WO2003043654A1 - Recombinant vaccinia virus vaccine - Google Patents

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Kazuhiro Matsuo
Takeaki Ohsu
Tatsuo Miyamura
Yoshiharu Matsuura
Koji Ishii
Kenzo Kato
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Japan Science and Technology Agency
National Institute of Infectious Diseases
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    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the invention of this application relates to a recombinant vaccinia virus vaccine. More specifically, the invention of this application relates to a virus vaccine against various infectious diseases of humans or animals, and a recombinant vaccinia virus Dls strain which is an active ingredient of the vaccine.
  • microorganisms such as viruses and bacteria be modified by genetic recombination and applied as vaccine vectors for the prevention and treatment of various infectious diseases and cancer.
  • Research is being actively conducted.
  • Various microorganisms such as poliovirus, influenza virus, rhinovirus, varicella virus, Salmonella, Mycobacterium bovis attenuated BCG strain, and Listeria monocytogenes have been used for research, but they have the oldest history. Is the vaccinia virus.
  • Vaccinia virus has been used as a vaccine for smallpox and has contributed greatly to its eradication.
  • This virus is a large DNA virus belonging to poxviridae, has a linear double-stranded DNA of about 190 kbp as its genome, and encodes about 200 kinds of proteins.
  • Panicali and Paoletti Proc. Natl. Acad. Scl. USA 79: 4927, 1982
  • Mackett et al. Proc. Natl. Acad. Scl. USA 79: 7415, 1982
  • simple ⁇ We have reported for the first time that the virus, thymidine kinase (TK), can be incorporated and expressed.
  • vaccinia virus Dls strain is a highly attenuated vaccinia virus isolated by subculture of vaccinia virus Dalian strain (DEI strain) in chicken egg embryos for the purpose of developing a safe smallpox vaccine.
  • vaccinia viruses include MVA (vaccinia virus strain Ankara) Zur Beurannon der MVA-Stufenimpfung bei Pockenerstrimpfungen.Med, Diss.Munchen, 1976) and NYVAC (vaccinia virus strain New York) (Virology 188: 217-232). ) has been reported. In particular, it has been suggested that MVA can be used as a vaccine against smallpox when inoculated into humans, and it has been propagated in mammalian cell lines such as CV-1 and BHK-16, and various recombinant viruses have been attenuated. It is used as a vector for vaccine production.
  • the attenuated vaccinia virus Dls strain differs from the attenuated strains such as the MVA strain and NYVAC strain in that the attenuated vaccinia virus strain Dls does not grow at all in mammalian cells and does not show a vaccine effect when inoculated into humans. ing.
  • the inventors of the present application have succeeded in integrating a foreign gene into the genome of the Dls strain, and have demonstrated that the recombinant Dls strain can be used as a virus vector for animal cells.
  • the Dls strain has weak immunity-inducing ability, it seems that the effect would not be expected even if the Dls strain genetically modified to express a foreign antigenic protein was used as a vaccine. Had been.
  • the vaccinia virus Dls strain has low cytotoxicity, and it is easily supposed that it is superior to other strains in terms of safety in humans. Due to its poor performance, use as a recombinant virus vaccine was not considered. In contrast, the inventors of the present application have found that a foreign gene can be introduced and expressed in the vaccinia virus strain Dls, and humoral and cellular immune responses to the foreign gene product can be induced in animal experiments. . Vaccinia virus strain Dls does not grow in animal cells and has been considered to be inappropriate as an expression vector for useful proteins and the like.
  • the inventors of the present application have found that the vaccinia virus Dls strain is promising as a vector for allowing host cells to survive for a long period of time due to low cytotoxicity and consequently expressing large amounts of protein.
  • This application was made based on such novel findings by the inventors, and has an object to provide a highly safe recombinant vaccinia virus vaccine.
  • Another object of the present application is to provide a recombinant vaccinia virus Dls strain which is an active ingredient of this vaccine.
  • Another object of the present application is to provide a transgenic vaccinia virus Dls strain which expresses a reporter molecule and can be used for producing a recombinant virus strain.
  • Still another object of the present application is to provide a method of using the vaccinia virus Dls strain as a vector. This application provides the following inventions (1) to (19) to solve the above problems.
  • Vaccinia virus vaccine containing a polynucleotide encoding an exogenous sex protein in the non-essential I region of ⁇ fe-body DMA and containing Dls strain, a genetic fiber vaccinia virus that expresses the sex protein, as an active ingredient .
  • the fetJ protein of the human deficiency virus is the gag gene 3 ⁇ 43 ⁇ 4re.
  • Hereditary vaccinia virus Dls (7) * ⁇ which carries a polynucleotide encoding a foreign antigenic protein in a non-essential gene region of chromosomal DNA and expresses the sex protein Is a human deficient virus, and is a gene vaccinia virus Dls of the invention (6).
  • Vegetable vaccinia virus Dl s a gene cloud of forebrain E3 ⁇ 4 ⁇ whose sex protein is derived from simian deficiency virus (6)
  • the simian protein of the simian insufficiency virus has the gag gene i3 ⁇ 4rC ' ⁇ ⁇ ⁇ Ming (9) Hereditary vaccinia virus Dls 3 ⁇ 4
  • ⁇ fe-DNA is not essential ⁇ I gene Thymidine kinase inheritance ⁇ region ⁇ ⁇ Akira (6) to (10) Any vaccinia virus Dls (12) ⁇ fe-DNA Indispensable ⁇ with parent stock! : A vaccinia virus inserted in the vaccinia virus Dls strain, which has been inserted into a DNA region that is deficient in the experiment, as described in any of (6) to (10) above.
  • Vaccinia virus Dls III which contains a polynucleotide encoding a reporter molecule in chromosomal DNA and expresses the reporter molecule
  • Non-essential I body region of body DNA and parent strain the invention (13) or (14) according to the above (13) or (14), which is inserted into the 3 ⁇ 4fe body DNA region which is defective in the vaccinia virus Dls strain at an early age.
  • Inheritance ⁇ ⁇ Vaccinia virus Dls (17) Incorporation of a polynucleotide encoding an exogenous protein into the non-essential medulla region of the body DNA of the vaccinia virus DIs strain, and exogenous protein into host cells A method for expressing a protein, which is expressed in a large amount in a protein.
  • FIG. 1 shows a strategy for constructing a transfer vector for introducing the HIV gag gene into the Dls strain genome.
  • FIG. 2 shows the results of Western blot analysis of gag antigen expression in CEF cell extracts infected with the recombinant vaccinia Dls strain into which the HIV gag gene was introduced. Lane 1 is the result of rVV-Dls-LacZ, and lane 2 is the result of rVV-Dls-aagaBm.
  • FIG. 3 shows the results of examining the infectivity of the recombinant vaccinia virus Dis strain of the present invention on CV-1 cells.
  • FIG. 4 shows the results of examining the ability of the recombinant vaccinia virus Dis strain of the present invention to express foreign genes in animal cells.
  • FIG. 5 shows the results of a CTL assay examining HIV gag-specific CTL induction in mice by rVV-Dls gagB.
  • FIG. 6 shows the results of a Western plot in which the ability to induce anti-HIV gag antibody production in mice was also examined. Lane 1 shows the results of a positive control (HIV-1 infected human serum), lane 2 shows the results of normal BALB / c mouse serum, and lane 3 shows the results of rVV-Dls-gagB-immunized BALB / c mouse serum (12 weeks after immunization). .
  • FIG. 1 shows the results of a positive control (HIV-1 infected human serum)
  • lane 2 shows the results of normal BALB / c mouse serum
  • lane 3 shows the results of rVV-Dls-gagB-i
  • vaccinia virus Dls strain rVV-Dls-SIV gag
  • the Chinese cynomolgus monkey ⁇ , ⁇ , sphere
  • the non-immunized monkey see after administration of the pathogenic virus SHIV C21.
  • 2 shows the time course of CD4 positive lymphocytes of the present invention.
  • the vaccine of the inventions (1) to (5) of the present application is a highly attenuated vaccine comprising the recombinant vaccinia virus Dls strain of the inventions (6) to (10) as an active ingredient. It is a vaccine.
  • a polynucleotide encoding any foreign (ie, other than vaccinia virus) antigenic protein is ligated downstream of the vaccinia virus-derived gene promoter sequence. This is a recombinant virus obtained by homologous recombination between the transfer vector and the Dls strain genomic DNA.
  • the foreign antigenic protein may be referred to as I "foreign polypeptide", and the polynucleotide encoding it may be referred to as “foreign polynucleotide”.
  • any promoter sequence can be used as long as it is recognized by the RNA polymerase encoded by the vaccinia virus's own gene.
  • the promoter p7.5 of the 7.5 kD polypeptide gene in the invarted tarminal repeat of the vaccinia virus genome can be used (Stunnenberg, H.G. et al. Nucleic Acids Res, 16,2431, 1988).
  • a foreign polynucleotide is a polynucleotide (eg, a cDNA fragment) that encodes an antigenic protein other than vaccinia virus.
