WO2003057913A2 - Procede de detection et/ou d'identification de l'espece animale d'origine de la matiere animale contenue dans un echantillon - Google Patents

Procede de detection et/ou d'identification de l'espece animale d'origine de la matiere animale contenue dans un echantillon Download PDF

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WO2003057913A2
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Sabine Desvarenne
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Bruno Lacroix
Natalia Bello Pigem
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Biomerieux SA
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Definitions

  • the present invention relates to the field of determining an animal species called hereinafter of origin in a sample capable of containing an ingredient, itself obtained from at least said species.
  • the products from which the determination is carried out according to the present invention are for example foodstuffs or foodstuffs intended for man or animals, cosmetic products, and, in general products likely to contain ingredients of animal origin, or on the contrary of the products in which these extracts are prohibited.
  • the identification of animal species present in food may be necessary in many fields of activity.
  • a first reason is to fight against food fraud where certain animal species are replaced by cheaper species, such as the replacement of hare by rabbit.
  • a second reason is public health, as in particular during the epidemic of bovine spongiform encephalitis or BSE, a disease due to the use of meat-and-bone meal of bovine origin for feeding cattle.
  • a third reason is religious in order to verify, for example, the absence of pork in food.
  • a fourth reason is of a legislative nature, notably when verifying the absence of protected species in food.
  • Tissue analysis thus consists in determining the presence in bone meal samples of animal meal.
  • This technique described in particular in the article by Michard, Journal of animal nutrition, vol. 508, pp 43-48, 1997, although sensitive, is tedious and based on the interpretation of an expert. It is therefore difficult to compare from one laboratory to another.
  • soft tissue such as organ meats, serum, blood tissue, gelatin.
  • protein analyzes there are mainly in the literature three groups of methods allowing the identification of animal species present in a given sample.
  • the first group of methods includes protein electrophoresis techniques, which consists in detecting soluble target proteins by specific enzymatic staining.
  • the diagnosis is obtained after electrophoresis on polyacrylamide gel for example.
  • this technique can only be performed with fresh or frozen, unprocessed tissue, since a cooking period of the food is an example of transformation likely to alter proteins. This technique cannot therefore be applied to the detection of animal species present in vegetable meal, which undergo during the baking phases during their manufacture.
  • the second group of methods is based on immunological techniques, by the use of antibodies directed against soluble target proteins.
  • the "Ouchterlony" technique or double immunodiffusion, a method used to differentiate antigens in a mixture, can be used.
  • this technique has the major drawback of involving cross-reactions with the epitopes of other species.
  • ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay
  • the third group of methods includes chromatographic techniques (HPLC) used to characterize soluble muscle proteins.
  • HPLC chromatographic techniques
  • the disadvantages of these three methods are mainly due to their dependence on the characterization of proteins which are heat-sensitive, denature during a period of cooking food, lose their biological activity after the death of the animal, and whose presence is often a function of the type of cells being examined. It is therefore preferable to analyze the DNA directly, rather than the proteins in the sample, to identify the original animal species present in a given sample, the DNA being identical in all cell types of a same animal and stable in comparison with proteins.
  • a third approach therefore consists in analyzing the DNA present in the sample.
  • methods have been found in the literature, based in particular on the use of restriction enzymes or genetic markers, these methods having the advantage of being able to be applied to processed products, in particular after heat treatment.
  • Nucleic determination can use restriction enzymes, or technique called RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism, see in particular Meyer et al, Journal of AOAC International, vol 78 n ° 6, pp 1542-1551, 1995). Restriction enzymes cut DNA, previously extracted from the sample to be analyzed, at specific points in the macromolecule. It then suffices to compare, by simple electrophoresis, the fragments obtained with those of control samples representative of the species to be identified. However, the analysis of the results obtained by this technique is very delicate, in particular when several animal species are present in the sample.
  • RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism
  • Nucleic determination can also consist in sequencing a ubiquitous marker, such as cytochrome B of mitochondrial DNA.
  • Mitochondrial DNA is a known target for this kind of analysis since each mitochondria contains from one to ten molecules of mitochondrial DNA, and each cell contains from a few tens to a few thousand mitochondhes, which makes it possible to work on a very small amount of sample.
  • FINS Formsically Informative Nucleotide Sequencing
  • This method consists in i) isolating the DNA present in a biological sample, ii) amplifying this DNA by PCR by using primers specific for the mitochondrial cytochrome B gene, the primers being chosen from the part of the gene which is highly conserved during evolution and iii) sequencing the amplified DNA segment.
  • the sequence is then used for phylogenetic analysis using a database, allowing the identification of the animal species initially present in the sample. If this method has the advantage of being quick and usable on any type of food (fresh, frozen, transformed ...), it however has the major drawback of not allowing the analysis of mixtures of species, from mixtures of amplified sequences derived from the same ubiquitous polymorphic marker, and thus remains reserved for homogeneous raw materials.
  • the analysis can also consist in amplifying a specific marker for a given species.
  • Lahiff et al Molecular and Cellular Probes, vol.15, pp27-35, 2001
  • PCR Molecular and Cellular Probes
  • a method developed by Colgan S. et al. was also described in 2001 (FOOD Research International, 2001, vol 34, n ° 5, 401-414) for the detection of 4 species in mixture by the use by PCR of specific primers. If this method allows specific and rapid identification of a particular species, it cannot be applied simultaneously to the detection of several species. Successive PCRs are then necessary if one wishes to detect several species.
  • this technique requires having a large number of specific primers if one wants to test a large number of species, which is impractical in practice due to problems of sensitivity and specificity. Finally, if a species is not represented in the set of primers but nevertheless present in the sample to be analyzed, the result will be distorted.
  • the previously described techniques allow the determination without prior knowledge of the species present when the sample comprises only one species, they allow the detection of several species when we have prior knowledge of the species present but, none of the techniques previously described does not allow a determination in the presence of a mixture of several species without prior knowledge of said species present. In addition, most of the techniques previously described when several species are present do not allow a reliable determination when the proportions of the different species are very different in the sample. There is therefore a significant need for a technique which, while remaining generic, can detect one or more species, even present in large numbers in the same sample to be analyzed or in very small quantity, and without prior knowledge of the species present.
  • the unwanted species must be present in quantities greater than 5% or even 1% according to the legislation compared to the normally present species for there to be effectively fraud, which alleviates the performance required for the molecular diagnostic test, it is otherwise in the case of products in which the presence of products of animal origin is prohibited.
  • the technical constraint is important in terms of sensitivity of the method for the most of the material is of plant origin and the addition of animal material varies between 0.1 and 5% w / w.
  • the problem to be solved presents an important complexity.
  • the determination must be possible in blind, that is to say that the sample is likely to contain or not to contain ingredients obtained from one or more animal species and these species of origin are unknown. If the sample contains ingredients obtained from animal species, the species of origin must be determined and are likely to be related, and the determination must be possible by making only one analysis, with one reagent and a single amplification step, without prior predetermination step, for example of the group of species or setting work of batteries of tests allowing for example to classify the reagents by genera or species to avoid for example cross reactions.
  • the Applicant has discovered a set of sequences constituted by the group comprising the sequences SEQ ID Nos 1 to 232, 242 to 261, their sequences respectively complementary, and all homologous sequences, comprising at least 5 contiguous monomers included in the any of said sequences and having at least 70% identity with said any sequence, which allow by the implementation of methods of analysis called molecular biology, the determination of at least one animal species of origin in a sample likely to contain an ingredient obtained from at least the said species.
  • a “determination” is understood to be the identification or the detection or quantitative and / or qualitative analysis of an animal species.
  • an "animal species” is understood to be the simplest category used in the classification of living species or taxonomy. Living species are classified into categories called taxa, the most important taxa are the Kingdom (animal or plant), the Phylum, the Class, the Order, the Family, the Genus, and the Species. Birds, Fishes and Mammals are classes of vertebrate animals.
  • animal species of origin means the animal species, the animal whose tissues, whatever they are, were used as raw material for the preparation of the sample ingredient (s), the product subject to determination according to the present invention.
  • a "molecular biology method” is a method based on the enzymatic amplification of nucleic targets (DNA and / or RNA) in vitro and the use of oligonucleotide probes.
  • sample is any part obtained directly or indirectly from a product, material, material, starting material, itself capable of containing at least one ingredient obtained from at least one so-called animal species.
  • sample to be determined in accordance with the present invention is likely to contain said ingredient of animal origin, from which the animal species or species entered in the composition or constitution of the product, material are identified or detected, or starting material.
  • the starting product can be a biological material, a food or foodstuff, for example based on meat or fish, a cosmetic product, etc.
  • lysis step means a step capable of releasing the nucleic acids contained in the protein and / or lipid envelopes of the microorganisms (such as cellular debris which disturb the subsequent reactions).
  • the lysis methods as described in the applicant's patent applications can be used: WO-A-00/05338 on mixed magnetic and mechanical lysis, WO-A-99/53304 on lysis electric, and
  • purification is meant the separation between the nucleic acids and the other cellular constituents released in the lysis step.
  • This step generally makes it possible to concentrate the nucleic acids.
  • magnetic particles optionally coated with oligonucleotides by adsorption or covalence (see on this subject US-A-4,672,040 and US-A-5,750,338), and thus purify the nucleic acids which are are fixed on these magnetic particles, by a washing step.
  • This nucleic acid purification step is particularly advantageous if it is desired to subsequently amplify said nucleic acids.
  • a particularly interesting embodiment of these magnetic particles is described in the patent applications filed by the Applicant under the following references: WO-A-97/45202 and WO-A-99/35500.
  • the intermediate layer is itself covered by an external layer based on a polymer capable of interacting with at least one biological molecule, for example nucleic acid; the external polymer is thermosensitive and has a predetermined lower critical solubility temperature (LCST) of between 10 and 100 ° C and preferably between 20 and 60 ° C.
  • LCST lower critical solubility temperature
  • This outer layer is synthesized from monomers cationic, which generate a polymer with the ability to bind nucleic acids.
  • This intermediate layer isolates the magnetic charges of the nucleus, in order to avoid the problems of inhibition of the techniques of amplification of these nucleic acids.
  • nucleic acid purification method is the use of silica either in the form of a column (Qiagen kits for example) or in the form of inert particles [Boom R. et al., J. Clin. Microbiol., 1990, n ° 28 (3), p. 495-503] or magnetic (Merck: MagPrep ® Silica, Promega: MagneSil TM Paramagnetic particles).
  • silica either in the form of a column (Qiagen kits for example) or in the form of inert particles [Boom R. et al., J. Clin. Microbiol., 1990, n ° 28 (3), p. 495-503] or magnetic (Merck: MagPrep ® Silica, Promega: MagneSil TM Paramagnetic particles).
  • Other widely used methods are based on ion exchange resins in columns (Qiagen necessary for example) or in paramagnetic particle format (Whatman: DEAE-Magarose) [Levis
  • a "sequence", or a “nucleotide fragment”, or an oligonucleotide, or a polynucleotide is a sequence of nucleotide patterns assembled together by phosphoric ester bonds, characterized by the informational sequence of natural nucleic acids, susceptible of s' hybridize to a nucleotide fragment, the sequence being able to contain monomers of different structures and to be obtained from a natural nucleic acid molecule and / or by genetic recombination and / or by chemical synthesis.
  • a "motif is derived from a monomer which can be a natural nucleotide of nucleic acid, the constituent elements of which are a sugar, a phosphate group and a nitrogenous base; in DNA the sugar is deoxy-2-ribose, in RNA, the sugar is ribose; depending on whether it is DNA or RNA, the nitrogenous base is chosen from adenine, guanine, uracil, cytosine, thymine; or although the monomer is a nucleotide modified in at least one of the three constituent elements; for example, the modification can take place either at the level of the bases, with modified bases such as inosine, 5-methyl-deoxycytidine, deoxyuridine, dimethylamino-oxy deoxyuridine, diamino-2,6-purine, bromo-5 deoxyuridine or any other modified base capable of hybridization, either at the sugar level, for example the replacement of at least one deoxyribose by a polyamide (
  • informational sequence is meant any ordered sequence of nucleotide type patterns, the chemical nature and order in a reference direction constitute information of the same quality as that of natural nucleic acids.
  • Hybridization means the process during which, under appropriate conditions, two nucleotide fragments, having sufficiently complementary sequences are capable of forming a double strand with stable and specific hydrogen bonds.
  • a nucleotide fragment "capable of hybridizing" with a polynucleotide is a fragment which can hybridize with said polynucleotide under hybridization conditions, which can be determined in each case in known manner.
  • the hybridization conditions are determined by the stringency, that is to say the rigor of the operating conditions. Hybridization is all the more specific as it is performed at higher stringency. Stringency is defined in particular as a function of the base composition of a probe / target duplex, as well as by the degree of mismatch between two nucleic acids.
  • the "stringency” can also be a function of the parameters of the reaction, such as the concentration and the type of ionic species present in the hybridization solution, the nature and the concentration of denaturing agents and / or the hybridization temperature. .
  • the stringency of the conditions under which a hybridization reaction must be carried out will depend mainly on the target probes used. All these data are well known and the appropriate conditions can be determined by a person skilled in the art.
  • the temperature for the hybridization reaction is between about 20 and 70 ° C, in particular between 35 and 65 ° C in saline at a concentration of about 0.5 to I M.
  • a "probe” comprises a nucleotide fragment comprising from 5 to 100 monomers, in particular from 6 to 35 monomers, having a specificity of hybridization under determined conditions to form a hybridization complex with a nucleotide fragment having, in the present case , a nucleotide sequence included for example in an RNA ribosomal, DNA obtained by reverse transcription of said ribosomal RNA and DNA (here called ribosomal DNA or rDNA) of which said ribosomal RNA is the product of transcription; a probe can be capture or detection.
  • a "capture probe” is immobilized or immobilizable on a solid support by any appropriate means, that is to say directly or indirectly, for example by covalence or adsorption.
  • a "detection probe” can be marked by means of a marker chosen from radioactive isotopes, enzymes (in particular a peroxidase, an alkaline phosphatase, or an enzyme capable of hydrolyzing a chromogenic, fluorigenic or luminescent substrate, compounds chromophoric chemicals, chromogenic, fluorescent or luminescent compounds, nucleotide base analogs, and ligands such as biotin.
  • a marker chosen from radioactive isotopes, enzymes (in particular a peroxidase, an alkaline phosphatase, or an enzyme capable of hydrolyzing a chromogenic, fluorigenic or luminescent substrate, compounds chromophoric chemicals, chromogenic, fluorescent or luminescent compounds, nucleotide base analogs, and ligands such as biotin.
  • a "primer” comprises a nucleotide fragment comprising from 5 to 100 nucleotide units and having a specificity of hybridization under conditions determined for the initiation of an enzymatic polymerization, for example in an amplification technique, in a method of sequencing, in a reverse transcription method, etc.
  • Homology characterizes the degree of identity of two nucleotide fragments compared, whose criteria used for the present invention are defined below.
  • the probes and primers according to the invention are chosen from: (a) the sequences identified in the sequence listing appended to the description, (b) the sequences complementary to each of the sequences identified in the sequence listing appended to the description, the complementarity being understood to mean any sequence capable of hybridizing at a temperature between 20 and 70 ° C and preferably between 35 and 65 ° C in saline at a concentration of approximately 0.5 to 1 M and preferably 0.8 at 1 M, with any of the sequences identified in the sequence listing appended to the description,
  • Identity sequence means any sequence or any fragment as defined above, which can serve as a detection and / or capture probe.
  • detection is meant either a direct detection by a physical method, or a detection method using a marker.
  • marker is meant a tracer capable of generating a signal.
  • a non-exhaustive list of these tracers includes the enzymes which produce a detectable signal for example by colorimetry, fluorescence or luminescence, such as horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, beta-lactactosidase, glucose-6-phosphate dehydrogenase; chromophores such as fluorescent, luminescent or coloring compounds; electron density groups detectable by electron microscopy or by their electrical properties such as conductivity, by amperometry or voltammetry methods, or by impedance measurements; the groups detectable by optical methods such as diffraction, surface plasmon resonance, variation of contact angle or by physical methods such as atomic force spectroscopy, tunnel effect, etc. ; radioactive molecules like 32 P, 35 S or 125 l.
  • the polynucleotide can be labeled during the enzymatic amplification step, for example using a labeled nucleotide triphosphate for the amplification reaction.
  • the labeled nucleotide will be a deoxyribonucleotide in DNA generating amplification systems, such as PCR, or a ribonucleotide in RNA generating amplification techniques, such as TMA or NASBA techniques.
  • the polynucleotide can also be labeled after the amplification step, for example by hybridizing a labeled probe according to the sandwich hybridization technique described in document WO-A-91/19812.
  • Another particular preferred mode of labeling nucleic acids is described in Application FR-A-2,780,059 to the Applicant.
  • Another preferred mode of detection uses the 5'-3 'exonuclease activity of a polymerase, as described by Holland P. M., PNAS (1991) p 7276-7280.
  • Signal amplification systems can be used as described in WO-A-95/08000 and, in this case, the preliminary enzymatic amplification reaction may not be necessary.
  • enzyme amplification is meant a process generating multiple copies of a particular nucleotide fragment using specific primers by the action of at least one enzyme.
  • enzyme amplification there are, among others, the following techniques:
  • solid support includes all materials on which a nucleic acid can be immobilized. Synthetic materials or natural materials, optionally chemically modified, can be used as solid support, in particular polysaccharides such as cellulose-based materials, for example paper, cellulose derivatives such as cellulose acetate and nitrocellulose or dextran, polymers, copolymers, in particular based on monomers of the styrene type, natural fibers such as cotton, and synthetic fibers such as nylon; mineral materials such as silica, quartz, glasses, ceramics; latexes; magnetic particles; metal derivatives, gels etc.
