WO2003072134A1 - Diagnostics et therapeutiques pour la pneumonie interstitielle - Google Patents

Diagnostics et therapeutiques pour la pneumonie interstitielle Download PDF

Info

Publication number
WO2003072134A1
WO2003072134A1 PCT/JP2003/002372 JP0302372W WO03072134A1 WO 2003072134 A1 WO2003072134 A1 WO 2003072134A1 JP 0302372 W JP0302372 W JP 0302372W WO 03072134 A1 WO03072134 A1 WO 03072134A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibody
region
chain
amino acid
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2003/002372
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Ryuzo Ueda
Shigeki Sato
Takeo Yoshinouchi
Takashi Niimi
Shigeki Shimizu
Tadaaki Eimoto
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
KH Neochem Co Ltd
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd filed Critical Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Priority to EP03743073A priority Critical patent/EP1491209A4/en
Priority to US10/505,980 priority patent/US20050095242A1/en
Priority to AU2003211550A priority patent/AU2003211550A1/en
Priority to JP2003570878A priority patent/JPWO2003072134A1/ja
Publication of WO2003072134A1 publication Critical patent/WO2003072134A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5047—Cells of the immune system
    • G01N33/505—Cells of the immune system involving T-cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]

Definitions

  • the present invention provides a prophylactic, diagnostic or therapeutic agent for interstitial pneumonia, comprising an anti-CCR4 (CC chemokine receptor 4) antibody and / or an anti-CXCR3 (CRC chemokine receptor 3) antibody as an active ingredient.
  • the present invention relates to a diagnostic agent and a method for distinguishing between idiopathic idiopathic interstitial pneumonia and atypical idiopathic interstitial pneumonia using a CCR4 antibody and an anti-CXCR3 antibody.
  • Idiopathic interstitial pneumonia is an inflammatory pulmonary disease of unknown cause, which is seen in relatively older men, with a prevalence of approximately 3.4 per 100,000 population.
  • the chronic type of idiopathic interstitial pneumonia is classified into a typical case (idiopathic pulmonary fibrosis; IPF) and an atypical case (non-specific interstitial pneumonia; NS IP). It is based on The features of idiopathic interstitial pneumonia are pathologically characterized by accumulation of mononuclear cells in the lung tissue, followed by deposition of collagen, etc., and progression of fibrosis. Causes respiratory depression. The pathological features are similar in both typical and atypical cases.
  • interstitial pneumonia is known as a symptom frequently observed in collagen diseases such as erythematosus, rheumatoid arthritis (RA) and scleroderma.
  • the frequency is the highest in scleroderma, more than 50-70%, In rheumatism, it is 5 to 20% (latest internal medicine, immune and allergic diseases 3 (1993)).
  • Patients present with symptoms such as shortness of breath, but there is no known effective treatment for interstitial pneumonia in collagen disease and they are generally refractory to current treatments. Little is known about the etiology of lung lesions in collagen disease. Inflammatory conditions are frequently observed in autoimmunity, infection, allergy, transplant rejection, etc., and T cells and other inflammatory cells are commonly accumulated.
  • CD4 + T cells play a central role in various diseases.
  • CD4 positive T cells are roughly classified into two types, Thl cells and Th2 cells, depending on the type of cytokine they produce (Annu. Rev. Immunol., 7, 145 (1989)).
  • Thl cells mainly produce interferon- ⁇ , interleukin- 12 and the like, and are thought to be involved in cell-mediated immunity.
  • Th2 cells are thought to regulate humoral immune responses by secreting cytokines such as interleukins_4, -5, and -13. Accumulation of T cells is observed at the site of inflammation, but a different T cell subpopulation accumulates at the site of inflammation.
  • Thl cells are significantly accumulated in rheumatoid arthritis
  • Th2 cells are significantly accumulated in allergic diseases such as bronchial asthma (Immunology Today, 21, 183 (2000)).
  • Th2 cells are present in bronchoalveolar lavage fluid or airway mucosa of patients with bronchial asthma (N. Engl. J. Med., 326, 298 (1992), Eur. J. Immunol., 23, 1445). (1993)), Th2 cell participation in asthma pathogenesis has been demonstrated in asthma model animals S! / Puru (Clin. Immunol. Imraunopathol., 75, 75 (1995), J. Exp. Med. , 186, 1737 (1997), J. Immunol., 160, 1378 (1998), J. Immunol., 161, 3128 (1998)).
  • Th2 cells are considered to be important for the treatment of asthma (Nature, 402, B31 (1999)).
  • a humanized anti-interleukin-5 antibody SB-240563: Glaxo's SmithKline Beechham, SCH-55700: Ehring Brah / Celtech
  • humanized anti-interleukin-4 antibody US Patent No.
  • soluble interleukin receptor Nuvance: manufactured by Imnettas
  • humanized anti-interleukin-4 Interleukin-5 receptor antibody TO97 / 10354
  • anti-CCR8 antibody W099 / 25734
  • anti-CCR4 antibody W001 / 64754
  • Thl cells each leukocyte surface such as Th2 cells are various chemokine receptors are expressed, chemokine receptors expressed respectively have been shown to be different (Immunol. Today, 21, 418 (2000)) 0 Chemokines are a general term for basic heparin-binding proteins having leukocyte migration and leukocyte activating effects, and a number of receptors have been identified (Curr. Opi. Immunol., 11, 626 (1999)).
  • Human CCR4 is a chemokine receptor whose gene has been cloned from human immature basophil cell line KU-812 (J. Biol. Chem., 270, 19495 (1995)). The ability to be TARC (thymus and activation-regulated chemokine) and MDC (macrophage-derived chemokine). (Curr. Op in. Immunol., 11, 626 (1999)). Furthermore, recent studies have revealed that CCR4 is selectively expressed in Th2 cells (J. Exp. Med., 187, 129 (1998), J. Immunol., 161, 5111). (1998), Int. Immunol., 11, 81 (1999), J. Clin.
  • CCR and its ligands are involved in the inflammatory response through Th2 cell migration and activation. It has been suggested that In fact, patients with atopic dermatitis, in which Th2 cells are thought to play an important role in the pathogenesis, have a higher percentage of CCR4-positive CD4-positive cells in peripheral blood (J. Leuk. Biol., 68, 568 (2000)), and the accumulation of CCR4 positive cells in skin lesions has been demonstrated (J. Allergy Clin. Immunol., 107, 353 (2001)). Furthermore, in atopic bronchial asthma, the proportion of CCR4-positive cells decreases with treatment with steroid hormones (Am. J. Respir. Crit.
  • immunosuppressants may cause serious infectious diseases, etc., they are not necessarily considered to be appropriate treatment methods, and there is a need for the development of safer and more effective therapeutic agents.
  • idiopathic interstitial pneumonia it is important to understand the pathological features of inflammatory features in typical and atypical cases in considering treatment, but no useful diagnostic method has been shown.
  • basic analysis has not been performed to determine whether the etiology of pulmonary lesions varies depending on the disease (dermatomyositis, chronic arthritis, rheumatism, etc.) caused by collagen disease.
  • An object of the present invention is to provide a preventive, diagnostic or therapeutic agent for interstitial pneumonia, in particular, a preventive, diagnostic or therapeutic agent for interstitial pneumonia in idiopathic idiopathic interstitial pneumonia or collagen disease.
  • An object of the present invention is to provide a therapeutic drug and a diagnostic agent for distinguishing between atypical idiopathic interstitial pneumonia and atypical idiopathic interstitial pneumonia.
  • the present invention relates to the following (1) to (55).
  • a prophylactic, diagnostic or therapeutic agent for interstitial pneumonia comprising an anti-CCR4 antibody and / or an anti-CXCR3 antibody as an active ingredient.
  • interstitial pneumonia is typical idiopathic interstitial pneumonia or atypical idiopathic interstitial pneumonia.
  • a diagnostic agent for distinguishing between atypical idiopathic interstitial pneumonia and an atypical idiopathic interstitial pneumonia comprising an anti-CCR4 antibody and an anti-CXCR3 antibody as active ingredients.
  • the extracellular region is an extracellular region selected from the group consisting of amino acids 1 to 39, 98 to 112, 176 to 206, and 271 to 284 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Prophylactic, diagnostic or therapeutic agent as described.
  • the humanized antibody is an antibody selected from a human chimeric antibody, a human complementarity determining region (CDR) transplanted antibody, and an antibody fragment thereof. Diagnostic or therapeutic agent.
  • Heavy chain variable region V region
  • light chain L chain
  • V region consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 2, 3, and 4 or
  • CDR1, CDR2, CDR3 of antibody light chain (L chain) V region consisting of amino acid sequences represented by SEQ ID NOS: 5, 6, and 7, respectively
  • the heavy chain (H chain) variable region (V region) of the antibody comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, and Z or
  • Light chain (L chain) V region of an antibody comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9
  • the prophylactic, diagnostic or therapeutic agent according to any one of (13) to (15) above,
  • the prophylactic, diagnostic or therapeutic agent according to the above (13), comprising a framework region (FR) of the H chain V region and the L chain V region of a human antibody.
  • the framework region (FR) of the H chain V region and L chain V region of the human antibody and
  • V region consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 2, 3, and 4, respectively.
  • CDR1, CDR2, CDR3 of antibody light chain (L chain) V region consisting of amino acid sequences represented by SEQ ID NOS: 5, 6, and 7, respectively
  • prophylactic, diagnostic or therapeutic agent according to any one of (13) and (18) to (20) above, comprising: (22) a human CDR-grafted antibody or an antibody fragment thereof,
  • the prophylactic, diagnostic or therapeutic agent according to any one of (13) and (18) to (21) above.
  • an antibody heavy chain comprising an amino acid sequence in which at least one amino acid residue selected from Thr at position 28 and Ala at position 97 has been substituted with another amino acid residue ( H chain) variable region (V region), and Z or
  • the prophylactic, diagnostic or therapeutic agent according to any one of (13) and (18) to (21) above.
  • Light chain (L chain) V region of an antibody comprising an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 12, 19 to 21
  • the prophylactic, diagnostic or therapeutic agent according to any one of (13) and (18) to (21) above.
  • the heavy chain (H chain) variable region (V region) of the antibody comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13, and Z or
  • prophylactic, diagnostic or diagnostic agent according to any one of (13) and (18) to (21) above, which comprises a light chain (L chain) V region of the antibody comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21.
  • Therapeutic drugs according to any one of (13) and (18) to (21) above, which comprises a light chain (L chain) V region of the antibody comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21.
  • the heavy chain (H chain) variable region (V region) of the antibody comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14, and Z or
  • prophylactic, diagnostic or diagnostic agent according to any one of (13) and (18) to (21) above, which comprises a light chain (L chain) V region of the antibody comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21.
  • Therapeutic drugs according to any one of (13) and (18) to (21) above, which comprises a light chain (L chain) V region of the antibody comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21.
  • a human CDR-grafted antibody or an antibody fragment thereof is a human CDR-grafted antibody or an antibody fragment thereof produced from a transformant selected from the group consisting of FERM BP-8129 and FERM BP-8130.
  • the prophylactic, diagnostic or therapeutic agent according to any one of (13) and (18) to (21) above.
  • Antibody fragments are Fab, Fab ', F (ab') 2 , single chain antibody (scFv;), dimerization variable region (V region) fragment (Diabody), disulfide stable V region fragment.
  • scFv single chain antibody
  • V region dimerization variable region fragment
  • Diabody dimerization variable region fragment
  • the extracellular region is an extracellular region selected from the group consisting of positions 1 to 39, 98 to 112, 176 to 206, and 271 to 284 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. The described method.
  • the anti-CCR4 antibody is a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, or an antibody fragment thereof.
  • CDR1, CDR2, CDR3 of the antibody light chain (L chain) V region consisting of the amino acid sequences represented by 6, 7
  • the humanized antibody is an antibody selected from a human chimeric antibody, a human complementarity determining region (CDR) transplanted antibody, and an antibody fragment thereof. . (40) a human chimeric antibody or an antibody fragment thereof,
  • Heavy chain variable region V region
  • light chain L chain
  • CDR1, CDR2, CDR3, and / or antibody heavy chain (H chain) variable region (V region) consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 2, 3, and 4, respectively.
  • CDR1, CDR2, CDR3 of antibody light chain (L chain) V region consisting of amino acid sequences represented by SEQ ID NOS: 5, 6, and 7, respectively
  • a heavy chain (H chain) variable region (V region) comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8;
  • the human chimeric antibody or the antibody fragment thereof according to any one of the above (39) to (42), wherein the human chimeric antibody or the antibody fragment is the antibody KM2760 produced by the transformant KM2760 (FERM BP-7054) or the antibody fragment thereof. the method of.
  • H chain V region and L chain V region framework region (FR) of human antibody H chain V region and L chain V region framework region (FR) of human antibody
  • V region consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 2, 3, and 4, respectively.
  • CDR1, CDR2, CDR3 of antibody light chain (L chain) V region consisting of amino acid sequences represented by SEQ ID NOS: 5, 6, and 7, respectively
  • At least one amino acid residue selected from Thr at position 28 and Ala at position 97 has been substituted with another amino acid residue.
  • An antibody heavy chain (H chain) variable region (V region) comprising an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 10, 11, 13 to 18, and Z or
  • H chain variable region V region containing an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 13, and / or
  • SEQ ID NO: 14 antibody heavy chain (H chain) variable region (V region) containing the selected amino acid sequence, and / or
  • the human CDR-grafted antibody or an antibody fragment thereof is a human CDR-grafted antibody or an antibody fragment thereof produced from a transformant selected from the group consisting of FERM BP-8129 and FERM BP-8130.
  • Antibody fragments are Fab ⁇ Fab ', F (ab,) 2 , single-chain antibody (scFv) ⁇ dimerization variable region (V region) fragment (Diabody), disulfide stability V region fragment ( The method according to any one of the above (35) to (53), which is an antibody fragment selected from a peptide comprising dsFv) and CDR.
  • Interstitial pneumonia can be caused by: a) collagen disease, b) infectious disease, c) radiation, d) occupation or environment, e) drug, f) sarcomatosis, Interstitial pneumonia, which may be caused by eosinophil granuloma or AIDS, but whose cause cannot be identified, is called idiopathic interstitial pneumonia.
  • the idiopathic interstitial pneumonia includes atypical idiopathic interstitial pneumonia and typical idiopathic interstitial pneumonia.
  • Collagenous diseases include dermatomyositis, polymyositis, systemic sclerosis (scleroderma), and chronic joint rheumatism.
  • the anti-CCR4 antibody used in the present invention may be any antibody that specifically binds to CCR4.
  • An anti-CCR4 antibody used as a prophylactic or therapeutic agent specifically binds to CCR4 and regulates the function of CCR4-positive cells, or eliminates CCR4-positive cells from the body by the effector function of the antibody. Anything that can be done may be used. Specific examples include an antibody capable of damaging CCR4-expressing cells by binding to the extracellular region of CCR4 and causing antibody-dependent cellular cytotoxicity + activity (ADCC activity), and antibody fragments thereof.
  • ADCC activity antibody-dependent cellular cytotoxicity + activity
  • the anti-CXCR3 antibody used in the present invention may be any antibody as long as it specifically binds to CXCR3.
  • An anti-CXCR3 antibody used as a prophylactic or therapeutic agent specifically binds to CXCR3 and regulates the function of CXCR3-positive cells, or eliminates CXCR3-positive cells from the body by the effector function of the antibody. Anything that can be done may be used.
  • Specific examples include an antibody capable of binding to the extracellular region of CXCR3 and damaging CXCR3-expressing cells by antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC activity), and antibody fragments thereof.
  • ADCC activity antibody-dependent cellular cytotoxicity
  • the antibodies used in the present invention include any antibodies such as polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, recombinant antibodies or antibody fragments thereof.
  • the recombinant antibodies include humanized antibodies such as human chimeric antibodies and human CDR-grafted antibodies.
  • Antibody fragments include Fab (abbreviation of fragment of antigen finding), F (ab) 2 , Fab, single chain Fv; hereinafter, referred to as scFv), dimerized V region fragment (Diabody ), Disulfide stabilized Fv (hereinafter, referred to as dsFv), peptides containing CDRs, and the like.
  • the anti-CXCR3 antibody specifically reacts with the extracellular region of human CXCR3.
  • the anti-CXCR3 antibody may be produced by a known method (Harlow E. and Lane D., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988); hereinafter, referred to as Antibody's laboratory manual).
  • a commercially available anti-CXCR3 antibody (Pharmingen) or the antibody disclosed in W098 / 11218 may be used.
  • the anti-CCR4 antibody preferably reacts specifically with the extracellular region of human CCR4.
  • the anti-CCR4 antibody has a specific amino acid sequence of 1 to 39, 98 to 112, 176 to 206 or 271 to 284 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • An antibody that specifically reacts with the region containing the amino acid sequence more preferably an antibody that reacts with amino acids 2 to 29 (SEQ ID NO: 22) of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and more preferably an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12th to 29th (sequence number 23).
  • the anti-CCR4 antibody can be produced using a known method (Antibody's Laboratory “Manual”).
  • the anti-CCR4 antibody either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody can be used, but a monoclonal antibody is preferably used.
  • the monoclonal antibodies used in the present invention include antibodies produced by hybridomas, humanized antibodies, and antibody fragments of these antibodies.
  • the anti-CCR4 monoclonal antibody produced by the hybridoma can be specifically produced by the method described below.
  • a cell expressing the CCR4 protein or a synthetic peptide based on the partial sequence of CCR4 is prepared as an antigen, plasma cells having antigen specificity are induced from animals immunized with the antigen, and A hybridoma is prepared by fusing the tumor cells with the tumor cells, and the hybridoma is cultured, or the hybridoma is administered to an animal to cause the animal to develop ascites carcinoma. Separate and purify antibodies that specifically bind to.
  • the anti-CCR4 monoclonal antibody obtained in this manner includes the monoclonal antibody KM2160 produced by hybridoma KM2160 belonging to the mouse IgGl subclass described in W001 / 64754 (Int. Immunol., 11, 81). (1999)).
  • examples of the anti-CCR4 antibody include a recombinant antibody such as a humanized antibody, and an antibody fragment thereof.
  • Examples of the humanized antibody used in the present invention include a recombinant antibody obtained by modifying the above-mentioned anti-CCR4 monoclonal antibody using a gene recombination technique, and an antibody fragment thereof.
  • these antibodies those with low antigenicity and prolonged half-life in blood are preferred as prophylactic or therapeutic agents.
  • H chain variable region As a humanized antibody, preferably Complementary determining regions of the antibody heavy chain (H chain) variable region (V region) consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 2, 3, and 4, respectively; CDR2, CDR3, and / or
  • CDR1, CDR2, CDR3 of antibody light chain (L chain) V region consisting of amino acid sequences represented by SEQ ID NOS: 5, 6, and 7, respectively
  • examples of the humanized antibody include a human chimeric antibody, a human CDR-grafted antibody, and antibody fragments thereof.
  • the human chimeric antibody comprises a heavy chain variable region (hereinafter, also referred to as a heavy chain, a variable region as a V region, and an H chain V region as a VH) and a light chain V region (hereinafter, referred to as a VH) of an antibody of an animal other than a human.
  • the light chain is also referred to as the L chain
  • the L chain V region is also referred to as VL
  • the H chain constant region of the human antibody hereinafter, the constant region is also referred to as the C region
  • the H chain C region is also referred to as CH).
  • any animal can be used as long as it can produce a hybridoma, such as a mouse, a rat, a hamster, or a heron.
  • the human chimeric antibody used in the present invention is obtained by obtaining cDNAs encoding VH and VL from a hybridoma producing an anti-CCR4 antibody, and expressing the cDNAs for animal cells having DNAs encoding human antibody CH and CL.
  • Human-type chimeric antibody expression vectors can be constructed by inserting them into vectors, and can be expressed and produced by introducing them into animal cells.
  • the CH of the human chimeric antibody may be any CH as long as it belongs to human immunoglobulin (hlg), but the hlgG class is preferable, and ⁇ 1, ⁇ 2, ⁇ / 3, Any of the subclasses such as 4 can be used.
  • the CL of the human chimeric antibody any CL may be used as long as it belongs to hlg, and a ⁇ class or; class can be used.
  • VH As a human chimeric antibody that specifically binds to CCR4 (hereinafter also referred to as an anti-CCR4 chimeric antibody), VH consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 3, 4, CDR1, CDR2, CDR3, and / or
  • a human chimeric antibody comprising CDR1, CDR2, CDR3 of VL consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, 6, or 7, or an antibody fragment thereof.
  • VH containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, and Z or
  • VL containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9
  • VH of the antibody consists of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 8
  • CH consists of the amino acid sequence of the human 0/1 subclass
  • VL of the antibody consists of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 9.
  • the transformant KM2760 that produces the human chimeric antibody KM2760 is available from the Ministry of International Trade and Industry at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Biotechnology and Industrial Technology Research Institute (currently the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary (Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan) 1-3-1 (Current address: 1-1-1, Higashi 1-11, Tsukuba, Ibaraki, Japan) Chuo No. 6) Internationally deposited as FERM BP-7054 on February 24, 2000 (W001 / 64754) .
  • the human CDR-grafted antibody means an antibody obtained by replacing the CDRs of VH and VL of a non-human animal antibody with a CDR sequence of a non-human animal antibody, respectively, with a human antibody.
  • the human CDR-grafted antibody used in the present invention encodes a V region obtained by replacing the VH and VL CDR sequences of any human antibody with the VH and VL CDR sequences of an anti-CCR4 antibody of a non-human animal, respectively.
  • any CH may be used as long as it belongs to hlg, but the hlgG class is preferable, and ⁇ 1, ⁇ 2, 73, Any of the subclasses such as 4 can be used.
  • the CL of the human CDR-grafted antibody any CL belonging to hlg may be used, and a ⁇ class or L class antibody may be used.
  • the human CDR-grafted antibody that specifically binds to CCR4 (hereinafter, also referred to as an anti-CCR4 CDR-grafted antibody) is preferably
  • VL CDR1, CDR2, CDR3 consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 5, 6, and 7, respectively
  • VH containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 or 11
  • VL containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12
  • At least one amino acid residue selected from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 selected from Ala at position 40, Gly at position 42, Lys at position 43, Gly at position 44, Lys at position 76, and Ala at position 97 Contains an amino acid sequence in which is substituted with another amino acid residue, and
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 at least one amino acid residue selected from the second Ile, the third Val, the 50th Gln, and the 88th Val has been replaced with another amino acid residue.
  • VL including amino acid sequence
  • a human CDR-grafted antibody or antibody fragment thereof or
  • VH containing an amino acid sequence in which at least one amino acid residue of the 28th Thr and 97th Ala in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 has been substituted with another amino acid residue, and / or In the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12, at least one amino acid residue selected from the second Ile, the third Val, the 50th Gln, and the 88th Val is substituted with another amino acid residue. Containing amino acid sequence
  • VH containing an amino acid sequence selected from SEQ ID NOS: 13 to 18, and VL containing an amino acid sequence selected from NO or SEQ ID NOS: 19 to 21
  • VH containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13, and / or
  • VL containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21
  • a human CDR-grafted antibody or antibody fragment thereof A human CDR-grafted antibody or antibody fragment thereof,
  • VH containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14, and Z or
  • VL containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21
  • a transformant M8759 that produces a human CDR-grafted antibody KM8759 that reacts with VCR containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13 and CCR4 containing VL containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21 It has been internationally deposited as FERM BP-8129 on July 30, 2002 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Center for Patent Organism Depositary (Tsukuba-Higashi 1-chome 1-1 Chuo No. 6 Ibaraki, Japan).
  • a transformant KM8760 that produces a human CDR-grafted antibody KM8760 that reacts with CCR4 containing VH containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 and VL containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21 It has been internationally deposited as FERM BP-8130 on July 30, 2002 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Center for Patent Organism Deposits (1-1, 1-1 Tsukuba East, Ibaraki, Japan).
  • the amino acid sequence defining the anti-CCR4 antibody used in the present invention one or more amino acid residues are deleted, substituted, inserted or added, and an antibody or an antibody fragment thereof specifically reacting with CCR4 is also included in the present invention. Included in the scope.
  • Deletion, substitution, insertion or addition of one or more amino acid residues in the amino acid sequence of the present invention means that one or more amino acids at any position in one or more amino acid sequences in the same sequence
  • Deletion, substitution, insertion or addition of a residue means that deletion, substitution, insertion or addition may occur simultaneously, and the amino acid residue to be replaced, inserted or added Regardless of non-natural type.
  • Natural amino acid residues include L-alanine, L-asparagine, L-asparaginic acid, L-glutamine, L-gunoletamic acid, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L -Methionine, L- mecanicarayun, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-norin, L-cystine and the like.
  • Group A leucine, isoloicin, norleucine, parin, norparin, alanine, 2-aminoptanoic acid, methionine, 0-methylserine, t-butylglycine, t-butynolealayun, cyclohexinoreaaraene
  • Group B aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, isodaltamic acid, 2-aminoaminodipic acid, 2-aminosuberic acid
  • Group D lysine, arginine, orditin, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid
  • Group E Proline, 3-hydroxyproline, 4-hydroxyproline
  • Group F serine, threonine, homoserine
  • Anti-CCR4 antibodies used in this effort also include antibody fragments.
  • the antibody fragment include Fab, F (ab,) 2 , Fab ′, scFv, Diabody, dsFv, and peptides including CDR, which are antibody fragments that specifically bind to CCR.
  • Fab is a fragment obtained by treating IgG with proteolytic enzyme papain (which is cleaved at the 224th amino acid residue of the H chain). About half of the N-terminal side of the H chain and the entire L chain are disulfide bonds ( This is an antibody fragment having a molecular weight of about 50,000 and an antigen-binding activity, which is linked by an S--S bond.
  • the Fab of the present invention can be obtained by treating an anti-CCR4 antibody with the protease, papain.
  • a DNA encoding the Fab of the antibody is inserted into a prokaryotic or eukaryotic expression vector, and the expression vector is introduced into a prokaryotic or eukaryotic organism. Can be expressed to produce Fab.
  • F (ab ') 2 is a fragment obtained by treating IgG with the protease pepsin (which is cleaved at the amino acid residue at position 234 of the H chain). This is an antibody fragment having a molecular weight of about 100,000 and having an antigen-binding activity, which is slightly larger than that bound via the antibody.
  • the F (ab ') 2 of the present invention can be obtained by treating an anti-CCR4 antibody with the protease pepsin.
  • the following Fab ′ can be prepared by thioether bond or SS bond.
  • Fab ′ is an antibody fragment having a molecular weight of about 50,000 and having an antigen-binding activity in which the SS bond in the hinge region of F (ab ′) 2 is cleaved.
  • Fab ′ of the present invention can be obtained by treating the above F (ab ′) 2 with a reducing agent dithiothreitol.
  • a DNA encoding Fab 'of the anti-CCR4 antibody is inserted into a prokaryotic or eukaryotic expression vector, and the expression vector is introduced into a prokaryotic or eukaryotic organism. It can be expressed and manufactured.
  • scFv is a VH-P-VL or VL-P-VH polypeptide in which one VH and one VL are linked using an appropriate peptide linker (P) having 12 or more residues, and binds to antigen.
  • the scFv of the present invention is obtained by obtaining cDNAs encoding the VH and VL of the anti-CCR4 antibody, constructing a DNA encoding the scFv, and inserting the DNA into a prokaryotic expression vector or eukaryotic expression vector.
  • the expression vector can be expressed and produced by introducing it into a prokaryote or eukaryote.
  • Diabody is an antibody fragment that forms a dimer of scFvs with the same or different antigen-binding specificities, and has a divalent antigen-binding activity for the same antigen or a bispecific antigen-binding activity for a different antigen. .
  • the diabody of the present invention for example, a bivalent diabody that specifically reacts with CCR4, obtains cDNA encoding VH and VL of an anti-CCR4 antibody, and obtains scFv having a polypeptide linker of 3 to 10 residues.
  • a DNA to be encoded is constructed, the DNA is inserted into a prokaryotic expression vector or a eukaryotic expression vector, and the expression vector is introduced into a prokaryotic or eukaryotic cell to express and produce a diabody. be able to.
  • dsFv is a binding antibody fragment obtained by substituting a polypeptide in which one amino acid residue in VH and VL is substituted with a cysteine residue via an SS bond between the cysteine residues.
  • the amino acid residue to be substituted for the cysteine residue can be selected based on the prediction of the three-dimensional structure of the antibody according to the method shown by Reiter et al. (Protein Engineering, 7, 697 (1994)).
  • the dsFv of the present invention is obtained by obtaining cDNAs encoding VH and VL of an anti-CCR4 antibody, constructing a DNA encoding dsFv, inserting the DNA into a prokaryotic expression vector or a eukaryotic expression vector, It can be expressed and produced by introducing an expression vector into a prokaryote or eukaryote.
  • a peptide containing a CDR is an antibody fragment comprising at least one region of CDR of VH or VL.
  • a peptide containing a plurality of CDRs can be produced by binding directly or via an appropriate peptide linker.
  • the peptide containing the CDR of the present invention is constructed by constructing cDNA encoding the CDRs of VH and VL of the anti-CCR4 antibody, and using the cDNA for a prokaryotic expression vector or eukaryotic organism. It can be produced by inserting the gene into an expression vector and introducing the expression vector into a prokaryote or eukaryote.
  • the peptide containing CDR can also be produced by a chemical synthesis method such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method).
  • the anti-CCR4 antibody of the present invention includes an antibody derivative in which a radioisotope, a protein, a drug, or the like is chemically or genetically bound to the anti-CCR4 antibody of the present invention.
  • the derivative of the anti-CCR4 antibody of the present invention can be obtained by substituting the N-terminal or C-terminal of the H-chain or L-chain of the anti-CCR4 antibody or its antibody fragment, an appropriate substituent or side chain in the antibody or antibody fragment, Manufacture by binding a radioisotope, protein or drug to the sugar chain in the antibody or antibody fragment by a chemical method (Introduction to Antibody Engineering, Osamu Kanemitsu, Jinjinshokan Co., Ltd. (1994)) Can be.
  • a DNA encoding an anti-CCR4 antibody or an antibody fragment thereof is ligated to a DNA encoding a protein to be ligated and inserted into an expression vector, and the expression vector is introduced into host cells. It can also be produced by the genetic engineering techniques described above.
  • Radioisotopes, 131 1, 125 1, and the like for example, by the chloramine T method or the like, can be attached to the antibody.
  • the drug is preferably a low-molecular-weight drug, such as an alkylating agent such as nitrogen mustard and cyclamide phosphamide, an antimetabolite such as 5-fluorouracil and methotrexate, daunomycin, bleomycin, mitomycin C, daunorubicin, Anticancer drugs such as antibiotics such as doxorubicin, plant algicids such as vincristine, vinblastine, and vindesine, and hormonal drugs such as tamoxifen and dexamethasone (Clinical Oncology, Japan Society for Clinical Oncology, Cancer and Chemotherapy Company 1996)), or steroid drugs such as hydric cortisone and prednisone, non-steroid drugs such as aspirin and indomethacin, immunomodulators such as gold thiomalate and ⁇ -silamine, cyclophosphamide, azathiop Phosphorus and other immunosuppressants; anti-inflammatory agents such
  • cytokines that activate immunocompetent cells are suitable.
  • human interleukin 2 hIL-2
  • human granulocyte macrophage co-stimulatory factor hGM CSF
  • human macrophage colony stimulation Factor hM-CSF
  • toxins such as ricin and diphtheria toxin can be used to directly damage cancer cells.
  • a fusion antibody with a protein a cDNA encoding the protein is linked to a cDNA encoding the antibody or antibody fragment, a DNA encoding the fusion antibody is constructed, and the DNA is expressed for prokaryotic or eukaryotic organisms.
  • a fusion antibody can be produced by inserting the expression vector into a prokaryote or eukaryote and expressing it.
  • Antigens required for producing anti-CCR4 antibodies include CCR4-expressing cells or cell fractions thereof, CCR4, partial fragments of CCR4, peptides having a partial sequence of the amino acid sequence of CCR4, and the like. .
  • CCR4 and a partial fragment of CCR4 can be obtained by converting the full-length CCR4 encoding fragment or a partial fragment thereof (J. Biol. Chem, 270, 19495 (1995)) into an appropriate vector promoter.
  • a CCR4-expressing cell obtained by constructing a recombinant vector inserted downstream and introducing it into a host cell is cultured in an appropriate medium, either directly on the cell or on the cell surface, or as a fusion protein. Can be produced.
  • a peptide having a partial sequence of CCR4 can be prepared using an amino acid synthesizer.
  • the full-length cDNA encoding CCR4 or a partial fragment thereof is a polymerase chain reaction (PCR) obtained by converting cDM prepared from cells expressing human CCR4, such as human peripheral blood, into PCR type; Sambrook J et al., Molecular Cloning ⁇ rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (2001) (hereinafter referred to as "Molecular Cloning Third Edition"), Ausubel FM et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons ( 1987-2001) (hereinafter referred to as “current 'protocols in' molecular 'pyrology”)).
  • PCR polymerase chain reaction
  • the host may be any host such as bacteria, yeast, animal cells, insect cells, etc., as long as they can express the gene of interest.
  • bacteria include bacteria of the genus Escherichia coli, Bacillus subtilis, and the like, and bacteria of the genus Bacillus and the like.
  • yeast include Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, and the like.
  • animal cells include Namawa cells, which are human Itoda cells, COS cells, which are monkey cells, and CH0 cells, which are cells of Chinese hamsters. And Sf21 (manufactured by Farmingen), High Five (manufactured by Invitrogen) and the like.
  • any vector into which the DNA can be inserted and which can be expressed in a host cell can be used.
  • the expression vector may be a promoter, a ribosome binding sequence, a full-length or partial fragment thereof encoding CCR4 cDNA, a transcription termination sequence, and, in some cases, a promoter.
  • the control sequence is composed of a control sequence.
  • Examples include PGEX-2T (manufactured by Amersham Biosciences), pET17b (manufactured by Novagen) and the like.
  • Examples of a method for introducing a recombinant vector into bacteria include a method for introducing DNA into bacteria, for example, a method using calcium ions (Cohen SN et ah, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110). -2114 (1972)) and the protoplast method (JP-A-63-248394).
  • yeast When yeast is used as a host, an expression vector, for example, YE P 13 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419) or the like is used.
  • a method for introducing DNA into yeast is exemplified by the electroporation method (Becker DM and Guarente L., Methods. Enzymol., 194, 182-187 (1991)). , Spheroplast method (Hinnen A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1929-1933 (1978)), lithium acetate method (Ito H. et al., J. Bacteriol., 153, 163-168 (1983)).
