WO2003033706A1 - Procedimiento de obtencion de indolocarbazoles mediante la utilizacion de genes biosinteticos de rebecamicina - Google Patents

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    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes

Definitions

  • the invention is attached to the pharmaceutical field and specifically to compounds with potential application in oncology, with a chemical structure of indolocarbazoles and which are obtained by fermentation of transformed microorganisms.
  • Rebecamycin ( Figure 1, A) is a natural product of the bacterium Saccharothrix aerocolonigenes ATCC39243, belonging to the group of actinomycetes (Bush et al. J. Antibiot. 40: 668-678, 1987). Actinomycetes are Gram-positive bacteria whose natural habitat is the soil and which have a great industrial and biotechnological interest, particularly the genus Streptomyces, because they produce a large part of the known bioactive compounds. Many of these compounds have pharmaceutical application due to their antitumor, antibacterial, antifungal, antiparasitic, immunosuppressive, etc. activity.
  • Rebecamycin has antibacterial activity against Gram-positive bacteria such as Staphylococcus aureus, Micrococcus lute ⁇ s and Streptococcus faecalis (Bush et al. J. Antibiot. 40: 668-678, 1987). However, his greatest interest is focused on his antitumor activity, which has been demonstrated in vivo against various tumors implanted in mice, and in vitro against several tumor cell lines (Bush et al. J. Antibiot. 40: 668- 678, 1987).). There are currently two rebecamycin derivatives in clinical trials for future use as antineoplastic agents (NB-506, NSC655649).
  • rebecamycin belongs to the family of natural products of indolocarbazoles. Since its discovery in 1977, more than 60 natural products of this family have been described, which can be classified into three groups according to containing indole-like structures [2,3-a] pyrrolo [3,4-c] carbazole (p. eg rebecamycin), indole [2,3-a] carbazole (eg tjipanazoles), or £> / s-indolylmaleimide (eg arciriarubin).
  • nolopyrrolocarbazoles constitute a new class of antitumor agents, which can be classified into two subgroups according to their mechanism of action.
  • a subgroup consists of kinase inhibitors, especially kinase C, and includes staurosporine ( Figure 1, B) and the like.
  • the second subgroup consists of agents that damage DNA by acting on topoisomerase I or II, but not on kinases, and includes rebecamycin ( Figure 1, A) and the like.
  • indolocarbazoles have, in their chemical structure, two components: indolocarbazole aglycone, and one or more sugars attached to it.
  • Indolocarbazole aglycone is biosynthesized from two tryptophan molecules, at least in the case of indolopyrolocarbazoles.
  • the sugar is 4-O-methyl- ⁇ -D-glucose.
  • sugar is a derivative of L-rhamnose.
  • Saccharothrix aerocolonigenes ATCC39243 responsible for the transfer of sugar to indolocarbazole aglycone (Ohuchi et al. J.
  • the present invention relates to a process based on the use of rebecamycin biosynthetic genes for the production of indolocarbazoles comprising the following steps:
  • Stage 1 Isolation of the Saccharothr ⁇ x aerocoloni ⁇ enes chromosome region that contains, among others, the gene encoding rebecamycin N-glucosyltransferase.
  • Example 1 Construction of a library from the genomic DNA of Saccharothr ⁇ x aerocolonigenes ATCC39243. In order to obtain genomic DNA from Saccharothr ⁇ x aerocolonigenes
  • ATCC39243 a dense spore suspension of this organism was used to inoculate 250 ml Erlenmeyer flasks containing 25 ml of TSB medium (trypticasein soy broth, Oxoid), and incubated at 28 ° C for 48 hours.
  • the cells obtained were collected by centrifugation and then processed following the method of genomic DNA isolation as described in detail in Kieser et al. (Practical Streptomyces genetics. The John Innes Foundation, Norwich, Great Britain, 2000). This genomic DNA was then partially digested with the restriction enzyme Sau3AI, originating DNA fragments of an approximate size of 30 kb.
  • Saccharothr ⁇ x aerocolonigenes was used the vector pKC505, which is able to replicate in both Escherichia coli and Streptomyces spp.
  • the vector pKC505 was subjected to total digestion with the restriction enzyme Hpa ⁇ , followed by extraction with phenol / chloroform and precipitation with ethanol, and subsequent treatment with alkaline phosphatase (Boehringer Mannheim). After inactivating the phosphatase, the vector was digested completely with the restriction enzyme ⁇ amHI, and subjected to phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation. The vector thus treated was then ligated with partially digested genomic DNA (previously obtained) using T4 DNA ligase (New England Biolabs).
  • This ligation mixture was packaged, in vitro, in lambda phage particles using a commercially available system ("DNA Packaging Kit", Boehringer Mannheim).
  • the phage preparation thus obtained was used to infect Escher ⁇ chia coli ED8767 cells and the transducers were selected on plates with TSA medium (trypticasein soybean broth [Oxoid] with 2% agar) containing 20 ⁇ g / ml tobramycin.
  • TSA medium trypticasein soybean broth [Oxoid] with 2% agar
  • About 3000 randomly selected transductant colonies were cultured in microtiter plates and, after the addition of glycerol (25% final concentration), this representative library of the genomic DNA of Saccharothrix aerocolonigenes was stored at -70 ° C for preservation.
  • Example 2 Analysis of the Saccharothr ⁇ x aerocolonigenes library with an ngt probe.
  • This fragment of the ngt gene was obtained by standard PCR techniques, using as a template Saccharothr ⁇ x aerocolonigenes genomic DNA (obtained according to Example 1) and the synthetic oligonucleotides CS003 SEQ ID NO: 20 and CS004 SEQ ID NO: 21, designed from known sequence of the ngt gene (Ohuchi et al. J. Antibiot. 53: 393-403, 2000). The identity of the amplified DNA fragment was verified by cloning into the pUC19 vector and subsequent nucleotide sequencing by standard Molecular Biology techniques. This DNA fragment was used as a probe in a colony hybridization against the Saccharothr ⁇ x aerocolonigenes library.
