WO2003076648A1 - Amperometrischer dickschicht-biosensor zur bestimmung der wasserstoffperoxid-konzentration in einer lösung und verfahren zur herstellung des sensors - Google Patents

Amperometrischer dickschicht-biosensor zur bestimmung der wasserstoffperoxid-konzentration in einer lösung und verfahren zur herstellung des sensors Download PDF

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WO2003076648A1
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electrode
enzyme
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biosensor
electrodes
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Dorothea Pfeiffer
Dirk SCHÖNFUSS
Jan Szeponik
Ingrid Gall
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/004—Enzyme electrodes mediator-assisted

Definitions

  • Amperometric thick-film biosensor for determining the hydrogen peroxide concentration in a solution and method for producing the sensor
  • the invention relates to an inexpensive, simple and material-saving to manufacture and easy-to-use amperometric thick-film biosensor for the quantitative H 2 0 2 determination of low concentrations and a method for producing this sensor.
  • the biosensor according to the invention permits H 2 0 2 determination in the concentration range from 10 to 10,000 nM, in particular in the submicromolar range.
  • Amperometric biosensors which can be used to determine the concentration of certain substances in solutions, work on the basic principle that the reaction of the substance to be determined with a biological component, often an enzyme, is combined with the electrochemical detection mechanism.
  • This enzymatic-electrochemical detection mechanism is the reaction of a mediator substance with the enzyme in the final state after its reaction with the substance to be determined in such a way that that after the reaction of the enzyme and the mediator substance, the enzyme is again in its original state, while the mediator substance is in an oxidized or reduced state and can be converted back to its original state in an electrochemical reaction on an electrode.
  • the current flowing through the electrode in this electrochemical reaction is proportional to the concentration of the substance to be determined and can be measured.
  • TTF tetrathiafulvalene
  • the first embodiment variant of the sensor principle described in US Pat. No. 4,882,013 consists of a graphite foil disk on a substrate, which serves as an electrode and is glued into a glass tube.
  • a wire which is attached to the back of the graphite foil with silver-containing adhesive, is used for contacting.
  • This electrode is immersed in a TTF-containing solution for 2 hours and then air-dried for 60 minutes. The electrode is then immersed for 90 minutes in a solution of 1-cyclohexyl-3 (2-morpholinoethyl) carbodiimide metho-p-toluenesulfonate, which serves as a bifunctional ligand for the covalent attachment of the enzyme glucose oxidase (GOD).
  • GOD glucose oxidase
  • This electrode pretreated in this way, is rinsed with distilled water is immersed in a GOD solution for 60 minutes and is ready for use after rinsing again with a phosphate buffer.
  • the glucose biosensor produced in this way delivers a linear current signal in the concentration range up to 25 mM glucose. The smallest concentration measured with this sensor is 5 mM glucose. It is stored in a phosphate buffer solution.
  • the second embodiment consists of the TTF-modified electrode described above, to which a concentrated glucose dehydrogenase solution is applied, which is held on the surface by a modified dialysis membrane attached with a rubber ring.
  • the glucose biosensor produced in this way delivers a linear current signal in the concentration range up to 10 mM glucose. The smallest concentration measured with this sensor is 1 mM glucose.
  • the electrode described above is placed in an ethanolic for 15 minutes
  • the electrode is immersed in a periodate-oxidized GOD solution for 90 minutes and then immediately transferred to a buffer solution containing adipin dihydrazine. After 30 more minutes, the electrode can be washed with water rinsed and used or they are kept in a phosphate buffer solution.
  • the glucose biosensor produced in this way delivers a linear current signal in the concentration range up to 15 mM glucose. The smallest concentration measured with this sensor is 5 mM glucose.
  • TTF is a suitable mediator for the enzyme L-amino acid oxidase. It is also shown that significant electron transfer via TTF to an untreated glass-carbon electrode takes place when both TTF, GOD and glucose are in solution. The cyclic voltammogram shows a clear peak in an approx. 20 mM glucose solution.
  • Patent WO 98/35053 describes a sensor for the detection and measurement of an analyte in a biological fluid.
  • the sensor comprises two enzymes.
  • One embodiment of the sensor measures the hydrogen peroxide concentration, one for this thermostable peroxidase is used, which is immobilized in a redox hydrogel and in this way forms a sensitive layer on a working electrode.
  • This sensor also contains a second, hydrogen peroxide generating enzyme, which is isolated from the redox hydrogel layer and the electrode.
  • This second enzyme eg glucose oxidase or lactate oxidase
  • an analyte eg glucose or lactate
  • the second enzyme can be isolated from the electrode by placing an electrically insulating layer between the sensitive layer and the second enzyme layer.
  • the second enzyme can be immobilized in an inorganic polymeric matrix, which is preferably implemented in a sol-gel polymerization process. Further stabilization of the enzyme can be achieved by joint immobilization with a polyelectrolyte polymer in a sol-gel matrix.
  • WO 98/35053 relates to the field of thermostable enzyme sensors for different analytes.
  • Blood glucose and blood lactate are given as examples.
  • a decrease in sensitivity of 10% was found at a temperature of 37 ° C. It is particularly aimed at the field of application of the in vivo continuous measurements of blood glucose and blood lactate.
