WO2003087356A2 - Helicokinin-rezeptor aus insekten - Google Patents

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WO2003087356A2
WO2003087356A2 PCT/EP2003/003519 EP0303519W WO03087356A2 WO 2003087356 A2 WO2003087356 A2 WO 2003087356A2 EP 0303519 W EP0303519 W EP 0303519W WO 03087356 A2 WO03087356 A2 WO 03087356A2
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dna
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    • C07K14/43563—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
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    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons

Definitions

  • the invention relates to polypeptides which exert the biological activity of a helicokinin receptor, as well as polynucleotides which code for these polypeptides and in particular their use for finding active substances for crop protection.
  • a chemical compound found in a high throughput screening or other way e.g. B. modulating on a target protein from insect pests, can be tested directly on a homologous target protein, which was cloned from one or more mammalian species, for selectivity in order to exclude broadly active toxic compounds. Those are particularly good as target proteins To look at proteins from insect pests, for example, which do not occur in higher organisms, such as mammals.
  • Receptors for biologically active peptides in insects are particularly good target proteins and thus targets for the development of new insecticides.
  • the biological effect of these peptides is mediated by binding to specific receptor proteins in insect cells. Many of these endocrine or neuronal peptides interact with G protein-coupled receptors (GPCRs; King and Wilson, 1999) that activate heterotrime G proteins after the binding of a corresponding peptide ligand (Vanden Broeck et al., 1997).
  • GPCRs G protein-coupled receptors
  • Antagonists that can bind to peptide receptors and that can be derived from natural peptides or that have a completely new chemical structure can interfere with normal insect development, growth, behavior or homeostasis, for example, and in this way insects -generate specific and receptor-specific novel insecticides.
  • peptides that can influence juvenile hormone biosynthesis can influence juvenile hormone biosynthesis (allatotropins and allatostatins, Tobe et al., 1994), insulin-like peptides (Lagueux et al., 1990), peptides that regulate the water balance (Coast, 1998), or those peptides that can control muscle activity (Holman, 1986; for an overview, see Gäde, 1997b) can be isolated from different species.
  • Peptides from the kinine group have been isolated from a number of insect species from various families, including Dictyoptera, Orthoptera and Lepidoptera (Coast, 1998; Blackburn et al., 1995).
  • the first members of this family of peptides were isolated based on their ability to induce contractions in the isolated intestine in cockroaches (Holman, 1991).
  • Kinins are particularly potent, diuretic peptides in insects that stimulate the secretion of primary urine in the Malpighian organs (Coast, 1998).
  • the biological functions of the peptides can be checked in various tests, which measure, for example, muscle activity (Holman, 1991) or the excretion of water and electrolytes (Ramsey, 1954). Some of these biologically active peptides have been described that in vivo an experimentally induced exaggerated effect can lead to the death of the insect pests (Seinsche et al., 2000).
  • Receptors of kinin peptides are described in mollusks from the pond snail Lymnea stagnalis (Cox et al., 1997) and in Acari from a tick species (Boophilus microplus, Holmes et al, 2000). Only in Drosophila melanogaster is a receptor for a Drosophila kinin described from insects (Terhzaz et al., 1999). The cellular response to kinin stimulation in insects is an increase in the intracellular calcium concentration, which ultimately leads to an influx of chloride ions into the lumen of the Malpighian vessels (Coast, 1998).
  • Drosophila melanogaster from the Diptera family is an important model organism for insect genetics, but does not play a major role in agriculture as a harmful insect.
  • the present invention is therefore based on the object of binding further receptors to which endocrine or neuronal peptides from insects, in particular from economically important insect pests, and via the binding of which the biological functions of these peptides can be mediated, and test systems based thereon with a high throughput to provide test compounds (high throughput screening assays; HTS assays).
  • polypeptides which exercise at least one biological activity of a helicokinin receptor and comprise an amino acid sequence which have at least 70% identity, preferably at least 80% identity, particularly preferably at least 90% identity, very particularly preferably have at least 95% identity, with a sequence according to SEQ ID NO: 2 over a length of at least 20, preferably at least 25, particularly preferably at least 30 consecutive amino acids and very particularly preferably over their total length.
  • the degree of identity of the amino acid sequences is preferably determined with the aid of the GAP program from the GCG program package, version 9.1 under standard settings (Devereux et al., 1984).
  • polypeptides refers to both short amino acid chains, commonly referred to as peptides, oligopeptides, or oligomers, and longer amino acid chains, commonly referred to as proteins. It includes amino acid chains that can be modified either by natural processes, such as post-translational processing, or by chemical processes that are state of the art. Such modifications can occur at various locations and multiple times in a polypeptide, such as, for example, on the peptide backbone, on the amino acid side chain, on the amino and / or on the carboxy terminus.
  • acetylations include, for example, acetylations, acylations, ADP ribosylations, amidations, covalent linkages with Flavins, heme portions, nucleotides or nucleotide derivatives, lipids or lipid derivatives or phosphatidylinositol, cyclizations, disulfide bridging, demethylations, cystine formations, formylations, gamma-carboxylations, glycosylations, hydroxylations, iodinations, methylations, myristoylations,, oxidations , proteolytic processing, phosphorylation, selenoylation and tRNA-mediated addition of amino acids.
  • polypeptides of the invention can be in the form of "mature” proteins or as parts of larger proteins, e.g. as fusion proteins. Furthermore, they can have secreting or "leader” sequences, pro sequences, sequences which enable easy purification, such as multiple histidine residues, or additional stabilizing amino acids.
  • polypeptides according to the invention do not have to be complete receptors, but can also only be fragments thereof, as long as they at least still have a biological activity of a complete helicokinin receptor.
  • polypeptides according to the invention can have deletions or amino acid substitutions compared to the corresponding region of naturally occurring receptors, as long as they still exert at least a biological activity of the complete helicokinin receptors.
  • Conservative substitutions are preferred.
  • conservative substitutions include variations in which one amino acid is replaced by another amino acid from the following group:
  • Aromatic residues Phe, Tyr and Trp.
  • biological activity of a helicokinin receptor means the binding of helicokinin to a peptide receptor.