  • Stage 2 Transfer of the ability to biosynthesize rebecamycin to a microorganism of the genus Streptomvces. by introducing said chromosomal region therein.
  • the vector pKC505 (as a control) and the four cosmids that included the ngt gene were introduced separately into a strain of the genus Streptomyces by transformation of protoplasts, as described in Kieser et al (Practical Streptomyces genetics. The John Innes Foundation, Norwich, Great Britain, 2000).
  • the host strain chosen was Streptomyces albus J1074, which does not produce rebecamycin or any similar metabolite, although any other actinomycete in which the pKC505 vector can replicate can be used for this purpose.
  • albus J1074 / 14E8 and S. albus J1074 / 17A12 showed similar chromatograms with each other, with two new peaks (Figure 2, B) not detectable in the extract of the control S. albus J1074 / pKC505 ( Figure 2, A).
  • the majority peak showed the same retention time as a pure rebecamycin sample ( Figure 2, C) and showed the characteristic absorption spectrum of rebecamycin.
  • the minor peak despite having different retention time, also had an absorption spectrum similar to that of rebecamycin. This minor peak could correspond to a rebecamycin degradation product, as it is sometimes observed in HPLC chromatograms of pure rebecamycin samples.
  • the compound corresponding to the majority peak was purified as follows. S. albus J1074 / 14E8 spores were used to inoculate TSB medium (trypticasein soy broth, Oxoid) containing 25 ⁇ g / ml apramycin, and incubated at 30 ° C, 250 rpm, for 24 hours. This preinocle was used to inoculate (2.5%, v / v) eight two-liter Erlenmeyer flasks containing 400 ml of R5A medium. After a 5 day incubation at 30 ° C, 250 rpm, the cultures were centrifuged (12000 rpm, 30 min).
  • TSB medium trypticasein soy broth, Oxoid
  • the compound of interest was mostly associated with the mycelium, so the supernatant was discarded.
  • the mycelium was extracted with 400 ml of acetone, subjected to stirring for 2 hours, centrifuged, and the Organic extract was evaporated in vacuo. This material was redissolved in 5 ml of a mixture of DMSO and acetone (50:50). This extract was subjected to chromatography on a radial compression cartridge " ⁇ Bondapak C18" (PrepPak Cartridge, 25 x 100 mm, Waters), using a socratic elution with acetonitrile and water (55:45) at 10 ml / min.
  • the compound of interest was collected from several injections, dried in vacuo and finally lyophilized. This compound was analyzed by MALDI-ToF mass spectrometry using a "Voyager-DE STR Biospectrometry Workstation" spectrometer. As a result, a main peak with a mass of 568 corresponding to that of rebecamycin was obtained, and a secondary peak with a mass of 392 corresponding to the rebecamycin aglycone.
  • Stage 3 Obtaining and analyzing the nucleotide sequence of the gene cluster responsible for the biosynthesis of rebecamycin.
  • Example 5 Determination and analysis of the nucleotide sequence of the cosmid insert 14E8.
  • Cosmid 14E8 was chosen for a more detailed study, and the complete nucleotide sequence of its insert was determined. Sequencing was performed on double stranded template DNA in pUC18, using the method of terminating DNA synthesis by dideoxynucleotides and the commercial system "Cy5 AutoCycle Sequencing Kit” (Amersham Pharmacia Biotech). Both strands of the DNA were sequenced, using an automatic "Alf-express" DNA sequencer (Amersham Pharmacia Biotech). For the computer analysis of the sequence, the GCG program package from the Genetics Computer Group of the University of Wisconsin was used. The sequence obtained (SEQ ID NO: 1) was found to be 25,681 nucleotides.
  • ORFs 16 complete and two incomplete open reading frames
  • Figure 3 The gene products deduced from said ORFs were compared with proteins of known function present in the databases using the BLAST program. This allowed us to assign probable functions, in a preliminary way, to most ORFs, as shown in Table 1. Table 1.
  • Stage 4 Expression of certain genes of said gene cluster in a host organism. to produce indolocarbazoles derived from rebecamycin.
  • Example 6 Construction of the recombinant plasmids pREB5, pREB6 and pREB7.
  • Plasmid pREB5 was constructed by inserting the DNA fragment between nucleotides 7119 (Sg / ll) and 17783 (EcoRI) of SEQ ID NO: 1 into vector pWHM3 (Kieser et al. Practical Streptomyces genetics. The John Innes Foundation , Norwich, Great Britain, 2000). Plasmid pREB6 was constructed by inserting the DNA fragment between nucleotides 8562 ( ⁇ g / ll) and 17783 (EcoRI) of SEQ ID NO: 1 into vector pEM4 (Quiros et al. Mol. Microbiol. 28: 1177- 1185, 1998).
  • Plasmid pREB7 was constructed by inserting the DNA fragment between nucleotides 7119 (BglW) and 22241 (EcoRI) of SEQ ID NO: 1 into the vector pWHM3 (Kieser et al. Practical Streptomyces genetics. The John Innes Foundation, Norwich, Great Britain, 2000).
  • plasmid pREB6 contains the promoter of the erythromycin resistance gene (ermE) of Saccharopolyspora erythraea, which would direct the constitutive expression of the included genes.
  • ermE erythromycin resistance gene
  • Example 7 Production of rebecamycin intermediates in Streptomyces albus due to plasmids pREB5, pREB6 and pREB7.
  • the introduction into a given organism of the biosynthetic genes of rebecamycin described in the present invention can be used for various purposes, including: (1) If the organism in question does not naturally produce any type of nolocarbazole, the biosynthetic genes Rebecamycin can be used in:
  • rebecamycin derivatives that incorporate new sugars instead of 4-O-methyl- ⁇ -D-glucose.
  • the organism in question naturally produces some type of indolocarbazole (such as staurosporine, K-252a, UCN-01, J-104303, AT-2433, arciriaflavins, arciriarububin, arciriacyanine, arciroxocin, arciriaverdine, etc.)
  • the biosynthetic genes of rebecamycin can be used for: (a) Improving the production of that indolocarbazole, by using a regulatory gene such as orid8.
