WO2003081229A1

WO2003081229A1 - Technique de dosage de coenzymes dans un echantillon biologique

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Publication number: WO2003081229A1
Application number: PCT/JP2003/003521
Authority: WO
Inventors: Mitsuru Sakai; Yoshinori Sugimoto
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
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Filing date: 2003-03-24
Publication date: 2003-10-02
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Description

明細書生体試料中補酵素 A類の測定方法技術分野

本発明は、生体試料中の補酵素 A類 Coenzyme 以下 GoA類と称す）の定量測定方法に関する。背景技術

GoA類は脂肪酸の生合成、分解、転移、ホルモン合成と調節、 T C Aサイクルなどの経路に含まれ、生命機能維持に欠かせない重要な化合物である。脂質代謝の機能解析研究などにおいて、 GoA類のマーカ一としての役割が重要視され、生体試料中の GoA類の濃度を正確に測定する方法が求められてきた。

このような中で.、脂質代謝機構の構成成分であるマロニル GoAは、ミトコンドリアに於ける脂肪酸酸化と脂質合成に関与する為、脂質代謝調節の上で重要な役割を担い、心臓や骨格筋での脂質エネルギー代謝、大脳視床下部におけるニューロぺプチド Yの発現制御、食物摂取、エネルギー消費制御など重要な調節因子として脚光を浴びている。かかる GoA類の測定方法としては、古くから酵素法や HPLG法など各種方法が開発されている。例えば酵素法による測定方法としては Guynnらの方法 ( Guynn, R. W. , Methods Enzymoに， 1975, 35, 31 2) や McGarryらの方法 ( McGarry. J. D. , J. B i o l . Chem. , 1978, 2 53, 22, 8291 ) などがある。これは例えばマロニル GoAを測定対象にするときには、放射能ラベルしたァセチル Go Aなどのマロニル CoA依存的な取り込みを測定するものである。しかし、この方法は特定の GoA類が測定対象となり汎用性がなく、測定時に共存する他の GoA類によって調節がかかリ真の値を示さない場合があり、更に操作が煩雑であるなどの欠点がある。

UV— HPLG法 ( m 7 \ Hosokawa, Y. , Ana I . B i ochem. , 1978, 91 , 1 , 370、 Demoz, A. , J. Chroma togに , B： B i omed. App I - , 1995, 667, 1 , 148など参照。）による CoA類の測定の報告例は非常に多い。測定する生体試料としても筋肉、心臓、肝臓中などの濃度が測定されている。しかし、 UV- HPLG法は感度が低いため、臓器のように夾雑物が多い試料中では再現性が悪く、特に脳中濃度は測られておらず、より高感度、再現性に優れた方法が期待されている。

また感度を得るための別の方法として、 LG- MS法 ( Buchhol z， A.， Anal. Bi ochem.， 2001， 295, 129を参照) が開発されている。かかる方法は菌中のァセチル GoA濃度を 3次元イオントラップ型マススぺクトロメータで測定したものである。かかる方法では測定対象である GoAの検出とピーク分離には成功しているが、絶対検量線法を採用し、内部標準物質を使用しておらず、正確性、再現性を得るには不十分である。また測定対象物質がァセチル CoAであり、極性が低く HPLG上での分離が容易である。さらに、菌中試料は測定を妨害するような夾雑物含量が低く、試料中のァセチル GoA濃度が高いなどの優位な点がある。それに比べて極性が高く HPLG上での分離が困難な場合、動物臓器のように測定を妨害する夾雑物含量が多い試料の場合、試料中濃度が低い場合、などの GoA類（たとえば動物臓器中のマロニル GoA) の測定には充分に対応できない問題がある。

本発明は上記問題点を解決するものであり、生体試料中 GoA類の高感度で再現性に優れた濃度測定法を提供するものである。発明の開示

本願発明者らは、上記のような課題のもとに鋭意研究を重ねた結果. 以下の方法を見出した。すなわち本発明は、生体試料中の補酵素 A類の濃度を測定する方法であり、生体試料を強酸性溶液を使用して抽出するステップ、固相抽出ステツプ、内部標準物質を添加するステツプ、 L C— M Sを用いて検出するステップを備えることを特徴とする補酵素 A類の測定方法を提供するものである。

