WO2003078631A1 - Nouveaux genes - Google Patents

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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals

Definitions

  • the present invention relates to a technique for detecting insulin-producing cells that are growing from a tissue or a cell population composed of a plurality of cell types.
  • the present invention relates to a technique for proliferating insulin-producing ⁇ cells and their precursor cells, or cells related to knee ⁇ cells, such as nerve cells.
  • Knee ⁇ cells are the organs that produce insulin, the only peptide hormone that lowers blood sugar. If the insulin-producing ability of the extracted ⁇ -cells is impaired, it is impossible to maintain a normal blood glucose level and diabetes will occur. Transplantation of cells with insulin-producing ability is a fundamental therapy to restore insulin-producing ability and normal control of blood sugar level in diabetic patients with impaired insulin-producing ability.
  • Sources of insulin-producing cells may be the cadaver's knee, or cells that have insulin-producing ability differentiated from embryonic stem cells (ES cells) or mesenchymal stem cells that are about to be put into practical use in the near future.
  • ES cells embryonic stem cells
  • mesenchymal stem cells that are about to be put into practical use in the near future.
  • Embryonic stem cells are cells derived from the inner cell mass of blastocysts and have the ability to differentiate into almost all tissues and cells.
  • Mesenchymal stem cells are multipotent cells found in bone marrow, blood, dermis, periosteum and the like. In recent years, it has been shown that cells having functions such as insulin-producing cells, nerve cells, and cardiomyocytes can be artificially differentiated from these cells in vitro and in vivo.
  • HGF Hetpatocytegrowth Factor
  • Reg protein a cell differentiation factor
  • petacellulin is made to act on cells serving as a source (O tonkoski et al. Natiabe et al., Proc. Natl. Ac ad. Sci. 91, 3589-35 92, 1994, Yamamoto et al., Diabetes, Vol. 43, 947-953, 1994. 49, 2021-2027, 2000) Power S, To date, no factors have been found that can be applied to actual treatment.
  • HGF Hetpatocytegrowth Factor
  • the problem to be solved by the present invention is a method for detecting a cell of interest, that is, a insulin-producing cell having a proliferative ability, from a cell population containing the number of insulin-producing cells required for treatment using cell differentiation, growth factors, and the like. Further, it is to provide a method for selecting them, and to treat insulin-producing cells, ie, down
  • the present invention relates to a novel gene that is specifically expressed in the knee of a PHHI patient, a protein translated from the gene, and a method for using the same.
  • the protein of the present invention is (1) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 2 or 3, or (2) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 2 or 3. is there.
  • the novel gene of the present invention comprises (1) a DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 2 or 3, and (2) a base sequence represented by SEQ ID NO: 4, 5 or 6.
  • DNA (3) DNA consisting of the nucleotide sequence at positions 174 to 904 of SEQ ID NO: 4, DNA consisting of the nucleotide sequence at positions 79 to 21 of SEQ ID NO: 5, or the nucleotide sequence at positions 28 to 384 of SEQ ID NO: 6
  • novel genes and proteins of the present invention can be used by: (1) a method for detecting growing insulin-producing cells using the novel DNA of the present invention; (2) a method for detecting a vector incorporating a novel DNA. (3) a method of introducing the novel DNA into primary cultured cells or established cell lines containing embryonic stem cells or mesenchymal stem cells to differentiate the embryonic stem cells or mesenchymal stem cells, (4) A method in which novel DNA is introduced into primary cultured cells or established cell lines containing embryonic stem cells or mesenchymal stem cells to proliferate embryonic stem cells or mesenchymal stem cells.
  • the embryonic stem cells or the mesenchymal stem cells are cells having a physiological function of a living body.
  • the differentiated cells are preferably insulin-producing cells or nerve cells.
  • An antibody that recognizes the protein of the present invention or the protein encoded by the novel gene as an antigen is also one of the present invention.
  • the target disease in the diagnostic method of the present invention includes a cell proliferative disease, a spiritis disease, a nervous system disease, familial persistent hyperinsulinic hypoglycemia, and the like.
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of Northern analysis of the expression of NC1, NC2 and NC3 genes specific to the knee of patients with familial persistent hyperinsulinic hypoglycemia c
  • FIG. 4 is a view showing the results of examining changes in the expression of the NC3 gene associated with cell differentiation by Northern analysis.
  • FIG. 3 is a view showing a morphological change of PC12 cells in which the NC1 gene is forcibly expressed.
  • the present inventors search for genes that are specifically expressed in proliferating insulin-producing cells or knee ⁇ cells, so that such genes may be expressed.
  • the knee tissue of a patient with familial persistent hyperinsulinic hypoglycemia (; persistent hyperinsulin em ipopoglycem iaof 1 nfancy; PHHI) was selected as the highly likely tissue.
  • PHHI is a human transmissible disease also called nesidiob 1 astosis, and it is known that some of the potassium channels on ⁇ ⁇ cells have mutations. For this reason, the overlying ⁇ -cells of patients with this disease are constantly in a state where insulin secretion is promoted and exhibit severe hypoglycemic symptoms (Science, 268, 426 (1995)).
  • patients with PHHI have high blood insulin levels and hyperplasia of islets of Langerhans, especially ⁇ cells, which are clearly distinguished from transformed cells such as cancer cells. Therefore, the spleen of ⁇ ⁇ patients is considered to be a model for spontaneous proliferation of knee ⁇ cells.