  • the sensor described is clearly not suitable for the detection of concentrations in the lower nanomolar range.
  • the applications described for the sensor are aimed at a concentration of the analyte in the millimolar range.
  • the sensitivity of the sensor is given as 0.8 nA / mM glucose and is therefore about 5 orders of magnitude worse than the required sensitivity. Due to the arrangement of the multilayer system and the resulting large layer thickness of the sensitive layer of the sensor, response times in the minute range can only be achieved.
  • the lengthy manufacturing process of the sensor is also particularly disadvantageous (cf. embodiment 1).
  • the object of the invention was to provide an inexpensive, easy-to-manufacture and therefore mass-production-compatible sensor for quantitative H 2 0 2 concentration determination in the submicromolar range, which is characterized by a short run-in phase.
  • the sensor should be easy to handle, easy to operate, robust against mechanical influences, durable and easy to store.
  • the object of the invention was also to provide a method for producing such a sensor.
  • a platinum or gold electrode is applied as a working electrode to a substrate, which is preferably a conventional ceramic substrate, for example from Ceramtec, Kyocera or Coors.
  • a silver electrode is printed as the counter electrode.
  • platinum pastes, gold pastes and silver pastes for example from Du Pont, Heraeus, ESL or Acheson, are available.
  • the associated contact paths and contact points can be printed, for example, with a silver / palladium paste or gold paste. Such pastes are also commercially available.
  • polymeric support e.g. based on polyimide or based on epoxy-impregnated glass fiber fabrics, e.g. FR-4 is used
  • polymeric printing pastes e.g. used by Acheson or DuPont to apply the electrodes.
  • the working electrode is produced using a Pt or Au paste.
  • carbon paste is usually used as an electrode material due to the large surface area or due to its electrochemical (large electrochemical overvoltage for the electrochemical oxygen and
  • a lacquer layer is printed as the electrically insulating material on the surfaces of the substrate not printed with the electrodes and on the applied contact tracks (but not on the contact points). It serves to isolate the conductor tracks.
  • the substrate-based 2-electrode system produced in this way comprising the working and counterelectrode, the contact tracks and contacting points and the lacquer layer, is also commercially available and is modified in accordance with the invention to form a highly sensitive biosensor for H 2 0 2 determination.
  • the printed silver electrode is now electrochemically modified before applying a polymer layer which immobilizes the mediator and enzyme.
  • an anodic current is passed through the silver electrode in a chloride-containing solution, whereby this is coated with a thin layer of silver chloride. This ensures that the reference electrode maintains an almost constant potential during the measuring process. If, on the other hand, you print a paste containing silver chloride, as is obvious, in order to produce a potential-stable electrode, the desired sensitivity of the biosensor is not achieved.
  • a mediator and an enzyme are preferred containing polymer layer applied to the electrodes.
  • the polymer layer is produced in such a way that a solution or suspension containing polymer, mediator and enzyme is applied uniformly both to the working electrode and to the counter electrode and the gap between the electrodes or only to the working electrode and allowed to dry.
  • the application and drying should preferably take place at a temperature of 18-35 ° C., preferably at 20 to 25 ° C.
  • the mediator and enzyme can be immobilized on the electrode in separate layers using a polymer in solution and / or as a suspension.
  • the mediator is preferably present in a solution to which the enzyme is then applied in a polymer layer.
  • Mediators are tetrathiafulvalene (TTF) or its derivatives, such as mono- and polycarboxylic acid derivatives or mono- and polyamino derivatives, ferrocene, hexacyanoferrate, N-methylphenazinium (NMP + ), methylacridinium (NMA) or 7, 7, 8, 8-tetracyano parachinodimethane ( TCNQ) used.
  • TTF tetrathiafulvalene
  • its derivatives such as mono- and polycarboxylic acid derivatives or mono- and polyamino derivatives
  • ferrocene hexacyanoferrate
  • NMP + N-methylphenazinium
  • NMA methylacridinium
  • TCNQ 7, 7, 8, 8-tetracyano parachinodimethane
  • Polyurethanes for example alipatic polycarbonate diurethanes, alipatic polyester urethanes, alipatic polyether urethanes, aromatic polyester urethanes, mixtures of these urethanes or mixtures of these urethanes with acrylates such as, for example, with anionic acrylates, nonionic acrylates, anionic methacrylates and modified anionic acrylates, are preferably used as polymers according to the invention. Polyacrylates can also be used.
  • Peroxidases are used as the enzyme. In a preferred embodiment according to the invention, the enzyme is horseradish peroxidase or soybean peroxidase. The enzyme is not required to be thermostable.
  • a solution or suspension is prepared that contains all three components.
  • solutions of the enzyme and the mediator are first prepared.
  • water, ethanol, ethyl acetate, dimethyl sulfoxide (DMSO), dimethyl formamide (DMF) and mixtures of these solvents are suitable for the solution of the enzyme and the mediator.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • DMF dimethyl formamide
  • These solutions are mixed with an aqueous suspension of the polymer. It has proven to be advantageous, e.g. Mix an aqueous peroxidase solution with an aqueous aliphatic polyurethane suspension and in turn mix this mixture with an alcoholic TTF solution containing ethyl acetate.