  • Preferred forms of the polypeptides according to the invention are helicokinin receptors from lepidopters, in particular from Heliothis virescens.
  • a particularly preferred embodiment of the polypeptides according to the invention is the Helicoldnin receptor from Heliothis virescens, which has the amino acid sequence according to SEQ ID NO: 2.
  • the present invention also relates to polynucleotides which code for the polypeptides according to the invention.
  • polynucleotides according to the invention are in particular single-stranded or double-stranded deoxyribonucleic acids (DNA) or ribonucleic acids (RNA).
  • DNA deoxyribonucleic acids
  • RNA ribonucleic acids
  • Preferred embodiments are fragments of genomic DNA, which may contain introns, and cDNAs.
  • a preferred embodiment of the polynucleotides according to the invention is a cDNA which has a polynucleotide sequence according to SEQ ID NO: 1.
  • Polynucleotides which hybridize to the sequences according to SEQ ID NO: 1 under stringent conditions are also encompassed by the present invention.
  • hybridize describes the process in which a single-stranded nucleic acid molecule is base paired with a complementary strand.
  • DNA fragments from insects other than Heliothis virescens, for example, which code for polypeptides with the biological activity of helicokinin receptors can be isolated.
  • Hybridization solution 6X SSC / 0% formamide
  • preferred hybridization solution 6X SSC / 25% formamide
  • Hybridization temperature 34 ° C
  • preferred hybridization temperature 42 ° C
  • 2nd washing step 2X SSC at 45 ° C; preferred 2nd washing step: 0.6X SSC at 55 ° C; particularly preferred 2nd washing step: 0.3X SSC at 65 ° C.
  • the present invention encompasses polynucleotides which have an at least 70% identity, preferably at least 80% identity, particularly preferably at least 90% identity, very particularly preferably at least 95% identity, with a sequence according to SEQ ID NO: 1 over a length of at least 20, preferably at least 25, particularly preferably at least 30 consecutive nucleotides and very particularly preferably over their total length.
  • the degree of identity of the polynucleotide sequences is preferably determined with the aid of the GAP program from the GCG program package, version 9.1 under standard settings.
  • the present invention furthermore relates to DNA constructs which comprise a polynucleotide according to the invention and a heterologous promoter.
  • heterologous promoter refers to a promoter which has different properties than the promoter which controls the expression of the gene in question in the original organism.
  • promoter as used herein generally refers to expression control sequences.
  • heterologous promoters depend on whether pro- or eukaryotic cells or cell-free systems are used for expression.
  • heterologous promoters are the early or late promoter of SV40, adenovirus or cytomegalovirus, the lac system, the trp system, the main operator and promoter regions of the phage lambda, the control regions of the fd coat protein, the promoter of the 3-phosphoglycerate kinase coding gene, the promoter of the gene coding for acid phosphatase and the promoter of the gene coding for the ⁇ -mating factor of the yeast.
  • the invention furthermore relates to vectors which contain a polynucleotide according to the invention or a DNA construct according to the invention. All plasmids, phasmids, cosmids, YACs or artificial chromosomes used in molecular biological laboratories can be used as vectors.
  • the present invention also relates to host cells which contain a polynucleotide according to the invention, a DNA construct according to the invention or a vector according to the invention.
  • host cell refers to cells that do not naturally contain the polynucleotides of the invention.
  • Suitable host cells are both prokaryotic cells, such as bacteria of the genera Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces, Streptococcus, Staphylococcus, preferably E. coli, and eukaryotic cells, such as yeast, mammalian, amphibian, insect or plant cells.
  • Preferred eukaryotic host cells are HEK-293, Schneider S2, Spodoptera Sf9, Kc, CHO, COS1, COS7, HeLa, C127, 3T3 or BHK cells and in particular Xenopus oocytes.
  • the invention furthermore relates to antibodies which bind specifically to the abovementioned polypeptides or receptors.
  • Such antibodies are produced in the usual way.
  • such antibodies can be produced by injecting a substantially immunocompetent host with an amount of the invention effective for antibody production Polypeptide or a fragment thereof and by subsequent recovery of this antibody.
  • an immortalized cell line which produces monoclonal antibodies can be obtained in a manner known per se.
  • the antibodies can optionally be labeled with a detection reagent.
  • Preferred examples of such a detection reagent are enzymes, radioactively labeled elements, fluorescent chemicals or biotin.
  • fragments can also be used which have the desired specific binding properties.
  • antibody as used herein also extends to parts of complete antibodies, such as Fa-, F (ab ') 2 - or Fv fragments, which still have the ability to target the epitopes of the polypeptides according to the invention tie.
  • the polynucleotides according to the invention can be used in particular for the production of transgenic invertebrates. These can be used in test systems which are based on an expression of the polypeptides according to the invention which differs from the wild type. Furthermore, on the basis of the information disclosed herein, it is possible to produce transgenic invertebrates in which the modification of other genes or promoters causes a change in the expression of the polypeptides according to the invention.
  • transgenic invertebrates are produced, for example, in Drosophila melanogaster by gene transfer mediated by P element (Hay et al., 1997) or in Caenorhabditis elegans by gene transfer mediated by transposon (e.g. by Tel; Plasterk, 1996).
  • the invention thus also relates to tansgenic invertebrates which contain at least one polynucleotide according to the invention, preferably transgenic invertebrates of the species Drosophila melanogaster or Caenorhabditis elegans, and their transgenic progeny.
  • the transgenic invertebrates preferably contain the polypeptides according to the invention in a form which differs from the wild type.
  • the present invention furthermore relates to processes for producing the polypeptides according to the invention.
  • host cells which contain a polynucleotide according to the invention can be cultivated under suitable conditions.
  • the polynucleotide to be expressed can be adapted to the "codon usage" of the host cells.
  • the desired polypeptides can then be isolated from the cells or the culture medium in a conventional manner.
  • the polypeptides can also be produced in in vitro systems.
  • a rapid method for isolating the polypeptides according to the invention begins with the expression of a fusion protein, whereby the fusion partner can be affinity-cleaned in a simple manner.
