WO2003066863A1 - Gene reductase d'un compose carbonyle alpha-substitue-alpha, beta-insature - Google Patents

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Harumi Kamachi
Nobuyoshi Esaki
Tatsuo Kurihara
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    • C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
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    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters

Definitions

  • the present invention relates to an ⁇ -substituted mono- ⁇ , ⁇ -unsaturated carbonyl compound reductase gene and an enzyme which is a product thereof. More specifically, the genus Acetobacter cetobacter, the genus Actinomyces, the genus Acinetobacter., The genus Agrobacterium, the genus Aeromonas, the genus Alcaligenes, Genus Arthrob acter, genus Azotobacter, genus Bacillus, genus Brevibacteriutn, genus Burkholderia, genus Cellulomonas, Corynebacterium Genus, genus Enterobacter, genus Enterococcus, genus Escherichia, genus Flavobacterium, genus Gluconobacter, genus Halobacterium S (Halococcus), Klebsiel la, Genus Lactobaci l lus, genus Microbacterium, genus
  • the present invention relates to the gene for a reductase of a chemical compound and an enzyme which is a product thereof.
  • microorganisms of the genus Pseudomonas or Burk holderia in particular, Pseudomonas sp. Strain SD810 (Pseudomonas sp. SD810), Pseudomonas sp. SD811 strain (Pseudoraonas sp. ⁇ -substituted monoa having the above activity derived from Pseudomonas sp. SD812 strain (Pseudomonas sp. SD812) and Burkholderia 'SP' SD816 strain (Burkholderia sp. SD816). , ⁇ -unsaturated carbonyl compound reductase gene and its product enzyme.
  • the present invention relates to a monosubstituted reporter compound having an ⁇ , —carbon ′ carbon double bond, which is a prochiral molecule at the ⁇ -position.
  • the present invention relates to a reductase useful for producing an ⁇ -substituted-a,] 3-saturated carbonyl compound optically active at the corresponding ⁇ -position and an enzyme which is a product thereof.
  • This novel enzyme gene and its product, the enzyme are optically active carbohydrate compounds such as saturated carboxylic acid amides having various optical activities (the absolute configuration of the position becomes S-form or R-form depending on the substituent). It can be used in the manufacturing field. Optically active carbonyl compounds are valuable chiral building blocks that are difficult to prepare by classical chemical processes, and are particularly useful as raw materials for pharmaceuticals and pesticides. Conventional technology
  • the present invention provides an a-substitution force having an a, i3-carbon.carbon double bond.
  • the carbon-carbon double bond of a luponyl compound is reduced using a microorganism to form a corresponding a-substituted a, ⁇ -substituted compound. It is an object to provide a catalytic enzyme useful for producing a saturated carbonyl compound and a gene thereof.
  • the present inventors have reduced the carbon-carbon double bond of an a-substituted carbonyl compound having an ⁇ , ⁇ monocarbon-carbon double bond to form a corresponding a-substituted mono-a, ⁇ monosaturated liponyl compound. Surprisingly, it has been found by thorough screening from soil that the resulting microorganisms are distributed over a relatively large number of aerobic or facultative aerobic bacteria. No. 2,248,211).
  • the present inventors have succeeded in establishing a method for producing an optically active ⁇ -substituted mono-, ⁇ -saturated carbonyl compound using these active microorganisms.
  • the present inventors have succeeded in identifying the catalytic enzyme, elucidating the mechanism of action, and obtaining a highly active organism, and leading to the present invention.
  • the present invention relates to the following reductase gene, plasmid, transformant, protein, a method for producing a gene encoding the protein, and a 0-unsaturated Rupoel compound reductase gene.
  • a child consisting of soybean DNA.
  • DNA comprising a base sequence represented by SEQ ID NO: 17 or a DNA encoding a protein having a reducing activity of a monosubstituted mono- ⁇ , ⁇ -unsaturated carbonyl compound, or under a stringent condition with said DNA.
  • Gene consisting of hybridizing DN DN.
  • a DNA encoding a protein having a reducing activity of a mono-substituted mono- ⁇ , ⁇ -unsaturated carbonyl compound which is hybridized with the DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 18 or the DNA under stringent conditions Characterized by comprising a DNA sequence encoding an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 and an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21. Reductase gene for monounsaturated carbon compounds.
  • the ⁇ , j3 _ unsaturated carbonyl compound reductase gene is a gene belonging to the genus Acetobacter, the genus Actinomyces, the genus Acinetobacter, the genus Agrobacterium Genus, Aeromonas, Alcaligenes, Arthrobacter, Azotobacter, Bacillus, Brevibacterium, Birchholdelier (Burkho lderia), Cellulomonas, Corynebacterium, Enterobacter, Enterococcus, Escherichia, Flavonocterium (Gluconobacter), Halococcus (Halococcus) ), Genus Klebsiella, genus Lactobacillus, genus Microbacteri un, genus Micrococcus, genus Micropolyspora 1, genus Micropolyspor, genus Mycobacterium Genus Nocardia, genus Pseudomonas (genus Pseudomonas J ⁇
  • reductase according to any one of the above items 1 to 13, wherein the reductase has a catalytic activity of generating an S-form compound in which the ⁇ -position is chiral by reduction of a carbon double bond.
  • Reductase gene for monosubstituted ⁇ , ⁇ -unsaturated carbonyls.
  • ⁇ -Substituted i, i3-unsaturated carbonyl compound is represented by the following general formula (1)
  • I 1 , R 2 , and R 3 independently represent a hydrogen atom, a halogen atom, a linear or branched aliphatic hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms, a linear or branched chain having 1 to 6 carbon atoms, Represents a branched alkoxy group, a hydroxyl group, a carboxyl group, an aromatic group which may be substituted or a nitrogen-containing, oxygen-containing or sulfur-containing heterocyclic group, wherein R 4 is a hydroxyl group, a straight chain having 1 to 3 carbon atoms.
  • R 3 is not a hydrogen atom, and is a compound represented by the following general formula (2):
  • the ⁇ -substituted mono ⁇ , —unsaturated carbon compound is represented by the following general formula (1)
  • a plasmid comprising the ⁇ -substituted mono- and ⁇ -unsaturated carbonyl compound reductase gene DN ⁇ according to any one of 1 to 19 above.
  • the reducing activity of the mono-substituted mono- ⁇ , mono-unsaturated luponyl compound which is an expression product of the mono-substituted mono-, ⁇ -unsaturated carbonyl compound reductase gene according to any of the above items 1 to 19 Or a protein comprising An ⁇ -substituted protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added, and having the activity of reducing ⁇ , ⁇ -unsaturated carbonyl compounds.
  • a base sequence selected from the base sequence upstream of the 631st base and a base sequence selected from the base sequence downstream of the 224th base A method for producing a gene encoding a protein having a reducing activity of a substituted mono- ⁇ , mono-unsaturated carbonyl compound, comprising using a primer obtained by combining the base sequences thus obtained with each other so as to have a reverse chain relationship.
  • FIG. 1 is a graph showing the difference in the reaction curve of Pseudomonas sp.
  • FIG. 2 is a graph showing a difference in a reaction curve of the Burkholderia 'SP-SD816 strain due to a cultured carbon source.
  • FIG. 3 shows the results of two-dimensional electrophoresis comparing the differences in the protein produced by the cultured carbon source of Burkholderia sp.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing the positional relationship between the CAA43 gene and the CAA67 gene, and the position of each DNA fragment (SEQ ID NO: described as No.).
  • FIG. 5 is a schematic diagram showing the design of a vector for asymmetric reductase gene expression.
  • the ⁇ -substituted mono-, ⁇ - ⁇ -unsaturated carbonyl compound reductase gene and the enzyme which is a product thereof are selected from the group consisting of Acetobacter, Acinomynomyces, Acinetobacter, and Acinetobacter.
  • It is preferably derived from a microorganism of the genus Pseudomonas or the genus Burk holderia.
  • a strain having an activity of reducing an ⁇ , ⁇ -carbon-carbon double bond of an ⁇ -substituted carbonyl compound having an ⁇ ,] 3-carbon ′ carbon double bond is particularly preferable.
  • Pseudomonas 'SP' SD811 strain or Burkholderia SP8 SD816 strain is particularly preferably used.
  • Pseudomonas sp. SD810 strain, Pseudomonas sp.SP81 SD81 strain, Pseudomonas' SP ⁇ SD812 strain or Burkholderia sp. SD816 strain, etc. were isolated from soil It has the ability to decompose and assimilate various types of luponyl compounds.
  • pseudomonas ⁇ SP ⁇ SD810 shares, pseudomonas sp. P. SD 811 strain and Pseudomonas sp. SD SD 812 strains were obtained from Nippon Life Science Bacteria No. BP-6767 (FERM BP-6767) [FERM BP-6767], respectively. Transfer], BF-6768 (FERM BP-6768) [FERM BP-6768] [Transferred from FERM 16747] and BP-6769 (FERM BP-6767) Transferred from Nippon Life Science No. 16748 (FERM B P-6769)], and Burke Holderia SP ⁇ SD 816 strain was designated as Life Science Industry No. BP-6770 (FERM BP-6770). Deposited at the Technical Research Institute.
  • JP-A-10-224821 For such separation and culture, a method and the like described in detail in JP-A-10-224821 can be used.
  • the reducing activity of the active microorganisms may differ depending on the culture conditions. That is, the cells are shown when cultured using a reducing substrate, ⁇ -substitution force having a single carbon 'carbon double bond, as a carbon source, and when cultured using a common carbon source such as saccharides. —Reduction activity of carbon-carbon double bonds is different, and cells cultured with a reducing substrate as a carbon source may show high reduction activity from the beginning of the reaction. This suggests that some or all of the reductase is induced by the reducing substrate, and by analyzing this difference, the reductase can be identified.
  • General formula (1) is used as a carbon source for culturing to obtain cells with high reducing activity.
  • RR 2 is independently a hydrogen atom, a halogen atom, a linear or branched aliphatic carbon having 1 to 6 carbon atoms. Hydride group, linear or branched alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, hydroxyl group, carboxyl group, aromatic group which may be substituted or saturated or unsaturated nitrogen-containing, oxygen-containing or sulfur-containing heterocyclic ring Represents a group.
  • Preferred RR 2 includes a hydrogen atom.
  • R 3 is a halogen atom, a linear or branched aliphatic hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms, a linear or branched alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, a hydroxyl group, a carboxyl group, Represents an aromatic group or a saturated or unsaturated nitrogen-containing, oxygen-containing or sulfur-containing heterocyclic group.
  • Preferred examples of R 3 include a halogen atom, particularly a chlorine atom and a bromine atom.
  • R 4 represents a hydroxyl group, a linear or branched alkoxy group having 1 to 4 carbon atoms, or a primary to tertiary amino group. Preferred examples of R 4 include a hydroxyl group.
  • ⁇ -cloacrylic acid, ⁇ -promoacrylic acid, 2-chloro-1-butenoic acid, 2-bromo-1-butenoic acid, 2-chloro-1-pentenoic acid, 2-promoic acid examples thereof include 2-pentenoic acid, methynoleestenol, ethynoleestenol, and the like, and preferred are ⁇ -mouth acrylic acid and ⁇ -bromoacrylic acid.
  • the inorganic salt medium used for ordinary bacteria e.g., (NH 4) 2 SO 4 2gZL, N a H 2 P0 4 l gZL, K 2 HP0 4 lg / L, Mg S 0 4 0. lg / L, Yeast extract (0.5 g / L) and a, ⁇ -unsaturated carbonyl compound having a substituent at the ⁇ -position, such as ⁇ -chloroacrylic acid, added with 2 gZL as a substantially sole carbon source.
  • the strain is inoculated into 5 mL and shake-cultured at 28 ° C for 12 to 72 hours, cells with high reducing activity can be obtained.
  • the protein whose production is increased in cells cultured using a reducing substrate is separated, and the enzyme can be identified by measuring its activity.
  • these enzymes have low stability in the state of a cell-free extract, and their activity is lost relatively quickly, so that it is often difficult to separate and identify them. This is one of the reasons why the study of enzymes belonging to this group has been delayed compared to other stable enzymes. In such cases, it may be possible to maintain the activity by performing separation work under a nitrogen atmosphere, etc., but first clarify the partial sequence of the protein and clone the gene using the DNA base sequence deduced from the partial sequence as a probe However, it is effective to express the gene and obtain a significant amount of the protein, and then analyze the activity and the like.
  • the reductase gene of the present invention can be easily obtained by using a DNA probe prepared in this manner by an ordinary method such as Southern hybridization used in genetic engineering. That is, DNA (including a chromosome and a plasmid if it has a plasmid) extracted from the microorganism is appropriately used. A fragment labeled with an identifiable label was hybridized (DNA and DNA) to the fragment transferred to a nitrocellulose membrane after fragmentation by fragmentation with a restriction enzyme, size separation by agarose gel electrophoresis, or the like. A fragment that specifically hybridizes with the probe, that is, the target gene, by forming a double strand between the NAs when their base sequence is highly complementary, also called pairing) Can be obtained. At this time, a partial fragment in which the gene is cleaved in the middle may be obtained.However, the same detection is performed by changing the type of restriction enzyme, or the previously obtained partial fragment is used as a probe. The whole gene can be obtained.
  • the optimal conditions differ depending on the length of the DNA to be hybridized, but a sufficiently specific hybridization result is not obtained.
  • the resulting stringent conditions are about 40 ° C. to 70 ° C., preferably 47 ° C. to 60 ° C., in the usual salt concentration range of the hybridization solution.
  • the genes of the reductase group of the present invention can be easily obtained by preparing primers that hybridize at appropriate positions of the genes and their peripheral sequences, and by carrying out the polymerase chain reaction (PCR) using the above-mentioned microbial DNA as type III. be able to.
  • PCR polymerase chain reaction
  • a primer is a fragment that can be used as a starting point for DNA synthesis by hybridizing to a DNA chain to be copied.
  • the enzymatic synthesis of DNA proceeds at the beginning of DNA replication because the DNA polymerase proceeds in the form of a diester liponucleotide diester bond to the 3,10H portion of the primer hybridized to type I DNA. Requires a primer.
  • Primers are also used in the polymerase chain reaction (PCR), and the choice of primers determines whether the desired DNA can be copied correctly and efficiently.
  • the primer that can be used in the present invention is the reductase gene of the present invention.