  • expression vectors When animal cells are used as hosts, examples of expression vectors include PAGE107 (Japanese Patent Application Laid-Open No. 3-22979; Miyaji H. et al., Cytotechnology, 3, 133-140 (1990)) and pAGE103 (Mizukami T. and Itoh). S., J. Biochem., 101, 1307-1310 (1987)) and the like.
  • Any promoter can be used as long as it can be expressed in animal cells.
  • Examples thereof include a promoter of the immediate early (IE) gene of cytomegalovirus (CMV), and a promoter of SV40 or metamouth thionine. Is raised.
  • the enhancer of the IE gene of human CMV may be used together with the promoter.
  • a method for introducing DNA into animal cells includes, for example, an electroporation method (Miyaji H. et al., Cytotechnology, 3, 133-140 ( 1990)), the calcium phosphate method (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-227075), and the Lipofection method (Feigner PL et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413-7417 (1987)).
  • the protein can be expressed by the above method. That is, the recombinant gene transfer vector and the paculovirus described below are co-transfected into insect cells to obtain a recombinant virus in the culture supernatant of insect cells. Obtain the expressing insect cells.
  • the gene transfer vector for example, pVL1392, pVL1393 (both from Pharmingen), P BlueBac4.5 (from Invitrogen) and the like are used.
  • the baculovirus e.g., burglar Gaka insect infection virus der Ru out publicly available force Riforuni force Nuclear Doroshisu virus to single-poly (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus;. Is Hitoshiryoku s for Rere recombinant virus
  • Examples of the method for co-transferring the above-mentioned recombinant gene transfer vector and the above-mentioned paculovirus into insect cells for preparing E. coli include the calcium phosphate method (Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075), the ribofusion method (Feigner PL Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413-7417 (1987)) and the like.
  • CCR4 is infected with insect cells such as Sf9, Sf21 or High Five described above by the recombinant virus. It can also be produced (Bio / Technology, 6, 47 (1988)). By culturing the transformant obtained as described above in a medium and collecting CCR4 from the culture, the full-length CCR4 or a partial fragment thereof can be produced as it is or as a fusion protein.
  • the method for culturing the transformant in a medium is performed according to a usual method used for culturing a host.
  • a culture medium for culturing a transformant obtained by using a microorganism such as Escherichia coli or yeast as a host contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like that can be used by the microorganism to efficiently culture the transformant.
  • the natural medium or the synthetic medium may be used (Molecular 'Cloning 3rd Edition).
  • Cultivation is usually carried out at 15 to 40 ° C for 16 to 96 hours under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture.
  • the pH is maintained at 3.0 to 9.0.
  • the pH is adjusted with an inorganic or organic acid, alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia, or the like. If necessary, an antibiotic such as ampicillin / tetracitalin may be added to the medium during the culture.
  • a medium for culturing a transformant obtained using animal cells as a host commonly used RPMI1640 medium, Eagle's MEM medium, or a medium obtained by adding fetal bovine serum or the like to such a medium is used. Cultures, 5% C0 2 presence usually performed 3-7 days at 35 to 37 ° C, if necessary in the culture, kanamycin, may ⁇ Ka ⁇ the antibiotic quality such Bae Eshirin the medium .
  • TNM-FH medium As a medium for culturing a transformant obtained using insect cells as a host, commonly used TNM-FH medium (Pharmingen), Sf900IISFM (Invitrogen), ExCell400, ExCell405 (JRH (Piyo Sciences (JRH Biosciences)).
  • the culture is performed at 25 to 30 ° C for 1 to 4 days, and an antibiotic such as gentamicin may be added to the medium during the culture, if necessary.
  • an antibiotic such as gentamicin may be added to the medium during the culture, if necessary.
  • a serum-free medium in order to use the partial fragment of CCR4 as it is or to facilitate purification of the fusion protein.
  • the cells are centrifuged, suspended in an aqueous buffer, sonicated, French pressed, etc. The cells are disrupted by centrifugation, and the protein is recovered in the centrifuged supernatant.
  • the insoluble substance when an insoluble substance is formed in cells, the insoluble substance is solubilized with a protein denaturant, and then the protein denaturant is not contained or the concentration of the protein denaturant is so low that the protein is not denatured. It can be diluted or dialyzed to form a protein conformation.
  • the expressed protein can be recovered in the culture supernatant.
  • solvent extraction fractional precipitation with organic solvents, salting out, dialysis, centrifugal separation, ultrafiltration, ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, hydrophobic mouth chromatography, affinity Separation operations such as chromatography, reverse phase chromatography, crystallization, and electrophoresis can be performed alone or in combination.
  • a peptide having a partial sequence of the amino acid sequence of CCR4 can be produced by a chemical synthesis method such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method). It can also be produced by using a peptide synthesizer such as Advanced ChemTech, Applied Biosystems, Protein Technologies, Shimadzu, or the like.
  • an animal is immunized using the protein obtained above as an antigen.
  • the antigen may be administered subcutaneously, intravenously, or intraperitoneally to the animal, but a carrier protein with high antigen binding to the antigen may be administered, or the antigen may be administered with an appropriate adjuvant. Is preferred.
  • carrier proteins examples include keyhole limpet hemocyanin, serum serum albumin, and thyroglobulin.
  • the adjuvant is Complete Freund's adjuvant. Adjuvant), aluminum hydroxide gel and pertussis vaccine.
  • Examples of the immunized animal include non-human mammals such as rabbits, goats, mice, rats, and hamsters.
  • the antigen is administered 3 to 10 times every 1 to 2 weeks after the first administration.
  • the dose of the antigen is preferably 50 to: 100 ⁇ g / animal.
  • blood is collected from the fundus venous plexus or tail vein of the immunized animal, and the specific binding of the serum to the antigen is determined by the enzyme immunoassay (ELISA; enzyme; Immunoassay 3rd edition, Medical Shoin (1987), Antibodies 'Laboratory' Manual, Chapter 14, boding JW, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1996)).
  • ELISA enzyme immunoassay
  • the enzyme immunoassay can be performed as follows.
  • the plate is coated with the antigen protein or cells expressing the antigen protein, and the serum collected from the immunized animal is reacted as the primary antibody. After the first antibody reaction, wash the plate and add the second antibody. After the reaction, a detection reaction is performed according to the substance labeled with the second antibody, and the antibody titer is measured.
  • the second antibody is obtained by labeling an antibody that can recognize the first antibody with an enzyme such as peroxidase or with biotin. Specifically, mice were used as immunized animals Then, an antibody capable of recognizing murine immunoglobulin is used as the second antibody.
  • lymphocytes are excised from the immunized animal in accordance with a known method (Antibody's Laboratory 'Manual), and the lymphocytes are fused with myeloma cells.
  • a polyclonal antibody can be prepared by separating and purifying the serum.
  • Monoclonal antibodies are prepared by fusing the antibody-producing cells with myeloma cells derived from non-human mammals to produce hybridomas, and culturing the hybridomas or administering the hybridomas to animals to cause the cells to develop ascites tumor. It can be prepared by separating and purifying the culture solution or ascites.
  • Antibody-producing cells are collected from antigen-administered non-human mammalian spleen cells, lymph nodes, peripheral blood, and the like.
  • the myeloma cells include a cell line obtained from a mouse, 8-azaguanine-resistant mouse (derived from BALB / c) myeloma cell line P3-X63Ag8-Ul (Kohler G and Milstein C, Eur. J. Immunol. , 6, 511-519 (1976)), SP2 / 0—Agl4 (Shulman M. et al., Nature, 276, 269-270 (1978)), P3-X63-Ag8653 (Kearney JF et al., J.
  • a cell-aggregating medium such as polyethylene glycol-1000 (PEG-1000) is added, and the cells are fused and suspended in a medium.
  • PEG-1000 polyethylene glycol-1000
  • MEM medium or PBS 1.83 g of sodium phosphate, 0.21 g of monolithium phosphate, 7.65 g of sodium chloride, 1 L of distilled water, pH 7.2
  • HAT medium normal medium (1.5 Yuzuru ol / L glutamic, 5 X 10- 5 mol / L L (T 4 mol / L hypoxanthine, 1.5 X 10-ol / L thymidine 4 X l (RPMI1640 medium supplemented with 2-mercaptoethanol, 10 g / mL gentamicin and 10% fetal serum) Medium supplemented with T 7 mol / L aminopterin].
  • a sample that reacts with the antigen protein and does not react with the non-antigen protein is selected by the following enzyme immunoassay.
  • clawing is performed by the limiting dilution method, and those having a stable and high antibody titer determined by the enzyme immunoassay are selected as monoclonal antibody-producing hybrid strains that specifically bind to CCR4.
  • the enzyme immunoassay is performed in the same manner as described in 1. (2).
  • As the primary antibody a hybridoma culture supernatant or a purified antibody obtained by the method described later is used.
  • anti-CCR4 monoclonal antibody examples include the monoclonal antibody KM2160 produced by the hybridoma KM2160 described above.
  • Monoclonal antibodies can be obtained from cultures obtained by culturing Hypridoma cells, or treated with Pristane (Pristane (2, 6, 10, 14-tetramethylpen). 0.5 mL was intraperitoneally administered, and bred for 2 weeks.] The monoclonal antibody-producing hybridoma cells were intraperitoneally administered to 8-10-week-old mice or nude mice and separated from ascites that had developed ascites tumor. It can be prepared by purification.
  • Methods for separating and purifying monoclonal antibodies include centrifugation, salting out with 40-50% ammonium sulfate, caprylic acid precipitation, DEAE-Sepharose column, anion exchange column, protein A or G-column or There is a method in which chromatography using a gel filtration column or the like is performed alone or in combination. By this method, an IgG or IgM fraction can be collected to obtain a purified monoclonal antibody.
  • the subclass of the purified monoclonal antibody can be determined using a monoclonal antibody typing kit or the like.
  • the protein content can be calculated by the Lowry method or from the absorbance at 280 nm.
  • the subclass of the antibody by isotype within a class in mice, IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3, in humans, I g Gl, IgG2, IgG3 , IgG4 and the like, in particular a mouse IgGl, IgG2a, human IgGl
  • the type has complement-dependent cytotoxic activity (hereinafter referred to as CDC activity) and ADCC activity, and is useful for therapeutic applications.
  • an anti-CCR4 antibody can be prepared according to the method described in TO01 / 64754.
  • a humanized antibody expression vector is an expression vector for animal cells into which genes encoding the C region of human antibody, CH and CL, are incorporated. It can be constructed by inserting each gene to be coded.
  • the C region of a human antibody can be CH and CL of any human antibody, such as human antibody subclass CH, ⁇ 4 subclass CH, and ⁇ class CL.
  • DNA encoding human antibody CH and CL chromosomal DNA consisting of exons and introns can be used, and cDNA can also be used. Any expression vector for animal cells can be used as long as it can incorporate and express the gene encoding the human antibody C region.
  • pAGE107 JP-A-3-22979; Miyaji H. et al., Cytotechnology, 3, 133-140 (1990)
  • pAGE103 Mizukami T. and Itoh S., J. Biochem., 101, 1307-1310 ( 1987)
  • pHSG274 Brain G. et al., Gene, 27, 223-232 (1984)
  • pKCR 'Hare K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 78, 1527 -1531 (1981)
  • pSGl d2-4 Miyaji H. et al., Cytotechnology, 4, 173-180 (1990)
  • promoters and enhancers used in expression vectors for animal cells include the early promoter and enhancer of SV40 (Mizukami T. and Itoh S., J. Biochem., 101, 1307-1310 (1987)), Moroe mouse leukemia LTR promoter and enhancer (Kuwana Y. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 149, 960-968 (1987)), and the promoter of the immunoglobulin heavy chain (Mason J. 0. et al., Cell , 41. 79-487 (1985)) and Enhancer (Gillies SD et al., Cell, 33, 717-728 (1983)).
  • the humanized antibody expression vector may be either a type in which the antibody H and L chains are present on separate vectors or a type in which the antibody is present on the same vector (tandem type).
  • tandem humanized antibodies in terms of the ease of construction of the current vector, ease of introduction into animal cells, and the ability to balance the expression levels of antibody H and L chains in animal cells.
  • Vectors are preferred (Shitara K. et al., J. Immunol. Methods, 167, 271-278 (1994)).
  • tandem humanized antibody expression vectors include pKANTEX93 (W097 / 10354), pEE18 (Bentley KJ et al., Hybridoma, 17, 559-567 (1998)) and the like.
  • the constructed humanized antibody expression vector can be used for expression of a human chimeric antibody and a human CDR-grafted antibody in animal cells.
  • MRNA is extracted from cells producing mouse anti-CCM monoclonal antibodies, such as mouse anti-CCR4 antibody-producing hybridomas, and cDNA is synthesized. Insert the synthesized cDNA into a vector such as phage or plasmid to prepare a cDNA library. From the library, a recombinant phage or a recombinant plasmid having a cDNA encoding VH and a recombinant phage having a cDNA encoding VL using a mouse antibody C region or V region as a probe. Alternatively, each recombinant plasmid is isolated. The entire nucleotide sequence of VH and VL on the recombinant phage or plasmid is determined, and the entire amino acid sequence of VH and VL is deduced from the nucleotide sequence.
  • any animal can be used as long as it can produce a hybridoma, such as a mouse, a rat, a hamster, and a heron.
  • Methods for preparing total RNA from hybridomas include the guanidine thiocyanate-cesium trifluoroacetate method (Okayaraa H. et al., Methods Enzymol., 154, 3-28 (1987)).
  • Examples of a method for preparing mRNA from RNA include an oligo (dT) -immobilized cellulose column method (Molecular 'Cloning 3rd Edition) and the like.
  • Kits for preparing mRNA from hybridomas include FastTrack mRNA isolation kit (manufactured by Invitrogen) and QuickPrep mRNA purification kit (manufactured by Amersham Biosciences). Can be
  • the cDNA library can be prepared using standard methods (Molecular cloning, 3rd ed .; Current 'Protocols'in' 1. Biology) or a commercially available kit, such as Superscript Choice System for cDNA Synthesis (manufactured by Invitrogen) or ⁇ -cDNA synthesis kit [STRATAGENE ), And a method using a TimeSaver cDNA synthesis kit (Amersham Biosciences).
  • any vector can be used as a vector for incorporating a cDNA synthesized by converting mRNA extracted from a hybridoma into a type II, as long as the vector can incorporate the cDNA.
  • ZAP Express (Stratagene), pBluescript II SK (+) (Stratagene), ⁇ ZAPII (Stratagene), gtlO (Stratagene), gtll (Stratagene) Company, Ltd.), Lambda BlueMid (Clontech Co., Ltd.), L ExCell (Amersham Bio Saienshizu, Inc.), P cD2 (Okayama H. and Berg P., Mol. Cell. Biol., 3, 280-289 (1983)) And a phage or plasmid vector such as pUC18 (Yanisch-Perron C. et al., Gene, 33, 103-119 (1985)).
  • any Escherichia coli can be used as long as the cDNA library can be introduced, expressed and maintained.
  • XL1-Blue MRF '(Stratagene) C600 (Appleyard RK Genetics, 39, 440-452 (1954))
  • Y1088 Young RA and Davis R., Science, 222, 778-782 (1983)
  • Y1090 Young RA and Davis R., Science, 222, 778-782 (1983)
  • ⁇ 522 Gough JA and Murray NE, J. Mol.
  • Methods for selecting cDNA clones encoding the anti-CCR4 antibody VH and VL of non-human animals from the cDNA library include colony hybridization using an isotope or fluorescently labeled probe or plaque hybridization. It can be selected by the hybridization method (Molecular 'Claw Young 3rd Edition).
  • primers can be prepared, and cDNAs encoding VH and VL can be prepared by PCR using a cDNA synthesized from mRNA or a cDNA library as a type III.
  • the nucleotide sequence of the cDNA selected by the above method is determined by the dideoxy method using the cDNA cloned in an appropriate vector (Sanger F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-). 5467 (1977)), and analysis can be performed using a DNA sequencer such as ABI377 (manufactured by Applied Biosystems).
  • sequence G sequences The obtained cDNA can be used as a secretory signal in comparison with US Patent No. of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991), hereinafter referred to as “sequences of proteins, of proteins, of immunological interest”. It can be confirmed that the antibody encodes the complete amino acid sequence of VH and VL including the sequence.
  • BLAST Altschul SF et al., J. Mol. Biol., 215, 403-410 (1990)
  • homology search program homology search of the obtained complete amino acid sequences of VH and VL can be performed to examine the novelty of the sequence.
  • VH and VL that form the antigen-binding site of the antibody are composed of four relatively conserved framework regions (hereinafter referred to as FR) and three CDRs (variable sequences) that link them.
  • CDR1, CDR2, CDR3) (Sequences 'Op' Proteins. Ob. Immunological Interest).
  • the amino acid sequence of each CDR of VH and VL can be identified by comparison with the amino acid sequence of the V region of a known antibody (sequences of proteins. Immunological interest).
  • an anti-CCR4 chimeric antibody expression vector can be constructed.
  • a plasmid having a cDNA encoding the VH and VL of an anti-CCR4 antibody of a non-human animal is used as a type I plasmid, and the VH and VL of the antibody are converted from the recognition sequence of an appropriate restriction enzyme and the nucleotide sequence encoding the V region.
  • the 5'-end and 3'-end primers were used to amplify by PCR, and each amplification product was cloned into a plasmid such as pBluescript II SK (_) (Stratagene), and 2.
  • a plasmid such as pBluescript II SK (_) (Stratagene), and 2.
  • the nucleotide sequence is determined by the method described in 1), and a plasmid having a DNA sequence encoding the amino acid sequence of VH and VL of the anti-CCR4 antibody is obtained. From the obtained plasmid, cDNA encoding the amino acid sequence of VH and VL of the anti-CCR4 antibody was isolated, and the human antibody CH and CL of the vector for expression of the humanized antibody described in (1) were encoded.
  • the clones can be cloned so that they can be expressed in an appropriate form upstream of the gene to be expressed, and an anti-CCR4 chimeric antibody expression vector can be constructed. (5) Construction of cDNA encoding V region of anti-CCR4 CDR-grafted antibody
  • CDNA encoding VH and VL of the anti-CCR4 CDR-grafted antibody can be constructed as follows. First, FR amino acid sequences of VH and VL of a human antibody to which the amino acid sequences of CDRs of VH and VL of an anti-CCR4 antibody of a non-human animal are transplanted are selected. As the amino acid sequence of FRs of VH and VL of a human antibody, any amino acid sequence can be used as long as it is derived from a human antibody.
  • amino acid sequences of human antibody VH and VL FR amino acids and the common amino acid sequences of human antibody VH and VL FR subgroups registered in databases such as the Protein Data Bank (Sequences of proteins) Among them, in order to produce a human CDR-grafted antibody having sufficient activity, anti-CCR4 antibodies VH and VL of non-human animals can be used. It is desirable to select an amino acid sequence having as high a homology as possible, preferably 60% or more, with the amino acid sequence of FR.
  • the amino acid sequence of the VH and VL CDRs of the anti-CCR4 antibody of the non-human animal other than the target human was transplanted into the VH and VL FR amino acid sequences of the selected human antibody.
  • Design the amino acid sequences of VH and VL of the CCR4CDR-grafted antibody Design the amino acid sequences of VH and VL of the CCR4CDR-grafted antibody.
  • the designed amino acid sequence is converted into a nucleotide sequence in consideration of the codon usage (sequences, protein, protein, immunological, interest) found in the nucleotide sequence of the antibody gene, and anti-CCR4CDR transplantation
  • Design nucleotide sequences encoding the amino acid sequences of VH and VL of the antibody Based on the designed base sequence, several synthetic DNAs of about 100 bases in length are synthesized, and PCR is performed using them. in this case,
  • the vector can be easily cloned into the humanized antibody expression vector constructed in 2.
  • (1) After the pcR reaction, the amplification product is cloned into a plasmid vector such as pBluescript SK (-) (Stratagene), and the nucleotide sequence is determined by the method described in 2.
  • (2) and Obtain a plasmid having a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of VH and VL of the CCR4 CDR-grafted antibody.
  • a human CDR-grafted antibody is the only non-human animal that has the antigen-binding activity of the original non-human animal, by grafting only the VH and VL CDRs of the target non-human animal to the human antibody VH and VL FR. It is known that the activity is lower than that of the antibody (Tempest PR et al., Bio / technology, 9, 266-271 (1991)). This is due to the fact that not only CDR but also some amino acid residues of FR are directly or indirectly involved in antigen-binding activity in VH and VL of the original non-human animal antibody. It is considered that amino acid residues are changed to different amino acid residues in FRs of VH and VL of a human antibody with CDR transplantation.
  • human CDR-grafted antibodies have the amino acid residues involved in direct binding to the antigen and the amino acid residues of CDR in the amino acid sequences of FRs of VH and VL of human antibodies. Identify amino acid residues that act or maintain the three-dimensional structure of an antibody and indirectly participate in antigen binding, and convert them to amino acid residues found in the original nonhuman animal antibody. It has been modified to increase the decreased antigen binding activity (Tempest PR et al., Bio / technology, 9, 266-271 (1991)). In the production of human CDR-grafted antibodies, the most important point is how to efficiently identify the amino acid residues of FR involved in the antigen-binding activity.
  • the modification of the amino acid residue of FR of human antibody VH and VL can be achieved by performing PCR using synthetic DNA for modification as a primer.
  • For the amplified product after PCR determine its nucleotide sequence by the method described in 2. (2), confirm that the desired modification has been made, and confirm that the vector containing the cDNA into which the desired mutation has been introduced (hereinafter referred to as , Called amino acid rooster sequence modification vector).
  • modification of the amino acid sequence of a narrow region can be performed by a PCR mutagenesis method using a mutation-introducing primer consisting of 20 to 35 bases.
  • a sense-mutated primer and an antisense-mutated primer consisting of 20 to 35 bases containing the DNA sequence encoding the amino acid residue after modification are synthesized, and the cDNA encoding the amino acid sequence of VH and VL to be modified is prepared.
  • VH and VL of the anti-CCR4 CDR-grafted antibody constructed in (5) and (6) upstream of the DNA encoding the CH and CL of the human antibody in the humanized antibody expression vector described in (1).
  • a recognition sequence for an appropriate restriction enzyme at the 5 'end of the synthetic DNA located at both ends can be cloned so that they can be expressed in an appropriate form upstream of the DNA encoding the CH and CL of the human antibody of the humanized antibody expression vector described in 2.
  • Transient expression of a humanized antibody can be performed using a vector or an expression vector obtained by modifying the vector.
  • any host cell can be used as long as it can express the humanized antibody.
  • COS-7 cells ATCC No .: CRL-1651 is commonly used (Warr GW et al., Methods in Nucleic Acids Research, CRC press, 283 (1990)).
  • Methods for introducing an expression vector into COS-7 cells include the DEAE-dextran method (Warr GW et al., Methods in Nucleic Acids Research, CRC press, 283 (1990)) and the lipofection method (Feigner PL et al., Natl. Acad. Sci. USA, 84. 7413-7417 (1987)).
  • the expression level and antigen-binding activity of the humanized antibody in the culture supernatant were determined using a culture supernatant as the first antibody and an anti-human immunoglobulin antibody labeled as the second antibody1. It can be measured by the enzyme immunoassay or the like described in (2).
  • Examples of a method for introducing an expression vector into a host cell include an electroporation method (Japanese Patent Laid-Open No. 2-257891; Miyaji H. et al., Cytotechnology, Sa, 133-140 (1990)) and the like.
  • any host cell that can express the humanized antibody can be used.
  • mouse SP2 / 0-Agl4 cell ATCC number: CRL-1581
  • mouse P3X63-Ag8.65 cell ATCC number: CRL- 1580
  • CH0 cells lacking the dihydrofolate reductase gene hereinafter referred to as the DHFR gene
  • Gil. 16Ag. 20 cells ATCC number: CRL-1662; hereinafter, referred to as YB2 / 0 cells).
  • transformants that stably produce humanized antibodies can be selected by culturing in an animal cell culture medium containing a drug such as G418 (G418 sulfate; manufactured by Sigma-Aldrich) (Shitara K. et al., J. Immunol. Methods, 167, 271-278 (1994)).
  • G418 G418 sulfate
  • Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich
  • the medium for animal cell culture includes 1640 medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical), GIT medium (manufactured by Nippon Pharmaceutical), EX-CELL302 medium (manufactured by JRH Biosciences), IMDM medium (manufactured by Invitrogen), Hybridoma -An SFM medium (manufactured by Invitrogen) or a medium obtained by adding various additives such as fetal calf serum (FBS) to these mediums can be used.
  • the humanized antibody can be expressed and accumulated in the culture supernatant by culturing the obtained transformant in a medium.
  • the expression level of the humanized antibody and the antigen-binding activity in the culture supernatant can be measured by ELISA or the like described in 1. (4) above.
  • transformants can increase the amount of humanized antibody produced using a DHFR gene amplification system or the like (Shitara K. et al., J. Immunol. Methods, 167, 271-278 (1994) ) 0
  • the humanized antibody can be purified from the culture supernatant of the transformant using a protein A column (Antibodies' A 'Laboratory' Manual, Chapter 8; Goding JW, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press ( 1996)).
  • a protein A column Antibodies' A 'Laboratory' Manual, Chapter 8; Goding JW, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press ( 1996).
  • other purification methods used for ordinary proteins can be used.
  • purification can be performed by a combination of gel filtration, ion exchange chromatography, and ultrafiltration.
  • the molecular weight of the purified humanized antibody H chain, L chain or whole antibody molecule can be determined by polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE; laemmli UK, Nature, 227, 680-685 (1970)) or Western blotting (anti- Poddy's Laboratory 1) Manual, Chapter 12; Goding JW, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1996)).
  • the antigen binding activity of the purified humanized antibody was determined by the enzyme immunoassay described in 1. (2) above using a purified humanized antibody as the first antibody and a labeled anti-human immunoglobulin antibody as the second antibody. And Fluorescent antibody method (Cancer Immunol. Immunother., 36, 373 (1993)), surface plasmon resonance using BIAcore TM (Karlsson R. et al., J. Immunol. Methods, 145, 229-240 (1991) )) Can be measured.
  • the cytotoxic activity against antigen-positive cultured cells can be evaluated by measuring CDC activity, ADCC activity and the like (Cancer Immunol. Immunother., 36, 373 (1993)).
  • the change in the amount of produced cytokine can be measured by an ELISA method, a fluorescent antibody method or the like.
  • an anti-CCR4 chimeric antibody can be prepared according to the method described in W001 / 64754. Further, an anti-CCR4CDR-grafted antibody can be prepared according to the method described in Reference Examples described later.
  • Antibody fragments can be prepared by genetic engineering or protein chemical techniques based on the anti-CCR4 monoclonal antibody and anti-CCR4 humanized antibody described in 1 and 2.
  • Antibody fragments include Fab, F (ab ') 2 , Fab', scFv, Diabody, dsFv, peptides including CDRs, and the like.
  • Fab can be prepared by treating an anti-CCR4 antibody with proteolytic enzyme papain. After treatment with papain, if the original antibody is an IgG subclass that has protein A binding 1 ", it can be separated from IgG molecules and Fc fragments by passing through a protein A column and recovered as a homogeneous Fab. Yes (Goding JW, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1996)) 0 In the case of an IgG subclass antibody without protein A binding, By mouth chromatography, Fab can be recovered in fractions eluted at low salt concentration (Goding JW, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1996)). Fab can also be produced by genetic engineering using Escherichia coli.
  • the DNA encoding the V region of the antibody described in (2), (5) and (6) can be cloned into a Fab expression vector to produce a Fab expression vector.
  • Any Fab expression vector can be used as long as it can incorporate and express Fab DNA.
  • pIT106 Bit M. et al., Science, 240, 1041-1043 (1988)
  • the Fab expression vector can be introduced into an appropriate Escherichia coli to produce and accumulate Fab in the inclusion body or periplasm layer.
  • Active Fabs can be converted from inclusion bodies into active Fabs by the refolding method usually used for proteins, and when expressed in periplasm, active Fabs leak into the culture supernatant. .
  • a homogeneous Fab can be purified by using an antigen-bound column (Borrebeck K., Antibody Engineering: A Practical Guide, Oxford University Press (1991)). .
  • F (ab ') 2 can be prepared by treating an anti-CCR4 antibody with the protease pepsin. After treatment with pepsin, it can be recovered as uniform F (ab ') 2 by the same purification procedure as Fab (Goding JW, Monoclonal Antioodies *. Principles and Practice, Academic Press (1996)). In addition, Fab 'described in 3.
  • (3) may be treated with maleimide such as N, N, -o_phenylenedimaleimide @ bismaleimidehexane to form a thioether bond, or 5,5'- It can also be prepared by a method of treating with dithiobis (2-etrobenzoic acid) (DTNB) and forming a disulfide bond (McCafferty J. et al., Antibody Engineering: A Practical Approach, IRL Press (1996)).
  • DTNB dithiobis (2-etrobenzoic acid)
  • Fab 'can be obtained by treating F (ab') 2 described in 3. (2) with a reducing agent such as dithiothreitol.
  • Fab 'can also be produced by genetic engineering using Escherichia coli. For example, 2.
  • a DNA encoding the V region of the antibody described in (2), (5) and (6) can be cloned into a Fab ′ expression vector to prepare a Fab ′ expression vector.
  • any vector can be used as long as it can incorporate and express the DNA encoding the V region of the antibody described in 2. (2), (5) and (6).
  • pAK19 Carter P.
  • the Fab 'expression vector can be introduced into an appropriate E. coli to produce and accumulate Fab' in the inclusion body or periplasm layer. From the inclusion bodies, active Fabs can be obtained by the refolding method usually used for proteins, and when expressed in the periplasmic layer, partial digestion with lysozyme, osmotic shock, -Bacteria can be crushed by treatment with a case or the like and collected outside the cells. After refolding or from the lysate of the bacteria, a uniform Fab 'can be purified by using a protein G column (McCafferty J. et al., Antibody Engineering: A Practical Approach, IRL Press (1996). )) 0
  • ScFv can be produced using phage or E. coli in genetic engineering.
  • the DNA encoding VH and VL of the antibody described in (2), (5) and (6) can be ligated via DNA encoding a polypeptide linker consisting of an amino acid sequence of 12 or more residues. Ligation is performed to produce scFv-encoding DNA. It is important that polypeptide linkers be optimized so that their addition does not interfere with VH, VL binding to antigen, such as those shown by Pantoliano et al. (Pantoliano MW et al., Biochemistry, 30, 10117-10125 (1991)) or a modified version thereof can be used.
  • the prepared DNA can be cloned into a scFv expression vector to prepare a scFv expression vector.
  • Any scFv expression vector can be used as long as it can incorporate and express scFv DNA. Examples include PCANTAB5E (manufactured by Amersham Biosciences) and Phfa (Lah M. et al., Hum. Antibodies Hybridomas, 5, 48-56 (1994)).
  • PCANTAB5E manufactured by Amersham Biosciences
  • Phfa Lah M. et al., Hum. Antibodies Hybridomas, 5, 48-56 (1994)
  • scFv can be produced and accumulated in the inclusion body or periplasmic layer of Escherichia coli into which the scFv expression vector has been introduced.
  • active scFvs can be obtained by the refolding method usually used for proteins, and when expressed in the periplasmic layer, partial digestion with lysozyme, osmotic shock, and so on.
  • -Bacteria can be crushed by treatment with case, etc., and collected outside the cells.
  • uniform scFv can be purified by cation exchange chromatography (McCafferty J. et al., Antibody Engineering: A Practical Approach, IRL Press ( 1996)).
  • Diabodies can be prepared by using a polypeptide linker of about 3 to 10 residues when preparing the above scFv.
  • a divalent diabody can be prepared.
  • a dibody having two specificities can be prepared (Le Gall F. et al., FEBS Lett., 453, 164-168 (1999), Courage C. et al., Int. J. Cancer, 77, 763-768 (1998)). (6) Preparation of dsFv
  • dsFv can be produced by genetic engineering using Escherichia coli. First, a mutation was introduced at the appropriate position in the DNA encoding VH and VL of the antibody described in 2. (2), (5) and (6), and the amino acid residue encoded was replaced with cysteine. Make DNA. Amino acid residues can be modified to cysteine residues by the mutagenesis method using PCR in 2. (6). Each of the prepared DNAs can be cloned into a vector for dsFv expression to prepare VH and VL expression vectors. As the dsFv expression vector, any vector can be used as long as it can incorporate and express dsFv DNA. For example, P ULI9 (Reiter Y.
  • VH and VL expression vectors can be introduced into appropriate E. coli to produce and accumulate VH and VL in inclusion bodies or periplasmic layers.
  • VH and VL can be obtained from the inclusion body or the periplasmic layer, mixed, and formed into disulfide bonds by the refolding method usually used for proteins to obtain active dsFv. After refolding, it can be further purified by ion exchange chromatography, gel filtration, etc. (Reiter Y. et al., Protein Eng., 7, 697-704 (1994)) o
  • a peptide containing CDR can be produced by a chemical synthesis method such as the Fmoc method or the tBoc method.
  • a DNA encoding a peptide containing CDR can be prepared, and the prepared DNA can be cloned into an appropriate expression vector to prepare a CDR peptide expression vector.
  • the expression vector any vector can be used as long as it can incorporate and express DNA encoding a peptide including CDR.
  • pLEX manufactured by Invitrogen
  • pAX4a + [manufactured by MoBiTec] and the like can be mentioned.
  • An expression vector can be introduced into an appropriate E.
  • coli and a peptide containing CDR can be produced and accumulated in an envelope or periplasmic layer. Wear. Peptides containing CDRs can be obtained from inclusion bodies or periplasmic layers and purified by ion exchange chromatography, gel filtration, etc. (Re iter Y. et al., Protein Eng., 7, 697-704 (1994) ).
  • the antigen binding activity of the above antibody fragment was determined by the enzyme immunoassay described in 1. (2) above, using the antibody fragment as the first antibody, surface plasmon resonance (Karlsson R. et al., J. Immunol. Methods, 145). , 229-240 (1991)).
  • the anti-CCR4 antibody binds to the CCR4 protein present on the cell membrane surface of CCR4-expressing cells infiltrating into peripheral blood or inflamed areas.
  • Anti-CCR4 antibodies inhibit the activation and migration of CCR4-positive cells by inhibiting the function of CCR4.
  • CCR4-expressing cells are damaged by the CDC activity or ADCC activity of the anti-CCR4 antibody bound to the cell surface.
  • CCR4-positive cells also called Th2 cells, include a cell population that has been shown to play an important role in forming an allergic inflammatory picture.
  • the anti-CXCR3 antibody binds to the CXCR3 protein present on the cell membrane surface of CXCR3-expressing cells infiltrated into peripheral blood or inflamed areas.
  • Anti-CXCR3 antibodies inhibit the activation and migration of CXCR3-positive cells by inhibiting the function of CXCR3.
  • CXCR3-expressing cells are damaged by the CDC activity or ADCC activity of the anti-CXCR3 antibody bound to the cell surface.
  • CXCR3-positive cells also called Th1 cells, include a cell population that has been shown to play an important role in the formation of an inflammatory image. Therefore, a medicament containing an anti-CCR4 antibody and an anti- or CXCR3 antibody can be used for diagnosis, prevention and treatment of interstitial pneumonia, which is one of inflammatory diseases.
  • the pathology is said to progress due to a markedly imbalanced ratio of Th2 cells and Thl cells infiltrating the inflamed area. Therefore, by using the discrimination method shown in 5 below, the ratio of Th2 cells to Thl cells By damaging the wet cells, it is possible to diagnose, prevent and treat inflammation of interstitial pneumonia, pulmonary fibrosis induced after the inflammatory reaction, and further, decrease in respiratory function.
  • the anti-CCR4 antibody is useful for diagnosis, prevention or treatment of diseases such as idiopathic interstitial pneumonia, where Th2 cells are more infiltrated than Thl cells at the site of inflammation.
  • the target of diagnosis, prevention or treatment of anti-CXCR3 antibody is atypical idiopathic interstitial pneumonia, rheumatoid arthritis, dermatomyositis, interstitial pneumonia in collagen diseases such as polymyositis, etc. Is also effective for diseases in which excessive Thl cell infiltration is observed.
  • the form of the drug “containing an anti-CCR4 antibody and an anti-CXCR3 antibody as an active ingredient” may be in any form, such as a combination drug, a combination of an anti-CCR4 antibody and an anti-CXCR3 antibody, Examples include the form of a kit containing a CCR4 antibody and an anti-CXCR3 antibody separately.
  • humanized antibodies Compared to monoclonal antibodies of non-human animals, humanized antibodies have a high effect in the human body and a low immunogenicity because most of the portions are derived from the amino acid sequence of human antibodies. Since it is expected to last for a long time, it is preferable as a prophylactic or therapeutic agent.