  • HIV human immunodeficiency virus
  • AIDS human acquired immunodeficiency syndrome
  • SIV gag precursor protein of simian immunodeficiency virus
  • pathogens other pathogenic viruses and bacteria
  • polynucleotides encoding cancer cell antigen proteins can also be used.
  • a polynucleotide having a substantial sequence can be cut out from a plasmid in which a genomic gene encoding a foreign polypeptide or its cDNA has been cloned with a suitable restriction enzyme, or a suitable sequence can be obtained.
  • Amplification may be performed by polymerase chain reaction (PCR) using the above primers. If it has not been cloned, use the above PCR method to amplify the genomic DNA of the bacterium or animal carrying the gene, or in the case of a virus, the DNA or RNA from animal cells infected with the virus as type III Can be obtained.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the foreign polynucleotide thus obtained and the above promoter are ligated in such a manner that their translation frames match each other, and this fusion polynucleotide (hereinafter, sometimes referred to as an “expression unit”) is inserted into an arbitrary plasmid.
  • a transfer vector can be prepared by inserting and binding to a vector.
  • vaccinia virus genomic DNA can be extracted from virus particles purified by the sucrose density gradient method (Joklik, WK Virology 18, 9, 1962) using L-laurylsarucosine ([Mackett, M.
  • the first indicator of a non-essential gene region is the thymidine kinase (TK) gene region.
  • TK thymidine kinase
  • the TK gene region is inserted into a plasmid vector such as pUC18, and a unique restriction enzyme site within the region is used to insert and bind the expression unit to transfer vector. Homologous recombination with TK gene in vaccinia virus genome Thus, a foreign polynucleotide can be inserted into the viral genome.
  • a recombinant virus is produced in a TK-deficient cell line, and cultured in the presence of promodeoxyperidine, whereby a recombinant virus that does not express TK can be selected.
  • a second candidate for a nonessential gene region is a genomic gene deficient region of the Dls strain.
  • a recombinant virus is prepared by inserting a polynucleotide encoding a single repo molecule into a genomic gene-deficient region.
  • a bacterial chromogenic enzyme such as iS-galactosidase, a green fluorescence protein (green fluorescence protein, GFP) or a derivative thereof (eg, EGFP) can be used.
  • GFP green fluorescence protein
  • a derivative thereof eg, EGFP
  • X-gal 5-bromo-4-chloro-3-3-indolyl-j8-D-galactopyranoside
  • plaques that fluoresce under a fluorescence microscope can be selected.
  • the target foreign polynucleotide is homologously recombined into the region where the reporter molecule is inserted.
  • a recombinant virus in which a foreign polynucleotide has been homologously recombined in the genomic gene-deficient region can be obtained.
  • the resulting recombinant virus was purified to a single clone by cloning, and the presence of the inserted gene was confirmed by PCR or other methods, and then the virus-infected CEF cells were sonicated using an extract obtained by sonication.
  • the expression of the exogenous polynucleotide in the infected cells can be confirmed by Western blotting or monoclonal enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the exogenous polypeptide.
  • ELISA monoclonal enzyme-linked immunosorbent assay
  • the humoral immune response in mice is determined by inoculating the recombinant virus intravenously, intramuscularly, or intraperitoneally, etc., and determining the antibody titer of the foreign polypeptide of interest in the serum over time by Western blotting or ELISA. It can be analyzed by measuring.
  • mice the cellular immune response in mice is stimulated by stimulating lymphocytes contained in blood collected over time after inoculation of the recombinant virus with the target foreign polypeptide antigen in the examiner. It can be analyzed by measuring the incorporation of tritiated thymidine into lymphocytes.
  • lymphocytes contained in blood collected over time after inoculation of the recombinant virus with the target foreign polypeptide antigen in the examiner. It can be analyzed by measuring the incorporation of tritiated thymidine into lymphocytes.
  • CTLs cytotoxic T cells
  • the vaccinia virus Dls strain can insert a wide range of polynucleotides regardless of the length or structure of the foreign polynucleotide to be inserted. Moreover, it can be handled extremely safely.
  • the recombinant vaccinia virus Dls strain as a virus vector for protein expression can be prepared for any foreign polynucleotide by the same method as the aforementioned recombinant virus Dls strain for vaccines.
  • the Dls strain virus vector is transfected into CEF cells, mouse-derived P813 cells, fibroblasts, and the like by a conventional method, and the transfected cells are cultured to obtain an integrated foreign polysaccharide.
  • the nucleotide-encoded protein can be expressed in large amounts over a long period of time.
  • the recombinant vaccinia virus Dls strain was allowed to act on cells for 1 hour at a temperature of 10 pfu, significant expression of the recombinant protein was observed after 6 to 12 hours. Was done. Moreover, the transfectant cells survived for a long time and continued to express proteins.
  • the position of the deletion in the Dls strain genome was first examined.
  • the genomic DNA of the parent strains DEI and Dls was digested with Hindlll and compared by agarose gel electrophoresis, the N fragment (1.5 kbp) of 16 fragments from A to P (in order of size) was compared.
  • the M fragment (2.2 kbp) disappeared, the length of the C fragment (25.1 kbp) and the K fragment (4.6 kbp) were shortened, and 15.4 kbp containing most of the K fragment from the 3 'side of the C fragment Region was found to be missing.
  • the 1.9 kbp region containing the C fragment and the K fragment with the deletion of the Dls strain and the 5 'side of the F fragment (13.5 ⁇ ) flanking on the 3' side of the K fragment was amplified by PCR, .1 Cloned into TA cloning vector (Invitrogen).
  • the PCR primers were Vac H-C (the oligonucleotide of SEQ ID NO: 1) and Vac H-F (the oligonucleotide of SEQ ID NO: 2).
  • Sowing vaccinia virus Dls strain about 10 5 pfu virus solution 500 I comprising (plaque forming Yuni' Bok) into CEF cells (dish diameter 6 cm), 4 times a dish every 15 minutes and shaken gently. One hour later, 2.5 ml of 1% FBS / MEM medium was added, and the cells were cultured for 6 hours under conditions of 37 ° C and 5% CO 2 . After removing the medium and washing twice with PBS (phosphate buffered saline), the cells were released with a trypsin-EDTA solution (manufactured by G CO), collected, and finally resuspended in 400 PBS.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the cells were allowed to stand at room temperature for at least 15 minutes, and then seeded on a petri dish and cultured for 4 days. The cells were released, collected together with the culture solution, diluted 10, 100, and 1000-fold, and similarly passaged to CEF cells.
  • FIG. 1 shows the outline of the construction. Specifically, a subtype B HIV molecule clone pNL432 (Adachi, A. et al. J. Virol. 59, 284, 1986) is digested with restriction enzymes BssHI and Hindi to obtain approximately 1.8 kb. Was blunt-ended using Klenow fragment.
  • This fragment was subcloned into the BamHI-Smal sites of the plasmid pUC-VVp7.5H in which the p7.5 promoter fragment excised from the plasmid pAK2 was inserted into the Pstl-Xbal sites of pUC18 to obtain pVV7.5-gagB.
  • This plasmid was partially digested with Hindlll, and a fragment of about 2.18 kbp was separated and purified by 1% agarose gel electrophoresis. Obtained.
  • the cells were released, collected together with the culture solution, diluted 10, 100, and 1000-fold, and similarly passaged to CEF cells. After 4 days, when CPE is observed, remove the medium, add agar medium supplemented with X-gal, and 4 hours later, use a Pasteur pipette to remove the agar from the white CPE part, which is not blue, and use the same method as above for 500 1 Collected in the medium. The agar was subdivided using an ultrasonic crusher, and CEF cells were similarly subcultured. Thereafter, the same operation was repeated, and cloning was performed until all CPE on one petri dish did not develop color.
  • SK89 oligonucleotide of SEQ ID NO: 4: positions 1638-1665
  • Figure 2 shows the sonicated extract of infected cells separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and using an anti-gag monoclonal antibody (Matsuo.K. Et al. J. Gen. Virol, 73, 2445, 1992). It is the result of having performed Western plot analysis.
  • One of the five strains showed a specific band that was considered to be the gag precursor p55 protein (there was a degradation product of the inserted protein in all strains), and this recombinant virus expressed the gag antigen It was confirmed that.
  • This strain was named rVV-Dls-gagB.
  • the supernatant is further centrifuged at 13000 rpm for 90 minutes to dissolve the virus mass in 8 ml of 10 mM Tris-HCI buffer, which precipitates the virus. For 90 minutes.
  • the resulting pellet was dissolved in 1 ml of 10 mM Tris-HCI buffer to obtain a partially purified virus solution.
  • This virus solution was serially diluted, and the amount of virus in CEF cells was measured. As a result, it was found to be 101 Qpfu / ml.
  • the parental strain (DEI) grows most actively in CEF cells and to some extent in other mammalian cells except CHO, whereas the recombinant virus Dls strain grows in mammalian cells other than CEF cells. It was confirmed that the animal did not grow at all.