  • the present inventors identify a gene that is specifically expressed in the knee of PHHI patients, it can be a marker for detecting proliferating ⁇ ⁇ cells. Considering that it could be expected to encode a molecule that differentiates progenitor cells into ⁇ ⁇ cells or proliferates knee ⁇ cells, extracting RN ⁇ ⁇ from the patient's knee and healthy human's kidney, By synthesizing cDNA of the gene expressed in each tissue and performing gene subtraction, we succeeded in obtaining a new gene that is specifically expressed in the pancreas of PHHI patients .
  • the present invention relates to a novel gene specifically expressed in the knee of a PHHI patient, a protein translated from the gene, and a method of using the same.
  • Examples of the DNA of the present invention include (1) a DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 2 or 3, and (2) a DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 4, 5 or 6. (3) a DNA consisting of the nucleotide sequence at positions 174 to 904 of SEQ ID NO: 4, a DNA consisting of the nucleotide sequence at positions 79 to 21 of SEQ ID NO: 5, or the DNA consisting of the nucleotide sequence at positions 28 to 384 of SEQ ID NO: 6 Becomes DNA.
  • a DNA comprising a part of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4, 5, or 6, and at least a DNA having the nucleotide sequence of the DNA of (3) above.
  • any DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4, 5, or 6 in (2) is a novel gene discovered for the first time in the present invention.
  • RNA is extracted from the knee of PHHI patients and the spleen of healthy individuals by the acidic phenol method, poly A (+) RNA is purified, and cDNA derived from each tissue is synthesized using reverse transcriptase. .
  • gene subtraction was performed by the method of Hu bank and Chatz (Nucleic Acids Res., 22, 5640 (1993)), and the cDNA was specifically expressed in the knee of PHHI patients. Detect the genes that are present. This time, we determined the base sequence of the specific gene and searched the base sequence database, and confirmed that at least three of the specific genes were novel genes, that is, genes whose functions were not clear. Was.
  • NC1, NC2, and NC3 The three types of genes identified as new genes by database search were named NC1, NC2, and NC3, respectively, and their nucleotide sequences were set as SEQ ID NOs: 4 (NC1), 5 (NC2), and ⁇ 6 (NC 3).
  • NC1 nucleotide sequences
  • NC2 nucleotide sequences
  • NC 3 amino acid sequences of the proteins translated from those genes were predicted from the nucleotide sequences, and are shown in SEQ ID NOS: 1 (NC1), 2 (NC2), and 3 (NC3).
  • DNA having a partial base sequence is not particularly limited as long as the purpose can be achieved.
  • DNA comprising the base sequence at positions 174 to 904 of SEQ ID NO: 4 DNA consisting of the nucleotide sequence at positions 79 to 2115 of SEQ ID NO: 5 or DNA consisting of the nucleotide sequence at positions 28 to 384 of SEQ ID NO: 6, and the DNA of SEQ ID NO: 4, 5 or 6 containing the partial sequence region DNA consisting of a part of the base sequence is exemplified.
  • the method for obtaining the DNA of the present invention is not particularly limited, and the gene obtained by the above-described method for obtaining a novel gene may be used as it is, or only a part thereof may be used, or a DNA having the sequence may be produced by chemical synthesis. You may.
  • Examples of the protein of the present invention include (1) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 2 or 3, and (2) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 2 or 3. .
  • the method for obtaining these proteins is not particularly limited.
  • the DNA of the present invention is genetically engineered using Escherichia coli, animal cells or the like as a host. Transformants can be obtained by incorporating the transfectant into a sliver and culturing the transformant. Known methods can be used for the vector integration, transformation method, culture method, and the like here.
  • Proliferating insulin-producing cells Z knee cells can be detected and selected from tissues or cell populations containing Northern extracts RN Alpha purposes of tissue or cell population, the onset Ming suitable method DNA from specific genes, such as those labeled with have use radioisotopes 3 2 P and DNA modifying enzymes as probes Perform analysis.
  • the presence of growing insulin-producing cells / knee ⁇ cells in the tissue or cell population of interest is detected by autoradiography.
  • proliferating insulin-producing cells can also be obtained by performing PCR using cDNA synthesized from R ⁇ extracted from a target tissue or cell population using the DNA of the present invention as a primer. Knee ⁇ cells can be detected.
  • an antibody recognizing the protein of the present invention as an antigen is produced, and the insulin-producing cells and knee cells proliferating from a target tissue or cell population by an immunological technique, for example, tissue immunostaining, using the antibody, are prepared. Can be detected.
  • this antibody can be used to diagnose diseases involving proliferation of insulin-producing cells / knee ⁇ cells.
  • diseases include, for example, cell proliferative diseases, cardiovascular diseases, neurological diseases, and the like.
  • the above antibodies are suitable for diagnosis of familial persistent hyperinsulinic hypoglycemia. Used.
  • the gene of the present invention is specifically expressed in the knee of a PHHI patient who is a model for spontaneous proliferation of knee ⁇ cells, it is involved in the proliferation or differentiation of ⁇ ⁇ cells or cells related thereto. It is thought that there is. Therefore, the DNA of the present invention derived from the gene can be used as a precursor cell for insulin-producing cells / knee cells and cells related thereto, such as, for example, nerve cells, or cultured cells corresponding to the precursor cells, such as embryonic stem cells, It is thought that by introducing and expressing mesenchymal stem cells and the like, the proliferation of those cells can be promoted.
  • the DNA of the present invention is Producer cells / Knee ⁇ cells and progenitor cells of cells related to them, such as neurons, or cultured cells corresponding to the progenitor cells, such as embryonic stem cells or mesenchymal stem cells, and express them by introducing them. It is thought that the differentiation of these cells into insulin-producing cells and nerve cells can be induced.