  • Enzyme, mediator or polymer concentrations of 0.5-2% are preferably used. Concentrations of 1-1.5% are particularly preferred for the enzyme and mediator. In a particularly preferred embodiment, the concentration of the polymer should be 1.5-2%.
  • H 2 0 2 biosensor has a run-in time of less than 30 minutes and H 2 0 2 concentrations in the Have the nanomolar range measured reliably.
  • the production of the basic sensor on the basis of screen printing in thick-film technology is a suitable and inexpensive method for mass production.
  • the immobilization of the enzyme and the mediator using a polymer saves time in one step and can also be automated.
  • the sensor has a long shelf life without special aids and can be stored well in a small size.
  • the present invention therefore also relates to a biosensor with the features of claim 8.
  • Advantageous embodiments of the biosensor are the subject of the subclaims.
  • the substrate (sensor body) 1 is planar and the sensor has the geometric configuration shown in FIGS. 1, 3 and 4, the electrodes 2, 3 having a round, angular or oval shape, preferably a round or ovale.
  • the size of the substrate 1 is from 2 to 400 mm 2 , preferably from 4 to 40 mm
  • FIGS. 3 and 4 are particularly advantageous in terms of material savings and cost-saving production. While the working and counter electrodes 2, 3 are arranged almost identically in the sensor variants in FIGS. 1, 3 and 4, the contact tracks 6 in the embodiment according to FIG. 3 lead from the working and reference electrodes 2, 3 to diagonally arranged contact points 7. who are in opposite corners of the rectangular sensor body 1 are located. Alternatively, as shown in FIG. 4, the contact points 7 can also be arranged on one side of the sensor body 1 (quasi parallel to one another), to which the respective contact tracks 6 then lead.
  • the sensor according to the invention can optionally be placed in a holder for better handling.
  • the polymer layer of the biosensor according to the invention contains the enzyme, the mediator and the polymer in a ratio (w / v) of 0.25-4: 0.25-4: 1, preferably 0.5-1.3 : 0.5 - 1.3: 1.
  • the sensor To operate the sensor, it is preferably fixed in a flow cell with a flow channel in such a way that the biosensor forms a wall of the flow channel and the working electrode covered with the sensitive polymer layer and part of the counter electrode are washed over by the sample.
  • the flow through the measuring cell is guaranteed by a pump with as little pulsation as possible.
  • a voltage is applied between the working electrode and the counter electrode and the resulting current is measured.
  • the measurement signals of the potentiostat can be recorded with analog or digital recording devices, e.g. a yt recorder.
  • the basic signal of the sensor is obtained when an H 2 0 2 -free solution is pumped through the measuring cell.
  • FIGS 1, 3 and 4 show the biosensor according to the invention in preferred embodiments.

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Abstract

Die Erfindung betrifft einen preiswerten, einfach und materialsparend zu fertigenden und leicht zu betreibenden amperometrischen Dickschicht-Biosensor zur quantitativen H202-Bestimmung in niedrigen Konzentrationen und ein Verfahren zur Herstellung dieses Sensors. Der erfindungsgemässe Biosensor erlaubt die H202-Bestimmung im Konzentrationsbereich von 10 bis 10.000 nM, insbesondere im submikromolaren Bereich.Der erfindungsgemässe Biosensor wird hergestellt, indem ein im Siebdruckverfahren hergestelltes 2-Elektrodensystem verwendet wird, das auf einem Substrat eine Platin- oder Goldelektrode als Arbeitselektrode, eine Silberelektrode als Gegen-elektrode, deren Kontaktbahnen und Kontaktierungspunkte und eine elektrisch isolierende Lackschicht aufweist, die die nicht mit den Elektroden bedruckten Flächen des Substrats und die aufgebrachten Kontaktbahnen bedeckt, die Silberelektrode des 2-Elektrodensystems elektrochemisch mit einer Silberchloridschicht überzogen wird, indem in einer chloridhaltigen Lösung ein anodischer Strom durch die Silberelektrode geleitet wird, danach eine Lösung oder Suspension, die ein Polymer, den Mediator und das Enzym enthält, homogen auf die Elektroden und deren Zwischenraum oder nur auf die Arbeitselektrode aufgebracht und getrocknet wird.

Description

Amperometrischer Dickschicht-Biosensor zur Bestimmung der Wasserstoffperoxid-Konzentration in einer Lösung und Verfahren zur Herstellung des Sensors
Beschreibung
Die Erfindung betrifft einen preiswerten, einfach und materialsparend zu fertigenden und leicht zu betreibenden amperometrischen Dickschicht-Biosensor zur quantitativen H202-Bestimmung von niedrigen Konzentrationen und ein Verfahren zur Herstellung dieses Sensors. Der erfindungsgemäße Biosensor erlaubt die H202-Bestimmung im Konzentrationsbereich von 10 bis 10.000 nM, insbesondere im submikromolaren Bereich.
Vor allem im medizinischen und umweltanalytischen Bereich ist es wünschenswert, über preiswerte und einer Massenfertigung leicht zugängliche Biosensoren zur H202- Bestimmung im submikromolaren Bereich zu verfügen.