  • Table 1 Next, 2.0 moi of the recombinant vaccinia virus rVV-Dls-gagB prepared in Example 1 was incubated with CV-1 cells at 37 C for 1 hour and cultured for 2 days.
  • the parent strain (DEI) ol moi was similarly infected into CV-1 cells and cultured for 4 days. After culturing, each cell was collected using a 0.125% trypsin-EDTA solution to prepare a cell lysate. The lysate was ingested into 10-day-old eggs and the infectious titer of each virus was measured.
  • the cells were cultured in a monolayer on a 48-well plate, and infected with the Dls strain or the recombinant vaccinia virus rDls-T7pol at a concentration of 2 moi, respectively.
  • an adenovirus rAdexCAT7 which also expresses T7 polymerase was infected at a concentration of 20 moi.
  • one reporter plasmid, pAcT7Luc or pAcT7EMCLuc was transfected into each cell. Luciferase activity was measured using the Atsica kit Pica Gene (Tokyo Ink).
  • the results are as shown in FIG. In FIG. 4, BHK is a hamster embryo cell line, and HepG2 is a human-derived cell line.
  • the recombinant vaccinia virus rDls-T7pol can express foreign gene in mammalian cells to the same extent as adenovirus, despite its inability to proliferate in mammalian cells. confirmed. From the above results, it was confirmed that the recombinant vaccinia virus Dls strain of the present invention, when used as a vaccine component, can express an antigen protein required for antibody production without unnecessary growth. . Such excellent characteristics are particularly preferable as a vaccinia virus vaccine for immunodeficient patients such as AIDS.
  • mice Analysis of the ability of mice to induce cellular immunity against HIV-1 gag antigen rVV-Dls-gagB was inoculated intravenously at 10 7 pfu per BALB / c mouse, and over time at weeks 2, 6, 8, and 12 The spleen was collected.
  • the spleen cells crushed in PBS were transferred to a 15 ml centrifuge tube and centrifuged in a 70 / im cell strainer (Becton Dickinson), and centrifuged. 5 ml of 1.0 mM, 0.15 M ammonium chloride, 0.1 mM aqueous solution of EDTA 2Na) was added thereto, and the mixture was mildly mixed and hemolyzed. After adding 10 ml of PBS and centrifuging, the pellet was washed twice with 10 ml of PBS. Pellet 5 X 1 CT 5 M 2-mercaptoethanol 1
  • the cells were suspended in 5 ml of 10% FBS / RPMI1640 medium (Niken Biomedical Research Institute Co., Ltd.), and the number of viable cells was measured. Adjust the concentration to 1 x 10 7 cells / ml in the same medium, and add 2 types of gag peptide! 1 aqueous solution (1 mg / ml strainer) to a final concentration of 10 xg / ml. In addition, the cells were cultured at 37 ° C for 5 days.
  • the amino acid sequences of the peptides (gag B253-277 and gag B287-309) are as shown in SEQ ID NOS: 5 and 6, respectively.
  • M12.4.5 mouse cells (H2d8 protype) were cultured in 10% FBS / RPMI1640 medium, and when they reached 80% confluence, washed once with PBS, and then released and recovered with Tribcine-EDTA solution. did.
  • the cells were suspended in 10 ml of a 10% FBS / RPMI1640 medium, and the number of viable cells was counted. 1 ⁇ 10 7 cells were collected by centrifugation and suspended in 100 ⁇ L of the same medium.
  • the two peptide solutions were added to this solution so that the final concentration was 50 tg / ml, and the solution to which the peptide was not added was adjusted, and the mixture was incubated at 37 ° C for 3 hours.
  • the 96-well plate was centrifuged to precipitate the cells, 20 Atl of the supernatant was removed, transferred to a luma plate (manufactured by Packard), left to stand, and air-dried. Radioactivity was measured using a gamma ray counter (manufactured by Packard), and CTL activity (%) was calculated by the following formula.
  • CTL activity (%) (value by target cell-value by spontaneous release /
  • This plasmid is introduced into CEF cells infected with the recombinant vaccinia virus Dls strain expressing monogalactosidase by electroporation in exactly the same manner as in Example 1, and white plaques are selected on X-gal agar medium. As a result, a recombinant virus strain was obtained. CEF cells infected with this virus were observed to emit green fluorescence under a fluorescence microscope, confirming that EGFP protein was expressed.
  • the obtained approximately 1500 bp fragment was subcloned into the BamHI-Smal site of pUC-VVp7.5H in the same manner as in Example 1, followed by Hindlll for the p7.5 promoter and EGFP.
  • a fragment containing the open reading frame was cut out, introduced into Hindlll site of pUC-Dls, and a transfer vector was constructed.