  • the primer there is no particular limitation as long as it can be used as a starting point for DNA synthesis by hybridizing to its surrounding sequence.For example, the degree of sequence complementarity of the fragment, the length of the fragment, There is no restriction on modification to the fragment.
  • a primer containing an adapter sequence for connecting the generated fragment to a plasmid, a primer modified with a fluorescent substance that facilitates detection of the generated gene fragment, and the like can be freely designed and used according to the purpose.
  • One set of primers useful for obtaining genes of the reductase group useful in the present invention is the base sequence shown in SEQ ID NO: 19, which is the first base of the start codon of the upstream gene, 63 1 Combination of one containing the sequence upstream of the 3rd base and the other containing the sequence downstream of the 3rd base 3 5 4 3 It is a thing.
  • Another useful set of primers includes one of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 19, which contains the sequence upstream of the 631st base which is the first base of the start codon of the upstream gene.
  • Another pair of primers that are more useful is one containing the sequence upstream of the second nucleotide, which is the first base of the initiation codon of the downstream gene, of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 19.
  • One is a combination of the other one containing a sequence downstream of the third base 354, which is the third base of the downstream gene termination codon, so that they have a reverse chain relationship to each other.
  • a DNA fragment containing either the entire gene group, the upstream gene, or the downstream gene can be obtained.
  • a set of primers obtained by combining 10 to 10 nucleotide sequences at both ends of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17 so as to have a reverse chain relationship with each other is also useful.
  • a DNA corresponding to the base sequence represented by SEQ ID NO: 17 can be prepared, and a gene corresponding to the downstream gene of the present invention can be prepared.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 18 It is also useful to use a set of primers in which 10 to 10 nucleotide sequences at both ends of the sequence are combined so as to have a reverse-chain relationship to each other.
  • a DNA corresponding to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 18 can be prepared, and a gene corresponding to the upstream gene of the present invention can be prepared.
  • the reaction conditions are not limited as long as the product obtained by the DNA synthesis reaction is obtained, but the denaturation temperature is usually 90 ° C to 100 ° C, preferably 94 ° C to 98 ° C, and the annealing temperature is 30 ° C to 70 ° C S preferably 37 ° C to 65 ° C, more preferably 5 ° C higher than the Tm of the primer, Preferably, the optimum conditions can be used in combination from 72 ° C.
  • the number of reaction totals can be repeated until the required amount of product can be obtained, but usually it can be selected from about 15 to 50 cycles.
  • the sequence of the gene obtained is the sequence of the type II DNA strand, the proofreading function of the DNA polymerase used for synthesis (proofreading function; A function that eliminates errors by removing it by exonuclease activity.) Closely related mutants having parts with different sequences depending on the strength are obtained. These closely related reductase genes are the basis for primer design. It can be used in the present invention similarly to the original reductase gene.
  • the organism that expresses the reductase gene of the present invention is not particularly limited, and microorganisms for which a host-vector system has been developed, for example, genus Escherichia, genus Notinoles (Bacillus), and genus Pseudomonas Bacteria such as genus Serratia, genus Serratia, genus Serratia, genus Plebibacterium, genus Corynebacterium, genus Streptococc, genus Ratatobacillus (Lactobacillus), Genus Kluyveromycesj, genus Schizosaccharomyces, genus Zyg osaccharomyces Y genus Yarro ia, genus Trichosporon, genus Rhodosporium a Pichia genus, Candida genus, etc.
  • Bacteria such as genus Serratia, genus Serratia, genus
  • the active microorganism thus produced does not need to use a medium using the above-mentioned enzyme-derived substrate as a carbon source, and active microorganism cells can be obtained by culturing in a general nutrient medium, that is, an LB medium or the like. .
  • the conditions of the reduction reaction using the produced reducing active microorganisms can be carried out in the same manner as the reaction of the microorganism originating from the present enzyme disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-106991.
  • the reduction reaction of the carbon-carbon double bond of an ⁇ -substituted carbonyl compound having an ⁇ , ⁇ one-carbon-carbon double bond can be carried out under conditions where the reducing power of the microorganism is stably expressed.
  • Either bacterial cells obtained by culturing according to the above method or cell-free extract obtained by crushing bacterial cells obtained by culturing by the above method are used in the culture solution of the microorganism. Can also be done.
  • ⁇ 3-carbon 0.1 mass of an a-substituted carbonyl compound having a carbon double bond in a culture solution. / 0 to 10 mass% / 0 , preferably 0.2 mass% to 2 mass%, continuously or batchwise at a culture temperature of 15 ° C to 40 ° C, preferably Can be cultured at 25 ° C to 37 ° C to produce the corresponding ⁇ ; -substituted,] 3-saturated carbohydrate compounds in the culture.
  • the cells recovered from the culture obtained by culturing according to the above method by centrifugation or the like can be used as a substrate in an appropriate solution, for example, a solution suspended in an aqueous solution such as a dilute ⁇ buffer solution.
  • an appropriate solution for example, a solution suspended in an aqueous solution such as a dilute ⁇ buffer solution.
  • Carbon′ A substituted carbonyl compound having a carbon double bond, for example, having a concentration of 0.1% by mass to 10% by mass / 0 , preferably 0.2% by mass. /.
  • the mixture is continuously or batchwise added so as to have a concentration of ⁇ 2% by mass, and the reaction temperature is 15 ° C. to 50 ° C., preferably 25 ° C. to 37 ° C., more preferably 28 ° C.
  • reaction pH 6.0-9.0 preferably pH 6.5-7.3
  • 3 _Saturation power It is possible to produce Ruponiiruich compound.
  • the pH is preferably maintained in an aqueous buffer, for example, an aqueous buffer containing potassium phosphate or Tris HC1 in the range of 1 OmM to 1M.
  • the timing, rate, or number of times of addition of the ⁇ -substituted carbohydrate compound having a carbon-carbon double bond can be freely selected within a range where the reaction is completed within the target time.
  • a treated product of a microorganism for example, a cell-free extract obtained by subjecting a culture obtained by subjecting a culture obtained by the culture method to centrifugal separation to crushing by a method such as a French press and the like is used as a substrate.
  • the concentration of the ⁇ -substituted carbonyl compound having one carbon-carbon double bond is 0.1% by mass to 10% by mass / 0 , preferably 0.2% by mass. /.
  • the reaction temperature is preferably 15 ° C. to 50 ° C., preferably. Is reacted at a temperature in the range of 28 ° C to 35 ° C.
  • Ponyl compounds can be produced.
  • a substance effective for maintaining the reducing activity of an a-substituted carbonyl compound having an ⁇ ,] 3-carbon.carbon double bond such as a sugar or an organic acid which can be oxidized by a microorganism used, such as a sugar or an organic acid.
  • a microorganism used such as a sugar or an organic acid.
  • the reaction can be carried out continuously or batchwise so as to obtain a concentration of 0.1% by mass, preferably 0.2% by mass to 1% by mass.
  • the addition ratio of ⁇ -chloroacrylic acid to these oxidizable substances can be arbitrarily selected from 1 to 20: 1.
  • the reaction time can be extended by the addition of the sugar or organic acid. This makes it possible to increase the concentration of the ⁇ -halo- ⁇ , ⁇ -saturated Carboel compound as the target product in the reaction solution, which is preferable for isolating and obtaining the product.
  • appropriate oxidoreductase genes such as malate dehydrogenase gene and glutamate dehydrogenase gene, are used. By introducing the gene into a microorganism so that it co-expresses with the reductase gene, productivity can be significantly improved. Such a method is disclosed in, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 61-128895, Biotechnol. Genet. Eng. Eng. Rev. 6, 22, 270 (1988).
  • the reaction can be performed in either an aerobic or anaerobic environment.
  • the ratio of the cell or cell-free extract to the substrate] 3-substituted halocarbole compound having a carbon-carbon double bond, or the timing, speed or number of additions of the substrate, depends on whether the reaction is performed within the target time. Include freely in the range where it ends.
  • the monosubstituted mono-, i3-saturated carbonyl compound produced by the reduction of an ⁇ -substituted carbonyl compound having an ⁇ , ⁇ monocarbon-carbon double bond is a metabolic intermediate for the microorganism used. If there is further decomposition There is. In such a case, the decomposition reaction can be stopped by selecting or preparing a host microorganism having no decomposition activity.
  • the microbial cells or the cell-free extract of the microorganism used in the present invention can be used by being immobilized on various immobilization carriers by a conventional method, for example, a method such as adsorption, entrapment, or crosslinking.
  • the type of carrier is not particularly limited, and for example, polysaccharide-based materials such as cellulose, polymer-based materials, and protein-based materials such as collagen can be used.
  • the ⁇ _substituted_ ⁇ ,] 3-saturated carpole compound produced in the present invention can be isolated and purified by a conventional purification method such as solvent extraction and distillation.
  • a conventional purification method such as solvent extraction and distillation.
  • (3 ⁇ 4—Q-propionic acid produced from crotch acrylic acid can be obtained by subjecting a culture solution or reaction solution to extraction with an organic solvent, distillation, or the like.
  • Bis-substituted carbonyl compounds having a carbon double bond are prochiral molecules at the position, but the mirror image of the chiral ⁇ -substituted-a, i3-saturated carbohydrate compound formed by the reduction method of the present invention.
  • the present invention relates to an a-substituent luponyl compound having a, i3 _ carbon-carbon double bond is to provide useful reductase group aND iTS genes to produce a monosubstituted one a, a ⁇ one saturated Karuboeru compound of absolute configuration S form the corresponding reduction of the carbon-carbon double bond
  • these BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION A high-producing organism is obtained by using the gene of the present invention, and a production method using the same is provided.
  • the reduction activity is detected by gas chromatography using a-chloroacrylic acid or monochloro- ⁇ , ⁇ -butenoic acid as a substrate and the reduction products a-chloropropionic acid and monochlorobutyric acid. And quantified.
  • 0.4 mL of 2N HCl was mixed with 0.4 mL of the reaction solution or medium supernatant from which the cells were removed by centrifugation, and then subjected to gas chromatography analysis under the following conditions.
  • Carrier gas Nitrogen 5 OmL / min
  • Pseudomonas sp. SD 811 strain was cultured in the following medium using the reducing substrate of S. sp. SD 811 strain as a carbon source.
  • Medium composition a-cloth acrylic acid (2 g / L), yeast extract (0.5 g, L), ammonium sulfate (2 gZL), sodium dihydrogen phosphate (lg / L), dipotassium hydrogen phosphate ( l gZL), magnesium sulfate (0.1 lg / L).
  • Pseudomonas sp. SD811 strain was cultured in the following medium.
  • Medium composition L-lactic acid (2 gZL), yeast extract (0.5 g / L), ammonium sulfate (2 g / L), sodium dihydrogen phosphate (1 g / L), dipotassium hydrogen phosphate (1 g / L) and magnesium sulfate (0.1 gZL).
  • Example 2 Pseudomonas sp. SD 811 strain cultured using two different carbon sources was subjected to centrifugation to collect the cells. The cells are suspended in 20 mL of a solution containing 0.2% ⁇ -chloroacrylic acid and 100 mM phosphate buffer (pH 7.3) (adjusted to pH 7.3), and shaken at 28 ° C. And reacted.
  • Burkholderia 'SP' strain SD816 was cultured in the following medium.
  • Medium composition Acrylic acid (2 g / L), yeast extract (0.5 g ZL), ammonium sulfate (2 g / L), sodium dihydrogen phosphate (lg / L), dipotassium hydrogen phosphate (LgZL), magnesium sulfate (O.lgZL).
  • Burkholderia 'SP' SD816 strain was cultured in the following medium.
  • Medium composition D-glucose (2 gZL), yeast extract (0.5 g L), ammonium sulfate (2 gZL), sodium dihydrogen phosphate (l gZL), dipotassium hydrogen phosphate (l gZL), magnesium sulfate (0.lgZL).
  • Example 5 Cell suspension reaction using sodium chloro-,
  • Example 4 Burkholderia 'SP' SD816 strain cultured using two different carbon sources was subjected to centrifugation to collect the cells.
  • the cells are suspended in 20 mL of a solution containing 0.2% ⁇ -chloro- ⁇ , ⁇ _putenoic acid and 100 mM phosphate buffer (pH7.3) (adjusted to pH7.3), and shaken at 28 ° C. And reacted.
  • a 0.5 mL sample was collected from the reaction solution, centrifuged to remove the cells, 0.4 mL of the supernatant was mixed with 0.1 mL of 6NHC1, and then mixed with 0.4 mL of ethyl acetate.
  • the product was extracted and the extracted sample was analyzed by the method of Example 1.
  • Pseudomonas sp. SD81 1 strain which was confirmed to have a different reducing activity in Example 2, was centrifuged for 18 hours to collect the cells. After washing with sterile water, the cells were resuspended in 50 mM phosphate buffer (pH 7.5). The cells are disrupted with an ultrasonic disrupter (BI0MC 7500 ULTRASONIC PROCESSOR (PULSED, 50 of% DUTY CYCLE, about 4.5 of OUT PUT CONTROL)), and the undisrupted cells and insoluble matter are centrifuged (16400 Xg, 5 min, 4 min). ° C).
  • an ultrasonic disrupter BIO0MC 7500 ULTRASONIC PROCESSOR (PULSED, 50 of% DUTY CYCLE, about 4.5 of OUT PUT CONTROL)
  • the prepared gel was placed in a semi-micro dry gel electrophoresis apparatus (KS-8110, manufactured by Oriental Instruments), and the upper and lower layers of the electrophoresis were placed separately.
  • KS-8110 semi-micro dry gel electrophoresis apparatus
  • a pre-run was performed at 300 V for 15 minutes and 400 V for 30 minutes.
  • SDS-PAGE was performed by a usual method using a slab gel apparatus (KS-8000 SE type, MARYS0L). That is, 12.5% SD
  • the sample was fixed on the top of the S-PAGE slab gel using 0.5 ° / o agarose, and electrophoresed at a constant current of 25 mA for about 4 hours.
  • Detection of proteins in the slab gel after electrophoresis was performed by ordinary CBB staining. That is, after staining with a CBB solution (0.25 g of Kumaji-Brilliant-Pur-R-2500, dissolved in 50 mL of methanol, 50 mL of acetic acid, and 450 mL of deionized water) for 1 hour, washed with deionized water, and then decolorized The solution was decolorized overnight (50 mL of methanol, 70 mL of acetic acid, 880 mL of deionized water). The gel was then soaked in a preservation solution (87% (w / v) glycerol solution 23 mL, ethanol 150 mL, deionized water 327 mL) for 3 hours.
