WO2003040188A1 - Anticorps stimulant la production d'il-1ra - Google Patents

Anticorps stimulant la production d'il-1ra Download PDF

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Frédéric Dhainaut
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Definitions

  • the present invention relates to the use of natural antibodies of class IgG capable of inducing a high production of IL-1Ra by monocytes or macrophages and to the use of said antibodies for the treatment of inflammatory or autoimmune diseases.
  • LTL-1 is a cytokine corresponding to two proteins (IL-la and IL-lb) which play a key role in the inflammatory response (Dinarello CA, Blood, 1996, 87: 2095, 2137).
  • 1TL-1 is considered to be the product of activated macrophages, it is also synthesized by lymphoid and non-lymphoid cells such as vascular, epithelial, skin, nerve, dendritic, fibroblastic and chondrocytic cells. It is considered to be a central mediator of the host response to infection and other forms of trauma.
  • LTL-1 is a multi-functional cytokine which acts on a wide variety of cells of the immune system as well as other cellular systems. LTL-1 acts directly on the central nervous system, induces the inhibition of insulin secretion by islet cells of the pancreas and stimulates cellular, humoral and natural immune responses.
  • LTL-l ⁇ and IL-l ⁇ act by binding to surface receptors expressed on many cells and trigger a series of signals having effects on cell proliferation, apoptosis, induction of cytokines, production of prostaglandins, activation of receptors and secretion of degrading enzymes.
  • IL-1a and IL-1b There are two receptors that interact with IL-1a and IL-1b: the type I receptor (80Kd) expressed on T cells, fibroblasts and epithelial cells, which requires interaction with ILIRacP (IL-1 accessory protein) to transmit the signal and the type II receptor (67Kd) expressed on B cells, neutrophils and macrophages which cannot transmit the signal because it is missing the intracellular part.
  • lTL-IRa IL-1 receptor antagonist
  • These three proteins have 25 to 30% of amino acids in common. LTL-IRa does not associate well with the type II receptor.
  • LTL-1 is considered to mediate the defense of the host against infections but also many pathologies and a high level of circulating IL-1 correlates with a variety of clinical situations and in particular septic shock. Its activity is finely regulated at the level of transcription, translation and secretion. Other regulatory mechanisms involve the action of other cytokines, the difference in expression of IL-1 receptors and the production of a natural inhibitor such as IL-1Ra.
  • LTL-IRa can act as a competitor of IL-1 and therefore represents an interesting therapeutic agent.
  • WO 95/16706, WO 99/36541, WO 01/42305, WO 01/41792 and WO 01/42304 describe the peptide IL-IRa, mutated peptides and their use for the treatment of various pathologies.
  • any strategy aimed at specifically stimulating the production of IL-1Ra and therefore at inhibiting the inflammatory activity of IL-1 is of therapeutic interest in the treatment of a certain number of acute or chronic inflammatory pathologies such as rheumatoid arthritis, GVH and others.
  • the present invention relates to the use of antibodies capable of strongly stimulating the in vitro (and in vivo) production of lTL-IRa (Interleukin 1 receptor antagonist), but not that of a pro-inflammatory cytokine IL-lb (Interleukin lb and la).
  • IgG type human antibodies have the characteristic of recognizing self proteins such as actin, myosin, tubulin, DNA or basic myelin protein (MBP) in ELISA but not vaccine antigens such as tetanus toxoid. They are also selected for their ability to bind to the dinitrophenyl or DNP hapten.
  • the invention relates to natural antibodies of class IgG reacting with hapten DNP and at least one autoantigen selected from myosin, actin, basic myelin protein (MBP) and tubulin, characterized in that it induces an overexpression of lTL-IRa at the level of the mRNA and of the secreted protein.
  • overexpression means that the level of expression of lTL-IRa is at least 50% higher than the level of expression of cells not stimulated by the antibodies of the invention.
  • natural antibodies of class IgG is intended to denote antibodies, fractions or subpopulations of antibodies or monoclonal antibodies exhibiting reactivity with respect to antigens of the self.
  • the dTgG subpopulations are prepared from polyvalent dTg or any other intermediate fraction obtained during the process of manufacturing IgINs for therapeutic use.
  • such natural antibodies do not react with tetanus toxoid and other non-self antigens.
  • these antibodies exhibit a vis-à-reactivity of the hapten DNP greater than 100, 125 or 150 relative to Igin, particularly in relation to TEGELI ⁇ E ®.
  • these antibodies have a reactivity rate with respect to at least one autoantigen selected from AD ⁇ , myosin, MBP, actin and tubulin greater than 50, 75 or 100 relative to IgIN versatile, especially compared to TEGELI ⁇ E ® .
  • the enrichment rate can be calculated in relation to the activity of the initial polyvalent Ig as a control value in the case of IgG subpopulations or in relation to a reference monoclonal antibody in the case where the natural antibody is a monoclonal antibody.
  • the invention in a second aspect, relates to a process for the preparation of an IgG subpopulation defined above, characterized in that it comprises the following steps: a) preparation of an insoluble support on which D ⁇ P is grafted -lysine, b) adsorption of polyvalent Ig on the support obtained in step a), c) elution of the Ig retained on the support so as to collect the fraction interacting with D ⁇ P, d) selection of the fractions exhibiting vis reactivity -to given autoantigens, and e) selection of the fractions inducing overexpression of lTL-IRa by macrophages or monocytes.