  • This plasmid was introduced into CEF cells infected with the recombinant vaccinia virus Dls strain expressing ⁇ -galactosidase by electroporation in exactly the same manner as in Example 1, and white plaques were selected on X-gal agar medium.
  • a recombinant virus strain rVV-Dls-SIV gag was obtained.
  • the pathogenic chimeric virus SHIV C21 10TCID was inoculated, and CD4 positive lymphocytes in peripheral blood were measured.
  • the monkeys in the control group significantly reduced the number of CD4 + lymphocytes within 2 weeks after administration of the pathogenic virus, whereas the monkeys in the rVV-Dls-SIV gag was found to inhibit the reduction of CD4 positive lymphocytes by 70-95%.
  • the plasma viral RNA copy number at the set point was reduced to 1/50 to 1/100.
  • the recombinant virus vaccine of the present invention has antigen-specific immunity induction and infection protective ability.
  • the recombinant vaccinia virus strain Dls provided by the present invention can induce both humoral and cellular immunity against a foreign polypeptide, and can easily exchange a foreign polypeptide for another polypeptide by a gene recombination technique. Because it is possible, it is useful as a vector for a recombinant virus vaccine against various infectious diseases.
  • recombinant viruses cannot be propagated in normal animal cells, but express antigens to exert immunogenicity (cellular immunity and ability to induce antibody production), and are simple to culture and can be produced at low cost.

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Description

明細書
遠伝子組換えワクシニアウィルスワクチン
技術分野 この出願の発明は、 遺伝子組換えワクシニアウィルスワクチンに関するものである。 さらに詳しくは、 この出願の発明は、 ヒ卜または動物の様々な感染症等に対するウィル スワクチンと、 このワクチンの有効成分である遺伝子組換えワクシニアウィルス Dls 株 に関するものである。
背景技術 この十数年来の遺伝子組換え技術の開発、 向上に伴い、 ウィルスや細菌などの微生物 を遺伝子組換えにより改変して、 様々な感染症や癌の予防および治療に対するワクチン ベクターとして応用しょうという研究が盛んに行われて来ている。 ポリオウイルス、 ィ ンフルェンザウィルス、 ライノウィルス、 水痘ウィルス、 サルモネラ菌、 牛型結核菌弱 毒 BCG株、 リステリア菌など様々な微生物が研究に用いられて来たが、 中でも最も古い 歴史を持つのがワクシニアウィルスである。 ワクシニアウィルスは天然痘のワクチンとして利用され、 その撲滅に大いに貢献して きた。 このウィルスは poxviridaeに属する大型の DNAウィルスであり、 ゲノムとして約 190kbp の線状二本鎖 DNAを持ち、 約 200種類の蛋白質をコードしている。 1982年、 Panicali and Paoletti (Proc. Natl. Acad. Scl. USA 79:4927, 1982) および Mackett ら (Proc. Natl. Acad. Scl. USA 79:7415, 1982) は、 ワクシニアウィルス遺伝子に単純ヘル ぺスウィルスのサイミジンカイネース （TK) 遠伝子を組み込んで発現させることが出来 ることを初めて報告した。 その後、 数多くの組換えワクシニアウィルスが作製され、 免 疫学的解析やワクチンへの応用が検討されてきたが、 組換えに用いられた親株の毒性に より、 人では脳炎を起こす可能性があること、 復帰突然変異によりウィルスが強毒化す る虞れがあることなどが指摘され、 安全性の観点から、 人のワクチン、 特にエイズなど 免疫不全を伴う疾患に対するワクチンとしての実用化は困難であった。 一方、 ワクシニアウィルス Dls 株は、 安全な天然痘ワクチン開発を目的として、 ワク シニアウィルス大連株 （DEI 株） を鶏卵胚にて継代培養することによって分離された高 度に弱毒化されたワクシニアウィルス株である （Nature 192:381 , 1961 ) 。 この Dls 株 は、 ニヮトリ胎児初代培養細胞 （DEF) では増殖するが、 他の哺乳動物細胞ではほとん ど増殖しないという特異な性質を持っている。 当時、 同時に開発された LC16 株と共に 臨床試行され、 日本の小児 200 人に播種された成績があるが、 人の細胞での増殖力がな いため、 天然痘ワクチンとしては免疫誘導能が弱く、 免疫誘導に優れた LC16 株の方が 天然痘ワクチンとして採用された経緯がある。 また、 別の弱毒化ワクシニアウィルスとして、 MVA (vaccinia virus strain Ankara) Zur Beurteilung der MVA-Stufenimpfung bei Pockenerstrimpfungen. Med, Diss. Munchen, 1976) および NYVAC (vaccinia virus strain New York) (Virology 188:217- 232) が報告されている。 特に、 MVA はヒ卜に接種すると天然痘に対するワクチンとし て使用できることが示唆されており、 また CV-1 や BHK-16 等の哺乳動物由来細胞株で 増殖し、 弱毒化ウィルスとして種々の組換えワクチン作製めためのベクターとして使用 されている。 ただし、 前記の弱毒化ワクシニアウィルス Dls 株は、 哺乳動物細胞では全 く増殖せず、 ヒ卜に接種してもワクチン効果を示さないという点において、 MVA 株や NYVAC株等の弱毒株とは異なっている。 この出願の発明者らは、 この Dls 株のゲノムに外来遺伝子を組み込むことに成功し、 この組換え Dls 株が動物細胞用のウィルスベクターとして利用可能であることを実証し た。 しかしながら、 前記のとおり、 Dls 株は免疫誘導能が弱いため、 外来の抗原性タン パク質を発現するように遺伝子組換えした Dls 株をワクチンとして使用したとしても効 果は期待できないであろうと考えられていた。
発明の開示 前記のとおり、 ワクシニアウィルス Dls 株は、 細胞傷害性が低いことから、 人での安 全性に関しては他の株より優れていることが容易に推測されるにも係わらず、 免疫誘導 能が弱いために、 組換えウィルスワクチンとしての利用は考慮されていなかった。 これ に対して、 この出願の発明者らは、 ワクシニアウィルス Dls 株に外来遺伝子を導入、 発 現させ、 動物実験で外来遺伝子産物に対する液性並びに細胞性免疫反応を誘導すること ができることを見出した。 また、 ワクシニアウィルス Dls 株は、 動物細胞では増殖しないため、 有用タンパク質 等の発現ベクターとしては不適切であると考えられてきた。 しかしながら、 この出願の 発明者らは、 このワクシニアウィルス Dls 株が、 細胞傷害性の低さによって宿主細胞を 長期間生存させ、 その結果、 タンパク質を大量発現させるためのベクターとして有望で あることを見出した。 この出願は、 発明者らによるこのような新規な知見に基づいてなされたものであって、 安全性の高い遺伝子組換えワクシニアウィルスワクチンを提供することを課題としてい る。 また、 この出願は、 このワクチンの有効成分である遺伝子組換えワクシニアウィルス Dls株を提供することを課題としている。 さらにこの出願は、 レポーター分子を発現し、 組換えウィルス株の作成に利用できる 遺伝子組換えワクシニアウィルス Dls株を提供することを課題としてもいる。 さらにまた、 この出願は、 ワクシニアウィルス Dls 株をベクターして利用する方法を 提供することを課題としてもいる。 この出願は、 前記の課題を解決するものとして、 以下の (1 )〜(19)の発明を提供する。
(1) 外来性の 性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを ¾fe体 DMAの非必^ I伝 域に 保有し、 その 性タンパク質を発現する遺伝子繊ぇワクシニアウィルス Dls株を有効成分とす るワクシニアウィルスワクチン。
(2) お源性タンパク質がヒ卜^不全ウィルス由来である前記発明 (1)のワクチン。 (3) ヒト敏不全ウィルスの fetJ 性タンパク質が gag遺伝子 ¾¾reある編 明 (2)のワクチン。