  • the solid support can be in the form of a microtiter plate, a membrane as described in application WO -A-94/12670, a particle or a biochip.
  • biochip a solid support of reduced size where a multitude of capture probes are fixed at predetermined positions.
  • the main characteristic of the solid support must be to retain the hybridization characteristics of the capture probes on the nucleic acids while generating minimum background noise for the detection method.
  • An advantage of biochips is that they simplify the use of numerous capture probes, thus allowing multiple detection of the species to be detected.
  • the invention described below makes it possible to solve the problems posed by the methods described above, both in terms of sensitivity, specificity, multidetection capacity and identification, while being fast and easy to implement.
  • the invention relates to a method for determining an animal species of origin in a sample capable of containing an ingredient obtained from at least said species, characterized in that: a) a nucleic fraction obtained at from said sample, b) at least one reagent specific to the animal species is available, chosen from the group consisting of
  • the complementarity being understood to mean any sequence capable of hybridizing at a temperature between 20 and 70 ° C and preferably between 35 and 65 ° C in saline at a concentration of approximately 0.5 to 1M and preferably 0.8 to 1M with any of the sequences SEQ ID Nos 1 to 232, Nos 242 to 261- the sequences homologous to each of sequences SEQ ID Nos 1 to 232, Nos 242 to 261 and sequences complementary to each of the sequences SED ID Nos 1 to 232,
  • nucleic fraction and said reagent are brought into contact, and d) by detection any signal or information resulting from the specific reaction between said reagent and the nucleic fraction is determined, characterizing the presence in said sample of said animal species of origin .
  • nucleotide sequence characterized in that it is chosen from the group consisting of: a) the reference sequences SEQ ID Nos 1 to 232, Nos 242 to 261, b) the sequences complementary to each of the SED ID Nos sequences 1 to 232, Nos 242 to 261 respectively, complementarity being understood to mean any sequence capable of hybridizing at a temperature between 20 and 70 ° C and preferably between 35 and 65 ° C in saline at a concentration of approximately 0.5 to 1 M and preferably 0.8 to 1 M with any of the sequences SEQ ID Nos 1 to 232, Nos 242 to 261 c) the sequences homologous to each of the SEQ ID sequences
  • the invention relates to a method for determining an animal species of origin in a sample capable of containing an ingredient obtained from at least said species, characterized in that it allows said determination in a sample containing at least one other ingredient obtained from another animal species and without prior knowledge of the species present and in that: a) there is a nucleic fraction obtained from said sample, b) there is at least one specific reagent to the animal species, chosen from the group consisting of
  • the nucleic fraction and said reagent are brought into contact, and d) by detection any signal or information resulting from the specific reaction between said reagent and the nucleic fraction is determined, characterizing the presence in said sample of said animal species of origin .
  • the invention can also be a probe for determining at least one animal species of origin, comprising at least one previously defined nucleotide identification sequence.
  • It also relates to a primer for the specific amplification of a nucleic acid of an animal species of origin, comprising at least one previously defined identification nucleotide sequence.
  • Another embodiment of the invention is a reagent for the determination of at least one animal species of origin, comprising a solid support, in the divided or undivided state, on which a previously defined nucleotide sequence is fixed.
  • nucleotide sequences or their fragments can be fixed on a solid support and can constitute a biochip which allows the determination of the multiplicity of signals or information.
  • the method according to the invention can be carried out manually, semi-automatically or automatically, allowing the implementation of a means of determining the animal species of origin of the animal material contained in a sample.
  • This invention also relates to a detection method using in particular the biochip technique.
  • This detection method is specific to the species sought through the use of sequences, called identification sequences of each species, as a probe. The speed, sensitivity and specificity of this detection method allow it to be applied equally to any environment.
  • this method applies to any sample of food product containing animal material whatever its state and the manufacturing and / or production processes used, in particular the cooking, dehydration and / or preservation techniques, and any sample of manufactured product likely to contain animal extracts, such as for example cosmetic products and / or pharmaceutical products comprising, for example, gelatins of animal origin.
  • nucleotide sequences can also be used in all known hybridization techniques such as point-in-time filter deposition techniques called “DOT-BLOT” [Maniatis et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1982], transfer techniques of DNA called “SOUTHERN BLOT” [Southern EM, J. Mol. Biol., 1975, 98, 503], the so-called “NORTHERN BLOT” RNA transfer techniques, or the “SANDWICH” techniques [Dunn A.R. et al., Cell, 1977, 12,23].
  • the present invention also relates to the determination of a group of species or class of animal species or taxon.
  • groups of species or classes or taxons are constituted for example of a class, such as the class of mammals, birds or fish, or even of subgroups of species such as a family of birds or of two subgroups united as the birds or mammals.
  • signature sequences characteristics of a class, a group, a subgroup or a taxon, and corresponding to regions conserved for the whole. individuals making up the group.
  • Any signature sequence specific to a class of animals used in the method according to the present invention has the characteristic that, on the one hand, it has a conserved nucleic region for practically all animal species of the same taxonomic class, and on the other hand it can be discriminated from other sequences corresponding to the same definition than previously, under the usual conditions of determination, defined generically in the appended claims.
  • the invention also relates to a method for determining a group of animal species of origin in a sample capable of containing an ingredient obtained from at least one species belonging to said group of animal species considered, characterized in that: a) a nucleic fraction obtained from said sample is available, b) the nucleotide sequence or sequences characteristic of the group of animal species to be determined are identified c) there is at least one reagent comprising a sequence identified with step b), c) the nucleic fraction and said reagent are brought into contact, and d) by detection any signal or information resulting from the presence of one of the previously defined sequences is determined, characterizing the presence in said sample of a group of original animal species.
  • the identification of the presence of birds is determined by the signatures:
  • CT bases positions 15076-15077 are kept for all of the nucleic material corresponding to the predefined species constituting the group that we want to search for, here birds. At most, 5 mutated positions are observed for the remainder of the signature cited for all of the sequences constituting the nucleic material of the group of birds chosen. The presence of these two bases at the positions indicated above thus makes it possible to determine the presence of birds in the sample.
  • CT or CA bases are kept for all the nucleic material corresponding to the predefined species constituting the group that we want to search for, here birds. At most 4 mutated positions are observed for the remainder of the signature cited for all of the sequences constituting the nucleic material of the group of birds chosen. The presence of these two bases at the positions indicated above thus makes it possible to determine the presence of birds in the sample.
  • the identification of the presence of mammals and birds is determined by the signature V, corresponding to the sequence SEQ N ° 238 ATAGCCACAGCATT, positions 14883 to 14896 (reference sequence Bos taurus genbank; accession n ° V00654).
  • the GC bases (in positions 14886 and 14887) are kept for all of the nucleic material corresponding to the predefined species constituting the group that we want to search for, here birds and mammals. At most 4 mutated positions are observed for the remainder of the signature cited for all of the sequences constituting the nucleic material of the group of birds and mammals chosen. The presence of these two bases at the positions indicated above thus makes it possible to determine the presence of mammals and birds in the sample.
  • the identification of the presence of fish is determined by 1 / the P1 signature, corresponding to the sequence SEQ N ° 239 ATAATAACCTCTTT, positions 14713 to 14726 (reference sequence Gadus morhua; genbank accession no. X99772).
  • the ATA or ATG bases are kept for all of the nucleic material corresponding to the predefined species constituting the group that we want to search for, here the fish. At most 4 mutated positions are observed for the remainder of the signature cited for all of the sequences constituting the nucleic material of the group of fish chosen. The presence of these three bases at the positions indicated above thus makes it possible to determine the presence of fish in the sample.
  • the signature sequence P2 corresponding to the sequence SEQ N ° 270, positions 14512 to 14526 (reference sequence Gadus morhua genbank; accession no X99772).
  • the T base in position 14519 (reference sequence Gadus morhua genbank; accession no. X99772) is kept for all the nucleic material corresponding to the predefined species constituting the group that is to be sought, here the fish. At most, 5 mutated positions are observed for the remainder of the signature cited for all of the sequences constituting the nucleic material of the group of fish chosen. The presence of this base at the position indicated above thus makes it possible to determine the presence of fish in the sample.
  • the present invention therefore also relates to a nucleotide sequence characterized in that it is chosen from the group consisting of: a) the reference sequences SEQ ID Nos 235 to 239, 262 to 271 b) the sequences complementary to each of the SED ID sequences Nos 235 to 239, 262 to 271 respectively, the complementarity being understood to mean any sequence capable of hybridizing at a temperature between 20 and 70 ° C in saline at a concentration from about 0.5 to 1 M with any of the sequences SEQ ID Nos 235 to 239, 262 to 271, c) the sequences homologous to each of the sequences SEQ ID Nos 235 to 239, 262 to 271 and sequences according to b) respectively, the homology being understood to mean any sequence, for example fragment, comprising a series of at least 5 contiguous nucleotides included in any one of said sequences as well as a group of two or three nucleotides belonging to a conserved region for all the species of
  • nucleotide sequences as defined above and characterized in that they consist of a group of 2 to 3 nucleotides included in one of the sequences SEQ ID Nos 235 to 239 and corresponding to a conserved region for all the species in a group considered.
  • sequences defined above that is to say characterized in that they consist of a group of 2 to 3 nucleotides included in one of the sequences SEQ ID Nos 235 to 239 and corresponding to a region conserved for all the species of a group considered, for the determination of a group of animal species of origin in a sample likely to contain an ingredient obtained from at least one animal species belonging to said group of animal species considered.
  • sequences are chosen from the group consisting of the nucleotide sequence consisting of the CAA bases in positions 14689-14690-14691 of SEQ ID No. 235, of the nucleotide sequence consisting of the CT bases in positions 15076-15077 of SEQ ID N ° 236, of the nucleotide sequence consisting of the CT bases in positions 15101-15102 of SEQ ID No. 237, of the nucleotide sequence consisting of the GC bases in positions 14886-14887 of SEQ ID No. 238, and of the nucleotide sequence consisting of ATA bases in positions 14713-14726 of SEQ ID N ° 239.
  • nucleotide sequences as defined above and characterized in that they consist a 1 nucleotide included in one of the sequences SEQ ID Nos 262 to 271 and corresponding to a conserved region for all the species of a group considered.
  • sequences defined above that is to say characterized in that they consist of a 1 nucleotide included in one of the sequences SEQ ID Nos 262 to 271 and corresponding to a region conserved for l '' set of species of a group considered, for the determination of a group of animal species of origin in a sample likely to contain an ingredient obtained from at least one animal species belonging to said group of animal species considered.
  • sequences are chosen from the group consisting of the nucleotide sequence consisting of the base T in positions 14641 of SEQ ID No. 262, of the nucleotide sequence consisting of the base A in positions 14778 of SEQ ID No. 263, the nucleotide sequence consisting of base C in positions 15043 of SEQ ID No. 264, of the nucleotide sequence consisting of base C in positions 15076 of SEQ ID No. 265, by the nucleotide sequence consisting of base C in positions 15101 of SEQ ID No. 266, of the nucleotide sequence consisting of base A in positions 15109 of SEQ ID No.
  • a reagent for the determination of at least one animal species of origin comprising a solid support, in the divided or undivided state, on which is fixed a nucleotide sequence chosen from the group consisting of the sequences SEQ ID Nos 235 to 239, Nos 262 to 271.
  • nucleotide sequence consisting of the base C in positions 15101 of SEQ ID No. 266 of the nucleotide sequence consisting of the base A in position 15109 of SEQ ID No. 267, of the nucleotide sequence consisting of base C in positions 15115 of SEQ ID No. 268, of the nucleotide sequence consisting of base C in positions 15239 of SEQ
  • nucleotide sequence consisting of the base T in positions 14519 of SEQ ID No. 270 of the nucleotide sequence consisting of the base T in positions 14717 of SEQ ID No. 271 characterizing the presence in said sample of a class of animal species or a group of original animal species.
  • the identification sequences can also be used as specific primers in identification techniques by
  • PCR by mixing several primers chosen from the nucleotide sequences specific for an animal species in the presence of other species likely to be present in the media to be assayed, and in that at least one of said primers is chosen from the group consisting of the sequences SEQ ID Nos: 1 to 232, 242 to 261, and all sequences comprising at least 5 contiguous monomers included in any one of said sequences and having at least 70% d identity with said any sequence
  • the invention also relates to the nucleotide sequences, chosen from the group consisting of sequences SEQ ID No. 240 to SEQ ID No. 241 and SEQ ID No. 272 to 276 and their use as universal amplification primers, ie usable for the detection of species in mixture and sufficiently sensitive with respect to the various species to avoid erroneous results due to the masking of certain species present in very small proportion due to too great sensitivity with respect to another species liable to 'be present in a larger proportion.
  • these primers are used in pairs chosen from the following couples: SEQ ID N ° 240 and SEQ ID N ° 241, SEQ ID N ° 272 and SEQ ID N ° 273, SEQ ID N ° 274 and SEQ ID N ° 275.
  • primers are used for the implementation of the amplification steps of the methods described above, in particular when the samples include or are likely to contain biological material originating from species belonging to the group of vertebrates.
  • Example 1 Detection of an animal species in a sample
  • reference DNA of various animal species mammalian DNA (beef, goat, sheep, pig, rabbit, hare, reindeer), bird DNA (ostrich, chicken, turkey, goose), fish DNA (cod, yellowfin tuna, tuna skipjack, hake, Spanish mackerel, Atlantic tuna, rainbow trout, sea trout, brook salmon)
  • a PCR is carried out using the Taq gold Ampli kit from Applied Biosystems according to the protocol below. 10X gold buffer, 3.5 mM Mgcl2, 100 ⁇ M dNTPs (deoxyribonucleosides triphosphates), 2U of Taq gold polymerase, 0.4 ⁇ M of euvertebrate primers as described by Bartlett et al are added to 2 ⁇ l of the total DNA suspension. in 1992 (Biotechniques vol12n ° 3 p408.412): SEQ ID N ° 233: 5 'CCATCCAACA TCTCAGCATG ATGAAA 3'
  • CDL sequence SEQ ID N ° 234: 5 'GAAATTAATA CGACTCACTA TAGGGAGACC
  • a first 10-minute PCR cycle is carried out at 95 ° C followed by 35 cycles each consisting of the following 3 steps: 94 ° C for 45 seconds, 50 ° C for 45 seconds, 72 ° C for 2 minutes. A final extension of 5 minutes at 72 ° C is then carried out.
  • amplification product or amplicon
  • 5 ⁇ l of amplification product are deposited on a 1.5% agarose gel in an EDTA-Tris Borate buffer. After a migration of 20 minutes at 100 volts, the amplification band is visualized by staining with Ethidium Bromide and by illumination with Ultra Violets. The amplification is positive as demonstrated by the presence of a band having the expected size (350 base pairs).
  • a biochip is synthesized on a solid glass support according to the method described in US Pat. No. 5,744,305 (Affymetrix, Fodor et al) using the resequencing strategy described in application WO 95/1 1995
  • Each identification sequence has 17 bases, with an interrogation position in o th position relative to the 3 'end of the sequence.
  • the analysis is carried out with the complete GeneChip® system (reference 900228, Affymetrix, Santa Clara, CA) which includes the GeneArray® reader, the GeneChip® fluid station and the GeneChip® analysis software. e. 1. Transcription and labeling of amplicons
  • the antisense primer CBHT7 all the amplification products have a promoter for T7 RNA polymerase. These amplicons will then serve as a matrix for a transcription reaction during which a fluorescent ribonucleotide will be incorporated. From the 50 ⁇ l of positive amplification product, a 2 ⁇ l aliquot is taken and added to a transcription mixture containing the components of the Megascript T7 kit (Ambion, ref. 1334) and fluorescein-12-UTP (Roche, ref. 1427857). The final reaction mixture is carried out in 20 ⁇ l and the transcription reaction is carried out for 2 hours at 37 ° C. e. 2.
  • the labeled transcripts are fragmented into fragments of approximately 20 nucleotides.
  • the 20 ⁇ l of labeled transcripts are subjected to the action of imidazole (Sigma) 30 mM and manganese chloride (Merck) 30 mM for 30 minutes at 65 ° C. e. 3.
  • the hybridization image obtained is analyzed by GeneChip® software (Affymetrix, Santa Clara, CA) .
  • GeneChip® software Affymetrix, Santa Clara, CA
  • the hybridization spots allow the amplicon sequence to be reconstructed, which is then compared to the reference sequences of the chip.
  • the sequence (and therefore the species which corresponds to it) which has the best percentage of homology (also called “base-call”, expressed in%) with the amplicon sequence is retained for identification. . Results interpretation.
  • the interpretation threshold i.e. the identification level is set at 90% base-call on the signature sequence. Below this threshold, the target, and therefore the corresponding species, is not considered identified.
  • the DNA extracted from the food sample gives rise to an amplification product, then to an identification on the chip.
  • the reference samples are correctly analyzed by this technique, which also allows the detection of animal species (mammal, bird, fish) in commercial samples.
  • Table 1 detection of an animal species in a sample
  • Example 1 The experimental conditions concerning sample preparation, sample lysis and purification of total DNA, PCR, verification of amplification and identification of the amplicon on a DNA chip (Affymetrix, Santa Clara) are identical to what is described in Example 1.
  • sample preparation, sample lysis and purification of total DNA, PCR, verification of amplification and identification of the amplicon on a DNA chip are identical to what is described in Example 1.
  • several animal species are simultaneously analyzed from the same sample.
