Hopfendroge wurden mit dem 12-fachen Gewicht an Wasser zunächst 5 Min. am Ultra-Turrax, dann unter Rühren 1 Stunde bei 60, 70, 80, 90 und 95°C extrahiert. Anschließend wurde der Wasserextrakt über ein Seitz Supra Filter 1500 abfiltriert. Der noch leicht feuchte Drogenrückstand wurde dann mit je 2 mal 800 g 92% (g/g) Ethanol zunächst 5 Min. am Ultra-Turrax, dann unter Rühren jeweils 1 Stunde bei 60°C extrahiert. Es wurde dann über Seitz Supra 1500 abfiltriert und die Extraktlösung am Rotationsverdampfer bei einer Wasserbadtemperatur von 55-65°C von Ethanol befreit und im Trockenschrank bei 60°C getrocknet.
Die in der Figur 1 graphisch dargestellten Ergebnisse zeigen eine deutliche Abhängigkeit der Konzentration der analysierten prenylierten Inhaltsstoffe von der Temperatur der Wasservorextraktion.
Beispiel 5: Prüfung der Hopfenextrakte auf östrogene Aktivität
Zur Prüfung von individuellen Extraktinhaltsstoffen, einem Vergleichsextrakt und einem erfindungsgemäßen Extrakt auf Wechselwirkungen mit dem humanen Östrogenrezeptor alpha (ER- α) bzw. beta (ER-ß) wurde ein kompetitiver Rezeptorbindungsassay durchgeführt. Dabei wird zunächst radioaktiv markiertes Östradiol an den humanen Östrogenrezeptor gebunden und anschließend mit der zu untersuchenden Testsubstanz behandelt. Ein der östrogenen Potenz der Probe entsprechender Anteil an markiertem Östradiol wird dabei verdrängt. Überschüssiges Östradiol wird nach Bindung des Komplexes an Hydroxylapatit herausgewaschen. Die Östrogenrezeptor ER-α und ER-ß wurden käuflich als rekombinante humane Rezeptoren erworben. Die Testansätze bestanden jeweils aus 1000 μl TEDG-Puffer (10 mM Tris, 1.5 raM EDTA, 10% Glycerol, pH 7,5), 5 μl Rezeptor (200 nM) , 10 μl 3H-Östradiol und 10 μl Ethanol (Kontrollwert) , 10 μl Diethylstilöstrol (100 mM, Positivkontrolle) oder 10 μl Extrakt bzw. Extraktinhaltsstoff. Die Ansätze werden vorsichtig durchmischt und für ca. 16 Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert . Nach der Inkubation wird
250 μl Hydroxylapatit (HAP) zugefügt, um die Proteine zu adsorbieren. Während einer Inkubationsphase von 15 Minuten werden die Ansätze alle fünf Minuten mit der Hand durchmischt. Der Niederschlag wird bei 10.000 rpm für einige
Sekunden scharf abzentrifugiert und der Überstand wird abpipettiert . Das Pellet wird dreimal mit je 1000 μl TEDG
Puffer gewaschen und zur Messung mit 1000 μl Ethanol versetzt, aufgeschlämmt und in ein Szintillationsvial überführt. Nach Zugabe von 9 ml Szintillatorflüssigkeit
(Ready Safe, Beckmann) erfolgt eine Messung über das gesamte
3H-Fenster in einem Beckmann Beta-Counter .
Die Charakterisierung der Bindungskapazitäten der Testsubstanzen erfolgt über die Bestimmung der ED50-Werte aus den Dosis-Wirkungskurven der Östradiolverdrängung. Die
Ergebnisse sind in der Tab. 1 zusammengestellt und demonstrieren für alle untersuchten Inhaltsstoffe potente
Wechselwirkungen mit beiden Östrogenrezeptoren. Überraschenderweise erwies sich der erfindungsgemäße Extrakt als wesentlich stärker wirksam als anhand der Aktivitäten der einzelnen Inhaltsstoffe zu erwarten wäre. Im Gegensatz dazu zeigte der Vergleichsextrakt eine Aktivität an beiden
Rezeptoren, die mindestens lOfach unterhalb der des erfindungsgemäßen Extraktes lag.
Tab . 1 : Bindung von ExtraktInhaltsstoffen, einem erfindungsgemäßen Extrakt und einem Vergleichsextrakt an den humanen Östrogenrezeptor-alpha (ER-α) bzw. Östrogenrezeptor- beta (ER-ß)
Figure imgf000021_0001
Die Prüfung von Extrakten auf östrogene Eigenschaften erfolgte außerdem mit einem Reportergen-Assay unter Verwendung von Hefezellen (Saccharomyces) . Die Zellen sind stabil mit dem humanen α-Östrogenrezeptor und einem Expressionsplasmid, das ein Östrogenresponse-Element und das Gen für das Enzym ß-Galaktosidase enthält, transfiziert . Alle Proben wurden in einer Konzentration von 20 mg/ml in DMSO gelöst und unverdünnt oder nach Verdünnen mit DMSO im Verhältnis 1/10, 1/100 oder 1/1000 in einem Volumen von 1 μl zu 100 μl Kulturmedium in 96-Well Flachboden- Mikrotiterplatten gegeben. Anschließend wurden 100 μl Hefesuspension und das chromogene Substrat Chlorphenolrot-ß- D-Galactopyranosid zugefügt. Auf jeder Platte wurden zur Kontrolle Wells vorbereitet, in die nur Kulturmedium bzw. das Lösungsmittel eingefüllt wurde oder die die Standardkonzentrationen von 17ß-Östradiol enthielten. Die Hefezellen wurden 72 h bei 32°C inkubiert und dann wurde die Absorption des Mediums bei 540 nm in einem Mikrotitierplatten-Photometer gemessen. Die Proben wurden teilweise zweifach geprüft. Ergebnisse:
Figure imgf000022_0001
Die Ergebnisse des Assays sind in Figur 2 dargestellt. Als "aktiv" werden hierbei jene Extrakte bezeichnet, deren Aktivität im Vergleich zur 17ß-Östradiol-Standardkurve signifikant oberhalb der Background-Werte (entspricht etwa 10% der maximalen Stimulation) lag.