  • compositions containing anti-CCR4 and Z- or anti-CXCR3 antibodies can be administered alone as prophylactic or therapeutic agents, but are usually one or more pharmacologically acceptable carriers. And provided as pharmaceutical preparations prepared by any of the methods well-known in the art of pharmacy. It is desirable to use the most effective route for treatment. And the like, and in the case of an antibody or peptide preparation, preferably, intra-articular and intravenous administration.
  • Dosage forms include sprays, capsules, tablets, granules, syrups, emulsions, suppositories, injections, ointments, tapes and the like.
  • Formulations suitable for oral administration include emulsions, syrups, capsules, tablets, powders, and granules.
  • Liquid preparations such as emulsion syrups include water, sugars such as sucrose, sorbitol, fructose, glycols such as polyethylene glycol and propylene glycol, oils such as sesame oil, olive oil, soybean oil, p -Can be manufactured using preservatives such as hydroxybenzoic acid esters and flavors such as strawberry flavor and peppermint as additives.
  • Capsules, tablets, powders, granules, etc. are excipients such as lactose, grape bran, sucrose, mannitol, disintegrants such as starch and sodium alginate, lubricants such as magnesium stearate, talc, poly It can be produced using a binder such as BURU alcohol, hydroxypropyl cellulose or gelatin, a surfactant such as fatty acid ester, or a plasticizer such as glycerin as an additive.
  • a binder such as BURU alcohol, hydroxypropyl cellulose or gelatin, a surfactant such as fatty acid ester, or a plasticizer such as glycerin as an additive.
  • Formulations suitable for parenteral administration include injections, suppositories, sprays and the like.
  • the injection is prepared using a carrier comprising a salt solution, a glucose solution, or a mixture of both.
  • Suppositories are prepared using carriers such as cocoa butter, hydrogenated fats or carboxylic acids.
  • the spray may be prepared using the antibody or peptide itself or a carrier which does not irritate the oral cavity and respiratory tract mucosa of the recipient and disperses the antibody or peptide as fine particles to facilitate absorption. Prepared.
  • the carrier include lactose and glycerin.
  • Formulations such as aerosols and dry powders can be made depending on the properties of the antibody or peptide and the carrier used.
  • the components exemplified as additives for oral preparations can also be added to these parenteral preparations.
  • the dose or frequency of administration varies depending on the desired therapeutic effect, administration method, treatment period, age, body weight, etc., but is usually 10 ig / kg to 20 mg / kg per day for an adult.
  • the dosage form and administration route for administering the anti-CCR4 antibody to the model animal can be appropriately selected depending on the nature and severity of the target model animal. For example, they can be used as such or together with other pharmacologically acceptable carriers, excipients, diluents, etc., by oral or parenteral (intraperitoneal, intravenous, intraarticular) , Intramuscular, subcutaneous administration, etc.).
  • the amount and dosage of the anti-CCR4 antibody are individually determined according to the administration method, administration form, intended use, specific symptoms of the model animal, the weight of the model animal, etc., and are not particularly limited. Dosage should be approximately lg / kg per day; LOOmg / kg approximately once a day as the dosing interval, and should be administered 2 to 4 times a day or more Can also. It is also possible to administer continuously by, for example, infusion. When administering locally to joints, etc., approximately lpg to lOOmg should be administered to one site.
  • the anti-CCR4 antibody specifically binds to CCR4 and can detect and quantify CCR4-positive cells.
  • the anti-CXCR3 antibody specifically binds to CXCR3, and can detect and quantify CXCR3-positive cells.
  • the number of CCR4-positive cells is increased compared to the number of CXCR3-positive cells in the lung tissue of typical idiopathic interstitial pneumonia.
  • the number of CXCR3-positive cells is increased compared to the number of CCR4-positive cells. Therefore, by reacting an anti-CCR4 antibody and an anti-CXCR3 antibody with a biological sample of a patient with idiopathic interstitial pneumonia, the typical can do.
  • the diagnostic agent of the present invention can distinguish CCR4-positive cells from CXCR3-positive cells, among patients with interstitial pneumonia, those with significant infiltration of CCR4-positive cells and those infiltrated by CXCR3-positive cells Patients with significant are identified, and the above four treatments can be selected.
  • Examples of the biological sample include a lung tissue section collected from a subject by biopsy or the like, a cell extract prepared from the cell or tissue, blood, and the like.
  • the anti-CCR4 antibody used in the diagnostic agent of the present invention may be any antibody that specifically binds to CCR4.
  • Examples of the antibody used in the present invention include a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, and a gene. Anything such as a recombinant antibody or an antibody fragment thereof is included.
  • Examples of the recombinant antibodies include humanized antibodies such as human chimeric antibodies and human CDR-grafted antibodies.
  • Antibody fragments include Fab, F (ab ') 2 , Fab', scFv, Diabody, dsFv, and CDR-containing peptides.
  • the diagnostic agent containing the anti-CCR4 antibody and / or the anti-CXCR3 antibody may include a reagent for performing an antigen-antibody reaction and a reagent for detecting the reaction according to the determination method described below.
  • Reagents for performing the antigen-antibody reaction include buffers, salts and the like.
  • Examples of the detection reagent include reagents used in ordinary immunological detection methods such as a labeled secondary antibody that recognizes an anti-CCR4 antibody or an anti-CXCR3 antibody, a substrate corresponding to the label, and the like.
  • Methods for immunologically detecting or quantifying CCR4-positive or CXCR3-positive cells infiltrating a biological sample using an anti-CCR4 antibody or anti-CXCR3 antibody include a fluorescent antibody method and an enzyme immunoassay (ELISA), radioactive labeling immunoassay (RIA), immunohistochemistry, immunocytostaining, western blotting, immunoprecipitation, sandwich ELISA (Sakuji Toyama and Tamie Ando, monoclonal antibody Yuaru, Kodansha Scientific (1987), Biochemical Society of Japan, Seminal Chemistry Laboratory Course 5, Immunobiochemical Research Method, Tokyo Kagaku Dojin (1986)), etc. can be used.
  • ELISA enzyme immunoassay
  • RIA radioactive labeling immunoassay
  • immunohistochemistry immunocytostaining
  • western blotting western blotting
  • immunoprecipitation sandwich ELISA
  • Optical geometry methods are described in the literature (Goding JW, Monoclonal Antibodies' -Principles and Practice, Academic Press (1996), Sakuji Toyama and Tamie Ando, Monoclonal Antibody Experiment Manual, Kodansha Scientific (1987)) This can be done using the methods described. Specifically, the separated cells or tissues are reacted with an anti-CCR4 antibody, and further reacted with an anti-imnoglobulin antibody labeled with a fluorescent substance such as fluorescein 'isothiosinate (FITC) or phycoerythrin. This is a method of measuring a fluorescent dye with a flow cytometer.
  • FITC fluorescein 'isothiosinate
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • RIA radiolabeled immunoassay
  • an anti-imnoglobulin antibody is prepared by reacting an anti-CCR4 antibody with isolated tissues and labeling it with a fluorescent substance such as FITC, an enzyme such as peroxidase or alkaline phosphatase.
  • a reaction is performed by adding a substrate that develops a color by the enzyme reaction, followed by observation using a microscope. The method is described in the literature (Goding JW, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1996) ), Toyama Sakuji and Ando Tamoe, Monoclonal Antibody Experiment Manual, Kodansha Scientific (1987)), and the like.
  • Western blotting is performed by dissolving the separated cells or tissues in a sample buffer containing SDS, performing SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, transferring them to polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane, and using an anti-CCR4 antibody.
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • React, Peru This is a method in which an anti-iminoglobulin antibody labeled with an enzyme such as oxidase or allyl phosphatase is allowed to react, followed by the addition of a substrate that emits color or chemiluminescence by an enzyme reaction, followed by detection as a band.
  • a separated cell or tissue lysate is reacted with an anti-CCR4 antibody immobilized on beads or the like, the beads are isolated by centrifugation, etc., and the beads are treated with a sample buffer containing SDS.
  • the dissolved CCR4 is detected by Western blotting or the like.
  • the sandwich ELISA method is a type of enzyme immunoassay using two types of anti-CCR4 antibodies, each having a different epitope. After fixing one anti-CCR4 antibody on the plate and reacting the separated cell or tissue lysate, the other anti-CCR4 antibody is further reacted with CCR4 bound to the anti-CCR4 antibody on the plate.
  • This is a method in which an anti-immunoglobulin antibody labeled with an enzyme such as peroxidase or alkaline phosphatase is allowed to react, a substrate that develops a color by an enzyme reaction is added, and the reaction is performed, and the coloring dye is measured with an absorptiometer.
  • Figure 1 is a diagram showing a Construction process of a plasmid P KM2160GalO.
  • FIG. 2 is a diagram showing a construction process of plasmid pKM2160Gall. * Indicates the position of the mutant gene codon for modifying the amino acid residue.
  • FIG. 3 is a diagram showing a Construction process of a plasmid P KM2160Gal3. * Indicates the position of the mutant gene codon for modifying the amino acid residue.
  • FIG. 4 is a diagram showing a Construction process of a plasmid P KM2160LV0.
  • FIG. 5 is a diagram showing a Construction process of a plasmid P KM2160LV1. * Indicates the position of the mutant gene codon for modifying the amino acid residue.
  • FIG. 6 is a diagram showing the construction steps of plasmid pKANTEX2160LV0 and plasmid pKANTEX2160Gal0LV0.
  • FIG. 7 is a diagram showing the reactivity of the expression vector of each anti-CCR4 CDR-grafted antibody in COS-7 cells by transient expression in COS-7 cells, and the CCR4 partial peptide in the obtained culture supernatant by ELISA.
  • Fig. 8 shows transient expression of each anti-CCR4 CDR-grafted antibody expression vector prepared using another FR in COS-7 cells, and reactivity with CCR4 partial peptide in the obtained culture supernatant by ELISA.
  • FIG. 9 is a diagram showing the reactivity of the purified anti-CCR4 CDR-grafted antibody to the CCR4 partial peptide by ELISA.
  • FIG. 10 is a graph showing the response of purified anti-CCR4 CDR-grafted antibody to CCR4 high-expressing cells (CCR4 / EL-4).
  • FIG. 11 is a diagram showing the affinity of the purified anti-CCR4 CDR-grafted antibody for the CCR4 partial peptide measured using a surface plasmon resonance sensor.
  • Example 1 Staining of lung tissue of patients with idiopathic interstitial pneumonia using anti-CCR4 antibody
  • T cells accumulate in inflamed areas. It is expressed on the cell surface of Thl cells
  • T cells that accumulate in lung tissue of patients with idiopathic interstitial pneumonia were stained using antibodies that react with CXCR3 and CCR4 expressed on the cell surface of Th2 cells, respectively.
  • Kit, BioGenex was used for immunostaining of paraffin sections of lung tissue. The method followed the operation manual of the kit.
  • the number of CXCR3 or CCR4 positive cells was determined by randomly selecting 20 visual fields (400-fold magnification) in the fibrous region and counting the number of antibody-positive mononuclear cells present in the visual fields. Table 1 shows the results. Table 1 Distribution of CXCR3 CCR4 positive cells in idiopathic interstitial pneumonia Number of positive cells
  • UIP A typical case of interstitial pneumonia (usual interstitial pneumonia)
  • NSIP Atypical non-specific interstitial pneumonia (Nonspecific interstitial pneumonia) CCR4-positive cells, that is, Th2 cells, are predominantly infiltrated in 2 patients with idiopathic stromal stromal ⁇ live pneumonia (patients 13 and 14) Was. In contrast, 12 patients with atypical idiopathic interstitial pneumonia (patients 1-12) showed significant infiltration of CXCR3-positive cells, that is, Thl cells.
  • idiopathic interstitial pneumonia is possible by using anti-CCR4 antibody and anti-CXCR3 antibody. Also, check the ratio of Thl cells to Th2 cells. By examining the ratio of Thl cells and Th2 cells infiltrated with anti-CCR4 and anti-CXCR3 antibodies, we can distinguish between idiopathic idiopathic interstitial pneumonia and atypical idiopathic interstitial Is possible.
  • Pulmonary tissue from interstitial pneumonia in patients with collagen disease was prepared from the literature (Histotechnology: A self-instruction test. ASCP Press (1990)). Tissue immunostaining was performed using an anti-CCR4 antibody # 2160, a commercially available anti-CXCR3 antibody (Pharmindin) and a commercially available immunohistochemical staining kit (SS MultiLink Detection Kit, BioGenex) in accordance with the procedure for the kit. The number of CXCR3 or CCR4 positive cells was determined by randomly selecting 5 visual fields (400-fold magnification) in the fibrous region and counting the number of antibody-positive mononuclear cells present in the visual fields. For the lymph follicle region, measurement was also performed by selecting 5 visual fields. Table 2 shows the results. Table 2 Distribution of CXCR3 and CCR4 positive cells in CVD-IP Thought Age (years) Diagnosis
  • RA rheumatoid arthritis CXCR3 positive cells predominantly infiltrate (patients 20, 23, 25, 27) and CCR4 positive cells predominantly infiltrate in lung tissue collected from patients with systemic sclerosis (patients 20-27) (Patients 21, 22, 24) were observed.
  • anti-CCR4 antibody is useful as a therapeutic agent in patients with significant infiltration of CCR4-positive cells, and anti-CXCR3 antibody in patients with significant infiltration of CXCR3-positive cells.
  • the antibodies proved to be useful as therapeutic agents.
  • the amino acid sequence of VH of the anti-CCR4 CDR-grafted antibody was designed as follows. Using the anti-CCR4 mouse antibody KM2160 prepared according to the method described in Example 1 of W001 / 64754 to transplant the amino acid sequences of CDRs 1, 2, and 3 of VH shown in SEQ ID NOs: 2, 3, and 4 The amino acid sequence of FR of human VH was selected. Using the GCG Package (Genetics Computer Group) as a sequence analysis system, a human antibody with high homology to KM2160 was extracted from the existing protein amino acid sequence database by the BLASTP method (Nucleic Acid Res., 25, 3389 (1997)). searched.
  • GCG Package Genetics Computer Group
  • the SWISSPROT database accession number P01781, Ig Heavy chain V-III region Gal (Hoppe. Seylers. Z. Physiol. Chem., 354, 1505) -1509 (1973); hereinafter referred to as Gal) Since the antibody showed a power of 82.5% and was the most homologous human antibody, the FR amino acid sequence of this antibody was selected. However, in the amino acid sequence of Gal FR in the database, the amino acid residue is not uniquely determined (secreted type amino acid residue).
  • amino acid sequences of CDR1, 2, and 3 of the VH of the anti-CCR4 mouse antibody KM2160 shown in SEQ ID NOs: 2, 3, and 4 were placed at appropriate positions in the FR amino acid sequence of the human antibody determined as described above.
  • the VH amino acid sequence GalO of the anti-CCR4 CDR-grafted antibody described in SEQ ID NO: 10 was designed.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 is shown in SEQ ID NO: 24.
  • amino acid sequence of VH of the anti-CCR4 CDR-grafted antibody was designed based on the consensus sequence classified by Rippat et al.
  • amino acid sequence of the VH CDR of the anti-CCR4 mouse antibody KM2160 was grafted to the appropriate position of the amino acid sequence of FR of the consensus sequence of the subgroup III of human antibody VH, and SEQ ID NO:
  • the VH amino acid sequence HV0 of the anti-CCR4 CDR-grafted antibody described in 11 was designed.
  • SEQ ID NO: 25 shows the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11.
  • VL of the anti-CCR4CDR-grafted antibody was designed as follows.
  • the amino acid sequence of FR of VL of a human antibody for transplantation of the amino acid sequence of CDR1, 2 or 3 of VL of anti-CCR4 mouse antibody KM2160 shown in SEQ ID NOs: 5, 6 and 7 was selected.
  • Kabat et al. Classified the VLs of various known human antibodies into four subgroups (HSG I-IV) based on their amino acid sequence homology, and reported common sequences for each of these subgroups. (Sequences of Proteins' ob 'Immnological' Interest).
  • the amino acid sequence of FR having the highest homology with the amino acid sequence of FR of KM2160 VL was selected.
  • Table 4 shows the results of the homology search. As shown in Table 4, the amino acid sequence of FR of VL of KM2160 had the highest homology with subgroup II. Table 4 FR amino acid sequence of the common sequence of each subgroup of human antibody VL
  • the amino acid sequence of the anti-CCR4 CDR-grafted antibody shown in SEQ ID NO: 12 was designed by grafting the amino acid sequences of SEQ ID NOs.
  • SEQ ID NO: 26 shows the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12.
  • the amino acid sequence of VH of the anti-CCR4 CDR-grafted antibody designed above is obtained by adding only the amino acid sequence of the anti-CCR4 mouse antibody KM2160 CDR to the amino acid sequence of FR of the selected human antibody. Although it is a transplanted sequence, in general, in the case of a human CDR-grafted antibody, the activity is often reduced only by transplanting the amino acid sequence of the mouse antibody CDR.
  • amino acid residues of FR that differ in the above, amino acid residues that are thought to affect the activity have been transplanted together with the amino acid sequence of CDR. Therefore, in this Reference Example, it was examined to identify amino acid residues of FR which are considered to affect the activity.
  • the three-dimensional structure of the antibody V region (GalOLVO and HV0LV0) consisting of the VH amino acid sequence Gal0, HV0 and VL amino acid sequence LV0 of the anti-CCR4CDR-grafted antibody designed above was constructed using a computer modeling technique.
  • the software AbM (made by Oxford Molecular) is used for preparing three-dimensional structure coordinates
  • the software Pro-Explore (made by Oxford Molecular) is used for displaying three-dimensional structures.
  • RasMol manufactured by Glaxo
  • a computer model of the three-dimensional structure of the V region of the anti-CCR4 mouse antibody KM2160 was similarly constructed.
  • amino acid sequences different from the anti-CCR4 mouse antibody KM2160 in order to residues found at corresponding positions of the anti-CCR4 mouse antibody KM2160. was constructed in the same manner, and the three-dimensional structure of the V region of the anti-CCR4 mouse antibody KM2160, GalOLVO or HV0LV0 and the variant was compared].
  • VH for example, Gall shown in SEQ ID NO: 13 in which Ala at position 97 of GalO has been modified, Gly in position 42 of GalO in which GalO has been modified, and Gal2 in position shown in SEQ ID NO: 14 in which Gly in position 44 has been modified, and 97th position of GalO in GalO Ala of Gly at the 42nd position and Gly at the 44th position were modified, and Gal3 shown in SEQ ID NO: 15, and Thr at the 28th position of HVO were modified.
  • the Ala at the 97th position of HV1 and HVO shown in SEQ ID NO: 16 were modified.
  • HV2 represented by SEQ ID NO: 17 and HV3 represented by SEQ ID NO: 18 in which 28th Thr and 97th Ala of HV0 were modified were designed, respectively.
  • VL for example, LV1 shown in SEQ ID NO: 19 obtained by modifying the second lie, LV2 shown in SEQ ID NO: 20 obtained by modifying the third Val, sequence obtained by modifying the second lie and the third Val
  • the LV3 shown in No. 21 was designed.
  • the nucleotide sequences encoding the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 13 to 21 are shown in SEQ ID NOs: 27 to 35, respectively.
  • the cDNA encoding the VH amino acid sequence GalO of the anti-CCR4CDR-grafted antibody designed in Section 1 (1) of Reference Example 1 was constructed by the PCR method as follows.
  • a complete antibody amino acid sequence was obtained by connecting the designed amino acid sequence to the H-chain secretion signal sequence (W001 / 64754) of the anti-CCR4 mouse antibody KM2160 described in SEQ ID NO: 36.
  • the amino acid sequence was converted to a gene codon. If multiple gene codons exist for one amino acid residue, consider the frequency of use (sequences, proteins, proteins, proteins, immunology, interest) found in the base sequence of the antibody gene. And the corresponding gene codon was determined.
  • the nucleotide sequence of the cDNA encoding the amino acid sequence of the complete antibody V region is designed, and the 5'-end and the 3'-end are combined with the base sequence of the amplification primer for PCR reaction ( (Including a restriction enzyme recognition sequence for cloning into a human antibody expression vector). Divide the designed base sequence into a total of 6 base sequences of about 100 bases from the 5 'end (adjacent base sequences should have an overlapping sequence of about 20 bases at their ends), Actually, six synthetic oligonucleotides having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 37 to 42 were synthesized in the alternate order of the antisense strand (GENSET).
  • Each oligonucleotide was added to a reaction solution containing 0.2 mM dNTPs and IraM magnesium chloride to a final concentration of 0.1 ⁇ M, and 0.4 ⁇ M M13 primer RV (Takara Shuzo), ⁇ ⁇ M PCR PCR reaction was performed using M13 primer M3 (manufactured by GENSET) and 2.5 units of KOD polymerase (manufactured by T0Y0B0) as a total.
  • the reaction conditions were 30 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, and 74 ° C for 60 seconds, followed by one cycle of 74 ° C for 10 minutes.
  • the reaction solution was purified using QIA quick PCR purification kit (manufactured by QIAGEN) and finally dissolved in sterilized water. Using 10 units of restriction enzyme ⁇ pal (Takara Shuzo) and 10 units of restriction enzyme Not_I (Takara Shuzo) The reaction was performed at 37 ° C for 1 hour. The reaction solution was fractionated by agarose gel electrophoresis, and an Apal-Notl fragment of about 0.47 kb was recovered.
  • the plasmid pBluescript II SK (-) (Stratagene) was reacted with 10 units of restriction enzyme I (Takara Shuzo) and 10 units of restriction enzyme 1 (Takara Shuzo) at 37 ° C for 1 hour. I let it.
  • the reaction solution was fractionated by agarose gel electrophoresis, and an Apal-Notl fragment of about 2.95 kb was recovered.
  • the plasmid pKM2160GalO shown in FIG. 1 having the target nucleotide sequence was obtained.
  • Escherichia coli DH5a / pKM2160GalO an Escherichia coli strain transformed with the plasmid pKM2160GalO, was obtained from the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary (Patent Organism Depositary Center) (1-1-1, Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan 1-Central 6) Deposited internationally as FERM BP-7709 on August 22, 2013.
  • the reaction solution was purified using QIA quick PCR purification kit (manufactured by QIAGEN) and finally dissolved in sterilized water. The whole amount was reacted with 10 units of restriction enzyme I (Takara Shuzo) at 37 ° C for 1 hour, and then with 10 units of restriction enzyme ⁇ ⁇ (New England Biolabs) for 1 hour at 37 ° C. Reacted.
  • the reaction solution was fractionated by agarose gel electrophoresis, and a Pstl-Dralll fragment of about 0.58 kb was recovered.
  • E ⁇ I- ⁇ III fragment derived from the PCR product obtained above and the Pstl-Dralll fragment derived from the plasmid pKM2160GalO were combined using Solution I of DNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo Co., Ltd.). Were linked according to the book.
  • the plasmid pKM2160Gall shown in FIG. 2 having the target nucleotide sequence was obtained.
  • Escherichia coli DH5a / pKM2160Gall a large intestine strain transformed with the plasmid pKM2160Gall, was obtained from the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) at the Patent Organism Depositary (Patent Organism Depositary) (1-1-1, Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan). It has been deposited internationally as FERM BP-7710 on August 22, 2016.
  • the PCR primers used were a synthetic DNA (GENSET) having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 45 for mutagenesis and M13 pKM2160Gal2 was obtained in basically the same manner as described above except that primer RV (manufactured by Takara Shuzo) was used as a primer.
  • Escherichia coli DH5 a / P KM2160Gal2 in plasmid P KM 2 160Gal2 is a transformed E. coli strains, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary (FERM BP-7711, dated August 22, 2001 at Tsukuba East 1-chome 1-Chome No. 6 Ibaraki, Japan).
  • the modification of all three residues was constructed as follows.
  • the obtained pKM2160Gall and p2160Gal2 were reacted at 37 ° C for 1 hour at 37 ° C with 10 units of I (manufactured by Takara Shuzo) using about 0.5 / zg, and then 37 ° C at 1 ° C (manufactured by Takara Shuzo).
  • the reaction was performed at C for 1 hour.
  • the reaction solution was fractionated by agarose gel electrophoresis, and an about 1.3 kb Nhel-Seal fragment derived from pKM2160Gall and a about 2. Okb fragment derived from pKM2160Gal2 were recovered.
  • the obtained two types of fragments were ligated using Solution I of DNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo) according to the attached instructions.
  • Escherichia coli DH5 strain (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) is transformed using the recombinant plasmid DNA solution obtained in this manner, and each plasmid DNA is prepared from the clone of the transformed strain.
  • Big Dye Terminator Kit ver. 2 (Appliedbiosystems) was used to analyze the nucleotide sequence.
  • a plasmid pKM2160Gal3 shown in FIG. 3 having the target nucleotide sequence was obtained.
  • Escherichia coli DH5a / pKM2160Gal3 a large intestinal strain transformed with plasmid pKM2160Gal3, was obtained from the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) at the Patent Organism Depositary (1-1-1, Tsukuba-Higashi, Ibaraki Pref., Japan). Deposited internationally as FERM BP-7712 on August 22, 2013.
  • a complete antibody amino acid sequence was obtained by connecting the designed amino acid sequence to the secretory signal sequence of the H chain of the anti-CCR4 mouse antibody KM2160 described in SEQ ID NO: 36.
  • the amino acid sequence was converted to a gene codon. If multiple gene codons exist for a single amino acid residue, consider the frequency of use (sequences / proteins / opin / immunological interest) found in the nucleotide sequence of the antibody gene. The corresponding gene codon was determined.
  • the nucleotide sequence of the cDNA encoding the complete antibody V region amino acid sequence was designed, and the 5'-end and the 3'-end were combined with a binding base sequence of an amplification primer for PCR reaction (including a restriction enzyme recognition sequence for cloning into a humanized antibody expression vector). Divide the designed base sequence into a total of 6 base sequences (approximately 100 bases from the 5 'end) (adjacent base sequences should have an overlapping sequence of about 20 bases at their ends) and use them as sense strands.
  • PKM2160HV0 was obtained in the same manner as for pKM2160GalO.
  • Escherichia coli DH5a / pKM2160HV0 an Escherichia coli strain transformed with the plasmid pKM2160HV0, is available from the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) at the Patent Organism Depositary (1-1-1, Tsukuba-Higashi, Ibaraki, Japan). Deposited internationally as FERM BP-7718 on August 27, 2001.
  • an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 50 is substituted for the oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 46, and the oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 50 is also described in SEQ ID NO: 47.
  • pKM2160HVl having the target nucleotide sequence is obtained.
  • an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 50 instead of the oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 46
  • the oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 47 instead of the oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 47, the oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 51, and instead of the oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 49, Having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 52.
  • the same reaction as in the construction of the above plasmid pKM2160HV0 was carried out using lignonucleotides to obtain pKM2160HV3 having the desired nucleotide sequence.
  • Escherichia coli DH5a / pKM2160HV3 an Escherichia coli strain transformed with plasmid PKM2160HV3, was transferred to the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) at the Patent Organism Depositary Center (1-1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan). Deposited internationally as FERM BP-7721 on August 27, 2013.
  • the resulting two types of fragments were ligated using Solution I of DNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo) according to the attached instructions.
  • Escherichia coli DH5 «strain (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) is transformed, each plasmid DNA is prepared from the clone of the transformed strain, and the Big Dye Terminator Kit
  • the nucleotide sequence was analyzed using ver. 2 (manufactured by Appliedbiosystems). As a result of analyzing the nucleotide sequence, a plasmid pKM2160HV2 having the target nucleotide sequence was obtained.
  • Escherichia coli DH5a / pKM2160HV2 an Escherichia coli strain transformed with plasmid pKM2160HV2 is the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) Patent Organism Depositary. Was deposited internationally on August 27, 2001 as FERM BP-7720.
  • the cDNA encoding the VL amino acid sequence LV0 of the anti-CCR4CDR-grafted antibody designed in Reference Example 1 (1) (2) was constructed using PCR in the same manner as VH as follows. However, the sequence of the light chain of the anti-CCR4 mouse antibody KM2160 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 53 was used as the secretory signal sequence (W001 / 64754). First, six synthetic oligonucleotides having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 54 to 59 were synthesized (GENSET).
  • the reaction was carried out at 37 ° C for 1 hour using 10 units of restriction enzyme (Takara Shuzo) and 10 units of restriction enzyme (Takara Shuzo).
  • the reaction solution was fractionated by agarose gel electrophoresis, and an EcoRI-Xhol fragment of about 0.44 kb was recovered.
  • a plasmid pKM2160LV0 shown in FIG. 4 having the target nucleotide sequence was obtained.
  • Escherichia coli DH5a / pKM2160LV0 an E. coli strain transformed with the plasmid pKM2160LV0, was obtained from the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary (1-1 Tsukuba East, Ibaraki, Japan). It has been deposited internationally as FERM BP-7713 on Address 1, Central No. 6) on August 22, 2001.
  • modification of the amino acid residues of FR designed in section 1 (3) of Reference Example 1 was performed by the method shown below.
  • the gene codon of the amino acid residue after the modification was set so as to be the gene codon found in the mouse antibody KM2160.
  • the above plasmid is replaced with an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 61 instead of the oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 50.
  • the plasmid PKM2160LV1 shown in FIG. 5 having the target nucleotide sequence was obtained.
  • Escherichia coli DH5a / pKM2160LVl an E.
  • coli strain transformed with the plasmid pKM2160LVl is available from the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary (Tsukuba-Higashi 1-1, Ibaraki, Japan, Central No. 6). Deposited internationally as FERM BP-7714 on August 22, 2001.
  • an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 62 is used instead of the oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 55, and
  • the target plasmid pKM2160LV2 can be obtained by using an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 63 instead of the oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 56.
  • pKM2160LV3 was obtained respectively. Escherichia coli DH5a / pKM2160LV2, an E.
  • Anti-CCR4 CDR-grafted antibody using the human antibody expression vector pKANTEX93 (Mol. Immunol., 37, 1035 (2000)) and the plasmids pKM2160GalO and PKM2160LV0 obtained in paragraphs (1) and (2) of Reference Example 1.
  • the expression vector pKANTEX2160Gal0LV0 was constructed as follows.
  • the humanized antibody expression vector PKA TEX93 was reacted with 10 units of restriction enzyme BsiWI (New England Biolabs) at 55 ° C for 1 hour, and then 10 units of restriction enzyme I ⁇ RI (Takara Shuzo) Was added and reacted at 37 ° C for 1 hour.
  • the reaction solution was fractionated by agarose gel electrophoresis, and a BsiWI-EcoRI fragment of about 12.75 kb was recovered.
  • the BsiWI-EcoRI fragment derived from pKM2160LV0 and the BsiWI-EcoRI fragment derived from plasmid PKANTEX93 obtained above were ligated using Solution I of DNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo) according to the attached instructions.
  • Escherichia coli DH5a strain manufactured by Toyobo Co., Ltd.
  • E. coli DH5 a strain (manufactured by TOYOBO) was transformed to prepare the plasmid DNA from the transformant clones.
  • FIG. 6 shows that the target DNA was cloned. It was confirmed that the obtained plasmid was obtained.
  • Expression vectors were also prepared using the same method for VH and VL, including HV0, in which other amino acid residues of FR were modified.
  • Gal0, Gall, Gal2, Gal3, HV0, HV1, HV2, and HV3 prepared in Reference Example 1, Section 2 (1), and LV0, LV1, Combining LV2 and LV3 with the following expression vectors Gal0LV0, GalOLVl, GalOLV2 s GalOLV3, GallLVl, GallLV3, Gal2LVl, Gal2LV3, Gal3LVl, Gal3LV3, HV0LV0, HV0LV1, HV0LV2, HV0LV3, HV1LV1, HV1LV1, HV1LV0 HV2LV0, HV2LV3, to prepare a HV3LV0 and HV 3 22 kinds of expression base Kuta one LV3.
  • Reference Example 2 Expression of anti-CCR4 CDR-grafted antibody in animal cells
  • the reaction solution was dropped onto the above-mentioned COS-7 cells, mixed well, and then cultured at 37 ° C. At 72 hours after the culture, the culture supernatant was collected and the activity of the anti-CCR4 CDR-grafted antibody in the culture supernatant was evaluated.
  • the activity of the obtained culture supernatant was evaluated by the following method.
  • Compound 1 (SEQ ID NO: 23) was selected as a human CCR4 extracellular domain peptide that can react with the anti-CCR4 chimeric antibody M2760 produced by the transformant KM2760 (FERM BP-7054) produced according to Example 2 of W001 / 64754. did.
  • a conjugate with BSA Bovine Serum Albumin
  • Nakarai Testa was prepared by the following method and used as an antigen.
  • the conjugate prepared as above is dispensed into a 96-well EIA plate (manufactured by Grainer Co., Ltd.) at 0.05 / ig / mL and 50 AtL / ⁇ l, and left at 4 ° C for 1 hour. Adsorbed. After washing with PBS, 100% PBS containing 1% BSA (hereinafter referred to as 1% BSA-PBS) was added, and the mixture was reacted at room temperature for 1 hour to block the remaining active groups.
  • 1% BSA-PBS 100% PBS containing 1% BSA
  • Tween-PBS PBS containing 0.05% Tween20
  • Tween-PBS PBS containing 0.05% Tween20
  • the expression of the anti-CCR4 CDR-grafted antibody in animal cells was performed as follows using the anti-CCR4 CDR-grafted antibody expression vector obtained in Section 2 (3) of Reference Example 1 above.
  • Each purified antibody was made up to lO / zg / mL in FACS buffer (1% BSA-PBS, 0.02% EDTA, 0.05% NaN 3 ), and human immunoglobulin was added to prevent non-specific staining.
  • Antibody solution diluted to 3.75 mg / mL (Elfidone earth) was added at 100 iL / mL, and the mixture was reacted on ice for 30 minutes.
  • an anti-human IL-5 receptor ⁇ -chain antibody (TO97 / 10354) was reacted at the same concentration. After washing twice with 200 ⁇ !
  • the Piochin of the compound 1-immobilized sensor chip prepared were added 20 ⁇ ⁇ solution of 4 ⁇ ⁇ / ⁇ of purified antibody at 5 / L / min flow rate, after the completion of the addition, over a 4 minute dissociation After monitoring the reaction, the surface of one chip of the sensor was regenerated by adding twice of 10 mM HC1. Thus, a binding reaction curve (sensorgram) for Compound 1 was obtained.
  • the vertical axis represents the resonance (resonance) unit (RU), which means the mass change on the sensor chip.
  • RU resonance (resonance) unit
  • 1000 RU corresponds to a mass change of about lng / mm 2 of protein.
  • KM2760 showed a time-dependent binding activity to compound 1, and the binding was hardly dissociated in the dissociation reaction, indicating that it was extremely stable and had a high binding activity.
  • various anti-CCR4 CDR-grafted antibodies showed almost the same dissociation reaction as the human chimeric antibody KM2760, but a slight decrease in activity was observed in the binding reaction to the CCR4 partial peptide, Compound 1.
  • the anti-CCR4 CDR-grafted antibody GalOLVO grafted with only CDR showed the lowest binding activity, and the binding activity was increased by modification of the amino acid residue of FR.
  • the above results demonstrate that by grafting the CDR of mouse antibody KM2160 to the appropriate human antibody FR, it is possible to produce an anti-CCR4 CDR-grafted antibody that maintains the antigen-binding activity and binding specificity of the mouse antibody. Furthermore, the three-dimensional structure of the antibody V region, etc. Based on this, it was demonstrated that by identifying FR amino acid residues important for binding activity and transplanting them together with CDRs, an anti-CCR4 CDR-grafted antibody with higher binding activity can be produced.
  • the anti-CCR4 CDR-grafted antibody prepared in this reference example has high binding activity to CCR4, and has lower immunogenicity and higher safety in humans than mouse antibodies and human chimeric antibodies It is expected to show a therapeutic effect.
  • a prophylactic, diagnostic or therapeutic agent for interstitial pneumonia particularly a preventive, diagnostic or therapeutic agent for interstitial pneumonia in idiopathic idiopathic interstitial pneumonia or collagen disease
  • a diagnostic agent for distinguishing between idiopathic idiopathic interstitial pneumonia and atypical idiopathic interstitial pneumonia is provided.
  • the present invention provides a method for distinguishing atypical idiopathic interstitial pneumonia from atypical idiopathic interstitial pneumonia.
  • SEQ ID NO: 21 Description of artificial sequence Synthetic peptide SEQ ID No. 24--Description of Artificial Sequence Synthetic DNA SEQ ID No. 25--Description of Artificial Sequence Synthetic DNA SEQ ID No. 26--Description of Artificial Sequence Synthetic DNA SEQ ID No. 27--Description of Artificial Sequence Synthetic DNA SEQ ID No. 28--Artificial Description of sequence Synthetic DNA SEQ ID No. 29--Description of artificial sequence Synthetic DNA SEQ ID No. 30--Description of artificial sequence Synthetic DNA SEQ ID No. 31--Description of artificial sequence Synthetic DNA SEQ ID No. 32--Description of artificial sequence Synthetic DNA sequence No. 33--Description of Artificial Sequence Synthetic DNA SEQ ID No.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