また本発明は、上記生体試料から補酵素 A類を抽出するステツプが凍結粉砕した上記生体試料を過塩素酸溶液で攪拌した後に、上清を遠心分離するステップであることを特徴とする上記補酵素 A類の測定方法を提供する。

上記固相抽出ステツプは、上記補酵素 A類を強酸性溶液で抽出した上清を中和した後、ォクタデシルシリル基乃至ォクチルシリル基を有するシリ力ゲルを充填した逆相系カー卜リッジにアプライし、水系溶媒で洗浄した後、有機系溶媒で溶出させるステツプであることを特徴とする。特に上記逆相カートリッジを、ァセトニトリル及び 1 M酢酸アンモニゥム溶液でコンディショニングした後に、上記上清をアップィし、ァセトニトリル及び酢酸アンモニゥム混合溶液で溶出させることを特徴とする。

また本発明は、該補酵素 A類が脂肪酸補酵素 Aエステル類であり、該内部標準物質が、該補酵素 A類の構造類似体であることを特徴とする補酵素 A類の測定方法を提供するものである。

その中でも該脂肪酸補酵素 Aエステル類が、主炭素鎖の炭素数が 2 〜 8個の短鎖脂肪酸補酵素 Aエステルであり、該構造類似体が該補酵素 A類との炭素数差が 3個以内であり、且つァシル基の主炭素鎖の水素が 3個以上重水素、或は ^{1 3} Cに置換されたもの、特に該補酵素 A 類がマロニル CoAであり、該構造類似体がァセチル CoA- d ₃体、メチルマロニル GoA— d ₃体、メチルマロニル GoA- d ₄体、プロピオニル GoA- d ₃体、プロピオニル GoA- d ₅体、マロニル GoA- ^{1 3} C ₃体であることを特徴とする補酵素 A類の測定方法を提供するものである。図面の簡単な説明

図 1 は、ウィスター系ラット筋肉試料測定時のクロマトグラムを示す。

図 2は、ウィスター系ラット肝臓試料測定時のクロマトグラムを示す。

図 3は、ウィスター系ラット脳試料測定時のクロマ卜グラムを示す, 発明を実施するための最良の形態

本発明は、 GoA類の測定方法であり、生体試料からの強酸性溶液による抽出、必要に応じた濃縮操作、内部標準物質の添加、 HPLG注入サンプルの調整、 GoA類と内部標準物質の HPLG分離、 GoA類と内部標準物質の質量分析計による検出、検出された測定対象 CoAと内部標準物質の面積比からの定量で構成される。

GoA類の生体試料からの強酸性溶液による抽出において、生体試料とは GoA類が内在するすべての試料が対象であり、具体例としては、人や動物の臓器、人、動物、植物などの組織、細胞、菌などが挙げられる。臓器のなかでも特に筋肉、心臓、肝臓、脳中の CoA類の測定が重要である。

測定対象の CoA類としては、チオール基がァシル化されたァシル Go A類や、チオール基が酸化的に結合した GoA酸化体類、 1級ァミンがァシル化された N -ァシル GoA類が挙げられる。ここで挙げた GoA類には生体試料中には存在しないものが含まれるが、これらについても機能解析などの研究目的で使用され、医薬品開発の効果評価の為に重要である。

ァシル GoA類の具体例として、ァセ卜ァセチル GoA、マロニル GoA、スクシニル GoA、 3—ヒドロキシ一 3—メチルグルタリル GoA、グルタリル GoA、 CoA、ァセチル GoA、ベンゾィル GoA、フェニルァセチル GoA、イソプチリル GoA、イソバレリル GoA、プチリル GoA、ベータ一メチルクロ卜ニル GoA、チグリル CoA、 3—ヒドロキシプロピオニル CoA、ク口トニル GoA、へキサノィル GoA、メチルマロニル GoA、プロピオニル G 0 ァクリロイル GoA、ァラキドイル GoA、デカノィル GoA、エライドィル GoA、ォレオイル GoA、パルミトレオイル GoA、パルミトイル GoA、リノレオイル GoA、口一ロイル GoA、ミリストレオイル GoA、ナ一ボノィル CoA、ステロイル GoA、ォクタノィル GoA、ミリストイノレ GoA、ァラキドニル GoA、ヘプタデカノィル GoA、ノナデカノィル GoA、ドコサへキサノィル GoA、ペンタデカノィル GoA、ベーターヒドロキシプチリル GoA、ヘプタノィル CoA、バレリル CoA、 2—ブテノィル GoA、ステア口ィル GoAなどが挙げられる。