  • These embryonic stem cells and mesenchymal stem cells are preferably cells having physiological functions of a living body. Here, the physiological function of the living body is in Vitr. Or it means high differentiation potential in vivo.
  • a commonly known method can be used. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the recovered DNA fragment was suspended in sterile distilled water, and 1.2 g of the cDNA fragment was combined with 8 g of R—Bgl—24 (agcactctccagccctctcac oligo DNA having the nucleotide sequence of cgca) and 4 g of the DNA fragment.
  • R—Bgl—24 agcactctccagccctctcac oligo DNA having the nucleotide sequence of cgca
  • R—Bgl—12 gatctgcggtga
  • the reaction was carried out at 16 ° C for 16 hours using England's Biolab.)
  • the DNA concentration of the reaction product was adjusted to 6 g / m 1, and 11 minutes were collected by fractionation.
  • the amplified product from the knee of the PHHI patient is called a tester, and the amplified product from the healthy human knee is called a driver.
  • R-Bgl-24 and R-Bgl-12 oligo DNAs are removed by cutting the tester and driver with Dp nil, and another oligo DNA J-Bgl-24 (accgacgtcgactatccatga aca) is used only for the tester.
  • J—Bgl—12 (.gatctgttcatg) was conjugated.
  • a 100-fold (40 ⁇ ) driver was added to 0.4 ⁇ g of the tester to which the oligo DNA was bound, and after ethanol precipitation, 4 ⁇ l of EEX3 buffer [30 mM N— (2—: hydroxy — Ethyl) iperazine—N—3—propanesulfonicacid (manufactured by Sigma); 3 mM EDTA (pH 8.0)].
  • This DNA solution was denatured by heat treatment at 98 ° C for 5 minutes, then kept at 67 ° C for 20 hours to anneal, and then TE buffer [10 mM Trizma Base (Sigma); 1 mM EDTA ( pH 8.0)] to obtain 400 ⁇ l.
  • the product was digested with D p nil, and 1.2 ⁇ g of the cDNA fragment was digested with 8 g of N—B g 1—24 (.aggcaactgtgctatcgaggg aa), 4 ⁇ g ⁇ N—B g 1—1 2 ( gatcttccctcg) to obtain DP2 according to the procedure for obtaining DP1.
  • DP2 was amplified by PCR using N-Bg1-24 as a primer, digested with Dpnil, and then combined with J-Bgl-24 and J-Bgl-12 to obtain DP3 in the same manner.
  • J one B g 1 - amplifying the DP 3 by 24 primer was P CR reactions (9 5 ° C 1 minute / / 70 ° C 3 min 22 cycles), resulting ⁇ After the width product was cut with Dpnil, it was subcloned into the BamHI site of pUC19.
  • nucleotide sequence of the obtained clone was determined and a nucleotide sequence database such as GeiiBank was searched, three of the clones did not match any nucleotide sequence in the database. Further, using these clones as a probe, a cDNA library was screened to obtain full-length cDNAs, which were designated as NC1, NC2 and NC3, respectively.
  • NC 1 SEQ ID NO: 4
  • NC 2 SEQ ID NO: 5
  • NC 3 SEQ ID NO: 6
  • RNA was extracted and purified. These were fractionated by electrophoresis in a 1.0% agarose gel, and then transferred to a nylon membrane (Hi Pond 1N, manufactured by Amersham Pharmacia) by the cabillari method.
  • T 4 polynucleotide key Na ⁇ "peptidase (Takara Shuzo) and - 32 P] ATP and radiolabeled using (Amersham 'Pharmacia Co.), Nai port transferring the as a probe for Northern analysis RNA.
  • RIN-m cells established from rat inulinoma have a low insulin-producing ability
  • the addition of sodium butyrate to the culture system allows them to secrete high levels of insulin, indicating that they differentiate into insulin-producing cells.
  • B arthol ome usz et al., En docrinology 24, 2680-2685, 1989 After culturing the RIN-m cells for 16 hours in the presence of 6 mM sodium butyrate, the total RNA was extracted, and the DNA consisting of the nucleotide sequence of positions 28 to 384 of SEQ ID NO: 6 was used as a probe as described in Example 2.
  • Northern analysis was performed in the same manner. As a result, as shown in FIG. 2A, the expression of NC3 gene was enhanced in RIN-m cells cultured with sodium butyrate.
  • PC-12 cells derived from adrenal pheochromocytoma are known to extend neurites and differentiate into neurons by adding nerve growth factor (NGF) (Saltiei et al., Biossay 16). Vol. 405-411, p. 1994). All RNAs were extracted from PC-12 cells cultured for 16 hours in a culture system in which NGF was added to a concentration of 50 ng / ml, and DNA consisting of the 28th to 384th base sequence of SEQ ID NO: 6 Using the as a probe, Northern analysis was performed in the same manner. As shown in FIG. 2B, the expression of NC3 gene was enhanced in PC-12 cells cultured with NGF.
  • NGF nerve growth factor
  • Example 4 Morphological change of PC-12 cell in which NC1 gene was forcibly expressed This is a region encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 among the nucleotide sequences described in SEQ ID NO: 4.
  • the DNA of the nucleotide sequence at positions 174 to 904 was incorporated into a predetermined site of pCI neo, a gene expression vector for animal cells, to construct an NC1 gene expression vector.
  • the cells were maintained in a culture system to which geneticin was added at a concentration of 500 g / m1, and cells having the expression vector were selected.
  • FIG. 3 in the PC-12 cells in which the NC1 gene was forcibly expressed, cells in which the transgenic bulge was extended were observed, and the PC-12 cells were forcibly expressed in the NC1 gene.