  • the analysis is carried out on: reference samples (designated “ref”, as in Example 1) consisting of: a mixture of DNA from two different animal species, in variable proportion from each of the 2 species one mixture of amplicons (obtained according to the protocol of example 1), in variable proportion of each of the two species, commercial samples (designated “comm”, as in example 1), obtained from mass distribution, comprising several animal species in the same sample.
  • Example 3 Detection of one or more animal species in flour intended for animal feed. a) Preparation of the sample The experimental conditions concerning the preparation of the samples are similar to what is described in Example 1. The samples are obtained from flour intended for animal feed. These samples (numbered from F1 to F17) were previously classified according to 4 categories, after analysis of the presence of bone fragments as described by Michard (Revue de l'Alimentation animal, vol. 508, pp 43-48, 1997 ; reference technique).
  • PCR is performed using the Taq gold Ampli kit from Applied Biosystems. 10X gold buffer, 3.5 mM MgCl 2 , 100 ⁇ M dNTPs are added to 10 ⁇ l of the suspension of total DNA extracted from flour (deoxyribonucleosides triphosphates), 2U of Taq gold polymerase, 0.4 ⁇ M of the euvertebrate primers CBL and CBHT7 as defined in Example 1 in order to obtain 50 ⁇ l of final reaction volume. A first 10-minute cycle is carried out at 95 ° C. of PCR, then 35 cycles each consisting of the following 3 steps: 94 ° C. 45 sec, 50 ° C. 45 sec, 72 ° C. 2 minutes. A final extension of 5 minutes at 72 ° C is then carried out. d) Verification of amplification
  • Table 3 detection of one or more animal species in meal intended for animal feed.
  • Example 4 detection of the class of species contained in a sample (table 4)
  • the objective of this example is to obtain a technique making it possible to detect the class of vertebrates (mammals, birds, fish %) of the animal of origin of the ingredient contained in a food sample or a flour sample intended for animal feed.
  • the identification of the presence of mammals and / or fish and / or birds is determined by the presence of signatures specific to each class.
  • the signature sequence M1 will be used, corresponding to the sequence SEQ No. 235 GACACAACAA CAGC, positions 14685 to 14698 (reference sequence Bos taurus genbank; accession no. V00654).
  • the CAA bases in positions 14689-14690-14691 are kept for all of the nucleic material corresponding to the predefined species constituting the group that is to be sought, here mammals. At most, 5 mutated positions are observed for the remainder of the signature cited for all of the sequences constituting the nucleic material of the group of mammals chosen. The presence of these three bases at the positions indicated above thus makes it possible to determine the presence of mammals in the sample.
  • the identification of the presence of birds is determined by the signatures: O1, corresponding to the sequence SEQ N ° 236 TCCCTAGCCT
  • TCTC positions 15073 to 15086 (reference sequence Gallus gallus; genbank accession no. X52392).
  • the CT bases positions 15076-15077 are kept for all of the nucleic material corresponding to the predefined species constituting the group that we want to search for, here birds. At most, 5 mutated positions are observed for the remainder of the signature cited for all of the sequences constituting the nucleic material of the group of birds chosen. The presence of these two bases at the positions indicated above thus makes it possible to determine the presence of birds in the sample.
  • CT or CA bases are kept for all the nucleic material corresponding to the predefined species constituting the group that we want to search for, here birds. At most 4 mutated positions are observed for the remainder of the signature cited for all of the sequences constituting the nucleic material of the group of birds chosen. The presence of these two bases at the positions indicated above thus makes it possible to determine the presence of birds in the sample.
  • the identification of the presence of mammals and birds is determined by the signature V1, corresponding to the sequence SEQ N ° 238 ATAGCCACAGCATT, positions 14883 to 14896 (reference sequence Bos taurus genbank; accession n ° V00654).
  • the GC bases (in positions 14886 and 14887) are kept for all of the nucleic material corresponding to the predefined species constituting the group that we want to search for, here mammals and birds. At most 4 mutated positions are observed for the remainder of the signature cited for all of the sequences constituting the nucleic material of the group of mammals and birds chosen. The presence of these two bases at the positions indicated above thus makes it possible to determine the presence of mammals and birds in the sample.
  • the identification of the presence of fish is determined by the signature P1, corresponding to the sequence SEQ No. 239 ATAATAACCTCTTT, positions 14713 to 14726 (reference sequence Gadus morhua; genbank accession no. X99772).
  • the ATA or ATG bases are kept for all of the nucleic material corresponding to the predefined species constituting the group that we may be looking for, here fish. At most 4 mutated positions are observed for the remainder of the signature cited for all of the sequences constituting the nucleic material of the selected fish group.
  • the presence of these three bases at the positions indicated above thus makes it possible to determine the presence of fish in the sample.
  • this technique makes it possible to detect the presence of mammals and / or birds and / or fish, whether these species are present singly or in a mixture.
  • Table 4a detection of species class in a sample
  • a variant consists in selecting not a triplet of nucleotides, but a single nucleotide representative of a given class of species. For example, for the detection of the presence of mammals, we will use indifferently
  • positions 14771 to 14785 reference sequence Bos taurus genbank; accession no. V00654.
  • the base A in position 14778 (reference sequence Bos taurus genbank; accession no. V00654) is kept for all of the nucleic material corresponding to the predefined species constituting the group that is to be sought, here mammals. At most, 5 mutated positions are observed for the remainder of the signature cited for all of the sequences constituting the nucleic material of the group of mammals chosen. The presence of this base at the position indicated above thus makes it possible to determine the presence of mammals in the sample.
  • positions 15036 to 15050 (reference sequence Gallus gallus genbank; accession no X52392).
  • the base C in position 15043 (reference sequence Ga // tvs gallus genbank; accession no X52392) is kept for all of the nucleic material corresponding to the predefined species constituting the group that is to be sought, here birds. At most, 5 mutated positions are observed for the remainder of the signature cited for all of the sequences constituting the nucleic material of the group of birds chosen. The presence of this base at the position indicated above thus makes it possible to determine the presence of birds in the sample.
  • the signature sequence P2 corresponding to the sequence SEQ N ° 270 TCAGACATCGAGACA, positions 14512 to 14526 (reference sequence Gadus morhua genbank; accession n ° X99772).
  • the T base in position 14519 (reference sequence Gadus morhua genbank; accession no X99772) is kept for all of the nucleic material corresponding to the predefined species constituting the group that is to be sought, here the fish. At most, 5 mutated positions are observed for the remainder of the signature cited for all of the sequences constituting the nucleic material of the group of fish chosen. The presence of this base at the position indicated above thus makes it possible to determine the presence of fish in the sample.
  • a first pair of primers comprising the following sequences
  • SEQ ID N ° 240 5 'GACCTCCCAG CCCCATCAAA 3' (sequence CBL 20) and SEQ ID N ° 241: 5 'GAAATTAATA CGACTCACTA TAGGGAGACC
  • ACACAGAATG ATATTTGTCC TCA 3 '(sequence CBHT7 20, with in bold, the localization of the T7 polymerase promoter) was initially chosen to increase the detection threshold of certain species, notably turkey, or sheep, which when they are in trace amounts in a commercial sample, can be masked by the presence of beef.
  • the technique used to obtain identification on the chip is as described in Example 1a, 1b, 1c (with the modified primers), 1d, 1e.
  • the use of these new primers makes it possible to obtain, in turkeys, a detection threshold of the order of 1% by comparison with the primers of Examples 1 to 4 where the detection threshold was around 10%.
  • the use of these new primers also allows, in commercial samples, coming from the large distribution, the identification of animal species, in particular the sheep, present in the trace state, which were masked by the presence of beef in the previous examples (Table 5b).
  • a second pair of primers was chosen and used in duplex with the pair of primers described in example 1c: during the detection of animal species initially present in a can, to be confronted with a problem of degradation of the DNA of the animal species which one wishes to detect, in particular during canned fish (for example canned tuna).
  • the technique used to obtain identification on the chip is as described in example 1a, 1b, 1d, 1e with the exception of step 1c: two additional internal primers (in addition to the universal ones) are used which amplify the 350 bp region into two smaller parts.
  • a first pair of primers (used in duplex 1) comprising the following sequences
  • SEQ ID N ° 273: TTCTTCTTTATCTGTITCTA (/ Inosine) was initially chosen to increase the detection threshold of certain fish species, in particular when these fish species are present in a can.
  • a second pair of primers (used in duplex 2), comprising the following sequences, was also selected:
  • a first cycle of 10 minutes at 95 ° C of PCR is carried out, then 35 cycles each made up of the following 3 steps: 94 ° C 45 sec, 50 ° C 45 sec, 72 ° C 2 min.
  • a final extension of 5 minutes at 72 ° C is then carried out.
  • An amplification check is carried out by depositing_5 ⁇ l of amplification product (amplicon) on a 1.5% agarose gel in EDTA- Tris Borate. After a migration of 20 min at 100 V, two amplification bands are visualized by staining with Ethidium Bromide and by UV illumination.
  • Table 5c detection of several species of fish in a sample (from a can)
  • each primer can be used with or without the T7 promoter.

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Abstract

Procédé de détermination d'une espèce animale d'origine dans un échantillon susceptible de contenir un ingrédient obtenu à partir d'au moins ladite espèce, caractérisé en ce que : a) on dispose d'une fraction nucléique obtenue à partir dudit échantillon, b) on dispose d'au moins un réactif spécifique à l'espèce animale, choisi dans le groupe constitué par - les séquences de référence SEQ ID Nos 1 à 232, 242 à 261 - les séquences complémentaires à chacune des séquences SED ID Nos 1 à 232, 242 à 261 respectivement, - les séquences homologues à chacune des séquences SEQ ID Nos 1 à 232, 242 à 261 et des séquences complémentaires à chacune des séquences SED ID Nos 1 à 232, 242 à 261 respectivement, c) on met en présence la fraction nucléique et ledit réactif, et d) par détection on détermine tout signal ou information résultant de la réaction spécifique entre ledit réactif et la fraction nucléique, caractérisant la présence dans ledit échantillon de ladite espèce animale d'origine.

Description

Procédé de détection et/ou d'identification de l'espèce animale d'origine de la matière animale contenue dans un échantillon.
La présente invention a trait au domaine de la détermination d'une espèce animale appelée ci-après d'origine dans un échantillon susceptible de contenir un ingrédient, lui-même obtenu à partir d'au moins ladite espèce. Les produits à partir desquels s'exerce la détermination selon la présente invention sont par exemple des aliments ou denrées alimentaires à destination de l'homme ou des animaux, des produits cosmétiques, et, de manière générale des produits susceptibles de contenir des ingrédients d'origine animale, ou au contraire des produits dans lesquels ces extraits sont interdits.
Par exemple, l'identification des espèces animales présentes dans les aliments peut être nécessaire dans de nombreux domaines d'activités. Une première raison est de lutter contre les fraudes alimentaires où sont substituées certaines espèces animales par des espèces moins chères, comme le remplacement de lièvre par du lapin. Une seconde raison est de santé publique, comme notamment lors de l'épidémie d'encéphalite spongiforme bovine ou ESB, maladie due à l'utilisation de farines animales carnées d'origine bovine pour l'alimentation des bovins. Une troisième raison est d'ordre religieux, afin de vérifier par exemple l'absence de porc dans les aliments. Une quatrième raison est d'ordre législatif, lors notamment de la vérification de l'absence d'espèces protégées dans les aliments.
Trois principales approches d'identification sont actuellement décrites dans la littérature ; ces méthodes sont basées sur une analyse tissulaire ou microscopique, sur une analyse proteique, et/ou sur une analyse génétique.
L'analyse tissulaire consiste ainsi à déterminer la présence dans des échantillons de farines destinées à l'alimentation animale, de fragments d'os. Cette technique, décrite notamment dans l'article de Michard, Revue de l'alimentation animale, vol. 508, pp 43-48, 1997, bien que sensible, est fastidieuse et repose sur l'interprétation d'un expert. Elle est donc difficilement comparable d'un laboratoire à un autre. De plus, par nature, elle ne peut détecter l'adjonction de tissus mous, tels que abats, sérum, tissus sanguins, gélatine. Parmi les analyses protéiques utilisées, on distingue principalement dans la littérature trois groupes de méthodes permettant l'identification d'espèces animales présentes dans un échantillon donné.
Le premier groupe de méthodes comprend des techniques d'électrophorèse de protéines, qui consiste à détecter les protéines cibles solubles par une coloration enzymatique spécifique. Le diagnostic est obtenu après électrophorèse sur gel polyacrylamide par exemple. Toutefois, cette technique ne peut être réalisée qu'avec des tissus frais ou congelés, non transformés, car une période de cuisson de l'aliment est un exemple de transformation susceptibles d'altérer les protéines. Cette technique ne peut donc pas être appliquée à la détection d'espèces animales présentes dans les farines végétales, qui subissent lors de leur fabrication des phases de cuisson.
Le deuxième groupe de méthodes est basé sur des techniques immunologiques, par l'utilisation d'anticorps dirigés contre les protéines cibles solubles. La technique « Ouchterlony », ou immunodiffusion double, méthode utilisée pour différencier des antigènes dans un mélange, peut être utilisée. Mais cette technique présente l'inconvénient majeur d'impliquer des réactions croisées avec les épitopes d'autres espèces. L'utilisation de techniques ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) permet une meilleure discrimination entre les espèces, et ces techniques peuvent être appliquées à de la viande cuite lorsque des anticorps dirigés contre des épitopes thermorésistants sont utilisés. Toutefois, des problèmes de spécificité sont encore observés. A titre indicatif, des anticorps polyclonaux dirigés contre les épitopes thermorésistants de poulet ne sont pas suffisamment spécifiques pour déterminer s'il s'agit de viande de poulet ou de viande de dinde.
Le troisième groupe de méthodes comprend les techniques chromatographiques (HPLC) utilisées pour caractériser des protéines solubles de muscles. Toutefois, ces techniques restent lourdes financièrement et techniquement, et ne peuvent être appliquées qu'a des tissus frais ou récemment congelés.
Les inconvénients de ces trois méthodes sont principalement dus à leur dépendance envers la caractérisation de protéines qui sont thermosensibles, se dénaturent lors d'une période de cuisson des aliments, perdent leur activité biologique après la mort de l'animal, et dont la présence est souvent fonction du type de cellules qui est examiné. Il est ainsi préférable d'analyser directement l'ADN, plutôt que les protéines de l'échantillon, pour identifier la ou les espèces animales d'origine présentes dans un échantillon donné, l'ADN étant identique dans tous les types cellulaires d'un même animal et stable en comparaison avec les protéines. Une troisième approche consiste donc à analyser l'ADN présent dans l'échantillon. Depuis peu de temps, on trouve ainsi dans la littérature des méthodes basées notamment sur l'utilisation d'enzymes de restriction ou de marqueurs génétiques, ces méthodes présentant l'avantage de pouvoir être appliquées à des produits transformés, en particulier après traitement thermique.
La détermination nucléique peut faire appel à des enzymes de restriction, ou technique dite RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism, voir notamment Meyer et al, Journal of AOAC International, vol 78 n°6, pp 1542-1551 , 1995). Les enzymes de restriction coupent l'ADN, préalablement extrait de l'échantillon à analyser, à des endroits précis de la macromolécule. Il suffit alors de comparer, par simple électrophorèse, les fragments obtenus avec ceux d'échantillons témoins représentatifs de l'espèce à identifier. Toutefois, l'analyse des résultats obtenus par cette technique est très délicate, en particulier lorsque plusieurs espèces animales sont présentes dans l'échantillon.
La détermination nucléique peut aussi consister à séquencer un marqueur ubiquitaire, tel que le cytochrome B de l'ADN mitochondrial. L'ADN mitochondrial est une cible connue pour ce genre d'analyse puisque chaque mitochondrie contient de une à dix molécules d'ADN mitochondrial, et chaque cellule renferme de quelques dizaines à quelques milliers de mitochondhes, ce qui permet de travailler sur une très faible quantité d'échantillon. Ainsi, Bartlett & Davidson (Biotechniques, vol. 12, n°3, 1992) décrivent une méthode appelée FINS (Forensically Informative Nucleotide Sequencing). Cette méthode consiste à i) isoler l'ADN présent dans un échantillon biologique, ii) amplifier cet ADN par PCR par l'utilisation d'amorces spécifiques du gène cytochrome B mitochondrial, les amorces étant choisies dans la partie du gène hautement conservée au cours de l'évolution et iii) séquencer le segment d'ADN amplifié. La séquence est ensuite utilisée pour une analyse phylogénétique à l'aide d'une base de données, permettant l'identification de l'espèce animale présente initialement dans l'échantillon. Si cette méthode présente l'avantage d'être rapide et utilisable sur tout type d'aliments (frais, congelés, transformés...), elle présente toutefois l'inconvénient majeur de ne pas permettre l'analyse de mélanges d'espèces, à partir de mélanges de séquences amplifiées issues du même marqueur polymorphe ubiquitaire, et reste ainsi réservée à des matières premières homogènes. L'analyse peut également consister à amplifier un marqueur spécifique d'une espèce donnée. Ainsi, Lahiff et al (Molecular and Cellular Probes, vol.15, pp27-35, 2001) décrivent l'identification d'espèce ovine, bovine ou aviaire présente dans un échantillon par l'utilisation par PCR d'amorces particulières, spécifiques à chaque espèce. Une méthode développée par Colgan S. et al. a été également décrite en 2001 (FOOD Research International, 2001 , vol 34, n° 5, 401-414) pour la détection de 4 espèces en mélange par l'utilisation par PCR d'amorces spécifiques. Si cette méthode permet l'identification spécifique et rapide de telle ou telle espèce, elle ne peut être appliquée simultanément à la détection de plusieurs espèces. Des PCR successives sont alors nécessaires si on souhaite détecter plusieurs espèces. On retrouve ainsi dans l'art antérieur la détection de six espèces animales par l'utilisation d'une PCR multiplex (Matsunaga et al, 1999 Méat Sciences, (1999), 145-148) et (Matsunaga T.. ét al., Nippon Shokuhin KogakuKaishi, (1999) vol 46, n°3, 187-194). Toutefois, cette technique reste délicate et difficile à appliquer et implique pratiquement une connaissance préalable des espèces recherchées. Cette technique n'est cependant pas applicable en aveugle, c'est à dire sans connaissance préalable des espèces susceptibles d'être présentes dans l'échantillon. Elle ne permet pas d'avoir des résultats quantitatifs en raisons des difficultés dues à l'amplification multiplex et des possibilités de mésappariements. De plus, cette technique oblige à disposer d'un grand nombre d'amorces spécifiques si l'on veut tester un grand nombre d'espèces, ce qui est peu réalisable en pratique en raison de problèmes de sensibilité et de spécificité. Enfin, si une espèce n'est pas représentée dans le jeu d'amorces mais néanmoins présente dans l'échantillon à analyser, le résultat sera faussé.