  • a preservation solution 87% (w / v) glycerol solution 23 mL, ethanol 150 mL, deionized water 327 mL
  • Example 6 In order to analyze the protein characteristic of the ⁇ -chloroatalylic acid culture cells found in Example 6, the ⁇ -chloroacrylic acid culture cells of Burkholderia 'SP' SD816 strain shown in Example 6 were analyzed. Using a semi-dry transfer device (TRANS-BLOT® SD Semi-dry Electrophoretic Transfer Cell (Bio-Rad)), the protein subjected to secondary electrophoresis separation of the sample was subjected to PVDF membrane (Immobilon TM Transfer membranes pore size: 0.45 m L, MILLIP0RE).
  • TRANS-BLOT® SD Semi-dry Electrophoretic Transfer Cell Bio-Rad
  • the transfer follows the standard usage of the machine, with a limiting current of 0.8 mA, 13 V, 0.22--0. Performed at 26A for 45 minutes. After staining the transferred PVDF membrane with a CBB solution, spots corresponding to the three types of proteins that appeared characteristically in the ⁇ -chloroatalylic acid cultured cell sample were cut out, and a peptide sequencer (Model 491 Pr ocise) was used. (Applied Biosystems)). As a result, one of them was found to be a known enzyme, dehalogenase (dehalogenase, L-DEX), but the other two had the novel peptide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 and 3. It turns out.
  • dehalogenase dehalogenase
  • Example 7 In order to further obtain sequence information, the two novel proteins shown in Example 7 were partially degraded with lysyl endopeptidase in in gel.
  • Example 6 After the two-dimensional electrophoresis of Example 6, a portion corresponding to the target two spots was cut out from the CBB-stained gel, a Tris buffer containing lysyl endopeptidase was added to the gel piece, and digestion was performed at 35 ° C. Thereafter, the reaction solution was subjected to reverse phase HP LC under the following conditions to separate fragmented peptides.
  • Example 8 Acquisition of CAA43 N-terminal partial gene fragment First, degenerate primer 1 and degenerate primer 2 were designed based on the N-terminal amino acid sequence of CAA43 and the internal amino acid sequence described in SEQ ID NOs: 1 and 2, respectively.
  • BIO-RAD iCycler manufactured by BIO-RAD
  • PCR was performed under the following conditions.
  • the nucleotide sequence of this fragment is shown in SEQ ID NO: 13.
  • the fragment contains the N-terminal amino acid sequence of CAA 43, 0.5 kb, and a portion encoding the sequence of CAA 67 shown in SEQ ID NO: 4. It was found to contain 0.8 kb, which is considered to encode the amino acid sequence of the C-terminal region of CAA67.
  • the coding region of CAA67 was continuously present upstream of the coding region of CAA43, indicating that both genes form a cluster.
  • Example 11 Obtaining a DNA fragment encoding the N-terminus of CAA67
  • Example 12 Determination of all sequences and gene cluster sequences of each gene:
  • the entire nucleotide sequence of the CAA43 gene described in SEQ ID NO: 17 was determined by GENETYX-WIN / ATSQ nucleic acid sequence automatic binding software.
  • the entire nucleotide sequence of the CAA67 gene described in SEQ ID NO: 18 was determined from the DNA fragments obtained in Examples 10 and 11. Further, based on the DNA fragments obtained in Examples 8 to 11, the cluster base sequence described in SEQ ID NO: 19 where both genes were present was determined.
  • SEQ ID NOs: 20 and 21 are amino acid sequences corresponding to SEQ ID NOs: 17 and 18, respectively.
  • Example 13 The DNA fragment obtained in Example 13 was inserted downstream of the T7 promoter of the expression vector ⁇ P / D-T0P0, and Escherichia coli BL 21 (DE 3) strain (Escherichia coli BL 21 (DE 3), Escherichia coli BL21 (DE3)).
  • Escherichia coli BL 21 (DE 3), Escherichia coli BL21 (DE3) For ligation of the insert with the vector, transformation and gene expression, a PET101 Directional T0P0 expression kit (Invitrogen) was used.
  • Example 15 Reduction reaction using CAA43 and CAA67 active cells
  • the present invention provides a method for reducing a carbon-carbon double bond of an ⁇ -substituted carbonyl compound having a Q !, ⁇ -carbon-carbon double bond by using an enzyme produced by a microorganism to form a corresponding para-substituted ⁇ , 1-carbon.
  • the present invention provides a base acid sequence encoding a related enzyme having a high catalytic activity, which is useful for producing a saturated carbonyl compound by a method that is economical, operable, and process safe. Furthermore, hydrogenation is carried out on the carbon-carbon double bond of the ⁇ -substituted carbon compound having an ⁇ -, ⁇ -carbon.
  • the present invention provides a reductase and its gene useful for producing a high-purity optically substituted mono- and ⁇ -saturable luponyl compound useful as a construction block.
  • Address Name Deposit date "HTti ⁇ ' ⁇ ” Tsukuba, Ibaraki, Japan April 2, 1998 FER BP- 6767 1-1 1-1 Higashi 1 National Institute of Advanced Industrial Science and Technology April 2, 1998 FERM BP- 6768 central 6, Patent organism Depositary Center, 1998 April 2, FERM BP - 6769 (zip code 3 0S- 3 ⁇ 4 66) 6 May 28, 1999 FERM BP- 6770

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Description

a一置換一 α， /3一不飽和カルボュル化合物の還元酵素遺伝子 技術分野
本発明は α—置換一 α， β一不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子お よびその産物である酵素に関する。 さらに詳しく言えば、 ァセトパクター cetobacter)属、 ァクチノマイセス（Actinomyces)属、 ァシネトバクタ一（Aci netobacter . ァク、 'ロノくクテリゥム (Agrobacterium)属、 エアロモナス (Aer omonas)属、 ァノレ力リジェネス（Alcaligenes)属、 アースロバクタ一（Arthrob acter)属、 ァゾトパクター（Azotobacter)属、 バシラス（Baci l lus)属、 ブレ ビバクテリゥム（Brevibacteriutn)属、 バークホルデリア（Burkholderia)属、 セノレ口モナス（Cellulomonas)属、 コリネバクテリゥム（Corynebacterium)属、 ェンテロバクタ一 (Enterobacter)属、 ェンテロコッカス（Enterococcus)属、 エツシェリツシァ（Escherichia)属、 フラボバクテリゥム（Flavobacterium) 属、 ダルコノノ クタ一 (Gluconobacter)属、 ノヽロノくクテリゥム (Halobacteriu S)属、 ハロコッカス（Halococcus)属、 クレブシラ（Klebsiel la)属、 ラクトノく シラス（Lactobaci l lus)属、 ミク ロノくクテリゥム (Microbacterium)属、 ミク ロコッカス (Micrococcus)属、 ミクロポリスポラ (Mi cropo lyspora)属、 マイ コノ クテジゥム（Mycobacterium)属、 ノカノレディァ（Nocardia)属、 シユード モナス（Pseudomonas)属、 シユードノカノレディァ (Pseudonocardia)属、 ロド コッカス (Rhodococcus)属、 口ドノ クタ一（Rhodobacter)属、 セラチア（Serra tia)属、 スタフイロコッカス（Staphylococcus)属、 ストレプトコッカス（Si£ eptococcus 属、 ストレプトマイセス（Streptomyces)属ぉょぴキサントモナ ス（Xanthomonas)属からなる群より撰ばれる 1種以上の微生物に由来するこ とを特徴とする、 α , 一炭素 '炭素二重結合を有する α—置換カルボニル 化合物のひ， β一炭素 ·炭素二重結合に水素添加して、 対応する a一置換一 a， β—飽和カルボニル化合物を生成する活性を有する α—置換— α， ]3 - 不飽和力ルポ-ル化合物の還元酵素遺伝子およびその産物である酵素に関す る。
さらには、 シユードモナス（Pseudomonas)属またはバークホルデリア（Burk holderia)属微生物、 特にシユードモナス ·エスピー■ S D 8 1 0株（Pseudo monas sp. SD810)、 シユードモナス ·エスピー · S D 8 1 1株（Pseudoraonas sp. SD811)、 シユードモナス ·エスピー · S D 8 1 2株（Pseudomonas sp. SD8 12)およびバークホリデリア 'エスピー ' S D 8 1 6株（Burkholderia sp. SD 816)に由来する上記活性を有する α—置換一 a， β—不飽和カルボニル化合 物の還元酵素遺伝子おょぴその産物である酵素に関する。
また、 本発明は、 α， —炭素 '炭素二重結合を有するひ一置換力ルポ- ル化合物は α位についてプロキラルな分子であるが、 この炭素 ·炭素二重結 合に立体選択的に水素添加して、 対応する α位について光学活性な α —置換 - a , ]3—飽和カルポニル化合物の製造に有用な還元酵素およびその産物で ある酵素に関する。
この新規な酵素遺伝子およびその産物である酵素は、 種々の光学活性 （ひ 位の絶対配置は置換基により S体または R体となる。 ） を有する飽和カルボ ン酸ゃァミドなどの光学活性カルボエル化合物の製造分野に利用することが できる。 光学活性を有するカルボニル化合物は、 古典的な化学プロセスでは 調製が困難な、 価値の高いキラル構築ブロックであり、 特に医薬や農薬の原 料として有用な物質群である。 従来技術