  • polyvalent Ig can be prepared using other methods.
  • TEGELINE ® LLB, France
  • retinochoroiditis of the "Birdshot” type pathologies for which Marketing Authorizations have been obtained.
  • polyvalent Ig is understood to mean, in the context of the invention, whole polyvalent IgGs, fragments of polyvalent IgGs such as F (ab ′) 2 or F (ab) and any intermediate fractions obtained during the manufacturing process polyvalent IgINs.
  • Step a) can be implemented by grafting D ⁇ P-lysine on a solid support, particularly on a Sepharose ® gel, Trisacryl ®, ® of Affiprep 'Affigel ®, or gels activated with C ⁇ Br, or ⁇ HS C 5 H 8 O 2 (glutaraldehyde).
  • the IgGs deposited on the solid support obtained in step a) are adsorbed either in the form of polyvalent IgGs dissolved after lyophilization or of polyvalent IgGs in liquid form, or in the form of intermediate fractions obtained during a process for the manufacture of polyvalent IgG in phosphate buffer comprising ⁇ aCl, the concentration of which can vary from 0 M to 3 M.
  • the elution of the IgGs retained in step b) is carried out with an ion buffer dissociating the bond between the IgGs and the D ⁇ P, selected in particular from chaotropes such as glycine-HCl or sodium iodide ( ⁇ al) , under conditions varying the pH and / or the molarity of the buffer.
  • an ion buffer dissociating the bond between the IgGs and the D ⁇ P selected in particular from chaotropes such as glycine-HCl or sodium iodide ( ⁇ al) , under conditions varying the pH and / or the molarity of the buffer.
  • Step d) comprises an ELIS A test carried out on a panel of autoantigens selected in particular from AD ⁇ , actin, myosin, MPB and tubulin or any other self-antigen.
  • This step can also include a measurement of the reactivity for a vaccine antigen, for example tetanus toxoid, taking the enrichment rate relative to the activity of the initial polyvalent Ig as a control value.
  • Sub-populations with the properties mentioned above are then selected in step e), ie sub-populations inducing the overexpression of mRNA and of IL-IRa protein by macrophages or monocytes . It is considered that there is overexpression when a significant increase in expression is detected compared to the basic expression observed naturally in macrophages or monocytes (for example an increase greater than 50% or more (for example 100% or 200%).
  • the invention also relates to the sub-populations capable of being obtained from this process.
  • the invention also relates to a process for the preparation of monoclonal antibodies defined above, characterized in that it comprises the following steps: a) transformation of B lymphocytes from healthy donor blood by EBV, b) identification of clones in each culture well secreting IgG capable of recognizing the hapten DNP and at least one autoantigen given by an ELISA test, c) amplification of the clones identified in step b), d) purification of the antibodies produced by the clones of step c) and, e) selection of the monoclonal antibodies inducing overexpression of lTL-IRa by human macrophages or monocytes.
  • the clones identified in step b) can be fused with a non-Ig secreting myeloma.
  • the autoantigen can be selected from DNA, actin, myosin, basic myelin protein (MBP) and tubulin.
  • the invention in another aspect, relates to clones of B cells transformed by EBV selected, fused or not with a myeloma and amplified by the method mentioned above. These clones are characterized in that they produce natural monoclonal antibodies capable of inducing overexpression of lTL-IRa by macrophages or monocytes.
  • the invention also relates to the monoclonal antibodies obtained by said clones. Such antibodies are capable of inducing the overexpression of lTL-IRa by macrophages or monocytes.
  • the invention relates to a composition
  • a composition comprising a natural antibody defined above (antibody subpopulation or monoclonal antibody) and a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • this composition is suitable for administration by the intravenous, subcutaneous or intramuscular route.
  • the invention also relates to the use of a natural antibody mentioned above for the preparation of a medicament.
  • this drug is intended for the treatment and prevention of inflammatory diseases. It can be useful for the treatment and prevention of sepsis and septic shock, for the treatment and prevention of arthritis, rheumatoid arthritis, polyarthritis, osteoporosis, inflammatory diseases of the intestine, autoimmune diseases, transplant rejection, ischemia, trauma, including brain trauma, psoriasis, dermatosis, restenosis, respiratory disease, allergic rhinitis, allergies and cancer.
  • Figure 1 Inhibitory capacity of TEGELESfE ® and of the anti-DNP fraction on the proliferation of human lymphocytes stimulated in mixed lymphocyte culture (CLM).
  • Figure 2 ABC Effect of TEGELINE ® and the anti-DNP fraction on the production of cytokines by human PBL stimulated in CML.
  • Figure 3 Secretion of dTLIRa by mouse macrophages in vitro.
  • Figure 4 Production of IL-lra by THPl cells stimulated with different doses of TEGELINE ® or anti-DNP fraction.
  • Figure 5 Inhibitory capacity of TEGELINE ® and anti-D monoclonal antibodies on the proliferation of human lymphocytes stimulated in CML.
  • Figure 6 AB Effect of TEGELINE ® and anti-D monoclonal antibodies on the production of cytokines by human PBL stimulated in CML.