Les techniques précédemement décrites permettent la détermination sans connaissance préalable de l'espèce présente lorsque l'échantillon ne comprend qu'une seule espèce, elles permettent la détection de plusieurs espèces lorsqu'on a une connaissance préalable des espèces en présence mais, aucune des techniques précédemment décrites ne permet une détermination en présence d'un mélange de plusieurs espèces sans connaissance prélable desdites espèces en présence. De plus la plupart des techniques précédemment décrites losqu'on est en présence de plusieurs espèces ne permettent pas une détermination fiable losque les proportions des différentes espèces sont très différentes dans l'échantillon. II existe donc un besoin important pour une technique qui, tout en restant générique, puisse détecter une ou plusieurs espèces, même présentes en grand nombre dans le même échantillon à analyser ou en très faible quantité, et sans connaissance préalable des espèces présentes.
En effet, si dans un produit, l'espèce non désirée doit être présente dans des quantités supérieures à 5 % voire 1% selon les législations par rapport à l'espèce normalement présente pour qu'il y ait effectivement fraude, ce qui allège les performances exigées pour le test de diagnostic moléculaire, il en est autrement dans le cas de produits dans lesquels la présence de produits d'origine animale est interdite. Par exemple dans le cas des farines employées en France pour l'alimentation animale depuis le 1 er janvier 2001 , les traces de teneur en produit d'origine animale sont recherchées, et la contrainte technique est importante en terme de sensibilité de la méthode car la majeure partie du matériel est d'origine végétale et l'adjonction de matériel animal varie entre 0,1 et 5% poids/poids. II existe donc un besoin de disposer d'un outil de détermination, permettant l'identification ou la détection qualitative et/ou quantitative d'espèces animales, en aveugle, c'est à dire sans a priori sur l'identité de l'espèce recherchée, susceptible d'être mis en œuvre de manière simple, tout en restant spécifique, fiable et fidèle, et susceptible d'être mis en œuvre dans un milieu pouvant contenir des ingrédients obtenus à partir de plusieurs espèces animales.
Le problème à résoudre présente une complexité importante. La détermination doit être possible en aveugle, c'est à dire que l'échantillon est susceptible de contenir ou de ne pas contenir des ingrédients obtenus à partir d'une ou de plusieurs espèces animales et ces espèces d'origine sont inconnues. Si l'échantillon contient des ingrédients obtenus à partir d'espèces animales, les espèces d'origine doivent être déterminées et sont susceptibles d'être voisines, et la détermination doit être possible en ne faisant qu'une seule analyse, avec un seul réactif et une seule étape d'amplification, sans étape préalable de prédétermination par exemple du groupe d'espèces ou mise en œuvre de batteries de tests permettant par exemple de classer les réactifs par genres ou espèces pour éviter par exemple les réactions croisées.
A cet effet, la Demanderesse a découvert un ensemble de séquences constitué par le groupe comprenant les séquences SEQ ID Nos 1 à 232, 242 à 261 , leurs séquences respectivement complémentaires, et toutes séquences homologues, comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et présentant au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence, qui permettent par la mise en œuvre de méthodes d'analyse dites de biologie moléculaire, la détermination d'au moins une espèce animale d'origine dans un échantillon susceptible de contenir un ingrédient obtenu à partir d'au moins ladite espèce.
Avant d'exposer l'invention, différents termes utilisés dans la description et les revendications sont définis ci-après.
Une "détermination" s'entend comme étant l'identification ou la détection ou analyse quantitative et/ou qualitative d'une espèce animale.
- Une "espèce animale" s'entend comme étant la catégorie la plus simple utilisée dans le classement des espèces vivantes ou taxonomie. Les espèces vivantes sont classées en catégories appelées taxons, les plus importants taxons sont le Règne (animal ou végétal), l'Embranchement, la Classe, l'Ordre, la Famille, le Genre, et l'Espèce. Les Oiseaux, Poissons et Mammifères sont des classes d'animaux vertébrés.
- Par "espèce animale d'origine" on entend l'espèce animale, de l'animal dont les tissus, quels qu'ils soient, ont été utilisé comme matière première pour la préparation du ou des ingrédients de l'échantillon, du produit soumis à la détermination selon la présente invention.
Une "méthode de biologie moléculaire", est une méthode basée sur l'amplification enzymatique de cibles nucléiques (ADN et/ou ARN) in vitro et l'utilisation de sondes oligonucléotidiques.
- Un "échantillon" est toute partie obtenue directement ou indirectement à partir d'un produit, d'un matériau, d'une matière, de départ, lui-même susceptible de contenir au moins un ingrédient obtenu à partir d'au moins une espèce animale dite d'origine. En conséquence de cette définition, l'échantillon à déterminer conformément à la présente invention est susceptible de contenir ledit ingrédient d'origine animale, à partir duquel on identifie ou détecte la ou les espèces animales entrées dans la composition ou constitution du produit, matériau, ou matière de départ. Au sens de la présente invention, le produit de départ peut être un matériel biologique, un aliment ou denrée alimentaire, par exemple à base de viande ou poisson, un produit cosmétique, etc..
- Par "étape de lyse", on entend une étape capable de libérer les acides nucléiques contenus dans les enveloppes protéiques et/ou lipidiques des microorganismes (comme des débris cellulaires qui perturbent les réactions ultérieures). A titre d'exemple, on peut utiliser les méthodes de lyse telles que décrite dans les demandes de brevet de la Demanderesse : WO-A-00/05338 sur la lyse mixte magnétique et mécanique, WO-A-99/53304 sur la lyse électrique, et
WO-A-99/15321 sur la lyse mécanique.
L'homme du métier pourra utiliser d'autres méthodes de lyse bien connues, telles que les chocs thermiques ou osmotiques ou les lyses chimiques par des agents chaotropiques tels que les sels de guanidium (US-A- 5,234,809).
- Par "purification", on entend la séparation entre les acides nucléiques et les autres constituants cellulaires relargués dans l'étape de lyse. Cette étape permet généralement de concentrer les acides nucléiques. A titre d'exemple, on peut utiliser des particules magnétiques éventuellement revêtues d'oligonucléotides, par adsorption ou covalence (voir à ce sujet les brevets US-A-4,672,040 et US-A-5,750,338), et ainsi purifier les acides nucléiques qui se sont fixés sur ces particules magnétiques, par une étape de lavage. Cette étape de purification des acides nucléiques est particulièrement intéressante si l'on souhaite amplifier ultérieurement lesdits acides nucléiques. Un mode de réalisation particulièrement intéressant de ces particules magnétiques est décrit dans les demandes de brevet déposées par la Demanderesse sous les références suivantes : WO-A-97/45202 et WO-A- 99/35500.
Dans la dernière de ces demandes de brevet, il s'agit de particules magnétiques thermosensibles ayant chacune un noyau magnétique recouvert d'une couche intermédiaire. La couche intermédiaire est elle-même recouverte par une couche externe à base d'un polymère susceptible d'interagir avec au moins une molécule biologique, par exemple acide nucléique ; le polymère externe est thermosensible et présente une température critique inférieure de solubilité (LCST) prédéterminée comprise entre 10 et 100°C et de préférence entre 20 et 60°C. Cette couche externe est synthétisée à partir de monomères cationiques, qui génèrent un polymère ayant la capacité de lier les acides nucléiques. Cette couche intermédiaire isole les charges magnétiques du noyau, afin d'éviter les problèmes d'inhibition des techniques d'amplification de ces acides nucléiques. Un autre exemple intéressant de méthode de purification des acides nucléiques est l'utilisation de silice soit sous forme de colonne (nécessaires Qiagen par exemple), soit sous forme de particules inertes [Boom R. et al., J. Clin. Microbiol., 1990, n°28(3), p. 495-503] ou magnétiques (Merck: MagPrep® Silica, Promega: MagneSil™ Paramagnetic particles). D'autres méthodes très répandues reposent sur des résines échangeuses d'ions en colonne (nécessaires Qiagen par exemple) ou en format particulaire paramagnétique (Whatman: DEAE-Magarose) [Levison PR et al., J. Chromatography, 1998, p. 337-344]. Une autre méthode très pertinente mais non exclusive pour l'invention est celle de l'adsorption sur support d'oxyde métallique (société Xtrana: matrice Xtra-Bind™).
- Une "séquence", ou un "fragment nucléotidique", ou un oligonucléotide, ou un polynucléotide, est un enchaînement de motifs nucléotidiques assemblés entre eux par des liaisons ester phosphorique, caractérisé par la séquence informationnelle des acides nucléiques naturels, susceptibles de s'hybrider à un fragment nucléotidique, l'enchaînement pouvant contenir des monomères de structures différentes et être obtenu à partir d'une molécule d'acide nucléique naturelle et/ou par recombinaison génétique et/ou par synthèse chimique.
- Un "motif est dérivé d'un monomère qui peut être un nucléotide naturel d'acide nucléique dont les éléments constitutifs sont un sucre, un groupement phosphate et une base azotée ; dans l'ADN le sucre est le désoxy-2-ribose, dans l'ARN le sucre est le ribose ; selon qu'il s'agisse de l'ADN ou l'ARN, la base azotée est choisie parmi l'adénine, la guanine, l'uracile, la cytosine, la thymine ; ou bien le monomère est un nucléotide modifié dans l'un au moins des trois éléments constitutifs ; à titre d'exemple, la modification peut intervenir soit au niveau des bases, avec des bases modifiées telles que l'inosine, la méthyl-5désoxycytidine, la désoxyuridine, la diméthylamino-δdésoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5désoxyuridine ou toute autre base modifiée capable d'hybridation, soit au niveau du sucre, par exemple le remplacement d'au moins un désoxyribose par un polyamide (P.E. Nielsen et al, Science, 254, 1497-1500 (1991), soit encore au niveau du groupement phosphate, par exemple son remplacement par des esters notamment choisis parmi les diphosphates, alkyl- et aryl-phosphonates et phosphorothioates,
- Par "séquence informationnelle", on entend toute suite ordonnée de motifs de type nucléotidique, dont la nature chimique et l'ordre dans un sens de référence constituent une information de même qualité que celle des acides nucléiques naturels.
- Par "hybridation", on entend le processus au cours duquel, dans des conditions appropriées, deux fragments nucléotidiques, ayant des séquences suffisamment complémentaires sont susceptibles de former un double brin avec des liaisons hydrogène stables et spécifiques. Un fragment nucléotidique "capable de s'hybrider" avec un polynucléotide est un fragment pouvant s'hybrider avec ledit polynucléotide dans des conditions d'hybridation, qui peuvent être déterminées dans chaque cas de façon connue. Les conditions d'hybridation sont déterminées par la stringence, c'est-à-dire la rigueur des conditions opératoires. L'hybridation est d'autant plus spécifique qu'elle est effectuée à plus forte stringence. La stringence est définie notamment en fonction de la composition en bases d'un duplex sonde/cible, ainsi que par le degré de mésappariement entre deux acides nucléiques. La "stringence" peut également être fonction des paramètres de la réaction, tels que la concentration et le type d'espèces ioniques présentes dans la solution d'hybridation, la nature et la concentration d'agents dénaturants et/ou la température d'hybridation. La stringence des conditions dans lesquelles une réaction d'hybridation doit être réalisée dépendra principalement des sondes cibles utilisées. Toutes ces données sont bien connues et les conditions appropriées peuvent être déterminées par l'homme du métier.
En général, selon la longueur des sondes cibles utilisées, la température pour la réaction d'hybridation est comprise entre environ 20 et 70°C, en particulier entre 35 et 65°C dans une solution saline à une concentration d'environ 0,5 à I M.
- Une "sonde" comprend un fragment nucléotidique comprenant de 5 à 100 monomères, notamment de 6 à 35 monomères, possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec un fragment nucléotidique ayant, dans le cas présent, une séquence nucléotidique comprise par exemple dans un ARN ribosomique, l'ADN obtenu par transcription inverse dudit ARN ribosomique et l'ADN (appelé ici ADN ribosomique ou ADNr) dont ledit ARN ribosomique est le produit de transcription ; une sonde peut être de capture ou de détection.
- Une "sonde de capture" est immobilisée ou immobilisable sur un support solide par tout moyen approprié, c'est-à-dire directement ou indirectement, par exemple par covalence ou adsorption.
- Une "sonde de détection" peut être marquée au moyen d'un marqueur choisi parmi les isotopes radioactifs, des enzymes (notamment une peroxydase, une phosphatase alcaline, ou une enzyme susceptible d'hydrolyser un substrat chromogène, fluorigène ou luminescent, des composés chimiques chromophores, des composés chromogènes, fluorigènes ou luminescents, des analogues de bases nucléotidiques, et des ligands tels que la biotine.
- Une "amorce" comprend un fragment nucléotidique comprenant de 5 à 100 motifs nucléotidiques et possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour l'initiation d'une polymérisation enzymatique, par exemple dans une technique d'amplification, dans un procédé de séquençage, dans une méthode de transcription inverse, etc.
- "L'homologie" caractérise le degré d'identité de deux fragments nucléotidiques comparés, dont les critères retenus pour la présente invention sont définis ci-après.
Les sondes et amorces selon l'invention sont choisies parmi : (a) les séquences identifiées dans le listage de séquences annexé à la description, (b) les séquences complémentaires à chacune des séquences identifiées dans le listage de séquences annexé à la description, la complémentarité s'entendant de toute séquence susceptible de s'hybrider à une température comprise entre 20 et 70°C et préférentiellement entre 35 et 65°C en solution saline à une concentration d'environ 0,5 à 1 M et préférentiellement 0,8 à 1 M, avec une quelconque des séquences identifiées dans le listage de séquences annexé à la description,
(c) les séquences homologues à chacune des séquences identifiées dans le listage de séquences annexé à la description, et des séquences complémentaires à chacune des séquences identifiées dans le listage de séquences annexé à la description, respectivement, l'homologie s'entendant de toute séquence, par exemple fragment comprenant une suite d'au moins 5 nucléotides contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences, et présentant au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence ; à titre d'exemple, un fragment (c) comporte 10 nucléotides parmi lesquels 5 nucléotides contigus appartiennent à une séquence (a) et au moins 2 nucléotides des 5 nucléotides restants sont identiques respectivement aux deux nucléotides correspondants dans la séquence de référence, après alignement.
- Par "séquence d'identification", on désigne toute séquence ou tout fragment tel que défini ci-dessus, pouvant servir de sonde de détection et/ou de capture.
- Par "détection" on entend soit une détection directe par une méthode physique, soit une méthode de détection à l'aide d'un marqueur.
De nombreuses méthodes de détection existent pour la détection des acides nucléiques. [Voir par exemple Kricka et al., Clinical Chemistry, 999, n° 45(4), p.453-458 ou Keller G. H. et al., DNA Probes, 2nd Ed., Stockton Press, 1993, sections 5 et 6, p.173-249].
Par "marqueur", on entend un traceur capable d'engendrer un signal. Une liste non limitative de ces traceurs comprend les enzymes qui produisent un signal détectable par exemple par colorimétrie, fluorescence ou luminescence, comme la peroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la bêtagalactosidase, la glucose-6-phosphate déshydrogénase ; les chromophores comme les composés fluorescents, luminescents ou colorants ; les groupements à densité électronique détectables par microscopie électronique ou par leurs propriétés électriques comme la conductivité, par les méthodes d'ampérométrie ou de voltamétrie, ou par des mesures d'impédance ; les groupements détectables par des méthodes optiques comme la diffraction, la résonance plasmon de surface, la variation d'angle de contact ou par des méthodes physiques comme la spectroscopie de force atomique, l'effet tunnel, etc. ; les molécules radioactives comme 32P, 35S ou 125l .
Ainsi, le polynucléotide peut être marqué pendant l'étape d'amplification enzymatique, par exemple en utilisant un nucléotide triphosphate marqué pour la réaction d'amplification. Le nucléotide marqué sera un désoxyribonucléotide dans les systèmes d'amplification générant un ADN, comme la PCR, ou un ribonucléotide dans les techniques d'amplification générant un ARN, comme les techniques TMA ou NASBA. Le polynucléotide peut aussi être marqué après l'étape d'amplification, par exemple en hybridant une sonde marquée selon la technique d'hybridation sandwich décrite dans le document WO-A-91/19812.