  • the fusion partner can be, for example, glutathione S-transferase.
  • the fusion protein can then be purified on a glutathione affinity column.
  • the fusion partner can be separated by partial proteolytic cleavage, for example on linkers between the fusion partner and the polypeptide according to the invention to be purified.
  • the linker can be designed to include target amino acids, such as arginine and lysine residues, which define sites for trypsin cleavage. Standard cloning techniques using oligonucleotides can be used to create such linkers.
  • detergent extractions are preferably carried out in the cleaning processes, for example using detergents which act as secondary and Do not influence the tertiary structures of the polypeptides, or influence them only slightly, such as non-ionic detergents.
  • the purification of the polypeptides according to the invention can include the isolation of membranes starting from host cells which express the polynucleotides according to the invention. Such cells preferably express the polypeptides according to the invention in a sufficient number of copies, so that the amount of polypeptides in a membrane fraction is at least 10 times higher than that found in comparable membranes - by cells which naturally express helicokinin receptors; the amount is particularly preferably at least 100 times, very particularly preferably at least 1000 times higher.
  • isolation or purification means that the polypeptides of the invention are separated from other proteins or other macromolecules of the cell or tissue.
  • a composition containing the polypeptides according to the invention is preferably enriched at least 10-fold and particularly preferably at least 100-fold with respect to the protein content of polypeptides according to the invention compared to a crude extract from host cells.
  • the purity or the protein content of the preparations can be determined in a manner known per se, for example by SDS polyacrylamide gel electrophoresis.
  • polypeptides according to the invention can also be affinity-purified without fusion partners using antibodies which bind to the polypeptides.
  • the present invention furthermore also relates to processes for producing the polynucleotides according to the invention.
  • the polynucleotides according to the invention can be produced in the usual way.
  • the polynucleotides can be synthesized completely chemically. It is also possible to chemically synthesize only short pieces of the polynucleotides according to the invention and to label such oligonucleotides radioactively or with a fluorescent dye.
  • the marked Oligonucleotides can be used to search cDNA libraries made from insect mRNA or genomic libraries made from insect genomic DNA. Clones to which the labeled Ohgonuldeotide hybridize are selected to isolate the DNA in question. After characterization of the isolated DNA, the polynucleotides according to the invention are obtained in a simple manner.
  • the polynucleotides according to the invention can also be produced by means of PCR methods using chemically synthesized Ohgonuldeotide.
  • oligonucleotide (s) as used herein means DNA molecules consisting of 10 to 50 nucleotides, preferably 15 to 30 nucleotides. They are chemically synthesized and can be used as probes.
  • new active substances for crop protection or pharmaceutical active substances for the treatment of humans and animals such as chemical compounds which, as modulators, in particular as agonists or antagonists, change the properties of the helicokinin receptors according to the invention can be identified become.
  • a recombinant DNA molecule which comprises at least one polynucleotide according to the invention is introduced into a suitable host cell.
  • the host cell is cultivated in the presence of a compound or a sample which comprises a multiplicity of compounds under conditions which allow the expression of the receptors according to the invention.
  • a change in the receptor properties can be detected, for example, as described in Example 2 below. In this way it is possible to find insecticidal substances, for example.
  • Receptors preferably change the concentration of intracellular cAMP or intracellular calcium via an interaction with G proteins after activation. Changes in the receptor properties due to chemical compounds can Therefore, after heterologous expression, for example by measuring the intracellular cAMP concentrations directly via ELISA assay systems (Biomol, Hamburg, Germany) or RIA assay systems (NEN, Schwalbach, Germany) in HTS format. Indirect measurement of the cAMP concentration is possible with the help of reporter genes (eg luciferase), the expression of which depends on the cAMP concentration (Stratowa et al, 1995). The coexpression of receptors with special G proteins, e.g.
  • G ⁇ l5, G l6 or also chimeric G proteins in heterologous systems and the measurement of the increase in calcium, e.g. with fluorescent dyes or equorine, is an alternative screening option (Stahles et al., 1997 ; Conklin et al., 1993).
  • binding of GTP to the activated G protein can be used as a read-out system for the testing of substances.
  • the polynucleotides or polypeptides according to the invention also make it possible to find compounds which bind to the receptors according to the invention without having to measure a change in the activity of the receptors.
  • host cells which contain the polynucleotides according to the invention and express the corresponding receptors or polypeptides or the gene products themselves are brought into contact with a compound or a mixture of compounds under conditions which allow the interaction of at least one compound with the host cells, the receptors or the individual Allow polypeptides.
  • the polypeptides according to the invention can be used in labeled form in such binding experiments.
  • agonist refers to a molecule that activates the receptors of the invention.
  • modulator refers to a molecule that displaces an agonist from its binding site.
  • modulator as used herein represents the generic term for agonist or antagonist.
  • Modulators can be small organic chemical molecules, peptides or antibodies that bind to the polypeptides according to the invention.
  • modulators can be small organic chemical molecules, peptides or antibodies which bind to a molecule which in turn binds to the polypeptides according to the invention and thereby influences their biological activity. Modulators may 'constitute natural substrates and ligands mimetics.
  • the modulators are preferably small organic chemical compounds.
  • the binding of the modulators to the polypeptides according to the invention can change the cellular processes in a way which leads to the death, paralysis or sterility of the insects treated therewith.
  • In vivo tests on insects, insect larvae or insect eggs to verify the insecticidal properties of the found modulators are well known.
  • the present invention therefore also extends to the use of modulators of the polypeptides according to the invention as insecticides or medicaments - hereinafter referred to as "active ingredients”.
  • the active compounds can be converted into the customary formulations, such as solutions, emulsions, wettable powders, suspensions, powders, dusts, pastes, soluble powders, granules, suspension emulsion concentrates, active substance-impregnated natural and synthetic substances and very fine encapsulations in polymeric substances.
  • formulations are prepared in a known manner, for example by mixing the active ingredients with extenders, that is to say liquid solvents and / or solid carriers, if appropriate using surface-active agents, ie emulsifiers and / or dispersants and / or foam-generating agents. If water is used as an extender, organic solvents can, for example, also be used as auxiliary solvents.