N -ァシル GoA類の具体例としては、 N-ブチリル GoA、 N-デカノィル G oA、 N -へキサノィル GoAなどが挙げられる。

チオール基が酸化的に結合した GoA酸化体類の具体例としては GoA 酸化体、 GoAグルタチオンジスルフィドなどが挙げられる。

なかでも、ァセチル CoA、 GoA、スクシ二ル CoA、ァセトァセチル Go 3—ヒドロキシ一 3—メチルダルタリル GoA、プロピオニル CoA、メチルマロニル GoA、マ口ニル GoA、 3—ヒドロキシプロピオニル CoA、ァクリロイル GoA、ォレオイル GoA、ステアロイル GoA、リノレニル Go A、ァラキドニノレ CoA、ノルミトイル CoA、ステロイル GoA、イソブチリル GoA、 GoA酸化体、 GoAグルタチオンジスルフィドなどが好ましく、特にァセチル CoA、 GoA、スクシニル GoA、ァセトァセチル GoA、 3—ヒドロキシー 3—メチルダルタリル GoA、プロピオニル GoA、メチルマロニル GoA、マ口ニル CoA、イソブチリル CoA、 GoAグルタチオンジスルフィドといった短鎖（ C ₈以下）脂肪酸 GoAエステル類、チォエステル類などの測定に適している。

生体試料から GoA類を抽出する際に使用する強酸性溶液は、一般的に生体試料をタンパク変性させ、測定対象化合物を抽出する溶液であリ、好適な具体例としてはトリクロ口酢酸溶液、過塩素酸溶液などが挙げられる。具体的抽出方法は特に限定するものではなく、測定する試料、測定対象によリ適宜選択するものであり、例えば筋肉や脳などの生体組織を液体窒素で凍結後粉砕し、上記強酸性溶液で所定濃度となるように加え、充分に攪袢した後、遠心分離し、その上清を生体試料抽出溶液とする。

添加する内部標準物質の好適な具体例は、上記の GoA類、あるいはそれらの同位体である。内部標準法の性格からすれば、測定対象 CoA と内部標準物質は物理的性質、化学的性質などが類似であり、本法の過程においてできるだけ両者が同じ挙動を示すが、検出する際には、互いに干渉せず分離できる関係が好ましい。かがる関係を満足する為に以下のような内部標準物質の選択基準を満たすような GoA類縁体、 C oA同位体を選択するのが好ましい。

GoA類縁体は測定対象 GoAと比較して、炭素数差が 3個以内であリ、測定対象 GoAの主炭素鎖がアルコール、ァミン、カルボン酸などの官能基を有する場合は、内部標準物質も同様の官能基を有することが好ましい。また GoA同位体は、測定対象 GoAのァシル基の主炭素鎖の水素が 3個以上重水素、または^{1 3} Cに置き換わっているものであって、かつ上記 GoA類縁体の基準を満たすものが好ましい。

—方で CoA類は、基本的には生体由来のものが存在する為、使用する内部標準物質としては前記重水素体や^{1 3} C体、 N -ァシル GoAなど人ェ的に合成したものが好ましい。例えば、ラット肝臓中のマロニル G oAを測定するには、ァセチル GoAが高濃度で内在するためァセチル Go Aを内部標準物質として使用することは出来ず、ァセチル GoA - d ₃体、ァセトァセチル GoA- d ₃体、ァセトァセチル GoA- d ₅体、メチルマロニル GoA— d ₃体、メチルマロニル CoA- d ₄体、プロピオニル G oA- d ₃ 体、プロピオニル GoA- d ₅体、イソプチリル GoA- d ₇体、或はメチルマロニル GoA- ^{1 3} C ₃体を使用するのが好ましい。

内部標準物質の添加は強酸性溶液にて生体試料中から GoAを抽出した上清に添加するか、強酸性溶液中に初めから加えておくかのどちらでもよい。また処理過程であまリに内部標準物質の挙動が異なるのであれば、 HP LGサンプル調製時に添加し、質量分析計のイオン化の補正の役割のみとして使用してもよい。