明 細 書 間質性肺炎の診断薬およぴ治療薬 技術分野
本発明は、 抗 CCR4 (CC ケモカイン受容体 4) 抗体および/または抗 CXCR3 (CRCケモカイン受容体 3) 抗体を有効成分として含有する、 間質性肺炎の予防 薬、 診断薬または治療薬、 および抗 CCR4抗体および抗 CXCR3抗体を用いる定 型例特発性間質性肺炎と非定型例特発性間質性肺炎とを判別する診断薬および 判別方法に関する。 背景技術
特発性間質性肺炎は、 原因不明の炎症性肺疾患であり、 男性では比較的高齢 者に見られ、 有病率は人口 10万対 3. 4程度とされている。 慢性型の特発性間 質性肺炎は、 定型例 （idiopathic pulmonary fibrosis ； IPF) と非定型例 (non-specific interstitial pneumonia； NS IP) とに分類される力 その相異 は主として X f泉所見に基づくものである。 特発性間質性肺炎の特徴としては、 病理学的には、 単核球の肺組織への集積とそれに引き続くコラーゲン等の沈着、 繊維化の進展があげられ、 これにより肺組織の破壌、 呼吸機能の低下をきたす。 定型例、 非定型例共に病理学的な特徴はほぼ同様である。 定型例および非定型 例の病巣局所には単核球、 特に CD4陽性 T細胞の浸潤が観察されていることか ら、 病態形成には免疫学的な機序が関与することが推察される。 しカゝしながら、 免疫学的な機序の詳細は不明であり、 特発性間質性肺炎の成因、 定型例と非定 型例の病態の相異等に関しては解明されていない。
また、 間質性肺炎はェリテマトーデス、 関節リゥマチ （RA： rheumatoid arthritis) , 強皮症を始めとする膠原病においても頻繁に観察される症状とし て知られている。 その頻度は、 強皮症において 50〜70%以上と最も高く、 関節 リゥマチでは 5〜20%とされている （最新内科学大系、 免疫 ·アレルギー性疾 患 3 (1993) )。 患者は息切れ等の症状を呈するが、 膠原病における間質性肺炎 に対する有効な治療法は知られておらず、 現状の治療法に対しては一般に抵抗 性である。 膠原病における肺病変の成因に関しては殆ど解明されていない。 炎症病態は、 自己免疫、 感染、 アレルギー、 移植片拒絶等で多く認められ、 共通して T細胞を始めとする炎症性細胞の集積が認められる。
近年の免疫学の進展により、 CD4陽性 T細胞は様々な疾患において中心的な 役割を担うことが明らかにされた。 CD4陽性 T細胞は、 その生産するサイトカ インの種類により、 Thl細胞および Th2細胞の大きく二種類のタイプに分別さ れる （Annu. Rev. Immunol. , 7, 145 (1989))。 Thl細胞は主としてインターフ ェロン- γ、 インターロイキン一 2等を生産し、 細胞性免疫に関与するものと考 えられている。 Th2細胞はインターロイキン _4、 -5、 及ぴ- 13 などのサイトカ インを分泌することにより液性免疫反応を制御するものと考えられている。 炎 症局所においては T細胞の集積が認められるが、 炎症部位においては異なる T 細胞亜集団が集積する。 例えば、 慢性関節リウマチでは Thl細胞が、 気管支喘 息等のアレルギー性疾患では Th2 細胞が有意に集積している （Immunology Today, 21, 183 (2000) )。
これは、 例えば、 気管支喘息患者の気管支肺胞洗浄液あるいは気道粘膜には Th2 細胞が存在し （N. Engl. J. Med. , 326, 298 (1992)、 Eur. J. Immunol. , 23, 1445 (1993) )、 喘息モデル動物においても喘息病態形成への Th2細胞の関 与力 S示されて!/ヽる (Clin. Immunol. Imraunopathol. , 75, 75 (1995)、 J. Exp. Med.， 186, 1737 (1997)、 J. Immunol. , 160, 1378 (1998)、 J. Immunol.， 161, 3128 (1998) )。 これらの知見は、 Th2細胞の制御、 あるいは Th2細胞が生 産するサイトカインの活性の制御が喘息治療に重要であると考えられている根 拠でもある （Nature, 402, B31 (1999) )。 実際に、 Th2 細胞を制御することを コンセプトとした開発中の喘息治療薬としては、 ヒト化抗インターロイキン- 5 抗体 （SB - 240563： グラクソ 'スミスクライン . ビーチャム社、 SCH- 55700：シ エーリング ·ブラゥ /セルテック社製）、 ヒ ト化抗ィンターロイキン- 4抗体 (US Patent No. 5, 914, 110)、 可溶性インターロイキン受容体 （Nuvance：ィムネッ タス社製）、 ヒ ト化抗インターロイキン - 5 受容体抗体 （TO97/10354)、 抗 CCR8 抗体 (W099/25734)、 抗 CCR4抗体 (W001/64754) 等をあげることができる。
Thl 細胞、 Th2 細胞等の各白血球表面には、 各種ケモカイン受容体が発現し ており、 それぞれ発現するケモカイン受容体は異なることが示されている (Immunol. Today, 21, 418 (2000) ) 0 ケモカインは、 白血球遊走および白血球 活性化作用を有する塩基性のへパリン結合性蛋白質の総称であり、 数多くの受 容体が同定されている (Curr. Opi. Immunol. , 11, 626 (1999) )。
ヒ ト CCR4は、 ヒ ト未熟好塩基球細胞株 KU - 812から遺伝子がクローニングさ れたケモカイン受容体であり （J. Biol. Chem. , 270, 19495 (1995) )、 そのリ カ ン ド は TARC (thymus and activation-regulated chemokine) 、 MDC (macrophage— derived chemokine) であること力 S明らカ こされてレヽる (Curr. Op in. Immunol. , 11, 626 (1999) )。 さらには、 近年の検討により、 CCR4 は Th2細胞に選択的に発現されていることが明らかにされており （J. Exp. Med. , 187, 129 (1998)、 J. Immunol. , 161, 5111 (1998)、 Int. Immunol. , 11, 81 (1999)、 J. Clin. Invest. , 108, 1331 (2001) )、 CCR およびそのリガンドは Th2 細胞の遊走、 活性化を介して炎症反応に関与していることが示唆されてい る。 実際、 Th2 細胞が病態形成に重要な役割を担っていると考えられているァ トピー性皮膚炎患者では末梢血中 CCR4陽性 CD4陽性細胞の比率が高いこと （J. Leuk. Biol. , 68, 568 (2000) )、 皮膚病変部に CCR4 陽性細胞が集積している こと （J. Allergy Clin. Immunol. , 107, 353 (2001) ) が明らかにされている。 さらには、 アトピー型気管支喘息においても、 ステロイドホルモン剤による治 療に伴い CCR4 陽性細胞の比率が低下すること （Am. J. Respir. Crit. Care Med. , 164, 754 (2001) )、 抗原吸入後気道局所に浸潤している CD4陽性 T細胞 には CCR4 が発現されていること （J. Clin. Invest. , 107, 1357 (2001) ) 等 が報告されている。 自己免疫疾患では、 全身 I1生エリテマトーデス患者において、 活動期に CCR4陽性細胞が末梢血中に増加していることが報告されているが （J. Leukocyte Biol. , 70, 749 (2001) )、 間質性肺炎と CCR4陽性細胞との関連性、 間質性肺炎と Th2細胞との関連性に関しては明らかにされていない。
一般に、 有用性の高い治療法を提供する為には、 疾患の病態、 成因に関して の深い理解が必要とされるが、 上記の通り、 特発性間質性肺炎、 膠原病におけ る間質性肺炎に関してはその成因等が殆ど解明されておらず、 有効な治療方法 の創出には至っていない。 本疾患の治療はステロイドホルモン剤を用いること が基本とされており、 その他にァザチォプリン、 シクロホスフアミド、 シクロ スポリンといった免疫抑制剤が補助的に用いられているのみである。 ステロイ ドホルモン剤は、 長期の使用により骨粗鬆症、 緑内障、 白内障といった副作用 を生じることは良く知られており、 耐性を獲得する等の問題もある。 また、 免 疫抑制剤も重篤な感染症を生じる可能性がある等を考慮すると必ずしも適切な 治療方法とは考えられず、 より安全で有効な治療薬の開発が必要とされている。 また、 特発性間質性肺炎において、 定型例と非定型例の炎症像の病理学的特 徴を理解することは治療を考える上で重要であるが、 有用な診断方法は示され ていない。 膠原病による間質性肺炎においても膠原病がもたらす各疾患 （皮膚 筋炎、 慢性関節炎、 リウマチなど） により肺病変の成因が異なるか否か等の基 本的な解析が行われていない。 喘息治療においても有効性と安全性の観点から より優れた治療薬の開発が求められており、 それを可能にしているのは、 喘息 の病態解明である。 即ち、 病態の解明は治療法の開発にとって必要欠くベから ざるものであると考えられ、 特発性間質性肺炎、 膠原病における間質性肺炎に おいてもその解明と診断方法の開発が必要とされている。 発明の開示
本発明の目的は、 間質性肺炎の予防薬、 診断薬または治療薬、 特に、 定型例 特発性間質性肺炎または膠原病における間質性肺炎の予防薬、 診断薬または治 療薬、 およぴ定型例特発性間質性肺炎と非定型例特発性間質性肺炎とを判別す る診断薬を提供することにある。
さらに、 本発明の目的は、 定型例特発性間質性肺炎の非定型例特発性間質性 肺炎との判別方法を提供することにある。
すなわち、 本発明は以下の （1)〜（55) に関する。
(1) 抗 CCR4抗体および/または抗 CXCR3抗体を有効成分として含有する、 間質性肺炎の予防薬、 診断薬または治療薬。
(2) 間質性肺炎が、 定型例特発性間質性肺炎または非定型例特発性間質性 肺炎である、 上記 （1) 記載の予防薬、 診断薬または治療薬。
(3) 間質性肺炎が、 膠原病における間質性肺炎である、 上記 （1) 記載の予 防薬、 診断薬または治療薬。
(4) 抗 CCR4抗体おょぴ抗 CXCR3抗体とを有効成分として含有する、 定型例 特発性間質性肺炎と非定型例特発性間質性肺炎とを判別する診断薬。
(5) 抗 CCR4抗体が、 CCR4の細胞外領域に特異的に結合する抗体である、 上 記 （1)〜(4) のいずれか 1項に記載の予防薬、 診断薬または治療薬。
(6) 細胞外領域が、 配列番号 1で示されるアミノ酸配列の 1〜39、 98〜112、 176〜206および 271〜284番目からなる群から選ばれる細胞外領域である、 上 記 （5) 記載の予防薬、 診断薬または治療薬。
(7) 細胞外領域が、 配列番号 1 で示されるアミノ酸配列の 2〜29番目に存 在するェピトープである、 上記 （5) 記載の予防薬、 診断薬または治療薬。
(8) 細胞外領域が、 配列番号 1で示されるアミノ酸配列の 13〜29番目に存 在するェピトープである、 上記 （5) 記載の予防薬、 診断薬または治療薬。
(9) 抗 CCR4抗体が、 ポリクローナル抗体、 モノクローナル抗体またはその 抗体断片である、 上記 （1)〜(8) のいずれか 1 項に記載の予防薬、 診断薬また は治療薬。
(10) 抗 CCR4抗体が、 遺伝子組換え抗体またはその抗体断片である、 上記 (1)〜(8) のいずれか 1項に記載の予防薬、 診断薬または治療薬。 (11) 遺伝子組換え抗体が、 ヒト化抗体およびその抗体断片から選ばれる抗 体である、 上記 (10) 記載の予防薬、 診断薬または治療薬。
(12) ヒト化抗体またはその抗体断片が、
それぞれ配列番号 2、 3、 4で示されるアミノ酸配列からなる抗体重鎖 （H鎖） 可変領域 （V領域） の相補性決定領域 （CDR) 1、 CDR2、 CDR3、 および Zまたは それぞれ配列番号 5、 6、 7で示されるァミノ酸配列からなる抗体軽鎖 (L鎖） V領域の CDR1、 CDR2、 CDR3
を含む、 上記 (11) 記載の予防薬、 診断薬または治療薬。
(13) ヒト化抗体が、 ヒト型キメラ抗体、 ヒト型相補性決定領域 （CDR) 移 植抗体およびそれらの抗体断片から選ばれる抗体である、 上記 （11) または (12) 記載の予防薬、 診断薬または治療薬。
(14) ヒト型キメラ抗体またはその抗体断片が、
CCR4に対するモノクローナル抗体の重鎖 （H鎖） 可変領域 （V領域） と軽鎖 (L鎖） V領域、 および
ヒト抗体の H鎖定常領域 （C領域） と L鎖 C領域
を含む、 上記 （13) 記載の予防薬、 診断薬または治療薬。
(15) ヒト型キメラ抗体またはその抗体断片が、
それぞれ配列番号 2、 3、 4で示されるアミノ酸配列からなる抗体重鎖 （H鎖） 可変領域 （V領域） の CDR1、 CDR2、 CDR3N および Zまたは
それぞれ配列番号 5、 6、 7で示されるアミノ酸配列からなる抗体軽鎖 （L鎖） V領域の CDR1、 CDR2、 CDR3
を含む、 上記 (13) または （14) 記載の予防薬、 診断薬または治療薬。
(16) ヒト型キメラ抗体またはその抗体断片が、
配列番号 8で示されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖 （H鎖） 可変領域 （V 領域)、 および Zまたは
配列番号 9で示されるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖 （L鎖） V領域 を含む、 上記 （13)〜（15) のいずれか 1項に記載の予防薬、 診断薬または治療
(17) ヒト型キメラ抗体またはその抗体断片が、 形質転換体 KM2760 (FERM BP- 7054) が生産する抗体 KM2760またはその抗体断片である、 上記 （13)〜 (16) のいずれか 1項に記載の予防薬、 診断薬または治療薬。
(18) ヒト型 CDR移植抗体またはその抗体断片が、 CCR4に対するモノクロ一 ナル抗体の重鎖 （H鎖） 可変領域 （V領域） および軽鎖 （L鎖） V領域の CDRを 含む、 上記 （13) 記載の予防薬、 診断薬または治療薬。
(19) ヒト型 CDR移植抗体またはその抗体断片が、
CCR4に対するモノクローナル抗体の重鎖 （H鎖） 可変領域 （V領域） および 軽鎖 （L鎖） V領域の CDR、 および
ヒト抗体の H鎖 V領域おょぴ L鎖 V領域のフレームワーク領域 （FR) を含む、 上記 （13) 記載の予防薬、 診断薬または治療薬。
(20) ヒト型 CDR移植抗体またはその抗体断片が、
CCR4に対するモノクローナル抗体の重鎖 （H鎖） 可変領域 （V領域） および 軽鎖 （L鎖） V領域の CDR、
ヒ ト抗体の H鎖 V領域おょぴ L鎖 V領域のフレームワーク領域 （FR)、 およ ぴ
ヒ ト抗体の H鎖定常領域 （C領域） および L鎖 C領域
を含む、 上記 (13) 記載の予防薬、 診断薬または治療薬。
(21) ヒト型 CDR移植抗体またはその抗体断片が、
それぞれ配列番号 2、 3、 4で示されるアミノ酸配列からなる抗体重鎖 （H鎖） 可変領域 （V領域） の CDR1、 CDR2、 CDR3、 および Zまたは
それぞれ配列番号 5、 6、 7で示されるアミノ酸配列からなる抗体軽鎖 （L鎖） V領域の CDR1、 CDR2、 CDR3
を含む、 上記 (13) および （18)〜(20) のいずれか 1項に記載の予防薬、 診断 薬または治療薬。 (22) ヒト型 CDR移植抗体またはその抗体断片が、
配列番号 10で示されるアミノ酸配列のうち、 40番目の Ala、 42番目の Gly、 43番目の Lys、 44番目の Gly、 76番目の Lys、 および 97番目の Alaから選ば れる少なくとも 1つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸 配列を含む抗体の重鎖 （H鎖） 可変領域 （V領域)、 および/または
配列番号 12で示されるアミノ酸配列のうち、 2番目の Ile、 3番目の Val、 50番目の Gln、 および 88番目の Valから選ばれる少なくとも 1つのアミノ酸 残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖 （L鎖） V 領域、
を含む、 上記 （13) および （18)〜(21) のいずれか 1項に記載の予防薬、 診断 薬または治療薬。
(23) ヒト型 CDR移植抗体またはその抗体断片が、
配列番号 11で示されるァミノ酸配列のうち、 28番目の Thrおよび 97番目の Alaから選ばれる少なくとも 1つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換さ れたアミノ酸配列を含む抗体の重鎖 （H鎖） 可変領域 （V領域）、 および Zまた は
配列番号 12で示されるアミノ酸配列のうち、 2番目の Ile、 3番目の Val、 50番目の Gln、 および 88番目の Valから選ばれる少なくとも 1つのアミノ酸 残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖 （L鎖） V 領域、
を含む、 上記 （13) および （18)〜(21) のいずれか 1項に記載の予防薬、 診断 薬または治療薬。
(24) ヒト型 CDR移植抗体またはその抗体断片が、
配列番号 10、 11、 13〜： 18 から選ばれるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖 （H 鎖） 可変領域 （V領域)、 および/または
配列番号 12、 19〜21 から選ばれるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖 （L鎖） V 領域 を含む、 上記 (13) および （18)〜（21) のいずれか 1項に記載の予防薬、 診断 薬または治療薬。
(25) ヒト型 CDR移植抗体またはその抗体断片が、
配列番号 13 で表されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖 （H鎖） 可変領域 （V 領域)、 および Zまたは
配列番号 21で表されるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖 （L鎖） V領域 を含む、 上記 (13) および （18)〜（21) のいずれか 1項に記載の予防薬、 診断 薬または治療薬。
(26) ヒト型 CDR移植抗体またはその抗体断片が、
配列番号 14 で表されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖 （H鎖） 可変領域 （V 領域)、 および Zまたは
配列番号 21で表されるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖 （L鎖） V領域 を含む、 上記 （13) および （18)〜(21) のいずれか 1項に記載の予防薬、 診断 薬または治療薬。
(27) ヒ ト型 CDR移植抗体またはその抗体断片が、 FERM BP- 8129 および FERM BP-8130からなる群から選ばれる形質転換株から生産されるヒト型 CDR移 植抗体またはその抗体断片である、 上記 （13) および （18)〜（21) のいずれか 1項に記載の予防薬、 診断薬または治療薬。
(28) 抗体断片が、 Fab、 Fab'、 F (ab' ) 2、 1 本鎖抗体 （scFv；)、 2 量体化可変 領域 （V領域） 断片 （Diabody)、 ジスルフィド安定ィヒ V領域断片 （dsFv) およ ぴ CDR を含むペプチドから選ばれる抗体断片である、 上記 （9)〜（27) のいず れか 1項に記載の予防薬、 診断薬または治療薬。
(29) 上記 （9) ~ (28) のいずれか 1項に記載の抗体またはその抗体断片が、 放射性同位元素、 蛋白質または薬剤と化学的または遺伝子工学的に結合してい る、 上記 （9)〜(28) のいずれか 1項の予防薬、 診断薬または治療薬。 (30) 抗 CCR4抗体おょぴ抗 CXCR3抗体を用いて試料中の Th2細胞と Thl細 胞とを検出および Zまたは定量することを特徴とする、 定型例特発性間質性肺 炎と非定型例特発性間質性肺炎との判別方法。
(31) 抗 CCR4抗体が、 CCR4の細胞外領域に特異的に結合する抗体である、 上記 （30) 記載の方法。
(32) 細胞外領域が、 配列番号 1で示されるアミノ酸配列の 1〜39、 98〜112、 176〜206および 271〜284番目からなる群から選ばれる細胞外領域である、 上 記 （31) 記載の方法。
(33) 細胞外領域が、 配列番号 1で示されるァミノ酸配列の 2〜29番目に存 在するェピトープである、 上記 (31) 記載の方法。
(34) 細胞外領域が、 配列番号 1 で示されるァミノ酸配列の 13〜29番目に 存在するェピトープである、 上記 （31) 記載の方法。
(35) 抗 CCR4抗体が、 ポリクローナル抗体、 モノクローナル抗体またはそ の抗体断片である、 上記 （31)〜（34) のいずれか 1項に記載の方法。
(36) 抗 CCR4抗体が、 遺伝子組換え抗体またはその抗体断片である、 上記 (31)〜（34) のいずれか 1項に記載の方法。
(37) 遺伝子組換え抗体が、 ヒト化抗体およびその抗体断片から選ばれる抗 体である、 上記 （36) 記載の方法。
(38) ヒト化抗体またはその抗体断片が、
それぞれ配列番号 2、 3、 4で示されるアミノ酸配列からなる抗体重鎖 （H鎖） 可変領域 （V領域） の相補性決定領域 (CDR) 1、 CDR2、 CDR3、 および/または それぞれ配列番号 5、 6、 7で示されるアミノ酸配列からなる抗体軽鎖 （L鎖） V領域の CDR1、 CDR2、 CDR3
を含む、 上記 (37) 記載の方法。
(39) ヒト化抗体が、 ヒト型キメラ抗体、 ヒト型相補性決定領域 （CDR) 移 植抗体おょぴそれらの抗体断片から選ばれる抗体である、 上記 （37) または (38) 記載の方法。 (40) ヒト型キメラ抗体またはその抗体断片が、
CCR4に対するモノクローナル抗体の重鎖 （H鎖） 可変領域 （V領域） と軽鎖 (L鎖） V領域、 および
ヒト抗体の H鎖定常領域 (C領域） と L鎖 C領域
を含む、 上記 （39) 記載の方法。
(41) ヒト型キメラ抗体またはその抗体断片が、
それぞれ配列番号 2、 3、 4で示されるアミノ酸配列からなる抗体重鎖 （H鎖） 可変領域 （V領域） の CDR1、 CDR2、 CDR3、 および/または
それぞれ配列番号 5、 6、 7で示されるアミノ酸配列からなる抗体軽鎖 （L鎖） V領域の CDR1、 CDR2、 CDR3
を含む、 上記 （39) または （40) 記載の方法。
(42) ヒト型キメラ抗体またはその抗体断片が、
配列番号 8で示されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖 （H鎖） 可変領域 （V 領域)、 およぴ または
配列番号 9で示されるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖 （L鎖） V領域 を含む、 上記 （39)〜（41) のいずれか 1項に記載の方法。
(43) ヒト型キメラ抗体またはその抗体断片が、 形質転換体 KM2760 (FERM BP- 7054) が生産する抗体 KM2760またはその抗体断片である、 上記 （39)〜 (42) のいずれか 1項に記載の方法。
(44) ヒト型 CDR移植抗体またはその抗体断片が、 CCR4に対するモノクロ一 ナル抗体の重鎖 （H鎖） 可変領域 （V領域） および軽鎖 （L鎖） V領域の CDRを 含む、 上記 （39) 記載の方法。
(45) ヒト型 CDR移植抗体またはその抗体断片が、
CCR4に対するモノクローナル抗体の重鎖 （H鎖） 可変領域 （V領域） および 軽鎖 （L鎖） V領域の CDR、 および
ヒト抗体の H鎖 V領域おょぴ L鎖 V領域のフレームワーク領域 (FR) を含む、 上記 （39) 記載の方法。 (46) ヒト型 CDR移植抗体またはその抗体断片が、
CCR4に対するモノクローナル抗体の重鎖 （H鎖） 可変領域 （V領域） および 軽鎖 （L鎖） V領域の CDR、
ヒト抗体の H鎖 V領域おょぴ L鎖 V領域のフレームワーク領域 （FR)、 およ び
ヒト抗体の H鎖定常領域 （C領域） および L鎖 C領域
を含む、 上記 （39) 記載の方法。
(47) ヒト型 CDR移植抗体またはその抗体断片が、
それぞれ配列番号 2、 3、 4で示されるアミノ酸配列からなる抗体重鎖 （H鎖） 可変領域 （V領域） の CDR1、 CDR2、 CDR3、 および Zまたは
それぞれ配列番号 5、 6、 7で示されるアミノ酸配列からなる抗体軽鎖 （L鎖） V領域の CDR1、 CDR2、 CDR3
を含む、 上記 （39) および （44)〜（46) のいずれか 1項に記載の方法。
(48) ヒト型 CDR移植抗体またはその抗体断片が、
配列番号 10で示されるアミノ酸配列のうち、 40番目の Ala、 42番目の Gly、 43番目の Lys、 44番目の Gly、 76番目の Lys、 および 97番目の Alaから選ば れる少なくとも 1つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸 配列を含む抗体の重鎖 （H鎖） 可変領域 （V領域)、 および/または
配列番号 12で示されるアミノ酸配列のうち、 2番目の Ile、 3番目の Val、 50番目の Gln、 および 88番目の Valから選ばれる少なくとも 1つのアミノ酸 残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖 （L鎖） V 領域、
を含む、 上記 （39) および （44)〜(47) のいずれか 1項に記載の方法。
(49) ヒト型 CDR移植抗体またはその抗体断片が、
配列番号 11で示されるァミノ酸配列のうち、 28番目の Thrおよび 97番目の Alaから選ばれる少なくとも 1つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換さ れたアミノ酸配列を含む抗体の重鎖 （H鎖） 可変領域 （V領域)、 および/また は
配列番号 12で示されるアミノ酸配列のうち、 2番目の Ile、 3番目の Val、 50番目の Gln、 および 88番目の Valから選ばれる少なくとも 1つのアミノ酸 残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖 （L鎖） V 領域、
を含む、 上記 （39) および （44)〜（47) のいずれか 1項に記載の方法。
(50) ヒト型 CDR移植抗体またはその抗体断片が、
配列番号 10、 11、 13〜18 から選ばれるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖 （H 鎖） 可変領域 （V領域)、 および Zまたは
配列番号 12、 19〜21 から選ばれるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖 （L鎖） V を含む、 上記 （39) および （44)〜（47) のいずれか 1項に記載の方法。
(51) ヒト型 CDR移植抗体またはその抗体断片が、
配列番号 13 から選ばれるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖 （H鎖） 可変領域 (V領域)、 および/または
配列番号 21から選ばれるァミノ酸配列を含む抗体の軽鎖 （L鎖） V領域 を含む、 上記 (39) および （44)〜（47) のいずれか 1項に記載の方法。
(52) ヒト型 CDR移植抗体またはその抗体断片が、
配列番号 14 力、ら選ばれるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖 （H鎖） 可変領域 (V領域）、 および/または
配列番号 21から選ばれるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖 （L鎖） V領域 を含む、 上記 (39) および （44)〜(47) のいずれか 1項に記載の方法。
(53) ヒ ト型 CDR移植抗体またはその抗体断片が、 FERM BP-8129 および FERM BP- 8130からなる群から選ばれる形質転換株から生産されるヒト型 CDR移 植抗体またはその抗体断片である、 上記 （39) および （44)〜(47) のいずれか 1項に記載の方法。 (54) 抗体断片が、 Fabヽ Fab' , F (ab，）2、 1 本鎖抗体 (scFv)ヽ 2量体化可変 領域 (V領域） 断片 （Diabody)、 ジスルフィド安定ィヒ V領域断片 （dsFv) およ ぴ CDR を含むペプチドから選ばれる抗体断片である、 上記 （35)〜（53) のいず れか 1項に記載の方法。
(55) 上記 （35)〜（54) のいずれか 1項に記載の抗体またはその抗体断片が、 放射性同位元素、 蛋白質または薬剤と化学的または遺伝子工学的に結合してい る、 上記 （35)〜（54) のいずれか 1項の方法。 以下、 本発明を詳細に説明する。
間質性肺炎の発症は、 a) 膠原病による、 b) 感染症による、 c) 放射線に起 因する、 d) 職業または環境に起因する、 e) 薬剤に起因する、 f) 類肉腫症、 好酸球肉芽腫、 AIDSなどに起因するなどが考えられるが、 発生原因の特定でき ない間質性肺炎を特発性間質性肺炎という。
間質性肺炎のうち、 特発性間質性肺炎としては、 非定型特発性間質性肺炎、 定型特発性間質性肺炎があげられる。
膠原病としては、 皮膚筋炎 、 多発性筋炎、 全身性硬化症 （強皮症)、 慢性関 節リゥマチなどがあげられる。
本発明で使用される抗 CCR4抗体としては、 CCR4 に特異的に結合する抗体で あればレ、かなるものでもよい。
予防薬または治療薬として使用する抗 CCR4抗体としては、 CCR4 に特異的に 結合し、 CCR4陽性細胞の機能を調節する、 あるいは該抗体のエフヱクタ一機能 により CCR4 陽性細胞を生体内から排除することができるものであればいかな るものでもよい。 具体的には、 CCR4の細胞外領域に結合し、 抗体依存性細胞性 細胞障害活+生 (ADCC活性）により、 CCR4発現細胞を傷害できる抗体おょぴその 抗体断片等があげられる。
また、 本発明で使用される抗 CXCR3抗体としては、 CXCR3 に特異的に結合す る抗体であればいかなるものでもよい。 予防薬または治療薬として使用する抗 CXCR3抗体としては、 CXCR3 に特異的 に結合し、 CXCR3 陽性細胞の機能を調節する、 あるいは該抗体のエフヱクタ一 機能により CXCR3 陽性細胞を生体内から排除することができるものであればい かなるものでもよい。 具体的には、 CXCR3 の細胞外領域に結合し、 抗体依存性 細胞性細胞障害活性 （ADCC活性）により、 CXCR3発現細胞を傷害できる抗体お よびその抗体断片等があげられる。
本発明で使用される抗体としては、 ポリクローナル抗体、 モノクローナル抗 体、 遺伝子組換え抗体またはそれらの抗体断片などいかなるものも包含される。 遺伝子組換え抗体としては、 ヒト型キメラ抗体、 ヒト型 CDR移植抗体などの ヒ ト化抗体があげられる。 抗体断片としては、 Fab (fragment of antigen findingの略）、 F (ab ) 2、 Fab，、 一本鎖几体 ^single chain Fv; 以下、 scFvと 称す）、 2量体化 V領域断片 （Diabody)、 ジスルフィド安定化抗体 （disulfide stabilized Fv ; 以下、 dsFv と称す） および CDRを含むペプチド等があげられ る。
抗 CXCR3抗体は、 ヒト CXCR3の細胞外領域に特異的に反応するものが好まし い。 抗 CXCR3 抗体は、 公知の手段（Harlow E. and Lane D. , Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)、 以下、 アンチ ボディーズ.ァ 'ラボラトリー 'マニュアルと記す） を用いて製造することが できるが、 市販の抗 CXCR3 抗体 （ファーミンジェン社製） でもよいし、 W098/11218に開示された抗体でもよい。
抗 CCR4抗体は、 ヒト CCR4の細胞外領域に特異的に反応するものが好ましく、 具体的には、 配列番号 1に示されるアミノ酸配列の 1〜39、 98〜112、 176〜206 または 271〜284番目を含む領域に特異的に反応する抗体、 より好ましくは配 列番号 1に示されるアミノ酸配列の 2〜29番目 （配列番号 22) に反応する抗体、 さらに好ましくは配列番号 1 に示されるアミノ酸配列の 12〜29番目 （配列番 号 23) があげられる。 抗 CCR4抗体は、 公知の手段 （アンチボディーズ ·ァ ·ラボラトリー 'マユ ュアル） を用いて製造することができる。
抗 CCR4抗体としては、 ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のい ずれも用いることができるが、 モノクローナル抗体が好ましく用いられる。 本発明で使用されるモノクローナル抗体としては、 ハイプリ ドーマにより生 産される抗体、 ヒト化抗体およびこれらの抗体の抗体断片をあげることができ る。
ハイブリ ドーマにより生産される抗 CCR4 モノクローナル抗体は、 具体的に は以下に述べる方法によって製造することができる。
すなわち、 CCR4蛋白質を発現している細胞あるいは CCR4 の部分配列に基づ く合成べプチドを抗原として調製し、 該抗原を免疫した動物より抗原特異性を もつ形質細胞を誘導し、 さらに、 それと骨髄腫細胞とを融合させてハイプリ ド 一マを調製し、 該ハイプリ ドーマを培養するか、 あるいは該ハイプリ ドーマ細 胞を動物に投与して該動物を腹水癌化させ、 該培養液または腹水より CCR4 に 特異的に結合する抗体を分離、 精製する。 このようにして得られた抗 CCR4 モ ノクローナル抗体として、 W001/64754 に記載されているマウス IgGl サブクラ スに属するハイブリ ドーマ KM2160が生産するモノクローナル抗体 KM2160があ げられる （Int. Immunol. , 11, 81 (1999) )。
さらに、 抗 CCR4抗体としては、 ヒト化抗体等の遺伝子組換え抗体、 および その抗体断片があげられる。
本発明で使用されるヒ ト化抗体としては、 上記の抗 CCR4 モノクローナル抗 体を遺伝子組換え技術を用いて改変した遺伝子組換え抗体およびその抗体断片 があげられる。 該抗体においては、 抗原性が低く、 血中半減期の延長されたも のが、 予防薬または治療薬として好ましい。
ヒト化抗体として、 好ましくは、 それぞれ配列番号 2、 3、 4で示されるアミノ酸配列からなる抗体重鎖 （H鎖） 可変領域 (V領域） の相ネき性決定領域 (complementary determining region;以 下、 CDRと略記する） 1、 CDR2、 CDR3、 および/または
それぞれ配列番号 5、 6、 7で示されるアミノ酸配列からなる抗体軽鎖 （L鎖） V領域の CDR1、 CDR2、 CDR3
を含むヒ ト化抗体またはその抗体断片があげられる （W001/64754)。
さらに、 ヒ ト化抗体としては、 ヒ ト型キメラ抗体、 ヒト型 CDR移植抗体およ びそれらの抗体断片があげられる。
ヒト型キメラ抗体は、 ヒ ト以外の動物の抗体の重鎖可変領域 （以下、 重鎖を H鎖、 可変領域を V領域、 H鎖 V領域を VHとも称す） および軽鎖 V領域 （以下、 軽鎖を L鎖、 L鎖 V領域を VLとも称す） とヒ ト抗体の H鎖定常領域 （以下、 定 常領域を C領域、 H鎖 C領域を CHとも称す） およぴヒ ト抗体の L鎖 C領域 （以 下、 CL とも称す） とからなる抗体を意味する。 ヒ ト以外の動物としては、 マウ ス、 ラット、 ハムスター、 ゥサギ等、 ハイプリ ドーマを作製することが可能で あれば、 いかなる動物も用いることができる。
本発明で使用されるヒ ト型キメラ抗体は、 抗 CCR4抗体を生産するハイプリ ドーマより、 VHおよび VLをコードする cDNAを取得し、 ヒト抗体の CHおよび CLをコードする DNAを有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒ ト 型キメラ抗体発現ベクターを構築し、 動物細胞へ導入することにより発現させ 製造することができる。
ヒ ト型キメラ抗体の CH としては、 ヒトイムノグロブリン （hlg) に属すれば いかなるものでもよいが、 hlgG クラスのものが好適であり、 hlgG クラスに属 する γ 1、 γ 2、 τ/ 3、 4 といったサブクラスのいずれも用いることができる。 また、 ヒト型キメラ抗体の CLとしては、 hlgに属すればいずれのものでもよく、 κクラスあるいは； クラスのものを用いることができる。
CCR4 に特異的に結合するヒ ト型キメラ抗体 （以下、 抗 CCR4 キメラ抗体とも 称する） として、 好ましくは 配列番号 2、 3、 4で示されるアミノ酸配列からなる VHの CDR1、 CDR2、 CDR3、 および /または
配列番号 5、 6、 7で示されるァミノ酸配列からなる VLの CDR1、 CDR2、 CDR3 を含むヒト型キメラ抗体またはその抗体断片があげられる。
さらに好ましくは、
配列番号 8で示されるァミノ酸配列を含む VH、 およぴ Zまたは
配列番号 9で示されるァミノ酸配列を含む VL
を含むヒト型キメラ抗体またはその抗体断片があげられる （W001/64754)。
具体的には、 抗体の VHが配列番号 8記載のアミノ酸配列、 CHがヒト 0/ 1サ プクラスのァミノ酸配列からなり、 抗体の VLが配列番号 9記載のァミノ酸配 歹 IJ、 CLがヒト κクラスのアミノ酸配列からなる W001/64754 に開示されている ヒト型キメラ抗体 KM2760またはその抗体断片があげられる。
ヒト型キメラ抗体 KM2760 を生産する形質転換体 KM2760 は、 通商産業省 ェ 業技術院生命工学工業技術研究所 （現名称：独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター （日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号 （現住所： 日 本国茨城県つくば市東 1一 1一 1中央第 6) ) に平成 12年 2月 24 日付けで FERM BP- 7054として国際寄託されている （W001/64754)。
ヒト型 CDR移植抗体は、 ヒト抗体に、 ヒト以外の動物の抗体の VHおよび VL の CDRをヒト以外の動物の抗体の CDR配列でそれぞれ置換した抗体を意味する。 本発明で使用されるヒト型 CDR移植抗体は、 ヒト以外の動物の抗 CCR4抗体 の VHおよび VLの CDR配列で任意のヒト抗体の VHおよび VLの CDR配列をそれ ぞれ置換した V領域をコードする cDNAを構築し、 ヒト抗体の CHおよぴヒト抗 体の CL をコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ揷入 してヒト型 CDR移植抗体発現ベクターを構築し、 動物細胞へ導入し、 発現させ ることにより製造することができる。
ヒト型 CDR移植抗体の CHとしては、 hlgに属すればいかなるものでもよいが、 hlgGクラスのものが好適であり、 さらに hlgGクラスに属する γ 1、 γ 2、 7 3, 4 といったサブクラスのいずれも用いることができる。 また、 ヒト型 CDR移 植抗体の CLとしては、 hlgに属すればいずれのものでもよく、 κクラスあるい は； Lクラスのものを用いることができる。
CCR4に特異的に結合するヒト型 CDR移植抗体 （以下、 抗 CCR4CDR移植抗体と も称する） としては、 好ましくは、
それぞれ配列番号 2、 3、 4 で示されるアミノ酸配列からなる VHの CDR1、 CDR2、 CDR3、 および または
それぞれ配列番号 5、 6、 7 で示されるアミノ酸配列からなる VL の CDR1、 CDR2、 CDR3
を含むヒト型 CDR移植抗体またはその抗体断片があげられる。
より好ましくは、
配列番号 10または 11で示されるァミノ酸配列を含む VH、 および/または 配列番号 12で示されるァミノ酸配列を含む VL
を含むヒト型 CDR移植抗体またはその抗体断片があげられる。
さらに好ましくは、
配列番号 10で示されるアミノ酸配列のうち、 40番目の Ala、 42番目の Gly、 43番目の Lys、 44番目の Gly、 76番目の Lys、 および 97番目の Alaから選ば れる少なくとも 1 つアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配 列を含む VH、 およぴ または
配列番号 12で示されるアミノ酸配列のうち、 2番目の Ile、 3番目の Val、 50番目の Gln、 および 88番目の Valから選ばれる少なくとも 1つのアミノ酸 残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む VL
を含むヒト型 CDR移植抗体またはその抗体断片、 または
配列番号 11で示されるァミノ酸配列のうち、 28番目の Thrおよび 97番目の Alaのうち少なくとも 1 つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたァ ミノ酸配列を含む VH、 および/または 配列番号 12で示されるアミノ酸配列のうち、 2番目の Ile、 3番目の Val、 50番目の Gln、 および 88番目の Valから選ばれる少なくとも 1つのアミノ酸 残基が他のァミノ酸残基に置換されたァミノ酸配列を含む VL
を含むヒト型 CDR移植抗体またはその抗体断片があげられる。
具体的には、
配列番号 13〜18から選ばれるアミノ酸配列を含む VH、 およびノまたは 配列番号 19〜21から選ばれるァミノ酸配列を含む VL
を含むヒト型 CDR移植抗体またはその抗体断片があげられる。
さらに具体的には、
配列番号 13に示されるァミノ酸配列を含む VH、 および/または
配列番号 21に示されるァミノ酸配列を含む VL
を含むヒト型 CDR移植抗体またはその抗体断片、
配列番号 14に示されるァミノ酸配列を含む VH、 および Zまたは
配列番号 21に示されるァミノ酸配列を含む VL
を含むヒト型 CDR移植抗体またはその抗体断片があげられる。
配列番号 13に示されるァミノ酸配列を含む VH、 配列番号 21に示されるァミ ノ酸配列を含む VLを含む CCR4に反応するヒト型 CDR移植抗体 KM8759を生産 する形質転換体 M8759 は、 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託セ ンター （日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6) に平成 14年 7月 30日付けで FERM BP - 8129として国際寄託されている。
配列番号 14に示されるアミノ酸配列を含む VH、 配列番号 21に示されるアミ ノ酸配列を含む VLを含む CCR4に反応するヒト型 CDR移植抗体 KM8760を生産 する形質転換体 KM8760は、 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託セ ンター （日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6) に平成 14年 7月 30日付けで FERM BP - 8130として国際寄託されている。 本発明で使用される抗 CCR4抗体を規定するアミノ酸配列において、 1以上の アミノ酸残基が欠失、 置換、 挿入または付加され、 かつ CCR4 と特異的に反応 する抗体またはその抗体断片も本発明の範囲に包含される。
本発明のアミノ酸配列において 1以上のアミノ酸残基が欠失、 置換、 挿入ま たは付加されたとは、 同一配列中の任意かつ 1 もしくは複数のァミノ酸配列中 の位置において、 1 または複数のアミノ酸残基の欠失、 置換、 挿入または付加 があることを意味し、 欠失、 置換、 揷入または付加が同時に生じてもよく、 置 換、 揷入または付加されるアミノ酸残基は天然型と非天然型とを問わない。 天 然型アミノ酸残基としては、 L -ァラニン、 L -ァスパラギン、 L -ァスパラギン酸、 L -グルタミン、 L -グノレタミン酸、 グリシン、 L-ヒスチジン、 L-イソロイシン、 L-ロイシン、 L -リジン、 L -メチォニン、 L-フエエルァラユン、 L -プロリン、 L-セリン、 L -スレオニン、 L -トリプトファン、 L -チロシン、 L-ノ リン、 L-シス ティン等があげられる。
以下に、 相互に置換可能なアミノ酸残基の好ましい例を示す。 同一群に含ま れるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
A群： ロイシン、 ィソロイシン、 ノルロイシン、 パリン、 ノルパリン、 ァラ ニン、 2 -ァミノプタン酸、 メチォニン、 0-メチルセリン、 t -ブチルグリシン、 t-ブチノレアラユン、 シクロへキシノレアラエン
B群：ァスパラギン酸、 グルタミン酸、 イソァスパラギン酸、 イソダルタミ ン酸、 2 -ァミノアジピン酸、 2-アミノスべリン酸
C群： ァスパラギン、 グルタミン
D群： リジン、 アルギニン、 オル二チン、 2， 4-ジァミノブタン酸、 2， 3-ジァ ミノプロピオン酸
E群：プロリン、 3-ヒドロキシプロリン、 4-ヒドロキシプロリン
F群：セリン、 スレオニン、 ホモセリン
G群：フエ二ルァラニン、 チロシン 本努明で使用される抗 CCR4抗体には、 抗体断片も含まれる。 抗体断片とし て、 CCR に特異的に結合する抗体断片である Fab、 F (ab，）2、 Fab'、 scFv、 Diabody、 dsFvおよび CDRを含むぺプチド等があげられる。
Fabは、 IgGを蛋白質分解酵素パパィンで処理して得られる断片のうち （H鎖 の 224番目のアミノ酸残基で切断される）、 H鎖の N末端側約半分と L鎖全体が ジスルフィド結合 （S- S結合） で結合した分子量約 5万の抗原結合活性を有す る抗体断片である。
本発明の Fab は、 抗 CCR4抗体を蛋白質分解酵素パパインで処理して得るこ とができる。 または、 該抗体の Fabをコードする DNAを原核生物用発現べクタ 一あるいは真核生物用発現べクタ一に挿入し、 該発現べクタ一を原核生物ある いは真核生物へ導入することにより発現させ、 Fabを製造することができる。
F (ab') 2は、 IgGを蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち （H 鎖の 234番目のァミノ酸残基で切断される）、 Fabがヒンジ領域の S- S結合を介 して結合されたものよりやや大きい、 分子量約 10 万の抗原結合活性を有する 抗体断片である。
本発明の F (ab') 2は、 抗 CCR4抗体を蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得る ことができる。 または、 下記の Fab'をチォエーテル結合あるいは S-S結合させ、 作製することができる。
Fab'は、 上記 F (ab') 2のヒンジ領域の S-S結合を切断した分子量約 5万の抗原 結合活性を有する抗体断片である。