  • the novel gene discovered by the present invention is not only specifically expressed in the knee of PHHI patients, but also changes its expression as the cells differentiate and proliferates, and transgenes into undifferentiated cells. It can induce differentiation into functional cells by forcibly expressing it by a technical method. Therefore, insulin-producing cells having a proliferative ability can be easily detected and selected using these genes and a part of the DNA and proteins translated therefrom. It can be differentiated and propagated. In addition, new diagnostic methods for various diseases caused by abnormal differentiation and proliferation of darka 0 cells, which are insulin-producing cells, and cells related thereto (eg, nerve cells) can be developed.

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Description

明細書
新規遺伝子 技術分野
本発明は複数の細胞種から構成される組織或レゝは細胞集団から增殖しているィ ンスリン産生細胞を検出する技術に関わる。 また、 本発明はィンスリン産生細胞 である腠 細胞及びその前駆細胞、 あるいは膝 β 細胞と類縁の細胞、 たとえば 神経細胞等を増殖させる技術に関わる。 背景技術
膝 β 細胞は血糖値を降下させる唯一のペプチドホルモンであるインスリンを 産生する器官である。 何らかの原因により)]萃 β 細胞のインスリン産生能が損な われると血糖値を正常に保つことが不可能となり糖尿病を発症する。 インスリン 産生能が損なわれた糖尿病患者にィンスリン産生能を回復させ、 血糖値を正常に 制御するためには、 インスリン産生能を有する細胞を移植することが根本的な治 療法となる。
インスリン産生細胞の供給源としては死体の膝臓、 あるいは近い将来実用化さ れようとしている胚性幹細胞 （E S細胞） または間葉系幹細胞から分化させたィ ンスリン産生能を有する細胞等が考えられる。 胚性幹細胞は胚盤胞の内部細胞塊 に由来する細胞でほぼすベての組織、 細胞に分化する能力を有している。 また、 間葉系幹細胞は骨髄、 血液、 真皮、 骨膜等に見出される多分化能を有する細胞で ある。 近年、 これらの細胞から、 試験管内及び生体内で人為的にインスリン産生 細胞や神経細胞、 心筋細胞等の機能を有する細胞を分化させうることが示されて いる。 しカゝし、 これらの組織あるいは細胞集団は供給に限りがあり糖尿病患者の 治療に充分な細胞数を確保することは困難であると考えられる。 そこでインスリ ン産生細胞あるいはその供給源となる細胞を増殖させることが求められる。 そのような効果を期待できる手法として H G F (H e p a t o c y t e g r o w t h F a c t o r ) 、 R e g蛋白質、 ペータセルリン等の細胞分化 '增殖 因子を供給源となる細胞に作用させることが考えられる（O t o n k o s k i ら、 D i a b e t e s 43卷、 947— 953頁、 1 994年、 Wa t a n a b e ら、 P r o c. Na t l . Ac a d. S c i . 91巻、 3589— 35 92頁、 1994年、 Yamamo t oら、 D i a b e t e s 49巻、 202 1— 2027頁、 2000年） 力 S、 現在までのところ実際の治療に適用できるよ うな因子は見出されていない。
また、 このような細胞分化 '増殖因子を用いてインスリン産生細胞を含む細胞 集団を増殖させてもその中から真に有効な細胞、 すなわち増殖能を有するィンス リン産生細胞だけを治療に用いることが望まれるが、 このような細胞を選抜する ための有効な方法は今までのところ明らかにされていない。 発明の要約
本発明が解決しようとしている課題は、 細胞分化 ·増殖因子等を用いて治療に 必要な数のィンスリン産生細胞を含む細胞集団から目的の細胞、 すなわち増殖能 を有するインスリン産生細胞を検出する方法、 さらにはそれらを選抜するための 方法を提供すること、 及び糖尿病等生体が産生する生理活性物質の絶対的不足に 起因する疾患の治療のためにインスリン産生細胞である睥 |3 細胞、 あるいはそ れと類縁の細胞、 たとえば神経細胞等をより効率的に分化 ·増殖させる方法を提 供することにある。
本発明は、 PHH I患者の膝臓で特異的に発現している新規な遺伝子、 および その遺伝子から翻訳される蛋白質、 そしてその利用法に関する。
本 ¾明の蛋白質は、 （1) 配列番号 1、 2または 3で表されるアミノ酸配列か らなる蛋白質、 または、 （2) 配列番号 1、 2または 3で表されるアミノ酸配列 を有する蛋白質である。