Amperometrische Biosensoren, mit deren Hilfe die Konzentration von bestimmten Stoffen in Lösungen bestimmt werden kann, funktionieren nach dem Grundprinzip, dass die Reaktion des zu bestimmenden Stoffes mit einer biologischen Komponente, oft einem Enzym, mit dem elektrochemischen Detektionsmechanismus kombiniert wird. Dieser enzymatisch- elektrochemische Detektionsmechanismus ist die Reaktion einer Mediatorsubstanz mit dem Enzym im Endzustand nach seiner Reaktion mit dem zu bestimmenden Stoff in der Weise, dass nach der Reaktion des Enzyms und der Mediatorsubstanz das Enzym wieder in seinem ursprünglichen Zustand vorliegt, während die Mediatorsubstanz in einem oxidierten oder reduzierten Zustand vorliegt und in einer elektrochemischen Reaktion an einer Elektrode wieder in seinen Ausgangszustand überführt werden kann. Der bei dieser elektrochemischen Reaktion durch die Elektrode fließende Strom ist der Konzentration des zu bestimmenden Stoffes proportional und kann gemessen werden. Mit Hilfe einer Kalibration ist somit die quantitative Bestimmung von unbekannten Konzentrationen der zu bestimmenden Stoffe in Lösungen möglich.
Ein derartiges Sensor-Prinzip wird im Patent US 4,882,013 mit Tetrathiafulvalen (TTF) als Mediatorsubstanz in verschiedenen Ausführungsvarianten beschrieben.
Die in US 4,882,013 beschriebene erste Ausführungsvariante des Sensor-Prinzips besteht aus einer Graphitfolien-Scheibe auf einem Substrat, die als Elektrode dient und in ein Glasrohr eingeklebt ist. Ein Draht, welcher mit silberhaltigem Klebstoff an der Rückseite der Graphitfolie befestigt ist, dient der Kontaktierung. Diese Elektrode wird für 2 Stunden in eine TTF-haltige Lösung getaucht und danach 60 Minuten an der Luft getrocknet. Danach wird die Elektrode für 90 Minuten in eine Lösung von 1-Cyclohexyl- 3 (2-morpholinoethyl) carbodiimidmetho-p-toluensulfonat getaucht, welches als bifunktioneller Ligand für die kovalente Anbindung des Enzyms Glucoseoxidase (GOD) dient. Diese so vorbehandelte Elektrode wird nach Abspülen mit destilliertem Wasser 60 Minuten in eine GOD-Lösung getaucht und ist nach abermaligem Spülen mit einem Phosphat-Puffer einsatzbereit. Der so angefertigte Glucose- Biosensor liefert im Konzentrationsbereich bis 25 mM Glucose ein lineares Stromsignal. Die kleinste mit diesem Sensor gemessene Konzentration beträgt 5 mM Glucose. Die Aufbewahrung erfolgt in einer Phosphat-Puffer-Lösung.
Die zweite Ausführungsvariante besteht aus der oben beschriebenen TTF-modifizierten Elektrode, auf die eine konzentrierte Glucosedehydrogenase-Lösung appliziert wird, welche durch eine mit einem Gummiring befestigte modifizierte Dialyse - Membran auf der Oberfläche gehalten wird. Der so angefertigte Glucose-Biosensor liefert im Konzentrations-bereich bis 10 mM Glucose ein lineares Stromsignal . Die kleinste mit diesem Sensor gemessene Konzentration beträgt 1 mM Glucose.
Eine weitere Ausführungsvariante mit einer verbesserten Enzyπiimmobilisierung nutzt die Möglichkeit, GOD über seine
Kohlenhydratketten aneinander und an die
Elektrodenoberfläche zu binden. Dazu wird die oben beschriebene Elektrode 15 Minuten in eine ethanolische
Lösung von Hexadecylamin getaucht und danach getrocknet . Die trockene Elektrode wird dann 1 Stunde in eine TTF-
Lösung getaucht und wiederum getrocknet . Nach dieser
Prozedur wird die Elektrode für 90 Minuten in eine periodatoxidierte GOD Lösung getaucht und danach umgehend in eine Adipin Dihydrazin-haltige Pufferlösung überführt. Nach 30 weiteren Minuten kann die Elektrode mit Wasser gespült und eingesetzt werden oder man bewahrt sie in einer Phosphat-Puffer-Lösung auf. Der so angefertigte Glucose- Biosensor liefert im Konzentrations-bereich bis 15 mM Glucose ein lineares Stromsignal. Die kleinste mit diesem Sensor gemessene Konzentration beträgt 5 mM Glucose.
Es wird weiterhin erwähnt, dass TTF ein geeigneter Mediator für das Enzym L-Aminosäureoxidase ist . Außerdem wird gezeigt, dass ein signifikanter Elektronentransfer über TTF zu einer unbehandelten Glas-Kohle-Elektrode erfolgt, wenn sowohl TTF, GOD sowie Glucose in Lösung vorliegen. Das Cyclovoltammogramm zeigt in einer ca. 20 mM Glucoselösung einen deutlichen Peak.