  • extenders that is to say liquid solvents and / or solid carriers, if appropriate using surface-active agents, ie emulsifiers and / or dispersants and / or foam-generating agents.
  • surface-active agents ie emulsifiers and / or dispersants and / or foam-generating agents.
  • organic solvents can, for example, also be used as auxiliary solvents.
  • aromatics such as xylene, toluene, or alkylnaphthalenes
  • chlorinated aromatics and chlorinated aliphatic hydrocarbons such as chlorobenzenes, chlorethylenes or methylene chloride
  • aliphatic hydrocarbons such as cyclohexane or paraffins, for example petroleum fractions, mineral and vegetable oils
  • Alcohols such as butanol or glycol, and their ethers and esters
  • ketones such as acetone, methyl ethyl ketone, methyl isobutyl ketone or cyclohexanone
  • strongly polar solvents such as dimethyl formamide and dimethyl sulfoxide, and water.
  • Possible solid carriers are: e.g. Ammonium salts and natural rock powders such as kaolins, clays, talc, chalk, quartz, attapulgite, montmorillonite or diatomaceous earth and synthetic rock powders such as highly disperse silica, aluminum oxide and silicates are suitable as solid carriers for granules: e.g. broken and fractionated natural rocks, such as calcite, marble, pumice, sepiolite, dolomite as well as synthetic granules from inorganic and organic flours and granules from organic material, such as sawdust, coconut shells, corn cobs and tobacco stems; as emulsifying and / or foaming agents are possible: e.g.
  • nonionic and anionic emulsifiers such as polyoxyethylene fatty acid esters, polyoxyethylene fatty alcohol ethers, e.g. Alkylaryl polyglycol ethers, alkyl sulfonates, alkyl sulfates, aryl sulfonates and protein hydrolyzates;
  • Possible dispersants are: e.g. Lignin liquor and methyl cellulose.
  • Adhesives such as carboxymethyl cellulose, natural and synthetic polymers in the form of powders, granules or latices, such as gum arabic, polyvinyl alcohol, polyvinyl acetate, and natural phospholipids, such as cephalins and lecithins and synthetic phospholipids, can be used in the formulations.
  • Other additives can be mineral and vegetable oils.
  • Dyes such as inorganic pigments, for example iron oxide, titanium oxide, ferrocyan blue and organic dyes, such as alizarin, azo and metal phthalocyanine dyes and trace nutrients, such as salts of iron, manganese, boron, copper, cobalt, molybdenum and zinc, can be used become.
  • the formulations generally contain between 0.1 and 95% by weight of active compound, preferably between 0.5 and 90%.
  • the active compounds can preferably be used as crop protection agents, in particular for controlling insects from the order of the Lepidoptera, such as, for example, Pectinophora gossypiella, Bupalus piniarius, Cheimatobia brumata, Li hocolletis blancardella, Hyponomeuta padella, Plutella xylostella, Malacos .
  • Lepidoptera such as, for example, Pectinophora gossypiella, Bupalus piniarius, Cheimatobia brumata, Li hocolletis blancardella, Hyponomeuta padella, Plutella xylostella, Malacos .
  • the treatment of the plants and parts of plants with the active compounds takes place directly or by acting on their surroundings, living space or storage space according to the usual treatment methods, e.g. by dipping, spraying, vaporizing, atomizing, scattering, spreading and, in the case of propagation material, in particular in the case of seeds, furthermore by coating in one or more layers.
  • the active ingredients are also suitable for combating insects that farm animals such as cattle, sheep, goats, horses, pigs, donkeys, camels, buffalo, rabbits, chickens, turkeys, ducks, geese, bees, other pets, such as dogs , Cats, house birds, aquarium fish and so-called experimental animals such as hamsters, guinea pigs, rats and mice.
  • farm animals such as cattle, sheep, goats, horses, pigs, donkeys, camels, buffalo, rabbits, chickens, turkeys, ducks, geese, bees, other pets, such as dogs , Cats, house birds, aquarium fish and so-called experimental animals such as hamsters, guinea pigs, rats and mice.
  • the control of these insects is intended to reduce deaths and reduced performance (for meat, milk, wool, skins, eggs, honey, etc.), so that the use of the active ingredients enables more economical and easier animal husbandry.
  • the active ingredients are used in the veterinary sector in a known manner by enteral administration in the form of, for example, tablets, capsules, drinkers, drenches, granules, pastes, boluses, the feed-through method, suppositories, by parenteral administration, such as, for example, by injections (intramuscular, subcutaneous, intravenous, intraperitonal, etc.), implants, by nasal application, by dermal application in the form of, for example, diving or bathing (dipping), spraying (spray), pouring on (pour-on and spot-on), washing, powdering and with the help of shaped articles containing active ingredients, such as collars, ear tags, tail tags, limb tapes, holsters, marking devices, etc.
  • enteral administration in the form of, for example, tablets, capsules, drinkers, drenches, granules, pastes, boluses, the feed-through method, suppositories
  • parenteral administration such as, for example
  • the active ingredients can be formulated (for example powders, emulsions, flowable agents) which contain the active ingredients in an amount of 1 to 80% by weight, directly or after 100 to 10,000 Apply a thinner or use it as a chemical bath.
  • formulated for example powders, emulsions, flowable agents
  • polynucleotides, vectors and regulatory regions according to the invention described above can also be used to find genes which code for polypeptides which are involved in the construction of functionally similar receptors in insects.
  • functionally similar receptors are understood to include receptors which comprise polypeptides which differ in terms of the amino acid sequence from those herein described polypeptides, but have essentially the same functions.
  • SEQ ID NO: 1 shows the polynucleotide sequence of the isolated helicokinin receptor cDNA.
  • SEQ ID NO: 2 shows the amino acid sequence of the polypeptide encoded by the polynucleotide sequence according to SEQ ID NO: 1.
  • Figure 1 shows the result of the electrophysiological measurement after injection of helicokinin receptor DNA into Xenopus oocytes and the addition of helicokinin peptide (Helicokinin III, 100nM, Blackburn et al, 1995) in comparison to the application of peptide to control oocytes in which no helicokinin receptor DNA was previously injected.