近年、 微生物の炭素 ·炭素二重結合の還元により様々な化合物、 特に光学 活性体を製造する方法が注目され、 種々の α , β一炭素 ·炭素二重結合を有 し、 かつ a位に置換基を持つカルボニル化合物の炭素■炭素二重結合を微生 物的に還元して対応するひ位に置換基を持つ Q；， β一飽和カルボエル化合物 を製造する方法が報告されている （例えば、 Hoppe- Seyler's Z. Physiol. Chem. 362, 33 (1981)、 Arch. Microbiol. 135， 51 (1983)、 Helv. Chim, Acta.， 62, 455 (19 79)、 ?61^. 8丄(½。§.，84, 195 (1997)参照。 ) 。
し力 しながら、 これらの方法で用いられている活性微生物から還元酵素が 分離同定されている例は無い。 そもそも、 このグループに属する酵素の研究 は、 その不安定性のため分離同定が困難であることから極めて少ない。 本発 明の酵素も例外では無く、 通常の方法では早い失活のため分離同定が不可能 であった。
このためこれらの還元酵素を化合物製造に用いようとする時、 遺伝子工学 や代謝工学的なアプローチにより改善することは困難であり、 それゆえ効率 的な製法改良ができないという状況にあった。 発明の開示
したがって、 本発明は、 a , i3—炭素 .炭素二重結合を有する a—置換力 ルポニル化合物の炭素■炭素二重結合を、 微生物を用いて還元して対応する a一置換一 a , β一飽和カルボニル化合物を製造するのに有用な触媒酵素お よびその遺伝子を提供することを課題とする。
本発明者らは、 α， β一炭素 ·炭素二重結合を有する a—置換カルボニル 化合物の該炭素 ·炭素二重結合を還元して対応する a—置換一 a , β一飽和 力ルポニル化合物を生成する微生物が、 驚くべきことに、 好気性あるいは通 性縑気性細菌の比較的多くの属に渡って分布していることを土壌からの徹底 的なスクリーニングにより見出している （特開平 1 0— 2 2 4 8 2 1号公報 等） 。
特にシユードモナス属（Pseudomonas)またはバークホルデリア属（Burkhold に属する微生物に本活性を有する株が多く存在すること、 これらの株 の中には α , β—炭素 ·炭素二重結合を有する a—ハロカルボ二ルイヒ合物を 還元して、 純度の極めて高いひ位の絶対配置 S体のひ一ハロー c¾， 一飽和 カルボニル化合物を生成しうるものが存在することを見出した。
さらに本発明者らはこれらの活性微生物を用いて光学活性な α—置換一ひ， β—飽和カルボニル化合物を製造する方法を確立することに成功し、 この製 法をさらに改良すべく還元酵素本体の同定さらにはその遺伝子の特定を目指 して鋭意研究した結果、 触媒酵素を同定し、 作用機作の解明と高活性生物の 取得に成功し、 本発明に至ったものである。
すなわち、 本発明は、 以下の還元酵素遺伝子、 プラスミド、 形質転換体、 タンパク質、 そのタンパク質をコードする遺伝子の製造方法及びひ、 0—不 飽和力ルポエル化合物の還元酵素遺伝子に関する。
1 . a—置換一ひ， β一不飽和カルボニル化合物の還元活性を有するタンパ ク質をコードする、 配列番号 1 9で示される塩基配列からなる D N Αまたは 前記 D N Aとス トリンジェントな条件でハイブリダイズする D N Aからなる 子。
2 . a一置換一 α , β—不飽和カルポニル化合物の還元活性を有するタンパ ク質をコードする、 配列番号 1 7で示される塩基配列からなる D NAまたは 前記 D NAとストリンジ工ントな条件でハイブリダィズする D N Αからなる 遺伝子。
3 . a一置換一 α， β—不飽和カルボニル化合物の還元活性を有するタンパ ク質をコードする、 配列番号 1 8で示される塩基配列からなる D N Αまたは 前記 D N Aとストリンジェントな条件でハイブリダイズする D N Aからなる 4 . 配列番号 2 0で示されるァミノ酸配列及び配列番号 2 1で示されるアミ ノ酸配列をコードする D N A配列を含むことを特徴とする α—置換一 ， β 一不飽和カルボ-ル化合物の還元酵素遺伝子。
5 . 配列番号 2 0で示されるァミノ酸配列または前記ァミノ酸配列において 1若しくは数個のァミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたァミノ酸配列か らなり、 かつ —置換 _ «， ]3—不飽和カルポニル化合物の還元活性を有す るタンパク質をコードする遺伝子。
6 . 配列番号 2 1で示されるァミノ酸配列、 または前記ァミノ酸配列におい て 1若しくは数個のァミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたァミノ酸配列 からなり、 かつ α—置換一 α , β—不飽和カルボニル化合物の還元活性を有 するタンパク質をコードする遺伝子。
7 . 置換— α， j3 _不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子が、 ァセ トノ クタ一 (Acetobacter)属、 ァクチノマイセス (Actinomyces)属、 ァシネト パクタ一 (Acinetobacter)属、 ァグロパクテリゥム (Agrobacterium)属、 エア ロモナス（Aeromonas)属、 ァノレ力リジェネス（Alcaligenes)属、 アースロバク タ一 (Arthrobacter)属、 ァゾトノ クタ一 (Azotobacter)属、 バシラス (Bacil l us)属、 ブレビバクテリウム（Brevibacterium)属、 バークホルデリァ（Burkho lderia)属、 セル口モナス（Cel lulomonas)属、 コリネノ クテリウム (Coryneba cterium)属ヽ ェンテロノ クタ一 (Enterobacter)属、 ェンテ口コッカス (Enter ococcus)属、 エツシエリッシァ（Escherichia)属、 フラボノ クテリゥム（Flav obacterium)属、 クノレ =ιノノ ク ^― (Gluconobacter) ノヽロノ クテリゥム alobacterium)属、 ハロコッカス（Halococcus)属、 クレブシラ (Klebsiella) 属、 ラタ 卜ノ ンラス（Lactobacillus)属、 ミクロノくクテリゥム（Microbacteri un 属、 ミクロコッカス (Micrococcus)属、 ミクロポリスポラ (Micropolyspor 1属、 マイコパ'クテリゥム（Mycobacterium)属、 ノ力/レディ了 (Nocardia)属、 シユートモナス（PseudomonasJ属ゝ シユードノカノレアィァ (Pseudonocardia) 属、 口ドコッカス（Rhodococcus)属、 口ドバクタ一（Rhodobacter)属、 セラチ ァ（Serratia)属、 スタフイロコッカス（StaoJiylococcus)—属、 ス トレプトコッ カス（Streptococcus)属、 ス トレプトマイセス (Streptomyces)属及びキサン トモナス（Xanthomonas)属からなる群より選ばれる 1種以上の微生物に由来 するものである前記 1乃至 6のいずれかに記載のひ一置換一 α， β一不飽和 カルボュル化合物の還元酵素遺伝子。
8. α _置換— a, 3—不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子が、 シュ 一ドモナス（Pseudotnonas)属微生物に由来する前記 7に記載のひ一置換一ひ， β—不飽和カルボエル化合物の還元酵素遺伝子。
9. 一置換ー ， 一不飽和カルボ二ルイヒ合物の還元酵素遺伝子が、 バー クホルデリ了 (Burkholderia)属微生物に由来する前記 7に記載の a—置換一 a, 一不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子。
1 0. シユードモナス属微生物が、 シユードモナス ■エスピー ' SD 8 1 0 株（Pseudotnonas sp. SD810)である前記 8に記載の α—置換一 , β—不飽和 カルボニル化合物の還元酵素遺伝子。
1 1. シユードモナス属微生物が、 シユードモナス ■エスピー · SD 8 1 1 株（Pseudotnonas sp. SD811)である前記 8に記載の α—置換— α， i3—不飽和 カルボ-ル化合物の還元酵素遺伝子。
1 2. シユードモナス属微生物が、 シユードモナス 'エスピー · SD 8 1 2 株（Pseudotnonas sp. SD812)である前記 8に記載の α—置換一 ， β一不飽和 カルボニル化合物の還元酵素遺伝子。
1 3. バークホルデリァ属微生物が、 バークホルデリア 'エスピー - SD 8 1 6株（Burkholderia sp. SD816)である前記 9に記載の α—置換一 α， β— 不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子。
1 4. 還元酵素が、 炭素 '炭素二重結合の還元によって、 α位がキラルな S 体化合物を生成する触媒能を有することを特徴とする前記 1乃至 1 3のいず れかに記載の 一置換一 α , β一不飽和カルボ二ルイヒ合物の還元酵素遺伝子。
1 5. α—置換一 ， i3—不飽和カルボニル化合物が、 下記一般式 （1)
Figure imgf000009_0001
(式中、 I 1、 R2、 R 3は独立に水素原子、 ハロゲン原子、 炭素数 1〜6の 直鎖状もしくは分岐状脂肪族炭化水素基、 炭素数 1〜 6の直鎖状もしくは分 岐状アルコキシ基、 ヒドロキシル基、 カルボキシル基、 置換されていてもよ い芳香族基または含窒素、 含酸素もしくは含硫黄複素環基を表わし、 R4は ヒドロキシル基、 炭素数 1〜 3の直鎖状もしくは分岐状アルコキシ基または 1級〜 3級アミノ基を表わす。 伹し、 R3は水素原子であることはない。 ） で示される化合物であり、 還元された化合物が下記一般式 （2)
Figure imgf000009_0002
(式中、 ！^1〜!^4は上記と同じ意味を表わす。 ） で示される化合物である前 記 1乃至 14のいずれかに記載の α—置換一 α , 一不飽和カルボエル化合 物の還元酵素遺伝子。
16. α—置換一α, —不飽和カルボ-ル化合物が、 下記一般式 （1)
Figure imgf000009_0003
(式中、 R R2が水素原子、 R3がハロゲン原子、 R4がヒ ドロキシル基 を表わす。 ） で示されるひーハロアクリル酸であり、 還元された化合物が、 下記一般式 （2)
Figure imgf000010_0001
(式中、 Ri R4は上記と同じ意味を表わす。 ） で示される絶対配置 Sのひ —ハロプロピオン酸である前記 1 5に記載のひ一置換一ひ， ]3—不飽和カル ポニルイ匕合物の還元酵素遺伝子。
1 7. R3が臭素原子である前記 1 6に記載の《—置換一ひ， ]3—不飽和力 ルポニル化合物の還元酵素遺伝子。
1 8. R3が塩素原子である前記 1 6に記載の a—置換一 a， β一不飽和力 ルポニル化合物の還元酵素遺伝子。
1 9. R3がフッ素原子である前記 1 6に記載の α—置換一 a！， ]3—不飽和 カルボニル化合物の還元酵素遺伝子。
20. 前記 1乃至 1 9のいずれかに記載の α—置換一ひ , β一不飽和カルボ ニル化合物の還元酵素遺伝子 DN Αを含んでなることを特徴とするプラスミ ド、。
2 1. 前記 1乃至 1 9のいずれかに記載の α—置換一ひ， β—不飽和カルボ ニル化合物の還元酵素遺伝子と、 NAD ΡΗ類を補酵素として機能する酵素 遺伝子を共に含むことを特徴とするプラスミ ド。
22. 前記 20または 2 1に記載のプラスミ ドで形質転換されてなる形質転 換体。
23. 前記 20に記載のプラスミドと、 NAD PH類を補酵素として機能す る酵素遺伝子を含むプラスミ ドで同時に形質転換されてなる形質転換体。
24. 前記 1乃至 1 9のいずれかに記載のひ一置換一ひ， β一不飽和カルボ ニル化合物の還元酵素遺伝子の発現産物であるひ一置換一 α， 一不飽和力 ルポニル化合物の還元活性を有するタンパク質、 または前記タンパク質を構 成する 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸 配列からなり α—置換— α， β一不飽和カルボニル化合物の還元活性を有す るタンパク質。
2 5 . 配列番号 2 0で示されるアミノ酸配列または前記アミノ酸配列質にお いて 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配 列からなり、 かつ α—置換一 α， β一不飽和カルボニル化合物の還元活性を 有するタンパク質。
2 6 . 配列番号 2 1で示されるァミノ酸配列または前記ァミノ酸配列におい て 1若しくは数個のァミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたァミノ酸配列 からなり、 かつ α—置換— α， 一不飽和カルポニル化合物の還元活性を有 するタンパク質。
2 7. 配列番号 1 9に示される塩基配列のうち 6 3 1番目の塩基より上流側 の塩基配列から選択された塩基配列と、 3 5 4 3番目の塩基より下流側の塩 基配列から選択された塩基配列とを相互に逆鎖の関係になるように組み合わ せたプライマーを用いることを特徴とする a—置換一 α， /3—不飽和カノレポ ニル化合物の還元活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の製造方法。 2 8 . 配列番号 1 9に示される塩基配列のうち 6 3 1番目の塩基より上流側 の塩基配列から選択された塩基配列と、 2 2 7 4番目の塩基より下流側の塩 基配列から選択された塩基配列とを相互に逆鎖の関係になるように組み合わ せたプライマーを用いることを特徴とする置換一 α， 一不飽和カルボニル 化合物の還元活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の製造方法。
2 9 . 配列番号 1 9に示される塩基配列のうち 2 5 4 7番目の塩基より上流 側の塩基配列から選択された塩基配列と、 3 5 4 3番目の塩基より下流側の 塩基配列から選択された塩基配列とを相互に逆鎖の関係になるように組み合 わせたプライマーを用いることを特徴とする α—置換一 α , 一不飽和カル ボニル化合物の還元活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の製造方法。 3 0 . 前記 2 2乃至 2 3に記載の形質転換体培養物および/または処理物を 用いることを特徴とする (X—置換一 α， 一不飽和カルボ-ル化合物の還元 方法。
図面の簡単な説明
図 1は、 シユードモナス 'エスピー■ S D 8 1 1株の培養炭素源による反 応曲線の差違を示すグラフである。
図 2は、 バークホルデリア 'エスピー - S D 8 1 6株の培養炭素源による 反応曲線の差違を示すグラフである。
図 3は、 バークホルデリア ·エスピー ' S D 8 1 6株の培養炭素源による 生成タンパク質の相違を、 二次元電気泳動で比較した結果である。
図 4は、 C AA 4 3遺伝子と C AA 6 7遺伝子の位置関係、 および各 D N Α断片 （配列番号を N o .で記載） の位置を示す概略図である。
図 5は、 不斉還元酵素遺伝子発現用べクターの設計を示す概略図である。
発明の詳細な説明