抽出上清は強酸性溶液である為、中和、溶媒交換等によリ中性領域に pHを調整した後、 HPLGに注入する。 HPLG注入サンプルは、 pHを 3〜 1 0に調整する。なかでも pHが 3〜 8の中性領域で測定するのが測定感度、再現性、安定性の点から好ましい。 pH 2以下の酸性側になると、 CoAのリン酸基の影響を受けてクロマ卜のピークのテーリングが起こる他、力ラムに吸着するなどの影響がある。また pH I O以上の塩基性になると、 GoA類が分解するなどの影響が出る。 pHの調製に用いる試薬には、酢酸アンモニゥムゃリン酸カリウムなどの緩衝作用を有する p H調整剤を使用することが出来る。

脳など生体試料中の GoA類の濃度が低い試料測定、高感度分析を行なうに当たっては濃縮操作を実施する。濃縮の好適な方法としては、凍結乾燥、減圧濃縮、液液抽出、固相抽出、オンライン濃縮などが挙げられるが、なかでも固相抽出が好ましい。

固相抽出は、逆相系、順相系、イオン交換性などの市販カートリツジがあるが、逆相系カートリッジが再現性が良く、 GoA類測定に適している。順相系は GoA類の極性が高い為適さず、イオン交換系は、今回の強酸性溶液で抽出する場合、塩濃度が高すぎて担体に保持させることが困難である。

固相抽出の操作は、まず、固相力一卜リッジを有機溶媒と水系溶媒などを用いてコンディショニング操作を施した後、生体試料中から強酸性溶液で抽出した GoA類の抽出上清を中和したものをカートリッジにアプライし、 GoA類を固相カートリッジに吸着させ、次いで水系溶媒で洗浄した後、吸着した GoA類を溶出させる。

コンディショニング操作は、有機溶媒と高濃度の ¾類溶液で行う。逆相系カートリッジを使用する場合はァセ卜二トリル及び 1 M酢酸アンモニゥムでコンディショニングを行う。具体的には、 1 00 %ァセ卜二卜リルを固相カートリッジに注入させた後、塩類の析出を避ける為、一旦 50%ァセトニトリル水溶液で力一トリッジ中のァセトニトリル濃度を下げ、その後 1 M酢酸アンモニゥ厶水溶液を注入することで力一トリッジのコンディショニングを行う。 50 m M程度の低濃度の酢酸アンモニゥムでは、逆相系力一トリッジに GoA類を完全に保持することが出来ず、回収率が悪くなる。

コンデイショニング操作に使用する有機溶媒は、ァセトニトリルのほか、メタノール、 2—プロパノール等の一般的有機溶媒を使用するこ-とが出来る。また塩溶液としては、酢酸アンモニゥムの他、ギ酸ァンモニゥム、炭酸アンモニゥ厶、或はリン酸ナトリウム、リン酸カリゥ厶等を使用することが出来る。含有濃度は 200mMから 2 Mが好ましい ( 洗浄用の水系溶液は、水が好ましいが、これに酢酸アンモニゥムゃリン酸ナトリウム等の塩類を含んでも良い。更に洗浄効果を高めるために、 GoA類が溶出しない程度のァセトニトリルやメタノール等の有機溶媒を含有することも可能である。 CoA類の洗浄溶媒の水の比率は 5 0 «½以上とし、特に短鎖脂肪酸 GoAエステルの測定では極性が高い為、有機溶媒無添加の水溶液とするのが好ましい。

その後、溶出溶媒を使用して、カートリッジに保持した測定対象 G oAを溶出する。溶出溶媒は固相抽出で使用される一般的な有機溶媒、例えばメタノール、ァセ卜二卜リル、 2—プロパノール、アセトン、テトラヒドロフランなどと水または前述の洗浄液で使用した水系溶媒の混合液を使用し、混合比率（0〜 1 00<½ ) は測定対象の GoA及び内部標準物質の溶出動態及び夾雑物の溶出動態から適宜決定する。

マロニル GoAなどの短鎖脂肪酸 GoAエステルの場合、 20 %程度の有機溶媒溶液で溶出が可能であるが、その後の溶媒留去のため 20〜75 <½で行なうのが好ましい。 1 00 %近くになると夾雑物溶出の影響がある。