本発明の新規な遺伝子は、 （1) 配列番号 1、 2または 3で表されるアミノ酸 配列からなる蛋白質をコードする DNA、 (2) 配列番号 4、 5または 6で表さ れる塩基配列からなる DNA、 (3) 配列番号 4の 1 74〜904番目の塩基配 列からなる DNA、 配列番号 5の 79-21 1 5番目の塩基配列からなる D N A 若しくは配列番号 6の 28~384番目の塩基配列からなる D N A、 または、 （ 4) 配列番号 4、 5または 6で表される塩基配列の一部からなる DNAであって、 少なくとも、 （3) の部分配列領域の DNAの塩基配列を有する DNAである。 本発明の新規な遺伝子及び蛋白質の利用法は、 （1) 本発明の新規な DN Aを 用いて、 増殖しているインスリン産生細胞を検出する方法、 （2) 新規な DNA を組み込んだベクターより得られる形質転換体、 （3) 新規な DNAを、 胚性幹 細胞または間葉系幹細胞を含む初代培養細胞または樹立細胞株に導入して胚性幹 細胞または間葉系幹細胞を分化させる方法、 （4) 新規な DNAを、 胚性幹細胞 または間葉系幹細胞を含む初代培養細胞または樹立細胞株に導入して、 胚性幹細 胞または間葉系幹細胞を増殖させる方法である。 （3) の方法、 及び （4) の方 法においては、 胚性幹細胞または間葉系幹細胞が生体の生理機能を有する細胞で あることが好ましい。 更に、 （3) の方法においては、 分化した細胞がインスリ ン産生細胞や神経細胞であることが好ましい。
また、 本発明の蛋白質または新規な遺伝子がコードする蛋白質を抗原として認 識する抗体もまた、 本発明の 1つである。
更に、 該抗体を用いた疾患の診断法もまた、 本発明の 1つである。 本発明の診 断法における目的の疾患としては、 細胞増殖性の疾患、 瞎臓の疾患、 神経系の疾 患、 家族性持続性過ィンスリン性低血糖症等が挙げられる。 図面の簡単な説明
図 1は、 家族性持続性過ィンスリン性低血糖症患者の膝臓に特異的な N C 1、 NC 2及び NC 3遺伝子の発現をノーザン解析により調べた結果を示す図である c 図 2は、 細胞の分化に伴う NC 3遺伝子の発現変化をノーザン解析により調べ た結果を示す図である。
図 3は、 N C 1遺伝子を強制発現させた P C 1 2細胞の形態変化を示す図であ る。 発明の詳細な開示
以下に本発明を詳述する。
本発明者らは、 増殖しているインスリン産生細胞、 または膝 β 細胞で特異的 に発現している遺伝子の検索を行うため、 このような遺伝子が発現している可能 性の高い組織として家族性持続性過インスリン性低血糖症 （； p e r s i s t e n t hy p e r i n s u l i n em i c h y p o g l y c em i a o f 1 n f a n c y ; PHH I ) 患者の膝臓を選んだ。 P HH Iは n e s i d i o b 1 a s t o s i sとも呼ばれるヒトの遣伝性疾患であり、 瞵 β 細胞上のカリゥム チャネルの一部に変異があることが知られている。 このため、 この疾患の患者の 睥 β 細胞は、 常にインスリンの分泌が促されている状態になっており、 重篤な 低血糖症状を呈する （S c i e n c e, 268, 426 (1995) ) 。 また、 PHH I患者では高い血中インスリン濃度とともにランゲルハンス島、 特に β 細胞の過形成が見られるが、 これは癌細胞のように形質転換した細胞とは明確に 区別される。 このため、 ΡΗΗ Ι患者の瞎臓は膝 β 細胞の自然増殖モデルであ るとされている。
したがって、 本発明者らは、 PHH I患者の膝臓で特異的に発現している遣伝 子を同定すれば、 それは増殖している陴 β 細胞を検出するためのマーカーとな り得る上、 前駆体の細胞から陴 β 細胞に分化させるあるいは膝 β 細胞を増殖さ せる分子をコードしていることも期待できると考え、 ΡΗΗΙ患者の膝臓及び健 常人の陴臓から RN Αを抽出し、 それぞれの組織で発現している遺伝子の c DN Aを合成して遺伝子サブトラクシヨンを行い、 PHH I患者の降臓で特異的に発 現している新規な遣伝子を取得することに成功した。
すなわち本発明は、 PHH I患者の膝臓で特異的に発現している新規な遺伝子、 およびその遺伝子から翻訳される蛋白質、 そしてその利用法に関する。
本発明の DNAとしては、 （1) 配列番号 1、 2または 3で表されるアミノ酸 配列からなる蛋白質をコードする DNA、 (2) 配列番号 4、 5または 6で表さ れる塩基配列からなる DNA、 (3) 配列番号 4の 1 74〜 904番目の塩基配 列からなる DNA、 配列番号 5の 79〜21 1 5番目の塩基配列からなる D N A または配列番号 6の 28〜 384番目の塩基配列からなる D N A。
(4) 配列番号 4、 5または 6で表される塩基配列の一部からなる DNAであつ て、 少なくとも、 上記 （3) の DNAの塩基配列を有する DNA、 が挙げられる。 ここで、 （2) の配列番号 4、 5または 6で表される塩基配列からなる DNA はいずれも、 本発明において初めて見いだされた新規な遺伝子である。 これら新 規な遺伝子は、 以下に述べる方法によって取得できた。
PHH I患者の膝臓及び健常人の降臓から酸性フエノール法により RNAを抽 出し、 ポリ A ( + ) RNAを精製した後、 逆転写酵素を用いてそれぞれの組織に 由来する c DNAを合成する。 これらの c DNAを材料として Hu b a n kと S c h a t zの方法 (Nu c l e i c Ac i d s Re s. ， 22， 5640 ( 1993) ) により遺伝子サブトラクションを行い、 P HH I患者の膝臓で特異 的に発現している遺伝子を検出する。 今回、 特異的遺伝子の塩基配列を決定し、 塩基配列データベースを検索したところ、 特異的遺伝子のうち少なくとも 3種類 の遺伝子は新規遺伝子、 即ち機能が明らかになつていない遺伝子であることが確 認された。