Un autre mode particulier préférentiel de marquage d'acides nucléiques est décrit dans la demande FR-A-2 780 059 de la Demanderesse. Un autre mode préférentiel de détection utilise l'activité exonucléase 5'-3' d'une polymérase, tel que décrit par Holland P. M., PNAS (1991) p 7276-7280.
Des systèmes d'amplification du signal peuvent être utilisés comme décrit dans le document WO-A-95/08000 et, dans ce cas, la réaction préliminaire d'amplification enzymatique peut ne pas être nécessaire.
- Par "amplification enzymatique", on entend une processus générant de multiples copies d'un fragment nucléotidique particulier à l'aide d'amorces spécifiques par l'action d'au moins une enzyme. Ainsi, pour l'amplification des acides nucléiques, il existe, entre autres, les techniques suivantes :
- PCR (Polymérase Chain Reaction), telle que décrite dans les brevets US-A- 4,683,195, US-A-4,683,202 et US-A-4,800,159,
- LCR (Ligase Chain Reaction), exposée par exemple dans la demande de brevet EP-A-0 201 184, - RCR (Repair Chain Reaction), décrite dans la demande de brevet WO-A- 90/01069,
- 3SR (Self Sustained Séquence Replication) avec la demande de brevet WO-A-90/06995,
- NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) avec la demande de brevet WO-A-91/02818, et
- TMA (Transcription Mediated Amplification) avec le brevet US-A-5, 399,491.
On parle alors d'"amplicons" pour désigner les polynucléotides générés par une technique d'amplification enzymatique.
- Le terme "support solide" tel qu'utilisé ici inclut tous les matériaux sur lesquels peut être immobilisé un acide nucléique. Des matériaux de synthèse ou des matériaux naturels, éventuellement modifiés chimiquement, peuvent être utilisés comme support solide, notamment les polysaccharides tels que les matériaux à base de cellulose, par exemple du papier, des dérivés de cellulose tels que l'acétate de cellulose et la nitrocellulose ou le dextrane, des polymères, des copolymères, notamment à base de monomères du type styrène, des fibres naturelles telles que le coton, et des fibres synthétiques telles que le nylon ; des matériaux minéraux tels que la silice, le quartz, des verres, des céramiques ; des latex ; des particules magnétiques ; des dérivés métalliques, des gels etc. Le support solide peut être sous la forme d'une plaque de microtitration, d'une membrane comme décrit dans la demande WO -A-94/12670, d'une particule ou d'une biopuce.
- Par "biopuce", on entend un support solide de dimension réduite où sont fixés une multitude de sondes de capture à des positions prédéterminées.
A titre d'illustration, des exemples de ces biopuces sont donnés dans les publications de [G. Ramsay, Nature Biotechnology, 1998, n°16, p. 40- 44 ; F. Ginot, Human Mutation, 1997, n°10, p.1-10 ; J. Cheng et al, Molecular diagnosis, 1996, n°1 (3), p.183-200 ; T. Livache et al, Nucleic Acids Research, 1994, n° 22(15), p. 2915-2921 ; J. Cheng et al, Nature Biotechnology, 1998, n° 16, p. 541-546] ou dans les brevets US-A-4,981 ,783, US-A-5,700,637, US-A- 5,445,934, US-A-5,744,305 et US-A-5,807,522.
La caractéristique principale du support solide doit être de conserver les caractéristiques d'hybridation des sondes de capture sur les acides nucléiques tout en générant un bruit de fond minimum pour la méthode de détection. Un avantage des biopuces est qu'elles simplifient l'utilisation de nombreuses sondes de capture permettant ainsi la détection multiple des espèces à détecter.
L'invention décrite ci-après permet de résoudre les problèmes posés par les méthodes précédemment décrites, à la fois en terme de sensibilité, spécificité, capacité de multidétection et identification, tout en étant rapide et facile à mettre en œuvre.
L'invention concerne un procédé de détermination d'une espèce animale d'origine dans un échantillon susceptible de contenir un ingrédient obtenu à partir d'au moins ladite espèce, caractérisé en ce que : a) on dispose d'une fraction nucléique obtenue à partir dudit échantillon, b) on dispose d'au moins un réactif spécifique à l'espèce animale, choisi dans le groupe constitué par
- les séquences de référence SEQ ID Nos 1 à 232, Nos 242 à 261 , - les séquences complémentaires à chacune des séquences SED ID Nos 1 à 232 , Nos 242 à 261 , respectivement, la complémentarité s'entendant de toute séquence susceptible de s'hybrider à une température comprise entre 20 et 70°C et préférentiellement entre 35 et 65°C en solution saline à une concentration d'environ 0,5 à 1M et préférentiellement 0,8 à 1 M avec l'une quelconque des séquences SEQ ID Nos 1 à 232 , Nos 242 à 261- les séquences homologues à chacune des séquences SEQ ID Nos 1 à 232 , Nos 242 à 261 et des séquences complémentaires à chacune des séquences SED ID Nos 1 à 232 ,
Nos 242 à 261 respectivement, l'homologie s'entendant de toute séquence, par exemple fragment comprenant une suite d'au moins 5 nucléotides contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences, et présentant au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence. c) on met en présence la fraction nucléique et ledit réactif, et d) par détection on détermine tout signal ou information résultant de la réaction spécifique entre ledit réactif et la fraction nucléique, caractérisant la présence dans ledit échantillon de ladite espèce animale d'origine.
Elle concerne en outre un procédé tel que décrit précédemment, caractérisé en ce qu'on dispose d'un ensemble comprenant une multiplicité desdits réactifs spécifiques à une même espèce d'origine et/ou à des espèces animales d'origine respectivement différentes ; et on détermine une multiplicité de signaux ou informations caractérisant la présence dans ledit échantillon d'une même espèce animale d'origine ou de plusieurs espèces animales d'origine respectivement différentes.
Elle concerne également toute séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle est choisie dans le groupe constitué par : a) les séquences de référence SEQ ID Nos 1 à 232 , Nos 242 à 261 , b) les séquences complémentaires à chacune des séquences SED ID Nos 1 à 232 , Nos 242 à 261 respectivement, la complémentarité s'entendant de toute séquence susceptible de s'hybrider une température comprise entre 20 et 70°C et préférentiellement entre 35 et 65°C en solution saline à une concentration d'environ 0,5 à 1 M et préférentiellement 0,8 à 1 M avec l'une quelconque des séquences SEQ ID Nos 1 à 232 , Nos 242 à 261 c) les séquences homologues à chacune des séquences SEQ ID
Nos 1 à 232 , Nos 242 à 261 et des séquences selon b) respectivement l'homologie s'entendant de toute séquence, par exemple fragment comprenant une suite d'au moins 5 nucléotides contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences, et présentant au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence. Elle concerne également l'utilisation d'une séquence précédemment définie, pour la détermination d'au moins une espèce animale d'origine dans un échantillon susceptible de contenir un ingrédient obtenu à partir d'au moins ladite espèce animale.
L'invention concerne un procédé de détermination d'une espèce animale d'origine dans un échantillon susceptible de contenir un ingrédient obtenu à partir d'au moins ladite espèce, caractérisé en ce qu'il permet ladite détermination dans un échantillon contenant au moins un autre ingrédient obtenu à partir d'une autre espèce animale et sans connaissance préalable des espèces en présence et en ce que : a) on dispose d'une fraction nucléique obtenue à partir dudit échantillon, b) on dispose d'au moins un réactif spécifique à l'espèce animale, choisi dans le groupe constitué par
- les séquences de référence SEQ ID Nos 1 à 232, Nos 242 à 261 ,
- les séquences complémentaires à chacune des séquences SED ID Nos 1 à 232 , Nos 242 à 261 , respectivement, la complémentarité s'entendant de toute séquence susceptible de s'hybrider à une température comprise entre 20 et 70°C et préférentiellement entre 35 et 65°C en solution saline à une concentration d'environ 0,5 à 1 M et préférentiellement 0,8 à 1M avec l'une quelconque des séquences SEQ ID Nos 1 à 232 , Nos
242 à 261- les séquences homologues à chacune des séquences SEQ ID Nos 1 à 232 , Nos 242 à 261 et des séquences complémentaires à chacune des séquences SED ID Nos 1 à 232 , Nos 242 à 261 respectivement, l'homologie s'entendant de toute séquence, par exemple fragment comprenant une suite d'au moins 5 nucléotides contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences, et présentant au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence. c) on met en présence la fraction nucléique et ledit réactif, et d) par détection on détermine tout signal ou information résultant de la réaction spécifique entre ledit réactif et la fraction nucléique, caractérisant la présence dans ledit échantillon de ladite espèce animale d'origine.
L'invention peut en outre être une sonde pour la détermination d'au moins une espèce animale d'origine, comprenant au moins une séquence nucléotidique d'identification précédemment définie.
Elle concerne également une amorce pour l'amplification spécifique d'un acide nucléique d'une espèce animale d'origine, comprenant au moins une séquence nucléotidique d'identification précédemment définie.
Un autre mode de réalisation de l'invention est un réactif pour la détermination d'au moins une espèce animale d'origine, comprenant un support solide, à l'état divisé ou non, sur lequel est fixée une séquence nucléotidique précédemment définie.
Selon l'invention les séquences nucléotidiques ou leurs fragments peuvent être fixés sur un support solide et peuvent constituer une biopuce qui permet la détermination de la multiplicité de signaux ou informations.
Le procédé selon l'invention peut être conduit de manière manuelle, semi-automatique ou automatique, permettant la mise en œuvre d'un moyen de détermination de l'espèce animale d'origine de la matière animale contenue dans un échantillon. Cette invention concerne également une méthode de détection utilisant en particulier la technique des biopuces. Cette méthode de détection est spécifique des espèces recherchées grâce à l'utilisation de séquences, dites séquences d'identification de chaque espèce, comme sonde. La rapidité, la sensibilité et la spécificité de cette méthode de détection, permettent de l'appliquer indifféremment à tout milieu. En particulier cette méthode s'applique à tout échantillon de produit alimentaire, comportant de la matière animale quelque soit son état et les procédés de fabrication et/ou d'élaboration mis en œuvre, en particulier les techniques de cuisson, de déshydratation et/ou de conservation, et à tout échantillon de produit manufacturé susceptible de contenir des extraits animaux, comme par exemple les produits cosmétiques et/ou les produits pharmaceutiques comportant par exemple des gélatines d'origine animale.
Cette détection simultanée en une seule étape de multiples produits d'amplifications spécifiques, est possible grâce à l'utilisation de support solide en particulier sous la forme d'un support solide de dimension réduite où sont fixées une multitude de sondes de capture à des positions prédéterminées, ou « biopuce », ces sondes de capture étant constituées par un jeu de fragments ou de la totalité de séquences nucléotidiques spécifiques dites séquences d'identification des espèces recherchées.
Ces séquences nucléotidiques peuvent également être mises en œuvre dans toutes les techniques d'hybridation connues comme les techniques de dépôt ponctuel sur filtre dites "DOT-BLOT"[Maniatis et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1982], les techniques de transfert d'ADN dites "SOUTHERN BLOT" [Southern E. M., J. Mol. Biol., 1975, 98, 503], les techniques de transfert d'ARN dites "NORTHERN BLOT", ou les techniques "SANDWICH" [Dunn A.R. et al., Cell,1977, 12,23].
La présente invention concerne également la détermination de groupe d'espèces ou classe d'espèces animales ou taxon. Ces groupes d'espèces ou classes ou taxons son constitués par exemple de classe, comme la classe des mammifères, les oiseaux ou les poissons, voire de sous groupes d'espèces comme une famille d'oiseaux ou de deux sou-groupes réunis comme les oiseaux ou les mammifères.
Cette identification est possible grâce à l'identification de séquences nucléotidiques, appelées séquences signatures, caractéristiques d'une classe, d'un groupe, d'un sous-groupe ou d'un taxon, et correspondant à des régions conservées pour l'ensemble des individus constituant le groupe. Toute séquence signature spécifique à une classe d'animaux mises en œuvre dans le procédé selon la présente invention présente la caractéristique selon laquelle, d'une part elle a une région nucléique conservée pour pratiquement toutes les espèces animales d'une même classe taxonomique, et d'autre part elle peut être discriminée d'autres séquences répondant à la même définition que précédemment, dans les conditions usuelles de détermination, définies de manière générique dans les revendications en annexe.
L'invention concerne également un procédé de détermination d'un groupe d'espèces animales d'origine dans un échantillon susceptible de contenir un ingrédient obtenu à partir d'au moins une espèce appartenant au dit groupe d'espèces animales considéré, caractérisé en ce que : a) on dispose d'une fraction nucléique obtenue à partir dudit échantillon, b) on identifie la ou les séquences nucléotidiques caractéristiques du groupe d'espèces animales à déterminer c) on dispose d'au moins un réactif comprenant une séquence identifiée à l'étape b), c) on met en présence la fraction nucléique et ledit réactif, et d) par détection on détermine tout signal ou information résultant de la présence d'une des séquences précédemment définies, caractérisant la présence dans ledit échantillon d'un groupe d'espèces animales d'origine.
Par exemple, pour la détection de la présence de mammifères on utilisera
1/ la séquence signature M1 , correspondant à la séquence SEQ N°235 GACACAACAA CAGC, positions 14685 à 14698 (séquence de référence Bos taurus genbank ; n° accession V00654). Les bases CAA en positions 14689- 14690-14691 (séquence de référence Bos taurus genbank ; n° accession V00654) sont conservées pour l'ensemble du matériel nucléique correspondant aux espèces prédéfinies constituant le groupe que l'on veut rechercher, ici les mammifères. On observe au plus 5 positions mutées pour le reste de la signature citée pour l'ensemble des séquences constituant le matériel nucléique du groupe de mammifères choisis. La présence de ces trois bases aux positions indiquées ci dessus permet ainsi de déterminer la présence de mammifères dans l'échantillon.
2/ la séquence signature M2, correspondant à la séquence SEQ N°262 positions 14634 à 14648 (séquence de référence Bos taurus genbank ; n° accession V00654). La base T en positions 14641 (séquence de référence Bos taurus genbank ; n° accession V00654) est conservée pour l'ensemble du matériel nucléique correspondant aux espèces prédéfinies constituant le groupe que l'on veut rechercher, ici les mammifères. On observe au plus 5 positions mutées pour le reste de la signature citée pour l'ensemble des séquences constituant le matériel nucléique du groupe de mammifères choisis. La présence de cette base à la position indiquée ci dessus permet ainsi de déterminer la présence de mammifères dans l'échantillon
3/ la séquence signature M3, correspondant à la séquence SEQ N°263, positions 14771 à 14785 (séquence de référence Bos taurus genbank ; n° accession V00654). La base A en position 14778 (séquence de référence Bos taurus genbank ; n° accession V00654) est conservée pour l'ensemble du matériel nucléique correspondant aux espèces prédéfinies constituant le groupe que l'on veut rechercher, ici les mammifères. On observe au plus 5 positions mutées pour le reste de la signature citée pour l'ensemble des séquences constituant le matériel nucléique du groupe de mammifères choisis. La présence de cette base à la position indiquée ci dessus permet ainsi de déterminer la présence de mammifères dans l'échantillon.
L'identification de la présence d'oiseaux est déterminée par les signatures :
1/ 01 , correspondant à la séquence SEQ N°236 TCCCTAGCCT TCTC, positions 15073 à 15086 (séquence de référence Gallus gallus; genbank n° accession X52392). Les bases CT (positions 15076-15077) sont conservées pour l'ensemble du matériel nucléique correspondant aux espèces prédéfinies constituant le groupe que l'on veut rechercher, ici les oiseaux. On observe au plus 5 positions mutées pour le reste de la signature citée pour l'ensemble des séquences constituant le matériel nucléique du groupe d'oiseaux choisis. La présence de ces deux bases aux positions indiquées ci dessus permet ainsi de déterminer la présence d'oiseaux dans l'échantillon.
2/ O2, correspondant à la séquence SEQ N°237 ACACTTGCCG GAAC, positions 15098 à 15111 (séquence de référence Gallus gallus; genbank n° accession X52392). Les bases CT ou CA (positions 15101 -15102) sont conservées pour l'ensemble du matériel nucléique correspondant aux espèces prédéfinies constituant le groupe que l'on veut rechercher, ici les oiseaux. On observe au plus 4 positions mutées pour le reste de la signature citée pour l'ensemble des séquences constituant le matériel nucléique du groupe d'oiseaux choisis. La présence de ces deux bases aux positions indiquées ci dessus permet ainsi de déterminer la présence d'oiseaux dans l'échantillon. 3/ 03, correspondant à la séquence SEQ N°264, positions 15036 à 15050 (séquence de référence Gallus gallus genbank ; n° accession X52392). La base C en position 15043 (séquence de référence Gallus gallus genbank ; n° accession X52392) est conservée pour l'ensemble du matériel nucléique correspondant, aux espèces prédéfinies constituant le groupe que l'on veut rechercher, ici les oiseaux. On observe au plus 5 positions mutées pour le reste de la signature citée pour l'ensemble des séquences constituant le matériel nucléique du groupe d'oiseaux choisis. La présence de cette base à la position indiquée ci dessus permet ainsi de déterminer la présence d'oiseaux dans l'échantillon.
4/ 04, correspondant à la séquence SEQ N°265, positions 15069 à 15083 (séquence de référence Gallus gallus genbank ; n° accession X52392). La base C en position 15076 (séquence de référence Gallus gallus genbank ; n° accession X52392) est conservée pour l'ensemble du matériel nucléique correspondant aux espèces prédéfinies constituant le groupe que l'on veut rechercher, ici les oiseaux. On observe au plus 5 positions mutées pour le reste de la signature citée pour l'ensemble des séquences constituant le matériel nucléique du groupe d'oiseaux choisis. La présence de cette base à la position indiquée ci dessus permet ainsi de déterminer la présence d'oiseaux dans l'échantillon.