  • hybrids new indolocarbazoles
  • the gene pool of rebecamycin or a part thereof For example, if the orfD11 gene (or the orfD ⁇ and or ⁇ D11 genes) encoding a tryptophan halogenase is introduced, new halogenated indolocarbazoles can be obtained.
  • the orfR2 and / or orid7 gene is introduced, new indolocarbazoles with modified sugars can be obtained.

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Abstract

La invención se basa en la utilización de genes biosintéticos de rebecamicina de Saccharothrix aerocolonigenes para la producción de indolocarbazoles en microorganismos relacionados (Streptomyces spp.). El método comprende el aislamiento de un fragmento de ADN de Saccharothrix aerocolonigenes ATCC39243 que contiene la agrupación de genes biosintéticos de rebecamicina y la expresión de dichos genes en Streptomyces albus, consiguiendo la producción de rebecamicina y derivados. De aplicación en el campo farmaceútico.

Description

PROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓN DE INDOLOCARBAZOLES MEDIANTE LA UTILIZACIÓN DE GENES BIOSINTÉTICOS DE REBECAMICINA.
Campo de la invención
La invención se adscribe al campo farmacéutico y en concreto a compuestos con potencial aplicación en oncología, con estructura química de indolocarbazoles y que se obtienen por fermentación de microorganismos transformados.
Estado de la técnica
La rebecamicina (Figura 1 , A) es un producto natural de la bacteria Saccharothrix aerocolonigenes ATCC39243, perteneciente al grupo de los actinomicetos (Bush et al. J. Antibiot. 40: 668-678, 1987). Los actinomicetos son bacterias Gram-positivas cuyo habitat natural es el suelo y que poseen un gran interés industrial y biotecnológico, en particular el género Streptomyces, pues producen una gran parte de los compuestos bioactivos conocidos. Muchos de estos compuestos poseen aplicación farmacéutica debido a su actividad antitumoral, antibacteriana, antifúngica, antiparasitaria, inmunosupresora, etc. La rebecamicina presenta actividad antibacteriana frente a bacterias Gram-positivas tales como Staphylococcus aureus, Micrococcus luteυs y Streptococcus faecalis (Bush et al. J. Antibiot. 40: 668- 678, 1987). Sin embargo, su mayor interés se centra en su actividad antitumoral, la cual ha sido demostrada in vivo frente a diversos tumores implantados en ratón, e in vitro frente a varias líneas celulares tumorales (Bush et al. J. Antibiot. 40: 668-678, 1987).). En estos momentos existen dos derivados de rebecamicina en ensayos clínicos para su futuro uso como agentes antineoplásicos (NB-506, NSC655649). Desde el punto de vista de su estructura química, la rebecamicina pertenece a la familia de productos naturales de los indolocarbazoles. Desde su descubrimiento en 1977, se han descrito más de 60 productos naturales de dicha familia, la cual puede ser clasificada en tres grupos según contengan estructuras de tipo indolo[2,3-a]pirrolo[3,4-c]carbazol (p.ej. rebecamicína), indolo[2,3-a]carbazol (p.ej. tjipanazoles), o £>/s-indolilmaleimida (p.ej. arciriarrubina). Debido a lo novedoso de estas estructuras y a la amplia variedad de actividades de sus miembros (antimicrobiana, antifúngica, inmunosupresora, antitumoral, etc.), este grupo de alcaloides ha atraído considerable interés. En particular, los ¡ndolopirrolocarbazoles constituyen una nueva clase de agentes antitumorales, que pueden clasificarse en dos subgrupos según su mecanismo de acción. Un subgrupo consiste en inhibidores de quinasas, especialmente quinasa C, e incluye la estaurosporina (Figura 1, B) y análogos. El segundo subgrupo consiste en agentes que dañan el ADN actuando sobre la topoisomerasa I ó II, pero no sobre quinasas, e incluye la rebecamicina (Figura 1 , A) y análogos. Actualmente hay varios indolocarbazoles en ensayos clínicos en Estados Unidos, Japón y Europa, incluyendo tanto inhibidores de quinasas (UCN-01, CGP41251 , CEP-751) como agentes que dañan el ADN (NB-506, NSC655649) (Akinaga et al. Anti-Cancer Drug Design 15: 43-52, 2000).
En nuestros días existe una gran necesidad de nuevos agentes antitumorales, con actividad mejorada, con menos efectos secundarios indeseables, y con mayor selectividad, en comparación con los fármacos actualmente en uso. Tradicionalmente, la industria farmacéutica ha desarrollado nuevos fármacos mediante dos vías fundamentales: (1) búsqueda de nuevos productos naturales, y (2) síntesis y/o modificación química de determinados compuestos. Estos métodos siguen siendo útiles, pero suelen requerir inversiones muy importantes de recursos (tiempo, dinero, energía), pues normalmente es necesario analizar miles de productos para encontrar un nuevo compuesto prometedor. El desarrollo de la tecnología del ADN recombinante ha abierto un interesante campo de investigación para la generación de nuevos compuestos bioactivos mediante la manipulación de genes implicados en la biosíntesis de agentes antitumorales, principalmente de bacterias del grupo de los actinomicetos. Estas técnicas también pueden ser usadas para mejorar la producción de compuestos naturales ya conocidos, pues las cepas naturales suelen producir bajas concentraciones del metabolito de interés. La mayoría de los indolocarbazoles de origen natural poseen, en su estructura química, dos componentes: el aglicón indolocarbazol, y uno o más azúcares unidos a él. El aglicón indolocarbazol se biosintetiza a partir de dos moléculas de triptófano, al menos en el caso de los indolopirrolocarbazoles. En el caso de la rebecamicina (Figura 1, A), el azúcar es 4-O-metil-β-D- glucosa. En el caso de la estaurosporina (Figura 1, B), el azúcar es un derivado de L-ramnosa. Recientemente se han descrito algunos genes implicados en la biosíntesis de la parte glucídica de estos dos indolocarbazoles:
(1) Una región del cromosoma de Streptomyces longisporoflavus DSM10189 implicada en la biosíntesis del azúcar de la estaurosporina. Dicha región de ADN era capaz de complementar una mutación que afectaba a la biosíntesis del azúcar. No existe ninguna prueba conocida de que dicha región de ADN esté implicada en la biosíntesis del aglicón indolocarbazol (US6210935). (2) El gen ngt que codifica la Λ/-glucosiltransferasa de rebecamicina de
Saccharothrix aerocolonigenes ATCC39243, responsable de la transferencia del azúcar al aglicón indolocarbazol (Ohuchi et al. J.