(4) 性夕ンパク質がサル 不全ウィルス由来である廳 明 (1)のワクチン。 (5) サル敏不全ウィルスの ί¾ 性夕ンパクが gag遺 翻である ΙϋΙ5¾明 (4)のワクチン。
(6) 外来性の抗原性夕ンパク質をコ一ドするポリヌクレオチドを染色体 DNAの非必須遺伝子領域に 保有し、 その 性タンパク質を発現する遺伝 跑えワクシニアウィルス Dl s (7) * ^性タンパク質がヒ卜 ^不全ウィルス由来である前記発明 (6)の遺伝子繊えワクシニア ウィルス Dl s
(8) ヒ卜^不全ウィルスの 性夕ンパク質が gag遺伝子 «ある IS発明 (7)の遺伝 えワクシニアウィルス Dl s ¾
(9) 性夕ンパク質がサル 不全ウィルス由来である前雲 E¾明 (6)の遺伝子繊ぇワクシニア ウィルス Dl s
(10) サル敏不全ウィルスの 性夕ンパク質が gag遺伝子 i¾rC'ある Ι ϊΕ^明 (9)の遺伝 えワクシニアウィルス Dl s ¾
(11) ¾fe体 DNAの非必^ I伝子領 サイミジンカイネース遺伝 ^域である ΙίίΙΞ^明 (6)から (10)のいずれかの遺伝 えワクシニアウィルス Dls (12) ^fe体 DNAの非必^ 、 親株と！： した驗にワクシニアウィルス Dl s株おいて 欠損している^体 DNA領域に挿入されている前言 明 (6)から (10)のいずれかの遺伝子 «えワク シニアウィルス。
(13) レポーター分子をコードするポリヌクレオチドを染色体 DNAに保有し、 レポーター分子を発 現する遺伝 臓えワクシニアウィルス Dls ¾
(14) レポ一ター分子が、 緑色蛍光タンパク質または 菌 ガラクトシダーゼである前記発明 (13)の遺伝 鹏えワクシニアウィルス Dls
(15) ^fe体 DNAの非必 $Iit伝 'サイミジンカイネース遺伝子領^ある前記発明 (13)また は (14)の遺伝 えワクシニアウィルス Dl s ^
(16) 体 DNAの非必^ I伝子領 、 親株と]: した齢にワクシニアウィルス Dls株おいて 欠損している ¾fe体 DNA領域に挿入されている前記発明 (13)または (14)の遺伝 ϊ ^えワクシニア ウィルス Dl s (17) ワクシニアウィルス D I s株の 体 DNAの非必 $髓伝子領域に外来性夕ンパク質をコードす るポリヌクレ才チドを組み込み、 外来性タンパク質を宿主細胞内で大量発現することを特徴とする タンパク質発現方法。
(18) ¾fe体 DNAの非必 $131伝子領 サイミジンカイネース遺伝子領域である前言 明 (17)のタ ンパク質発現方法。
(19) ¾fe体 DNAの非必^ 1伝子領 、 親株と it^した場合にワクシニアウィルス Dl s株おいて 欠損している ^fe体 DNA領 ある前記発明 (17)のタンパク質発現方法。
図面の簡単な説明 図 1 は、 HIV gag 遺伝子を Dls 株ゲノムに導入するための卜ランスファーベクター構 築のス卜ラテジ一を示す。 図 2は、 HIV gag遺伝子を導入した組換えワクシニア Dls株が感染した CEF細胞抽出 液中の gag抗原の発現を、 ウエスタンブロッ卜で解析した結果を示す。 レーン 1 は rVV- Dls-LacZ、 レーン 2は rVV-Dls-aagaBmの結果である。 図 3は、 この発明の組換えワクシニアウィルス Dis 株の CV-1 細胞に対する感染性を 調べた結果を示す。
差替え用紙 （規則 26) - - ·, '
図 4は、 この発明の組換えワクシニアウィルス Dis 株の各動物細胞における外来遺伝 子発現能を調べた結果を示す。 図 5は、 rVV-Dls gagB によるマウスでの HIV gag 特異的な CTL 誘導を調べた CTL assayの結果を示す。 図 6は、 同じくマウスでの抗 HIV gag抗体産生誘導能を調べたウェスタンプロッ卜の 結果を示す。 レーン 1 は陽性コントロール （HIV-1 感染ヒ卜血清） 、 レーン 2は正常 BALB/cマウス血清、 レーン 3は rVV-Dls-gagB免疫 BALB/cマウス血清 （免疫後 12週 目） の結果である。 図 7は、 この発明の組換えワクシニアウィルス Dls株 （rVV-Dls-SIV gag) を免疫した 力二クイザル （△、 〇、 圏） と、 非免疫サル （參） における病原性ウィルス SHIV C21 投与後の CD4陽性リンパ球の経時的変化を示す。
発明を実施するための最良の形態 この出願の発明（1 )〜(5)のワクチンは、 発明 (6)~(10)の遺伝子組換えワクシニアウィル ス Dls 株を有効成分とする高度弱毒化生ワクチンである。 発明 (6)の遺伝子組換えワクシ ニァウィルス Dls 株は、 ワクシニアウィルス由来の遺伝子プロモーター配列の下流に、 外来性の （すなわち、 ワクシニアウィルス以外の） 任意の抗原性タンパク質をコードす るポリヌクレオチドを連結した卜ランスファーべクタ一と Dls株ゲノム DNAとの相同組 換えにより得られた組換えウィルスである。 なお、 以下の記載では、 外来性の抗原性夕 ンパク質を I"外来ポリペプチド」 、 これをコードするポリヌクレオチドを Γ外来ポリヌ クレオチド」 と記載することがある。 卜ランスファーベクターに組み込まれるプロモータ一配列としては、 ワクシニアウイ ルス自身の遺伝子にコードされた RNAポリメラ一ゼにより認識されるものであれば如何 なるものでも使用できる。 例えばワクシニアウィルスゲノムの invarted tarminal repeat 内にある 7.5kD ポリペプチド遺伝子のプロモーター p7.5 を用いることができる (Stunnenberg, H.G. et al. Nucleic Acids Res, 16,2431 , 1988) 。
差替え用紙（規則 2β》 6/ 1
外来ポリヌクレオチドは、 ワクシニアウィルス以外の抗原性タンパク質をコードする ポリヌクレオチド （例えば、 cDNA断片） であり、 外来ポリペプチドは生体内で抗原抗
差替え用紙（規則 26》 体反応を惹起するものであてば如何なるものであってもよい。 具体的にはヒ卜後天性免 疫不全症候群 （AIDS) の原因ウィルスであるヒ卜免疫不全ウィルス （HIV) の gag 前駆 体 p55タンパク質、 envタンパク質 gp120または gp160、 pol前駆体タンパク質、 nef 夕 ンパク質、 tatタンパク質、 またはサル免疫不全ウィルス （SIV) の gag前駆体タンパク 質等も対象とすることができる。 また、 その他の病原体 （他の病原性ウィルスや細菌） 、 あるいは癌細胞の抗原タンパク質をコードするポリヌクレオチド等を用いることもでき る。 外来ポリヌクレオチドの取得方法としては、 外来ポリペプチドをコードするゲノム違 伝子またはその cDNA がクローン化されたプラスミドからその実質的な配列であるポリ ヌクレオチドを適当な制限酵素で切り出すか、 適当な配列のプライマーを用いた polymerase chain reaction (PCR) により増幅すればよい。 クローン化されていない場 合は、 その遺伝子を持つ細菌、 動物のゲノム DNAを、 ウィルスの場合はウィルスが感染 した動物細胞由来の DNAまたは RNAを錶型として、 上記 PCR法により DNAを増幅す ることにより得ることができる。 このようにして取得した外来ポリヌクレオチドと前記のプロモーターとを、 互いの翻 訳枠を一致させて連結し、 この融合ポリヌクレオチド （以下、 「発現ユニット」 と記載 することがある） を任意のプラスミドベクターに挿入結合することによって、 卜ランス ファーベクターを作成することができる。 次に、 相同組換えにょリ外来ポリヌクレオチドをワクシニアウィルスゲノムに導入す る方法について説明する。 まず、 ワクシニアウィルスゲノム DNAは、 ショ糖密度勾配法 (Joklik, W.K. Virology 18, 9, 1962) で精製したウィルス粒子から L-laurylsarucosineを 用いて抽出することができる （[Mackett, M. and Archard, L.C.J. Gen, Virol. 45, 683, 1979) 。 次に抽出したゲノム DNA の中で、 相同組換えを起こす位置として、 ワクシニ ァウィルス自身の複製に影響を及ぼさない非必須遺伝子領域を選択する必要がある。 非必須遺伝子領域の第一の候捕はサイミジンカイネース （TK) 遺伝子領域である。 こ の場合には、 TK遺伝子の領域を p U C 18等のプラスミドベクターに組み込み、 その領域 内のユニークな制限酵素サイ卜を利用して、 発現ュニッ卜を挿入結合したものを卜ラン スファーべクタ一として用い、 ワクシニアウィルスゲノム中の TK 遺伝子との相同組換 えにより外来ポリヌクレオチドをウィルスゲノムに挿入することができる。 相同組換え 後、 TK欠損細胞株中で組換えウィルスを作らせ、 プロモデォキシゥリジン存在下で培養 することによリ TKを発現していない組換えウィルスを選択することができる。 非必須遺伝子領域の第二の候補は、 Dls株のゲノム遺伝子欠損領域である。 Dls株のゲ ノ厶 DNAの制限酵素切断パターンを親株の D I E株と比較することにより、 ゲノムのど の領域に欠損があるかを調べることができる。 その領域は Dls 株の複製には基本的には 不必要である。 欠損領域前後の領域の DNAを PpR法で増幅した後、 プラスミドベクタ 一に組み込み、 その DNA内のユニークな制限酵素サイ卜に発現ュニッ卜を挿入結合した ものを卜ランスファーべクタ一として用い、 Dls株ゲノム DNAと相同組換えを起こさせ ることにより、 欠損領域に発現ユニットを挿入することができる。 ただこの方法では、 組換えウィルスの選択が困難である。 そこで先ず、 レポ一夕一分子をコードするポリヌ クレオチドをゲノム遺伝子欠損領域に挿入して組換えウィルスを作成する。 レポーター 分子としては、 iS—ガラク卜シダーゼなどの細菌由来の発色酵素や、 緑色蛍光タンパク 質 (green fluorescence protein, GFP)またはその誘導体 （例えば、 EGFP) 等を利用する ことができる。 例えば、 ）3—ガラクトシダーゼを発現する組換えウィルスの場合は、 培 地中に X-gal (5-ブロモ -4-クロ口- 3-インドリル- j8 -D-ガラク 卜ピラノシド） を加えるこ とにより、 —ガラク卜シダーゼを発現しているウィルスによるプラーク （青色） を選 択する。 