データベース検索により新規遺伝子であることが確認された 3種類の遺伝子を それぞれ NC1、 NC 2、 及ぴ NC 3と名づけ、 それらの塩基配列を配列番号 4 (NC 1) 、 5 (NC 2) 、 及ぴ 6 (NC 3) に示した。 また、 それらの遺伝子 から翻訳されるタンパク質のアミノ酸配列を塩基配列から予測し、 配列番号 1 ( NC 1) 、 2 (NC 2) 、 及ぴ 3 (N C 3 ) に示した。
本発明においては、 上記新規遺伝子の塩基配列の一部分の DN Aを用いても、 後述する目的に利用できる。 ここでいう、 一部分の塩基配列を有する DNAとは 目的を達することができれば特に限定されるものではないが、 具体的には、 配列 番号 4の 174〜904番目の塩基配列からなる DNA、 配列番号 5の 79〜2 115番目の塩基配列からなる D N Aまたは配列番号 6の 28〜 384番目の塩 基配列からなる D N Aが挙げられ、 また該部分配列領域を含む配列番号 4， 5ま たは 6の塩基配列の一部分からなる D N Aが挙げられる。
本発明の D N Aを得る方法は特に限定されず、 上記新規遺伝子の取得方法によ つて得た遺伝子をそのまま、 あるいはその一部のみを用いても良いし、 該配列を 有する DNAを化学合成によって作製しても良い。
本発明の蛋白質としては、 （1) 配列番号 1、 2または 3で表されるアミノ酸 配列からなる蛋白質、 （2) 配列番号 1、 2または 3で表されるアミノ酸配列を 有する蛋白質、 が挙げられる。 これら蛋白質を得る方法は特に限定されないが、 例えば、 遺伝子工学的に大腸菌、 動物細胞等を宿主とし、 先の本発明の DNAを ベタターに組み込んで形質転換し、 該形質転換体を培養して得ることができる。 ここでのベクタ一^■の組み込みや形質転換方法、 その培養方法などは、 公知の方 法を用いることができる。
本 明において、 これらの P H H I患者の鸱臓で特異的に発現している遺伝子 から由来する D N A、 及びその D N Aから翻訳される蛋白質を用いれば、 次に述 ベるような方法で様々な細胞種を含む組織あるいは細胞集団から、 増殖している インスリ ン産生細胞 Z膝 細胞を検出し、 それを選抜することができる。 目的の組織または細胞集団から R N Αを抽出し、 特異的遺伝子に由来する本発 明の D N Aを適当な方法、 たとえば放射性同位元素3 2 Pと D N A修飾酵素を用 いて標識したものをプローブとしてノーザン解析を行う。 目的の組織または細胞 集団に増殖しているインスリン産生細胞/膝 β 細胞が存在すればオートラジオ グラフィ一により検出される。 また、 目的の組織または細胞集団から抽出した R Ν Αから合成した c D N Aを鎊型として、 本発明の D N Aをプライマーとして用 いて P C Rを行うことによつても、 増殖しているインスリン産生細胞 Ζ膝 β 細 胞を検出することができる。
また本発明の蛋白質を抗原として認識する抗体を作製し、 この抗体を用いて、 免疫学的手法、 たとえば組織免疫染色により、 目的の組織または細胞集団から、 増殖しているインスリン産生細胞 Ζ膝 細胞を検出することができる。 また、 この抗体を用いて、 インスリン産生細胞/膝 β 細胞の増殖が関与する疾患を診 断することができる。 このような疾患としては、 例えば、 細胞増殖性の疾患、 瞒 臓の疾患、 神経の疾患等が挙げられ、 なかでも、 上記抗体は家族性持続性過イン スリン性低血糖症の診断に好適に用いられる。
また、 本発明の遺伝子は膝 β 細胞の自然増殖モデルである P HH I患者の膝 臓に特異的に発現していることから、 腠 β 細胞或いはそれと類縁の細胞の増殖 または分化に関与していると考えられる。 したがって、 該遺伝子を由来とする本 発明の D N Aをインスリン産生細胞/膝 細胞及び、 例えば神経細胞等のそれ と類縁の細胞の前駆細胞、 あるいは前駆細胞に相当する培養細胞、 例えば胚性幹 細胞や間葉系幹細胞等に導入し、 発現させることによりそれらの細胞の増殖を促 進させることができると考えられる。 また、 同様に本発明の D N Aをインスリン 産生細胞/膝 β 細胞及び、 例えば神経細胞等のそれと類縁の細胞の前駆細胞、 あるいは前駆細胞に相当する培養細胞、 例えば胚性幹細胞や間葉系幹細胞等に導 入し、 発現させることによりそれらの細胞のインスリン産生細胞や神経細胞への 分化を誘導させることができると考えられる。 これらの胚性幹細胞や間葉系幹細 胞は、 生体の生理機能を有する細胞であることが好ましい。 ここで、 生体の生理 機能とは、 i n V i t r 。または i n v i v oにおける高い分化能を意味す る。 これら導入発現の方法に関しては、 通常行われる公知の方法を用いることが できる。 発明を実施するための最良の形態
以下に実施例をあげて本発明をより具体的に説明するが、 その要旨を越えない 限り、 以下の実施例に限定されるものではない。
(実施例 1) 新規遺伝子 NC I, NC 2及び NC 3の取得方法