Der in US 4,882,013 vorgeschlagene Aufbau von Sensoren, d.h. von auf Kohlenstoff basierenden Elektroden, auf denen Enzyme und Mediatoren immobilisiert sind, so dass mit ihnen ohne weitere Zusätze Stoffkonzentrationen in Lösungen bestimmt werden können, bringt wesentliche Nachteile mit sich. Der Aufbau ist kompliziert, sehr zeitaufwendig und damit teuer und für eine Massenproduktion ungeeignet. Mit den resultierenden Sensoren können nur Konzentrationen im Bereich von 1-25 mM bestimmt werden. Die fertigen Sensoren müssen in einer Pufferlösung aufbewahrt werden.
Das Patent WO 98/35053 beschreibt einen Sensor für den Nachweis und die Messung eines Analyten in einer biologischen Flüssigkeit. Der Sensor umfasst zwei Enzyme. Eine Ausführungsform des Sensors misst die Wasserstoffperoxid-Konzentration, wobei hierfür eine thermostabile Peroxidase benutzt wird, welche in einem Redox-Hydrogel immobilisiert ist und auf diese Weise eine sensitive Schicht auf einer Arbeitselektrode bildet. Dieser Sensor beinhaltet weiterhin ein zweites, Wasserstoffperoxid generierendes Enzym, das von der Redox-HydrogelSchicht und der Elektrode isoliert ist. Dieses zweite Enzym (z.B. Glucoseoxidase oder Lactatoxidase) generiert Wasserstoffperoxid in Abhängigkeit von der Anwesenheit eines Analyten (z.B. Glucose oder Lactat) oder einer aus dem Analyten gebildeten Verbindung. Das zweite Enzym kann von der Elektrode isoliert werden, indem eine elektrisch isolierende Schicht zwischen sensitive Schicht und zweite Enzymschicht gebracht wird. Alternativ kann das zweite Enzym in einer anorganischen polymeren Matrix immobilisert werden, was vorzugsweise in einem Sol-Gel- Polymerisationsprozess realisiert wird. Eine weitere Stabilisierung des Enzyms kann durch die gemeinsame Immobilisierung mit einem Polyelektrolyt-Polymer in einer Sol-Gel-Matrix erreicht werden.
WO 98/35053 betrifft das Gebiet thermostabiler Enzym- Sensoren für unterschiedliche Analyte . Als Beispiele sind Blut-Glucose und Blut-Lactat angeführt. Bei den beschriebenen Sensoren wurde bei einer Temperatur von 37°C eine Abnahme der Empfindlichkeit von 10% festgestellt. Es wird insbesondere auf das Einsatzfeld der in vivo kontinuierlichen Messungen von Blut-Glucose und Blut-Lactat abgezielt . Der beschriebene Sensor ist eindeutig nicht für die Detektion von Konzentrationen im unteren nanomolaren Bereich geeignet . Die beschriebenen Anwendungen für den Sensor zielen auf eine Konzentration des Analyten im millimolaren Bereich ab. Im Ausführungsbeispiel 15 wird die Empfindlichkeit des Sensors mit 0,8 nA/mM Glucose angegeben und ist damit um etwa 5 Größenordnungen schlechter als die geforderte Empfindlichkeit. Aufgrund der Anordnung des Mehrschichtsystems und der daraus resultierenden großen Schichtdicke der sensitiven Schicht des Sensors können lediglich Ansprechzeiten im Minuten-Bereich erzielt werden. Als besonders nachteilig ist auch das langwierige Herstellungsverfahren des Sensors einzuschätzen (vgl. Ausführungsbeispiel 1) .
Aufgabe der Erfindung war es, einen preiswerten, einfach zu fertigenden und somit massenproduktionstauglichen Sensor für die quantitative H202-Konzentrationsbestimmung im submikromolaren Bereich bereitzustellen, der sich durch eine kurze run in-Phase auszeichnet. Der Sensor soll einfach handhabbar, leicht zu betreiben, robust gegenüber mechanischen Einflüssen, haltbar und ohne großen Aufwand lagerfähig sein. Aufgabe der Erfindung war es auch, ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Sensors anzugeben.
Überraschenderweise hat sich gezeigt, dass sich ein solcher H202-Sensor gemäß den kennzeichnenden Merkmalen des Anspruchs 1 herstellen lässt. Vorteilhafte Ausgestaltungen des Herstellungsverfahrens sind Gegenstand der Unteransprüche . Zur Herstellung des 2-Elektrodensystems wird im Siebdruckverfahren auf ein Substrat, das vorzugsweise ein übliches Keramiksubstrat, z.B. der Firmen Ceramtec, Kyocera oder Coors ist, eine Platin- oder Goldelektrode als Arbeitselektrode aufgebracht. Als Gegenelektrode wird eine Silberelektrode aufgedruckt. Dazu stehen entsprechende kommerziell erhältliche Platin-Pasten, Gold-Pasten und Silber-Pasten z.B. der Firmen Du Pont, Heraeus, ESL oder Acheson zur Verfügung. Die zugehörigen Kontaktbahnen und Kontaktierungspunkte können z.B. mit einer Silber/Palladium-Paste oder Goldpaste aufgedruckt werden. Auch solche Pasten sind kommerziell erhältlich.