Antibiot. 53: 393-403, 2000). Tampoco existen pruebas conocidas de que la región de ADN identificada esté implicada en la biosíntesis del aglicón indolocarbazol. La secuencia de ADN del gen ngt ha sido previamente usada para la bioconversión de aglicones indolocarbazoles en derivados D-glucosilados. El procedimiento consistía en añadir un determinado aglicón ¡ndolocarbazol (sintetizado químicamente, o aislado de una cepa productora) al medio de cultivo de una cepa de Streptomyces lividans que contenía un plásmido con el gen ngt, y aislar el producto glucosilado del cultivo (Ohuchi et al. J.
Antibiot. 53: 393-403, 2000). Con la excepción mencionada del gen ngt (Ohuchi et al. J. Antibiot. 53: 393-403, 2000), no se conoce descripción previa de la secuencia de nucleótidos a la que se refiere la presente invención. Además, no se conoce ninguna descripción previa de secuencias de nucleótidos que hayan sido implicadas en la biosíntesis de un aglicón indolocarbazol.
Breve descripción de la invención
La presente invención se refiere a un procedimiento basado en la utilización de genes biosintéticos de rebecamicina para la producción de indolocarbazoles que comprende las siguientes etapas:
(1 ) Aislamiento de la región del cromosoma de Saccharothrix aerocolonigenes que contiene, entre otros, el gen que codifica la -glucosiltransferasa de rebecamicina.
(2) Transferencia de la capacidad de biosintetizar rebecamicina a un microorganismo del género Streptomyces, mediante la introducción en el mismo de dicha región cromosómica. (3) Obtención y análisis de la secuencia nucleotídica del agrupamiento génico responsable de la biosíntesis de rebecamicina. (4) Expresión de ciertos genes de dicho agrupamiento génico en un organismo hospedador, para producir ¡ndolocarbazoles derivados de rebecamicina.
Descripción detallada de la invención
Las técnicas de Biología molecular empleadas en la presente invención se detallan en: Kieser et al. (Practical Streptomyces genetics. The John Innes Foundation, Norwich, Gran Bretaña, 2000) y Sambrook et al. (Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, EE.UU, 1989).
Etapa 1. Aislamiento de la región del cromosoma de Saccharothríx aerocoloniαenes que contiene, entre otros, el gen que codifica la N- glucosiltransferasa de rebecamicina.
Ejemplo 1. Construcción de una genoteca a partir del ADN genómico de Saccharothríx aerocolonigenes ATCC39243. Con el fin de obtener ADN genómico de Saccharothríx aerocolonigenes
ATCC39243, se usó una suspensión densa de esporas de este organismo para inocular matraces Erlenmeyer de 250 mi conteniendo 25 mi de medio TSB (caldo de soja tripticaseína, Oxoid), y se incubaron a 28°C durante 48 horas. Las células obtenidas fueron recogidas mediante centrifugación y seguidamente fueron procesadas siguiendo el método de aislamiento de ADN genómico tal como se describe detalladamente en Kieser et al. (Practical Streptomyces genetics. The John Innes Foundation, Norwich, Gran Bretaña, 2000). Este ADN genómico fue entonces digerido parcialmente con el enzima de restricción Sau3AI, originándose fragmentos de ADN de un tamaño aproximado de 30 kb. La cantidad necesaria de enzima, así como el tiempo de digestión, se determinó empíricamente analizando la digestión mediante electroforesis en gel de agarosa. La reacción enzimática fue interrumpida por congelación rápida, seguida de extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol. Para la preparación de la genoteca a partir del ADN genómico de
Saccharothríx aerocolonigenes se utilizó el vector pKC505, que es capaz de replicarse tanto en Escherichia coli como en Streptomyces spp. Se sometió el vector pKC505 a digestión total con el enzima de restricción Hpa\, seguida de extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol, y posterior tratamiento con fosfatasa alcalina (Boehringer Mannheim). Tras inactivar la fosfatasa, el vector fue digerido totalmente con el enzima de restricción βamHI, y sometido a extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol. El vector así tratado fue entonces ligado con el ADN genómico parcialmente digerido (previamente obtenido) utilizando ADN ligasa de T4 (New England Biolabs). Esta mezcla de ligación fue empaquetada, in vitro, en partículas de fago lambda empleando un sistema disponible comercialmente ("DNA Packaging Kit", Boehringer Mannheim). La preparación fágica así obtenida se utilizó para infectar células de Escheríchia coli ED8767 y los transductantes fueron seleccionados en placas con medio TSA (caldo de soja tripticaseína [Oxoid] con 2% agar) conteniendo 20 μg/ml tobramicina. Unas 3000 colonias transductantes elegidas al azar fueron cultivadas en placas de microtitulación y, tras la adición de glicerol (25% concentración final), esta genoteca representativa del ADN genómico de Saccharothrix aerocolonigenes fue guardada a -70°C para su preservación.
Ejemplo 2. Análisis de la genoteca de Saccharothríx aerocolonigenes con una sonda ngt.