  • helicokinin peptide Helicokinin III, 100nM, Blackburn et al, 1995
  • Polynucleotides were manipulated using standard recombinant DNA technology methods (Sambro ⁇ k et al., 1989). Bioinformatic processing of nucleotide and amino acid sequences was carried out with the GCG Version 9.1 program package (GCG Genetics Computer Group, Inc., Madison Wisconsin, USA).
  • sequence region of SEQ ID NO: 1 was amplified by means of polymerase chain reaction (PCR) and cloned into the vector pCMV Script EX (Stratagene, La Jolla, USA).
  • G-protein-activatable potassium channels (GIRK1 and GIRK4) are partially co-expressed in order to measure the activation of the receptors (White et al., 1998).
  • the oocytes come from an adult female Xenopus laevis frog (Horst Kahler, Hamburg, Germany).
  • the frogs are kept in large tanks with circulating water at a water temperature of 18-20 ° C. Parts of the Frog ovars are removed under complete anesthesia through a my incision in the abdomen (approx. 1 cm).
  • the ovary is then shaken for about 140 minutes in 25 ml collagenase (type I, C-0130, SIGMA-ALDRICH CHEMIE GmbH, Deisenhofen, Germany; 355U / ml, prepared in Barth's solution without calcium in mM: NaCl 88, KC1 1 , MgSO4 0.82, NaHCO3 2.4, Tris / HCl 5, pH 7.4).
  • the oocytes are then washed with Barth's solution without calcium. Only oocytes in maturity stage V (Dumont, 1972) are selected for further treatment and filled into microtiter plates (Nunc Micro Well TM plates, cat. No. 245128 + 263339 (Deckel), Nunc GmbH & Co.
  • Injection electrodes with a diameter of 10 - 15 ⁇ m are manufactured with a pipette puller (type L / M-3P-A, List-electronic, Darmstadt-Eberstadt, Germany). Before the injection, aliquots are thawed with the receptor DNA or GIRK1 / 4 DNA and diluted with water to a final concentration of 10ng / ⁇ l. The DNA samples are centrifuged at 3200 g for 120 s (type Biofuge 13, Heraeus Instruments GmbH, Hanau, Germany). A pulled-out PE tube is then used as the transfer tube to fill the pipettes from behind.
  • a pipette puller type L / M-3P-A, List-electronic, Darmstadt-Eberstadt, Germany.
  • the injection electrodes are attached to an X, Y, Z travel unit (machining center EP 1090, isel-automation, Eiterfeld, Germany). With the help of a Macintosh computer, the oocytes in the wells of the microtiter plates are approached and about 50nl of the DNA solution is injected into the oocyte by short pressure application (0.5-3 bar, 3-6s). 3. Electrophysiological measurements
  • a two-electrode voltage clamp with a TURBO TEC-10CD (npi electronic GmbH, Tamm, Germany) amplifier is used for the electrophysiological measurements.
  • Current and voltage electrodes have a diameter of 1 - 3 ⁇ m and are filled with 1.5M KCl and 1.5M potassium acteate.
  • the pipettes have a capacitive resistance of 0.2 - 0.5 MW.
  • the oocytes are transferred to a small chamber which is continuously rinsed with normal Rimland solution (in mM: KCl 90, MgCl 2 3, HEPES 5, pH 7.2).
  • Rimland solution in mM: KCl 90, MgCl 2 3, HEPES 5, pH 7.2.
  • the perfusion solution is replaced by a substance solution with the same composition and additionally the desired substance concentration.
  • a clamping potential of -60mV the successful expression of the receptor DNA is checked after one week. Unresponsive oocytes are discarded. All others are used for substance testing.
  • the data is documented using a YT recorder (YT recorder, model BD 111, Kipp & Zonen Delft BV, AM Delft, The Netherlands).
  • Origin evaluation software Microcal Origin, Microcal Software, Inc., Northampton, MA 01060-4410 USA (Additive GmbH, Friedrichsdorf / Ts, Germany). Average values, standard deviation, IC 5 o values and IC 5 n- Curves are calculated using Origin, and these measurements were performed at least twice.
  • Insect myotropic peptides isolation, structural characterization and biological properties.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Polypeptide, welche die biologische Aktivität eines Helicokinin-Rezeptors ausüben, sowie Polynukleotide, die für diese Polypeptide codieren und insbesondere deren Verwendung zum Auffinden von Wirkstoffen für den Pflanzenschutz.

Description

Helicokinin-Rezeptor aus Insekten
Die Erfindung betrifft Polypeptide, welche die biologische Aktivität eines Helicokinin-Rezeptors ausüben, sowie Polynukleotide, die für diese Polypeptide codieren und insbesondere deren Verwendung zum Auffinden von Wirkstoffen für den Pflanzenschutz.
Die Entwicklung von Pestiziden hat sich traditionell vor allem auf die chemischen und physikalischen Eigenschaften der bekannten, pestizid wirksamen chemischen Verbindungen konzentriert. Als Konsequenz daraus wurde der Schwerpunkt der weiteren Bearbeitung besonders bei der Modifizierung von bereits existierenden chemischen Verbindungen und nicht auf die Auffindung und Entwicklung ganz neuartiger Pestizide mit neuen Wirl-αnechanismen gelegt. Es ist daher von besonderer Bedeutung für die Entwicklung neuer Pestizide, neue biologische Angriffspunkte (Target-Proteine) aus z.B. Schadinsekten zu finden, an denen die potentiellen Pestizide binden und ihre Wirkung entfalten können. Diese neuen Target-Proteine können dann auf verschiedene Weise exprimiert und die biologische Funktion in verschiedenen biochemischen Testverfahren geprüft werden. Des Weiteren können mit Hilfe hochdurchsatzfähiger Testverfahren, dem sogenannten Hochdurchsatz- Screening. eine große Vielfalt von chemischen Substanzen relativ kostengünstig und schnell auf ihre Wirkung an dem neuen Target-Protein überprüft werden. Da von Beginn einer solchen Vorgehensweise an klar ist, an welches Target-Protein eine gegebene chemische Substanz bindet, ist es besonders gut möglich, in einem solchen Target-orientierten Ansatz bei der Entwicklung eines neuen Pestizids auf Selektivität in der Wirkungsweise und damit auf Sicherheit zu achten. Eine in einem Hochdurchsatz-Screening oder auf andere Art aufgefundene chemische Verbindung, die z. B. an einem Target-Protein aus Schadinsekten modulierend wirkt, kann direkt an einem homologen Target-Protein, welches aus einer oder mehreren Säugetier- Spezies Moniert wurde, auf Selektivität geprüft werden, um breit wirksame toxische Verbindungen auszuschließen. Besonders gut als Target-Proteine sind solche Proteine aus z.B. Schadinsekten anzusehen, die nicht in höheren Organismen, wie Säugetieren, vorkommen.