  • Figure 7 Production of dTL-lra by THPA cells stimulated by different doses (25, 50, 100 ⁇ g / ml) of anti-D monoclonal antibodies
  • Figure 8 Determination of IL-lra in ELISA in the supernatant of culture of THP cells stimulated with 25 ⁇ g / ml of TEGELINE ® or with IgG from cultures of B cells EBV + Cl (DNP ++) or C2 (DNP-)
  • Example 1 Obtaining a fraction of anti-DNP IgG from polyclonal immunoglobulins from a pool of plasma from healthy donors (IVIg).
  • This anti-DNP fraction is capable of inhibiting ten to twenty times more than the starting IgG (TEGELINE ®) proliferation of human PBL suspensions of two incompatible CML ( Figure 1).
  • the quantity of lTL-IRa mRNAs in THP cells was measured by quantitative PCR.
  • the level of mRNA expression of ITL-IRa compared to the level of expression of actin mRNA is greatly increased after incubation of THPl cells in the presence of anti DNP fraction but not TEGELINE ® (Table 2).
  • the expression of TNF ⁇ mRNA is also increased in the presence of the fraction but to a lesser extent.
  • Table 2 Effect of TEGELINE ® and anti-DNP fraction on the synthesis of the mRNA of TNF and IL-IRa by THPl cell.
  • Example 2 Obtaining natural monoclonal human antibodies having the property of stimulating the production of IL1-Ra.
  • Example 2.1 Production of monoclonal antibodies from human peripheral blood lymphocytes from an immunized donor.
  • a series of human monoclonal antibodies (mAbs) have been obtained after transformation by the EBV virus of B lymphocytes originating from the blood of donors immunized with red Rh + cells. These antibodies are all of the IgG 1 type and have the property of agglutinating the Rh + red blood cells. They are therefore specific for the D antigen.
  • Table 3 ELISA reactivity of monoclonal anti-D with respect to TEGELINE ® vis-à-vis more antigens.
  • the supernatant of THP1 cells stimulated by Acm D41 and D32 contains large quantities of IL1-Ra whereas at the same concentrations, Acm D35 and D83 induce only a small production of this cytokine (FIG. 7 ).
  • Example 2.2 Production of monoclonal antibodies from human peripheral blood lymphocytes from a healthy donor.
  • B cells from the blood of healthy donors were transformed with EBV and cultured at the rate of 10 cells per well.
  • the supernatants from the wells were tested for the presence of IgG capable of recognizing hapten DNP and actin in ELISA.
  • the four most positive wells were pooled (Cl) and cloned by dilution to 1000, 100, 50 and 10 cells per well.
  • the same approach was used to select negative wells with anti-DNP and actin (C2) activity (Table 4).
  • Table 4 Reactivity in ELISA of purified IgGs originating from culture supernatants of human EBN + B cells with respect to several antigens.
  • the cells of wells C1 and C2 were amplified to obtain quantities of antibodies sufficient to be purified on protein G.
  • the antibodies obtained are of the IgG type and Table 4 present the results of two purifications carried out using supernatants taken on D +7 (preparation 1) and D + 14 (preparation 2) and show that the purified IgGs of the well Cl recognize the DNP and are reactive for a certain number of autoantigens.
  • C2 wells IgG possess no enhanced activity compared to TEGELINE ®.
  • the IgGs purified from the two wells C1 and C2 were incubated at a dose of 25 ⁇ g / ml in the presence of THP1 cells. Cell growth is inhibited in the presence of Cl IgG but not of C2 (data not shown) and only Cl IgG stimulates the in vitro production of dTL-IRa by THP1 cells (FIG. 8).
  • the cells from wells Cl and C2 are being cloned at 0.5 cells per well to obtain monoclonal IgGs.

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Abstract

La présente invention se rapporte à des anticorps naturels éventuellement monoclonaux capables d'induire une forte production d'IL-1Ra par des monocytes ou des macrophages et à l'utilisation desdits anticorps pour le traitement de maladies inflammatoires ou autoimmunes.

Description

Anticorps stimulant la production d'IL-lRa
La présente invention se rapporte à l'utilisation d'anticorps naturels de classe IgG capables d'induire une forte production d'IL-lRa par des monocytes ou des macrophages et à l'utilisation desdits anticorps pour le traitement de maladies inflammatoires ou autoimmunes.
LTL-1 est une cytokine correspondant à deux protéines (IL- la et IL-lb) qui jouent un rôle clé dans la réponse inflammatoire (Dinarello CA, Blood, 1996, 87: 2095, 2137). Bien que 1TL-1 soit considérée comme le produit de macrophages activés, elle est également synthétisée par des cellules lymphoïdes et non lymphoïdes comme les cellules vasculaires, épithéliales, cutanées, nerveuses, dendritiques, fibroblastiques et chondrocytaires. Elle est considérée comme un médiateur central de la réponse de l'hôte à l'infection et à d'autres formes de traumatismes.
LTL-1 est une cytokine multi-fonctionelle agissant sur une grande variété de cellules du système immunitaire mais aussi d'autres systèmes cellulaires. LTL-1 agit directement sur le système nerveux central, induit l'inhibition de la sécrétion d'insuline par les cellules des îlots du pancréas et stimule les réponses immunitaires cellulaires, humorales et naturelles.
