WO2003066860A1 - Inhibiteurs d'angiogenese - Google Patents

Inhibiteurs d'angiogenese Download PDF

Info

Publication number
WO2003066860A1
WO2003066860A1 PCT/JP2003/001057 JP0301057W WO03066860A1 WO 2003066860 A1 WO2003066860 A1 WO 2003066860A1 JP 0301057 W JP0301057 W JP 0301057W WO 03066860 A1 WO03066860 A1 WO 03066860A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
amino acid
protein
acid sequence
present
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2003/001057
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Tetsuya Ohtaki
Yasushi Masuda
Yoshihiro Takatsu
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Takeda Chemical Industries Ltd filed Critical Takeda Chemical Industries Ltd
Priority to US10/503,554 priority Critical patent/US20050176632A1/en
Priority to EP03737460A priority patent/EP1473365A1/en
Priority to AU2003244347A priority patent/AU2003244347A1/en
Publication of WO2003066860A1 publication Critical patent/WO2003066860A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • the present invention relates to (1) (i) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 39; A peptide having the same or substantially the same amino acid sequence or a salt thereof, and (ii) the orphan receptor protein, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: No .: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 171 or SEQ ID NO: 173
  • EG-VEGF hypoxia-inducible factor-1
  • EG-VEGF also described as ZAQ ligand peptide
  • ZAQ ligand peptide binds to ZAQ, which is an orphan receptor, and activates ZAQ (WO01 / 16309).
  • ZAQ ligand peptide having ileal contractile activity (W002 / 6483) has high sequence similarity to MIT1 (FEBS Letters 461, 183-188, 1999) isolated from snakes. It is a mammalian peptide, and not only the human ZAQ ligand peptide, but also the snake venom MIT1 and its human homolog peptide bind to and activate ZAQ.
  • the present inventors conducted a study using human adrenal capillary endothelial cells (BACE), and found that BACE expresses ZAQ and its related receptor, I5E.
  • BACE responds to the human ZAQ ligand peptide, snake venom MIT1 and its human homologue (human Bv8 peptide) to increase intracellular calcium ions, activate MAP kinase, and reduce thymidine incorporation. It was also found that it causes an increase in cell proliferation ability. Based on these results, the activity of human ZAQ ligand peptide on endothelial cell growth factor Sex was concluded to be mediated through ZAQ and / or I5E.
  • a compound that blocks the action of ZAQ or I5E can be an inhibitor of EG-VEGF or Bv8 peptide, and that a simple inhibitor of EG-VEGF or Bv8 peptide can be used. As a result of intensive research, they have completed the present invention.
  • angiogenesis inhibitor comprising a compound or a salt thereof that inhibits the activity of a peptide or a salt thereof,
  • (la) inhibits the activity of a peptide having an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 109 or SEQ ID NO: 138, or a salt thereof
  • An angiogenesis inhibitor comprising a compound or a salt thereof
  • Angiogenesis comprising a compound having an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 39 or a compound inhibiting the activity of a salt thereof or a salt thereof Inhibitors,
  • angiogenesis inhibitor comprising a compound which inhibits the activity of a protein having the same or substantially the same amino acid sequence or a salt thereof, or a salt thereof;
  • (3b) (a) a peptide containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 109 or SEQ ID NO: 138, or a salt thereof; (B) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 44 SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 171 or identical or identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 173
  • An angiogenesis inhibitor comprising a compound that inhibits binding to a protein having substantially the same amino acid sequence or a salt thereof, or a salt thereof;
  • (3c) (a) a peptide having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 39 or a salt thereof, and (b) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 44, containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 171 or SEQ ID NO: 173
  • An angiogenesis inhibitor comprising a compound that inhibits binding to a protein or a salt thereof, or a salt thereof;
  • SEQ ID NO: 21 SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 109 SEQ ID NO: 138, Identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 39
  • SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 171 or SEQ ID NO: of a peptide containing the amino acid sequence of An angiogenesis inhibitor comprising a compound having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by 173 or a compound that inhibits the activating action of a salt thereof, or a salt thereof;
  • (4a) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 51, of a peptide containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 or a salt thereof SEQ ID NO
  • angiogenesis inhibitor comprising a compound that inhibits the activation effect of a protein or a salt thereof substantially containing the same amino acid sequence or a salt thereof;
  • SEQ ID NO: 19 sequence of a peptide containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 39, or a salt thereof SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 1 ⁇ 1 or SEQ ID NO: 1 ⁇ 3
  • An angiogenesis inhibitor comprising a compound that inhibits the activating action of a protein or a salt thereof,
  • An angiogenesis inhibitor comprising an antibody to a peptide containing an amino acid sequence or a partial peptide thereof or a salt thereof; (7) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 171 or identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 173 Or an antisense nucleotide containing a base sequence complementary to or substantially complementary to a base sequence of a DNA encoding a protein containing a substantially identical amino acid sequence or a partial peptide thereof, or a part thereof.
  • Angiogenesis inhibitor comprising an antibody to a peptide containing an amino acid sequence or a partial peptide thereof or a salt thereof; (7) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 171 or identical to the amino acid sequence
  • SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 171 or amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 173
  • An angiogenesis inhibitor comprising an antibody against a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence or a partial peptide or a salt thereof,
  • angiogenesis inhibitor according to any of (1) to (8) above, which is a prophylactic / therapeutic agent for cancer, polycystic ovary syndrome or ovarian hyperstimulation syndrome.
  • an angiogenesis inhibitor comprising the compound obtained by the screening method according to (11) or a salt thereof,
  • angiogenesis inhibitor comprising a compound having an endothelial cell growth inhibitory activity or a salt thereof
  • (21) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 137 or a salt thereof;
  • (32) A method for screening a compound or a salt thereof which promotes or inhibits the activity of the protein or a salt thereof according to the above (19), characterized by using the protein or a partial peptide thereof or a salt thereof according to the above (19).
  • SEQ ID NO: 1 For mammals, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 51 SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 171 or SEQ ID NO: 173
  • a method for inhibiting angiogenesis which comprises administering an effective amount of a compound or a salt thereof that inhibits the activity of a protein or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence,
  • SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 171 or sequence for producing an angiogenesis inhibitor No .: identical to or identical to the amino acid sequence represented by 173
  • SEQ ID NO: 1 For mammals, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 51 SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 171 or SEQ ID NO: 173 Cancer, polycystic ovary syndrome or ovary characterized by administering an effective amount of a compound or a salt thereof that inhibits the activity of a protein or a salt thereof containing an amino acid sequence identical or substantially identical to an amino acid sequence Hyperstimulation Prevention and treatment of symptoms
  • SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 for producing a prophylactic or therapeutic agent for cancer, polycystic ovary syndrome or ovarian hyperstimulation syndrome
  • SEQ ID NO: 54 SEQ ID NO: 171 or SEQ ID NO: 173 or a compound that inhibits the activity of a salt thereof or a salt thereof provide.
  • FIG. 1 shows the results of measurement of the ZAQ receptor activating effects of human Bv8 peptide and MI II performed in Reference Example 4.
  • _ ⁇ — indicates human Bv8 peptide
  • —— indicates MIT1.
  • FIG. 2 shows the results of measurement of the activity of the human Bv8 peptide and MIT1 to activate the I5E receptor performed in Reference Example 4.
  • eleven represents human Bv8 peptide, and — one represents MIT1.
  • FIG. 3 shows the results of the measurement of the ZAQ activating effect of the purified ZAQ ligand peptide performed in Reference Example 11 (3).
  • FIG. 4 shows the measurement results of the ZAQ receptor activating effect of the human ZAQ ligand peptide and MIT1 performed in Reference Example 13 (3).
  • “-” indicates a human ZAQ ligand peptide
  • “-” indicates MIT1.
  • FIG. 5 shows the results of measurement of the activity of the human ZAQ ligand peptide and MIT1 to activate the I5E receptor performed in Reference Example 13 (3).
  • ______ is human ZAQ ligand _ Reference refers to MIT1.
  • Figure 6 shows TaqMan PCR quantification of porcine ZAQ and vascular I5E mRNA in vascular adrenal capillary endothelial cells (BACE) and vascular aortic vascular endothelial cells (BAE) performed in Example 2. The results are shown.
  • the mouth indicates the number of copies of the Zinc-type ZAQ mRNA per 1 ng of total RNA, and the country indicates the copy number of the type-I 5E mRNA in the same manner.
  • FIG. 7 shows the results of measurement of intracellular calcium ion concentration increasing activity by FLIPR using BACE performed in Example 3.
  • —Ken-ichi indicates human ZAQ ligand peptide
  • -1 indicates MIT1.
  • FIG. 8 shows the results of dose responsiveness of ZAQ-related peptides on the activation of p42 MAP kinase and p44 MAP kinase in BACE performed in Example 3.
  • C indicates the control to which no ligand (solution) was administered
  • M indicates MIT1
  • L1 indicates the human ZAQ ligand peptide
  • L2 indicates the human Bv8 peptide was added at the concentrations shown in the figure.
  • P44 MAPK-P shows the band of phosphorylated p44 MAP kinase
  • p42 MAPK-P shows the band of phosphorylated p42 MAP kinase.
  • FIG. 9 shows the results of dose responsiveness of ZAQ-related peptides on p38 MAP kinase activation in BACE performed in Example 3.
  • C indicates a control to which no ligand (solution) was administered
  • M indicates MIT1
  • L1 indicates human ZAQ ligand peptide
  • L2 indicates human Bv8 peptide at the concentrations shown in the figure.
  • p38 MAPK-P shows a band of phosphorylated p38 MAP kinase.
  • FIG. 10 shows the results of the dose response of the peptide on [] thymidine incorporation in BACE.
  • -in- indicates human ZAQ ligand peptide
  • FIG. 11 shows the effects of human ZAQ ligand peptide and human Bv8 peptide on the growth of BACE.
  • the vertical axis indicates the number of BACE cells per 1 ⁇ l.
  • ZAQ-1 on the horizontal axis indicates a human type ZAQ ligand peptide, and
  • ZAQL-2 indicates a human type Bv8 peptide. * Indicates that the p-value obtained from the Student's test is less than 0.05, and ** indicates that the p-value is also less than 0.001.
  • Peptides having the same amino acid sequence or a salt thereof are as follows: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52
  • the peptide of the present invention can be used, for example, in any cells (eg, spleen cells, nerve cells, glial cells, etc.) of human mammals (eg, guinea pigs, rats, mice, rabbits, pigs, sheep, horses, monkeys, etc.).
  • human mammals eg, guinea pigs, rats, mice, rabbits, pigs, sheep, horses, monkeys, etc.
  • Viscera / 3 cells bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, fibrocytes, muscle cells, fat cells, immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells , Natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, breast cells, Hepatocytes or stromal cells, or precursors of these cells, stem cells or cancer cells, etc., or blood cells (eg, MEL, MK CTLL-2, HT-2, WEH3, HL-60, J0SK-1) , K562, ML -1, M0LT-3, MOLT-4, MOLT-10, CCRF-CEM, TALL-1, Jurka CCRT-HSB-2, KE-37, SKW-3, ⁇ -78,
  • the peptide of the present invention has a signal sequence, the peptide can be efficiently secreted extracellularly.
  • Examples of the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 81 or SEQ ID NO: 82 include, for example, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 81 or SEQ ID NO: 82 and about 6 amino acids. 0% or more (preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, more preferably about 85% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more) ⁇
  • Examples of peptides having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 81 or SEQ ID NO: 82 include, for example, SEQ ID NO: 81 or Having substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: -82, and having substantially the same properties as the peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 81 or SEQ ID NO: 82 With Such that the peptide is preferred.
  • a peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 81 or SEQ ID NO: 82 may be referred to as a human ZAQ ligand mature peptide.
  • Examples of the peptide having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 81 or SEQ ID NO: 82 include, for example, the amino acid represented by SEQ ID NO: 81 or SEQ ID NO: 82 Peptides having the same or substantially the same amino acid sequence as the sequence and having substantially the same activity as the peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 81 or SEQ ID NO: 82 are preferred. More specifically, examples include a peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83 or SEQ ID NO: 84.
  • a peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 83 or SEQ ID NO: 84 may be referred to as a human ZAQ ligand precursor peptide.
  • amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 109 is, for example, 95% or more (preferably about 97%) of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 109. % Or more, more preferably about 99% or more).
  • amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 109 examples include, for example, a peptide having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 109 and having substantially the same amino acid sequence as the peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 109. Peptides with similar activity are preferred.
  • a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 109 may be referred to as a mouse type ZAQ ligand mature peptide.
  • Examples of the peptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 109 include, for example, the same as or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 109 And a peptide having substantially the same activity as the peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 109. Specifically, SEQ ID NO: 109 or SEQ ID NO: 1 And a peptide having the amino acid sequence represented by 07.
  • mouse-type ZAQ ligand precursor peptide the peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 107 may be referred to as mouse-type ZAQ ligand precursor peptide.
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 138 is, for example, 95% or more (preferably about 97%) of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 138. % Or more, more preferably about 99% or more).
  • Examples of the peptide having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 138 include, for example, a peptide having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 138 And a peptide having substantially the same activity as the peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 138 is preferred.
  • Specific examples of the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 140 include a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 140, a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 142, and the like. Is mentioned.
  • the peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140 or SEQ ID NO: 142 may be referred to as mature rat ZAQ ligand peptide.
  • Specific examples of the peptide having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 138 are SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134 or SEQ ID NO: 1 Peptides having the amino acid sequence represented by 36 are also included.
  • rat ZAQ ligand precursor peptide the peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134 or SEQ ID NO: 136 may be referred to as rat ZAQ ligand precursor peptide.
  • Examples of the amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 39 include, for example, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 39 and about 6 0% or more (preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, more preferably about 85% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more)
  • Examples of the peptide having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 39 include, for example, SEQ ID NO: 19 or It has an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 39, and has substantially the same activity as the peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 39. Have Such as the peptide is preferred.
  • a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 is a human BV8 mature peptide
  • a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 39 is a rat Bv8 mature peptide or mouse Sometimes referred to as type B v8 mature peptide.
  • Examples of the peptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 include, for example, the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19
  • a peptide containing an amino acid sequence and having substantially the same activity as that of the peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 is preferred.
  • SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 19 is preferred.
  • Examples of the peptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 39 include, for example, the amino acid represented by SEQ ID NO: 39 A peptide having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence, and having substantially the same activity as the peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 39; Peptides having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 or SEQ ID NO: 55, and the like.
  • a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 may be referred to as a human BV8 precursor peptide.
  • a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 37 may be referred to as rat BV8 precursor peptide, and a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 55 is designated as mouse Bv8. It may be described as a progenitor peptide.
  • amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 for example, about 60% or more (preferably about 70%) of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 Or more, more preferably about 80% or more, more preferably about 85% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more.
  • amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 for example, about 60% or more (preferably about 70%) of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 Or more, more preferably about 80% or more, more preferably about 85% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more.
  • Examples of the peptide having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 include, for example, a peptide having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21; Peptides having substantially the same activity as the peptide having the amino acid sequence represented by No. 21 are preferred.
  • MI I1 a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 may be referred to as MI I1.
  • substantially equivalent activities include, for example, a binding activity to the protein of the present invention, a signal information transduction action via the protein of the present invention, and the like. Substantially the same indicates that their activities are the same in nature. Therefore, it is preferable that the activity of binding to the protein of the present invention and the activity of signal transduction via the protein of the present invention are equivalent (eg, about 0.5 to 2 times). Quantitative factors such as the molecular weight of the peptide may be different.
  • the activity can be measured according to a method known per se, for example, according to a screening method described later.
  • the peptides of the present invention include (i) SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, 1 or 2 or more (preferably about 1 to 30, more preferably 1 to 20) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 39 (Ii) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 39
  • SEQ ID NO: : 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 19 or 1 or more in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 39 (preferably 1 to 40) About 1, more preferably about 1 to 30,
  • peptide of the present invention include, for example, a human-derived peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 81, a human-derived peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 82, A peptide derived from a mouse containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 109, a peptide derived from a rat containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 138, a peptide derived from a rat containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 140, A rat-derived peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 142, a human-derived peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19, a rat-derived peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 39, or Mouse-derived peptides and the like.
  • the partial peptide of the peptide of the present invention may be any peptide as long as it can be used in the method for screening a drug or the like described below, and has substantially the same activity as the peptide of the present invention. It should just be.
  • the number of amino acids in the partial peptide is preferably a peptide having an amino acid sequence of at least 10 or more, preferably 20 or more of the constituent amino acid sequences of the peptide of the present invention.
  • Examples of the partial peptide include (i) one or two or more (preferably) Preferably, several (1 to 4) amino acids are deleted, and (ii) 1 or 2 or more (preferably about 1 to 20 and more preferably 1 to 10) Degree, more preferably several (1-5)) amino acids, or (iii) one or more (preferably several (1-4)) amino acids in the above amino acid sequence, etc. May be substituted.
  • the peptide of the present invention and the partial peptide of the peptide of the present invention may be collectively referred to as the peptide of the present invention.
  • the protein of the present invention can be used, for example, in any cell (eg, spleen cell, nerve cell, glial cell, etc.) of human mammals (eg, guinea pigs, rats, mice, rabbits, bushes, sheep, horses, monkeys, etc.).
  • human mammals eg, guinea pigs, rats, mice, rabbits, bushes, sheep, horses, monkeys, etc.
  • the protein of the present invention has a signal sequence, the peptide or protein can be efficiently secreted extracellularly.
  • amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 examples thereof include an amino acid sequence having about 90% or more and preferably about 95% or more, more preferably about 98% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • Examples of the protein containing an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 include, for example, a protein containing an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; A protein having substantially the same activity as the protein having the amino acid sequence represented by 1 is preferred.
  • Examples of the protein of the present invention having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 include, for example, the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • a protein containing an amino acid sequence and having substantially the same activity as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is preferred. Specific examples include the proteins described in WO 01/16309.
  • a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 may be referred to as ZAQ or human ZAQ.
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 44 is, for example, about 97% or more, preferably about 98% or more, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 44. More preferably, an amino acid sequence having a homology of about 99% or more, most preferably about 99.5% or more can be mentioned.
  • Examples of a protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 44 include, for example, a protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 44; A protein having substantially the same activity as the protein having the amino acid sequence represented by No. 44 is preferred.
  • Examples of the protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 44 include, for example, the same or substantially the same amino acid as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 44
  • a protein containing a sequence and having substantially the same activity as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 44 is preferred.
  • Examples of the amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 51 include, for example, about 95% or more, preferably about 96% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 51. More preferably about 97% or more, most preferably about 98% or less Amino acid sequences having the above homology, and the like.
  • Examples of the protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 51 include, for example, a protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 51; A protein having an activity substantially the same as that of the protein having the amino acid sequence represented by No. 51 is preferred.
  • Examples of the protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 51 include, for example, the same or substantially the same amino acid as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 51
  • a protein containing a sequence and having substantially the same activity as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 51 is preferred.
  • the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52 is, for example, about 90% or more, preferably about 95% or more, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52. More preferred are amino acid sequences having about 98% or more homology.
  • Examples of the protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52 include, for example, a protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52; A protein having substantially the same activity as the protein having the amino acid sequence represented by No. 52 is preferred.
  • Examples of the protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52 include, for example, the same or substantially the same amino acid as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52 It is preferable to use a protein containing the sequence and having substantially the same activity as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52, and specifically, the protein described in WO98 / 46620. Is mentioned.
  • the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52 may be referred to as I5E or human I5E.
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 53 is, for example, about 95% or more, preferably about 96% or more, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 53. More preferably, the amino acid sequence has about 97% or more, most preferably about 98% or more homology.
  • a protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 53 and having substantially the same activity as the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 53 are preferred.
  • Examples of the protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 53 include, for example, the same or substantially the same amino acid as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 53 It is preferable to use a protein having a sequence and having substantially the same activity as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 53. Specifically, Biochem. Biophys. Acta, Vol. 1491, 369 -P. 375, 2000, etc.
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 54 is, for example, about 95% or more, preferably about 96% or more, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 54. More preferably, the amino acid sequence has about 97% or more, most preferably about 98% or more homology.
  • Examples of the protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 54 include, for example, a protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 54; A protein having substantially the same activity as the protein having the amino acid sequence represented by No. 54 is preferred.
  • Examples of a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 54 include, for example, the same or substantially the same amino acid as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 54 It is preferable to use a protein containing the sequence and having substantially the same activity as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 54, and specifically, the protein described in W98 / 6620. Is mentioned.
  • amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 171 is, for example, 95% or more, preferably about 97%, to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 171. % Or more, more preferably about 99% or more homology.
  • Examples of a protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 171 include, for example, a protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 171.
  • SEQ ID NO: 17 Amino represented by 1 A protein having substantially the same activity as a protein having an acid sequence is preferred.
  • Examples of the protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 171 of the present invention include, for example, the same or the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 171 A protein containing substantially the same amino acid sequence and having substantially the same activity as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 171, is preferred.
  • p-type ZAQ protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 171 may be referred to as “p-type ZAQ”.
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 173 is, for example, 95% or more, preferably about 973, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 173. % Or more, more preferably about 99% or more homology.
  • Examples of a protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 173 include, for example, a protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 173.
  • the protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 173 of the present invention includes, for example, the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 173
  • a protein containing a substantially identical amino acid sequence and having substantially the same activity as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 173 is preferable.
  • substantially equivalent activities include, for example, a binding activity to the peptide of the present invention, a signal transduction effect, and the like. Substantially the same indicates that the activities are qualitatively the same. Therefore, it is preferable that the activities of the peptide of the present invention such as the binding activity and the signal transduction activity are equivalent (eg, about 0.5 to 2 times). Elements can be different.
  • the activity such as the binding activity and the signal transduction action can be measured according to a method known per se.
  • proteins of the present invention include (i) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 171 or sequence One or more (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, and more preferably several (1 or 2)) amino acids in the amino acid sequence represented by No .: 173 (Ii) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 171 or SEQ ID NO: 173 An amino acid having one or more (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, and more preferably several (1 or 2)) amino acids added to the amino acid sequence represented by Acid sequence, (iii) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 5 1, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO:
  • protein of the present invention include, for example, a protein of human origin (more preferably, of human brain origin) containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 44 or SEQ ID NO: : A protein derived from a rat having the amino acid sequence represented by 51; a protein derived from a mouse having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 53 or 54; represented by SEQ ID NO: 171 or 173 And other proteins containing an amino acid sequence.
  • a protein of human origin more preferably, of human brain origin
  • partial peptide of the protein of the present invention may be any partial peptide of the protein of the present invention described above.
  • the protein molecules of the present invention those that are exposed outside the cell membrane and have substantially the same ligand binding activity are used.
  • the partial peptide of the protein of the present invention is a peptide containing a portion analyzed as an extracellular region (hydrophilic site) in a hydrophobicity plot analysis.
  • a peptide partially containing a hydrophobic site can be used.
  • a peptide containing individual domains may be used, but a peptide containing a plurality of domains at the same time may be used.
  • the number of amino acids of the partial peptide of the present invention is at least 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 100 or more of the amino acid sequences constituting the protein of the present invention. Are preferred.
  • a substantially identical amino acid sequence is defined as about 50% or more, preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, most preferably about 90% or more of these amino acid sequences.
  • the amino acid sequence has about 95% or more homology.
  • “substantially the same ligand binding activity” has the same meaning as described above.
  • the “substantially the same ligand binding activity” can be measured according to a method known per se.
  • the partial peptides of the present invention include SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 171
  • one or more (preferably about 1 to 10, more preferably several (1 or 2)) amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 173 are missing.
  • the salt of the peptide of the present invention or the protein of the present invention or a partial peptide thereof is particularly preferably a physiologically acceptable acid addition salt.
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid) Acids, tartaric acid, cunic acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like are used.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid
  • peptides and proteins have N-terminus (amin
  • SEQ ID NO: ⁇ white matter of the present invention including the protein containing the amino acid sequence represented by 4 7, C-terminal, carboxyl groups (- C00H), carboxylate (- C00-), amide ( ⁇ C0NH 2) Or it may be ester (-C00R).
  • R in the ester e.g., methyl, Echiru, n- propyl, C WINCH 6 alkyl group such as isopropyl or n- butyl, cyclopentyl Le, C 3 _ 8 cycloalkyl group such as cyclohexyl, for example , phenyl, shed - C si 2 Ariru group such naphthyl, for example, benzyl, phenyl, such as phenethyl - ci- 2 alkyl or flying one naphthyl such as Fei one naphthylmethyl - c 7 _ such as C 2 ⁇ alkyl group
  • a pivaloyloxymethyl group commonly used as an oral ester is used.
  • the carboxyl group is amidated or esterified.
  • the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
  • peptide-protein of the present invention includes:
  • Amino group protecting groups Mechionin residues of N-terminal (e.g., formyl group, C 2 such Asechiru groups - such as C l-6 Ashiru groups such as 6 Arukanoiru group) is protected with a protecting, N end side in vivo Pyruglutamine oxidation of the daryumil group formed by cleavage in the above, a substituent on the side chain of an amino acid in the molecule (for example, 110H, 1SH, amino group, imidazole group, indole group, guanidino group) group, etc.) a suitable protecting group (e.g., formyl groups, C such as C 2-6 Arukanoiru group such Asechiru group, those protected by _ 6 Ashiru group, etc.), or the so-called sugar sugar chain bound Complex peptides such as peptides and glycoproteins ⁇ Complex proteins are also included.
  • N-terminal e.g., formyl group, C 2 such Asechiru
  • the C-terminus of the present invention a carboxyl group (-C00H), carbo Kishireto (- C00-), amide (- C0NH 2) or it may also be an ester (-C00R) Les ⁇ part of the present invention If the peptide has a non-C
  • the carboxyl group is amidated or esterified, it is also included in the partial peptide of the present invention.
  • the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
  • the partial peptide of the present invention has the same structure as the above-mentioned protein of the present invention, in which the amino group of the N-terminal methionine residue is protected with a protecting group, and the N-terminal is cleaved in vivo.
  • G1n is pyroglutamine-oxidized
  • those in which a sugar chain is bonded such as a so-called glycopeptide. .
  • the peptide or protein of the present invention or a salt thereof can be produced from the above-mentioned human or mammalian cells or tissues by a known method for purifying a peptide or protein.
  • a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 53 or a salt thereof can be produced according to the method described in 'Biochem. Biophys. Acta, Vol. 1491, pp. 369-375, 2000'.
  • the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52 or SEQ ID NO: 54 or a salt thereof can be produced according to the method described in WO 98/46620.
  • the human or mammalian tissues or cells are homogenized and then extracted with an acid or the like, and the resulting extract is subjected to reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, etc. Purification and isolation can be carried out by combining the above chromatography methods.
  • a commercially available resin for peptide / protein synthesis can be usually used.
  • resins include, for example, chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4 1-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, 4-hydroxymethylmethylphenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ', 4'-dimethoxyphenol) 2- (hydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-Fmocaminoethyl) phenoxy resin, and the like.
  • an ⁇ -amino acid and an amino acid having an appropriately protected side chain functional group are condensed on the resin in accordance with the sequence of the target peptide ′ protein according to various known condensation methods.
  • the peptide and protein are cleaved from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed.
  • an intramolecular disulfide bond formation reaction is carried out in a highly diluted solution to obtain the desired peptide, protein or amide thereof. Get the body.
  • the protected amino acid may be added directly to the resin along with a racemization inhibitor additive (eg, HOBt, HOOBt) or may be pre-protected as a symmetrical acid anhydride or HOBt ester or HOOBt ester. Can be added to the resin after activation.
  • a racemization inhibitor additive eg, HOBt, HOOBt
  • the solvent used for the activation of the protected amino acid and the condensation with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for the peptide-protein condensation reaction.
  • acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride, chloroform, and trifluoroethanol.
  • Alcohols sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, ethers such as pyridine, dioxane, and tetrahydrofuran; nitriles such as acetonitrile and propionitrile; esters such as methyl acetate and ethyl acetate; or an appropriate mixture thereof.
  • the reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for a protein bond formation reaction, and is usually appropriately selected from a range of about -20 ° C to 50 ° C.
  • the activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess.
  • Examples of the protecting group for the starting amino group include ⁇ , Boc, tertiary pentoxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, C 1 -Z, Br—Z, and ⁇ . Damantyloxycarbonyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like are used.
  • the lipoxyl group can be, for example, alkyl esterified (for example, methyl, ethyl, propyl, butyl, tert-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.) Or cyclic alkyl esterification), aralkyl esterification (eg, benzyl ester, 412 trobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-methyl benzyl ester, benzhydryl esterification), fenash It can be protected by esterification, benzyloxycarbonyl hydrazide, short butoxycarbonyl hydrazide, trityl hydrazide, and the like.
  • alkyl esterified for example, methyl, ethyl, propyl, butyl, tert-butyl, cyclopentyl, cycl
  • the hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • esterification for example, a lower alkanol group such as an acetyl group, an aroyl group such as a benzoyl group, a group derived from carbonic acid such as a benzyloxycarbonyl group, an ethoxycarponyl group, and the like are used.
  • groups suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydropyranyl group, and a tributyl group.
  • the protecting group of the phenolic hydroxyl group of tyrosine for example, B z 1, C l 2 - B zl, 2- two Torobenjiru, B r- Z, such as evening over tert-butyl is used.
  • Examples of the imidazole protecting group of histidine include Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, and Fmoc.
  • Activated carboxyl groups in the raw material include, for example, the corresponding acid anhydride Product, azide, active ester [alcohol (for example, pentachlorophenol, 2,4,5-trichloromouth phenol, 2,4-dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N- Hydroxyester, ester with HOB t)] and the like.
  • active ester alcohol (for example, pentachlorophenol, 2,4,5-trichloromouth phenol, 2,4-dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N- Hydroxyester, ester with HOB t)] and the like.
  • active ester alcohol (for example, pentachlorophenol, 2,4,5-trichloromouth phenol, 2,4-dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N- Hydroxy
  • Methods for removing (eliminating) the protecting group include, for example, catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or hydrogen fluoride anhydride or methanesulfonic acid.
  • a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or hydrogen fluoride anhydride or methanesulfonic acid.
  • Acid treatment with trifluoromethanesulfonic acid, trifluoroacetic acid or a mixture thereof, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., and reduction with sodium in liquid ammonia Also used.
  • the elimination reaction by the above-mentioned acid treatment is generally performed at a temperature of about 120 to 40 ° C.
  • the acid treatment for example, anisol, phenol, thioanisole, methacrylol, paracresol, dimethyl sulfol
  • a cation capture agent such as feed, 1,4-butanedithiol, 1,2-ethanedithiol, and the like.
  • the 2,4-dinitrophenyl group used as an imidazole protecting group of histidine is removed by thiophenol treatment
  • the formyl group used as an indole protecting group of tributanone is 1,2-ethanedithiol, 1,4.
  • alkali treatment with dilute sodium hydroxide solution, dilute ammonia and the like.
  • the protection of the functional group which should not be involved in the reaction of the raw materials, the protecting group, the elimination of the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, and the like can be appropriately selected from known groups or known means.
  • an amide form of a peptide or protein for example, first, after amidating and protecting the ⁇ -carboxyl group of the amino acid at the terminal end of the amino acid, a peptide chain is extended to a desired chain length on the amino group side. After that, a peptide / protein in which only the protecting group of the ⁇ -amino group at the ⁇ -terminal of the peptide chain was removed and a peptide / protein in which only the protecting group of the C-terminal lipoxyl group was removed were produced. Peptide Condensation in a mixed solvent as described above. Details of the condensation reaction are the same as described above.
  • the crude peptide / crude protein is purified by using various known purification means, and the main fraction is freeze-dried to obtain an amide of the desired peptide 'protein.
  • an ester of a peptide / protein for example, after condensing a strong propyl group of a carboxy-terminal amino acid with a desired alcohol to form an amino acid ester, a desired peptide is prepared in the same manner as in the amide of a peptide / protein. ⁇ Ester of protein can be obtained.
  • the peptide of the present invention and the protein of the present invention can be produced according to a peptide synthesis method known per se. Further, the partial peptide of the protein of the present invention or a salt thereof can be produced according to a peptide synthesis method known per se, or by cleaving the protein of the present invention with an appropriate peptidase.
  • any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, by condensing the peptide of the present invention or a partial peptide or amino acid capable of constituting the protein of the present invention with the remaining portion 4, and when the product has a protecting group, removing the protecting group to obtain the desired compound. Peptides can be produced. Examples of the known condensation method and elimination of the protecting group include the methods described in the following (i) to (V).
  • the peptide of the present invention is combined with a conventional purification method such as solvent extraction, distillation, column chromatography, 'liquid chromatography', and recrystallization. Or the partial peptide of the present invention can be purified and isolated.
  • a conventional purification method such as solvent extraction, distillation, column chromatography, 'liquid chromatography', and recrystallization.
  • the partial peptide of the present invention can be purified and isolated.
  • the peptide or partial peptide obtained by the above method is in a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method.
  • the peptide or partial peptide is obtained in a salt form, it can be converted to a free form by a known method Can be converted.
  • the peptide of the present invention or the polynucleotide encoding the protein of the present invention may be any as long as it has the above-described nucleotide sequence encoding the peptide of the present invention or the protein of the present invention.
  • it is DNA.
  • the DNA may be any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the above-mentioned cell tissue, cDNA library derived from the above-described cell / tissue, and synthetic DNA.
  • the vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like.
  • RT-PCR method reverse transcriptase polymerase chain reaction
  • examples of the DNA encoding the peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 81 include, for example, DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 87, or SEQ ID NO: 87 Having a DNA that hybridizes under high stringent conditions with a DNA having the nucleotide sequence represented by the following formula: and substantially the same activity as the peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 81 (for example, the present invention) Any DNA may be used as long as it encodes a peptide having a protein-binding activity, a signal transduction action via the protein of the present invention, and the like.
  • Examples of the DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 87 include DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 87 or SEQ ID NO: 89, and the like.
  • Examples of the DNA that hybridizes with the DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 87 under high stringency conditions include, for example, about 60% or more, preferably about 70% of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 87. As described above, more preferably, DNA containing a nucleotide sequence having a homology of about 80% or more is used.
  • a peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 82 was Examples of the DNA to be loaded include a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 88, and a DNA that hybridizes with the DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 88 under high stringent conditions. And a peptide having substantially the same activity as the peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 82 (eg, a binding activity to the protein of the present invention, a signal information transduction action via the protein of the present invention, etc.) Any DNA may be used as long as it encodes
  • Examples of the DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 88 include DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 88 or SEQ ID NO: 90, and the like.
  • Examples of the DNA which hybridizes with the DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 88 under high stringency conditions include, for example, about 60% or more, preferably about 70% of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 88 As described above, more preferably, DNA containing a nucleotide sequence having a homology of about 80% or more is used.
  • a DNA encoding a peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 109 for example, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 110, or a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 110
  • a DNA having a DNA that hybridizes under high stringent conditions with DNA having the base sequence represented, and having substantially the same activity as a peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 109 eg, the present invention
  • Any DNA may be used as long as it encodes a peptide having a protein-binding activity, a signal information transduction effect via the protein of the present invention, and the like.
  • Examples of the DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 110 include DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 110 or SEQ ID NO: 108, and the like.
  • Examples of the DNA which hybridizes under high stringent conditions with the DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 110 include, for example, at least 95%, preferably about 95% or more of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 110.
  • DNA containing a nucleotide sequence having a homology of 97% or more, more preferably about 99% or more is used.
  • SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140 or SEQ ID NO: 142 examples of the DNA encoding a peptide containing the amino acid sequence represented by the following are: DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141 or SEQ ID NO: 143, or SEQ ID NO: 139 SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140 or SEQ ID NO: 142, having DNA that hybridizes under high stringent conditions with DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 141 or SEQ ID NO: 143.
  • DNA encoding a peptide having substantially the same activity as the peptide having the amino acid sequence represented eg, a binding activity to the protein of the present invention, a signal transmitting action via the protein of the present invention, etc. Any one may be used.
  • Examples of the DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141 or SEQ ID NO: 143 include: SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: No .: 141 or a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 143.
  • DNA that hybridizes under high stringent conditions with DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141 or SEQ ID NO: 143 include, for example, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141 Alternatively, a DNA containing a base sequence having 95% or more, preferably about 97% or more, more preferably about 99% or more homology with the base sequence represented by SEQ ID NO: 143 is used.
  • the DNA encoding the peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 is, for example, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 20, or SEQ ID NO: 20 Having a DNA that hybridizes under high stringent conditions with a DNA having the nucleotide sequence represented by the following formula: and having substantially the same activity as the peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 (for example, the present invention) Any binding DNA may be used as long as it encodes a peptide having a protein-binding activity, a signal transduction action via the protein of the present invention, and the like.
  • Examples of the DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 20 include DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 18.
  • Examples of DNA that hybridizes with DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 20 under high stringent conditions include, for example, 95% or more, and preferably about 97% of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 20 'A DNA containing a nucleotide sequence having homology of at least about 99% or more, and more preferably about 99% or more is used.
  • the DNA encoding the peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 39 is, for example, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 40 or SEQ ID NO: 57 Or a DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 40 or SEQ ID NO: 57 and a DNA capable of elimination under high stringency conditions, comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 39
  • Any DNA may be used as long as it encodes a peptide having substantially the same activity as the peptide (eg, a binding activity to the protein of the present invention, a signal transduction effect via the protein of the present invention, and the like).
  • Examples of the DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 40 or SEQ ID NO: 57 include DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 56 or SEQ ID NO: 57, and the like. Is mentioned.
  • Examples of the DNA which hybridizes with DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 40 or SEQ ID NO: 57 under high stringent conditions include, for example, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 40 or the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 57 and 95 % Or more, preferably about 97% or more, more preferably about 99% or more.
  • Examples of the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 include, for example, DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3, or SEQ ID NO: 2 Or an activity substantially identical to that of a protein comprising a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 and a DNA that hybridizes under high stringency conditions and having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Any DNA can be used as long as it encodes a protein having (eg, ligand binding activity, signal transduction action, etc.).
  • DNA that hybridizes under high stringent conditions with DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 include, for example, DNA containing a nucleotide sequence having about 90% or more, preferably about 95% or more, and more preferably about 98% or more homology with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 is used.
  • Examples of the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 44 include a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 43 or a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 43 Having substantially the same activity as a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 44 and having a DNA that hybridizes under high stringent conditions with the DNA having the same (for example, a peptide of the present invention). Any DNA may be used as long as it encodes a protein having a binding activity, a signal transduction action, and the like.
  • Examples of DNA that hybridizes under high stringent conditions with DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 43 include, for example, about 90% or more, preferably 90% or more, of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 43.
  • a DNA containing a nucleotide sequence having a homology of about 95% or more, more preferably about 98% or more is used.
  • Examples of the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 51 include, for example, a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 50, or a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 50 Having a DNA that hybridizes under high stringent conditions with a DNA having the same, and having substantially the same activity as a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 51 (eg, the peptide of the present invention has Any DNA may be used as long as it encodes a protein having a binding activity to a protein, a signal transduction action, and the like.
  • Examples of the DNA that hybridizes with the DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 50 under high stringent conditions include, for example, about 90% or more, preferably about 90% or more of the base sequence represented by SEQ ID NO: 50.
  • a DNA containing 95% or more, more preferably about 98% or more of a nucleotide sequence having homology 4 or the like is used.
  • the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52 is, for example, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 6, or having the base sequence represented by SEQ ID NO: 6
  • DNA that hybridizes with DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 under high stringent conditions include, for example, about 90% or more, preferably about 95% or more of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 % Or more, and more preferably DNA containing a nucleotide sequence having a homology of about 98% or more is used.
  • Examples of the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 53 include a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 63 or a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 63 Having a DNA that hybridizes under high stringent conditions to DNA having the same activity as the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 63 (eg, binding to the peptide of the present invention) Any DNA may be used as long as it encodes a protein having activity, signal transduction action, etc.).
  • Examples of the DNA that hybridizes with the DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 63 under high stringent conditions include, for example, about 95% or more, preferably about 95% or more of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 63.
  • a DNA containing a nucleotide sequence having a homology of 97% or more, more preferably about 98% or more is used.
  • the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 54 is, for example, a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 64 or a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 64 Having substantially the same activity as a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 64, which has a DNA that hybridizes under high stringent conditions with the DNA having the amino acid sequence (for example, against the peptide of the present invention). Any DNA may be used as long as it encodes a protein having a binding activity, a signal transduction action, and the like.
  • Examples of the DNA that hybridizes with DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 64 under high stringent conditions include, for example, about 95% or more, preferably 95% or more, of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 64.
  • the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 11 is, for example, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 172, or represented by SEQ ID NO: 172
  • Examples of the DNA that hybridizes with the DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 172 under high stringent conditions include, for example, 95% or more, preferably about 97%, of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 172.
  • DNA containing a nucleotide sequence having a homology of at least 99% or more, more preferably at least about 99% is used.
  • Examples of the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 173 include DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 174 or the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 174 Having a DNA that hybridizes under high stringent conditions to a DNA having the same, and having substantially the same activity as a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 173 (eg, binding activity to the peptide of the present invention, signal Any DNA may be used as long as it encodes a protein having an information transfer function.
  • Examples of the DNA that hybridizes under high stringent conditions with the DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 174 include, for example, 95% or more, preferably about 97%, of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 174.
  • DNA containing a nucleotide sequence having a homology of at least about 99%, more preferably about 99% or more, may be used.
  • Hybridization is carried out by a method known per se or a method analogous thereto, for example, the method described in Molecular 'Cloning (Molecular Cloning) 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). It can be done according to. When a commercially available library is used, it can be carried out according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, it can be performed under high stringent conditions.
  • High stringent conditions include, for example, sodium concentration of about 19-40 m M, preferably about 19-20 mM, and a temperature of about 50-70 ° C, preferably about 60-65.
  • sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 is most preferable.
  • examples of the DNA encoding the peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 81 include a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 87, and SEQ ID NO: 82
  • Examples of the DNA encoding the peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 88 include a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 88, and a peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 83
  • Examples of the DNA encoding include a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 89.
  • the DNA encoding the peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 84 is represented by SEQ ID NO: 90.
  • the DNA encoding the peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 109 is exemplified by the DNA encoding the peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 110.
  • the DNA encoding the peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 107 is exemplified by the DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 108.
  • Examples of the DNA encoding the peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 138 include a DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 139, represented by SEQ ID NO: 140
  • Examples of the DNA encoding the peptide containing the amino acid sequence include DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 141, and the peptide encoding the peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 142
  • Examples of DNA include a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 143, and encode a peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 132
  • Examples of the DNA include a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 133, and a DNA encoding a peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 134 is represented by SEQ ID NO: 135
  • DNA encoding a peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 136 is exemp
  • the DNA encoding the peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 is SEQ ID NO: 18
  • the DNA encoding the peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 39 is exemplified by the DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 39 or the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 57.
  • Examples of the DNA encoding the peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 37 include DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 38;
  • Examples of the DNA encoding the peptide containing the amino acid sequence represented include DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 56.
  • Examples of the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 include a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3, and represented by SEQ ID NO: 44.
  • Examples of the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 43 include a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 43, and a DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 51 Examples thereof include a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 50.
  • DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52 a DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6
  • the DNA encoding the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 53 is represented by SEQ ID NO: 63.
  • Examples of the DNA encoding the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 54 include DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 64.
  • Examples of the DNA encoding the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 171 include a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 172, and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 173
  • Examples of the DNA encoding the contained protein include DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 174.
  • nucleotide sequence (complementary to the nucleotide sequence of the DNA encoding the peptide of the present invention or a nucleotide (oligonucleotide) containing a part thereof) is defined as the nucleotide sequence of the present invention. It is used to include not only DNA encoding the tide but also RNA.
  • a DNA encoding an antisense (oligo) nucleotide (nucleic acid) capable of inhibiting the replication or expression of the gene of the peptide of the present invention is cloned or determined. It can be designed and synthesized based on the base sequence information of the base sequence.
  • Such (oligo) nucleotides (nucleic acids) can hybridize with the RNA of the peptide gene of the present invention and can inhibit the synthesis or function of the RNA, or can bind to the peptide-related RNA of the present invention.
  • the expression of the gene of the peptide of the present invention can be regulated and controlled through the interaction of.
  • (Oligo) nucleotides complementary to the selected sequence of the peptide-related RNA of the present invention, and (oligo) nucleotides capable of specifically hybridizing with the peptide-related RNA of the present invention are used in vivo and in vivo. In addition, it is useful for regulating and controlling the expression of the gene of the peptide of the present invention, and is also useful for treating or diagnosing diseases and the like.
  • corresponding means having homology or being complementary to a nucleotide, base sequence or a specific sequence of a nucleic acid including a gene.
  • Corresponding between a nucleotide, nucleotide sequence or nucleic acid and a peptide generally refers to the amino acids of the peptide as directed by the nucleotide (nucleic acid) sequence or its complement.
  • the untranslated region, the 3'-end palindrome region, and the 3'-end hairpin loop can be selected as preferable regions of interest, but any region within the gene of the peptide of the present invention can be selected as the region of interest.
  • the relationship between the target nucleic acid and the (oligo) nucleotide complementary to at least a part of the target region can be said to be "antisense" between the (oligo) nucleotide that can hybridize with the target.
  • Antisense '(oligo) nucleotides are 2-deoxy-D-report-containing polydeoxynucleotides, D-report-containing polydeoxynucleotides, N-glycosides of purine or pyrimidine bases, and others.
  • a polynucleotide of the type Alternatively, other polymers having a non-nucleotide backbone (eg, commercially available protein nucleic acids and synthetic sequence-specific nucleic acid polymers) or other polymers containing special bonds (provided that such polymers are found in DNA or RNA) Base pairs that contain nucleotides having a configuration that allows the attachment of bases).
  • a non-nucleotide backbone eg, commercially available protein nucleic acids and synthetic sequence-specific nucleic acid polymers
  • other polymers containing special bonds provided that such polymers are found in DNA or RNA
  • Base pairs that contain nucleotides having a configuration that allows the attachment of bases).
  • RNA hybrids can be double-stranded DNA, single-stranded DNA, double-stranded RNA, single-stranded RNA, and also DNA: RNA hybrids, and can also be unmodified polynucleotides or unmodified oligonucleotides, Are those with known modifications, e.g., those with labels, capped, methylated, and one or more naturally-occurring nucleotides replaced by analogs known in the art.
  • Those having an intramolecular nucleotide modification such as those having an uncharged bond (eg, methylphosphonate, phosphotriester, phosphoramidate, olebamate, etc.), a charged bond or a sulfur-containing bond (eg, Those with phosphorothioate, phosphorodithioate, etc., such as proteins (nucleases, nucleases * inhibitors, toxins, antibodies, Those having side chain groups such as gnal peptide, poly-L-lysine, etc.
  • an uncharged bond eg, methylphosphonate, phosphotriester, phosphoramidate, olebamate, etc.
  • a charged bond or a sulfur-containing bond eg, Those with phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.
  • proteins nucleases, nucleases * inhibitors, toxins, antibodies, Those having side chain groups such as gnal peptide, poly-L-
  • nucleic acid may include not only those containing purine and pyrimidine bases but also those having other modified heterocyclic bases. Such modifications may include methylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other heterocycles.
  • Modified nucleotides and modified nucleotides may also be modified at the sugar moiety, e.g., where one or more hydroxyl groups have been replaced with halogens, aliphatic groups, etc., or functionalities such as ethers, amines, etc. It may be converted to a group.
  • the antisense nucleic acid of the present invention is RNA, DNA, or a modified nucleic acid.
  • modified nucleic acids include sulfur derivatives of nucleic acids ⁇ thiophosphate derivatives, and polynucleoside amides ⁇ resistant to degradation of oligonucleoside amides But not limited to them.
  • the antisense nucleic acid of the present invention can be preferably designed according to the following policy.
  • the antisense nucleic acid is more stable in the cell, the cell permeability of the antisense nucleic acid is greater, the affinity for the target sense strand is greater, and if toxic, the Minimize the toxicity of sense nucleic acids.
  • the antisense nucleic acids of the present invention may contain altered or modified sugars, bases, or bonds, may be provided in special forms such as ribosomes or microspheres, may be applied by gene therapy, It could be given in additional form.
  • additional forms include polycations, such as polylysine, which act to neutralize the charge on the phosphate backbone, and lipids, which enhance interaction with cell membranes or increase the uptake of nucleic acids ( For example, crude water-based substances such as phospholipids and cholesterol are exemplified.
  • Preferred lipids for addition include cholesterol and its derivatives (eg, cholesteryl chromate formate, cholic acid, etc.).
  • Such a substance can be attached to the 3 'end or 5' end of a nucleic acid, and can be attached via a base, a sugar, or an intramolecular nucleoside bond.
  • Other groups include cap groups specifically located at the 3 'end or 5' end of nucleic acids, which prevent degradation by nucleases such as exonuclease and RNAse.
  • capping groups include, but are not limited to, hydroxyl-protecting groups known in the art, including glycols such as polyethylene glycol and tetraethylene glycol.
  • the inhibitory activity of an antisense nucleic acid can be examined using the transformant of the present invention, the in vivo or in vitro gene expression system of the present invention, or the in vivo or in vitro translation system of a protein.
  • the nucleic acid can be applied to cells by various methods known per se.
  • the partial peptide of the present invention As the DNA encoding the partial peptide of the present invention, the partial peptide of the present invention described above is used. It may be any as long as it contains a nucleotide sequence encoding a peptide.Also, genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the above-described cells and tissues, cDNA derived from the above-described cells and tissues c Either a DNA library or synthetic DNA may be used.
  • the vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Alternatively, amplification can be performed directly by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction using an mRNA fraction prepared from the cells and tissues described above.
  • the DNA encoding the partial peptide of the present invention includes, for example, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 63, DNA having a partial nucleotide sequence of a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 172 or SEQ ID NO: 174, or
  • Examples of the DNA that hybridizes with a DNA having the following under stringent conditions include: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 63 Contains a nucleotide sequence having about 90% or more, preferably about 95% or more, more preferably about 98% or more homology with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 172 or SEQ ID NO: 174.
  • a DNA is used.
  • '' amplification is carried out by PCR using a synthetic DNA primer having a partial nucleotide sequence of the DNA sequence encoding the peptide of the present invention.
  • DNA encoding part or all of the region of the peptide of the present invention by incorporating DNA into an appropriate vector. Selection can be performed by hybridization with fragments or those labeled with synthetic DNA. The hybridization method can be performed, for example, according to the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
  • Cloning of a DNA completely encoding the protein of the present invention or a partial peptide thereof can be performed in the same manner as cloning of a DNA completely encoding the peptide of the present invention. it can.
  • the DNA base sequence can be converted by PCR or a known kit, for example, Mutan TM -Super Express Km (Takara Shuzo), Mutan TM -K (Takara Shuzo), etc., using the 0DA-LA PCR method. It can be carried out according to a method known per se, such as the Gupped duplex method and the Kunkel method, or a method analogous thereto.
  • the DNA encoding the cloned peptide / protein can be used as it is depending on the purpose, or can be used after digesting with a restriction enzyme or adding a linker, if desired.
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon on its 5, terminal side and TAA, TGA or TAG as a translation termination codon on its 3, terminal side. These translation initiation codon and translation termination codon can also be added using a suitable synthetic DNA adapter.
  • the peptide / protein expression vector of the present invention includes, for example, (a) cutting out a DNA fragment of interest from DNA encoding the peptide / protein of the present invention, and (mouth) placing the DNA fragment in an appropriate expression vector. It can be manufactured by connecting to the downstream of the Promo One Night.
  • Escherichia coli-derived plasmids eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13
  • Bacillus subtilis-derived plasmids eg, pUB110, pTP5, pC194
  • yeast-derived plasmids eg, , PSH19, pSH15
  • bacteriophages such as ⁇ phage
  • animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, baculovirus, etc., pAl-11, pXTl, pRc / CMV, pRcZRSV , PcDNA I / Ne o, pc DNA 3.1, DR cZCMV2, pRc / RSV (Invitrogen) and the like are used.
  • the promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression.
  • SRa promoter when animal cells are used as host, SRa promoter, SV40 promoter, HIV-LTR promoter, CMV promoter, HSV-TK promoter and the like can be mentioned.
  • the CMV promoter, SR promoter and the like are preferably used.
  • the host is Eshierihia genus bacterium, trp promoter, lac flop port mode evening one, re cA promoter evening one, AP L promoter, l pp promoter, if the host is Bacillus, SP_ ⁇ 1 promoter one, SP_ ⁇ 2 flops port motors, such as p en p promoter, if the host is a yeast, PH05 flop port motor, PGK promoter, GAP promoter, etc. ADH promoter are preferred.
  • a polyhedrin promoter, a P10 promoter and the like are preferable.
  • the expression vector may contain, in addition to the above, an enhancer, a splicing signal, a polyA addition signal, a selection marker, and an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori), if desired. Anything can be used.
  • selectable markers include dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dh fr) gene [methotrexate (MTX) resistance], ampicillin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Amp 1 ), neomycin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Ne o 1 ", G418 resistance).
  • dh fr gene is used as a selection marker using CHO (dh fr-) cells
  • the target gene can be selected using a thymidine-free medium.
  • a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the protein of the present invention. If the host is Escherichia, Pho A signal sequence, Omp A signal sequence, etc. When the host is yeast, MFa signal sequence, SUC2 signal sequence, etc. Sequence, antibody molecule, signal sequence, etc. can be used.
  • a transformant can be produced.
  • Escherichia bacteria for example, Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, yeast, insect cells, insects, animal cells, and the like are used.
  • Escherichia examples include Escherichia coli K12, DH1 [Processing's of the National Academic Demonstration — 'Ob Syenzies' of the U.S.A. (Proc. Natl. Acad.. Sci. USA), 60, 160 (1968)], JM103 (Nucleic Acids Research, Vol. 9, 309 (1981)), JA221 [Journal of Molecular Biology, 120, 5 17 (1978)], ⁇ 10 1 [Journal of Molecular Biology, 41, 459 (1969)] , C 600 [Genetics, Vol. 39, 440 (1954)].
  • Bacillus bacteria examples include, for example, Bacillus subtilis MI114 (Gene, Vol. 24, 255 (1983)), 207-21 (Journal of Biochemistry), 95, 87 (1 984)].
  • yeast examples include, for example, Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R—, NA87-11A, DKD—5D, 20B_12, Schizosaccharomyces pombe NC YC 1913, NCYC2036 , Pichia pastoris, etc. are used.
  • Insect cells include, for example, when the virus is Ac NPV, a cell line derived from the larvae of night moth (Spodoptera frugiperda cell; S f cell), MG 1 cell derived from Trichoplusia ni midgut, Trichoplusia ni egg High Five TM cells, cells derived from Mamestra brassicae or cells derived from Estigmena acrea are used.
  • Sf cells a silkworm-derived cell line (Bombyx mori N; BmN cell) is used.
  • Sf cells include Sf9 cells (ATCC CRL1711), Sf21 cells (above, Vaughn, JL et al., In Vivo, 13, 213-217, (1977)) and the like are used.
  • insects for example, silkworm larvae are used [Maeda et al.
  • animal cells examples include monkey cell COS-7, Vero, Chinese Hamster cell CHO (hereinafter abbreviated as CHO cell), dh fr gene-deficient Chinese hamster cell CHO (hereinafter abbreviated as CHO (dh fr—) cell). ), Mouse L cells, mouse AtT-20, mouse myeloma cells, rat GH3, human FL cells, etc. are used.
  • Transformation of Bacillus spp. can be performed, for example, according to the method described in Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979).
  • Transformation of insect cells or insects can be performed, for example, according to the method described in Bio / Technology, 6, 47-55 (1988).
  • a liquid medium is suitable as a medium used for the cultivation, and a carbon source necessary for the growth of the transformant is contained therein.
  • Nitrogen sources inorganic substances and others.
  • carbon sources include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose.
  • nitrogen sources include ammonium salts, nitrates, corn chip liquor, peptone, potato zein, meat extract, soybean meal, and potato extract
  • the inorganic or organic substance and the inorganic substance include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride and the like.
  • yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • a medium for culturing Escherichia sp. For example, M9 medium containing glucose and casamino acid (Miller, Journal of Experimen 'Molecular N'etics (Journal oi Experiments) in Molecular Genetics), 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 197 2). If necessary, a drug such as 3) 3-indolylacrylic acid can be added to make the promoter work efficiently.
  • the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia
  • the cultivation is usually performed at about 15 to 43 ° C for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be added.
  • cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C for about 6 to 24 hours.
  • a medium for example, Burkholder's minimum medium [Bostian, KL et al., Processings of the National Academy of Sciences] ⁇ The USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 77, 4505 (1 980)] and 0.
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 5-8. Culture is usually about 20 ⁇ 35: for about 24-72 hours, adding aeration and stirring as needed.
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. Culture is usually performed at about 27 ° C for about 3 to 5 days, and aeration and agitation are added as necessary.
  • examples of the medium include a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, 122, 501 (1952)], a DMEM medium [Virology, 8, 396 (1959)], RPMI 1640 medium [Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)] , 1 99 Medium [Proceding of the Society for the Biological Medicine]
  • the pH is about 6-8.
  • Culture is usually performed at about 30 to 40 ° C for about 15 to 60 hours, and aeration and agitation are added as necessary.
  • the peptide protein of the present invention can be produced in the transformant, inside the cell membrane, or outside the cell.
  • the peptide / protein of the present invention can be separated and purified from the above culture by, for example, the following method.
  • the cells or cells When extracting the peptide / protein of the present invention from cultured cells or cells, the cells or cells are collected by a known method after culturing, suspended in an appropriate buffer, and sonicated, lysozyme and / or freeze-thawed. After the cells or cells are destroyed by, for example, a method of obtaining a crude extract of the protein by centrifugation or filtration is used as appropriate.
  • the buffer may contain a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-1100 TM .
  • the supernatant is separated from the cells or cells by a method known per se, and the supernatant is collected.
  • Purification of the peptide-protein contained in the thus obtained culture supernatant or extract can be carried out by appropriately combining known separation and purification methods. These known separation and purification methods mainly include methods using solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS polyacrylamide gel electrophoresis, etc.
  • Method using difference in charge method using charge difference such as ion exchange chromatography, method using specific affinity such as affinity chromatography, hydrophobicity such as reversed phase high performance liquid chromatography
  • a method utilizing the difference between the isoelectric points such as a method utilizing the difference between the isoelectric points, and an isoelectric point electrophoresis method are used.
  • the peptide or protein thus obtained when obtained in a free form, it can be converted to a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and conversely, when the peptide or protein is obtained as a salt, it is known per se It can be converted to a free form or another salt by a method or a method analogous thereto.
  • the peptide / protein produced by the recombinant can be arbitrarily modified or the peptide / polypeptide can be partially removed by applying an appropriate protein-modifying enzyme before or after purification.
  • an appropriate protein-modifying enzyme for example, trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, proteinase, glycosidase and the like are used.
  • the activity of the thus-produced peptide of the present invention can be measured by a binding experiment between the labeled peptide of the present invention and the protein of the present invention, and enzymatic immortality using a specific antibody.
  • the activity of the produced protein of the present invention can be measured by a binding experiment with the labeled peptide of the present invention, or by enzymimnoassay using a specific antibody.
  • the peptide of the present invention may be produced as an active peptide by expressing it in a prokaryotic host by genetic engineering and refolding it in a redox buffer. Details are described below.
  • the peptide of the present invention forms an insoluble component (inclusion body) in host prokaryotic cells
  • cells are collected by a method such as centrifugation, the cells are disrupted, and the inclusion body is denatured with a denaturing agent.
  • the peptide of the present invention can be extracted.
  • the disruption of the cells can be carried out in a conventional manner, for example by sonication. It is preferable to use a suitable buffer (for example, a phosphate buffer or the like) adjusted to a neutral pH value (pH 6.5 to 7.5) as a suspension medium. At this time, EDTA may be added to promote cell disruption. After disrupting the cells in this way, the insoluble components (encapsulated body) are separated by centrifugation or filtration by any method. In order to remove as much as possible proteins derived from prokaryotic cells, it is preferable to wash with, for example, water or a phosphate buffer, but in some cases, it may be washed with about 4 M of urea.
  • a suitable buffer for example, a phosphate buffer or the like
  • a neutral pH value pH 6.5 to 7.5
  • a denaturing agent for solubilizing the obtained precipitate (pellet) using a denaturing agent a known denaturing agent, in particular, guanidine or urea can be used.
  • the denaturant is usually used as an aqueous solution, and the concentration of the denaturant in the aqueous solution is 4 to 8 mol / liter, preferably about 6 to 7 mol / liter for guanidine, and 5 to 9 mol Z liter for urea, preferably about 8 mol Z liters.
  • Guanidine is usually used as an acid addition salt of guanidine such as guanidine hydrochloride.
  • the peptide of the present invention does not form an inclusion body in the host prokaryotic cells, after culturing, the cells are collected by a method such as centrifugation, and then the cells are solubilized using a denaturing agent, or After crushing, the peptide of the present invention can be extracted by solubilization with a denaturing agent.
  • denaturing agents used for solubilizing the collected cells include guanidine and urea.
  • the denaturing agent is usually used as an aqueous solution, and the concentration of the denaturing agent in the aqueous solution is usually 4 to 8 mol mol, preferably about 6 to 7 mol / liter for guanidine.
  • Guanidine is usually used as an acid addition salt of guanidine such as guanidine hydrochloride.
  • Disruption of the cells can be carried out in a conventional manner, for example by sonication or French press.
  • a denaturant used for solubilization of the disrupted cells a known denaturant may be used, and guanidine or urea is preferably used.
  • the denaturant is generally used as an aqueous solution, and the concentration of the denaturant in the aqueous solution is 4 to 8 mol / liter, preferably about 6 to 7 mol / liter for guanidine, and 5 to 9 mol / liter for urea, preferably about 8 mol Z liters.
  • Guanidine is usually guanidine hydrochloride Etc. are used as acid addition salts of guanidine.
  • the refolding is performed by adding a redox buffer to the purified peptide of the present invention or diluting the supernatant containing the peptide of the present invention with the redox buffer.
  • redox buffers examples include buffers containing oxidized daltathione (GS SG) and reduced daluzion (GSH), buffers containing cysteine and cystine, and buffers containing cysteamine and cisamine. Can be Among them, a buffer containing GS SG and GSH is preferable.
  • the buffer include a Tris buffer, a phosphate buffer, an acetate buffer, a citrate buffer and the like, among which a Tris buffer and the like are preferable.
  • the concentrations of the oxidizing agent (oxidized substance) and the reducing agent (reduced substance) in the redox buffer are, for example, 0.01 to 100 mmol Z liter and 0.0:! To 100 mmol / liter, respectively. More specifically, when GS SG and GSH are used, the concentration of GS SG in the redox buffer is 0.01 to 100 millimoles Z liter, preferably 0.1 to 10 millimoles Z liter, preferably 0.1.
  • the concentration of GSH is from 0.01 to 100 millimol / liter, preferably from 0.1 to 10 milliliter, and preferably from 0.2 to 2.0 milliliter.
  • an amino acid having no mercapto group is further contained in the redox buffer.
  • diluting the supernatant containing the peptide of the present invention with redox buffer it is preferable to dilute the denaturing agent to neutral concentration at neutral pH suitable for activation.
  • the concentration of guanidine in the diluent is 0 to 2.0 mol Z liter, preferably up to about 1 molnoliter, and when urea is used as a denaturant, the diluent is The concentration of urea in the solution is 0-4.0 mol liter, preferably about 2 mol / litre It is desirable to dilute to less than Torr.
  • the amino acid having no mercapto group examples include arginine, aspartic acid, amino X 'phosphorus, lysine, alanine, and citrulline. Arginine and the like are preferred in terms of yield.
  • the concentration of the amino acid added to the redox buffer is from 0.1 to 1.0 mol liter, preferably from 0.2 to 0.8 mol / l.
  • the temperature for the above refolding is 0 to 30 ° C, preferably 4 to 15 ° C.
  • the pH is between 7 and 9, preferably between pH 7.5 and 8.5.
  • the time required for refolding is usually 0.5-7 days, preferably 1-3 days, and more preferably :! ⁇ 2 days.
  • purification steps such as extraction, salting out, dialysis, distribution, crystallization, recrystallization, gel filtration, and chromatography can be introduced.
  • the purification step can also be performed following refolding.
  • such purification includes, for example, extraction, salting-out, dialysis, partitioning, crystallization, recrystallization, gel filtration, chromatography, and the like.
  • Preferred examples include dialysis and, for example, SP-Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech (Amersham Pharmacia Biotech)). ), CM—5PW (Tosoh Corporation), DEAE-5PW (Tosoh Corporation), etc.
  • Ion exchange mouth chromatography for example, C4P-50 (Showa Denko Corporation) was used.
  • a purification method by reversed phase chromatography or the like can be mentioned.
  • An antibody against the peptide of the present invention, the protein of the present invention or a partial peptide thereof or a salt thereof may be a polyclonal antibody that can recognize the peptide of the present invention or the protein of the present invention or a partial peptide thereof or a salt thereof. Any of an antibody and a monoclonal antibody may be used.
  • Antibodies against the peptide of the present invention, the protein of the present invention, a partial peptide thereof, or a salt thereof (hereinafter, may be abbreviated as the peptide / protein of the present invention).
  • the peptide protein of the present invention is administered to a mammal at a site capable of producing an antibody by administration to itself or together with a carrier or a diluent.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production during administration. Administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times. Examples of mammals to be used include monkeys, egrets, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, and goats, and mice and rats are preferably used.
  • a warm-blooded animal immunized with the antigen for example, a mouse with an antibody titer is selected from the mouse, and the spleen or lymph node is collected 2 to 5 days after the final immunization.
  • a monoclonal antibody-producing hybridoma By fusing the antibody-producing cells contained in the above with myeloma cells, a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared.
  • the antibody titer in the antiserum is measured, for example, by reacting the labeled peptide protein of the present invention described below with the antiserum, and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody. be able to.
  • the fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Koehler and Milstein [Nature, 256, 495 (1975)].
  • the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, and preferably PEG is used.
  • myeloma cells examples include NS-1, P3U1, and 3-2, and P3U1 is preferably used.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably, PEG 1000 to PEG6000) is about 10 to 80%.
  • the cells are added at a concentration of about 20 to 40 ° C., preferably about 30 to 37, and incubated for about 1 to 10 minutes, so that cell fusion can be carried out efficiently.
  • the hybridoma culture supernatant is added to a solid phase (eg, microplate) on which the peptide / protein antigen of the present invention is adsorbed directly or together with a carrier, and then labeled with a radioactive substance, an enzyme, or the like.
  • a radioactive substance e.g., an enzyme, or the like.
  • Anti-immunoglobulin antibody if the cells used for cell fusion are mice, an anti-mouse immunoglobulin antibody is used
  • protein A protein A
  • the selection of the monoclonal antibody can be carried out according to a method known per se or a method analogous thereto. Usually, it can be carried out in a medium for animal cells to which HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) is added.
  • HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • any medium can be used as long as a hybridoma can grow.
  • RPMI 1640 medium containing 1 to 20%, preferably 10 to 20% fetal bovine serum, GIT medium containing 1 to 10% fetal bovine serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
  • a serum-free medium for hybridoma culture SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.
  • the culture temperature is usually 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C.
  • the culture time is generally 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks.
  • the culture can be usually performed under 5% carbon dioxide gas.
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
  • Monoclonal antibodies can be separated and purified in the same manner as normal polyclonal antibodies. [Examples: salting out, alcohol precipitation, isoelectric focusing, electrophoresis, ion exchangers (ex. , DEAE), ultracentrifugation, gel filtration, antigen-binding solid phase or specific antibody obtained by collecting only the antibody with an active adsorbent such as protein A or protein G, and dissociating the bond to obtain the antibody. Purification method].
  • the polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a method known per se or a method analogous thereto. For example, immunizing antigen (peptide of the present invention, protein A complex of the antigen) and a carrier protein, and immunize a mammal in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody. It can be produced by separating and purifying the antibody.
  • the type of carrier protein and the mixing ratio of the carrier and octane are determined by the antibody against the hapten immunized by cross-linking the carrier.
  • any substance may be crosslinked at any ratio.
  • serum albumin, thyroglobulin, keyhole, lindet, hemocyanin, etc. may be used in a weight ratio of 8 parts by weight. For one, about 0.:! A method of coupling at a rate of about 20 to 20 and preferably about 1 to 5 is used.
  • various condensing agents can be used for force coupling between the hapten and the carrier.
  • daltaraldehyde, carbodiimide, a maleimide active ester, an active ester reagent containing a thiol group or a dithiopyridyl group, or the like is used.
  • the condensation product is administered to a warm-blooded animal itself or together with a carrier or diluent at a site where antibody production is possible.
  • Complete Freund's adjuvant / incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration.
  • the administration can usually be performed once every about 2 to 6 weeks, for a total of about 3 to 10 times.
  • the polyclonal antibody can be collected from blood, ascites, etc., preferably from blood, of the mammal immunized by the above method.
  • the polyclonal antibody titer in the antiserum can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the serum described above. Separation and purification of the polyclonal antibody can be carried out according to the same immunoglobulin separation and purification method as the above-mentioned separation and purification of the monoclonal antibody.
  • the peptide of the present invention a peptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 or a salt thereof (hereinafter sometimes abbreviated as MIT 1) or the present invention Proteins, polynucleotides encoding them, or antibodies against them can be easily searched for obtaining angiogenesis inhibitors Useful for screening (screening). In particular, angiogonists of the protein of the present invention are useful as excellent angiogenesis inhibitors.
  • a protein of the present invention a DNA encoding the protein of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as the DNA of the present invention), an antisense DNA of the present invention and an antibody against the peptide of the present invention (hereinafter, the antibody of the present invention) (May be abbreviated as ")": (i) a prophylactic / therapeutic agent for various diseases related to the protein of the present invention; (ii) a compound or a salt thereof that alters the binding property between the peptide of the present invention and the protein of the present invention.