Wird als Substrat ein polymerer Träger, z.B. auf Polyimidbasis oder auf Basis von epoxidharzgetränkten Glasfasergeweben, z.B. FR-4 verwendet, so werden polymere Druckpasten z.B. von den Firmen Acheson oder DuPont zum Aufbringen der Elektroden eingesetzt.
Zum Erreichen der angestrebten Sensitivität ist es erfindungswesentlich, dass die Arbeitselektrode mittels einer Pt- oder Au-Paste hergestellt wird. Im Gegensatz dazu wird üblicherweise aufgrund der großen Oberfläche Kohlepaste als Elektrodenmaterial oder aufgrund seiner elektrochemischen (große elektrochemische Überspannung für die elektrochemische Sauerstoff- und
Wasserstoffentwicklung) und chemischen Eigenschaften
(Möglichkeit der chemischen Immobilisierung von Enzymen auf der Elektrodenoberfläche) Kohlenstoff als Elektrodenmaterial verwendet .
Auf die nicht mit den Elektroden bedruckten Flächen des Substrates und auf die aufgebrachten Kontaktbahnen (aber nicht auf die Kontaktierungspunkte) wird als elektrisch isolierendes Material eine Lackschicht aufgedruckt. Sie dient der Isolation der Leiterbahnen.
Das so hergestellte substratbasierte 2 -Elektrodensystem aus Arbeits- und Gegenelektrode, den Kontaktbahnen und Kontaktierungspunkten und der Lackschicht ist auch kommerziell erhältlich und wird gemäß der Erfindung zum hochsensitiven Biosensor zur H202-Bestimmung modifiziert.
Erfindungsgemäß wird nun die aufgedruckte Silberelektrode vor Aufbringen einer Polymerschicht, die Mediator und Enzym immobilisiert, elektrochemisch modifiziert. Dazu wird in einer chloridhaltigen Lösung ein anodischer Strom durch die Silberelektrode geleitet, wobei sich diese mit einer dünnen Silberchloridschicht überzieht. Dadurch wird erreicht, dass die Referenzelektrode beim Messprozess ein nahezu konstantes Potential behält. Druckt man dagegen, wie es nahe liegt, eine silberchloridhaltige Paste auf, um eine potentialstabile Elektrode zu erzeugen, so wird die gewünschte Sensitivität des Biosensors nicht erreicht.
Die Immobilisierung von Mediator und Enzym unter
Einbeziehung eines Polymers kann wie folgt durchgeführt werden. Bevorzugt wird die einen Mediator und ein Enzym enthaltende Polymerschicht auf die Elektroden aufgebracht . Die Polymerschicht wird in der Weise hergestellt, dass eine Lösung oder Suspension, die Polymer, Mediator und Enzym enthält, gleichmäßig sowohl auf die Arbeitselektrode als auch auf die Gegenelektrode und den Zwischenraum zwischen den Elektroden oder nur auf die Arbeitselektrode aufgebracht und eintrocknen gelassen wird. Vorzugsweise sollte das Aufbringen und Trocknen bei einer Temperatur von 18-35°C erfolgen, bevorzugt bei 20 bis 25°C. Alternativ können Mediator und Enzym in getrennten Schichten unter Verwendung eines Polymers in Lösung und/oder als Suspension auf die Elektrode immobilisiert werden. Bevorzugt liegt der Mediator in einer Lösung vor, auf die dann das Enzym in einer Polymerschicht aufgebracht wird.
Als Mediatoren werden Tetrathiafulvalen (TTF) oder seine Derivate, wie z.B. Mono- und Polycarbonsäurederivate oder Mono- und Polyaminoderivate, Ferrocen, Hexacyanoferrat , N- Methylphenazinium (NMP+) , Methylacridinium (NMA) oder 7, 7, 8, 8-Tetracyanparachinodimethan (TCNQ) eingesetzt.
Als Polymer finden erfindungsgemäß bevorzugt Polyurethane, z.B. alipatische Polycarbonatdiolurethane, alipatische Polyesterurethane, alipatische Polyetherurethane, aromatische Polyesterurethane, Mischungen dieser Urethane oder Mischungen dieser Urethane mit Acrylaten wie z.B. mit anionischen Acrylaten, nichtionischen Acrylaten, anionischen Methacrylaten und modifizierten anionoschen Acrylaten Verwendung. Auch Polyacrylate können eingesetzt werden . Als Enzym finden Peroxidasen Verwendung. In einer erfindungsgemäß bevorzugten Ausführungsform ist das Enzym Meerrettich-Peroxidase oder Sojabohnen-Peroxidase. Es ist nicht erforderlich, dass das Enzym thermostabil ist.