本発明の Fab'は、 上記 F (ab') 2を還元剤ジチオスレィトール処理して得ること ができる。 または、 抗 CCR4抗体の Fab'をコードする DNAを原核生物用発現べク ターあるいは真核生物用発現べクタ一に挿入し、 該発現ベクターを原核生物あ るいは真核生物へ導入することにより発現させ、 製造することができる。
scFvは、 1本の VHと 1本の VLとを 12残基以上の適当なぺプチドリンカ一 (P) を用いて連結した、 VH-P-VL ないしは VL- P- VHポリペプチドで、 抗原結合 活性を有する抗体断片である。 本発明の scFvは、 抗 CCR4抗体の VHおよび VLをコードする cDNAを取得し、 scFvをコードする DNAを構築し、 該 DNAを原核生物用発現ベクターあるいは真 核生物用発現べクタ一に挿入し、 該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物 へ導入することにより発現させ、 製造することができる。
Diabodyは、 抗原結合特異性の同じまたは異なる scFvが 2量体を形成した抗 体断片で、 同じ抗原に対する 2価の抗原結合活性または異なる抗原に対する 2 特異的な抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明の Diabody、 例えば、 CCR4に特異的に反応する 2価の Diabodyは、 抗 CCR4抗体の VHおよび VLをコードする cDNAを取得し、 3〜； 10残基のポリぺプ チドリンカーを有する scFvをコードする DNAを構築し、 該 DNAを原核生物用 発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに揷入し、 該発現ベクターを原 核生物あるいは真核生物へ導入することにより Diabody を発現させ、 製造する ことができる。
dsFvは、 VHおよび VL中のそれぞれ 1ァミノ酸残基をシスティン残基に置換 したポリペプチドを該システィン残基間の S- S結合を介して結合抗体断片であ る。 システィン残基に置換するアミノ酸残基は Reiter らにより示された方法 (Protein Engineering, 7, 697 (1994) ) に従って、 抗体の立体構造予測に基 づいて選択することができる。
本発明の dsFvは、 抗 CCR4抗体の VHおよび VLをコードする cDNAを取得し、 dsFvをコードする DNAを構築し、 該 DNAを原核生物用発現ベクターあるいは真 核生物用発現ベクターに挿入し、 該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物 へ導入することにより発現させ、 製造することができる。
CDRを含むぺプチドは、 VHまたは VLの CDRの少なくとも 1領域以上を含ん で構成される抗体断片である。 複数の CDRを含むペプチドは、 直接または適当 なぺプチドリンカ一を介して結合させることにより製造することができる。 本発明の CDRを含むぺプチドは、 抗 CCR4抗体の VHおよび VLの CDRをコー ドする cDNAを構築し、 該 cDNAを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用 発現ベクターに挿入し、 該発現べクタ一を原核生物あるいは真核生物へ導入す ることにより発現させ、 製造することができる。 また、 CDRを含むペプチドは、 Fmoc 法 （フルォレニルメチルォキシカルポニル法）、 tBoc 法 （t-ブチルォキシ カルボニル法） などの化学合成法によって製造することもできる。
本発明の抗 CCR4抗体は、 本発明の抗 CCR4抗体に放射性同位元素、 蛋白質ま たは薬剤などを化学的にあるいは遺伝子工学的に結合させた抗体の誘導体を包 含する。
本発明の抗 CCR4抗体の誘導体は、 抗 CCR4抗体またはその抗体断片の H鎖あ るいは L鎖の N末端側あるいは C末端側、 抗体または抗体断片中の適当な置換 基あるいは側鎖、 さらには抗体または抗体断片中の糖鎖に放射性同位元素、 蛋 白質あるいは薬剤などを化学的手法 （抗体工学入門、 金光修著、 （株） 地人書 館 （1994) ) により結合させることにより製造することができる。
または、 抗 CCR4抗体またはその抗体断片をコードする DNA と、 結合させた い蛋白質をコードする DNAを連結させて発現ベクターに挿入し、 該発現べクタ 一を宿主細胞へ導入する。 以上のような遺伝子工学的手法によっても製造する ことができる。
放射性同位元素としては、 1311、 1251等があげられ、 例えば、 クロラミン T法 等により、 抗体に結合させることができる。
薬剤としては、 低分子のものが好ましく、 ナイトロジェン ·マスタード、 サ イク口フォスフアミ ドなどのアルキル化剤、 5—フルォロウラシル、 メソトレ キセートなどの代謝拮抗剤、 ダウノマイシン、 ブレオマイシン、 マイ トマイシ ン C、 ダウノルビシン、 ドキソルビシンなどの抗生物質、 ビンクリスチン、 ビ ンブラスチン、 ビンデシンのような植物アル力ロイ ド、 タモキシフェン、 デキ サメタソンなどのホルモン剤等の抗癌剤 （臨床腫瘍学、 日本臨床腫瘍研究会編、 癌と化学療法社 （1996) )、 またはハイド口コーチゾン、 プレドニゾンなどのス テロイド剤、 アスピリン、 インドメタシンなどの非ステロイド剤、 金チォマレ ート、 ぺ-シラミンなどの免疫調節剤、 サイクロフォスフアミド、 ァザチォプ リンなどの免疫抑制剤、 マレイン酸クロルフエ-ラミン、 クレマシチンのよう な抗ヒスタミン剤等の抗炎症剤 （炎症と抗炎症療法、 医歯薬出版株式会社
(1982) ) などがあげられる。 例えば、 ダウノマイシンと抗体を結合させる方法 としては、 ダルタールアルデヒドを介してダウノマイシンと抗体のアミノ基間 を結合させる方法、 水溶性カルポジイミドを介してダウノマイシンのアミノ基 と抗体の力ルポキシル基を結合させる方法等があげられる。
蛋白質としては、 免疫担当細胞を活性化するサイトカインが好適であり、 例 えば、 ヒトインターロイキン 2 (hIL— 2)、 ヒト顆粒球マクロファージコ口-一 刺激因子 （hGM CSF)、 ヒ トマクロファージコロニー刺激因子 （hM- CSF)、 ヒ ト インターロイキン 12 (hIL-12) 等があげられる。 また、 癌細胞を直接障害する ため、 リシンやジフテリア毒素などの毒素を用いることができる。 例えば、 蛋 白質との融合抗体ついては、 抗体または抗体断片をコードする cDNA に蛋白質 をコードする cDNA を連結させ、 融合抗体をコードする DNA を構築し、 該 DNA を原核生物あるいは真核生物用発現べクタ一に挿入し、 該発現べクタ一を原核 生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、 融合抗体を製造するこ とができる。
以下に、 本発明で使用される抗 CCR4抗体の具体的な作製方法と活性評価方 法、 抗 CCR4抗体を含有する間質性肺炎の予防薬、 診断薬または治療薬、 抗 CCR4抗体を用いた特発性間質性肺炎の判定方法について説明する。
1. 抗 CCR4抗体 （ポリクローナル抗体、 モノクローナル抗体） の作製方法 (1) 抗原の調製
抗 CCR4抗体を作製するために必要な抗原としては、 CCR4 を発現する細胞あ るいはその細胞画分、 または CCR4、 CCR4の部分断片、 CCR4 のアミノ酸配列の 部分配列を有するぺプチド等があげられる。
CCR4および CCR4の部分断片は、 CCR4をコ一ドする全長あるいはその部分断 片 cDNA (J. Biol. Chem, 270, 19495 (1995) ) を適当なベクターのプロモータ 一下流に挿入した組換え体ベクターを造成し、 それを宿主細胞に導入すること により得られた CCR4発現細胞を、 適当な培地中で培養することにより細胞内 あるいは細胞表面にそのままあるいは融合蛋白質として生産することができる。 また、 CCR4の部分配列を有するペプチドは、 アミノ酸合成機を用いて調製する ことができる。
CCR4をコードする全長あるいはその部分断片 cDNAは、 CCR4を発現している ヒ ト末梢血等の細胞から調製した cDM を铸型にした、 ポリメラーゼ連鎖反応 (Polymerase Chain Reaction、 以下 PCR と す ； Sambrook J. et al. , Molecular Cloning ^rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (2001) (以下、 「モレキュラー ·クローニング 第 3 版」 と記す）、 Ausubel F. M. et al. , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987- 2001) (以下、 「カレント 'プロトコールズ .イン 'モレキュラー 'パイォロ ジー」 と記す)） により調製することができる。
宿主としては、 細菌、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞等、 目的とする遺伝子を発 現できるものであれば、 いずれでもよい。 細菌としては、 ェシエリヒア ·コリ (Escherichia coli)ヽ バチルス . ズプチリス (Bacillus subtil is) 等のェシ エリヒア属、 バチルス属等の細菌が例示される。 酵母としては、 サッカロミセ ス .セレビシェ (Saccharomyces cerevisiae)、 シゾサッカロミセス . ポンべ (Schizosaccharomyces pombe) 等が例示される。 動物細胞としては、 ヒ トの糸田 胞であるナマ "パ （Namalwa) 細胞、 サルの細胞である COS 細胞、 チヤィニー ズ ·ハムスターの細胞である CH0 細胞等が例示される。 昆虫細胞としては、 Sf9、 Sf21 (ファーミンジェン (Farmingen) 社製）、 High Five (インビトロジ ェン （Invitrogen) 社製） 等が例示される。
CCR4 をコードする全長あるいはその部分断片 cDNA を導入するベクターとし ては、 該 DNA を組み込むことができ、 宿主細胞で発現できるものであればいか なるベクターでも用いることができる。 細菌、 例えばェシヱリヒア ·コリ (Escherichia coli) を宿主として用いる 場合の発現ベクターとしては、 プロモーター、 リボゾーム結合配列、 CCR4をコ ードする全長あるいはその部分断片 cDNA、 転写終結配列、 場合によってはプロ モーターの制御配列より構成されているのが好ましいが、 例えば、 市販の
PGEX-2T (アマシャム · バイオサイエンス （Amersham Biosciences) 社製）、 pET17b (ノバジヱン （Novagen) 社製） 等が例示される。
細菌への組換えベクターの導入方法としては、 細菌に DNAを導入する方法で あれば、 例えば、 カルシウムイオンを用いる方法 （Cohen S. N. et ah , Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 69, 2110-2114 (1972) )、 プロ トプラス ト法 （特開昭 63-248394) 等、 いずれの方法も用いられる。
酵母を宿主として用いる場合には、 発現ベクターとして、 例えば、 YEP13 (ATCC37115)、 YEp24 (ATCC37051)、 YCp50 (ATCC37419) 等が用いられる。
酵母への組換えベクターの導入方法としては、 酵母に DNAを導入する方法で あれば、 例えば、 エレク トロポレーシヨン法 (Becker D. M. and Guarente L.， Methods. Enzymol. , 194, 182-187 (1991) )、 スフエロプラスト法 (Hinnen A. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1929 - 1933 (1978))、 酢酸リチウ ム法 （Ito H. et al. , J. Bacteriol. , 153, 163-168 (1983) ) 等、 いずれの 方法も用いられる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、 発現ベクターとして、 例えば、 PAGE107 (特開平 3-22979； Miyaji H. et al. , Cytotechnology, 3, 133-140 (1990) )、 pAGE103 (Mizukami T. and Itoh S.， J. Biochem. , 101, 1307-1310 (1987) ) 等が用いられる。
プロモーターとしては、 動物細胞中で発現できるものであればいかなるもの を用いてもよいが、 例えば、 サイトメガロウィルス （CMV) の IE (immediate early) 遺伝子のプロモーター、 SV40 あるいはメタ口チォネインのプロモータ 一等があげられる。 また、 ヒ ト CMV の IE遺伝子のェンハンサーをプロモータ 一とともに用いてもよい。 動物細胞への,袓換えべクタ一の導入方法としては、 動物細胞に DNAを導入す る方法であれば、 例えば、 エレク トロポレーシヨン法 （Miyaji H. et al. , Cytotechnology, 3, 133-140 (1990) )、 リン酸カルシウム法 （特開平 2- 227075)、 リポフエクシヨン法 (Feigner P. L. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413-7417 (1987) 等、 いずれの方法も用いられる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、 例えばカレント ·プロトコールズ' イ ン · モレキュラー · ノ ィォロジ一、 0' Reilly et al.， Baculovirus Expression Vectors : A Laboratory Manual, Oxford University Press (1994) 等に記載された方法によって、 タンパク質を発現することができる。 すなわち、 以下に述べる組換え遺伝子導入ベクターおよびパキュロウィルスを 昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウィルスを得たのち、 さら に組換えウィルスを昆虫細胞に感染させ、 タンパク質発現昆虫細胞を取得する。 遺伝子導入ベクターとしては、 例えば、 pVL1392、 pVL1393 (共にファーミン ジェン社製）、 PBlueBac4. 5 (インビトロジェン社製） 等が用いられる。
バキュロウィルスとしては、 例えば、 夜盗蛾科昆虫に感染するウィルスであ るアウトグラファ ·力リフォルニ力 ·ヌクレア一 ·ポリへドロシス · ウィルス (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus; 等力 s用レヽられる。 組換えウィルスを調製するための、 昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入べク ターと上記パキュロウィルスの共導入方法としては、 例えば、 リン酸カルシゥ ム法 （特開平 2- 227075)、 リボフヱクシヨン法 （Feigner P. L. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413-7417 (1987) ) 等が用いられる。
また、 ファーミンジェン社製バキュ口ゴールドスターターキット等を用いて 組換えパキュロウィルスを作製したのち、 前述した Sf9、 Sf21 あるいは High Five等の昆虫細胞に該組換えウィルスを感染させることにより CCR4 を生産ざ せることもできる （Bio/Technology, 6, 47 (1988) )。 以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、 該培養物から CCR4 を採取することにより、 CCR4の全長あるいはその部分断片をそのままあるいは 融合蛋白質として製造することができる。
形質転換体を培地に培養する方法は、 宿主の培養に用いられる通常の方法に 従って行われる。
大腸菌あるいは酵母等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する 培地としては、 微生物が資化し得る炭素源、 窒素源、 無機塩類等を含有し、 形 質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、 合成培地のレ、ずれを 用いてもよい （モレキュラー 'クローニング第 3版)。 培養は、 通常振盪培養 または深部通気攪拌培養等の好気的条件下、 15〜40°Cで 16〜96 時間行う。 培 養期間中、 PHは 3. 0〜9. 0に保持する。 pHの調整は、 無機または有機の酸、 了 ルカリ溶液、 尿素、 炭酸カルシウム、 アンモニア等を用いて行う。 培養中は必 要に応じて、 アンピシリンゃテトラサイタリン等の抗生物質を培地に添カ卩して もよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、 一般に 使用されている RPMI1640培地、 Eagleの MEM培地またはこれら培地に牛胎児血 清等を添加した培地等が用いられる。 培養は、 通常 5%C02存在下、 35〜37°Cで 3〜7 日間行い、 培養中は必要に応じて、 カナマイシン、 ぺェシリン等の抗生物 質を培地に添カ卩してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、 一般に 使用されている TNM- FH培地 （ファーミンジェン社製）、 Sf900IISFM (インビト ロジェン社製）、 ExCell400、 ExCell405 (いずれも JRHパイォサイエンシズ (JRH Biosciences) 社製） 等が用いられる。 培養は、 25〜30°Cで 1〜4 日間行 い、 培養中は必要に応じて、 ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加しても よい。 上記において、 動物細胞および昆虫細胞の培養において可能であれば、 CCR4 の部分断片をそのままあるいは融合蛋白質の精製を容易にするため、 血清無添 加の培地を用いることが好ましい。
CCR4の全長あるいはその部分断片をそのままあるいは融合蛋白質として宿主 細胞内に蓄積された場合には、 培養終了後、 細胞を遠心分離し、 水系緩衝液に けん濁後、 超音波法、 フレンチプレス法等により細胞を破碎し、 その遠心分離 上清に該蛋白質を回収する。
さらに、 細胞内に不溶体を形成した場合には、 不溶体をタンパク質変性剤で 可溶化後、 タンパク質変性剤を含まないあるいはタンパク質変性剤の濃度がタ ンパク質が変性しない程度に希薄な溶液に希釈、 あるいは透析し、 タンパク質 の立体構造を形成させることができる。
CCR4あるいはその部分断片、 あるいはこれらの融合蛋白質が細胞外に分泌さ れた場合には、 培養上清中に発現蛋白質を回収することができる。
単離精製については、 溶媒抽出、 有機溶媒による分別沈殿、 塩析、 透析、 遠 心分離、 限外ろ過、 イオン交換クロマトグラフィー、 ゲルろ過クロマトグラフ ィー、 疎水性ク口マトグラフィー、 ァフィ二ティークロマトグラフィー、 逆相 クロマトグラフィー、 結晶化、 電気泳動等の分離操作を単独あるいは,組合わせ て行うことができる。
CCR4 のアミノ酸配列の部分配列を有するペプチドは、 Fmoc 法 （フルォレニ ルメチルォキシカルボニル法）、 tBoc 法 （t-ブチルォキシカルボニル法） 等の 化学合成法によって製造することができる。 また、 アドバンスド .ケムテック (Advanced ChemTech) 社、 アプライ ド ' バイオシステムズ （Applied Biosystems; 社、 プロテイン ·テクノロジーズ (Protein Technologies) 社、 島津製作所等のぺプチド合成機を用いても製造することができる。 (2) 動物の免疫と抗体産生細胞の調製
上記で得られた該蛋白質を抗原として動物を免疫する。 免疫する方法として は、 動物の皮下、 静脈内または腹腔内に抗原をそのまま投与してもよいが、 抗 原性の高いキャリアタンパク質を抗原に結合させて投与する、 あるいは適当な アジュバントとともに抗原を投与することが好ましい。
キヤリァタンパク質としては、 キーホール · リンぺッ ト ·へモシァニン (Keyhole limpet hemocyanin)、 ゥシ血清アルプミン、 ゥシチログロブリン等 があげられ、 アジュバンドとしては、 フロイントの完全ァジュバント (Complete Freund' s Adjuvant)、 水酸化アルミニゥムゲルと百日咳菌ワクチン 等があげられる。
免疫動物としては、 ゥサギ、 ャギ、 マウス、 ラット、 ハムスター等の非ヒト 哺乳動物があげられる。
抗原の投与は、 1回目の投与の後、 1〜2週間毎に 3〜10回行う。 抗原の投与 量は動物 1匹当たり 50〜： lOO ^ gが好ましい。 各投与後、 3〜7 日目に免疫動物 の眼底静脈叢あるいは尾静脈より採血し、 該血清の抗原との特異的な結合性に ついて、 下記に示すような酵素免疫測定法 （ELISA；酵素免疫測定法 第 3版 医学書院 （1987)、 アンチボディーズ 'ァ ' ラボラトリー 'マニュアル， Chapter 14、 boding J. W. , Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, Academic Press (1996) ) 等で確認する。
酵素免疫測定法は以下のようにして行うことができる。
抗原蛋白質あるいは抗原蛋白質を発現した細胞等をプレートにコートし免疫 動物より採取した血清を第一抗体として反応させる。 第一抗体反応後、 プレー トを洗浄して第二抗体を添加する。 反応後、 第二抗体を標識した物質に応じた 検出反応を行い、 抗体価を測定する。
第二抗体とは、 第一抗体を認識できる抗体を、 パーォキシダーゼ等の酵素や ピオチン等で標識したものである。 具体的には、 免疫動物にマウスを用いたの であれば、 第二抗体としては、 マウスィムノグロプリンを認識できる抗体を用 いる。
そして、 該血清が十分な抗体価を示した非ヒト哺乳動物を、 抗体産生細胞の 供給源とする。
抗原の最終投与後 3〜7 日目に、 免疫動物より公知の方法 （アンチボディー ズ ·ァ ·ラボラトリー 'マニュアル） に準じてリンパ球を摘出し、 リンパ球と 骨髄腫細胞とを融合させる。
ポリクローナル抗体は、 該血清を分離、 精製することにより調製することが できる。
モノクローナル抗体は、 該抗体産生細胞と非ヒト哺乳動物由来の骨髄腫細胞 とを融合させてハイプリ ドーマを作製し、 該ハイプリ ドーマを培養するか、 動 物に投与して該細胞を腹水癌化させ、 該培養液または腹水を分離、 精製するこ とにより調製することができる。
抗体産生細胞は、 抗原投与された非ヒト哺乳動物脾細胞、 リンパ節、 末梢血 等から採取する。
(3) 骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、 マウスから得られた株化細胞である、 8 -ァザグァニン 耐性マウス （BALB/c 由来） 骨髄腫細胞株 P3- X63Ag8 - Ul (Kohler G and Milstein C, Eur. J. Immunol. , 6, 511-519 (1976) )、 SP2/0— Agl4 (Shulman M. et al.， Nature, 276, 269-270 (1978) )、 P3-X63 - Ag8653 (Kearney J. F. et al. , J. Immunol. , 123, 1548-1550 (1979) )、 P3— X63 - Ag8 (Kohler G and Milstein C, Nature, 256, 495-497 (1975) ) 等、 イン · ビトロ （in vitro) で増殖可能な骨髄腫細胞であればいかなるものでもよい。 これらの細胞株の培 養および継代については公知の方法 （アンチボディーズ ·ァ ·ラボラトリー ' マニュアル） に従い、 細胞融合時までに 2 X 107個以上の細胞数を確保する。 (4) 細胞融合とモノクローナル抗体の選択
上記で得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを洗浄したのち、 ポリエチレン グリコール- 1000 (PEG-1000) 等の細胞凝集性媒体を加え、 細胞を融合させ、 培地中に懸濁させる。 細胞の洗浄には MEM培地または PBS (リン酸ニナトリウ ム 1. 83g、 リン酸一力リウム 0. 21g、 塩化ナトリウム 7. 65g、 蒸留水 1L、 pH7. 2) 等を用いる。 また、 融合細胞を懸濁させる培地としては、 目的の融合 細胞のみを選択的に得られるように、 HAT培地 [正常培地 （1. 5讓 ol/L グルタ ミン、 5 X 10— 5mol/L 2-メルカプトエタノール、 10g/mL ゲンタマイシンおよび 10%ゥシ胎児血清を加えた RPMI1640培地） に l(T4mol/L ヒポキサンチン、 1. 5 X 10— ol/Lチミジンおょぴ 4 X l(T7mol/Lアミノプテリンを加えた培地] を用い る。
培養後、 培養上清の一部をとり、 下記の酵素免疫測定法により、 抗原蛋白質 に反応し、 非抗原蛋白質に反応しないサンプルを選択する。 ついで、 限界希釈 法によりクローユングを行い、 酵素免疫測定法により安定して高い抗体価の認 められたものを CCR4 と特異的に結合するモノクローナル抗体産生ハイプリ ド 一マ株として選択する。
酵素免疫測定法は 1. (2) に記載したのと同様に行う力 第一抗体として、 ハ イブリ ドーマ培養上清もしくは後述の方法で得られる精製抗体を用いる。
モノクローナル抗体と CCR4 との特異的な結合は表面プラズモン共鳴 (Karlsson R. et al. , J. Immunol. Methods, 145, 229—240 (1991) ) によつ ても評価できる。
抗 CCR4 モノクローナル抗体の具体例としては、 上記記載のハイプリ ドーマ KM2160が生産するモノクローナル抗体 KM2160があげられる。
(5) モノクローナル抗体の調製
モノクローナル抗体は、 ハイプリ ドーマ細胞を培養して得られる培養液、 ま たはプリスタン （Pristane) 処理 〔プリスタン （2， 6， 10， 14-テトラメチルペン タデカン） 0. 5mL を腹腔内投与し、 2週間飼育する〕 した 8〜10週令のマウス またはヌードマウスに、 モノクローナル抗体産生ハイプリ ドーマ細胞を腹腔内 投与して腹水癌化させた腹水から、 分離、 精製することにより調製できる。 モノクローナル抗体を分離、 精製する方法としては、 遠心分離、 40〜50%飽 和硫酸アンモニゥムによる塩析、 力プリル酸沈殿法、 DEAE-セファロースカラ ム、 陰イオン交換カラム、 プロテイン Aまたは G-カラムあるいはゲル濾過カラ ム等を用いるクロマトグラフィー等を、 単独または組合わせて行う方法があげ られる。 この方法により、 IgG あるいは IgM画分を回収し、 精製モノクローナ ル抗体を取得することができる。
精製モノクローナル抗体のサブクラスの決定は、 モノクローナル抗体タイピ ングキット等を用いて行うことができる。 蛋白質量は、 ローリー法あるいは 280nmでの吸光度より算出することができる。
抗体のサブクラスとは、 クラス内のアイソタイプのことで、 マウスでは、 IgGl、 IgG2a、 IgG2b、 IgG3、 ヒトでは、 IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4があげられる が、 特にマウス IgGl、 IgG2a、 ヒト IgGl タイプは、 補体依存性細胞傷害活性 (以下、 CDC活性と称す） および ADCC活性を有し、 治療への応用上、 有用であ る。
具体的には、 TO01/64754 に記載の方法に従って、 抗 CCR4抗体を作製するこ とができる。
2. 抗 CCR4 ヒト化抗体の作製方法
(1) ヒト化抗体発現用ベクターの構築
ヒ ト以外の動物の抗体からヒト化抗体を作製するために必要なヒト化抗体発 現用ベクターを構築する。 ヒト化抗体発現用ベクターとは、 ヒト抗体の C領域 である CHおよび CLをコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現べクタ 一であり、 動物細胞用発現ベクターにヒト抗体の CHおよび CLをコードする遺 伝子をそれぞれ挿入することにより構築することができる。 ヒ ト抗体の C領域は任意のヒ ト抗体の CHおよび CLであることができ、 例え ば、 ヒト抗体 サブクラスの CH、 γ 4サブクラスの CH、 および κクラスの CL 等があげられる。 ヒ ト抗体の CHおよび CLをコードする DNAとしてはェキソン とイントロンより成る染色体 DNAを用いることができ、 また、 cDNAを用いるこ ともできる。 動物細胞用発現ベクターとしては、 ヒ ト抗体 C領域をコードする 遺伝子を組込み、 発現できるものであればいかなるものでも用いることができ る。
例えば、 pAGE107 (特開平 3- 22979； Miyaji H. et al. , Cytotechnology, 3, 133-140 (1990) )、 pAGE103 (Mizukami T. and Itoh S. , J. Biochem. , 101, 1307 - 1310 (1987) )、 pHSG274 (Brady G. et al. , Gene, 27, 223-232 (1984) )、 pKCR (0' Hare K. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA.， 78, 1527-1531 (1981) )、 pSGl d2-4 (Miyaji H. et al. , Cytotechnology, 4， 173 - 180 (1990) ) 等があげられる。 動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとェ ンハンサ一としては、 SV40 の初期プロモーターとェンハンサー （Mizukami T. and Itoh S. , J. Biochem. , 101, 1307—1310 (1987) )、 モロエ一マウス白血病 ゥイノレスの LTR プロモーターとェンハンサー （Kuwana Y. et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. , 149, 960-968 (1987) )、 および免疫グロプリン H鎖 のプロモーター （Mason J. 0. et al. , Cell, 41. 79-487 (1985) ) とェンハ ンサー (Gillies S. D. et al. , Cell, 33, 717-728 (1983) ) 等があげられる。 ヒト化抗体発現用ベクターは、 抗体 H鎖、 L鎖が別々のベクター上に存在す るタイプあるいは同一のベクター上に存在するタイプ （タンデム型） のどちら でも用いることができるが、 ヒ ト化抗体 現ベクターの構築のしゃすさ、 動物 細胞への導入のし易さ、 動物細胞内での抗体 H鎖および L鎖の発現量のバラン スがとれる等の点でタンデム型のヒ ト化抗体発現用ベクターの方が好ましい (Shitara K. et al. , J. Immunol. Methods, 167, 271-278 (1994) )。 タンデ ム型のヒ ト化抗体発現用ベクターとしては、 pKANTEX93 (W097/10354)、 pEE18 (Bent ley K. J. et al.， Hybridoma, 17, 559-567 (1998) ) 等があげられる。 構築したヒト化抗体発現用ベクターは、 ヒト型キメラ抗体およびヒト型 CDR 移植抗体の動物細胞での発現に使用できる。
(2) ヒ ト以外の動物の抗 CCR4抗体の VHおよび VLをコードする cDNAの取得 ヒ ト以外の動物の抗 CCR4抗体、 例えば、 マウス抗 CCR4モノクローナル抗体 の VHおよび VLをコードする cDNAは以下のようにして取得する。
マウス抗 CCM モノクローナル抗体を産生する細胞、 例えば、 マウス抗 CCR4 抗体産生ハイプリ ドーマ等より mRNA を抽出し、 cDNA を合成する。 合成した cDNA を、 ファージあるいはプラスミ ド等のベクターに挿入し、 cDNA ライブラ リーを作製する。 該ライブラリーより、 マウス抗体の C領域部分あるいは V領 域部分をプローブとして用い、 VH をコードする cDNA を有する糸且換えファージ あるいは組換えプラスミド、 および VLをコードする cDNAを有する組換えファ ージあるいは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。 組換えファージあるいは 組換えプラスミド上の VHおよび VL の全塩基配列を決定し、 塩基配列より VH および VLの全ァミノ酸配列を推定する。
ヒト以外の動物としては、 マウス、 ラット、 ハムスター、 ゥサギ等、 ハイプ リ ドーマを作製することが可能であれば、 いかなるものも用いることができる。 ハイプリ ドーマから全 RNAを調製する方法としては、 チォシアン酸グァ-ジ ン-ト リ フルォロ酢酸セシウム法 (Okayaraa H. et al. , Methods Enzymol. , 154, 3-28 (1987) )、 また、 全 RNAから mRNAを調製する方法としては、 オリゴ (dT) 固定ィ匕セルロースカラム法 （モレキュラー 'クローニング第 3版） 等が あげられる。 また、 ハイプリ ドーマから mRNA を調製するキットとしては、 フ ァストトラック （FastTrack) mRNA単離キット （インビトロジェン社製）、 クィ ックプレップ （QuickPrep) mRNA精製キッ ト （アマシャム 'バイオサイェンシ ズ社製） 等があげられる。
cDNA の合成おょぴ cDNA ライプラリー作製法としては、 常法 （モレキユラ · クローニング 第 3版；カレント ' プロ トコールズ 'イン 'モレキユラ 一.バイオロジー）、 あるいは市販のキット、 例えば、 cDNA合成用スーパース タ リ プ ト ' チヨ イス · システム （Superscript Choice System for cDNA Synthesis, インビトロジェン社製） や ΖΑΡ-cDNA合成キット 〔ストラタジーン (STRATAGENE) 社製〕 、 タイムセーバー （TimeSaver) cDNA合成キット （アマシ ャム ·バイオサイェンシズ社製） を用いる方法等があげられる。
cDNA ライブラリーの作製の際、 ハイブリ ドーマから抽出した mRNA を錄型と して合成した cDNAを組み込むベクターは、 該 cDNAを組み込めるベクターであ ればいかなるものでも用いることができる。 例えば、 ZAP Express (ス トラタ ジーン社製）、 pBluescript II SK ( + ) (ス トラタジーン社製）、 λ ZAP II (ストラタジーン社製）、 え gtlO (ストラタジーン社製）、 え gtll (ストラタジ ーン社製）、 Lambda BlueMid (Clontech社製）、 L ExCell (アマシャム ·バイオ サイェンシズ社製）、 PcD2 (Okayama H. and Berg P. , Mol. Cell. Biol.， 3, 280-289 (1983) ) および pUC18 (Yanisch— Perron C. et al. , Gene, 33, 103 - 119 (1985) ) 等のファージあるいはプラスミ ドベクターが用いられる。
ファージあるいはプラスミ ドベクターにより構築される cDNA ライブラリー を導入する大腸菌としては該 cDNA ライブラリーを導入、 発現および維持でき るものであればいかなるものでも用いることができる。 例えば、 XL1- Blue MRF' (ス トラタジーン社製）、 C600 (Appleyard R. K. Genetics, 39, 440-452 (1954))、 Y1088 (Young R. A. and Davis R. , Science, 222, 778-782 (1983) )、 Y1090 (Young R. A. and Davis R.， Science, 222, 778-782 (1983) )、 丽 522 (Gough J. A. and Murray N. E.， J. Mol. Biol. , 166, 1—19 (1983) )、 K802 (Wood W. B. , J. Mol. Biol. , 16, 118-133 (1966) ) および JM105 (Yanisch-Perron C. et al. , Gene, 33, 103-119 (1985) ) 等が用いら れる。
cDNAライプラリーからのヒ ト以外の動物の抗 CCR4抗体の VHおよび VLをコ ードする cDNA クローンの選択法としては、 アイソトープあるいは蛍光標識し たプローブを用いたコロニー ·ハイブリダィゼーション法あるいはプラーク · ハイブリダィゼーシヨン法 （モレキュラー 'クローユング 第 3版） により選 択することができる。 また、 プライマーを調製し、 mRNAから合成した cDNAあ るいは cDNAライブラリーを铸型として、 PCRにより VHおよび VLをコードする cDNAを調製することもできる。
上記方法により選択された cDNA の塩基配列は、 適当なベクターにクロー- ングされた該 cDNA を用いてジデォキシ法 （Sanger F. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467 (1977) ) に基く反応を行い、 ABI377 (ァプラ ィドバイオシステムズ社製） 等の DNAシークェンサ一を用いて解析することで 決定することができる。
(3) ヒト以外の動物の抗 CCR4抗体の VHおよび VLのァミノ酸配列の解析と CDR のアミノ酸配列の同定
2. (2) で取得し、 決定した cDNAの塩基配列から該 cDNAがコードする VHお よび VLの全ァミノ酸配列を推定し、 既知の抗体の VHおよび VLの全ァミノ酸 目 G列 (sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)、 以下、 「シーケンシズ ·ォブ ·プロティンズ · ォブ'ィムノロジカル 'インタレスト」 と記す） と比較することにより、 取得 した cDNAが分泌シグナル配列を含む抗体の VHおよび VLの完全なアミノ酸配 列をコードしているかを確認することができる。 分泌シグナル配列を含む抗体 の VHおよび VLの完全なァミノ酸配列に関しては、 既知の抗体の VHおよび VL の全アミノ酸配列 （シーケンシズ'ォブ.プロテインズ'ォブ'ィムノロジカ ル 'インタレスト） と比較することにより、 分泌シグナル配列の長さおょぴ N 末端アミノ酸配列を推定でき、 さらにはそれらが属するサブグループを知るこ とができる。
さらに、 任意のデータベース、 例えば SWISS-PR0Tや PIR- Protein等に対し て、 BLAST (Altschul S. F. et al. , J. Mol. Biol. , 215, 403-410 (1990) ) 等相同性検索プログラムを用いて、 得られた VHおよび VLの完全なアミノ酸配 列の相同性検索を行い、 配列の新規性を検討することができる。
抗体の抗原結合部位を形成する VH及び VLは、 配列の比較的保存された 4個 のフレームワーク領域 （以下、 FR と称す） とそれらを連結する配列の変化に富 んだ 3個の CDR (CDR1、 CDR2、 CDR3) からなる （シーケンシズ'ォプ'プロテ インズ.ォブ.ィムノロジカル ·インタレスト）。 そして VHおよび VLの各 CDR のアミノ酸配列は、 既知の抗体の V領域のアミノ酸配列 （シーケンシズ'ォ ブ .プロテインズ ·ォブ ·ィムノロジカル ·インタレスト） と比較することに より同定することができる
(4) 抗 CCR4キメラ抗体発現べクタ一の構築
2. (1) で構築したヒト化抗体発現用ベクターのヒ ト抗体の CHおよび CLをコ 一ドする遺伝子の上流に、 ヒ ト以外の動物の抗 CCR4抗体の VHおよび VLをコ 一ドする cDNAを揷入し、 抗 CCR4キメラ抗体発現ベクターを構築することがで きる。 例えば、 ヒト以外の動物の抗 CCR4抗体の VHおよび VL をコードする cDNAを有するプラスミドを铸型として、 抗体の VHおよび VLを、 適当な制限酵 素の認識配列と V領域をコードする塩基配列よりなる 5'末端側と 3'末端側の プライマーを用いて PCR法により増幅し、 それぞれの増幅産物を pBluescript II SK (_) (ストラタジーン社製) 等のプラスミ ドにクローニングし、 2. (2) に記載の方法により、 塩基配列を決定し、 抗 CCR4抗体の VHおよび VLのァミ ノ酸配列をコードする DNA配列を有するプラスミドを取得する。 得られたブラ スミ ドより、 抗 CCR4抗体の VHおよび VLのァミノ酸配列をコードする cDNAを 単離し、 2. (1) に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体の CHおよび CL をコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現する様にクローニングし、 抗 CCR4キメラ抗体発現べクターを構築することができる。 (5) 抗 CCR4CDR移植抗体の V領域をコードする cDNAの構築
抗 CCR4CDR移植抗体の VHおよび VLをコードする cDNAは、 以下の様にして 構築することができる。 まず、 ヒト以外の動物の抗 CCR4抗体の VHおよび VL の CDRのアミノ酸配列を移植するヒト抗体の VHおよび VLの FRのアミノ酸配 列を選択する。 ヒ ト抗体の VHおよび VLの FRのアミノ酸配列としては、 ヒ ト 抗体由来のものであれば、 いかなるものでも用いることができる。 例えば、 Protein Data Bank等のデータベースに登録されているヒト抗体の VHおよび VLの FRのァミノ酸配列、 ヒト抗体の VHおよび VLの FRの各サブグループの共 通アミノ酸配列 （シーケンシズ' ォブ' プロテインズ' ォブ' ィムノロジカ ル 'インタレス ト） 等があげられるが、 それらの中でも、 十分な活性を有する ヒト型 CDR移植抗体を作製するためには、 ヒト以外の動物の抗 CCR4抗体の VH および VLの FRのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性、 好ましくは 60%以上 の相同性を有するアミノ酸配列を選択することが望ましい。
次に、 選択したヒ ト抗体の VHおよび VLの FR のアミノ酸配列に目的のヒ ト 以外の動物の抗 CCR4抗体の VHおよび VLの CDRのァミノ酸配列を移植し、 抗
CCR4CDR移植抗体の VHおよび VLのァミノ酸配列を設計する。 設計したァミノ 酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度 （シーケンシ ズ' ォブ' プロテインズ' ォブ' ィムノロジカル 'インタレス ト） を考慮して 塩基配列に変換し、 抗 CCR4CDR移植抗体の VHおよび VLのァミノ酸配列をコー ドする塩基配列を設計する。 設計した塩基配列に基づき、 100塩基前後の長さ からなる数本の合成 DNAを合成し、 それらを用いて PCR法を行う。 この場合、
PCR での反応効率および合成可能な DNAの長さから、 VH、 VL とも 6本の合成
DNAを設計することが好ましい。 また、 両端に位置する合成 DNAの 5'末端に適 当な制限酵素の認識配列を導入することで、 2. (1) で構築したヒト化抗体発現 用ベクターに容易にクローユングすることができる。 pcR反応後、 増幅産物を pBluescript SK (-) (ストラタジーン社製） 等のプラスミドベクターにクロ 一ユングし、 2. (2) に記載の方法により、 塩基配列を決定し、 所望の抗 CCR4CDR移植抗体の VHおよび VLのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有す るプラスミドを取得する。
(6) ヒト型 CDR移植抗体の VHおよび VLのァミノ酸配列の改変
ヒト型 CDR移植抗体は目的のヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLの CDRの みをヒト抗体の VHおよび VLの FRに、 移植しただけでは、 その抗原結合活性 はもとのヒト以外の動物の抗体の活性に比べて低下してしまうことが知られて いる （Tempest P. R. et al. , Bio/technology, 9, 266—271 (1991) )。 この原 因としては、 元のヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLでは、 CDRのみならず、 FRのいくつかのアミノ酸残基が直接的あるいは間接的に抗原結合活性に関与し ており、 それらアミノ酸残基が CDRの移植に伴い、 ヒト抗体の VHおよび VLの FRの異なるアミノ酸残基へと変化してしまうことが考えられている。 この問題 を解決するため、 ヒト型 CDR移植抗体では、 ヒト抗体の VHおよび VLの FRの アミノ酸配列の中で、 直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基や CDRの アミノ酸残基と相互作用したり、 抗体の立体構造を維持し、 間接的に抗原との 結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、 それらを元のヒト以外の動物の抗 体に見出されるァミノ酸残基に改変し、 低下した抗原結合活性を上昇させるこ とが行われている （Tempest P. R. et al. , Bio/technology, 9, 266 - 271 (1991) )。 ヒト型 CDR移植抗体の作製においては、 それら抗原結合活性に関わ る FR のアミノ酸残基を如何に効率よく同定するかが、 最も重要な点であり、 そのために X 線結晶解析 （Bernstein F. C. et al. , J. Mol. Biol. , 112, 535-542 (1977) ) あるいはコンピューターモデリング （Tempest P. R. et al. , Protein Engineering, 7, 1501-1507 (1994) ) 等による抗体の立体構造の構築 および解析が行われている。 これら抗体の立体構造の情報は、 ヒト型 CDR移植 抗体の作製に多くの有益な情報をもたらして来たが、 その一方、 あらゆる抗体 に適応可能なヒト型 CDR移植抗体の作製法は未だ確立されておらず、 現状では それぞれの抗体について数種の改変体を作製し、 それぞれの抗原結合活性との 相関を検討する等の種々の試行錯誤が必要である。
ヒト抗体の VHおよび VLの FRのァミノ酸残基の改変は、 改変用合成 DNAを プライマーとして用いて PCR法を行うことにより、 達成できる。 PCR後の増幅 産物について 2. (2) に記載の方法により、 その塩基配列を決定し、 目的の改変 が施されたことを確認して、 目的の変異が導入された cDNA を含むベクター (以下、 アミノ酸酉己列改変ベクターと称す） を取得する。