  • a compound that changes the binding property of a ligand to the protein of the present invention which is specific to humans and mammals, by using a receptor-binding Atssay system using the expression system of the recombinant protein of the present invention (eg, agonist, Can be screened, and the agonist or angonist can be used as a prophylactic or therapeutic agent for various diseases.
  • a receptor-binding Atssay system using the expression system of the recombinant protein of the present invention (eg, agonist, Can be screened, and the agonist or angonist can be used as a prophylactic or therapeutic agent for various diseases.
  • the compound that inhibits the activity of the peptide of the present invention may be any compound that inhibits the activity of the peptide of the present invention. Examples thereof include vascular endothelial cell proliferation activity, intestinal contraction control activity, and protein against the protein of the present invention. Compounds that inhibit the binding activity, signal transduction via the protein of the present invention, and the like are included.
  • the compound that inhibits the activity of the protein of the present invention may be any compound that inhibits the activity of the protein of the present invention. Compounds that inhibit signal transduction and the like are included.
  • the compound that inhibits the binding of the peptide or MIT 1 of the present invention to the protein of the present invention may be any compound that inhibits the binding of the peptide or MIT 1 of the present invention to the protein of the present invention. .
  • the compound that inhibits the activating action of the peptide or MIT 1 of the present invention on the protein of the present invention the compound that inhibits the activating action of the peptide or MIT 1 of the present invention on the protein of the present invention.
  • Any compound may be used, and examples thereof include compounds that inhibit the binding activity of the protein of the present invention to the peptide of the present invention, the signal transduction activity, and the like by the peptide of the present invention or MIT 1 class.
  • the compounds (i) to (iv) or salts thereof can be obtained, for example, by using a screening method or a screening kit of the present invention described below.
  • a pharmaceutically acceptable salt or the like is used as the salt.
  • examples include salts with inorganic bases, salts with organic bases, salts with inorganic acids, salts with organic acids, and salts with basic or acidic amino acids.
  • the salt with an inorganic base include, for example, alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt, alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt, and aluminum salt and ammonium salt.
  • salt with an organic base examples include, for example, trimethylamine, triethylamine, pyridine, picoline, 2-6-lutidine, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, cyclohexylamine, dicyclohexylamine, N, N'—Salts with dibenzylethylenediamine and the like.
  • salts with inorganic acids include salts with hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, phosphoric acid, and the like.
  • salts with organic acids include, for example, formic acid, acetic acid, propionic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, citric acid, succinic acid, malic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, benzoic acid Salts with acids and the like can be mentioned.
  • salt with a basic amino acid include, for example, salts with arginine, lysine, and oltinine
  • salt with an acidic amino acid include, for example, aspartic acid, glutamic acid, and the like.
  • the above compound or a salt thereof is used as an angiogenesis inhibitor.
  • Diseases associated with life e.g., cancer (e.g., lung cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, prostate cancer, gastric cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, Ovarian disease (eg, polycystic ovary syndrome (ovarian polycystic disease), ovarian hyperstimulation, etc.), inflammatory disease (eg, rheumatoid arthritis, etc.), diabetic retinopathy, etc. It is used safely as a medicine such as a preventive and therapeutic agent.
  • cancer e.g., lung cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, prostate cancer, gastric cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer
  • Ovarian disease eg, polycystic ovary syndrome (ovarian polycystic disease), ovarian hyperstimulation, etc
  • An angiogenesis inhibitor comprising an antisense nucleotide containing a nucleotide sequence complementary or substantially complementary to the nucleotide sequence of DNA encoding the peptide of the present invention or a part thereof
  • the antisense nucleotide can suppress the function of the peptide of the present invention or its DNA in a living body, it can be used as an angiogenesis inhibitor such as a disease associated with angiogenesis , Cancer (e.g., breast cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, prostate cancer, stomach cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, cystic sarcoma) Prevention and treatment of ovarian diseases (eg, polycystic ovary syndrome (polycystic ovary), ovarian hyperstimulation, etc.), inflammatory diseases (eg, rheumatoid arthritis, etc.), diabetic retinopathy, etc.) It is used safely as an agent and other pharmaceuticals.
  • ovarian diseases eg, polycystic ovary syndrome (polycystic ovary), ovarian hyperstimulation, etc.
  • inflammatory diseases eg, rheumato
  • the antisense DNA can be administered alone or after being inserted into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, or the like, and then administered in a conventional manner.
  • the antisense DNA can be administered as it is or in the form of a formulation together with a physiologically acceptable carrier such as an adjuvant for promoting uptake, and can be administered by a gene gun or a catheter such as a hide mouth gel catheter.
  • an angiogenesis inhibitor comprising an antibody against the peptide of the present invention or an antibody against the protein of the present invention
  • the above-mentioned antibodies include, for example, diseases caused by overexpression of the peptide of the present invention or the protein of the present invention; , Renal cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, prostate cancer, stomach cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, cystic sarcoma, etc.), ovarian disease (eg, polycyst) It is used safely as a drug for the prevention and treatment of ovarian syndrome (ovarian polycystic disease), ovarian hyperstimulation, etc., inflammatory diseases (eg, rheumatoid arthritis, etc.), diabetic retinopathy, etc.
  • a diagnostic agent for cancer, ovarian disease, inflammatory disease, diabetic retinopathy, etc. comprising the peptide of the present invention or the polynucleotide encoding the protein of the present invention.
  • the polynucleotide can be used, for example, as a probe to produce human or warm-blooded animals (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, higgies, bushus, horses, horses, cats, dogs, monkeys). And the like) can be used to detect abnormalities (genetic abnormalities) in the DNA or mRNA encoding the peptide of the present invention or the protein of the present invention. It is useful as a diagnostic agent for genes such as an increase or overexpression of DNA or mRNA.
  • the above-mentioned genetic diagnosis can be performed by, for example, a known northern hybridization or PJ? (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989)), Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol. 86, pp. 2766-2770 (1989)), DNA microarray, etc. You can do it.
  • cancer eg, Cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, prostate cancer, stomach cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, cystic sarcoma
  • ovarian disease For example, polycystic ovary syndrome Cystic disease), ovarian hyperstimulation, etc.
  • inflammatory diseases eg, rheumatoid arthritis, etc.
  • a screening method characterized by using the peptide of the present invention (including its partial peptide) or MIT 1 class and the protein of the present invention (including the partial peptide of the protein of the present invention);
  • a screening kit (hereinafter sometimes abbreviated as the screening method of the present invention or the screening kit of the present invention) characterized by using the MIT 1 class and the protein of the present invention, A compound that alters the binding of the peptide of the present invention or MIT 1 class to the protein of the present invention, preferably
  • the compounds (i) to (iv) or salts thereof have an angiogenesis inhibitory effect and are useful as an angiogenesis inhibitor.
  • a binding assay system ligand / recept yuuichi assay system
  • a compound that changes the binding between the peptide of the present invention or MIT 1s and the protein of the present invention, a compound that changes the binding between the peptide or MIT 1s of the present invention and the protein of the present invention for example, peptide , Proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, etc.
  • salts thereof for example, peptide , Proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, etc.
  • Such compounds may have a cell stimulating activity (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation via the protein of the present invention).
  • a cell stimulating activity eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation via the protein of the present invention.
  • Compounds having no cell stimulating activity are included. “Altering the binding between the peptide of the present invention and the protein of the present invention” includes both cases of inhibiting and promoting the binding of the peptide of the present invention to the protein of the present invention.
  • the present invention provides a comparison between (i) the case where the protein of the present invention is brought into contact with the peptide of the present invention and (ii) the case where the above-mentioned protein of the present invention is brought into contact with the peptide of the present invention and a test compound.
  • the present invention provides a method for screening a compound or a salt thereof, which alters the binding property between the peptide of the present invention and the protein of the present invention. In this screening, MIT1s may be used in the same manner as the peptide of the present invention.
  • the screening method of the present invention (i) the case where the above-mentioned protein of the present invention is brought into contact with the peptide of the present invention and (ii) the above-mentioned protein of the present invention which comes in contact with the peptide of the present invention and a test compound.
  • the amount of the peptide of the present invention bound to the protein of the present invention, the cell stimulating activity, and the like are measured and compared.
  • screening method of the present invention include, for example,
  • the peptide of the present invention When the peptide of the present invention is brought into contact with the protein of the present invention, and when the peptide of the present invention and a test compound are brought into contact with the protein of the present invention, the peptide of the present invention A method for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property between the peptide of the present invention and the protein of the present invention, comprising measuring and comparing the amount of binding to the protein;
  • the peptide of the present invention is a labeled peptide, a receptor binding assay system such as the screening method of (a) to (c) above,
  • the protein of the present invention used in the screening method of the present invention may be any protein containing the above-described protein of the present invention.
  • the protein of the present invention, etc. which is expressed in large amounts using a recombinant, is suitable for use in screening.
  • endothelial cells derived from mammals can also be used.
  • the preparation method described later when a cell containing the protein of the present invention or the cell membrane fraction is used, the preparation method described later may be followed.
  • the cell When a cell containing the protein of the present invention is used, the cell may be immobilized with daltaraldehyde, formalin, or the like.
  • the immobilization method can be performed according to a method known per se.
  • the cell containing the protein of the present invention refers to a host cell expressing the protein of the present invention.
  • the host cell include the aforementioned Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cells, animal cells, and the like.
  • the membrane fraction refers to a fraction containing a large amount of cell membrane obtained by crushing cells and then using a method known per se.
  • Cell crushing methods include crushing cells with a Potter-Elvehj em-type homogenizer, crushing with a Waring blender or polytron (Kinematica), crushing with ultrasonic waves, French press, etc. Disruption by ejecting cells from a narrow nozzle while applying pressure can be cited.
  • centrifugal fractionation methods such as differential centrifugation and density gradient centrifugation are mainly used.
  • the cell lysate is centrifuged at a low speed (500-3000 rpm) for a short time (typically, about 1-10 minutes), and the supernatant is further centrifuged at a high speed (15OO-30rpm), usually 30 minutes-2 hours.
  • the precipitate is the membrane fraction.
  • the membrane fraction is rich in the expressed protein of the present invention and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
  • the amount of the protein of the present invention in the cells or membrane fraction containing the protein of the present invention is preferably 10 3 to 10 8 molecules per cell, more preferably 10 5 to 10 7 molecules per cell. is there.
  • the higher the expression level the higher the ligand binding activity (specific activity) per membrane fraction, which not only enables the construction of a highly sensitive screening system, but also enables the measurement of a large number of samples in the same lot. Become.
  • mammal-derived endothelial cells examples include endothelial cells of humans, monkeys, mice, mice, rats, mice, etc. (eg, arterial vascular endothelial cells, capillary endothelial cells, etc.).
  • a capillary endothelial cell which is one of mammalian-derived capillary endothelial cells, can be prepared by the following method.
  • capillary endothelial cells can be prepared from mammalian brain, ovaries, and the like.
  • the protein fraction of the present invention is preferably a natural protein fraction of the present invention or a recombinant protein fraction of the present invention having an activity equivalent thereto.
  • equivalent activity means equivalent ligand binding activity and the like.
  • the peptide labeled present invention for example, radioactive same position elements (eg, [125 I], [13 '1), (3 ⁇ 4], [I4 C], [32 P], [33 P], [35 S] etc.), fluorescent substances [eg, cyanine fluorescent dyes (eg, Cy2, Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7 (manufactured by Amersham Bioscience)), fluorescamine, fluorescein sothiosianate, etc.], enzymes (eg, , / 3-galactosidase, / 3-dalcosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase, etc.), A peptide of the present invention labeled with a luminescent substance (eg, luminol, luminol derivative, luciferin, lucigenin, etc.), a biotin, a lanthanide element, and the like, preferably a radioactive isotope-labeled peptide of the
  • the buffer may be any buffer such as a phosphate buffer of pH 4 to 10 (preferably pH 6 to 8) or a buffer of Tris-HCl which does not inhibit the binding of the peptide of the present invention to the protein of the present invention.
  • a surfactant such as CHAPS, Tween-80 TM (Kaoichi Atlas), digitonin, and dexcholate can be added to the buffer.
  • a protease inhibitor such as PMSF, leptin, E-64 (manufactured by Peptide Research Laboratories), and peptide suptin may be added for the purpose of suppressing the degradation of the protein of the present invention or the peptide of the present invention by a protease. it can.
  • a reaction tube containing a large excess of an unlabeled peptide of the present invention is also prepared to determine the non-specific binding amount (NSB).
  • the reaction is carried out at 0 to 5 (TC, preferably at 4 to 37 ° C, for 20 minutes to 24 hours, preferably for 30 minutes to 3 hours.
  • the reaction solution is filtered through a glass fiber filter paper or the like, and an appropriate amount of the same buffer is used. After washing with a filter, the radioactivity remaining on the glass fiber filter paper is measured with a liquid scintillation counter or an counter 1.
  • the non-specific binding amount (NSB) is subtracted from the count (B fl ) when there is no antagonist.
  • a test compound having a specific binding amount (B-NSB) of, for example, 50% or less, when the counted value (B.-NSB) is set to 100%, can be selected as a candidate substance having a competitive inhibition ability.
  • BIAcore manufactured by Amersham Pharmacia Biotech
  • the peptide of the present invention can be used as an amino acid according to the protocol attached to the device.
  • a protein fraction of the present invention or a membrane fraction containing the protein of the present invention which is immobilized on a sensor chip by a coupling method and purified from cells containing the protein of the present invention or transformants containing DNA encoding the protein of the present invention;
  • a purified buffer of the protein of the present invention or the membrane fraction containing the protein of the present invention and a buffer solution containing a test compound, such as a phosphate buffer or tris buffer are supplied at a flow rate of 2 to 20 ⁇ 1 per minute on the sensor chip. Let through by volume.
  • the cell stimulating activity mediated by the protein of the present invention for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular c AM).
  • the measurement can be performed using a known method or a commercially available measurement kit. Specifically, first, cells containing the protein of the present invention are cultured on a multiwell plate or the like.
  • an appropriate protein of the present invention is used. Is used.
  • the cells expressing the protein of the present invention the above-mentioned recombinant cell lines expressing the protein of the present invention are preferable.
  • the transformant expressing the protein of the present invention may be a stable expression strain or a transient expression strain. The same kind of animal cells as described above are used.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, etc. More specifically, they are described in the following [1] to [12].
  • GTPaS When a receptor-expressing cell is stimulated by a receptor agonist, an intracellular G protein is activated and GTP is bound. This phenomenon is also observed in the membrane fraction of receptor-expressing cells. Normally, GTP is hydrolyzed and changes to GDP.At this time, if GTPaS is added to the reaction solution, GTPaS binds to G protein like GTP, but is hydrolyzed. However, the state of binding to the G protein-containing cell membrane is maintained. When labeled GTPrS is used, the activity of stimulating the receptor-expressing cells of the receptor agonist can be measured by measuring the labeled GTPrS remaining on the cell membrane.
  • This method is performed using a membrane fraction containing the protein of the present invention.
  • materials exhibiting GTP ⁇ S binding promoting activity to the protein membrane fraction of the present invention is the c specifically a Agonisuto this measurement method, the presence of labeled GTPrS, protein membrane of the present invention a peptide of the present invention
  • the GTPrS binding promoting activity to the protein cell membrane fraction of the present invention was measured when the fraction was brought into contact with the protein cell membrane fraction of the present invention when the peptide and the test compound were brought into contact with the protein cell membrane fraction of the present invention.
  • a compound that changes the binding property between the peptide of the present invention and the protein of the present invention is screened.
  • a test compound having an activity of suppressing the activity of promoting the binding of GT P ⁇ S to the protein cell membrane fraction of the protein of the present invention by the peptide of the present invention can be selected as a candidate substance having a competitive inhibitory ability.
  • agonists can be screened by bringing only the test compound into contact with the protein cell membrane fraction of the present invention and measuring the activity of promoting GTP-AS binding to the protein cell membrane fraction of the present invention.
  • a cell membrane fraction containing the protein of the present invention prepared according to a known method is treated with a membrane dilution buffer (50 mM Tris, 5 mM MgCl 2 , 150 mM NaCl, 1 MGDP, 0.1% BSA; pH 7.4). ) Dilute with. The dilution rate depends on the expression level of the receptor. This is dispensed in 0.2 ml each into Falcon 2053, the peptide of the present invention or the peptide of the present invention and a test compound are added, and [ 35 S] GTPrS is further added to a final concentration of 200 pM.
  • a membrane dilution buffer 50 mM Tris, 5 mM MgCl 2 , 150 mM NaCl, 1 MGDP, 0.1% BSA; pH 7.4
  • the dilution rate depends on the expression level of the receptor. This is dispensed in 0.2 ml each into Falcon 2053, the peptide of the present invention or the peptid
  • the present invention The effect of the test compound on the GTPaS binding promoting activity of the peptide of the present invention was calculated by setting the radioactivity of the test group to which the peptide of the present invention was added to 100% and the radioactivity of the experimental group to which no peptide of the present invention was added to 0%.
  • a test compound having a GTPaS binding promoting activity of, for example, 50% or less can be selected as a candidate substance having an antagonistic ability.
  • AMP production is suppressed.
  • this reaction to measure the stimulating activity of the peptide of the present invention on cells expressing the protein of the present invention, it is possible to screen for a compound that changes the binding property between the peptide of the present invention and the protein of the present invention. it can. Specifically, the case where the peptide of the present invention is brought into contact with the protein-expressing cell of the present invention in the presence of a substance that increases the amount of intracellular cAMP, the case where the peptide of the present invention and the test compound are compared with the protein of the present invention.
  • a compound that alters the binding property between the peptide of the present invention and the protein of the present invention is measured by measuring the activity of inhibiting the production of intracellular cAMP of the cell when the cell is brought into contact with the expressing cell, and comparing the results. .
  • Substances that increase the amount of intracellular cAMP include, for example, forskolin, cal Cytonin and the like are used.
  • CAMP production amount of protein expression in cells of the present invention is a mouse, rat, Usagi, catcher formic, an anti-cAMP antibody obtained by immunizing such ⁇ a [125 1] (commercially available in the well) labeled cAMP It can be measured in an RIA system by use or an EIA system in which an anti-cAMP antibody and labeled cAMP are combined.
  • the anti-c AMP antibody, a protein A or anti-c AM P such as beads containing scintillant which is secured using such antibodies against antibody production in animals of I g G using [125 1] -labeled c AMP It can be quantified by the SPA (Scintillation Proximity Assay) method used (using a kit manufactured by Amersham Pharmacia Biotech).
  • SPA Scintillation Proximity Assay
  • a test compound showing an activity of inhibiting the cAMP production-suppressing activity of the protein-expressing cell of the present invention by the peptide of the present invention can be selected as a candidate substance having a competitive inhibitory ability.
  • compounds that exhibit agonist activity can be screened by contacting only the test compound with the protein-expressing cell of the present invention and examining cAMP production inhibitory activity.
  • Cells expressing the protein of the present invention are seeded on a 24-well plate at 5 ⁇ 10 4 ce 11 / we 11. Incubate for 48 hours. Cells were washed in a Hanks buffer containing 0.2 mM 3-isobutyl-methylxanthine, 0.05% BSA and 2 OmM HEPES.
  • reaction buffer 1 (pH 7.4) (hereinafter abbreviated as reaction buffer 1). Then, add 0.5 ml of reaction buffer and incubate in the incubator for 30 minutes. Except for the reaction buffer, 0.25 ml of a new reaction buffer was added to the cells, and then a IM buffer of the present invention or a 1 M peptide of the present invention and 1 M of the present compound and a test compound were added thereto. Add 0.25 ml of reaction buffer containing choline to the cells and incubate at 37 for 24 minutes. Stop the reaction by adding 100% of 20% perchloric acid, then place on ice for 1 hour to extract intracellular cAMP. Measure the amount of cAMP in the extract using the cAMP EIA kit (Amersham Pharmacia Biotech).
  • the amount of cAMP produced by forskolin stimulation is calculated by setting the amount of cAMP suppressed by addition of 1 M of the peptide of the present invention to 0% and 0%.
  • a test compound that inhibits the activity of the peptide of the present invention and has cAMP production activity of, for example, 50% or more can be selected as a candidate substance having a competitive inhibition ability. .
  • the protein-expressing cell of the present invention which exhibits the property of increasing intracellular 'c AMP level by stimulation of the peptide of the present invention
  • the peptide of the present invention when the peptide of the present invention is brought into contact with the protein-expressing cell of the present invention.
  • the activity of promoting the intracellular cAMP production of the cell is measured and compared to obtain the peptide of the present invention.
  • Compounds that alter the binding to the protein of the present invention can be screened.
  • a test compound showing an activity of inhibiting the cAMP production promoting activity of the protein-expressing cell of the present invention by the peptide of the present invention can be selected as a candidate substance having a competitive inhibitory ability.
  • a compound exhibiting agonist activity can be screened by bringing only the test compound into contact with the protein-expressing cell of the present invention and examining cAMP production promoting activity.
  • the activity of promoting AMP production was determined by adding the peptide of the present invention or the peptide of the present invention and a test compound to cells expressing the protein of the present invention (eg, animal cells such as CHO cells) without adding forskolin in the above screening method.
  • CAMP produced by addition is quantified and measured by the above method.
  • the binding between the peptide of the present invention and the protein of the present invention can be determined by measuring the stimulating activity of the peptide of the present invention on cells expressing the protein of the present invention using the CRE-repo overnight gene vector. Can be screened for a compound that alters the expression.
  • DNA containing a CRE (cAMP response element) is inserted into the vector upstream of the reporter gene to obtain a CRE-reporter gene vector.
  • CRE cAMP response element
  • DNA containing a CRE is inserted into the vector upstream of the reporter gene to obtain a CRE-reporter gene vector.
  • the CRE_ Induces the production of the gene product (protein) of the overnight gene.
  • the reporter gene protein by measuring the enzymatic activity of the reporter gene protein, it is possible to detect a change in the amount of CAMP in the CRE-reporter gene vector-introduced cells.
  • the peptide of the present invention when the peptide of the present invention is brought into contact with a cell expressing the protein of the present invention into which a CRE-reporter gene vector has been introduced in the presence of a substance that increases the amount of intracellular c AMP, When the compound is contacted with a CRE-reporter gene vector-introduced protein-expressing cell of the present invention, the enzymatic activity of the repo overnight gene protein is measured and compared with the peptide of the present invention. A compound that changes the binding property to the protein of the present invention is screened.
  • forskolin, calcitonin, and the like are used as substances that increase the amount of intracellular cAMP.
  • the vector for example, Pitka Gene Basic Vector, Pitka Gene Enhancer Vector (Toyo Ink Manufacturing Co., Ltd.) and the like are used.
  • the CRE-containing DNA is inserted into a reporter gene of the above vector, for example, a multicloning site upstream of the luciferase gene, to give CRE—repo overnight gene vector.
  • a test compound that restores suppression of the reporter gene protein enzyme activity by the peptide of the present invention can be selected as a candidate substance having a competitive inhibition ability.
  • agonists can be screened by bringing only the test compound into contact with the protein-expressing cells of the present invention and measuring the same suppression of the amount of luminescence increased by forskolin stimulation as in the peptide of the present invention.
  • Cells expressing the protein of the present invention into which the CRE-reporter gene (luciferase) has been introduced are seeded on a 24-well plate at 5 ⁇ 10 3 ce 11 cells and cultured for 48 hours. Wash the cells with Hank's buffer (pH 7.4) containing 0.2 mM 3-isobutyl-methylxanthine, 0.05% BSA and 20 mM HE PES (hereinafter abbreviated as reaction buffer). Then 5 ml of reaction Add buffer and incubate for 30 minutes in the incubator.
  • Hank's buffer pH 7.4
  • reaction buffer containing 0.2 mM 3-isobutyl-methylxanthine, 0.05% BSA and 20 mM HE PES
  • the peptide of the present invention suppresses an increase in luminescence by luciferase based on forskolin stimulation.
  • a compound that restores the inhibition can be selected as a candidate substance having competitive inhibitory ability.
  • alkaline phosphatase for example, alkaline phosphatase, chloramphenicol transferase (chloramphenicol)
  • acetyltransferase and (3-galactosidase may be used.
  • the enzyme activity of these reporter gene proteins is measured according to a known method or using a commercially available assay kit.
  • the activity of chloramphenicol acetyltransferase was measured using, for example, Lumi-Phos 530 manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Is measured using, for example, Aurora Gate XE manufactured by Wako Pure Chemical.
  • the protein-expressing cells of the present invention release arachidonic acid metabolites extracellularly by stimulation of the peptides of the present invention. Utilizing this reaction, the stimulatory activity of the peptide of the present invention on the protein-expressing cell of the present invention is measured to screen for a compound that alters the binding between the peptide of the present invention and the protein of the present invention. But
  • the arachidonic acid metabolite release activity can be increased by the extracellular release of labeled arachidonic acid.
  • the measured arachidonic acid metabolite can be measured.
  • the peptide of the present invention is contacted with a cell expressing the protein of the present invention containing labeled arachidonic acid, and the peptide of the present invention and the test compound containing the arachidonic acid of the present invention containing the labeled arachidonic acid.
  • a compound that changes the binding property of the peptide of the present invention to the protein of the present invention is screened.
  • a test compound that inhibits the arachidonic acid metabolite release activity of the peptide of the present invention can be selected as a candidate substance having a competitive inhibition ability.
  • a compound exhibiting agonist activity can be screened by bringing only the test compound into contact with the protein-expressing cell of the present invention and examining the arachidonic acid metabolite releasing activity of the protein-expressing cell of the present invention by a known method. .
  • reaction buffer 1 Hanks buffer (pH 7.4) containing 0.05% BSA and 20 mM HE PES (hereinafter abbreviated as reaction buffer 1).
  • a reaction buffer 5001 containing a peptide of the present invention at a final concentration of 10 iM or a peptide of the present invention at a final concentration of 10 M and a test compound is added to each we11. After incubating at 37 ° C for 60 minutes, add the reaction solution 400 111 to the scintillator overnight, and measure the amount of [ 3 H] arachidonic acid metabolite released in the reaction solution by scintillation counting.
  • test compound having an arachidonic acid metabolite releasing activity of, for example, 50% or less can be selected as a candidate substance having an antagonistic ability.
  • the protein-expressing cell of the present invention is stimulated by the peptide of the present invention, C a concentration increases.
  • C a concentration increases.
  • the intracellular calcium concentration in the case where the peptide of the present invention was brought into contact with the protein-expressing cell of the present invention and the case where the peptide and the test compound of the present invention were brought in contact with the protein-expressing cell of the present invention are screened by measuring and comparing the increasing activities. The measurement is performed according to a known method.
  • a test compound that suppresses an increase in intracellular calcium concentration due to the peptide of the present invention can be selected as a candidate substance having a competitive inhibition ability.
  • agonists can be screened by measuring the increase in fluorescence intensity due to the addition of the test compound alone.
  • the protein-expressing cells of the present invention are seeded on a sterilized cover glass for a microscope. Two days later, the culture solution is replaced with HB suspended in 4 mM Fura-2AM (Dojindo Research Laboratories). Leave for 30 minutes. After washing with HBSS, set a cover glass in a cuvette, add the peptide of the present invention or the peptide of the present invention and a test compound, and excite the protein at a wavelength of 505 nm at an excitation wavelength of 340 nm and 380 nm. The increase in the ratio of fluorescence intensity is measured with a fluorimeter and compared.
  • FLIPR manufactured by Molecular Devices
  • F1uo_3AM manufactured by Dojindo Laboratories
  • F1uo_3AM manufactured by Dojindo Laboratories
  • a protein gene eg, aequorin
  • a protein gene that emits light by increasing intracellular Ca ions is co-expressed in the protein-expressing cell of the present invention, and the intracellular Ca ion concentration is increased.
  • the gene protein eg, aequor in etc.
  • the binding between the peptide of the present invention and the protein of the present invention is achieved.
  • a protein-expressing cell of the present invention in which a gene of a protein that emits light by increasing intracellular Ca ions, is seeded on a 96-well plate, and a peptide of the present invention or a peptide of the present invention and a test are prepared in the same manner as described above. Add the compound, measure the increase in the ratio of fluorescence intensity with a fluorimeter, and compare.
  • a test compound that suppresses an increase in fluorescence intensity due to the peptide of the present invention can be selected as a candidate substance having a competitive inhibition ability.
  • ETA endothelin A receptor
  • the intracellular Ca ion concentration of 28 (3-J81 cells (Reference Example 2 described later) and ETA24 cells) was determined for samples for atsey. Elevation activity is measured using FL IPR (Molequiura I Device) ZAQC—BMEM and BTA1 cells and DTA containing 10% dialyzed fetal serum (hereinafter referred to as dFBS) Suspend the ZAQC-B1 cells and ETA24 cells in a medium (10% dFBS-DMEM) at 15 ⁇ 10 4 cells / ml, and use them for FLIPR.
  • FL IPR Molequiura I Device
  • ZAQC—BMEM and BTA1 cells and DTA containing 10% dialyzed fetal serum hereinafter referred to as dFBS
  • the peptide of the present invention was brought into contact with the protein-expressing cell of the present invention in the presence of labeled inositol, and the peptide and test compound of the present invention were brought into contact with the protein-expressing cell of the present invention.
  • the compound that alters the binding property between the peptide of the present invention and the protein of the present invention is screened by measuring and comparing inositol triphosphate production viability. The measurement is performed according to a known method. In this method, a test compound that suppresses inositol triphosphate-producing activity can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition.
  • agonists can be screened by bringing only the test compound into contact with the protein-expressing cells of the present invention and measuring the increase in inositol triphosphate production.
  • the cells expressing the protein of the present invention are seeded on a 24-well plate and cultured for one day. After that, the cells are cultured in a medium supplemented with myo- [2-3 ⁇ 4] inositol (2.5 ⁇ Ci / wel 1) for 1 day, and the cells are thoroughly washed with a medium without radioactive inositol. After adding the peptide of the present invention or the peptide of the present invention and the test compound, 10% perchloric acid is added to stop the reaction. 1.
  • a test compound having an inositol triphosphate-producing activity of, for example, 50% or less can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition.
  • the binding between the peptide of the present invention and the protein of the present invention can be determined by measuring the stimulating activity of the peptide of the present invention on the cells expressing the protein of the present invention using the TRE-reporter gene vector. It is possible to screen for compounds that alter it.
  • DNA containing TRE is inserted upstream of the reporter gene in the vector to obtain a TRE-reporter gene vector.
  • TPA response element DNA containing TRE
  • TRE-reporter gene vector DNA containing TRE (TPA response element) is inserted upstream of the reporter gene in the vector to obtain a TRE-reporter gene vector.
  • stimulation accompanied by an increase in the intracellular calcium concentration is caused by TRE-mediated reporter gene expression and the subsequent reporter gene gene product ( Protein). That is, by measuring the enzymatic activity of the reporter gene protein, it is possible to detect a change in the amount of calcium in the cells into which the TRE-repo overnight gene vector has been introduced.
  • the protein of the present invention is expressed.
  • a compound that changes the binding property between the peptide of the present invention and the protein of the present invention is screened.
  • the vector for example, Pitska Gene Basic Vector, Pitska Gene Enhancer Vector-1 (Toyo Ink Mfg. Co., Ltd.) and the like are used.
  • the TRE-containing DNA is inserted into a reporter gene of the above vector, for example, a multi-cloning site upstream of the luciferase gene, to obtain a TRE—repo overnight gene vector.
  • a test compound that suppresses the enzymatic activity of the reporter gene protein by the peptide of the present invention can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition.
  • agonists can be screened by bringing only the test compound into contact with the TRE-reporter gene vector-introduced protein-expressing cell of the present invention and measuring the increase in luminescence in the same manner as the peptide of the present invention.
  • the protein-expressing cells of the present invention into which the TRE-repo overnight gene (luciferase) has been introduced are seeded on a 24-well plate at 5 ⁇ 10 3 ce 11 Zwe 11 and cultured for 48 hours. After washing the cells with Hank's buffer (pH 7.4) containing 0.05% BSA and 20 mM HEPES, 10 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ of the peptide of the present invention or 10 ⁇ of the peptide of the present invention and the test compound are added, and 37 to 60. Let react for a minute.
  • the cells are lysed with a cell lysing agent for Pitka Gene (Toyo Ink Mfg.
  • a luminescent substrate (Toyo Ink Mfg. Co., Ltd.) is added to the lysate.
  • Luminescence from luciferase is measured using a luminometer, liquid scintillation counter or top counter. The amount of luminescence by luciferase in the case where the peptide of the present invention is added and in the case where the peptide of the present invention and the test compound of ⁇ are added are measured and compared.
  • the increase in intracellular calcium by the peptide of the present invention increases the amount of luminescence by luciferase.
  • a compound that suppresses this increase can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition.
  • Reporter genes such as alkaline phosphatase, chloramphenicol transferase (chloramphenicol)
  • a gene such as acetyltransferase) or / 3-galactosidase may be used.
  • the enzyme activity of these reporter gene proteins is measured according to a known method or using a commercially available measurement kit.
  • Alkaline phosphatase activity was measured using, for example, Lumi-Phos 530 manufactured by Wako Pure Chemical
  • chloramphenicol acetyltransferase was measured using, for example, FAST CAT chrolamphenicol Acetyltransferase manufactured by Wako Pure Chemical.
  • Assay KiT the / 3-galactosidase activity is measured using, for example, Aurora Gait XE manufactured by Wako Pure Chemical Industries.
  • the MAP kinase is activated and proliferates in the cells expressing the protein of the present invention by the stimulation of the peptide of the present invention.
  • This reaction to measure the stimulating activity of the peptide of the present invention on cells expressing the protein of the present invention, it is possible to screen for a compound that alters the binding property between the peptide of the present invention and the protein of the present invention. it can.
  • cell proliferation was measured when the peptide of the present invention was brought into contact with the cell expressing the protein of the present invention, and when the peptide and the test compound of the present invention were brought into contact with the cell expressing the protein of the present invention. Then, a compound that changes the binding property between the peptide of the present invention and the protein of the present invention is screened by comparison.
  • the growth of the protein-expressing cell of the present invention may be measured, for example, by measuring MAP kinase activity, thymidine incorporation activity, cell number, and the like.
  • MAP kinase activity after adding the peptide of the present invention or the peptide of the present invention and a test compound to the cells expressing the protein of the present invention, immunoprecipitation using an anti-MAP kinase antibody from the cell lysate was performed. by after obtaining the MAP kinase fractions were measured known methods, for example, manufactured by Wako pure Chemical Industries, Ltd. MAP of kinase Assay Kit and ⁇ chromatography [32 P] MAP kinase activity using _ATP, compare.
  • the protein-expressing cells of the present invention are seeded on a 24-well plate, cultured, and added with the peptide of the present invention or the peptide and the test compound of the present invention.
  • methy Bok 3 H] - etc. thymidine was added, then the cells were lysed and the radioactivity of the thymidine incorporated into the cells, by counting in a liquid scintillator one Chillon counter one measures the thymidine uptake activity , Compare.
  • the protein-expressing cells of the present invention were seeded on a 24-well plate. After culturing and adding the peptide of the present invention or the peptide and the test compound of the present invention, MTT (3- (4,5- Add dimethyl-2-thiazolyl) -2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide). MTT formazan whose MTT was changed by being taken into the cells was dissolved in an aqueous solution of isopropanol acidified with hydrochloric acid. Measured by nm absorbance and compared.
  • a test compound that suppresses the growth of the protein-expressing cell of the present invention can be selected as a candidate substance having a competitive inhibition ability.
  • agonist screening can also be performed by bringing only the test compound into contact with the protein-expressing cell of the present invention and measuring the cell proliferation activity similar to that of the peptide of the present invention.
  • 500-well cells of the protein-expressing cell of the present invention are seeded on a 24-well plate and cultured for 1 day. The cells are then starved in a serum-free medium for 2 days. The peptide or peptides of the present invention and a test compound of the present invention, after incubation was added to the cells for 24 hours, [methy Bok 3 H] -. Thymidine per Ueru 0 0 1 5 MB q was added, 6 Incubate for hours. After washing the cells with PBS, add methanol and let stand for 10 minutes.
  • a test compound that suppresses an increase in radioactivity when the peptide of the present invention is added can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition.
  • the potassium channel is activated by the stimulation of the peptide of the present invention, and the K ion in the cell flows out of the cell. Utilizing this reaction, the stimulatory activity of the peptide of the present invention on the cell expressing the protein of the present invention is measured to screen for a compound that changes the binding property between the peptide of the present invention and the protein of the present invention. can do.
  • Rb ions rubberidium ions
  • the protein-expressing cells of the present invention radioactive after allowed incorporation of R b ([8 6 R b ]) which is an isotope, 8 6 R b flow out by stimulation of the peptides of the present invention (
  • the stimulating activity of the peptide of the present invention on cells expressing the protein of the present invention is measured by measuring the efflux activity.
  • a test compound that suppresses an increase in the efflux activity of 86 Rb due to stimulation by the peptide of the present invention can be selected as a candidate substance having a competitive inhibition ability.
  • agonist screening can also be performed by bringing only the test compound into contact with the protein-expressing cell of the present invention and measuring an increase in the efflux activity of 86 Rb similar to that of the peptide of the present invention.
  • the cells expressing the protein of the present invention are seeded on a 24-well plate and cultured for 2 days. Thereafter, the mixture is incubated for 2 hours in a medium containing lmC / 1 86 Rb CI. Wash cells thoroughly with medium to completely remove 86 RbC1 in the external solution.
  • the peptide of the present invention or the peptide of the present invention and a test compound are added to the cells, and after 30 minutes, the external solution is collected, and the radioactivity is measured with a counter to compare.
  • a test compound that suppresses the increase in the 86 Rb efflux activity due to the peptide stimulation of the present invention can be selected as a candidate substance having a competitive inhibitory ability.
  • the cells expressing the protein of the present invention react with the peptide of the present invention to change the extracellular pH.
  • this reaction to measure the stimulating activity of the peptide of the present invention on the cells expressing the protein of the present invention, it is possible to screen for a compound that changes the binding property between the peptide of the present invention and the protein of the present invention.
  • the extracellular pH between the case where the peptide of the present invention is brought into contact with the protein-expressing cell of the present invention and the case where the peptide of the present invention and the test compound are brought into contact with the protein-expressing cell of the present invention is measured and comparing the change.
  • a compound that changes the binding property between the peptide of the present invention and the protein of the present invention is screened.
  • the change in extracellular pH is measured using, for example, a Cytosensor apparatus (Molecular Devices).
  • a test compound that suppresses the extracellular pH change caused by the peptide of the present invention can be selected as a candidate substance having a competitive inhibition ability.
  • agonists can be screened by bringing only the test compound into contact with the cells expressing the protein of the present invention and measuring the extracellular pH change similar to that of the peptide of the present invention.
  • a compound that suppresses the extracellular pH change caused by the peptide of the present invention can be selected as a candidate substance having a competitive inhibition ability.
  • the yeast Sacharoiyces cerevisiae CDhaploid ⁇ -mating Type (MAT)
  • MAT ⁇ -mating Type
  • MAP kinase responds to the sex pheromone a-mating factor. Is activated, followed by activation of Far 1 (cell-cycle arrest) and the transcriptional activator Ste 12.
  • Ste 12 is involved in various proteins (eg, involved in conjugation).
  • the regulator Sst2 functions in a suppressive manner in the above-mentioned process In this system, a yeast into which a receptor gene has been introduced is produced, and the receptor agonist stimulates the yeast.
  • the genes encoding Ste2 and Gpa1 of the MAT ⁇ yeast are removed, and instead, a gene encoding the protein gene of the present invention and a Gpa1-Gai2 fusion protein are introduced.
  • the gene encoding Far is removed to prevent ceH-cycle arrest from occurring, and the gene encoding Sst is removed to remove the peptide of the present invention.
  • the response sensitivity to is improved.
  • a FUS1-HIS3 gene in which the histidine biosynthesis gene HIS3 is linked to FUS1 is introduced. This gene recombination operation is carried out, for example, by replacing the somatosustin receptor type 2 (SSTR2) gene with the protein of the present invention in the method described in Molecular and Cellular Biology, vol. 15, pages 6188-6195, 1995. Can be implemented.
  • SSTR2 somatosustin receptor type 2
  • the transformed yeast thus constructed reacts with high sensitivity to the peptide of the present invention, resulting in activation of MAP kinase, synthesis of histidine biosynthetic enzyme, and growth in a histidine-deficient medium. Will be possible.
  • the above-described protein-expressing yeast of the present invention (the Ste2 gene and the Gpa1 gene were removed, the protein gene of the present invention and the Gpa1-Gai2 fusion protein code gene were introduced, and the Far gene And the FUS1-HIS3 gene-introduced MAT ⁇ yeast) is cultured in a histidine-deficient medium, and the yeast of the present invention or the peptide of the present invention and a test compound are contacted with the yeast. By measuring the growth of and comparing them, it is possible to screen for a compound that alters the binding between the peptide of the present invention and the protein of the present invention.
  • a test compound that suppresses the growth of the yeast can be selected as a candidate substance having a competitive inhibition ability.
  • agonists can be screened by bringing only the test compound into contact with the above-described yeast expressing the protein of the present invention and measuring the growth of yeast similar to the peptide of the present invention.
  • Protein expression yeast of the present invention described above was cultured overnight in liquid culture medium completely synthetic medium, after them, the dissolution agar medium was removed histidine is added to a concentration of 2x l 0 4 cel lZml. Then sow in a 9 x 9 cm square petri dish. After the agar solidifies, a sterile filter paper impregnated with the peptide of the present invention or the peptide of the present invention and the test compound is placed on the agar surface, and cultured at 30 ° C for 3 days. The effect of the test compound is determined by comparing the growth of the yeast around the filter paper with the use of sterile filter paper impregnated with only the peptide of the present invention.
  • the peptide of the present invention is added to an agar medium from which histidine has been removed in advance, and the test compound is soaked in sterile filter paper to cultivate yeast. Nourish and observe that yeast growth on the entire dish is affected around the filter paper.
  • a compound that suppresses the growth of yeast can be selected as a candidate substance having a competitive inhibition ability.
  • RNA-introduced African Xenopus oocytes of the present invention By measuring and comparing the change in cell membrane potential when brought into contact with the oocyte, a compound that changes the binding property between the peptide of the present invention and the protein of the present invention is screened.
  • a test compound that suppresses a change in cell membrane potential can be selected as a candidate substance having a competitive inhibition ability.
  • agonists can be screened by contacting only the test compound with the protein gene RNA-transfected Xenopus laevis oocytes of the present invention and measuring a change in cell membrane potential similar to that of the peptide of the present invention. it can.
  • the protein gene mRNA of the present invention may be prepared from tissues or cells, or may be transcribed from plasmid in vitro.
  • the protein gene mRNA of the present invention was cultured in MBS solution at 20 ° C for 3 days, and this was placed in the cavity of a voltage cla immediately flowing Ringer solution, and a glass microelectrode for potential fixing and Insert a glass microelectrode for potential measurement into the cell, and (1) place the electrode outside the cell.
  • a change in potential is recorded by flowing a Ringer solution containing the peptide of the present invention or the peptide of the present invention and a test compound.
  • the effect of the test compound can be measured by comparing the change in the cell membrane potential of the oocyte of the present invention into which the protein gene RNA of the present invention has been introduced and comparing it with the case of flowing a Ringer solution containing only the peptide of the present invention. .
  • a compound that suppresses a change in cell membrane potential can be selected as a candidate substance having a competitive inhibition ability.
  • pNAyA-added RNA of each G protein gene may be introduced.
  • polyA-added RNA of a gene of a protein eg, aequor in
  • vascular endothelial cells derived from mammals preferably aortic vascular endothelial cells, more preferably capillary endothelial cells, more preferably capillary endothelial cells derived from endocrine tissues (eg, adrenal gland, ovary, testis, etc.)
  • endocrine tissues eg, adrenal gland, ovary, testis, etc.
  • the peptide of the present invention or the MIT 1 class radioactive chloride label is brought into contact with endothelial cells or an endothelial cell-derived membrane fraction cultured on a culture plate, A compound that inhibits the binding of the radioactive labeled compound to the endothelial cells or the membrane fraction is screened by measuring and comparing the binding of the labeled peptide to the endothelial cells or the membrane fraction.
  • the peptide of the present invention or MITs By stimulating endothelial cells, measuring the increase in intracellular calcium ion concentration, and comparing the results, a compound that suppresses the increase in intracellular calcium ion concentration depending on the peptide of the present invention or MIT1s is screened.
  • the endothelial cells were stimulated with the peptide of the present invention or MITs, and the amount of MAP kinase, the amount of thymidine incorporation, or the rate of cell proliferation was measured and compared. Screen for compounds that inhibit peptide or MIT-dependent MAP kinase levels, thymidine uptake reactions, or cell growth rate increases.
  • the above method 3) may be directly performed, or the method may be performed in the order of 1), 2), 3) or 2), 3). Good. Screening can be performed efficiently if the steps are performed in the order of 1), 2), 3) or in the order of 2), 3).
  • the screening kit of the present invention comprises a protein of the present invention, a cell containing the protein of the present invention, a membrane fraction of a cell containing the protein of the present invention, or a mammal (eg, human, monkey, mouse, pig, (Rat, mouse, etc.)-Derived endothelial cells and the peptide of the present invention.
  • a mammal eg, human, monkey, mouse, pig, (Rat, mouse, etc.)-Derived endothelial cells and the peptide of the present invention.
  • Examples of the screening kit of the present invention include the following.
  • It may be sterilized by filtration through a filter with a pore size of 0.45 and stored in 4, or may be prepared at use.
  • Protein CHO cells were expressed or mammalian, the present invention (e.g., human, monkey, ⁇ sheet, blanking evening, rats, mice, etc.) derived from endothelial cells, passage at 5 XI 0 5 or a 12-well plate generations and, 37t :, 5% C_ ⁇ 2, which were cultured for 2 days at 95% air.
  • the present invention e.g., human, monkey, ⁇ sheet, blanking evening, rats, mice, etc.
  • Ligand standard solution The peptide of the present invention is dissolved in PBS containing 0.1% ⁇ serum albumin (manufactured by Sigma) so as to be ImM, and stored at ⁇ 20 ° C.
  • the compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is a compound that changes the binding (inhibits or promotes the binding) between the peptide of the present invention and the protein of the present invention.
  • a compound having a cell stimulating activity via the protein of the present invention or a salt thereof (so-called agonist of the protein of the present invention) or a compound having no stimulating activity (so-called agonist of the protein of the present invention) )
  • Such compounds include peptides, proteins, non-peptides Examples thereof include compounds, synthetic compounds, and fermentation products. These compounds may be novel compounds or known compounds.
  • a specific method for evaluating whether the above-mentioned compound is an agonist of the protein of the present invention or an anthrone gonist may be, for example, according to the following (A) or (B).
  • the compound having a cell stimulating activity or a salt thereof is an agonist of the protein of the present invention, and the compound or a salt thereof having no such activity is an agonist of the protein of the present invention.
  • test compound is brought into contact with a cell containing the protein of the present invention, and the cell stimulating activity mediated by the protein of the present invention is measured.
  • the compound having a cell stimulating activity or a salt thereof is an agonist of the protein of the present invention.
  • the agonist of the protein of the present invention has the same activity as the physiological activity of the peptide of the present invention on the protein of the present invention, it is useful as a safe and low-toxic drug like the peptide of the present invention. is there.
  • the protein antagonist of the present invention can suppress the physiological activity of the peptide of the present invention for the protein of the present invention, it is useful as a safe and low-toxic drug for suppressing the receptor activity.
  • protein antagonist of the present invention for example, a compound that changes the binding of the peptide or MIT1s of the present invention to the protein of the present invention, preferably
  • an agonist of the protein of the present invention can be used as a drug such as an angiogenesis agent.
  • angiogonists of the protein of the present invention may be used as angiogenesis inhibitors, for example, diseases associated with angiogenesis [eg, cancer (eg, renal cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, ovary) Cancer, prostate cancer, stomach cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, cystic sarcoma, etc., ovarian disease (eg, polycystic ovary syndrome (ovarian polycystic disease), ovarian hypersting Disease), inflammatory diseases (eg, rheumatoid arthritis, etc.), diabetic retinopathy, etc.) can be used as low-toxicity and safe drugs such as preventive and therapeutic agents.
  • diseases associated with angiogenesis eg, cancer (eg, renal cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, ovary) Cancer, prostate cancer, stomach cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, cystic sarcoma, etc.
  • salts of the above compounds for example, pharmaceutically acceptable salts and the like are used.
  • examples thereof include salts with inorganic bases, salts with organic bases, salts with inorganic acids, salts with organic acids, and salts with basic or acidic amino acids.
  • the salt with an inorganic base include an alkali metal salt such as a sodium salt and a potassium salt, an alkaline earth metal salt such as a calcium salt and a magnesium salt, and an aluminum salt and an ammonium salt.
  • Preferred examples of the salt with an organic base include, for example, trimethylamine, triethylamine, pyridine, picoline, 2,6-lutidine, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, cyclohexylamine, dicyclohexylamine. , N, N,-salts with dibenzylethylenediamine and the like.
  • salts with inorganic acids include salts with hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, phosphoric acid, and the like.
  • Suitable examples of salts with organic acids include, for example, formic acid, acetic acid, propionic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, citric acid, succinic acid, malic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, benzoic acid And the like.
  • salts with basic amino acids include, for example, arginine, lysine, or Salts with tinin and the like can be mentioned, and preferred examples with the acidic amino acid include salts with aspartic acid and dalmic acid.
  • a compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is used as the above-mentioned medicament, it can be carried out according to a conventional method.
  • It can be used parenterally in the form of injections, such as aqueous solutions or suspensions.
  • a physiologically acceptable carrier, flavoring agent, excipient, vehicle, preservative, stabilizer, binder and the like in a generally accepted unit dosage form.
  • the amount of the active ingredient in these preparations is such that a suitable dosage in the specified range can be obtained.
  • additives that can be mixed with tablets, capsules, etc.
  • binders such as gelatin, corn starch, tragacanth gum, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc.
  • a leavening agent such as magnesium stearate, a sweetener such as sucrose, lactose or saccharin, and a flavoring agent such as peppermint, cocoa oil or cherry are used.
  • a liquid carrier such as oils and fats can be further contained in the above-mentioned type of material.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to standard pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending the active substance in a vehicle such as water for injection, or naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil, etc. .
  • aqueous liquids for injection examples include physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.).
  • Agents such as alcohols (eg, ethanol), polyalcohols (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), and nonionic surfactants (eg, polysorbate 80 TM , HCO-50) Good.
  • the oily liquid includes sesame oil, soybean oil and the like, and may be used in combination with a dissolution aid such as benzyl benzoate or benzyl alcohol.
  • buffers eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer
  • soothing agents eg, benzalkonium chloride, proforce hydrochloride, etc.
  • stabilizers eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • preservatives eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, and can be used, for example, in mammals (eg, humans, mice, rats, guinea pigs, egrets, sheep, sheep, bushus, dogs, cats, dogs, monkeys, chimpanzees, etc. ) Can be administered.
  • mammals eg, humans, mice, rats, guinea pigs, egrets, sheep, sheep, bushus, dogs, cats, dogs, monkeys, chimpanzees, etc.
  • the dose of a compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention varies depending on symptoms and the like.
  • oral administration in general, in adults (with a body weight of 60 kg), About 0.1 to 1000 mg, preferably about 1.0 to 300 mg, more preferably about 3.0 to 50 mg per day.
  • parenteral administration the single dose varies depending on the subject, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • adult cancer patients (with a body weight of 60 kg) Is administered at about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day by intravenous injection.
  • the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • the compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention may be used for other drugs such as chemotherapeutic agents (eg, diphosphamide
  • a method for screening an angiogenesis inhibitor using a polynucleotide encoding the peptide of the present invention or a polynucleotide encoding the protein of the present invention (Iv) when a cell having the ability to produce a protein is cultured; Screening for an angiogenesis inhibitor is performed by comparing with a mixture of a test compound and cells capable of producing white matter.
  • the expression level of the gene of the peptide of the present invention or the protein of the present invention (specifically, the amount of the protein or the amount of the mRNA encoding the protein) Measure and compare.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like. Or a known compound.
  • cells having the ability to produce the peptide of the present invention or the protein of the present invention are prepared by suspending them in a buffer suitable for screening.
  • a buffer a phosphate buffer or a borate buffer having a pH of about 4 to 10 (preferably, a pH of about 6 to 8) is used.
  • Examples of the cells capable of producing the peptide of the present invention or the protein of the present invention include, for example, a host (transformant) transformed with a vector containing the above-described DNA of the present invention or the DNA encoding the protein of the present invention. ) Is used.
  • a host for example, animal cells such as CHO cells are preferably used.
  • a transformant expressing the peptide of the present invention or the protein of the present invention by culturing by the above-mentioned method is preferably used.
  • the protein amount of the peptide of the present invention or the protein of the present invention can be measured by a known method, for example, by using an antibody that recognizes the peptide of the present invention or the protein of the present invention, the protein present in a cell extract or the like. Can be measured according to a method such as Western analysis or ELISA method or a method analogous thereto. '
  • the gene expression level of the peptide of the present invention or the protein of the present invention can be determined by a method known per se, for example, a non-san flocking reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), a real-time PCR analysis system (manufactured by ABI,
  • the gene expression level of the protein in the above case (b) is about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more, as compared with the above case (a).
  • a test compound that inhibits can be selected as an angiogenesis inhibitor.
  • the expression level (specifically, the protein mass) of the peptide of the present invention, MIT 1 class or the protein of the present invention is determined using the above-mentioned antibody. Measure and compare.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like. Or a known compound.
  • cells having the ability to produce the peptide of the present invention, MIT1s or the protein of the present invention are prepared by suspending them in a buffer suitable for screening.
  • a buffer suitable for screening.
  • Examples of the cells having the ability to produce the peptide of the present invention, MIT 1s or the protein of the present invention include, for example, vectors containing the DNA of the above-described peptide of the present invention, MIT 1s or the protein of the present invention.
  • the transformed host is used.
  • the host for example, animal cells such as CHO cells are preferably used.
  • a transformant that expresses the peptide, the MIT1s or the protein of the present invention by culturing by the above-described method is preferably used.
  • Compounds can be selected as angiogenesis inhibitors.
  • An angiogenesis inhibitor comprising a compound having an endothelial cell growth inhibitory activity or a salt thereof.
  • any compound or a salt thereof having an endothelial cell growth inhibitory action may be used.
  • the compound or a salt thereof is used as an angiogenesis inhibitor, for example, a disease associated with angiogenesis [eg, a cancer (eg, a hepatic cancer, a lung cancer, a kidney cancer, a liver cancer, a non-small cell lung cancer, an ovarian cancer, a prostate) Cancer, stomach cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, positron sarcoma, etc.), ovarian disease (eg, polycystic ovary syndrome (ovarian polycystic disease), ovarian hyperstimulation, etc.), It is used safely as a drug for prophylactic and therapeutic agents such as inflammatory diseases (eg, rheumatoid arthritis, etc.), diabetic retinopathy, etc.
  • a disease associated with angiogenesis eg, a cancer (eg, a hepatic cancer, a lung cancer, a kidney cancer, a liver cancer, a non-small cell lung cancer, an ovarian
  • the antibody of the present invention can specifically recognize the protein of the present invention, the protein of the present invention or the peptide of the present invention in the test solution (hereinafter referred to as the protein of the present invention in the section (9)). ), Especially for quantification by sandwich immunoassay.
  • An antibody of the present invention and a test wave and a labeled protein of the present invention are competitively reacted, and the ratio of the labeled protein of the present invention bound to the antibody is measured.
  • a method for quantifying the protein of the present invention in a test solution and
  • the activity of the labeling agent on the insolubilized carrier is measured.
  • the present invention provides a method for quantifying the protein of the present invention in a test solution.
  • the protein of the present invention can be quantified using a monoclonal antibody against the protein of the present invention (hereinafter sometimes referred to as the monoclonal antibody of the present invention). Detection by tissue staining or the like can also be performed.
  • the antibody molecule itself may be used, or the F (ab ') 2 , Fa or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the method for quantifying the protein of the present invention using the antibody of the present invention is not particularly limited, and may be an antibody, an antigen or an antibody-antigen corresponding to the amount of the antigen in the test solution (eg, the amount of the peptide of the present invention). Any method that detects the amount of the complex by chemical or physical means and calculates it from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen can be used. Good. For example, nephelometry, competition method, immunometric method and sandwich method are suitably used, but it is particularly preferable to use the sandwich method described later in terms of sensitivity and specificity.
  • a labeling agent used in a measurement method using a labeling substance for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance, a lanthanide element and the like are used.
  • the radioactive isotope elemental for example, [125 1], [131 1], [3 ⁇ 4], [ “C], [32 P], as [33 P], C 35 S) or the like is used.
  • the enzyme The preferred are those which are stable and have a large specific activity, for example,] -galactosidase,) 3-darcosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase, etc.
  • a cyanine fluorescent dye eg, Cy2, Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7 (manufactured by Amersham Biosciences), etc.
  • fluorescamine fluorescein isothiocyanate, etc.
  • the luminescent substance include luminol, luminol derivatives, luciferin, lucigenin, etc.
  • the use of a biotin-avidin system for binding an antibody or an antigen to a labeling agent may be used. It can also be.
  • the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose; synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon; and glass.
  • the test solution is reacted with the insolubilized monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further reacted with another labeled monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction).
  • primary reaction By measuring the activity of the labeling agent on the carrier The amount of the peptide of the present invention in the test solution can be determined.
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at staggered times.
  • the labeling agent and the method of insolubilization can be in accordance with those described above.
  • the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody is not necessarily required to be one type, but a mixture of two or more types of antibodies for the purpose of improving the measurement sensitivity and the like. May be used.
  • the monoclonal antibody of the present invention used for the primary reaction and the secondary reaction is preferably an antibody having a different site to which the peptide of the present invention binds.
  • the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is, for example, when the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal of the peptide of the present invention, the antibody used in the primary reaction is preferably An antibody that recognizes other than the C-terminal, for example, the N-terminal, is used.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method, or a nephelometry.
  • a competition method the antigen in the test solution and the labeled antigen are allowed to react competitively with the antibody, and then the unreacted labeled antigen (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody are separated.
  • BZF separation Measure the amount of labeling of either B or F, and quantify the amount of antigen in the test wave.
  • a soluble antibody is used as the antibody
  • BZF separation is performed using polyethylene glycol
  • a liquid phase method using a second antibody against the antibody a solid phase antibody is used as the first antibody
  • An immobilization method using a soluble first antibody and an immobilized antibody as the second antibody is used.
  • an antigen in a test solution and a solid-phased antigen are subjected to a competitive reaction with a certain amount of a labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated.
  • the antigen is allowed to react with an excess amount of the labeled antibody, and then the immobilized antigen is added to bind the unreacted labeled antibody to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated.
  • the amount of label in either phase is measured to determine the amount of antigen in the test wave.
  • nephelometry the amount of insoluble sediment resulting from an antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured.
  • the protein measurement system of the present invention may be constructed by adding ordinary technical considerations of those skilled in the art to ordinary conditions and procedures in each method. For details of these general technical means, reference can be made to reviews and publications.
  • the protein of the present invention can be quantified with good sensitivity by using the antibody of the present invention.
  • the expression level of the protein of the present invention is high in capillary endothelial cells such as ovary and testis.
  • diseases associated with the proliferation of capillary endothelial cells in these organs such as cancer (eg, hepatic cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, ovarian cancer) , Prostate cancer, stomach cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, positron sarcoma, etc., ovarian disease (eg, polycystic ovary syndrome (ovarian polycystic disease), ovarian hyperstimulation Etc.), inflammatory diseases (eg, rheumatoid arthritis, etc.), diabetic retinopathy, etc., or can be diagnosed as likely to suffer in the future.
  • cancer eg, hepatic cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, ovarian cancer
  • Prostate cancer stomach cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon
  • the antibody of the present invention binds to the protein of the present invention present in a subject such as a body fluid or a tissue. Can be used to detect. Also, for preparing an antibody column used for purifying the protein of the present invention, detecting the protein of the present invention in each fraction at the time of purification, analyzing the behavior of the protein of the present invention in a test cell, and the like. Can be used for (10) Gene diagnostics
  • the DNA of the present invention can be used, for example, in humans or warm-blooded animals (for example, rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, higgies, bushes, dogs, cats, dogs, It is possible to detect abnormalities (genetic abnormalities) in the DNA or mRNA encoding the protein of the present invention or the peptide of the present invention (hereinafter, abbreviated as the protein of the present invention in section (10)) in monkeys and the like. For example, it is useful as a diagnostic agent for a gene such as damage, mutation, or decreased expression of the DNA or mRNA, and increased or excessive expression of the DNA or mRNA.
  • the above-described genetic diagnosis using the DNA of the present invention includes, for example, the known Northern Hybridization and PCR_SSCP methods (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879, 1989), Proceedings of the National Academy of Sciences of the
  • a DNA mutation is detected by, for example, a disease involving proliferation of capillary endothelial cells, for example, cancer (eg, kidney cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, ovarian cancer) , Prostate cancer, stomach cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, positron sarcoma, etc., ovarian disease (eg, polycystic ovary syndrome (ovarian polycystic disease), ovarian hyperstimulation Etc.), inflammatory diseases (eg, rheumatoid arthritis, etc.), diabetic retinopathy, etc. can be diagnosed as having a high possibility.
  • cancer eg, kidney cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, ovarian cancer
  • Prostate cancer stomach cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, positron sarcoma, etc.
  • ovarian disease eg, polycystic
  • Antisense DNA can suppress the function of the protein of the present invention or the peptide of the present invention (hereinafter abbreviated as the protein of the present invention in section (11)) or the DNA of the present invention in vivo.
  • diseases caused by excessive expression of the protein of the present invention such as cancers (eg, cancer of the lung, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, prostate cancer, gastric cancer, bladder cancer, breast cancer, Cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, positron sarcoma, etc.), ovarian disease (eg, polycystic ovary syndrome (ovarian polycystic disease), ovarian hyperstimulation, etc.), inflammatory disease (eg, joints) Rheumatism and prevention of diabetic retinopathy-can be used as a therapeutic agent.
  • cancers eg, cancer of the lung, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, prostate cancer, gastric cancer, bladder cancer, breast cancer, Cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, positron sarcoma, etc.
  • ovarian disease eg, polycystic ovary syndrome (ovarian polycystic disease), ova
  • the above-mentioned antisense DNA can be used as the above-mentioned preventive / therapeutic agent in the same manner as the above-mentioned preventive / therapeutic agent for various diseases containing the DNA of the present invention.
  • the antisense DNA can be administered alone or after insertion into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, or the like, and then administered in a conventional manner.
  • the antisense DNA can be administered as it is or in the form of a formulation together with a physiologically acceptable carrier such as an adjuvant for promoting uptake, and administered with a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
  • the antisense DNA can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence or expression of the DNA of the present invention in tissues or cells.
  • a drug comprising the lipozyme is also provided.
  • RNAi double-stranded RNA
  • lipozyme etc.
  • a polynucleotide eg, DNA
  • the function of the protein or DNA of the present invention and the function of the peptide of the present invention depending on the function can be suppressed, for example, cancer (eg, hepatic cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, Cell lung cancer, ovarian cancer, prostate cancer, stomach cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, positiosarcoma, etc.), ovarian disease (eg, polycystic ovary syndrome (ovarian polycystic disease), Ovarian hyperstimulation, etc.), inflammatory diseases (eg, rheumatoid arthritis, etc.), diabetic retinopathy and other prophylactic and therapeutic agents can be used.
  • cancer eg, hepatic cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, Cell lung cancer, ovarian cancer, prostate cancer, stomach cancer, bladder cancer, breast cancer
  • the double-stranded RNA can be designed and produced based on the sequence of the polynucleotide of the present invention according to a known method (eg, Nature, 411, 494, 2001).
  • the lipozyme is designed and manufactured based on the sequence of the polynucleotide of the present invention according to a known method (eg, TRENDS in Molecular Medicine, Vol. 7, p. 221, 2001). Can be. For example, it can be produced by linking a known liposome to a part of RNA encoding the protein of the present invention.
  • a part of the RNA encoding the protein of the present invention includes a portion (RNA fragment) adjacent to the cleavage site on the RNA of the present invention, which can be cleaved by a known ribozyme.
  • RNA or lipozyme When the above double-stranded RNA or lipozyme is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated and administered in the same manner as the antisense polynucleotide.
  • the antibody of the present invention which has the activity of neutralizing the activity of the protein of the present invention or the peptide of the present invention (hereinafter, abbreviated as the protein of the present invention in the section (12)), is, for example, an expression of the protein of the present invention.
  • Excessive diseases such as cancer (eg, kidney cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, prostate cancer, gastric cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, Ovarian disease (eg, polycystic ovary syndrome (ovarian polycystic disease), ovarian hyperstimulation, etc.), inflammatory disease (eg, rheumatoid arthritis, etc.), diabetic retinopathy, etc.
  • cancer eg, kidney cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, prostate cancer, gastric cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer
  • Ovarian disease eg, polycy
  • It can be used as a medicament such as a prophylactic or therapeutic agent, or as a diagnostic agent for diseases associated with proliferation of endothelial cells expressing the protein of the present invention, for example, polycystic ovary syndrome, ovarian hyperirritation syndrome, and the like.
  • the agent for preventing or treating the above-mentioned diseases containing the antibody of the present invention can be used as it is as a liquid or as a pharmaceutical composition in an appropriate dosage form, in humans or mammals (eg, rat, porch egret, sheep, bush, Can be administered orally or parenterally to rats, cats, dogs, monkeys, etc.).
  • the dose depends on the target of administration, target disease, symptoms, administration route, etc.
  • the antibody of the present invention may be used in a single dose, usually about 0.01 to 20 mg / kg body weight, preferably about 0.1 to 10 mg / kg body weight, and more preferably about 0.1 to 10 mg / kg body weight.
  • the antibodies of the present invention can be administered by themselves or as a suitable pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition used for the above administration contains the above or a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient.
  • Such compositions are provided in dosage forms suitable for oral or parenteral administration.
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (soft capsules) ), Syrups, emulsions, suspensions and the like.
  • Such a composition is produced by a method known per se and contains a carrier, diluent or excipient commonly used in the field of pharmaceuticals.
  • a carrier for example, lactose, starch, sucrose, magnesium stearate and the like are used as carriers and excipients for tablets.
  • compositions for parenteral administration include injections, suppositories, etc.
  • injections include intravenous, subcutaneous, intradermal, intramuscular, and intravenous injections.
  • Shape Such injections are prepared according to a method known per se, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the antibody or a salt thereof in a sterile aqueous or oily liquid commonly used for injections.
  • aqueous solution for injection ⁇ , for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants is used, and a suitable solubilizing agent, for example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, , Propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants (eg, polysorbate 80, HC 0-50 (polyoxythylene (50 mol) adduc tof hydrogenated cas tor oil)) and the like.
  • alcohol eg, ethanol
  • polyalcohol eg, Propylene glycol, polyethylene glycol
  • nonionic surfactants eg, polysorbate 80, HC 0-50 (polyoxythylene (50 mol) adduc tof hydrogenated cas tor oil)
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil, and the like are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol, and the like may be used as a solubilizing
  • each dosage unit dosage form is about 5 to 500 mg, especially for injections. It is preferable that about 5 to 100 mg, and about 10 to 250 mg, of the above-mentioned antibody is contained in other dosage forms.
  • Each of the above-mentioned compositions may contain another active ingredient as long as the composition does not cause an undesirable interaction with the above-mentioned antibody.
  • each of the aforementioned angiogenesis inhibitors is, for example, a chemotherapeutic agent (eg, ifosfamide, adriamycin, puromycin)
  • a chemotherapeutic agent eg, ifosfamide, adriamycin, puromycin
  • a transgenic non-human animal expressing the protein of the present invention or the peptide of the present invention can be prepared.
  • Non-human animals include mammals (for example, rats, mice, egrets, sheep, pigeons, pigs, cats, dogs, monkeys, etc.), and the like (hereinafter abbreviated as animals). Egrets and the like are preferred.
  • the DNA of the present invention In transferring the DNA of the present invention to a target animal, it is generally advantageous to use the DNA as a gene construct linked downstream of a promoter capable of being expressed in animal cells.
  • a gene construct linked to the downstream of various promoters capable of expressing the DNA of the present invention derived from an animal having high homology to animal cells in an animal cell For example, a DNA transgenic animal that highly produces the protein of the present invention or the peptide of the present invention can be produced by microinjection into a fertilized egg of a egret.
  • this promoter examples include: For example, a ubiquitous expression promoter such as a virus-derived promoter or meta-mouth thionein may be used, but an NGF gene promoter or an enolase gene promoter that is specifically expressed in the brain is preferably used.
  • a ubiquitous expression promoter such as a virus-derived promoter or meta-mouth thionein may be used, but an NGF gene promoter or an enolase gene promoter that is specifically expressed in the brain is preferably used.
  • Transfer of the DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target animal.
  • the presence of the protein or the like of the present invention in the germinal cells of the animal produced after the DNA transfer means that all the offspring of the animal produced have the protein of the present invention or the peptide of the present invention in all of the germ cells and somatic cells. Means.
  • the progeny of this type of animal that has inherited the gene has the protein of the present invention or the peptide of the present invention in all of its germinal and somatic cells.
  • the DNA-transferred animal of the present invention After confirming that the DNA-transferred animal of the present invention stably retains the gene by mating, it can be reared and passaged in a normal rearing environment as the DNA-bearing animal. Furthermore, by crossing male and female animals having the target DNA, homozygous animals having the transgene on both homologous chromosomes are obtained, and by crossing the male and female animals, all the offspring will have the DNA Breeding to have Since the protein of the present invention or the peptide of the present invention is highly expressed in the animal to which the DNA of the present invention has been transferred, an agonist or an antagonist of the protein of the present invention, or a compound that inhibits the activity of the peptide of the present invention. It is useful as an animal for screening.
  • the DNA-transferred animal of the present invention can also be used as a cell source for tissue culture.
  • tissue culture For example, by directly analyzing DNA or RNA in the tissue of the DNA transgenic mouse of the present invention or by analyzing the tissue in which the protein of the present invention expressed by the gene or the peptide of the present invention is present, the present invention can be carried out. Can be analyzed. Cells of a tissue having the protein of the present invention or the peptide of the present invention are cultured by standard tissue culture techniques, and the functions of cells from tissues that are generally difficult to culture, such as those derived from brain and peripheral tissues, are used. Can study. In addition, by using the cells, for example, a drug that enhances the function of various tissues can be selected.
  • the protein of the present invention or the peptide of the present invention can be isolated and purified therefrom.
  • bases, amino acids, and the like are indicated by abbreviations based on the abbreviations by the IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature or commonly used abbreviations in the art, and examples thereof are described below.
  • optical isomer with respect to the amino acid the L-form is indicated unless otherwise specified.
  • DNA Deoxylipo nucleic acid
  • RNA ribonucleic acid
  • Trp or W Tribute fan
  • Xaa an unidentified amino acid residue 0 a substituent frequently used in the present specification
  • 1 shows the amino acid sequence of human brain-derived protein ZAQ.
  • 1 shows the nucleotide sequence of DNA encoding human I5E receptor protein.
  • FIG. 5 shows the 5′-end nucleotide sequence of DNA encoding the human BV8 peptide obtained in Reference Example 3 described later.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of a human BV8 precursor peptide.
  • 1 shows the nucleotide sequence of DNA encoding human Bv8 mature peptide.
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of DNA encoding rat BV8 precursor peptide.
  • FIG. 3 shows the amino acid sequences of a rat BV8 mature peptide and a mouse BV8 mature peptide.
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of DNA encoding a rat type BV8 mature peptide.
  • the nucleotide sequence of the cDNA encoding the novel G protein-coupled receptor protein (rZAQl) is shown.
  • FIG. 13 shows the nucleotide sequence of a primer used in Reference Example 7 described later.
  • FIG. 13 shows the nucleotide sequence of a primer used in Reference Example 7 described later.
  • FIG. 13 shows the nucleotide sequence of a primer used in Reference Example 7 described later.
  • the nucleotide sequence of the cDNA encoding the novel G protein-coupled receptor protein (rZAQ2) is shown.
  • GPR73 mouse-derived G protein-coupled receptor protein
  • FIG 2 shows the amino acid sequence of mouse-derived G protein-coupled receptor Yuichi protein (ml 5E).
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of a mouse Bv8 precursor peptide.
  • the nucleotide sequence of DN ⁇ encoding a mouse type V8 mature peptide is shown.
  • GPR73 mouse-derived G protein-coupled receptor protein
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence encoding mouse-derived G protein-coupled receptor protein (ml5E).
  • FIG 13 shows the nucleotide sequence of DNA fragment # 2 used in Reference Example 8.
  • the nucleotide sequence of a synthetic DNA encoding human Bv8 represented by SEQ ID NO: 30 is shown.
  • N-terminal amino acid of ZAQ activating peptide purified in Reference Example 9 (8) below Shows the sequence.
  • FIG. 3 shows the 3 ′ terminal nucleotide sequence of DNA encoding the human ZAQ ligand peptide obtained in Reference Example 9 (II) described later.
  • SEQ ID NO: 85 This shows the nucleotide sequence of DNA containing DNA encoding the human ZAQ ligand precursor peptide represented by SEQ ID NO: 89.
  • the nucleotide sequence of DNA coding for the human ZAQ ligand precursor peptide represented by SEQ ID NO: 84 is shown.
  • [SEQ ID NO: 96] 2 shows the nucleotide sequence of DNA fragment # 2 used in Reference Example 1.
  • the base sequence of a synthetic DNA encoding the human ZAQ ligand represented by SEQ ID NO: 82 is shown.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of a mouse ZAQ ligand precursor peptide.
  • FIG. 13 shows the nucleotide sequence of a DNA fragment obtained in Reference Example 16 described later (Y type).
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of a rat ZAQ ligand precursor peptide (normal type).
  • the nucleotide sequence of the DNA encoding the rat type ZAQ ligand precursor peptide (normal type) is shown.
  • [SEQ ID NO: 136] 2 shows the amino acid sequence of rat type ZAQ ligand precursor peptide (Q type). [SEQ ID NO: 137]
  • the nucleotide sequence of DNA encoding the rat type ZAQ ligand precursor peptide (Q type) is shown.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of a rat type ZAQ ligand mature peptide (normal type).
  • the nucleotide sequence of the DNA encoding the rat ZAQ ligand mature peptide (normal type) is shown.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 1 described later.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 1 described later.
  • Example 1 shows a base sequence of a partial sequence of a p-type ZAQ obtained in Example 1 described later.
  • Example 1 shows a base sequence of a partial sequence of a pouch type I 5 E obtained in Example 1 described later.
  • [SEQ ID NO: 148] 1 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 1 described later.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 1 described later.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of the 5 ′ partial sequence (type 1) of the oxytype ZAQ obtained in Example 1 described later.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of the 5 ′ partial sequence (typ 2) of the pesticidal ZAQ obtained in Example 1 described later.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 1 described later.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 1 described later.
  • FIG. 3 shows the nucleotide sequence of the 3 ′ partial sequence (type 2) of the oxytype ZAQ obtained in Example 1 described later.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 1 described later.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 1 described later.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 1 described later.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 1 described later.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of a 2038 bp DNA fragment encoding the entire length of a zebra-type ZAQ obtained in Example 1 described later.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 1 described later.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 1 described later.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 1 described later.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 1 described later.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 1 described later.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 1 described later.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