La identificación de clones de la genoteca que contenían genes biosintéticos de rebecamicina se realizó mediante hibridación en colonia, utilizando como sonda un fragmento interno del gen ngt de Saccharothríx aerocolonigenes que codifica la Λ/-glucosiltransferasa de rebecamicina (Ohuchi et al. J. Antibiot. 53: 393-403, 2000). Este fragmento del gen ngt fue obtenido mediante técnicas estándar de PCR, usando como molde ADN genómico de Saccharothríx aerocolonigenes (obtenido según Ejemplo 1) y los oligonucleótidos sintéticos CS003 SEQ ID NO: 20 y CS004 SEQ ID NO: 21 , diseñados a partir de la secuencia conocida del gen ngt (Ohuchi et al. J. Antibiot. 53: 393-403, 2000). La identidad del fragmento de ADN amplificado se verificó mediante su clonación en el vector pUC19 y posterior secuenciación de nucleótidos mediante técnicas estándar de Biología Molecular. Este fragmento de ADN fue empleado como sonda en una hibridación en colonia frente a la genoteca de Saccharothríx aerocolonigenes. Para ello se usó un sistema disponible comercialmente ("DIG DNA Labeling and Detection Kit", Boehringer Mannheim), siguiendo procedimientos estándar y recomendaciones del fabricante. Varios clones dieron señal positiva, y los correspondientes cósmidos fueron estudiados mediante análisis Southern usando la misma sonda ngt. De este modo se seleccionaron cuatro cósmidos que incluían el gen ngt (10A4, 14E8, 17A12 y 24B2) y mostraban mapas de restricción solapantes. La cepa E. coli ED8767 portadora del cósmido 14E8 fue depositada con fecha 10/10/2001 en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), Universidad de Valencia, Campus de Burjassot, 46100 Burjassot (Valencia, España) con el número de acceso CECT 5984.
Etapa 2. Transferencia de la capacidad de biosintetizar rebecamicina a un microorganismo del género Streptomvces. mediante la introducción en el mismo de dicha región cromosómica.
Ejemplo 3. Transferencia de la capacidad de producir rebecamicina a Streptomyces albus.
El vector pKC505 (como control) y los cuatro cósmidos que incluían el gen ngt fueron introducidos separadamente en una cepa del género Streptomyces mediante transformación de protoplastos, tal como se describe en Kieser et al (Practical Streptomyces genetics. The John Innes Foundation, Norwich, Gran Bretaña, 2000). La cepa hospedadora elegida fue Streptomyces albus J1074, la cual no produce rebecamicina ni ningún metabolito similar, aunque para este fin puede utilizarse cualquier otro actinomiceto en el que pueda replicarse el vector pKC505. Varias colonias de cada una de las transformaciones fueron cultivadas a 28°C durante 10 días en medio sólido R5A conteniendo 25 μg/ml apramicina y 2,2% agar. El medio R5A es el medio R5 modificado descrito por Fernández et al. (J. Bacterio!. 180: 4929-4937, 1998). Estos cultivos fueron extraídos con acetona, y los correspondientes extractos fueron analizados mediante bioensayo y mediante HPLC, en busca de rebecamicina. Los bioensayos se realizaron siguiendo técnicas estándar de Microbiología, empleando la bacteria Microccocus luteus ATCC1024, la cual es sensible a rebecamicina. Los extractos obtenidos a partir de transformantes S. albus J1074/14E8 y S. albus J1074/17A12 inhibían el crecimiento de M. luteus, mientras que los extractos obtenidos a partir del control S. albus J1074/pKC505 no tenían ningún efecto aparente. El análisis mediante HPLC se realizó empleando una columna de fase reversa (Symmetry C18, 4.6 x 250 mm, Waters), con acetonitrilo y 0.1% ácido trifluoroacético en agua como solventes. Se utilizó un gradiente lineal de 20 a 75% de acetonitrilo en 20 minutos, con un flujo de 1 ml/min. La detección y la caracterización espectral de los picos se realizaron con un detector de fotodiodos y software Millenium (Waters), extrayéndose cromatogramas bidimensionales a 316 nm. El análisis HPLC de los extractos de S. albus J1074/14E8 y S. albus J1074/17A12 mostró cromatogramas similares entre sí, con dos picos nuevos (Figura 2, B) no detectables en el extracto del control S. albus J1074/pKC505 (Figura 2, A). El pico mayoritario presentaba el mismo tiempo de retención que una muestra de rebecamicina pura (Figura 2, C) y mostraba el espectro de absorción característico de la rebecamicina. El pico minoritario, a pesar de tener diferente tiempo de retención, también presentaba un espectro de absorción similar al de rebecamicina. Este pico minoritario podría corresponder a un producto de degradación de rebecamicina, pues se observa a veces en cromatogramas de HPLC de muestras de rebecamicina pura.
El compuesto correspondiente al pico mayoritario fue purificado de la siguiente manera. Se emplearon esporas de S. albus J1074/14E8 para inocular medio TSB (caldo de soja tripticaseína, Oxoid) conteniendo 25 μg/ml apramicina, y se incubaron a 30°C, 250 r.p.m., durante 24 horas. Este preinóculo fue usado para inocular (al 2.5%, v/v) ocho matraces Erlenmeyer de dos litros conteniendo 400 mi de medio R5A. Después de una incubación de 5 días a 30°C, 250 r.p.m., los cultivos fueron centrifugados (12000 rpm, 30 min). El compuesto de interés se encontraba mayoritariamente asociado al micelio, por lo que se descartó el sobrenadante. El micelio fue extraído con 400 mi de acetona, sometido a agitación durante 2 horas, centrifugado, y el extracto orgánico fue evaporado in vacuo. Este material fue redisuelto en 5 mi de una mezcla de DMSO y acetona (50:50). Este extracto fue sometido a cromatografía en un cartucho de compresión radial "μBondapak C18" (PrepPak Cartridge, 25 x 100 mm, Waters), empleándose una elución ¡socrática con acetonitrilo y agua (55:45) a 10 ml/min. El compuesto de interés fue recolectado a partir de varias inyecciones, secado in vacuo y finalmente liofilizado. Este compuesto fue analizado mediante espectrometría de masas MALDI-ToF utilizando un espectrómetro "Voyager-DE STR Biospectrometry Workstation". Como resultado se obtuvo un pico principal con una masa de 568 que corresponde con la de rebecamicina, y un pico secundario con una masa de 392 que corresponde con el aglicón de rebecamicina.