溶出液の溶媒を留去して、再溶解液で残渣を再溶解する。もし、内部標準物質を強酸性溶液による抽出液に添加しなかった場合、この時点で一定量を添加する。

GoA類と内部標準物質の HPLG分離において、液体クロマ卜グラフ用分離カラムは一般的に逆相クロマトグラフィ一用として市販されているものを使用すればよいが、なかでもォクタデシルシラン基（ C 1 8 ) が結合しているシリ力ベースの充填剤が好ましい。その他ォクチルシラン基（G8 ) が結合したシリカベースの充填剤やアミド系、特にカルバモイル基化学結合型シリカゲルを使用することも可能である。

カラムサイズは市販されている分析用のものでよく、内径 1 mm以上、 1 0mm以下で、長さが 50圆以上、 250圓以下のもので測定が可能である。ただし、サイズに関してはこれに限定することなく、基本的には測定対象物質がきちんと保持さて、きれいなピーク形状を示せばよい。移動相は逆相 HPLCで通常用いられる溶媒を使用し、好ましくは蒸発性または昇華性の酢酸アンモニゥムなどの塩が含有されている方がよい。

GoA類と内部標準物質の質量分析計による検出において、質量分析計の好適な具体例は四重極型、セクタ一型、トリプル四重極型、ィォントラップ型、飛行時間型、四重極飛行時間ハイプリッド型などが挙げられる。なかでも四重極型、トリプル四重極型が好ましく、特に卜リプル四重極型が最も好しい。検出条件は化合物に応じたマスュニッ卜を設定し、分析カラム上で分離されたピークを検出する。

検出された測定対象 GoAと内部標準物質の面積比からの定量において、検量線用に調整したサンプルを上記検出条件を用いて測定し、得られた測定対象 GoAと内部標準物質とのピーク面積比と濃度を用いて検量線を作成する。検量線は最小二乗法による一次回帰直線から作成し、実サンプル測定で得られた測定対象 CoAと内部標準物質とのピーク面積比を逆算回帰させ、測定対象 GoAの濃度を算出する。実施例

以下、本発明の GoA類の測定方法について、筋肉中、肝臓中及び脳中のマロ _t二ル GoAの測定に関する実施例を示す。

1 . 標準溶液の調製

マロニル CoA リチウム塩、数 m gを精密天秤で正確に量りとリ、 1 0 mMの濃度になるように 6%過塩素酸で溶解し標準原液とした。この標準原液を 6%過塩素酸で順次希釈することにより、 1 0 1« , 5 μ Μ , 1 Μ， 500nM， 100nM, 50nM, 10nM検量線用標準溶液を調製した。また同様に標準原液を 6%過塩素酸で順次希釈することにより、 50 M, 5 i M, 50 0 nM 再現性確認（QG)用標準溶液を調製した。 2. 内部標準溶液（IS)の調製

ァセチル GoA-d ₃体数 mgを精密天秤で正確に量リとり、 10 ιτιΜの濃度になるように 6%過塩素酸で溶解し標準原液とした。この標準原液を 6 %過塩素酸で希釈することにより、 5 Mの溶液を調製した。尚、ァセチル GoA-d ₃体は、原料に GoAと、無水酢酸一 d6を用いて Simonの方法（Simon, E.丄， J. A. S.， 1953, 75, 2520) に従って合成した。

3. 測定試料溶液の調製

1 ) 生体試料抽出液の調製

ウィスター系ラットの筋肉、肝臓、脳を摘出した直後に、液体窒素中で凍らせ粉々に粉砕した後、 6%過塩素酸を 5ml/g wet wt.になるように加え、よく攪拌した。 9000回転で遠心分離し、上清を生体試料抽出液とした。

2 ) 試料前処理法

筋肉、肝臓中濃度測定の場合：酢酸アンモニゥ厶溶液（pH未調製） 300 しに、検量線用標準溶液、生体試料抽出液、 QC用は生体抽出液の複数個体分をプールしたもの 200 ju L、 I S溶液 20 し、 QG用のみ QG用標準溶液 20 Lを添加して、固相抽出用試料とした。