明 細 書 血管新生阻害剤 技術分野
本発明は、 （ 1 ) (i) 配列番号： 21、 配列番号： 81、 配列番号： 82、 配列番号： 109、 配列番号： 138、 配列番号： 19もしくは配列番号： 39 で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する ペプチドまたはその塩、 および （ii) ォーファンレセプ夕一蛋白質である配列番 号： 1、 配列番号： 44、 配列番号： 51、 配列番号： 52、 配列番号： 53、 配列番号： 54、 配列番号： 171もしくは配列番号： 173で表わされるアミ ノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその 塩とを用いる血管新生阻害剤として有用な化合物またはその塩などのスクリー二 ング方法 Zキッ卜、 （2) 配列番号： 1、 配列番号： 44、 配列番号： 51、 配 列番号： 52、 配列番号： 53、 配列番号： 54、 配列番号： 171もしくは配 列番号： 173で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸 配列を含有する蛋白質またはその塩の活性を阻害する血管新生阻害剤、 （3) 配 列番号： 171もしくは配列番号： 173で表わされるアミノ酸配列と同一また は実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩、 その製造法およ び用途などに関する。 背景技術
各種の分泌蛋白質を集めたライブラリーからゥシ副腎毛細血管内皮細胞に対す る新たな増殖因子が見出された （Nature、 412巻、 877- 884頁、 2001年）。 上記物 質は、 既知の血管内皮細胞増殖因子 VEGFとは異なり、 内分泌性組織由来の内皮細 胞に特異的な増殖因子であり、 この性質から EG-VEGFと名づけられた。 EG-VEGFは 生理的には内分泌組織を特徴づける透過性の高い内皮構造 （fenestrate) の形成 に関与することが示唆されている。 また、 その遺伝子の転写制御領域には低酸素 下での発現誘導に関わる hypoxia-inducible factor- 1 (HIF-1) の認識部位が存 1057
2
■ 在し、 実際に副腎由来の癌細胞では、 低酸素下での EG-VEGF遺伝子発現誘導が確 認された。 さらに、 ヒト多嚢胞性卵巣症候群 （polycys t i c ovary syndrome) で は EG- VEGFの強発現が認められたとの記載がなされている。
一方、 EG- VEGF (ZAQリガンドペプチドとも記載する） はォーファン受容体であ る ZAQに結合し、 ZAQを活性化する （W0 01/16309号公報）。 回腸収縮活性を有する ZAQリガンドペプチド （W0 02/6483号公報） はへビから単離された MIT1 (FEBS Let ters 461巻、 183-188頁、 1999年) に配列上の類似性が高く、 その哺乳類型べ プチドであり、 ヒト型 ZAQリガンドペプチドのみならず、 へビ毒 MIT1およびその ヒト型ホモログペプチドも ZAQに結合し、 これを活性化する。
現在、 VEGF受容体の作用を抑制する化合物が、 その血管新生阻害作用に基づい て抗癌剤として開発されつつあるものの、 EG- VEGFが発見されて以来、 VEGF作用 の遮断のみでは、 十分な血管新生阻害効果が現れない症例もあり得ると考えられ るようになってきている。 また、 今後の医学研究の進展によっては、 VEGFよりは , むしろ EG- VEGFが病態の増悪因子として作用している症例が見出される可能性が あり、 そのような場合には EG- VEGF阻害剤が単体として使用されることも期待さ れる。 これまでの研究では、 EG- VEGFが内皮細胞の増殖を引き起こす過程におい ても ZAQなどの受容体が関与しているのかどうか、 または、 全く異なる受容体が 関与しているのか、 といった点について全く明らかにされていなかった。 しかし ながら、 EG-VEGF拮抗薬の開発には、 拮抗薬探索法の簡便化および作用メカニズ ムの記述などの点から、 その受容体について明らかにすることが必須である。 ま た、 安全で、 優れた癌の血管新生阻害剤も望まれている。 発明の開示
本発明者らは、 ゥシ副腎毛細血管内皮細胞 （BACE) を用いて研究を行い、 BACE には、 ZAQおよびその類縁受容体である I 5Eが発現されていることを見出した。 さ らに、 BACEがヒ卜型 ZAQリガンドペプチド、 へビ毒 MIT1およびそのヒト型ホモ口 グ （ヒト Bv8ペプチド） に応答して細胞内カルシウムイオンの上昇、 MAPキナーゼ の活性化、 チミジン取り込み量の増大、 細胞増殖能の増大を起こすことも見出し た。 これらの検討結果より、 ヒト型 ZAQリガンドペプチドの内皮細胞増殖因子活 性は、 ZAQおよび （または） I5Eを介して引き起こされるものと結論した。 このよ うな知見に基づいて、 本発明者らは、 ZAQまたは I5Eの作用を遮断する化合物が EG-VEGFまたは Bv8ぺプチドの阻害剤となり、 かつ EG- VEGFまたは Bv8ぺプチドの阻 害剤の簡便な探索法を提供することを見出し、 鋭意研究を重ねた結果、 本発明を 完成するに至った。
すなわち、 本発明は、
( 1 ) 配列番号： 81、 配列番号： 82、 配列番号： 109、 配列番号： 13 8、 配列番号： 19もしくは配列番号： 39で表わされるアミノ酸配列と同一ま たは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩の活性を阻害 する化合物またはその塩を含有してなる血管新生阻害剤、
(l a) 配列番号： 81、 配列番号： 82、 配列番号： 109もしくは配列番 号： 138で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列 を含有するペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有し てなる血管新生阻害剤、
(l b) 配列番号： 19もしくは配列番号： 39で表わされるアミノ酸配列と 同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩の活性 を阻害する化合物またはその塩を含有してなる血管新生阻害剤、
( 2 ) 配列番号： 1、 配列番号： 44、 配列番号： 51、 配列番号： 52、 酉己 列番号： 53、 配列番号： 54、 配列番号： 171もしくは配列番号： 173で 表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋 白質またはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる血管新生 阻害剤、
(3) (a) 配列番号： 21、 配列番号： 81、 配列番号： 82、 配列番号： 109、 配列番号： 138、 配列番号： 19もしくは配列番号： 39で表わされ るアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドま たはその塩と （b) 配列番号： 1、 配列番号： 44、 配列番号： 51、 配列番 号： 52、 配列番号： 53、 配列番号： 54、 配列番号： 171もしくは配列番 号： 173で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列 を含有する蛋白質またはその塩との結合を阻害する化合物またはその塩を含有し てなる血管新生阻害剤、
(3 a) (a) 配列番号： 21で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的 に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩と （b) 配列番号： 1、 配列番号： 44、 配列番号： 51、 配列番号： 52、 配列番号： 53、 配列番 号： 54、 配列番号： 171もしくは配列番号： 173で表わされるアミノ酸配 列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との 結合を阻害する化合物またはその塩を含有してなる血管新生阻害剤、
(3 b) (a) 配列番号： 81、 配列番号： 82、 配列番号： 109もしくは 配列番号： 138で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ 酸配列を含有するペプチドまたはその塩と （b) 配列番号： 1、 配列番号： 44 配列番号： 51、 配列番号： 52、 配列番号： 53、 配列番号： 54、 配列番 号： 171もしくは配列番号： 173で表わされるアミノ酸配列と同一または実 質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合を阻害する化 合物またはその塩を含有してなる血管新生阻害剤、
(3 c) (a) 配列番号： 19もしくは配列番号： 39で表わされるアミノ酸 配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩 と （b) 配列番号： 1、 配列番号： 44、 配列番号： 51、 配列番号： 52、 配 列番号： 53、 配列番号： 54、 配列番号： 171もしくは配列番号： 173で 表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋 白質またはその塩との結合を阻害する化合物またはその塩を含有してなる血管新 生阻害剤、
(4) 配列番号： 2 1、 配列番号： 81、 配列番号： 82、 配列番号： 109 配列番号： 138、 配列番号： 19もしくは配列番号： 39で表わされるァミノ 酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその 塩の、 配列番号： 1、 配列番号： 44、 配列番号： 51、 配列番号： 52、 配列 番号： 53、 配列番号： 54、 配列番号： 171もしくは配列番号： 173で表 わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白 質またはその塩の活性化作用を阻害する化合物またはその塩を含有してなる血管 新生阻害剤、 (4 a) 配列番号： 2 1で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩の、 配列番号： 1、 配列番号： 44、 配列番号： 5 1、 配列番号： 52、 配列番号： 53、 配列番号： 54、 配 列番号： 1 Ί 1もしくは配列番号： 173で表わされるアミノ酸配列と同一また は実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩の活性化作用を阻 害する化合物またはその塩を含有してなる血管新生阻害剤、
(4b) 配列番号： 8 1、 配列番号： 82、 配列番号： 109もしくは配列番 号： 1 38で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列 を含有するペプチドまたはその塩の、 配列番号： 1、 配列番号： 44、 配列番 号： 5 1、 配列番号： 52、 配列番号： 53、 配列番号： 54、 配列番号： 17 1もしくは配列番号： 1 73で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同 一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩の活性化作用を阻害する化合物 またはその塩を含有してなる血管新生阻害剤、
(4 c) 配列番号： 1 9もしくは配列番号： 39で表わされるアミノ酸配列と 同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩の、 配 列番号： 1、 配列番号： 44、 配列番号： 5 1、 配列番号： 52、 配列番号： 5 3、 配列番号： 54、 配列番号： 1 Ί 1もしくは配列番号： 1 Ί 3で表わされる アミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質または その塩の活性化作用を阻害する化合物またはその塩を含有してなる血管新生阻害 剤、
( 5 ) 配列番号： 8 1、 配列番号： 82、 配列番号： 109、 配列番号： 1 3 8、 配列番号： 1 9もしくは配列番号： 39で表わされるァミノ.酸配列と同一ま たは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその部分ペプチドを コードする DNAの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列または その一部を含有するアンチセンスヌクレオチドを含有してなる血管新生阻害剤、
( 6 ) 配列番号： 8 1、 配列番号： 82、 配列番号： 109、 配列番号： 13 8、 配列番号： 1 9もしくは配列番号： 39で表わされるアミノ酸配列と同一ま たは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその部分ペプチドま たはその塩に対する抗体を含有してなる血管新生阻害剤、 ( 7 ) 配列番号： 1、 配列番号： 44、 配列番号： 51、 配列番号： 52、 配 列番号： 53、 配列番号： 54、 配列番号： 171もしくは配列番号： 173で 表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋 白質またはその部分ペプチドをコードする D N Aの塩基配列に相補的もしくは実 質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスヌクレオチドを 含有してなる血管新生阻害剤、
( 8 ) 配列番号： 1、 配列番号： 44、 配列番号： 51、 配列番号： 52、 配 列番号： 53、 配列番号： 54、 配列番夸： 171もしくは配列番号： 173で 表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋 白質またはその部分べプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる血管新生 阻害剤、
(9) 癌、 多嚢胞性卵巣症候群または卵巣過剰刺激症候群の予防 ·治療剤であ る上記 （1) 〜 （8) 記載のいずれかの血管新生阻害剤、
(9 a) 癌が、 内分泌組織の癌である上記 （9) 記載の血管新生阻害剤、 (9 b) 多嚢胞性卵巣症候群の予防，治療剤である上記 （1) 〜 （8) 記載の いずれかの血管新生阻害剤、
(10) (a) 配列番号： 81、 配列番号： 82、 配列番号： 109、 配列番 号： 138、 配列番号： 19もしくは配列番号： 39で表わされるアミノ酸配列 と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩をコ —ドするポリヌクレオチド、 または （b) 配列番号： 1、 配列番号： 44、 配列 番号： 51、 配列番号： 52、 配列番号： 53、 配列番号： 54、 配列番号： 1 71もしくは配列番号： 173で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に 同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩をコードするポリヌクレオチ ドを含有してなる癌、 多嚢胞性卵巣症候群または卵巣過剰刺激症候群の診断薬、 (1 1) 内皮細胞を用いることを特徴とする、 配列番号： 1、 配列番号： 44、 配列番号： 51、 配列番号： 52、 配列番号： 53、 配列番号： 54、 配列番 号： 171もしくは配列番号： 173で表わされるアミノ酸配列と同一または実 質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩の活性を阻害する化合 物またはその塩のスクリーニング方法、 P T/画 01057
7
(12) 上記 （1 1) 記載のスクリーニング方法で得られる化合物またはその 塩を含有してなる血管新生阻害剤、
(1 3) (a) 配列番号： 21、 配列番号： 81、 配列番号： 82、 配列番 号： 109、 配列番号： 138、 配列番号： 19もしくは配列番号： 39で表わ されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するべプチ ドまたはその塩、 および （または） （b) 配列番号： 1、 配列番号： 44、 配列 番号： 51、 配列番号： 52、 配列番号： 53、 配列番号： 54、 配列番号： 1 71もしくは配列番号： 173で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に 同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩を用いることを特徴とする血 管新生阻害剤のスクリーニング方法、
(13 a) (a) 配列番号： 21で表わされるアミノ酸配列と同一または実質 的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩、 および （または）
(b) 配列番号： 1、 配列番号： 44、 配列番号： 51、 配列番号： 52、 配列 番号： 53、 配列番号： 54、 配列番号： 171もしくは配列番号： 173で表 わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白 質またはその塩を用いることを特徴とする血管新生阻害剤のスクリーニング方法、
(13 b) (a) 配列番号： 81、 配列番号： 82、 配列番号：.109もしく は配列番号： 138で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩、 および （または） （b) 配列番号： 1、 配列番号： 44、 配列番号： 5 1、 配列番号： 52、 配列番号： 53、 配列 番号： 54、 配列番号： 171もしくは配列番号： 173で表わされるアミノ酸 配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩を 用いることを特徴とする血管新生阻害剤のスクリーニング方法、
(13 c) (a) 配列番号： 19もしくは配列番号： 39で表わされるァミノ 酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその 塩、 および （または） （b) 配列番号： 1、 配列番号： 44、 配列番号： 51、 配列番号： 52、 配列番号： 53、 配列番号： 54、 配列番号： 171もしくは 配列番号： 173で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ 酸配列を含有する蛋白質またはその塩を用いることを特徴とする血管新生阻害剤 のスクリーニング方法、
(14) (a) 配列番号： 21、 配列番号： 81、 配列番号： 82、 配列番 号： 109、 配列番号： 138、 配列番号： 19もしくは配列番号： 39で表わ されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するべプチ ドまたはその塩、 および （または） （b) 配列番号： 1、 配列番号： 44、 配列 番号： 51、 配列番号： 52、 配列番号： 53、 配列番号： 54、 配列番号： 1 71もしくは配列番号： 173で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に 同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩を含有することを特徴とする 血管新生阻害剤のスクリーニング用キット、
(15) (a) 配列番号： 81、 配列番号： 82、 配列番号： 109、 配列番 号： 138、 配列番号： 19もしくは配列番号： 39で表わされるアミノ酸配列 と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩をコ —ドするポリヌクレオチド、 および （または） （b) 配列番号： 1、 配列番号： 44、 配列番号： 51、 配列番号： 52、 配列番号： 53、 配列番号： 54、 配 列番号： 171もしくは配列番号： 173で表わされるアミノ酸配列と同一また は実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩をコードするポリ ヌクレオチドを用いることを特徴とする血管新生阻害剤のスクリ一ニング方法、 (15 a) (a) 配列番号： 81、 配列番号： 82、 配列番号： 109もしく は配列番号： 138で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチド、 およ び （または） （b) 配列番号： 1、 配列番号： 44、 配列番号： 51、 配列番 号： 52、 配列番号： 53、 配列番号： 54、 配列番号： 171もしくは配列番 号： 173で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列 を含有する蛋白質またはその塩をコードするポリヌクレオチドを用いることを特 徵とする血管新生阻害剤のスクリーニング方法、
(1 5 b) (a) 配列番号： 19もしくは配列番号： 39で表わされるァミノ 酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するべプチドまたはその 塩をコードするポリヌクレオチド、 および （または） （b) 配列番号： 1、 配列 番号： 44、 配列番号： 51、 配列番号： 52、 配列番号： 53、 配列番号： 5 4、 配列番号： 171もしくは配列番号： 173で表わされるアミノ酸配列と同 一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩をコードす るポリヌクレオチドを用いることを特徴とする血管新生阻害剤のスクリーニング 方法、
(16) (a) 配列番号： 21、 配列番号： 81、 配列番号： 82、 配列番 号： 109、 配列番号： 138、 配列番号： 19もしくは配列番号： 39で表わ されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するべプチ ドまたはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、 および （または） （b) 配列番号： 1、 配列番号： 44、 配列番号： 51、 配列番号： 52、 配列番号： 53、 配列番号： 54、 配列番号： 17 1もしくは配列番号： 173で表わされ るアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質また はその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を用いることを特徴とする血管新 生阻害剤のスクリーニング方法、
(17) 上記 （13) 、 （15) もしくは （16) 記載のスクリーニング方法 または上記 （14) 記載のスクリーニング用キットを用いて得られる血管新生阻 害剤、
(18) 内皮細胞増殖阻害作用を有する化合物またはその塩を含有してなる血 管新生阻害剤、
(19) 配列番号： 171もしくは配列番号： 137で表わされるアミノ酸配 列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とする蛋白質 またはその塩、
(20) 配列番号： 171で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質またはそ の塩、
(21) 配列番号： 137で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質またはそ の塩、
(22) 上記 （19) 記載の蛋白質の部分ペプチドまたはその塩、
(23) 上記 （19) 記載の蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有する ポリヌクレオチド、
(24) DNAである上記 （23) 記載のポリヌクレオチド、 (25) 配列番号： 172または配列番号： 174で表される塩基配列からな るポリヌクレオチド、
(26) 上記 （24) 記載のポリヌクレオチドを含有する組換えべクタ一、 (27) 上記 （26) 記載の組換えべクタ一で形質転換された形質転換体、 (28) 上記 （27) 記載の形質転換体を培養し、 上記 （19) 記載の蛋白質 を生成 ·蓄積せしめることを特徴とする上記 （19) 記載の蛋白質またはその塩 の製造法、
(29) 上記 （19) 記載の蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に 対する抗体、
(30) 上記 （29) 記載の抗体を含有してなる医薬、
(31) 上記 （29) 記載の抗体を含有してなる診断薬、
(32) 上記 （19) 記載の蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を 用いることを特徴とする、 上記 （19) 記載の蛋白質またはその塩の活性を促進 または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(33) 上記 （19) 記載の蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を 含有することを特徴とする、 上記 （19) 記載の蛋白質またはその塩の活性を促 進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
(34) 上記 （32) 記載のスクリーニング方法または上記 （33) 記載のス クリーニング用キットを用いて得られる、 上記 （19) 記載の蛋白質またはその 塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩、
(35) 上記 （34) 記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
(36) 哺乳動物に対して、 配列番号： 1、 配列番号： 44、 配列番号： 51 配列番号： 52、 配列番号： 53、 配列番号： 54、 配列番号： 171もしくは 配列番号： 173で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ 酸配列を含有する蛋白質またはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の有 n効量を投与することを特徴とする血管新生阻害方法、
(37) 血管新生阻害剤を製造するための、 配列番号： 1、 配列番号： 44、 配列番号： 51、 配列番号： 52、 配列番号： 53、 配列番号： 54、 配列番 号： 171もしくは配列番号： 173で表わされるアミノ酸配列と同一または実 質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩の活性を阻害する化合 物またはその塩の使用、
(38) 哺乳動物に対して、 配列番号： 1、 配列番号： 44、 配列番号： 51 配列番号： 52、 配列番号： 53、 配列番号： 54、 配列番号： 171もしくは 配列番号： 173で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ 酸配列を含有する蛋白質またはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の有 効量を投与することを特徴とする癌、 多嚢胞性卵巣症候群または卵巣過剰刺激症 候群の予防 ·治療方法、
(39) 癌、 多嚢胞性卵巣症候群または卵巣過剰刺激症候群の予防 ·治療剤を 製造するための、 配列番号： 1、 配列番号： 44、 配列番号： 51、 配列番号： 52、 配列番号： 53、 配列番号： 54、 配列番号： 171もしくは配列番号： 173で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含 有する蛋白質またはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の使用などを提 供する。 図面の簡単な説明
図 1は、 参考例 4で行われたヒト型 Bv8ぺプチドおよび MI Πの ZAQ受容体活性化 作用の測定結果を示す。 図中、 _〇—はヒト型 Bv8ペプチドを、 —拿—は MIT1を 示す。
図 2は、 参考例 4で行われたヒト型 Bv8ペプチドおよび MIT1の I5E受容体活性化 作用の測定結果を示す。 図中、 一〇一はヒト型 Bv8ペプチドを、 —會一は MIT1を 示す。
図 3は、 参考例 1 1 (3) で行われた、 精製 ZAQリガンドペプチドの ZAQ活性化 作用の測定結果を示す。
図 4は、 参考例 13 (3) で行われたヒト型 ZAQリガンドペプチドおよび MIT1 の ZAQ受容体活性化作用の測定結果を示す。 図中、 一〇—はヒト型 ZAQリガンドぺ プチドを、 ー秦—は M I T1を示す。
図 5は、 参考例 13 (3) で行われたヒ卜型 ZAQリガンドペプチドおよび MIT1 の I5E受容体活性化作用の測定結果を示す。 図中、 _〇一はヒト型 ZAQリガンドぺ プチドを、 _參一は MIT1を示す。
図 6は、 実施例 2で行われたゥシ副腎毛細血管内皮細胞 （BACE) およびゥシ大 動脈血管内皮細胞 （BAE) におけるゥシ型 ZAQおよびゥシ型 I 5E mRNAの TaqMan PCR 法による定量結果を示す。 図中、 口は total RNA 1 ngあたりのゥシ型 ZAQ mRNA のコピー数を、 また、 國は同様にゥシ型 I 5E mRNAのコピー数を示す。
図 7は、 実施例 3で行われた BACEを用いた FLIPRによる細胞内カルシウムィォ ン濃度上昇活性の測定の結果を示す。 図中、 —拳一は、 ヒト型 ZAQリガンドぺプ チドを、 一▲—はヒト型 Bv8ペプチドを、 一画一は MIT1を示す。
図 8は、 実施例 3で行われた BACEにおける p42 MAPキナーゼおよび p44 MAPキナ —ゼの活性化に及ぼす ZAQ関連ペプチドの用量反応性の結果を示す。 図中、 Cはリ ガンド （溶液） を投与しないコントロールを、 Mは MIT1を、 L1はヒト型 ZAQリガン ドペプチドを、 L2はヒト型 Bv8ペプチドをそれぞれ図中に示した濃度で添加した ことを示す。 また、 p44 MAPK-Pはリン酸化された p44 MAPキナーゼのバンドを、 また p42 MAPK- Pはリン酸化された p42 MAPキナーゼのバンドを示す。
図 9は、 実施例 3で行われた BACEにおける p38 MAPキナーゼの活性化に及ぼす ZAQ関連ペプチドの用量反応性の結果を示す。 図中、 Cはリガンド （溶液） を投与 しないコントロールを、 Mは MIT1を、 L1はヒト型 ZAQリガンドペプチドを、 L2はヒ ト型 Bv8ペプチドをそれぞれ図中に示した濃度で添加したことを示す。 また、 p38 MAPK- Pはリン酸化された p38 MAPキナーゼのバンドを示す。
図 1 0は、 BACEにおける [ ]チミジン取り込みに及ぼすペプチドの用量反応性 の結果を示す。 図中、 ー秦—は、 ヒト型 ZAQリガンドペプチドを、 —▲—はヒト 型 Bv8ペプチドを、 —画一は MIT1を示す。
図 1 1は、 BACEの増殖に及ぼすヒト型 ZAQリガンドペプチドおよびヒト型 Bv8ぺ プチドの影響を示す。 縦軸は、 1ゥエルあたりの BACEの細胞数を示す。 横軸の ZAQい 1は、 ヒト型 ZAQリガンドペプチドを、 ZAQL- 2は、 ヒト型 Bv8ペプチドを示す。 *は Student ' s t tes t 検定から得られた p値が 0. 05より小さいことを、 * *は 同様に、 p値が 0. 001より小さいことを示す。 発明を実施するための最良の形態 配列番号： 8 1、 配列番号： 8 2、 配列番号： 1 0 9、 配列番号： 1 3 8、 配 列番号： 1 9もしくは配列番号： 3 9で表わされるアミノ酸配列と同一または実 質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩 （以下、 本発明のぺ プチドと略記することがある） は、 配列番号： 1、 配列番号： 4 4、 配列番号： 5 1、 配列番号： 5 2、 配列番号： 5 3、 配列番号： 5 4、 配列番号： 1 7 1も しくは配列番号： 1 7 3で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一の アミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩 （以下、 本発明の蛋白質と略記する ことがある） と結合する能力を有するペプチドまたはその塩であり、 本発明の蛋 白質と結合し、 本発明の蛋白質を活性化する能力を有するペプチドまたはその塩 である。 本発明のペプチドの本発明の蛋白質と結合する能力および本発明の蛋白 質を活性化する能力は、 後述の方法により測定することができる。
本発明のペプチドは、 例えば、 ヒトゃ哺乳動物 （例えば、 モルモット、 ラッ卜、 マウス、 ゥサギ、 ブタ、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） のあらゆる細胞 （例えば、 脾 細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 塍臓 /3細胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム細胞、 ラン ゲルハンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 内皮細胞、 繊維芽細胞、 繊維細胞、 筋細 胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロファージ、 T細胞、 B細胞、 ナチュラルキ ラ一細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝細胞もしくは間質細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくはガン細胞など） や血球系の細胞 (例えば、 MEL、 MK CTLL - 2、 HT- 2、 WEHト 3、 HL-60、 J0SK - 1、 K562、 ML - 1、 M0LT-3、 MOLT- 4、 MOLT- 10、 CCRF- CEM、 TALL - 1、 Jurka CCRT-HSB- 2、 KE-37, SKW - 3、 丽-78、 丽-102、 H9、 ϋ937、 THP-K HEL、 JK-K CMK、 KO-812, MEG-01 など） 、 またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、 例えば、 脳、 脳の各部位 (例、 嗅球、 扁頭核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 視床下核、 大脳皮質、 延髄、 小脳、 後頭葉、 前頭葉、 側頭葉、 被殻、 尾状核、 脳染、 黒質） 、 脊髄、 下 垂体、 胃、 滕臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋 肉、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 末梢血球、 前立腺、 睾丸、 精巣、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋など （特 に、 脳や脳の各部位） に由来するペプチドであってもよく、 また合成ペプチドで あってもよい。
本発明のペプチドがシグナル配列を有している場合は、 該ペプチドを効率良く 細胞外に分泌させることができる。
配列番号： 8 1または配列番号： 8 2で表わされるアミノ酸配列と実質的に同 一のアミノ酸配列としては、 例えば、 配列番号： 8 1または配列番号： 8 2で表 されるアミノ酸配列と約 6 0 %以上 （好ましくは約 7 0 %以上、 さらに好ましく は約 8 0 %以上、 より好ましくは約 8 5 %以上、 特に好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上） の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる < 配列番号： 8 1または配列番号： 8 2で表わされるアミノ酸配列と実質的に同 一のアミノ酸配列を含有するペプチドとしては、 例えば、 配列番号： 8 1または 配列番号： -8 2で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有 し、 配列番号： 8 1または配列番号： 8 2で表わされるアミノ酸配列を含有する ペプチドと実質的に同質の性質を有するペプチドなどが好ましい。
以下、 配列番号： 8 1または配列番号： 8 2で表わされるアミノ酸配列を含有 するペプチドをヒト型 Z AQリガンド成熟体ペプチドと記載することがある。
配列番号： 8 1または配列番号： 8 2で表わされるアミノ酸配列と同一または 実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドとしては、 例えば、 配列番号： 8 1または配列番号： 8 2で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一 のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 8 1または配列番号： 8 2で表わされるァ ミノ酸配列を含有するペプチドと実質的に同質の活性を有するペプチドなどが好 ましく、 具体的には配列番号： 8 1、 配列番号： 8 2、 配列番号： 8 3または配 列番号： 8 4で表わされるアミノ酸配列を含有するペプチド等が挙げられる。
以下、 配列番号： 8 3または配列番号： 8 4で表わされるアミノ酸配列を含有 するペプチドをヒト型 Z A Qリガンド前駆体ペプチドと記載することがある。
配列番号： 1 0 9で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列と しては、 例えば、 配列番号： 1 0 9で表されるアミノ酸配列と 9 5 %以上 （好ま しくは約 9 7 %以上、 さらに好ましくは約 9 9 %以上） の相同性を有するァミノ 酸配列などが挙げられる。
配列番号： 1 0 9で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を 含有するペプチドとしては、 例えば、 配列番号： 1 0 9で表わされるアミノ酸配 列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 1 0 9で表わされるアミ ノ酸配列を有するペプチドと実質的に同質の活性を有するペプチドなどが好まし レ^
以下、 配列番号： 1 0 9で表わされるアミノ酸配列を有するペプチドをマウス 型 Z A Qリガンド成熟体べプチドと記載することがある。
配列番号： 1 0 9で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するペプチドとしては、 例えば、 配列番号： 1 0 9で表わされる アミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 1 0 9で表わされるアミノ酸配列を有するペプチドと実質的に同質の活性を有する ペプチドなどが好ましく、 具体的には配列番号： 1 0 9または配列番号： 1 0 7 で表わされるアミノ酸配列を有するペプチド等が挙げられる。
以下、 配列番号： 1 0 7で表わされるアミノ酸配列を有するペプチドをマウス 型 Z AQリガンド前駆体べプチドと記載することがある。
配列番号： 1 3 8で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列と しては、 例えば、 配列番号： 1 3 8で表されるアミノ酸配列と 9 5 %以上 （好ま しくは約 9 7 %以上、 さらに好ましくは約 9 9 %以上） の相同性を有するァミノ 酸配列などが挙げられる。
配列番号： 1 3 8で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を 含有するペプチドとしては、 例えば、 配列番号： 1 3 8で表わされるアミノ酸配 列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 1 3 8で表わされるアミ ノ酸配列を有するペプチドと実質的に同質の活性を有するペプチドなどが好まし レ^ 配列番号： 1 3 8で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列 を含有するペプチドとして具体的には、 配列番号： 1 4 0で表されるアミノ酸配 列を含有するべプチド、 配列番号： 1 4 2で表されるアミノ酸配列を含有するべ プチドなどが挙げられる。
以下、 配列番号： 1 3 8、 配列番号： 1 4 0または配列番号： 1 4 2で表わさ れるァミノ酸配列を有するペプチドをラット型 Z A Qリガンド成熟体べプチドと 記載することがある。 配列番号： 1 3 8で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するペプチドとして具体的には配列番号： 1 3 2、 配列番号： 1 3 4または配列番号： 1 3 6で表わされるアミノ酸配列を有するペプチド等も挙 げられる。
以下、 配列番号： 1 3 2、 配列番号： 1 3 4または配列番号： 1 3 6で表わさ れるアミノ酸配列を有するペプチドをラット型 Z A Qリガンド前駆体べプチドと 記載することがある。
配列番号： 1 9または配列番号： 3 9で表わされるアミノ酸配列と実質的に同 一のアミノ酸配列としては、 例えば、 配列番号： 1 9または配列番号： 3 9で表 されるアミノ酸配列と約 6 0 %以上 （好ましくは約 7 0 %以上、 さらに好ましく は約 8 0 %以上、 より好ましくは約 8 5 %以上、 特に好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上） の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる' 配列番号： 1 9または配列番号： 3 9で表わされるアミノ酸配列と実質的に同 一のアミノ酸配列を含有するペプチドとしては、 例えば、 配列番号： 1 9または 配列番号： 3 9で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有 し、 配列番号： 1 9または配列番号： 3 9で表わされるアミノ酸配列を有するぺ プチドと実質的に同質の活性を有するペプチドなどが好ましい。
以下、 配列番号： 1 9で表わされるアミノ酸配列を有するペプチドをヒト型 B V 8成熟体ペプチド、 配列番号： 3 9で表わされるアミノ酸配列を有するぺプチ ドをラット型 B v 8成熟体ペプチドまたはマウス型 B v 8成熟体ペプチドと記載 することがある。
配列番号： 1 9で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ 酸配列を含有するペプチドとしては、 例えば、 配列番号： 1 9で表わされるアミ ノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 1 9で 表わされるアミノ酸配列を有するペプチドと実質的に同質の活性を有するぺプチ ドなどが好ましく、 具体的には配列番号： 1 7または配列番号： 1 9で表わされ るアミノ酸配列を有するぺプチド等が挙げられる。
配列番号： 3 9で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ 酸配列を含有するペプチドとしては、 例えば、 配列番号： 3 9で表わされるアミ ノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 3 9で 表わされるアミノ酸配列を有するペプチドと実質的に同質の活性を有するぺプチ ドなどが好ましく、 具体的には配列番号： 3 7、 配列番号： 3 9または配列番 号： 5 5で表わされるアミノ酸配列を有するペプチド等が挙げられる。
以下、 配列番号： 1 7で表わされるアミノ酸配列を有するペプチドをヒト型 B V 8前駆体ペプチドと記載することがある。 配列番号： 3 7で表わされるァミノ 酸配列を有するペプチドをラット型 B V 8前駆体べプチドと記載することがある, 配列番号： 5 5で表わされるアミノ酸配列を有するペプチドをマウス型 B v 8前 駆体べプチドと記載することがある。
配列番号： 2 1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とし ては、 例えば、 配列番号： 2 1で表されるアミノ酸配列と約 6 0 %以上 （好まし くは約 7 0 %以上、 さらに好ましくは約 8 0 %以上、 より好ましくは約 8 5 %以 上、 特に好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上） の相同性を有 するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号： 2 1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含 有するペプチドとしては、 例えば、 配列番号： 2 1で表わされるアミノ酸配列と 実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 2 1で表わされるアミノ酸配 列を有するペプチドと実質的に同質の活性を有するペプチドなどが好ましい。
以下、 配列番号： 2 1で表わされるアミノ酸配列を有するペプチドを M I Τ 1 と記載することがある。
実質的に同質の活性としては、 例えば、 本発明の蛋白質に対する結合活性、 本 発明の蛋白質を介するシグナル情報伝達作用などが挙げられる。 実質的に同質と は、 それらの活性が性質的に同質であることを示す。 したがって、 本発明の蛋白 質に対する結合活性、 本発明の蛋白質を介するシグナル情報伝達作用などの活性 が同等 （例、 約 0 . 5〜2倍） であることが好ましいが、 これらの活性の程度や ペプチドの分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
これらの活性の測定は、 自体公知の方法に準じて行なうことができるが、 例え ば、 後述するスクリーニング方法などに従つて測定することができる。
また、 本発明のペプチドとしては、 （i ) 配列番号： 8 1、 配列番号： 8 2、 配列番号： 109、 配列番号： 138、 配列番号： 19または配列番号： 39で 表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜30個程度、 よ り好ましくは 1〜20個程度） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 （ii) 配列 番号： 81、 配列番号： 82、 配列番号： 109、 配列番号： 138、 配列番 号： 19または配列番号： 39で表されるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好 ましくは、 1〜40個程度、 より好ましくは 1〜30個程度、 なかでも好ましく は 1〜20個程度） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 （iii) 配列番号： 8 1、 配列番号： 82、 配列番号： 109、 配列番号： 138、 配列番号： 19ま たは配列番号： 39で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜40個程度、 より好ましくは 1〜30個程度、 なかでも好ましくは 1〜20 個程度） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 または （iv) そ れらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するペプチドなども用いられる。
本発明のペプチドの具体例としては、 例えば、 配列番号： 81で表わされるァ ミノ酸配列を含有するヒト由来のペプチド、 配列番号： 82で表わされるァミノ 酸配列を含有するヒト由来のペプチド、 配列番号： 109で表わされるアミノ酸 配列を含有するマウス由来のペプチド、 配列番号： 138で表わされるアミノ酸 配列を含有するラット由来のペプチド、 配列番号： 140で表わされるアミノ酸 配列を含有するラット由来のペプチド、 配列番号： 142で表わされるアミノ酸 配列を含有するラット由来のペプチド、 配列番号： 19で表わされるアミノ酸配 列を含有するヒト由来のペプチド、 配列番号： 39で表わされるアミノ酸配列を 含有するラット由来またはマウス由来のペプチドなどがあげられる。
本発明のペプチドの部分ペプチドとしては、 後述の医薬等のスクリーニング方 法に用いることのできるものであれば、 いかなるものであってもよく、 本発明の ペプチドと実質的に同質の活性を有していればよい。 該部分ペプチドのアミノ酸 の数は、 本発明のペプチドの構成アミノ酸配列のうち少なくとも 10個以上、 好 ましくは 20個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい。
ここで、 「実質的に同質の活性」 とは、 上記と同意義を示す。 「実質的に同質 の活性」 の測定は上記と同様に行なうことができる。
該部分ペプチドとしては、 （i) 上記アミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好 ましくは数個 （1〜4個） ） のアミノ酸が欠失し、 （i i ) 上記アミノ酸配列に 1 または 2個以上 （好ましくは、 1〜 2 0個程度、 より好ましくは 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜 5個） ) のアミノ酸が付加し、 または （i i i ) 上記 アミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは数個 （1〜4個） ） のアミノ酸 力他のアミノ酸で置換されていてもよい。
以下、 本発明のぺプチドとの本発明のぺプチドの部分べプチドとをまとめて本 発明のペプチドと称することがある。
本発明の蛋白質は、 例えば、 ヒトゃ哺乳動物 （例えば、 モルモット、 ラッ卜、 マウス、 ゥサギ、 ブ夕、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） のあらゆる細胞 （例えば、 脾 細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 滕臓δ細胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム細胞、 ラン ゲルハンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 内皮細胞、 繊維芽細胞、 繊維細胞、 筋細 胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロファージ、 Τ細胞、 Β細胞、 ナチュラルキ ラー細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝細胞もしくは間質細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくはガン細胞など） や血球系の細胞 (例えば、 MEL、 MK CTLL- 2、 HT- 2、 丽- 3、 HL-60, JOSK-K K562, ML-K
OLT-3, MOLT- 4、 MOLT-10, CCRF-CEM, TALL- 1、 Jurkat、 CCRT-HSB-2, KE - 37、 SKW-3, HUT- 78、 HUT-102 , H9、 薦 7、 THP-K 鼠、 JK-K CMK、 KO-812, MEG-01 など） 、 またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、 例えば、 脳、 脳の各部位 (例、 嗅球、 扁頭核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 視床下核、 大脳皮質、 延髄、 小脳、 後頭葉、 前頭葉、 側頭葉、 被殻、 尾状核、 脳染、 黒質） 、 脊髄、 下 垂体、 胃、 滕臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋 肉、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 末梢血球、 前立腺、 睾丸、 精巣、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋など （特 に、 脳や脳の各部位） に由来する蛋白質であってもよく、 また合成蛋白質であつ てもよい。
本発明の蛋白質がシグナル配列を有している場合は該ペプチドまたは蛋白質を 効率良く細胞外に分泌させることができる。
配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列として は、 例えば、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と約 9 0 %以上： 好ましく は約 9 5 %以上、 より好ましくは約 9 8 %以上の相同性を有するアミノ酸配列な どが挙げられる。
配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有 する蛋白質としては、 例えば、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と実質的 に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を有す る蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。
本発明の配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一の アミノ酸配列を含有する蛋白質としては、 例えば、 配列番号： 1で表わされるァ ミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 1で 表わされるアミノ酸配列と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。 具体的には WO 0 1 / 1 6 3 0 9に記載の蛋白質などが挙げられる。
以下、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質を Z AQまたは ヒト Z AQと記載することがある。
配列番号： 4 4で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とし ては、 例えば、 配列番号： 4 4で表わされるアミノ酸配列と約 9 7 %以上、 好ま しくは約 9 8 %以上、 より好ましくは約 9 9 %以上、 最も好ましくは約 9 9 . 5 %以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号： 4 4で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有 する蛋白質としては、 例えば、 配列番号： 4 4で表わされるアミノ酸配列と実質 的に同一のアミノ酸配列を有し、 配列番号： 4 4で表わされるアミノ酸配列を有 する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。
配列番号： 4 4で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ 酸配列を含有する蛋白質としては、 例えば、 配列番号： 4 4で表わされるァミノ 酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 4 4で表 わされるアミノ酸配列と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。 配列番号： 5 1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とし ては、 例えば、 配列番号： 5 1で表わされるアミノ酸配列と約 9 5 %以上、 好ま しくは約 9 6 %以上、 より好ましくは約 9 7 %以上、 最も好ましくは約 9 8 %以 上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号： 5 1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有 する蛋白質としては、 例えば、 配列番号： 5 1で表わされるアミノ酸配列と実質 的に同一のアミノ酸配列を有し、 配列番号： 5 1で表わされるアミノ酸配列を有 する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。
配列番号： 5 1で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ 酸配列を含有する蛋白質としては、 例えば、 配列番号： 5 1で表わされるァミノ 酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 5 1で表 わされるアミノ酸配列と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。 配列番号： 5 2で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とし ては、 例えば、 配列番号： 5 2で表わされるアミノ酸配列と約 9 0 %以上、 好ま しくは約 9 5 %以上、 より好ましくは約 9 8 %以上の相同性を有するアミノ酸配 列などが挙げられる。
配列番号： 5 2で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有 する蛋白質としては、 例えば、 配列番号： 5 2で表わされるアミノ酸配列と実質 的に同一のアミノ酸配列を有し、 配列番号： 5 2で表わされるアミノ酸配列を有 する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。
配列番号： 5 2で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ 酸配列を含有する蛋白質としては、 例えば、 配列番号： 5 2で表わされるァミノ 酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 5 2で表 わされるアミノ酸配列と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましく、 具 体的には WO 9 8 / 4 6 6 2 0に記載の蛋白質などが挙げられる。
以下、 配列番号： 5 2で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質を I 5 Eまた はヒト型 I 5 Eなどと記載することがある。
配列番号： 5 3で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とし ては、 例えば、 配列番号： 5 3で表わされるアミノ酸配列と約 9 5 %以上、 好ま しくは約 9 6 %以上、 より好ましくは約 9 7 %以上、 最も好ましくは約 9 8 %以 上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号： 5 3で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有 する蛋白質としては、 例えば、 配列番号： 5 3で表わされるアミノ酸配列と実質 的に同一のアミノ酸配列を有し、 配列番号： 5 3で表わされるアミノ酸配列を有 する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。
配列番号： 5 3で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ 酸配列を含有する蛋白質としては、 例えば、 配列番号： 5 3で表わされるァミノ 酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 5 3で表 わされるアミノ酸配列と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましく、 具 体的には、 Bi ochem. Bi ophys. Ac ta, 1491巻， 369- 375頁， 2000年に記載の蛋白 質などが挙げられる。
配列番号： 5 4で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とし ては、 例えば、 配列番号： 5 4で表わされるアミノ酸配列と約 9 5 %以上、 好ま しくは約 9 6 %以上、 より好ましくは約 9 7 %以上、 最も好ましくは約 9 8 %以 上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号： 5 4で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有 する蛋白質としては、 例えば、 配列番号： 5 4で表わされるアミノ酸配列と実質 的に同一のアミノ酸配列を有し、 配列番号： 5 4で表わされるアミノ酸配列を有 する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。
配列番号： 5 4で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ 酸配列を含有する蛋白質としては、 例えば、 配列番号： 5 4で表わされるァミノ 酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 5 4で表 わされるアミノ酸配列と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましく、 具 体的には W〇 9 8 / 6 6 2 0に記載の蛋白質などが挙げられる。
配列番号： 1 7 1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列と しては、 例えば、 配列番号： 1 7 1で表わされるアミノ酸配列と 9 5 %以上、 好 ましくは約 9 7 %以上、 より好ましくは約 9 9 %以上の相同性を有するアミノ酸 配列などが挙げられる。
配列番号： 1 7 1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を 含有する蛋白質としては、 例えば、 配列番号： 1 7 1で表わされるアミノ酸配列 と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 1 7 1で表わされるァミノ 酸配列を有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。 本発明の配列番号： 1 7 1で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同 一のアミノ酸配列を含有する蛋白質としては、 例えば、 配列番号： 1 7 1で表わ されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番 号： 1 7 1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同質の活性を有する蛋白質など が好ましい。
以下、 配列番号： 1 7 1で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質をゥシ型 Z A Qと記載することがある。
配列番号： 1 7 3で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列と しては、 例えば、 配列番号： 1 7 3で表わされるアミノ酸配列と 9 5 %以上、 好 ましくは約 9 7 %以上、 より好ましくは約 9 9 %以上の相同性を有するアミノ酸 配列などが挙げられる。
配列番号： 1 7 3で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を 含有する蛋白質としては、 例えば、 配列番号： 1 7 3で表わされるアミノ酸配列 と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 1 7 3で表わされるァミノ 酸配列を有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。 本発明の配列番号： 1 7 3で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同 一のアミノ酸配列を含有する蛋白質としては、 例えば、 配列番号： 1 7 3で表わ されるァミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ酸配列を含有し、 配列番 号： 1 7 3で表わされるアミノ酸配列と実質的に同質の活性を有する蛋白質など が好ましい。
以下、 配列番号： 1 7 3で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質をゥシ型 I 5 Eと記載することがある。
実質的に同質の活性としては、 例えば、 本発明のペプチドに対する結合活性、 シグナル情報伝達作用などが挙げられる。 実質的に同質とは、 それらの活性が性 質的に同質であることを示す。 したがって、 本発明のペプチドに対する結合活性 やシグナル情報伝達作用などの活性が同等 （例、 約 0 . 5〜2倍） であることが 好ましいが、 これらの活性の程度や蛋白質の分子量などの量的要素は異なってい てもよい。 結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、 自体公知の方法に準じ て行なうことができる。
さらに、 本発明の蛋白質としては、 （i) 配列番号： 1、.配列番号： 44、 配 列番号： 51、 配列番号： 52、 配列番号： 53、 配列番号： 54、 配列番号： 171または配列番号： 173で表わされるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 (好ましくは、 1〜30個程度、 より好ましくは 1〜10個程度、 さらに好まし くは数個 （1または 2個） ） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 （ii) 配列番 号： 1、 配列番号： 44、 配列番号： 51、 配列番号： 52、 配列番号： 53、 配列番号： 54、 配列番号： 171または配列番号： 173で表わされるァミノ 酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜30個程度、 より好ましくは 1〜 10個程度、 さらに好ましくは数個 （1または 2個） ） のアミノ酸が付加したァ ミノ酸配列、 （iii) 配列番号： 1、 配列番号： 44、 配列番号： 51、 配列番 号： 52、 配列番号： 53、 配列番号： 54、 配列番号： 171または配列番 号： 173で表わされるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜 30個程度、 より好ましくは 1〜10個程度、 さらに好ましくは数個 （1または 2個） ） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 または （iv) そ れらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質なども用いられる。
本発明の蛋白質の具体例としては、 例えば、 配列番号： 1または配列番号： 5 2で表わされるアミノ酸配列を含有するヒト由来 （より好ましくはヒト脳由来） の蛋白質、 配列番号： 44または配列番号： 51で表わされるアミノ酸配列を含 有するラット由来の蛋白質、 配列番号： 53または配列番号： 54で表わされる アミノ酸配列を含有するマウス由来の蛋白質、 配列番号： 171または配列番 号： 173で表されるアミノ酸配列を含有するゥシ由来の蛋白質などがあげられ る。
本発明の蛋白質の部分ペプチド （以下'、 本発明の部分ペプチドと略記する場合 がある） としては、 前記した本発明の蛋白質の部分ペプチドであれば何れのもの であってもよいが、 例えば、 本発明の蛋白質分子のうち、 細胞膜の外に露出して いる部位であって、 実質的に同質のリガンド結合活性を有するものなどが用いら れる。 具体例として、 本発明の蛋白質の部分ペプチドとしては、 疎水性プロット解析 において細胞外領域 （親水性 （hydroph i l ic) 部位） であると分析された部分を 含むペプチドである。 また、 疎水性 （hydrophob ic) 部位を一部に含むペプチド も同様に用いることができる。 個々のドメインを個別に含むペプチドも用い得る が、 複数のドメインを同時に含む部分のペプチドでも良い。
本発明の部分ペプチドのアミノ酸の数は、 前記した本発明の蛋白質の構成アミ ノ酸配列のうち少なくとも 2 0個以上、 好ましくは 5 0個以上、 より好ましくは 1 0 0個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい。
実質的に同一のアミノ酸配列とは、 これらアミノ酸配列と約 5 0 %以上、 好ま しくは約 7 0 %以上、 より好ましくは約 8 0 %以上、 さらに好ましくは約 9 0 % 以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアミノ酸配列を示す。 ここで、 「実質的に同質のリガンド結合活性」 とは、 前記と同意義を示す。 「実質的に同質のリガンド結合活性」 の測定は自体公知の方法に準じて行なうこ とができる。
また、 本発明の部分ペプチドは、 配列番号： 1、 配列番号： 4 4、 配列番号： 5 1、 配列番号： 5 2、 配列番号： 5 3、 配列番号： 5 4、 配列番号： 1 7 1ま たは配列番号： 1 7 3で表わされるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好まし くは、 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1または 2個） ） のアミノ酸が 欠失し、 または、 そのアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜2 0 個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1または 2 個） ） のアミノ酸が付加し、 または、 そのアミノ酸配列中の 1または 2個以上
(好ましくは、 1〜1 0個程度、 より好ましくは 1〜5個程度、 さらに好ましく は数個 （1または 2個） ） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。 本発明のぺプチドまたは本発明の蛋白質もしくはその部分べプチドの塩として は、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。 この様な塩としては、 例えば無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有 機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンス ルホン酸） との塩などが用いられる。 本明細書におけるペプチドおよび蛋白質は、 ペプチド標記の慣例に従って左端 が N末端 （ァミノ末端） 、 右端が C末端 （カルボキシル末端） である。 配列番 号： 4 7で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋白質をはじめとする本発明の蛋 白質は、 C末端がカルボキシル基 （- C00H) 、 カルボキシレート（- C00—) 、 アミド (~C0NH2) またはエステル （-C00R) であってもよい。
ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n—プロピル、 イソプロピルもしくは n—ブチルなどの C卜 6アルキル基、 例えば、 シクロペンチ ル、 シクロへキシルなどの C 3 _ 8シクロアルキル基、 例えば、 フエニル、 ひ—ナ フチルなどの C s-i 2ァリール基、 例えば、 ベンジル、 フエネチルなどのフエニル — c i— 2アルキル基もしくはひ一ナフチルメチルなどのひ一ナフチル— C 2ァ ルキル基などの c 7_14ァラルキル基のほか、 経口用エステルとして汎用されるピ バロィルォキシメチル基などが用いられる。
本発明のペプチドおよび本発明の蛋白質 （本発明のペプチド ·蛋白質） が C末 端以外にカルボキシル基 （またはカルボキシレート） を有している場合、 カルボ キシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のペプチド ·蛋白 質に含まれる。 この場合のエステルとしては、 例えば上記した C末端のエステル などが用いられる。
さらに、 本発明のペプチド ·蛋白質には、 上記したペプチド ·蛋白質において、
N末端のメチォニン残基のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基 などの C 2— 6アルカノィル基などの C l-6ァシル基など） で保護されているもの、 N 端側が生体内で切断され生成したダル夕ミル基がピログルタミン酸化したもの、 分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基 （例えば、 一〇H、 一 S H、 アミノ基、 イミ ダゾール基、 インド一ル基、 グァニジノ基など） が適当な保護基 （例えば、 ホル ミル基、 ァセチル基などの C 2-6アルカノィル基などの C ,_6ァシル基など） で保護 されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチド，糖蛋白質などの 複合ペプチド ·複合蛋白質なども含まれる。
また、 本発明の部分ペプチドは C末端が、 カルボキシル基 （-C00H) 、 カルボ キシレート （- C00—) 、 アミド （- C0NH2) またはエステル （-C00R) であってもよ レ^ 本発明の部分ペプチドが C末端以外に力ルポキシル基 （またはカルボキシレ ート） を有している場合、 カルボキシル基がアミド化またはエステル化されてい るものも本発明の部分ペプチドに含まれる。 この場合のエステルとしては、 例え ば上記した C末端のエステルなどが用いられる。
さらに、 本発明の部分ペプチドには、 前記した本発明の蛋白質と同様に、 N末 端のメチォニン残基のァミノ基が保護基で保護されているもの、 N端側が生体内 で切断され生成した G 1 nがピログルタミン酸化したもの、 分子内のアミノ酸の 側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、 あるいは糖鎖が結合した いわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明のペプチドもしくは蛋白質またはその塩は、 前述したヒトゃ哺乳動物の 細胞または組織から自体公知のペプチド ·蛋白質の精製方法によって製造するこ ともできるし、 配列番号： 8 1、 配列番号： 82、 配列番号： 109、 配列番 号： 138、 配列番号： 140、 配列番号： 142、 配列番号： 1 9、 配列番 号： 39、 配列番号： 1、 配列番号： 44、 配列番号： 5 1、 配列番号： 52、 配列番号： 53、 配列番号： 54、 配列番号： 1 7 1または配列番号： 173で 表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする DNAを含有する形質転換 体を培養することによつても製造することができる。 また、 後述のペプチド ·蛋 白質合成法またはこれに準じて製造することもできる。 さらに、 配列番号： 53 で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質またはその塩は、' Biochem. Biophys. Acta, 1491巻， 369-375頁， 2000年に記載の方法に準じて製造できる。 配列番 号： 52または配列番号： 54で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質またはそ の塩は、 W0 98/46620に記載の方法に準じて製造できる。
ヒトゃ哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、 ヒトゃ哺乳動物の組織ま たは細胞をホモジナイズした後、 酸などで抽出を行ない、 該抽出液を逆相クロマ トグラフィ一、 イオン交換クロマトグラフィ一などのクロマトグラフィ一を組み 合わせることにより精製単離することができる。
本発明のペプチドまたは本発明の蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはそれ らのアミド体またはそれらの塩の合成には、 通常市販のペプチド ·蛋白質合成用 樹脂を用いることができる。 そのような樹脂としては、 例えば、 クロロメチル樹 脂、 ヒドロキシメチル樹脂、 ベンズヒドリルァミン樹脂、 アミノメチル樹脂、 4 一べンジルォキシベンジルアルコール樹脂、 4 _メチルベンズヒドリルアミン樹 月旨、 PAM樹脂、 4—ヒドロキシメチルメチルフエニルァセトアミドメチル樹脂、 ポリアクリルアミド樹脂、 4一 (2', 4'—ジメトキシフエ二ル―ヒドロキシメ チル） フエノキシ樹脂、 4— (2'， 4'—ジメトキシフエ二ル— Fmo cァミノ ェチル） フエノキシ樹脂などを挙げることができる。 このような樹脂を用い、 α 一アミノ¾と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、 目的とするペプチド '蛋 白質の配列通りに、 自体公知の各種縮合方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応 の最後に樹脂からペプチド ·蛋白質を切り出すと同時に各種保護基を除去し、 さ らに高希釈溶液中で分子内ジスルフィ ド結合形成反応を実施し、 目的のぺプチ ド ·蛋白質またはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、 ペプチド ·蛋白質合成に使用できる 各種活性化試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミド類がよい。 カル ポジイミド類としては、 DCC、 N, N'—ジイソプロピルカルポジイミド、 N —ェチルー N' _ (3—ジメチルァミノプロリル） カルポジイミドなどが用いら れる。 これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 HOB t, HOO B t) とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、 対称酸無水物また は HOB tエステルあるいは HOOB tエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸 の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、 ペプチド · 蛋白質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。 例 えば、 N, N—ジメチルホルムアミド， N, N—ジメチルァセトアミド， N—メ チルピロリドンなどの酸アミド類、 塩化メチレン， クロ口ホルムなどのハロゲン 化炭化水素類、 トリフルォロエタノールなどのアルコール類、 ジメチルスルホキ シドなどのスルホキシド類、 ピリジン， ジォキサン， テトラヒドロフランなどの エーテル類、 ァセトニトリル， プロピオ二トリルなどの二トリル類、 酢酸メチル， 酢酸ェチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。 反応温度は蛋白質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜 選択され、 通常約— 20°C〜50°Cの範囲から適宜選択される。 活性化されたァ ミノ酸誘導体は通常 1.5〜 4倍過剰で用いられる。 ニンヒドリン反応を用いた テス卜の結果、 縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を 繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。 反応を繰り返しても十分 な縮合が得られないときには、 無水酢酸またはァセチルイミダゾ一ルを用いて未 反応アミノ酸をァセチル化することができる。
原料のァミノ基の保護基としては、 例えば、 τ、 B o c、 ターシャリーペンチ ルォキシカルボニル、 イソボルニルォキシカルボニル、 4—メトキシベンジルォ キシカルボニル、 C 1 一 Z、 B r— Z、 ァダマンチルォキシカルポニル、 トリフ ルォロアセチル、 フタロイル、 ホルミル、 2—ニトロフエニルスルフエ二ル、 ジ フエニルホスフィノチオイル、 Fm o cなどが用いられる。
力ルポキシル基は、 例えば、 アルキルエステル化 （例えば、 メチル、 ェチル、 プロピル、 ブチル、 夕一シャリーブチル、 シクロペンチル、 シクロへキシル、 シ クロへプチル、 シクロォクチル、 2—ァダマンチルなどの直鎖状、 分枝状もしく は環状アルキルエステル化） 、 ァラルキルエステル化 （例えば、 ベンジルエステ ル、 4一二トロべンジルエステル、 4—メトキシベンジルエステル、 4一クロ口 ベンジルエステル、 ベンズヒドリルエステル化） 、 フエナシルエステル化、 ベン ジルォキシカルポニルヒドラジド化、 夕ーシャリーブトキシカルポニルヒドラジ ド化、 トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、 例えば、 エステル化またはエーテル化によって保護するこ とができる。 このエステル化に適する基としては、 例えば、 ァセチル基などの低 級アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジルォキシカルポニル 基、 エトキシカルポニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。 また、 エーテル化に適する基としては、 例えば、 ベンジル基、 テトラヒドロピラニル基、 卜ブチル基などである。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 例えば、 B z 1 、 C l 2— B z l 、 2—二トロベンジル、 B r— Z、 夕ーシャリーブチルなどが用いられる。 ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、 例えば、 T o s、 4ーメトキシ — 2， 3 , 6—トリメチルベンゼンスルホニル、 D N P、 ベンジルォキシメチル、 B u m, B o c、 T r t、 F m o cなどが用いられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応する酸無水 物、 アジド、 活性エステル 〔アルコール （例えば、 ペンタクロロフエノール、 2 , 4， 5 _トリクロ口フエノール、 2， 4—ジニトロフエノール、 シァノメチルァ ルコール、 パラニトロフエノ一ル、 H O N B、 N—ヒドロキシスクシミド、 N— ヒドロキシフ夕ルイミド、 H O B t ) とのエステル〕 などが用いられる。 原料の ァミノ基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応するリン酸アミドが用いら れる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 例えば、 P d—黒あるいは P d—炭素な どの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メタ ンスルホン酸、 トリフルォロメタンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるいはこれ らの混合液などによる酸処理や、 ジイソプロピルエヂルァミン、 トリェチルアミ ン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニア中ナトリ ゥムによる還元なども用いられる。 上記酸処理による脱離反応は、 一般に約一 2 0で〜 4 0 °Cの温度で行なわれるが、 酸処理においては、 例えば、 ァニソール、 フエノール、 チオアニソ一ル、 メタクレゾ一ル、 パラクレゾール、 ジメチルスル フイ ド、 1，4 -ブタンジチオール、 1 , 2—エタンジチオールなどのようなカチォ ン捕捉剤の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダゾール保護基として用 いられる 2 , 4—ジニトロフエニル基はチオフエノ一ル処理により除去され、 ト リブトフアンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の 1 , 2— エタンジチオール、 1， 4 _ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保 護以外に、 希水酸化ナトリウム溶液、 希アンモニアなどによるアルカリ処理によ つても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、 およびその保護 基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から 適宜選択しうる。
ペプチド ·蛋白質のアミド体を得る別の方法としては、 例えば、 まず、 力ルポ キシ末端アミノ酸の α—カルボキシル基をアミド化して保護した後、 アミノ基側 にべプチド鎖を所望の鎖長まで延ばした後、 該ぺプチド鎖の Ν末端の α—アミノ 基の保護基のみを除いたペプチド ·蛋白質と C末端の力ルポキシル基の保護基の みを除去したペプチド ·蛋白質とを製造し、 この両ペプチド ·両蛋白質を上記し たような混合溶媒中で縮合させる。 縮合反応の詳細については上記と同様である。 縮合により得られた保護ペプチド ·保護蛋白質を精製した後、 上記方法によりす ベての保護基を除去し、 所望の粗ペプチド ·粗蛋白質を得ることができる。 この 粗ペプチド ·粗蛋白質は既知の各種精製手段を駆使して精製し、 主要画分を凍結 乾燥することで所望のペプチド '蛋白質のアミド体を得ることができる。
ペプチド ·蛋白質のエステル体を得るには、 例えば、 カルポキシ末端アミノ酸 のひ一力ルポキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、 ペプチド ·蛋白質のアミド体と同様にして、 所望のペプチド ·蛋白質のエステル 体を得ることができる。
本発明のペプチドおよび本発明の蛋白質は、 自体公知のペプチドの合成法に従 つて製造することができる。 また、 本発明の蛋白質の部分ペプチドまたはその塩 は、 自体公知のペプチドの合成法に従って、 あるいは本発明の蛋白質を適当なぺ プチダーゼで切断することによって製造することができる。
ペプチドの合成法としては、 例えば、 固相合成法、 液相合成法のいずれによつ ても良い。 すなわち、 本発明のペプチドもしくは本発明の蛋白質を構成し得る部 分ペプチドまたはアミノ酸と残余部 4とを縮合させ、 生成物が保護基を有する場 合は保護基を脱離することにより目的のぺプチドを製造することができる。 公知 の縮合方法や保護基の脱離としては、 例えば、 以下の （i) 〜 （V) に記載された 方法が挙げられる。
(i) M. Bodanszky および M.A. Ondetti, ペプチド シンセシス （Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年)
(i i) Schroederおよび Luebke、 ザ ペプチド（The Peptide), Academic Press, New York (1965年）
(iii) 泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株） （1975年）
(iv) 矢島治明 および榊原俊平、 生化学実験講座 1、 蛋白質の化学 IV、 205、 (1977年）
(V) 矢島治明監修、 続医薬品の開発第 14巻 ペプチド合成広川書店
また、 反応後は通常の精製法、 たとえば、 溶媒抽出 ·蒸留 ·カラムクロマトグ ラフィ一'液体クロマトグラフィー '再結晶などを組み合わせて本発明のぺプチ ドまたは本発明の部分ペプチドを精製単離することができる。 上記方法で得られ るペプチドまたは部分ペプチドが遊離体である場合は、 公知の方法によって適当 な塩に変換することができるし、 逆に塩で得られた場合は、 公知の方法によって 遊離体に変換することができる。
本発明のぺプチドまたは本発明の蛋白質をコードするポリヌクレオチドとして は、 前述した本発明のペプチドまたは本発明の蛋白質をコードする塩基配列を含 有するものであればいかなるものであってもよい。 好ましくは DNAである。 D NAとしては、 ゲノム DNA、 ゲノム DNAライブラリー、 前記した細胞 組織 由来の cDNA、 前記した細胞 ·組織由来の cDNAライブラリー、 合成 DNA のいずれでもよい。 ライブラリーに使用するべクタ一は、 バクテリオファージ、 プラスミド、 コスミド、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また、 前記し た細胞 '組織より t o t a l RN Aまたは mRN A画分を調製したものを用い て直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain React ion (以下、 RT— PC R法と略称する） によって増幅することもできる。
具体的には、 配列番号： 8 1で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドをコ ードする DNAとしては、 例えば、 配列番号： 87で表わされる塩基配列を含有 する DNA、 または配列番号： 87で表わされる塩基配列を有する DNAとハイ ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNAを有し、 配列番号： 8 1 で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドと実質的に同質の活性 （例、 本発明 の蛋白質に対する結合活性、 本発明の蛋白質を介するシグナル情報伝達作用な ど） を有するペプチドをコードする DNAであれば何れのものでもよい。
配列番号： 87で表わされる塩基配列を含有する DNAとしては、 配列番号： 87または配列番号： 89で表わされる塩基配列を含有する DN A等が挙げられ る。
配列番号： 87で表わされる塩基配列を有する DNAとハイストリンジェント な条件下でハイブリダィズする DNAとしては、 例えば、 配列番号： 87で表わ される塩基配列と約 60%以上、 好ましくは約 70%以上、 より好ましくは約 8 0%以上の相同性を有する塩基配列を含有する DN Aなどが用いられる。
具体的には、 配列番号： 82で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドをコ ードする DNAとしては、 例えば、 配列番号： 88で表わされる塩基配列を含有 する DNA、 または配列番号： 88で表わされる塩基配列を有する DNAとハイ ストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズする DNAを有し、 配列番号： 82 で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドと実質的に同質の活性 （例、 本発明 の蛋白質に対する結合活性、 本発明の蛋白質を介するシグナル情報伝達作用な ど） を有するペプチドをコ一ドする DNAであれば何れのものでもよい。
配列番号： 88で表わされる塩基配列を含有する DNAとしては、 配列番号： 88または配列番号： 90で表わされる塩基配列を含有する DN A等が挙げられ る。
配列番号： 88で表わされる塩基配列を有する DNAとハイストリンジェント な条件下でハイブリダィズする DNAとしては、 例えば、 配列番号： 88で表わ される塩基配列と約 60%以上、 好ましくは約 70%以上、 より好ましくは約 8 0%以上の相同性を有する塩基配列を含有する DN Aなどが用いられる。
具体的には、 配列番号： 109で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドを コードする DNAとしては、 例えば、 配列番号： 1 10で表わされる塩基配列を 含有する DNA、 または配列番号： 1 10で表わされる塩基配列を有する DNA とハイストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DN Aを有し、 配列番 号： 109で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドと実質的に同質の活性 (例、 本発明の蛋白質に対する結合活性、 本発明の蛋白質を介するシグナル情報 伝達作用など） を有するペプチドをコードする DNAであれば何れのものでもよ い。
配列番号： 110で表わされる塩基配列を含有する DNAとしては、 配列番 号： 1 10または配列番号： 108で表わされる塩基配列を含有する DN A等が 挙げられる。
配列番号： 1 10で表わされる塩基配列を有する DN Aとハイストリンジェン 卜な条件下でハイブリダィズする DN Aとしては、 例えば、 配列番号： 1 10で 表わされる塩基配列と 95%以上、 好ましくは約 97%以上、 より好ましくは約 99 %以上の相同性を有する塩基配列を含有する DNAなどが用いられる。
具体的には、 配列番号： 138、 配列番号： 140または配列番号： 142で 表されるアミノ酸配列を含有するペプチドをコ一ドする DN Aとしては、 例えば、 配列番号： 139、 配列番号： 141または配列番号： 143で表わされる塩基 配列を含有する DNA、 または配列番号： 139、 配列番号： 141または配列 番号： 143で表わされる塩基配列を有する DNAとハイストリンジェントな条 件下でハイブリダィズする DN Aを有し、 配列番号： 138、 配列番号： 140 または配列番号： 142で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドと実質的に 同質の活性 （例、 本発明の蛋白質に対する結合活性、 本発明の蛋白質を介するシ グナル情報伝達作用など） を有するぺプチドをコ一ドする DNAであれば何れの ものでもよい。
配列番号： 139、 配列番号： 141または配列番号： 143で表わされる塩 基配列を含有する DN Aとしては、 配列番号： 133、 配列番号： 135、 配列 番号： 137、 配列番号： 139、 配列番号： 141または配列番号： 143で 表わされる塩基配列を含有する DN A等が挙げられる。
配列番号： 139、 配列番号： 141または配列番号： 143で表わされる塩 基配列を含有する DN Aとハイストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNAとしては、 例えば、 配列番号： 139、 配列番号： 141または配列番 号： 143で表わされる塩基配列と 95 %以上、 好ましくは約 97%以上、 より 好ましくは約 99 %以上の相同性を有する塩基配列を含有する DNAなどが用い られる。
具体的には、 配列番号： 1 9で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドをコ —ドする DNAとしては、 例えば、 配列番号： 20で表わされる塩基配列を含有 する DNA、 または配列番号： 20で表わされる塩基配列を有する DNAとハイ ストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズする DNAを有し、 配列番号： 19 で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドと実質的に同質の活性 （例、 本発明 の蛋白質に対する結合活性、 本発明の蛋白質を介するシグナル情報伝達作用な ど） を有するペプチドをコ一ドする DN Aであれば何れのものでもよい。
配列番号： 20で表わされる塩基配列を含有する DNAとしては、 配列番号： 20または配列番号： 18で表わされる塩基配列を含有する DNA等が挙げられ る。 配列番号： 20で表わされる塩基配列を有する DN Aとハイストリンジェント な条件下でハイブリダィズする DNAとしては、 例えば、 配列番号： 20で表わ される塩基配列と 95 %以上、 好ましくは約 97 %'以上、 より好ましくは約 9 9%以上の相同性を有する塩基配列を含有する DN Aなどが用いられる。
具体的には、 配列番号： 39で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドをコ —ドする DNAとしては、 例えば、 配列番号： 40または配列番号： 57で表わ される塩基配列を含有する DNA、 または配列番号： 40または配列番号： 57 で表わされる塩基配列を有する DN Aとハイストリンジェントな条件下で八イブ リダィズする DNAを有し、 配列番号： 39で表されるアミノ酸配列を含有する ペプチドと実質的に同質の活性 （例、 本発明の蛋白質に対する結合活性、 本発明 の蛋白質を介するシグナル情報伝達作用など） を有するペプチドをコードする D N Aであれば何れのものでもよい。
配列番号： 40または配列番号： 57で表わされる塩基配列を含有する DNA としては、 配列番号： 38、 配列番号： 40、 配列番号： 56または配列番号： 57で表わされる塩基配列を含有する DNA等が挙げられる。
配列番号： 40または配列番号： 57で表わされる塩基配列を有する DN Aと ハイストリンジェントな条件下でハイブリダィズする D N Aとしては、 例えば、 配列番号： 40または配列番号： 57で表わされる塩基配列と 95 %以上、 好ま しくは約 97%以上、 より好ましくは約 99%以上の相同性を有する塩基酉己列を 含有する DN Aなどが用いられる。
また、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする D NAとしては、 例えば、 配列番号： 2または配列番号： 3で表わされる塩基配列 を含有する DNA、 または配列番号： 2または配列番号： 3で表わされる塩基配 列を有する DNAとハイストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNA を有し、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質 の活性 （例、 リガンド結合活性、 シグナル情報伝達作用など） を有する蛋白質を コ一ドする DNAであれば何れのものでもよい。
配列番号： 2または配列番号： 3で表わされる塩基配列を含有する DNAとハ イストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズする DNAとしては、 例えば、 配 列番号： 2または配列番号： 3で表わされる塩基配列と約 90 %以上、 好ましく は約 95%以上、 より好ましくは約 98%以上の相同性を有する塩基配列を含有 する D N Aなどが用いられる。
配列番号： 44で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする DNA としては、 例えば、 配列番号： 43で表わされる塩基配列を含有する DNA、 ま たは配列番号： 43で表わされる塩基配列を有する DNAとハイストリンジェン トな条件下でハイブリダィズする DNAを有し、 配列番号： 44で表されるアミ ノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性 （例、 本発明のペプチドに対す る結合活性、 シグナル情報伝達作用など） を有する蛋白質をコードする DNAで あれば何れのものでもよい。
配列番号： 43で表わされる塩基配列を含有する DN Aとハイストリンジェン 卜な条件下でハイブリダィズする DNAとしては、 例えば、 配列番号： 43で表 わされる塩基配列と約 90%以上、 好ましくは約 95%以上、 より好ましくは約 98 %以上の相同性を有する塩基配列を含有する DN Aなどが用いられる。 配列番号： 51で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする DNA としては、 例えば、 配列番号： 50で表わされる塩基配列を含有する DNA、 ま たは配列番号： 50で表わされる塩基配列を有する DNAとハイストリンジェン 卜な条件下で八イブリダィズする DNAを有し、 配列番号： 51で表されるアミ ノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性 （例、 本発明のペプチドに対す る結合活性、 シグナル情報伝達作用など） を有する蛋白質をコードする DN Aで あれば何れのものでもよい。
配列番号： 50で表わされる塩基配列を含有する DNAとハイストリンジェン 卜な条件下でハイブリダィズする DNAとしては、 例えば、 配列番号： 50で表 わされる塩基配列と約 90%以上、 好ましくは約 95%以上、 より好ましくは約 98 %以上の相同4を有する塩基配列を含有する DN Aなどが用いられる。 配列番号： 52で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする DNA としては、 例えば、 配列番号： 6で表わされる塩基配列を含有する DNA、 また は配列番号： 6で表わされる塩基配列を有する DN Aとハイストリンジェントな 条件下でハイブリダィズする DN Aを有し、 配列番号： 6で表されるアミノ酸配 列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性 （例、 本発明のペプチドに対する結合 活性、 シグナル情報 達作用など） を有する蛋白質をコードする DNAであれば 何れのものでもよい。
配列番号： 6で表わされる塩基配列を含有する DN Aとハイストリンジェン卜 な条件下でハイブリダィズする DNAとしては、 例えば、 配列番号： 6で表わさ れる塩基配列と約 90%以上、 好ましくは約 95%以上、 より好ましくは約 9 8%以上の相同性を有する塩基配列を含有する DN Aなどが用いられる。
配列番号： 53で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする DNA としては、 例えば、 配列番号： 63で表わされる塩基配列を含有する DNA、 ま たは配列番号： 63で表わされる塩基配列を有する DN Aとハイストリンジェン 卜な条件下でハイブリダィズする DNAを有し、 配列番号： 63で表されるアミ ノ酸配列を有する蛋白質と実質的に同質の活性 （例、 本発明のペプチドに対する 結合活性、 シグナル情報伝達作用など） を有する蛋白質をコードする DNAであ れば何れのものでもよい。