La producción de rebecamicina obtenida con la cepa S. albus J1074/14E8 fue varias veces mayor que la observada en las mismas condiciones con la cepa natural Saccharothríx aerocolonigenes ATCC39243.
Ejemplo 4. Transferencia de la capacidad de resistencia a rebecamicina.
Es conocido que la rebecamicina posee actividad antibacteriana frente a algunas bacterias Gram-positivas (Bush et al. J. Antibiot. 40: 668-678, 1987), y que produce una inhibición débil del crecimiento en algunas especies de Streptomyces, entre ellas S. albus J1074. Por tanto los cósmidos 14E8 y 17A12, que conferían la capacidad de producir rebecamicina, debían también conferir resistencia a dicha molécula. Con el fin de comprobar este punto, se estudió el efecto de la rebecamicina añadida exógenamente sobre el crecimiento de S. albus J1074/14E8 y del control S. albus J1074/pKC505. Para ello se usaron esporas de estas dos cepas para inocular sendas placas con medio sólido Bennett (Kieser et al. Practical Streptomyces genetics. The John Innes Foundation, Norwich, Gran Bretaña, 2000) conteniendo 25 μg/ml apramicina. Sobre este medio ya inoculado, se colocaron discos absorbentes a los que se añadieron diferentes cantidades de rebecamicina disuelta en acetona. Tras dejar las placas a 4°C durante una hora para que la solución de rebecamicina difundiera en el medio, se incubaron a 28 °C durante 4 días. Así pudo comprobarse que, en las condiciones descritas, el crecimiento de la cepa control S. albus J1074/pKC505 era inhibido por cantidades de rebecamicina de 100 μg o superiores. Sin embargo la cepa S. albus J1074/14E8 era totalmente resistente a 100 y 200 μg de rebecamicina.
Etapa 3. Obtención v análisis de la secuencia nucleotídica del agrupamiento génico responsable de la biosíntesis de rebecamicina.
Ejemplo 5. Determinación y análisis de la secuencia nucleotídica del inserto del cósmido 14E8.
El cósmido 14E8 fue elegido para un estudio más detallado, y se determinó la secuencia nucleotídica completa de su inserto. La secuenciación se realizó sobre ADN molde de doble cadena en pUC18, empleando el método de terminación de la síntesis de ADN por didesoxinucleótidos y el sistema comercial "Cy5 AutoCycle Sequencing Kit" (Amersham Pharmacia Biotech). Se secuenciaron ambas hebras del ADN, empleando un secuenciador de ADN automático "Alf-express" (Amersham Pharmacia Biotech). Para el análisis informático de la secuencia se empleó el paquete de programas GCG, del Genetics Computer Group de la Universidad de Wisconsin. La secuencia obtenida (SEQ ID NO:1) resultó ser de 25.681 nucleótidos. El análisis informático de esta secuencia reveló la existencia de 16 marcos abiertos de lectura (ORFs) completos y dos incompletos (Figura 3). Los productos génicos deducidos de dichas ORFs fueron comparados con proteínas de función conocida presentes en las bases de datos empleando el programa BLAST. Esto nos permitió asignar funciones probables, de manera preliminar, a la mayoría de las ORFs, tal como se muestra en la Tabla 1. Tabla 1.
Figure imgf000012_0001
Etapa 4. Expresión de ciertos genes de dicho agrupamiento génico en un organismo hospedador. para producir indolocarbazoles derivados de rebecamicina.
Ejemplo 6. Construcción de los plásmidos recombinantes pREB5, pREB6 y pREB7.
Con el fin de determinar la cantidad mínima de ADN necesaria para dirigir la biosíntesis de rebecamicina o de alguno de sus intermediarios, se construyeron tres nuevos plásmidos, denominados pREB5, pREB6 y pREB7, que contenían fragmentos del inserto presente en el cósmido 14E8 (Figura 4). Para ello se emplearon técnicas estándar de Biología Molecular descritas en Sambrook et al. (Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, EE.UU, 1989).
El plásmido pREB5 fue construido mediante la inserción del fragmento de ADN comprendido entre los nucleótidos 7119 (Sg/ll) y 17783 (EcoRI) de SEQ ID NO:1 en el vector pWHM3 (Kieser et al. Practical Streptomyces genetics. The John Innes Foundation, Norwich, Gran Bretaña, 2000). El plásmido pREB6 fue construido mediante la inserción del fragmento de ADN comprendido entre los nucleótidos 8562 (βg/ll) y 17783 (EcoRI) de SEQ ID NO:1 en el vector pEM4 (Quirós et al. Mol. Microbiol. 28: 1177-1185, 1998). Por último, el plásmido pREB7 fue construido mediante la inserción del fragmento de ADN comprendido entre los nucleótidos 7119 (BglW) y 22241 (EcoRI) de SEQ ID NO:1 en el vector pWHM3 (Kieser et al. Practical Streptomyces genetics. The John Innes Foundation, Norwich, Gran Bretaña, 2000).
Los tres plásmidos se replican en alto número de copias tanto en E. coli como en Streptomyces, debido a la elección de los vectores empleados para su construcción. En pREB5 y pREB7, la posible expresión de los genes incluidos se debería a sus propias secuencias promotoras y reguladoras naturales. Sin embargo, el plásmido pREB6 contiene el promotor del gen de resistencia a eritromicina (ermE) de Saccharopolyspora erythraea, el cual dirigiría la expresión constitutiva de los genes incluidos. La elección de otros vectores y/o la adición de determinadas secuencias promotoras o reguladoras permite la expresión de los genes mencionados en otros organismos.
Ejemplo 7. Producción de intermediarios de rebecamicina en Streptomyces albus debida a los plásmidos pREB5, pREB6 y pREB7.