脳中濃度測定の場合： 1M酢酸アンモニゥム溶液（pH未調製） 450 しに、検量線用標準溶液、生体試料抽出液、 QG用は生体抽出液の複数個体分をプールしたものし、 I S溶液 20 ^ し、 QG用のみ QG用標準溶液 20 しを添加して、固相抽出用試料とした。

固相抽出カートリッジであるポンドェルート C 18 100mg/1mL (バリアン社製）をァセトニトリル 1mし、 50%ァセトニトリル水溶液 1ιτιし 1Μ 酢酸アンモニゥム溶液（pH未調整） 1 m Lでコンディショニングした後、固相抽出用試料をアプライした。水 1 m Lで洗浄し、ァセトニトリル/ ·50πΜ酢酸アンモニゥム溶液（ρΗ未調整） = 2 8の混合溶液 1 m Lで溶出した溶液を凍結乾燥して溶媒留去した。そして残渣に水 2 Ο μ Lを加えて溶解したものを測定試料溶液とし、 Lを LG/MS/M Sシステムに注入した。

4. 測定装置および装置条件

1 ) 測定機器

LC/MS/MSシステムとして、以下に記載のある装置、機器を使用した。

HPLGシステム： Agi lent 1100 (Agi lent)

ォー卜サンプラー： Shimadzu SIL-HTc (島津製作所）質量分析装置： API 3000 (Appl ied Biosystems)

2 ) HPLG条件

HPLGの分析条件は、分析カラムとして AQUA G18、ガードカラムとして AQUA G18用ガードカラムを使用し、カラム温度 25°C、移動相は 10m M酢酸アンモニゥム（pH未調整）水溶液（A液）およびメタノール（B液）を使用し、流速 1 ml/minで、表 1 に示すグラジェント条件で行なった。

表 1 HPLGグラジェント条件

3 ) M S条件

質量分析は、イオン化法（ターボイオンスプレー、ポジティブモード）で行い、マロニル GoAイオン（Q1 :854 (m/z)、 Q3:347 (m/z) ) 、ァセチル GoA- d ₃体イオン（Q1 :813(m/z；)、 Q3： 306 (m/z) ) を測定した。 4 ) 定量値の算出方法

ピークの同定は MRM法（マロニル GoA:m/z 854→347, IS： m/z 813→3 06)によリ得られた保持時間及びモニターイオンの質量数により行い. 定量はマロニル GoAと ISのピーク面積比による内部標準法によって行なった。検量線式、 QG試料及び生体試料中抽出液の定量値について、検量線式は ISに対するマロニル GoAのピーク面積比（y)と濃度（X)との関係を用いて最小二乗法（重み 1/x) により求めた。

y = a x + b

x:濃度、 y:ピーク面積比

QG試料及び生体試料中抽出液の濃度は、検量線式によリ次式で求めた。

X = ( y — b ) Z a

X:求める濃度

5. 結果

1 ) 直線性：検量線用試料を上記分析法に従って測定し、検量線を作成した（表 2 ) 。 1/Xの重み付けを行い、相関係数（r)は 0.9998、相対誤差（RE) は一 7.5〜十 6.8%と、良好な直線性を示した。

表 2 ：検量線データ

理論値（nM) 実測値（nM) 相対誤差（％)

10 10.7 6.8

50 46.3 -7.5

100 94.8 - 5.2

500 506 1.2

1, 000 1, 040 4.4

5, 000 5, 070 1.4

10， 000 9, 890 -1.1

相関係数（r) 0.9998 2 ) 再現性：

再現性確認（QG)試料として、ブランク試料（Q0) 及び 500 n M， 5jW M, 50j« Mの QC用標準溶液を添加した QC試料（Q1, Q2, Q3、各濃度 N=3) のマロニル GoA濃度を測定した。 QC1 ~QG3は、得られた定量値から Q0 を差し引いた値であり、表 3から表 5に示すように、筋肉中濃度においては精度（％CV) 1. 7 - 9. 1 %.真度（％RE) - 4. 3〜 5■ 7 %、肝臓中濃度においては精度（％GV) 3. 0〜 8 · 2 %、真度（％RE) — 5. 6〜 9. 1 o/o、脳中濃度においては精度（％GV) 2. 0〜 7. 5 %、真度（％RE) — 3. 6〜 6. 9 %といずれも良好な値を示した。