LTL-lα et l'IL-lβ agissent en se liant à des récepteurs de surface exprimés sur de nombreuses cellules et déclenchent une série de signaux ayant des effets sur la prolifération cellulaire, l'apoptose, l'induction de cytokines, la production de prostaglandines, l'activation de récepteurs et la sécrétion d'enzymes de dégradation. Il existe deux récepteurs qui interagissent avec IL- la et IL-lb : le récepteur de type I (80Kd) exprimé sur les cellules T, les fibroblastes et les cellules épithéliales, qui requiert une interaction avec lTLIRacP (IL-1 accessory protein) pour transmettre le signal et le récepteur de type II (67Kd) exprimé sur les cellules B, les neutrophiles et les macrophages qui ne peut pas transmettre le signal parce qu'il manque la partie intracellulaire.
Un troisième membre de la famille de l'IL-l, lTL-IRa (IL-1 receptor antagonist), agit comme antagoniste naturel de l'IL-la et IL-lb et interagit avec le récepteur de l'IL-l de type I mais ne transduit pas le signal intracellulaire ou une réponse biologique. Ces trois protéines ont en commun 25 à 30% des acides aminés. LTL-IRa s'associe mal au récepteur de type II.
LTL-1 est considéré comme un médiateur de la défense de l'hôte contre les infections mais aussi de nombreuses pathologies et un niveau élevé d'IL-1 circulant corrèle avec une variété de situations cliniques et en particulier le choc septique. Son activité est finement régulée au niveau de la transcription, traduction et sécrétion. D'autres mécanismes régulateurs mettent en jeu l'action d'autres cytokines, la différence d'expression des récepteurs à l'IL-l et la production d'inhibiteur naturel comme l'IL- lRa.
De nombreuses études expérimentales et quelques essais cliniques ont montré le rôle protecteur de lTL-IRa dans un certain nombre de pathologies : choc septique, arthrite rhumatoïde, le rejet de greffe, attaque et ischémie cardiaque.
LTL-IRa peut agir comme un compétiteur de l'IL-l et donc représente un agent thérapeutique intéressant. WO 95/16706, WO 99/36541, WO 01/42305, WO 01/41792 et WO 01/42304 décrivent le peptide IL-IRa, des peptides mutés et leur utilisation pour le traitement de diverses pathologies.
Cependant, si les essais thérapeutiques utilisant lTL-IRa recombinant soluble ont montré une bonne efficacité de ce produit dans le choc septique, l'arthrite rhumatoïde et la GNH, les doses nécessaires très élevées et la courte demi-vie de lTL-IRa recombinant sont des obstacles à son utilisation.
Dès lors, toute stratégie visant à stimuler spécifiquement la production d'IL-lRa et donc à inhiber l'activité inflammatoire de l'IL-l présente un intérêt thérapeutique dans le traitement d'un certain nombre de pathologies inflammatoires aiguës ou chroniques comme l'arthrite rhumatoïde , la GVH et autres.
La présente invention porte sur l'utilisation d'anticorps capables de stimuler fortement la production in vitro (et in vivo) de lTL-IRa (Interleukin 1 receptor antagonist), mais pas celle d'une cytokine pro-inflammatoire l'IL-lb (Interleukin lb et la). Ces anticorps humains de type IgG ont pour caractéristique de reconnaître en ELISA des protéines du soi telles que l'actine, la myosine, la tubuline, l'ADN ou la protéine basique de la myéline (MBP) mais pas des antigènes vaccinaux comme l'anatoxine tétanique. Ils sont sélectionnés également par leur capacité à se lier à l'haptène Dinitrophenyl ou DNP.
Ces anticorps peuvent donc se substituer avantageusement à lTL-IRa pour toutes applications thérapeutiques et répondent aux problèmes évoqués précédemment.
Description
Ainsi, dans un premier aspect, l'invention se rapporte à des anticorps naturels de classe IgG réagissant avec l'haptène DNP et au moins un autoantigène sélectionné parmi la myosine, l'actine, la protéine basique de la myéline (MBP) et la tubuline, caractérisé en ce qu'il induit une surexpression de lTL-IRa au niveau de l'ARNm et de la protéine sécrétée.
Le terme « surexpression » signifie que le taux d'expression de lTL-IRa est au moins 50% supérieur au taux d'expression des cellules non stimulées par les anticorps de l'invention.
Par « anticorps naturels de classe IgG», on entend désigner des anticorps, des fractions ou sous-populations d'anticorps ou des anticorps monoclonaux présentant une réactivité vis-à-vis d'antigènes du soi. Les sous-populations dTgG sont préparées à partir dTg polyvalentes ou toute autre fraction intermédiaire obtenue au cours du procédé de fabrication des IgIN à usage thérapeutique. Avantageusement, de tels anticorps naturels ne réagissent pas avec l'anatoxine tétanique et d'autres antigènes du non soi.
Plus spécifiquement, ils présentent une réactivité vis-à-vis de l'haptène DNP supérieure à 100, 125 ou 150 par rapport aux IgIN, notamment par rapport à TEGELIΝE®. En outre, ces anticorps présentent un taux de réactivité vis-à-vis d'au moins un autoantigène sélectionné parmi l'ADΝ, la myosine, la MBP, l'actine et la tubuline supérieur à 50, 75 ou 100 par rapport aux IgIN polyvalentes, notamment par rapport à TEGELIΝE®. Le taux d'enrichissement peut être calculé par rapport à l'activité des Ig polyvalentes initiales comme valeur contrôle dans le cas de sous- populations d'IgG ou par rapport à un anticorps monoclonal de référence dans le cas où l'anticorps naturel est un anticorps monoclonal.