配列番号： 63で表わされる塩基配列を含有する DNAとハイストリンジェン 卜な条件下でハイブリダィズする DNAとしては、 例えば、 配列番号： 63で表 わされる塩基配列と約 95%以上、 好ましくは約 97%以上、 より好ましくは約 98%以上の相同性を有する塩基配列を含有する DN Aなどが用いられる。 配列番号： 54で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする DNA としては、 例えば、 配列番号： 64で表わされる塩基配列を含有する DNA、 ま たは配列番号： 64で表わされる塩基配列を有する DNAとハイストリンジェン トな条件下でハイブリダィズする DNAを有し、 配列番号： 64で表されるアミ ノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性 （例、 本発明のペプチドに対す る結合活性、 シグナル情報伝達作用など） を有する蛋白質をコードする DN Aで あれば何れのものでもよい。
配列番号： 64で表わされる塩基配列を含有する DN Aとハイストリンジェン トな条件下でハイブリダィズする DNAとしては、 例えば、 配列番号： 64で表 わされる塩基配列と約 95%以上、 好ましくは約 97%以上、 より好ましくは約 98%以上の相同性を有する塩基配列を含有する D N Aなどが用いられる。 配列番号： 1 Ί 1で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする DN Aとしては、 例えば、 配列番号： 1 72で表わされる塩基配列を含有する DNA、 または配列番号： 1 72で表わされる塩基配列を有する DNAとハイストリンジ ェントな条件下でハイブリダィズする DN Aを有し、 配列番号： 17 1で表され るアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性 （例、 本発明のペプチド に対する結合活性、 シグナル情報伝達作用など） を有する蛋白質をコードする D N Aであれば何れのものでもよい。
配列番号： 1 72で表わされる塩基配列を含有する DNAとハイストリンジェ ントな条件下でハイブリダィズする DNAとしては、 例えば、 配列番号： 1 72 で表わされる塩基配列と 95%以上、 好ましくは約 97%以上、 より好ましくは 約 99%以上の相同性を有する塩基配列を含有する DNAなどが用いられる。
配列番号： 173で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする DN Aとしては、 例えば、 配列番号： 1 74で表わされる塩基配列を含有する DNA、 または配列番号： 174で表わされる塩基配列を有する DNAとハイストリンジ ェントな条件下でハイブリダィズする DNAを有し、 配列番号： 1 73で表され るアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性 （例、 本発明のペプチド に対する結合活性、 シグナル情報伝達作用など） を有する蛋白質をコードする D N Aであれば何れのものでもよい。
配列番号： 1 74で表わされる塩基配列を含有する DNAとハイストリンジェ ントな条件下でハイブリダィズする DNAとしては、 例えば、 配列番号： 1 74 で表わされる塩基配列と 95%以上、 好ましくは約 97%以上、 より好ましくは 約 99%以上の相同性を有する塩基配列を含有する DN Aなどが用いられる。
ハイブリダィゼーシヨンは、 自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例え ば、 モレキュラー 'クローニング （Molecular Cloning) 2 nd (J. Sambrook et al.， Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行 なうことができる。 また、 市販のライブラリーを使用する場合、 添付の使用説明 書に記載の方法に従って行なうことができる。 より好ましくは、 ハイストリンジ ェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェン卜な条件とは、 例えば、 ナトリウム濃度が約 1 9〜40m M、 好ましくは約 19〜 20 mMで、 温度が約 50〜 70 °C、 好ましくは約 60 〜 65 の条件を示す。 特に、 ナトリゥム濃度が約 19 mMで温度が約 65での 場合が最も好ましい。
より具体的には、 配列番号： 81で表わされるアミノ酸配列を含有するべプチ ドをコードする DNAとしては、 配列番号： 87で表わされる塩基配列を含有す る DNAがあげられ、 配列番号： 82で表わされるアミノ酸配列を含有するぺプ チドをコードする DNAとしては、 配列番号： 88で表わされる塩基配列を含有 する DNAがあげられ、 配列番号： 83で表わされるアミノ酸配列を含有するべ プチドをコードする DNAとしては、 配列番号： 89で表わされる塩基配列を含 有する DNAがあげられ、 配列番号： 84で表わされるアミノ酸配列を含有する ペプチドをコードする DNAとしては、 配列番号： 90で表わされる塩基配列を 含有する DNAがあげられ、 配列番号： 109で表わされるアミノ酸配列を含有 するペプチドをコードする DNAとしては、 配列番号： 110で表わされる塩基 配列を含有する DNAがあげられ、 配列番号： 107で表わされるアミノ酸配列 を含有するペプチドをコ一ドする DNAとしては、 配列番号： 108で表わされ る塩基配列を含有する DNAがあげられ、 配列番号： 138で表わされるァミノ 酸配列を含有するペプチドをコードする DNAとしては、 配列番号： 139で表 わされる塩基配列を含有する DNAがあげられ、 配列番号： 140で表わされる アミノ酸配列を含有するペプチドをコードする DNAとしては、 配列番号： 14 1で表わされる塩基配列を含有する DN Aがあげられ、 配列番号： 142で表わ されるアミノ酸配列を含有するペプチドをコードする DN Aとしては、 配列番 号： 143で表わされる塩基配列を含有する DNAがあげられ、 配列番号： 13 2で表わされるァミノ酸配列を含有するペプチドをコードする D N Aとしては、 配列番号： 133で表わされる塩基配列を含有する DNAがあげられ、 配列番 号： 134で表わされるアミノ酸配列を含有するペプチドをコードする DNAと しては、 配列番号： 135で表わされる塩基配列を含有する DN Aがあげられ、 配列番号： 136で表わされるアミノ酸配列を含有するペプチドをコードする D NAとしては、 配列番号： 137で表わされる塩基配列を含有する DNAがあげ られ、 配列番号： 19で表わされるアミノ酸配列を含有するペプチドをコードす る DNAとしては、 配列番号： 20で表わされる塩基配列を含有する DN Aがあ げられ、 配列番号： 1 7で表わされるアミノ酸配列を含有するペプチドをコード する DNAとしては、 配列番号： 1 8で表わされる塩基配列を含有する DNAが あげられ、 配列番号： 39で表わされるアミノ酸配列を含有するペプチドをコ一 ドする DNAとしては、 配列番号： 40または配列番号： 57で表わされる塩基 配列を含有する DNAがあげられ、 配列番号： 37で表わされるアミノ酸配列を 含有するペプチドをコードする DNAとしては、 配列番号： 38で表わされる塩 基配列を含有する DNAがあげられ、 配列番号： 55で表わされるアミノ酸配列 を含有するペプチドをコードする DNAとしては、 配列番号： 56で表わされる 塩基配列を含有する DN Aがあげられる。
また、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする DNAとしては、 配列番号： 2または配列番号： 3で表わされる塩基配列を含有 する DNAがあげられ、 配列番号： 44で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋 白質をコードする DNAとしては、 配列番号： 43で表わされる塩基配列を含有 する DNAがあげられ、 配列番号： 51で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋 白質をコードする DNAとしては、 配列番号： 50で表わされる塩基配列を含有 する DNAがあげられ、 配列番号： 52で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋 白質をコードする DNAとしては、 配列番号： 6で表わされる塩基配列を含有す る DNAがあげられ、 配列番号： 53で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋白 質をコードする DNAとしては、 配列番号： 63で表わされる塩基配列を含有す る DNAがあげられ、 配列番号： 54で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋白 質をコードする DNAとしては、 配列番号： 64で表わされる塩基配列を含有す る DNAがあげられ、 配列番号： 1 71で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋 白質をコードする DNAとしては、 配列番号： 172で表わされる塩基配列を含 有する DNAがあげられ、 配列番号： 1 73で表わされるアミノ酸配列を含有す る蛋白質をコードする DNAとしては、 配列番号： 1 74で表わされる塩基配列 を含有する DN Aがあげられる。
本発明のペプチドをコードする DNAの塩基配列と相補的な塩基配列またはそ の一部を含有してなるヌクレオチド （オリゴヌクレオチド） とは、 本発明のぺプ チドをコードする D N Aを包含するだけではなく、 R N Aをも包含する意味で用 いられる。
本発明に従えば、 本発明のペプチドの遺伝子の複製又は発現を阻害することの できるアンチセンス · （オリゴ） ヌクレオチド （核酸） を、 クローン化したある いは決定されたべプチドをコ一ドする D N Aの塩基配列の塩基配列情報に基づき 設計し、 合成しうる。 そうした （オリゴ） ヌクレオチド （核酸） は、 本発明のぺ プチドの遺伝子の R N Aとハイブリダイズすることができ、 該 R N Aの合成又は 機能を阻害することができるか、 あるいは本発明のぺプチド関連 R N Aとの相互 作用を介して本発明のペプチドの遺伝子の発現を調節 ·制御することができる。 本発明のペプチド関連 R NAの選択された配列に相補的な （オリゴ） ヌクレオチ ド、 及び本発明のペプチド関連 R N Aと特異的にハイブリダイズすることができ る （オリゴ） ヌクレオチドは、 生体内及び生体外で本発明のペプチドの遺伝子の 発現を調節 ·制御するのに有用であり、 また病気などの治療又は診断に有用であ る。
用語 「対応する」 とは、 遺伝子を含めたヌクレオチド、 塩基配列又は核酸の特 定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。 ヌクレオチド、 塩基配列又は核酸とペプチドとの間で 「対応する」 とは、 ヌクレオチド （核酸） の配列又はその相補体から誘導される指令にあるペプチドのアミノ酸を通常指し ている。 本発明のペプチドの遺伝子の 5 ' 端ヘアピンループ、 5 ' 端 6—ベース ペア， リピート、 5 ' 端非翻訳領域、 ポリペプチド翻訳開始コドン、 蛋白質コ一 ド領域、 O R F翻訳終止コドン、 3 ' 端非翻訳領域、 3 ' 端パリンドローム領域、 及び 3 ' 端ヘアピンループは好ましい対象領域として選択しうるが、 本発明のぺ プチドの遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。
目的核酸と、 対象領域の少なくとも一部に相補的な （オリゴ） ヌクレオチドと の関係は、 対象物とハイブリダィズすることができる （オリゴ） ヌクレオチドと の関係は、 「アンチセンス」 であるということができる。 アンチセンス ' （オリ ゴ） ヌクレオチドは、 2—デォキシ—D—リポースを含有しているポリデォキシ ヌクレオチド、 D—リポースを含有しているポリデォキシヌクレオチド、 プリン 又はピリミジン塩基の N—グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、 あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー （例えば、 市販の蛋白質 核酸及び合成配列特異的な核酸ポリマー） 又は特殊な結合を含有するその他のポ リマー （但し、 該ポリマーは D NAや R NA中に見出されるような塩基のペアリ ナグゃ塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する） などが挙げら れる。 それらは、 2本鎖 D NA、 1本鎖 D NA、 2本鎖 R N A、 1本鎖 R N A、 さらに D NA : R NAハイブリッドであることができ、 さらに非修飾ポリヌクレ ォチド又は非修飾オリゴヌクレオチド、 さらには公知の修飾の付加されたもの、 例えば当該分野で知られた標識のあるもの、 キャップの付いたもの、 メチル化さ れたもの、 1個以上の天然のヌクレオチドを類緣物で置換したもの、 分子内ヌク レオチド修飾のされたもの、 例えば非荷電結合 （例えば、 メチルホスホネート、 ホスホトリエステル、 ホスホルアミデート、 力ルバメートなど） を持つもの、 電 荷を有する結合又は硫黄含有結合 （例えば、 ホスホロチォエート、 ホスホロジチ ォエートなど） を持つもの、 例えば蛋白質 （ヌクレアーゼ、 ヌクレア一ゼ*イン ヒビ夕一、 トキシン、 抗体、 シグナルペプチド、 ポリ— L一リジンなど） や糖 (例えば、 モノサッカライドなど） などの側鎖基を有しているもの、 イン夕一力 レント化合物 （例えば、 ァクリジン、 プソラレンなど） を持つもの、 キレート化 合物 （例えば、 金属、 放射活性をもつ金属、 ホウ素、 酸化性の金属など） を含有 するもの、 アルキル化剤を含有するもの、 修飾された結合を持つもの （例えば、 ひァノマ一型の核酸など） であってもよい。 ここで 「ヌクレオシド j 、 「ヌクレ ォチド」 及び 「核酸」 とは、 プリン及びピリミジン塩基を含有するのみでなく、 修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。 こうした 修飾物は、 メチル化されたプリン及びピリミジン、 ァシル化されたプリン及びピ リミジン、 あるいはその他の複素環を含むものであってよい。 修飾されたヌクレ ォチド及び修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、 例えば 1個以上の水酸基がハロゲンとか、 脂肪族基などで置換されていたり、 あるいは ェ一テル、 ァミンなどの官能基に変換されていてよい。
本発明のアンチセンス核酸は、 R NA、 D NA、 あるいは修飾された核酸であ る。 修飾された核酸の具体例としては核酸の硫黄誘導体ゃチォホスフェート誘導 体、 そしてポリヌクレオシドアミドゃオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性 のものが挙げられるが、 それに限定されるものではない。 本発明のアンチセンス 核酸は次のような方針で好ましく設計されうる。 すなわち、 細胞内でのアンチセ ンス核酸をより安定なものにする、 アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、 目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、 そしてもし毒性が あるならアンチセンス核酸の毒性をより小さなものにする。
こうして修飾は当該分野で数多く知られており、 例えば J. Kawakami et ah , Pharm Tech J apan, Vo l . 8, pp. 247, 1992 ; Vo l . 8, pp. 395, 1992 ; S. T.
Crooke et a l . ed. , An t i sense Research and Appl i cat i ons, CRC Press, 1993 などに開示がある。
本発明のアンチセンス核酸は、 変化せしめられたり、 修飾された糖、 塩基、 結 合を含有していて良く、 リボゾーム、 ミクロスフエアのような特殊な形態で供与 されたり、 遺伝子治療により適用されたり、 付加された形態で与えられることが できうる。 こうして付加形態で用いられるものとしては、 リン酸基骨格の電荷を 中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、 細胞膜との相互作用を 高めたり、 核酸の取込みを増大せしめるような脂質 （例えば、 ホスホリピッド、 コレステロールなど） といった粗水性のものが挙げられる。 付加するに好ましい 脂質としては、 コレステロールやその誘導体 （例えば、 コレステリルクロ口ホル メート、 コール酸など） が挙げられる。 こうしたものは、 核酸の 3 ' 端あるいは 5 ' 端に付着させることができ、 塩基、 糖、 分子内ヌクレオシド結合を介して付 着させることができうる。 その他の基としては、 核酸の 3 ' 端あるいは 5 ' 端に 特異的に配置されたキャップ用の基で、 ェキソヌクレア一ゼ、 R N a s eなどの ヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。 こうしたキャップ 用の基としては、 ポリエチレングリコール、 テトラエチレングリコールなどのグ リコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、 そ れに限定されるものではない。
アンチセンス核酸の阻害活性は、 本発明の形質転換体、 本発明の生体内や生体 外の遺伝子発現系、 あるいは蛋白質の生体内や生体外の翻訳系を用いて調べるこ とができる。 該核酸それ自体公知の各種の方法で細胞に適用できる。
本発明の部分べプチドをコードする D N Aとしては、 前述した本発明の部分べ プチドをコ一ドする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよ レ^ また、 ゲノム DNA、 ゲノム DNAライブラリ一、 前記した細胞 ·組織由来 の cDNA、 前記した細胞 ·組織由来の c DNAライブラリー、 合成 DNAのい ずれでもよい。 ライブラリーに使用するべクタ一は、 バクチリオファージ、 プラ スミド、 コスミド、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また、 前記した細 胞 ·組織より mRNA画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reactionによって増幅することもできる。
具体的には、 本発明の部分ペプチドをコードする DNAとしては、 例えば、 配 列番号： 2、 配列番号： 3、 配列番号： 43、 配列番号： 50、 配列番号： 6、 配列番号： 63、 配列番号： 64、 配列番号： 172または配列番号： 174で 表わされる塩基配列を含有する D N Aの部分塩基配列を有する DNA、 または
(ii) 配列番号： 2、 配列番号： 3、 配列番号： 43、 配列番号： 50、 配列番 号： 6、 配列番号： 63、 配列番号： 64、 配列番号： 172または配列番号： 174で表わされる塩基配列を含有する DNAとハイストリンジェン卜な条件下 でハイブリダィズする DNAを有し、 本発明の蛋白質と実質的に同質の活性 （例、 本発明のペプチドに対する結合活性、 シグナル情報伝達作用など） を有する蛋白 質をコードする DN Aの部分塩基配列を有する DN Aなどが用いられる。
配列番号： 2、 配列番号： 3、 配列番号： 43、 配列番号： 50、 配列番号： 6、 配列番号： 63、 配列番号： 64、 配列番号： 172または配列番号： 17 4で表わされる塩基配列を有する DNAとハイストリンジェントな条件下でハイ ブリダィズする DNAとしては、 例えば、 配列番号： 2、 配列番号： 3、 配列番 号： 43、 配列番号： 50、 配列番号： 6、 配列番号： 63、 配列番号： 64、 配列番号： 172または配列番号： 174で表わされる塩基配列と約 90 %以上、 好ましくは約 95%以上、 より好ましくは約 98%以上の相同性を有する塩基配 列を含有する DN Aなどが用いられる。
本発明のペプチドを完全にコ一ドする DNAのクローニングの手段としては、 ' 本発明のペプチドをコードする DNAの塩基配列の部分塩基配列を有する合成 D NAプライマーを用いて PC R法によって増幅するか、 または適当なベクタ一に 組み込んだ DN Aを本発明のペプチドの一部あるいは全領域をコ一ドする DNA 断片もしくは合成 DN Aを用いて標識したものとのハイブリダィゼ一シヨンによ つて選別することができる。 ハイブリダィゼ一シヨンの方法は、 例えば、 モレキ ユラ一 .クロ—ニング (Molecular Cloning) 2 nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうこと ができる。 また、 市販のライブラリ一を使用する場合、 添付の使用説明書に記載 の方法に従って行なうことができる。
本発明の蛋白質またはその部分ペプチド （以下、 本発明の蛋白質と略記する） を完全にコードする DN Aのクローニングも本発明のペプチドを完全にコードす る DN Aのクローニングと同様にして行うことができる。
DNAの塩基配列の変換は、 PCRや公知のキット、 例えば、 Mutan™- super Express Km (宝酒造 （株） ） 、 Mutan™- K (宝酒造 （株） ） 等を用いて、 0DA - LA PCR法、 Gupped duplex法、 Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる 方法に従って行なうことができる。
クローン化されたペプチド ·蛋白質をコードする DN Aは目的によりそのまま、 または所望により制限酵素で消化したり、 リンカーを付加したりして使用するこ とができる。 該 DNAはその 5， 末端側に翻訳開始コドンとしての ATGを有し、 また 3， 末端側には翻訳終止コドンとしての TAA、 TGAまたは TAGを有し ていてもよい。 これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、 適当な合成 DNA アダプタ一を用いて付加することもできる。
本発明のペプチド ·蛋白質の発現ベクターは、 例えば、 （ィ） 本発明のぺプチ ド ·蛋白質をコードする DNAから目的とする DNA断片を切り出し、 （口） 該 DN A断片を適当な発現ベクター中のプロモ一夕一の下流に連結することにより 製造することができる。
ベクタ一としては、 大腸菌由来のプラスミド （例、 pBR322， p BR 32 5, pUC 12, pUC 13) 、 枯草菌由来のプラスミド （例、 pUB 1 10, pTP 5, pC 194) 、 酵母由来プラスミド （例、 p SH 19, p SH 1 5) 、 λファージなどのバクチリオファージ、 レトロウイルス， ワクシニアウィルス， バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどの他、 pAl— 1 1、 pXT l、 p R c/CMV, pRcZRSV、 p cDNA I/Ne o、 p c DNA 3. 1、 D R cZCMV2、 pRc/RSV (Invi trogen社） などが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、 遺伝子の発現に用いる宿主に対応 して適切なプロ 一ターであればいかなるものでもよい。 例えば、 動物細胞を宿 主として用いる場合は、 SRaプロモー夕一、 SV40プロモータ一、 H I V- LTRプロモー夕一、 CMVプロモー夕一、 HSV-TKプロモーターなどが挙 げられる。
これらのうち、 CMVプロモーター、 S Rひプロモーターなどを用いるのが好 ましい。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 t r pプロモーター、 l a cプ 口モー夕一、 r e cAプロモー夕一、 APLプロモーター、 l ppプロモーター などが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 S P〇 1プロモータ一、 S P〇 2プ 口モーター、 p e npプロモーターなど、 宿主が酵母である場合は、 PH05プ 口モーター、 PGKプロモーター、 GAPプロモーター、 ADHプロモーターな どが好ましい。 宿主が昆虫細胞である場合は、 ポリヘドリンプロモーター、 P 1 0プロモーターなどが好ましい。
発現べクタ一には、 以上の他に、 所望によりェンハンサー、 スプライシングシ ダナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカー、 SV40複製オリジン （以下、 S V40 o r iと略称する場合がある） などを含有しているものを用いることがで きる。 選択マーカーとしては、 例えば、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （以下、 dh f r と略称する場合がある） 遺伝子 〔メソトレキセート （MTX) 耐性〕 、 アンピシ リン耐性遺伝子 （以下、 Amp1"と略称する場合がある） 、 ネオマイシン耐性遺 伝子 （以下、 Ne o1"と略称する場合がある、 G418耐性） 等が挙げられる。 特に、 CHO (dh f r— ) 細胞を用いて dh f r遺伝子を選択マーカ一として 使用する場合、 目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 本発明の蛋白質の N端末 側に付加する。 宿主がェシェリヒア属菌である場合は、 P h o A · シグナル配列、 Omp A ·シグナル配列などが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 ひ—アミラ 一ゼ*シグナル配列、 サブチリシン ·シグナル配列などが、 宿主が酵母である場 合は、 MFa ·シグナル配列、 SUC2 ·シグナル配列など、 宿主が動物細胞で ある場合には、 インシュリン 'シグナル配列、 ひ一インターフェロン 'シグナル 配列、 抗体分子 ·シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のペプチド ·蛋白質をコードする DNAを含 有するベクターを用いて、 形質転換体を製造することができる。
宿主としては、 例えば、 ェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫細胞、 昆虫、 動物細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌の具体例としては、 ェシエリヒア 'コリ （Escherichia coli) K 1 2 · DH 1 〔プロシ一ジングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·ァ力デミ — 'ォブ ·サイェンシィズ 'ォブ ·ザ ·ユーエスエー （Proc. Natl. Acad. . Sci. USA) , 60巻， 160 (1 968)〕 ， J M 103 〔ヌクイレック ·ァシッ ズ ' リサーチ （Nucleic Acids Research) ， 9卷， 309 (1981)〕 ， JA2 2 1 〔ジャーナル 'ォブ 'モレキュラー 'バイオロジー （Journal of Molecular Biology) ， 120巻， 5 1 7 ( 1978) 〕 ， ΗΒ 10 1 〔ジャーナル ·ォブ · モレキュラー 'バイオロジー， 41巻， 459 (1969)〕 ， C 600 〔ジエネ ティックス （Genetics) ， 39卷， 440 (1954)〕 などが用いられる。
バチルス属菌としては、 例えば、 バチルス ·サチルス （Bacillus subtilis) M I 1 14 〔ジーン， 24巻， 255 (1 983)〕 ， 207— 2 1 〔ジャーナ ル ·ォブ ·バイオケミストリー （Journal of Biochemistry) ， 95巻， 87 (1 984)〕 などが用いられる。
酵母としては、 例えば、 サッカロマイセス セレピシェ （Saccharomyces cerevisiae) AH 22， AH22R—, NA 87 - 1 1 A, DKD— 5D, 20 B_ 12、 シゾサッカロマイセス ボンべ (Schizosaccharomyces pombe) N C YC 19 1 3, NCYC 2036, ピキア パストリス （Pichia pastoris) な どが用いられる。
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが Ac NPVの場合は、 夜盗蛾の幼虫由 来株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell； S f細胞) 、 Tr ichoplusia niの中 腸由来の MG 1細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High Five™細胞、 Mamestra brassicae由来の細胞または Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。 ウイ ルスが BmNP Vの場合は、 蚕由来株化細胞 （Bombyx mori N； BmN細胞） な どが用いられる。 該 S f細胞としては、 例えば、 S f 9細胞 （ATCC CRL1711) 、 S f 21細胞 （以上、 Vaughn, J.L.ら、 イン 'ヴイボ （In Vivo) , 13, 213- 217, (1977)) などが用いられる。
昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、 ネイチヤー
(Nature) , 31 5巻， 592 (1985)〕 。
動物細胞としては、 例えば、 サル細胞 COS— 7， Ve r o, チャイニーズハ ムスター細胞 CHO (以下、 CHO細胞と略記） ， dh f r遺伝子欠損チヤィニ ーズハムスター細胞 CHO (以下、 CHO (dh f r— ) 細胞と略記） ， マウス L細胞， マウス A t T— 20， マウスミエローマ細胞， ラット GH3, ヒト FL 細胞などが用いられる。
ェシェリヒア属菌を形質転換するには、 例えば、 プロシージングズ ·ォブ · ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンジィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスエー
(Pro atl. Acad. Sci. USA) ， 69巻， 2110 ( 1972 )やジーン (Gene) ， 17巻， 107 (1982)などに記載の方法に従って行なうことがで きる。
バチルス属菌を形質転換するには、 例えば、 モレキュラー ·アンド ·ジエネラ ル ·ジエネティックス （Molecular & General Genetics) , 168卷， 1 1 1 (1979)などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、 例えば、 メッソズ'イン ·ェンザィモロジ一 (Methods in Enzymology) , 194巻， 182— 187 (1991) 、 プロシ —ジングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォ ブ.ザ.ュ—エスエー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 75巻， 1929 (1
978) などに記載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、 例えば、 バイオ テクノロジー (Bio/Technology) ,6, 47-55 (1988) などに記載の方法に従って行なうことがで きる。
動物細胞を形質転換するには、 例えば、 細胞工学別冊 8 新 細胞工学実験プ ロトコール. 2632-67 ( 1995) (秀潤社発行） 、 ヴイロロジー
(Virology) , 52巻， 456 ( 1973 )に記載の方法に従って行なうことがで きる。 このようにして、 G蛋白質共役型蛋白質をコードする DNAを含有する発現べ クタ一で形質転換された形質転換体が得られる。
宿主がェシエリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培養 に使用される培地としては液体培地が適当であり、 その中には該形質転換体の生 育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物その他が含有せしめられる。 炭素源としては、 例えば、 グルコース、 デキストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖など、 窒素源としては、 例えば、 アンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コーンスチープ · リカー、 ペプトン、 力 ゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液などの無機または有機物質、 無機 物としては、 例えば、 塩化カルシウム、 リン酸二水素ナトリウム、 塩化マグネシ ゥムなどが挙げられる。 また、 酵母エキス、 ビタミン類、 生長促進因子などを添 加してもよい。 培地の pHは約 5〜8が望ましい。
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えば、 グルコース、 カザミ ノ酸を含む M9培地 〔ミラ一 （Miller) , ジャーナル ·ォブ ·ェクスペリメン ッ · ン 'モレキュラー ·ンェ不ティックス (Journal oi Experiments in Molecular Genetics) , 43 1—433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1 97 2) が好ましい。 ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせ るために、 例えば、 3 )3—インドリル アクリル酸のような薬剤を加えることが できる。 宿主がェシエリヒア属菌の場合、 培養は通常約 1 5〜43°Cで約 3〜 24時間行ない、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 30〜 40 °Cで約 6〜 24時間行な レ 必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 バークホ 一ルダー （Burkholder) 最小培地 〔Bostian, K. L. ら、 プロシージングズ .ォ ブ.ザ ·ナショナル .アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ .ザ ·ユーエス エー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 77巻， 4505 (1 980)〕 や 0.
5%カザミノ酸を含有する SD培地 GBitter, G. A. ら、 プロシージングズ -ォ ブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ'ユーエス ェ一 （Pro atl. Acad. . Sci. USA) , 8 1巻， 5330 (1984) 〕 が挙 げられる。 培地の pHは約 5〜8に調整するのが好ましい。 培養は通常約 20 〜35 :で約 24〜72時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、 培地としては、 Grace s Insect Medium (Grace, T. ，ネィチヤ一
(Nature) ,195,788 (1962)) に非動化した 10 %ゥシ血清等の添加物を適宜加え たものなどが用いられる。 培地の pHは約 6. 2〜6. 4に調整するのが好まし い。 培養は通常約 27 °Cで約 3〜5日間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加え る。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 約 5 〜20 %の胎児牛血清を含む MEM培地 〔サイエンス （Science) , 122巻， 501 (1952)〕 ， DMEM培地 〔ヴイロロジ一 （Virology) , 8巻， 396 (1959)〕 ， RPM I 1640培地 〔ジャーナル ·ォブ ·ザ ·アメリカン · メディカル ·アソシエーション (The Journal of the American Medical Association) 199巻， 519 (1967)〕 ， 1 99培地 〔プロシージング' ォブ ·ザ ·ソサイエティ ·フォー ·ザ ·バイオロジカル ·メディスン
(Proceeding of the Society for the Biological Medicine) ， 73巻， 1 (1 950)〕 などが用いられる。 pHは約 6〜8であるのが好ましい。 培養は通常 約 30〜40°Cで約 15〜60時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。 以上のようにして、 形質転換体の細胞内、 細胞膜または細胞外に本発明のぺプ チド ·蛋白質を生成せしめることができる。
上記培養物から本発明のペプチド ·蛋白質を分離精製するには、 例えば、 下記 の方法により行なうことができる。
本発明のペプチド ·蛋白質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、 培養後、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩衝液に懸濁し、 超音波、 リゾチームおよび または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破 壊したのち、 遠心分離やろ過により蛋白質の粗抽出液を得る方法などが適宜用い られる。 緩衝液の中に尿素や塩酸グァニジンなどの蛋白質変性剤や、 トリトン X 一 100TMなどの界面活性剤が含まれていてもよい。 培養液中にペプチド ·蛋白 質が分泌される場合には、 培養終了後、 それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞 と上清とを分離し、 上清を集める。 このようにして得られた培養上清、 あるいは抽出液中に含まれるペプチド -蛋 白質の精製は、 自体公知の分離 ·精製法を適切に組み合わせて行なうことができ る。 これらの公知の分離、 精製法としては、 塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を利 用する方法、 透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法、 および S D S _ポリアクリルァ ミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、 イオン交換クロ マトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、 ァフィ二ティーク口マトグラフ ィーなどの特異的親和性を利用する方法、 逆相高速液体クロマトグラフィーなど の疎水性の差を利用する方法、 等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方 法などが用いられる。
かくして得られるペプチド ·蛋白質が遊離体で得られた場合には、 自体公知の 方法あるいはそれに準じる方法によつて塩に変換することができ、 逆に塩で得ら れた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、 遊離体または他 の塩に変換することができる。
なお、 組換え体が産生するペプチド ·蛋白質を、 精製前または精製後に適当な 蛋白修飾酵素を作用させることにより、 任意に修飾を加えたり、 ペプチド ·ポリ ペプチドを部分的に除去することもできる。 蛋白修飾酵素としては、 例えば、 ト リプシン、 キモトリブシン、 アルギニルエンドべプチダーゼ、 プロテインキナー ゼ、 グリコシダーゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明のペプチドの活性は、 標識した本発明のペプチドと本 発明の蛋白質との結合実験および特異抗体を用いたェンザィムィムノアツセィな どにより測定することができる。
また、 生成する本発明の蛋白質の活性は、 標識した本発明のペプチドとの結合 実験および特異抗体を用いたェンザィムィムノアッセィなどにより測定すること ができる。
また、 本発明のペプチドは、 遺伝子工学的に原核細胞宿主中で発現させ、 レド ックスバッファ一中でリフォ一ルディングして活性型のペプチドとして製造して もよい。 詳細を以下に述べる。
本発明のペプチドが宿主原核細胞中で不溶成分 （封入体） を形成する場合には、 培養後、 遠心分離等の方法により集菌した後、 細胞を破砕し、 封入体を変性剤を 用いて可溶化することによって、 本発明のぺプチドを抽出することができる。
細胞の破砕は、 常法で、 たとえば超音波処理により実施できる。 懸濁媒体とし て中性付近の p H値 （p H 6 . 5〜7 . 5 ) に調整した好適な緩衝液 （例えばリ ン酸緩衝液等） を用いることが好ましい。 この際、 細胞の破碎を促進させるため E D T Aを添加してもよい。 このようにして細胞を破砕した後に、 不溶成分 （封 入体） を任意の方法で、 遠心分離するか、 濾過することにより分取する。 原核細 胞由来の蛋白質をできる限り除去するため、 たとえば水、 リン酸緩衝液を用いて 洗浄することが好ましいが、 場合により 4 M程度の尿素で洗浄してもよい。
得られた沈殿 （ペレット） を変性剤を用いて可溶化する際の変性剤としては、 公知の変性剤、 特にグァニジンまたは尿素等を使用することができる。 変性剤は 通常水溶液として用いられ、 水溶液中の変性剤の濃度は、 グァニジンでは 4〜 8 モル/リットル、 好ましくは約 6〜 7モルノリットル、 尿素では 5〜 9モル Zリ ットル、 好ましくは約 8モル Zリットルである。 グァニジンは通常グァニジン塩 酸塩等のグァニジンの酸付加塩として用いられる。
本発明のペプチドが宿主原核細胞中で封入体を形成しない場合には、 培養後、 遠心分離等の方法により集菌した後、 細胞を変性剤を用いて可溶化するか、 ある いは細胞を破砕後変性剤で可溶化することによって本発明のペプチドを抽出する ことができる。
集菌した細胞の可溶化に用いられる変性剤としては、 例えばグァニジンまたは 尿素などが挙げられる。 変性剤は通常水溶液として用いられ、 水溶液中の変性剤 の濃度は、 グァニジンでは通常 4〜 8モルノリットル、 好ましくは約 6〜 7モル /リットルである。 グァニジンは通常グァニジン塩酸塩等のグァニジンの酸付加 塩として用いられる。
細胞の破砕は、 常法で、 たとえば超音波処理、 フレンチ ·プレスにより実施で きる。 破砕された細胞の可溶化に用いられる変性剤としては、 公知の変性剤を使 用してよく、 好ましくは、 グァニジンまたは尿素などを使用する。 変性剤は通常、 水溶液として用いられ、 水溶液中の変性剤の濃度は、 グァニジンでは 4〜 8モル /リットル、 好ましくは約 6〜 7モル リットル、 尿素では 5〜 9モル Zリット ル、 好ましくは約 8モル Zリットルである。 グァニジンは通常グァニジン塩酸塩 等のグァニジンの酸付加塩として用いられる。
上記のようにして封入体の可溶化を行うか、 菌体を変性剤で直接可溶化するか、 または細胞を破砕後変性剤で可溶化した後、 遠心分離等で不純物を除去し、 得ら れた上澄液を必要により精製工程に付した後、 本発明のペプチドのリフォールデ イング （活性化、 再生化） を行う。
リフォールディングは、 精製した本発明のペプチドにレドックスバッファ一を 添加するか、 または本発明のぺプチドを含有する上澄液をレドックスバッファー で希釈することにより行われる。
レドックスバッファ一としては、 酸化型ダルタチオン （GS SG) および還元 型ダル夕チオン （GSH) を含有する緩衝液、 システィンおよびシスチンを含有 する緩衝液、 システアミンおよびシス夕ミンを含有する緩衝液などが挙げられる。 中でも GS SGおよび GSHを含有する緩衝液が好ましい。 上記緩衝液としては、 例えば、 トリス緩衝液、 リン酸緩衝液、 酢酸緩衝液、 クェン酸緩衝液等が挙げら れ、 中でもトリス緩衝液等が好ましい。
レドックスバッファ一中の酸化剤 （酸化型物質） および還元剤 （還元型物質） の濃度は、 例えば、 それぞれ 0. 01〜 100ミリモル Zリットルおよび 0. 0 ：!〜 100ミリモル/リットルである。 より具体的には、 GS SGおよび GSH を用いる場合、 レドックスバッファ一中の GS SGの濃度は 0. 01〜100ミ リモル Zリットル、 好ましくは 0. 1〜 10ミリモル Zリットル、 好ましくは 0. 1〜1. 0ミリモル リットルが用いられ、 GSHの濃度は 0. 01〜； 100ミ リモル/リットル、 好ましくは 0. 1 ~ 10ミリモル リットル、 好ましくは 0. 2〜2. 0ミリモル リットルが用いられる。
この際、 たとえばメルカブト基を有さないアミノ酸などをレドックスバッファ 一にさらに含有させておくことが好ましい。 本発明のペプチドを含有する上澄液 をレドックスバッファ一で希釈する場合、 変性剤の濃度を活性化に適した中性 p Hにおいて不作用濃度まで希釈することが好ましい。 たとえば変性剤としてグァ ジニンを使用する場合、 希釈液中のグァニジンの濃度を 0〜2. 0モル Zリット ル、 好ましくは約 1モルノリットル以下まで、 変性剤として尿素を使用する場合、 希釈液中の尿素の濃度を 0〜 4. 0モル リットル、 好ましくは約 2モル/リツ トル以下まで希釈することが望ましい。
上記メルカプト基を有さないアミノ酸としては、 例えばアルギニン、 ァスパラ ギン酸、 ノ X'リン、 リジン、 ァラニン、 シトルリン等が挙げられる。 アルギニン等 が収率の点で好ましい。 レドックスバッファ一中の該アミノ酸の添加濃度は、 0 1〜1. 0モル リットル、 好ましくは 0. 2〜0. 8モル/リットルである。 上記リフォ一ルディングに当っての温度は 0〜30°C、 好ましくは 4〜15°C である。 pHは 7〜9、 好ましくは pH7. 5〜8. 5である。 リフォールディ ングに要する時間は通常 0. 5〜7日間、 好ましくは 1〜3日間、 さらに好まし くは：！〜 2日間である。
なお、 可溶化後かつリフォールディングの前に、 例えば抽出、 塩析、 透析、 分 配、 結晶化、 再結晶、 ゲルろ過、 クロマトグラフィー等の公知で常用の精製工程 を導入することができ、 好ましくは、 たとえば 0. 1モル/リットル リン酸緩 衝液中セフアデックス （Sephadex) G- 25 (アマシャム フアルマシア バイ ォテク （株） ） にかけることにより精製することができる。 変性剤の分離は場合 により 0. 1モル/リットル リン酸緩衝液に対して透析することによつても可 能である。
精製工程はリフォールディングに続いて行うこともできる。 一般にそのような 精製としては例えば抽出、 塩析、 透析、 分配、 結晶化、 再結晶、 ゲルろ過、 クロ マトグラフィ一等が挙げられ、 好ましい例として透析や、 たとえば SP—セファ ロース （アマシャム フアルマシア バイオテク （株） ） 、 CM— 5PW (ト一 ソー （株） ） 、 DEAE— 5PW (トーソー （株） ） などを介したイオン交換ク 口マトグラフィ一、 たとえば C4P— 50 (昭和電工 （株） ） を用いた逆相クロ マトグラフィ一等による精製法が挙げられる。
本発明のペプチドまたは本発明の蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはそれ らの塩に対する抗体は、 本発明のペプチドまたは本発明の蛋白質もしくはその部 分ペプチドまたはそれらの塩を認識し得る抗体であれば、 ポリクローナル抗体、 モノクローナル抗体の何れであってもよい。
本発明のペプチドまたは本発明の蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはそれ らの塩 （以下、 本発明のペプチド ·蛋白質と略記することもある） に対する抗体 は、 本発明のペプチド '蛋白質を抗原として用い、 自体公知の抗体または抗血清 の製造法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
(a) モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のぺプチド ·蛋白質は、 哺乳動物に対して投与により抗体産生が可能な 部位にそれ自体あるいは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産 生能を高めるため、 完全フロイントアジュバン卜や不完全フロイントアジュバン 卜を投与してもよい。 投与は通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計 2〜 10回程度行な われる。 用いられる哺乳動物としては、 例えば、 サル、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモッ ト、 マウス、 ラット、 ヒッジ、 ャギが挙げられるが、 マウスおよびラットが好ま しく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、 抗原を免疫された温血動物、 例えば、 マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜 5日後に脾 臓またはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合 させることにより、 モノクローナル抗体産生ハイプリドーマを調製することがで きる。 抗血清中の抗体価の測定は、 例えば、 後記の標識化した本発明のぺプチ ド ·蛋白質と抗血清とを反応させたのち、 抗体に結合した標識剤の活性を測定す ることにより行なうことができる。 融合操作は既知の方法、 例えば、 ケーラーと ミルスタインの方法 〔ネィチヤ一 （Nature)、 256巻、 495頁 （1975 年） 〕 に従い実施することができる。 融合促進剤としては、 例えば、 ポリエチレ ングリコール （PEG) やセンダイウィルスなどが挙げられるが、 好ましくは P EGが用いられる。
骨髄腫細胞としては、 例えば、 NS— 1、 P 3U1、 3? 2ノ0などが挙げら れるが、 P 3U1が好ましく用いられる。 用いられる抗体産生細胞 （脾臓細胞） 数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 ： 1〜20 ： 1程度であり、 PEG (好 ましくは、 PEG 1000〜PEG6000) が 10〜 80 %程度の濃度で添加 され、 約 20〜40°C、 好ましくは約 30〜37 で約 1〜10分間インキュべ 一卜することにより効率よく細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイブリ ドーマのスクリーニングには種々の方法が使 用できるが、 例えば、 本発明のペプチド ·蛋白質抗原を直接あるいは担体ととも に吸着させた固相 （例、 マイクロプレート） にハイプリ ドーマ培養上清を添加し， 次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロプリン抗体 （細胞融合に用いら れる細胞がマウスの場合、 抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる） またはプ 口ティン Aを加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、 抗免疫 グロプリン抗体またはプロテイン Aを吸着させた固相にハイプリドーマ培養上清 を添加し、 放射性物質や酵素などで標識した本発明のペプチド ·蛋白質を加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法など力挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、 自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行 なうことができるが、 通常は HAT (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジ ン） を添加した動物細胞用培地などで行なうことができる。 選別および育種用培 地としては、 ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても 良い。 例えば、 1〜2 0 %、 好ましくは 1 0〜2 0 %の牛胎児血清を含む R P M I 1 6 4 0培地、 1〜1 0 %の牛胎児血清を含む G I T培地 （和光純薬工業 (株） ） またはハイプリドーマ培養用無血清培地 （S F M— 1 0 1、 日水製薬 (株） ） などを用いることができる。 培養温度は、 通常 2 0〜4 0 °C、 好ましく は約 3 7 °Cである。 培養時間は、 通常 5日〜 3週間、 好ましくは 1週間〜 2週間 である。 培養は、 通常 5 %炭酸ガス下で行なうことができる。 ハイプリドーマ培 養上清の抗体価は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
( b ) モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、 通常のポリクローナル抗体の分離精製と同 様に免疫グロブリンの分離精製法 〔例、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等電点沈殿 法、 電気泳動法、 イオン交換体 （例、 D E A E) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲ ルろ過法、 抗原結合固相またはプロティン Aあるいはプロティン Gなどの活性吸 着剤により抗体のみを採取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕 に従 つて行なうことができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、 それ自体公知あるいはそれに準じる方法にし たがって製造することができる。 例えば、 免疫抗原 （本発明のペプチド .蛋白質 の抗原） とキャリアー蛋白質との複合体をつくり、 上記のモノクローナル抗体の 製造法と同様に哺乳動物に免疫を行ない、 該免疫動物から本発明のペプチド ·蛋 白質に対する抗体含有物を採取して、 抗体の分離精製を行なうことにより製造で きる。
哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリア一蛋白質との複合体 に関し、 キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーと八プテンとの混合比は、 キ ャリア一に架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、 どの 様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、 例えば、 ゥシ血清アルブミン、 ゥシサイログロブリン、 キーホール · リンぺット ·へモシァニン等を重量比で八 プテン 1に対し、 約 0 .：！〜 2 0、 好ましくは約 1〜5の割合でカプルさせる方 法が用いられる。
また、 ハプテンとキャリアーの力プリングには、 種々の縮合剤を用いることが できるが、 ダルタルアルデヒドやカルポジイミド、 マレイミド活性エステル、 チ オール基、 ジチォピリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。 縮合生成物は、 温血動物に対して、 抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは 担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全 フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。 投 与は、 通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計約 3〜1 0回程度行なうことができる。 ポリクローナル抗体は、 上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、 腹水など、 好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリク口一ナル抗体価の測定は、 上記の血清中の抗体価の測定と同 様にして測定できる。 ポリクロ一ナル抗体の分離精製は、 上記のモノクローナル 抗体の分離精製と同様の免疫グロプリンの分離精製法に従って行なうことができ る。 本発明のペプチド、 配列番号： 2 1で表わされるアミノ酸配列と同一または実 質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩 （以下、 M I T 1類 と略記する場合がある） もしくは本発明の蛋白質、 それらをコードするポリヌク レオチドまたはそれらに対する抗体は、 血管新生阻害剤を得るための簡便な探索 法 （スクリーニング） に有用である。 特に、 本発明の蛋白質のアン夕ゴニストは、 優れた血管新生阻害剤として有用である。
さらに、 本発明の蛋白質、 本発明の蛋白質をコードする DNA (以下、 本発明 の DNAと略記する場合がある） 、 本発明のアンチセンス DNAおよび本発明の ペプチドに対する抗体 （以下、 本発明の抗体と略記する場合がある） は、 （i) 本発明の蛋白質が関与する各種疾病の予防 ·治療剤、 （ii) 本発明のペプチドと 本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング、 (iii) 本発明の蛋白質の定量、 （iv) 遺伝子診断薬、 （V) アンチセンス DNA を含有する医薬、 （vi) 本発明の抗体を含有する医薬および診断薬、 （vii) 本 発明の DNAを有する非ヒト動物の作製、 （viii) 構造的に類似したリガンド · レセプ夕一との比較にもとづいたドラッグデザィンなどの実施のために有用であ る。 特に、 本発明の組換え蛋白質の発現系を用いたレセプター結合アツセィ系を 用いることによって、 ヒトゃ哺乳動物に特異的な本発明の蛋白質に対するリガン ドの結合性を変化させる化合物 （例、 ァゴニスト、 アン夕ゴニストなど） をスク リーニングすることができ、 該ァゴ二ストまたはアン夕ゴニストを各種疾病の予 防 ·治療剤などとして使用することができる。
これら用途について、 以下に具体的に説明する。
(1) (i) 本発明のペプチドの活性を阻害する化合物またはその塩、 （ii) 本 発明の蛋白質の活性を阻害する化合物またはその塩、 （iii) 本発明のペプチド または M I T 1類と本発明の蛋白質との結合を阻害する化合物またはその塩、 ま たは （iv) 本発明のペプチドまたは MI T 1類の、 本発明の蛋白質の活性化作用 を阻害する化合物またはその塩を含有してなる血管新生阻害剤
(i) 本発明のペプチドの活性を阻害する化合物としては、 本発明のペプチド の活性を阻害する化合物であればよく、 例えば、 血管内皮細胞増殖活性、 腸管収 縮制御活性、 本発明の蛋白質に対する結合活性、 本発明の蛋白質を介するシグナ ル情報伝達作用などを阻害する化合物などが挙げられる。
(ii) 本発明の蛋白質の活性を阻害する化合物としては、 本発明の蛋白質の活 性を阻害する化合物であればよく、 例えば、 本発明のペプチドに対する結合活性、 シグナル情報伝達作用などを阻害する化合物などが挙げられる。
(i i i) 本発明のペプチドまたは M I T 1類と本発明の蛋白質との結合を阻害 する化合物としては、 本発明のペプチドまたは M I T 1類と本発明の蛋白質との 結合を阻害する化合物であればよい。
(iv) 本発明のペプチドまたは M I T 1類の、 本発明の蛋白質の活性化作用を 阻害する化合物としては、 本発明のペプチドまたは M I T 1類の、 本発明の蛋白 質の活性化作用を阻害する化合物であればよく、 例えば、 本発明のペプチドまた は M I T 1類による、 本発明の蛋白質の本発明のペプチドに対する結合活性、 シ グナル情報伝達作用などを阻害する化合物などが挙げられる。
上記 （i) 〜 （iv) の化合物またはその塩は、 例えば、 後述の本発明のスクリ —ニング方法またはスクリーニング用キットを用いることにより得られうる。 該塩としては、 例えば、 薬学的に許容可能な塩などが用いられる。 例えば、 無 機塩基との塩、 有機塩基との塩、 無機酸との塩、 有機酸との塩、 塩基性または酸 性アミノ酸との塩などがあげられる。 無機塩基との塩の好適な例としては、 例え ばナトリウム塩、 カリウム塩などのアルカリ金属塩、 カルシウム塩、 マグネシゥ ム塩などのアルカリ土類金属塩、 ならびにアルミニウム塩、 アンモニゥム塩など があげられる。 有機塩基との塩の好適な例としては、 例えばトリメチルァミン、 トリェチルァミン、 ピリジン、 ピコリン、 2- 6—ルチジン、 エタノールァミン、 ジエタノールァミン、 トリエタノールァミン、 シクロへキシルァミン、 ジシクロ へキシルァミン、 N， N ' —ジベンジルエチレンジァミンなどとの塩などがあげ られる。 無機酸との塩の好適な例としては、 例えば塩酸、 臭化水素酸、 硫酸、 リ ン酸などとの塩があげられる。 有機酸との塩の好適な例としては、 例えばギ酸、 酢酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 シユウ酸、 酒石酸、 マレイン酸、 クェン酸、 コ ハク酸、 リンゴ酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸、 安息香酸などとの 塩があげられる。
塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、 例えばアルギニン、 リジン、 オル チニンなどとの塩があげられ、 酸性アミノ酸との好適な例としては、 例えばァス パラギン酸、 グル夕ミン酸などとの塩があげられる。
上記化合物またはその塩は、 血管新生阻害剤として用いられ、 例えば、 血管新 生を伴う疾患 〔例、 癌 （例、 滕臓癌、 肺癌、 腎臓癌、 肝臓癌、 非小細胞肺癌、 卵 巣癌、 前立腺癌、 胃癌、 膀胱癌、 乳癌、 子宮頸部癌、 結腸癌、 直腸癌、 力ポジ肉 腫など） 、 卵巣疾患 （例、 多嚢胞性卵巣症候群 （卵巣多嚢胞症） 、 卵巣過剰刺激 症など） 、 炎症性疾患 （例、 関節リューマチなど） 、 糖尿病性網膜症など〕 等の 予防 ·治療剤などの医薬として安全に用いられる。
このような医薬として使用する場合、 後述の本発明のスクリーニング方法また はスクリーニング用キットを用いることにより得られる化合物を医薬として実施 する場合と同様にして実施することができる。 ( 2 ) 本発明のペプチドをコードする D N Aの塩基配列に相補的もしくは実質的 に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスヌクレオチドを含有 してなる血管新生阻害剤
上記アンチセンスヌクレオチド （アンチセンス D NA等） は、 生体内における 本発明のぺプチドまたはその D N Aの機能を抑制することができるので、 血管新 生阻害剤として、 例えば、 血管新生を伴う疾患 〔例、 癌 （例、 滕臓癌、 肺癌、 腎 臓癌、 肝臓癌、 非小細胞肺癌、 卵巣癌、 前立腺癌、 胃癌、 膀胱癌、 乳癌、 子宮頸 部癌、 結腸癌、 直腸癌、 力ポジ肉腫など） 、 卵巣疾患 （例、 多嚢胞性卵巣症候群 (卵巣多嚢胞症） 、 卵巣過剰刺激症など） 、 炎症性疾患 （例、 関節リューマチな ど） 、 糖尿病性網膜症など〕 等の予防 ·治療剤などの医薬として安全に用いられ る。
例えば、 該アンチセンス D N Aを単独あるいはレトロウイルスベクター、 アデ ノウィルスベクタ一、 アデノウイルスァソシエーテツドウィルスベクター等の適 当なベクターに挿入した後、 常套手段に従って投与することができる。 該アンチ センス D N Aは、 そのままで、 あるいは摂取促進のために補助剤等の生理学的に 認められる担体とともに製剤化し、 遺伝子銃やハイド口ゲルカテーテルのような カテーテルによって投与できる。
( 3 ) 本発明のペプチドに対する抗体または本発明の蛋白質に対する抗体を含有 してなる血管新生阻害剤 上記抗体は、 例えば、 本発明のペプチドまたは本発明の蛋白質の発現過多に起 因する疾患、 例えば血管新生阻害剤として、 例えば、 血管新生を伴う疾患 〔例、 癌 （例、 塍臓癌、 肺癌、 腎臓癌、 肝臓癌、 非小細胞肺癌、 卵巣癌、 前立腺癌、 胃 癌、 膀胱癌、 乳癌、 子宮頸部癌、 結腸癌、 直腸癌、 力ポジ肉腫など） 、 卵巣疾患 (例、 多嚢胞性卵巣症候群 （卵巣多嚢胞症） 、 卵巣過剰刺激症など） 、 炎症性疾 患 （例、 関節リューマチなど） 、 糖尿病性網膜症など〕 等の予防 ·治療剤などの 医薬として安全に用いられる。
このような医薬として使用する場合、 後述の本発明の抗体を含有する医薬を実 施する場合と同様にして実施することができる。
(4) 本発明のペプチドまたは本発明の蛋白質をコードするポリヌクレオチドを 含有してなる癌、 卵巣疾患、 炎症性疾患、 糖尿病性網膜症などの診断薬
上記ポリヌクレオチドは、 例えばプローブとして使用することにより、 ヒトま たは温血動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 トリ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル等） における本発明のペプチドまたは本発 明の蛋白質をコードする DNAまたは mRNAの異常 （遺伝子異常） を検出する ことができるので、 例えば、 該 DNAまたは mRNAの損傷、 突然変異あるいは 発現低下や、 該 DN Aまたは mRNAの増加あるいは発現過多等の遺伝子診断薬 として有用である。
上記遺伝子診断は、 例えば、 自体公知のノーザンハイブリダィゼ一シヨンや P じ ー じ？法 （Genomics, 第 5巻， 874〜879頁 （1989年） 、 Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 第 86巻， 2766〜2770頁 （1989年） ） 、 D N Aマイクロアレイ等により実施することがで さる。
例えば、 ノーザンハイブリダィゼ一シヨンや DNAマイクロアレイにより発現 低下が検出された場合や PCR—S S CP法や DNAマイクロアレイにより DN Aの突然変異が検出された場合は、 例えば、 癌 （例、 滕臓癌、 肺癌、 腎臓癌、 肝 臓癌、 非小細胞肺癌、 卵巣癌、 前立腺癌、 胃癌、 膀胱癌、 乳癌、 子宮頸部癌、 結 腸癌、 直腸癌、 力ポジ肉腫など） 、 卵巣疾患 （例、 多嚢胞性卵巣症候群 （卵巣多 嚢胞症） 、 卵巣過剰刺激症など） 、 炎症性疾患 （例、 関節リューマチなど） 、 糖 尿病性網膜症などに罹患している可能性が高いと診断することができる。
( 5 ) 本発明のペプチドまたは M I T 1類と本発明の蛋白質とを用いるスクリ一 ニング
本発明のぺプチド （その部分べプチドも含む） または M I T 1類および本発明 の蛋白質 （本発明の蛋白質の部分ペプチドも含む） を用いることを特徴とするス クリーニング方法、 または本発明のペプチドまたは M I T 1類および本発明の蛋 白質を用いることを特徴とするスクリーニング用キット （以下、 本発明のスクリ 一二ング方法、 本発明のスクリーニング用キットと略記する場合もある） により， 例えば、 本発明のペプチドまたは M I T 1類と本発明の蛋白質との結合性を変化 させる化合物、 好ましくは、
(i) 本発明のぺプチドの活性を阻害する化合物またはその塩、
(i i) 本発明の蛋白質の活性を阻害する化合物またはその塩、
(i i i) 本発明のペプチドまたは M I T 1類と本発明の蛋白質との結合を阻害す る化合物またはその塩、
(iv) 本発明のペプチドまたは M I T 1類の、 本発明の蛋白質の活性化作用を阻 害する化合物またはその塩などが得られる。
上記 （i ) 〜 （iv) の化合物またはその塩は、 血管新生阻害作用を有しており、 血管新生阻害剤として有用である。
本発明のスクリ一ニング方法または本発明のスクリーニング用キッ卜について、 以下に詳述する。
本発明の蛋白質を用いるか、 または組換え型本発明の蛋白質の発現系を構築し、 該発現系を用いた本発明のペプチドとの結合アツセィ系 （リガンド ·レセプ夕一 アツセィ系） を用いることによって、 本発明のペプチドまたは M I T 1類と本発 明の蛋白質との結合性を変化させる化合物、 本発明のペプチドまたは M I T 1類 と本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物 （例えば、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物など） またはその塩をスクリ一二 ングすることができる。 このような化合物には、 本発明の蛋白質を介して細胞刺激活性 （例えば、 ァラ キドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質 のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する活性または抑制す る活性など） を有する化合物 （ァゴ二スト） と該細胞刺激活性を有しない化合物 (アンタゴニスト） などが含まれる。 「本発明のペプチドと本発明の蛋白質との 結合性を変化させる」 とは、 本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合を阻害 する場合と促進する場合の両方を包含するものである。
本発明は、 （i) 本発明の蛋白質に、 本発明のペプチドを接触させた場合と (i i) 上記した本発明の蛋白質に、 本発明のペプチドおよび試験化合物を接触さ せた場合との比較を行なうことを特徴とする本発明のペプチドと本発明の蛋白質 との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。 本スクリーニングにおいては、 M I T 1類は、 本発明のペプチドと同様に使用 すればよい。
本発明のスクリーニング方法においては、 （i) 上記した本発明の蛋白質に本 発明のペプチドを接触させた場合と （i i) 上記した本発明の蛋白質に本発明のぺ プチドおよび試験化合物を接触させた場合における、 例えば該本発明の蛋白質に 対する本発明のぺプチドの結合量、 細胞刺激活性などを測定して比較する。
本発明のスクリーニング方法としての具体例としては、 例えば、
(a) 本発明のペプチドを本発明の蛋白質に接触させた場合と、 本発明のぺプチ ドおよび試験化合物を本発明の蛋白質に接触させた場合における、 本発明のぺプ チドの本発明の蛋白質に対する結合量を測定し、 比較することを特徴とする、 本 発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物またはその塩の スクリーニング方法、
(b) 本発明のペプチドを、 本発明の蛋白質を含有する細胞または該細胞の膜画 分に接触させた場合と、 本発明のぺプチドおよび試験化合物を本発明の蛋白質を 含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、 本発明のぺプチ ドの該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、 比較することを特徴とする、 本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物またはその塩 のスクリーニング方法、 および
(c) 本発明の蛋白質が、 本発明の蛋白質をコードする D N Aを含有する形質転 換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明の蛋白質である上記
(b) 記載のスクリーニング方法、
(d) 本発明のペプチドが、 標識したペプチドである上記 （a) 〜 （c) のスクリ 一二ング方法などのレセプ夕一結合ァッセィ系、
(e) 本発明のペプチドを本発明の蛋白質に接触させた場合と、 本発明のぺプチ ドおよび試験化合物を本発明の蛋白質に接触させた場合における、 本発明の蛋白 質を介した細胞刺激活性を測定し、 比較することを特徴とする、 本発明のぺプチ ドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリ一ニン グ方法、
(f) 本発明のペプチドを本発明の蛋白質を含有する細胞または該細胞の膜画分 に接触させた場合と、 本発明のペプチドおよび試験化合物を本発明の蛋白質を含 有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、 本発明の蛋白質を 介した細胞刺激活性を測定し、 比較することを特徴とする、 本発明のペプチドと 本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方 法、 および
(g) 本発明の蛋白質が、 本発明の蛋白質をコードする D N Aを含有する形質転 換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明の蛋白質である上記 (0 のスクリーニング方法などの細胞刺激アツセィ系などが挙げられる。
本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。
まず、 本発明のスクリーニング方法に用いる本発明の蛋白質としては、 上記の 本発明の蛋白質を含有するものであれば何れのものであってもよい。 しかし、 特 にヒト由来の臓器は入手が極めて困難なことから、 スクリーニングに用いられる ものとしては、 組換え体を用いて大量発現させた本発明の蛋白質などが適してい る。 また、 哺乳動物由来の内皮細胞も使用できる。
本発明の蛋白質を製造するには、 前述の方法などが用いられる。
本発明のスクリーニング方法において、 本発明の蛋白質を含有する細胞あるい は該細胞膜画分などを用いる場合、 後述の調製法に従えばよい。 本発明の蛋白質を含有する細胞を用いる場合、 該細胞をダルタルアルデヒド、 ホルマリンなどで固定化してもよい。 固定化方法はそれ自体公知の方法に従って 行うことができる。
本発明の蛋白質を含有する細胞としては、 本発明の蛋白質を発現した宿主細胞 をいうが、 該宿主細胞としては、 前述の大腸菌、 枯草菌、 酵母、 昆虫細胞、 動物 細胞などがあげられる。
膜画分としては、 細胞を破砕した後、 それ自体公知の方法で得られる細胞膜が 多く含まれる画分のことをいう。 細胞の破砕方法としては、 Po t ter— E l vehj em型 ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、 ワーリングブレンダ一やポリトロン (Ki nemat i ca社製） による破砕、 超音波による破砕、 フレンチプレスなどで加圧 しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などがあげられる。 細 胞膜の分画には、 分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画 法が主として用いられる。 例えば、 細胞破砕液を低速 （500〜3000rpm) で短時間 (通常、 約 1〜10分） 遠心し、 上清をさらに高速 （1 5OOO〜30OOOrpm) で通常 30分 〜2時間遠心し、 得られる沈澱を膜画分とする。 該膜画分中には、 発現した本発 明の蛋白質と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。 該本発明の蛋白質を含有する細胞や膜画分中の本発明の蛋白質の量は、 1細胞 当たり 103〜108分子であるのが好ましく、 105〜107分子であるのが好適である。 な お、 発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性 （比活性） が高くなり、 高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、 同一ロットで大量 の試料を測定できるようになる。
上記の哺乳動物由来の内皮細胞としては、 例えば、 ヒト、 サル、 ゥシ、 ブ夕、 ラット、 マウスなどの内皮細胞 （例、 動脈血管内皮細胞、 毛細血管内皮細胞な ど） が挙げられる。
例えば、 哺乳動物由来の毛細血管内皮細胞の一つであるゥシ毛細血管内皮細胞 は、 以下の方法で調製することができる。 また、 同様の方法で、 哺乳動物の脳、 卵巣などからも毛細血管内皮細胞を調製することができる。
先ず、 ゥシ副腎の表面についている脂質をはさみで除去後、 副腎を 20 %イソジ ンを含む生理食塩水に 5分間浸し消毒する。 その後、 生理食塩水で副腎を洗浄し てから半分に切断し副腎髄質を除去する。 残った副腎皮質を内側からメスとはさ みで採取し細かく切断する。 続いて、 副腎皮質半分を用いて以下の操作を実施す る。 すなわち、 細片に 0. 5 %コラゲナ一ゼ （和光純薬） と 0. 1 % bovine serum albumi n (BSA)を含む Mi nimum essen t i al med i um (MEM) 20 mlを加え、 37でで 30 分間インキュベーションする。 その後、 ピペッティングして組織塊を崩した後、 1〜600 ΐ ΐηで 5分間遠心し、 得られた沈殿に 25 % BSAを含む MEMを 25 ml添加し再 度 2， 700卬111で 20分間遠心する。 得られた沈殿に上述のコラゲナ一ゼを含む MEMを 加えて懸濁し 37 で 15分間インキュベーションした後、 コラゲナーゼ消化物をナ ィロンガーゼ （100ミクロン） で濾過し濾液を回収する。 この濾液を再度ナイ口 ンガーゼ （50ミクロン） で濾過し、 ガーゼに捕集されたくずを 10% fetal bovine serum (FBS)を含む MEMを用いてゼラチンコートした 6穴プレートに洗いこ む。 4時間後、 10 % FBS/MEMでプレートを穏やかに洗浄後、 2 ng/ml bas i c f ibrob l as t growth fac torと 10% FBSを含む MEMを添加し 5 % C02下 37でで培養する。 以後、 培地は 3日毎に全量交換する。 5〜6日後に目的とする細胞のコロニーを残 して不要細胞を顕微鏡下でパスツールピペットを用いて除去する。 9〜10日後に 目的コロニーにクローニングリングをかけ、 トリプシン処理により細胞を回収し 24穴プレートに移して培養する。 得られた細胞を適当なスケールになるまで培養 し実験に使用する。
前記のレセプ夕一結合ァッセィ系や細胞刺激ァッセィ系などのスクリ一ニング 方法を実施するためには、 例えば、 本発明の蛋白質画分と、 本発明のペプチド
(例、 標識した本発明のペプチド） などが用いられる。 本発明の蛋白質画分とし ては、 天然型の本発明の蛋白質画分か、 またはそれと同等の活性を有する組換え 型本発明の蛋白質画分などが望ましい。 ここで、 同等の活性とは、 同等のリガン ド結合活性などを示す。 標識した本発明のペプチドとしては、 例えば、 放射性同 位元素 （例、 〔125I〕 、 〔13' 1〕 、 〔¾〕 、 〔I4C〕 、 〔32P〕 、 〔33P〕 、 〔35S〕 な ど） 、 蛍光物質 〔例、 シァニン蛍光色素 （例、 Cy2、 Cy3、 Cy5、 Cy5. 5、 Cy7 (ァ マシャムバイオサイエンス社製） など） 、 フルォレスカミン、 フルォレツセンィ ソチオシァネートなど〕 、 酵素 （例、 /3—ガラクトシダーゼ、 /3—ダルコシダー ゼ、 アルカリフォスファターゼ、 パーォキシダーゼ、 リンゴ酸脱水素酵素など） 、 発光物質 （例、 ルミノール、 ルミノール誘導体、 ルシフェリン、 ルシゲニンな ど） 、 ピオチン、 ランタニド元素などで標識された本発明のペプチド、 好ましく は放射性同位元素で標識された本発明のペプチドなどを用いることができる。 ま た、 ポルトン一ハンター試薬を用いて公知の方法で調製した本発明のペプチドの 標識体を利用することもできる。
具体的には、 本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合 物のスクリーニングを行うには、 まず本発明の蛋白質を含有する細胞または細胞 の膜画分を、 スクリーニングに適したバッファーに懸濁することにより本発明の 蛋白質標品を調製する。 バッファーには、 pH4〜10 (望ましくは pH6〜8) のリン 酸バッファー、 トリスー塩酸バッファーなどの本発明のペプチドと本発明の蛋白 質との結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。 また、 非特異的結 合を低減させる目的で、 CHAPS、 Tween-80™ (花王一アトラス社） 、 ジギトニン、 デォキシコレートなどの界面活性剤をバッファ一に加えることもできる。 さらに プロテアーゼによる本発明の蛋白質や本発明のペプチドの分解を抑える目的で PMSF, ロイぺプチン、 E- 64 (ペプチド研究所製） 、 ぺプス夕チンなどのプロテア —ゼ阻害剤を添加することもできる。 0. 01〜10mlの該本発明の蛋白質溶液に、 一 定量 （5000〜500000cpm) の標識した本発明のペプチドを添加し、 同時に 10一4〜 10_ の試験化合物を共存させる。 非特異的結合量 （NSB) を知るために大過剰の未 標識の本発明のペプチドを加えた反応チューブも用意する。 反応は 0〜5(TC、 望 ましくは 4〜37°Cで、 20分〜 24時間、 望ましくは 30分〜 3時間行う。 反応後、 ガラ ス繊維濾紙等で濾過し、 適量の同バッファーで洗浄した後、 ガラス繊維濾紙に残 存する放射活性を液体シンチレ一シヨンカウンタ一またはァーカウンタ一で計測 する。 拮抗する物質がない場合のカウント（Bfl) から非特異的結合量 （NSB) を引 いたカウント （B。- NSB) を 100%とした時、 特異的結合量 （B- NSB) が例えば 50% 以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができ る。
また、 本発明の蛋白質と本発明のペプチドとの結合を測定する方法として、 BIAcore (アマシャム フアルマシア バイオテク社製） を用いることもできる。 この方法では、 本発明のペプチドを装置に添付のプロトコールに従ったアミノカ ップリング法によってセンサーチップに固定し、 本発明の蛋白質を含有する細胞 または本発明の蛋白質をコードする D N Aを含有する形質変換体から精製した本 発明の蛋白質または本発明の蛋白質を含む膜画分、 あるいは精製した本発明の蛋 白質または本発明の蛋白質を含む膜画分および試験化合物を含むリン酸バッファ —または卜リスバッファ一などの緩衝液をセンサーチップ上を毎分 2〜20 ^ 1の流 量で通過させる。 センサーチップ上の本発明のペプチドと本発明の蛋白質とが 結合することによって生じる表面プラズモン共鳴の変化を共存する試験化合物が 変化させることを観察することによって本発明の蛋白質と本発明のペプチドとの ' 結合を変化させる化合物のスクリーニングを行なうことができる。 この方法は、 本発明の蛋白質をセンサーチップに固定し、 本発明のペプチドまたは本発明のぺ プチドおよび試験化合物を含むリン酸バッファーまたはトリスバッファーなどの 緩衝液をセンサーチップ上を通過させる方法を用いても同様に測定することがで きる。 試験化合物としては、 上記と同様のものなどがあげられる。
前記の細胞刺激ァッセィ系のスクリ一ニング方法を実施するためには、 本発明 の蛋白質を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊 離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシト一 ルリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する活性または抑制する活性など） を公知の方法または巿 販の測定用キットを用いて測定することができる。 具体的には、 まず、 本発明の 蛋白質を含有する細胞をマルチウエルプレート等に培養する。 スクリーニングを 行うにあたっては前もつて新鮮な培地あるレゝは細胞に毒性を示さない適当なバッ ファーに交換し、 試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、 細 胞を抽出あるいは上清液を回収して、 生成した産物をそれぞれの方法に従って定 量する。 細胞刺激活性の指標とする物質 （例えば、 ァラキドン酸など） の生成が、 細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、 該分解酵素に対する阻害剤 を添加してアツセィを行なってもよい。 また、 c AM P産生抑制などの活性につ いては、 フオルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対 する産生抑制作用として検出することができる。
細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、 適当な本発明の蛋白質 を発現した細胞が用いられる。 本発明の蛋白質を発現した細胞としては、 前述の 組換え型本発明の蛋白質発現細胞株などが望ましい。 形質転換体である本発明の 蛋白質発現細胞は安定発現株でも一過性発現株でも構わない。 また、 動物細胞の 種類は上記と同様のものが用いられる。
試験化合物としては、 例えばペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合成化 合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などがあげられる, 上記細胞刺激アツセィ系のスクリーニング方法について、 さらに具体的に以下 〔1〕 〜 〔12〕 に記載する。
〔1〕 受容体発現細胞が受容体ァゴニストによって刺激されると細胞内の G蛋 白質が活性化されて GTPが結合する。 この現象は受容体発現細胞の膜画分にお いても観察される。 通常、 GTPは加水分解されて GDPへと変化するが、 この とき反応液中に GTPァ Sを添加しておくと、 GTPァ Sは GTPと同様に G蛋 白質に結合するが、 加水分解されずに G蛋白質を含む細胞膜に結合した状態が維 持される。 標識した GTPr Sを用いると細胞膜に残存した標識された GTPr Sを測定することにより、 受容体ァゴニストの受容体発現細胞刺激活性を測定す ることができる。
この反応を利用して、 本発明のペプチドの本発明の蛋白質発現細胞に対する刺 激活性を測定することにより、 本発明のぺプチドと本発明の蛋白質との結合性を 変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
この方法は、 本発明の蛋白質を含む膜画分を用いて行う。 本測定法において本 発明の蛋白質膜画分への GTPァ S結合促進活性を示す物質はァゴニストである c 具体的には、 標識した GTPrSの存在下、 本発明のペプチドを本発明の蛋白 質細胞膜画分に接触させた場合と、 本発明のぺプチドおよび試験化合物を本発明 の蛋白質細胞膜画分に接触させた場合における、 本発明の蛋白質細胞膜画分への GTPrS結合促進活性を測定し、 比較することにより、 本発明のペプチドと本 発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
本方法において、 本発明のペプチドによる本発明の蛋白質細胞膜画分への GT P τ S結合促進活性を抑制する活性を示す試験化合物を、 拮抗阻害能力のある候 補物質として選択することができる。 一方、 試験化合物のみを本発明の蛋白質細胞膜画分に接触させ、 本発明の蛋白 質細胞膜画分への GTPァ S結合促進活性を測定することにより、 ァゴニス卜の スクリーニングを行なうこともできる。
スクリーニング法の一例についてより具体的に以下に述べる。
公知の方法に準じて調製した本発明の蛋白質を含む細胞膜画分を、 膜希釈緩衝 液 （50mM T r i s、 5mM MgC l 2、 150mM NaC l、 1 M G DP、 0. 1 % B S A ; pH7. 4) で希釈する。 希釈率は、 受容体の発現量 により異なる。 これを F a l c on 2053に 0. 2m 1ずつ分注し、 本発明の ぺプチドまたは本発明のぺプチドおよび試験化合物を加え、 さらに終濃度 200 pMとなるように [35 S] GTPrSを加える。 25 で 1時間保温した後、 氷 冷した洗浄用緩衝液 （5 OmM Tr i s, 5mM Mg C 12, 15 OmM N a C 1 , 0. 1 % BSA, 0. 05% CHAP S ； pH7. 4) 1. 5ml を加えて、 ガラス繊維ろ紙 GFZFでろ過する。 65で、 30分保温して乾燥後、 液体シンチレーシヨンカウン夕一でろ紙上に残った膜画分に結合した [35S] G TP 7" Sの放射活性を測定する。 本発明のペプチドのみを加えた実験区の放射活 性を 100%、 本発明のペプチドを加えなかった実験区の放射活性を 0%とし、 本発明のペプチドによる GTPァ S結合促進活性に対する試験化合物の影響を算 出する。 GTPァ S結合促進活性が例えば 50 %以下になる試験化合物を拮抗阻 害能力のある候補物質として選択することができる。
〔2〕 本発明の蛋白質発現細胞は、 本発明のペプチドの刺激により、 細胞内 c
AMPの産生が抑制される。 この反応を利用して、 本発明のペプチドの本発明の 蛋白質発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、 本発明のぺプチドと本 発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。 具体的には、 細胞内 c AMP量を増加させる物質の存在下、 本発明のペプチド を本発明の蛋白質発現細胞に接触させた場合と、 本発明のペプチドおよび試験化 合物を本発明の蛋白質発現細胞に接触させた場合における、 該細胞の細胞内 c A MPの産生抑制活性を測定し、 比較することにより、 本発明のペプチドと本発明 の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
細胞内 c AMP量を増加させる物質としては、 例えば、 フオルスコリン、 カル シトニンなどが用いられる。
本発明の蛋白質発現細胞内の cAMP産生量は、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ャ ギ、 ゥシなどを免疫して得られた抗 cAMP抗体と 〔1251〕 標識 cAMP (と もに市販品） を使用することによる R I A系、 または抗 c AMP抗体と標識 c A MPとを組み合わせた E I A系で測定することができる。 また、 抗 c AMP抗体 を、 p r o t e i n Aまたは抗 c AM P抗体産生に用いた動物の I g Gなどに 対する抗体などを使用して固定したシンチラントを含むビーズと 〔1251〕 標識 c AMPとを使用する SPA (Scintillation Proximity Assay) 法による定量 も可能である （アマシャムフアルマシアバイオテク社製のキットを使用する） 。 本方法において、 本発明のペプチドによる本発明の蛋白質発現細胞の cAMP 産生抑制活性を阻害する活性を示す試験化合物を、 拮抗阻害能力のある候補物質 として選択することができる。
一方、 試験化合物のみを本発明の蛋白質発現細胞に接触させて、 cAMP産生 抑制活性を調べることによりァゴニスト活性を示す化合物のスクリーニングを行 なうことができる。
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の蛋白質発現細胞 （例、 CHO細胞などの動物細胞） （ZAQC— B 1 細胞；後述の参考例 2 ) を 24穴プレー卜に 5 X 104 c e 1 1 /we 1 1で播 種し、 48時間培養する。 細胞を 0. 2mM 3—イソブチル—メチルキサンチ ン、 0. 05% BSAおよび 2 OmM HEPESを含むハンクスバッファ一
(pH7. 4) で洗浄する （以下、 反応用バッファ一と略記する） 。 その後、 0. 5m lの反応用バッファーを加えて 30分間培養器で保温する。 反応用バッファ 一を除き、 新たに 0. 25m 1の反応用バッファ一を細胞に加えた後、 I Mの 本発明のぺプチドまたは 1 Mの本発明のぺプチドおよび試験化合物を添加した 2 M フォルスコリンを含む 0. 25m 1の反応用バッファ一を、 細胞に加え, 37 で 24分間反応させる。 100 1の 20 %過塩素酸を加えて反応を停止 させ、 その後氷上で 1時間置くことにより細胞内 cAMPを抽出する。 抽出液中 の c AMP量を、 cAMP E I Aキット （アマシャムフアルマシアバイオテ ク） を用いて測定する。 フオルスコリンの刺激によって産生された c AMP量を 1 0 0 %とし、 1 Mの本発明のペプチドの添加によって抑制された c AMP量 を 0 %として、 本発明のぺプチドによる c AMP産生抑制活性に対する試験化合 物の影響を算出する。 本発明のペプチドの活性を阻害して、 c AMP産生活性が 例えば 5 0 %以上になる試験化合物を、 拮抗阻害能力のある候補物質として選択 することができる。 .
また、 本発明のペプチドの刺激により、 細胞内' c AMP量が増加する性質を示 す本発明の蛋白質発現細胞を使用する場合、 本発明のペプチドを本発明の蛋白質 発現細胞に接触させた場合と、 本発明のぺプチドおよび試験化合物を本発明の蛋 白質発現細胞に接触させた場合における、 該細胞の細胞内 cAMPの産生促進活 性を測定し、 比較することにより、 本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合 性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
本方法において、 本発明のペプチドによる本発明の蛋白質発現細胞の c AMP 産生促進活性を阻害する活性を示す試験化合物を、 拮抗阻害能力のある候補物質 として選択することができる。
一方、 試験化合物のみを本発明の蛋白質発現細胞に接触させて c AMP産生促 進活性を調べることによりァゴニスト活性を示す化合物のスクリ一ニングを行な うことができる。
c AMP産生促進活性は、 上記のスクリーニング法においてフォルスコリンを 添加せずに本発明の蛋白質発現細胞 （例、 CHO細胞などの動物細胞） に本発明 のべプチドまたは本発明のペプチドおよび試験化合物を添加して産生された c A MPを上記の方法で定量して測定する。
〔3〕 CRE—レポ一夕一遺伝子ベクターを用いて、 本発明のペプチドの本発 明の蛋白質発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、 本発明のぺプチド と本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることがで きる。
CRE (cAMP response element) を含む DNAを、 ベクタ一のレポーター遺 伝子上流に挿入し、 CRE—レポーター遺伝子べクタ一を得る。 CRE_.レポ一 ター遺伝子ベクターを導入した本発明の蛋白質発現細胞において、 c AMPの上 昇を伴う刺激は、 CREを介したレポ一夕一遺伝子発現と、 それに引き続くレポ 一夕一遺伝子の遺伝子産物 （蛋白質） の産生を誘導する。 つまり、 レポーター遺 伝子蛋白質の酵素活性を測定することにより、 CRE—レポーター遺伝子べク夕 一導入細胞内の CAM P量の変動を検出することができる。
具体的には、 細胞内 c AMP量を増加させる物質の存在下、 本発明のぺプチド を、 CRE—レポーター遺伝子ベクター導入本発明の蛋白質発現細胞に接触させ た場合と、 本発明のペプチドおよび試験化合物を、 CRE—レポ一ター遺伝子べ クタ一導入本発明の蛋白質発現細胞に接触させた場合における、 レポ一夕一遺伝 子蛋白質の酵素活性を測定し、 比較することにより、 本発明のペプチドと本発明 の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
細胞内 cAMP量を増加させる物質としては、 例えば、 フオルスコリン、 カル シトニンなどが用いられる。
ベクターとしては、 例えば、 ピツカジーン ペイシックベクター、 ピツカジー ン ェンハンサーベクター （東洋インキ製造 （株） ） などが用いられる。 CRE を含む DNAを、 上記ベクターのレポーター遺伝子、 例えばルシフェラ一ゼ遺伝 子上流のマルチクロ一ニングサイトに挿入し、 CRE—レポ一夕一遺伝子べクタ —とする。
本方法において、 本発明のペプチドによるレポーター遺伝子蛋白質の酵素活性 抑制を回復させる試験化合物を、 拮抗阻害能力のある候補物質として選択するこ とができる。
一方、 試験化合物のみを本発明の蛋白質発現細胞に接触させて、 フォルスコリ ン刺激によって上昇した発光量の本発明のペプチドと同様な抑制を測定すること によりァゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
レポーター遺伝子として、 ルシフェラーゼを利用する例を用いて、 このスクリ —ニング方法の具体例を以下に述べる。
CRE—レポーター遺伝子 （ルシフェラーゼ） を導入した本発明の蛋白質発現 細胞を、 24穴プレートに 5 X 103c e 1 1ノ we 1 1で播種し、 48時間培 養する。 細胞を 0. 2mM 3—イソプチルーメチルキサンチン、 0. 05% BSAおよび 20mM HE P E Sを含むハンクスバッファ一 （pH7. 4) で 洗浄する （以下、 反応用バッファーと略記する） 。 その後 5m lの反応用バ ッファーを加えて 30分間培養器で保温する。 反応用バッファーを除き、 新たに 0. 25m 1の反応用バッファーを細胞に加えた後、 l wMの本発明のペプチド または 1 の本発明のペプチドおよび試験化合物を添加した 2 フォルス コリンを含む 0. 25m 1の反応用バッファ一を、 細胞に加え、 37 で 24分 間反応させる。 細胞をピツカジーン用細胞溶解剤 （東洋インキ製造 （株） ） で溶 かし、 溶解液に発光基質 （東洋インキ製造 （株） ） を添加する。 ルシフェラーゼ による発光は、 ルミノメ一夕一、 液体シンチレーシヨンカウンタ一またはトップ カウンタ一により測定する。 本発明のペプチド単独を添加した場合と、 の 本発明のペプチドおよび試験化合物を添加した場合のルシフェラーゼによる発光 量を測定して、 比較する。
本発明のペプチドは、 フオルスコリン刺激に基づくルシフェラーゼによる発光 量の増加を抑制する。 該抑制を回復させる化合物を拮抗阻害能力のある候補物質 として選択することができる。
レポ一夕一遺伝子として、 例えば、 アルカリフォスファタ一ゼ、 クロラムフエ ニコ一 レ ·ァセチリレトランスフェラーゼ (chloramphenicol
acetyltransferase) 、 （3—ガラクトシダ一ゼなどの遺伝子を用いてもよい。 こ れらのレポーター遺伝子蛋白質の酵素活性は、 公知の方法に従い、 または市販の 測定キットを用いて測定する。 アルカリフォスファタ一ゼ活性は、 例えば和光純 薬製 Lumi-Phos 530を用いて、 クロラムフエ二コール 'ァセチルトランスフェラ ーゼ活性は、 例えば和光純薬製 FAST CAT chrolamphenicol Acetyltransferase Assay KiTを用いて、 /3 _ガラクトシダーゼ活性は、 例えば和光純薬製 Aurora Ga卜 XEを用いて測定する。
〔4〕 本発明の蛋白質発現細胞は、 本発明のペプチドの刺激により、 ァラキド ン酸代謝物を細胞外に放出する。 この反応を利用して、 本発明のペプチドの本発 明の蛋白質発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、 本発明のぺプチド と本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることがで さる。
あらかじめ、 標識したァラキドン酸を、 本発明の蛋白質発現細胞に取り込ませ ておくことによって、 ァラキドン酸代謝物放出活性を、 細胞外に放出された標識 されたァラキドン酸代謝物を測定することによって測定することができる。 具体的には、 本発明のペプチドを、 標識したァラキドン酸を含有する本発明の 蛋白質発現細胞に接触させた場合と、 本発明のペプチドおよび試験化合物を、 標 識したァラキドン酸を含有する本発明の蛋白質発現細胞に接触させた場合におけ る、 ァラキドン酸代謝物の放出活性を測定し、 比較することにより、 本発明のぺ プチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。 本方法において、 本発明のペプチドによるァラキドン酸代謝物放出活性を阻害 する試験化合物を、 拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。 また、 試験化合物のみを本発明の蛋白質発現細胞に接触させ、 本発明の蛋白質 発現細胞のァラキドン酸代謝物放出活性を公知の方法で調べることによりァゴニ スト活性を示す化合物のスクリーニングを行なうこともできる。
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
.本発明の蛋白質発現細胞を 24穴プレートに 5 X 10 c e 1 1/we 1 1で 播種し、 24時間培養後、 [3H] ァラキドン酸を 0. 25^C iZwe l lと なるよう添加し、 16時間後、 細胞を 0. 05% BSAおよび 20mM HE PESを含むハンクスバッファー （pH7. 4) (以下、 反応用バッファ一と略 記する） で洗浄する。 終濃度 10 iMの本発明のペプチドまたは終濃度 10 M の本発明のペプチドおよび試験化合物を含む反応用バッファー 500 1を、 各 we 1 1に添加する。 37 °Cで 60分間インキュベートした後、 反応液 400 11 1をシンチレ一夕一に加え、 反応液中に遊離した [3H] ァラキドン酸代謝物 の量をシンチレーションカウン夕一により測定する。
反応用バッファ一 500 1のみを添加した場合 （本発明のペプチド非添 加 ·試験化合物非添加） の遊離 [3H] ァラキドン酸代謝物の量を 0%、 10 Μの本発明のペプチドを含む反応用バッファ一を添加した場合 （試験化合物非添 カロ） の遊離 [3Η] ァラキドン酸代謝物の量を 100%として、 試験化合物を添 加した場合の遊離 [3Η] ァラキドン酸代謝物の量を算出する。
ァラキドン酸代謝物放出活性が、 例えば 50%以下になる試験化合物を拮抗阻 害能力のある候補物質として選択することができる。
〔5〕 本発明の蛋白質発現細胞は、 本発明のペプチドの刺激により、 細胞内の C a濃度が上昇する。 この反応を利用して、 本発明のペプチドの本発明の蛋白質 発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、 本発明のぺプチドと本発明の 蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
具体的には、 本発明のペプチドを、 本発明の蛋白質発現細胞に接触させた場合 と、 本発明のペプチドおよび試験化合物を、 本発明の蛋白質発現細胞に接触させ た場合における、 細胞内カルシウム濃度上昇活性を測定し、 比較することにより、 本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリー二 ングする。 測定は公知の方法に従って行う。
本方法において、 本発明のぺプチドによる細胞内カルシウム濃度の上昇を抑制 する試験化合物を、 拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。 一方、 試験化合物のみの添加による蛍光強度の上昇を測定することによってァ ゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の蛋白質発現細胞を、 滅菌した顕微鏡用カバーグラス上に播き、 2日後、 培養液を、 4 mM F u r a— 2 AM (同仁化学研究所） を縣濁した H B に 置換し、 室温で 2時間 3 0分おく。 H B S Sで洗浄した後、 キュベットにカバー グラスをセッ卜し、 本発明のペプチドまたは本発明のペプチドおよび試験化合物 を添加し、 励起波長 3 4 0 n mおよび 3 8 0 n mでの、 5 0 5 n mの蛍光強度の 比の上昇を蛍光測定器で測定し、 比較する。