Los plásmidos pREB5, pREBδ y pREB7, y el control pEM4, fueron introducidos separadamente en Streptomyces albus J1074 mediante transformación de protoplastos, tal como se describe en Kieser et al. (Practical Streptomyces genetics. The John Innes Foundation, Norwich, Gran Bretaña, 2000). De nuevo se eligió Streptomyces albus J1074 como cepa hospedadora, pero muchos otros actinomicetos podrían usarse debido al amplio rango de huésped de los vectores empleados para la construcción de pREB5, pREB6 y pREB7. Los transformantes fueron cultivados y se obtuvieron extractos que se analizaron por HPLC en las condiciones ya descritas en el Ejemplo 3.
Los extractos obtenidos de transformantes S. albus J1074/pREB5 no contenían aparentemente ningún indolocarbazol, siendo sus cromatogramas de HPLC esencialmente idénticos a los de los extractos del control S. albus J1074/pEM4 (Figura 5, A).
El análisis mediante HPLC de los extractos de transformantes S. albus J1074/pREB6 (Figura 5, B) reveló la presencia de un producto, al que denominamos RM62, que poseía un tiempo de elución diferente al de la rebecamicina (Figura 5, D). La comparación del espectro de absorción de RM62 (Figura 6, B) con el de rebecamicina (Figura 6, A) indica que RM62 es efectivamente un indolocarbazol derivado, o precursor, de rebecamicina. Este resultado indica que la ausencia de producción de indolocarbazoles en S. albus J1074/pREB5 se debe a una baja expresión de los genes incluidos, y que este defecto es solucionado en pREBδ por la presencia del promotor añadido del gen de resistencia a eritromicina.
El análisis mediante HPLC de los extractos de transformantes S. albus J1074/pREB7 (Figura 5, C) reveló la presencia de dos nuevos productos: RM761 , minoritario, y RM762, mayoritario. Tanto RM761 como RM762 poseían tiempos de elución diferentes al de rebecamicina (Figura 5, D), pero sus espectros de absorción (Figura 6, C-D) indican que son derivados, o precursores, de rebecamicina. La comparación de estos resultados con los obtenidos con pREB5 y pREBδ, indica que el fragmento de ADN contenido en pREB7 contiene algún elemento regulador (probablemente oríDS) que estimula la expresión de los genes de biosíntesis del indolocarbazol.
La introducción en un determinado organismo de los genes biosintéticos de rebecamicina descritos en la presente invención puede ser utilizada para diversos fines, entre ellos: (1) Si el organismo en cuestión no produce de forma natural ningún tipo de ¡ndolocarbazol, los genes biosintéticos de rebecamicina pueden ser utilizados en:
(a) La producción de rebecamicina, mediante el uso del agrupamiento génico completo. (b) La producción de intermediarios biosintéticos de rebecamicina, mediante el uso de una parte del agrupamiento génico. (c) La obtención de un organismo resistente a rebecamicina. (2) Si a un organismo del apartado anterior (1) se le introducen además genes procedentes de otros organismos, se puede conseguir la producción de derivados de rebecamicina. Por ejemplo, si se introduce un gen que codifica un determinado enzima modificador de triptófano (p.ej. hidroxilasa) pueden obtenerse derivados de rebecamicina con modificaciones (p.ej. hidroxilaciones) en posiciones específicas del aglicón ¡ndolocarbazol. Otro ejemplo: si se introduce uno o varios genes implicados en biosíntesis de un determinado azúcar, es posible obtener derivados de rebecamicina que incorporen nuevos azúcares en lugar de 4-O-metil-β-D-glucosa. (3) Si el organismo en cuestión produce de forma natural algún tipo de indolocarbazol (tales como estaurosporina, K-252a, UCN-01 , J-104303, AT- 2433, arciriaflavinas, arciriarrubina, arciriacianina, arciroxocina, arciriaverdina, etc.), los genes biosintéticos de rebecamicina pueden usarse para: (a) La mejora de la producción de ese indolocarbazol, mediante el uso de un gen regulador tal como oríD8. (b) La obtención de nuevos indolocarbazoles ("híbridos"), mediante el uso del agrupamiento génico de rebecamicina o de una parte del mismo. Por ejemplo, si se introduce el gen orfD11 (o los genes orfDΘ y oríD11) que codifica una halogenasa de triptófano, pueden obtenerse nuevos indolocarbazoles halogenados. Otro ejemplo: si se introduce el gen orfR2 y/o oríD7, pueden obtenerse nuevos indolocarbazoles con azúcares modificados.
(4) Si el organismo en cuestión produce de forma natural algún metabolito biosintetizado a partir de triptófano, aunque no de tipo indolocarbazol (tal como violaceína), los genes biosintéticos de rebecamicina pueden utilizarse para la producción de nuevas variantes ("híbridas") de dicho metabolito, de forma análoga a la descrita en el apartado anterior (3b).
Descripción de las figuras
Figura 1. Estructura de la rebecamicina (A) y la estaurosporina (B).
Figura 2. Análisis por HPLC de:
(A) Un extracto de S. albus J1074/pKC505. (B) Un extracto de S. albus J1074/14E8.
(C) Una muestra de rebecamicina pura.
Figura 3. Mapa de restricción del inserto contenido en el cósmido 14E8, el cual incluye el agrupamiento de genes biosintéticos de rebecamicina.
Fiαura 4. Esquema de los insertos incluidos en los plásmidos pREBδ, pREB6 y pREB7. Figura 5. Análisis por HPLC de:
(A) Un extracto de S. albus J1074/pEM4.
(B) Un extracto de S. albus J1074/pREB6. El pico principal corresponde al producto RM62. (C) Un extracto de S. albus J1074/pREB7. El pico principal corresponde al producto RM762. El pico minoritario, en torno al minuto 12.3, corresponde al producto RM761. (D) Una muestra de rebecamicina pura. Figura 6. Espectros de absorción de: (A) Rebecamicina.
(B) Producto RM62, procedente de un extracto de S. albus J1074/pREB6.
(C) Producto RM761 , procedente de un extracto de S. albus J1074/pREB7.
(D) Producto RM762, procedente de un extracto de S. albus J1074/pREB7.