Dans un deuxième aspect, l'invention porte sur un procédé de préparation d'une sous- population d'IgG définie précédemment caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) préparation d'un support insoluble sur lequel est greffé du DΝP-lysine, b) adsorption d'Ig polyvalentes sur le support obtenu à l'étape a), c) élution des Ig retenues sur le support de façon à recueillir la fraction interagissant avec le DΝP, d) sélection des fractions présentant une réactivité vis-à-vis d' autoantigènes donnés, et e) sélection des fractions induisant la surexpression de lTL-IRa par les macrophages ou les monocytes.
Le procédé général de préparation d'Ig polyvalentes est connu de l'homme du métier et comporte essentiellement les étapes suivantes :
- Fractionnement du plasma provenant d'un pool de donneurs par précipitation, adsorption et filtration puis ultrafiltration (obtention d'une première fraction " PSO 1"),
Traitement par la pepsine à pH acide, formulation, répartition, et lyophilisation
(obtention du produit TEGELIΝE®), - Bien entendu, les Ig polyvalentes peuvent être préparées en utilisant d'autres procédés. Actuellement, la tolérance et l'efficacité des IgG polyvalentes commercialisées, notamment TEGELINE® (LFB, France) sont reconnues en particulier dans le traitement du PTI, de la maladie de Kawasaki et de la rétinochoroïdite de type "Birdshot", pathologies pour lesquelles des AMM ont été obtenues.
On entend par " Ig polyvalentes " dans le cadre de l'invention, des IgG polyvalentes entières, des fragments d'IgG polyvalentes tels que F(ab')2 ou F(ab) et toutes fractions intermédiaires obtenues au cours du procédé de fabrication des IgIN polyvalentes.
L'étape a) peut être mise en œuvre par greffage de DΝP-Lysine sur un support solide, notamment sur un gel de Sepharose®, de Trisacryl®, d'Affiprep®' d'Affigel® , gels activés avec CΝBr, ΝHS ou C5H8O2 (glutaraldéhyde). Ainsi, dans le procédé, les IgG déposées sur le support solide obtenu à l'étape a) sont adsorbées soit sous forme d'IgG polyvalentes mises en solution après lyophilisation ou d'IgG polyvalentes sous forme liquide, soit sous forme de fractions intermédiaires obtenues au cours d'un procédé de fabrication d'IgG polyvalentes en tampon phosphate comprenant duΝaCl dont la concentration peut varier de 0 M à 3 M.
L'élution des IgG retenues à l'étape b) est effectuée avec un tampon d'ions dissociant la liaison entre les IgG et le DΝP, sélectionnés notamment parmi les chaotropes tels que la glycine-HCl ou l'iodure de sodium (Νal), dans des conditions faisant varier le pH et/ou la molarité du tampon.
L'étape d) comprend un test ELIS A effectué sur un panel d' autoantigènes sélectionnés notamment parmi l'ADΝ, l'actine, la myosine, la MPB et la tubuline ou tout autre antigène du soi. Cette étape peut également comprendre une mesure de la réactivité pour un antigène vaccinal, par exemple l'anatoxine tétanique, en prenant le taux d'enrichissement par rapport à l'activité des Ig polyvalentes initiales comme valeur contrôle. On sélectionne ensuite à l'étape e) des sous-populations possédant les propriétés évoquées ci-dessus, c'est à dire des sous-populations induisant la surexpression de l'ARNm et de la protéine IL-IRa par les macrophages ou les monocytes. On considère qu'il y a surexpression lors que l'on détecte une augmentation significative de l'expression comparée à l'expression de base observée naturellement dans les macrophages ou les monocytes (par exemple une augmentation supérieure à 50% ou plus (par exemple 100 % ou 200 %).
L'invention porte également sur les sous-populations susceptibles d'être obtenues à partir de ce procédé.
L'invention se rapporte également à un procédé de préparation d'anticorps monoclonaux définis ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) transformation des lymphocytes B provenant du sang de donneur sain par l'EBV, b) identification de clones dans chaque puits de culture sécrétant des IgG capables de reconnaître l'haptène DNP et au moins un autoantigène donné par un test ELISA, c) amplification des clones identifiés à l'étape b), d) purification des anticorps produits par les clones de l'étape c) et, e) sélection des anticorps monoclonaux induisant la surexpression de lTL-IRa par les macrophages ou les monocytes humains.
Pour améliorer la stabilité de l'expression des Ig naturelles, les clones identifiés à l'étape b) peuvent être fusionnés avec un myélome non sécréteur d'Ig.
Dans ce procédé, l'autoantigène peut être sélectionné parmi l'ADN, l'actine, la myosine, la protéine basique de la myéline (MBP) et la tubuline.
Dans un autre aspect, l'invention vise les clones de cellules B transformées par EBV sélectionnés, fusionnés ou non avec un myélome et amplifiés par le procédé mentionné ci-dessus. Ces clones se caractérisent en ce qu'ils produisent des anticorps monoclonaux naturels et capables d'induire la surexpression de lTL-IRa par les macrophages ou les monocytes. L'invention a également trait aux anticorps monoclonaux obtenus par lesdits clones. De tels anticorps sont capables d'induire la surexpression de lTL-IRa par les macrophages ou les monocytes.