5/ 05, correspondant à la séquence SEQ N°266, positions 15094 à 15108 (séquence de référence Gallus gallus genbank ; n° accession X52392). La base C en position 15101 (séquence de référence Gallus gallus genbank ; n° accession X52392) est conservée pour l'ensemble du matériel nucléique correspondant aux espèces prédéfinies constituant le groupe que l'on veut rechercher, ici les oiseaux. On observe au plus 5 positions mutées pour le reste de la signature citée pour l'ensemble des séquences constituant le matériel nucléique du groupe d'oiseaux choisis. La présence de cette base à la position indiquée ci dessus permet ainsi de déterminer la présence d'oiseaux dans l'échantillon.
6/ 06, correspondant à la séquence SEQ N°267, positions 15102 à 15116 (séquence de référence Gallus gallus genbank ; n° accession X52392). La base A en position 15109 (séquence de référence Gallus gallus genbank ; n° accession X52392) est conservée pour l'ensemble du matériel nucléique correspondant aux espèces prédéfinies constituant le groupe que l'on veut rechercher, ici les oiseaux. On observe au plus 5 positions mutées pour le reste de la signature citée pour l'ensemble des séquences constituant le matériel nucléique du groupe d'oiseaux choisis. La présence de cette base à la position indiquée ci dessus permet ainsi de déterminer la présence d'oiseaux dans l'échantillon. 11 07, correspondant à la séquence SEQ N°268, positions 15108 à 15122 (séquence de référence Gallus gallus genbank ; n° accession X52392). La base C en position 15115 (séquence de référence Gallus gallus genbank ; n° accession X52392) est conservée pour l'ensemble du matériel nucléique correspondant aux espèces prédéfinies constituant le groupe que l'on veut rechercher, ici les oiseaux. On observe au plus 5 positions mutées pour le reste de la signature citée pour l'ensemble des séquences constituant le matériel nucléique du groupe d'oiseaux choisis. La présence de cette base à la position indiquée ci dessus permet ainsi de déterminer la présence d'oiseaux dans l'échantillon. 8/ 08, correspondant à la séquence SEQ N°269, positions 15232 à 15246 (séquence de référence Gallus gallus genbank ; n° accession X52392). La base C en position 15239 (séquence de référence Gallus gallus genbank ; n° accession X52392) est conservée pour l'ensemble du matériel nucléique correspondant aux espèces prédéfinies constituant le groupe que l'on veut rechercher, ici les oiseaux. On observe au plus 5 positions mutées pour le reste de la signature citée pour l'ensemble des séquences constituant le matériel nucléique du groupe d'oiseaux choisis. La présence de cette base à la position indiquée ci dessus permet ainsi de déterminer la présence d'oiseaux dans l'échantillon.
L'identification de la présence de mammifères et d'oiseaux est déterminée par la signature V, correspondant à la séquence SEQ N°238 ATAGCCACAGCATT, positions 14883 à 14896 (séquence de référence Bos taurus genbank ; n° accession V00654). Les bases GC (en positions 14886 et 14887) sont conservées pour l'ensemble du matériel nucléique correspondant aux espèces prédéfinies constituant le groupe que l'on veut rechercher, ici les oiseaux et les mammifères. On observe au plus 4 positions mutées pour le reste de la signature citée pour l'ensemble des séquences constituant le matériel nucléique du groupe d'oiseaux et mammifères choisis. La présence de ces deux bases aux positions indiquées ci dessus permet ainsi de déterminer la présence de mammifères et d'oiseaux dans l'échantillon. L'identification de la présence de poissons est déterminée par 1/ la signature P1 , correspondant à la séquence SEQ N°239 ATAATAACCTCTTT, positions 14713 à 14726 (séquence de référence Gadus morhua ; genbank n° accession X99772). Les bases ATA ou ATG (positions 14716-14717-14718 ) sont conservées pour l'ensemble du matériel nucléique correspondant aux espèces prédéfinies constituant le groupe que l'on veut rechercher, ici les poissons. On observe au plus 4 positions mutées pour le reste de la signature citée pour l'ensemble des séquences constituant le matériel nucléique du groupe de poissons choisis. La présence de ces trois bases aux positions indiquées ci dessus permet ainsi de déterminer la présence de poissons dans l'échantillon.
2/ la séquence signature P2, correspondant à la séquence SEQ N°270, positions 14512 à 14526 (séquence de référence Gadus morhua genbank ; n° accession X99772). La base T en position 14519 (séquence de référence Gadus morhua genbank ; n° accession X99772) est conservée pour l'ensemble du matériel nucléique correspondant aux espèces prédéfinies constituant le groupe que l'on veut rechercher, ici les poissons. On observe au plus 5 positions mutées pour le reste de la signature citée pour l'ensemble des séquences constituant le matériel nucléique du groupe de poissons choisis. La présence de cette base à la position indiquée ci dessus permet ainsi de déterminer la présence de poissons dans l'échantillon.
3/ la séquence signature P3, correspondant à la séquence SEQ N°271 , positions 14710 à 14724 (séquence de référence Gadus morhua genbank ; n° accession X99772). La base T en position 14717 (séquence de référence Gadus morhua genbank ; n° accession X99772) est conservée pour l'ensemble du matériel nucléique correspondant aux espèces prédéfinies constituant le groupe que l'on veut rechercher, ici les poissons. On observe au plus 5 positions mutées pour le reste de la signature citée pour l'ensemble des séquences constituant le matériel nucléique du groupe de poissons choisis. La présence de cette base à la position indiquée ci dessus permet ainsi de déterminer la présence de poissons dans l'échantillon.
La présente invention concerne donc également une séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle est choisie dans le groupe constitué par : a) les séquences de référence SEQ ID Nos 235 à 239, 262 à 271 b) les séquences complémentaires à chacune des séquences SED ID Nos 235 à 239 , 262 à 271 respectivement, la complémentarité s'entendant de toute séquence susceptible de s'hybrider à une température comprise entre 20 et 70°C en solution saline à une concentration d'environ 0,5 à 1 M avec l'une quelconque des séquences SEQ ID Nos 235 à 239 , 262 à 271 , c) les séquences homologues à chacune des séquences SEQ ID Nos 235 à 239 , 262 à 271 et des séquences selon b) respectivement l'homologie s'entendant de toute séquence, par exemple fragment, comprenant une suite d'au moins 5 nucléotides contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences ainsi qu'un groupe de deux ou trois nucléotides appartenant à une région conservée pour l'ensemble des espèces d'un groupe considéré, et ladite séquence présentant au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
Elle concerne plus particulièrement les séquences nucléotidiques telles que définies ci-dessus et caractérisées en ce qu'elles sont constituées d'un groupe de 2 à 3 nucléotides compris dans l'une des séquences SEQ ID Nos 235 à 239 et correspondant à une région conservée pour l'ensemble des espèces d'un groupe considéré.
Elle concerne également l'utilisation des séquences définies précédemment, c'est à dire caractérisées en ce qu'elles sont constituées d'un groupe de 2 à 3 nucléotides compris dans l'une des séquences SEQ ID Nos 235 à 239 et correspondant à une région conservée pour l'ensemble des espèces d'un groupe considéré, pour la détermination d'un groupe d'espèces animales d'origine dans un échantillon susceptible de contenir un ingrédient obtenu à partir d'au moins une espèce animale appartenant au dit groupe d'espèces animales considéré.
Ces séquences dites séquences signatures sont choisies parmi le groupe constitué par la séquence nucléotidique constituée des bases CAA en positions 14689-14690-14691 de SEQ ID N°235, de la séquence nucléotidique constituée des bases CT en positions 15076-15077 de SEQ ID N°236, de la séquence nucléotidique constituée des bases CT en positions 15101-15102 de SEQ ID N°237, de la séquence nucléotidique constituée des bases GC en positions 14886-14887 de SEQ ID N°238, et de la séquence nucléotidique constituée des bases ATA en positions 14713-14726 de SEQ ID N°239. Elle concerne plus particulièrement les séquences nucléotidiques telles que définies ci-dessus et caractérisées en ce qu'elles sont constituées d'un 1 nucléotide compris dans l'une des séquences SEQ ID Nos 262 à 271 et correspondant à une région conservée pour l'ensemble des espèces d'un groupe considéré.
Elle concerne également l'utilisation des séquences définies précédemment, c'est à dire caractérisées en ce qu'elles sont constituées d'un 1 nucléotide compris dans l'une des séquences SEQ ID Nos 262 à 271 et correspondant à une région conservée pour l'ensemble des espèces d'un groupe considéré, pour la détermination d'un groupe d'espèces animales d'origine dans un échantillon susceptible de contenir un ingrédient obtenu à partir d'au moins une espèce animale appartenant au dit groupe d'espèces animales considéré.
Ces séquences dites séquences signatures sont choisies parmi le groupe constitué par la séquence nucléotidique constituée de la base T en positions 14641 de SEQ ID N°262, de la séquence nucléotidique constituée de la base A en positions 14778 de SEQ ID N°263, de la séquence nucléotidique constitué de la base C en positions 15043 de SEQ ID N°264, de la séquence nucléotidique constituée de la base C en positions 15076 de SEQ ID N°265, par la séquence nucléotidique constituée de la base C en positions 15101 de SEQ ID N°266, de la séquence nucléotidique constituée de la base A en positions 15109 de SEQ ID N°267, de la séquence nucléotidique constitué de la base C en positions 15115 de SEQ ID N°268, de la séquence nucléotidique constituée de la base C en positions 15239 de SEQ ID N°269, de la séquence nucléotidique constituée de la base T en positions 14519 de SEQ ID N°270, de la séquence nucléotidique constitué de la base T en positions 14717 de SEQ ID N°271.
Elle concerne également un réactif pour la détermination d'au moins une espèce animale d'origine, comprenant un support solide, à l'état divisé ou non, sur lequel est fixée une séquence nucléotidique choisie parmi le groupe constitué par les séquences SEQ ID Nos 235 à 239, Nos 262 à 271. Elle concerne également le procédé de détermination d'un groupe d'espèces animales d'origine dans un échantillon susceptible de contenir un ingrédient obtenu à partir d'au moins une espèce appartenant au dit groupe d'espèces animales considéré, caractérisé en ce que : a) on dispose d'une fraction nucléique obtenue à partir dudit échantillon, b) on dispose d'au moins un réactif comprenant une séquence précédemment définie, c) on met en présence la fraction nucléique et ledit réactif, et d) par détection on détermine tout signal ou information résultant de la présence d'une des séquences signatures choisies parmi le groupe constitué par la séquence nucléotidique constituée des bases CAA en positions 14689-14690-14691 de SEQ ID N°235, de la séquence nucléotidique constituée des bases CT en positions 15076-15077 de SEQ ID N°236, de la séquence nucléotidique constituée des bases CT en positions 15101-15102 de SEQ ID
N°237, de la séquence nucléotidique constituée des bases GC en positions 14886-14887 de SEQ ID N°238, et de la séquence nucléotidique constituée des bases ATA ou ATG en positions 14713-14726 de SEQ ID N°239, de la séquence nucléotidique constituée de la base T en positions 14641 de SEQ ID N°262, de la séquence nucléotidique constituée de la base A en positions 14778 de SEQ ID N°263, de la séquence nucléotidique constitué de la base C en positions 15043 de SEQ ID N°264, de la séquence nucléotidique constituée de la base C en positions 15076 de SEQ ID N°265, par la séquence nucléotidique constituée de la base C en positions 15101 de SEQ ID N°266, de la séquence nucléotidique constituée de la base A en position 15109 de SEQ ID N°267, de la séquence nucléotidique constitué de la base C en positions 15115 de SEQ ID N°268, de la séquence nucléotidique constituée de la base C en positions 15239 de SEQ
ID N°269, de la séquence nucléotidique constituée de la base T en positions 14519 de SEQ ID N°270, de la séquence nucléotidique constitué de la base T en positions 14717 de SEQ ID N°271 caractérisant la présence dans ledit échantillon d'une classe d'espèces animales ou d'un groupe d'espèces animales d'origine.
Les séquences d'identification peuvent également être mises en œuvre comme amorces spécifiques dans des techniques d'identification par
PCR, par mélange de plusieurs amorces choisies parmi les séquences nucléotidiques spécifiques d'une espèce animale en présence d'autres espèces susceptibles d'être présentes dans les milieux à doser, et en ce que au moins une desdites amorces est choisie parmi le groupe constitué par les séquences SEQ ID Nos : 1 à 232, 242 à 261 , et toutes séquences comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et présentant au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence
L'invention concerne également les séquences nucléotidiques, choisies parmi le groupe constitué des séquences SEQ ID N° 240 à SEQ ID N°241 et SEQ ID N° 272 à 276 et leur utilisation comme amorces d'amplification universelles, c'est à dire utilisables pour la détection d'espèces en mélange et suffisamment sensibles vis à vis des différentes espèces pour éviter des résultats erronés dus au masquage de certaines espèces présentes en très faible proportion en raison de trop grande sensibilité vis à vis d'une autre espèce susceptible d'être présente dans un proportion plus importante. Préférentiellement, ces amorces sont utilisées en couple choisies parmies les couples suivants : SEQ ID N°240 et SEQ ID N°241 , SEQ ID N°272 et SEQ ID N°273, SEQ ID N°274 et SEQ ID N°275.
Ces amorces sont utilisées pour la mise en œuvre des étapes d'amplification des procédés précédemment décrits, notamment lorsque les échantillons comprennent ou sont susceptibles de contenir du matériel biologique provenant d'espèces appartenant au groupe des vertébrés.
Les exemples suivants sont donnés à titre illustratif et n'ont aucun caractère limitatif. Ils permettront de mieux comprendre l'invention.
Exemple 1 : Détection d'une espèce animale dans un échantillon
(tableau 1 )
a) Préparation de l'échantillon
Des échantillons provenant de plusieurs espèces animales (mammifères, oiseaux, poissons) ont été utilisés dans cet exemple. Ces échantillons se répartissaient en plusieurs catégories :
- des échantillons de référence (désignés sous le terme « ref » dans le tableau 1 ) : ADN de référence de diverses espèces animales : ADN de mammifères (bœuf, chèvre, mouton, porc, lapin, lièvre, renne), ADN d'oiseaux (autruche, poulet, dinde, oie), ADN de poissons (cabillaud, thon albacore, thon listao, merlu, maquereau espagnol, thonine de l'Atlantique, truite arc-en-ciel, truite de mer, saumon de fontaine)
- des prélèvements tissulaires effectués au laboratoire selon un protocole classique : prélèvement buccal de chèvre, de chat ; souris - des prélèvements alimentaires, dont la composition exacte et l'origine sont connues : blanquette de veau, bœuf Bourguignon, langue de veau en sauce, rôti d'agneau, rôti de porc, cuisse de poulet,
- des échantillons commerciaux (désignés sous le terme « comm » dans le tableau 1), obtenus en grande distribution à base de boeuf (foie de veau, beefsteack, côte de veau, vache à lait, rôti de veau, Parmentier, Bolognaise), de porc (Jamkon, saucisson, saucisse, porc à la chinoise), d'oiseau (steack d'autruche, poulet rôti, pintade rôti, cuisse de dinde, oie rôtie), de poisson (anguille d'Europe, filet de morue salée, thon albacore en boite, thon listao en boite, filet de saumon atlantique, maquereau commun, truite arc- en-ciel, omble chevalier).
Tous les échantillons sont numérotés (E1 à E57), et cette numérotation a été conservée dans les 5 exemples illustrant l'invention.
Chaque échantillon est placé dans un sac type baglight® (Intersciences) puis malaxé jusqu'à homogénéisation dans un malaxeur type BagMixer® (Intersciences).
b) Lyse de 25 mg d'échantillon et purification des ADN totaux La lyse de l'échantillon et la purification des acides nucléiques est réalisée par l'utilisation du Dneasy ™ Tissue Nécessaire (Qiagen, ref 69504) en appliquant le protocole préconisé par Qiagen pour l'extraction et la purification des acides nucléiques de tissus animaux.
c) PCR
Une PCR est réalisée en utilisant le nécessaire Ampli Taq gold de Applied Biosystems suivant le protocole ci dessous. On ajoute à 2μl de la suspension d'ADN total le tampon 10X gold buffer , 3,5mM de Mgcl2, 100μM de dNTPs (deoxyribonucleosides triphosphates), 2U de Taq gold polymérase, 0,4μM des amorces euvertébrés telles que décrites par Bartlett et al en 1992 (Biotechniques vol12n°3 p408.412) : SEQ ID N°233: 5' CCATCCAACA TCTCAGCATG ATGAAA 3'
(séquence CDL) SEQ ID N°234: 5' GAAATTAATA CGACTCACTA TAGGGAGACC
ACACCCCTCA GAATGATATT TGTCCTCA3' (séquence CBHT7, en gras : promoteur de la polymérase T7), afin d'obtenir 50μl de volume réactionnel final.