Je nach eingesetztem Polymer, Mediator und Enzym wird eine Lösung oder eine Suspension hergestellt, welche alle drei Komponenten enthält . Dazu werden zunächst Lösungen des Enzyms und des Mediators hergestellt. Für die Lösung des Enzyms und des Mediators eignen sich, je nach dem, welches Enzym und welcher Mediator verwendet werden, Wasser, Ethanol , Essigsäureethylester, Dimethylsulfoxid (DMSO) , Dimethyl-formamid (DMF) und Mischungen aus diesen Lösungsmitteln. Diese Lösungen werden mit einer wassrigen Suspension des Polymers vermischt. Als vorteilhaft hat es sich erwiesen, zunächst z.B. eine wässrige Peroxidaselösung mit einer wassrigen aliphatischen Polyurethan-Suspension zu mischen und dieses Gemisch wiederum mit einer essigsaureethyl-esterhaltigen alkoholischen TTF-Lösung zu vermischen. Bevorzugt werden Enzym-, Mediator- oder Polymerkon-zentrationen von 0,5 - 2% eingesetzt. Für Enzym und Mediator sind Konzentrationen von 1 - 1,5% besonders bevorzugt. Die Konzentration des Polymers sollte in einer besonders bevorzugten Ausführungsform 1,5 - 2% betragen.
Es hat sich gezeigt, dass der gemäß dem erfindungsgemäßen
Verfahren hergestellte H202-Biosensor eine run-in Zeit von weniger als 30 Minuten hat und sich H202-Konzentrationen im nanomolaren Bereich zuverlässig messen lassen. Die Herstellung des Grundsensors auf der Basis des Siebdruckes in Dickschichttechnologie ist ein für eine Massenproduktion geeignetes und preiswertes Verfahren. Die Immobilisierung des Enzyms und des Mediators mit Hilfe eines Polymers erfolgt zeitsparend in einem Schritt und lässt sich ebenfalls automatisieren. Der Sensor ist ohne besondere Hilfsmittel lange haltbar und bei geringer Größe gut lagerbar .
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch ein Biosensor mit den Merkmalen des Anspruchs 8. Vorteilhaf e Ausgestaltungen des Biosensors sind Gegenstand der Unteransprüche. In einer bevorzugten geometrischen Ausgestaltung ist das Substrat (Sensorkörper) 1 planar und der Sensor weist die in den Figuren 1, 3 und 4 dargestellte geometrische Ausgestaltung auf, wobei die Elektroden 2,3 eine runde, eckige oder ovale Form besitzen, vorzugsweise eine runde oder ovale. Die Größe des Substrats 1 beträgt erfindungsgemäß von 2 bis 400 mm2, bevorzugt von 4 bis 40 mm
Die in Fig. 3 und 4 dargestellten geometrischen Ausgestaltungen sind insbesondere unter dem Aspekt der Material- einsparung und der kostensparenden Herstellung vorteilhaft. Während in den Sensorvarianten der Figuren 1 , 3 und 4 Arbeits- und Gegenelektrode 2,3 nahezu gleich angeordnet sind, führen die Kontaktbahnen 6 in der Ausgestaltung gemäß Fig. 3 von der Arbeits- und der Referenzelektrode 2,3 zu diagonal angeordneten Kontaktpunkten 7, die sich in gegenüberliegenden Ecken des rechteckigen Sensorkörpers 1 befinden. Alternativ, wie in Fig. 4 dargestellt, können die Kontaktpunkte 7 auch auf einer Seite des Sensorkörpers 1 (quasi parallel zueinander) angeordnet sein, zu denen dann die jeweiligen Kontaktbahnen 6 führen. Der erfindungsgemäße Sensor kann zum besseren Handling wahlweise in eine Halterung eingebracht werden.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung enthält die Polymerschicht des erfindungsgemäßen Biosensors das Enzym, den Mediator und das Polymer im Verhältnis (w/v) von 0,25 - 4 : 0,25 - 4 : 1, vorzugsweise von 0,5 - 1,3 : 0,5 - 1,3 : 1.
Zum Betrieb des Sensors wird dieser bevorzugt in einer Durchflusszelle mit einem Strömungskanal so fixiert, dass der Biosensor eine Wand des Strömungskanals bildet und die mit der sensitiven Polymerschicht bedeckte Arbeitselektrode und ein Teil der Gegenelektrode von der Probe überspült werden. Der Fluss durch die Messzelle wird durch eine möglichst pulsationsarme Pumpe gewährleistet. Mit Hilfe des Potentiostaten wird zwischen Arbeitselektrode und Gegenelektrode eine Spannung angelegt und der resultierende Strom gemessen. Die Messsignale des Potentiostaten können mit analogen oder digitalen AufZeichnungsgeräten, z.B. einem y-t-Schreiber, aufgezeichnet werden. Das Grundsignal des Sensors erhält man, wenn man eine H202- freie Lösung durch die Messzelle pumpt. Wird eine H202-haltige Lösung durch die Messzelle gepumpt, erhält man ein der Analytkonzentration entsprechendes Sensorsignal. Die mit zehn erfindungsgemäßen Biosensoren ermittelten Messwerte bei H202-Konzentrationen von 15 nM bis 2.000 nM gemäß Fig. 2 zeigen, dass die Abhängigkeit des Biosensorsignals in diesem Bereich der H202-Konzentration linear ist und damit der Biosensor leicht kalibrierbar ist.
Untersuchungen zur Haltbarkeit des Sensors haben gezeigt, dass bei einer trockenen Lagerung im Kühlschrank bei 4°C nach 3 Monaten kein signifikanter Empfindlichkeitsverlust auftritt .
Figuren 1, 3 und 4 zeigen den erfindungsgemäßen Biosensor in bevorzugten Ausführungsformen.