GFP またはその誘導体の場合は、 蛍光顕微鏡下で蛍光を発しているプラークを 選択することができる。 そして、 このレポーター分子発現ウィルスを親株として、 レポ 一ター分子を挿入した領域に目的の外来ポリヌクレオチドを相同組換えする。 これによ つて、 レポーター分子を発現しないウィルスを選択することによりゲノム遺伝子欠損領 域に外来ポリヌクレオチドが相同組換えされた組換えウィルスを得ることができる。 得られた組換えウィルスはクローニングにより単一のクローンにまで純化し、 PCR 法 等により組み込んだ遺伝子の有無を確認した後、 ウィルスに感染した CEF細胞の超音波 破砕による抽出液を用いて、 組み込んだ外来ポリペプチドに対するモノクローナルまた はホリクローナ レ几体によるウェスタンプロッ 卜法や enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA法） などにより、 外来ポリヌクレオチドの感染細胞内での発現を確認する ことができる。 得られた組換えウィルスは CEF細胞で培養後、 ショ糖密度勾配法により部分精製し、 動物実験に用いることができる。 動物実験にはマウスの他ゥサギやサルを用いることが できる。 例えばマウスでの液性免疫応答は、 組換えウィルスを静脈内、 筋肉内あるいは 腹腔内等に接種し、 血清中の目的の外来ポリペプチドに対する抗体価を経時的にウェス タンプロッ卜法や ELISA法により測定することで解析できる。 またマウスでの細胞性免 疫応答は、 まず第一に、 組換えウィルス接種後、 経時的に採取した血液中に含まれるリ ンパ球を、 試験官内で目的の外来ポリペプチド抗原で刺激し、 卜リチウムチミジンのリ ンパ球への取込みを測定することにより解析できる。 第二に、 外来ポリペプチド抗原特 異的な細胞傷害性 T 細胞 （CTL) は、 組換えウィルス接種後、 一定期間経過したマウス の脾臓を採取し、 これをすリ溃して得られた脾細胞を、 外来ポリペプチド中の CTLェピ 卜一プに対応する合成ペプチドにより一定期間試験官内で刺激してエフェクター細胞と する。 一方、 同系マウスの細胞株に同じ組換えワクシニアウィルスを感染させるか、 CTL ェピトープと同定されたペプチド抗原と共に培養した細胞株を 51 Cr でラベルして ターゲッ卜細胞とする。 エフェクター細胞とターゲッ卜細胞を比率を変えて反応させ、 培養上清に放出された 51 Cr の放射能を測定することにより、 免疫マウス脾細胞中の CTL活性の有無を調べることができる。 この出願の発明（17)~(19)は、 ワクシニアウィルス Dls株を用いて有用タンパク質等の 外来ポリヌクレオチドを大量発現する方法である。 すなわち、 ワクシニアウィルス Dls 株は、 挿入する外来ポリヌクレオチドの長さや構造等に関係なく、 広範なポリヌクレオ チドを挿入することが可能である。 しかも極めて安全に取り扱うことが可能である。 蛋白質発現用ウィルスベクターとしての組換えワクシニアウィルス Dls 株は、 任意の 外来ポリヌクレオチドを対象として、 前記のワクチン用組換えウィルス Dls 株と同様の 方法で作成することができる。 そして、 この Dls株ウィルスベクターは、 CEF細胞、 マ ウス由来の P813 細胞や線維芽細胞等に常法により 卜ランスフエクシヨンし、 このトラ ンスフェクタン卜細胞を培養することによって、 組み込まれた外来ポリヌクレオチドに コードされたタンパク質を長期間に渡って大量に発現することができる。 例えば、 この 出願の発明者らの研究によれば、 10 pfu の澳度で組換えワクシニアウィルス Dls株を細 胞に 1 時間作用させると、 6~ 12 時間後に組換えタンパク質の顕著な発現が認められた。 しかも、 トランスフエクタント細胞は長期間に渡って生存し、 タンパク質を発現し続け た。 1 0
実施例 以下、 実施例を示してこの出願の発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、 この出 願の発明は以下の例に限定されるものではない。
実施例 1
組換えワクシニアウィルス Dls株の作製
Dls株を用いて組換えワクシニアウィルスを作製する上で、 まず Dls株ゲノムのどの 位置に欠失があるかを検討した。 親株の DEI株および Dls株ゲノム DNAを、 Hindlllで 消化してできる断片をァガロースゲル電気泳動で比較した所、 Aから P まで （大きさの 順） の 16種の断片のうち、 N断片 (1.5kbp)と M断片 (2.2kbp)が消失し、 C断片 (25.1 kbp) と K断片 (4.6kbp)の長さが短くなつておリ、 C断片の 3'側から K断片のほとんどを含む 15.4kbpの領域が欠損していることが判った。 そこで Dls株の欠失を持つ C断片と K断 片、 および K断片の 3'側で接している F断片 (13.5Ι ρ)の 5'側を含む領域約 1.9kbpを PCRで増幅して PCR2.1 TA cloning vector(lnvitrogen社製）にクローニングした。 PCR プライマーは Vac H-C (配列番号 1のオリゴヌクレオチド） と Vac H-F (配列番号 2の オリゴヌクレオチド） である。
このプラスミドから、 増幅した領域を含む EcoRI 斬片を切り出し、 pUC19 の EcoRI site にサブクローニングし、 pUC-Dls ベクターを得た。 このベクターの Dls 断片中に Hindlll siteが 1ケ所存在するので、 この siteを利用して、 ワクシニアウィルス後期プロ モーター p1 1 の下流に大腸菌の J3—ガラクトシダーゼ遺伝子 （LacZ) のオープンリーデ イングフレームを含む DNA 断片をサブローニングして卜ランスファーベクター pUC- Dls-LacZとした。
ワクシニアウィルス Dls株約 105 pfu (プラーク形成ュニッ卜） を含む 500 Iのウイ ルス液を CEF細胞 （直径 6 cmのシャーレ） に播き、 15分ごとにシャーレを 4回、 軽く 振盪した。 1 時間後、 2.5mlの 1 % FBS/MEM培地を加え、 6時間、 37°C、 5% CO2条件 下にて培養した。 培地を取り除き PBS (phosphate buffered saline) で 2回洗浄した後、 トリプシン— EDTA溶液 （G旧 CO社製） で細胞を遊離、 回収後、 最終的には 400 の PBSに再懸濁した。 この細胞懸濁液に上記卜ランスファーベクター pUC-Dls-LacZ 20 t g を溶かし、 0.4cmキュぺッ卜中、 250 V、 500 /i FDで 1 回電圧をかけ、 電気穿孔法を行 P T/JP01/10141
1 1
つた （BioRad製 Gene Puisar II使用） 。 細胞を室温で 15分以上放置した後、 シャーレ に播き 4 日間培養した。 細胞を遊離、 培養液とともに回収し、 10、 100、 1000倍希釈し、 同様に CEF細胞に継代感染させた。 4日後 CPEが観察されたら培地を取り除き X-gal添 加寒天培地 （4 倍溏縮 MEM 培地 25ml、 蒸留水 20.7ml、 7.5% NaHC03 3mk 2.92% L-gultamine 1.0mし 2% X-gal 0.2mし 30mg/ml 硫酸カナマイシン 0.1mし 2.4% Agar Noble 50.0ml) を加え 4時間後、 青く発色した CPE部分の寒天をパスツールピペットで ピックアップし、 500 | の上記と同じ培地に回収した。 超音波破砕機にて寒天を細分化 し、 同様に CEF細胞に継代感染させた。 以後同じ操作を繰り返し、 1 つのシャーレ上で の CPEがすべて青色になるまでクローニングを行った。
次に、 同様の卜ランスファーベクターの Hindlll site に、 ワクシニアウィルス p7.5 プ 口モーターの下流に HIV subtype Bの gag前駆体タンパク質遺伝子を転結した発現ュニ ッ卜を挿入した。 構築の概略を図 1 に示す。 具体的にはまず、 subtype B の HIV 分子ク ローン pNL432 (Adachi, A. et al. J. Virol. 59， 284， 1986) を、 制限酵素 BssHIと Hindi で完全に消化して得られる約 1.8kbの断片を Klenow fragmentを用いて平滑末端化した。 この断片を、 プラスミド pAK2より切り出した p7.5プロモーター断片を pUC18の Pstl- Xbal sitesに挿入したプラスミド pUC-VVp7.5Hの BamHI-Smal sitesにサブクロ一ニン グして、 pVV7.5-gagBを得た。 このプラスミドを Hindlllで部分消化し、 約 2.18kbpの断 片を 1 %ァガロースゲル電気泳動で分離、 精製した後、 トランスファーベクター pUC- Dlsの Hindlll siteにサブクローニングして、 目的のベクター pUC-Dls-gagBを得た。
既に作製した i8—ガラク トシダーゼを発現する組換えワクシニアウィルス Dls 株 (rVV-Dls-LacZ) 約 105 pfuを.含む 500 /i lのウィルス液を同様に CEF細胞に感染させ、 卜リブシン一 EDTA溶液で細胞を遊離、 回収後、 最終的には 400 μ Iの PBSに再懸濁し た。 この細胞懸濁液に上記卜ランスファーベクター pUC-Dls-gagB (20 ii g) を溶かし、 全く同じ条件で電気穿孔法を行った。 細胞を室温で 15分以上放置した後、 シャーレに播 き 4 日間培養した。 細胞を遊離、 培養液とともに回収し、 10、 100、 1000倍希釈し、 同 様に CEF細胞に継代感染させた。 4日後 CPEが観察されたら培地を取リ除き、 X-gal添 加寒天培地を加え 4時間後、 青く発色していない白色の CPE部分の寒天をパスツールピ ペットを用いて、 500 1 の上記と同じ培地に回収した。 超音波破砕機にて寒天を細分化 し、 同様に CEF細胞に継代感染させた。 以後同じ操作を繰り返し、 1 つのシャーレ上で の CPEがすべて発色しなくなるまでクローニングを行った。