本発明において、 α—置換一 α , β一不飽和カルボニル化合物の還元酵素 遺伝子およびその産物である酵素は、 ァセトパクター（Acetobacter)属、 ァ クチノマイセス（Actinomyces)属、 ァシネトバクタ一（Acinetobacter)属、 ァ ク"ロノくクテリゥム (Agrobacterium)属、 エア口モナス（Ae扇 onas)属、 ァノレ力 リジヱネス（Alcal igenes)属、 アースロバクタ一（Ar throbact er)属、 ァゾト パクター（Azotobacter)属、 バシラス（Bacillus)属、 プレビバタテリゥム（ evibacterium)属、 バークホルデリ了 (Burkholderia)属、 セノレ口モナス（Cell ulomonas)属、 コ Vネノ クテジクム (Corynebacterium)属、 ェンテロノ クタ一 (Enterobacter)属、 ェンテロコッカス (Enterococcus)属、 エツシェリツンァ (Escherichia)属、 フラボパクテリゥム（Flavobacterium)属、 グノレコノバク タ一 (Gluconobacter)属、 ハロノくクテリゥム (Halobacterium)属、 ハロコッカ ス（Halococcus)属、 クレブシラ（Klebsiella)属、 ラタトノ ンラス（Lactobaci llus)属、 ミクロバタテリゥム（Microbacterium)属、 ミクロコッカス（Microc occus)属、 ミクロポジスポラ (Micropolyspora)属、 マイコノ クテリゥム (Myc obacteriutn) fe、 ノカノレティ了 (Nocardia)『禺、 シュードモナス (Pseudomonas) 属、 シユードノカルティァ (Pseudonocardia) fe、 口ドコッカス (Rhodococcus )属、 口ドバクタ一（Rhodobacter)属、 セラチア（Serratia)属、 スタフイロコ ッカス (Staphylococcus)属、 ストレプトコッカス (Streptococcus)属、 ス ト レプ卜マイセス (Streptomyces)属、 キサントモナス（Xanthomonas)属のいず れかに属する微生物に存在する。
好適にはシュ一ドモナス (Pseudomonas)属あるいはバークホ /レデリァ (Burk holderia)属微生物に由来する。
本発明において用いる由来微生物としては、 α , ]3—炭素 '炭素二重結合 を有する α—置換カルボニル化合物の α , β一炭素 ·炭素二重結合を還元す る活性を有する株であれば特に制限はないが、 例えば、 シユードモナス ·ェ スピー ' S D 8 1 0株、 シユードモナス ■エスピー · S D 8 1 1株、 シユー ドモナス ■エスピー■ S D 8 1 2株、 またはバークホルデリア■エスピー · S D 8 1 6株等が好適である。
中でも比較的高い還元活性の観点から、 シユードモナス 'エスピー ' S D 8 1 1株またはバークホルデリア■エスピー · S D 8 1 6株が特に好適に用 いられる。
シユードモナス ·エスピー · S D 8 1 0株、 シユードモナス ■エスピー · S D 8 1 1株、 シユードモナス 'エスピー■ S D 8 1 2株またはバークホル デリア ·エスピー · S D 8 1 6株等は、 土壌中から単離されたものであり、 各種の力ルポニル化合物を分解資化する能力を有している。
これらシユードモナス ■エスピー■ S D 8 1 0株、 シユードモナス ·エス ピー ' SD 811株およびシユードモナス 'エスピー · SD 8 12株は、 そ れぞれ生命研菌寄第 B P— 6767号 （FERM BP— 6767) [生命 研菌寄第 16746号 (FERM- 16 746) から移管] 、 生命研菌寄第 BP— 6768号 （FERM BP— 6768) [生命研菌寄第 16747 号 （FERM 16747) から移管] および生命研菌寄第 B P— 6769 号 （FERM BP— 6769) [生命研菌寄第 16748号 (FERM B P- 6769) から移管] 、 バークホルデリア ·エスピー■ SD 8 16株 は、 生命研菌寄第 B P— 6770号 （F ERM BP— 6770) として生 命工業技術研究所に寄託されている。
これらの分離 ·培養は、 特開平 10— 224821号公報に詳細に示され ている方法等を用いることができる。
上記活性微生物では、 培養条件によつてその還元活性が異なることがある。 すなわち、 還元基質であるひ， 一炭素 '炭素二重結合を有する α—置換力 ルポエル化合物を炭素源として培養した場合と、 糖類など一般的な炭素源を 用いて培養した場合で菌体が示す —炭素 '炭素二重結合の還元活性が 異なり、 還元基質を炭素源として培養した菌体は反応開始時から高い還元活 性を示すことがある。 このことは還元酵素の一部または全てが還元基質によ つて誘導されることを示唆しており、 この差を解析することによって還元酵 素を同定することが可能となる。
還元活性の高い菌体を得る培養の炭素源としては一般式 （1)
Figure imgf000014_0001
で示される化合物を用いることができる。 一般式 （I) 中、 R R2は独立 に水素原子、 ハロゲン原子、 炭素数 1~ 6の直鎖状もしくは分岐状脂肪族炭 化水素基、 炭素数 1〜6の直鎖状もしくは分岐状アルコキシ基、 ヒドロキシ ル基、 カルボキシル基、 置換されていてもよい芳香族基または飽和もしくは 不飽和含窒素、 含酸素もしくは含硫黄複素環基を表わす。 好ましい R R2 としては水素原子を挙げることができる。
R 3はハロゲン原子、 炭素数 1〜6の直鎖状もしくは分岐状脂肪族炭化水 素基、 炭素数 1〜6の直鎖状もしくは分岐状アルコキシ基、 ヒドロキシル基、 カルボキシル基、 置換されていてもよい芳香族基または飽和もしくは不飽和 含窒素、 含酸素もしくは含硫黄複素環基を表す。 好ましい R 3としてはハロ ゲン原子、 特に塩素原子、 臭素原子を挙げることができる。
R4はヒドロキシル基、 炭素数 1〜4の直鎖状もしくは分岐状アルコキシ 基、 1級〜 3級アミノ基を表わし、 好ましい R 4としてはヒドロキシル基を 挙げることができる。
具体的には α—クロ口アクリル酸、 α—プロモアクリル酸、 2—クロ口一 2—ブテン酸、 2—ブロモ一 2—プテン酸、 2 _クロ口一 2—ペンテン酸、 2一プロモ一 2—ペンテン酸、 それらのメチノレエステノレ、 ェチノレエステノレな どが挙げられ、 好ましくは《—クロ口アクリル酸、 α—ブロモアクリル酸で ある。
すなわち、 通常の細菌に用いられる無機塩培地 (例えば、 (NH4) 2 S O 4 2gZL、 N a H2 P04 l gZL、 K2HP04 l g/L、 Mg S 04 0. l g/L、 酵母エキス 0.5g/L) に、 例えば、 α—クロ口アクリル酸のよ うな α位に置換基を持つ a， β—不飽和カルボニル化合物を実質的に唯一の 炭素源として 2 gZL添加した最少培地 5 mLに菌株を植菌し、 2 8°Cで 1 2〜7 2時間振とう培養を行うと、 還元活性の高い菌体が得られる。 一方、 上記培養条件のうち炭素源だけを還元基質の代謝生成物、 例えば、 α—クロ ロアクリル酸などの置換アクリル酸の場合は乳酸に変えて培養すると、 反応 初期には還元活性を示さない菌体が得られる。 これらの菌体をそれぞれ遠心分離に供して回収し、 フレンチプレス等の方 法により破壊して得た無細胞抽出液を力ラムクロマトグラフィーに供してタ ンパク質の分離パターンを比較すると、 両者で異なるタンパク質が見い出さ れる。
このうち還元基質を用いて培養した菌体で生成量が増加したタンパク質を 分離し、 その活性を測定すれば酵素の同定が可能である。 しかしながら一般 に、 これらの酵素は無細胞抽出液の状態では安定性が低く、 比較的速やかに 活性が消失してしまうため分離同定が困難な場合が多い。 これこそがこの群 に属する酵素の研究が他の安定な酵素に比して遅れている一因となっている。 このような場合、 窒素雰囲気下などで分離作業を行う事で活性を保つこと ができる場合もあるが、 まずタンパク質の部分配列を明らかにし、 部分配列 から推定した D N A塩基配列をプローブとして遺伝子をクローニングし、 こ の遺伝子を発現させてタンパク質を著量取得した後活性などの解析を行う方 法が有効である。
すなわち、 異なる炭素源を用いて無細胞抽出液を二次元タンパク質電気泳 動などで分離したタンパク質の生成パターンを比較して、 還元基質で培養し た菌体で増加しているタンパク質を見いだす。 このタンパク質を P V D Fメ ンプレンなどに移して、 気相ェドマン分解装置などにより N末端配列の解析 を行う。 得られた N末端配列から、 D NA塩基配列を推測し、 オリゴヌタレ ォチドを合成することにより、 染色体から還元酵素群の遺伝子を取得するの に有用なプローブ （ある配列の D NAを見出す時に用いる、 識別可能な標識 を施した D NA断片） を作成する。
本発明の還元酵素遺伝子は、 このようにして作成した D N Aプローブを用 いて、 遺伝子工学で用いられるサザンハイプリダイゼーション等の通常の方 '法によって容易に取得することができる。 すなわち、 前記微生物から抽出し た D NA (染色体及びプラスミドを持つ場合はプラスミドを含む） を適当な 制限酵素で切断して断片化し、 ァガロースゲル電気泳動などの方法でサイズ 分離した後ニトロセルロース膜に転写した断片に対して、 識別可能な標識を 施したプローブをハイブリダィゼーシヨン （D NAと D NAの間で、 その塩 基配列に相補性が高いときに二重鎖を形成することで、 対合とも言う） させ ることで、 プローブと特異的にハイプリダイゼーシヨンする断片、 すなわち 目的遺伝子を含む D NA断片を得ることができる。 このとき、 遺伝子が途中 で切断された部分断片が取得される場合もあるが、 制限酵素の種類を変えて 同様の検出を行ったり、 先に取得された部分断片をプローブとして用いるな どして、 遺伝子全体を取得することができる。
本発明の還元酵素群の遺伝子に対してハイプリダイゼーション法を用いる 場合、 ハイプリダイズさせる D NAの長さによって最適な条件には違いがあ るが、 十分に特異的なハイブリダィゼーション結果が得られるストリンジェ ント条件は、 通常のハイプリダイゼーション溶液の塩濃度範囲で約 4 0 °C〜 7 0 °C、 好ましくは 4 7 °C〜6 0 °Cである。
本発明の還元酵素群の遺伝子は、 遺伝子およびその周辺配列の適当な位置 にハイプリダイゼーションするプライマーを作成し、 前記の微生物 D N Aを 铸型としたポリメラーゼ連鎖反応 （P C R) によっても容易に取得すること ができる。
プライマーとは、 コピーしたい D N A鎖にハイプリダイゼーシヨンし、 D N A合成開始点となり得る断片である。 D N Aの酵素合成は、 鍩型 D NAに ハイプリダイゼーシヨンしたプライマーの 3，一〇H部分に D NAポリメラー ゼがデォキシリポヌクレオチドをジエステル結合する形で進むため、 D N A の複製の開始にはプライマーが必須である。 ポリメラーゼ連鎖反応 （P C R) でもプライマーが使用され、 このプライマーの選択によって目的の D N Aを正しく効率良くコピーできるかが決まる。
本発明において用いることができるプライマーは、 本発明の還元酵素遺伝 子おょぴその周辺配列にハイプリダイゼーシヨンして D N A合成開始点とな り得るものであれば特に制限は無く、 例えば、 断片の配列相補性の高さの度 合い、 断片の長さ、 断片に対する修飾などに制限は無い。 例えば、 生成する 断片をプラスミドに接続するためのアダプタ配列を含むプライマー、 生成し た遺伝子断片の検出を容易にする蛍光物質で修飾したプライマー等を目的に 応じて自由に設計し用いることができる。
本発明において有用な還元酵素群の遺伝子を得るのに有用な一組のプライ マーは、 配列番号 1 9に示される塩基配列のうち、 上流遺伝子の開始コドン の第一塩基である 6 3 1番目の塩基より上流の配列を含む一つと、 下流遺伝 子終了コドンの第三塩基である 3 5 4 3番目の塩基より下流の配列を含む他 —つを、 相互に逆鎖の関係となるよう組み合わせたものである。 また、 有用 な他の一組のプライマーは、 配列番号 1 9に示される塩基配列のうち、 上流 遺伝子の開始コドンの第一塩基である 6 3 1番目の塩基より上流の配列を含 む一つと、 上流遺伝子の終了コドン第三塩基である 2 2 ,7 4番 gの塩基より 下流の配列を含む他一つを、 相互に逆鎖の関係となるよう組み合わせたもの である。 さらに有用な他の一組のプライマーは、 配列番号 1 9に示される塩 基配列のうち、 下流遺伝子の開始コドンの第一塩基である 2 5 4 2番目の塩 基より上流の配列を含む一つと、 下流遺伝子終了コドンの第三塩基である 3 5 4 3番目の塩基より下流の配列を含む他一つを、 相互に逆鎖の関係となる よう組み合わせたものである。 この 3種の組み合わせで、 それぞれ遺伝子群 全体、 上流遺伝子、 下流遺伝子のいずれかを含む D N A断片を得ることがで きる。 さらに、 配列番号 1 7で示される塩基配列の両末端 1 0数個から数 1 0個の塩基配列を、 相互に逆鎖の関係となるよう組み合わせた一組のプライ マーも有用である。 この組み合わせでは、 配列番号 1 7で示される塩基配列 に相当する D N Aを作成することができ、 本発明の下流遺伝子に相当する遺 伝子を作成することができる。 同様にして、 配列番号 1 8で示される塩基配 列の両末端 1 0数個から数 1 0個の塩基配列を、 相互に逆鎖の関係となるよ う組み合わせた一組のプライマーも有用である。 この組み合わせでは、 配列 番号 1 8で示される塩基配列に相当する D NAを作成することができ、 本発 明の上流遺伝子に相当する遺伝子を作成することができる。
これらのプライマーを用いて遺伝子を取得する方法に特に制限は無いが、 ポリメラーゼ連鎖反応 （P C R) が最も簡便に用いることのできる方法であ る。 反応条件は D N A合成反応による生成物が取得される限り制限は無いが、 通常変性温度は 9 0 °C〜 1 0 0 °C、 好ましくは 9 4 °C〜 9 8 °C、 ァニーリン グ温度は 3 0 °C〜 7 0 °CS 好ましくは 3 7 °C〜 6 5 °C、 さらに好ましくはプ ライマーの T mより 5 °C高い温度、 伸長温度は 6 5 °C〜 7 5 °C、 好ましくは 7 2 °Cからそれぞれの最適条件を組み合わせて用いることができる。 反応サ イタル数は生成物が必要量取得できるまで繰り返すことができるが、 通常 1 5〜 5 0サイクル程度から選択すればよ 1/、。 取得される遺伝子の配列は錄型 とする D N A鎖の配列、 合成に用いる D N Aポリメラーゼの校正機構 (proofreading function； D N Aの複製時に誤って取り込まれた塩基を、 D NAポリメラーゼの 5，→ 3，ェキソヌクレアーゼ活性によって取り除くこ とで誤りを無くす機能） 強度によって相互に配列の異なる部分を持つ近縁の 変異体が取得されるが、 これら近縁の還元酵素遺伝子は、 プライマーの設計 の元となったオリジナルの還元酵素遺伝子と同様に本発明に用いることがで きる。