また、 F L I P R (モレキュラーデバイス社製） を使って行ってもよい。 本発 明の蛋白質発現細胞縣濁液に F 1 u o _ 3 AM (同仁化学研究所製） を添加し、 細胞に取り込ませた後、 上清を遠心により数度洗浄後、 9 6穴プレートに細胞を 播く。 F L I P R装置にセットし、 F u r a _ 2の場合と同様に、 本発明のぺプ チドまたは本発明のペプチドおよび試験化合物を添加し、 蛍光強度の比の上昇を 蛍光測定器で測定し、 比較する。
さらに、 本発明の蛋白質発現細胞に、 細胞内 C aイオンの上昇によって発光す るような蛋白質の遺伝子 （例、 aequor inなど） を共発現させておき、 細胞内 C a イオン濃度の上昇によって、 該遺伝子蛋白質 （例、 aequor inなど） が C a結合型 となり発光することを利用して、 本発明のぺプチドと本発明の蛋白質との結合性 を変化させる化合物をスクリ一二ングすることもできる。
細胞内 C aイオンの上昇によって発光するような蛋白質の遺伝子を共発現させ た本発明の蛋白質発現細胞を、 96穴プレートに播き、 上記と同様に、 本発明の ペプチドまたは本発明のペプチドおよび試験化合物を添加し、 蛍光強度の比の上 昇を蛍光測定器で測定し、 比較する。
本発明のぺプチドによる蛍光強度の上昇を、 抑制する試験化合物を拮抗阻害能 力のある候補物質として選択することができる。
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
対照として ETA (エンドセリン Aレセプター） 発現 CH〇細胞 24番クロー ン （以後 ETA24細胞と略称する。 Journal of Pharmacology and
Experimental Therapeutics, 279巻、 675- 685頁、 1996年参照） を用い、 アツセ ィ用サンプルについて、 2八(3じー81細胞 （後述の参考例 2) および ETA2 4細胞における細胞内 C aイオン濃度上昇活性の測定を FL I PR (モレキユラ 一デバイス社製） を用いて行う。 ZAQC— B 1細胞、 ETA24細胞共に 1 0%透析処理済ゥシ胎児血清 （以後 d FBSとする） を加えた DMEMで継代 培養しているものを用いる。 ZAQC— B 1細胞、 ET A 24細胞をそれぞれ 15 X104cells/mlとなるように培地 （10% d FBS-DMEM) に懸濁し、 F L I P R用 9 6穴プレート（Black plate clear bottom, Coster社）に分注器を用いて各ゥエル に 200 lずつ植え込み （3.0X104cells/200 zl/ゥエル） 、 5% C02インキュべ一 ター中にて 37°Cで一晩培養した後用いる （以後、 細胞プレートとする） 。 H/HBSS (二ッスィハンクス 2 (日水製薬株式会社） 9.8g、 炭酸水素ナトリウム 0.35g、 HEPES 4.77 g 、 水酸化ナトリウム溶液で pH7.4に合わせた後、 フィルター滅菌 処理） 20 ml、 250 mM Probenecid 200 n\, ゥシ胎児血清（FBS) 200 wlを混合 する。 また、 Fluo 3- AM (同仁化学研究所） 2バイアル（50 ^g)をジメチルスル フオキサイド 40 X K 20% Pluronic acid (Molecular Probes社） 40 lに溶 解し、 これを上記 H/HBSS— Probenecid— FBS に加え、 混和後、 8連ピペットを用 いて培養液を除いた細胞プレートに各ゥエル 100 lずつ分注し、 5% C02インキ ュべ一夕一中にて 37でで 1時間インキュベートする （色素ローデイング） 。 アツ セィ用サンプル （各フラクション） に、 2.5 mM Probenecid, 0.1% CHAPSを含む H/HBSS 150 ilを加えて希釈し、 FL I PR用 96穴プレート （V- Bot tomプレー 卜、 Coster社） へ移す （以後、 サンプルプレートとする） 。 細胞プレー卜の色素 ローデイング終了後、 H/HBSSに 2.5 mM Probenecidを加えた洗浄バッファーでプ レートゥォッシャ一（Molecular Devices社）を用いて細胞プレートを 4回洗浄し, 洗浄後 100 ； 1の洗浄バッファーを残す。 この細胞プレートとサンプルプレート を FLIPRにセットしアツセィを行う （FLIPRにより、 サンプルプレートから 50 \ のサンプルが細胞プレートへと移される） 。
〔6〕 受容体を発現する細胞に、 受容体ァゴニストを添加すると、 細胞内イノ シトール三リン酸濃度は上昇する。 本発明のペプチドの、 本発明の蛋白質発現細 胞における細胞内ィノシトール三リン酸産生活性を利用することにより、 本発明 のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングす ることができる。
具体的には、 標識したイノシトールの存在下、 本発明のペプチドを、 本発明の 蛋白質発現細胞に接触させた場合と、 本発明のペプチドおよび試験化合物を、 本 発明の蛋白質発現細胞に接触させた場合における、 イノシトール三リン酸産生活 性を測定し、 比較することにより、 本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合 性を変化させる化合物をスクリ一ニングする。 測定は公知の方法に従って行う。 本方法において、 イノシトール三リン酸産生活性を抑制する試験化合物を、 拮 抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
一方、 試験化合物のみを本発明の蛋白質発現細胞に接触させ、 イノシトール三 リン酸産生上昇を測定することによってァゴニス卜のスクリーニングを行なうこ ともできる。
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の蛋白質発現細胞を 24穴プレートに播き、 1日間培養する。 その後、 myo-[2-¾] inositol (2.5^Ci/wel 1) を添加した培地で 1日間培養し、 細胞を放 射活性を有するィノシトールを無添加の培地でよく洗浄する。 本発明のぺプチド または本発明のペプチドおよび試験化合物を添加後、 10%過塩素酸を加え、 反 応を止める。 1. 5M 水酸化カリウムおよび 6 OmM HEPES溶液で中和し、 0. 5m lの AG 1 x 8樹脂 （Bio- Rad) を詰めたカラムに通し、 5mM 四ホウ 酸ナトリウム （Na2B4〇7) および 60mM ギ酸アンモニゥムで洗诤した後、 1M ギ酸アンモニゥムおよび 0. 1M ギ酸で溶出した放射活性を、 液体シンチ レーシヨンカウンターで測定する。 本発明のペプチドを添加しない場合の放射活 性を 0%、 本発明のペプチドを添加した場合の放射活性を 100%とし、 試験化 合物の、 本発明のペプチドと本発明の蛋白質の結合に対する影響を算出する。 ィノシトール三リン酸産生活性が、 例えば 50 %以下になる試験化合物を拮抗 阻害能力のある候補物質として選択することができる。
〔7〕 TRE—レポーター遺伝子べクタ一を用いて、 本発明のペプチドの本発 明の蛋白質発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、 本発明のぺプチド と本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることがで さる。
TRE (TPA response element) を含む DNAを、 ベクタ一のレポーター遺伝 子上流に挿入し、 TRE—レポーター遺伝子ベクターを得る。 TRE—レポ一夕 一遺伝子ベクターを導入した本発明の蛋白質発現細胞において、 細胞内カルシゥ ム濃度の上昇を伴う刺激は、 TREを介したレポーター遺伝子発現と、 それに引 き続くレポーター遺伝子の遺伝子産物 （蛋白質） の産生を誘導する。 つまり、 レ ポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を測定することにより、 TRE—レポ一夕一遺 伝子ベクター導入細胞内のカルシウム量の変動を検出することができる。
具体的には、 本発明のペプチドを、 TRE—レポーター遺伝子ベクター導入本 発明の蛋白質発現細胞に接触させた場合と、 本発明のペプチドおよび試験化合物 を、 T R E—レポーター遺伝子ベクター導入本発明の蛋白質発現細胞に接触させ た場合における、 レポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を測定し、 比較することに より、 本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスク リーニングする。
ベクタ一としては、 例えば、 ピツカジーン べィシックべクタ一、 ピツカジ一 ン ェンハンサーベクタ一 （東洋インキ製造 （株） ） などが用いられる。 TRE を含む DNAを、 上記べクタ一のレポーター遺伝子、 例えばルシフェラーゼ遺伝 子上流のマルチクローニングサイトに揷入し、 TRE—レポ一夕一遺伝子べクタ —とする。 本方法において、 本発明のペプチドによるレポーター遺伝子蛋白質の酵素活性 を抑制する試験化合物を、 拮抗阻害能力のある候補物質として選択することがで さる。
一方、 試験化合物のみを T R E -レポ一ター遺伝子ベクター導入本発明の蛋白 質発現細胞に接触させ、 本発明のペプチドと同様な発光量の増加を測定すること によりァゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
レポ一夕一遺伝子として、 ルシフェラ一ゼを利用する例を用いて、 このスクリ —ニング方法の具体例を以下に述べる。
TRE—レポ一夕一遺伝子 （ルシフェラ一ゼ） を導入した本発明の蛋白質発現 細胞を、 24穴プレートに 5 X 103 c e 1 1 Zwe 1 1で播種し、 48時間培 養する。 細胞を 0. 05% BSAおよび 20mM HEPESを含むハンクス バッファー （pH7. 4) で洗浄した後、 10 ηΜの本発明のペプチドまたは 1 0 ηΜの本発明のペプチドおよび試験化合物を添加し、 37 で 60分間反応さ せる。 細胞をピツカジーン用細胞溶解剤 （東洋インキ製造 （株） ） で溶かし、 溶 解液に発光基質 （東洋インキ製造 （株） ） を添加する。 ルシフェラーゼによる発 光は、 ルミノメーター、 液体シンチレ一シヨンカウンターまたはトップカウンタ —により測定する。 本発明のペプチドを添加した場合と、 Ι Ο ηΜの本発明のぺ プチドおよび試験化合物を添加した場合のルシフェラーゼによる発光量を測定し て、 比較する。
本発明のペプチドによる細胞内カルシウムの上昇によって、 ルシフェラ一ゼに よる発光量が増加する。 この増加を抑制する化合物を拮抗阻害能力のある候補物 質として選択することができる。
レポーター遺伝子として、 例えば、 アルカリフォスファターゼ、 クロラムフエ ニコ一リレ ·ァセチルトランスフェラーゼ (chloramphenicol
acetyltransferase) 、 /3—ガラクトシダ一ゼなどの遺伝子を用いてもよい。 こ れらのレポーター遺伝子蛋白質の酵素活性は、 公知の方法に従い、 または市販の 測定キットを用いて測定する。 アルカリフォスファターゼ活性は、 例えば和光純 薬製 Lumi- Phos 530を用いて、 クロラムフエ二コール ·ァセチルトランスフェラ ーゼ活性は、 例えば和光純薬製 FAST CAT chrolamphenicol Acetyltransferase Assay KiTを用いて、 /3—ガラクトシダーゼ活性は、 例えば和光純薬製 Aurora Ga卜 XEを用いて測定する。
〔8〕 本発明の蛋白質発現細胞は、 本発明のペプチドの刺激により、 MAPキ ナーゼが活性化され、 増殖する。 この反応を利用して、 本発明のペプチドの本発 明の蛋白質発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、 本発明のペプチド と本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることがで きる。
具体的には、 本発明のペプチドを、 本発明の蛋白質発現細胞に接触させた場合 と、 本発明のペプチドおよび試験化合物を、 本発明の蛋白質発現細胞に接触させ た場合における、 細胞増殖を測定し、 比較することにより、 本発明のペプチドと 本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
本発明の蛋白質発現細胞の増殖は、 例えば、 MAPキナーゼ活性、 チミジン取 り込み活性、 細胞数などを測定すればよい。
具体例としては、 MAPキナーゼ活性については、 本発明のペプチドまたは本 発明のペプチドおよび試験化合物を、 本発明の蛋白質発現細胞に添加した後、 細 胞溶解液から抗 M A Pキナーゼ抗体を用いた免疫沈降により M A Pキナーゼ分画 を得た後、 公知の方法、 例えば和光純薬製 MAP Kinase Assay Kitおよびァー [32 P] _ATPを使用して MAPキナーゼ活性を測定し、 比較する。
チミジン取り込み活性については、 本発明の蛋白質発現細胞を 24穴プレート に播種し、 培養し、 本発明のペプチドまたは本発明のペプチドおよび試験化合物 を添加した後、 放射活性により標識したチミジン （例、 [methy卜3 H]-チミジンな ど） を加え、 その後、 細胞を溶解し、 細胞内に取り込まれたチミジンの放射活性 を、 液体シンチレ一シヨンカウンタ一で計数することにより、 チミジン取り込み 活性を測定し、 比較する。
細胞数の測定については、 本発明の蛋白質発現細胞を 24穴プレートに播種し. 培養し、 本発明のペプチドまたは本発明のペプチドおよび試験化合物を添加した 後、 MTT (3- (4, 5-dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazol ium bromide) を添加する。 細胞内に取り込まれて MTTが変化した MTTホルマザ ンを、 塩酸にて酸性としたイソプロパノール水溶液で細胞を溶解した後、 570 n mの吸収によって測定し、 比較する。
本方法において、 本発明の蛋白質発現細胞の増殖を抑制する試験化合物を、 拮 抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
一方、 試験化合物のみを本発明の蛋白質発現細胞に接触させ、 本発明のぺプチ ドと同様な細胞増殖活性を測定することによりァゴニス卜のスクリ一ニングを行 なうこともできる。
チミジン取り込み活性を利用するスクリーニング法の一具体例を以下に述べる, 本発明の蛋白質発現細胞を 2 4穴プレートに 5 0 0 0個 ウエル播き、 1日間 培養する。 次に血清を含まない培地で 2日間培養し、 細胞を飢餓状態にする。 本 発明のぺプチドまたは本発明のぺプチドおよび試験化合物を、 細胞に添加して 2 4時間培養した後、 [methy卜3 H] -チミジンをゥエル当たり 0 . 0 1 5 M B q添加 し、 6時間培養する。 細胞を P B Sで洗った後、 メタノールを添加して 1 0分間 放置する。 次に 5 %トリクロ口酢酸を添加して 1 5分間放置後、 固定された細胞 を蒸留水で 4回洗う。 0 . 3 N水酸化ナトリウム溶液で細胞を溶解し、 溶解液中 の放射活性を液体シンチレーシヨンカウン夕一で測定する。
本発明のペプチドを添加した場合の放射活性の増加を抑制する試験化合物を、 拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
〔9〕 本発明の蛋白質発現細胞は、 本発明のペプチドの刺激により、 カリウム チャネルが活性化し、 細胞内にある Kイオンが、 細胞外に流出する。 この反応を 利用して、 本発明のぺプチドの本発明の蛋白質発現細胞に対する刺激活性を測定 することにより、 本発明のぺプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化 合物をスクリーニングすることができる。
Kイオンと同族元素である R bイオン （ルビジウムイオン） は、 Kイオンと区 別無く、 カリウムチャネルを通って細胞外に流出する。 よって、 本発明の蛋白質 発現細胞に、 放射活性同位体である R b ( [ 8 6 R b ] ) を取り込ませておいた後、 本発明のペプチドの刺激によって流出する8 6 R bの流れ （流出活性） を測定する ことにより、 本発明のペプチドの本発明の蛋白質発現細胞に対する刺激活性を測 定する。
具体的には、 8 6 R bの存在下、 本発明のペプチドを、 本発明の蛋白質発現細胞 に接触させた場合と、 本発明のペプチドおよび試験化合物を、 本発明の蛋白質発 現細胞に接触させた場合における、 86Rbの流出活性を測定し、 比較することに より、 本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスク リーニングする。
本方法において、 本発明のペプチド刺激による86 Rbの流出活性の上昇を抑制 する試験化合物を、 拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。 一方、 試験化合物のみを本発明の蛋白質発現細胞に接触させ、 本発明のぺプチ ドと同様な 86 R bの流出活性の上昇を測定することによりァゴニス卜のスクリー ニングを行なうこともできる。
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の蛋白質発現細胞を 24穴プレートに播き、 2日間培養する。 その後、 lmC / 1の86 Rb CIを含む培地中で 2時間保温する。 細胞を培地でよく 洗浄し、 外液中の86 RbC 1を完全に除く。 本発明のペプチドまたは本発明のぺ プチドおよび試験化合物を細胞に添加し、 30分後外液を回収し、 ァカウンター で放射活性を測定し、 比較する。
本発明のペプチド刺激による86 Rbの流出活性の上昇を抑制する試験化合物を、 拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
〔10〕 本発明の蛋白質発現細胞が本発明のペプチドに反応し、 細胞外の pH が変化する。 この反応を利用して、 本発明のペプチドの本発明の蛋白質発現細胞 に対する刺激活性を測定することにより、 本発明のペプチドと本発明の蛋白質と の結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
具体的には、 本発明のペプチドを、 本発明の蛋白質発現細胞に接触させた場合 と、 本発明のペプチドおよび試験化合物を、 本発明の蛋白質発現細胞に接触させ た場合における、 細胞外の pH変化を測定し、 比較することにより、 本発明のぺ プチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリ一ニングする。 細胞外 pH変化は、 例えば、 Cy to s e n s o r装置 （モレキュラーデバイ ス社） を使用して測定する。
本方法において、 本発明のペプチドによる細胞外 pH変化を抑制する試験化合 物を、 拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。 一方、 試験化合物のみを本発明の蛋白質発現細胞に接触させ、 本発明のぺプチ ドと同様な細胞外 p H変化を測定することによりァゴニス卜のスクリーニングを 行なうこともできる。
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の蛋白質発現細胞を Cy to s e n s o r装置用のカプセル内で終夜培 養し、 装置のチャンバ一にセットして細胞外 pHが安定するまで約 2時間、 0. 1 % 83八を含む ？? 1 1 640培地 （モレキュラーデバイス社製） を灌流 させる。 pHが安定した後、 本発明のペプチドまたは本発明のペプチドおよび試 験化合物を含む培地を細胞上に灌流させる。 灌流によって生じた培地の pH変化 を測定し、 比較する。
本発明のペプチドによる細胞外 pH変化を抑制する化合物を拮抗阻害能力のあ る候補物質として選択することができる。
し 1 1〕 酵母 (Saccharoiyces cerevisiae CDhaploid α-mat ing Type (MAT ) の性フェロモン受容体 STe 2は、 G蛋白質 G p a 1と共役しており、 性フ エロモン a- mating factorに応答して MAPキナーゼを活性化し、 これに引き続 き、 F a r 1 (cell-cycle arrest) および転写活性化因子 S t e 1 2が活性化 される。 S t e 1 2は、 種々の蛋白質 （例えば、 接合に関与する FUS 1) の発 現を誘導する。 一方、 制御因子 S s t 2は上記の過程に抑制的に機能する。 この 系において、 受容体遺伝子を導入した酵母を作製し、 受容体ァゴニストの刺激に より酵母細胞内のシグナル伝達系を活性化し、 その結果生じる増殖などを指標と して用いる、 受容体ァゴニストと受容体との反応の測定系の試みが行なわれてい る (Trends in Biotechnology, 15卷, 487- 494頁, 1997年） 。 上記の受容体遺伝 子導入酵母の系を利用して、 本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変 化させる化合物をスクリ一ニングすることができる。
具体例を以下に示す。
MAT α酵母の S t e 2および Gp a 1をコードする遺伝子を除去し、 代わり に、 本発明の蛋白質遺伝子および Gp a 1— G a i 2融合蛋白質をコードする遣 伝子を導入する。 F a rをコードする遺伝子を除去して ceH-cycle arrestが生 じないようにし、 また、 S s tをコードする遺伝子を除去して本発明のペプチド に対する応答の感度を向上させておく。 さらに、 FUS 1にヒスチジン生合成遺 伝子 H I S 3を結合した FUS 1— H I S 3遺伝子を導入する。 この遺伝子組換 え操作は、 例えば、 Molecular and Cellular Biology, 15巻， 6188- 6195頁, 1995年に記載の方法において、 ソマトス夕チン受容体タイプ 2 (SSTR2) 遺伝子 を、 本発明の蛋白質に置き換えて実施することができる。
このように構築された形質変換酵母は、 本発明のペプチドに高感度で反応し、 その結果、 MAPキナーゼの活性化が起き、 ヒスチジン生合成酵素が合成される ようになり、 ヒスチジン欠乏培地で生育可能になる。
従って、 上記の本発明の蛋白質発現酵母 （S t e 2遺伝子および Gp a 1遺伝 子が除去され、 本発明の蛋白質遺伝子および Gp a 1 -Ga i 2融合蛋白質コー ド遺伝子が導入され、 F a r遺伝子および S s t遺伝子が除去され、 FUS 1— HI S 3遺伝子が導入された MAT α酵母） を、 ヒスチジン欠乏培地で培養し、 本発明のペプチドまたは本発明のペプチドおよび試験化合物を接触させ、 該酵母 の生育を測定し、 比較することにより、 本発明のペプチドと本発明の蛋白質との 結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
本方法において、 該酵母の生育を抑制する試験化合物を、 拮抗阻害能力のある 候補物質として選択することができる。
一方、 試験化合物のみを上記の本発明の蛋白質発現酵母に接触させ、 本発明の ぺプチドと同様な酵母の生育を測定することによりァゴニス卜のスクリーニング を行なうこともできる。
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
上記の本発明の蛋白質発現酵母を完全合成培地の液体培地で終夜培養し、 その 後、 ヒスチジンを除去した溶解寒天培地に、 2x l 04c e l lZmlの濃度に なるように加える。 ついで、 9 X 9 cmの角形シャーレに播く。 寒天が固化した 後、 本発明のペプチドまたは本発明のペプチドおよび試験化合物をしみこませた 滅菌濾紙を寒天表面におき、 30°Cで 3日間培養する。 試験化合物の影響は、 濾 紙の周囲の酵母の生育を、 本発明のペプチドのみをしみこませた滅菌濾紙を用い た場合と比較する。 また、 あらかじめ、 ヒスチジンを除去した寒天培地に本発明 のペプチドを添加しておき、 滅菌濾紙に試験化合物のみをしみこませて酵母を培 養し、 シャーレ全面での酵母の生育が濾紙の周囲で影響を受けることを観察して もよい。
酵母の生育を抑制する化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択するこ とができる。
〔1 2〕 本発明の蛋白質遺伝子 RNAをアフリカッメガエル卵母細胞に注入し、 本発明のペプチドによって刺激すると細胞カルシウム濃度が上昇して、 calcium - activated chloride currentが生じる。 これは、 膜電位の変化としてとらえるこ とができる （Kイオン濃度勾配に変化がある場合も同様） 。 本発明のペプチドに よって生じる本発明の蛋白質導入アフリカッメガエル卵母細胞における上記反応 を利用して、 本発明のペプチドの本発明の蛋白質発現細胞に対する刺激活性を測 定することにより、 本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる 化合物をスクリーニングすることができる。
具体的には、 本発明のペプチドを、 本発明の蛋白質遺伝子 RNA導入アフリカ ッメガエル卵母細胞に接触させた場合と、 本発明のペプチドおよび試験化合物を、 本発明の蛋白質遺伝子 RNA導入アフリカッメガエル卵母細胞に接触させた場合 における、 細胞膜電位の変化を測定し、 比較することにより、 本発明のペプチド と本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
本方法において、 細胞膜電位変化を抑制する試験化合物を、 拮抗阻害能力のあ る候補物質として選択することができる。
—方、 試験化合物のみを本発明の蛋白質遺伝子 RNA導入アフリカッメガエル 卵母細胞に接触させ、 本発明のぺプチドと同様な細胞膜電位変化を測定すること によりァゴニストのスクリ一ニングを行なうこともできる。
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
氷冷して動けなくなった雌のアフリカッメガエルから取り出した、 卵母細胞塊 を、 MBS液 （88mM NaCl, lmM KC1, 0.41mM CaCl2, 0.33mM Ca(N03)2, 0.82mM
MgS04, 2.4mM NaHC03, lOmM HEPES； pH7.4) に溶かしたコラゲナ一ゼ （ 0. 5m g/m 1 ) で卵塊がほぐれるまで 1 9 、 ：！〜 6時間、 1 50 r pmで処理する。 外液を MB S液に置換することで 3度洗浄し、 マイクロマニピュレーターで本発 明の蛋白質遺伝子 p o 1 y A付加 c RNA (50 ng/50 n 1) を卵母細胞 にマイクロインジェクションする。
本発明の蛋白質遺伝子 mR N Aは、 組織や細胞から調製してもよく、 プラスミ ドから in vi t roで転写してもよい。 本発明の蛋白質遺伝子 mR N Aを M B S液中 で 2 0 °Cで 3日培養し、 これを Ringer液を流している vo l tage c l a即装置のくぼ みに置き、 電位固定用ガラス微小電極および電位測定用ガラス微小電極を細胞内 に刺入し、 （一） 極は細胞外に置く。 電位が安定したら、 本発明のペプチドまた は本発明のペプチドおよび試験化合物を含む Ringer液を流して電位変化を記録す る。 試験化合物の影響は、 本発明の蛋白質遺伝子 R NA導入アフリカッメガエル 卵母細胞の細胞膜電位変化を、 本発明のぺプチドのみ含む Ringer液を流した場合 と比較することによって測定することができる。
細胞膜電位変化を抑制する化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択す ることができる。
上記の系において、 電位の変化量を増大させると、 測定しやすくなるため、 各 種の G蛋白質遺伝子の p o 1 y A付加 R N Aを導入してもよい。 また、 カルシ ゥム存在下で発光を生じるような蛋白質 （例、 aequor inなど） の遺伝子の p o l y A付加 R NAを共インジェクションすることにより、 膜電位変化ではなく発 光量を測定することもできる。
さらに、 哺乳動物由来の内皮細胞を使用したスクリーニング方法について、 以 下に述べる。
哺乳動物由来の血管内皮細胞、 好ましくは大動脈血管内皮細胞、 より好ましく は毛細血管内皮細胞、 さらに好ましくはの内分泌組織 （例、 副腎、 卵巣、 精巣な ど） 由来の毛細血管内皮細胞を用いて以下の方法などにより血管新生阻害作用を 有する化合物をスクリ一二ングすることができる。
1 ) 試験化合物の存在下および非存在下、 培養用プレートに培養した内皮細胞 または内皮細胞由来の膜画分に、 本発明のペプチドまたは M I T 1類の放射性ョ 一ド標識体を接触させ、 放射性ョード標識体の内皮細胞または膜画分への結合を 測定し、 比較することにより、 放射性ョード標識体の内皮細胞または膜画分への 結合を阻害する化合物をスクリーニングする。
2 ) 試験化合物の存在下および非存在下、 本発明のペプチドまたは M I T類で 内皮細胞刺激し、 細胞内カルシウムイオン濃度の上昇反応を測定し、 比較するこ とにより、 本発明のペプチドまたは M I T 1類に依存した細胞内カルシウムィォ ン濃度上昇を抑制する化合物をスクリーニングする。
3) 試験化合物の存在下および非存在下、 本発明のペプチドまたは M I T類で 内皮細胞を刺激し、 MAPキナーゼ量、 チミジン取り込み反応量または細胞増殖 速度を測定し、 比較することにより、 本発明のペプチドあるいは M I Tに依存し た MAPキナーゼ量、 チミジン取り込み反応量または細胞増殖速度上昇を抑制す る化合物ををスクリ一ニングする。
血管新生阻害剤をスクリーニングするには、 直接上記 3) の方法を実施しても よく、 上記 1) 、 2)、 3) の順に従い、 または上記 2)、 3) の順に従い実施し てもよい。 上記 1) 、 2)、 3) の順、 または上記 2)、 3) の順で実施すると、 効率的にスクリーニングを行うことができる。
本発明のスクリーニング用キットは、 本発明の蛋白質、 本発明の蛋白質を含有 する細胞、 本発明の蛋白質を含有する細胞の膜画分、 または哺乳動物 （例、 ヒト、 サル、 ゥシ、 ブタ、 ラット、 マウスなど） 由来の内皮細胞および本発明のぺプチ ドを含有するものである。
本発明のスクリーニング用キットの例としては、 次のものがあげられる。
1. スクリーニング用試薬
(i) 測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution (ギブコ社製） に、 0.05%のゥシ血清アル ブミン （シグマ社製） を加えたもの。
孔径 0.45 のフィルタ一で濾過滅菌し、 4 で保存するか、 あるいは用 時調製しても良い。
(ii) 本発明の蛋白質の標品
本発明の蛋白質を発現させた CHO細胞、 または哺乳動物 （例、 ヒト、 サル、 ゥシ、 ブ夕、 ラット、 マウスなど） 由来の内皮細胞を、 12穴プレートに 5 X I 05個 穴で継代し、 37t：、 5%C〇2、 95%a i rで 2日間培養したもの。
(iii) 標識リガンド
〔3H〕 、 〔125 I〕 、 〔14C〕 、 〔35S〕 などで標識した本発明のペプチド。 適当な溶媒または緩衝液に溶解したものを 4°Cあるいは— 20°Cにて保存し、 用時に測定用緩衝液にて 1 に希釈する。
(iv) リガンド標準液 ' 本発明のペプチドを 0.1 %ゥシ血清アルブミン （シグマ社製） を含む PBS で ImMとなるように溶解し、 — 20°Cで保存する。
2. 測定法
(i) 12穴組織培養用プレートにて培養した本発明の蛋白質を発現させた細胞 または哺乳動物 （例、 ヒト、 サル、 ゥシ、 ブ夕、 ラット、 マウスなど） 由来の内 皮細胞を、 測定用緩衝液 1 m 1で 2回洗浄した後、 490 ^ 1の測定用緩衝液を 各穴に加える。
(ii) 10一3〜 10— 1QMの試験化合物溶液を 5 1加えた後、 標識した本発明 のペプチドを 5 1加え、 室温にて 1時間反応させる。 非特異的結合量を知るた めには試験化合物のかわりに 10— 3 Mの本発明のペプチドを 5 ;α 1加えておく。
(iii) 反応液を除去し、 lm 1の洗浄用緩衝液で 3回洗浄する。 細胞に結合し た標識した本発明のペプチドを 0.2 N NaOH— 1 %SDSで溶解し、 4m
1の液体シンチレ一ター A (和光純薬製） と混合する。
(iv) 液体シンチレーシヨンカウンター （ベックマン社製） を用いて放射活性を 測定し、 Percent Maximum Binding (PMB) を次の式で求める。
PMB= [ (B-NS B) / (B。一 NSB) ] X 100
PMB ： Percent Maximum Binding
B ：検体を加えた時の値
NSB ： Non-specific Binding (非特異的結合量)
B。 ：最大結合量
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物またはその塩は、 本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合を変化させ る （結合を阻害または促進する） 化合物であり、 具体的には本発明の蛋白質を介 して細胞刺激活性を有する化合物またはその塩 （いわゆる本発明の蛋白質のァゴ 二スト） 、 または該刺激活性を有しない化合物 （いわゆる本発明の蛋白質のアン 夕ゴニスト） などである。 該化合物としては、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性 化合物、 合成化合物、 発酵生産物などがあげられ、 これら化合物は新規な化合物 であってもよいし、 公知の化合物であってもよい。
上記の化合物が、 本発明の蛋白質のァゴニストであるか、 アン夕ゴニストであ るかの具体的な評価方法は、 例えば以下の （A) または （B) に従えばよい。
(A) 前記のスクリーニング方法で示されるバインディング ·アツセィを行い、 本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる （特に、 結合を阻害 する） 化合物を得た後、 該化合物が上記した本発明の蛋白質を介する細胞刺激活 性を有しているか否かを測定する。 細胞刺激活性を有する化合物またはその塩は 本発明の蛋白質のァゴニストであり、 該活性を有しない化合物またはその塩は本 発明の蛋白質のアン夕ゴニストである。
( B ) (a)試験化合物を本発明の蛋白質を含有する細胞に接触させ、 上記本発明 の蛋白質を介した細胞刺激活性を測定する。 細胞刺激活性を有する化合物または その塩は本発明の蛋白質のァゴニス卜である。
(b) 本発明の蛋白質を活性化する化合物を本発明の蛋白質を含有する細胞に接触 させた場合と、 本発明の蛋白質を活性化する化合物および試験化合物を本発明の 蛋白質を含有する細胞に接触させた場合における、 本発明の蛋白質を介した細胞 刺激活性を測定し、 比較する。 本発明の蛋白質を活性化する化合物による細胞刺 激活性を減少させ得る化合物またはその塩は本発明の蛋白質のアン夕ゴニストで ある。
該本発明の蛋白質のァゴニストは、 本発明の蛋白質に対する本発明のペプチド が有する生理活性と同様の作用を有しているので、 本発明のペプチドと同様に安 全で低毒性な医薬として有用である。
本発明の蛋白質アン夕ゴニストは、 本発明の蛋白質に対する本発明のぺプチ ドが有する生理活性を抑制することができるので、 該受容体活性を抑制する安全 で低毒性な医薬として有用である。
本発明の蛋白質アン夕ゴニストとして、 例えば、 本発明のペプチドまたは M I T 1類と本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物、 好ましくは、
(i) 本発明のペプチドの活性を阻害する化合物またはその塩、
(i i) 本発明の蛋白質の活性を阻害する化合物またはその塩、 (i i i) 本発明のペプチドまたは M I T 1類と本発明の蛋白質との結合を阻害す る化合物またはその塩、
(iv) 本発明のペプチドまたは M I T 1類の、 本発明の蛋白質の活性化作用を阻 害する化合物またはその塩などが挙げられる。
本発明のペプチドは血管内皮細胞の増殖などを制御する活性などを有するため、 例えば、 本発明の蛋白質のァゴニストは、 例えば、 血管造成剤などの医薬として 用いることができる。
また、 本発明の蛋白質のアン夕ゴニストは、 血管新生阻害剤として、 例えば血 管新生を伴う疾患 〔例、 癌 （例、 降臓癌、 肺癌、 腎臓癌、 肝臓癌、 非小細胞肺癌、 卵巣癌、 前立腺癌、 胃癌、 膀胱癌、 乳癌、 子宮頸部癌、 結腸癌、 直腸癌、 力ポジ 肉腫など） 、 卵巣疾患 （例、 多嚢胞性卵巣症候群 （卵巣多嚢胞症） 、 卵巣過剰刺 激症など） 、 炎症性疾患 （例、 関節リューマチなど） 、 糖尿病性網膜症など〕など の予防 ·治療剤などの低毒性で安全な医薬として用いることができる。
上記の化合物の塩としては、 例えば、 薬学的に許容可能な塩などが用いられる。 例えば、 無機塩基との塩、 有機塩基との塩、 無機酸との塩、 有機酸との塩、 塩基 性または酸性アミノ酸との塩などがあげられる。
無機塩基との塩の好適な例としては、 例えばナトリウム塩、 カリウム塩などの アルカリ金属塩、 カルシウム塩、 マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、 な らびにアルミニウム塩、 アンモニゥム塩などがあげられる。
有機塩基との塩の好適な例としては、 例えばトリメチルァミン、 トリェチルァ ミン、 ピリジン、 ピコリン、 2, 6—ルチジン、 エタノールァミン、 ジエタノール ァミン、 トリエタノールァミン、 シクロへキシルァミン、 ジシクロへキシルアミ ン、 N， N， —ジベンジルエチレンジァミンなどとの塩などがあげられる。
無機酸との塩の好適な例としては、 例えば塩酸、 臭化水素酸、 硫酸、 リン酸な どとの塩があげられる。
有機酸との塩の好適な例としては、 例えばギ酸、 酢酸、 プロピオン酸、 フマル 酸、 シユウ酸、 酒石酸、 マレイン酸、 クェン酸、 コハク酸、 リンゴ酸、 メタンス ルホン酸、 ベンゼンスルホン酸、 安息香酸などとの塩があげられる。
塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、 例えばアルギニン、 リジン、 オル チニンなどとの塩があげられ、 酸性アミノ酸との好適な例としては、 例えばァス パラギン酸、 ダル夕ミン酸などとの塩があげられる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリ一ニング用キットを用いて得られる 化合物またはその塩を上述の医薬として使用する場合、 常套手段に従って実施す ることができる。 例えば、 必要に応じて糖衣や腸溶性被膜を施した錠剤、 カプセ ル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水もし くはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注 射剤の形で非経口的に使用できる。 例えば、 該化合物またはその塩を生理学的に 認められる担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとと もに一般に認められた単位用量形態で混和することによって製造することができ る。 これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるよ うにするものである。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えばゼラチ ン、 コーンスターチ、 トラガントガム、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セ ルロースのような陚形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような 膨化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカ リンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのような香味剤 などが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 前記タイプの材料 にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成 物は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然 産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施にしたがって処方 することができる。
注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を 含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナトリウムな ど） などがあげられ、 適当な溶解補助剤、 たとえばアルコール （たとえばェ夕ノ —ル） 、 ポリアルコール （たとえばプロピレングリコール、 ポリエチレングリコ ール） 、 非イオン性界面活性剤 （たとえばポリソルベート 8 0 TM、 H C O - 5 0 ) などと併用してもよい。 油性液としてはゴマ油、 大豆油などがあげられ、 溶 解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと併用してもよい。 また、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩輯衝液、 酢酸ナトリウム緩衝液） 、 無痛化剤 (例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロ力インなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒ ト血清アルブミン、 ポリエチレングリコールなど） 、 保存剤 （例えば、 ベンジル アルコール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤などと配合してもよい。 調製された 注射液は通常、 適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば哺乳動物 （例 えば、 ヒト、 マウス、 ラット、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） に対して投与することができる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物またはその塩の投与量は、 症状などにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に成人 （体重 6 0 k gとして） においては、 一日につき約 0. l〜1000mg、 好ましくは約 1.0〜300mg、 より好ましくは約 3.0〜50mgである。 非経口的に投与 する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによつ ても異なるが、 たとえば注射剤の形では成人の癌患者 （体重 60kgとして） への投 与においては、 一日につき約 0.01〜30mg、 好ましくは約 0. l〜20mg、 より好まし くは約 0. l〜10mgを静脈注射により投与する。 他の動物の場合も、 60kg当たりに 換算した量を投与することができる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物またはその塩は、 他の薬剤、 例えば化学療法剤 〔例、 ィホスフアミド
(Ifosfamide) 、 アドリアマイシン （Adr iamycin) 、 ぺプロマイシン
(Peplomycin) 、 シスプラチン （Cisplatin) 、 シクロフォスフアミド
(Cyclophosphamide) 、 5_FU、 UFT、 メトレキセート （Methotrexate) 、 マイトマイシン C (Mitomycin C) 、 マイトキサントロン （Mi toxantrone) な ど〕 などと併用してもよい。
(6) 本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド、 または本発明の蛋白質 をコードするポリヌクレオチドを用いる血管新生阻害剤のスクリーニング方法 具体的には、 例えば、 （a) 本発明のペプチドまたは本発明の蛋白質を産生す る能力を有する細胞を培養した場合と （iv) 本発明のペプチドまたは本発明の蛋 白質を産生する能力を有する細胞と試験化合物の混合物を培養した場合との比較 を行い、 血管新生阻害剤をスクリーニングする。
上記スクリーニング方法においては、 例えば、 （a) と （b) の場合における、 本発明のペプチドまたは本発明の蛋白質の遺伝子の発現量 （具体的には、 蛋白質 量または該蛋白質をコードする mRNA量） を測定して、 比較する。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合成 化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などが挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であってもよい。 本スクリーニング方法を実施するには、 本発明のペプチドまたは本発明の蛋白 質を産生する能力を有する細胞をスクリーニングに適したバッファーに浮遊して 調製する。 バッファ一には、 pH約 4〜10 (望ましくは、 pH約 6〜8) のリン酸バッ ファー、 ほう酸バッファーなどが用いられる。
本発明のペプチドまたは本発明の蛋白質を産生する能力を有する細胞としては、 例えば、 前述した本発明のペプチドまたは本発明の蛋白質をコードする DNAを 含有するベクターで形質転換された宿主 （形質転換体） が用いられる。 宿主とし ては、 例えば、 CHO細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。 該スクリー二 ングには、 例えば、 前述の方法で培養することによって、 本発明のペプチドまた は本発明の蛋白質を発現させた形質転換体が好ましく用いられる。
本発明のペプチドまたは本発明の蛋白質の蛋白量の測定は、 公知の方法、 例え ば、 本発明のペプチドまたは本発明の蛋白質を認識する抗体を用いて、 細胞抽出 液中などに存在する前記蛋白質を、 ウエスタン解析、 ELISA法などの方法または それに準じる方法に従い測定することができる。 '
本発明のペプチドまたは本発明の蛋白質の遺伝子発現量は、 自体公知の方法、 例えは、 ノ一サンフロッティンクゃ Reverse transcription - polymerase chain reaction (RT-PCR) 、 リアルタイム P C R解析システム （ABI社製、
TaqMan polymerase chain reaction) などの方法あるいはそれに準じる方法にし たがつて測定することができる。
例えば、 上記 （b) の場合における蛋白質の遺伝子発現量を、 上記 （a) の場合 に比べて、 約 20%以上、 好ましくは 30%以上、 より好ましくは約 50%以上 阻害する試験化合物を、 血管新生阻害剤として選択することができる。
( 7 ) 本発明のペプチド、 M I T 1類または本発明の蛋白質に対する抗体を用い る血管新生阻害剤のスクリーニング方法
具体的には、 例えば、 （a) 本発明のペプチド、 M I T 1類または本発明の蛋 白質を産生する能力を有する細胞を培養した場合と （b) 本発明のペプチド、 M I T 1類または本発明の蛋白質を産生する能力を有する細胞と試験化合物の混合 物を培養した場合との比較を、 本発明のペプチド、 M I T 1類または本発明の蛋 白質に対する抗体を用いて行い、 血管新生阻害剤をスクリーニングする。
上記スクリーニング方法においては、 例えば、 （a) と （b) の場合における、 本発明のペプチド、 M I T 1類または本発明の蛋白質の発現量 （具体的には、 蛋 白質量） を上記抗体を用いて測定して、 比較する。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合成 化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などが挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であってもよい。 本スクリーニング方法を実施するには、 本発明のペプチド、 M I T 1類または 本発明の蛋白質を産生する能力を有する細胞をスクリーニングに適したバッファ 一に浮遊して調製する。 バッファーには、 pH約 4〜10 (望ましくは、 pH約 6〜8) のリン酸バッファー、 ほう酸バッファーなどが用いられる。
本発明のペプチド、 M I T 1類または本発明の蛋白質を産生する能力を有する 細胞としては、 例えば、 前述した本発明のペプチド、 M I T 1類または本発明の 蛋白質をコードする D NAを含有するべクタ一で形質転換された宿主 （形質転換 体） が用いられる。 宿主としては、 例えば、 C H O細胞などの動物細胞が好まし く用いられる。 該スクリーニングには、 例えば、 前述の方法で培養することによ つて、 本発明のペプチド、 M I T 1類または本発明の蛋白質を発現させた形質転 換体が好ましく用いられる。
例えば、 上記 （b) の場合における蛋白質の発現量を、 上記 （a) の場合に比べ て、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上阻害す る試験化合物を、 血管新生阻害剤として選択することができる。 ( 8 ) 内皮細胞増殖阻害作用を有する化合物またはその塩を含有してなる血管新 生阻害剤。
内皮細胞増殖阻害作用を有する化合物またはその塩としては、 内皮細胞増殖阻 害作用を有する化合物またはその塩であれば、 いずれのものでもよい。
該化合物またはその塩は、 血管新生阻害剤として用いられ、 例えば、 血管新生 を伴う疾患 〔例、 癌 （例、 滕臓癌、 肺癌、 腎臓癌、 肝臓癌、 非小細胞肺癌、 卵巣 癌、 前立腺癌、 胃癌、 膀胱癌、 乳癌、 子宮頸部癌、 結腸癌、 直腸癌、 力ポジ肉腫 など） 、 卵巣疾患 （例、 多嚢胞性卵巣症候群 （卵巣多嚢胞症） 、 卵巣過剰刺激症 など） 、 炎症性疾患 （例、 関節リューマチなど） 、 糖尿病性網膜症など〕 等の予 防 ·治療剤などの医薬として安全に用いられる。
このような医薬として使用する場合、 前述の本発明のスクリーニング方法また はスクリーニング用キットを用いることにより得られる化合物を医薬として実施 する場合と同様にして実施することができる。
( 9 ) 本発明の蛋白質または本発明のペプチドの定量
本発明の抗体は、 本発明の蛋白質を特異的に認識することができるので、 被検 液中の本発明の蛋白質または本発明のペプチド （以下、 （9 ) 項では本発明の蛋 白質と略記する） の定量、 特にサンドイッチ免疫測定法による定量等に使用する ことができる。
すなわち、 本発明は、
(0 本発明の抗体と、 被検波および標識化された本発明の蛋白質とを競合的に 反応させ、 該抗体に結合した標識化された本発明の蛋白質の割合を測定すること を特徴とする被検液中の本発明の蛋白質の定量法、 および
( i i ) 被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の別 の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化担体上の標識剤の活性 を測定することを特徴とする被検液中の本発明の蛋白質の定量法を提供する。 また、 本発明の蛋白質に対するモノクローナル抗体 （以下、 本発明のモノクロ ーナル抗体と称する場合がある） を用いて本発明の蛋白質の定量を行なえるほか 組織染色等による検出を行なうこともできる。 これらの目的には、 抗体分子その ものを用いてもよく、 また、 抗体分子の F (ab' ) 2 、 Fa または Fab画分を用いても よい。
本発明の抗体を用いる本発明の蛋白質の定量法は、 特に制限されるべきもの ではなく、 被測定液中の抗原量 （例えば、 本発明のペプチド量） に対応した抗体、 抗原もしくは抗体一抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、 こ れを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法で あれば、 いずれの測定法を用いてもよい。 例えば、 ネフロメトリー、 競合法、 ィ ムノメトリック法およびサンドィツチ法が好適に用いられるが、 感度、 特異性の 点で、 後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、 例えば、 放射性同位元 素、 酵素、 蛍光物質、 発光物質、 ランタニド元素等が用いられる。 放射性同位元 素としては、 例えば、 〔1251〕 、 〔1311〕 、 〔¾〕 、 〔"C〕 、 〔32P〕 、 〔33P〕 、 C35S) 等が用いられる。 上記酵素としては、 安定で比活性の大きなものが好まし く、 例えば、 ]3—ガラクトシダ一ゼ、 ）3—ダルコシダーゼ、 アルカリフォスファ 夕一ゼ、 パーォキシダーゼ、 リンゴ酸脱水素酵素等が用いられる。 蛍光物質とし ては、 例えば、 シァニン蛍光色素 （例、 Cy2、 Cy3、 Cy5、 Cy5. 5、 Cy7 (アマシャ ムバイオサイエンス社製） など） 、 フルォレスカミン、 フルォレツセンイソチォ シァネ一ト等が用いられる。 発光物質としては、 例えば、 ルミノール、 ルミノ一 ル誘導体、 ルシフェリン、 ルシゲニン等が用いられる。 さらに、 抗体あるいは抗 原と標識剤との結合にピオチン一アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化にあたっては、 物理吸着を用いてもよく、 また通常 ペプチドあるいは酵素等を不溶化、 固定化するのに用いられる化学結合を用いる 方法でもよい。 担体としては、 ァガロース、 デキストラン、 セルロース等の不溶 性多糖類、 ポリスチレン、 ポリアクリルアミド、 シリコン等の合成樹脂、 あるい はガラス等が挙げられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクロ一ナル抗体に被検液を 反応させ （1次反応） 、 さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体を反 応させ （2次反応） たのち、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより 被検液中の本発明のぺプチド量を定量することができる。 1次反応と 2次反応は 逆の順序に行っても、 また、 同時に行なってもよいし時間をずらして行なっても よい。 標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。 また、 サンドイッチ法による免疫測定法において、 固相用抗体あるいは標識用抗体に用 いられる抗体は必ずしも 1種類である必要はなく、 測定感度を向上させる等の目 的で 2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドィツチ法による本発明のぺプチドの測定法においては、 1次反 応と 2次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、 本発明のぺプチドの 結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。 すなわち、 1次反応および 2次反応に用いられる抗体は、 例えば、 2次反応で用いられる抗体が、 本発明の ペプチドの C端部を認識する場合、 1次反応で用いられる抗体は、 好ましくは C 端部以外、 例えば N端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドィツチ法以外の測定システム、 例えば、 競合法、 ィムノメトリック法あるいはネフロメトリー等に用いることができる。 競合法では、 被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させた のち、 未反応の標識抗原（F ) と、 抗体と結合した標識抗原 （B ) とを分離レ
( B Z F分離） 、 B， Fいずれかの標識量を測定し、 被検波中の抗原量を定量す る。 本反応法には、 抗体として可溶性抗体を用い、 B Z F分離をポリエチレング リコール、 前記抗体に対する第 2抗体等を用いる液相法、 および、 第 1抗体とし て固相化抗体を用いるか、 あるいは、 第 1抗体は可溶性のものを用い第 2抗体と して固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
ィムノメトリック法では、 被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗 体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、 あるいは、 被検波中の抗 原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、 次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗 体を固相に結合させたのち、 固相と液相を分離する。 次に、 いずれかの相の標識 量を測定し被検波中の抗原量を定量する。
また、 ネフロメトリーでは、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じ た不溶性の沈降物の量を測定する。 被検液中の抗原量が僅かであり、 少量の沈降 物しか得られない場合にもレ一ザ一の散乱を利用するレーザーネフロメトリー等 が好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、 特 別の条件、 操作等の設定は必要とされない。 それぞれの方法における通常の条件、 操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明の蛋白質の測定系を構築すれ ばよい。 これらの一般的な技術手段の詳細については、 総説、 成書等を参照する ことができる。
例えば、 入江 寛編 「ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 49年発行） 、 入 江 寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 54年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （医学書院、 昭和 53年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定 法」 （第 2版） （医学書院、 昭和 57年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 (第 3版) (医学書院、 昭和 62年発行） 、 「Methods in ENZYMOLOGYj Vol.
70 (Immunochemical Techniques (Part A))、 同書 Vol. 73 (Immunochemical
Techniques (Part B))、 同書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C))、 同書 Vol. 8 (Immunochemical Techniques (Part D:Selected Immunoassays))、 同書 Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)), 同書 Voし■ 121 (Immunochemical
Techniques (Part I： Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (以上、 アカデミックプレス社発行)等を参照することができる。
以上のようにして、 本発明の抗体を用いることによって、 本発明の蛋白質を感 度良く定量することができる。
さらには、 本発明の抗体を用いて本発明の蛋白質の濃度を定量することによつ て、 本蛋白質は卵巣や精巣などの毛細血管内皮細胞に発現量が高いため、 本発明 の蛋白質の濃度の増多が検出された場合、 これらの臓器での毛細血管内皮細胞の 増殖を伴う疾患、 例えば、 癌 （例、 滕臓癌、 肺癌、 腎臓癌、 肝臓癌、 非小細胞肺 癌、 卵巣癌、 前立腺癌、 胃癌、 膀胱癌、 乳癌、 子宮頸部癌、 結腸癌、 直腸癌、 力 ポジ肉腫など） 、 卵巣疾患 （例、 多嚢胞性卵巣症候群 （卵巣多嚢胞症） 、 卵巣過 剰刺激症など） 、 炎症性疾患 （例、 関節リューマチなど） 、 糖尿病性網膜症など に罹患している、 または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、 本発明の抗体は、 体液や組織等の被検体中に存在する本発明の蛋白質を 検出するために使用することができる。 また、 本発明の蛋白質を精製するために 使用する抗体カラムの作製、 精製時の各分画中の本発明の蛋白質の検出、 被検細 胞内における本発明の蛋白質の挙動の分析等のために使用することができる。 (10) 遺伝子診断薬
本発明の DN Aは、 例えば、 プローブとして使用することにより、 ヒトまたは 温血動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 トリ、 ヒッジ、 ブ夕. ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル等） における本発明の蛋白質または本発明のぺプ チド （以下、 （10) 項では本発明の蛋白質と略記する） をコードする DNAま たは mRNAの異常 （遺伝子異常） を検出することができるので、 例えば、 該 D NAまたは mRNAの損傷、 突然変異あるいは発現低下や、 該 DNAまたは mR N Aの増加あるいは発現過多等の遺伝子診断薬として有用である。
本発明の DNAを用いる上記の遺伝子診断は、 例えば、 自体公知のノーザンハ イブリダィゼ一シヨンや PC R_S S CP法 （Genomics, 第 5巻， 874〜879 頁， 1989年) 、 Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America) , 第 86巻， 2766〜2770頁， 1989年） 、 DNAマイク ロアレイ等により実施することができる。
本発明の蛋白質は卵巣や精巣などの毛細血管内皮細胞に発現量が高いため、 例 えば、 ノーザンハイブリダィゼーションゃ DN Aマイクロアレイにより発現増大 が検出された場合や PCR— S S CP法や DNAマイクロアレイにより DNAの 突然変異が検出された場合は、 例えば、 毛細血管内皮細胞の増殖を伴う疾患、 例 えば、 癌 （例、 塍臓癌、 肺癌、 腎臓癌、 肝臓癌、 非小細胞肺癌、 卵巣癌、 前立腺 癌、 胃癌、 膀 癌、 乳癌、 子宮頸部癌、 結腸癌、 直腸癌、 力ポジ肉腫など） 、 卵 巣疾患 （例、 多嚢胞性卵巣症候群 （卵巣多嚢胞症） 、 卵巣過剰刺激症など） 、 炎 症性疾患 （例、 関節リューマチなど） 、 糖尿病性網膜症などに罹患している可能 性が高いと診断することができる。
(1 1) アンチセンス DNAを含有する医薬
本発明の DN Aに相補的に結合し、 該 DN Aの発現を抑制することができるァ ンチセンス DN Aは、 生体内における本発明の蛋白質もしくは本発明のペプチド (以下、 （1 1) 項では本発明の蛋白質と略記する） または本発明の DN Aの機 能を抑制することができるので、 例えば、 本発明の蛋白質の発現過多に起因する 疾患、 例えば癌 （例、 滕臓癌、 肺癌、 腎臓癌、 肝臓癌、 非小細胞肺癌、 卵巣癌、 前立腺癌、 胃癌、 膀胱癌、 乳癌、 子宮頸部癌、 結腸癌、 直腸癌、 力ポジ肉腫な ど） 、 卵巣疾患 （例、 多嚢胞性卵巣症候群 （卵巣多嚢胞症） 、 卵巣過剰刺激症な ど） 、 炎症性疾患 （例、 関節リューマチなど） 、 糖尿病性網膜症などの予防 -治 療剤として使用することができる。
上記アンチセンス DNAを上記の予防 ·治療剤として、 前記した本発明の DN Aを含有する各種疾病の予防 ·治療剤と同様に使用することができる。
例えば、 該アンチセンス DNAを単独あるいはレトロウイルスベクタ一、 アデ ノウィルスベクタ一、 アデノウイルスァソシエーテツドウィルスベクター等の適 当なベクタ一に挿入した後、 常套手段に従って投与することができる。 該アンチ センス DNAは、 そのままで、 あるいは摂取促進のために補助剤等の生理学的に 認められる担体とともに製剤化し、 遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのような カテ一テルによって投与できる。
さらに、 該アンチセンス DN Aは、 組織や細胞における本発明の DN Aの存在 やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用す ることもできる。
さらに、 本発明は、
(0 本発明の蛋白質をコードする RN Aの一部を含有する二重鎖 RNA、
(ii) 前記二重鎖 RNAを含有してなる医薬、
(iii) 本発明の蛋白質をコードする RNAの一部を含有するリポザィム、
(iv) 前記リポザィムを含有してなる医薬も提供する。
上記アンチセンスヌクレオチドと同様に、 二重鎖 RNA (RNAi； RNA interference法） 、 リポザィムなども、 本発明の蛋白質をコードするポリヌクレ ォチド （例、 DNA) の発現を抑制することができ、 生体内における本発明の蛋 白質または DNAの機能、 およびそれに依存した本発明のペプチドの機能を抑制 することができるので、 例えば、 癌 （例、 滕臓癌、 肺癌、 腎臓癌、 肝臓癌、 非小 細胞肺癌、 卵巣癌、 前立腺癌、 胃癌、 膀胱癌、 乳癌、 子宮頸部癌、 結腸癌、 直腸 癌、 力ポジ肉腫など） 、 卵巣疾患 （例、 多嚢胞性卵巣症候群 （卵巣多嚢胞症） 、 卵巣過剰刺激症など） 、 炎症性疾患 （例、 関節リューマチなど） 、 糖尿病性網膜 症などの予防 ·治療剤などとして使用することができる。
二重鎖 R N Aは、 公知の方法 （例、 Nature, 41 1巻， 494頁， 2001年） に準じて, 本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。
リポザィムは、 公知の方法 （例、 TRENDS i n Mo l ecu l ar Med i c ine, 7巻， 221頁, 2001年） に準じて、 本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造するこ とができる。 例えば、 本発明の蛋白質をコードする R N Aの一部に公知のリポザ ィムを連結することによって製造することができる。 本発明の蛋白質をコードす る R N Aの一部としては、 公知のリボザィムによって切断され得る本発明の R N A上の切断部位に近接した部分 （R N A断片） が挙げられる。
上記の二重鎖 R N Aまたはリポザィムを上記予防 ·治療剤として使用する場合、 ァンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製剤化し、 投与することができる。
( 1 2 ) 本発明の抗体を含有する医薬および診断薬
本発明の蛋白質または本発明のペプチド （以下、 （1 2 ) 項では本発明の蛋白 質と略記する） の活性を中和する作用を有する本発明の抗体は、 例えば、 本発明 の蛋白質の発現過多に起因する疾患、 例えば、 癌 （例、 塍臓癌、 肺癌、 腎臓癌、 肝臓癌、 非小細胞肺癌、 卵巣癌、 前立腺癌、 胃癌、 膀胱癌、 乳癌、 子宮頸部癌、 結腸癌、 直腸癌、 力ポジ肉腫など） 、 卵巣疾患 （例、 多嚢胞性卵巣症候群 （卵巣 多嚢胞症） 、 卵巣過剰刺激症など） 、 炎症性疾患 （例、 関節リューマチなど） 、 糖尿病性網膜症などの予防 ·治療剤等の医薬として、 あるいは本発明の蛋白質を 発現する内皮細胞の増殖を伴う疾患、 例えば、 多嚢胞性卵巣症候群、 卵巣過剰刺 激症候群などの診断薬として使用することができる。
本発明の抗体を含有する上記疾患の予防 ·治療剤は、 そのまま液剤として、 ま たは適当な剤型の医薬組成物として、 ヒトまたは哺乳動物 （例、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サル等） に対して経口的または非経口的に投 与することができる。 投与量は、 投与対象、 対象疾患、 症状、 投与ルート等によ つても異なるが、 例えば、 癌治療の目的で本発明の抗体を 1回量として、 通常 0. 01〜20mg/kg体重程度、 好ましくは 0. l〜10mg/kg体重程度、 さらに好ましくは 0. l〜5mg/kg体重程度を、 1日 1〜5回程度、 好ましくは 1日 1〜3回程度、 静脈注射 により投与するのが好都合である。 他の非経口投与および経口投与の場合もこれ に準ずる量を投与することができる。 症状が特に重い場合には、 その症状に応じ て増量してもよい。
本発明の抗体は、 それ自体または適当な医薬組成物として投与することができ る。 上記投与に用いられる医薬組成物は、 上記またはその塩と薬理学的に許容さ れ得る担体、 希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。 かかる組成物は、 経口 または非経口投与に適する剤形として提供される。
すなわち、 例えば、 経口投与のための組成物としては、 固体または液体の剤形、 具体的には錠剤 （糖衣錠、 フィルムコーティング錠を含む） 、 丸剤、 顆粒剤、 散 剤、 カプセル剤 （ソフトカプセル剤を含む） 、 シロップ剤、 乳剤、 懸濁剤等があ げられる。 かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、 製剤分野において 通常用いられる担体、 希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。 例えば、 錠 剤用の担体、 賦形剤としては、 乳糖、 でんぷん、 蔗糖、 ステアリン酸マグネシゥ ム等が用いられる。
非経口投与のための組成物としては、 例えば、 注射剤、 坐剤等が用いられ、 注 射剤は静脈注射剤、 皮下注射剤、 皮内注射剤、 筋肉注射剤、 点滴注射剤等の剤形 を包含する。 かかる注射剤は、 自体公知の方法に従って、 例えば、 上記抗体また はその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、 懸濁また は乳化することによって調製する。 注射用の水性液としては、♦例えば、 生理食塩 水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリアルコール （例、 プロピレンダリ コール、 ポリエチレングリコール） 、 非イオン界面活性剤 〔例、 ポリソルベート 8 0、 H C 0— 5 0 (po lyoxye thyl ene (50mo l ) adduc t o f hydrogenated cas tor o i l ) 〕 等と併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油 等が用いられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコール等を併 用してもよい。 調製された注射液は、 通常、 適当なアンプルに充填される。 直腸 投与に用いられる坐剤は、 上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合する ことによって調製される。
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、 活性成分の投与量に適合するよう な投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。 かかる投薬単位の剤形とし ては、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 注射剤 （アンプル） 、 坐剤等が例示され、 それ ぞれの投薬単位剤形当たり通常 5〜500mg程度、 とりわけ注射剤では 5〜100mg程度、 その他の剤形では 10〜250mg程度の上記抗体が含有されていることが好ましい。 なお前記した各組成物は、 上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生 じない限り他の活性成分を含有してもよい。
例えば、 前記した各血管新生阻害剤は、 例えば化学療法剤 （例、 ィホスフアミ ド （Ifosfamide) 、 アドリアマイシン （Adriamycin) 、 ぺプロマイシン
(Peplomycin) 、 シスプラチン （Cisplatin) 、 シクロフォスフアミド
(Cyclophosphamide) 、 5— FU、 UFT、 メトレキセ一卜 （Methotrexate) 、 マイトマイシン C (Mitomycin 0 、 マイトキサントロン （Mitoxantrone) な ど） などと併用してもよい。
(13) 本発明の DN Aを有する非ヒト動物の作製
本発明の DN Aを用いて、 本発明の蛋白質または本発明のペプチドを発現する トランスジエニック非ヒト動物を作製することができる。 非ヒト動物としては、 哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） など （以下、 動物と略記する） が挙げられるが、 特に、 マウス、 ゥサ ギなどが好適である。
本発明の DN Aを対象動物に転移させるにあたっては、 該 DN Aを動物細胞で 発現させうるプロモーターの下流に結合した遺伝子コンストラクトとして用いる のが一般に有利である。 例えば、 ゥサギ由来の本発明の DNAを転移させる場合、 これと相同性が高い動物由来の本発明の DN Aを動物細胞で発現させうる各種プ ロモ—夕—の下流に結合した遺伝子コンストラクトを、 例えば、 ゥサギ受精卵へ マイクロインジェクションすることによって本発明の蛋白質または本発明のぺプ チドを高産生する DNA転移動物を作出できる。 このプロモーターとしては、 例 えば、 ウィルス由来プロモーター、 メタ口チォネイン等のュビキアスな発現プロ モー夕一も使用しうるが、 好ましくは脳で特異的に発現する N G F遺伝子プロモ 一ターやエノラ一ゼ遺伝子プロモーターなどが用いられる。
受精卵細胞段階における本発明の D N Aの転移は、 対象動物の胚芽細胞および 体細胞の全てに存在するように確保される。 D NA転移後の作出動物の胚芽細胞 において本発明の蛋白質等が存在することは、 作出動物の子孫が全てその胚芽細 胞及び体細胞の全てに本発明の蛋白質または本発明のペプチドを有することを意 味する。 遺伝子を受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の 全てに本発明の蛋白質または本発明のペプチドを有する。
本発明の D N A転移動物は、 交配により遺伝子を安定に保持することを確認し て、 該 D N A保有動物として通常の飼育環境で飼育継代を行うことができる。 さ らに、 目的 D NAを保有する雌雄の動物を交配することにより、 導入遺伝子を相 同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、 この雌雄の動物を交配する ことによりすべての子孫が該 D N Aを有するように繁殖継代することができる。 本発明の D N Aが転移された動物は、 本発明の蛋白質または本発明のペプチド が高発現させられているので、 本発明の蛋白質に対するァゴニストまたはアン夕 ゴニスト、 本発明のペプチドの活性を阻害する化合物のスクリーニング用の動物 などとして有用である。
本発明の D N A転移動物を、 組織培養のための細胞源として使用することもで きる。 例えば、 本発明の D N A転移マウスの組織中の D N Aもしくは R N Aを直 接分析するか、 あるいは遺伝子により発現された本発明の蛋白質または本発明の ぺプチドが存在する組織を分析することにより、 本発明の蛋白質について分析す ることができる。 本発明の蛋白質または本発明のペプチドを有する組織の細胞を 標準組織培養技術により培養し、 これらを使用して、 例えば、 脳や末梢組織由来 のような一般に培養困難な組織からの細胞の機能を研究することができる。 また、 その細胞を用いることにより、 例えば、 各種組織の機能を高めるような医薬の選 択も可能である。 また、 高発現細胞株があれば、 そこから、 本発明の蛋白質また は本発明のぺプチドを単離精製することも可能である。 本明細書および図面において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 I UPAC— I UB Commission on Biochemical Nomenclature による略号ある いは当該分野における慣用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 またァ ミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示すもの とする。
DNA ：デォキシリポ核酸
cDNA ：相補的デォキシリポ核酸
A ：アデニン
T ：チミン
G ：グァニン
C
Y チミンまたはシトシン
N チミン、 シトシン、 アデニンまたはグァニン
R アデニンまたはグァニン
M シトシンまたはアデニン
W チミンまたはアデニン
S シトシンまたはグァニン
B ；グァニン、 チミンまたはシトシン
RNA ： リボ核酸
mRNA ：メッセンジャーリポ核酸
d ATP
dTTP ：デォキシチミジン三リン酸
d GTP
d CTP
ATP ：アデノシン三リン酸
G 1 yまたは G ：グリシン
A 1 aまたは A ：ァラニン
V a 1または V ： Λ Uン
L e uまたは L ： ロイシン 0301057
107
I 1 eまたは I ：イソロイシン
S e rまたは S ：セリン
Th rまたは T ：スレオニン
Cy sまたは C ： システィン
5 Me tまたは M ：メチォニン
G 1 uまたは E ：グルタミン酸
As pまたは D ：ァスパラギン酸
L y sまたは K ： リジン
A r gまたは R ：アルギニン
10 H i sまたは H ： ヒスチジン
Ph eまたは F ： フエ二ルァラニン
Ty rまたは Y ：チロシン
T r pまたは W ： トリブトファン
P r oまたは P ：プロリン
丄リ A ς nホ "，は N ■ ノ A , 、 ノ
G 1 nまたは Q ： ダル夕ミン
pG】 u ： ピ口ダル夕ミン酸
X a a ：未同定アミノ酸残基 0 また、 本明細書中で繁用される置換基、
記する。
Me ： メチル基
Et ：ェチル基
Βυ ：ブチル基
5 P h ： フエニル基
A c ：ァセチル基
TC ：チアゾリジン一 4
Bom ベンジルォキシメチル
B z 1 z ベンジルォキシカルポニル
B r - Z 2 -ブロモベンジルォキシカルボニル
C 1一 Z
C 12B z 1 2-6—ジクロ口べンジル
B o c t一ブチルォキシカルボニル
HOBt 1—ヒドロキシベンズトリアゾール
HOOB t 3, 4—ジヒドロ一 3—ヒドロキシ— 4—ォキソ一
1, 2， 3—ベンゾトリアジン
PAM フエニルァセトアミドメチル
To s p—トルエンスルフォニル
Fmo c N— 9—フルォレニルメトキシカルボニル
DNP ジニトロフエニル
Bum ターシャリーブトキシメチル
T r t h Uチル
Bom ベンジルォキシメチル
Z ベンジルォキシカルボニル
Me B z 1 4一メチルベンジル
DCC HONB 卜ヒドロキシ -5-ノルポルネン- 2， 3-ジカルボキシイミド NMP N—メチルピロリドン
HONB N—ヒドロキシ一 5 _ノルボルネンー 2, 3—ジカルポ キシイミド
NMP N—メチルピロリドン
TF A トリフルォロ酢酸
CHAPS 3— [ (3—コラミドプロピル） ジメチルアンモニォ]—
1—プロパンスルホナ一ト
PMS F フエ二ルメチルスルホニルフルオリド
GDP " グアノシン一 5'—ニリン酸
F u r a - 2 AM 1 - [6—ァミノ一 2— （5—力ルポキシー 2—ォキサ — 5—ベンゾフラ二口キシ] 一 2— （2—アミ ノー 5メチルフエノキシ） ーェタン一 N， N, Ν'， Ν'
F 1 u o- 3 AM 1一 [2—アミノー 5— (2, 7—ジクロロー 6—ヒド 口キシ— 3—ォキシ _ 9ーキサンテニル） フエノキシ] 一 2— （2—ァミノ一 5—メチルフエノキシ） エタンー Ν, Ν, Ν', N'—四酢酸ペンタァセトキシメチルエス テル
HE PE S 2 -[4 - (2—ヒドロキシェチル） 一 1—ピペラジニ ル]エタンスルホン酸
EDTA エチレンジアミン四酢酸
SDS ドデシル硫酸ナトリゥム
B S A ゥシ血清アルブミン
HB S S ハンクス平衡塩液
E I A CHAP S 3-[(3-chol amidopropyl) dimethylaminoj-l- propanesul fate 本明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
〔配列番号： 1〕
ヒ卜脳由来蛋白質 ZAQのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 2〕
ヒト脳由来蛋白質 ZAQをコードする DN Aの塩基配列を示す （ZAQC) 〔配列番号： 3〕
ヒト脳由来蛋白質 ZAQをコードする DNAの塩基配列を示す （ZAQT) 〔配列番号： 4〕
後述の参考例 3で用いられたプライマー 1の塩基配列を示す。
〔配列番号： 5〕
後述の参考例 3で用いられたプライマ一 2の塩基配列を示す。 〔配列番号： 6〕
ヒ卜型 I 5 Eレセプター蛋白質をコ一ドする DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 7〕
後述の参考例 3で用いられたプライマー hBv 8 -F 1の塩基配列を示す。 〔配列番号： 8〕
後述の参考例 3で用いられたプライマ一 hBv 8— R 1の塩基配列を示す。 〔配列番号： 9〕
後述の参考例 3で得られた D N A断片の塩基配列を示す。
〔配列番号： 10〕
後述の参考例 3で用いられたプライマー hBv 8— R 2の塩基配列を示す。 〔配列番号： 1 1〕
後述の参考例 3で得られたヒト型 B V 8ペプチドをコードする DNAの 5 ' 端 塩基配列を示す。
〔配列番号： 12〕
後述の参考例 3で用いられたプライマ一 hBv 8—WFの塩基配列を示す。 〔配列番号： 13〕
後述の参考例 3で用いられたプライマー hBv 8—WRの塩基配列を示す。 〔配列番号： 14〕
後述の参考例 3で用いられたプライマー h B V 8— C Fの塩基配列を示す。 '〔配列番号： 1 5〕
後述の参考例 3で用いられたプライマ一 hBv 8— SRの塩基配列を示す。 〔配列番号： 16〕
後述の参考例 3で得られた D N A断片の塩基配列を示す。
〔配列番号： 17〕
ヒト型 B V 8前駆体ペプチドのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 18〕
ヒ卜型 B V 8前駆体べプチドをコ一ドする DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 19〕
ヒト型 B V 8成熟体ペプチドのアミノ酸配列を示す。 〔配列番号： 20〕
ヒト型 Bv 8成熟体ペプチドをコードする DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 21〕
へビ毒 M I T 1のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 22〕
ヒト型 B V 8成熟体べプチドの C末端の L y s欠損体のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号： 23〕
後述の参考例 5で用いられたプライマー B F 2の塩基配列を示す。
〔配列番号： 24〕
後述の参考例 5で用いられたプライマー BR 1の塩基配列を示す。
〔配列番号： 25〕
後述の参考例 5で得られた D N A断片の塩基配列を示す。
〔配列番号： 26〕
後述の参考例 5で用いられたプライマー RB 5— 1の塩基配列を示す。
〔配列番号： 27〕
後述の参考例 5で用いられたプライマ一 RB 5— 3の塩基配列を示す。
〔配列番号： 28〕
後述の参考例 5で得られたラッ卜型 Bv 8をコードする DNAの 5' 端塩基配 列を示す。
〔配列番号： 29〕
後述の参考例 5で用いられたプライマー RB 3— 1の塩基配列を示す。
〔配列番号： 30〕
後述の参考例 5で用いられたプライマ一 RB3— 2の塩基配列を示す。
〔配列番号： 31〕
後述の参考例 5で得られたラット型 Bv 8をコードする DN Aの 3' 端塩基配 列を示す。
〔配列番号： 32〕
後述の参考例 5で用いられたブライマー RB V 8一 WF 1の塩基配列を示す。 〔配列番号： 33〕 後述の参考例 5で用いられたプライマー RB v 8 -WF 2の塩基配列を示す。 〔配列番号： 34〕
後述の参考例 5で用いられたプライマー RB V 8 -WR 1の塩基配列を示す。 〔配列番号： 35〕
後述の参考例 5で用いられたプライマー RB V 8 -WR 2の塩基配列を示す。 〔配列番号： 36〕
後述の参考例 5で得られた D N A断片の塩基配列を示す。
〔配列番号： 37〕
ラット型 B V 8前駆体べプチドのァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 38〕
ラット型 B V 8前駆体ペプチドをコードする DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 39〕
ラット型 B V 8成熟体ペプチドおよびマウス型 B V 8成熟体ペプチドのァミノ 酸配列を示す。
〔配列番号： 40〕
ラット型 B V 8成熟体ペプチドをコードする DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 41〕
後述の参考例 6で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 42〕
後述の参考例 6で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 43〕
新規 G蛋白質共役型レセプター蛋白質 （r ZAQ l) をコードする cDNAの 塩基配列を示す。
〔配列番号： 44〕
新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 （r ZAQl) のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号： 45〕
後述の参考例 7で用いられたプローブの塩基配列を示す。
〔配列番号： 46〕
後述の参考例 7で用いられたプローブの塩基配列を示す。 〔配列番号： 47〕
後述の参考例 7で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 48〕
後述の参考例 7で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 49〕
後述の参考例 7で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 50〕
新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 （r ZAQ2) をコードする cDNAの 塩基配列を示す。
〔配列番号： 51〕
新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 （r ZAQ2) のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号： 52〕
ヒト型 I 5 Eレセプ夕一蛋白質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 53〕
マウス由来 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 （GPR73) のアミノ酸配列を 示す。
〔配列番号： 54〕
マウス由来 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 （ml 5E) のアミノ酸配列を示 す。
〔配列番号： 55〕
マウス型 Bv 8前駆体ペプチドのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 56〕
マウス型 Β V 8前駆体ペプチドをコードする DNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 57〕
マウス型 Β V 8成熟体ペプチドをコ一ドする DN Αの塩基配列を示す。
〔配列番号： 58〕
後述の参考例 1で用いられたプライマー 3の塩基配列を示す。
〔配列番号： 59〕
後述の参考例 1で用いられたプライマ一 4の塩基配列を示す。 01057
114
〔配列番号： 60〕
後述の参考例 1で用いられた Z AQp r o b eの塩基配列を示す。
〔配列番号： 61〕
後述の参考例 1で用いられたプライマー ZAQC S a 1の塩基配列を示す。 〔配列番号： 62〕
後述の参考例 4で用いられたプライマー ZAQC S p eの塩基配列を示す。 〔配列番号： 63〕
マウス由来 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 （GPR73) をコードする塩基 配列を示す。
〔配列番号： 64〕
マウス由来 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 （m l 5E) をコードする塩基配 列を示す。
〔配列番号： 65〕
参考例 8で用いられた DN A断片 # 1の塩基配列を示す。
〔配列番号： 66〕
参考例 8で用いられた D N A断片 # 2の塩基配列を示す。
〔配列番号： 67〕
参考例 8で用いられた D N A断片 # 3の塩基配列を示す。
〔配列番号： 68〕 - 参考例 8で用いられた D N A断片 # 4の塩基配列を示す。
〔配列番号： 69〕
参考例 8で用いられた DN A断片 # 5の塩基配列を示す。
〔配列番号： 70〕
参考例 8で用いられた DN A断片 # 6の塩基配列を示す。
〔配列番号： 71〕
配列番号： 30で表わされるヒト型 Bv 8をコードする合成 DN Aの塩基配列 を示す。
〔配列番号： 72〕
後述の参考例 9 (8) で精製された ZAQ活性化ペプチドの N末端のアミノ酸 配列を示す。
〔配列番号： 73〕
後述の参考例 9 (II) で用いられたプライマ一 ZF 1の塩基配列を示す。 〔配列番号： 74〕
後述の参考例 9 (II) で用いられたプライマー ZF 2の塩基配列を示す。 〔配列番号： 75〕
後述の参考例 9 (II) で用いられたプライマー Z F 3の塩基配列を示す。 〔配列番号： 76〕
後述の参考例 9 (II) で得られたヒト型 ZAQリガンドペプチドをコードする D N Aの 3 ' 端塩基配列を示す。
〔配列番号： 77〕
後述の参考例 9 (II) で用いられたプライマー Z AQL— CFの塩基配列を示 す。 ' 〔配列番号： 78〕
後述の参考例 9 (II) で用いられたプライマー ZAQL— XR 1の塩基配列を 示す。
〔配列番号： 79〕
後述の参考例 9 (II) で得られた DNA断片の塩基配列を示す。
〔配列番号： 80〕
後述の参考例 9 (II) で得られた DNA断片の塩基配列を示す。
〔配列番号： 81〕
ヒト型 ZAQリガンド成熟体べプチドのァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 82〕
ヒト型 ZAQリガンド成熟体ペプチドのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 83〕
ヒト型 Z A Qリガンド前駆体べプチドのァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 84〕
ヒト型 Z A Qリガンド前駆体べプチドのァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 85〕 配列番号： 89で表わされるヒト型 ZAQリガンド前駆体ペプチドをコードす る DN Aを含有する DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 86〕
配列番号： 90で表わされるヒト型 ZAQリガンド前駆体ペプチドをコードす る DN Aを含有する DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 87〕
配列番号： 81で表わされるヒト型 Z A Qリガンド成熟体べプチドをコードす る D N Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 88〕
配列番号： 82で表わされるヒト型 ZAQリガンド成熟ペプチドをコードする DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 89〕
配列番号： 83で表わされるヒト型 ZAQリガンド前駆体ペプチドをコードす る DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 90〕
配列番号： 84で表わされるヒト型 ZAQリガンド前駆体ペプチドをコ一ドす る D N Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 91〕
後述の参考例 10 (1) で用いられた DNA断片の塩基配列を示す。
〔配列番号： 92〕
後述の参考例 1 1 (2) で分析された、 ヒト型 ZAQリガンドペプチドの N末 端アミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 93〕
後述の参考例 12で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 94〕
後述の参考例 12で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 9 §〕
参考例 1で用いられた D N A断片 # 1の塩基配列を示す。
〔配列番号： 96〕 参考例 1で用いられた DN A断片 # 2の塩基配列を示す。
〔配列番号： 97〕
-参考例 1で用いられた DN A断片 # 3の塩基配列を示す。
〔配列番号： 98〕
参考例 1で用いられた DNA断片 #4の塩基配列を示す。
〔配列番号： 99〕
参考例 1で用いられた D N A断片 # 5の塩基配列を示す。
〔配列番号： 100〕
参考例 1で用いられた DN A断片 # 6の塩基配列を示す。
〔配列番号： 101〕
配列番号： 82で表わされるヒト型 ZAQリガンドをコードする合成 DNAの 塩基配列を示す。
〔配列番号： 102〕
後述の参考例 15で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 103〕
後述の参考例 15で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 104〕
後述の参考例 15で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 105〕
後述の参考例 15で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 106〕
後述の参考例 15で得られた D N A断片の塩基配列を示す。
〔配列番号： 107〕
マウス型 ZAQリガンド前駆体べプチドのァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 108〕
マウス型 Z A Qリガンド前駆体べプチドをコードする D N Aの塩基配列を示す。 〔配列番号： 109〕
マウス型 Z A Qリガンド成熟体べプチドのァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 1 10〕 マウス型 Z A Qリガンド成熟体べプチドをコードする D N Aの塩基配列を示す c 〔配列番号： 1 1 1〕
マウス型 Z A Qリガンド前駆体べプチドをコードする DNAを含有する D N A の塩基配列を示す。 '
〔配列番号： 1 12〕
後述の参考例 16で用いられたプライマ一の塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 13〕
後述の参考例 16で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 14〕
後述の参考例 16で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 11 5〕
後述の参考例 16で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 16〕
後述の参考例 16で得られた DN A断片の塩基配列を示す。
〔配列番号： 117〕
後述の参考例 16で得られた DN A断片の塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 18〕
後述の参考例 16で用いられたプライマ一の塩基配列を示す。
〔配列番号： 119〕
後述の参考例 16で用いられたプライマ一の塩基配列を示す。
〔配列番号： 120〕
後述の参考例 16で用いられたプライマ一の塩基配列を示す。
〔配列番号： 121〕
後述の参考例 16で得られたラット型 ZAQリガンドペプチドをコードする D NAの 5' 端塩基配列を示す。
〔配列番号： 122〕
後述の参考例 16で用いられたプライマ一の塩基配列を示す。
〔配列番号： 123〕
後述の参考例 16で用いられたプライマ一の塩基配列を示す。 〔配列番号： 124〕
後述の参考例 16で得られたラット型 ZAQリガンドペプチドをコードする D NAの 5' 端塩基配列を示す。
〔配列番号： 125〕
後述の参考例 16で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 126〕
後述の参考例 16で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 127〕
後述の参考例 16で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 128〕
後述の参考例 16で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 129〕
後述の参考例 16で得られた DN A断片の塩基配列を示す （ノーマルタイプ） 〔配列番号： 130〕
後述の参考例 16で得られた DNA断片の塩基配列を示す （Yタイプ） 。
〔配列番号： 131〕
後述の参考例 16で得られた DN A断片の塩基配列を示す （Qタイプ） 。
〔配列番号： 132〕
ラット型 ZAQリガンド前駆体ペプチド （ノーマルタイプ） のアミノ酸配列を 示す。
〔配列番号： 133〕
ラット型 ZAQリガンド前駆体ペプチド （ノーマルタイプ） をコードする DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 134〕
ラット型 ZAQリガンド前駆体ペプチド （Yタイプ） のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号： 135〕
ラット型 ZAQリガンド前駆体ペプチド （Yタイプ） をコードする DN Aの塩 基配列を示す。
〔配列番号： 136〕 ラット型 ZAQリガンド前駆体ペプチド （Qタイプ） のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号： 137〕
ラット型 ZAQリガンド前駆体ペプチド （Qタイプ） をコードする DN Aの塩 基配列を示す。
〔配列番号： 138〕
ラット型 ZAQリガンド成熟体ペプチド （ノーマルタイプ） のアミノ酸配列を 示す。
〔配列番号： 139〕
ラット型 ZAQリガンド成熟体ペプチド （ノーマルタイプ） をコードする DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 140〕
ラ.ット型 ZAQリガンド成熟体ペプチド （Yタイプ） のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号： 141〕
ラット型 ZAQリガンド成熟体ペプチド （Yタイプ） をコードする DN Aの塩 基配列を示す。
〔配列番号： 142〕
ラット型 ZAQリガンド成熟体ペプチド （Qタイプ） のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号： 143〕
ラット型 ZAQリガンド成熟体ペプチド （Qタイプ） をコードする DN Aの塩 基配列を示す。
〔配列番号： 144〕
後述の実施例 1で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 145〕
後述の実施例 1で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 146〕
後述の実施例 1で得られたゥシ型 Z AQの部分配列の塩基配列を示す。
〔配列番号： 147〕
後述の実施例 1で得られたゥシ型 I 5 Eの部分配列の塩基配列を示す。
〔配列番号： 148〕 後述の実施例 1で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 149〕
後述の実施例 1で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 150〕
後述の実施例 1で得られたゥシ型 Z A Qの 5 ' 部分配列 （ t y p e 1 ) の塩基 配列を示す。
〔配列番号： 15 1〕
後述の実施例 1で得られたゥシ型 ZAQの 5' 部分配列 （t yp e 2) の塩基 配列を示す。
〔配列番号： 152〕
後述の実施例 1で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 153〕
後述の実施例 1で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 154〕
後述の実施例 1で得られたゥシ型 Z A Qの 3 ' 部分配列 （ t y p e 2 ) の塩基 配列を示す。
〔配列番号： 155〕
後述の実施例 1で用いられたプライマ一の塩基配列を示す。
〔配列番号： 156〕
後述の実施例 1で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 157〕
後述の実施例 1で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 158〕
後述の実施例 1で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 159〕
後述の実施例 1で得られたゥシ型 ZAQ全長をコードする 2038 bpのDN A断片の塩基配列を示す。
〔配列番号： 160〕
後述の実施例 1で用いられたプライマーの塩基配列を示す。 〔配列番号： 161〕
後述の実施例 1で用いられたプライマ一の塩基配列を示す。
〔配列番号： 162〕
後述の実施例 1で得られたゥシ型 I 5Eの 5' 部分配列の塩基配列を示す。 〔配列番号： 163〕
後述の実施例 1で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 164〕
後述の実施例 1で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 165〕
後述の実施例 1で得られたゥシ型 I 5Eの 3' 部分配列の塩基配列を示す。 〔配列番号： 166〕
後述の実施例 1で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 167〕
後述の実施例 1で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 168〕
後述の実施例 1で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 169〕
後述の実施例 1で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 170〕
後述の実施例 1で得られたゥシ型 I 5 E全長をコードする 1623 bpの DN A断片の塩基配列を示す。
〔配列番号： 171〕
後述の実施例 1で得られたゥシ型 Z A Qのァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 172〕