Es bedeuten:
1 - Substrat (Sensorkörper)
2 - Platin- oder Goldarbeitselektrode
3 - Ag/AgCl-Referenzelektrode 4 - Lackschicht
5 - Zwischenraum zwischen den Elektroden
6 - Kontaktbahnen der Elektroden
7 - Kontaktpunkte
Fig. 2 zeigt die durchschnittlichen Messwerte, die mit zehn erfindungsgemäßen Biosensoren (Arbeitselektrode Platin, Gegenelektrode Ag/AgCl, Keramiksubstrat, Enzym Peroxidase, Mediator TTF, Polymer Polyurethan) erhalten wurden. Es wurden Probelösungen unterschiedlicher H202-Konzentrationen von 15 nM bis 2.000 nM in 0,033 M chloridhaltigem Phospatpuffer (pH=7,l) vermessen. Das an die Arbeitselektrode angelegte Potential betrug - 100mV vs . Ag/AgCl .

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung eines amperometrischen Biosensors zur Bestimmung der Wasserstoffperoxid- Konzentration unter Verwendung eines dickschicht- technologisch hergestellten 2 -Elektrodensystems auf einem Substrat und Aufbringen eines Enzyms und eines Mediators auf die Elektroden, wobei ein im Siebdruckverfahren hergestelltes 2- Elektrodensystem verwendet wird, das auf einem Substrat eine Platin- oder Goldelektrode als Arbeitselektrode, eine Silberelektrode als Gegenelektrode, deren Kontaktbahnen und Kontaktierungspunkte, und eine elektrisch isolierende Lackschicht aufweist, die die nicht mit den Elektroden bedruckten Flächen des Substrats und die aufgebrachten Kontaktbahnen bedeckt, die Silberelektrode des 2- Elektrodensystems elektrochemisch mit einer Silberchloridschicht überzogen wird, indem in einer chloridhaltigen Lösung ein anodischer Strom durch die Silberelektrode geleitet wird, danach ein Polymer, der Mediator und das Enzym in einer Lösung oder einer Suspension oder in getrennten Lösungen und/oder getrennten Suspensionen homogen auf die Elektroden und deren Zwischenraum oder nur auf die Arbeitselektrode aufgebracht und getrocknet wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass als Mediator Tetrathiafulvalen (TTF) oder dessen Derivate verwendet werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Polymer ein Polyurethan oder ein Polyacrylat oder eine Mischung aus diesen Polymeren verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Enzym eine Peroxidase verwendet wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung oder Suspension das Enzym, den Mediator und das Polymer in einer Konzentration von je 0,5 - 2% enthält .
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Aufbringen und Trocknen der den Mediator, das Enzym und das Polymer enthaltenden Lösung oder Suspension bei einer Temperatur von 18-35°C vorgenommen wird.
7. Amperometrischer Dickschicht-Biosensor zur Bestimmung der Wasserstoffperoxid-Konzentration in einer Lösung hergestellt nach einem der Ansprüche 1 bis 6.
8. Amperometrischer Dickschicht-Biosensor zur Bestimmung der Wasserstoffperoxid-Konzentration in einer Lösung, umfassend ein Substrat (1) , eine auf das Substrat aufgedruckte Platin- oder Gold-Arbeitselektrode (2) , eine aufgedruckte Silber-Gegenelektrode (3) , die mit einer Silberchloridschicht bedeckt ist, eine isolierende Lackschicht (4) , die die nicht mit den Elektroden (2,3) bedruckten Flächen des Substrats (1) und die Kontaktbahnen (6) der Elektroden bedeckt, eine homogene Polymerschicht, die ein Enzym und einen Mediator enthält und die Elektroden (2,3) und deren Zwischenraum (5) bedeckt.
9. Biosensor nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymerschicht aus einem Polyurethan oder einem Polyacrylat oder einer Mischung aus diesem Polymeren besteht .
10. Biosensor nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das in der Polymerschicht enthaltene Enzym eine Peroxidase ist .
11. Biosensor nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der in der Polymerschicht enthaltene Mediator
Tetrathiafulvalen (TFF) oder dessen Derivate sind.
12. Biosensor nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymerschicht das Enzym, den Mediator und das
Polymer im Verhältnis (w/v) von 0,25 - 4 : 0,25 - 4 : 1, vorzugsweise von 0,5 - 1,3 : 0,5 - 1,3 : 1, enthält .
13. Biosensor nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat (1) eine Größe von 2 bis 400 mm2 aufweist, vorzugsweise von 4 bis 40 mm2.
14. Biosensor nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Elektroden (2,3) eine runde, ovale oder eckige Form besitzen, vorzugsweise eine runde oder ovale.
15. Biosensor nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Kontaktbahnen 6 und die Kontaktpunkte 7 so angeordnet sind, dass sich die beiden Kontaktpunkte 7 auf einer Diagonalen jeweils in der entgegengesetzten Ecke des Sensorkörpers 1 befinden.
6. Biosensor nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Kontaktbahnen 6 und die Kontaktpunkte 7 so angeordnet sind, dass die beiden Kontaktpunkte 7 sich an einer Seite des Sensorkörpers 1 (parallel zueinander) befinden.
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