Dans un mode supplémentaire de réalisation, l'invention porte sur une composition comprenant un anticorps naturel défini ci-dessus (sous-population d'anticorps ou anticorps monoclonal) et un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Avantageusement, cette composition est adaptée à une administration par voie intraveineuse, subcutanée ou intramusculaire.
L'invention vise également l'utilisation d'un anticorps naturel mentionné ci-dessus pour la préparation d'un médicament. De préférence, ce médicament est destiné au traitement et à la prévention des maladies inflammatoires. Il peut être utile pour le traitement et la prévention de la septicémie et des chocs septiques, pour le traitement et la prévention de l'arthrite, de l'arthrite rhumatoïde, de la polyarthrite, de l'ostéoporose, des maladies inflammatoires de l'intestin, des maladies autoimmunes, des rejets de greffes, des ischémies, des traumatismes, notamment des traumatismes du cerveau, du psoriasis, des dermatoses, des resténoses, des maladies respiratoires, des rhinites allergiques, des allergies et du cancer.
Légendes
Figure 1 : Capacité inhibitrice de TEGELESfE® et de la fraction anti-DNP sur la prolifération de lymphocytes humains stimulés en culture lymphocytaire mixte (CLM).
Figure 2 A-B-C : Effet de TEGELINE® et de la fraction anti-DNP sur la production de cytokines par les PBL humains stimulés en CML.
Figure 3 : Sécrétion dTLIRa par des macrophages de souris in vitro. Figure 4 : Production d'IL-lRa par les cellules THPl stimulées par différentes doses de TEGELINE® ou de la fraction anti-DNP.
Figure 5 : Capacité inhibitrice de TEGELINE® et d'anticorps monoclonaux anti-D sur la prolifération de lymphocytes humains stimulés en CML.
Figure 6 A-B : Effet de TEGELINE®et d'anticorps monoclonaux anti-D sur la production de cytokines par des PBL humains stimulés en CML.
Figure 7 : Production dTL-lra par les cellules THPA stimulées par différentes doses (25, 50, 100 μg/ml) d'anticorps monoclonaux anti-D
Figure imgf000009_0001
Figure 8 : Dosage de l'IL-lra en ELISA dans le surnageant de culture de cellules THPl stimulées par 25 μg/ml de TEGELINE® ou par IgG provenant de cultures de cellules B EBV+ Cl (DNP++) ou C2 (DNP-)
Exemple 1 : Obtention d'une fraction d'IgG anti-DNP à partir d'immunoglobulines polyclonales issues d'un pool de plasma provenant de donneurs sains, (IVIg).
Il a été montré précédemment (FR 99/16632) que le passage sur un immunoadsorbant NHS-Affiprep couplé au DNP-Lysine d'une préparation dTNIg (TEGELINE®, LFB) permet d'obtenir par élution avec de l'iodure de sodium (Nal), un éluat représentant 0.13% des IgG déposées. Cet éluat possède une forte réactivité en ELISA pour le DNP- albumine et pour de nombreux auto antigènes tels que l'actine, la myosine, le MBP, l'ADN et la tubuline mais pas l'anatoxine tétanique (tableau 1). Tableau 1 : Réactivité en ELISA de la fraction anti-DNP par rapport à TEGELINE® vis-à-vis de plusieurs antigènes
Figure imgf000010_0001
Cette fraction anti-DNP est capable d'inhiber dix à vingt fois plus que les IgG de départ (TEGELINE®) la prolifération de deux suspensions de PBL humains incompatibles en CML (figure 1).
L'analyse en ELISA de la présence de plusieurs cytokines dans le surnageant des CML montrent que la sécrétion d'IFNg, d'IL-4, d'IL-10, de TNFa et de TGFb est plus fortement inhibée par la fraction anti-DNP que par TEGELINE®. En revanche, la fraction anti-DNP stimule très fortement la synthèse d'IL-lRa (figures 2).
L'incubation de 2 x 10 de macrophages péritonéaux de souris in vitro avec la fraction anti-DNP pendant 24h, 48h et 72h provoque la libération d'IL-lRa de souris ; par contre, l'incubation avec TEGELINE® n'a aucun effet (figure 3).
La mesure de la quantité des ARNm de lTL-IRa dans les cellules THPl (lignées de cellules monocytaires humaines) a été réalisée par PCR quantitative. Le niveau d'expression de l'ARNm de lTL-IRa par rapport au niveau d'expression de l'ARNm de l'actine est très augmenté après incubation des cellules THPl en présence de la fraction anti DNP mais pas de TEGELINE® (tableau 2). L'expression de l'ARNm de TNFα est également augmentée en présence de la fraction mais dans une moins moindre mesure. Tableau 2 : Effet de TEGELINE® et de la fraction anti-DNP sur la synthèse de l'ARNm du TNFα et de lTL-IRa par la cellule THPl.
Figure imgf000011_0001
De même, le surnageant des cellules THPl stimulées par la fraction anti-DNP contient d'importante quantité d'ILl-Ra alors qu'aux mêmes concentrations, TEGELINE® n'induit aucune production de cette cytokine (figure 4).
Des expériences précédentes (brevet n° 99 16632) avaient démontré que cette fraction anti-DNP administrée in vivo protégeait contre le développement de la polyarthrite induite par le collagène, de l'encéphalomyélite expérimentale auto immune (EAE) induite par la MBP chez le rat et du diabète chez la souris NOD. Cette activité protectrice est supérieure après injection des IgG anti-DNP par rapport aux IglV non-fractionnées. Ces anticorps naturels pourraient représenter un traitement efficace de certaines pathologies inflammatoires.