ゥシ型 Z AQをコードする DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 173〕
後述の実施例 1で得られたゥシ型 I 5 Eのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 174〕
ゥシ型 I 5 Eをコードする DN Aの塩基配列を示す。 〔配列番号： 175〕
後述の実施例 2で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 76〕
後述の実施例 2で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 77〕
後述の実施例 2で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 178〕
後述の実施例 2で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 179〕
後述の実施例 2で用いられたプローブの塩基配列を示す。 配列中、 FAMは、 6- car boxy fluoresce inを、 T AMR Aは 6 - carboxy- tetramethylrhodamineをそれ ぞれ示す。 ）
〔配列番号： 180〕
後述の実施例 2で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 18 1〕
後述の実施例 2で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 182〕
後述の実施例 2で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 183〕
後述の実施例 2で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 184〕
後述の実施例 2で用いられたプローブの塩基配列を示す。 配列中、 FAMは、 6 - car boxy fluoresce inを、 TAMRA¾6-car boxy- 1 e t r ame t hy 1 r hodam i ne
Figure imgf000124_0001
す。 ） 後述の実施例 1で得られた形質転換体大腸菌 （Escherichia col i)DH5 a/pBZAQ は、 平成 14 (2002) 年 1月 9日から、 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305-8566) 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター に受託番号 FERM BP- 7845として、 2001年 12月 18日から、 日本国大阪府大阪市淀川 区十三本町 2丁目 17番 85号 （郵便番号 532-8686) 財団法人 ·発酵研究所 （IF0) に 受託番号 IF0 16740として寄託されている。
後述の実施例 1で得られた形質転換体大腸菌 (Escherichia col ί)Τ0Ρ10/ρΒΙ5Ε は、 平成 14 (2002) 年 1月 9日から、 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物 寄託セン夕一に受託番号 FERM ΒΡ-7844として、 2001年 12月 18日から、 財団法人 ' 発酵研究所 （IF0) に受託番号 IF0 16739として寄託されている。
後述の参考例 1で得られた形質転換体ェシエリヒア コリ （Escherichia coli)DH5a/pCR2.卜 ZAQCは、 平成 11 (1999) 年 8月 23日から、 独立行政法人産業 技術総合研究所 特許生物寄託センター （旧 NIBH) に受託番号 FERM BP- 6855とし て、 平成 11 (1999) 年 8月 4日から、 財団法人 ·発酵研究所 （IF0) に受託番号 IF0 16301として寄託されている。
後述の参考例 1で得られた形質転換体ェシエリヒア コリ （Escherichia coli) DH5a/pCR2.卜 ZAQTは、 平成 11 (1999) 年 8月 23日から独立行政法人産業技 術総合研究所 特許生物寄託センター （旧 NIBH) に受託番号 FERM BP-6856として、 平成 11 (1999) 年 8月 4日から財団法人 ·発酵研究所 （IF0) に受託番号 IF0 16302 として寄託されている。
後述の参考例 5で得られた形質転換体ェシエリヒア コリ （Escherichia coli) ΤΟΡΙΟ/pRBvは、 平成 13 (2001) 年 1月 11日から独立行政法人産業技術総合 研究所 特許生物寄託センター （旧 NIBH) に受託番号 FERM BP- 7427として、 2000 年 12月 22日から財団法人 '発酵研究所 （IF0) に受託番号 IF0 16522として寄託さ れている。
後述の参考例 6で得られた形質転換体ェシエリヒア コリ （Escherichia coli) DH5a/pCR2.卜 rZAQlは、 平成 12 (2000) 年 8月 21日から独立行政法人産業 技術総合研究所 特許生物寄託センター （旧 NIBH) に受託番号 FERM BP- 7275とし て、 平成 12 (2000) 年 8月 1日から財団法人 ·発酵研究所 （IF0) に受託番号 IF0 16459として寄託されている。
後述の参考例 7で得られた形質転換体ェシエリヒア コリ （Escherichia coli) DH10B/pCMV-rZAQ2は、 平成 12 (2000) 年 8月 21日から独立行政法人産業技 術総合研究所 特許生物寄託センター （旧 NIBH) に受託番号 FERM ΒΡ-7Π6として、 平成 12 (2000) 年 8月 1日から財団法人 ·発酵研究所 （IF0) に受託番号 IF0 16460 として寄託されている。
後述の参考例 8で得られたェシエリヒア コリ （Escherichia coli) 關 294(DE3)/pTCh2ZAQは、 平成 13 (2001) 年 4月 27日から独立行政法人産業技術総 合研究所特許生物寄託センターに受託番号 FERM BP-7572として、 2001年 3月 15日 から財団法人発酵研究所 （IF0) に受託番号 IF0 16587として寄託されている。 後述の参考例 9で得られた形質転換体ェシエリヒア ·コリ （Escherichia coli) ΤΟΡΙΟ/ρΗΜΙΤΑは、 平成 12 (2000) 年 7月 13日から独立行政法人産業技術総 合研究所 特許生物寄託センター （旧 NIBH) に寄託番号 FERM BP- 7219として、 平 成 12年 5月 26日から財団法人 ·発酵研究所 （IF0) に寄託番号 IF0 16440として寄 託されている。
後述の参考例 9で得られた形質転換体ェシエリヒア ·コリ （Escherichia coli) TOPlO/pHMITGは、 平成 12 (2000) 年 7月 13日から独立行政法人産業技術総 合研究所 特許生物寄託センター （旧 NIBH) に寄託番号 FERM BP-7220として、 平 成 12 (2000)年 5月 26日から財団法人 ·発酵研究所 （IF0) に寄託番号 IF0 16441と して寄託されている。
後述の参考例 14で取得されたェシエリヒア ·コリ （Escherichia coli) MM294 (DE3)/pTChlZAQは、 平成 13 (2001) 年 4月 27日から、 独立行政法人産業技術 総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号 FERM BP- 7571として、 2001年 1月 16日から、 財団法人発酵研究所 （IF0) に受託番号 IF0 16527として寄託されてい る。
後述の参考例 15で得られた形質転換体ェシエリヒア コリ （Escherichia coli) ΤΟΡΙΟ/ρ國 ITは、 平成 13 (2001) 年 1月 11日から、 独立行政法人産業技術総 合研究所 特許生物寄託センター （旧 NIBH) に受託番号 FERM BP- 7425として、 2000年 12月 22日から、 財団法人 ·発酵研究所 （IF0) に受託番号 IF0 16520として 寄託されている。
後述の参考例 16で得られた形質転換体ェシエリヒア コリ （Escherichia coli) TOPlO/pRMITは、 平成 13 (2001) 年 1月 11日から、 独立行政法人産業技術総 合研究所 特許生物寄託センター （旧 NIBH) に受託番号 FERM BP-7426として、 2000年 12月 22日から、 財団法人 ·発酵研究所 （IF0) に受託番号 IF0 16521として 寄託されている。
〔実施例〕
以下に実施例および参考例を示して、 本発明をより詳細に説明するが、 これら は本発明の範囲を限定するものではない。 なお、 大腸菌を用いての遺伝子操作法 は、 モレキュラー ·クローニング （Molecular cloning) に記載されている方法 に従った。 実施例 1 ゥシ型 ZAQおよびゥシ型 I 5Eレセプター cDNAのクロ一ニング ゥシ副腎毛細血管内皮細胞 （BACE) およびゥシ大動脈血管内皮細胞 （BAE) よ り、 RNeasy Mini Kit (QIAGEN社） を用いて添付のマニュアルに記載された方法 に従って BACE 由来 total RNA(BACE tRNA)および BAE由来 total 腿 (BAE tRNA)を 取得した。 これを铸型として、 SUPERSCRIPT First-Strand Synthesis System for RT-PCR Kit (GIBC0 BRL社） を用いて添付のマニュアルに記載された方法に 従って BACE 由来 cDNA(BACE cDNA)および BAE 由来 cDNA(BAE cDNA)を取得した。 続 いて BACE cDNAを铸型としてヒト ZAQ、 マウス ZAQ、 ラット ZAQ、 ヒト I5E、 マウス I5Eおよび GPR73の情報より degenerateプライマ一 ZAQ-B1F (配列番号： 144) ZAQ-B1R (配列番号： 145) を作成し、 以下に記した PCR反応を実施した。
ZAQ-B1F: 5' -ATYGTSTGCTGCCCCTTYGAGATG-3' (配列番号： 144)
ZAQ-B1R: 5' -TAGTAGAGCTGCTGRTCCACBGRCC-3' (配列番号： 145) PCR反応液は AmpliTaq Gold (Applied Biosys tems社）を 0.5 ιι\, 添付の 10x PCR buffer II (100 mM Tris-HCl, 500 m KC1)を 5 1、 25 mM MgCl2を 4< l、 dNTP mixture (2.0 mM each, Applied 8105 5161115社）を5^1、 12.5^M プライマ — ZAQ- B1Fおよび ZAQ- B1Rを 2.5 1、 铸型 cDNAを l/ l、 および蒸留水を 29.5 1 を混合して作製した。 反応条件は、 95 >10分の初期変性後、 95で'20秒-66°〇'30 秒のサイクル反応を 35回、 および 66t> 10分の最終伸長反応とした。
得られた DNA断片を T0P0 TA Cloning Kit (Invitrogen社）を用いて添付のマ二 ュアルに記載された方法に従ってクローニングした。 クローニングされた DNA配 列を ABI3100 DNA sequencerを用いて解読し、 ゥシ型 ZAQの部分配列 （配列番 号： 146) およびゥシ型 I 5 Eの部分配列 （配列番号： 147') の塩基配列を 得た。
ゥシ副腎毛細血管内皮細胞 （BACE) より、 TRIzol Reagent (GIBCO BRL社） を 用いて添付のマニュアルに記載された方法に従って BACE 由来 total RNA(BACE tRNA)を取得した。 これを铸型として、 mRNA Purification Kit (Amersham Pharmacia biotech社） を用いて添付のマニュアルに記載された方法に従って BACE 由来 mRNA (BACE mRNA)を取得した。 BACE mRNAを铸型として、 Marathon cDNA Amplification Kit (CLONTECH社） を用いて添付のマニュアルに記載された方法 に従って BACE 由来 Library of adaptor-1 igated ds cDNA(BACE AL ds c DNA)を作 成した。
配列番号： 146の情報より、 プライマー bZAQ5- 2 (配列番号： 148) と bZAQ5-3 (配列番号： 149) を作成し、 BACE AL ds cDNAを铸型として以下に記 した 5' RACE実験を実施した。
bZAQ5-2: 5' -GGCCAGCAGGGCGTTGGTGGAGA-3' (配列番号： 148)
bZAQ5-3: 5 ' -GTGCGCAGGTAGTTGACAGAGGCGCACA-3 ' (配列番号： 149) 5'1^じ5の？0反応液は5(« Advantage- GC 2 Polymerase Mix (CLONTECH社）を 0.5 1、 添付の 5x Advantage- GC 2 PCR buffer (200 mM Tricine-KOH, 75 mM KOAc, 17.5 mM Mg(0Ac)2, 25% Dimethyl Sulfoxide, 18.75 /g/ml BSA， 0.025%Tween- 20, 0.025% Nonidet-P40)を 5 1、 dNTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造）を 2 1 lOAiMプライマ一 bZAQ5- 2を 0.5 1、 10 //Mプライマー API (プライマー APIは CLONTECH社の Marathon- Ready cDNA Kitに添付のもの） を 0.5 1、 鎵型 CDNA
(BACE AL ds cDNAの 50倍希釈液） を 2.5μ1、 および蒸留水を 14 1を混合して作 製した。 反応条件は 94 '30秒の初期変性後、 94°C'5秒- 72 '4分のサイクル反応 を 5回、 94°C'5秒- 70 >4分のサイクル反応を 5回、 94t) ·5秒- 68^ ·4分のサイクル 反応を 25回行った。
続いて、 該 PCR反応の反応液を鎵型として nested PCRを実施した。 反応液は 50X Advantage - GC 2 Polymerase Mix (CLONTECH社）を 0.5 1、 添付の 5x Advantage- GC 2 PCR buffer (200 mM Tricine-KOH, 75 mM KOAc, 17.5 mM Mg(0Ac)2, 25% Dimethyl Sulfoxide, 18.75 /ml BSA, 0.025%Tween-20, 0.025% Nonidet- P40)を 5 1、 dNTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造）を 2.0 1、 IO Mプライマ一 bZAQ5 - 3を 0.5 1、 10 Mプライマー AP2 (プライマ一 AP2は CL0NTECH社の
Marathon-Ready cDNA Kitに添付のもの） を 0.5 μ\, 铸型 DNA (該 PCR反応液 50倍 希釈液） を 2.5 il、 および蒸留水を 14^1を混合して作製した。 反応条件は 94°> 30秒の初期変性後、 94°C'5秒- 72 '4分のサイクル反応を 5回、 94°C ·5秒- 70°C ·4 分のサイクル反応を 5回、 94°C'5秒- 68 >4分のサイクル反応を 25回行った。
得られた DNA断片を T0P0 TA Cloning Kit (Invi trogen社）を用いて添付のマ二 ュアルに記載された方法に従ってクロ一ニングした。 クローニングされた DNA配 列を ABI3100 DNA sequencerを用いて解読し、 2種類のゥシ ZAQの 5'部分配列
(typel：配列番号： 150 ; type2：配列番号： 151) の配列を得た。
配列番号： 150の情報より、 プライマ一 bZAQa_Fl (配列番号： 152) と bZAQa- F2 (配列番号： 1 53) を作成し、 以下に記した 3' RACE実験を実施した bZAQa-Fl: 5' -TCATCAGCCCGACCGCCCACTCTGGC-3' (配列番号： 152) bZAQa-F2: 5' -TAGGATGAAGCTTGGATTCTGGACGCCA-3' (配列番号： 153)
3' RACEの PCR反応液は、 PfuTurbo DNA polymerase (Stratagene社）を 1 ^ 1、 添 付の 10x PCR 131^【61"を5 1、 dNTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造）を 4 1、 10 Mプライマー bZAQa-Flおよび 10 xMプライマー API (プライマー APIは CL0NTECH社の Marathon-Ready cDNA KiUこ添付のもの） を各 2.5/^1 、 錶型 cDNA (BACE AL ds cDNAの 50倍希釈液） を 1 1、 および蒸留水を 34 1を混合して作製した。 反応条 件は 94 · 30秒の初期変性後、 94°C'5秒- 72°C'4分のサイクル反応を 5回、 94°C'5 秒 - 70°O4分のサイクル反応を 5回、 94°C'5秒- 68°C'4分のサイクル反応を 25回行 つた。
続いて、 該 PCR反応の反応液を蒸留水で 50倍に希釈したものをを铸型として nested PCRを行った。 PCR反応液は、 PfuTurbo DNA polymerase (Stratagene社） を 1 1、 添付の 10x PCR bufferを 5 1、 dNTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造）を 4 1、 10 Mプライマー bZAQa- F2および 10 Mプライマー API (プライマー AP2は CL0NTECH社の Marathon- Ready cDNA Kitに添付のもの) を各 2.5 1 、 錶型 DNAを 1 および蒸留水を 34/^1を混合して作製した。 反応条件は 94°C'30秒の初期変 性後、 94°C'5秒- 72°C'4分のサイクル反応を 5回、 94 >5秒- 70t>4分のサイクル 反応を 5回、 94°C'5秒- 68°C'4分のサイクル反応を 25回行った。
得られた DNA断片を Zaro Blunt T0P0 PCR Cloning Kit (Invi trogen社）を用い て添付のマニュアルに記載された方法に従ってクローニングした。 クローニング された DNA配列を ABI3100 DNA sequencerを用いて解読し、 ゥシ ZAQの 3'端の塩基 配列 （配列番号： 154) を得た。
5' RACEおよび 3' RACEの情報より、 プライマー bZAQa- EF1 (配列番号： 1 5 5) bZAQa-IFl (配列番号： 156) 、 bZAQa-IRl (配列番号 : 1 57) および bZAQa - ER1 (配列番号： 1 58) を作成し、 BACE AL ds cDNAの 50倍希釈液を铸型とし て、 以下に記した PCR反応を実施した。
bZAQa-EFl: 5' - TTTGAGTCGCTCCCAGTGTGTCCT - 3' (配列番号 : 155) bZAQa-IFl: 5' -GCTCCTCCCGGTTCTTTGAAATC-3' (配列番号： 1 56)
bZAQa-IRl: 5' -TGTAGTCTCTGAATCTCACTGGTGCC-3' (配列番号 : 1 57) bZAQa-ERl： 5' -GGTGGATTAAAAAGGCCCTCAATAAGCC-3' (配列番号： 1 58) PCR反応液は PfuTurbo DNA polymerase (Stratagene社）を 1 l、 添付の lOx PCR bufferを 5 1、 2.5 mM dNTP mixtureを 4 1、 10 プライマ一 bZAQa- EF1および bZAQa-ERlを各 2.5 1 、 铸型 DNAを 1 1、 および蒸留水を 34 1を混合して作製し た。 反応条件は 95°01分の初期変性後、 95 '30秒-60で'30秒-72°〇'3分のサィク ル反応を 35回、 および 72t> 10分の最終伸長反応とした。
続いて、 該 PCR反応の反応液を蒸留水で 50倍に希釈したものを铸型として nested PCRを行った。 PCR反応液は PfuTurbo DNA polymerase (Stratagene社）を 1 添付の IOX PCR bufferを 5 、 2.5 mM dNTP mixtureを 4 1、 IO Mプライ マー bZAQa- IF1および bZAQa- IR1を各 2.5 1 、 铸型 DNAを 1 1、 および蒸留水を 34 lを混合して作製した。 反応条件は 95°C'l分の初期変性後、 95°C'30秒- 60°C-30 秒- 72°C'3分のサイクル反応を 35回、 および 72°C · 10分の最終伸長反応とした。 得られた DNA断片を Zaro Blunt T0P0 PCR Cloning Kit (Invitrogen社）を用い て添付のマニュアルに記載された方法に従つてクローニングした。 クローニング された DNA配列を ABI3100 DNA sequencerを用いて解読し、 ゥシ型 ZAQ全長をコ —ドする 2038 bpの DM断片 （配列番号： 1 59) を有する P B Z AQを得ること ができた。 該プラスミドによりトランスフォームさせた大腸菌 DH5 aを、 大腸 菌 DH 5ひ Zp B Z AQと命名した。
配列番号： 1 5 9で表される塩基配列を有する c DNA断片には、 3 9 3個の アミノ酸配列 （配列番号： 1 7 1) がコードされており （配列番号： 1 7 2) 、 該アミノ酸配列を有する蛋白質をゥシ型 ZAQと命名した。
配列番号： 1 47の情報より、 プライマ一 bI5E5-l (配列番号 1-60) および bI5E5-3 (配列番号： 1 6 1) を作成し、 BACE AL ds cDNAを铸型として以下に記 した 5' RACE実験を実施した。
bI5E5-l: 5 ' -GTAGGCTGATGGGATGGAGATGAGAATGGA-3 ' (配列番号： 1 6 0) bI5E5-3: 5 ' -GCAGGTAGTTGATACAGGCACAGAGCACAT-3 ' (配列番号： 1 6 1 )
5，RACEの PCR反応液は 50X Advantage - GC 2 Polymerase Mix (CL0NTECH社）を 0.5 添付の 5x Advantage- GC 2 PCR buffer (200 mM Tricine-KOH, 75 mM KOAc, 17.5 mM Mg(0Ac)2， 25% Dimethyl Sulfoxide, 18.75 g/ml BSA, 0.025%Tween- 20, 0.025% Nonidet- P40)を 5 1、 dNTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造）を 2 / 1、 10 /Mプライマ一 bI5E5- 1を 0.5/zl、 10 Mプライマー API (プライマー APIは CL0NTECH社の Marathon- Ready cDNA Kitに添付のもの) を 0.5^ 1、 铸型 cDNA
(BACE AL ds cDNAの 50倍希釈液） を 2.5 l、 および蒸留水を 14 1を混合して作 製した。 反応条件は 94 > 30秒の初期変性後、 94 >5秒- 72°C'4分のサイクル反応 を 5回、 94°C'5秒- 70°C'4分のサイクル反応を 5回、 94°C · 5秒- 68°C ·4分のサイクル 反応を 25回行った。
続いて、 該 PCR反応の反応液を铸型として nested PCRを実施した。 反応液は 50X Advantage- GC 2 Polymerase Mix (CL0NTECH社）を 0.5 1、 添付の 5x Advantage- GC 2 PCR buffer (200 mM Tricine-KOH, 75 mM KOAc, 17.5 mM Mg(0Ac)2, 25% Dimethyl Sulfoxide, 18.75〃g/ml BSA, 0.025%Tween-20, 0.025% Nonidet- P40)を 5 1、 dNTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造）を 2.0/il、 10 Mプライマー bI5E5- 3を 0.5 1、 lO^Mプライマー AP2 (プライマ一 AP2は CL0NTECH社の
Marathon-Ready cDNA Ki tに添付のもの） を 0.5 zl、 铸型 DNA (該 PCR反応液 50倍 希釈液） を 2.5 、 および蒸留水を 14 1を混合して作製した。 反応条件は 94t> 30秒の初期変性後、 94°C'5秒- 72 >4分のサイクル反応を 5回、 94! '5秒-70 -4 分のサイクル反応を 5回、 94°C'5秒- 68°C'4分のサイクル反応を 25回行った。
得られた DNA断片を T0P0 TA Cloning Kit (Invi trogen社）を用いて添付のマ二 ュアルに記載された方法に従ってクローニングした。 クローニングされた DNA配 列を ABI3100 DNA sequencerを用いて解読し、 ゥシ I5Eの 5'部分配列 (配列番号： 162) を得た。
配列番号： 147の情報より、 プライマー bI5E3- 1 (配列番号： 163) およ び bI5E3- 3 (配列番号： 1 64) を作成し、 以下に記した 3' RACE実験を実施した bI5E3-l: 5'-AGCCTCCTTCCTGATCGCTCTGGTCTG-3' (配列番号： 163) bI5E3-3: 5'-CCCATCAGCCTACTTCACAAAGGAAACCG-3' (配列番号： 164) 3'1^ 5の？0反応液は5(^ Advantage- GC 2 Polymerase Mix (CL0NTECH社）を 0.5 1、 添付の 5x Advantage- GC 2 PCR buffer (200 mM Tricine-KOH, 75 mM KOAc, 17.5 mM Mg(0Ac)2, 25% Dimethyl Sulfoxide, 18.75 g/ml BSA, 0.025%Tween- 20, 0.025% Nonidet- P40)を 5 1、 dNTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造）を 2 1 IO Mプライマ一 bI5E3- 1を 0.5 zl、 プライマー API (プライマ一 APIは CL0NTECH社の Marathon-Ready cDNA Kitに添付のもの） を 0.5 1、 铸型 cDNA
(BACE AL ds cDNAの 50倍希釈液） を 2.5 1、 および蒸留水を 14 1を混合して作 製した。 反応条件は 94 >30秒の初期変性後、 94°C'5秒- 72 >4分のサイクル反応 を 5回、 94t>5秒- 70°C'4分のサイクル反応を 5回、 94°C ·5秒- 68°C ·4分のサイクル 反応を 25回行った。
続いて、 該 PCR反応の反応液を铸型として nested PCRを実施した。 反応液は 50X Advantage - GC 2 Polymerase Mix (CL0NTECH社）を 0.5 1、 添付の 5x Advantage - GC 2 PCR buffer (200 mM Tricine-KOH, 75 mM KOAc, 17.5 mM Mg(0Ac)2, 25% Dimethyl Sulfoxide, 18.75 g/ml BSA, 0.025 Tween-20, 0.025% Nonidet- P40)を 5^1、 dNTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造）を 2.0 1、 IO Mプライマー bI5E3- 3を 0.5 1、 10 Mプライマ一 AP2 (プライマー AP2は CL0NTECH社の
Marathon-Ready cDNA Kitに添付のもの) を 0.5 1、 铸型 DNA (該 PCR反応液 50倍 希釈液） を 2.5^1、 および蒸留水を 14 1を混合して作製した。 反応条件は 94°C- 30秒の初期変性後、 94°C'5秒- 72 >4分のサイクル反応を 5回、 94°C '5秒- 70°C ·4 分のサイクル反応を 5回、 94^·5秒- 68°C'4分のサイクル反応を 25回行った。 得られた DNA断片を T0P0 TA Cloning Ki t (Ιηνί trogen社）を用いて添付のマ二 ュアルに記載された方法に従ってクローニングした。 クロ一ニングされた DNA配 列を ABI3100 DNA sequencerを用いて解読し、 ゥシ I5Eの 3'部分配列 （配列番号 1-65 ) を得た。
5' RACEおよび 3' RACEの情報より、 プライマ一 bZAQb- F (配列番号： 1 6 6) 、 bZAQb-F2 (配列番号： 1 6 7) 、 bZAQb-R (配列番号 : 1 6 8) および bZAQb- R2
(配列番号： 1 6 9) を作成し、 BACE AL ds cDNAの 50倍希釈液を铸型として、 以下に記した PCR反応を実施した。
bZAQb-F: 5'- CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC- 3' (配列番号： 1 6 6)
bZAQb-F2: 5' -GCTGGGTGAGAAGGAATAGGGA-3' (配列番号： 1 6 7)
bZAQb-R: 5' -GCAGGTGCCAATTCATTTTGC-3' (配列番号： 1 68)
bZAQb-R2： 5' -TGCTCTTTAATCTCGCTGGTGGT-3' (配列番号： 1 69)
PCR反応液は PfuTurbo DNA polymerase(Stratagene社）を 1 1、 添付の 10x PCR bufferを 5/il、 2.5 m dNTP mixtureを 4 1、 IO Mプライマ一 bZAQb-Fおよび bZAQb-Rを各 2.5μ1 、 铸型 DNAを 1^1、 および蒸留水を 34 1を混合して作製した。 反応条件は 95で · 1分の初期変性後、 95で · 30秒- 58°C · 30秒- 72°C · 3分のサイクル反 応を 40回、 および 72°C · 10分の最終伸長反応とした。
続いて、 該 PCR反応の反応液を蒸留水で 50倍に希釈したものを铸型として nested PCRを行った。 PCR反応液は PfuTurbo DNA polymerase (Stratagene社）を 1 L K 添付の 10χ PCR bufferを 5 1、 2.5 mM dNTP mixtureを 4 1、 IO Mプライ マー bZAQb - F2および bZAQb-R2を各 2· 5 1 、 铸型 DNAを 1 1、 および蒸留水を 34 1を混合して作製した。 反応条件は 95°C'l分の初期変性後、 951>30秒-58°030 秒 - 72°C · 3分のサイクル反応を 40回、 および 72°C · 10分の最終伸長反応とした。
得られた DNA断片を Zaro Blunt T0P0 PCR Cloning Kit (Invi trogen社）を用い て添付のマニュアルに記載された方法に従ってクロ一ニングした。 クローニング された DNA配列を ABI3100 DNA sequencerを用いて解読し、 ゥシ型 I 5 E全長をコ ードする 1623 bpの DNA断片 （配列番号： 1 7 0) を有する p B I 5 Eを得ること ができた。 該プラスミドによりトランスフォームさせた大腸菌 TOP 1 0を、 大 腸菌 TOP 1 OXp B I 5 Eと命名した。 配列番号： 170で表される塩基配列を有する cDN A断片には、 384個の アミノ酸配列 （配列番号： 173) がコードされており （配列番号： 174) 、 該アミノ酸配列を有する蛋白質をゥシ型 I 5 Eと命名した。 実施例 2 ゥシ副腎毛細血管内皮細胞 （BACE) およびゥシ大動脈血管内皮細 胞 （BAE) に発現しているゥシ型 ZAQおよびゥシ型 I 5 Eレセプ夕一の同定 PBZAQを銬型としてゥシ型 ZAQの情報より、 プライマー bZAQa- IF1 (配列番号： 175) および bZAQa-te即 IR (配列番号： 176) を作成し、 以下に記した方法 で ZAQ用標準 DNA断片を作製した。
bZAQa-IFl: 5' -GCTCCTCCCGGTTCTTTGAAATC-3' (配列番号： 175) bZAQa- te即 IR: 5' -TGGTGAGGTTGCGTAGCTTCTTG-3' (配列番号： 176 ) PCR反応液は PfuTurbo hotstart DNA polymerase (5 &{&361^社）を4 /1、 添付 の 10x PCR bufferを 20 /1、 dNTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造）を 16 1、 10 z Mプライマ一 bZAQa- IF1および bZAQa- tempIRを各 10 1 、 铸型 cDNA (pBZAQ) を 4w 1、 および蒸留水を 136 /^を混合して作製した。 反応条件は 95で ·1分の初期変性 後、 95t>30秒- 60°C'30秒- 72 >l分のサイクル反応を 40回行った。 得られた DNA 断片をゥシ型 ZAQ用標準 DNA断片とした。
ゥシ型 ZAQの情報より Primer Expressソフトウェアを用いて、 ゥシ型 ZAQ用 forwardおよび reverse TaqMan primer, bZAQa-taqF (配列番号 : 177) および bZAQa-taqR (配列番号： 178) 、 ゥシ型 ZAQ用 TaqMan probe, bZAQa-probe (配 列番号： 179) を作製した。
bZAQa-taqF: 5' -AACCAACTATTTCCCTCTGCTTGAC-3' (配列番号： 177) bZAQa-taqR: 5' -TCACCGTAGCTGAAGTTGAAGG-3' (配列番号： 178) bZAQa-probe: 5' -FAM-CCTCGGAGCCCAAGCTGCTTCTTT-TAMRA-3' (配列番号： 17 9)
ゥシ型 ZAQ遣伝子に対する TaqMan Probeと TaqMan Primerとの組合せで、 BACE 由来 cDNA(BACE cDNA)および BAE 由来 cDNA(BAE cDNA)を铸型として TaqMan PCR解 析によるゥシ型 ZAQ遺伝子転写産物の定量を行った。 反応液は 2xTaqMan PCR Master Mix 12.5 K 5〃Mプライマ一 bZAQa - taqFおよび bZAQa-taqRを各 1.5/ 1 、 プローブ bZAQa-probeを各 、 希釈濃度の異なるゥシ型 ZAQ用標準 DNA断片 ぁるぃは銹型00^を4 1 (200ng tRNA由来）、 および蒸留水を 4.5 1を混合して 作製した。
TaqMan PCR反応は、 50°C ·2分 95°C · 10分の初期反応、 95°C · 15秒- 60°C · 1分のサ ィクル反応を 50回という条件で、 SDS7700 (Sequence Detection System, ABI) を用いて行った。 反応終了後、 ソフトウェア上で各希釈濃度の標準 DNA断片に対 する蛍光強度より標準曲線をプロットし、 铸型 cDNAサンプル中のゥシ型 ZAQ遺伝 子転写産物を定量した。
PBI5Eを铸型としてゥシ型 I5Eの情報よりプライマー bZAQb-F2 (配列番号： 1 80) および bZAQb- tempi R (配列番号： 181) を作成し、 以下に記した方法で ZAQ用標準 DNA断片を作製した。
bZAQb-F2: 5'-GCTGGGTGAGAAGGAATAGGGA-3' (配列番号： 180)
bZAQb- te即 IR: 5， -GGAGAGCTGATGCACCACATAGTAG- 3 ' (配列番号： 181) PCR反応液は PfuTurbo hotstart DNA polymerase (5 3(&861^社）を4^1、 添付 の 10x PCR bufferを 20/ 1、 dNTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造）を 16wl、 10^ Mプライマー bZAQb-F2および bZAQb- tempIRを各 10 1 、 铸型 cDNA (pBI5E) を 4/ l、 および蒸留水を 136^1を混合して作製した。 反応条件は 95 >l分の初期変性後、 95T: ·30秒- 60°C ·30秒- 72°C · 1分のサイクル反応を 40回行つた。 得られた DNA断片 をゥシ型 15E用標準 DNA断片とした。
ゥシ型 I5Eの情報より Primer Expressソフトウェアを用いて、 ゥシ型 I5E用 forwardおよび reverse TaqMan primer, bZAQb-taqF (配列番号： 182) および bZAQb-taqR (配列番号： 183) 、 ゥシ型 I5E用 TaqMan probe, bZAQb-probe (配 列番号： 184) を作製した。
bZAQb-taqF: 5 '-TCATGAGAGCAGAAGGTCTGGA-3 ' (配列番号： 182)
bZAQb-taqR: 5' -TGGCTGGAAAACTAGCATTTCC-3' (配列番号： 183)
bZAQb-probe: 5'-FAM-CACACACCGCTCACTGGAAAGCTTCA-TAMRA-3' (配列番号： 18 4)
ゥシ型 I5E遣伝子に対する TaqMan Probeと TaqMan Primerとの組合せで、 BACE 由来 cDNA(BACE cDNA)および BAE 由来 cDNA(BAE cDNA)を铸型として TaqMan PCR解 析によるゥシ型 I5E遺伝子転写産物の定量を行った。 反応液は 2xTaqMan PCR Master Mix 12.5 1、 5 iMプライマー bZAQb-taqFおよび bZAQb-taqRを各 1· 5 1 5 Μプローブ bZAQb- probeを各 ΙίΗ 、 希釈濃度の異なるゥシ型 I5E用標準 DNA断片 あるいは铸型 cDNAを (200ng tRNA由来）、 および蒸留水を 4· 5 1を混合して作 製した。
TaqMan PCR反応は、 50 ·2分 95" ·10分の初期反応、 95°じ'15秒-60で'1分のサ ィクル反応を 50回という条件で、 SDS7700 (Sequence Detection System, ABI) を用いて行った。 反応終了後、 ソフトウェア上で各希釈濃度の標準 DNA断片に対 する蛍光強度より標準曲線をプロットし、 铸型 cDNAサンプル中のゥシ型 I5E遺伝 子転写産物を定量した。
結果を 〔図 6〕 に示す。 これより、 ゥシ副腎毛細血管内皮細胞にはゥシ型 ZA Qおよびゥシ型 I 5 Eが発現されていることがわかる。 また、 ゥシ大動脈血管内 皮細胞にはゥシ型 I 5 Eが発現されていることがわかる。 実施例 3
(1) ゥシ副腎毛細血管内皮細胞 （BACE) を用いた FL I PRによる細胞内 カルシウムイオン濃度上昇活性の測定
BACEは Gospodarowicz等が報告している方法を用いて単離した (Journal of Cellular Physiology 127, 121-136, 1986) 。 増殖用培地（10% ゥシ胎児血清
(FBS) 、 100 units/ml Penicillin, 100 ugM 8 6010町 11を含む1)¾¾\0 に 分散した BACEを 3X cells/200 / 1/wel 1になるように FLIPR用 96穴プレート (Black plate clear bottom, Cos ter社）に播種し、 5% C02インキュベータ一中に て 37°Cで一晩培養後実験に用いた. (以後細胞プレートとする）。 FLIPRアツセィバ ッファー （二ッスィハンクス 2 (日水製薬株式会社） 9.8 g、 炭酸水素ナトリウ ム 0.35 g、 HEPES 4.77 g 、 6 M水酸化ナトリウム溶液で pH 7.4に合わせた後、 1リットルにフィルアップ後フィルター滅菌） 10 ml、 250 mM Probenecid 100 fi 1、 FBS 100 lを混合した。 また、 Fluo 3- AM (同人化学研究所） 1バイアル（25 g)に dimethyl sul foxideを 20 "1と 20% Pluronic acid (Molecular Probes 社） 20 1を添加し溶解後、 これを上記 Hanks'/HBSS— Probenecid— FBS に加え， 培養上清を除いた細胞プレートに各ゥエル 100 1ずつ分注し、 5% C02インキュ ベ一夕一中にて 37 で 1時間ィンキュベー卜した。
一方、 参考例 1 4、 8および 1 3に示した方法で調製したヒト型 ZAQリガン ドペプチド、 ヒト型 B V 8ペプチドまたはへビ毒 M I T 1を、 2.5 mM
Probenecid, 0.2% bovine serum albumin (BSA) , 0.1% CHAPSを含む
Hanks'/HBSSで希釈し、 96穴プレートに分注した（サンプルプレー卜）。 細胞プレ —卜の色素ローデイング終了後、 細胞プレートを 2.5 mM Probenecidを含む FLIPR アツセィバッファー （洗浄用バッファー） でプレートウォッシャー（Molecular Devices社）を用いて 4回洗浄後、 100 1の洗浄バッファーを残した。 この細胞 プレートとサンプルプレートを FLIPRにセットしアツセィを行った （FLIPRにより サンプルプレートから 50 1のサンプルが細胞プレートへと移される） 。
結果を 〔図 7〕 に示す。
これより、 ゥシ毛細血管内皮細胞 （BACE) はヒト型 ZAQリガンドぺプチ ド、 ヒト型 B V 8ペプチドおよびへビ毒 M I T 1に応答して細胞内カルシウムィ オンの上昇を起こすことが明らかである。
従って、 試験化合物の存在下または非存在下、 ヒト型 ZAQリガンドぺプチ ド、 ヒ卜型 B V 8ペプチドおよびへビ毒 M I T 1などの本発明のペプチドを用い てゥシ毛細血管内皮細胞を刺激することにより、 試験化合物に ZAQまたは I 5 Eのシグナル情報伝達を阻害する活性があるのか否かを知ることができ、 血管新 生阻害剤を得ることができる。
(2) リン酸化 p 42 MAPキナ一ゼおよびリン酸化 p 44 MAPキナーゼの ウェスタンプロッティンブによる検出
増殖用培地に分散した BACEを 2X105 cells/ml/wellになるように 12穴プレート に播種しー晚 5% C02、 37でで培養後実験に用いた。 10 nM、 100 nM、 1,000 nMの リガンド溶液を 10 1添加し 37 で 5分間ィンキュベ一シヨンした。
このリガンド溶液として、 参考例 1 4、 8および 1 3に示した方法で調製した ヒト型 Z AQリガンドぺプチド、 ヒト型 B V 8ぺプチドまたはへビ毒 M I T 1を， 0.2% BSAと 0.〗％ CHAPSを含む H/HBSSに溶解したものを用いた。 その後、 培養上清を除去し Lysis Buffer (50 mM Tris, 150 m NaCK 】 uiM EDTA、 2 mM Na3V04、 50 mM NaF、 4 mM Na4P207, \% NP 40、 1 mM
phenylmethylsul fonyl fluoride (PMSF)、 20 g/ml、 leupeptin, 10 g/m\ peps tat in A、 pH 7.4) を 100 «1添加した。 氷上で 30分間放置後、 上清を 15, 000 ι·ριπで 10分間遠心し得られた上清に SDS- PAGE用サンプルバッファ一（300 mM Tris, 10% sodium dodesylsul f ate> 0.025% bromophenolblues 50% glycerol, pH 6.8)を 20 1添加し 3分間煮沸した。 このうち 18 1を 12.5%のゲル （BI0-RAD 社） を用いて SDS- PAGEで分離した。 電気泳動後、 ゲルをトランスファ一用バッフ ァ一 （25 mM Tris, 192 mM Glycine, 10% MeOH) 中で 15分間しんとうした後、 ゲル中の蛋白を PVDF膜 （MiniProBlot、 Applied Biosystems) にトランスファー した。 トランスファ一した膜 （ブロット） をブロッキングバッファ一 （50 mM Tris, 150 mM NaCK 0.1% Tween 20、 1% BSA、 pH 7.4) を用いてー晚 4°Cでブ ロッキングした。 この後、 プロットに一次抗体溶液 （Cell Signaling
TECHNOLOGY社の Phospho p42/44 MAP Kinase Ant ibodyを前述のブロッキングバッ ファーで 5, 000倍希釈したもの） を 30 ml添加し室温で 2時間インキュベートした。 この後、 ブロットを洗浄用バッファ一 （50 mM Tris, 150 mM NaCK 0.1% Tween 20、 pH 7.4) で洗浄後 （20分間 X3) 、 プロットに二次抗体溶液 （KPL社の Anti Rabbit IgG HRP- linked (Goat)を前述のブロッキングバッファ一で 1， 000倍希釈 したもの） 30 ml添加し室温で 1時間反応させた。 この後、 プロットを洗浄用バッ ファーで洗浄し （20分間 X 3) 、 さらにバッファー （50 mM Tris, 150 mM NaCし pH 7.4) で洗浄後 （2分間 X2) 、 ECL Plus (Amersham Pharmacia Biotech)を用 いてリン酸化 P42/44 MAP Kinaseを検出した。
結果を 〔図 8〕 に示す。
図 8より、 リガンドを添加しないコントロールに比べ、 ヒト型 ZAQリガンド ペプチド、 ヒト型 Bv 8ペプチドまたはへビ毒 M I T 1を添加した場合にはリン 酸化された MAPキナーゼ （MAPK—P) のバンドの染色強度が増強している ことを読み取ることができる。 また、 へビ毒 M I T 1は 0. I nMという低濃度 からこの増強効果を現すことができ、 ヒト型 B V 8ペプチドは 1 nM から、 ヒ 卜型 Z AQリガンドペプチドは 10 nMからこの効果を現した。 ゥシ毛細血管内皮細胞 （BACE) はヒト型 ZAQリガンドペプチド、 ヒト型 B V 8ペプチドおよびへビ毒 M I T 1などのペプチドの添加により MAPキナー ゼの活性化が起こることが明らかである。
従って、 試験化合物の存在下または非存在下、 ヒト型 ZAQリガンドペプチド. ヒト型 B V 8ペプチドおよびへビ毒 M I T 1などの本発明のぺプチドを用いてゥ シ毛細血管内皮細胞を刺激することにより、 試験化合物に ZAQまたは I 5Eの シグナル情報伝達を阻害する活性を有しているのか否かを知ることができ、 血管 新生阻害剤を得ることができる。 (3) リン酸化 p 38 MAPキナーゼのウエスタンブロッテイングによる検出 増殖用培地に分散した BACEを 2X105 cells/ml/wellになるように 12穴プレート に播種しー晚 5% C02、 371：で培養後実験に用いた。 10 nM、 100 nM、 1,000 nMの リガンド溶液を 10 l添加し 37tで 5分間インキュベーションした。
このリガンド溶液は、 参考例 14、 8および 13に示した方法で調製したヒト 型 ZAQリガンドペプチド、 ヒト型 B V 8ペプチドまたはへビ毒 M I T 1を、 0.2% BSAと 0.1% CHAPSを含む H/HBSS に溶解したものを用いた。
その後、 培養上清を除去し Lysis Buffer (50 mM Tris、 150 mM NaCK 1 mM EDTA、 2 mM Na3V04、 50 mM NaF、 4 mM Na4P207、 1% NP 40、 1 mM PMSF、 20 zg/ml, leupeptin, 10
Figure imgf000139_0001
pepstatin A、 pH 7.4) を 100 1添加した。 氷上で 30分 間放置後、 上清を 15， 000 rpmで 10分間遠心し得られた上清に SDS-PAGE用サンプル バッファー 20 1添加し 3分間煮沸した。 このうち 18 lを 12.5%のゲル （BI0- RAD社） を用いて SDS-PAGEで分離した。 電気泳動後、 ゲルをトランスファ一用バ ッファー （25 mM Tris、 192 mM Glycine, 10% MeOH) 中で 15分間しんとうした 後、 ゲル中の蛋白を PVDF膜 (MiniProBlot, Applied Biosystems) にトランスフ ァ一した。 トランスファーした膜 （ブロット） をブロッキングバッファー （50 mM Tris、 150 mM NaCl、 0.1% Tween 20、 1% BSA、 pH 7.4) を用いて室温で 1時 間ブロッキングした。 この後、 プロットに一次抗体溶液 （Cell Signaling
TECHNOLOGY社の Phospho p38 MAP Kinase (Thrl80/Tyrl82) Antibodyを前述のブ ロッキング溶液で 1,000倍希釈したもの） を 30 ml添加し 4 で一晩インキュベー 卜した。 この後、 プロットを洗浄用バッファーで洗浄後 （20分間 X3) 、 ブロッ 卜に二次抗体溶液 (Cell Signaling TECHNOLOGY社の Ant i Rabbit IgG, HRP- 1 inked Antibodyを前述のブロッキングバッファ一で 1, 000倍希釈したもの） 30 ml添加し室温で 1時間反応させた。 この後、 プロットを洗浄用バッファー （50 mM Tris、 150 mM NaCK 0.1% Tween 20、 H 7.4) で洗浄し （20分間 X 3) 、 さらに バッファー （50 mM Tris、 150 mM NaCK pH 7.4) で洗浄後 （2分間 X2) 、 ECL Plus (Amersh m Pharmacia Biotech)を用いてリン酸化 p38 MAP Kinaseを検出し た。
結果を 〔図 9〕 に示す。
図 9より、 リガンドを添加しないコントロールに比べてヒト型 Z AQリガンド ペプチド、 ヒト型 B V 8ペプチドまたはへビ毒 M I T 1などのペプチドを添加し た場合にはリン酸化された P 38 MAPキナーゼ （p 38 MAPK-P) の バンドの染色強度が増強していることを読み取ることができる。 また、 へビ毒 M I TlttO. 1 nMという低濃度からこの増強効果を現すことができ、 ヒト型 B v 8ペプチドは I nM から、 ヒ卜型 Z AQリガンドペプチドは 10 nMからこ の効果を現した。
ゥシ毛細血管内皮細胞 （BACE) はヒト型 ZAQリガンドペプチド、 ヒト型 Bv 8ペプチドおよびへビ毒 M I T 1などのペプチドの添加により ρ 38 ΜΑ Ρキナーゼの活性化が起こることが明らかである。
従って、 試験化合物の存在下または非存在下、 ヒト型 ZAQリガンドペプチド. ヒト型 Β V 8ペプチドおよびへビ毒 M I Τ 1などの本発明のぺプチドを用いてゥ シ毛細血管内皮細胞を刺激することにより、 試験化合物に ZAQまたは I 5Εの シグナル情報伝達を阻害する活性を有しているのか否かを知ることができ、 血管 新生阻害剤を得ることができる。
(4) [3Η] チミジン取り込みアツセィ
増殖用培地に分散した BACEを 1.5X104 cells/200 1/wel 1になるように 48ゥェ ルプレー卜に播種し一晩培養後、 培養上清を除去しアツセィバッファ一 （0.5% BSA、 0.1% FBSを含む DMEM) 495 ； とリガンド溶液 5 を添加し、 さらに 15 - 18時間培養した。
このリガンド溶液としては、 参考例 14、 8および 13に示した方法で調製し たヒ卜型 ZAQリガンドペプチド、 ヒト型 B V 8ペプチドまたはへビ毒 M I T 1 を、 0.2% BSAと 0.1% CHAPSを含む H/HBSS に溶解したものを用いた。
その後、 各ゥエルに [ ] Thymidine溶液 （NEN社、 NET- 027を血清不含 DMEMで 100 倍希釈したもの） を 50 添加しさらに 6時間培養した。 この後、 培養上清を除 去し各ゥエルに洗浄バッファ一 500 lを添加し洗浄後、 メタノール 500 1を添 加し氷上で 15分間放置した。 その後、 各ゥエルの上清を除去し 5%トリクロ口酢 酸 （TCA) 500 1を添加し氷上で 15分間放置後、 TCAを除去し水 500 /1を添加し 洗浄した。 最後に 0.3 M NaOHを 200 1添加し溶解後、 液体シンチレ一ターを 3 ml 添加し放射活性を液体シンチレーシヨンカウンターで測定した。
結果を 〔図 1 0〕 に示す。
図 10より、 リガンドを添加しないコントロールに比べてヒト型 ZAQリガン ドペプチド、 ヒト型 Bv 8ペプチドまたはへビ毒 M I Τ 1を添加した場合にはゥ シ副腎毛細血管内皮細胞の [3Η] チミジン取り込み量が増加していることがわ かる。
従って、 試験化合物の存在下または非存在下、 ヒト型 ZAQリガンドペプチド、 ヒト型 Β V 8ペプチドおよびへビ毒 M I Τ 1などの本発明のぺプチドを用いてゥ シ毛細血管内皮細胞を刺激することにより、 試験化合物に ZAQまたは I 5 Εの シグナル情報伝達を阻害する活性を有しているのか否かを知ることができ、 血管 新生阻害剤を得ることができる。
(5) 細胞増殖アツセィ
増殖用培地に分散した BACEを 5X103 cells/ml/wellになるように 24穴プレート に播種し一晩培養した後、 参考例 14および 8に示した方法で調製したヒト型 Z AQリガンドペプチドまたはヒト型 Bv 8ペプチドを、 0.2% BSAと 0.1% CHAPS を含む H/HBSS に溶解したものを 10 l添加し、 さらに 4-5日間培養した。 その後、 培養上清を除去し PBSlmlをゥエルに添加し細胞を洗浄後、 トリプシン溶液 200 n 1を添加し細胞をピベッティングで回収し、 細胞数を血球計算版で測定した。 結果を 〔図 1 1〕 に示す。
図 1 1より、 上記ペプチドを添加しないコントロールに比べてヒト型 ZAQリ ガンドペプチドまたはヒト型 B V 8ぺプチドを添加した場合にはゥシ副腎毛細血 管内皮細胞の細胞数が増加していることがわかる。
従って、 試験化合物の存在下または非存在下、 ヒト型 ZAQリガンドペプチド およびヒト型 Bv 8ペプチドなどの本発明のペプチドを用いてゥシ毛細血管内皮 細胞を刺激することにより、 試験化合物に ZAQまたは I 5 Εのシグナル情報伝 達を阻害する活性を有しているのか否かを知ることができ、 血管新生阻害剤を得 ることができる。 参考例 1 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 ZAQをコ一ドする c DNAのクロ 一二ングと塩基配列の決定および Z A Qの発現分布の解析
(1) G蛋白質共役型レセプター蛋白質 ZAQをコードする c DNAのクロ一二 ングと塩基配列の決定
ヒト脳下垂体 cDNA (CL0NTECH社） を铸型とし、 2個のプライマー、 プライ マー 1 (5'- GTC GAC ATG GAG ACC ACC ATG GGG TTC ATG G -3' ； 配列番号： 4) 及びプライマー 2 (5'- ACT AGT TTA TTT TAG TCT GAT GCA GTC CAC CTC TTC -3' ;配列番号： 5) を用いて P C R反応を行った。 該反応における反応液の組成は上記 c DNAの 1 0分の 1量を铸型として使用し. Advantage2 Polymerase Mix (CL0NTECH社） 1 50量、 プライマー 1及びプ ライマ一 2を各 0.2wM， dNTPs 200 wM、 及び酵素に添付のバッファ一を加え、 25 の液量とした。 PCR反応は、 94 2分の後、 94°C ' 20秒、 Ί 2°C · 1 00秒のサイクルを 3回、 94°C . 20秒、 68 °C . 100秒のサイク ルを 3回、 94 · 20秒、 64 ' 20秒、 68で · 100秒のサイクルを 3 8回繰り返し、 蕞後に 68^： · 7分の伸長反応を行った。 該 PCR反応後の反応 産物を TAクローニングキット （InWtrogen社） の処方に従いプラスミドベクタ 一 PCR2.1 (Invitrogen社） へサブクローニングした。 これを大腸菌 DH 5ひに導 入し、 c DNAをもつクローンをアンピシリンを含む LB寒天培地中で選択した 後、 個々のクローンの配列を解析した結果、 新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白 質をコードする 2種類の c DNA配列 ZAQC (配列番号： 2) 及び ZAQT
(配列番号： 3) を得た。 この cDNAより導き出されるアミノ酸配列を有する 蛋白質はいずれも同一配列 （配列番号： 1) を有したため ZAQと命名し、 配列 番号： 2で表される DNAを含有する形質転換体を大腸菌 （Escherichia coli) DH 5 α/ρ CR 2. 1— ZAQCと、 配列番号： 3で表される DNAを含有す る形質転換体を大腸菌 DH 5 a CR 2. 1一 ZAQTと命名した。
(2) Ta qman P C Rによる Z A Qの発現分布の解析
Taqman PCRに用いるプライマ一およびプローブは、 Primer Express ver. 1.0 (PEバイオシステムスジャパン）を用いて検索し、 プライマー 3 (5'- TCATGTTGCTCCACTGGAAGG-3' (配列番号： 58) )， プライマー 4 (5'- CCAATTGTCTTGAGGTCCAGG-3' (配列番号： 29) ) , ZAQprobe (5' - TTCTTACAATGGCGGTAAGTCCAGTGCAG-3' (配列番号： 60) ) を選択した。 プロ一ブ のリポーター色素として、 FA (6-carboxyf luorescein) を付加した。
スタンダード DNAとして、 pAK— ZAQCを铸型に、 プライマー ZAQC Sal (5' - GTCGACATGGAGACCACCATGGGGTTCATGG- 3' (配列番号： 61) ) および ZAQC
Spe (5' -ACTAGTTTATTTTAGTCTGATGCAGTCCACCTCTTC-3' (配列番号： 62) )を用い て増幅した PCR断片を、 CHROMA SPIN200 (CLONTECH Laboratories, Inc. (CA, USA) ) を用いて精製し、 10°— 106コピー/ に調整して使用した。 各組識の cDNAソースとして、 Human Multiple Tissue cDNA Panel Iおよび Panel II
(CLONTECH Laboratories, Inc. ) を 使用した。 プライマ一、 プローブ、 鎵型 に、 Taqman Universal PCR Master Mix (PEバイオシステムスジャパン） を添付 書類記載の規定量加え、 ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (PEバイオ システムズジャパン） で PCR反応および解析をおこなった。
結果を表 1に示す。 主に精巣、 ついで肺、 脳等の部位で ZAQの発現がみられた。 〔表 1〕
Figure imgf000144_0001
参考例 2 レセプター安定発現 CH〇細胞の作製
(2 - 1) Z A Q安定発現細胞株の作製
ZAQ安定発現細胞株は以下のようにして調製した。 すなわち、 参考例 1で得た DH5ひノ pCR2.1— ZAQCの 1クローンを、 アンピシリンを含む LB培地で振とう培養 し、 プラスミド pCR2.1— ZAQCを得た。 これを制限酵素 Sal Iおよび Spe Iで処理し. ZAQCをコードするインサート部分を切り出した。 同様に制限酵素 Sal Iおよび Spe Iで処理した pAKKO—l.11H (Biochemica et Biophysica Acta 1219 (1994) 251- 259) と、 該インサート部分を Ligation Express Kit (CL0NTECH Laboratories, Inc. (CA, USA) ) を用いて連結し、 大腸菌 DH10Bにエレクト口ポーレーシヨン 法にて導入した。 得られたクローンの有するプラスミドの構造を、 制限酵素処理 ならびに配列解析で確認し、 正しい構築のものを CH0細胞発現用プラスミド pAK— ZAQCとして使用した。
このプラスミド pAK—ZAQCを CHO/dhfr細胞 (American Type Culture
Collection) に CellPh.ect Transfect ion kit (Amersham Pharmacia Biotech社) を用いて形質導入することにより'取得した。 まず、 蒸留水 120 1に溶解したプ ラスミド DNA 4 に対して Buffer A (CellPhect Transfection Kitに添付) 120 1を添加し、 撹拌し、 10分間静置後、 Buffer B (CellPhect Transfection Kit に添付） 240 1を添加し、 激しく撹拌し該 DNAを含有する DNA—リン酸カルシ ゥム複合体を形成させた。 5 105個の CH0/ dhfr細胞を 60 mmシャーレに播き、 10%のゥシ胎児血清 （BIO WH1TTAKER社） を含む Ham's F- 12培地 （日水製薬株 式会社） 中で 37 ：、 5%炭酸ガス中で 1日間培養した後、 該 DNA—リン酸カル シゥム複合体の懸濁液 480 β \ をシャーレの該細胞上に滴下きせた。 これを、 37 、 5%炭酸ガス中にて 6時間培養した後、 血清を含まない Ham's F- 12培地で 2回細胞を洗浄し、 シャーレの該細胞上に 15%グリセロールを含む緩衝液 （140 mM NaCl, 25 mM HEPES, 1.4 mM Na2P04> pH7.1) 1.2mlを添加し 2分間処理した。 これを、 再度、 血清を含まない Ham's F-12培地で 2回洗浄した後、 10%のゥシ胎 児血清を含む Ham's F- 12培地中で 37°C、 5%炭酸ガス中でー晚培養した。 該細胞 をトリプシン処理により分散させてシャーレから回収し、 2 x 104個ずつ 6-wdl plateに植え込み、 透析済み 10%ゥシ胎児血清 （JRH BIOSCIENCES社） 、 1 mM MEM非必須アミノ酸溶液 （大日本製薬株式会社） 、 100 units/ml Penicillin, 100 xg/ml Streptomycinを含む Dulbecco s modified Eagle medium (DMEM) 培 地 （日水製薬株式会社） 中にて 37°C、 5%炭酸ガス中にて培養を開始した。 ブラ スミドの導入された形質転換 CH0細胞は該培地中で生育するが、 非導入細胞は次 第に死滅していくので、 培養開始 1日目、 および 2日目に培地を交換して死滅細 胞を除去した。 培養開始 8— 10日後に生育してきた形質転換 CH0細胞のコロニ 一を約 21個選んだ。 それぞれ選択された細胞から RNAを市販の RNA単離用キット を用いて回収し、 以降、 公知の RT— PCR法により ZAQを高発現する ZAQ発現 CH0細胞 B- 1番クローン （以後、 ZAQC- B1細胞と略称する） を選別した。 (2 -2) I 5 E安定発現細胞株の作製
ヒト I5Eレセプター cDNA (配列番号： 6) を公知の P C R法によりクローニン グし、 pAKKOl.11H発現ベクターに組み込んだ。 該発現べクタ一を （2— 1) に記 載した方法により CHO/dhfr細胞 (American Type Culture Collection) に形質導 入した。 培養開始 10— 14日後に生育してきた形質転換 CH0細胞のコロニーを 約 20個選んだ。 選択した細胞を 3X104個/ wellで 96穴プレートに植え込み、 へビ 毒 ΜΙΠ (配列番号： 2 1) に対する反応性を、 後述の （2— 3) に記載する試験 方法により検討し、 反応性の良い I5E発現 CH0細胞 4番クローン （以後、 I5E-4細胞 と略称する） を選別した。
(2-3) 受容体活性化作用の測定
上記 （2— 1) で得られた ZAQC- B1細胞、 および上記 （2— 2) で得られた I5E- 4細胞を、 それぞれ 15X104cells/mlとなるように培地 （10% d FBS-DMEM) に 懸濁し、 FLIPR用 96穴プレート（Black plate clear bottom. Coster社）に分注器 を用いて各ゥエルに 200 lずつ植え込み （3.0X104cells/200 l/ゥエル） 、 5% C02インキュベータ一中にて 37 で一晩培養した後用いた （以後、 細胞プレートと する） 。 H/HBSS (二ッスィハンクス 2 (日水製薬株式会社） 9.8έ、 炭酸水素ナ トリウム 0.35g、 HEPES 4.77 g、 6 M水酸化ナトリウム溶液で pH7.4に合わせた 後、 フィルター滅菌処理） 20 ml、 250 mM Probenecid 200 β ゥシ胎児血清 (FBS) 200 1を混合した。 また、 Fluo 3-AM (同仁化学研究所） 2バイアル （50 a g) をジメチルスルフオキサイド 40 K 20% Pluronic acid (Molecular Probes社） 40 tlに溶解し、 これを上記 H/HBSS— Probenecid_FBS に加え、 混 和後、 8連ピペットを用いて培養液を除いた細胞プレートに各ゥエル 100 1ず つ分注し、 5% C02インキュベータ一中にて 37°Cで 1時間インキュベートした （色 素ローデイング） 。 へビ毒 ^を mM Probenecid, 0.2% BSAを含む H/HBSS 150 lを加えて希釈し、 FLIPR用 96穴プレート（V-Bottomプレート、 Coster社）へ 移した（以後、 サンプルプレートとする）。 細胞プレートの色素ローデイング終了 後、 11/1¾53に2.5 mM Probenecidを加えた洗浄バッファーでプレートゥォッシャ -(Molecular Devices社）を用いて細胞プレートを 4回洗浄し、 洗浄後 100 の 洗浄バッファーを残した。 この細胞プレートとサンプルプレートを FLIPRにセッ 卜し （FLIPRにより、 サンプルプレートから 50 1のサンプルが細胞プレートへ と移される） 、 蛍光強度変化を継時的に測定することにより、 細胞内 C aイオン 濃度上昇活性を測定した。 参考例 3 ヒト型 B V 8ペプチドの作製
(3 - 1) ヒ卜型 Bv 8ペプチド cDNAのクローニング
ヒト精巣 Marathon-Ready cDNA (CL0NTECH社）を铸型として、 プライマ一 hBv8 - F1 (配列番号： 7) 及びプライマー hBv8- R1 (配列番号： 8) を作成し、 以下に 記した PCR反応を実施した。
hBv8-Fl： 5'-CTACTTCTGCTGCTGCCGCTGCTGTT-3' (配列番号： 7)
hBv8-Rl： 5' - TTGGAAAGTTGAGGAAGCAAGAGCATTT - 3' (配列番号： 8)
PCR反応液は 50X Advantage 2 Polymerase Mix (CL0NTECH社）を 1 z 1、 添付の 10x Advantage 2 PCR buffer (400 mM Tricine-KOH, 150 mM KOAc, 35 m
Mg(0Ac)2， 37.5 g/ml BSA, 0.05% Tween-20, 0.05% Nonidet— P40)を 5 1、 dNTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造）を 4 xl、 10 Mプライマー hBv8- Fl及び hBv8- Rlを 1 1、 铸型 cDNAを 5 l、 及び蒸留水を 33 1を混合して作製した。 反 応条件は 95aC'l分の初期変性後、 95°C'30秒- 68°C'l分のサイクル反応を 35回、 お よび 68°C'l分の最終伸長反応とした。
得られた DNA断片を、 T0P0 TA Cloning Kit (Invi trogen社）を用いて添付のマ ニュアルに記載された方法に従ってクロ一ニングした。 クロ一ニングされた DNA の塩基配列を ABI377DNA sequencerを用いて解読し、 配列番号： 9で表される配 列を得た。
ヒト精巣 Marathon- Ready cDNA (CL0NTECH社）を铸型として、 プライマ一 hBv8- R2 (配列番号： 10) を作成し、 以下に記した 5' RACE実験を実施した。
hBv8-R2: 5' -TGTCTCCCAGTTTGCCCATAGGTGTGC-3' (配列番号： 10 )
5'1^じ£の？0反応液は5(« Advantage - GC 2 Polymerase Mix (CL0NTECH社）を 1 、 添付の 5x Advantage- GC 2 PCR buffer (200 mM Tricine-KOH, 75 mM KOAc, 17.5 mM Mg(0Ac)2, 25% Dimethyl Sulfoxide, 18.75 g/ml BSA, 0.025 Tween- 20, 0.025% Nonidet-P40)を 10 dNTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造）を 4 \, 10 プライマ一 hBv8- Rlを 1 /iし 10 / Mプライマ一 API (プライマ一 API は CLONTECH社の Marathon - Ready cDNA Ki Uこ添付のもの） を 1 1、 铸型 CDNA
(CL0NTECH社、 ヒト精巣 Marathon- Ready cDNA) を 5 1、 及び蒸留水を 28 1を 混合して作製した。 反応条件は 94°C'l分の初期変性後、 94 '30秒-72°03分のサ ィクル反応を 10回、 94°C'30秒- 7(TC'3分のサイクル反応を 5回、 94で'30秒-68で' 3分のサイクル反応を 25回行った。
続いて、 該 PCR反応の反応液を錡型として nested PCRを実施した。 反応液は 50X Advantage- GC 2 Polymerase Mix (CL0NTECH社） を 1 1、 添付の 5x Advantage- GC 2 PCR buffer (200 mM Tricine- K0H, 75 mM KOAc, 17.5 mM g(0Ac)2, 25% Dimethyl Sulfoxide, 18.75 g/ml BSA, 0.025%Tween-20, 0.025% Nonidet- P40) を 10 u K dNTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造） を 4 10 /xMプライ マ一 hBv8- R2を 1 l、 10 Mプライマ一 AP2 (プライマ一 AP2は CL0NTECH社の Marathon-Ready cDNA Ki tに添付のもの） を 1 1、 铸型 DNA (該 PCR反応液 50倍希 釈液） を 5 L 及び蒸留水を 28 ； を混合して作製した。 反応条件は 94°C'l分 の初期変性後、 94°C'30秒- 68t>3分のサイクル反応を 35回行った。
得られた DNA断片を、 T0P0 TA Cloning Kit (Invi trogen社）を用いて添付のマ ニュアルに記載された方法に従ってクローニングした。 クロ一ニングされた DNA の塩基配列を ABI377DNA sequencerを用いて解読し、 5'端の配列 (配列番号： 1 1) を得た。
得られた配列番号： 9及び配列番号： 1 1の情報より、 プライマ一 hBv8- WF (配列番号： 12) 、 プライマー hBv8-WR (配列番号： 1 3) 、 プライマー hBv8-CF (配列番号： 14) 及びプライマー hBv8- SR (配列番号： 15) を作成 し、 以下に記した PCR反応を実施した。
hBv8-WF: 5' -CCATGAGGAGCCTGTGCTGCGCC-3' (配列番号： 1 2 ) hBv8-WR: 5' -CTATTCACATTTGGTTTCTACTC-3' (配列番号： 1 3 ) hBv8-CF: 5'-GTCGACCACCATGAGGAGCCTGTGCTGCG-3' (配列番号： 14) hBv8-SR: 5'- ACTAGTCGATTACTTTTGGGCTAAAC - 3' (配列番号： 1 5 )
PCR反応液は PfuTurbo DNA polymerase (St rat agene社）を 1 μ1、 添付の 1 Ox PCR bufferを 5 μ1、 2.5 mM dNTP mixtureを 4 u K 10 Mプライマ一 hBv8 - WF及び hBv8- WRを各 2.5 1 、 铸型 DNA (ヒト精巣 Marathon- Ready cDNA、 CLONTECH社） を铸型として 5 1、 及び蒸留水を 30 1を混合して作製した。 反応条件は 95 >l 分の初期変性後、 95°C1分- 65°C'l分- 72°C'l分のサイクル反応を 35回、 および 72°C ·5分の最終伸長反応とした。
続いて、 該 PCR反応の反応液を铸型として nested PCRを行った。 PCR反応液は PfuTurbo DNA polymerase (Stratagene社）を 1 、 添付の 10x PCR bufferを 5 II K 2.5 mM dNTP mixtureを 4 10 プライマ一 hBv8- CF及び hBv8 - SRを各 2.5 il l 、 铸型 DNAを l xl、 及び蒸留水を 34 ^lを混合して作製した。 反応条件 は 95°C · 1分の初期変性後、 95°C · 1分- 65Ό · 1分- 72 · 1分のサイクル反応を 35回、 および 72°C' 5分の最終伸長反応とした。
得られた DNA断片を T0P0 TA Cloning Kit (Invi trogen社）を用いて添付のマ二 ュアルに記載された方法に従ってクローニングした。 クロ一ニングされた DNAの 塩基配列を ABI377DNA sequencerを用いて解読し、 配列番号： 1 6で表される 346bpの塩基配列を有していることが明らかとなった。 配列番号： 1 6で表わさ れる塩基配列を有する DNA断片を有するプラスミドを pHBvと命名した。 プラスミ ド pHBvにより大腸菌 （Escherichia coli) をトランスフォームさせ、 ェシエリヒ ァ コリ （Escherichia coli) ΤΟΡΙΟ/ρΗΒνと命名した。
この DNA断片の塩基配列を解析した結果、 配列番号卜 6で表わされる DNA断片は、 配列番号： 1 7で表わされるヒト型 Bv 8前駆体ペプチド（108アミノ酸残基） を コードする DNA (配列番号： 1 8) を含んでいることが明らかとなった。
また、 配列番号： 18で表わされる塩基配列は典型的なシグナル配列を有して おり、 配列番号： 1 8で表わされる塩基配列を有する DNAは、 配列番号： 1 9で 表わされる'ヒト型 Bv 8成熟体ペプチド （81アミノ酸残基） をコードする 243塩 基対からなる DNA (配列番号： 20) を含んでいることが明らかとなった。
(3— 2) ヒト型 Bv 8ペプチド発現 CHO細胞の樹立
上記 （3— 1) に記載したプラスミド pHBvから、 インサート cDNAを Sal I及び Spe I制限酵素を用いて切り出し pAKKOl.11H発現ベクターに組み込んだ。 該プラ スミドを CHO/dhFr細胞 (American Type Culture Collection) に CellPhect Transfection kit (Amersham Pharmacia Biotech社) を用いて形質導入すること により取得した。 はじめに、 蒸留水 300 1に溶解したプラスミド DNA 10 gに 対して Buffer A (CellPhect Transfection Kitに添付) 120 1を添加後撹拌し た。 10分間静置後、 Buffer B (CellPhect Transfection Kitに添付) 240 1を 添加し、 激しく撹拌し該 DNAを含有する DNA—リン酸カルシウム複合体を形成させ た。 4 X 105個の CHO/ dhFr細胞を 60 匪シャーレに植え込み、 10%のゥシ胎児 血清 （BIO WHITTAKER社） と MEM用非必須アミノ酸を含む Ham's F- 12培地 （日水 製薬株式会社） 中で 37 ：、 5%炭酸ガス中で 1日間培養した後、 該複合体をシャ 一レの該細胞上に滴下させた。 これを、 37で、 5%炭酸ガス中にて 7時間培養した 後、 血清を含まない Ham's F-12培地で 2回細胞を洗浄し、 シャーレの該細胞上 に 15%グリセロール 3 mlを添加し 2分間処理した。 これを、 再度、 血清を含まな い Ham's F-12培地で 2回洗浄した後、 10%のゥシ胎児血清を含む Ham's F- 12培 地中で 37T、 5%炭酸ガス中で 15時間培養した。 該細胞をトリプシン処理により 分散させてシャーレから回収し、 1.25 X 104個ずつ 6穴プレートに植え込み、 透析 済み 10%ゥシ胎児血清 （JRH BIOSCIENCES 社） 、 1 mM MEM非必須アミノ酸溶液、 100 units/ml Penici 11 in, 100 /xg/ml Streptomycinを含む Dulbecco s
Modified Eagle Medium (DMEM) 培地 （日水製薬株式会社） 中にて 37°C、 5%炭酸 ガス中にて培養を開始した。 プラスミドの導入された形質転換 CH0細胞は該培地 中で生育するが、 非導入細胞は次第に死滅していくので、 2日毎に培地を交換し て死滅細胞を除去した。 培養開始 10-14日後に生育してきた形質転換 CH0細胞のコ ロニーを 29個選択した。 それぞれ選択された細胞を 24穴プレートに植え込み、 細 胞がコンフルェントになった後、 培地を 10%ゥシ胎児血清 （JRH BIOSCIENCES 社） 、 1 mM MEM非必須アミノ酸溶液、 100 units/ml Penicillin, 100 g/ml
Streptomycinを含む Dulbecco s modified Eagle medium 培地 (Phenol Red不含、 GIBC0社） に交換し 3日間培養した。 その後、 培養上清を回収し、 上記 （2— 3) の方法に従って、 ZAQ発現 CH0細胞で FLIPRによるカルシウムアツセィで ZAQ活性化 能を測定した。 これによりヒト型 Bv8を高発現する ZAQL- 2発現 CH0細胞クローン No.2 (以後、 ZAQL-2/CH0 No.4と略称する） を選別した。
(3- 3) ヒト型 Bv 8ぺプチド発現 C HO細胞無血清培養上清の調製
透析済み 10%ゥシ胎児血清 （JRH BIOSCIENCES社） 、 1 mM MEM非必須アミノ酸 溶液、 100 units/ml Penici 11 in, 100 g/ l Streptomycinを含む Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM) 培地 (日水製薬株式会社) で Single Tray (Nunc 社) 4枚コンフルェントまで培養した ZAQL- 2/CH0 No.4をトリプシン処理して分散 後、 遠心して回収した。 上記 Single Tray 1枚分の細胞を上記培地 1.5 Lに懸濁 後、 Ceil Factories 10 (Nunc社） に植え込み、 4基の Cell Factories 10につい て 37°Cで 5%炭酸ガス中にて 3日間培養した。 培養上清を除いた後、 前述の H/HBSS 1 で 1基の Cell Factories 10の細胞を洗浄した。 H/HBSSを除いた後、 1基の Cell Factories 10あたり 2 Lの無血清培地 （1 mM MEM非必須アミノ酸溶液、 100 uni ts/ml Penici 11 in, 100 g/ml Streptomycinを含む Dulbecco' s Modi ed Eagle Medium培地） を加えさらに 2日間培養した。 回収した培養上清を日立高速 遠心機で 1,000 rpmで 10分間遠心後、 ガーゼを用いてろ過し、 清澄な上清を得た, これに酢酸を最終濃度〗 Mになるように添加し、 以下の操作を行った。
(3-4) ヒト型 Bv 8ペプチド発現 CH〇細胞無血清培養上清のォクタドデシ ル逆相クロマトグラフィーによる粗分画
ォク夕ドデシル基を固定したシリカゲルを充填した PrepCIS (Waters社） をメ タノールで膨潤後、 ガラス製カラムに充填した （BioRad社製；内径 5cm， 高さ 10cm) 。 その後、 1 M酢酸で平衡化したカラムに、 上記 （3— 3) で調製した抽 出液を添着した。 次にこのカラムを 800 mlの 1 M酢酸で洗浄した。 次に、 この カラムに 1000 mlの 60% ァセトニトリル /0.1% トリフルォロ酢酸を流し、 目的 とする粗ペプチド成分を溶出した。 得られた溶出液を、 エバポレ一夕一を用いて 濃縮した後、 凍結乾燥機 （12EL ; VirTis社） にて凍結乾燥した。
(3-5) Wa k o s i 1 - I I 5C 18HG P r e p逆相高速液体クロマト グラフィ一による分離
Wakosil-II 5C18HG Prep逆相高速液体クロマトグラフィー用カラム （和光純薬、 20mm X 250mm) を、 40°Cにて、 流速 5 ml/minで A液 （0.1% トリフルォロ酢酸/ 蒸留水） 容量 91.7%/B液 （0.1% トリフルォロ酢酸/ 60% ァセトニトリル） 容 量 8.3%を流し平衡化した。 上記 （3— 4) で得られた凍結乾燥物についてクロ マトグラフィー操作を行った。 即ち、 凍結乾燥物を 1 M酢酸 36 mlを加えて溶解 し遠心後、 その内の 1/3を該カラムに添着した後、 流速 5 ml/minで、 1分間かけ て A液容量 66.7%/B液容量 33.3% まで上昇させ、 次いで 120分間かけて A液容 量16.7%/8液容量83.3%まで、 B液濃度を直線的グラジェントで上昇させた。 溶出液を 5 mlずつフラクション番号をつけて分取した。 この操作を 3回実施し、 上記 （3— 4) の凍結乾燥物を処理した。 分取フラクションより各 3 fi\ を 0.2% BSA 150 fi 1 と混合し、 凍結乾燥機 （12EL； VirTis社） で凍結乾燥した。 この乾燥物に、 アツセィバッファー 〔H/HBSS (二ッスィハンクス 2 (日水製薬株 式会社） 9.8g、 炭酸水素ナトリウム 0.35g、 HEPES 4.77 g 、 水酸化ナトリウム 溶液で PH7.4に合わせた後、 フィル夕一滅菌処理） に、 2.5 mM Probenecid およ び 0.1% CHAPS を添加したもの〕 150 1を加えて溶解し、 この溶液 50 1 を用 いて上記 （2— 3) の方法に準じ、 ZAQ受容体活性化作用を測定した。 その結果、 目的とする ZAQ受容体活性化作用を有する成分は、 主としてフラクション No.73 - 74に溶出されていることが判明した。
(3-6) TSKge 1 CM— 2 SWイオン交換高速液体クロマトグラフィー による分離
TSKge 1 CM- 2SWイオン交換高速液体クロマトグラフィー用カラム （東ソ一、 4.6 mmX 250 mm) を 25 にて、 流速 1 ml/minで A液 （4 Mギ酸アンモニゥム：蒸留 水： ァセトニトリル = 1 ： 299 ： 100) 容量 100%、 B液 （4 Mギ酸アンモニゥ ム：蒸留水：ァセトニトリル = 1 : 2 : 1) 容量 0%を流し平衡化した。 上記 (3 - 5) で得られたフラクション No.73-74を凍結乾燥したものを A液 4 mlに溶 解し、 TSKgel CM- 2SWイオン交換カラムに添着した後、 流速 2 ml/minで 120分間 かけて A液容量 25%ZB液容量 75%まで直線的グラジェン卜で上昇させ溶出液を 回収した。 溶出液を 2 mlずつフラクション番号をつけて分取し、 分取フラクショ ンより各 2 UL \ を 0.2% BSA 100 と混合し凍結乾燥機 （12EL ; VirTis社） で凍結乾燥した。 この乾燥物に上記アツセィバッファ一 100 ιι\ を加えて溶解 しこれをさらに同バッファ一で 100倍希釈し、 上記 （2— 3) の方法に準じ、 ZAQ 受容体活性化作用を測定した。 その結果、 目的とする ZAQ受容体活性化作用を有 する成分はフラクション No.83- 85に溶出されていることが判明した。
(3-7) TSKg e 1 ODS—8 OT s逆相高速液体クロマトグラフィーに よる精製 TSKgel ODS- 80Ts逆相高速液体クロマトグラフィー用カラム （東ソ一、 4.6 mm X 100 mm) を、 40°Cにて、 流速 1 ml/minで A液 （0.1% トリフルォロ酢酸/蒸留 水） 容量 91.7%/B液 （0.1% トリフルォロ酢酸/ 60% ァセトニトリル） 容量 8.3%を流し平衡化した。 上記 （3— 6) で得られたフラクション No.83-85の凍 結乾燥物についてクロマトグラフィー操作を行った。 即ち、 凍結乾燥物を 1 M酢 酸 2 mlを加えて溶解し該カラムに添着した後、 流速 1 ml/minで、 1分間かけて A液容量 75%/B液容量 25% まで上昇させ、 次いで 60分間かけて A液容量 25%/ B液容量 75%まで B液濃度を直線的グラジェントで上昇させ溶出液を回収した。 溶出液を 0.5 mlずつフラクション番号をつけて分取した。 フラクション No.121 - 130について各 1 lを採取し、 上記アツセィバッファーで 100倍希釈し、 上記 （2 一 3) の方法に準じ、 ZAQ受容体活性化作用を測定した。 その結果、 目的とする ZAQ受容体活性化作用を有する成分はフラクション No.123- 125に溶出されている ことが判明した。
(3-8) TSKg e 1 Sup e r -Ph e ny 1逆相高速液体クロマトダラ フィ一による精製
TSKgel Super-Phenyl逆相高速液体クロマトグラフィー用カラム （東ソ一、 4.6 mm X 100腿） を、 40 にて、 流速 1 ml/minで A液 （0.1% トリフルォロ酢酸/ 蒸留水） 容量 91.7%/B液 （0.1% トリフルォロ酢酸/ 60% ァセトニトリル） 容 量 8.3%を流し平衡化した。 上記 （3— 7) で得られたフラクション No.123- 125 についてクロマトグラフィー操作を行った。 即ち、 フラクション溶液を直接口一 ドし、 該カラムに添着した後、 流速 1 ml/minで、 1分間かけて A液容量 75%/B 液容量 25% まで上昇させ、 次いで 60分間かけて A液容量 25%ZB液容量 75%ま で B液濃度を直線的グラジェントで上昇させ溶出液を回収した。 溶出液を 0.5 ml ずつフラクション番号をつけて分取した。 フラクション No.9卜 100について各 1 1を採取し、 上記アツセィバッファーで 100倍希釈し、 上記 （2— 3) の方法に準 じ、 ZAQ受容体活性化作用を測定した。 その結果、 目的とする ZAQ受容体活性化作 用を有する成分はフラクション No.97- 98に溶出されていることが判明した。
(3— 9) TSKg e l Sup e r-Ph e ny l逆相高速液体クロマトダラ フィ一による再精製 301057
153
TSKgel Super- Phenyl逆相高速液体クロマトグラブィー用カラム （東ソ一、 4.6 mm X 100 mm) を、 40°Cにて、 流速 1 ml/minで A液 （0.1 % トリフルォロ酢酸/ 蒸留水） 容量 91.7%/B液 （0.1% トリフルォロ酢酸/ 60% ァセトニトリル） 容 量 8.3%を流し平衡化した。 上記 （3— 8) で得られたフラクション No.97- 98に ついてクロマトグラフィー操作を行った。 即ち、 フラクション溶液を直接ロード し該カラムに添着した後、 流速 1 ml/minで、 1分間かけて A液容量 75%/B液容 量 25% まで上昇させ、 次いで 60分間かけて A液容量 25%ZB液容量 75%まで B 液濃度を直線的グラジェントで上昇させ溶出液を回収した。 その結果、 目的とす る ZAQ受容体活性化作用を有する成分は単一なピークとして溶出された。
(3— 10) 精製されたヒト型 Bv 8ペプチドの構造解析
上記 （3— 9) で得られた ZAQ活性化主成分について、 以下の方法で構造決定 を実施した。 精製したヒト型 Bv 8ペプチドを凍結乾燥機 （12EL； VirTis社） に て凍結乾燥した。 得られたペプチド凍結乾燥物を、 DM SO (ジメチルスルフォ キシド） に溶解した。 この溶液の一部をプロテインシークェンサ一（パーキンェ ルマ一社、 PE Biosystems Procise 491cLC)を用いた N末端からのアミノ酸配列 解析に供した。 その結果、 予想されるヒト型 Bv 8成熟体ペプチド、 配列番号： 1 9で表されるアミノ酸配列と一致する N端アミノ酸配列を得た。 また、 Finnigan LCQ LC/MS装置を用いて、 エレクトロンスプレ Γオン化法により質量 分析を行い、 分子量が 8664.34であると算定した。 本測定値はヒト型 Bv 8成熟 体ペプチド （配列番号： 19) の理論値 8792.54に比べて 128.2小さな値となって おり、 成熟体ペプチドからさらに C末端の Lys残基が脱落したペプチド （配列番 号： 22) が取得できたことが確認された。 参考例 4 ヒト型 Bv 8ペプチドの反応性の測定
参考例 3で得られた精製ヒト型 B V 8ペプチドの、 ZAQ及び I 5 E受容体活 性化作用を、 上記 （2— 3) に記載した方法に準じ、 測定した。
その結果、 Z AQレセプ夕一発現 CH〇細胞及び I 5Eレセプ夕一発現 CHO 細胞において、 ヒト型 B V 8ぺプチドは濃度依存的に細胞内カルシウム濃度の上 昇を惹起した。 また、 へビ毒 M I T 1は、 ヒト型 Bv 8ペプチドに比べて 10倍 程度低い濃度より I 5 E受容体活性化作用を現した。 結果を 〔図 1〕 および 〔図 2〕 に示す。 参考例 5 ラット型 Bv 8ペプチド cDNAのクローニング
ラット精巣 Marathon- Ready cDNA (CL0NTECH社）を铸型として、 degenerateプラ イマ一 BF2 (配列番号： 23) とプライマー BR1 (配列番号： 24) を作成し、 以下に記した PCR反応を実施した。
BF2: 5' -GCTTGYGACAAGGACTCYCA-3' (配列番号： 23)
BR1: 5' -GTTYCTACTYCAGAGYGAT-3' (配列番号： 24)
PCR反応液は 50X Advantage 2 Polymerase Mix (CL0NTECH社）を 0· 4 K 添付 の 10x Advantage 2 PCR buffer (400 mM Tricine-KOH, 150 iM KOAc, 35 mM Mg(0Ac)2) 37.5/ g/ml BSA, 0.05%Tween-20, 0.05% Nonidet-P40)を 2 1、 dNTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造）を卜 6 1、 10 Mプライマー BF2及び BR1を 0.4 1、 鎵型 cDNAを 2 1、 及び蒸留水を 13.2 1を混合して作製した。 反応条件は 95 ·1分の初期変性後、 95°C'30秒- 55°C'l分- 68°C'l分のサイクル反応を 40回、 および 68t> 5分の最終伸長反応とした。
得られた DNA断片を T0P0 TA Cloning Kit (Invi trogen社）を用いて添付のマ二 ュアルに記載された方法に従ってクローニングした。 クローニングされた DNAの 塩基配列を ABI377DNA sequencerを用いて解読し、 配列番号： 25で表される部 分配列を得た。
この配列情報よりプライマー RB5-1 (配列番号： 26) とプライマー RB5-3 (配列番号： 27) を作成し、 以下に記した 5' RACE実験を実施した。
RB5-1： 5'-GTGCATCCTCCGCCCCCAAAATGGAA-3' (配列番号： 26 )
RB5-3: 5'-GACAGCGCAGCACATTCCTCCTCCACAC-3' (配列番号： 27)
5'1^じ5の1^1反応液は50 Advantage 2 Polymerase Mix (CL0NTECH社）を 1 1、 添付の 10x Advantage 2 PCR buffer (400 mM Tricine-KOH, 150 mM KOAc, 35 mM Mg(0Ac)2, 37.5 /ig/ml BSA, 0.05 Tween-20, 0.05% Nonidet- P40)を 5 1、 dNTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造）を 4 n U 10 //Mプライマ一 RB5- 1を 1 し 10 iMプライマ一 API (プライマー APIは CL0NTECH社の Marathon- Ready cDNA Kitに 添付のもの） を 1 し 铸型 cDNA (CLONTECH社、 ラット精巣 Marathon- Ready cDNA) を 5 し 及び蒸留水を 33 ilを混合して作製した。 反応条件は 94°C'l分 の初期変性後、 94°C'30秒- 72°C'3分のサイクル反応を 5回、 94°C ·30秒- 70°C · 3分 のサイクル反応を 5回、 94°C ·30秒- 68°C · 3分のサイクル反応を 25回行つた。
続いて、 該 PCR反応の反応液を鎵型として nested PCRを実施した。 反応液は 50X Advantage 2 Polymerase Mix (CLONTECH社）を 1 1、 添付の 10x Advantage 2 PCR buffer (400 mM Tricine-KOH, 150 mM KOAc, 35 mM Mg(0Ac)2, 37.5 g/ml BSA, 0.05%Tween-20, 0.05% Nonidet- P40)を 5 1、 dNTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造）を 4 1、 10 μΜプライマー RB5-3を 1 1、 10 Μプライマー ΑΡ2 (プライ マー ΑΡ2は CLONTECH社の Marathon-Ready cDNA Kitに添付のもの） を 1 il、 铸型 cDNA (該 PCR反応液 50倍希釈液） を 5 1、 及び蒸留水を 33 1を混合して作製し た。 反応条件は 94 >l分の初期変性後、 94で · 30秒- 68で · 3分のサイクル反応を 35 回行った。
得られた DNA断片を TOPO TA Cloning Kit (Invi trogen社）を用いて添付のマ二 ュアルに記載された方法に従ってクローニングした。 クローニングされた DNAの 塩基配列を ABI377DNA sequencerを用いて解読し、 5'端の配列 (配列番号： 2 8) を得た。
配列番号： 2 5の情報より、 プライマー RB3- 1 (配列番号： 2 9) とプライマ 一 RB3- 2 (配列番号： 30) を作成し、 以下に記した 3' RACE実験を実施した。
RB3-1： 5 ' -GAGACAGCTGCCACCCCCTGACTCGGAA-3 ' (配列番号： 2 9 )
RB3-2: 5 ' -GGCGGAGGATGCACCACACTTGTCCCTG-3 ' (配列番号： 3 0)
3' RACEの PCR反応液は 50X Advantage 2 Polymerase Mix (CLONTECH社）を 1 1、 添付の 10x Advantage 2 PCR buffer (400 mM Tricine-KOH, 150 mM KOAc, 35 mM Mg(0Ac)2, 37.5 jtzg/ml BSA, 0.05%Tween-20, 0.05% Nonidet-P40)を 5 n K dNTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造）を 4 1、 10 WMプライマー RB3-1を 1 ^ 1、 10 iMプライマー API (プライマー APIは CLONTECH社の Marathon- Ready cDNA Kit に添付のもの） を 1 し 铸型 cDNA (CLONTECH社、 ラット精巣 Marathon-Ready cDNA) を 5 iii, 及び蒸留水を 33 1を混合して作製した。 反応条件は 94 >l分 の初期変性後、 94°C'30秒- 72ΐ>3分のサイクル反応を 5回、 94°C ·30秒- 70°C ·3分 のサイクル反応を 5回、 94で'30秒-68で'3分のサィクル反応を 25回行った。
続いて、 該 PCR反応の反応液を銬型として nested PCRを実施した。 反応液は 50X Advantage 2. Polymerase Mix (CL0NTECH社）を 1 1、 添付の 1 Ox Advantage 2 PCR buffer (400 mM Tricine-顧， 150 mM KOAc, 35 mM Mg(0Ac)2> 37.5 xg/ml BSA, 0.05%Tween-20, 0.05% Nonidet- P40)を 5 ^1、 dNTP mixture (2.5 mM .each, 宝酒造）を 4 u K 10 Mプライマー RB3- 2を 1 〃1、 10 〃Mプライマー AP2 (プラ イマ一 AP2は CL0NTECH社の Marathon- Ready cDNA Ki tに添付のもの） を 1 1、 铸 型 cMA (該 PCR反応液 50倍希釈液） を 5 l、 及び蒸留水を 33 /1を混合して作製 した。 反応条件は 94 >l分の初期変性後、 94t>30秒- 68°C'3分のサイクル反応を 35回行った。
得られた DNA断片を T0P0 TA Cloning Kit (Invi trogen社）を用いて添付のマ二 ュアルに記載された方法に従ってクローニングした。 クローニングされた DNAの 塩基配列を ABI377DNA sequencerを用いて解読し、 3'端の配列 (配列番号： 3 1) を得た。
ラット脳 Marathon- Ready cDNA (CL0NTECH社）を铸型として、 上記 5' RACE及び 3'RACEの情報より、 プライマー RBv8- WF1 (配列番号： 32)、 プライマー RBv8 - WF2 (配列番号： 33) 、 プライマー RBv8- WR1 (配列番号： 34) およびプラ イマ一 RBv8-WR2 (配列番号： 35) を作成し、 以下に記した KR反応を実施した c RBv8-WFl: 5'-TAACCGCCACCGCCTCCT-3' (配列番号： 32 )
RBv8-WF2: 5' -GGGACGCCATGGAGGAC-3' (配列番号： 33)
RBv8-WRl： 5'-CGAGACTTGACAGACATTGTTCAGTG-3' (配列番号： 34)
RBv8-WR2: 5' - TTTCCAGCTCCTGCTTCAGA- 3' (配列番号： 35 )
PCR反応液は PfuTurbo DNA polymerase (Stratagene社）を 0.6 1、 添付の 10x PCR bufferを 3 K 2.5 mM dNTP mixtureを 2.4 1、 10 Mプライマ一 RBv8 - WFl及び RBv8-WRlを各 1.5 l 、 銬型 DNAを 3^1、 及び蒸留水を 18 1を混合して 作製した。 反応条件は 95°C'l分の初期変性後、 95 >30秒- 55 >30秒- 72 >l分の サイクル反応を 35回、 および 72°C · 5分の最終伸長反応とした。
続いて、 該 PCR反応の反応液を蒸留水で 50倍に希釈したものをを铸型として nested PCRを行った。 PCR反応液は PfuTurbo DNA polymerase (Stratagene社）を 0.6 l, 添付の ΙΟχ PCR bufferを 3 \, 2.5 mM dNTP mixtureを 2.4 \ 10 Mプライマ一 RBv8-WF2及び RBv8- WR2を各 1.5 ill 、 铸型 DNAを 3 K 及び蒸留 水を 18 1を混合して作製した。 反応条件は 95で ·1分の初期変性後、 95°C'30秒 - 55°C ·30秒- 72°C · 1分のサイクル反応を 35回、 および 72°C · 5分の最終伸長反応とし た。
得られた DNA断片を Zero Blunt T0P0 PCR Cloning Kit (Invi trogen社）を用い て添付のマニュアルに記載された方法に従ってクローニングした。 クロ一ニング された DNAの塩基配列を ABI377DNA sequencerを用いて解読し、 配列番号： 36で 表される 356bpの塩基配列を有していることが明らかとなった。 配列番号： 36 で表わされる塩基配列を有する DNA断片を有するプラスミドを pRBvと命名した。 プラスミド pRBvにより大腸菌 （Escherichia coli) をトランスフォームさせ、 ェ シエリヒア コリ （Escherichia coli) TOP10/ pRBvと命名した。
この DNA断片の塩基配列を解析した結果、 配列番号： 36で表わされる DNA断片 は、 配列番号： 37で表わされるラット型 Bv 8前駆体ペプチド（107アミノ酸残 基） をコードする ΡΝΑ (配列番号： 38) を含んでいることが明らかとなった。 また、 配列番号： 38で表わされる塩基配列は典型的なシグナル配列を有して おり、 配列番号： 38で表わされる塩基配列を有する DNAは、 配列番号： 39で 表わされるラット型 Βν 8成熟体ペプチド （81アミノ酸残基） をコードする 243 塩基対からなる DNA (配列番号： 40) を含んでいることが明らかとなった。 参考例 6 ラット脳 c DNA由来新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 （r ZA Q 1) をコ一 する c DNAのクローニングと塩基配列の決定
ラット全脳 cDNAライブラリー （CL0NTECH社） を铸型とし、 2種類のプライマー (配列番号： 41および配列番号： 42) を用いて PCR反応を行った。 該反応 における反応液の組成は上記 cDNAを 10分の 1量铸型として使用し、 Advantage-2 cDNApolymerase Mix (CL0NTECH社） 1/50量、 プライマ一各 0.2^M、 dNTPs 200 M、 および酵素に添付のバッファーを加え、 25 1の液量とした。 PCR反応は、 (i) 94 '2分の後、 （ii) 94 ·20秒、 72 · 1分 30秒のサイクルを 3回、 (iii) 94t>20秒、 68^ · 1分 30秒のサイクルを 3回、 （iv) 94 >20秒、 62 > 20秒、 68°C 1分のサイクルを 36回繰り返し、 最後に 68で · 7分の伸長反応を行つ た。 該 PC R反応後の反応産物を T0P0— TAクローニングキット （Invitrogen社） の処方に従いプラスミドベクター PCR2.1 - T0P0 (Invitrogen社） へサブクロー二 ングした。 これを大腸菌 DH5aに導入し、 cDNAを持つクローンを， アンピシリン を含む LB寒天培地中で選択した。 個々のクローンの配列を解析した結果、 新規 G 蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質をコードする cDNA (配列番号： 43) を得た。 該 cDNAの塩基配列から導き出されるアミノ酸配列 （配列番号： 44) には、 配列番 号： 1で表されるアミノ酸配列と 83.7%の相同性がみられた。 このアミノ酸配列 を含有する新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質を rZAQlと命名した。 また配列 番号： 43で表わされる塩基配列を有する DNAを含有する形質転換体 （大腸菌） については、 ェシエリヒア コリ （Escherichia col i)DH5ひ / pCR2.1 - rZAQlと 命名した。 参考例 7 ラット脳 cDNA由来 新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 （r Z AQ2) をコードする c DNAのクローニングと塩基配列の決定
rZAQ2をコードするクローンは、 genetrapper法で取得した。 すなわち、 プロ一 ブ （配列番号： 45および配列番号： 46) をピオチン化したのち、 一本鎖にし たラット全脳 cDNAライブラリ一 （GIBC0— BRL社） とハイブリダィゼ一シヨンし、 得られた一本鎖遺伝子をプライマ一 （配列番号： 47および配列番号： 48) を 用いて二本鎖に修復した。 この遺伝子を大腸菌 DH10Bにエレクト口ポーレーショ ンし、 アンピシリン耐性を指標として形質転換体を得た。 さらに、 プローブ （配 列番号： 45) とプライマー （配列番号： 49) を用いたコロニー PCRで、 目的 とする塩基配列をコードするクローンを選択した。 このクローンの塩基配列から 予測される ORF (open reading frame) の塩基配列 （配列番号： 50) より導き 出されるアミノ酸配列 （配列番号： 51) は、 (¾1と80.6%の相同性がみられ た。 このアミノ酸配列を有する新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質を rZAQ2と 命名した。 また、 この genetrapper法で取得した形質転換体 （大腸菌） を、 ェシ エリヒア コリ （Escherichia coli) DH10B /pCMV-rZAQ2と命名した。 参考例 8 大腸菌でのヒト型 B V 8ペプチド （配列番号： 19) の製造