Besonders gut als Target-Proteine und damit als Angriffspunkte für die Entwicklung neuartige Insektizide sind Rezeptoren für biologisch aktive Peptide in Insekten anzusehen. Peptide regulieren die meisten wichtigen Schlüsselfunktionen in Insekten, wie zum Beispiel die Embryonal- und Post-Embryonal Entwicklung, die Ionen- Homeostase, Osmoregulation oder Muskelaktivität (siehe Gäde et al., 1997a; Osborne, 1996). Die biologische Wirkung dieser Peptide wird dabei durch die Bindung an spezifische Rezeptor-Proteine in Insektenzellen vermittelt. Viele dieser endokrinen oder neuronalen Peptide interagieren mit G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs; King und Wilson, 1999), die nach der Bindung eines korresponierenden Peptid-Liganden heterotrime G-Proteine aktivieren (Vanden Broeck et al., 1997). Antagonisten, die an Peptid-Rezeptoren binden können und die von den natürlichen Peptiden abgeleitet sein oder auch eine völlig neuartige chemische Struktur besitzen können, können beispielsweise mit der normalen Insekten-Entwicklung, dem Wachstum, dem Verhalten oder der Homeostase interferieren und auf diese Weise Insekten-spezifische und Rezeptor-spezifische neuartige Insektizide generieren.
Seit der Isolierung des Neuropeptids Proctolin aus Insekten-Muskelpräparationen (Brown und Starratt, 1975) ist eine Vielzahl von Peptiden aus verschiedenen Insekten-Spezies isoliert und charakterisiert worden (zur Übersicht siehe Vanden Broeck et al, 1997; Osborne, 1996). Substantieller Fortschritt wurde vor allem bei der Aufklärung der Aminosäuresequenz solcher Peptide und bei der Aufklärung der biologischen Funktion in den entsprechenden Insekten-Spezies gemacht. So konnten beispielsweise Peptide, die die Juvenilhormon-Biosynthese beeinflussen können (Allatotropine und Allatostatine, Tobe et al., 1994), Insulin-artige Peptide (Lagueux et al., 1990), Peptide, die den Wasserhaushalt regulieren (Coast, 1998), oder solche Peptide, die die Muskelaktivität steuern können (Holman, 1986; zur Übersicht siehe Gäde, 1997b) aus verschiedenen Spezies isoliert werden. Peptide aus der Gruppe der Kinine sind aus einer Reihe von Insekten- Spezies aus verschiedenen Familien, u.a. aus Dictyoptera, Orthoptera und Lepidoptera, isoliert worden (Coast, 1998; Blackburn et al., 1995). Sie haben als Gemeinsamkeit eine hochkonservierte Struktur mit einem carboxytermmalen Pentapeptid der Sequenz Phenylalanin-Xaa-Xbb-Tryptophan-Glycin-Amid, wobei Xaa entweder Tyrosin, Histidin, Serin oder Asparagin sein kann, und wobei Xbb entweder Alanin, meist aber Serin oder Prolin sein kann (Coast, 1998). Verwandte Peptide wurden auch aus anderen Invertebraten, wie Mollusken oder Krebsen, isoliert (Cox et al., 1997; Torfs et al., 1999). Die ersten Mitglieder dieser Peptid-Familie wurden auf der Basis ihrer Fähigkeit isoliert, Kontraktionen beim isolierten Darm in Schaben auszulösen (Holman, 1991). Kinine sind in Insekten besonders potente, diuretisch wirkende Peptide, die die Sekretion von primärem Urin in den Malpighischen Organen stimulieren (Coast, 1998).
Die biologischen Funktionen der Peptide können in verschiedenen Testen überprüft werden, welche beispielsweise die Muskelaktivität (Holman, 1991) oder die Ausscheidung von Wasser und Elektrolyten (Ramsey, 1954) messen. Von einigen dieser biologisch aktiven Peptide ist beschrieben, dass in vivo eine experimentell induzierte übersteigerte Wirkung zum Absterben der Schadinsekten führen kann (Seinsche et al., 2000).
Während eine Vielzahl von Peptiden isoliert, in der Struktur aufgeklärt und die Aminosäuresequenz beschrieben werden konnte, sind demgegenüber in Insekten nur wenige Rezeptoren bekannt, die endokrine oder neuronale Peptide binden können. Beschrieben sind u.a. Rezeptoren für das Diuretische Hormon aus Manduca sexta (Reagan, 1994) oder Bombyx mori (Ha et al., 2000), für Tachykinin aus Drosophila (Li et al, 1991; Monnier et al., 1992), oder für Galanin aus Drosophila (Birgul et al., 1999). Rezeptoren von Kinin-Peptiden sind in Mollusken aus der Teichschnecke Lymnea stagnalis (Cox et al., 1997) und in Acari aus einer Zeckenart (Boophilus microplus, Holmes et al, 2000) beschrieben. Aus Insekten ist nur in Drosophila melanogaster ein Rezeptor für ein Drosophila-Kinin beschrieben (Terhzaz et al., 1999). Die zelluläre Antwort auf eine Kinin- Stimulation in Insekten ist ein Anstieg in der intrazellulären Calcium-Konzentration, die letztlich zu einem Einstrom von Chlorid- Ionen in das Lumen der Malpighischen Gefäße führt (Coast, 1998). In Larven des Schadinsektes Heliothis virescens -fuhrt die Wirkung der Kinine zum einen zur erhöhten Flüssigkeits-Sekretion an isolierten Malpighischen Gefäßen und zum anderen nach Injektion in die Hämolymphe der Larven zur Reduktion der Gewichtszunahme und zu partieller Mortalität (Seinsche et al, 2000). Es ist daher von besonderem Interesse, die Rezeptoren für die Kinine aus wirtschaftlich bedeutsamen Schadinsekten bereitzustellen.