Exemple 2 : Obtention d'anticorps humains monoclonaux naturels ayant la propriété de stimuler la production d'ILl-Ra.
Exemple 2.1 : Production d'anticorps monoclonaux à partir de lymphocytes du sang périphérique humain provenant d'un donneur immunisé. Une série d'anticorps monoclonaux humains (Acm) ont été obtenus après transformation par le virus EBV de lymphocytes B provenant du sang de donneurs immunisés par des globules rouges Rh+. Ces anticorps sont tous de type IgG 1 et ont la propriété d'agglutiner les globules rouges Rh+. Ils sont donc spécifiques de l'antigène D.
Quatorze Acm anti-D ont été testés pour leur capacité à reconnaître en ELISA l'haptène DNP et les autoantigènes décrits ci-dessus.
Sur les quatorze Acm, seuls deux Acm D41 et D32 reconnaissent le DNP mais seul D41 se lie aux autoantigènes mais pas à l'anatoxine tétanique. Les autres Acm ne reconnaissent aucun des antigènes de manière supérieure à TEGELINE R (tableau 3).
Tableau 3 : Réactivité en ELISA des anticorps monoclonaux anti-D par rapport à TEGELINE® vis-à-vis de plusieurs antigènes.
Figure imgf000012_0001
La capacité des Acm anti-D à inhiber la prolifération de lymphocytes humains incompatibles en CML est supérieure à celle de TEGELINE® pour tous les anticorps qu'ils réagissent avec le DNP ou non (figure 5).
L'étude de la libération de cytokines dans le surnageant des CML montrent que, seuls les deux Acm D41 et D32 réagissant avec le DNP, provoquent une synthèse accrue d'IL-lRa proportionnellement à leur réactivité au DNP (figure 6). La synthèse d'autres cytokines est soit diminuée (IL-4) soit non modifiée (INFg et TNFa) par les Acm quelle que soit leur réactivité (figures 6).
Le surnageant des cellules THPl stimulées par l'Acm D41 et D32 contient d'importante quantité d'ILl-Ra alors qu'aux mêmes concentrations, l'Acm D35 et D83 n'induisent qu'une faible production de cette cytokine (figure 7).
Exemple 2.2 : Production d'anticorps monoclonaux à partir de lymphocytes du sang périphérique humain provenant d'un donneur sain.
Des lymphocytes B provenant du sang de donneurs sains ont été transformés par l'EBV et mis en culture à raison de 10 cellules par puits. Les surnageants des puits ont été testés pour la présence d'IgG capables de reconnaître en ELISA l'haptène DNP et l'actine. Les quatre puits les plus positifs ont été poolés (Cl) et clones par dilution à 1000, 100, 50 et 10 cellules par puits. La même approche a été utilisée pour sélectionner des puits négatifs en activité anti-DNP et actine (C2) (Tableau 4).
Tableau 4 : Réactivité en ELISA d'IgG purifiées provenant de surnageants de culture de cellules humaines B EBN+ vis-à-vis de plusieurs antigènes.
Figure imgf000014_0001
Les cellules des puits Cl et C2 ont été amplifiées pour obtenir des quantités d'anticorps suffisantes pour être purifiés sur protéine G. Les anticorps obtenus sont de type IgG et le tableau 4 présentent les résultats de deux purifications réalisées à partir de surnageants prélevés à J+7 (préparation 1) et J+14 (préparation 2) et montrent que les IgG purifiées du puits Cl reconnaissent le DNP et sont réactives pour un certain nombre d' autoantigènes. Par contre, les IgG du puits C2 ne possèdent aucune activité enrichie par rapport à TEGELINE®.
Les IgG purifiées à partir des deux puits Cl et C2 ont été incubées à la dose de 25 μg/ml en présence de cellules THPl. La croissance cellulaire est inhibée en présence des IgG de Cl mais pas de C2 (données non présentées) et seules les IgG de Cl stimulent la production in vitro dTL-IRa par les cellules THPl (figure 8).
Les cellules des puits Cl et C2 sont en cours de clonage à 0.5 cellules par puits pour obtenir des IgG monoclonales.
Tous ces résultats montrent une corrélation positive entre la réactivité d'anticorps de type IgG vis-à-vis de plusieurs autoantigènes et la capacité accrue d'induire la synthèse dTL-IRa qu'ils soient polyclonaux ou monoclonaux par des monocytes ou des macrophages.

Claims

REVENDICATIONS
1. Anticorps monoclonal de classe IgG réagissant avec l'haptène DNP et au moins un autoantigène sélectionné parmi la myosine, l'actine, la protéine basique de la myéline
(MBP) et la tubuline, caractérisé en ce qu'il induit une surexpression de lTL-IRa dans les macrophages ou les monocytes.
2. Anticorps selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il ne réagit pas avec l'anatoxine tétanique.
3. Anticorps selon Tune des revendications 1 et 2 ayant un taux de réactivité vis-à- vis de l'haptène DNP supérieur à 100 par rapport aux IglV, notamment par rapport à
TEGELINE®.