また、 狭い領域のアミノ酸配列の改変であれば、 20〜35塩基からなる変異導 入プライマーを用いた PCR変異導入法により行うことができる。 具体的には、 改変後のアミノ酸残基をコードする DNA配列を含む 20〜35塩基からなるセン ス変異プライマー及びアンチセンス変異プライマーを合成し、 改変すべき VH および VL のアミノ酸配列をコードする cDNAを含むプラスミドを鍚型として 2 段階の PCR を行う。 最終増幅断片を適当なベクターにサブクローニング後、 そ の塩基配列を決定し、 目的の変異が導入された cDNA を含むァミノ酸配列改変 ベクターを取得する。
(7) 抗 CCR4CDR移植抗体発現べクタ一の構築
2. (1) に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体の CHおよび CLをコー ドする DNAの上流に、 2. (5) および （6) で構築した抗 CCR4CDR移植抗体の VH および VLをコードする cDNAをクローニングし、 抗 CCR4CDR移植抗体発現べク ターを構築することができる。 例えば、 2. (5) および （6) で抗 CCR4CDR移植 抗体の VHおよび VLを構築する際に用いる合成 DNAのうち、 両端に位置する合 成 DNAの 5'末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、 2. (1) に記載 のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体の CHおよび CLをコードする DNAの上 流にそれらが適切な形で発現する様にクローニングすることができる。 (8) ヒ ト化抗体の一過性発現および活性評価
作製した多種類のヒ ト化抗体の抗原結合活性を効率的に評価するために、 2. (4) 記載の抗 CCR4 キメラ抗体発現ベクター、 2. (7) に記載の抗 CCR4CDR移 植抗体発現ベクター、 あるいはそれらを改変した発現ベクターを用いてヒ ト化 抗体の一過性発現を行うことができる。 発現ベクターを導入する宿主細胞とし ては、 ヒ ト化抗体を発現できる宿主細胞であれば、 いかなる細胞でも用いるこ とができるが、 その発現量の高さから、 COS- 7細胞 （ATCC番号： CRL-1651) が '一般に用いられる (Warr G. W. et al. , Methods in Nucleic Acids Research, CRC press, 283 (1990) )。 COS- 7 細胞への発現ベクターの導入法としては、 DEAE -デキス トラン法 （Warr G. W. et al.， Methods in Nucleic Acids Research, CRC press, 283 (1990) )、 リポフエクシヨン法 (Feigner P. L. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84. 7413-7417 (1987) ) 等があげられる。 発現ベクターの導入後、 培養上清中のヒ ト化抗体の発現量および抗原結合活 性は、 第一抗体として培養上清を、 第二抗体として標識した抗ヒ トイムノグロ プリン抗体を用いた 1. (2) に記載の酵素免疫測定法等により測定できる。
(9) ヒ ト化抗体の安定発現および活性評価
2. (4) 記載の抗 CCR4 キメラ抗体発現ベクターまたは 2. (7) に記載の抗 CCR4CDR移植抗体発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することによりヒト化 抗体を安定に生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞への発現ベクターの導入法としては、 エレク トロポレーシヨン法 (特開平 2-257891； Miyaji H. et al. , Cytotechnology, さ， 133-140 (1990)) 等があげられる。
抗 CCR4 キメラ抗体発現ベクターまたは抗 CCR4CDR移植抗体発現ベクターを 導入する宿主細胞としては、 ヒ ト化抗体を発現させることができる宿主細胞で あれば、 いかなる細胞でも用いることができる。 例えば、 マウス SP2/0- Agl4 細胞 （ATCC番号： CRL- 1581)、 マウス P3X63- Ag8. 653 細胞 （ATCC番号： CRL - 1580)、 ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子 （以下、 DHFR遺伝子と称す） が欠損した CH0細胞 （Urlaub G. and Chasin L. A.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ΤΊ_, 4216-4220 1980)、 ラット YB2/3HL. P2. Gil. 16Ag. 20細胞 （ATCC番号： CRL - 1662、 以下、 YB2/0細胞と称す） 等があげられる。
発現ベクターの導入後、 ヒ ト化抗体を安定に生産する形質転換体は、 G418 (G418 sulfate；シグマ ·アルドリツチ社製） 等の薬剤を含む動物細胞培養用 培地で培養することにより選択できる （Shitara K. et al.， J. Immunol. Methods, 167, 271-278 (1994) )。 動物細胞培養用培地としては、 画 1640培 地 （日水製薬社製)、 GIT培地 （日本製薬社製)、 EX-CELL302培地 （JRHバイオ サイェンシズ社製）、 IMDM培地 （ィンビトロジヱン社製）、 Hybridoma-SFM培地 (インビトロジ ン社製）、 またはこれら培地にゥシ胎児血清 （FBS) 等の各種 添加物を添加した培地等を用いることができる。 得られた形質転換体を培地中 で培養することで培養上清中にヒト化抗体を発現蓄積させることができる。 培 養上清中のヒ ト化抗体の発現量および抗原結合活性は前記 1. (4) に記載の ELISA等により測定できる。 また、 形質転換体は、 DHFR遺伝子増幅系等を利用 してヒト化抗体の生産量を上昇させることができる （Shitara K. et al. , J. Immunol. Methods, 167, 271-278 (1994) ) 0
ヒト化抗体は、 形質転換体の培養上清よりプロテイン Aカラムを用いて精製 することができる （アンチボディーズ 'ァ ' ラボラトリー 'マニュアル， Chapter 8 ； Goding J. W. , Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, Academic Press (1996) )。 また、 その他に、 通常の蛋白質で用いら れる精製方法を使用することができる。 例えば、 ゲル濾過、 イオン交換クロマ トグラフィ一および限外濾過等を組合せて行い、 精製することができる。 精製 したヒト化抗体の H鎖、 L鎖あるいは抗体分子全体の分子量は、 ポリアクリル アミ ドゲル電気泳動 （SDS- PAGE ； laemmli U. K. , Nature, 227, 680-685 (1970) ) やウェスタンブロッティング法 （アンチポディーズ ·ァ ·ラボラトリ 一 · マニュアル， Chapter 12 ； Goding J. W. , Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, Academic Press (1996) ) 等で測疋する。
精製したヒト化抗体の抗原結合活性は、 第一抗体として精製ヒト化抗体を、 第二抗体として標識した抗ヒトイムノグロプリン抗体を用いた前記 1. (2) に記 載の酵素免疫測定法、 及ぴ蛍光抗体法 （Cancer Immunol. Immunother. , 36, 373 (1993) )、 BIAcore™等を用いた表面プラズモン共鳴 (Karlsson R. et al. , J. Immunol. Methods, 145, 229-240 (1991) ) 等により測定できる。 抗原陽性 培養細胞に対する細胞障害活性は、 CDC活性、 ADCC活性等を測定し、 評価する ことができる （Cancer Immunol. Immunother. , 36, 373 (1993) )。 産生サイト カイン量の変化は ELISA法及び蛍光抗体法等により測定できる。
具体的には、 W001/64754 に記載の方法に従って、 抗 CCR4 キメラ抗体を作製 することができる。 また、 後述する参考例に記載の方法に従って、 抗 CCR4CDR 移植抗体を作製することができる。
3. 抗体断片の作製
抗体断片は、 1.および 2.に記載の抗 CCR4モノク口ーナル抗体、 抗 CCR4 ヒト 化抗体を元に遺伝子工学的手法あるいは蛋白質化学的手法により、 作製するこ とができる。 抗体断片としては、 Fab、 F(ab' ) 2、 Fab'、 scFv、 Diabody、 dsFv、 CDRを含むぺプチド等があげられる。
(1) Fabの作製
Fabは、 抗 CCR4抗体を蛋白質分解酵素パパィンで処理することにより、 作製 することができる。 パパインの処理後は、 元の抗体がプロテイン A結合 1"生を有 する IgGサブクラスであれば、 プロテイン Aカラムに通すことで、 IgG分子や Fc 断片と分離し、 均一な Fab として回収することができる （Goding J. W. , Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, Academic Press (1996) ) 0 プロティン A結合性を持たない IgGサブクラスの抗体の場合は、 イオン交換ク 口マトグラフィ一により、 Fab は低塩濃度で溶出される画分中に回収すること 力 Sできる (Goding J. W.， Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, Academic Press (1996) )。 また、 Fab は、 大腸菌を用いて遺伝子工学的に作製 することもできる。 例えば、 2. (2)、 (5) および （6) に記載の抗体の V領域 をコードする DNA を、 Fab発現用ベクターにクローニングし、 Fab発現べクタ 一を作製することができる。 Fab発現用ベクターとしては、 Fab用の DNA を組 み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。 例えば、 pIT106 (Better M. et al. , Science, 240, 1041 - 1043 (1988) ) 等があげられ る。 Fab発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、 封入体あるいはペリプラズマ 層に Fab を生成蓄積させることができる。 封入体からは、 通常蛋白質で用いら れるリフォールデイング法により、 活性のある Fab とすることができ、 また、 ペリブラズムに発現させた場合は、 培養上清中に活性を持った Fabが漏出する。 リフォールディング後あるいは培養上清からは、 抗原を結合させたカラムを用 いることにより、 均一な Fab を精製することができる （Borrebeck K. , Antibody Engineering: A Practical Guide, Oxford University Press (1991) )。
(2) F (ab' ) 2の作製
F (ab' ) 2は、 抗 CCR4抗体を蛋白質分解酵素ペプシンで処理することにより、 作製することができる。 ペプシンの処理後は、 Fab と同様の精製操作により、 均一な F(ab' ) 2 として回収することができる （Goding J. W. , Monoclonal Antioodies *. Principles and Practice, Academic Press (1996) )。 また、 3. (3) に記載の Fab'を N，N，- o_フエ二レンジマレイミドゃビスマレイミドへキ サン等のようなマレイミドで処理し、 チォエーテル結合させる方法や、 5、 5' - ジチォビス （2-エトロ安息香酸） （DTNB) で処理し、 ジスルフイド結合させる 方法によっても作製することができる （McCafferty J. et al.， Antibody Engineering: A Practical Approach, IRL Press (1996) )。 (3) Fab'の作製
Fab'は、 3. (2) に記載の F (ab' ) 2をジチオスレィトール等の還元剤で処理し て得ることができる。 また、 Fab'は、 大腸菌を用いて遺伝子工学的に作製する こともできる。 例えば、 2. (2)、 (5) および （6) に記載の抗体の V領域をコ ードする DNAを、 Fab'発現用ベクターにクローエングし、 Fab'発現ベクターを 作製することができる。 Fab'発現用ベクターとしては、 2. (2)、 (5) および (6) に記載の抗体の V領域をコードする DNAを組み込み発現できるものであれ ばいかなるものも用いることができる。 例えば、 pAK19 (Carter P. et al. , Bio/technology,- 10, 163-167 (1992) ) 等があげられる。 Fab'発現ベクターを 適当な大腸菌に導入し、 封入体あるいはペリプラズマ層に Fab'を生成蓄積させ ることができる。 封入体からは、 通常蛋白質で用いられるリフォールデイング 法により、 活性のある Fab，とすることができ、 また、 ペリプラズマ層に発現さ せた場合は、 リゾチームによる部分消化、 浸透圧ショック、 ソ-ケーシヨン等 の処理により菌を破砕し、 菌体外へ回収させることができる。 リフォールディ ング後あるいは菌の破碎液からは、 プロテイン Gカラム等を用いることにより、 均一な Fab'を精製することができる （McCafferty J. et al. , Antibody Engineering: A Practical Approach, IRL Press (1996) ) 0
(4) scFvの作製
scFvは遺伝子工学的には、 ファージまたは大腸菌を用いて作製することがで きる。 例えば、 2. (2)、 (5) および （6) に記載の抗体の VHおよび VL をコー ドする DNAを、 12残基以上のアミノ酸配列からなるポリペプチドリンカーをコ 一ドする DNAを介して連結し、 scFvをコードする DNAを作製する。 ポリぺプチ ドリンカ一は、 その付加が VH、 VL の抗原への結合に対して妨害しないように 最適化することが重要で、 例えば Pantoliano らにより示されたもの (Pantoliano M. W. et al. , Biochemistry, 30, 10117-10125 (1991) ) あるい はそれを改変したものを用いることができる。
作製した DNAを scFv発現用ベクターにクローユングし、 scFv発現ベクター を作製することができる。 scFv発現用ベクターとしては、 scFv の DNA を組み 込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。 例えば、 PCANTAB5E (アマシャム ·パイォサイエンシズ社製）、 Phfa (Lah M. et al. , Hum. Antibodies Hybridomas, 5, 48-56 (1994) ) 等があげられる。 scFv発現 ベクターを適当な大腸菌に導入し、 ヘルパーファージを感染させることで、 フ ァージ表面に scFv がファージ表面蛋白質と融合した形で発現するファージを 得ることができる。 また、 scFv発現ベクターを導入した大腸菌の封入体あるい はペリプラズマ層に scFv を生成蓄積させることができる。 封入体からは、 通 常蛋白質で用いられるリフォールデイング法により、 活性のある scFv とする ことができ、 また、 ペリプラズマ層に発現させた場合は、 リゾチームによる部 分消化、 浸透圧ショック、 ソ-ケーシヨン等の処理により菌を破砕し、 菌体外 へ回収することができる。 リフォールディング後あるいは菌の破碎液からは、 陽イオン交換クロマトグラフィー等を用いることにより、 均一な scFv を精製 するこ とカ できる (McCafferty J. et al. , Antibody Engineering: A Practical Approach, IRL Press (1996))。
(5) Diabodyの作製
Diabodyは、 上記の scFvを作製する際のポリぺプチドリンカーを 3〜10残基 程度にすることで、 作製することができる。 1種類の抗体の VHおよび VLを用 いた場合には、 2価の Diabodyを、 2種類の抗体の VHおよび VLを用いた場合 は、 2特異性を有する Diabody を作製することができる （Le Gall F. et al. , FEBS Lett. , 453, 164-168 (1999)、 Courage C. et al. , Int. J. Cancer, 77, 763-768 (1998) )。 (6) dsFvの作製
dsFv は、 大腸菌を用いて遺伝子工学的に作製することができる。 まず、 2. (2)、 (5) および （6) に記載の抗体の VHおよび VLをコードする DNAの適 当な位置に変異を導入し、 コードするァミノ酸残基がシスティンに置換された DNAを作製する。 アミノ酸残基のシスティン残基への改変は 2. (6) の PCRを用 いた変異導入法により行うことができる。 作製した各 DNAを dsFv発現用べク ターにクローユングし、 VHおよび VLの発現ベクターを作製することができる。 dsFv発現用ベクターとしては、 dsFv用の DNA を組み込み発現できるものであ ればいかなるものも用いることができる。 例えば、 PULI9 (Reiter Y. et al.， Protein Eng. , 7, 697-704 (1994) ) 等があげられる。 VHおよび VLの発現べク ターを適当な大腸菌に導入し、 封入体あるいはペリプラズマ層に VHおよび VL を生成蓄積させることができる。 封入体あるいはペリプラズマ層から VHおよ び VL を得、 混合し、 通常蛋白質で用いられるリフォールデイング法により、 ジスルフイド結合を形成させ、 活性のある dsFv とすることができる。 リフォ 一ルディング後は、 イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過等により、 さらに精製することができる （Reiter Y. et al. , Protein Eng. , 7, 697-704 (1994) ) o
(7) CDRを含むペプチドの作製
CDR を含むペプチドは、 Fmoc法あるいは tBoc法等の化学合成法によって作 製することができる。 また、 CDRを含むペプチドをコードする DNA を作製し、 作製した DNA を適当な発現用ベクターにクローニングし、 CDRペプチド発現べ クタ一を作製することができる。 発現用ベクターとしては、 CDR を含むぺプチ ドをコードする DNAを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いる ことができる。 例えば、 pLEX (インビトロジェン社製）、 pAX4a+ [モビテック (MoBiTec) 社製] 等があげられる。 発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、 封 入体あるいはペリプラズム層に CDRを含むペプチドを生成蓄積させることがで きる。 封入体あるいはペリプラズム層から CDRを含むペプチドを得、 イオン交 換クロマトグラフィーおよびゲル濾過等により、 精製することができる (Re iter Y. et al. , Protein Eng. , 7, 697-704 (1994) )。
(8) 活性の評価
上記の抗体断片の抗原結合活性は抗体断片を第一抗体として用いた前記 1. (2) に記載の酵素免疫測定法、 表面プラズモン共鳴 （Karlsson R. et al. , J. Immunol. Methods, 145, 229-240 (1991) ) 等により測定できる。
4. 本発明の診断薬、 予防薬および治療薬
抗 CCR4抗体は、 末梢血中あるいは炎症局所に浸潤した CCR4発現細胞の細胞 膜表面上に存在する CCR4蛋白質と結合する。 抗 CCR4抗体は CCR4の機能を阻 害することにより、 CCR4陽性細胞の活性化、 遊走を阻害する。 あるいは、 細胞 表面に結合した抗 CCR4抗体の CDC活性あるいは ADCC活性により、 CCR4発現細 胞は傷害を受ける。 CCR4陽性細胞は、 Th2細胞とも呼ばれアレルギー性炎症像 の形成に重要な働きを担うことが明らかにされている細胞集団を含む。
また、 抗 CXCR3抗体は、 末梢血中あるいは炎症局所に浸潤した CXCR3発現細 胞の細胞膜表面上に存在する CXCR3蛋白質と結合する。 抗 CXCR3抗体は CXCR3 の機能を阻害することにより、 CXCR3 陽性細胞の活性化、 遊走を阻害する。 あ るいは、 細胞表面に結合した抗 CXCR3抗体の CDC活性あるいは ADCC活性によ り、 CXCR3発現細胞は傷害を受ける。 CXCR3 陽性細胞は、 Th l細胞とも呼ばれ 炎症像の形成に重要な働きを担うことが明らかにされている細胞集団を含む。 従って、 抗 CCR4抗体およびノまたは抗 CXCR3抗体を含む医薬は炎症疾患の 1つである間質性肺炎の診断、 予防および治療に用いることができる。
炎症疾患では、 炎症局所に浸潤する Th2細胞と Thl細胞の比率が著しく不均 衡になることにより、 病態が進行するとされている。 そこで、 後述 5に示す判 別方法を用いることにより、 Th2細胞と Thl 細胞の割合を把握して、 過剰な浸 潤細胞を傷害することにより、 間質性肺炎の炎症、 炎症反応後に惹起される肺 繊維化、 更には呼吸機能の低下を診断、 予防および治療することができる。 抗 CCR4抗体の診断、 予防または治療対象としては、 定型例特発性間質性肺 炎など、 炎症部位に Thl細胞よりも Th2細胞の浸潤が過剰に見られる疾患に有 効である。
抗 CXCR3抗体の診断、 予防または治療対象としては、 非定型例特発性間質性 肺炎、 慢性関節リウマチ、 皮膚筋炎、 多発性筋炎などの膠原病における間質性 肺炎など、 炎症部位に Th2細胞よりも Thl細胞の浸潤が過剰に見られる疾患に 有効である。
また、 炎症局所に浸潤する Th2細胞と Thl細胞の比率が均衡であっても病態 が進行している場合には、 浸潤する T細胞を傷害することにより間質性肺炎の 炎症、 炎症反応後に惹起される肺繊維化、 更には呼吸機能の低下を予防、 治療 することができる。
なお 「抗 CCR4抗体および抗 CXCR3抗体を有効成分として含有する」 医薬の 形態としては、 いかなるものであってもよいが、 例えば合剤、 抗 CCR4抗体と 抗 CXCR3抗体とを結合させたもの、 抗 CCR4抗体と抗 CXCR3抗体を別々に含む キットの形態などがあげられる。
ヒト化抗体は、 ヒト以外の動物のモノクローナル抗体と比較して、 ヒト抗体 のアミノ酸配列に由来する部分がほとんどであるため、 ヒト体内において高い 効果を示し、 かつ免疫原性が低く、 その効果が長期に渡り持続することが期待 されるので、 予防薬および治療薬として好ましい。
抗 CCR4抗体おょぴ Zまたは抗 CXCR3抗体を含有する医薬は、 予防薬または 治療薬として単独で投与することも可能ではあるが、 通常は薬理学的に許容さ れる一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、 製剤学の技術分野において よく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。 投与経路は、 治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、 経口 投与、 または口腔内、 気道内、 直腸内、 皮下、 筋肉内、 関節内、 および静脈内 等の非経口投与をあげることができ、 抗体またはペプチド製剤の場合、 望まし くは関節内および静脈内投与をあげることができる。
投与形態としては、 噴霧剤、 カプセル剤、 錠剤、 顆粒剤、 シロップ剤、 乳剤、 座剤、 注射剤、 軟膏、 テープ剤等があげられる。
経口投与に適当な製剤としては、 乳剤、 シロップ剤、 カプセル剤、 錠剤、 散 剤、 顆粒剤等があげられる。
乳剤おょぴシロップ剤のような液体調製物は、 水、 ショ糖、 ソルビトール、 果糖等の糖類、 ポリエチレングリコール、 プロピレングリコール等のグリコー ル類、 ごま油、 ォリーブ油、 大豆油等の油類、 p-ヒドロキシ安息香酸エステル 類等の防腐剤、 ス トロベリーフレーバー、 ペパーミント等のフレーバー類等を 添加剤として用いて製造できる。
カプセル剤、 錠剤、 散剤、 顆粒剤等は、 乳糖、 ブドウ糠、 ショ糖、 マンニト ール等の賦形剤、 デンプン、 アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、 ステアリン酸 マグネシウム、 タルク等の滑沢剤、 ポリビュルアルコール、 ヒ ドロキシプロピ ルセルロース、 ゼラチン等の結合剤、 脂肪酸エステル等の界面活性剤、 グリセ リン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤としては、 注射剤、 座剤、 噴霧剤等があげられる。 注射剤は、 塩溶液、 ブドウ糖溶液、 あるいは両者の混合物からなる担体等を 用いて調製される。
座剤はカカオ脂、 水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。 また、 噴霧剤は該抗体またはペプチドそのもの、 ないしは受容者の口腔およ ぴ気道粘膜を刺激せず、 かつ該抗体またはぺプチドを微細な粒子として分散さ せ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製される。
担体として具体的には乳糖、 グリセリン等が例示される。 該抗体またはぺプ チドおよび用いる担体の性質により、 エアロゾル、 ドライパウダー等の製剤が 可能である。 また、 これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示し た成分を添加することもできる。 投与量または投与回数は、 目的とする治療効果、 投与方法、 治療期間、 年齢、 体重等により異なるが、 通常成人 1日当たり 10 i g/kg〜20mg/kgである。
抗 CCR4抗体をモデル動物に投与する際の剤型および投与経路としては、 対 象となるモデル動物の性質や重篤度に応じて適宜選択することができる。 例え ば、 それらをそのまま、 または他の薬理学的に許容され得る担体、 賦形剤、 希 釈剤等と共に、 モデル動物に対して、 経口的または非経口的 （腹腔内、 静脈内、 関節内、 筋肉内、 皮下投与等） に投与することができる。
抗 CCR4抗体の配合量並びに投与量は、 その製剤の投与方法、 投与形態、 使 用目的、 モデル動物の具体的症状、 モデル動物の体重等に応じて個別に決定さ れ、 特に限定されないが、 投与量として、 1 日当たり概ね l g/kg〜； LOOmg/kg 程度を、 投与間隔として 1日 1回程度でも可能であり、 1日 2〜4回、 またはそ れ以上の回数に分けて投与することもできる。 また、 例えば点滴等により連続 的に投与することも可能である。 関節等の局所に投与する場合には、 1 個所に 概ね lpgから lOOmgを投与する。
5. 定型例特発性間質性肺炎と非定型例特発性間質性肺炎とを判別する方法お よび判別する診断薬
抗 CCR4抗体は、 CCR4と特異的に結合し、 CCR4陽性細胞を検出および定量で きる。 また、 抗 CXCR3抗体は、 CXCR3 と特異的に結合し、 CXCR3 陽性細胞を検 出および定量できる。
特発性間質性肺炎患者のうち、 定型例特発性間質性肺炎患者の肺組織では、 CXCR3陽性細胞数に比べて CCR4陽性細胞数が増加している。 一方、 非定型例特 発性間質性肺炎患者の肺組織では、 CCR4陽性細胞数に比べて CXCR3陽性細胞が 増加している。 したがって、 特発性間質性肺炎患者の生体試料に抗 CCR4抗体 およぴ抗 CXCR3抗体とを反応させることにより、 定型例特発性間質性肺炎と非 定型例特発性間質性肺炎とを判別することができる。 また、 本発明の診断薬は、 CCR4陽性細胞と CXCR3陽性細胞を判別することが できるため、 間質性肺炎患者のなかでも、 CCR4陽†生細胞の浸潤が有意な患者と CXCR3陽性細胞の浸潤が有意な患者とを判別し、 上述の 4の治療薬の選定を行 うことができる。
生体試料としては、 バイオプシー等で被験者より採取した肺組織切片、 該細 胞または組織より調製した細胞抽出液、 血液などがあげられる。
本発明の診断薬に使用される抗 CCR4抗体としては、 CCR4 に特異的に結合す る抗体であればいかなるものでもよく、 本発明で使用される抗体としては、 ポ リクローナル抗体、 モノクローナル抗体、 遺伝子組換え抗体またはそれらの抗 体断片などいかなるものも包含される。 遺伝子組換え抗体としては、 ヒト型キ メラ抗体、 ヒト型 CDR移植抗体などのヒト化抗体があげられる。 抗体断片とし ては、 Fab、 F (ab' ) 2、 Fab' , scFv、 Diabody、 dsFvおよび CDR を含むペプチド 等があげられる
抗 CCR4抗体および/または抗 CXCR3抗体を含有する診断薬は、 下記に示す ような判定方法に応じて、 抗原抗体反応を行なうための試薬、 該反応の検出用 試薬を含んでもよい。 抗原抗体反応を行なうための試薬としては、 緩衝剤、 塩 等があげられる。 検出用試薬としては、 抗 CCR4抗体または抗 CXCR3抗体を認 識する標識された二次抗体、 標識に対応した基質等の通常の免疫学的検出法に 用いられる試薬があげられる。
抗 CCR4抗体または抗 CXCR3抗体を用いて生体試料に浸潤している CCR4陽性 細胞または CXCR3 陽性細胞を免疫学的に検出おょぴ または定量する方法とし ては、 蛍光抗体法、 酵素免疫測定法 （ELISA)、 放射性物質標識免疫抗体法 (RIA)、 免疫組織染色法、 免疫細胞染色法、 ウェスタンブロッテイング法、 免 疫沈降法、 サンドイッチ ELISA法 （富山朔二および安東民衛， 単クローン抗体 実験マ-ユアル， 講談社サイエンティフィック （1987)、 日本生化学会， 続生 化学実験講座 5， 免疫生化学研究法， 東京化学同人 （1986) ) 等を用いることが できる。 光几体法は、 文献 (Goding J. W. , Monoclonal Antibodies '- Principles and Practice, Academic Press (1996)、 富山朔二および安東民衛， 単クロー ン抗体実験マニュアル， 講談社サイエンティフィック （1987) ) 等に記載され た方法を用いて行うことができる。 具体的には、 分離した細胞あるいは組織等 に、 抗 CCR4 抗体を反応させ、 さらにフルォレセイン 'イソチオシァネート (FITC) あるいはフィコエリスリン等の蛍光物質でラベルした抗ィムノグロプ リン抗体を反応させた後、 蛍光色素をフローサイトメ一ターで測定する方法で ある。
酵素免疫測定法 （ELISA) は、 分離した細胞あるいは組織等に、 抗 CCR4抗体 を反応させ、 さらにペルォキシダーゼ、 アルカリフォスファターゼ等の酵素標 識を施した抗ィムノグロプリン抗体を反応させた後、 酵素反応により発色する 基質を加えて反応させ、 発色色素を吸光光度計で測定する方法である。
放射性物質標識免疫抗体法 （RIA) は、 分離した細胞あるいは組織等に、 抗 CCR4抗体を反応させ、 さらに放射性同位体標識を施した抗ィムノグロプリン抗 体を反応させた後、 シンチレーシヨンカウンタ一等で放射能を測定する方法で ある。
免疫細胞染色法、 免疫組織染色法は、 分離した組織等に、 抗 CCR4抗体を反 応させ、 さらに FITC等の蛍光物質、 ペルォキシダーゼ、 アルカリフォスファ ターゼ等の酵素等で標識を施した抗ィムノグロプリン抗体を反応させ、 酵素標 識の場合は酵素反応により発色する基質を加えて反応させた後、 顕微鏡を用い て観察する方法であり、 文献 （Goding J. W. , Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, Academic Press (1996)、 富山朔二および安東民衛， 単クローン抗体実験マニュアル， 講談社サイエンティフィック （1987) ) 等に 記載された方法を用いて行うことができる。
ウェスタンブロッテイングは、 分離した細胞あるいは組織等を SDS を含むサ ンプル用緩衝液に溶解させて SDS -ポリアクリルアミドゲル電気泳動したのち、 ポリフッ化ビ-リデン （PVDF) 膜に転写し、 抗 CCR4抗体を反応させ、 ペルォ キシダーゼ、 アル力リフォスファターゼ等の酵素標識を施した抗ィムノグロブ リン抗体を反応させた後、 酵素反応により発色あるいは化学発光する基質を加 えて反応させ、 パンドとして検出する方法である。
免疫沈降法は、 分離した細胞あるいは組織の破砕液とビーズ等に固定化した 抗 CCR4抗体を反応させ、 遠心等によりビーズを単離した後、 ビーズを SDS を 含むサンプル用緩衝液で処理して、 溶解させた CCR4 をウェスタンプロッティ ング等により検出する方法である。
サンドィツチ ELISA法はェピトープがそれぞれ異なる 2種類の抗 CCR4抗体 を用いた酵素免疫測定法の一種である。 一方の抗 CCR4抗体をプレート上に固 定し、 分離した細胞あるいは組織の破砕液を反応させた後、 プレート上の抗 CCR4抗体に結合した CCR4にさらにもう一方の抗 CCR4抗体を反応させる。 ペル ォキシダーゼ、 アルカリフォスファターゼ等の酵素標識を施した抗ィムノグロ プリン抗体を反応させた後、 酵素反応により発色する基質を加えて反応させ、 発色色素を吸光光度計で測定する方法である。
以下に、 本発明の実施例、 参考例により、 本発明を説明するが、 本発明はそ れらに限定されるものではない。 図面の簡単な説明
第 1図はプラスミド PKM2160GalOの造成工程を示した図である。
第 2 図はプラスミド pKM2160Gall の造成工程を示した図である。 *は、 アミ ノ酸残基を改変するための変異遺伝子コドンの位置を示している。
第 3 図はプラスミド PKM2160Gal3 の造成工程を示した図である。 *は、 アミ ノ酸残基を改変するための変異遺伝子コドンの位置を示している。
第 4図はプラスミド PKM2160LV0の造成工程を示した図である。
第 5図はプラスミド PKM2160LV1の造成工程を示した図である。 *は、 ァミノ 酸残基を改変するための変異遺伝子コドンの位置を示している。 第 6図はプラスミド pKANTEX2160LV0およびプラスミド pKANTEX2160Gal0LV0 の造成工程を示した図である。
第 7図は各抗 CCR4CDR移植抗体の発現ベクターを COS- 7細胞に一過性発現さ せ、 得られた培養上清中の CCR4部分ペプチドへの ELISA法における反応性を 示した図である。
第 8図は別の FRを用いて作製した各抗 CCR4CDR移植抗体の発現ベクターを COS- 7細胞に一過性発現させ、 得られた培養上清中の CCR4部分ペプチドへの ELISA法における反応性を示した図である。
第 9図は精製した抗 CCR4CDR移植抗体の CCR4部分べプチドへの ELISA法に おける反応性を示した図である。
第 10図は精製した抗 CCR4CDR移植抗体の CCR4高発現細胞 （CCR4/EL- 4) に 対する反応†生を示した図である。
第 11図は精製した抗 CCR4CDR移植抗体の CCR4部分べプチドに対する親和性 を表面プラズモン共鳴センサーを用いて測定した図である。 発明を実施するための最良の形態
実施例 1 抗 CCR4抗体を使用した特発性間質性肺炎患者肺組織の染色
炎症局所では T細胞が集積される。 そこで Thl 細胞の細胞表面に発現する
CXCR3、 および Th2細胞の細胞表面に発現する CCR4にそれぞれ反応する抗体を 用いて、 特発性間質性肺炎患者の肺組織に集積される T細胞を染色した。
特発性間質性肺炎患者 （14 例） より採取した肺組織より、 文献の方法
(Histotechnology： A self-instruction test. ASCP Press (1990) ) に従いノ ラフィン切片を作製した。
6. 32 μ g/mlマウス抗 CCR4抗体 KM2160、 6. 32 μ g/ml抗 CXCR3抗体（ファーミ ンジヱン社製）および市販の免疫組織染色キット （SS MultiLink Detection
Kit, BioGenex社製） を用いて、 肺組織パラフィン切片の免疫染色を行った。 方法はキットの操作手順書に従った。 CXCR3あるいは CCR4陽性細胞の数は、 繊維性領域でランダムに 20視野を選 択し （400倍拡大)、 視野中に存在する抗体陽性の単核球数を計測することによ り行った。 その結果を第 1表に示す。 第 1表 特発性間質性肺炎における CXCR3 CCR4陽性細胞の分布 陽性細胞数
患者 年齢（才）
CXCR3 CCR4 CXCR3 : CCR4比
1 74 NSIP 313 2 156. 5
2 66 NSIP 395 12 32. 9
3 60 NSIP 173 2 86. 5
4 74 NSIP 195 12 16. 3
5 52 NSIP 347 16 21. 7
6 67 NSIP 321 9 35. 7
7 67 NSIP 545 7 77. 9
8 69 NSIP 274 3 91. 3
9 73 NSIP 43 2 21. 5
10 74 NSIP 220 31 7. 1
11 62 NSIP 285 12 23. 8
12 76 NSIP 22 6 3. 7
13 73 匿 43 94 0. 46
14 61 UIP 45 66 0. 68
UIP：定型例特発性間質性肺炎 （usual interstitial pneumonia)
NSIP:非定型例特発性間質性肺炎 （Nonspecific interstitial pneumonia) 定型例特発†生間質†生肺炎患者 2例 （患者 13および 14) では CCR4陽性細胞、 すなわち Th2細胞の優位な浸潤が認められた。 それに対して、 非定型例特発性 間質性肺炎患者 12例 （患者 1-12) では CXCR3陽性細胞、 すなわち Thl細胞の 優位な浸潤が認められた。
したがって、 抗 CCR4抗体おょぴ抗 CXCR3抗体を用いることにより、 特発性 間質性肺炎の診断が可能である。 また、 Thl細胞と Th2細胞の比率を調べるこ とにより、 抗 CCR4抗体と抗 CXCR3抗体を用いて浸潤した Thl細胞と Th2細胞 の比率を調べることにより、 定型例特発性間質性肺炎と非定型例特発性間質性 月市炎との判別が可能である。
また、 抗 CCR4抗体を用いることにより、 定型例特発性間質性肺炎を治療す ることも可能であること、 抗 CXCR3抗体を用いることにより、 非定型例特発性 間質性肺炎を治療することも可能であることが示唆された。 実施例 2 抗 CCR4抗体を使用した膠原病患者の間質性肺炎肺組織の染色
膠原病患者は間質性肺炎を患っていることが多い。 そこで、 実施例 1と同様 に、 Thl細胞の細胞表面に発現する CXCR3、 および Th2細胞の細胞表面に発現 する CCR4 にそれぞれ反応する抗体を用いて、 皮膚筋炎 、 多発性筋炎、 全身性 硬化症 （強皮症）、 慢性関節リウマチなどの膠原病で間質性肺炎を併発する患 者の肺組織に集積される T細胞を染色した。
膠原病患者間質性肺炎 （CVD- IP) の肺組織を、 文献の方法 (Histotechnology： A self-instruction test. ASCP Press (1990) ) ίこ従 ヽ / ラフィン切片を作製した。 抗 CCR4抗体 ΚΜ2160、 市販抗 CXCR3抗体 （ファーミ ンジヱン社製） と市販の免疫組織染色キット （SS MultiLink Detection Kit， BioGenex社製） を用い、 キットの操作手順書に従って組織免疫染色を行った。 CXCR3あるいは CCR4陽性細胞の数は、 繊維性領域においてはランダムに 5視野 を選択し （400倍拡大）、 視野中に存在する抗体陽性の単核球数を計測すること により行った。 リンパ濾胞領域に関しても同じく 5視野を選択して計測を行つ た。 その結果を第 2表に示す。 第 2表 CVD-IPにおける CXCR3、 CCR4陽性細胞の分布 思 年齢 （才） 診断
Kc5 レレ し し しし し し ·しし ίΧι
1 64 RA 10 4 2. 5
2 68 RA 110 10 11. 0
3 89 RA 92 6 15. 3
4 59 RA 60 5 12
5 71 RA 208 60 77. 6
6 73 RA 309 15 20. 6
7 57 RA 48 8 6
8 56 RA 159 41 3， 9
9 64 RA 140 25「 5. 6
10 62 RA 280 10 28
11 72 RA 298 2 149
12 44 DM 80 1 80
13 69 DM 30 3 10
14 45 DM 38 6 6. 3
15 56 PM 30 10 3
16 61 PM 51 20 2. 6
17 65 PM 41 25 1. 6
18 58 PM 138 58 2. 4
19 57 DM 19 9 2. 1
20 50 SSc 21 1 21. 0
21 58 SSc 20 72 0. 28
22 56 SSc 17 44 0. 39
23 38 SSc 231 46 5. 0
24 50 SSc 23 34 0. 68
25 41 SSc 41 4 10. 0
26 67 SSc 20 20 1
27 60 SSc 96 43 2. 2
DM：皮膚筋炎 （dermatomyositis)
PM：多発性筋炎 （polymyositis)
SSc：全身性硬化症 （強皮症） （systemic sclerosis)
RA:慢性関節リゥマチ （rheumatoid arthritis) 全身性硬化症患者 （患者 20-27) より採取された肺組織において、 CXCR3 陽 性細胞優位な浸潤を示す症例 （患者 20、 23、 25、 27) と CCR4陽性細胞の優位 な浸潤を示す症例 （患者 21、 22、 24) とが観察された。
したがって、 全身性硬化症患者のうち、 CCR4陽性細胞の優位な浸潤を示す症 例においては、 抗 CCR4抗体が治療薬として有用であり、 CXCR3陽性細胞の有意 な浸潤を示す症例においては、 抗 CXCR3抗体が治療薬として有用であることが 明らかとなった。
以上の結果は、 膠原病患者肺病変の組織染色を行い、 患者の病態診断を行う ことにより適切な治療方法を選択することができることを示している。 参考例 1 CCR4に対するヒト型 CDR移植抗体 （抗 CCR4CDR移植抗体） の作製 1. 抗 CCR4CDR移植抗体の VHおよび VLをコードする cDNAの設計
(1) 抗 CCR4CDR移植抗体の VHのァミノ酸配列の設計
まず、 抗 CCR4CDR移植抗体の VHのァミノ酸配列を以下の様にして設計した。 W001/64754 の実施例 1 に記載の方法に従って作製された抗 CCR4 マウス抗体 KM2160を使用し、 配列番号 2、 3および 4に示した VHの CDR1、 2および 3のァ ミノ酸配列を移植するためのヒト抗体の VHの FRのアミノ酸配列を選択した。 配列解析システムとして GCG Package (Genetics Computer Group社製） を用 いて、 既存の蛋白質のアミノ酸配列データベースを BLASTP法 （Nucleic Acid Res. , 25, 3389 (1997) ) により KM2160 と相同性の高いヒト抗体を検索した。 相同性スコアと実際のァミノ酸配列の相同性を比較したところ、 SWISSPROTデ ータベースァクセッションナンバー P01781、 Ig Heavy chain V- III region Gal (Hoppe. Seylers. Z. Physiol. Chem. , 354, 1505-1509 (1973) ;以下、 Gal と称す） 力 S 82. 5%を示し、 最も相同性の高いヒト抗体であったため、 この 抗体の FRのアミノ酸配列を選択した。 ただしデータベース上の Galの FRのァ ミノ酸配列中には、 アミノ酸残基が一義的に決定されていない部分 （分泌型抗 体の N末端から 28番目、 30番目） ゃヒト抗体の配列では出現頻度の低いアミ ノ酸残基 （V領域の最後の残基である Thr) が認められた。 そこで、 28番目と 30番目については、 マウス抗体 KM2160に見られる残基である lieと Serを選 択し、 V領域の最後の Thr については、 Ser へ置換した。 これらのアミノ酸残 基は、 任意のヒト抗体の配列 （シーケンシズ ·ォプ ·プロテインズ ·ォプ .ィ ムノロジカル 'インタレスト） においても高頻度に認められることから、 ヒト 抗体の配列から逸脱するものではない。
以上のようにして決定したヒト抗体の FR のアミノ酸配列の適切な位置に配 列番号 2、 3および 4に示した抗 CCR4マウス抗体 KM2160の VHの CDR1、 2およ ぴ 3のァミノ酸配列を移植し、 配列番号 10に記載の抗 CCR4CDR移植抗体の VH のアミノ酸配列 GalOを設計した。 配列番号 10のアミノ酸配列をコードする塩 基配列を配列番号 24に示した。
また、 力パットらによって分類された共通配列を基に抗 CCR4CDR移植抗体の VHのァミノ酸配列を設計した。
力バットらは、 既知の様々なヒト抗体の VH をそのアミノ酸配列の相同性か ら 3種類のサブグループ （HSG I〜： [II) に分類し、 更に、 それら各サブグルー プ毎に共通配列を報告している （シーケンシズ .ォブ ·プロティンズ ·ォブ · ィムノロジカル.インタレスト）。 それら共通配列は、 ヒトにおいてより免疫 原性が低下する可能性が考えられる。 そこで、 活性の高い抗 CCR4CDR移植抗体 を作製するために、 設計にあたってはヒト抗体の VHの 3種類のサブグループ の共通配列の FRのァミノ酸配列のうち、 KM2160の VHの FRのァミノ酸配列と 最も高い相同性を有する FRのアミノ酸配列を選択した。 第 3表には、 相同性 の検索結果を示した。 第 3表に示した様に、 KM2160の VH領域の FRのアミノ酸 配列はサブグループ IIIと最も高い相同性を有していた。 第 3 ヒト抗体の VHの各サブグループの共通配列の FRのァミノ酸配列と
KM2160の VHの FRのァミノ酸配列との間の相同性
HSGI HSGII HSGIII
57. 47% 50. 58% 77. 01%
以上の結果から、 ヒ ト抗体の VHのサブグループ IIIの共通配列の FRのァミ ノ酸配列の適切な位置に抗 CCR4マウス抗体 KM2160の VHの CDRのァミノ酸配 列を移植し、 配列番号 11 に記載の抗 CCR4CDR移植抗体の VH のアミノ酸配列 HV0を設計した。 配列番号 11のァミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号 25に示した。
(2) CCR4に対するヒ ト型 CDR移植抗体の VLのァミノ酸配列の設計