(1) 大腸菌でのヒト型 Bv 8ペプチド発現プラスミドの構築
(a) ヒト型 Bv 8の構造遺伝子の調製
6種の DNA断片 # 1〜# 6 (配列番号： 65〜配列番号： 70) を用いて、 ヒト型 Bv 8の構造遺伝子を調製した。
(b)DNAオリゴマーのリン酸化
5 ' 側になるべき上記 # 1および # 6を除いた 4種の DN Aオリゴマー (# 2 〜#5) 各々を、 25 / 1のリン酸化反応液 ！: DNAオリゴマー 10 g， 50 mM Tris-HCl, pH 7.6, 1 OmM MgCl2, ImMスペルミジン， 10m M ジチオスレィトール （以後 DTTと略記） ， 0. lmgZm 1ゥシ血清アルブ ミン （以後 BS Aと略記） ， ImM ATP， 10ユニット T 4ポリヌクレオチ ドキナ一ゼ （宝酒造） 〕 中で 37^： · 1時間反応させ、 各オリゴマーの 5'末端 をリン酸化した。 フエノール処理を行った後、 2倍量のエタノールを加え、 一 7 0°Cに冷却した後、 遠心で DN Aを沈殿させた。
(c)DN Aフラグメントの連結
上記 （b) で得られた DNAフラグメントと上記 #1および # 6を合わせ、 12 0 a 1とした。 この混合液を 90 で 10分間保持した後、 室温まで徐冷しァニ 一リングを行った後、 TaKaRa DNA Ligation Kit ver.2 (宝酒造） を用いてライ ゲーシヨン反応を行った。 ァニーりング液 30 1にキットに付属の I I液 30 1を加え、 よく混合した後、 キットに付属の I液 60 1を加え、 37°C - 1 時間反応させ、 ライゲーシヨンを行った。 その後、 フエノール処理を行ない、 水 層を回収して 2倍量のエタノールを加え、 一 70°Cに冷却した後、 遠心で DNA を沈殿させた。 この様にして得られた DN Aフラグメントを T 4ポリヌクレオチ ドキナーゼ （宝酒造） によるリン酸化を行った後、 以下の工程（d)に供した。
(d) ヒト型 B V 8発現ベクターの構築
発現用ベクターとしては PTC I I (特開 2000- 178297号公報に記載） を Nd e Iおよび B amH (宝酒造） で 37 · 2時間消化した後、 1 %ァガロース ゲル電気泳動により 4.3kbの DNA断片を QIAquick Gel Extraction Kit (キア ゲン社） を用いて抽出し、 25 1の TE緩衝液に溶解した。 この pTC I Iの Nd e I, B amH I断片と上記により調製したヒト型 Bv 8の構造遺伝子 （配 列番号： 71) を TaKaRa DNA ligation kit ver.2 (宝酒造） を用いてライゲー ション反応を行った。 この反応液を 10 1用いて大腸菌 JM 109コンビテン トセル （東洋紡） を形質転換し、 10 gZi lのテトラサイクリンを含む LB 寒天培地上に播き、 37 で 1晚培養し、 生じたテトラサイクリン耐性コロニー 選んだ。 この形質転換体を LB培地で一晩培養し、 QIAprep8 Miniprep Kit (キ ァゲン社） を用いてプラスミド pTCh 2 ZAQを調製した。 このヒト型 Bv 8 DNAの塩基配列をアプライドバイオシステムズ社モデル 377DNAシーゲン サ一を用いて確認した。 プラスミド pTC h 2 Z AQを大腸菌 （Escherichia coli) MM294 (DE 3) に形質転換し、 ヒト型 B v 8発現株 Escherichia coli MM294(DE3)/ pTCh2ZAQを得た。
(2) ヒ卜型 Bv 8ペプチドの製造
上記の Escherichia coli MM294(DE3)/ pTCh2ZAQを 5. OmgZLのテトラサ イクリンを含む LB培地 ' 1 L (1%ペプトン、 0. 5%酵母エキス、 0. 5% 塩化ナトリウム） を用いて 2 L容フラスコ中で 37 C、 8時間振とう培養した。 得られた培養液を 19 Lの主発酵培地 （1-68%リン酸 1水素ナトリウム、 0. 3%リン酸 2水素カリウム、 0. 1%塩化アンモニゥム、 0. 05%塩化ナトリ ゥム、 0. 05%硫酸マグネシウム、 0. 02%消泡剤、 0. 00025 %硫酸 第 1鉄、 0. 0005 %塩酸チアミン、 1. 5%ブドウ糖、 1. 5%ハイケース ァミノ） を仕込んだ 50L容発酵槽へ移植して、 30 で通気攪拌を開始した。 培養液の濁度が 500クレツト単位になったところで、 イソプロピル一 )3— D— チォガラクトビラノシドの最終濃度が 12mgZLになるように添加し、 さらに 4時間培養を行った。 培養終了後、 培養液を遠心分離し、 約 500 gの湿菌体を 取得し、 一 80°Cで保存した。
(3) ヒト型 Bv 8ペプチドの活性化
上記 （2) で得られた菌体 400 gに、 20 OmMトリス ZHC 1、 7Mグァ 二ジン塩酸塩 （pH8. 0) 800m 1を加えて菌体を溶解した後、 遠心分離
(10000 r pm 1時間） を行った。 上澄液に 0. 4Mアルギニン、 50m Mトリス ZHC 1、 0. 2mM GSSG (酸化型グル夕チオン） 、 1 mM G SH (還元型ダル夕チオン） （PH8. 0) 20リットルを加えて、 4°Cでー晚 活性化を行った。
(4) ヒト型 B V 8ペプチドの精製
上記 （3) で活性化の終了した再生液を pH 6. 0に調整し、 50mMリン酸 緩衝液 （ρΗ6· 0) で平衡化した S Ρ—セファロ一スカラム （11. 3 cmx 15 cm) に吸着させた後、 60 OmM Na C 1 /5 OmMリン酸緩衝液 （p H6. 0) で溶出し、 ヒト型 B V 8を含むフラクションをプールした。 この画分 を 5 OmM リン酸緩衝液 （pH 6. 0 ) で平衡化した S P— 5 P W ( 21.5 mm l 5 OmmL) に通液し、 吸着、 洗浄した後、 0— 100%B (B=50 mM リン酸緩衝液 + 1M NaCl、 pH6. 05) の段階勾配 （60分） で溶出 を行いヒト型 Bv8画分 （溶出時間約 40分） を得た。 この画分を、 さらに 0. 1 %トリフルォロ酢酸で平衡化した C 4 P— 50 (21.5 mm I Dx30 Omm L、 昭和電工） に通液し、 吸着、 洗浄した後、 25— 50%B (B： 80%ァセ トニトリル 0.1%トリフルォロ酢酸） の段階勾配 （60分） で溶出を行い、 ヒト型 Bv 8画分 （溶出時間約 30分） をプールした後、 凍結乾燥を行い、 ヒト 型 Βν 8凍結乾燥粉末約 25mgを得た。
(5) ヒト型 B V 8ペプチドの特徴決定
(a) SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた分析
上記 （4) で得られたヒト型 Bv 8を 10 OmM DTTを添加した Sa即 le buffer [Laemmli, Nature, 227, 680 (1979)] に懸濁し、 95°Cで 1分間加熱し た後、 マルチゲル 15Z25 (第一化学薬品） で電気泳動を行った。 泳動後のゲ ルをクーマシー ·ブリリアント 'ブルー （Coomassie brilliant blue) で染色し. た結果、 9 kD aの位置に単一の蛋白バンドが認められた。 このことから、 上記 (4) で得られた大腸菌由来の組換え型ヒト型 Bv 8の標品は極めて高純度であ ることが分かった。
(b) アミノ酸組成分析
アミノ酸組成をアミノ酸分析計 （日立 L一 850 OA Amino Acid
Analyzer) を用いて決定した。 その結果、 ヒト型 Bv 8 (配列番号： 19で表さ れるァミノ酸配列からなるペプチド） の D N Aの塩基配列から推定されるァミノ 酸組成と一致した （表 2 )
〔表 2〕
1モル当たりの ヒ卜型 B V 8の塩基配列 アミノ酸 残 基—数 ― から予測される値
A S X 4 0 4
T h r ° 4 6 5
S e r，） 4 3 5
G I x 2 3 2
P r o 5 2 5
G I y 8 8
A I a 5 0 5
C y s 2 ) N . D . 1 0
V a I 3 . 8 4
M e t 2 8 3
I I e 4 2 5
し e u 6 6
T y r 0 0
P h e 3 4
H i s 2 9 3
し y s 4 9 5
A r g 5 8 6
T r p _ 0 9 1
酸加水分解 （ 6 N H C 1 - 4 %チォグリコール酸、 1 0で、 2 4 および 4 8時間加水分解の平均値）
1) 0時間に外挿した値
2) 未検出
(c) N末端アミノ酸配列分析 N末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー （PEアプライドバイオシ ステムズ モデル 49 2) を用いて決定した。 その結果、 得られたヒト型 B v 8 の D Ν Αの塩基配列から推定されたヒト型 B v 8の N末端アミノ酸配列と一致し た （表 3) 。
〔表 3〕 检¾.μ屮0. ciれ リ の +
し/ >_ H Κ·开 p¾ v Q 其 i?石 ll
其 M n ρ "τ 1μ Π_-ρ - ¾«.✓ ¾ Ε¾*ι ) 'つ j '刖 c： tス
1U ^ ίπυ 1ノ
1
I Λ I 1 d f 1 ¾
画 Π3、 Λ I
ノ
. V L 1 、33ノ V CL 1
I I 11 c (、0Q^0ノ
A T 1 h Π r Γ 、34*、ノ T h r
C
丄0 O J I y 、ooノ \ y
o Λ 1 ¾ M 1 a
7 IN . Π U . し y
Q O M μ 、4 /ノ Λ c
Q し y s O J し y s
20 1 0 A s p (50) A s p
1 1 S e r (36) S e r
1 2 G 1 n (52) G 1 n
1 3 N. D. C y s
1 G 1 y (44) G 1 y
25 1 5 G 1 y (55) G 1 y
1 6 G 1 y (56) G 1 y
1 7 M e t (50) M e t
1 8 N. D. C y s
1 9 N. D. C y s
30 2 0 A 1 a (33) A 1 a 1) PTH (フェニールチオヒダン卜イン） 誘導体として検出した。
ヒト型 B V 8 ¾ 150 pmo 1用いて分析 ¾行った。
N. D. は未検出 示す。
(d) C末端アミノ酸分析
C末端アミノ酸をアミノ酸分析計 （日立 L— 850 OA Amino Acid
Analyzer) を用いて決定した。 得られたヒ卜型 B v 8は D N Aの塩基配列から推 定された C末端アミノ酸と一致した （表 4) 。
〔表 4〕
C末端アミノ酸 回収率 （％)
L y s 18. 9
気相ヒドラジン分解法 (100°C, 3. 5時間)
(6) ヒト型 Bv 8ペプチドの活性測定 （FL I PRを用いた細胞内 C aイオン 濃度上昇活性の測定）
上記 （4) で得られた純化された大腸菌由来の組換え型ヒト型 Bv 8標品を参 考例 2 (2-3) の方法を用いて、 活性測定 （FL I PRを用いた細胞内 C aィ オン濃度上昇活性の測定） を行った。 その結果、 CHO細胞由来の組換え型標品
(ヒト型 Bv 8の精製品：参考例 3) と同等の活性を有していた。 参考例 9 ヒト型 ZAQリガンドペプチドの cDN Aのクローニング
(I) ZAQを活性化するペプチドの単離
(1) 牛乳抽出液の調製
市販の低温殺菌牛乳を用いて、 以下の操作を行い抽出液を調製した。 牛乳 2 literを高速遠心機 （CR26H、 R10A型ローター： 日立株式会社） を用いて、 10,000 rpm, 15分間、 4 で遠心し、 得られた上清をガーゼでろ過し、 脂質片を取り 除いた。 上清に最終濃度 1 Mになるように酢酸を加え、 4でにて 30分間攪拌し, 次いで高速遠心機 （CR26H、 R10A型ローター： 日立株式会社） を用いて 10， 000 rpm、 15分間遠心し上清をガーゼでろ過し不溶物を除去した。 上清に撹拌しな がら 2倍容のアセトンを加え 4 °Cにて 3時間攪拌した。 次いで高速遠心機
(CR26H, Rl OA型口一ター： 日立株式会社） を用いて 10, 000 rpm、 15分間遠心 後、 得られた上清をガーゼでろ過し不溶物を除去した。 得られた上清をロータリ —エバポレーターにかけ、 アセトンを除去し、 最終的に 135 Om 1まで濃縮し た。 得られた濃縮液を、 675mlごとに 338m lのジェチルェ一テルと混合 し、 分液ロート中にて激しく混和し、 2相分離後、 水相を得た。 得られた水相に ついて同じ操作をさらに 1回繰り返し、 清澄な水相を得た。 得られた水相を、 口 一夕リーエバポレーターを用いて 80 Om lまで濃縮し、 最終的な抽出液を得た < (2) 牛乳抽出液の C 18逆相クロマトグラフィーによる粗分画
ォク夕デシル基を固定したシリカゲルを充填したカラム Sep-Pak C18 (Waters 社） 10 gをメタノールで膨潤後、 1 M酢酸で平衡化した。 このカラムに、 上記 (1) で調製した抽出液 （牛乳 2 liter分） を添着した。 続いて、 このカラムに， 10 Om 1の 1 M酢酸を流しゲルを洗浄した。 次に、 このカラムに 20 Om 1の 60 %ァセトニトリル /0. 1 %トリフルォロ酢酸を流し、 目的とする粗べプチ ド成分を溶出した。 得られた溶出液を、 エバポレーターを用いて濃縮した後、 凍 結乾燥機 （12EL ; VirTis社） にて凍結乾燥した。
(3) 牛乳抽出液のスルホプロピルイオン交換クロマトグラフィーによる粗分画 ポリプロピレン製のカラムに 100 mM塩酸中で膨潤させた SP Sephadex C-25 (Amersham Pharmacia Biotech 社） を、 容量が 2 m 1になるよう充填し、 蒸留 水及び 2 M ギ酸アンモニゥム（pH 4.0)で洗浄した後、 I液 （2 Mギ酸アンモニゥ ム： ァセトニトリル：水 =1:25:74) で平衡化した。 上記 （2) で得られた凍結 乾燥物を I液 20m 1に溶解し、 SP Sephadex C- 25 2 mlにロードした。 I液 1 0m 1で洗诤後、 I I液 （2 M ギ酸アンモニゥム：ァセトニトリル：水 =
1:2.5:6.5) I I I液 （2 M ギ酸アンモニゥム ： ァセトニトリル：水 =1:1:2) 、 I V液 （2 M ギ酸アンモニゥム：ァセトニトリル：水 =1:0.5:0.5) 各 1 Om 1 で順次溶出した。 得られた I液から I V液を、 それぞれ凍結乾燥機 （12EL ;
VirTis社） にて凍結乾燥した。
(4) 牛乳抽出液の TSKg e 1 ODS 80 T s逆相高速液体クロマトグラフ 1057
166 ィ一による分画
TSKgel ODS- 80Ts逆相高速液体クロマトグラフィー用カラム （東ソ一株式会社、 4.6 mm X 25 cm) を、 40 °Cにて、 流速 1 m 1 Zm i nで A液 （0.1% トリフル ォロ酢酸/蒸留水） 容量 91.7%/B液 （0.1%トリフルォロ酢酸/ 60%ァセトニトリ ル） 容量 8.3%を流し、 平衡化した。 上記 （3〉 で得られた I液から I V液の凍 結乾燥物を、 それぞれ 1 M酢酸 4m 1に溶解しクロマトグラフィー操作に処した。 即ち、 凍結乾燥物の溶液 4m Iを当該カラムに添着した後、 流速 lml /m i n で、 1分間かけて A液容量 67 %ZB液容量 33%まで上昇させ、 次いで 40分 間かけて A液容量 6 液容量 33%から A液容量 0%ZB液容量 100% まで、 B液濃度を直線的グラジェントで上昇させた。
溶出液を、 lm 1ずつフラクション番号をつけて分取し、 各フラクション 2 I 1を 150 l の 0.2% Bovine Serum Albumin (BSA) /蒸留水と混合し凍結乾燥し た。 この乾燥物を後述の （5) に記した細胞内 C a 2+イオン濃度上昇活性測定用 のアツセィ用サンプルとした。
(5) FL I PRを用いた細胞内 C a 2+イオン濃度上昇活性の測定
ZAQ安定発現細胞株は以下のようにして調製した。 すなわち、 実施例 1で得 た DH5a pCR2.1— ZAQCの 1クロ一ンを、 アンピシリンを含む LB培地で振とう 培養し、 プラスミド pCR2.1— ZAQCを得た。 これを制限酵素 S a 1 Iおよび S p e Iで処理し、 ZAQCをコードするインサート部分を切り出した。 同様に制限酵 素 S a 1 Iおよび S p e Iで処理した pAKKO— 1.11H (Biochemica et Biophysica Acta 1219 (1994) 251-259) と、 当該インサート部分を Ligat ion Express Kit (CLONTECH Laboratories, Inc. (CA, USA) ) を用いて連結し、 大腸菌 DH 10 Bにエレクトロポーレーシヨン法にて導入した。 得られたクローンの有する プラスミドの構造を、 制限酵素処理ならびに配列解析で確認し、 正しい構築のも のを CHO細胞発現用プラスミド pAK— ZAQCとして使用した。
このプラスミド pAK— ZAQCを CHO/dhfr細胞 (American Type Culture
Collection) に CellPhect Transfect ion kit (Amersham Pharmacia Biotech h) を用いて形質導入することにより取得した。 まず、 蒸留水 120 lに溶解したプ ラスミド DNA gに対して Buffer A (CellPhect Transfection Kitに添付） 120 lを添加し、 撹拌し、 10分間静置後、 Buffer B (CellPhect
Transfection Kitに添付） 240 lを添加し、 激しく撹拌し当該 D N Aを含有す る DNA—リン酸カルシウム複合体を形成させた。 5 X 105個の CHO/ dhfr—細胞 を 6 Ommシャーレに播き、 10%のゥシ胎児血清 （BIO WHITTAKER社） を含む Ham's F-12培地 （日水製薬株式会社） 中で 37°C、 5 %炭酸ガス中で 1日間培養 した後、 当該 DNA—リン酸カルシウム複合体の懸濁液 480 il l をシャーレの当 該細胞上に滴下させた。 これを、 37°C、 5%炭酸ガス中にて 6時間培養した後、 血清を含まない Ham s F-12培地で 2回細胞を洗浄し、 シャーレの当該細胞上に 1 5 %グリセロールを含む緩衝液（140 mM NaCl， 25 mM HEPES, 1.4 mM Na2HP04, pH7.1) 1.2mlを添加し 2分間処理した。 これを、 再度、 血清を含まない Ham' s F - 12培地で 2回洗浄した後、 10%のゥシ胎児血清を含む Ham's F- 12培地中で 3 7T：、 5%炭酸ガス中で一晩培養した。 当該細胞をトリプシン処理により分散さ せてシャーレから回収し、 2 X 104個ずつ 6-well plateに植え込み、 透析済み 1 0%ゥシ胎児血清 （JRH BIOSCIENCES 社） 、 1 mM MEM非必須アミノ酸溶液 （大日 本製薬株式会社） 、 100 units/ml Penicillin, 100 g/ml Streptomycinを含む Dulbecco' s modified Eagle medium (DMEM) 培地 (日水製薬株式会社) 中に て 37°C、 5%炭酸ガス中にて培養を開始した。 プラスミドの導入された形質転 換 CHO細胞は当該培地中で生育するが、 非導入細胞は次第に死滅していくので、 培養開始後 2日毎に培地を交換して死滅細胞を除去した。 培養開始 8— 10日後 に生育してきた形質転換 CHO細胞のコロニーを 2 1個選んだ。 それぞれ選択 された細胞から RNAを市販の RNA単離用キッ卜を用いて回収し、 以降公知の 尺丁ー？ 尺法にょり 2 <2を高発現する2八(3発現〇1 〇細胞8— 1番クロー ン （以後、 ZAQC— B 1細胞と略称する） を選別した。
また、 対照として ETA (エンドセリン A受容体） 発現 CHO細胞 24番クロ ーン （以後 ETA 24細胞と略称する。 journal of Pharmacology and
Experimental Therapeutics, 279巻、 675- 685頁、 1996年参照) を用いた。
上記 （4) で得られたアツセィ用サンプルについて、 ZAQC - B 1細胞及び ET A 24細胞における細胞内 C a 2+イオン濃度上昇活性の測定を FL I PR (Molecular Devices社）を用いて行った。 ZAQC— B 1細胞、 ETA24細胞 共に 10%透析処理済ゥシ胎児血清（以後 d FBSとする）を加えた DMEMで継代 培養しているものを用いた。 ZAQC— B 1細胞、 ETA 24細胞をそれぞれ 15 X104cells/mlとなるように培地（10% d FBS-DMEM)に懸濁し、 FL I PR用 96穴 プレート（Black plate clear bottom, Cos ter社）に分注器を用いて各ゥエルに 200 1ずつ植え込み（3.0X104cells/200 l/ゥエル）、 5 % C02インキュベータ —中にて 37°Cで一晩培養した後用いた（以後細胞プレートとする）。 H/HBSS (二 ッスィハンクス 2 (日水製薬株式会社） 9.8g、 炭酸水素ナトリウム 0.35g、 HEPES 4.77 g、 水酸化ナトリウム溶液で PH7.4に合わせた後、 フィルター滅菌 処理） 20 ml、 250 mM Probenecid 200 K ゥシ胎児血清（FBS) 200 lを混合 した。 また、 Fluo 3-AM (同仁化学研究所） 2バイアル（50 zg)をジメチルスル フォキサイド 40 ιι\, 20% Pluronic acid (Molecular Probes社） 40 lに溶 解し、 これを上記 H/HBSS— Probenecid— FBS に加え、 混和後、 8連ピペットを用 いて培養液を除いた細胞プレートに各ゥエル 100 lずつ分注し、 5% C02イン キュベー夕一中にて 37 °Cで 1時間インキュベートした（色素ローディング)。 上 記 （4) で得られたアツセィ用サンプルについて、 各フラクションに、 2.5 mM Probenecid, 0.1% CHAPSを含む H/HBSS 150 lを加えて希釈し、 FL I PR用 96穴プレート（V-Bottomプレート、 Cos ter社）へ移した（以後、 サンプルプレー トとする）。 細胞プレー卜の色素ローデイング終了後、 H/HBSS 2.5 mM
Probenecid カロ！た洗净ノヾッファ——でプレ——卜ゥォッシヤー (Molecular Devices 社）を用いて細胞プレートを 4回洗浄し、 洗浄後 100 / lの洗浄バッファーを残し た。 この細胞プレートとサンプルプレートを FL I PRにセッ卜しアツセィを行 つた（FL I PRにより、 サンプルプレートから 50 1のサンプルが細胞プレー トへと移される）。
その結果、 上記 （3) IV液を上記 （4) 逆相高速液体クロマトグラフィー分離 して得られたフラクション ^.53に∑八<3( — 81細胞に特異的な細胞内 C a2 + ィォン濃度上昇活性が見られた。
(6) TSKg e l Sup e r-Ph e ny 1逆相高速液体クロマトグラフィ 一による精製
TSKgel Super-Phenyl逆相高速液体クロマトグラフィー用カラム （東ソ一株式 会社、 0.46 cm x 10 cm) を、 4 0でにて、 流速 1 m 1 i nで A液 （0.1 % トリフルォロ酢酸/蒸留水） 容量 91.7%/ B液 （0.1% トリフルォロ酢酸/ 60% ァ セトニトリル） 容量 8.3%を流し平衡化した。 上記 （4) で得られたフラクショ ン No.53についてクロマトグラフィー操作を行った。 即ち、 フラクション No.53の 溶液 lm 1を当該カラムに添着した後、 流速 lm 1 Zm i nで、 1分間かけて A 液容量 7 5 %ZB液容量 2 5 %まで上昇させ、 次いで 7 5分間かけて A液容量 6 7 %ZB液容量 3 3 %まで、 B液濃度を直線的グラジェン卜で上昇させた。 溶出液を、 500 lずつフラクション No.をつけて分取した。 分取フラクション より各 25 1づっ 0.2% BSA 150 1と混合し凍結乾燥機 （12EL； VirTis社） で 凍結乾燥させた。 この乾燥物に、 2.5 mM Probenecid, 0. 1% CHAPSを含む
H/HBSS 150 u \ を加えて溶解し、 この溶液 50 ^ 1を用いて上記 ( 5 ) の試験法 により、 細胞内 C a2+イオン濃度上昇活性を測定することにより、 ZAQC— B 1細胞に対する受容体活性化作用を測定した。 その結果、 目的とする ZAQC— B 1細胞に対する受容体活性化作用を有する成分、 すなわち、 ZAQ活性化成分 は、 主としてフラクション No.103-105に溶出されていることが判明した。
(7) / RPC C 2/C 1 8 ST 4. 6 Z 1 0 0逆相高速液体クロマトダラ フィ一による精製
RPC C2/C18 ST 4.6/100逆相高速液体クロマトグラフィー用カラム
(Amersham Pharmacia Biotech社、 0.46 cm x 10 cm) を、 4 0°Cにて、 流速 1 m lZm i nで A液 （ヘプタフルォロ酪酸/蒸留水） 容量 9 5 %/B液 （0. 1 %へ プ夕フルォロ酪酸/ 100% ァセトニトリル） 容量 5 %を流し平衡化した。
上記 （6 ) で得られた TSKgel Super-Phenyl逆相高速液体クロマトグラフィー 分取フラクションのうちフラクション No.103- 105をそのまま RPC C2/C18 ST 4.6/100逆相カラムに添着した後、 流速 lm 1 Zm i nで 1分間で A液 （0. 1 % ヘプ夕フルォロ酪酸/蒸留水） 容量 9 5 %ZB液 （0. 1% ヘプ夕フルォロ酪酸 /100% ァセトニトリル） 容量 5 %から A液容量 6 5 %ZB液容量 3 5 %まで急 速に上昇させ、 これを次に、 流速 lml Zm i nで、 60分間かけて A液容量 5 0 %/B液容量 5 0 %まで直線的グラジェントで上昇させ溶出液を回収した。 溶 出液は、 2 1 0 nmの紫外吸収では単一なピークとして検出された。 溶出液を、 500 / 1ずつフラクション番号をつけて分取し、 分取フラクション より各 10 づっを 0.2% BSA 150 wlと混合し凍結乾燥機 （12EL； VirTis社） で凍結乾燥させた。 この乾燥物に、 2.5 DIM Probenecid, 0.1% CHAPSを含む H/HBSS 75 lを加えて溶解し、 この溶液 50 lを用いて上記 （5) の試験法に より、 ZAQC— B 1細胞に対する受容体活性化作用を測定した。 その結果、 目 的とする ZAQC— B 1細胞に対する受容体活性化作用を有する成分、 すなわち. Z A Q活性化成分は、 フラクション No.82-84に溶出されていることが判明した。 この活性ピークは、 2 1 0 nmの紫外吸収ピークに完全に一致し、 単一ペプチド にまで精製されたものと判断した。
(8) 精製された ZAQ活性化ペプチドの構造解析
上記 （7) で得られた ZAQ活性化成分について以下の方法で構造決定を実施 した。 ZAQ活性化成分精製標品を凍結乾燥し、 得られた凍結乾燥物を溶媒 DM SO (ジメチルサルフォキシド） に溶解した。 この溶液の一部をプロティンシー クェンサ一（パーキンエルマ一社、 PE Biosystems Procise 491cLC)を用いた N末 端からのアミノ酸配列解析に供した。 その結果、 N末端のアミノ酸残基から 16 番目のアミノ酸残基のうち、 1 4残基を同定することができた （Ala Val lie Thr Gly Ala Xaa Glu Arg Asp Val Gin Xaa Arg Ala Gly (配列番号： 7 2 ; Xaaは未同定残基） ） 。
(II) ヒト型 ZAQリガンドペプチドの c DN Aのクローニング
上記 （I ) で得られた牛乳から精製された ZAQを活性化するペプチドの N末 端アミノ酸配列 （配列番号： 7 2) をクエリーとしてデータベースを B l a s t 検索したところ、 配列番号： 7 2で表わされるアミノ酸配列を有するペプチドを コードする DN Aの塩基配列と同等な配列を含むヒト EST (X4046 7) を 見出した。 本配列は完全長のオープンリーディング · フレームを有していなかつ たので、 以下に RACE法により未確定部分の配列を明らかにし、 引き続いて完 全長のオープンリーディング ·フレームを有す c DNAクローンを取得した。
EST (X4046 7) の情報よりプライマー Z F 1 (配列番号： 7 3 ) 、 Z F 2 (配列番号： 74) と Z F 3 (配列番号： 7 5) を作成し、 ヒト精巣
Marathon-Ready cDNA (CL0NTECH社） を铸型として以下に記した 3' RACE実験を実 施した。
ZF1: 5'-GGTGCCACGCGAGTCTCAATCATGCTCC-3' (配列番号： 7 3)
ZF2: 5'-GGGGCCTGTGAGCGGGATGTCCAGTGTG-3' (配列番号： 74)
ZF3: 5'-CTTCTTCAGGAAACGCAAGCACCACACC-3' (配列番号： 7 5)
3' RACEの P CR反応液は 50 X Advantage 2 Polymerase Mix (CL0NTECH社） を 1 μΑ、 添付の 10 χ Advantage 2 PCR buffer (400 mM Tricine-KOH, 150 mM KOAc, 35 mM Mg(0Ac)2 , 37.5 g/ml BSA, 0.05%Tween-20, 0.05% Nonidet- P40)を 5 dNTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造）を 4 j 10 / Mプライマー ZF1を 1 1、 10 Μプライマー API (プライマー APIは CL0NTECH社の Marathon- Ready cDNA Kitに添付のもの） を 1 1、 铸型 C DNA (CL0NTECH社、 ヒト精巣 Marathon-Ready cDNA) を 5 及び蒸留水を 33 1を混合して作製した。 反応 条件は 94で' 60秒の初期変性後、 94 >30秒- 72^·4分のサイクル反応を 5回、 94 · 30秒- 70で · 4分のサイクル反応を 5回、 94 · 30秒- 68°C · 44分のサイクル反応 を 25回行った。
続いて、 当該 PC R反応の反応液を铸型として nested PCRを実施した。 反応液 は 50 X Advantage 2 Polymerase Mix (CL0NTECH社） を 1 1、 添付の 10 x Advantage 2 PCR buffer (400 mM Tricine-KOH, 150 mM KOAc, 35 mM Mg(0Ac)2, 37.5jLig/ml BSA, 0.05%Tween-20, 0.05% Nonidet-P40)を 5 K dNTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造）を 4 fil、 10 / Mプライマー ZF2を 1 1、 10 プライ マー AP2 (プライマ一 AP2は CL0NTECH社の Marathon-Ready cDNA Kitに添付のも の） を 1 1、 铸型 DNA (当該 PC R反応液 50倍希釈液） を 5 及び蒸留 水を 33 ^1を混合して作製した。 反応条件は 94 > 60秒の初期変性後、 94°C-30 秒- 72°C · 4分のサイクル反応を 5回、 94°C'30秒- 70°C> 4分のサイクル反応を 5 回、 94°C'30秒- 68で'44分のサイクル反応を 2 5回行った。
さらに続いて、 当該 PC R反応の反応液を铸型として 2回目の nested PCRを実 施した。 反応液は 50 X Advantage 2 Polymerase Mix (CL0NTECH社） を 1 し 添付の 10 X Advantage 2 PCR buffer (400 mM Tricine-KOH, 150 mM KOAc, 35 mM Mg(0Ac)2 , 37.5 g/ml BSA, 0.05%Tween-20, 0.05% Nonidet- P40)を 5 1 dNTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造）を 4 1、 10 Mプライマ一 ZF3を 1 1、 10 プライマ一 AP2 (プライマー AP2は CLONTECH社の Marathon-Ready cDNA Kit に添付のものを用いた。 ） を 1 1、 铸型 DNA (当該 P C R反応液 50倍希釈 液） を 5 j し 及び蒸留水を 33 を混合して作製した。 反応条件は 94°C'60秒の 初期変性後、 94°C'30秒- 72°C'4分のサイクル反応を 5回、 94°C ·30秒- 70°C '4分の サイクル反応を 5回、 94°C'.30秒- 68°C'44分のサイクル反応を 25回行った。 得られ た DNA断片を T0P0 TA Cloning Kit (Invi trogen社）を用いて添付のマニュアル に記載された方法に従ってクローニングした。 クローニングされた D N Aの塩基 配列を ABI377DNA sequencerを用いて解読し、 3'端配列 (配列番号： 7 6) を得 た。
配列番号： 7 6で表わされる塩基配列及び EST (X40467) の情報によ りプライマー ZAQい CF (配列番号： 7 7) 及び ZAQい XR1 (配列番号： 78) を作 成した。 ヒト精巣 Marathon-Ready cDNA (CL0NTECH社） を鍀型としてプライマー ZAQL-CF と ZAQL-XR1を用いて P CRを実施した。
ZAQL-CF: 5' -CCACCATGAGAGGTGCCACG-3' (配列番号： 7 7)
ZAQL-XR1： 5' -CTCGAGCTCAGGAAAAGGATGGTG-3' (配列番号： 7 8)
P CR反応液は PfuTurbo DNA polymerase (Stratagene社）を 1 添付の 10 x PCR bufferを 5 1、 2.5 mM dNTP mixtureを 4 K 10 Mプライマ一 ZAQL- CF及 び ZAQL - XR1を各 2.5 K 铸型 DNAを 5 し 及び蒸留水を 30 1を混合して作 製した。 反応条件は 95T>1分の初期変性後、 95 '1分-60 '1分-72^'1分のサィ クル反応を 40回、 および 72°C' 10分の最終伸長反応とした。 得られた DNA断片 を T0P0 TA Cloning Kit (Invi trogen社）を用いて添付のマニュアルに記載された 方法に従ってクローニングした。 クローニングされた DN A断片の塩基配列を ABI 377 DNA sequencerを用いて解読した結果、 3 7 1 b pの、 それぞれ配列番 号： 7 9および配列番号： 8 0で表わされる塩基配列を有していることが明らか となった。 配列番号： 7 9で表わされる塩基配列を含有する DNA断片を有する プラスミドを pHMITAと、 配列番号： 80で表わされる塩基配列を含有する DN A 断片を有するプラスミドを pHMITGと命名した。
プラスミド PHMITA及び pHMITGにより大腸菌 （Escherichia coli) を形質転換し、 それぞれェシエリヒア ·コリ （Escherichia coli) ΤΟΡΙΟ/ρΗΜΙΤΑおよびェシエリ ヒア .コリ (Escherichia coli) TOPlO/pHMITGと命名した。
これらの DNA断片の塩基配列を解析した結果、 配列番号： 79で表わされる DNA断片は、 配列番号： 83で表わされるヒト型 ZAQリガンド前駆体べプチ ド（Aタイプ、 105アミノ酸残基）をコードする DNA (配列番号： 89) を含んで おり、 配列番号： 80で表わされる DNA断片は、 配列番号： 84で表わされる ヒト型 ZAQリガンド前駆体ペプチド（Gタイプ、 105アミノ酸残基）をコード する DNA (配列番号： 90) を含んでいることが明らかとなった。
また、 配列番号： 89および配列番号： 90で表わされる塩基配列は典型的な シグナル配列を有しており、 配列番号： 89で表わされる塩基配列を含有する D NAは、 配列番号： 81で表わされるヒト型 ZAQリガンド成熟体ペプチド（A タイプ、 86アミノ酸残基）をコードする 258塩基対からなる DNA (配列番 号： 87) を含んでおり、 配列番号： 90で表わされる塩基配列を含有する DN Aは、 配列番号： 82で表わされるヒト型 ZAQリガンド成熟体ペプチド（G夕 イブ、 86アミノ酸残基）をコードする 258塩基対からなる DNA (配列番 号： 88) を含んでいることが明らかとなった。 参考例 10 ヒト型 Z A Qリガンドペプチドの哺乳動物細胞での産生 （ 1 )
(1) ヒト型 ZAQリガンド前駆体べプチド哺乳動物細胞発現ベクターの構築 参考例 9 (II) において取得したプラスミド pHMITGから E c oR I、 Xh o I 制限酵素消化によってヒト型 ZAQリガンド前駆体べプチドをコードする cDN Aを含む 382 b pの DNA断片 （配列番号： 91 ) を切出した。
すなわち、 プラスミド pHMITGを E c o R Iおよび Xh o Iで酵素消化し、 得ら れた DNAを 1. 5%ァガロースゲルを用いて電気泳動し、 サイバーグリーン染 色される約 382 bpのバンドを含むゲル片を剃刀で切り取った。 当該ゲル片ょ り Gene Clean spin DNA抽出キット （BI0 101社） を用いて D N A断片を回収した t 得られた DNA断片を CMV- IEェンハンサーおよび chicken beta-actin promoter を発現プロモーターとする哺乳動物細胞発現ベク ー PCAN618に対して E c oR I、 Xh o I制限酵素切断部位に定法に従ってクロ一ニングした。 クローニング された DN A断片の塩基配列を前述の方法により解読した結果、 配列番号： 91 で表わされる塩基配列を有していることが確認された。 このヒト型 Z AQリガン ド前駆体べプチドをコードする DNAを含有する哺乳動物細胞発現べク夕一を pCANZAQLg2と命名した。
(2) COS 7細胞への発現ベクターの導入
COS 7細胞は ATCCより購入し、 DMEM培地 （ 10 % FBSを加えたも の） を用いて継代培養しているものを用いた。 DMEM培地を用いて COS 7細' 胞を 1.5X106cells/dishとなるよう 10 cmシャーレにまき、 371：、 5 % C02 インキュベータ一中で一晩培養した。 ヒト型 ZAQリガンド前駆体ペプチド発現 プラスミド （pCANZAQLg2) l g (2 ^ 1の TEバッファ一に溶解） にバッファー EC (Effectene transfection reagent, QIAGEN) 298 1を加え、 さらに Enhancer 16 1を加え、 1秒間混和後室温で 3分間放置した。 さらに Effectene
Transfection Reagent 60 1を加え、 10秒間混和後室温で 10分間放置した。 前日にまいた細胞の上清を除き、 DMEM培地 10m 1で 1回洗浄し、 DMEM 培地を 9m lを加えた。 プラスミド溶液に DMEM培地 lm 1を加えて混和後細 胞に滴下し、 全体を混ぜた後 37 X：、 5% C02インキュベータ一中で一晩培養し た。 DMEM培地 10m 1で 2回洗浄し、 DMEM培地 10 m 1を加え、 37^：、 5% C02インキュベータ一中でー晚培養した。 2日後、 培養上清を回収した。
(3) ヒト型 ZAQリガンド前駆体ペプチド発現 COS 7細胞培養上清からの Z A Qを活性化するべプチドの部分精製
(3- 1) ヒト型 ZAQリガンド前駆体ペプチド発現 COS 7細胞培養上清抽出 液の調製
ヒト型 ZAQリガンド前駆体ペプチド発現 COS 7細胞培養上清を回収し、 以 下の操作を行い抽出液を調製した。 先ず、 細胞培養上清 （約 18.5ml) に終濃度が 1 Mになるように酢酸 1. 1m lを滴下し、 一時間攪拌した。 さらにその 2倍容 量のアセトンを加え、 41Cにて 30分間攪拌し、 次いで高速遠心機 （CR26H、 23 型口一ター： 日立株式会社） を用ぃて15,000 卬111、 30分間遠心し上清を得た。 得られた上清をエバポレー夕一にかけ、 アセトンを除去した後、 凍結乾燥機 （1 2 EL ； VirTis社） にて凍結乾燥した。
(3-2) ヒト型 ZAQリガンド前駆体べプチド発現 C O S 7細胞培養上清の S e p h a d e x G 50ゲルろ過クロマトグラフィー及び S e pP a kカラムク ロマ卜グ^フィ一
上記 （3 _ 1) で得られた凍結乾燥粉末を 1M酢酸 2m 1に溶解後、 1 M酢酸 で平衡化した Sephadex G15 (直径 3cm、 35ml、 Pharmacia Biotec 社）カラムに 吸着させた後、 1M酢酸をカラムに流し、 溶出液を 5m 1づっフラクション No. をつけて分取し、 凍結乾燥機 （12 EL ； VirTis社） で凍結乾燥させた。
SepPak C18-5gカラム （10ml) を、 メタノールにて膨潤後、 0.1% トリフルォ 口酢酸/蒸留水を流し、 平衡化した。 Sephadex G50ゲルろ過クロマトグラフィー 分取フラクションのうちフラクション No.1-16の凍結乾燥品をまとめて 0.1 %トリ フルォロ酢酸/蒸留水 3mlに溶解し、 SepPak C18- 5gカラムに添着した後、 0.1% トリフルォロ酢酸/蒸留水 24mlで洗浄後、 0.1% トリフルォロ酢酸/ 60% ァセト 二トリル 20mlで溶出した。 得られた溶出液をサーバントにかけた。
(3 -3) Su p e r OD S逆相高速液体クロマトグラフィーによる精製
TSKgel Super 0DS逆相高速液体クロマトグラフィー用カラム （東ソ一株式会社、 0.46 cm 10 cm) を、 40でにて、 流速 1 ml/minで A液 （0.1% トリフルォロ酢 酸/蒸留水） を流し、 平衡化した。 （5— 3— 2) で得られた SepPak C18-5gカラ ムフラクションをサーバントにかけた後、 Super 0DS逆相高速液体クロマトダラ フィ一に添着し、 流速 1 ml/minで 60分間で A液 （0.1% トリフルォロ酢酸/蒸 留水） 容量 100%/B液 （0.1% トリフルォロ酢酸 /60% ァセトニトリル） 容量 0%から A液容量 0%ZB液容量 100%まで直線的グラジェントで上昇させ、 溶出 液を回収した。
溶出液を、 1 mlずつフラクション No.をつけて分取し、 分取フラクション全量 を凍結乾燥機 （12 EL ; VirTis社） で凍結乾燥させた。 この乾燥物に H/HBSS に 2.5 Probenecid 、 0.2% BSAを加えたもの 150 1を加えて溶解し、 この溶液 を用いて下記 （3— 4) の試験法により、 ZAQC— B 1細胞に対する受容体活 性化作用を測定した。
(3-4) FL I PRを用いた細胞内 C a 2+イオン濃度上昇活性の測定
上記 （3— 3) で得られたサンプルについて、 参考例 9 (1)(5) で得られた ZAQ発現細胞 （ZAQC— B 1) における細胞内 C a 2+イオン濃度上昇活性の 測定を FL I PRを用いて行った。 また、 対照として hOT7T175発現細胞
(hOT7T175-16； WO 00 / 24890に記載）を用いた。
Z AQC-B 1細胞、 hOT7T1751- 6細胞共に 10 %透析処理済ゥシ胎児血清（以 後 d FBSとする）を加えた DMEMで継代培養しているものを用いた。 ZAQC— B 1細胞、 hOT7T175卜 6細胞をそれぞれ 15X104cells/mlとなるように培地（10% dFBS- DMEM)に懸濁し、 FL I P R用 96穴プレート（Black plate clear bottom, Coster社)に分注器を用いて各ゥエルに ずつ播き（3.0X104cells/200w 1/ゥ エル）、 5% C02インキュベータ一中で 37 °Cで一晩培養した後、 用いた（以後細 胞プレートとする）。 H/HBSS (HANKS' 9.8g、 炭酸水素ナトリウム 0.35g、 HEPES 4.77 g、 水酸化ナトリウムで pH7.4に合わせた後、 フィルター滅菌処理） 21ml、
250mM Probenecid 210M K ゥシ胎児血清 （FB S) 210jalを混合した。 また、 Fluo3-AM 2バイアル（50 g)をジメチルスルフオキサイド 42 1、 20% Pluronic acid 42 1に溶解し、 これを上記 H/HBSS— Probenecid—FBS に加え、 混和後、 8 連ピぺットを用いて培養液を除いた細胞プレートに各ゥエル 100^1ずつ分注し、 5% C02インキュベータ一中で 37でで 1時間インキュベートした（色素ローディ ング）。 上記 （5— 3— 3) で得られたアツセィ用サンプルについて、 各フラク シヨンに H/HBSSに 2.5mM Probenecid 、 0.2% BSAを加えたもの 150^ 1を加えて溶 解し、 F L I P R用 96穴プレート（V-Bottomプレー卜、 Coster社）へ移した（以後、 サンプルプレートとする）。 細胞プレートの色素ローデイング終了後、 H/HBSSに 2.5mM Probenecidを加えた洗浄バッファーでプレートウォッシャー（Molecular Dev i ces社）を用いて細胞プレートを 4回洗浄し、 洗浄後 100 1の洗浄バッファー を残した。 この細胞プレートとサンプルプレートを FL I PRにセットし、 アツ セィを行った（FL I PRにより、 サンプルプレートから 0.05mlのサンプルが細 胞プレートへと移される）。 フラクション No.48-68に ZAQC— B 1細胞特異的 な細胞内 C a 2+イオン濃度上昇活性が見られた。 このことから、 目的とする ZA QC— B 1細胞に対する受容体活性化作用を有する成分、 すなわち、 ZAQ活性 化成分は、 フラクション No.48-68に溶出されていることが判明した。 参考例 1 1 ヒ卜型 ZAQリガンドペプチドの哺乳動物細胞での産生 （2) (1) 培養上清の調製
参考例 1 0に記載した方法で COS 7細胞にヒト型 ZAQリガンド前駆体ぺプ チド発現プラスミド （pCANZAQLg2) を導入した。 すなわち、 DMEM培地を用い て COS 7細胞を 3.0X106cells/dishとなるよう 15cmシャーレにまき、 37°C, 5% (：02ィ キュベータ一中で一晩培養した。 ヒト型 ZAQリガンド前駆体ぺプ チド発現プラスミド （pCANZAQLg2) 4 g (4 1の TEバッファーに溶解） にバ ッファー EC (Effectene transfection reagent, QIAGEN) 600 1を加え、 さら に Enhancer 32 1を加え、 1秒間混和後室温で 3分間放置した。 さらに
Effectene Transfection Reagent 120 zlを加え、 10秒間混和後室温で 10分 間放置した。 前日にまいた細胞の上清を除き、 DMEM培地 10m 1で 1回洗浄 し、 DMEM培地を 30m 1を加えた。 プラスミド溶液に DMEM培地 1 m 1を 加えて混和後細胞に滴下し、 全体を混ぜた後 37 、 5% C02インキュベーター 中でー晚培養した。 DMEM培地 10m 1で 1回洗浄し、 DMEM培地 20ml を加え、 37T：、 5% C02インキュベータ一中で一晩培養した。 1日後、 培養上 清を回収し、 さらに DMEM培地 20m 1を加え、 37°C、 5% C02インキュべ 一夕一中で一晩培養した後培養上清を回収した。
(2) 培養上清からのヒト型 ZAQリガンドペプチドの精製
上記 （1) に記載した方法で 15 cmシャーレ 80枚分の培養上清を回収し、 これに酢酸を終濃度 1Mになるように添加した。 1時間攪拌した後、 2倍容のァ セトンを添加し蛋白質を析出させた。 4°Cにて 30分間攪拌し、 次いで高速遠心 機 （CR26H、 RR10A型ローター： 日立株式会社） を用いて 10， 000 卬 m、 30分間 遠心し上清を得た。 得られた上清をエバポレー夕一にかけアセトンを除去し、 あ らかじめ 0 · 1 %トリフルォロ酢酸/蒸留水で平衡化した逆相カラム （ Wa t e r s社 C 18、 100 g) に流した。 0.1%トリフルォロ酢酸/蒸留水 1000ml、 次いで 0.1%トリフ ルォロ酢酸 /20%ァセトニトリル 1000mlでカラムを洗浄した後、 0.1%トリフルォ 口酢酸 /60%ァセトニトリル 1000mlでペプチドを溶出した。 得られた溶出液をェ バポレーターにかけた後、 凍結乾燥器 （1 2 EL ; VirTis社） にて凍結乾燥し た。
TSKgel 0DS80TM逆相高速液体クロマトグラフィー用カラム （東ソ一株式会社、 21.5 關 x 30 cm) を、 40°Cにて、 流速 4m 1 /m i nで A液 （0.1%トリフル ォロ酢酸/蒸留水） を流し、 平衡化した。 得られた凍結乾燥粉末を A液に溶解し た後、 当該 ODS80TMカラムに添着し、 流速 4m 1 Zm i nで 1 20分間に A液 (0.1%トリフルォロ酢酸/蒸留水） 容量 60%ZB液 （0.1%トリフルォロ酢酸 /60%ァセトニトリル） 容量 40 %から A液容量 0 %ZB液容量 100 %まで直 線的グラジェントで上昇させて、 ペプチドを溶出させた。
溶出液を、 8m 1ずつフラクション No.をつけて分取し、 分取フラクションか ら 50 zlを取り凍結乾燥機 （12EL ; VirTis社） で凍結乾燥させた。 この乾 燥物に H/HBSSに 2.5mM Probenecid 、 0.2% BSAを加えたもの 200 1を加えて溶解 し、 この溶液を用いて上記 （5— 3— 4) の試験法により、 ZAQC— B 1細胞 に対する受容体活性化作用を測定した。 その結果、 目的とする ZAQC— B 1細 胞に対する受容体活性化作用を有する成分、 すなわち、 ZAQ¾性化成分は、 フ ラクシヨン No. 32に溶出されていることが判った。
TSKgel CM-2SWイオン交換高速液体クロマトグラフィー用カラム （東ソ一株式 会社、 4.6 籠 X 25 cm) を、 25 X：にて、 流速 1 m 1 Zm i nで A液 （10 mMぎ 酸アンモニゥム /10%ァセトニトリル） を流し、 平衡化した。 上記フラクション No.32を当該 CM- 2SWカラムに添着し、 流速 1 m 1 /m i nで 60分間に A液 （10 mM ぎ酸アンモニゥム /10% ァセトニトリル） 容量 100%ノ B液 （1000 mMぎ酸ァ ンモニゥムハ 0% ァセトニトリル） 容量 0%から A液容量 0%ノ B液容量 10 0 %まで直線的グラジェントで上昇させて、 ペプチドを溶出させた。
溶出液を、 lm 1ずつフラクション No.をつけて分取し、 分取フラクションか ら 1.5 lを取り、 これを H/HBSSに 2.5mM Probenecid 、 0.2% BSA 200 1希釈し. この溶液を用いて上記 （5— 3— 4) の試験法により、 ZAQC— B 1細胞に対 する受容体活性化作用を測定した。 その結果、 目的とする ZAQC— B 1細胞に 対する受容体活性化作用を有する成分、 すなわち、 ZAQ活性化成分は、 フラク シヨン No. 56および 57に溶出されていることが判った。
TSKgel Super phenyl逆相高速液体クロマトグラフィー用カラム （東ソ一株式 会社、 4.6 議 X 10 cm) を、 40 にて、 流速 lm 1 Zm i nで A液 （0.1% 卜 リフルォロ酢酸/蒸留水） を流し、 平衡化した。 上記フラクション No.56および 57を当該 Super phenylカラムに添着し、 流速 1 m 1 Zm i nで 60分間に A液 (0.1% トリフルォロ酢酸/蒸留水） 容量 70%ZB液 （0.1% トリフルォロ酢 酸 /60% ァセ卜二トリル） 容量 30%から A液容量 50%ZB液容量 50%まで 直線的グラジェン卜で上昇させて、 ペプチドを溶出させた。
溶出液を、 1m Iずつフラクション No.をつけて分取し、 分取フラクションか ら 1.5 lを取り、 これを H/HBSSに 2.5mM Probenecid、 0.2% BSA 200 1希釈し、 この溶液を用いて参考例 10の試験法により、 ZAQC— B 1細胞に対する受容 体活性化作用を測定した。 その結果、 目的とする ZAQC— B 1細胞に対する受 容体活性化作用を有する成分、 すなわち、 ZAQ活性化成分は、 フラクション No. 54、 55および 56に溶出されていることが判った。 本活性は単一な紫外吸収ピー クと一致し、 活性成分が単一にまで精製されたものと判断した。
Z A Q活性化成分精製標品中の溶媒を凍結乾燥して除去し、 得られた凍結乾燥 物を溶媒 DM S〇 （ジメチルサルフォキシド） に溶解した。 この溶液の一部 （約 7.5 pmol) をプロテインシークェンサ一（パーキンエルマ一社、 PE Biosystems Procise 491cLC)を用いた N末端アミノ酸配列解析に供した。 その結果、 N末端 のアミノ酸残基から 1 0番目のアミノ酸残基のうち、 9残基を同定することがで きた （Ala Val He T r Gly Ala Xaa Glu Arg Asp (配列番号： 92 ; Xaaは未 同定残基） ） 。 得られたアミノ酸配列は、 予想されるヒト型 ZAQリガンド成熟 体ペプチドの N端アミノ酸配列と一致した。 また、 ZAQ活性化成分精製標品の 質量分析を Finnigan LCQ LC/MS装置（Thermoquest, San 〗ose， CA)を用いて、 ェ レクトロスプレーイオン化法により実施し、 分子量が 9657.6であることを確認し た。 これは 1 0個のシスティン残基がすべてジスルフィ ド結合を形成した 86残 基のヒト型 ZAQリガンド成熟体ペプチド （配列番号： 82) の理論値 9657.3に 良く一致し、 Z A Q活性化成分精製標品が、 配列番号： 82で表わされるァミノ 酸配列を有するヒト型 Z A Qリガンド成熟体べプチドを有していることが確認さ れた。
(3) 精製ヒト型 ZAQリガンドペプチドの ZAQ活性化作用の測定
上記 （2) で精製したヒト型 ZAQリガンド成熟体ペプチドの ZAQC— B 1 細胞に対する受容体活性化作用を参考例 1 0の試験法により測定した。 その結果、 ZAQ発現 CHO細胞 （ZAQC— B l細胞） においてヒト型 Z AQリガンド成 熟体ペプチドは濃度依存的に細胞内カルシウム濃度の上昇を惹起した。 EC5。値 は 96 pMで、 ヒト型 ZAQリガンド成熟体ペプチドは非常に強いァゴニスト活性 を示すことが明らかとなった。 結果を 〔図 3〕 に示す。 参考例 12 ヒト型 Z AQリガンドぺプチドの哺乳動物細胞での産生 （ 3 )
(1) ヒト型 ZAQリガンドペプチド安定発現 CHO細胞株の樹立
参考例 9 (II) に記載したプラスミド pHMITGを铸型として下記のプライマー 5' GTCGACCACCATGAGAGGTGCCACGC 3' (配列番号： 93)
5' ACTAGTCGCAGAACTGGTAGGTATGG 3' (配列番号： 94)
を用いてヒト型 ZAQリガンド cDNAを PCR増幅し、 pCR Blunt IIベクター (Invitrogen社） にクローニングした。 得られた正しい配列を有するクローンか らインサート cDNAを S a 1 I及び S p e I制限酵素を用いて切り出し、 pAKKOl.11H発現ベクターに組み込んだ。 当該プラスミドを CHO/dhFr—細胞
(American Type Culture Collection) に、 参考例 9に記載した Cel lPhect Transfection kit (Amersham Pharmacia Biotech社） を用いた方法に従って形質 導入した。 形質導入株数クローンから培養上清を回収し、 参考例 9に記載した試 験方法により、 ZAQC— B 1細胞の細胞内 C a2 +イオン濃度を上昇させる ZA Qリガンド活性を測定した。 これにより Z AQリガンドを高発現する ZAQL— 1発現 CHO細胞クローン No.4を選別した。
(2) ヒト型 ZAQリガンド （ZAQL— 1) 発現 CHO細胞無血清培養上清の 透析済み 10%ゥシ胎児血清 （JRH BIOSCIENCES 社） 、 1 mM MEM非必須アミノ酸 溶液、 100 units/ml Penici 11 in, 100 g/ml Streptomyc inを含む Dulbecco s Modified Eagle Medium (DMEM) 培地 （日水製薬株式会社） で Single
Tray(Nunc社） 4枚コンフルェントまで培養した Z AQ L— 1発現 CHO細胞クロ —ン No.4を、 トリプシン処理して分散後、 遠心して回収した。 上記 Single Tray 1枚分の細胞を上記培地 1.5 Lに懸濁後 Cell Factories 10 (Nunc社） に植え込み、 4基の Cell Factories 10について 37 で 5%炭酸ガス中にて 3日間培養した。 培 養上清を除いた後、 前述の H/HBSS 1 Lで 1基の Cell Factories 10の細胞を洗浄 した。 H/HBSSを除いた後、 1基の Cell Factories 10あたり 2 Lの無血清培地 （1 mM MEM非必須アミノ酸溶液、 100 units/ml Penicillin, 100 g/ml
Streptomycinを含む Dulbecco's Modified Eagle Medium培地） を加えさらに 2日 間培養した。 回収した培養上清を日立高速遠心機で 1,000 rpmで 1 0分間遠心後、 ガーゼを用いてろ過し清澄な上清を得た。 これに酢酸を最終濃度 1 Mになるよう に添加し以下の操作を行つた。
(3) ZAQL— 1発現 CHO細胞無血清培養上清のォクタドデシル逆相クロマ トグラフィ一による粗分画
ォクタドデシル基を固定したシリカゲルを充填した PrepC18 (Waters社） をメ 夕ノールで膨潤後、 ガラス製カラムに充填した （50謹 XI 00 醒） 。 その後、 1 M 酢酸で平衡化したカラムに、 参考例 1 1 (2) で調製した抽出液を添着した。 次 にこのカラムを 80 Om 1の 1M酢酸で洗浄した。 次に、 このカラムに 1000 m 1の 60 %ァセトニトリル/ 0. 1 %トリフルォロ酢酸を流し、 目的とする粗 ペプチド成分を溶出した。 得られた溶出液を、 エバポレー夕一を用いて濃縮した 後、 凍結乾燥機 （12EL ; VirTis社） にて凍結乾燥した。
(4) Wa ko s i 1一 I I 5 C 18HG P r e p逆相高速液体クロマトグラ フィ一による分離
Wakos i 1-11 5C18HG Prep逆相高速液体クロマトグラフィー用カラム （和光純薬、 20龍 X250mm) を、 40°Cにて、 流速 5 m 1 Zm i nで A液 （0.1%ト リフルォロ 酢酸 蒸留水） 容量 91.7%/B液 （0.1%トリフルォロ酢酸 60%ァセトニトリ ル） 容量 8,3%を流し平衡化した。 上記 （3) で得られた凍結乾燥物についてク 口マトグラフィー操作を行った。 即ち、 凍結乾燥物を 1M酢酸 36m 1を加えて 溶解し遠心後、 その内の 1Z3を当該カラムに添着した後、 流速 5m l Zm lで、 1分間かけて A液容量 66.7%/B液容量 33.3% まで上昇させ、 次いで 120分 間かけて A液容量 16.7 % B液容量 83.3 %まで、 B液濃度を直線的グラジェントで 上昇させた。 溶出液を 5m 1ずつフラクション番号をつけて分取した。 分取フラ クシヨンより各 3 lづっ 0.2% BSA 150 \ と混合し凍結乾燥機 （12EL；
VirTis社） で凍結乾燥させた。 この乾燥物に、 アツセィバッファー 〔H/HBSS (二 ッスィハンクス 2 (日水製薬株式会社） 9.8g、 炭酸水素ナトリウム 0.35g、 HEPES 4.77 g 、 水酸化ナトリウム溶液で pH7.4に合わせた後、 フィルター滅菌 処理） に、 2.5 mM Probenecid および 0.1% CHAPS を添加したもの〕 150 1を 加えて溶解し、 この溶液 50 u\ を用いて参考例 9の試験法に従い、 ZAQ— B 1受容体活性化作用を測定した。 その結果、 目的とする ZAQ— B 1受容体活性 化作用を有する成分は、 主としてフラクション No.73- 75に溶出されていることが 判明した。
(5) TSKg e 1 CM— 2 SWイオン交換高速液体クロマトグラフィーによ る分離
TSKgel CM- 2SWイオン交換高速液体クロマトグラフィー用カラム （東ソ一、 7.8 X300匪） を 25T:にて、 流速 2 ml/minで A液 （4 Mギ酸アンモニゥム：蒸留水：ァ セトニトリル = 1 ： 299 ： 100) 容量 100%、 B液 （4 Mギ酸アンモニゥム：蒸留 水：ァセトニトリル = 1 : 2 : 1) 容量 0%を流し平衡化した。 上記 （4) で得 られた WakosH-II 5C18HG Prep逆相高速液体クロマトグラフィー分取フラクショ ンのうちフラクション No.73-75を凍結乾燥したものを A液 4 mlに溶解し TSKgel CM - 2SWイオン交換カラムに添着した後、 流速 lm l /m i nで 120分間かけて A液容量 25%ZB液容量 75% まで直線的グラジェン卜で上昇させ溶出液を 回収した。 溶出液を 2m 1ずつフラクション番号をつけて分取し、 分取フラクシ ヨンより各 10 1づっを 0.2% BSA 100 1 混合し凍結乾燥機 （12EL； VirTis 社） で凍結乾燥させた。 この乾燥物に上記アツセィバッファー 100 ιι\ を加えて 溶解しこれをさらに同バッファ一で 1 00倍希釈し上記 （3— 5) の試験法に従 い、 ZAQ受容体活性化作用を測定した。 その結果、 目的とする ZAQ受容体活 性化作用を有する成分はフラクション No.95- 100に溶出されていることが判明し た。
(6) TSKg e l 〇D S— 80 T s逆相高速液体クロマトグラフィーによる 精製
TSKgel ODS-80Ts 逆相高速液体クロマトグラフィー用カラム （東ソ一、 4.6 mm X 100 mm) を、 40 にて、 流速 1 m 1 Zm i nで A液 （0.1 % トリフルォロ酢 酸/蒸留水） 容量 91.7%/B液 （0.1% トリフルォロ酢酸 /60% ァセトニトリル） 容量 8.3%を流し平衡化した。 上記 （5) で得られたフラクション No.95-100の凍 結乾燥物についてクロマトグラフィー操作を行った。 即ち、 凍結乾燥物を 1 M酢 酸 4 mlを加えて溶解し当該カラムに添着した後、 流速 lmlZm i nで、 1分間 か^て A液容量 75%/B液容量 25%まで上昇させ、 次いで 60分間かけて A 液容量 25%B液容量 75%まで B液濃度を直線的グラジェントで上昇させ溶出 液を回収した。 溶出液を lm lずつフラクション番号をつけて分取した。 参考例 9に記載した方法に従い Z AQリガンド活性を測定し、 当該活性が単一な紫外吸 収ピークと一致するフラクションに溶出されていることを確認した。 これより Z A Qリガンドが単一に精製されたものと判断した。
(7) 精製された ZAQリガンドペプチドの構造解析
上記 （6) で得られた ZAQリガンドペプチドについて以下の方法で構造決定 を実施した。 ZAQ活性化主成分精製標品中の凍結乾燥機 （12EL ; VirTis社） にて凍結乾燥した。 得られた凍結乾燥物を溶媒 DMS0(ジメチルサルフォキシド）に 溶解した。 この溶液の一部をプロティンシークェンサー（パーキンエルマ一社、 PE Biosystems Procise 491cLC)を用いた N末端からのアミノ酸配列解析に供し た。 その結果、 予想されるヒト方 ZAQリガンドペプチド成熟体 (配列番号： 8 2)と一致する N端アミノ酸配列を得た。 また、 Finnigan LCQ LC/MS装置を用い て、 エレクトロンスプレ一^ fオン化法により質量分析を行い、 分子量が 9658.0で あると算定した。 本測定値はヒト型 ZAQリガンド成熟体べプチド（配列番号： 82)の理論値 9657.3にと良く一致し、 目的とする配列番号： 82で表わされる アミノ酸配列を含有するべプチドが取得できたことが確認された。 参考例 13 へビ毒 M I T 1およびヒト型 Z AQリガンドと Z AQおよび I 5 E との反応性
(1) へビ毒 M I T 1の単離
(1 - 1) Wak o s i 1— I I 5C 18HG P r e p逆相高速液体クロマト グラフィ一による分離
Wakosil-II 5C18HG Prep逆相高速液体クロマトグラフィー用カラム （和光純薬、 20匪 X 250mm) を、 40°Cにて、 流速 5 ml/minで A液 （0.1% トリフルォロ酢酸/蒸 留水） 容量 91.7%/B液 （0.1% トリフルォロ酢酸/ 60% ァセトニ卜リル） 容量 8.3%を流し平衡化した。 Black Mamba毒液 （Sigma社） 凍結乾燥品 50 mgに 1 M AcOH 4 mlを加え溶解し、 15,000 rpmで 10分間遠心して得られた上清についてク 口マトグラフィ一操作を行った。 サンプルを当該カラムに添着した後、 流速 5 ml/minで、 1分間かけて A液容量 91.7%/B液容量 8.3% まで上昇させ、 次いで 120分間かけて A液容量 33.4% B液容量 66.6%まで、 B液濃度を直線的グラジェ ントで上昇させた。 溶出液を 20分後から 10 mlずつフラクション番号をつけて分 取した。 各フラクションから 1 〗を採取し、 前述のアツセィバッファ一で
10,000倍希釈後、 参考例 9の試験法に従い、 ZAQ— B 1受容体活性化作用を測 定した。 その結果、 目的とする ZAQ-B1受容体活性化作用を有する成分は、 主とし てフラクション No.2卜 23に溶出されていることが判明した。
(1 - 2) TSKg e 1 CM— 2 SWイオン交換高速液体クロマトグラフィー による分離
TSKgel CM- 2SWイオン交換高速液体クロマトグラフィー用カラム （東ソ一、 4.6 X250 mm) を 25 にて、 流速 1 ml/minで A液 （4 Mギ酸アンモニゥム：蒸留水： ァセトニトリル = 1 ： 299 ： 100) 容量 100%、 B液 （4 Mギ酸アンモニゥム：蒸 留水：ァセトニトリル = 1 : 2 : 1) 容量 0%を流し平衡化した。 参考例 1 2で 得られた Wakosi卜 II 5C18HG Prep逆相高速液体クロマトグラフィー分取フラクシ ヨンのうちフラクション No.2卜 23を凍結乾燥したものを A液 4 mlに溶解し TSKgel CM- 2SWイオン交換カラムに添着した後、 流速 1 ml/minで 90分間かけて A液容量 0%ZB液容量 100%まで直線的グラジェン卜で上昇させ溶出液を回収した。 溶出 液を 1 mlずつフラクション番号をつけて分取した。 各フラクションから 1 JLL Iを 採取し、 前述のアツセィバッファーで 10， 000倍希釈後、 参考例 9の試験法に従い、 ZAQ- B1受容体活性化作用を測定した。 その結果、 目的とする ZAQ-B1受容体活性化 作用を有する成分は、 主としてフラクション No.50-51に溶出されていることが判 明した。
(1-3) Vyd a e 238TP 3410逆相高速液体クロマトグラフィーによ る分離
Vydac238TP3410逆相高速液体クロマトグラフィー用カラム （Vydac、 4.6mmX 100 mm) を、 40 にて、 流速 1 ml/minで A液 （0.1% トリフルォロ酢酸/蒸留 水） 容量 91.7%/B液 （0. ί% トリフルォロ酢酸/ 60% ァセトニトリル） 容量 8.3%を流し平衡化した。 上記 （1一 2) で得られた TSKgel CM- 2SWイオン交換高 速液体クロマトグラフィー分取フラクションのうちフラクション No.50-51を直接 当該カラムに添着した後、 流速 1 ml/minで、 1分間かけて A液容量 75%/B液容量 25% まで上昇させ、 次いで 75分間かけて A液容量 41.7%B液容量 58.3%まで、 B液濃度を直線的グラジェントで上昇させた。 溶出液を 0.5 mlずつフラクション 番号をつけて分取した。 各フラクションから 1 を採取し、 前述のアツセィバ ッファーで 10, 000倍希釈後、 参考例 9の試験法により、 ZAQ— B 1受容体活性 化作用を測定した。 その結果、 目的とする ZAQ— B 1受容体活性化作用を有す る成分は、 主としてフラクション No.108- 115に溶出されていることが判明した。 (1 -4) 精製されたへビ毒 M I T 1の構造解析
上記 （1— 3) で得られたへビ毒 M I T 1について以下の方法で構造決定を実 施した。 精製した M I T 1を凍結乾燥機 （12EL ; VirTis社） にて凍結乾燥した。 得られたペプチド凍結乾燥物を溶媒 DM SO (ジメチルサルフォキシド） に溶解 した。 この溶液の一部をプロテインシ一クェンサー（パーキンエルマ一社、 PE Biosystems Procise 491cLC)を用いた N末端からのアミノ酸配列解析に供した。 その結果、 予想されるへビ毒 M I T 1 (配列番号： 2 1) と一致する N端ァミノ 酸配列を得た。 また、 Finnigan LCQ LC/MS装置を用いて、 エレクトロンスプレー イオン化法により質量分析を行い、 分子量が 8506.8であると算定した。 本測定値 はへビ毒 M I T 1の理論値 8506.4に良く一致し、 目的とする配列番号： 2 1で表 わされるァミノ酸配列を含有するぺプチドが取得できたことが確認された。
(2) I 5 E安定発現細胞株の樹立
ヒト型 I 5 E受容体 c DNA (配列番号： 6) を公知の P C R法によりクロー ニングし、 pAKKOl.11H発現べクタ一に組み込んだ。 当該発現ベクターを参考例 9 に記載した方法に従い、 CHO/dhFr—細胞 (American Type Culture Collection) に形質導入した。 培養開始 10- 14日後に生育してきた形質転換 CH〇細胞のコロ ニーを約 20個選んだ。 選択した細胞を 3X 個/ wellで 96穴プレートに植え込み、 参考例 9に記載した試験法に従い、 M I T 1に対する反応性を検討した。 反応性 の良い I 5 E発現 CH〇細胞 4番クローン （I 5 E— 4細胞と略称する） を選別 した。 酉列番号： 6で表される塩基配列がコードするアミノ酸配列を配列番号： 52に示す。
(3) ヒト型 ZAQリガンドペプチドおよび M I Τ 1の ZAQ受容体および I 5 Ε受容体活性化作用の根 4定
参考例 12に記載した方法で精製したヒト型 ZAQリガンドペプチド、 及び上 記 （1) に記載した方法で精製したへビ毒 M I Τ 1について、 それらの ZAQ受 容体活性化作用、 及び I 5 Ε受容体活性化作用を参考例 9に記載した方法に従い 測定した。 結果を 〔図 4〕 および 〔図 5〕 に示す。
その結果、 ヒト型 ZAQリガンドペプチドおよびへビ毒 M I Τ 1は濃度依存的 に細胞内カルシウム濃度の上昇を惹起した。 へビ毒 M I Τ 1の Z AQ受容体活性 化作用はヒト型 ZAQリガンドペプチドのそれに比べて 10倍強かった。 また、 へビ毒 M I Τ 1のヒト型 I 5 Ε受容体活性化作用はヒト型 ZAQリガンドぺプチ ドのそれに比べて 100倍程度強いものであった。 参考例 14 大腸菌でのヒト Z A Qリガンド （配列番号： 82) の製造
(1) 大腸菌でのヒト ZAQリガンド発現プラスミドの構築
(a) 6種の DNA断片 # 1〜# 6 (配列番号： 95〜； L 00 ) を用いて、 ZA Qリガンドの構造 DN Aを調製した。
(b)DNAオリゴマーのリン酸化
5 ' 側になるべき上記 # 1および # 6を除いた 4種の DNAオリゴマー （#2
〜# 5) 各々を、 25 lのリン酸化反応液 〔DNAオリゴマー 10 z g, 50m M Tris-HCl, pH7.6, 1 OmM MgCl2, lmMスペルミジン， 1 OmM ジ チオスレィトール （以後 DTTと略記） ， 0. lmgZinlゥシ血清アルブミン （以 後 BSAと略記） ， lmM ATP, 10ユニット T 4ポリヌクレオチドキナ一ゼ (宝酒造） 〕 中で 37で · 1時間反応させ、 各オリゴマーの 5' 末端をリン酸化 した。 フエノール処理を行った後、 2倍量のエタノールを加え、 一 70でに冷却 した後、 遠心で DN Aを沈殿させた。
(c)DN Aフラグメントの連結 上記 （b) で得られた DNAフラグメントと上記 #1および # 6を合わせ、 1 20 w 1とした。 この混合液を 90^で10分間保持した後、 室温まで徐冷しァ ニーリングを行った後、 TaKaRa DNA Ligation Kit ver.2 (宝酒造） を用いてラ ィゲーシヨン反応を行った。 アニーリング液 30 1にキットに付属の I I液 3 0 1を加え、 よく混合した後、 キットに付属の I液 60 1を加え、 37 - 1時間反応させ、 ライゲ一シヨンを行った。 その後、 フエノール処理を行ない、 水層を回収して 2倍量のエタノールを加え、 一 70 に冷却した後、 遠心で DN Aを沈殿させた。 この様にして得られた D N Aフラグメントを T 4ポリヌクレオ チドキナーゼ （宝酒造） によるリン酸化を行った後、 以下の工程（d)に供した。
(d) ZAQリガンド発現ベクターの構築
発現用ベクターとしては PTC I I (特開 2000- 178297号に記載） を Nd e l および BamHI (宝酒造） で 37 · 2時間消化した後、 1 %ァガロースゲル 電気泳動により 4.3kbの DNA断片を QIAquick Gel Extraction Kit (キアゲ ン社） を用いて抽出し、 25 1の TE緩衝液に溶解した。 この pTC I Iの N d e l , B amH I断片と上記により調製した ZAQリガンドの構造遺伝子 （配 列番号： 101) を TaKaRa DNA ligation kit ver.2 (宝酒造） を用いてライゲ ーシヨン反応を行った。 この反応液を 10 1用いて大腸菌 JM 109コンビテ ントセル （東洋紡） を形質転換し、 10 gZm 1のテトラサイクリンを含む L B寒天培地上に播き、 37°Cで 1晚培養し、 生じたテトラサイクリン耐性コロニ 一選んだ。 この形質転換体を LB培地でー晚培養し、 QIAprepS Miniprep Kit (キアゲン社） を用いてプラスミド pTCh 1 Z AQを調製した。 この ZAQリ ガンド DN Aの塩基配列をアプライドバイオシステムズ社モデル 377 DNAシ 一ケンサ一を用いて確認した。 プラスミド pTCh 1 ZAQを大腸菌
(Escherichia col i) MM294 (DE 3) に形質転換し、 ZAQリガンド発現 株 Escherichia coli M294(DE3)/ pTChlZAQを得た。
(2) ZAQリガンドの製造
上記の Escherichia coli MM294(DE3)/ pTChlZAQを 5. Omg/Lのテトラサ イクリンを含む LB培地 · 1 L (1%ペプトン、 0. 5%酵母エキス、 0. 5% 塩化ナトリウム） を用いて 2L容フラスコ中で 37T：、 8時間振とう培養した。 得られた培養液を 19 Lの主発酵培地 （1-68%リン酸 1水素ナトリウム、 0. 3%リン酸 2水素カリウム、 0. 1 %塩化アンモニゥム、 0. 05%塩化ナトリ ゥム、 0. 05%硫酸マグネシウム、 0. 02%消泡剤、 0. 00025 %硫酸 第 1鉄、 0. 0005 %塩酸チアミン、 1. 5%ブドウ糖、 1. 5%ハイケース ァミノ） を仕込んだ 50L容発酵槽へ移植して、 30°Cで通気攪拌を開始した。 培養液の濁度が 500クレツト単位になったところで、 イソプロピル一 /3— D— チォガラクトピラノシドの最終濃度が 12mg/Lになるように添加し、 さらに 4時間培養を行った。 培養終了後、 培養液を遠心分離し、 約 200 gの湿菌体を 取得し、 一 80°Cで保存した。
この形質転換大腸菌 MM294 (DE 3) ZpTCh l ZAQは、 受託番号 I FO卜 6527として財団法人発酵研究所 （I FO) に寄託されている。
(3) ZAQリガンドの活性化
上記 （2) で得られた菌体 200 gに、 20 OmMトリス HC 1、 7Mグァ 二ジン塩酸塩 （pH8. 0) 40 Om 1を加えて菌体を溶解した後、 遠心分離 (10000 r pm、 1時間） を行った。 上澄液に 0. 4Mアルギニン、 50m Mトリス/ HC 1、 0. 2mM GSSG、 1 mM GSH (pH8. 0) 10 リットルを加えて、 4 °Cでー晚活性化を行った。
(4) ZAQリガンドの精製
上記 （3) で活性化の終了した再生液を pH 6. 0に調整し、 50mMリン酸 緩衝液 （pH6. 0) で平衡化した SP—セファロースカラム （1 1. 3 cmX 15 cm) に吸着させた後、 600 mM NaC 1 /50 mMリン酸緩衝液 （p H6. 0) で溶出し、 ZAQリガンドを含むフラクションをプールした。 この画 分を 50mM リン酸緩衝液 （pH 6. 0 ) で平衡化した CM— 5 PW ( 21.5 mmx 15 OmmL) に通液し、 吸着、 洗诤した後、 0— 100%B (B= 5 OmM リン酸緩衝液 + 1M NaCl、 pH 6. 05) の段階勾配 （ 60分） で溶出を行い ZAQリガンド画分 （溶出時間約 40分） を得た。 この画分を、 さらに 0.1% トリフルォロ酢酸で平衡化した C 4 P— 50 (21.5mm I DX 30 OmmL, 昭 和電工） に通液し、 吸着、 洗浄した後、 25— 50%B (B ： 80%ァセトニト リル 0.1 %トリフルォロ酢酸） の段階勾配 （60分） で溶出を行い、 ZAQ リガンド画分 （溶出時間約 40分） をプールした後、 凍結乾燥を行い、 ZAQリ ガンド凍結乾燥粉末約 8 Omgを得た。
(5) ZAQリガンドの特徴決定
(a) SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた分析
上記 （4) で得られた ZAQリガンドを 10 OmM DTTを添加した S am p i e bu f f e r [Laemmli, Nature, 227, 680 (1979)] に懸濁し、 95。C で 1分間加熱した後、 マルチゲル 15ノ 25 (第一化学薬品） で電気泳動を行つ た。 泳動後のゲルをクーマシー ·ブリリアント ·ブルー （Coomassie brilliant blue) で染色した結果、 参考例 10で得られた COS 7細胞由来の組換え型 ZA Qリガンド標品と同じ位置に、 単一の蛋白質バンドが認められた。 このことから. 上記 （4) で得られた大腸菌由来の組換え型 ZAQリガンド標品は極めて高純度 であり、 C〇 S 7細胞から調製した組換え型 Z AQリガンドと分子量的に同一で あることが分かった。
(b) アミノ酸組成分析
アミノ酸組成をアミノ酸分析計 （日立 L— 850 OA Amino Acid
Analyzer) を用いて決定した。 その結果、 ZAQリガンド （配列番号： 82で表 されるァミノ酸配列からなるペプチド） の D N Aの塩基配列から推定されるアミ ノ酸組成と一致した （表 5) 。
0301057
190
〔表 5〕
1モル当たりの ZAQリガンドの塩基配列 アミノ酸 „残 基 数 から予測される値
A s X 5. 7 6
T h r n 3. 3 4
S β r 1) 3. 4 4
G I x 5. 0 5
P r o 5. 6 6
G I y 8
A I a 3. 9 4
C y s 2) N. D. 1 0
V a I 2. 9 3
M e t 1 9 2
I I e 2 6 3
L e u 8 8
T y r 1 0 1
P h e 3 4
H i s 3 8 4
し y s 3 8 4
A r g 8 5 9
丁 r p 0 9, 1
酸加水分解 （ 6 N HC 1 - %フエノール、 110 ：、 24および 48時間 加水分解の平均値）
1) 0時間に外挿した値
2) 未検出
(C) N末端アミノ酸配列分析
N末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサ一 （PEアプライドバイオシ ステムズ モデル 492) を用いて決定した。 その結果、 得られた ZAQリガン ドの D N Aの塩基配列から推定された Z A Qリガンドの N末端アミノ酸配列と - 致した （表 6) 。
〔表 6〕 検出された ZAQリガンドの塩基配列 残基 N 0 PTH-アミノ酸1) から予測される
πιοΙ) アミノ酸
1 A I a (99) A I a
2 V a I (100) V a I
3 I I e (91) I I e
4 T h r (57) T h r
5 G I y (70) G I y
6 A I a (89) A I a
N. D. C y s
8 G I u (60) G I u
9 A r g (49) A r g
1 0 A s (54) A s
1 1 V a I (79) V a I
1 2 G I n (67) G I n
1 3 N. D. C y s
1 4 G I y (54) G I y
1 5 A I a (65) A I a
1 6 G I y (47) G I y
1 7 T h r (32) T h r
1 8 N. D. C y s
1 9 N. D. C y s
20 A I a (36) A I a
1) フェニールチオヒダン卜イン 150 pmo 1 Φ用いて分析 ¾行つた。
N.D. は未検出 示す。 7
192
(d) C末端アミノ酸分析
C末端アミノ酸をアミノ酸分析計 （日立 L一 850 OA Amino Acid
Analyzer) を用いて決定した。 得られた Z AQリガンドは DN Aの塩基配列から 推定された C末端アミノ酸と一致した （表 7) 。
〔表 7〕
C末端アミノ酸 回収率 （％)
Ph e 49. 8
気相ヒドラジン分解法 (100°C, 3. 5時間)
(e) 質量分析
質量分析を nanoESIイオン源を装着した LCQイオントラップ質量分析計 （サーモ クェスト社製） を用いて行った。 その結果、 分子量 9657.55±0.89が得られ、 配 列番号： 82の、 しかも配列番号： 82が含有する 10残基の C y sが 5対のジ スルフィ ド結合を形成した ZAQリガンドの理論分子量（9657.3)と良く一致して いた。
(6) ZAQリガンドの活性測定 （FL I PRを用いた細胞内 Caイオン濃度上 昇活性の測定）
上記 （4) で得られた純化された大腸菌由来の組換え型 ZAQリガンド標品を 参考例 10の方法を用いて、 活性測定 （FL I PRを用いた細胞内 C aイオン濃 度上昇活性の測定） を行った。 その結果、 参考例 10で得られた COS 7細胞由 来の組換え型標品 （ZAQリガンドの精製品） と同等の活性を有していた。 参考例 15 マウス型 ZAQリガンドペプチド cDNAのクローニング
マウス Multiple Tissue cDNA Panel (CLONTECH社) の brainを铸型としてプラ イマ一 mMIT卜 F3 (配列番号： 102) 、 mMITl-R3 (配列番号： 103) 、 mMITl-F4 (配列番号： 104) および mMIT卜 R4 (配列番号： 105) を作成し、 以下に記した PCR反応を実施した。
mMITl-F3: 5' -CTTGGCCTTCTCGGCTTGTCTAG-3' (配列番号： 102) mMITl-R3: 5' -GGTGTAAAGCAAGAGGTCACCCAGT-3' (配列番号： 1 03) mMITl-F4: 5' -ACAAGGCAGCGCAGAAGGAAGT-3' (配列番号： 1 04) mMITl-R4: 5' -GGCTCCAGTACAGAGTCCAGACAA-3' (配列番号： 1 05)
PCR反応液は、 5 OX Advantage-GC 2 Polymerase Mix (CLONTECH社）を 0.6 "1、 添付の 5x Advantage-GC 2 PCR buffer (200 mM Tricine-KOH, 75 mM KOAc, 17.5 mM Mg(0Ac)2, 25% Dimethyl Sulfoxide, 18.75 g/ml BSA, 0.025 Tween-20, 0.025% Nonidet - P40) を 6 し 2.5 mM dNTP mixtureを 2.4 fi 10 ； プライ マー niMIT卜 F3および mMIT卜 R3を各 0· 6 1 、 铸型 DNAを 3 1、 および蒸留水を 16.8 lを混合して作製した。 反応条件は 94 > 3分の初期変性後、 94t>30秒 - 68°C'3分のサイクル反応を 35回、 および 68 >3分の最終伸長反応とした。
続いて、 該 PCR反応の反応液を蒸留水で 50倍に希釈したものをを铸型として nested PCRを行った。 50X Advantage-GC 2 Polymerase Mix (CLONTECH社）を 0.6 K 添付の 5χ Advantage-GC 2 PCR buffer (200 mM Tricine-KOH, 75 mM KOAc, 17.5 mM Mg(0Ac)2, 25% Dimethyl Sulfoxide, 18.75 g/ml BSA, 0.025%Tween- 20, 0.025% Nonidet-P40)を 6 K 2.5 mM dNTP mixtureを 2· 4 K 10 Mプ ライマー niMIT卜 F4および mMin- R4を各 0.6 1 、 铸型 DNAを 3 1、 および蒸留水 を 16.8 ^1を混合して作製した。 反応条件は 94°C' 3分の初期変性後、 94T>30秒- 68°C' 3分のサイクル反応を 35回、 および 68 > 3分の最終伸長反応とした。
得られた DNA断片を TOP0 TA Cloning Kit (Invi trogen社）を用いて添付のマ二 ュアルに記載された方法に従ってクロ一ニングした。 クローニングされた DNA配 列を ABI377DNA sequencerを用いて解読し、 マウス ZAQリガンド全長ペプチドをコ ードする 410 bpの DNA断片 （配列番号： 106) を有するプラスミドを取得し、 これを pMMITと命名した。 また、 該塩基配列からプライマ一により規定される部 分の配列を差し引いた配列を cDNA塩基配列として確定した（配列番号： 1 1 1)。 該プラスミドにより大腸,菌 (Escherichia coli) T0P10をトランスフォームさせ、 大腸菌 TOP 10/pMM I Tと命名した。
この DNA断片の塩基配列を解析した結果、 配列番号： 1 06で表わされる DNA断 片は、 配列番号： 107で表わされるマウス型 ZAQリガンド前駆体ペプチド (105アミノ酸残基） をコードする DNA (配列番号： 108) を含んでいることが 明らかとなった。
また、 配列番号： 1 08で表わされる塩基配列は典型的なシグナル配列を有し ており、 配列番号： 108で表わされる塩基配列を有する DNAは、 配列番号： 1 09で表わされるマウス型 ZAQリガンド成熟体ペプチド （86アミノ酸残基） を コードする 258塩基対からなる DNA (配列番号： 1 10) を含んでいることが明ら かとなつた。 参考例 16 ラット型 ZAQリガンドペプチド c DN Aのクローニング .
ラット脳 QUICK- clone cDNA (CLONTECH社）を铸型として、 degenerateプライマ ― MF1 (配列番号： 1 12)、 MR1 (配列番号： 1 13)、 F2 (配列番号： 1 1 4)およ (配列番号： 1 15)を作成し、 以下に記した PCR反応を実施した。
MF1: 5' -TCACCYCAAGTGAYCATGAGAGG-3' (配列番号： 112)
MR1: 5' -CTAAAARTTGRYRTTCTTCAAGTCC-3' (配列番号： 113)
MF2: 5' -ATCACAGGGGCCTGTGARCG-3' (配列番号： 1 14)
MR2: 5' -AGCAGCGGTACCTGCCGTCC-3' (配列番号： 1 15)
PCR反応液は 50X Advantage 2 Polymerase Mix (CLONTECH社）を 0.6 1、 添付 の 10x Advantage 2 PCR buffer (400 mM Tricine-KOH, 150 mM KOAc, 35 mM Mg(0Ac)2, 37.5 xg/ml BSA, 0.05%Tween-20, 0.05% Nonidet-P40)を 3 1、 dNTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造） を 2.4 n\, 10 / Μプライマ一 MF1および MR1を 0.6 \, 銹型 cDNAを 1 1、 および蒸留水を 20.6 lを混合して作製した 反応条件は 95°C · 1分の初期変性後、 95°C ·30秒- 55°C · 1分- 68 · 1分のサイクル反 応を 35回、 および 68°C' 5分の最終伸長反応とした。
続いて、 該 PCR反応の反応液を蒸留水で 15倍希釈したものを铸型として nested PCRを実施した。 反応液は 50X Advantage 2 Polymerase Mix (CLONTECH社）を 0.6 1、 添付の 10x Advantage 2 PCR buffer (400 mM Tricine-KOH, 150 mM KOAc, 35 mM Mg(0Ac)2) 37.5^g/ml BSA, 0.05 Tween-20, 0.05% Nonidet_P40)を 3 i 1、 dNTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造）を 2.4 K 10 プライマ一 MF1およ び R1を 0.6 K 铸型 cDNAを 1 /1、 および蒸留水を 20.6 1を混合して作製し た。 反応条件は 95t>l分の初期変性後、 95 '30秒-55で'1分-68° '1分のサィク 1057
195 ル反応を 35回、 および 68°C' 5分の最終伸長反応とした。
得られた DNA断片を Zaro Blunt T0P0 PCR Cloning Kit (Invi trogen社）を用い て添付のマニュアルに記載された方法に従ってクローニングした。 クロ一エング された DNA配列を ABI377DNA sequencerを用いて解読し、 配列番号： 1 1 6 (Tタ イブ） および配列番号： 1 1 7 (Cタイプ） で表される部分配列を得た。
上記配列の情報よりプライマ一 RM3- 1 (配列番号： 1 1 8) 、 RM3-2 (配列番 号： 1 1 9) および R 3- 3 (配列番号： 1 20) を作成し、 以下に記した 5' RACE 実験を実施した。
RM3-1: 5'-GTGGCACTCCTCTCCTTCCCGCCCCAGA-3' (配列番号： 1 18) RM3-2： 5'-CAGGCCCCGCAGCCACAGGCTGATAGCA-3' (配列番号： 1 1 9) RM3-3： 5'-AGCAGGTGCCAGCCCCACACTGGACATC-3' (配列番号： 1 20) 5'1^ 5の1^11反応液は5(« Advantage- GC 2 Polymerase Mix (CLONTECH社）を 0· 6 fi 添付の 5x Advantage- GC 2 PCR buffer (200 mM Tricine-KOH, 75 mM KOAc, 17.5 mM Mg(0Ac)2, 25% Dimethyl Sulfoxide, 18.75 ig/ml BSA, 0.025%Tween- 20, 0.025% Nonidet- P40)を 6 1、 dNTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造）を 2· 4 II K 10 iMプライマー RM3- 1を 0.6 1、 10 ； Μプライマ一 API (プライマー API は CLONTECH社の Marathon-Ready cDNA Ki tに添付のもの） を 0.6 ιι , 铸型 cDNA (CLONTECH社、 ラット脳 Marathon- Ready cDNA) を 3 1、 および蒸留水を 16.8 】を混合して作製した。 反応条件は 94°C' 30秒の初期変性後、 94 '5秒-72で'3 分のサイクル反応を 5回、 94°C-5秒- 70 >3分のサイクル反応を 5回、 94°〇'5秒- 68°C'3分のサイクル反応を 25回行った。
続いて、 該 PCR反応の反応液を铸型として nested PCRを実施した。 反応液は 50X Advantage - GC 2 Polymerase Mix (CLONTECH社）を 0.6 1、 添付の 5x Advantage - GC 2 PCR buffer (200 mM Tricine-KOH, 75 mM KOAc, 17.5 mM Mg(0Ac)2, 25% Dimethyl Sulfoxide, 18.75 g/ml BSA, 0.025%Tween-20, 0.025% Nonidet- P40)を 6 \, dNTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造）を 2.4 10 プライマ — RM3-2または RM3- 3を 0.6 \, 10 Mプライマー AP2 (プライマー AP2は
CLONTECH社の Marathon- Ready cDNA Kitに添付のもの） を 0.6 μ. K 錶型 DNA (該 PCR反応液 50倍希釈液） を 3 K および蒸留水を 16.8 ； ΐを混合して作製した。 反応条件は 94°C · 30秒の初期変性後、 94°C · 5秒- 68で · 3分のサイクル反応を 30回行 つた。
得られた DNA断片を T0P0 TA Cloning Kit (Invi trogen社）を用いて添付のマ二 ュアルに記載された方法に従ってクローニングした。 クローニングされた DNA配 列を ABI377DNA sequencerを用いて解読し、 5'端の配列 （配列番号： 121) を 得た。
配列番号： 116および配列番号： 1 17の情報よりプライマー RM5- 1 (配列 番号： 122)と RM5- 4 (配列番号： 123)を作成し、 以下に記した 3' RACE実験 を実施した。
RM5-1: 5'-GGAAGGAGAGGAGTGCCACCCTGGAAG-3' (配列番号： 122) RM5-4: 5'-ACCATACCTGTCCCTGTTCACCCAGCCT-3' (配列番号： 123)
3' RACEの PCR反応液は 50X Advantage- GC 2 Polymerase Mix (CLONTECH社）を 0.6 1、 添付の Advantage - GC 2 PCR buffer (200 mM Tricine-KOH, 75 mM KOAc, 17.5 mM Mg(0Ac)2, 25% Dimethyl Sulfoxide, 18.75 g/ml BSA, 0.025%Tween- 20， 0.025% Nonidet-P40)を 6 dNTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造）を 2.4 K 10 プライマー RM5- 1を 0.6 K 10 ΑίΜプライマー API (プライマ一 API は CLONTECH社の Marathon-Ready cDNA Ki Uこ添付のもの） を 0.6 1、 铸型 cDNA (CLONTECH社、 ラット脳 Marathon - Ready cDNA) を 3 μΑ、 および蒸留水を 16.8 ilを混合して作製した。 反応条件は 94°01分の初期変性後、 94 '30秒-72 '3 分のサイクル反応を 5回、 94°C'30秒- 7(TC'3分のサイクル反応を 5回、 94 >30秒- 68°C' 3分のサイクル反応を 25回、 および 68°C' 3分の最終伸長反応とした。
続いて、 該 PCR反応の反応液を铸型として nested PCRを実施した。 反応液は 50X Advantage- GC 2 Polymerase Mix (CLONTECH社）を 0.6 μ 1, 添付の 5x Advantage- GC 2 PCR buffer (200 mM Tricine-KOH, 75 mM KOAc, 17.5 mM Mg(0Ac)2, 25% Dimethyl Sulfoxide, 18.75 g/ml BSA, 0.025%Tween-20, 0.025% Nonidet- P40)を 6 1、 dNTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造）を 2.4 K 10 zMプライマ 一 RM5- 4または RM3- 3を 0.6 u K 10 Mプライマ一 AP2 (プライマー AP2は
CLONTECH社の Marathon-Ready cDNA Kitに添付のもの) を 0.6 1、 铸型 DNA (該 PCR反応液 50倍希釈液） を 3 および蒸留水を 16.8 1を混合して作製した。 反応条件は 94°C'l分の初期変性後、 94°C'30秒- 68°C'3分のサイクル反応を 35回、 および 68T>3分の最終伸長反応とした。
得られた DNA断片を ΤΟΡ0 TA Cloning Kit (Invi trogen社）を用いて添付のマ二 ュアルに記載された方法に従ってクローニングした。 クロ一ニングされた DNA配 列を ABI377DNA sequencerを用いて解読し、 3'端の配列 （配列番号： 124) を 得た。
ラット脳 QUICK- clone cDNA (CL0NTECH社） またはラット脳 cDNA (Wistar rat) を铸型として 5' RACEおよび 3' RACEの情報よりプライマー RBv8- WFl (配列番号： 1 25)、 BV8-WF2 (配列番号： 126)、 RBv8-WRl (配列番号： 1 27) および RBv8-WR2 (配列番号： 128) を作成し、 以下に記した PCR反応を実施した。
RMIT-WF1: 5 ' -ATTCCAGAGTGGACAGTGTTTGCCTTCACC-3 ' (配列番号： 1 25) RMIT-WF2: 5'-GATCATGAGAGGTGCTGTGCAAGTCTTC-3' (配列番号： 1 26) RMIT-WRl: 5'-CTCTCTGCACGCTGCTGGACTGTTCC-3' (配列番号： 1 27)
RMIT-WR2: 5'-CAGATGTAACACAAGAGGTCACCCAGTAGG-3' (配列番号： 1 28) PCR反応液は PfuTurbo DNA polymerase(Stratagene社）を 0.6 ^1、 添付の 10x PCR bufferを 3 2.5 mM dNTP mixtureを 2.4 \、 10 プライマー RMIT - WFlおよび RMIT-WRlを各】.5 1 、 铸型 DNAを 1 1、 および蒸留水を 20 1を混合 して作製した。 反応条件は 95°C'l分の初期変性後、 95^>30秒-55で'30秒-72で'1 分のサイクル反応を 35回、 および 72 > 5分の最終伸長反応とした。
続いて、 該 PCR反応の反応液を蒸留水で 50倍に希釈したものをを錶型として nested PCRを行った。 PCR反応液は PfuTurbo DNA polymerase (Stratagene社）を 0.6 K 添付の 10χ PCR bufferを 3 fi L 2.5 mM dNTP mixtureを 2.4 /il、 10 Mプライマー RMIT- WF2および RMIT- WR2を各 1.5 fi\ 、 铸型 DNAを 3 1、 および蒸 留水を 18 1を混合して作製した。 反応条件は 95°C'l分の初期変性後、 95°C'30 秒- 55 ·30秒- 72°C'l分のサイクル反応を 35回、 および 72°C ·5分の最終伸長反応 とした。
得られた DNA断片を Zaro Blunt T0P0 PCR Cloning Kit (Invi trogen社）を用い て添付のマニュアルに記載された方法に従ってクローニングした。 クローニング された DNA配列を ABI377DNA sequencerを用いて解読し、 ラット ZAQリガンド全長 ペプチドをコードする 3種の 375bpの DNA断片 （配列番号： 1 29、 配列番号： 1 30および配列番号： 1 3 1 ;塩基置換が起こっているそれぞれをノーマルタイ プ、 Yタイプ、 Qタイプとする） を有するプラスミドを、 pRMIT、 pRMITYおよび pHMITQとそれぞれ命名した。 該プラスミドにより大腸菌 （Escherichia coli) TOP10をトランスフォームさせ、 大腸菌 TOP10/pRMIT、 大腸菌 TOPI 0/pRMITYおよび 大腸菌 TOPlO/pRMITQとそれぞれ命名した。
これらの DNA断片の塩基配列を解析した結果、 配列番号： 1 29で表わされる DNA断片は、 配列番号： 1 32で表わされるラット型 ZAQリガンド前駆体べプ チド（105アミノ酸残基） をコードする DNA (配列番号： 1 33) を含んでいるこ とが、 配列番号： 1 30で表わされる DNA断片は、 配列番号： 1 34で表わされ るラット型 ZAQリガンド前駆体べプチド（105ァミノ酸残基） をコードする DNA (配列番号： 135) を含んでいることが、 配列番号： 1 3 1で表わされる DNA 断片は、 配列番号： 1 36で表わされるラット型 ZAQリガンド前駆体ペプチド (105アミノ酸残基） をコードする DNA (配列番号： 1 37) を含んでいることが 明らかとなった。
また、 配列番号： 1 32、 配列番号： 1 34または配列番号： 1 36で表わさ れる塩基配列は典型的なシグナル配列を有しており、 配列番号： 1 32で表わさ れる塩基配列を有する DNAは、 配列番号： 1 38で表わされるラット型 Z AQリ ガンド成熟体ペプチド （86アミノ酸残基） をコードする 258塩基対からなる DNA (配列番号： 139) を含んでいることが、 配列番号： 1 34で表わされる塩基 配列を有する DNAは、 配列番号： 140で表わされるラット型 ZAQリガンド成 熟体ペプチド （86アミノ酸残基） をコードする 258塩基対からなる DNA (配列番 号： 141) を含んでいることが、 配列番号： 136で表わされる塩基配列を有 する DNAは、 配列番号： 142で表わされるラット型 ZAQリガンド成熟体ぺプ チド （86アミノ酸残基） をコードする 258塩基対からなる DNA (配列番号： 14 3) を含んでいることが明らか.となった。
配列番号： 138のアミノ酸配列において、 配列番号： 140では 46番目の H i sが Ty rに、 配列番号： 142では 36番目の A r gが G 1 nにそれぞれ 置換されている。 産業上の利用可能性
本発明のペプチド、 M I T 1類または本発明の蛋白質、 それらに対する抗体、 および本発明のぺプチドまたは本発明の蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、 血管新生阻害剤を得るための簡便な探索法 （スクリーニング） に有用である。 特 に、 本発明の蛋白質のアンタゴニストは、 優れた血管新生阻害剤として有用であ る。 また、 本発明のスクリーニング方法は、 哺乳動物由来の内皮細胞を用いて行 うことにより、 より生理的な条件下での血管新生阻害剤のスクリーニングが可能 となる。
さらに、 本発明の蛋白質、 本発明の D NA、 本発明のアンチセンス D N Aおよ び本発明の抗体は、 （i) 本発明の蛋白質が関与する各種疾病の予防 ·治療剤、
(i i) 本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物または その塩のスクリーニング、 （i i i ) 本発明の蛋白質の定量、 （iv) 遺伝子診断薬、 (V) アンチセンス D NAを含有する医薬、 （vi) 本発明の抗体を含有する医薬 および診断薬、 （vi i) 本発明の D N Aを有する非ヒト動物の作製、 （vi i i) 構 造的に類似したリガンド ·レセプターとの比較にもとづいたドラッグデザインな どの実施のために有用である。 特に、 本発明の組換え蛋白質の発現系を用いたレ セプター結合アツセィ系を用いることによって、 ヒトゃ哺乳動物に特異的な本発 明の蛋白質に対するリガンドの結合性を変化させる化合物 （例、 ァゴニスト、 ァ ンタゴ二ストなど） をスクリーニングすることができ、 該ァゴ二ストまたはアン 夕ゴニストを各種疾病、 例えば血管新生を伴う疾患 〔例、 癌 （例、 fl萃臓癌、 肺癌、 腎臓癌、 肝臓癌、 非小細胞肺癌、 卵巣癌、 前立腺癌、 胃癌、 膀胱癌、 乳癌、 子宮 頸部癌、 結腸癌、 直腸癌、 力ポジ肉腫など） 、 卵巣疾患 （例、 多嚢胞性卵巣症候 群 （卵巣多嚢胞症） 、 卵巣過剰刺激症など） 、 炎症性疾患 （例、 関節リューマチ など） 、 糖尿病性網膜症など〕 等の予防 ·治療剤などとして安全に使用すること ができる。