4. Anticorps selon l'une des revendications 1 à 3 ayant un taux de réactivité vis-à-vis d'au moins un autoantigène sélectionné parmi la myosine, l'actine, le MBP et la tubuline supérieur à 50 par rapport aux IglV polyvalentes, notamment par rapport à TEGELINE®.
5. Procédé de préparation d'anticorps monoclonaux définis aux revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) transformation des lymphocytes B provenant du sang de donneur sain par l'EBV, b) identification de clones dans chaque puits de culture sécrétant des IgG capables de recomiaître l'haptène DNP et au moins un autoantigène donné par un test ELISA, c) amplification des clones identifiés à l'étape b), d) purification des anticorps produits par les clones de l'étape c) et, sélection des anticorps monoclonaux induisant la surexpression de lTL-IRa par les macrophages ou les monocytes humains.
6. Procédé selon la revendication 5 caractérisé en ce que l'autoantigène est sélectionné parmi l'ADN, l'actine, la myosine, la protéine basique de la myéline (MBP) et la tubuline.
7. Procédé selon l'une des revendications 5 et 6 caractérisé en ce que les clones identifiés à l'étape b) sont fusionnés avec un myélome non sécréteur d'Ig.
8. Anticorps monoclonal susceptible d'être obtenus à partir du procédé selon l'une des revendications 5 à 7 caractérisé en ce qu'il est capable d'induire la surexpression de 1TL- 1 Ra par les macrophages ou les monocytes.
9. Clones de lymphocytes B EBV identifiés et amplifiés par le procédé selon l'une des revendications 5 à 7 caractérisés en ce qu'ils produisent des anticorps monoclonaux capables d'induire la surexpression de lTL-IRa par les macrophages ou les monocytes.
10. Anticorps monoclonal obtenu par un clone selon la revendication 9 caractérisé en ce qu'il est capable d'induire la surexpression de lTL-IRa par les macrophages ou les monocytes.
11. Composition comprenant un anticorps selon l'une des revendications 1 à 4, 8 et 10 et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
12. Composition selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'elle est adaptée à une administration par voie intraveineuse, subcutanée ou intramusculaire.
13. Procédé de préparation d'une sous-population d'IgG caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) préparation d'un support insoluble sur lequel est greffé du DNP-lysine, b) adsorption d'Ig polyvalentes sur le support obtenu à l'étape a), c) élution des Ig retenues sur la partie DNP liée au support de façon à recueillir la fraction interagissant avec le DNP, d) sélection des fractions présentant une réactivité vis-à-vis d' autoantigènes donnés, et e) sélection des fractions induisant la surexpression de lTL-IRa par les macrophages ou les monocytes au niveau de l'ARNm et de la protéine sécrétée.
14. Procédé selon la revendication 13 caractérisé en ce que l'étape d) comprend une mesure de la réactivité pour l'anatoxine tétanique en prenant le taux d'enrichissement par rapport à l'activité des Ig polyvalentes initiales comme valeur contrôle.
15. Procédé selon l'une des revendications 13 et 14 caractérisé en ce que l'étape d) comprend un test ELISA effectué sur un panel d' autoantigènes sélectionnés notamment parmi l'ADN, l'actine, la myosine, la protéine basique de la myéline (MBP) et la tubuline.
16. Procédé selon l'une des revendications 13 à 15 caractérisé en ce que les Ig déposées sur le support solide obtenu à l'étape a) sont adsorbées soit sous forme d'IgG polyvalentes lyophilisées et remises en solution ou sous forme liquide, soit sous forme de fractions intermédiaires obtenues au cours d'un procédé de fabrication d'IgG polyvalentes en tampon phosphate comprenant duNaCl dont la concentration peut varier de 0 M à 3 M.
17. Utilisation d'une sous-population d'IgG susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une des revendication 13 à 16 pour la fabrication d'un médicament pour induire une surexpression de lTL-IRa dans les macrophages ou les monocytes.
18. Utilisation selon la revendication 17 caractérisée en ce que la sous-population d'IgG est préparée à partir d'Ig polyvalentes ou toute autre fraction intermédiaire obtenue au cours du procédé de fabrication des IglV à usage thérapeutique.
19. Utilisation d'un anticorps monoclonal selon l'une des revendications 1 à 4, 8 et 10, pour la préparation d'un médicament.
20. Utilisation selon la revendication 19 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et la prévention des maladies inflammatoires.
21. Utilisation selon la revendication 19 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et la prévention de la septicémie et des chocs septiques.
22. Utilisation selon la revendication 19 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et la prévention de l'arthrite, de l'arthrite rhumatoïde, de la polyarthrite, de l'ostéoporose, des maladies inflammatoires de l'intestin, des maladies autoimmunes, des rejets de greffes, des ischémies, des traumatismes, notamment des traumatismes du cerveau, du psoriasis, des dermatoses, des resténoses, des maladies respiratoires, des rhinites allergiques, des allergies et du cancer.
23. Utilisation selon la revendication 17 ou 18 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et la prévention des maladies inflammatoires, de la septicémie et des chocs septiques, de l'arthrite, de l'arthrite rhumatoïde, de la polyarthrite, de l'ostéoporose, des maladies inflammatoires de l'intestin, des ischémies, des traumatismes, notamment des traumatismes du cerveau, du psoriasis, des dermatoses, des resténoses, des maladies respiratoires, des rhinites allergiques, des allergies et du cancer.
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