PHH I患者の膝臓及び健常人の膝臓から RNA z o 1 B (バイオテックス- ラポラトリーズ製） を用いて全 RNAを抽出し、 P o l yAT r a c t me s s e n g e r RNA i s o l a t i o n s y s t em (ブロメ力 D によ りポリ A ( + ) RNAを精製した。 このポリ A(+)RNAから R i b o c 1 o n e cDNA Sy n t h e s i s S y s t em (プロメガ製） を用いて 2本 鎖 cDNAを合成した。 PHH I患者の膝臓由来及び健常人の脖臓由来の 2本鎖 c DNAをそれぞれ制限酵素 Dp nil (ェユーイングランド■バイオラボ製） で 完全切断し、 フエノール処理により反応を停止した後、 エタノール沈殿により切 断した c DNA断片を回収した。 回収した DN A断片を滅菌蒸留水に縣濁し、 1. 2 μ gの c DNA断片に対して 8 gの R— B g l— 24 (a g c a c t c t c c a g c c c t c t c a c c g c aの塩基配列を有するオリゴ DNA) と 4 μ g の R— B g l— 12 (g a t c t g c g g t g a) を 50 μ 1のスケーノレで T 4 DNAリガーゼ （ニューイングランド 'バイオラボ製） を用いて 14°C、 16時 間の反応により結合させた。 反応産物の DNA濃度を 6 g/m 1 となるように 調製し、 このうち 1 1分を分取して R— B g 1— 24をプライマーとして PC R反応により増幅させた。 PHH I患者膝臓由来の増幅産物をテスター、 健常人 膝臓由来の増幅産物をドライバーと呼ぶ。 テスター及ぴドライバーを D p nil で切断することにより R— B g l— 24、 R— B g l — 1 2オリゴ DNAを除去 し、 テスターのみに別のオリゴ DNA J—B g l— 24 (a c c g a c g t c g a c t a t c c a t g a a c a) J— B g l— 1 2 (.g a t c t g t t c a t g) を結合させた。 オリゴ DNAを結合させたテスター 0. 4〃 gに対し 1 00 倍量 （40 §) のドライバーを加え、 エタノール沈殿させた後 4 μ 1の EEX 3緩衝液 [30 mM N— （2— : h y d r o x y— e t h y l ) i p e r a z i n e— N — 3— p r o p a n e s u l f o n i c a c i d (シクマ製) ； 3mM EDTA (p H 8. 0) ] に縣濁した。 この DNA溶液を 9 8 °C 5 分間の熱処理で変性した後、 6 7°Cで 20時間保持してァニールさせ、 TE緩衝 液 [ 1 0 mM T r i z m a B a s e (シグマ製） ； 1 mM EDTA (p H 8. 0) ] を加えて 400 μ 1 とした。 このうち 10 μ 1を分取し、 7 2 で 3 分間保持して J一 B g 1 — 1 2を c DN Aからはずし、 5単位の T a qポリメラ ーゼ （ニューイングランド 'バイオラボ製） を添加してさらに 5分間反応させて 1本鎖になった部分を 2本鎖にした。 この反応産物を铸型として 9 5 °C 1分間 /70°C 3分間 1 0サイクルの PCR反応を行い、 増幅産物をフエノール処 理、 ェタノール沈殿し、 400 /z lの 0. 2倍濃度 T E緩衝液に縣濁し、 40単 位の Mu n g B e a n Nu c l e a s e (ニューイングランド .バイオラボ 製） を加え、 30°Cで.3 5分間反応させた。 この反応産物を D P 1と呼ぶ。 1 0 X 1の D P 1にプライマーとして 2 μ gの J一 B g 1 — 24を加え、 9 5°C 1 分間/ 7 0°C 3分間 1 8サイクルの PCR反応を行って得られた増幅産物を D p nil で切断し、 1. 2 μ gの c DNA断片に対し 8 gの N— B g 1— 2 4 (.a g g c a a c t g t g c t a t c g a g g g a a) 、 4 μ g©N— B g 1 - 1 2 (g a t c t t c c c t c g) を結合し、 以下 D P 1を得た手法に準じて D P 2を得た。 D P 2を N— B g 1 - 24をプライマーとした P C R反応により 増幅し、 Dp nil 切断後 J一 B g l— 24、 J— B g l— 1 2を結合し、 同様 にして D P 3を得た。 J一 B g 1 - 24をプライマーとした P CR反応 （9 5 °C 1分間/ /70°C 3分間 22サイクル） により DP 3を増幅し、 得られた增 幅産物を D p nil で切断後、 p UC 1 9の B a mH I部位にサブクローユング した。 得られたクローンの塩基配列を決定し、 G e iiB a n k等の塩基配列デー タベースを検索したところ、 それらのうち 3個のクローンがデータベース上のあ らゆる塩基配列と一致しなかった。 さらにこれらのクローンをプロ一プとして c DN Aライブラリ一をスクリーニングし、 全長 cDNAを得、 それぞれ NC 1、 NC 2、 NC 3とした。
(実施例 2) ノーザン解析による増殖しているインスリン細胞 Z膝 β 細胞の 検出
実施例 1で得られた N C 1 (配列番号 4 ) 、 N C 2 (配列番号 5 ) 及び N C 3 (配列番号 6) の遺伝子配列の一部分の DN Αを用いて、 目的の組織中に増殖し ているィンスリン産生細胞が含まれているか否かをノーザン解析により検討した。 健常人の膝臓 （レーン 1及ぴレーン 2、 2検体） 及び PHH I患者の膝臓（レ ーン 3、 1検体）から T R I /. () 1 (ギブコ ■ ライフテックオリエンタル社製） を用いて全 RN Aを抽出し、 精製した。 これらを 1. 0%ァガロースゲル電気泳 動により分画した後、 ナイロンメンブラン （ハイポンド一 N、 アマシャム■ファ ルマシア社製） にキヤビラリ一法により転写した。 配列番号 4の 174〜904 番目の塩基配列からなる D N A、 配列番号 5の 79〜 21 15番目の塩基配列か らなる DNA、 配列番号 6の 28〜384番目の塩基配列からなる DNAを、 そ れぞれ P CR法により増幅し、 ァガロースゲル電気泳動により分画した後、 目的 の DNA断片をゲルから切り出し、 精製した。 これらを T 4ポリヌクレオチドキ ナ^ "ゼ （宝酒造製） と —32 P]ATP (アマシャム 'フアルマシア社製） を 用いて放射能標識し、 ノーザン解析用のプローブとした。 RNAを転写したナイ 口ンメンプランと放射能標識したプローブを混合して 65 で 1晚ハイブリダイ ゼーシヨンを行った後、 メンブランを洗浄し、 オートラジオグラフィ一によりプ ロープと反応する RN A分画を検出した（図 1)。 NC 1、 〇2及び：^ 3由来 の部分配列の DNAのいずれも、 それをプロ ブとして用いた場合に、 PHH I 患者由来の RN Aからはシグナルが検出されたが、 健常人由来の RN Aからは検 出されなかった。 (実施例 3 ) 細胞の分化に伴う N C 3の発現の変化