次に、 抗 CCR4CDR移植抗体の VLのァミノ酸配列を以下の様にして設計した。 配列番号 5、 6および 7に示した抗 CCR4マウス抗体 KM2160の VLの CDR1、 2お ょぴ 3のァミノ酸配列を移植するためのヒト抗体の VLの FRのアミノ酸配列を 選択した。 カバットらは、 既知の様々なヒ ト抗体の VL をそのアミノ酸配列の 相同性から 4 種類のサブグループ （HSG I〜IV) に分類し、 更に、 それら各サ ブグループ毎に共通配列を報告している （シーケンシズ ·ォブ ·プロティン ズ'ォブ'ィムノロジカル 'インタレスト）。 そこで、 ヒ ト抗体の VLの 4種類 のサブグループの共通配列の FRのァミノ酸配列のうち、 KM2160の VLの FRの アミノ酸配列と最も高い相同性を有する FR のアミノ酸配列を選択した。 第 4 表には、 相同性の検索結果を示した。 第 4表に示した様に、 KM2160の VLの FR のアミノ酸配列はサブグループ IIと最も高い相同性を有していた。 第 4表 ヒト抗体の VLの各サブグループの共通配列の FRのァミノ酸配列と
KM2160の VLの FRのァミノ酸配列との間の相同性
HSGI HSGII HSGIII HSGIV
Figure imgf000066_0001
以上の結果から、 ヒ ト抗体の VLのサブグループ IIの共通配列の FRのアミ ノ酸配列の適切な位置に配列番号 5、 6および 7 に示した抗 CCR4マウス抗体 KM2160の VLの CDR1、 2および 3のァミノ酸配列を移植し、 配列番号 12に記載 の抗 CCR4CDR移植抗体の VLのァミノ酸配列 LV0を設計した。 配列番号 12のァ ミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号 26に示した。
(3) CCR4に対するヒト型 CDR移植抗体の VHおよび VLの改 o変
上記で設計した抗 CCR4CDR移植抗体の VHのアミノ酸配列 Gal0、 HV0および VLのァミノ酸配列 LV0は、 選択したヒト抗体の FRのァミノ酸配列に抗 CCR4マ ウス抗体 KM2160の CDRのァミノ酸配列のみを移植した配列であるが、 一般に、 ヒト型 CDR移植抗体では、 マウス抗体の CDRのァミノ酸配列の移植のみでは活 性が低下してしまうことが多く、 それを回避するため、 ヒト抗体とマウス抗体 で異なっている FRのアミノ酸残基のうち、 活性に影響を与えると考えられる アミノ酸残基を CDRのアミノ酸配列とともに移植することが行われている。 そ こで、 本参考例においても、 活性に影響を与えると考えられる FR のアミノ酸 残基を同定することを検討した。
まず、 上記で設計した抗 CCR4CDR移植抗体の VHのアミノ酸配列 Gal0、 HV0 および VLのァミノ酸配列 LV0 よりなる抗体 V領域 (GalOLVOおよび HV0LV0) の三次元構造をコンピューターモデリングの手法を用いて構築した。 三次元構 造座標作製に関してはソフトウエア AbM (Oxford Molecular社製） を、 三次元 構造の表示についてはソフトウエア Pro- Explore (Oxford Molecular社製） あ るいは RasMol (Glaxo社製） を用いてそれぞれ添付の使用説明書に従い、 行つ た。 また、 抗 CCR4マウス抗体 KM2160の V領域の三次元構造のコンピューター モデルも同様にして構築した。 更に、 GalOLVOまたは HV0LV0の VHおよび VLの FRのアミノ酸配列において、 抗 CCR4マウス抗体 KM2160と異なっている残基に ついて順次、 抗 CCR4マウス抗体 KM2160の相当する位置に見られる残基へ改変 したアミノ酸配列からなる三次元構造モデルを同様にして構築し、 抗 CCR4 マ ウス抗体 KM2160、 GalOLVOまたは HV0LV0およぴ改変体の V領域の三次元構造 を];ヒ較した。
その結果、 GalOLVOまたは HV0LV0の FRのアミノ酸残基の中で抗原結合部位 の三次元構造を変化させ、 抗体の活性に影響を与えると考えられる残基として、 GalOでは 40番目の Ma、 42番目の Gly、 43番目の Lys、 44番目の Gly、 76番 目の Lys、 および 97番目の Alaを、 HV0では、 28番目の Thrおよび 97番目の Alaを、 LV0では、 2番目の Ile、 3番目の Val、 50番目の Gln、 および 88番目 の Valを選択した。 これらの選択したアミノ酸残基のうち、 少なくとも 1つを マウス抗体 KM2160 に見られるァミノ残基へ改変し、 様々な改変を有するヒ ト 型 CDR移植抗体の VHおよぴ VLを設計した。
まず、 VHについては、 例えば GalOの 97番目の Ala を改変した配列番号 13 で示した Gall、 GalOの 42番目の Gly、 44番目の Glyを改変した配列番号 14 で示した Gal2、 GalOの 97番目の Ala、 42番目の Gly、 44番目の Glyを改変し た配列番号 15に示した Gal3、 HVOの 28番目の Thrを改変した配列番号 16に 示した HV1、 HVOの 97番目の Alaを改変した配列番号 17で示した HV2、 および HV0の 28番目の Thr、 97番目の Alaを改変した配列番号 18で示した HV3をそ れぞれ設計した。 さらに VLについては、 例えば 2番目の lieを改変した配列 番号 19に示した LV1、 3番目の Valを改変した配列番号 20に示した LV2、 2番 目の lieおよび 3番目の Valを改変した配列番号 21に示した LV3を設計した。 配列番号 13〜21 のアミノ酸配列をコードする塩基配列を、 それぞれ配列番号 27〜35に示した。 2. 抗 CCR4CDR移植抗体の cDNAの構築
(1) 抗 CCR4CDR移植抗体の VHをコードする cDNAの構築
参考例 1の 1項 （1) で設計した抗 CCR4CDR移植抗体の VHのアミノ酸配列 GalOをコードする cDNAを PCR法を用いて以下の様にして構築した。
まず、 設計したアミノ酸配列に配列番号 36 に記載の抗 CCR4 マウス抗体 KM2160の H鎖の分泌シグナル配列 （W001/64754) を繋げて完全な抗体ァミノ酸 配列とした。 次に、 該アミノ酸配列を遺伝子コドンに変換した。 1 つのアミノ 酸残基に対して複数の遺伝子コドンが存在する場合は、 抗体の遺伝子の塩基配 列に見られる使用頻度 （シーケンシズ ·ォブ ·プロティンズ ·ォブ ·ィムノロ ジカル 'インタレスト） を考慮し、 対応する遺伝子コドンを決定した。 決定し た遺伝子コドンを繋げて、 完全な抗体 V領域のァミノ酸配列をコードする cDNA の塩基配列を設計し、 更に 5'末端と 3'末端に PCR反応時の増幅用プライマー の結合塩基配列 （ヒ ト化抗体発現用ベクターへクローニングするための制限酵 素認識配列も含む）を付加した。 設計した塩基配列を 5'末端側から約 100塩基 ずつ計 6本の塩基配列に分け （隣り合う塩基配列は、 その末端に約 20塩基の 重複配列を有する様にする）、 それらをセンス鎖、 アンチセンス鎖の交互の順 で、 実際には、 配列番号 37〜42 に記載の塩基配列を有する 6本の合成オリゴ ヌクレオチドを合成した （GENSET社製)。
各ォリゴヌクレオチドを最終濃度が 0. 1 μ Mとなる様に 0. 2mM dNTPs、 IraM塩 化マグネシウムを含む反応液に加え、 さらに 0. 4 μ Μ M13 primer RV (宝酒造社 製）、 ΟΛ μ Μ M13 primer M3 (GENSET社製） および 2. 5単位の KOD polymerase (T0Y0B0社製） を用いて、 合計 とし、 PCR反応を行った。 反応条件は 94°C 30秒間、 55°C 30秒間、 74°C 60秒間のサイクルを 30サイクル、 その後 74°C 10分間を 1サイクルで行った。 該反応液を QIA quick PCR purification kit (QIAGEN社製） にて精製し、 最終的に滅菌水に溶解した。 10単位の制限酵 素 ^pal (宝酒造社製） および 10単位の制限酵素 Not_I (宝酒造社製） を用いて 37°Cで 1時間反応させた。 該反応液をァガロースゲル電気泳動にて分画し、 約 0. 47kbの Apal-Notl断片を回収した。
次に、 プラスミド pBluescript II SK (-) (Stratagene社製） の を 10 単位の制限酵素 I (宝酒造社製） および 10単位の制限酵素 1 (宝酒造社 製） を用いて 37°Cで 1時間反応させた。 該反応液をァガロースゲル電気泳動に て分画し、 約 2. 95kbの Apal-Notl断片を回収した。
次に、 上記で得られた抗 CCR4CDR移植抗体の VHの PCR産物の l断 片とプラスミ ド pBluescript II SK (-） の Apal-Notl 断片を、 DNA Ligation Kit Ver. 2 (宝酒造社製） の Solution I を用いて添付の説明書に従って連結し た。 この様にして得られた組換えプラスミド DNA溶液を用いて大腸菌 DH5 o;株 (東洋紡績社製） を形質転換し、 形質転換株のクローンより各プラスミ ド DNA 調製し、 Big Dye Terminator Kit ver. 2 (Appliedbiosysteras 社製) を用い て塩基配列の解析を行った。 塩基配列を解析した結果、 目的の塩基配列を有す る第 1図に示したプラスミド pKM2160GalOを得た。 プラスミド pKM2160GalOで 形質転換された大腸菌株である Escherichia coli DH5 a /pKM2160GalO は、 独 立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター （日本国茨城県つくば 市東 1丁目 1番地 1 中央第 6) に平成 13年 8月 22 日付けで FERM BP-7709と して国際寄託されている。
次に、 参考例 1の 1項 （3) で設計した FRのァミノ酸残基の改変は以下のよ うに行った。 改変後のアミノ酸残基の遺伝子コドンについては、 マウス抗体 KM2160で見られる遺伝子コドンとなるように行った。
97 番目の Ala を Gly に改変する際には、 本項で作製したプラスミ ド pKM2160GalOの 25ngを錶型とし、 配列番号 43と 44に記載の塩基配列を有する 変異導入のための合成 DNA (GENSET社製） をプライマーとしてそれぞれ終濃度 0. 4 / Mとなるように加え、 2. 5単位の K0D plus polymerase (T0Y0B0社製） を 用いて、 添付の取扱説明書に従い、 50 Lの系でまず 94°Cで 2分間加熱した後、 94°C15秒間、 55°C30秒間、 68°C40秒間の条件で 35サイクルの PCR反応を行つ た。 該反応液を QIA quick PCR purification kit (QIAGEN社製） にて精製し、 最終的に滅菌水に溶解した。 全量を 10単位の制限酵素 I (宝酒造社製） を 用いて 37°Cで 1 時間反応させた後、 10単位の制限酵素 ^ΠΙ (New England Biolabs社製） を用いて 37°Cで 1時間反応させた。 該反応液をァガロースゲル 電気泳動にて分画し、 約 0. 58kbの Pstl-Dralll断片を回収した。
次に、 プラスミド PKM2160GalOの 3 gを 10単位の制限酵素 ^1 (宝酒造社 製）を用いて 37°Cで 1 時間反応させた後、 10 単位の制限酵素 (New England Biolabs社製） を用いて 37°Cで 1時間反応させた。 該反応液をァガロ ースゲル電気泳動にて分画し、 約 2. 7kbの Pstl-Dralll断片を回収した。
次に、 上記で得られた PCR 産物由来の E^I -^ III 断片とプラスミ ド pKM2160GalO 由来の Pstl-Dralll 断片を DNA Ligation Kit Ver. 2 (宝酒造社 製） の Solution I を用いて添付の説明書に従って連結した。 この様にして得 られた組換えプラスミド DNA溶液を用いて大腸菌 DH5 a株 （東洋紡績社製） を 形質転換し、 形質転換株のクローンより各プラスミド DNA を調製し、 Big Dye Terminator Kit ver. 2 (Appliedbiosystems社製） を用いて塩基配列の解析を 行った。 塩基配列を解析した結果、 目的の塩基配列を有する第 2図に示したプ ラスミド pKM2160Gallを得た。 プラスミド pKM2160Gallで形質転換された大腸 菌株である Escherichia coli DH5 a /pKM2160Gall は、 独立行政法人産業技術 総合研究所特許生物寄託センター （日本国茨城県つくば市東 1 丁目 1 番地 1 中央第 6) に平成 13年 8月 22日付けで FERM BP- 7710として国際寄託されてい る。
42番目の Glyを Aspに、 また 44番目の Glyを Argに改変する際には、 PCR プライマーとしては配列番号 45 に記載の塩基配列を有する変異導入のための 合成 DNA (GENSET社製） と M13 primer RV (宝酒造社製） をプライマーとする以 外は、 基本的には上記と同様の方法で実施し、 pKM2160Gal2 を得た。 プラスミ ド PKM2160Gal2 で形質転換された大腸菌株である Escherichia coli DH5 a /PKM2160Gal2 は、 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター (日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6) に平成 13年 8月 22 日付 けで FERM BP - 7711として国際寄託されている。
また上記 3 残基全ての改変は、 以下のようにして構築した。 得られた pKM2160Gall と p 2160Gal2を各約 0. 5 /z g用いて、 10単位の I (宝酒造社 製） で 37°Cで 1時間反応させた後、 更に さ1 (宝酒造社製） で 37°Cで 1時間 反応させた。 該反応液をァガロースゲル電気泳動にて分画し、 pKM2160Gall 由 来の約 1. 3kbの Nhel - Seal断片と、 pKM2160Gal2由来の約 2. Okbの断片を回収 した。 得られた 2 種類の断片を DNA Ligation Kit Ver. 2 (宝酒造社製） の Solution I を用いて添付の説明書に従って連結した。 この様にして得られた組 換えプラスミド DNA溶液を用いて大腸菌 DH5ひ株 （東洋紡績社製） を形質転換 し、 形質転換株のクローンより各プラスミ ド DNA を調製し、 Big Dye Terminator Kit ver. 2 (Appliedbiosystems社製） を用いて塩基配列の;^析を 行った。 塩基配列を解析した結果、 目的の塩基配列を有する第 3 図に示したプ ラスミド pKM2160Gal3を得た。 プラスミド pKM2160Gal3で形質転換された大腸 菌株である Escherichia coli DH5 a /pKM2160Gal3 は、 独立行政法人産業技術 総合研究所特許生物寄託センター （日本国茨城県つくば巿東 1 丁目 1 番地 1 中央第 6) に平成 13年 8月 22日付けで FERM BP- 7712として国際寄託されてい る。
次に、 参考例 1の 1項 （1) で設計した抗 CCR4CDR移植抗体の VHのアミノ酸 配列 HV0をコードする cDNAを PCR法を用いて以下の様にして構築した。
まず、 設計したアミノ酸配列に配列番号 36 に記載の抗 CCR4 マウス抗体 KM2160の H鎖の分泌シグナル配列を繋げて完全な抗体ァミノ酸配列とした。 次 に、 該アミノ酸配列を遺伝子コドンに変換した。 1 つのアミノ酸残基に対して 複数の遺伝子コドンが存在する場合は、 抗体の遺伝子の塩基配列に見られる使 用頻度 （シーケンシズ ·ォプ ·プロテインズ ·ォプ ·ィムノロジカル ·インタ レスト） を考慮し、 対応する遺伝子コ ドンを決定した。 決定した遺伝子コ ドン を繋げて、 完全な抗体 V領域のアミノ酸配列をコードする cDNAの塩基配列を 設計し、 更に 5'末端と 3'末端に PCR反応時の増幅用プライマーの結合塩基配 列 （ヒト化抗体発現用ベクターへクローニングするための制限酵素認識配列も 含む）を付カ卩した。 設計した塩基配列を 5'末端側から約 100塩基ずつ計 6本の 塩基配列に分け （隣り合う塩基配列は、 その末端に約 20塩基の重複配列を有 する様にする）、 それらをセンス鎖、 アンチセンス鎖の交互の順で、 実際には、 配列番号 37、 46〜49、 および 42に記載の塩基配列を有する 6本の合成オリゴ ヌクレオチドを合成し （GENSET社製）、 本項に記載した pKM2160GalO と同様の 方法で pKM2160HV0を得た。 プラスミド pKM2160HV0で形質転換された大腸菌株 である Escherichia coli DH5 a /pKM2160HV0 は、 独立行政法人産業技術総合研 究所特許生物寄託センター （日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6) に平成 13年 8月 27日付けで FERM BP-7718として国際寄託されている。
28番目の Thrを lieに改変する際には、 配列番号 46に記載の塩基配列を有 するオリゴヌクレオチドの代わりに配列番号 50 に記載の塩基配列を有するォ リゴヌクレオチドを、 また配列番号 47 に記載の塩基配列を有するオリゴヌク レオチドの代わりに、 配列番号 51 に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオ チドを用いて上記のプラスミド pKM2160HV0 の構築と同様の反応を行うことに より、 目的の塩基配列を有する pKM2160HVlを得た。 プラスミド pKM2160HVlで 形質転換された大腸菌株である Escherichia coli DH5 a /pKM2160HVl は、 独立 行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター （日本国茨城県つくば巿 東 1丁目 1番地 1 中央第 6) に平成 13年 8月 27 日付けで FERM BP- 7719とし て国際寄託されている。
28番目の Thrを lieに、 および 97番目の Alaを Glyに改変する際には、 配 列番号 46 に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの代わりに配列番号 50 に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを、 また配列番号 47 に記載 の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの代わりに配列番号 51 に記載の塩基 配列を有するオリゴヌクレオチド、 また配列番号 49 に記載の塩基配列を有す るオリゴヌクレオチドの代わりに、 配列番号 52 に記載の塩基配列を有するォ リゴヌクレオチドを用いて上記のプラスミド pKM2160HV0 の構築と同様の反応 を行うことにより、 目的の塩基配列を有する pKM2160HV3 を得た。 プラスミ ド PKM2160HV3 で形質転換された大腸菌株である Escherichia coli DH5 a /pKM2160HV3 は、 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター （日 本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6) に平成 13年 8月 27日付けで FERM BP-7721として国際寄託されている。
97番目の Alaを Glyに改変する際には、 以下の様にして構築した。 得られた PKM2160HV0と pKM2160HV3を各約 0. 5 μ g用いて、 10単位の 1 (宝酒造社製） で 37°Cで 1時間反応させた後、 更に^ I (宝酒造社製） で 37°Cで 1時間反応 させた。 該反応液をァガロースゲル電気泳動にて分画し、 pKM2160HV3 由来の約 1. 3kbの Nhel-Scal断片と、 pKM2160HV0由来の約 2. Okbの断片を回収した。 得 られた 2種類の断片を DNA Ligation Kit Ver. 2 (宝酒造社製） の Solution I を用いて添付の説明書に従つて連結した。 この様にして得られた組換えプラス ミド DNA溶液を用いて大腸菌 DH5 «株 （東洋紡績社製） を形質転換し、 形質転 換株のクローンより各プラスミ ド DNA を調製し、 Big Dye Terminator Kit ver. 2 (Appliedbiosystems社製） を用いて塩基配列の解析を行った。 塩基配列 を解析した結果、 目的の塩基配列を有するプラスミド pKM2160HV2 を得た。 プ ラスミ ド pKM2160HV2で形質転換された大腸菌株である Escherichia coli DH5 a /pKM2160HV2 は、 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター (日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6) に平成 13年 8月 27 日付 けで FERM BP - 7720として国際寄託されている。
(2) 抗 CCR4CDR移植抗体の VLをコードする cDNAの構築
参考例 1 の 1項 （2) で設計した抗 CCR4CDR移植抗体の VLのアミノ酸配列 LV0をコードする cDNAを VHと同様に PCR法を用いて以下の様にして構築した。 ただし、 分泌シグナル配列としては、 配列番号 53 に記載のアミノ酸配列を有 する抗 CCR4マウス抗体 KM2160の L鎖の配列を用いた （W001/64754)。 まず、 配列番号 54〜59 に記載の塩基配列を有する 6本の合成オリゴヌタレ ォチドを合成した （GENSET社製)。 各オリゴヌクレオチドを最終濃度が 0. 1 Μ となる様に の反応液に加えて、 0· 4 μ Μ M13 primer RV (宝酒造社製）、 0. 4 μ Μ M13 primer M4 (宝酒造社製） もしくは配列番号 60 に示した M13 primer M3 (GENSET社製）、 および 2. 5単位の KOD polymerase (T0Y0B0社製） を用いて、 PCR反応を行った。 この際の反応条件は 94°C 30秒間、 55°C 30秒 間、 74°C 60秒間のサイクルを 30サイクル、 その後 72°Cで 10分間を 1サイク ルとした。 該反応液を QIA quick PCR purification kit (QIAGEN社製） にて 精製し、 最終的に滅菌水に溶解した。 10 単位の制限酵素 (宝酒造社製） および 10単位の制限酵素 （宝酒造社製） を用いて 37°Cで 1時間反応させ た。 該反応液をァガロースゲル電気泳動にて分画し、 約 0. 44kb の EcoRI- Xhol 断片を回収した。
次に、 プラスミド pBluescript II SK (-) (Stratagene社製） の 3 g を 15 単位の制限酵素 I (宝酒造社製） および 15単位の制限酵素 Ι (宝酒造 社製） を用いて 37°Cで 1時間反応させた。 該反応液をァガロースゲル電気泳動 にて分画し、 約 2. 95kbの EcoRI- Xhol断片を回収した。
次に、 上記で得られた抗 CCR4CDR移植抗体の VLの PCR産物の EcoRI - Xhol断 片とプラスミ ド pBluescript II SK (-） EcoRI-XhoI 断片を DNA Ligation Kit Ver. 2 (宝酒造社製） の Solution I を用いて添付の説明書に従って連結した。 この様にして得られた組換えプラスミド DNA溶液を用いて大腸菌 DH5ひ株 (東洋 紡績社製）を形質転換し、 形質転換株のクローンより各プラスミド DNA を調製 し、 Big Dye Terminator Kit ver. 2 (Appliedbiosystems社製) を用いて塩 配列の解析を行った。 塩基配列を解析した結果、 目的の塩基配列を有する第 4 図に示したプラスミド pKM2160LV0を得た。 プラスミド pKM2160LV0で形質転換 された大腸菌株である Escherichia coli DH5 a /pKM2160LV0は、 独立行政法人 産業技術総合研究所特許生物寄託センター （日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1 番地 1 中央第 6) に平成 13年 8月 22 日付けで FERM BP-7713 として国際寄託 されている。
次に、 参考例 1の 1項 （3) で設計した FRのアミノ酸残基の改変は以下に示 す方法で行った。 改変後のアミノ酸残基の遺伝子コドンについては、 マウス抗 体 KM2160で見られる遺伝子コドンとなるように行つた。
2番目の lieを Valに改変する際には、 配列番号 50に記載の塩基配列を有す るオリゴヌクレオチドの代わりに、 配列番号 61 に記載の塩基配列を有するォ リゴヌクレオチドを用いて上記のプラスミ ド pKM2160LV0 の構築と同様の反応 を行うことにより、 目的の塩基配列を有する第 5 図に示したプラスミ ド PKM2160LV1 を得た。 プラスミド pKM2160LVl で形質転換された大腸菌株である Escherichia coli DH5 a /pKM2160LVl は、 独立行政法人産業技術総合研究所特 許生物寄託センター （日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6) に平 成 13年 8月 22日付けで FERM BP- 7714として国際寄託されている。
同様にして 3番目の Valを Leuに改変する際には、 配列番号 55に記載の塩 基配列を有するオリゴヌクレオチドの代わりに配列番号 62 に記載の塩基配列 を有するオリゴヌクレオチドを用い、 また上記 2残基をすベて改変する際には、 配列番号 56 に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの代わりに配列番 号 63 に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いることで目的のプ ラスミド pKM2160LV2、 pKM2160LV3をそれぞれ得た。 プラスミド pKM2160LV2で 形質転換された大腸菌株である Escherichia coli DH5 a /pKM2160LV2およぴプ ラスミド pKM2160LV3で形質転換された大腸菌株である Escherichia coli DH5 a /pKM2160LV3 は、 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター (日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6) に平成 13年 8月 22 日付 けで FERM BP- 7715および FERM BP- 7716としてそれぞれ国際寄託されている。 (3) 抗 CCR4CDR移植抗体発現べクタ一の構築
ヒ ト化抗体発現用ベクター pKANTEX93 (Mol. Immunol. , 37, 1035 (2000) ) と参考例 1の 2項 （1) および （2) で得られたプラスミド pKM2160GalOおよび PKM2160LV0 を用いて抗 CCR4CDR移植抗体発現ベクター pKANTEX2160Gal0LV0 を 以下の様にして構築した。
参考例 1の 2項 （2) で得られたプラスミド pKM2160LV0の 3 μ gを 10単位の 制限酵素 BsiWI (New England Biolabs社製） を用いて 55°Cで 1時間反応させ た後、 10単位の制限酵素 i^RI (宝酒造社製） を加えて 37°Cで 1時間反応させ た。 該反応液をァガロースゲル電気泳動にて分画し、 約 0. 44kbの BsiWI-EcoRI 断片を回収した。
次に、 ヒト化抗体発現用ベクター PKA TEX93 の を 10 単位の制限酵素 BsiWI (New England Biolabs社製） を用いて 55°Cで 1 時間反応させた後、 10 単位の制限酵素 I^RI (宝酒造社製） を加えて 37°Cで 1時間反応させた。 該反 応液をァガロースゲル電気泳動にて分画し、 約 12. 75kbの BsiWI-EcoRI断片を 回収した。
次に、 上記で得られた pKM2160LV0 由来 BsiWI-EcoRI 断片とプラスミ ド PKANTEX93 由来の BsiWI-EcoRI 断片を DNA Ligation Kit Ver. 2 (宝酒造社製） の Solution I を用いて添付の説明書に従って連結した。 この様にして得られ た組換えプラスミド DNA溶液を用いて大腸菌 DH5 a株 （東洋紡績社製） を形質 転換し、 第 6図に示したプラスミド pKANTEX2160LV0を得た。
次に、 参考例 1の 2項 （1) で得られたプラスミド pKM2160GalOの を 10単位の制限酵素 ^1 (宝酒造社製） を用いて 37°Cで 1時間反応させた後、 更に 10単位の制限酵素 l (宝酒造社製） を用いて 37°Cで 1時間反応させた。 該反応液をァガロースゲル電気泳動にて分画し、 約 0. 47kb の Apal-Notl 断片 を回収した。
次に、 上記で得られたプラスミド pKA TEX2160LV0の 3 μ §を 10単位の制限 酵素^ I (宝酒造社製） を用いて 37°Cで 1時間反応させた後、 更に 10単位の 制限酵素 I (宝酒造社製） を用いて 37°Cで 1 時間反応させた。 該反応液を ァガロースゲル電気泳動にて分画し、 約 0. 45kbの Apal-Notl断片を回収した。 次に、 上記で得られた pKM2160GalO 由来の Apal-Notl 断片とプラスミ ド PKANTEX2160LV0 由来の Apal-Notl 断片を DNA Ligation Kit Ver. 2 (宝酒造社 製） の Solution I を用いて、 添付の説明書に従って連結した。 この様にして 得られた組換えプラスミド DNA溶液を用いて大腸菌 DH5 a株 （東洋紡績社製） を形質転換し、 形質転換株のクローンより各プラスミド DNAを調製した。
得 ら れたプ ラ ス ミ ドを用 い、 Big Dye Terminator Kit ver. 2 (Appliedbiosystems社製） を用いて塩基配列の解析を行った結果、 目的の DNA がクローニングされている第 6図に示したプラスミドが得られたことを確認し た。
また、 HV0を含め、 その他 FRのァミノ酸残基に改変を加えた VHおよび VLに ついても同様の方法を用いて発現ベクターを作製した。
具体的には、 参考例 1の 2項（1)で作製した Gal0、 Gall, Gal2、 Gal3、 HV0、 HV1、 HV2および HV3と、 参考例 1の 2項（2)で作製した LV0、 LV1、 LV2および LV3 とをそれぞれ組み合せて以下の発現ベクターである Gal0LV0、 GalOLVl, GalOLV2s GalOLV3、 GallLVl、 GallLV3、 Gal2LVl、 Gal2LV3、 Gal3LVl、 Gal3LV3、 HV0LV0、 HV0LV1, HV0LV2、 HV0LV3、 HV1LV0, HV1LV1、 HV1LV2、 HV1LV3、 HV2LV0、 HV2LV3, HV3LV0および HV3LV3の 22種類の発現べクタ一を作製した。 参考例 2 抗 CCR4CDR移植抗体の動物細胞による発現
1. COS- 7細胞 （ATCC CRL1651) を用いた抗 CCR4CDR移植抗体の一過性発現
(1) COS- 7細胞での一過性発現
1 X 105細胞/ raLの COS- 7細胞を 10%の FCSを含む DMEM培地 （ギブコ社製） に て 6ゥヱルプレート （岩城硝子社製） に 2mL/ゥヱルずつ分注し、 37°Cで一晩培 養した。 0ΡΠ- MEM 培地 （ギブコ社製） 100 μ L に対して Fu- GENE™ 6 Transfection Reagent (ロシュ社製） 3 /i Lをカ卩え、 さらに参考例 1の 2項 (3) で得られた抗 CCR4CDR移植抗体発現ベクター 1 μ §を加えて室温で 15分間放置 し、 DNA -リボソーム複合体を形成させた。 該反応液を前述した COS- 7細胞に滴 下し、 よく混合した後に 37°Cで培養した。 培養後、 72 時間の時点で培養上清 を回収し、 培養上清中の抗 CCR4CDR移植抗体の活性評価を行つた。
(2) 抗 CCR4CDR移植抗体のヒト CCR4に対する反応性評価
得られた培養上清を以下の方法にて活性評価を行った。
W001/64754 の実施例 2 に従って作製された形質転換体 KM2760 (FERM BP- 7054) が生産する抗 CCR4キメラ抗体 M2760が反応し得るヒト CCR4細胞外領 域ペプチドとして化合物 1 (配列番号 23) を選択した。 ELISA法による活性測 定に用いるため、 以下の方法で BSA (Bovine Serum Albumin) (ナカライテスタ 社製） とのコンジュゲートを作製し、 抗原として用いた。 すなわち、 10mg の BSAを含む PBS溶液 900mLに、 lOOmLの 25mg/mL SMCC (4_ (N-マレイミドメチ ノレ）シク口へキサン- 1-力ノレボキシリックァシッド N-ヒ ドロキシサクシンィミ ド エステル) (シグマ社製) - DMS0溶液を vortex下で滴下し、 30分間ゆつくりと 攪拌した。 25mL PBS で平衡化した NAP- 10カラム等のゲルろ過カラムに反応液 1 mLをアプライし、 1. 5mLの PBSで溶出させた溶出液を BSA- SMCC溶液とした (A28fl測定から BSA濃度を算出）。 次に、 0. 5mgの化合物 1に 250mL PBSを加え、 次いで 250mL DMF を加えて完全に溶解させた後、 前述の BSA- SMCC溶液 （BSA 1. 25mg分） を vortex下で添加して 3時間ゆつくり攪拌した。 反応液を PBSに 対して 4°C、 一晩透析し、 最終濃度 0. 05%となるようにアジ化ナトリウムを添 カロして、 0. 22mmフィルターでろ過した後 BSA-化合物 1溶液とした。
96穴の EIA用プレート （グライナ一社製） に、 上述のように調製したコンジ ュゲートを 0. 05 /i g/mL、 50 At L/ゥヱルで分注し、 4°Cで一晚放置して吸着させ た。 PBSで洗浄後、 1%BSAを含む PBS (以下、 1%BSA- PBS と表記する） を 100 し/ゥエルでカ卩え、 室温で 1 時間反応させて残存する活性基をプロックした。 各ゥヱルを 0. 05%Tween20 を含む PBS (以下、 Tween - PBS と表記する） で洗浄 後、 形質転換株の培養上清を 50 1 ゥエルでカ卩え、 室温で 1時間反応させた。 反応後、 各ゥエルを Tween- PBSで洗浄後、 1%BSA- PBSで 6000倍に希釈したぺ ルォキシダーゼ標識ャギ抗ヒト IgG ( y )抗体溶液 （American Qualex社製） を 二次抗体溶液として、 それぞれ 50 μ L/ゥエルで加え、 室温で 1時間反応させた。 反応後、 Tween - PBS で洗浄後、 ABTS基質液 （2， 2' -アジノ-ビス（3-ェチルベン ゾチアゾリン- 6 -スルホン酸）アンモユウムの 0. 55gを 1Lの 0. 1Mクェン酸緩衝 液 （ΡΗ4· 2) に溶解し、 使用直前に過酸化水素を l L/mL で添力 Πした溶液） を 50 μ ΐ ゥヱルで加えて発色させ、 20分後に 5%SDS溶液を 50 μ ΐ7ゥヱル加えて 反応を停止した。 その後 415nmの吸光度を測定した。
また、 培養上清中のヒト IgG抗体の産生濃度を比較するためには抗原として ャギ抗ヒト IgG ( y )抗体 （American Qualex社製） を PBSで 2000倍希釈したも のを使用した。
その結果を第 7図と第 8図に示した。 各ヒト化 CCR4CDR移植抗体はヒト型キ メラ抗体 KM2760とほぼ同等の活性を示した。
2. 抗 CCR4CDR移植抗体の動物細胞を用いた安定発現
上記参考例 1 の 2項 （3) で得られた抗 CCR4CDR移植抗体発現ベクターを用 いて抗 CCR4CDR移植抗体の動物細胞での発現を以下の様にして行った。
(1) ラットミエローマ細胞株 Y02/O細胞 （ATCC CRL1581) での安定発現
各ヒト化抗体発現プラスミドを制限酵素 Aatll (東洋紡績社製） で消化して 直線状化した後、 10 / g を 4 X 106細胞のラットミエローマ細胞株 YB2/0細胞 (ATCC CRL1581) へエレク ト口ポレーシヨ ン法 （Cytotechnology, 3, 133 (1990) ) により導入後、 40mL の H- SFM (GIBC0-BRL社製） 培地 （牛胎児血清 (FBS) を 5%添加） に懸濁し、 5%C02インキュベーター内で 37°Cで 1〜3日間培 養した後、 G418 (ナカライテスク社製） を lmg/mLになるように添加して 1〜2 週間培養し、 G418耐性の形質転換株を得た。 (2) 抗 CCR4CDR移植抗体の培養上清からの精製
G418 耐性を示す形質転換株が出現し、 コンフルェントになった時点で Daigo' s GF21 (和光純薬社製） を 5%の濃度で含む H- SFM 300〜1100mL の H - SFM培地に交換し、 さらに 3〜5 日間培養した。 コンフルェントになった時点で 培養上清を回収した。 培養上清約 300〜1100mL より Prosep- A (ミリポア社製） カラムを用いて、 添付の説明書に従い、 抗 CCR4CDR移植抗体を精製し、 精製蛋 白質を取得した。
3. 精製抗 CCR4CDR移植抗体の活性評価
(1) 抗 CCR4CDR移植抗体のヒト CCR4に対する結合活性の測定 （ELISA法） 参考例 2の 1項 （2) に記載の方法と同様に行った。 その結果を第 9図に示 した。 どの抗 CCR4CDR移植抗体もヒト型キメラ抗体 KM2760 とほぼ同程度の活 性を示した。
(2) 抗 CCR4CDR移植抗体のヒト CCR4高発現細胞との反応性 （蛍光抗体法） 参考例 1で得られた CCR4高発現細胞である CCR4/EL- 4細胞を 2 X 105個以上、
96 ゥエルプレートに分注した。 各精製抗体を FACS 用緩衝液 （1%BSA-PBS、 0. 02%EDTA、 0. 05%NaN3) にて lO /z g/mLに、 さらに非特異的な染色を防ぐため にヒトイムノグロプリン （ゥエルフアイドネ土製） を 3. 75mg/mL にそれぞれ希釈 した抗体溶液を 100 i L/ゥヱルとして加え、 氷中で 30分間反応させた。 陰性対 照としては、 抗ヒト IL - 5受容体 α鎖抗体 （TO97/10354) を同濃度で反応させ た。 FACS用緩衝液にて 200 μ!7ゥエルで 2回洗浄後、 ΡΕ標識抗ヒト IgG抗体 (コールター社製） を 100倍希釈したものを 50 /i L/ゥェルカ卩えた。 遮光し氷中 で 30分間反応後、 200 17ゥヱルで 3回洗浄し、 最終的に 500 i Lに懸濁して、 フローサイトメ一ターで蛍光強度を測定した。 その結果を第 10 図に示した。 どの抗 CCR4CDR移植抗体もヒト型キメラ抗体 KM2760 とほぼ同程度の活性を示 した。
(3) 抗 CCR4CDR移植抗体のヒト CCR4に対する結合活性の測定 （BIAcore法） さらに詳細な結合活性を測定するために、 精製した各種抗体の結合活性を BIAcore2000 (BIACORE社製） を用いて以下のように測定した。 なお、 試料の希 釈及び測定中の緩衝液としては HBS-EP (BIACORE社製） を使用した。 まずセン サーチップ SA (BIACORE社製） にビォチン化した CCR4部分ペプチドである化 合物 1の 0. 01 i g/mLの溶液 5 z Lを 5 L/分の流速で添加し、 センサーチップ に固定ィ匕した。
作製したピオチン化した化合物 1 の固定化センサーチップに、 精製した抗体 の 4 μ β/ιΛの溶液の 20 μ ίを 5 / L/分の流速で添加し、 添加終了後、 4分間に わたり解離反応をモニターした後、 lOmMの HC1の 5 しを 2回添加してセンサ 一チップ表面を再生した。 こうして化合物 1 に対する結合反応曲線 （センサー グラム） を得た。
その結果を第 11 図に示した。 縦軸は、 レゾナンス （共鳴） ユニット （RU) を表し、 センサーチップ上の質量変化を意味する。 例えば、 1000RUは蛋白質の 約 lng/mm2の質量変化に相当する。 KM2760は、 化合物 1に対して時間依存的な 結合活性を示し、 その結合は、 解離反応においてほとんど解離が認められない ことから、 極めて安定、 かつ、 高い結合活性を有することが示された。 一方、 各種抗 CCR4CDR移植抗体は、 ヒ ト型キメラ抗体 KM2760 とほぼ同程度の解離反 応を示したが、 CCR4部分べプチドである化合物 1への結合反応において若干の 活性低下が認められた。 CDRのみを移植した抗 CCR4CDR移植抗体 GalOLVOは、 最も低い結合活性を示し、 FRのアミノ酸残基の改変により、 結合活性は上昇し た。 以上の結果は、 マウス抗体 KM2160の CDRを適切なヒト抗体の FRに移植す ることにより、 マウス抗体の抗原結合活性おょぴ結合特異性を維持した抗 CCR4CDR移植抗体を作製可能であること、 さらに、 抗体 V領域の三次元構造等 を基に結合活性に重要な FRのアミノ酸残基を同定し、 それらを CDR とともに 移植することで、 より結合活性の高い抗 CCR4CDR移植抗体を作製できることを 示したものである。 本参考例で作製した抗 CCR4CDR移植抗体は、 CCR4に対する 高い結合活性を有し、 かつ、 ヒトにおいてマウス抗体、 さらには、 ヒト型キメ ラ抗体よりも免疫原性が低下し、 高い安全性と高い治療効果を示すことが期待 される。 産業上の利用可能性
本発明により、 間質性肺炎の予防薬、 診断薬または治療薬、 特に、 定型例特 発性間質性肺炎または膠原病における間質性肺炎の予防薬、 診断薬または治療 薬、 およぴ定型例特発性間質性肺炎と非定型例特発性間質性肺炎とを判別する 診断薬が提供される。 さらに、 本発明により、 定型例特発性間質性肺炎の非定 型例特発性間質性肺炎との判別方法を提供される。 配列フリーテキスト
配列番号 10—人工配列の説明 合成べプチド
配列番号 11一人工配列の説明 合成べプチド
配列番号 12—人工配列の説明 合成ぺプチド
配列番号 13—人工配列の説明 合成べプチド
配列番号 14一人工配列の説明 合成べプチド
配列番号 15—人工配列の説明 合成べプチド
配列番号 16—人工配列の説明 合成べプチド
配列番号 17—人工配列の説明 合成べプチド
配列番号 18—人工配列の説明 合成べプチド
配列番号 19一人工配列の説明 合成べプチド
配列番号 20—人工配列の説明 合成べプチド
配列番号 21—人工配列の説明 合成べプチド 配列番号 24- -人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 25- -人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 26- -人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 27- -人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 28- -人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 29- -人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 30- -人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 31 - -人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 32- -人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 33- -人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 34- -人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 35- -人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 37- -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 38- -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 39- -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 40- -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 41 - -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 42- -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 43- -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 44- -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 45- -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 46- -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 47- -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 48- -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 49- -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 50- -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 51 - -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 52- -人工配列の説明 合成腿 配列番号 54- -人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 55- -人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 56- -人工配列の説明 .合成 DNA 配列番号 57- -人工配列の説明 合成 DM 配列番号 58- -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 59- -人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 60- -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 61 - -人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 62- -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 63- -人工配列の説明 ：合成 DNA