Seitdem das Genom von Drosophila in Teilen oder komplett als in Datenbanken recherchierbare Sequenz zur Verfügung steht, sind verschiedene Rezeptoren aus dieser Spezies beschrieben oder vorhergesagt worden (Hauser et al., 1998; Lenz et al., 2000a; Lenz et al, 2000b; Eriksen et al, 2000; Vanden Broeck, 2001; Hewes und Tahert, 2001; WO 00/70980; WO 00/31005). Drosophila melanogaster aus der Familie der Dipteren ist ein wichtiger Modellorganismus für die Insekten-Genetik, spielt in der Landwirtschaft als Schadinsekt aber keine große Rolle. Die Unterschiede in den Aminosäure-Sequenzen zwischen z.B. homologen Genen aus Drosophila melanogaster und anderen Insekten aus anderen Familien oder anderen Invertebraten ist mitunter beträchtlich und überschreitet oft 50% (Hewes und Taghert, 2001). Die Unterschiede auf der Ebene der Nukleotide ist dabei noch größer. Es gelingt daher oft nicht, mit Hilfe gängiger molekuklarbio logischer Methoden (z.B. mittels PCR mit DNA-Primern oder mit DNA-Sonden, die von z.B. Drosophila-Genen abgeleitet sind) die interessierenden homologen Rezeptor-Gene in einem Invertebraten- Organismus (z.B. einer Lepidopteren-Spezies) aufzufinden und zu isolieren (Pietrantonio et al, 2000). Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, weitere Rezeptoren, an die endokrine oder neuronale Peptide aus Insekten, insbesondere aus wirtschaftlich bedeutsamen Schadinsekten, binden können und über deren Bindung die biologische Funktionen dieser Peptide vennittelt werden kann, und darauf aufbauende Testsysteme mit einem hohen Durchsatz an Testverbindungen (High Throughput Screening Assays; HTS-Assays) bereitzustellen.
Die Aufgabe wird gelöst durch die Bereitstellung von Polypeptiden, welche zumindest eine biologische Aktivität eines Helicokinin-Rezeptors ausüben und eine Aminosäuresequenz umfassen, die eine zumindest 70 %ige Identität, vorzugsweise zumindest 80 %ige Identität, besonders bevorzugt zumindest 90 %ige Identität, ganz besonders bevorzugt zumindest 95 %ige Identität, mit einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 2 über eine Länge von wenigstens 20, vorzugsweise wenigstens 25, besonders bevorzugt wenigstens 30 fortlaufenden Aminosäuren und ganz besonders bevorzugt über deren Gesamtlänge aufweisen.
Der Grad der Identität der Aminosäuresequenzen wird vorzugsweise bestimmt mit Hilfe des Programms GAP aus dem Programmpaket GCG, Version 9.1 unter Standardeinstellungen (Devereux et al., 1984).
Der Ausdruck "Polypeptide", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich sowohl auf kurze Aminosäureketten, die gewöhnlich als Peptide, Oligopeptide oder Oligomere bezeichnet werden, als auch auf längere Aminosäureketten, die gewöhnlich als Proteine bezeichnet werden. Er umfasst Aminosäureketten, die entweder durch natürliche Prozesse, wie posttranslationale Prozessierung, oder durch chemische Verfahren, die Stand der Technik sind, modifiziert sein können. Solche Modifikationen können an verschiedenen Stellen und mehrfach in einem Polypeptid vorkommen, wie beispielsweise an dem Peptid-Rückgrat, an der Aminosäure-Seitenkette, am Amino- und/oder am Carboxy-Terminus. Sie umfassen beispielsweise Acetylierungen, Acylierungen, ADP-Ribosylierungen, Amidierungen, kovalente Verknüpfungen mit Flavinen, Häm-Anteilen, Nukleotiden oder Nukleotid-Derivaten, Lipiden oder Lipid- Derivaten oder Phosphatidylinositol, Cyclisierungen, Disulfidbrückenbildungen, Demethylierungen, Cystin-Bildungen, Formylierungen, gamma-Carboxylierungen, Glycosylierungen, Hydroxylierungen, Iodierungen, Methylierungen, Myristoylie- rungen, , Oxidationen, proteolytische Prozessierungen, Phosphorylierungen, Selenoylierungen und tRNA-vermittelte Additionen von Aminosäuren.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können in der Form "reifer" Proteine oder als Teile größerer Proteine, z.B. als Fusionsproteine, vorliegen. Weiterhin können sie Sezernierungs- oder "Leader"-Sequenzen, Pro-Sequenzen, Sequenzen, die eine einfache Reinigung ermöglichen, wie mehrfache Histidin-Reste, oder zusätzliche stabilisierende Aminosäuren aufweisen.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide müssen nicht vollständige Rezeptoren darstellen, sondern können auch nur Fragmente davon sein, solange sie zumindest noch eine biologische Aktivität eines vollständigen Helicokinin-Rezeptors aufweisen. Polypeptide, die im Vergleich zu dem Helicokinin-Rezeptor, der aus dem erfindungsgemäßen Polypeptid mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 besteht, eine um 50 % höhere oder verminderte Aktivität ausüben, werden noch als erfmdungsgemäß betrachtet.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können im Vergleich zu der entsprechenden Region natürlich vorkommender Rezeptoren Deletionen oder Aminosäuresubstitutionen aufweisen, solange sie zumindest noch eine biologische Aktivität der vollständigen Helicokinin-Rezeptoren ausüben. Konservative Substitutionen sind bevorzugt. Solche konservativen Substitutionen umfassen Variationen, wobei eine Aminosäure durch eine andere Aminosäure aus der folgenden Gruppe ersetzt wird:
1. Kleine aliphatische, nicht-polare oder wenig polare Reste: Ala, Ser, Thr, Pro und Gly;
2. Polare, negativ geladene Reste und deren Amide: Asp, Asn, Glu und Gin; 3. Polare, positiv geladene Reste: His, Arg und Lys;