Claims

請求 の 範 囲
1. 配列番号： 8 1、 配列番号： 82、 配列番号： 109、 配列番号： 1 38 配列番号： 1 9もしくは配列番号： 39で表わされるアミノ酸配列と同一または 実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩の活性を阻害する 化合物またはその塩を含有してなる血管新生阻害剤。
2. 配列番号： 1、 配列番号： 44、 配列番号： 5 1、 配列番号： 52、 配列 番号： 53、 配列番号： 54、 配列番号： 1 7 1もしくは配列番号： 1 73で表 わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白 質またはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる血管新生阻 害剤。
3. (a) 配列番号： 2 1、 配列番号： 81、 配列番号： 82、 配列番号： 1 09、 配列番号： 1 38、 配列番号： 1 9もしくは配列番号： 39で表わされる アミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するべプチドまた はその塩と （b) 配列番号： 1、 配列番号： 44、 配列番号： 51、 配列番号： 52、 配列番号： 53、 配列番号： 54、 配列番号： 1 7 1もしくは配列番号： 1 7 3で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含 有する蛋白質またはその塩との結合を阻害する化合物またはその塩を含有してな る血管新生阻害剤。
4. 配列番号： 2 1、 配列番号： 8 1、 配列番号： 82、 配列番号： 1 09、 配列番号： 1 38、 配列番号： 19もしくは配列番号： 39で表わされるァミノ 酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその 塩の、 配列番号： 1、 配列番号： 44、 配列番号： 51、 配列番号： 52、 配列 番号： 53、 配列番号： 54、 配列番号： 1 7 1もしくは配列番号： 1 Ί 3で表 わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白 質またはその塩の活性化作用を阻害する化合物またはその塩を含有してなる血管 新生阻害剤。
5. 配列番号： 8 1、 配列番号： 82、 配列番号： 1 09、 配列番号： 1 38， 配列番号： 19もしくは配列番号： 39で表わされるアミノ酸配列と同一または 実質的に同一のァミノ酸配列を含有するぺプチドまたはその部分べプチドをコ一 ドする DN Aの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその 一部を含有するァンチセンスヌクレオチドを含有してなる血管新生阻害剤。
6. 配列番号： 81、 配列番号： 82、 配列番号： 109、 配列番号： 138、 配列番号： 19もしくは配列番号： 39で表わされるアミノ酸配列と同一または 実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその部分ペプチドまたは その塩に対する抗体を含有してなる血管新生阻害剤。
7. 配列番号： 1、 配列番号： 44、 配列番号： 51、 配列番号： 52、 配列 番号： 53、 配列番号： 54、 配列番号： 171もしくは配列番号： 173で表 わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白 質またはその部分べプチドをコードする DN Aの塩基配列に相補的もしくは実質 的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスヌクレオチドを含 有してなる血管新生阻害剤。
8. 配列番号： 1、 配列番号： 44、 配列番号： 51、 配列番号： 52、 配列 番号： 53、 配列番号： 54、 配列番号： 171もしくは配列番号： 173で表 わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白 質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる血管新生阻
9. 癌、 多嚢胞性卵巣症候群または卵巣過剰刺激症候群の予防 ·治療剤である 請求項 1〜 8記載のいずれかの血管新生阻害剤。
10. (a) 配列番号： 81、 配列番号： 82、 配列番号： 109、 配列番 号： 138、 配列番号： 19もしくは配列番号： 39で表わされるアミノ酸配列 と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩をコ —ドするポリヌクレオチド、 または （b) 配列番号： 1、 配列番号： 44、 配列 番号： 51、 配列番号： 52、 配列番号： 53、 配列番号： 54、 配列番号： 1 71もしくは配列番号： 173で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に 同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩をコードするポリヌクレオチ ドを含有してなる癌、 多嚢胞性卵巣症候群または卵巣過剰刺激症候群の診断薬。
1 1. 内皮細胞を用いることを特徴とする、 配列番号： 1、 配列番号： 44、 配列番号： 51、 配列番号： 52、 配列番号： 53、 配列番号： 54、 配列番 号： 171もしくは配列番号： 173で表わされるアミノ酸配列と同一または実 質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩の活性を阻害する化合 物またはその塩のスクリーニング方法。
12. 請求項 1 1記載のスクリーニング方法で得られる化合物またはその塩を 含有してなる血管新生阻害剤。
13. (a) 配列番号： 2 1、 配列番号： 81、 配列番号： 82、 配列番号：
109、 配列番号： 138、 配列番号： 19もしくは配列番号： 39で表わされ るァミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ酸配列を含有するぺプチドま たはその塩、 および （または） （b) 配列番号： 1、 配列番号： 44、 配列番 号： 51、 配列番号： 52、 配列番号： 53、 配列番号： 54、 配列番号： 17
1もしくは配列番号： 173で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同 一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩を用いることを特徴とする血管 新生阻害剤のスクリーニング方法。
14. (a) 配列番号： 21、 配列番号： 81、 配列番号： 82、 配列番号：
109、 配列番号： 138、 配列番号： 19もしくは配列番号： 39で表わされ るアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ酸配列を含有するぺプチドま たはその塩、 および （または） （b) 配列番号： 1、 配列番号： 44、 配列番 号： 51、 配列番号： 52、 配列番号： 53、 配列番号： 54、 配列番号： 17 1もしくは配列番号： 173で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同 一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩を含有することを特徴とする血 管新生阻害剤のスクリーニング用キット。
15. (a) 配列番号： 81、 配列番号： 82、 配列番号： 109、 配列番 号： 138、 配列番号： 19もしくは配列番号： 39で表わされるアミノ酸配列 と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩をコ ードするポリヌクレオチド、 および （または） （b) 配列番号： 1、 配列番号： 44、 配列番号： 51、 配列番号： 52、 配列番号： 53、 配列番号： 54、 配 列番号： 171もしくは配列番号： 173で表わされるアミノ酸配列と同一また は実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩をコードするポリ ヌクレオチドを用いることを特徴とする血管新生阻害剤のスクリ一ニング方法。
16. (a) 配列番号： 21、 配列番号： 81、 配列番号： 82、 配列番号： 109、 配列番号： 138、 配列番号： 19もしくは配列番号： 39で表わされ るアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ酸配列を含有するぺプチドま たはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、 および （または） （b) 配列 番号： 1、 配列番号： 44、 配列番号： 51、 配列番号： 52、 配列番号： 53 配列番号： 54、 配列番号： 171もしくは配列番号： 173で表わされるアミ ノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその 部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を用いることを特徴とする血管新生阻害 剤のスクリーニング方法。
17. 請求項 13、 15もしくは 16記載のスクリーニング方法または請求項 14記載のスクリーニング用キットを用いて得られる血管新生阻害剤。
18. 内皮細胞増殖阻害作用を有する化合物またはその塩を含有してなる血管 新生阻害剤。
19. 配列番号： 171もしくは配列番号： 137で表わされるアミノ酸配列 と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とする蛋白質ま たはその塩。
20. 配列番号： 171で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質またはその
21 配列番号： 137で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質またはその
22 請求項 19記載の蛋白質の部分ペプチドまたはその塩。
23 請求項 19記載の蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリ ヌクレオチド。
24. DN Aである請求項 23記載のポリヌクレオチド。
25. 配列番号： 172または配列番号： 174で表される塩基配列からなる ポリヌクレオチド。
26. 請求項 24記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
27. 請求項 26記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
28. 請求項 27記載の形質転換体を培養し、 請求項 19記載の蛋白質を生 成 ·蓄積せしめることを特徴とする請求項 19記載の蛋白質またはその塩の製造 法。
29. 請求項 19記載の蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対す る抗体。
30. 請求項 29記載の抗体を含有してなる医薬。
31. 請求項 29記載の抗体を含有してなる診断薬。
32. 請求項 19記載の蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用い ることを特徴とする、 請求項 19記載の蛋白質またはその塩の活性を促進または 阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
33. 請求項 19記載の蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有 することを特徴とする、 請求項 19記載の蛋白質またはその塩の活性を促進また は阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
34. 請求項 32記載のスクリーニング方法または請求項 33記載のスクリー ニング用キットを用いて得られる、 請求項 19記載の蛋白質またはその塩の活性 を促進または阻害する化合物またはその塩。
35. 請求項 34記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。
36. 哺乳動物に対して、 配列番号： 1、 配列番号： 44、 配列番号： 51、 配列番号： 52、 配列番号： 53、 配列番号： 54、 配列番号： 171もしくは 配列番号： 173で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ 酸配列を含有する蛋白質またはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の有 効量を投与することを特徴とする血管新生阻害方法。
37. 血管新生阻害剤を製造するための、 配列番号： 1、 配列番号： 44、 配 列番号： 51、 配列番号： 52、 配列番号： 53、 配列番号： 54、 配列番号： 171もしくは配列番号： 173で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的 に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩の活性を阻害する化合物ま たはその塩の使用。
38. 哺乳動物に対して、 配列番号： 1、 配列番号： 44、 配列番号： 51、 配列番号： 52、 配列番号： 53、 配列番号： 54、 配列番号： 171もしくは 配列番号： 1 7 3で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ 酸配列を含有する蛋白質またはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の有 効量を投与することを特徴とする癌、 多嚢胞性卵巣症候群または卵巣過剰刺激症 候群の予防 ·治療方法。
3 9 . 癌、 多嚢胞性卵巣症候群または卵巣過剰刺激症候群の予防 ·治療剤を製 造するための、 配列番号： 1、 配列番号： 4 4、 配列番号： 5 1、 配列番号： 5 2、 配列番号： 5 3、 配列番号： 5 4、 配列番号： 1 7 1もしくは配列番号： 1 7 3で表わされるァミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ酸配列を含有 する蛋白質またはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の使用。
PCT/JP2003/001057 2002-02-04 2003-02-03 Inhibiteurs d'angiogenese Ceased WO2003066860A1 (fr)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10/503,554 US20050176632A1 (en) 2002-02-04 2003-02-03 Angiogenesis inhibitors
EP03737460A EP1473365A1 (en) 2002-02-04 2003-02-03 Angiogenesis inhibitors
AU2003244347A AU2003244347A1 (en) 2002-02-04 2003-02-03 Angiogenesis inhibitors

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2002027299 2002-02-04
JP2002-27299 2002-02-04

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2003066860A1 true WO2003066860A1 (fr) 2003-08-14

Family

ID=27677838

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2003/001057 Ceased WO2003066860A1 (fr) 2002-02-04 2003-02-03 Inhibiteurs d'angiogenese

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20050176632A1 (ja)
EP (1) EP1473365A1 (ja)
AU (1) AU2003244347A1 (ja)
WO (1) WO2003066860A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7662380B2 (en) 2003-01-22 2010-02-16 Takeda Pharmaceutical Company Limited ZAQ ligand-1 antibodies and uses thereof

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070286845A1 (en) * 2000-11-17 2007-12-13 Vascular Biogenics Ltd. Promoters exhibiting endothelial cell specificity and methods of using same for regulation of angiogenesis
CN101137390B (zh) * 2005-01-05 2013-03-27 盐野义制药株式会社 新型血管生成抑制因子
US20140303001A1 (en) * 2013-03-14 2014-10-09 Myriad Genetics, Inc. Bladder cancer detection and monitoring
CN111575276A (zh) * 2020-05-26 2020-08-25 湖北科技学院 一种分泌表达重组前动力蛋白2的生产方法
CN113185595B (zh) * 2020-12-11 2023-05-09 兆科（广州）眼科药物有限公司 一种具有抑制新生血管生长及抑制炎症反应活性的蛋白质及其制备方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001016309A1 (fr) * 1999-08-27 2001-03-08 Takeda Chemical Industries, Ltd. Proteine recepteur couplee a une proteine g et adn correspondant
WO2001057190A2 (en) * 2000-02-03 2001-08-09 Hyseq, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
WO2002006483A1 (fr) * 2000-07-18 2002-01-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Nouveau peptide actif sur le plan physiologique et utilisation associee

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5985602A (en) * 1996-08-14 1999-11-16 Genetics Institute, Inc. Secreted proteins and polynucleotides encoding them
US20010014737A1 (en) * 1997-09-24 2001-08-16 Dirk Heerding Vitronectin receptor antagonist

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001016309A1 (fr) * 1999-08-27 2001-03-08 Takeda Chemical Industries, Ltd. Proteine recepteur couplee a une proteine g et adn correspondant
WO2001057190A2 (en) * 2000-02-03 2001-08-09 Hyseq, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
WO2002006483A1 (fr) * 2000-07-18 2002-01-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Nouveau peptide actif sur le plan physiologique et utilisation associee

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7662380B2 (en) 2003-01-22 2010-02-16 Takeda Pharmaceutical Company Limited ZAQ ligand-1 antibodies and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
AU2003244347A1 (en) 2003-09-02
US20050176632A1 (en) 2005-08-11
EP1473365A1 (en) 2004-11-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7045299B2 (en) Physiologically active peptide and use thereof
JP2000312590A (ja) 新規ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質、そのｄｎａおよびそのリガンド
JP4841054B2 (ja) 新規インスリン／ｉｇｆ／リラキシンファミリーポリペプチドおよびそのｄｎａ
WO2001057524A1 (fr) Procede de criblage
US20050176632A1 (en) Angiogenesis inhibitors
WO2010147117A1 (ja) ペプチドおよびその用途
JPWO2006118328A1 (ja) 脱顆粒抑制剤
JP4772684B2 (ja) スクリーニング方法
JP4965776B2 (ja) 新規生理活性ペプチドおよびその用途
JP2003292455A (ja) 血管新生阻害剤
JP4128030B2 (ja) 新規リガンドおよびそのｄｎａ
JP4637378B2 (ja) スクリーニング方法
JP2000175691A (ja) 新規ｇ蛋白質共役型レセプタ―蛋白質およびそのｄｎａ
JP2001309792A (ja) スクリーニング方法
JP4535670B2 (ja) 新規ポリペプチド、そのｄｎａおよびそれらの用途
JP2002095474A (ja) 新規ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質およびそのｄｎａ
JP2004292361A (ja) 摂食調節剤
JP2001340094A (ja) 新規蛋白質、そのｄｎａおよびその製造法
JP2003116582A (ja) 新規生理活性ペプチドおよびその用途
JP2004051622A (ja) 新規リガンドおよびそのｄｎａ
JP2002238584A (ja) 新規ｍａｓレセプター類似蛋白質およびそのＤＮＡ
JP2003177127A (ja) Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の用途
JP2004073179A (ja) 新規タンパク質、そのｄｎａおよび用途
JP2003174888A (ja) 新規生理活性ペプチドおよびその用途
JP2004115394A (ja) 免疫疾患予防・治療剤

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NO NZ OM PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PT SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2003737460

Country of ref document: EP

Ref document number: 10503554

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2003737460

Country of ref document: EP

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 2003737460

Country of ref document: EP