Claims

請 求 の 範 囲
1. 抗 CCR4抗体および または抗 CXCR3抗体を有効成分として含有する、 間質性肺炎の予防薬、 診断薬または治療薬。
2. 間質性肺炎が、 定型例特発性間質性肺炎または非定型例特発性間質性 肺炎である、 請求の範囲 1記載の予防薬、 診断薬または治療薬。
3. 間質性肺炎が、 膠原病における間質性肺炎である、 請求の範囲 1 記載 の予防薬、 診断薬または治療薬。
4. 抗 CCR4抗体およぴ抗 CXCR3抗体とを有効成分として含有する、 定型例 特発性間質性月巿炎と非定型例特発性間質性肺炎とを判別する診新薬。
5. 抗 CCR4抗体が、 CCR4の細胞外領域に特異的に結合する抗体である、 請 求の範囲 1〜4のいずれか 1項に記載の予防薬、 診断薬または治療薬。
6. 細胞外領域が、 配列番号 1で示されるアミノ酸配列の 1〜39、 98〜： 112、 176〜206および 271〜284番目からなる群から選ばれる細胞外領域である、 請 求の範囲 5記載の予防薬、 診断薬または治療薬。
7. 細胞外領域が、 配列番号 1 で示されるァミノ酸配列の 2〜29番目に存 在するェピトープである、 請求の範囲 5記載の予防薬、 診断薬または治療薬。
8. 細胞外領域が、 配列番号 1で示されるァミノ酸配列の 13〜29番目に存 在するェピトープである、 請求の範囲 5記載の予防薬、 診断薬または治療薬。
9. 抗 CCR4抗体が、 ポリクローナル抗体、 モノクローナル抗体またはその 抗体断片である、 請求の範囲 1〜8 のいずれか 1項に記載の予防薬、 診断薬ま たは治療薬。
10. 抗 CCR4抗体が、 遺伝子組換え抗体またはその抗体断片である、 請求 の範囲 1〜8のいずれか 1項に記載の予防薬、 診断薬または治療薬。
11. 遺伝子,祖換え抗体が、 ヒト化抗体およびその抗体断片から選ばれる抗 体である、 請求の範囲 10記載の予防薬、 診断薬または治療薬。
12. ヒト化抗体またはその抗体断片が、
それぞれ配列番号 2、 3、 4で示されるアミノ酸配列からなる抗体重鎖 （H鎖） 可変領域 （V領域） の相補性決定領域 （CDR) 1、 CDR2、 CDR3、 および/または それぞれ配列番号 5、 6、 7で示されるアミノ酸配列からなる抗体軽鎖 （L鎖） V領域の CDR1、 CDR2、 CDR3
を含む、 請求の範囲 11記載の予防薬、 診断薬または治療薬。
13. ヒト化抗体が、 ヒ ト型キメラ抗体、 ヒト型相補性決定領：^ (CDR) 移 植抗体およびそれらの抗体断片から選ばれる抗体である、 請求の範囲 11 また は 12記載の予防薬、 診断薬または治療薬。
14. ヒト型キメラ抗体またはその抗体断片が、
CCR4に対するモノクローナル抗体の重鎖 （H鎖） 可変領域 （V領域） と軽鎖 (L鎖） V領域、 および
ヒト抗体の H鎖定常領域 （C領域） と L鎖 C領域
を含む、 請求の範囲 13記載の予防薬、 診断薬または治療薬。
15. ヒト型キメラ抗体またはその抗体断片が、
それぞれ配列番号 2、 3、 4で示されるアミノ酸配列からなる抗体重鎖 （H鎖） 可変領域 （V領域） の CDR1、 CDR2、 CDR3、 および/または
それぞれ配列番号 5、 6、 7で示されるアミノ酸配列からなる抗体軽鎖 （L鎖） V領域の CDR1、 CDR2、 CDR3
を含む、 請求の範囲 13または 14記載の予防薬、 診断薬または治療薬。
16. ヒト型キメラ抗体またはその抗体断片が、
配列番号 8で示されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖 （H鎖） 可変領域 （V 領域)、 および Zまたは
配列番号 9で示されるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖 （L鎖） V領域 を含む、 請求の範囲 13〜15のいずれか 1項に記載の予防薬、 診断薬または治
17. ヒト型キメラ抗体またはその抗体断片が、 形質転換体 KM2760 (FERM BP-7054) が生産する抗体 KM2760またはその抗体断片である、 請求の範囲 13〜 16のいずれか 1項に記載の予防薬、 診断薬または治療薬。
18. ヒト型 CDR移植抗体またはその抗体断片が、 CCR4に対するモノクロ一 ナル抗体の重鎖 （H鎖） 可変領域 （V領域） および軽鎖 （L鎖） V領域の CDRを 含む、 請求の範囲 13記載の予防薬、 診断薬または治療薬。
19. ヒト型 CDR移植抗体またはその抗体断片が、
CCR4に対するモノクローナル抗体の重鎖 （H鎖） 可変領域 （V領域） および 軽鎖 （L鎖） V領域の CDR、 および
ヒト抗体の H鎖 V領域おょぴ L鎖 V領域のフレームワーク領域 （FR) を含む、 請求の範囲 13記載の予防薬、 診断薬または治療薬。
20. ヒト型 CDR移植抗体またはその抗体断片が、
CCR4に対するモノクローナル抗体の重鎖 （H鎖） 可変領域 （V領域） および 軽鎖 （L鎖） V領域の CDR、
ヒ ト抗体の H鎖 V領域おょぴ L鎖 V領域のフレームワーク領域 （FR)、 およ ぴ
ヒ ト抗体の H鎖定常領域 （C領域） および L鎖 C領域
を含む、 請求の範囲 13記載の予防薬、 診断薬または治療薬。
21. ヒト型 CDR移植抗体またはその抗体断片が、
それぞれ配列番号 2、 3、 4で示されるアミノ酸配列からなる抗体重鎖 （H鎖） 可変領域 （V領域） の CDR1、 CDR2、 CDR3、 および Zまたは
それぞれ配列番号 5、 6、 7で示されるアミノ酸配列からなる抗体軽鎖 （L鎖） V領域の CDR1、 CDR2、 CDR3
を含む、 請求の範囲 13および 18〜20のいずれか 1項に記載の予防薬、 診断薬 または治療薬。
22. ヒト型 CDR移植抗体またはその抗体断片が、
配列番号 10で示されるアミノ酸配列のうち、 40番目の Ala、 42番目の Gly、 43番目の Lys、 44番目の Gly、 76番目の Lys、 および 97番目の Alaから選ば れる少なくとも 1つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸 配列を含む抗体の重鎖 （H鎖） 可変領域 （V領域)、 および または
配列番号 12で示されるアミノ酸配列のうち、 2番目の Ile、 3番目の Val、 50番目の Gln、 および 88番目の Valから選ばれる少なくとも 1つのアミノ酸 残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖 （L鎖） V 領域、 を含む、 請求の範囲 13および 18〜21のいずれか 1項に記載の予防薬、 診断薬 または治療薬。
23. ヒト型 CDR移植抗体またはその抗体断片が、
配列番号 11で示されるァミノ酸配列のうち、 28番目の Thrおよび 97番目の Alaから選ばれる少なくとも 1 つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換さ れたアミノ酸配列を含む抗体の重鎖 （H鎖） 可変領域 (V領域)、 およぴノまた は
配列番号 12で示されるアミノ酸配列のうち、 2番目の Ile、 3番目の Val、 50番目の Gln、 および 88番目の Valから選ばれる少なくとも 1つのアミノ酸 残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖 （L鎖） V 領域、
を含む、 請求の範囲 13および 18〜21のいずれか 1項に記載の予防薬、 診断薬 または治療薬。
24. ヒト型 CDR移植抗体またはその抗体断片が、
配列番号 10、 11、 13〜18 から選ばれるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖 （H 鎖） 可変領域 （V領域)、 およぴ または
配列番号 12、 19〜21 力 ら選ばれるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖 （L鎖） V 領域
を含む、 請求の範囲 13および 18〜21のいずれか 1項に記載の予防薬、 診断薬 または治療薬。
25. ヒト型 CDR移植抗体またはその抗体断片が、
配列番号 13 力 ら選ばれるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖 （H鎖） 可変領域 (V領域)、 および または
配列番号 21から選ばれるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖 （L鎖） V領域 を含む、 請求の範囲 13および 18〜21のいずれか 1項に記載の予防薬、 診断薬 または治療薬。
26. ヒト型 CDR移植抗体またはその抗体断片が、
配列番号 14 から選ばれるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖 （H鎖） 可変領域 (V領域）、 および/または
配列番号 21力 ら選ばれるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖 （L鎖） V領域 を含む、 請求の範囲 13および 18〜21のいずれか 1項に記載の予防薬、 診断薬 または治療薬。
27. ヒト型 CDR移植抗体またはその抗体断片が、 FERM BP- 8129 および FERM BP- 8130からなる群から選ばれる形質転換株から生産されるヒト型 CDR移 植抗体またはその抗体断片である、 請求の範囲 13および 18〜21のいずれか 1 項に記載の予防薬、 診断薬または治療薬。
28. 抗体断片が、 Fab、 Fab' , F (ab' ) 2、 1 本鎖抗体 （scFv)、 2量体化可変 領域 (V領域） 断片 (Diabody) , ジスルフィ ド安定ィヒ V領域断片 （dsFv) およ ぴ CDRを含むぺプチドから選ばれる抗体断片である、 請求の範囲 9〜27のいず れか 1項に記載の予防薬、 診断薬または治療薬。
29. 請求の範囲 9〜28のいずれか 1項に記載の抗体またはその抗体断片が、 放射性同位元素、 蛋白質または薬剤と化学的または遺伝子工学的に結合してい る、 請求の範囲 9〜28のいずれか 1項の予防薬、 診断薬または治療薬。
30. 抗 CCR4抗体おょぴ抗 CXCR3抗体を用いて試料中の Th2細胞と Thl細 胞とを検出および/または定量することを特徴とする、 定型例特発性間質性肺 炎と非定型例特発性間質性肺炎との判別方法。
31. 抗 CCR4抗体が、 CCR4の細胞外領域に特異的に結合する抗体である、 請求の範囲 30記載の方法。
32. 細胞外領域が、 配列番号 1で示されるアミノ酸配列の 1〜39、 98〜112、 176〜206および 271〜284番目からなる群から選ばれる細胞外領域である、 請 求の範囲 31記載の方法。 '
33. 細胞外領域が、 配列番号 1で示されるァミノ酸配列の 2〜29番目に存 在するェピトープである、 請求の範囲 31記載の方法。
34. 細胞外領域が、 配列番号 1 で示されるアミノ酸配列の 13〜29番目に 存在するェピトープである、 請求の範囲 31記載の方法。
35. 抗 CCR4抗体が、 ポリクローナル抗体、 モノクローナル抗体またはそ の抗体断片である、 請求の範囲 31〜34のいずれか 1項に記載の方法。
36. 抗 CCR4抗体が、 遺伝子組換え抗体またはその抗体断片である、 請求 の範囲 31〜34のいずれか 1項に記載の方法。
37. 遺伝子組換え抗体が、 ヒト化抗体おょぴその抗体断片から選ばれる抗 体である、 請求の範囲 36記載の方法。
38. ヒト化抗体またはその抗体断片が、
それぞれ配列番号 2、 3、 4で示されるアミノ酸配列からなる抗体重鎖 （H鎖） 可変領域 （V領域） の相補性決定領域 （CDR) 1、 CDR2, CDR3、 および/または それぞれ配列番号 5、 6、 7で示されるアミノ酸配列からなる抗体軽鎖 （L鎖） V領域の CDR1、 CDR2、 CDR3
を含む、 請求の範囲 37記載の方法。
39. ヒト化抗体が、 ヒト型キメラ抗体、 ヒ ト型相補性決定領域 （CDR) 移 植抗体およびそれらの抗体断片から選ばれる抗体である、 請求の範囲 37 また は 38記載の方法。
40. ヒト型キメラ抗体またはその抗体断片が、
CCR4に対するモノクローナル抗体の重鎖 （H鎖） 可変領域 （V領域） と軽鎖 (L鎖） V領域、 および
ヒト抗体の H鎖定常領域 （C領域） と L鎖 C領域
を含む、 請求の範囲 39記載の方法。
41. ヒト型キメラ抗体またはその抗体断片が、
それぞれ配列番号 2、 3、 4で示されるアミノ酸配列からなる抗体重鎖 （H鎖） 可変領域 （V領域） の CDR1、 CDR2、 CDR3、 および/または
それぞれ配列番号 5、 6、 7で示されるアミノ酸配列からなる抗体軽鎖 （L鎖） V領域の CDR1、 CDR2、 CDR3
を含む、 請求の範囲 39または 40記載の方法。
42. ヒト型キメラ抗体またはその抗体断片が、
配列番号 8で示されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖 （H鎖） 可変領域 （V 領域）、 およびノまたは
配列番号 9で示されるァミノ酸配列を含む抗体の軽鎖 （L鎖） V領域 を含む、 請求の範囲 39〜41のいずれか 1項に記載の方法。
43. ヒト型キメラ抗体またはその抗体断片が、 形質転換体 KM2760 (FERM BP- 7054) が生産する抗体 KM2760またはその抗体断片である、 請求の範囲 39〜 42のいずれか 1項に記載の方法。
44. ヒト型 CDR移植抗体またはその抗体断片が、 CCR4に対するモノクロ一 ナル抗体の重鎖 （H鎖） 可変領域 （V領域） および軽鎖 （L鎖） V領域の CDRを 含む、 請求の範囲 39記載の方法。
45. ヒト型 CDR移植抗体またはその抗体断片が、
CCR4に対するモノクローナル抗体の重鎖 （H鎖） 可変領域 （V領域） および 軽鎖 （L鎖） V領域の CDR、 および
ヒ ト抗体の H鎖 V領域おょぴ L鎖 V領域のフレームワーク領域 （FR) を含む、 請求の範囲 39記載の方法。
46. ヒト型 CDR移植抗体またはその抗体断片が、
CCR4に対するモノクローナル抗体の重鎖 （H鎖） 可変領域 （V領域） および 軽鎖 （L鎖） V領域の CDR、
ヒ ト抗体の H鎖 V領域および L鎖 V領域のフレームワーク領域 （FR)、 およ ぴ
ヒト抗体の H鎖定常領域 （C領域） および L鎖 C領域
を含む、 請求の範囲 39記載の方法。
47. ヒト型 CDR移植抗体またはその抗体断片が、
それぞれ配列番号 2、 3、 4で示されるアミノ酸配列からなる抗体重鎖 （H鎖） 可変領域 （V領域） の CDR1、 CDR2、 CDR3、 および Zまたは
それぞれ配列番号 5、 6、 7で示されるアミノ酸配列からなる抗体軽鎖 （L鎖） V領域の CDR1、 CDR2、 CDR3 を含む、 請求の範囲 39および 44〜46のいずれか 1項に記載の方法。
48. ヒト型 CDR移植抗体またはその抗体断片が、
配列番号 10で示されるアミノ酸配列のうち、 40番目の Ala、 42番目の Gly、 43番目の Lys、 44番目の Gly、 76番目の Lys、 および 97番目の Alaから選ば れる少なくとも 1つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸 配列を含む抗体の重鎖 （H鎖） 可変領域 （V領域）、 および/または
配列番号 12で示されるアミノ酸配列のうち、 2番目の Ile、 3番目の Val、 50番目の Gln、 および 88番目の Valから選ばれる少なくとも 1つのアミノ酸 残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖 （L鎖） V 領域、
を含む、 請求の範囲 39および 44〜47のいずれか 1項に記載の方法。
49. ヒト型 CDR移植抗体またはその抗体断片が、
配列番号 11で示されるアミノ酸配列のうち、 28番目の Thrおよび 97番目の Alaから選ばれる少なくとも 1 つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換さ れたアミノ酸配列を含む抗体の重鎖 （H鎖） 可変領域 （V領域)、 および Zまた は
配列番号 12で示されるアミノ酸配列のうち、 2番目の Ile、 3番目の Val、 50番目の Gln、 および 88番目の Valから選ばれる少なくとも 1つのアミノ酸 残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖 （L鎖） V 領域、
を含む、 請求の範囲 39および 44〜47のいずれか 1項に記載の方法。
50. ヒト型 CDR移植抗体またはその抗体断片が、
配列番号 10、 11、 13〜18 から選ばれるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖 （H 鎖） 可変領域 （V領域)、 および/または 配列番号 12、 19〜21 力 ら選ばれるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖 （L鎖） V 領域
を含む、 請求の範囲 39および 44〜47のいずれか 1項に記載の方法。
51. ヒト型 CDR移植抗体またはその抗体断片が、
配列番号 13 から選ばれるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖 （H鎖） 可変領域 (V領域)、 および/または
配列番号 21から選ばれるァミノ酸配列を含む抗体の軽鎖 （L鎖） V領域 を含む、 請求の範囲 39および 44〜47のいずれか 1項に記載の方法。
52. ヒト型 CDR移植抗体またはその抗体断片が、
配列番号 14 力 ら選ばれるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖 （H鎖） 可変領域 (V領域)、 および/または
配列番号 21から選ばれるァミノ酸配列を含む抗体の軽鎖 （L鎖） V領域 を含む、 請求の範囲 39および 44〜47のいずれか 1項に記載の方法。
53. ヒ ト型 CDR移植抗体またはその抗体断片が、 FERM BP- 8129 および FERM BP - 8130からなる群から選ばれる形質転換株から生産されるヒト型 CDR移 植抗体またはその抗体断片である、 請求の範囲 39および 44〜47のいずれか 1 項に記載の方法。
54. 抗体断片が、 Fab、 Fab\ F (ab' ) 2、 1 本鎖抗体 （scFv)、 2量体化可変 領域 （V領域） 断片 （Diab0dy)、 ジスルフィド安定化 V領域断片 （dsFv) およ ぴ CDR を含むペプチドから選ばれる抗体断片である、 請求の範囲 35〜53 のい ずれか 1項に記載の方法。
55. 請求の範囲 35〜54 のいずれか 1項に記載の抗体またはその抗体断片 力 放射性同位元素、 蛋白質または薬剤と化学的または遺伝子工学的に結合し ている、 請求の範囲 35〜54のいずれか 1項の方法。
PCT/JP2003/002372 2002-02-28 2003-02-28 Diagnostics et therapeutiques pour la pneumonie interstitielle Ceased WO2003072134A1 (fr)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP03743073A EP1491209A4 (en) 2002-02-28 2003-02-28 MEANS FOR DIAGNOSIS AND TREATMENT OF INTERSTITIAL PNEUMONIA
US10/505,980 US20050095242A1 (en) 2002-02-28 2003-02-28 Diagnostics and remedies for interstitial pneumonia
AU2003211550A AU2003211550A1 (en) 2002-02-28 2003-02-28 Diagnostics and remedies for interstitial pneumonia
JP2003570878A JPWO2003072134A1 (ja) 2002-02-28 2003-02-28 間質性肺炎の診断薬および治療薬

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2002054764 2002-02-28
JP2002-54764 2002-02-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2003072134A1 true WO2003072134A1 (fr) 2003-09-04

Family

ID=27764411

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2003/002372 Ceased WO2003072134A1 (fr) 2002-02-28 2003-02-28 Diagnostics et therapeutiques pour la pneumonie interstitielle

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20050095242A1 (ja)
EP (1) EP1491209A4 (ja)
JP (1) JPWO2003072134A1 (ja)
AU (1) AU2003211550A1 (ja)
WO (1) WO2003072134A1 (ja)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006046661A1 (ja) * 2004-10-28 2006-05-04 Osaka University インターロイキン－６阻害剤
WO2009148184A1 (ja) * 2008-06-05 2009-12-10 国立大学法人佐賀大学 特発性間質性肺炎の検出方法
WO2015147335A1 (ja) * 2014-03-27 2015-10-01 国立大学法人大阪大学 脳マラリアの診断および治療
WO2018168769A1 (ja) * 2017-03-14 2018-09-20 国立大学法人大阪大学 組織線維化バイオマーカー

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998011218A1 (en) * 1996-09-10 1998-03-19 Theodor-Kocher Institute Cxcr3 chemokine receptor, antibodies, nucleic acids, and methods of use
WO2001064754A1 (en) * 2000-03-03 2001-09-07 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Gene recombinant antibody and its fragment
WO2003018635A1 (fr) * 2001-08-31 2003-03-06 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Anticorps greffes cdr humains et fragments de ces anticorps

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6488930B1 (en) * 1999-01-15 2002-12-03 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Anti-CCR4 antibodies and methods of use therefor

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998011218A1 (en) * 1996-09-10 1998-03-19 Theodor-Kocher Institute Cxcr3 chemokine receptor, antibodies, nucleic acids, and methods of use
WO2001064754A1 (en) * 2000-03-03 2001-09-07 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Gene recombinant antibody and its fragment
WO2003018635A1 (fr) * 2001-08-31 2003-03-06 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Anticorps greffes cdr humains et fragments de ces anticorps

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CURRENT OPINION IN PULMONARY MEDICINE, vol. 7, no. 5, 2001, pages 255 - 261 *
CURRENT OPINION IN PULMONARY MEDICINE, vol. 7, no. 5, 2001, pages 309 - 313 *
DATABASE MEDLINE [online] BAUGHMAN R.P. ET AL.: "Nonsteriodal therapy for idiopathic pulmonary fibrosis", XP002975461, accession no. STN Database accession no. 21467902 *
DATABASE MEDLINE [online] COSTABEL U. ET AL.: "Bronchoaveolar lavage in interstitial lung disease", XP002975462, accession no. STN Database accession no. 21467894 *
MASAKO MURAI: "Th1/Th2/Balance seigyo ni okeru chemokine no yakuwari", IGAKU NO AYUMI, vol. 196, no. 12, 2001, pages 838 - 842, XP002975463 *
See also references of EP1491209A4 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006046661A1 (ja) * 2004-10-28 2006-05-04 Osaka University インターロイキン－６阻害剤
WO2009148184A1 (ja) * 2008-06-05 2009-12-10 国立大学法人佐賀大学 特発性間質性肺炎の検出方法
US8420310B2 (en) 2008-06-05 2013-04-16 Saga University Method for detection of idiopathic interstitial pneumonia
US9482676B2 (en) 2008-06-05 2016-11-01 Saga University Method for screening for a therapeutic agent for idiopathic interstitial pneumonia
WO2015147335A1 (ja) * 2014-03-27 2015-10-01 国立大学法人大阪大学 脳マラリアの診断および治療
WO2018168769A1 (ja) * 2017-03-14 2018-09-20 国立大学法人大阪大学 組織線維化バイオマーカー

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2003072134A1 (ja) 2005-06-16
EP1491209A4 (en) 2006-05-17
US20050095242A1 (en) 2005-05-05
AU2003211550A1 (en) 2003-09-09
EP1491209A1 (en) 2004-12-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4052515B2 (ja) ヒト型ｃｄｒ移植抗体およびその抗体断片
JP3926153B2 (ja) 遺伝子組換え抗体およびその抗体断片
JPWO2001064754A1 (ja) 遺伝子組換え抗体およびその抗体断片
EA031948B1 (ru) Антитело к il-36r или его антигенсвязывающий фрагмент, выделенный полинуклеотид, клетка-хозяин и способ получения этого антитела или его фрагмента, содержащая их фармацевтическая композиция и применение антитела или его фрагмента и композиции
JPWO2005028515A1 (ja) ヒトインスリン様成長因子に対する遺伝子組換え抗体
US9181332B2 (en) Anti-A(β) oligomer humanized antibody
JP6309050B2 (ja) ヒトｃｒｔｈ２に特異的に結合する抗体
EP3903816A1 (en) Bispecific antibody binding to tfr
WO2024260280A1 (en) Antibodies or antigen-binding fragments binding to nkg2a and uses thereof
TWI872319B (zh) 治療性結合分子
KR20190017740A (ko) 플렉틴-1 결합 항체 및 그의 용도
US20120020962A1 (en) Method of depleting regulatory t cell
EP1466623B1 (en) Anti-fgf-8 antibodies against arthritis
WO2003072134A1 (fr) Diagnostics et therapeutiques pour la pneumonie interstitielle
US20070172476A1 (en) Method of treating B-cell neoplasms or Hodgkin's lymphoma
IL314512A (en) Anti-human cxcl1 antibody
HK40113316A (en) Therapeutic binding molecules
HK40062464A (en) Bispecific antibody binding to tfr
HK1068543A (en) Remedies for arthritis
JPWO1999060025A1 (ja) 遺伝子組換え抗体

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NO NZ OM PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PT SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2003570878

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10505980

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2003743073

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2003743073

Country of ref document: EP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 2003743073

Country of ref document: EP