得られた組換えウィルスに HIV gag遺伝子が挿入されているかどうかを、 PCR法で確 認した。 プライマーは、 subtype Bおよび Eに汎用の SK38 (配列番号 3のオリゴヌクレ 1 2
ォチド ：位置 1551-1578) および SK89 (配列番号 4のオリゴヌクレオチド ：位置 1638- 1665) を用いた。
得られた白色プラークからの組換えウィルス 5株はすべて 1 14bpの DNAを増幅し、 HIV gag遺伝子が挿入されていることが確認された。
次に、 これらの組換えウィルスが感染した CEF細胞での HIV gag抗原の発現を調べた。 図 2は、 感染細胞の超音波破砕抽出液を SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離 し、 抗 gagモノクローナル抗体 (Matsuo.K.et al. J. Gen. Virol, 73, 2445, 1992) を用い たウエスタンプロット解析を行った結果である。 5株中 1株で gag前駆体 p55タンパク 質と思われる特異的なバンドが認められ （全ての株で挿入したタンパク質の分解産物は 存在した） 、 この組換えウィルスが、 gag 抗原を発現していることが確認された。 この 株を rVV-Dls-gagBと命名した。
実施例 2
HIV-1 gag遺伝子を発現する組換えワクシニアウィルス Dls株の
部分精製とウィルス量の測定 rVV-Dls-gagB を CEF 細胞に感染させ （5 枚の直径 10cm のシャーレ上で） 1 % PBS/MEM培地 10ml中、 37°C、 5% C02存在下で培養した。 2— 4 日後、 CPEが観察さ れた時点で培地を除き、 10mM Tris-HCI(pH8.0) 15ml で細胞を壊した後、 物理的に遊離、 回収し、 超音波破砕により細胞片に付着したウィルスを遊離させた。 3000rpm で 20 分 間遠心した後、 その上清をさらに 13000rpmで 90分間遠心して、 ウィルスを沈殿させる 10mM Tris-HCI buffer 8ml にウィルス塊を溶かし、 36%シユークロース溶液 3mlを静か に加えて、 再度 13000rpmで 90分間遠心分離した。 得られたペレツトを 1 ml の 10mM Tris-HCI buffer に溶かし、 部分精製ウィルス液とした。 このウィルス液を段階希釈し、 CEF細胞におけるウィルス量を測定した結果、 1 mlあたり 101Q pfuであった。
実施例 3
組換えワクシニアウィルス Dls株の増殖能の検討 哺乳動物由来の各種細胞株を 48穴プレー卜上で単層培養し、 実施例 1で作成した組換 1 3
えウィルス株 rVV-Dis-LacZ 105 pfuを感染させた。 37°Cで 1 時間放置した後、 各細胞を PBSで洗浄し、 新鮮培地中で 37°Cでインキュベートした。 吸収 （absorption) 後の 0時 間と 48 時間でそれぞれ細胞を回収し、 凍結—融解させ、 超音波処理し、 48 時間時点で のウィルス量を 0 時間時点でのウィルス量で除することによってウィルス増殖の程度を 計測した。 結果を表 1 に示す。 表 1 において、 HeLaはヒ卜由来細胞株、 CV-1 はァフリ 力ミドリザル細胞株、 RK はゥサギ腎細胞株、 CHO はチャイニーズ八厶スター卵巣細胞 株である。 表 1 から明らかなように、 親株 （DEI) は CEF 細胞で最も活発に増殖し、 CHOを除く他の哺乳動物細胞でもある程度増殖するのに対し、 組換えウィルス Dls株は、 CEF細胞以外の哺乳動物では全く増殖しないことが確認された。 表 1
Figure imgf000015_0001
次に、 実施例 1で作成した組換えワクシニアウィルス rVV-Dls-gagBの 2.0moiを CV-1 細胞とともに 37 Cで 1 時間インキュベートし、 2 日間培養した。 また親株 （DEI ) o.l moiを同様に CV-1細胞に感染させ、 4日間培養した。 培養後、 各細胞を 0.125%トリ プシン一 EDTA溶液を用いて回収し、 細胞溶解液を調製した。 この溶解液を 10 日齢の卵 に摂取し、 各ウィルスの感染性力価を測定した。
結果は図 3に示したとおりである。 ワクシニアウィルス親株 D曰は、 CV-1細胞に対し て感染性を示すのに対し、 この発明の組換えウィルス Dls 株は、 全く感染性を示さない ことが確認された。
実施例 4
組換えワクシニアウイルス Dls株の外来逮伝子発現能の検討 バクテリオファージ T7ポリメラ一ゼを発現する組換え Dls株を実施例 1 と同様にして 作成し、 文献 (Virology 231 :192-200, 1997; Virology 250:140-150, 1998 ) 記載された 方法に基づき、 レポーター遺伝子 pT7Lucおよび pT7EMCLucを用いて組換え Dls株の T7 ポリメラーゼ活性 （発現量） を測定した。 すなわち、 哺乳動物由来の各種細胞株を 1 4
48穴プレー卜上で単層培養し、 Dls株または組換えワクシニアウィルス rDls-T7polをそ れぞれ 2moiの濃度で感染させた。 また、 コントロールとして、 同じく T7ポリメラ一ゼ を発現するアデノウイルス rAdexCAT7を 20moiの濃度で感染させた。 24時間後、 1 のレポータープラスミド pAcT7Lucまたは pAcT7EMCLucを各細胞に卜ランスフエクシ ヨンした。 ルシフェラ一ゼ活性は、 アツセィキット Pica Gene (Tokyo Ink社） を用いて 測定した。 細胞は、 卜ランスフエクシヨンの 24時間後に回収し、 PBSで 2 回洗浄し、 100 ^ 1 の細胞溶解バッファ一 LUC/PGC-50 (Tokyo Inksha) で溶解した。 次いで、 20 Ι の透明細胞溶解液を、 100 Ιの反応溶液 （137mM NaCk 2.7mM KCし 4.3mM Na2HP04、 1.4mM KH2P0 20mM Tricine、 1.07mM (MgC03)4Mg(OH)2■ 5H20、 2.67mM MgS04、 o.1 mM EDTA、 33.3mM DTT、 270 M Coenzyme A、 470 /i M ルシフェリン、 530 w M ATP 含有） と共にインキュベー トした。 相対的光度ユニッ ト （RLU ) は光度計 (Berthold社） を用いて計測した。
結果は図 4に示したとおりである。 図 4において、 BHK はハムスター幼仔細胞株、 HepG2はヒト由来細胞株である。 組換えワクシニアウィルス rDls-T7polは、 実施例 3に 示したように、 哺乳動物細胞における増殖能はないにも係わらず、 哺乳細胞内において アデノウイルスと同程度に外来遠伝子を発現することが確認された。 以上の結果から、 この発明の組換えワクシニアウィルス Dls 株は、 ワクチン成分として使用した場合、 不 必要に増殖することなく、 しかも抗体の生成に必要な抗原タンパク質を発現可能である ことが確認された。 このような優れた特徴は、 特に AIDS 等の免疫不全患者を対象とし たワクシニアウィルスワクチンとして好ましい。
実施例 5
HIV-1 gag遺伝子を発現する組換えワクシニアウィルス Dls株を接種した
マウスでの HIV-1 gag抗原に対する細胞性免疫誘導能の解析 rVV-Dls-gagBを BALB/cマウス 1 匹当たり 107 pfu静脈内に接種し、 2、 6、 8、 12週 目に経時的に脾臓を採取した。 孔径 70 /i mの cell strainer(Becton Dickinson製)内にて、 PBS中ですり潰した脾細胞を、 15mlの遠心管に移して遠心分離した後、 細胞のペレツ卜 に ACK buffer (重炭酸力リウ厶 1.0mM、 塩化アンモニゥ厶 0.15M、 EDTA 2Na 0.1 mM 水溶液） 5mlを加え、 マイルドに混和して溶血させた。 PBS 10mlを加えて遠心後、 ペレ ッ卜を PBS 10mlで 2回洗浄した。 ペレツ卜を 5 X 1 CT5 Mの 2—メルカプトエタノールを 1
1 5
含む 10% FBS/RPMI1640 培地 （ （株） 日研生物医学研究所） 5ml に懸濁し、 生細胞数 を測定した。 同じ培地で 1 X 107 cells/mlに濃度を調整し、 2種類の gagェピ ! ^一プぺプ チドの水溶液 （1mg/ml 漉度） をそれぞれが終濃度 10 x g/ml になるように加えて、 37°C、 5日間培養した。 ペプチド （gag B253-277、 および gag B287-309) のアミノ酸配列はそ れぞれ配列番号 5および 6の通りである。
5日後、 再度生細胞数を測定し、 10% FBS/RPMI1640培地で 1 X 107 cells/mlに細胞濃 度を調整してエフェクター細胞とした。
一方 M12.4.5マウス細胞 （H2d八プロタイプ） を 10% FBS/RPMI1640培地で培養し、 80%コンフルェントになった時点で PBSで 1 回洗浄した後、 卜リブシン— EDTA溶液で 細胞を遊離、 回収した。 10% FBS/RPMI1640培地 10mlで懸濁して、 生細胞数をカウン 卜した。 1 X 107 cells分を遠心して回収し、 同様の培地 100 μ Ι に懸濁した。 この溶液に 終濃度がそれぞれ 50 t g/mlになるように上記 2種のペプチド溶液を加えたものと、 ぺプ チドを加えないものを調整し、 37°Cで 3時間インキュベートした。 次に、 51Crでラペル されたクロ厶酸ナトリウム水溶液 (New England Biolab)100ii l (lOOii Ci) を加え、 さら に 1 時間 30分、 37°C、 5% C02条件下でインキュベートした。 10% FBS/RPMI1640培 地で細胞を 3 回洗浄した後、 同じ培地で 1 X 105 cells/ml の濃度に調製し、 ターゲット 細胞とした。