Claims

REIVINDICACIONES
1.- Procedimiento de obtención de indolocarbazoles mediante la utilización de genes biosintéticos de rebecamicina caracterizado porque comprende las siguientes etapas:
(a) Aislar un fragmento de ADN del genoma de Saccharothrix aerocolonigenes.
(b) Insertar dicho fragmento de ADN, o una parte de él, en un vector apropiado para las células hospedadoras, de modo que pueda mantenerse dentro de ellas.
(c) Transformar las células hospedadoras con dicho plásmido recombinante.
(d) Cultivar las células hospedadoras transformadas en un medio de cultivo adecuado que permita la producción de indolocarbazoles.
2.- Una molécula de ácido nucleico seleccionada entre:
(a) una secuencia de nucleótidos descrita como SEQ ID NO:1 ; o
(b) una secuencia de nucleótidos complementaria a SEQ ID NO:1; o
(c) una secuencia de nucleótidos degenerada respecto a SEQ ID NO:1 ; o (d) una secuencia de nucleótidos capaz de hibridar bajo condiciones restrictivas con SEQ ID NO.1, con la hebra complementaria de SEQ ID NO:1 , o con una sonda de hibridación derivada de SEQ ID NO:1 o de su hebra complementaria; o
(e) una secuencia de nucleótidos que posee al menos un 80% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:1 ; o
(f) una secuencia de nucleótidos que posee al menos un 65% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:1 y que preferiblemente codifica o es complementaria a una secuencia que codifica al menos un enzima biosintético de rebecamicina o una parte de él.
3.- Una molécula de ácido nucleico que contiene una parte de la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizada porque dicha parte tiene al menos 15 nucleótidos de longitud.
4.- Una molécula de ácido nucleico, según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3, que codifica uno o más polipéptidos, o que incluye uno o más elementos genéticos, que poseen una actividad funcional en la síntesis de un indolocarbazol o un precursor de un indolocarbazol.
5.- Una molécula de ácido nucleico, según la reivindicación 4, caracterizada porque dicho carbazol es la rebecamicina, un derivado de rebecamicina o un precursor de rebecamicina
6.- Una molécula de ácido nucleico, según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3, caracterizada por incluir uno o más genes, y/o una o más secuencias reguladoras, o elementos genéticos codificantes o no codificantes de un agrupamiento génico de biosíntesis de un indolocarbazol.
7.- Una molécula de ácido nucleico, caracterizada por incluir una secuencia de nucleótidos que codifica una o más secuencias de aminoácidos de las descritas en SEQ ID Nos:2 a 19, o una secuencia de nucleótidos que es complementaria o degenerada a una secuencia de nucleótidos que codifica una o más secuencias de aminoácidos que poseen al menos un 60% de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID Nos:2 a 19.
8.- Una molécula de ácido nucleico, según la reivindicación 7, que codifica una o más secuencias aminoacídicas que poseen al menos un 85% de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID Nos:2 a 19.
9.- Un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico, según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8.
10.- Un polipéptido, según la reivindicación 9, que incluye:
(a) una o más secuencias aminoacídicas completas, o partes de las mismas, descritas en SEQ ID Nos:2 a 19; o
(b) una o más secuencias aminoacídicas completas, o partes de las mismas, que poseen al menos un 60% de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID Nos:2 a 19.
1 - Un polipéptido, según la reivindicación 10, caracterizado porque las secuencias aminoacídicas mencionadas en (b) poseen al menos un 85% de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID Nos:2 a 19.
12.- Un polipéptido, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11 , que posee una actividad funcional en la síntesis de una estructura de tipo indolocarbazol.
13.- Un vector que incluye una molécula de ácido nucleico, según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8.
14.- Un vector, según la reivindicación 13, caracterizado por consistir en el cósmido 14E8 depositado en la cepa de Escheríchia coli ED8767/14E8 con el número de identificación CECT 5984.
15.- Una célula hospedadora o un organismo transgénico que contiene una molécula de ácido nucleico, según las reivindicaciones 2 a 8.
16.- Una célula hospedadora o un organismo transgénico que contiene un vector, según la reivindicación 13.
17.- Células hospedadoras, según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 16, caracterizadas por consistir en una cepa pura de Streptomyces spp., sus mutantes o sus derivados transformados.
18.- Células hospedadoras, según la reivindicación 17, caracterizadas por consistir en una cepa pura de Streptomyces albus, sus mutantes o sus derivados transformados.
19.- Células hospedadoras, según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, caracterizadas por expresar resistencia a rebecamicina.
20.- Células hospedadoras, según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, caracterizadas por expresar resistencia a un indolocarbazol.
21.- Utilización de una molécula de ácido nucleico, según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, en la producción de indolocarbazoles, derivados de indolocarbazoles o precursores de indolocarbazoles.
22.- Utilización de una molécula de ácido nucleico, según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, en la producción de rebecamicina, derivados de rebecamicina o precursores de rebecamicina.
23.- Utilización de una molécula de ácido nucleico, según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, para aumentar el nivel de producción de un indolocarbazol.
24.- Utilización de una molécula de ácido nucleico, según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, para la obtención de células hospedadoras que expresen resistencia a un indolocarbazol.
25.- Utilización de una molécula de ácido nucleico, según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, para inactivar genes de biosíntesis de un indolocarbazol.
26.- Utilización de una molécula de ácido nucleico, según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, para técnicas de PCR encaminadas al aislamiento y/o utilización de genes de biosíntesis de indolocarbazoles.
27.- Utilización de células hospedadoras u organismos transgénicos, según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20, en la producción de indolocarbazoles, derivados de indolocarbazoles o precursores de indolocarbazoles.
28.- Utilización de células hospedadoras u organismos transgénicos, según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20, en la producción de rebecamicina, derivados de rebecamicina o precursores de rebecamicina.
29.- Un indolocarbazol o un precursor de un indolocarbazol producido por una célula hospedadora o un organismo transgénico según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20.
30.- Utilización de un indolocarbazol o de un precursor de un indolocarbazol, según la reivindicación 29, en la producción de composiciones activas en el tratamiento de distintos procesos tumorales.
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