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Hopfenextrakt, gekennzeichnet durch einen Gehalt an α- Bittersäuren von mindestens 0,5%, an Xanthohumol von mindestens 2% und an prenylierten Flavonen ausgewählt aus der Gruppe umfassend 6-Prenylnaringenin, 8-
Prenylnaringenin und Isoxanthohumol von mindestens 0,5%.
2. Hopfenextrakt nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch einen Gehalt an α-Bittersäuren von mindestens 0,8%, an Xanthohumol von mindestens 3% und an prenylierten Flavonen ausgewählt aus der Gruppe umfassend 6- Prenylnaringenin, 8 -Prenylnaringenin und Isoxanthohumol von mindestens 0,7%.
3. Verfahren zur Gewinnung eines Hopfenextrakts, umfassend die Schritte:
(a) ein- oder mehrmaliges Extrahieren einer Hopfendroge mit einem C5-C7-Alkan oder überkritischem C02 und Abtrennen des Drogenrückstandes von der Extraktionslδsung;
(b) ein- oder mehrmaliges Extrahieren des Drogenrückstandes aus Schritt (a) mit Wasser und Abtrennen des Drogenrückstandes;
(c) ein- oder mehrmaliges Extrahieren des Drogenrückstandes aus Schritt (b) mit einem Lösungsmittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Alkoholen, wässrigen Alkoholen, Ketonen, wässrigen Ketonen und Estern sowie Filtrieren der erhaltenen Extraktionslösung; und
(d) Entfernen des Lösungsmittels aus den in Schritt (c) erhaltenen vereinigten Extraktlösungen und Trocknen des erhaltenen Rückstands .
4. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei in Schritt (a) ein-, zwei- oder dreimal extrahiert wird.
5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 3 oder 4 , wobei das Lösungsmittel in Schritt (a) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus n-Pentan, n-Hexan und n-Heptan.
6. Verfahren gemäß Anspruch 5 , wobei das Lösungsmittel in Schritt (a) n-Heptan ist.
7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 3 bis 6, wobei die Extraktion in Schritt (b) zwischen 60 und 95°C, vorzugsweise bei etwa 90°C erfolgt.
8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 3 bis 7, wobei das Lösungsmittel in Schritt (c) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Methanol, wässrigem Methanol, Ethanol, wässrigem Ethanol, Aceton, wässrigem Aceton und Ethylacetat.
9. Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei das Lösungsmittel in Schritt (c) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 80-96% (g/g) Ethanol, 74-99% (g/g) Methanol und 60-99% (g/g) Aceton.
10. Verfahren gemäß Anspruch 8 oder 9, wobei das Lösungsmittel in Schritt (c) 92% (g/g) Ethanol ist.
11. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Lösungsmittel in Schritt (a) n-Heptan ist und das Lösungsmittel in Schritt (c) 92% (g/g) Ethanol ist.
12. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Lösungsmittel in Schritt (a) überkritisches C02 ist und das Lösungsmittel in Schritt (c) 92% (g/g) Ethanol ist.
13. Pharmazeutische Zubereitung, umfassend einen Extrakt gemäß Anspruch 1 oder 2 und übliche pharmazeutische verträgliche Hilfsstoffe.
14. Verwendung eines Extrakts nach Anspruch 1 oder 2 oder einer pharmazeutischen Zubereitung nach Anspruch 13 zur
Prophylaxe und Therapie von Krankheitszuständen, die durch einen Mangel an Östrogenen oder durch eine Dysregulation des Geschlechtshormonstoffwechsels, insbesondere Östrogenstoffwechseis verursacht werden.
15. Verwendung nach Anspruch 14, wobei die Krankheitszustände aus der Gruppe bestehend aus klimakterischen Beschwerden, geschlechtshormonabhängigen Krebserkrankungen, benigner Prostatahyperplasie, Osteoporose, Alzheimerscher Krankheit und Herz-Kreislauferkrankungen ausgewählt sind.
16. Verwendung nach Anspruch 15, wobei die geschlechtshormonabhängigen Krebserkrankungen aus der Gruppe bestehend aus Brustkrebs, Prostatakrebs und Gebärmutterkrebs ausgewählt sind.
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