Un premier cycle de PCR de 10 minutes est réalisé à 95°C suivi de 35 cycles composés chacun des 3 étapes suivantes : 94°C pendant 45 secondes, 50°C pendant 45 secondes, 72°C pendant 2 minutes. Une extension finale de 5 minutes à 72°C est ensuite réalisée.
d) Vérification de l'amplification
Afin de vérifier l'amplification, 5μl de produit d'amplification (ou amplicon) sont déposés sur un gel d'agarose 1 ,5% dans un tampon EDTA-Tris Borate. Après une migration de 20 minutes à 100 Volts, la bande d'amplification est visualisée par coloration au Bromure d'Ethidium et par illumination aux Ultra Violets. L'amplification est positive comme le démontre la présence d'une bande ayant la taille attendue (350 paires de bases).
e) Identification de l'amplicon sur une puce à ADN (Affymetrix, Santa Clara)
Une biopuce est synthétisée sur un support solide en verre selon le procédé décrit dans le brevet US 5,744,305 (Affymetrix, Fodor et al) en utilisant la stratégie de reséquençage décrite dans la demande WO 95/1 1995
(Affymax, Chee et al) et selon la méthode décrite par A. Troesch et al. (J. Clin. Microbiol., 37(1 ) : 49-55, 1999).
Chaque séquence d'identification comporte 17 bases, avec une position d'interrogation en oeme position par rapport à l'extrémité 3' de la séquence.
L'analyse est effectuée avec le système complet GeneChip® (référence 900228, Affymetrix, Santa Clara, CA) qui comprend le lecteur GeneArray®, la station fluidique GeneChip® et le logiciel d'analyse GeneChip®. e. 1. Transcription et marquage des amplicons
Grâce à l'amorce antisens CBHT7, tous les produits d'amplification présentent un promoteur pour la RNA polymérase T7. Ces amplicons vont alors servir de matrice à une réaction de transcription au cours de laquelle sera incorporé un ribonucléotide fluorescent. A partir des 50μl de produit d'amplification positif, un aliquot de 2μl est prélevé et ajouté à un mélange de transcription contenant les composants du nécessaire Megascript T7 (Ambion, ref. 1334) et de fluorescein-12-UTP (Roche, ref. 1427857). Le mélange réactionnel final se fait dans 20μl et la réaction de transcription s'effectue pendant 2 heures à 37°C. e. 2. Fragmentation des transcripts marqués Afin d'améliorer les conditions d'hybridation, les transcripts marqués sont fragmentés en fragments d'environ 20 nucléotides. Pour cela, les 20μl de transcripts marqués sont soumis à l'action de l'imidazole (Sigma) 30mM et du chlorure de manganèse (Merck) 30mM pendant 30 minutes à 65°C. e. 3. Hybridation sur la puce à ADN
A partir des 20μl de transcripts marqués et fragmentés, un aliquot de 7μl est prélevé et ajouté à 700μl de tampon d'hybridation (SSPE 6X (Eurobio), DTAB 5mM (Sigma), Bétaine 3M (Acros), antifoam 0,01 % (ref A80082, Sigma), et 250 μg/ml d'ADN de sperme de hareng (Gibco). Ce mélange est hybride sur la puce dans les conditions suivantes: 30 minutes à 40°C. Après lavage, la puce est scannée, puis l'image d'hybridation obtenue est analysée par le logiciel GeneChip® (Affymetrix, Santa Clara, CA). Les spots d'hybridation permettent de reconstituer la séquence de l'amplicon, qui est ensuite comparée aux séquences de références de la puce. La séquence (et donc l'espèce qui lui correspond) qui présente le meilleur pourcentage d'homologie (appelé aussi « base-call », exprimé en %) avec la séquence de l'amplicon est retenue pour l'identification. e.4. Interprétation des résultats.
Seule une partie de la séquence de 350 bases est analysée pour chaque espèce. Elle correspond à tout ou partie des sondes d'identification. Le seuil d'interprétation, c'est à dire le niveau d'identification est fixé à 90% de base-call sur la séquence signature. En dessous de ce seuil, la cible, et donc l'espèce correspondante n'est pas considérée comme identifiée. f) Résultat
L'ADN extrait de l'échantillon alimentaire donne lieu à un produit d'amplification, puis à une identification sur la puce. Comme présenté dans le tableau 1 , les échantillons de référence sont correctement analysés par cette technique, qui permet également la détection d'espèce animale (mammifère, oiseau, poisson) dans des échantillons commerciaux. Tableau 1 : détection d'une espèce animale dans un échantillon
Figure imgf000031_0001
Exemple 2 : Détection de plusieurs d'espèces animales dans un échantillon (tableau 2)
Les conditions expérimentales concernant la préparation des échantillons, la lyse des échantillons et la purification des ADN totaux, la PCR, la vérification de l'amplification et l'identification de l'amplicon sur une puce à ADN (Affymetrix, Santa Clara) sont identiques à ce qui est décrit dans l'exemple 1. Dans cet exemple, plusieurs espèces animales sont simultanément analysées à partir d'un même échantillon. L'analyse est réalisée sur : des échantillons de référence (désignés « ref », comme dans l'exemple 1) constitués par : un mélange d'ADN provenant de deux espèces d'animaux différentes, en proportion variable de chacune des 2 espèces un mélange d'amplicons (obtenus selon le protocole de l'exemple 1 ), en proportion variable de chacune des deux espèces, des échantillons commerciaux (désignés « comm », comme dans l'exemple 1), issus de la grande distribution, comprenant plusieurs espèces animales dans un même échantillon.
Comme présentés dans le tableau 2, ces résultats montrent que des mélanges d'espèces peuvent être détectées simultanément dans un même échantillon, que cet échantillon soit constitué d'un mélange d'ADN, d'un mélange d'amplicons ou d'un échantillon commercial comprenant plusieurs espèces.
Figure imgf000033_0001
Exemple 3: Détection d'une ou plusieurs espèces animales dans les farines destinées à l'alimentation animale. a) Préparation de l'échantillon Les conditions expérimentales concernant la préparation des échantillons sont similaires à ce qui est décrit dans l'exemple 1. Les échantillons sont issus de farines destinées à l'alimentation animale. Ces échantillons (numérotés de F1 à F17) ont été préalablement répertoriés selon 4 catégories, après analyse de la présence de fragments d'os telle que décrite par Michard (Revue de l'Alimentation animale, vol. 508, pp 43-48, 1997 ; technique de référence).
On distingue alors des échantillons « négatifs » lorsque le nombre de fragments d'os est inférieurs à 20, des échantillons « traces » lorsqu'il y a plus de 20 fragments d'os mais une proportion en os présents dans l'échantillon, inférieure à 0,01%, des échantillons « à suivre » lorsque la proportion est comprise entre 0,01 % et 1%o, et les échantillons « positifs » lorsque la proportion est supérieure à 1%0- b) Lyse de l'échantillon et purification des ADN totaux
Pour la lyse de l'échantillon et la purification des acides nucléiques, on utilise le Dneasy ™ Tissue Nécessaire (Qiagen, ref 69504) tel que décrit dans l'exemple 1 , à partir de 25 mg de farine. Une adaptation de la technique est réalisée afin d'éliminer les inhibiteurs de la PCR. En effet, ces inhibiteurs (polyphénols, cations (Ca2+ ,Fe3+), traces de métaux lourds, tanins, carbohydrates, sels (NaCI, nitrites)) sont en quantité importante dans les végétaux, et de ce fait dans les farines destinées à l'alimentation animale. Cette adaptation est la suivante :
1- Après la lyse avec le tampon ATL et la protéinase K, du chelex est ajouté lors de l'étape de purification de l'ADN (200μl de InstaGene™ Matrix (BIO-RAD, ref 732-6030). 2- Après incubation de 30 minutes à 56°C, une centrifugation (5 minutes ; 14000 tours/minutes) est réalisée, et l'extraction est réalisée telle que décrite dans le manuel Dneasy™ Tissue Nécessaire de Qiagen. c) PCR
On effectue une PCR en utilisant le nécessaire Ampli Taq gold de Applied Biosystems. On ajoute à 10μl de la suspension d'ADN total extrait de farines le tampon 10X gold buffer, 3,5mM de MgCI2, 100 μM de dNTPs (déoxyribonucleosides triphosphates), 2U de Taq gold polymérase, 0,4μM des amorces euvertébrés CBL et CBHT7 telles que définies dans l'exemple 1 afin d'obtenir 50μl de volume reactionnel final. On réalise un premier cycle de 10 minutes à 95°C de PCR puis 35 cycles composés chacun des 3 étapes suivantes : 94°C 45 sec, 50°C 45 sec, 72°C 2 minutes. Une extension finale de 5 minutes à 72°C est ensuite réalisée. d) Vérification de l'amplification
La vérification de l'amplification est réalisée comme décrit dans l'exemple 1. e) Identification de l'amplicon sur une puce à ADN (Affymetrix,
Santa Clara).
Cette étape d'identification est réalisée telle que décrite dans l'exemple 1. f) Résultat Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 3, et comparés aux résultats obtenus par le protocole classique de l'art antérieur. Il y parfaite concordance entre les 2 techniques, mais avec, en plus, l'indication de l'espèce dans le cas de l'invention. L'invention permet de détecter la présence d'une ou plusieurs espèces animales dans des échantillons de farines destinées à l'alimentation animale.
Tableau 3 : détection d'une ou plusieurs espèces animales dans les farines destinées à l'alimentation animale.
Figure imgf000036_0001
Exemple 4 : détection de la classe des d'espèces contenues dans un échantillon (tableau 4)
L'objectif de cet exemple est d'obtenir une technique permettant de détecter la classe de vertébrés (mammifères, oiseaux, poissons...) de l'animal d'origine de l'ingrédient contenu dans un échantillon alimentaire ou un échantillon de farine destinée à l'alimentation animale.
Les conditions expérimentales concernant a) la préparation de l'échantillon, b) la lyse de l'échantillon et la purification des ADN totaux, c) la PCR, d) la vérification de l'amplification et e) l'identification de l'amplicon sur une puce à ADN (Affymetrix, Santa Clara) sont similaires à ce qui est décrit dans l'exemple 1 et 3.
L'identification de la présence de mammifère et/ou poisson et/ou d'oiseaux est déterminée par la présence de signatures spécifiques à chaque classe.
Par exemple, pour la détection de la présence de mammifères on utilisera la séquence signature M1 , correspondant à la séquence SEQ N°235 GACACAACAA CAGC, positions 14685 à 14698 (séquence de référence Bos taurus genbank ; n° accession V00654). Les bases CAA en positions 14689- 14690-14691 (séquence de référence Bos taurus genbank ; n° accession V00654) sont conservées pour l'ensemble du matériel nucléique correspondant aux espèces prédéfinies constituant le groupe que l'on veut rechercher, ici les mammifères. On observe au plus 5 positions mutées pour le reste de la signature citée pour l'ensemble des séquences constituant le matériel nucléique du groupe de mammifères choisis. La présence de ces trois bases aux positions indiquées ci dessus permet ainsi de déterminer la présence de mammifères dans l'échantillon.
L'identification de la présence d'oiseaux est déterminée par les signatures : O1 , correspondant à la séquence SEQ N°236 TCCCTAGCCT
TCTC, positions 15073 à 15086 (séquence de référence Gallus gallus; genbank n° accession X52392). Les bases CT (positions 15076-15077) sont conservées pour l'ensemble du matériel nucléique correspondant aux espèces prédéfinies constituant le groupe que l'on veut rechercher, ici les oiseaux. On observe au plus 5 positions mutées pour le reste de la signature citée pour l'ensemble des séquences constituant le matériel nucléique du groupe d'oiseaux choisis. La présence de ces deux bases aux positions indiquées ci dessus permet ainsi de déterminer la présence d'oiseaux dans l'échantillon.
O2, correspondant à la séquence SEQ N°237 ACACTTGCCG GAAC, positions 15098 à 15111 (séquence de référence Gallus gallus; genbank n° accession X52392). Les bases CT ou CA (positions 15101 -15102) sont conservées pour l'ensemble du matériel nucléique correspondant aux espèces prédéfinies constituant le groupe que l'on veut rechercher, ici les oiseaux. On observe au plus 4 positions mutées pour le reste de la signature citée pour l'ensemble des séquences constituant le matériel nucléique du groupe d'oiseaux choisis. La présence de ces deux bases aux positions indiquées ci dessus permet ainsi de déterminer la présence d'oiseaux dans l'échantillon.
L'identification de la présence de mammifères et d'oiseaux est déterminée par la signature V1 , correspondant à la séquence SEQ N°238 ATAGCCACAGCATT, positions 14883 à 14896 (séquence de référence Bos taurus genbank ; n° accession V00654). Les bases GC (en positions 14886 et 14887) sont conservées pour l'ensemble du matériel nucléique correspondant aux espèces prédéfinies constituant le groupe que l'on veut rechercher, ici lesmammifères et les oiseaux. On observe au plus 4 positions mutées pour le reste de la signature citée pour l'ensemble des séquences constituant le matériel nucléique du groupe de mammifères et d'oiseaux choisis La présence de ces deux bases aux positions indiquées ci dessus permet ainsi de déterminer la présence de mammifères et d'oiseaux dans l'échantillon.
L'identification de la présence de poissons est déterminée par la signature P1 , correspondant à la séquence SEQ N°239 ATAATAACCTCTTT, positions 14713 à 14726 (séquence de référence Gadus morhua ; genbank n° accession X99772). Les bases ATA ou ATG (positions 14716-14717-14718 ) sont conservées pour l'ensemble du matériel nucléique correspondant aux espèces prédéfinies constituant le groupe que l'on vseut rechercher, ici les poissons. On observe au plus 4 positions mutées pour le reste de la signature citée pour l'ensemble des séquences constituant le matériel nucléique du groupe poissons choisis La présence de ces trois bases aux positions indiquées ci dessus permet ainsi de déterminer la présence de poissons dans l'échantillon. Comme présenté dans le tableau 4, cette technique permet de détecter la présence de mammifères et/ou d'oiseaux et/ou de poissons, que ces espèces soient présentes isolément ou en mélange. Tableau 4a : détection de classe d'espèces dans un échantillon
Figure imgf000039_0001
Une variante consiste à sélectionner non pas un triplet de nucléotides, mais un seul nucléotide représentatif d'une classe d'espèces donnée. Par exemple, pour la détection de la présence de mammifères, on utilisera indifféremment
1/ la séquence signature M2, correspondant à la séquence SEQ N°262 CTAATCCTACAAATC positions 14634 à 14648 (séquence de référence Bos taurus genbank ; n° accession V00654). La base T en positions 14641 (séquence de référence Bos taurus genbank ; n° accession V00654) est conservée pour l'ensemble du matériel nucléique correspondant aux espèces prédéfinies constituant le groupe que l'on veut rechercher, ici les mammifères. On observe au plus 5 positions mutées pour le reste de la signature citée pour l'ensemble des séquences constituant le matériel nucléique du groupe de mammifères choisis. La présence de cette base à la position indiquée ci dessus permet ainsi de déterminer la présence de mammifères dans l'échantillon 2/ la séquence signature M3, correspondant à la séquence SEQ N°263
AGCTTCAATGTTTTT, positions 14771 à 14785 (séquence de référence Bos taurus genbank ; n° accession V00654). La base A en position 14778 (séquence de référence Bos taurus genbank ; n° accession V00654) est conservée pour l'ensemble du matériel nucléique correspondant aux espèces prédéfinies constituant le groupe que l'on veut rechercher, ici les mammifères. On observe au plus 5 positions mutées pour le reste de la signature citée pour l'ensemble des séquences constituant le matériel nucléique du groupe de mammifères choisis. La présence de cette base à la position indiquée ci dessus permet ainsi de déterminer la présence de mammifères dans l'échantillon.
Pour la détection d'oiseaux, on peut utiliser indifféremment
1/ la séquence signature 03, correspondant à la séquence SEQ N°264 CGGCCTACTACTAGC, positions 15036 à 15050 (séquence de référence Gallus gallus genbank ; n° accession X52392). La base C en position 15043 (séquence de référence Ga//tvs gallus genbank ; n° accession X52392) est conservée pour l'ensemble du matériel nucléique correspondant aux espèces prédéfinies constituant le groupe que l'on veut rechercher, ici les oiseaux. On observe au plus 5 positions mutées pour le reste de la signature citée pour l'ensemble des séquences constituant le matériel nucléique du groupe d'oiseaux choisis. La présence de cette base à la position indiquée ci dessus permet ainsi de déterminer la présence d'oiseaux dans l'échantillon.
2/ la séquence signature O4, correspondant à la séquence SEQ N°265 CACATCCCTAGCCTT, positions 15069 à 15083 (séquence de référence Gallus gallus genbank ; n° accession X52392). La base C en position 15076 (séquence de référence Gallus gallus genbank ; n° accession X52392) est conservée pour l'ensemble du matériel nucléique correspondant aux espèces prédéfinies constituant le groupe que l'on veut rechercher, ici les oiseaux. On observe au plus 5 positions mutées pour le reste de la signature citée pour l'ensemble des séquences constituant le matériel nucléique du groupe d'oiseaux choisis. La présence de cette base à la position indiquée ci dessus permet ainsi de déterminer la présence d'oiseaux dans l'échantillon.
3/ la séquence signature 05, correspondant à la séquence SEQ N°266 GCCCACACTTGCCGG, positions 15094 à 15108 (séquence de référence Gallus gallus genbank ; n° accession X52392). La base C en position 15101 (séquence de référence Gallus gallus genbank ; n° accession X52392) est conservée pour l'ensemble du matériel nucléique correspondant aux espèces prédéfinies constituant le groupe que l'on veut rechercher, ici les oiseaux. On observe au plus 5 positions mutées pour le reste de la signature citée pour l'ensemble des séquences constituant le matériel nucléique du groupe d'oiseaux choisis. La présence de cette base à la position indiquée ci dessus permet ainsi de déterminer la présence d'oiseaux dans l'échantillon.