エフェクター細胞とターゲッ卜細胞の比が 100： 1、 50： 1、 25： 1、 12.5： 1 になる ように、 96穴プレー卜中で混合し (total volume 200 At l/well) 、 37°C、 5% C02条件下 で 4時間インキュベートした。 また自然放出 Crと最大放出 Crを測定するため、 ターゲ ッ卜細胞液 100 I にそれぞれ 10% FBS/RPMI1640培地 100 i lまたは 1 % Triton X 100 水溶液 100 Iを加え、 同様に 37°C、 5% C02条件で 4時間インキュベートした。 4時間 後 96 穴プレー卜を遠心して細胞を沈澱させ、 上清 20 At l を取って luma plate(Packard 社製)に移し、 一晚放置して風乾させた。 ガンマ線カウンター （Packard 社製） で放射能 を測定し、 以下の式で CTL活性 （％) を算出した。
CTL活性 （％) = (ターゲット細胞による値一自然放出による値/
最大放出による値一自然放出による値） X 100 結果を図 5に示した。 免疫後 2週目では、 CTL活性は明確でなかったが、 6週目で 2 匹中 1 匹、 8週目では 2匹とも抗 gag CTL活性が検出され、 12週目においても CTし活 性が維持されていることが確認された。 このことから、 rVV-Dls-gagB がマウスで CTL 誘導能を持つことが明らかとなつた。 1 6
実施例 6
HIV-1 gag遺伝子を発現する組換えワクシニアウィルス Dls株の接種
によるマウスでの抗 HIV-1 gag抗体産生誘導能の解析 実施例 5で作成した rVV-Dls-gagB 免疫マウスの血液を、 免疫後 2、 6、 8、 12週目で それぞれ採取し、 血清を調製した。 この内 12週目の血清 20 Iを用いて、 HIV抗原をプ ロッ卜したニトロセルロースメンプランフィルタ一 (Genelabs Diagnostics社製ウェス夕 ンプロットキット)を用いて、 反応性を調べた。
結果は図 6に示したとおりである。 免疫群では、 非免疫群では検出されない p55、 p24 および p1 の位置にバンドが検出され、 マウスにおいて、 抗 gag 抗体の発生が誘導され ることが確認された。
実施例 7
GFP誘導体を発現する組換えヮクシニアウィルス Dls株の作成 プラスミド pEGFP-1 (Clontach社製)を EcoRIで消化、 klenow fragment処理で末端平 滑化した DNAをさらに BamHI消化して得られる約 700bpの断片を、 実施例 1 と同様に pUC-VVp7.5Hの BamHI-Smal siteにサブクローニングした後、 Hindlllで ρ7·5プロモー ターと EGFP のオープンリーディングフレームを含む断片を切り出し、 pUC-Dls の Hindlll site に導入して、 卜ランスファーベクターを構築した。 このプラスミドを実施例 1 と全く同じ方法で、 一ガラクトシ一ダーゼを発現する組換えワクシニアウィルス Dls株に感染した CEF 細胞に電気穿孔法で導入し、 X-gal 寒天培地上で白色プラークを 選択することにより、 組換えウィルス株を得た。 このウィルスに感染した CEF細胞は蛍 光顕微鏡下で、 緑色の蛍光を発色することが観察され、 EGFP 蛋白質が発現されること が確認された。
実施例 8
S1V gag遠伝子を発現する組換えワクシニアウイルス Dls株の作成 サル免疫不全ウィルス SIVの遺伝子クローン pKS460を制限酵素 Ndel と Xholで消化 1 7
し、 klenow fragment処理で末端平滑化し、 得られる約 1500bpの断片を、 実施例 1 と同 様に pUC-VVp7.5Hの BamHI-Smal siteにサブクローニングした後、 Hindlllで p7.5プロ モーターと EGFP のオープンリーディングフレームを含む断片を切り出し、 pUC-Dlsの Hindlll site に導入して、 トランスファ一ベクターを構築した。 このプラスミドを実施例 1 と全く同じ方法で、 β —ガラク卜シーダーゼを発現する組換えワクシニアウィルス Dls 株に感染した CEF 細胞に電気穿孔法で導入し、 X-gal 寒天培地上で白色プラークを 選択することにより、 組換えウィルス株 rVV-Dls-SIV gagを得た。
実施例 9
SIV gag遺伝子を発現する組換えワクシニアウィルス Dls株の接種
によるサルでの免疫誘導および免疫防の評価 実施例 8で作成した組換えウィルス rVV-Dls-SIV gag (106 pfu/monkey) を力二クイザ ルに 45 日間隔で 2回、 静脈投与し、 抗体産生、 リンパ球増殖試験、 ELISPOT アツセィ および細胞内サイ 卜力イン産生の解析により免疫誘導の評価を行った。 その結果、 rVV- Dls-SIV gagで免疫した全ての力二クイザルにおいて、 抗 Gag抗体、 Gag特異的なヘル パーおよび CTL活性の誘導が認められた。 一方、 組換えウィルスの投与による異常な所 見は認められなかった。
次に、 rVV-Dls-SIV gag での免疫から 30 日後に、 病原性キメラウィルス SHIV C21 10TCID を接種し、 末梢血中の CD4陽性リンパ球を測定した。 その結果、 図 7に示した ように、 コントロール群のサルが病原性ウィルスの投与から 2週間以内に CD4陽性リン パ球の数を顕著に減少させるのに対し、 rVV-Dls-SIV gag 免疫サルは、 CD4 陽性リンパ 球の減少を 70〜95%も抑制することが確認された。 また、 セットポイントにおける血漿 中ウィルス RNAコピー数を 1/50~1/100に減少させることを確認された。
以上の結果から、 この発明の組換えウィルスワクチンは、 抗原特異的な免疫誘導およ び感染防御能を有することが、 霊長類動物においても確認された。
産業上の利用可能性 以上詳しく説明したとおり、 この出願によって、 ワクシニアウィルス以外の病原体に 1 8
対して高い免疫原性を有する遺伝子組換え弱毒化ワクシニアウィルスワクチンと、 この ワクチンの有効成分である遺伝子組換えワクシニアウィルス Dls 株が提供される。 この 発明によって提供される組換えワクシニアウィルス Dls 株は、 外来ポリプチドに対する 液性および細胞性免疫の両方を誘導することができ、 しかも外来ポリべプチドを遺伝子 組換え技術により容易に他のポリプチドと交換可能なことから、 様々な感染症に対する 組換えウィルスワクチンのベクターとして有用である。 また組換えウィルスは、 通常の 動物細胞では増殖できないが抗原は発現して免疫原性 （細胞性免疫および抗体産生誘導 能） を発揮できること、 培養が簡単で低コス卜で製造できるなどの理由から、 エイズヮ クチン開発などで盛んに用いられている prime and boost法の boost用の安価な抗原と しても用いる事ができる。 従って製造コス卜の高い精製遺伝子組換えタンパク質の代替 抗原として極めて有用である。 さらに、 人に対する安全性が高いので、 C T L活性測定 時にターゲッ卜細胞に感染させる組換えワクシニアウィルス株としても、 実験者への安 全性という観点から有用である。

Claims

1 9 請求の範囲
1 . 外来性の抗原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを染色体 DNAの非必須 遺伝子領域に保有し、 その抗原性タンパク質を発現する遺伝子組換えワクシニアウィル ス Dls株を有効成分とするワクシニアウィルスワクチン。
2 . 抗原性タンパク質がヒ卜免疫不全ウィルス由来である請求項 1 のワクチン。
3 . ヒ卜免疫不全ウィルスの抗原性タンパク質が gag 遺伝子産物である請求項 2のヮ クチン。
4 . 抗原性タンパク質がサル免疫不全ウィルス由来である請求項 1のワクチン。
5 . サル免疫不全ウィルスの抗原性タンパクが gag 遺伝子産物である請求項 4のワク チン。
6 . 外来性の抗原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを染色体 DNAの非必須 遺伝子領域に保有し、 その抗原性タンパク質を発現する遺伝子組換えワクシニアウィル ス Dls株。
7 . 抗原性タンパク質がヒ卜免疫不全ウィルス由来である請求項 6の遺伝子組換えヮ クシニアウィルス Dls株。
8 . " ヒ卜免疫不全ウィルスの抗原性タンパク質が gag 遺伝子産物である請求項 7の遺 伝子組換えワクシニアウィルス Dls株。
9 . 抗原性タンパク質がサル免疫不全ウィルス由来である請求項 6の遺伝子組換えヮ クシニアウィルス Dls株。
1 0 . サル免疫不全ウィルスの抗原性タンパク質が gag 遺伝子産物である請求項 9の 遺伝子組換えワクシニアウィルス Dls株。 20
1 1 . 染色体 DNAの非必須遺伝子領域がサイミジンカイネース遺伝子領域である請求 項 6から 1 0のいずれかの遺伝子組換えワクシニアウィルス Dls株。
1 2 . 染色体 DNAの非必須遺伝子領域が、 親株と比較した場合にワクシニアウィルス Dls株おいて欠損している染色体 DNA領域である請求項 5から 1 0のいずれかの遺伝子 組換えワクシニアウィルス Dls株。
1 3 . レポーター分子をコードするポリヌクレオチドを染色体 DNAの非必須遺伝子領 域に保有し、 レポーター分子を発現する遠伝子組換えワクシニアウィルス Dls株。
1 4 . レポ一ター分子が、 録色蛍光タンパク質または大腸菌 β —ガラク卜シダーゼで ある請求項 1 3の遺伝子組換えワクシニアウィルス Dls株。
1 5 . 染色体 DNAの非必須遺伝子領域がサイミジンカイネース遺伝子領域である請求 項 1 3または 1 4の遺伝子組換えワクシニアウィルス Dls株。
1 6 . 染色体 DNAの非必須遺伝子領域が、 親株と比較した場合にワクシニアウィルス Dls株おいて欠損している染色体 DNA領域である請求項 1 3または 1 4の遺伝子組換え ワクシニアウィルス Dls株。
1 7 . ワクシニアウィルス Dls株の染色体 DNAの非必須遺伝子領域に外来性タンパク 質をコードするポリヌクレオチドを組み込み、 外来性タンパク質を宿主細胞内で大量発 現することを特徴とするタンパク質発現方法。
1 8 . 染色体 DNAの非必須遺伝子領域がサイミジンカイネース遺伝子領域である請求 項 1 7のタンパク質発現方法。
1 9 . 染色体 DNAの非必須遺伝子領域が、 親株と比較した場合にワクシニアウィルス Dls株おいて欠損している染色体 DNA領域である請求項 1 7のタンパク質発現方法。
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