これらの遺伝子を、 一般的に知られる発現ベクター等を用いて宿主生物体 内で発現できる形で生物に導入することにより、 α , 3—炭素 ·炭素二重結 合を有するひ一置換カルボ-ル化合物の該炭素 ·炭素二重結合を還元して対 応する α—置換一ひ , β一飽和カルボ二ルイヒ合物を生成する高い還元活性を 示す生物を作出できる。 この時、 下流遺伝子は単独ではなく、 上流遺伝子と 組み合わせて用いることにより還元活性を得ることが出来る。 本発明の還元酵素遺伝子を発現させる生物としては、 特に制限は無いが、 宿主一ベクター系の開発されている微生物、 例えば、 エシ リヒア (Escher ichia) 属、 ノ チノレス (Bacillus) 属、 シユードモナス (Pseudomonas) 属、 セラチア (Serratia) 属、 プレビパクテリゥム (Brevibacterium) 属、 コリ ネノ クテリゥム (Corynebacterium) 属、 ストレプトコッカス (Streptococc ） 属、 ラタトバチノレス (Lactobacillus) 属などの細菌、 サッカロマイセ ス (Saccharomyces) 属、 クライべロマイセス (Kluyveromycesj 属、 シゾサ ッカロマイセス (Schizosaccharomyces) 属、 チゴサッカロマイセス属 (Zyg osaccharomyces) ヽ ャロウィァ (Yarro ia) 禺、 リコスホロン (Trichosp oron) 属、 ロドスポリジゥム (Rhodosporidium) 属、 ノヽンゼヌラ (Hansenul a) 属、 ピキア (Pichia) 属、 キャンディダ (Candida) 属などの酵母、 ノィ ロスポラ (Neurospora) 属、 アスペスレギノレス (Aspergil lus) 、 セファロス ポリゥム (Cephalosporium) 属、 トリコデノレマ (Trichoderma) 属などに属 するカビなどが挙げられる。 好適な微生物の一例としては、 大腸菌が挙げら れる。 作出した活性微生物は、 前記の酵素誘導基質を炭素源とした培地を用 いる必要が無く、 一般的な栄養培地、 すなわち L B培地等で培養することで 活性微生物菌体を得ることができる。
作出した還元活性微生物を用いる還元反応の条件は、 特開 2 0 0 0— 1 0 6 8 9 1に開示されている本酵素起源微生物の反応と同様にして行うことが できる。
すなわち、 α , β一炭素 ·炭素二重結合を有する α—置換カルボニル化合 物の炭素■炭素二重結合の還元反応は、 前記微生物が持つ還元力が安定に発 現する条件下であれば、 該微生物の培養液中、 前記方法により培養して得た 菌体、 または前記方法により培養して得た菌体を破砕して得られる無細胞抽 出液等の微生物の処理物のいずれを用いても行うことができる。
すなわち、 培養して得た菌体を用いる場合は、 基質となる α , |3—炭素 - 炭素二重結合を有する a—置換カルポニル化合物を培養液に、 0. 1質量。 /0 〜 1 0質量°/0の濃度、 好ましくは 0. 2質量％〜 2質量％の濃度になるよう に連続的または回分的に添加し、 培養温度 1 5°C〜40°C、 好ましくは 2 5 °C〜3 7°Cで培養し、 培養液中に相当する ο;—置換一ひ， ]3—飽和カルボェ ル化合物を生成させることができる。
あるいは、 前記方法により培養して得た培養物から遠心分離などの方法で 回収した菌体を、 適当な溶液、 例えば希薄な ρ Η緩衝溶液のごとき水溶液に 懸濁した溶液に、 基質となる 3—炭素 '炭素二重結合を有する《—置換 カルボニル化合物を、 例えば、 0. 1質量％〜1 0質量 °/0の濃度、 好ましく は 0. 2質量。/。〜 2質量％の濃度になるように連続的または回分的に添カロし、 反応温度 1 5 °C〜 5 0 °C、 好ましくは、 2 5 °C〜 3 7 °C、 より好ましくは 2 8°C〜 3 5°C、 反応 p H 6. 0— 9. 0、 好ましくは、 p H6. 5〜 7. 3 に調節して反応させ、 該菌体懸濁液中に相当する α—置換一a, |3 _飽和力 ルポ二ルイヒ合物を生成させることができる。 p H維持は、 水性バッファ、 た とえばリン酸カリゥムもしくはトリス HC 1を 1 OmM〜 lMの範囲で含 むような水性バッファで行うことが好ましい。
a , β一炭素 ·炭素二重結合を有する α—置換カルボュル化合物の添カロの 時期と、 速度または回数は、 反応が目的時間内で終了するような範囲で自由 に選択できる。
微生物の処理物を用いる場合は、 例えば、 前記培養法による培養物を遠心 分離に供して回収した菌体を、 フレンチプレス等の方法により破壌して得た 無細胞抽出液を、 基質となる α， 一炭素 ·炭素二重結合を有する α—置換 カルボニル化合物の濃度が、 0. 1質量％〜 1 0質量 °/0、 好ましくは 0. 2 質量。/。〜 2質量％であり、 反応液の ρ Η維持に有効な成分を 1 0 mM〜 1 M の範囲で含むような反応液に添加して、 反応温度 1 5 °C〜 5 0 °C、 好ましく は 2 8°C〜3 5°Cの範囲で反応させ、 相当するひ一置換一α， ]3—飽和カル ポニル化合物を生成させることができる。
さらに本発明においては、 α， ]3—炭素 .炭素二重結合を有する a—置換 カルボニル化合物の還元活性の維持に有効な物質、 たとえば使用する微生物 が酸化することのできる糖や有機酸のごとき化合物、 好ましくはグルコース や L—乳酸等を、 単独で、 あるいはひ一クロ口アクリル酸との混合溶液とし て反応中、 0 . 1質量％〜1 0質量。 /。の濃度、 好ましくは 0 . 2質量％〜1 質量％の濃度になるように連続的または回分的に添加しながら反応させるこ とができる。 α—クロロアクリル酸とこれら被酸化物質との添加割合は 1 〜 2 0 ： 1の間で任意に選択できる。 この糖や有機酸の添加により反応時間を 延長することができる。 このことにより、 目的生成物である α _ハロ一 α， β一飽和カルボエル化合物の反応液中の濃度を高くすることができ、 生成物 を単離収得するのに好ましい。 特にこれらの被酸ィヒ物質を用いて補酵素 N A D P Hの還元型を効率良く再生できる系を強化するため、 適当な酸化還元酵 素遺伝子、 例えば、 リンゴ酸脱水素酵素遺伝子やグルタミン酸脱水素酵素遺 伝子を、 還元酵素遺伝子と共発現するよう微生物に導入することによって、 生産性を大幅に改善することができる。 このような方法は、 例えば特開昭 6 1— 1 2 8 8 9 5、 Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 6, 22ト 270 (1988)に開 示されている。
反応は培養中で無い場合は、 好気的、 嫌気的いずれの環境でも行うことが できる。 菌体または無細胞抽出液と基質である ]3—炭素 ·炭素二重結合 を有するひ一置換ハロカルボ-ル化合物の比率、 あるいは基質の添加の時期、 速度または回数は、 反応が目的時間内で終了するような範囲で自由に選択で 含る。
本発明においては、 α， β一炭素 ·炭素二重結合を有する α—置換カルボ ニル化合物の還元によって生成するひ一置換一ひ， i3—飽和カルボニル化合 物は、 使用する微生物にとって代謝中間体であってさらに分解を受ける場合 がある。 このような場合には、 分解活性を持たない宿主微生物を選択するか 作成することにより分解反応を停止させることができる。
さらに、 本発明で用いられる微生物の菌体あるいは無細胞抽出液は、 慣用 の方法、 たとえば、 吸着、 包括、 架橋などの方法により、 種々の固定化担体 に固定化して用いることができる。 担体の種類は特に制限されず、 たとえば、 セルロースなどの多糖系材料、 ポリマー系材料、 コラーゲン等のタンパク質 系材料などを用いることができる。
本発明で生成した α _置換 _ α， ]3—飽和カルポュル化合物は、 常用の溶 媒抽出、 蒸留といった精製法を用いて、 単離精製することができる。 たとえ ば、 （¾—クロ口アクリル酸から生成した Q! —クロ口プロピオン酸は、 培養液 や反応液から有機溶媒抽出、 蒸留等に供することにより得ることができる。 また、 ， i3—炭素 '炭素二重結合を有するひ —置換カルボニル化合物はひ 位についてプロキラルな分子であるが、 本発明の還元法によつて生成するキ ラルな α—置換一a , i3—飽和カルボ-ル化合物の鏡像異性体の純度は、 キ ラルカラム材料での G C、 H P L Cあるいは旋光計で決定することができる。 このように、 本発明は、 a , i3 _炭素 ·炭素二重結合を有する a—置換力 ルポニル化合物の炭素 ·炭素二重結合を還元して対応する絶対配置 S体の a 一置換一 a， β一飽和カルボエル化合物を製造するのに有用な還元酵素群お よびその遺伝子群を提供するものである。 さらに、 これらの遺伝子を用いて 高生産生物を取得し、 これを用いた製造方法を提供するものである。 発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例により本発明をより詳細に説明するが、 本発明はこれら実施 例によりなんら限定されるものではない。 実施例中、 全ての塩基配列決定で は、 P C R産物をプラスミドに組み込むことなく、 直接錡型として使用し、 D NAシーケンサー m o d e 1 3 7 7 (A B I社製） の標準的な反応■分離 -解析条件により両鎖について解読した。 実施例 1 ： a， 一炭素 ·炭素二重結合を有する a—ハロカルボニル化合物 の還元活性の検出
還元活性の検出は、 a—クロ口アクリル酸またはひ一クロロー α, β—ブ テン酸を基質として、 還元生成物である a—クロ口プロピオン酸、 ひ一クロ 口酪酸を、 ガスクロマトグラフィーを用いて定量した。 遠心に供して菌体を 除去した反応液または培地上清 0.4m Lに、 0.4mLの 2N HC 1を混合し た後、 次の条件でガスクロマトグラフィ一分析を行つた。
本体： 0。ー7 （株式会社島津製作所製） 、
カラム ： Th e r mo n— 3000/SH I NCARBON A 2.6mm X2. lm、
キヤリァガス ：窒素 5 OmL/m i n、
検出： F I D、
カラム温度： 200°C (一定） 、
インジェクション： 2〜： L 0マイクロリタ一， 260。C、
記録：クロマトコーダ一 12 (S I C) 実施例 2
(1) シユードモナス 'エスピー · S D 811株の還元基質を炭素源とした シユードモナス 'エスピー · SD 811株を次の培地において培養した。 培地組成： a—クロ口アクリル酸 (2 g/L) 、 酵母抽出物 （0.5g,L) 、 硫酸アンモニゥム （2gZL) 、 リン酸二水素ナトリウム （l g/L) 、 リ ン酸水素二カリウム （l gZL) 、 硫酸マグネシウム （0. lg/L) 。
培地の作成は以下のような手順にて行った。 前記成分のうち、 ひ一クロロアクリル酸および硫酸マグネシウムを除く全 成分を 95 OmLの水に溶解して p H値を 7.0に調整し、 5 Lのフラスコに 入れ、 121 °Cで 20分間滅菌した。 続いて、 この培地の温度が 70 °C程度 まで下がった後、 α—クロロアタリル酸および硫酸マグネシゥムを 50mL の水に溶解して p Hィ直を 7.0に調整した溶液を滅菌フィルタ一で滅菌した後 混合した。 さらに酸素の供給や pH調節をすることなく、 この培地に 5%予 備培養物 （OD 660 nm = l.10) を接種し 30°Cで 12〜24時間、 振と うしながら株を培養した。
(2) シユードモナス ·エスピー■ SD 811株の還元生成物を炭素源とし た培養
シユードモナス■エスピー · SD811株を次の培地において培養した。 培地組成： L—乳酸 （2 gZL) 、 酵母抽出物 （0.5g/L) 、 硫酸アンモ ニゥム (2 g/L) 、 リン酸ニ水素ナトリウム (1 g/L) 、 リン酸水素二 カリウム (1 g/L) 、 硫酸マグネシウム (0.1 gZL) 。
培地の作成は以下のように行った。
前記成分のうち、 L—乳酸および硫酸マグネシゥムを除く全成分を 950 raLの水に溶解して pH値を 7.0に調整し、 5 Lのフラスコに入れ、 121 °Cで 20分間滅菌した。 続いて、 この培地の温度が 70°C程度まで下がった 後、 L—乳酸および硫酸マグネシゥムを 50 m Lの水に溶解して p H値を 7. 0に調整した溶液を滅菌フィルターで滅菌した後混合した。 さらに酸素の供 給や pH調節をすることなく、 この培地に 5%予備培養物 （OD660 nm = 1.10) を接種し 30 °Cで 12〜 24時間、 振とうしながら株を培養した。 実施例 3 ： α—クロ口アクリル酸を基質とする菌体懸濁反応
実施例 2において、 2種の異なる炭素源を用いて培養したシユードモナス •エスピー . SD 811株を、 それぞれ遠心分離に供して菌体を回収した。 この菌体を、 α—クロロアクリル酸 0.2%、 リン酸緩衝液 100 mM ( p H7. 3) を含む溶液 （ p H7.3に調整） 20 m Lに懸濁し、 28 °Cで振とうして反 応させた。
反応液から、 特定の時点で 0.5m Lのサンプルを採取し、 遠心に供して菌 体を除去した上清 0.4m Lに、 0. lmLの 6NHC 1を混合した後、 0.4m L の酢酸ェチルにより生成物を抽出し、 抽出サンプルを実施例 1の方法により 分析した。
還元基質を用いて培養した菌体の反応では、 反応直後からひ一クロロアク リル酸の消費に伴って、 一クロ口プロピオン酸の位置にピークが出現した。 反応速度は全ての基質を消費するまでほぼ直線的であった。 一方、 乳酸を炭 素源として培養した菌体の反応では、 反応開始直後は α—クロ口アクリル酸 の消費も α—クロ口プロピオン酸のピークも見られず、 開始から約 5時間次 第に還元活性が上昇した。 結果を図 1に示す。 実施例 4
(1) バークホルデリア 'エスピー · SD816株の還元基質を炭素 とし た培養
バークホルデリア 'エスピー ' SD816株を次の培地において培養した。 培地組成： ひ一クロ口アクリル酸 （2 g/L) 、 酵母抽出物 （0.5gZL) 、 硫酸アンモニゥム （2 g/L) 、 リン酸二水素ナトリウム （l g/L) 、 リ ン酸水素二カリウム （l gZL) 、 硫酸マグネシウム （O.lgZL) 。
培地の作成は以下のように行った。
前記成分のうち、 一クロロアクリル酸および硫酸マグネシウムを除く全 成分を 950 mLの水に溶解して pH値を 7.0に調整し、 5 Lのフラスコに 入れ、 121°Cで 20分間滅菌した。 続いて、 この培地の温度が 70°C程度 まで下がった後、 α—クロ口アクリル酸および硫酸マグネシウムを 5 OmL の水に溶解して p H値を 7.0に調整した溶液を滅菌フィルターで滅菌した後 混合した。
さらに酸素の供給や p H調節をすることなく、 この培地に 5 %予備培養物 (OD 660 nm = l.10) を接種し 30°Cで 12〜24時間、 振とうしなが ら株を培養した。
(2) バークホルデリア 'エスピー ' SD 816株の糖を炭素源とした培養 バークホルデリア 'エスピー · SD816株を次の培地において培養した。 培地組成： D—グルコース （2 gZL) 、 酵母抽出物 （0.5gノ L) 、 硫酸 アンモニゥム （2 gZL) 、 リン酸二水素ナトリウム （l gZL) 、 リン酸 水素二カリウム （l gZL) 、 硫酸マグネシウム （0. lgZL) 。
培地の作成は以下のように行った。
前記成分のうち、 D—グルコースおよび硫酸マグネシゥムを除く全成分を 95 OmLの水に溶解して p H値を 7.0に調整し、 5 Lのフラスコに入れ、 121°Cで 20分間滅菌した。 続いて、 この培地の温度が 70°C程度まで下 がつた後、 D—グルコースおよぴ硫酸マグネシゥムを 50mLの水に溶解し て p H値を 7.0に調整した溶液を滅菌フィルタ一で滅菌した後混合した。
さらに酸素の供給や、 pH調節をすることなく、 この培地に 5%予備培養 物 （OD 660 nm = l.10) を接種し 30°Cで 12〜24時間、 振とうしな がら株を培養した。 実施例 5 ： ひ一クロローひ， |3—ブテン酸を基質とする菌体懸濁反応
実施例 4において、 2種の異なる炭素源を用いて培養したバークホルデリ ァ 'エスピー ' SD 816株を、 それぞれ遠心分離に供して菌体を回収した。 この菌体を、 α—クロロー α , β _プテン酸 0.2%、 リン酸緩衝液 100m M (pH7.3) を含む溶液 （pH7.3に調整） 20mLに懸濁し、 28°Cで振 とうして反応させた。 反応液から、 特定の時点で 0.5m Lのサンプルを採取し、 遠心に供して菌 体を除去した上清 0.4m に、 0. ImLの 6NHC 1を混合した後、 0.4m L の酢酸ェチルにより生成物を抽出し、 抽出サンプルを実施例 1の方法により 分析した。