4/ la séquence signature O6, correspondant à la séquence SEQ N°267 TTGCCGGAACGTACA, positions 15102 à 15116 (séquence de référence Gallus gallus genbank ; n° accession X52392). La base A en position 15109 (séquence de référence Gallus gallus genbank ; n° accession X52392) est conservée pour l'ensemble du matériel nucléique correspondant aux espèces prédéfinies constituant le groupe que l'on veut rechercher, ici les oiseaux. On observe au plus 5 positions mutées pour le reste de la signature citée pour l'ensemble des séquences constituant le matériel nucléique du groupe d'oiseaux choisis. La présence de cette base à la position indiquée ci dessus permet ainsi de déterminer la présence d'oiseaux dans l'échantillon.
5/ la séquence signature O7, correspondant à la séquence SEQ N°268 GAACGTACAATACGG, positions 15108 à 15122 (séquence de référence Gallus gallus genbank ; n° accession X52392). La base C en position 15115 (séquence de référence Gallus gallus genbank ; n° accession X52392) est conservée pour l'ensemble du matériel nucléique correspondant aux espèces prédéfinies constituant le groupe que l'on veut rechercher, ici les oiseaux. On observe au plus 5 positions mutées pour le reste de la signature citée pour l'ensemble des séquences constituant le matériel nucléique du groupe d'oiseaux choisis. La présence de cette base à la position indiquée ci dessus permet ainsi de déterminer la présence d'oiseaux dans l'échantillon.
6/ la séquence signature O8, correspondant à la séquence SEQ N°269 TGAAACACAGGAGTA, positions 15232 à 15246 (séquence de référence Gallus gallus genbank ; n° accession X52392). La base C en position 15239 (séquence de référence Ga//t;s gallus genbank ; n° accession X52392) est conservée pour l'ensemble du matériel nucléique correspondant aux espèces prédéfinies constituant le groupe que l'on veut rechercher, ici les oiseaux. On observe au plus 5 positions mutées pour le reste de la signature citée pour l'ensemble des séquences constituant le matériel nucléique du groupe d'oiseaux choisis. La présence de cette base à la position indiquée ci dessus permet ainsi de déterminer la présence d'oiseaux dans l'échantillon.
Pour la détection de poissons, on peut utiliser indifféremment
1/ la séquence signature P2, correspondant à la séquence SEQ N°270 TCAGACATCGAGACA, positions 14512 à 14526 (séquence de référence Gadus morhua genbank ; n° accession X99772). La base T en position 14519 (séquence de référence Gadus morhua genbank ; n° accession X99772) est conservée pour l'ensemble du matériel nucléique correspondant aux espèces prédéfinies constituant le groupe que l'on veut rechercher, ici les poissons. On observe au plus 5 positions mutées pour le reste de la signature citée pour l'ensemble des séquences constituant le matériel nucléique du groupe de poissons choisis. La présence de cette base à la position indiquée ci dessus permet ainsi de déterminer la présence de poissons dans l'échantillon.
2/ la séquence signature P3, correspondant à la séquence SEQ N°271 GTAATAATAACCTCT, positions 14710 à 14724 (séquence de référence Gadus morhua genbank ; n° accession X99772). La base T en position 14717 (séquence de référence Gadus morhua genbank ; n° accession X99772) est conservée pour l'ensemble du matériel nucléique correspondant aux espèces prédéfinies constituant le groupe que l'on veut rechercher, ici les poissons. On observe au plus 5 positions mutées pour le reste de la signature citée pour l'ensemble des séquences constituant le matériel nucléique du groupe de poissons choisis. La présence de cette base à la position indiquée ci dessus permet ainsi de déterminer la présence de poissons dans l'échantillon.
Comme présenté dans le tableau 4b, cette technique permet de détecter la présence de mammifères et/ou d'oiseaux et/ou de poissons dans un échantillon notamment alimentaire. Tableau 4b : détection de classe d'espèces dans un échantillon
Figure imgf000043_0001
Exemple 5 : amorces universelles d'amplification des vertébrés (tableau 5a et 5b)
L'objectif des expériences présentées dans cet exemple est d'obtenir des amorces encore plus sensibles que celles décrites dans les exemples précédents, et plus universelles pour la détection des espèces en mélanges. En effet, les amorces utilisées dans les exemples 1 à 4 sont très sensibles vis à vis du bœuf, ce qui peut masquer parfois la présence d'autres espèces lorsque elles sont présentes en très faible proportion. Plusieurs couples d'amorces ont été utilisés dans cet exemple : Un premier couple d'amorces comprenant les séquences suivantes
SEQ ID N°240: 5' GACCTCCCAG CCCCATCAAA 3' (séquence CBL 20) et SEQ ID N°241 : 5' GAAATTAATA CGACTCACTA TAGGGAGACC
ACACAGAATG ATATTTGTCC TCA 3' ( séquence CBHT7 20, avec en gras, la localisation du promoteur de la polymérase T7) a été choisi dans un premier temps pour augmenter le seuil de détection de certaines espèces, notamment la dinde, ou le mouton, qui lorsqu'elles sont a l'état de trace dans un échantillon commercial, peuvent être masquées par la présence de boeuf. La technique utilisée pour obtenir l'identification sur la puce est telle que décrite dans l'exemple 1a, 1b, 1c (avec les amorces modifiées ), 1d, 1e.
Comme présenté dans le tableau 5a, l'utilisation de ces nouvelles amorces permettent d'obtenir, chez la dinde, un seuil de détection de l'ordre de 1% par comparaison avec les amorces des exemples 1 à 4 où le seuil de détection était de l'ordre de 10%. L'utilisation de ces nouvelles amorces permettent également, dans des échantillons commerciaux, provenant de la grande distribution, l'identification d'espèces animales, notamment le mouton, présentes à l'état de trace, qui étaient masquées par la présence de bœuf dans les exemples précédents (tableau 5b).
Tableau 5 a : seuil de détection de la dinde en mélange avec du boeuf
Figure imgf000045_0001
Tableau 5b : détection du mouton en mélange avec d'autres espèces
Figure imgf000045_0002
Dans un deuxième temps, un deuxième couple d'amorces a été choisi et utilisé en duplex avec le couple d'amorces décrit dans l'exemple 1 c : lors de la détection d'espèces animales présentes initialement dans une boite de conserve, on peut être confronté à un problème de dégradation de l'ADN des espèces animales que l'on souhaite détecter, notamment lors de boite de conserve de poissons (par exemple le thon en boite). La technique utilisée pour obtenir l'identification sur la puce est telle que décrite dans l'exemple 1a, 1b, 1d, 1e à l'exception de l'étape 1c : on utilise 2 amorces internes supplémentaires (en plus de celles universelles) qui permettent d'amplifier la région de 350 pb en deux parties plus petites. Plusieurs couples d'amorces sont étudiées, permettant d'amplifier la région de
350 pb en deux régions de longueur comprise entre 114 et 245 pb chacune, selon les amorces utilisées. Deux couples d'amorces ont alors été sélectionnées pour leur caractère universel.
Un premier couple d'amorces (utilisé en duplex 1) comprenant les séquences suivantes
SEQ ID N° 272 : 5' AGAIGCICCGTTTGCGTG 3' (flanqué du promoteur de la polymérase T7 et 1= Inosine))
SEQ ID N° 273:TTCTTCTTTATCTGTITCTA (/= Inosine) a été choisi dans un premier temps pour augmenter le seuil de détection de certaines espèces de poissons, en particulier lorsque ces espèces de poissons sont présentes dans une boite de conserve.
Un deuxième couple d'amorces (utilisé en duplex 2), comprenant les séquences suivantes, a également été sélectionné :
SEQ ID N° 274 : 5' RTCICGRCARATGTG 3' (flanqué du promoteur de la polymérase T7 et R= A ou G, 1= Inosine)
SEQ ID N° 275 : 5' GTIAAYTWYGGITGACTIATCCG 3' (M= A ou C, R= A ou
G, Y= C ou T, W= A ou T, 1= Inosine)
D'un façon comparable à ce qui est décrit dans l'exemple 1c, on effectue une PCR en utilisant le kit Ampli Taq gold de Applied Biosystems
(4311814)On ajoute à 2μl de la suspension d'ADN total le tampon 10Xgold buffer, 3.5mM de Mgcl2, 100μM de dNTPs (déoxyribonucleosides triphosphates), 2U de Taq gold polymérase, 0.2μM des amorces universels pour vertébrés CBL et CBHT7 tel que présentées dans l'exemple 1c, et 0.2μM des amorces choisies parmi les couples d'amorces définies ci dessus (duplex
1 et duplex 2), afin d'obtenir 50μl de volume reactionnel final. On réalise un premier cycle de 10mn à 95°C de PCR puis 35 cycles composés chacun des 3 étapes suivantes : 94°C 45 sec, 50°C 45 sec, 72°C 2mn. Une extension finale de 5mn à 72°C est ensuite réalisée. Une vérification de l'amplification est réalisée en déposant_5μl de produit d'amplification (amplicon) sur un gel d'agarose 1 ,5% dans de l'EDTA- Tris Borate. Après une migration de 20mn à 100V, on visualise deux bandes d'amplification par coloration au Bromure d'Ethidium et par illumination aux UV.
Les résultats obtenus par l'utilisation de chaque duplex est présenté dans le tableau 5c, et comparés aux résultats obtenus par une amplification « classique », en utilisant uniquement les amorces universelles telles que décrites dans l'exemple 1c.
Tableau 5c : détection de plusieurs espèces de poissons dans un échantillon (issus d'une boite de conserve)
Figure imgf000047_0001
Il apparaît que les amorces utilisés en duplex 1 et 2 présentent de meilleurs résultats et une meilleur sensibilité lorsque 'Ion souhaite détecter la présence de poissons notamment dans une boite de conserve.
Il est bien évident que chaque amorce peut être utilisée avec ou sans le promoteur T7.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de détermination d'une espèce animale d'origine dans un échantillon susceptible de contenir un ingrédient obtenu à partir d'au moins ladite espèce, caractérisé en ce que : a) on dispose d'une fraction nucléique obtenue à partir dudit échantillon, b) on dispose d'au moins un réactif spécifique à l'espèce animale, choisi dans le groupe constitué par - les séquences de référence SEQ ID Nos 1 à 232, Nos 242 à
261 ,
- les séquences complémentaires à chacune des séquences SED ID Nos 1 à 232 , Nos 242 à 261 respectivement, la complémentarité s'entendant de toute séquence susceptible de s'hybrider à une température comprise entre 20 et 70°C en solution saline à une concentration d'environ 0,5 à 1M, avec l'une quelconque des séquences SEQ ID Nos 1 à 232 , Nos 242 à 261 ,
- les séquences homologues à chacune des séquences SEQ ID Nos 1 à 232 , Nos 242 à 261 et des séquences complémentaires à chacune des séquences SED ID Nos 1 à 232 , Nos 242 à 261 respectivement, l'homologie s'entendant de toute séquence, par exemple fragment comprenant une suite d'au moins 5 nucléotides contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences, et présentant au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence. c) on met en présence la fraction nucléique et ledit réactif, et d) par détection on détermine tout signal ou information résultant de la réaction spécifique entre ledit réactif et la fraction nucléique, caractérisant la présence dans ledit échantillon de ladite espèce animale d'origine.
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu'on dispose d'un ensemble comprenant une multiplicité desdits réactifs spécifiques à une même espèce d'origine et/ou à des espèces animales d'origine respectivement différentes ; et on détermine une multiplicité de signaux ou informations caractérisant la présence dans ledit échantillon d'une même espèce animale d'origine et/ou de plusieurs espèces animales d'origine respectivement différentes.
3. Séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle est choisie dans le groupe constitué par : a) les séquences de référence SEQ ID Nos 1 à 232 , Nos 242 à
261 , b) les séquences complémentaires à chacune des séquences SED ID Nos 1 à 232 , Nos 242 à 261 respectivement, la complémentarité s'entendant de toute séquence susceptible de s'hybrider à une température comprise entre 20 et 70°C en solution saline à une concentration d'environ
0,5 à 1 M, avec l'une quelconque des séquences SEQ ID Nos 1 à 232 , Nos 242 à 261 , c) les séquences homologues à chacune des séquences SEQ ID Nos 1 à 232 , Nos 242 à 261 et des séquences selon b) respectivement, l'homologie s'entendant de toute séquence, par exemple fragment comprenant une suite d'au moins 5 nucléotides contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et présentant au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
4. Utilisation d'une séquence selon la revendication 3, pour la détermination d'au moins une espèce animale d'origine dans un échantillon susceptible de contenir un ingrédient obtenu à partir d'au moins ladite espèce animale.
5. Sonde pour la détermination d'au moins une espèce animale d'origine, comprenant au moins une séquence nucléotidique d'identification selon la revendication 3.
6. Amorce pour l'amplification spécifique d'un acide nucléique d'une espèce animale d'origine, comprenant au moins une séquence nucléotidique d'identification selon la revendication 3.
7. Réactif pour la détermination d'au moins une espèce animale d'origine, comprenant un support solide, à l'état divisé ou non, sur lequel est fixée une séquence nucléotidique selon la revendication 3.
8. Biopuce comprenant un support solide comportant une surface développée, sur laquelle est disposée et fixée une multiplicité de séquences nucléotidiques selon la revendication 3, et ceci selon un arrangement prédéterminé.
9. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on détermine la multiplicité de signaux ou informations avec une biopuce selon la revendication 8.
10. Séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle est choisie dans le groupe constitué par : a) les séquences de référence SEQ ID Nos 235 à 239, 262 à 271 b) les séquences complémentaires à chacune des séquences SED ID Nos 235 à 239, 262 à 271 respectivement, la complémentarité s'entendant de toute séquence susceptible de s'hybrider à une température comprise entre 20 et 70°C en solution saline à une concentration d'environ 0,5 à 1M avec l'une quelconque des séquences SEQ ID Nos 235 à 239, 262 à 271 , c) les séquences homologues à chacune des séquences SEQ ID Nos 235 à 239, 262 à 271 et des séquences selon b) respectivement l'homologie s'entendant de toute séquence, par exemple fragment, comprenant une suite d'au moins 5 nucléotides contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences ainsi qu'un groupe de deux ou trois nucléotides appartenant à une région conservée pour l'ensemble des espèces d'un groupe considéré, et ladite séquence présentant au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
11. Séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle est constituée d'un groupe de 1 à 3 nucléotides compris dans l'une des séquences selon la revendication 10 et correspondant à une région conservée pour l'ensemble des espèces d'un groupe considéré.
12. Séquence nucléotidique selon la revendication 11 , caractérisée en ce qu'elle est constituée des bases CAA en positions 14689- 14690-14691 de SEQ ID N°235 ou des bases CT en positions 15076-15077 de SEQ ID N°236.ou des bases CT en positions 15101-15102 de SEQ ID N°237.ou des bases GC en positions 14886-14887 de SEQ ID N°238.ou des bases ATA en positions 14713-14726 de SEQ ID N°239.
13. Séquence nucléotidique selon la revendication 11 , caractérisée en ce qu'elle est constituée de la base T en positions 14641 de SEQ ID N°262, ou de la base A en positions 14778 de SEQ ID N°263, ou de la base C en positions 15043 de SEQ ID N°264, ou de la base C en positions 15076 de SEQ ID N°265, ou de la base C en positions 15101 de SEQ ID N°266, ou de la base A en position 15109 de SEQ ID N°267, ou de la base C en positions 15115 de SEQ ID N°268, ou de la base C en positions 15239 de SEQ ID N°269, ou de la séquence nucléotidique constituée de la base T en positions 14519 de SEQ ID N°270, ou de la base T en positions 14717 de SEQ ID N°271.
14 Réactif pour la détermination d'au moins une espèce animale d'origine, comprenant un support solide, à l'état divisé ou non, sur lequel est fixée une séquence nucléotidique selon la revendication 10.
15. Procédé de détermination d'un groupe d'espèces animales d'origine dans un échantillon susceptible de contenir un ingrédient obtenu à partir d'au moins une espèce appartenant au dit groupe d'espèces animales considéré, caractérisé en ce que : a) on dispose d'une fraction nucléique obtenue à partir dudit échantillon, b) on dispose d'au moins un réactif comprenant une séquence selon la revendication 10, c) on met en présence la fraction nucléique et ledit réactif, et d) par détection on détermine tout signal ou information résultant de la présence d'une des séquences selon l'une quelconque des revendications 11 à 13, caractérisant la présence dans ledit échantillon d'un groupe d'espèces animales d'origine.
16 Utilisation des séquences définies dans l'une quelconque des revendications 11 à 13, pour la détermination d'un groupe d'espèces animales d'origine dans un échantillon susceptible de contenir un ingrédient obtenu à partir d'au moins une espèce animale appartenant au dit groupe d'espèces animales considéré.
17. Procédé de détermination d'un groupe d'espèces animales d'origine dans un échantillon susceptible de contenir un ingrédient obtenu à partir d'au moins une espèce appartenant au dit groupe d'espèces animales considéré, caractérisé en ce que : a) on dispose d'une fraction nucléique obtenue à partir dudit échantillon, b) on identifie la ou les séquences nucléotidiques caractéristiques du groupe d'espèces animales à déterminer c) on dispose d'au moins un réactif comprenant une séquence identifiée à l'étape b), c) on met en présence la fraction nucléique et ledit réactif, et d) par détection on détermine tout signal ou information résultant de la présence d'une des séquences selon l'une quelconque des revendications 11 à 13, caractérisant la présence dans ledit échantillon d'un groupe d'espèces animales d'origine.
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