3 ) 生体試料中のマロニル GoA濃度の測定：

ウィスター系ラッ卜 6個体について、筋肉、肝臓、及び脳中のマロニル GoA濃度を測定した。クロマトグラム（図 1 乃至図 3 ) 及び測定結果（表 6乃至表 8 ) を示す。表 6 ウイスタッ卜筋肉中のマロニル GoA濃度

ゥイスター系ラマロニル GoA濃度

ット個体 No. (nmol/g wet wt. )

1 5.94

2 5.21

3 6.41

4 6.01

5 4.54

6 4.12 表 7 ウィスター系ラット肝臓中のマロニル GoA濃度

表 8

発明の効果

本発明による測定法によれば、生体試料中の GoA類を L C— M Sを用いて、正確に再現性よく定量的に測定することが可能となる。

表 3 筋肉サンプルを用いた再現性確認試験結果

表 4 肝臓サンプルを用いた再現性確認試験翁

肝臓 QCO QC1 QC2 QC3

QC sample Endogenous level 0. 25nmol/g wet wt. 2. 5 nmol/g wet wt. 25 nmol/g wet wt. mean (nmol/ g wet wt. ) 0. 50 0. 272 2. 67 23. 6

CV (%) 8. 2 4. 8 5. 0 3. 0

RE (%) 9. 1 6. 8 -5. 6 表 5 脳サンプルを用いた再現性確認試鹦結果

m ~ QCO QC1 QC2 QC3

QC sample Endogenous level 125 praol/g wet wt. 1250 pmol/g wet wt. 12500 pmol/g wet wt mean 、pmol/g wet wt. ) 51. 6 120. 5 1336 13337

CV (%) 4. 6 7. 5 2. 0 4. 3

RE (%) . - 3. 6 6. 9 6. 7

Claims

請求の範囲

1 . 生体試料中の補酵素 A類の濃度を測定する方法であり、生体試料を強酸性溶液を使用して抽出するステップ、固相抽出ステツプ、内部標準物質を添加するステップ、 L C— M Sを用いて検出するステップを備えることを特徴とする補酵素 A類の測定方法。

2 · 上記生体試料から補酵素 A類を抽出するステップが、凍結粉砕した上記生体試料を過塩素酸溶液で攪袢した後に、上清を遠心分離するステップであることを特徴とする請求項 1 記載の補酵素 A類の測定方法。

3 . 上記固相抽出ステップが、上記補酵素 A類を強酸性溶液で抽出した上清を中和した後、ォクタデシルシリル基乃至ォクチルシリル基を有するシリカゲルを充填した逆相系カートリッジにアプライし、水系溶媒で洗浄した後、有機系溶媒で溶出させるステップであることを特徴とする請求項 1 、 2記載の補酵素 A 類の測定方法。

4 . 上記逆相カートリッジを、ァセトニトリル及び 1 M酢酸アンモ

, ニゥム溶液でコンディショニングした後に、上記上清をァプラィすることを特徴とする請求項 3記載の補酵素 A類の測定方法。

5 . 上記有機系溶媒が、ァセトニトリル及び酢酸アンモニゥム混合溶液であることを特徴とする請求項 3記載の補酵素 A類の測定方法。

6 . 該補酵素 A類が脂肪酸補酵素 Aエステル類であり、該内部標準物質が、該補酵素 A類の構造類似体であることを特徴とする請求項 1 記載の補酵素 A類の測定方法。

7 . 該脂肪酸補酵素 Aエステル類が、主炭素鎖の炭素数が 2〜 8個の短鎖脂肪酸補酵素 Aエステルであリ、該構造類似体が該補酵素 A類との炭素数差が 3個以内であり、且つァシル基の主炭素鎖の水素が 3個以上重水素に置換されたもの、或いは主炭素の炭素が 3個以上 ^{1 3} Cに置換されたものであることを特徴とする請求項 6記載の補酵素 A類の測定方法。

該補酵素 A類がマロニル GoAであり、該構造類似体がァセチル G oA - d ₃体、メチルマロニル CoA- d ₃体、メチルマロニル GoA- d ₄体、プロピオニル GoA - d ₃体、プロピオニル GoA- d ₅体、メチルマロニル GoA- ^{1 3} C ₃体であることを特徴とする請求項 7記載の補酵素 A類の測定方法。