還元基質を用いて培養した菌体の反応では、 反応直後から α—クロ口一α, βープテン酸の消費に伴って、 α—クロ口酪酸の位置にピークが出現した。 反応速度は全ての基質を消費するまでほぼ直線的であった。 一方、 乳酸を炭 素源として培養した菌体の反応では、 反応開始直後はひ一クロ口一ひ， β— ブテン酸の消費も α—クロ口酪酸のピークも見られず、 開始から約 6〜10 時間の間に次第に還元活性が上昇した。 結果を図 2に示す。 実施例 6 ：タンパク質生成パターンの二次元電気泳動による角科斤
(1) 粗酵素抽出液の調整
実施例 2で還元活性が異なることを確認したシユードモナス ■エスピー■ SD81 1株 18時間培養菌体を遠心分離に供して菌体を回収した。 滅菌水 で洗浄した後、 50mMリン酸緩衝液 （pH7.5) に再懸濁した。 菌体を超 音波破碎機 (BI0MC 7500 ULTRASONIC PROCESSOR (PULSED, 50 of %DUTY CYC LE， about 4.5 of OUT PUT CONTROL) ) で破砕し、 未破砕の細胞と不溶物を 遠心 （16400Xg， 5m i n, 4 °C) して除去した。
同様にして、 実施例 5で還元活性が異なることを確認したバークホルデリ ァ ·エスピー■ SD 8 16株の粗酵素抽出液も調整した。
(2) 一次泳動：等電点電気泳動
尿素 1.92 g、 30 %アクリルアミド混液 （アタリルァミド 29.2% (w/ V ) 、 N— N' ーメチレン一ビスアタリルァミ ド 0.8% (w/v) ) 0.53m L、 脱イオン水 l.OmLを混合し、 尿素が完全に溶解した後、 10%ノニデ ッ ト P— 40 0.8mL、 バイオライ ト 3/10アンフォォライト (BI0-RA D) 200 z L、 10%過硫酸アンモニゥム 8 L, TEMED 5.6μ 1^を 混合した。 この溶液を、 一方をシールしたガラス管 （長さ 13mmX内径 2 mm) に速やかに注入し、 8 M尿素溶液を積層し 1〜 2時間静置してゲルを 固化させた。
作成したゲルをセミマイクロドライゲル電気泳動装置 （K S— 81 10、 オリエンタルインスツルメンッ社製） に設置し、 泳動上層と下層にそれぞれ
20 mM水酸化ナトリウム溶液と 10 mM硫酸溶液を入れ、 200 V 1 5分、
300 V 15分、 400 V 30分プレランを行った。
泳動上層とゲル上部の水酸化ナトリウム溶液を取り除き、 試料溶液 （ 10 0〜300 μ g/12.5/i Lのタンパク質を含む溶液、 10%ノニデット P—
40 3 μ L、 バイオライト 3 10アンフォオライト (BI0-RAD) 1.5μ L、 2—メルカプトエタノール 1.5μ Lを混合して調整したもの） をシリンジを 用いてゲル上部に供し、 続いてサンプルオーバーレイ溶液 （尿素 0.48g、 1 0%ノ -デット P— 40 200 μ L、 バイオライト 3 10アンフォオラ イト （BIO- RAD) 50 L、 脱イオン水 38 OmLを混合したもの） 20 L、 さらに 2 OmM水酸化ナトリゥム液 （適量） を積層し、 泳動上層に 20 mM水酸化ナトリゥム液を満たし、 400 Vで 12時間、 続いて 800 Vで 1時間電気泳動した。
一次泳動の終了したゲルをガラス管から取り出し、 4 OmLの脱イオン水 中で 5分間室温振とうし、 続いて 4 m Lの平衡化緩衝液 （0. δΜΤ r i s— HC 1 (pH6.8) 0.5mL、 10 % S D S 1.6mL、 0.1%B P BO.05mL、 2—メルカプトエタノール 2mL、 脱イオン水 1.65m Lを混合する） で 20 分間室温振とうした。
(3) 二次泳動： SDS— PAGE
SDS— PAGEはスラブゲル装置 （KS - 8000 SE type, MARYS0L) を用レヽ て通常の方法により行った。 すなわち、 平衡化が終了したゲルを 12.5% SD S— PAGEスラブゲル上端に 0.5°/oァガロースを用いて固定し、 25 mA 定電流で約 4時間泳動した。
(4) タンパク質の検出： CBB染色
泳動終了したスラプゲル中のタンパク質の検出は、 通常の C B B染色によ つて行った。 すなわち、 CBB溶液 （クマジ一ブリリアントプル一 R— 25 0 0.25gをメタノール 50 OmL、 酢酸 50mL、 脱イオン水 450m L に溶解） にて 1時間染色した後、 脱イオン水で洗浄し、 続いて脱色液 （メタ ノーノレ 50m L， 酢酸 70mL， 脱イオン水 880mL) で一昼夜脱色した。 その後ゲルを保存液 (87% (w/v) グリセ口ール液 23mL, ェタノ ール 150 m L， 脱ィオン水 327 m L) に 3時間浸透した。
シユードモナス ■エスピー · SD 81 1株の L一乳酸培養菌体および α— クロロアタリル酸培養菌体、 バークホルデリア 'エスピー ' SD81 6株の D—グルコース培養菌体と α—クロ口アクリル酸培養菌体から調整した粗酵 素抽出液試料の二次元電気泳動分離パターンを比較した結果、 それぞれの菌 株の組で、 ほぼ同じ位置に、 α—クロ口アクリル酸培養菌体に特徴的な生成 タンパク質が複数あることを見いだした。 シユードモナス ■エスピー ' SD 81 1株の結果を図 3に示す。 実施例 7 (1) ：末端配列の決定
実施例 6で見いだした α—クロロアタリル酸培養菌体に特徴的なタンパク 質を解析するため、 実施例 6で示したバークホルデリア 'エスピー ' S D 8 16株の α—クロロアクリル酸培養菌体の試料について二次電気泳動分離し たタンパク質を、 セミ ドライ転写装置 （TRANS- BLOT R SD Semi-dry Electro phoretic Transfer Cell (Bio-Rad) ) を用いて PVDF膜 (Immobilon TM Transfer membranes pore size： 0.45m L, MILLIP0RE)に転写した。
転写は同機の標準的な使用法に従い、 限界電流 0.8mA、 13V、 0.22〜0. 26Aで 45分間で行った。 転写し終わった P VDF膜を CBB溶液で染色し た後、 α—クロロアタリル酸培養菌体試料で特徴的に出現した 3種のタンパ ク質に相当するスポットを切り出し、 ペプチドシーケンサー （Model 491 Pr ocise (Applied Biosystems) ) にて分析した。 その結果、 その 1種は既知酵 素である脱ハロゲン酵素 （デハロゲナーゼ、 L一 DEX) であることが判明 したが、 残る 2種は配列番号 1および 3に示した新規なペプチド配列を有す ることが判った。
実施例 7 (2) ：内部配列の決定
さらに配列情報を得るため、 実施例 7で示した新規な 2種のタンパク質に ついて、 リジルエンドぺプチダーゼによるイングノレ （in gel) 部分分解を行 つた。
実施例 6の二次元電気泳動後、 C B B染色したゲルから目的の 2スポッ ト に相当する部分を切り出し、 そのゲル片にリジルェンドぺプチダーゼを含む トリス緩衝液を加え、 35 °Cでー晚消化した後、 その反応液を下記条件の逆 相 HP LCに供して、 断片化ペプチドを分離した。
カラム ： TSKg e l OD S— 120 T、
溶媒： TFA/Ac e t o n i t r i l e系、 グラジェント溶出、 流速： L OmL/ m i n、
検出波長： 210 n m。 得られたクロマトグラムから適当なピークを選択し、 そのフラクションを ペプチドシーケンサー (Model 491 Procise (Applied Biosystems) ) にて分 析した結果、 配列番号 2、 4および 5に示す 3つの内部アミノ酸配列が得ら れた。 実施例 8 ： CAA43 N末端部分遺伝子断片の取得 まず、 配列番号 1および 2に記載の、 CAA43の N末端アミノ酸配列と 内部ァミノ酸配列に基づき縮重プライマー 1および縮重プライマー2をそれ ぞれ設計した。
バークホルデリ了 ·エスピー · SD 816株 染色体 DNAの抽出には QI AGEN genomic- tip 100/Gおよび QIAGEN Genomic DNA buffer set (いずれも Q I AGE N社製） を使用した。
BIO-RAD iCycler (BIO- RAD社製） を用い、 以下の条件で P CRを行った。
[反応液組成]
バークホルデリア 'エスピー · SD 816株 染色体 DN 5 n g プライマー 1 (配列番号 1に対応） 10 p m o 1 プライマー 2 (配列番号 2に対応） 10 p m o 1 T a K a R a L AT a q 0.5u n i t dNT P混合物 （2.5mMe a c h) 2.0 L 10 XLA PCR BUFFERII (Mg 2+ Free) 2.5/i L 25mM Mg C 12 2.5/i L 滅菌蒸留水 25 Lに調整 [反応サイクル]
1サイクル：
変性 （95°C、 4m i n) 、
アニーリング (47.9。C、 lm i n) 、
伸長 （72°C、 2m i n) 。
2〜 30サイクノレ ：
変性 （ 95 °C、 lm i n) 、
アニーリング (47.9°C、 lm i n) 、
伸長 （ 72 °C、 2m i n) 。
このバークホルデリア ·エスピー■ SD 816株 染色体 DNAを铸型と した PCRにより CAA43遺伝子の一部をコードすると考えられる、 DN A断片 （350 b p) を得た。 この部分断片の配列を配列番号 1 1に示した。 実施例 9 ： CAA 43の C末端領域をコードする遺伝子断片の取得
実施例 8で得られた配列番号 1 1で示される塩基配列に基づいて、 配列番 号 8および 9に記載の下流方向のプライマー 2種を設計した。 これらのブラ イマ一と TaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kitを用いて CAA 43の C末端 側をコードする遺伝子のクローニングを試みた。 反応等は、 K i tに添付の 標準的な手法に従って行った。 その結果、 Xb a I処理したバークホルデリ ァ ·エスピー . SD 816株 染色体 DNAを铸型とした PCRで DNA断 片 （1.3k b) を取得し、 その塩基配列を決定した。 塩基配列を配列番号 1 2に示したが、 本配列中に終止コドンを確認した。 実施例 10 ： CAA43の N末端領域およびその上流に存在する遺伝子の取 得
実施例 8で得られた配列番号 1 1で示される塩基配列に基づいて、 配列番 号 10に記載の inverted PCR (ゲノム工学の基礎参照、 （2002) 東 京化学同人） 用のプライマーを設計した。 これと配列番号 8に記載のプライ マーを組み合わせて、 s a 1 I処理したバークホルデリア■エスピー ' SD 81 6株 染色体 DN Aを铸型として下記条件により inverted PCRを行 つた。
[反応液組成]
SD816株染色体DNA S a 1 I処理物 200 n g プライマー 1 (配列番号 8) 10 pmo 1 プライマー 2 (配列番号 10) l O pmo l T aKaR a LAT a q 2.5u n i t dNTP混合物 （2.5mMe a c h) 8.0 μ L·
10 XLA PCR BufferlKMg 2+ Free) 5.0 μ L·
25mM Mg C 12 5.0 μ L· 滅菌蒸留水 5 0 μ L·に調整 [反応サイクル] 変性 （94°C、 4.5m i n) 、
ァニーリング （55°C、 30 s e c) 、
伸長 （72°C、 4m i n) 。
2〜30サイクノレ ：
変性 （ 94 °C、 30 s e c) 、
ァエーリング （55°C、 30 s e c) 、
伸長 （ 72 °C、 4m i n) 。
その結果、 約 1.3k bの DNA断片が取得された。 この断片の塩基配列を 配列番号 13に示したが、 断片には C AA 43の N末端領域ァミノ酸配列 0. 5k bの他、 配列番号 4で示される CAA 6 7の配列をコードする部分が含 まれており、 CAA67の C末端領域アミノ酸配列をコードすると考えられ る部分 0.8k bを含むことが判明した。 CAA67のコード領域は CAA4 3のコード領域の上流に連続して存在しており、 両遺伝子はクラスターを形 成していることが明らかになった。 実施例 11 ： CAA67の N末端をコードする DN A断片の取得
実施例 10で明らかになった、 C A A 67の内部アミノ酸配列をコ一ドす る塩基配列を基に、 配列番号 14および 15に記載の CAA67遺伝子の上 流方向のプライマー 2種を設計した。 これらのプライマーと TaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kitを用いて CAA 67の N末端側をコードする遺伝子の クローユングを試みた。 反応等は、 K i tに添付の標準的な手法に従って行 つた。 その結果、 P s t I処理したバークホルデリア 'エスピー■ SD 8 1 6株染色体 DNAを铸型とした PCRで DNA断片 （1.8k b) を取得した。 決定した塩基配列を配列番号 1 2に示したが、 配列番号 4, 5に記載の C A A 6 7の内部アミノ酸配列と配列番号 3に記載の CAA 6 7の N末端アミノ 酸配列をコ一ドする D N A断片であることを確認した。 実施例 1 2 ：各遺伝子の全配列と遺伝子クラスター配列の決定：
実施例 8、 9、 1 0で得られた D N A断片により、 GENETYX— WIN/ATSQ核 酸配列自動結合ソフトウエアにより、 配列番号 1 7に記載の C A A 4 3遺伝 子の全塩基配列を決定した。 同様にして、 実施例 1 0および 1 1で得られた DN A断片により、 配列番号 1 8に記載の CAA6 7遺伝子の全塩基配列を 決定した。 さらに、 実施例 8〜1 1で得られた DNA断片により、 両遺伝子 が存在する配列番号 1 9に記載のクラスター塩基配列を決定した。 配列番号 20と 2 1は、 それぞれ配列番号 1 7と 1 8に対応するァミノ酸配列である。 実施例 1 3 ： CAA43及び CAA6 7を含む遺伝子断片の作成
実施例 1 2で得られた配列番号 1 9で示される塩基配列に基づいて、 配列 番号 22および 23に記載のプライマーを設計した。 これらを組み合わせて、 バークホルデリア 'エスピー ■ SD 8 1 6株 染色体 DN Aを鎵型として下 記条件により PCRを行い、 還元酵素遺伝子全長をコードする DN A断片 2 9 1 3 b pを作成した。
[反応液組成] (全量 50 /z L)
SD 8 1 6株染色体 DNA (5 n g/μ L) 4. 0 μ L 10 /iMプライマー 1 (配列番号 22) 1. 5 μ L·
Ι Ο ^Μプライマー 2 (配列番号 23) 1. 5 U L TOYOBO KOD-P l u s- (l u n i t / μ L) 1. 0 L dNTP混合物 （2.5mMe a c h) 5. 0 μ L 1 0 XKOD PCR Buffer (Mg 2 +Free) 5. 0 μ L 2 5mM Mg S 04 2. 0 μ L· 滅菌蒸留水 30 μ L·
[反応サイクル]
1サイクル：
変性 （94°C、 2 m i n ) 、
2〜30サイクル：
変性 （ 94 °C、 1 5 s e c) 、
ァニーリング (52. 3°C、 30 s e c) 、
伸長 （ 68 °C、 3m i n) 。 実施例 1 4： CAA43及び CAA6 7発現系の構築