ラットインシユリノーマから樹立された R I N— m細胞のインスリン産生能は 低いが、 酪酸ナトリゥムを培養系に加えることによりインスリンを高濃度に分泌 するようになり、 インスリン産生細胞に分化することが示されている （B a r t h o l ome u s zら、 En d o c r i n o l o g y 24卷、 2680— 26 85頁、 1 989年） 。 R I N— m細胞を 6mMの酪酸ナトリウム存在下で 16 時間培養した後、 全 RNAを抽出し、 配列番号 6の 28〜 384番目の塩基配列 からなる DNAをプロープとして、 実施例 2に記載したものと同様の方法でノー ザン解析を行った。 その結果、 図 2の Aに示したように、 酪酸ナトリウムを加え て培養した R I N— m細胞では NC 3遺伝子の発現が亢進していた。
また、 副腎褐色細胞腫由来の P C— 12細胞は神経成長因子 （NGF) を添加 することにより神経突起を伸展し、 神経細胞様に分化することが知られている （ S a l t i e i ら、 B i o e s s a y 16卷、 405— 41 1頁、 1994年 ) 。 NG Fを 50 n g/m 1の濃度になるように加えた培養系で 16時間培養し た PC— 12細胞から全 RN Aを抽出し、 配列番号 6の 28〜384番目の塩基 配列からなる DNAをプローブとして、 同様の方法でノーザン解析を行った。 図 2の Bに示したように、 NG Fを加えて培養した P C— 1 2細胞では NC 3遺伝 子の発現が亢進していた。
(実施例 4) NC 1遺伝子を強制発現させた P C— 1 2細胞の形態変化 配列番号 4に記載されている塩基配列のうち、 配列番号 1のァミノ酸配列から なる蛋白質をコードする領域である 1 74〜904番目の塩基配列部分の DN A を動物細胞用遺伝子発現ベクターである p C I n e oの所定の部位に組み込み、 NC 1遺伝子発現ベクターを構築した。 このものをリボソーム法により PC— 1 2細胞に導入し、 強制発現させた。 g e n e t i c i nを 500 g/m 1の濃 度で加えた培養系で細胞を維持し、 発現べクターを保持した細胞を選択した。図 3に示したように NC 1遺伝子を強制発現させた P C— 12細胞の中には祌経突 起を伸張させた細胞が観察され、 NC 1遺伝子の強制発現により PC— 12細胞 を神経細胞様に分化させることができることが示唆された。 産業上の利用の可能性
本発明によって見いだされた新規遺伝子は、 P H H I患者の膝臓に特異的に発 現しているだけでなく、 細胞の分化 '増殖に伴って発現が変化したり、 未分化の 細胞に遣伝子工学的手法により強制発現させることにより機能を有する細胞への 分化を誘導させうるものである。 したがって、 これらの遺伝子、 及ぴその一部の D NAやそれらから翻訳される蛋白質を用いて、 増殖能を有するインスリン産生 細胞を容易に検出し、 それらを選抜すること、 さらにはインスリン産生細胞を分 化'増殖させることが可能となる。 さらにはインスリン産生細胞である縢 0 細胞、 及びそれと類縁の細胞 （たとえば神経細胞等） の分化 '増殖の異常に起因する種 々の疾患の新たな診断法が開発できる。

Claims

請求の範囲
1. 配列番号 1、 2または 3で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
2. 配列番号 1、 2または 3で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
3. 配列番号 1、 2または 3で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードす る DNA。
4. 配列番号 4、 5または 6で表される塩基配列からなる DNA。
5. 配列番号 4の 1 74〜 904番目の塩基配列からなる D N A、 配列番号 5の
79〜21 1 5番目の塩基配列からなる DNAまたは配列番号 6の 28〜384 番目の塩基配列からなる D N A。
6. 配列番号 4、 5または 6で表される塩基配列の一部からなる DN Aであって、 少なく とも、 請求の範囲第 5項記載の DNAの塩基配列を有する DNA。
7. 請求の範囲第 3〜6項のいずれかに記載の DNAを用いて、 増殖しているィ ンスリ ン産生細胞を検出する方法。
8. 請求の範囲第 3〜 6項のいずれかに記載の DNAを組み込んだベクターより 得られる形質転換体。
9. 請求の範囲第 3〜 6項のいずれかに記載の DNAを、 胚性幹細胞または間葉 系幹細胞を含む初代培養細胞または樹立細胞株に導入して胚性幹細胞または間葉 系幹細胞を分化させる方法。
10. 請求の範囲第 3〜6項のいずれかに記載の DNAを、 胚性幹細胞または間 o
00
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