実施例 1 3で得られた DNA断片を発現ベクター ρΕΤΙΟΙ/D- T0P0の T7プロ モーター下流に揷入し、 大腸菌 B L 2 1 (DE 3) 株 （エツシェリシァ -コ リ B L 2 1 (DE 3) 、 Escherichia coli BL21(DE3)) に導入した。 インサ 一トとベクターのライゲーション、 形質転換および遺伝子の発現には PET101 Directional T0P0発現キット （Invitrogen) を用いた。 実施例 1 5 ： CAA43及び CAA6 7活性菌体を用いた還元反応
実施例 14で得られた菌体を、 5m lの LB培地 （1% Bacto Tryptone (DI FCO)、 0.5% Bacto Yeast Extract (DIFCO)、 1% Sodium chloride (Nacalai T esque) 、 lOOmg/ral アンピシリン） で培養 （ 3 7 °C、 1 3 0 r p m、 1 0 h) した。 得られた菌体を lm 1の 6 OmMリン酸バッファ （ 1 mM DT T添加、 ρΗ7.1) に懸濁した。 菌体を超音波処理 （BRANSON Digital Sonif ier) により破砕し、 遠心 （15,000 r pm、 4°C、 10分） を行った。 得ら れた菌体破砕液上清の還元活性を実施例 1の方法に従い測定した。 その際、 各種の補酵素を反応液に添加して還元活性を測定したところ、 反応液に NADP H (還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド燐酸） を添加した時のみ 十分な還元活性が観察された。
そこで次に、 反応液 （3mM 2- CM、 0.65mM NADPH、 60mM Ammonium acetate buffer (pH7.1)) に NAD P Hを 1 / 10容量添加し、 光路長 0.2cmのセル 中、 30°Cで反応させた時の経時的な NAD PHの減少を 339 nmの吸光 度変化で測定した。 1分間当たりに lmmo 1の NADPHを減少させる酵 素量を酵素活性の l un i tと定義し、 比活性 （units/mg) をもとめた。 形 質転換体と E. coli BL21 (DE3)の 2-CAA還元酵素活性を表 1に示した。 形質転換 体で顕著な 2 - CM還元活性が認められた。 表 1 形質転換体と宿主の 2 - CM還元酵素活性
Figure imgf000037_0001
産業上の利用可能性
本発明は、 微生物の産生する酵素を用いて Q! , β一炭素■炭素二重結合を 有する α—置換カルボニル化合物の炭素■炭素二重結合を還元して対応する ひ—置換— α， 一飽和カルボニル化合物を、 経済性、 操作性、 プロセスの 安全性に優れた方法で製造するのに有用な高い触媒活性を有する関連酵素を コードする塩基酸配列を提供する。 さらには、 a位についてプロキラルな分 子である α， β一炭素 .炭素二重結合を有する α—置換カルボ-ル化合物の 炭素 ·炭素二重結合に水素添加して、 対応する α位について医農薬等のキラ ル構築プロックとして有用な高純度の光学 性なひ一置換一 ， β一飽和力 ルポニル化合物を製造するのに有用な還元酵素おょぴその遺伝子を提供する ものである。 あて名 名称 寄託日 "HTti乇 'έ" 日本国茨城県つくば市 独立行政法人 1998年 4月 2日 FER BP- 6767 東 1丁目 1番地 1 産業技術総合研究所 1998年 4月 2日 FERM BP- 6768 中央第 6 特許生物寄託センター 1998年 4月 2日 FERM BP - 6769 (郵便番号 30S- ¾66) 1999年 6月 28日 FERM BP- 6770

Claims

請求の範囲
1. ο;—置換— a, ]3—不飽和カルボニル化合物の還元活性を有するタンパ ク質をコードする、 配列番号 1 9で示される塩基配列からなる DNAまたは 前記 DNAとストリンジェントな条件でハイブリダィズする DN Aからなる fe十。
2 · a—置換— ， —不飽和カルボ-ル化合物の還元活性を有するタンパ ク質をコードする、 配列番号 1 7で示される塩基配列からなる DN Αまたは 前記 DNAとストリンジェントな条件でハイブリダィズする DNAからなる 遺伝子。
3. a一置換一 a , β一不飽和カルボニル化合物の還元活性を有するタンパ ク質をコードする、 配列番号 1 8で示される塩基配列からなる D Ν Αまたは 前記 D N Aとストリンジェントな条件でハイブリダイズする D N Aからなる 遺伝子。
4. 配列番号 20で示されるアミノ酸配列及び配列番号 2 1で示されるアミ ノ酸配列をコードする DN A配列を含むことを特徴とする α—置換一α， β —不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子。
5. 配列番号 20で示されるァミノ酸配列または前記ァミノ酸配列において 1若しくは数個のァミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたァミノ酸配列か らなり、 かつ α—置換一 α， β—不飽和カルボ二ルイヒ合物の還元活性を有す るタンパク質をコードする遺伝子。
6 . 配列番号 2 1で示されるアミノ酸配列、 または前記アミノ酸配列におい て 1若しくは数個のァミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたァミノ酸配列 からなり、 かつ α—置換— α , β—不飽和カルポニル化合物の還元活性を有 するタンパク質をコードする遺伝子。
7 . α—置換一 α， ]3—不飽和カルボ二ルイヒ合物の還元酵素遺伝子が、 ァセ トノ クタ一 (Acetobacter)属、 ァクチノマイセス（Actinomyces)属、 ァシネト パクター (Acinetobacter)属、 ァグロノくクテリゥム (Agrobacterium)属、 エア 口モナス (Aeromonas)属、 アル力リジ ネス（Alcaligenes)属、 アースロバク ター（Arthrobacter)属、 ァゾトバクタ一（Azotobacter)属、 バシラス（Bacill us)属、 ブレビバクテリゥム（Brevibacterium)属、 バークホルデリ了 (Burkho lderia)属、 セノレロモナス (Cellulomonas)属、 コリネノ クテリゥム (Coryneba cterium)属、 ェンテロノ クタ一 (Enterobacter)属、 ェンテロコッカス (Enter ococcus)属、 ェッシェリッシァ (Escherichia)属、 フラポノ クテリゥム (Flav obacterium)属、 ダルコノノ、クター (Gluconobacter)属、 ノヽロノくクテリウム_ ^ alobacterium)属、 ハロコッカス (Halococcus)属、 クレブンラ (Klebsiella) 属、 ラク 卜ノ ンラス (Lactobacillus)属、 ミクロノくクテリゥム (Microbacteri um属、 ^クロコッカス丄 Micrococcj丄 s) 、 クロ リスホラ (Micropolyspor §i属、 マイ： Jノ クテリゥム (Mycobacterium)属、 ノカノレディァ（Nocardia)属、 シユードモナス (Pseudomonas)禺、 シユードノカノレディァ (Pseudonocardia) 属、 口ドコッカス（Rhodococcus)属、 口ドノ クタ一（Rhodobacter)属、 セラチ ァ（Serratia)属、 スタフイロコッカス（Staphylococcus)属、 ストレプトコッ カス（Streptococcus)属、 ストレプトマイセス（Streptomyces)属及びキサン トモナス（Xanthomonas)属からなる群より潠ばれる 1種以上の微生物に由来 するものである請求の範囲 1乃至 6のいずれかに記載の α—置換—a , β— 不飽和力ルポニル化合物の還元酵素遺伝子。
8 . α—置換— α ， ]3—不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子が、 シュ 一ドモナス（Pseudomonas)属微生物に由来する請求の範囲 7に記載のひ一置 換ーひ ， β一不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子。
9 . α—置換一 α ， —不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子が、 バー クホルデリァ（Burkholderia)属微生物に由来する請求の範囲 7に記載の α— 置換一 α ， β一不飽和カルボエル化合物の還元酵素遺伝子。 1 0 . シユードモナス属微生物が、 シユードモナス 'エスピー · S D 8 1 0 株（Pseudomonas sp. SD810)である請求の範囲 8に記載の α—置換一 α ， β— 不飽和カルポニル化合物の還元酵素遺伝子。
1 1 . シユードモナス属微生物が、 シユードモナス 'エスピー · S D 8 1 1 株（Pseudomonas sp. SD811)である請求の範囲 8に記載のひ一置換一 a， β— 不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子。
1 2 . シユードモナス属微生物が、 シユードモナス ·エスピー · S D 8 1 2 株 (Pseudomonas sp. SD812)である請求の範囲 8に記載の α—置換一ひ ， β - 不飽和カルポニル化合物の還元酵素遺伝子。
1 3 . バークホルデリァ属微生物が、 バークホルデリア 'エスピー ' S D 8 1 6株（Burkholderia sp. SD816)である請求の範囲 9に記載の α—置換一 ， β一不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子。
4 . 還元酵素が、 炭素 ·炭素二重結合の還元によって、 α位がキラルな S 体化合物を生成する触媒能を有することを特徴とする請求の範囲 1乃至 1 3 のいずれかに記載の a一置換一 a , β一不飽和カルボニル化合物の還元酵素 l fe子。
1 5. ひ一置換一ひ， ]3—不飽和カルボニル化合物が、 下記一般式 （1)
Figure imgf000042_0001
(式中、 R1 R2、 R 3は独立に水素原子、 ハロゲン原子、 炭素数 1〜 6の 直鎖状もしくは分岐状脂肪族炭化水素基、 炭素数 1〜 6の直鎖状もしくは分 岐状アルコキシ基、 ヒドロキシル基、 カルボキシル基、 置換されていてもよ い芳香族基または含窒素、 含酸素もしくは含硫黄複素環基を表わし、 R4は ヒドロキシル基、 炭素数 1〜 3の直鎖状もしくは分岐状アルコキシ基または 1級〜 3級アミノ基を表わす。 但し、 R 3は水素原子であることはない。 ） で示される化合物であり、 還元された化合物が下記一般式 （2)
Figure imgf000042_0002
(式中、 Ri R4は上記と同じ意味を表わす。 ） で示される化合物である請 求の範囲 1乃至 1 4のいずれかに記載の α—置換— α， —不飽和カルボ二 ル化合物の還元酵素遺伝子。
6. α—置換一ひ， 0—不飽和カルボニル化合物が、 下記一般式 （1)
Figure imgf000043_0001
(式中、 R R2が水素原子、 R3がハロゲン原子、 R4がヒ ドロキシル基 を表わす。 ） で示される α アクリル酸であり、 還元された化合物が、 下記一般式 （2)
Figure imgf000043_0002
(式中、 Ri R4は上記と同じ意味を表わす。 ） で示される絶対配置 Sの ο; プロピオン酸である請求の範囲 1 5に記載の α—置換一 α i3—不飽 和力ルポ-ル化合物の還元酵素遺伝子。 17. R3が臭素原子である請求の範囲 16に記載の α—置換一 β—不 飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子。
18. R3が塩素原子である請求の範囲 16に記載の α—置換一 ]3—不 飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子。
1 9. R 3がフッ素原子である請求の範囲 16に記載の α—置換一 α β— 不飽和カルボニル化合物の還元酵素遺伝子。
20. 請求の範囲 1乃至 19のいずれかに記載の 一置換一 α, 0—不飽和 カルボ二ルイ匕合物の還元酵素遺伝子 DN Αを含んでなることを特徴とするプ ラスミ ド。
2 1 . 請求の範囲 1乃至 1 9のいずれかに記載の ( 一置換一 α， β一不飽和 カルボ-ル化合物の還元酵素遺伝子と、 N AD Ρ Η類を補酵素として機能す る酵素遺伝子を共に含むことを特徴とするプラスミ ド。
2 2 . 請求の範囲 2 0または 2 1に記載のプラスミ ドで形質転換されてなる 形質転換体。
2 3 . 請求の範囲 2 0に記載のプラスミ ドと、 NA D P H類を補酵素として 機能する酵素遺伝子を含むプラスミ ドで同時に形質転換されてなる形質転換 体。
2 4 . 請求の範囲 1乃至 1 9のいずれかに記載の α—置換一ひ， β一不飽和 カルボニル化合物の還元酵素遺伝子の発現産物であるひ一置換—ひ， β—不 飽和力ルポ-ル化合物の還元活性を有するタンパク質、 または前記タンパク 質を構成する 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたァ ミノ酸配列からなり a—置換一 α， β一不飽和カルボニル化合物の還元活性 を有するタンパク質。
2 5 . 配列番号 2 0で示されるァミノ酸配列または前記ァミノ酸配列質にお いて 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配 列からなり、 かつひ一置換一 ， —不飽和カルボ-ル化合物の還元活性を 有するタンパク質。
2 6 . 配列番号 2 1で示されるアミノ酸配列または前記アミノ酸配列におい て 1若しくは数個のァミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたァミノ酸配列 からなり、 かつ α—置換—a， ]3—不飽和カルボニル化合物の還元活性を有 するタンパク質。
2 7 . 配列番号 1 9に示される塩基配列のうち 6 3 1番目の塩基より上流側 の塩基配列から選択された塩基配列と、 3 5 4 3番目の塩基より下流側の塩 基配列から選択された塩基配列とを相互に逆鎖の関係になるように組み合わ せたプライマーを用いることを特徴とする α—置換一 α , β—不飽和カルボ ニル化合物の還元活性を有するタンパク質をコ一ドする遺伝子の製造方法。
2 8 . 配列番号 1 9に示される塩基配列のうち 6 3 1番目の塩基より上流側 の塩基配列から選択された塩基配列と、 2 2 7 4番目の塩基より下流側の塩 基配列から選択された塩基配列とを相互に逆鎖の関係になるように組み合わ せたプライマーを用いることを特徴とする置換一 α， β一不飽和力ルポ-ル 化合物の還元活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の製造方法。
2 9 . 配列番号 1 9に示される塩基配列のうち 2 5 4 7番目の塩基より上流 側の塩基配列から選択された塩基配列と、 3 5 4 3番目の塩基より下流側の 塩基配列から選択された塩基配列とを相互に逆鎖の関係になるように組み合 わせたプライマーを用いることを特徴とする α—置換一ひ， β一不飽和カル ボニル化合物の還元活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の製造方法。
3 0 . 請求の範囲 2 2乃至 2 3に記載の形質転換体培養物および/または処 理物を用いることを特徴とする α—置換 _ α , β一不飽和カルボエル化合物 の還元方法。
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