4. Große aliphatische, nicht-polare Reste: Met, Leu, Ile, Val und Cys; und
5. Aromatische Reste: Phe, Tyr und Trp.
Die folgende Liste zeigt bevorzugte konservative Substitutionen:
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Der Ausdruck "biologische Aktivität eines Helicokinin-Rezeptors", wie er hierin verwendet wird, bedeutet die Bindung von Helicokinin an einen Peptid-Rezeptor. Bevorzugte Ausfülirungsformen der erfmdungsgemäßen Polypeptide stellen Helicokinin-Rezeptoren von Lepidopteren, insbesondere von Heliothis virescens dar.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Polypeptide stellt der Helicoldnin-Rezeptor von Heliothis virescens dar, welcher die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 besitzt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Polynukleotide, die für die erfmdungsgemäßen Polypeptide codieren.
Bei den erfindungsgemäßen Polynukleotiden handelt es sich insbesondere um einzel- strängige oder doppelsträngige Desoxyribonukleinsäuren (DNA) oder Ribonukleinsäuren (RNA). Bevorzugte Ausftihrungsformen sind Fragmente genomischer DNA, die Introns enthalten können, und cDNAs.
Eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Polynukleotide stellt eine cDNA dar, welche eine Polynukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 besitzt.
Polynukleotide, welche unter stringenten Bedingungen an die Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 hybridisieren, sind ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfasst.
Der Ausdruck "hybridisieren", wie er hierin verwendet wird, beschreibt den Vorgang, bei welchem ein einzelsträngiges Nuldeinsäuremolekül mit einem komplementären Strang eine Basenpaarung eingeht. Auf diese Weise können ausgehend von der hierin offenbarten Sequenzinformation beispielsweise DNA-Fragmente aus anderen Insekten als Heliothis virescens isoliert werden, welche für Polypeptide mit der biologischen Aktivität von Helicokinin-Rezeptoren codieren.
Bevorzugte Hybridisierungsbedingungen sind nachstehend angegeben: Hybridisierungslösung: 6X SSC / 0 % Formamid, bevorzugte Hybridisierungslösung: 6X SSC / 25 % Formamid
Hybridisierungstemperatur: 34°C, bevorzugte Hybridisierungstemperatur: 42°C
1. Waschschritt: 2X SSC bei 40°C,
2. Waschschritt: 2X SSC bei 45°C; bevorzugter 2. Waschschritt: 0,6X SSC bei 55°C; besonders bevorzugter 2. Waschschritt: 0,3X SSC bei 65°C.
Weiterhin sind von der vorliegenden Erfindung Polynukleotide umfasst, die eine zumindest 70 %ige Identität, vorzugsweise zumindest 80 %ige Identität, besonders bevorzugt zumindest 90 %ige Identität, ganz besonders bevorzugt zumindest 95 %ige Identität, mit einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 über eine Länge von wenigstens 20, vorzugsweise wenigstens 25, besonders bevorzugt wenigstens 30 fortlaufenden Nukleotiden und ganz besonders bevorzugt über deren Gesamtlänge aufweisen.
Der Grad der Identität der Polynukleotidsequenzen wird vorzugsweise bestimmt mit Hilfe des Programms GAP aus dem Programmpaket GCG, Version 9.1 unter Standardeinstellungen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind weiterhin DNA-Konstrukte, die ein erfindungsgemäßes Polynukleotid und einen heterologen Promotor umfassen.
Der Ausdruck "heterologer Promotor", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf einen Promotor, der andere Eigenschaften als derjenige Promotor aufweist, der im Ursprungsorganismus die Expression des betreffenden Gens kontrolliert. Der Ausdruck "Promotor", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich allgemein auf Expressionskontrollsequenzen.
Die Auswahl von heterologen Promotoren ist davon abhängig, ob zur Expression pro- oder eukaryotische Zellen oder zellfreie Systeme verwendet werden. Beispiele f r heterologe Promotoren sind der frühe oder späte Promotor des SV40, des Adenovirus oder des Cytomegalovirus, das lac-System, das trp-System, die Haupt- Operator- und Promotorregionen des Phagen lambda, die Kontrollregionen des fd- Hüllproteins, der Promotor des für 3-Phosphoglyceratkinase codierenden Gens, der Promotor des für Saure Phosphatase codierenden Gens und der Promotor des für den α-Mating-Faktor der Hefe codierenden Gens.
Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Vektoren, die ein erfindungsgemäßes Polynuldeotid bzw. ein erfindungsgemäßes DNA-Konstrukt enthalten. Als Vektoren können alle in molekularbiologischen Laboratorien verwendete Plasmide, Phasmide, Cosmide, YACs oder künstliche Chromosomen verwendet werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Wirtszellen, die ein erfindungsgemäßes Polynuldeotid, ein erfmdungsgemäßes DNA-Konstrukt oder einen erfindungsgemäßen Vektor enthalten.
Der Ausdruck "Wirtszelle", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf Zellen, die natürlicherweise die erfindungsgemäßen Polynukleotide nicht enthalten.
Als Wirtszellen eignen sich sowohl prokaryotische Zellen, wie Bakterien der Gattungen Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces, Streptococcus, Staphylococcus, vorzugsweise E. coli, als auch eukaryotische Zellen, wie Hefen, Säuger-, Amphibien-, Insekten- oder Pflanzenzellen. Bevorzugte eukaryotische Wirtszellen sind HEK-293-, Schneider S2-, Spodoptera Sf9-, Kc-, CHO-, COS1-, COS7-, HeLa-, C127-, 3T3- oder BHK-Zellen und insbesondere Xenopus-Oocyten.
Weiterhin sind Antikörper Gegenstand der Erfindung, die spezifisch an die vorstehend genannten Polypeptide bzw. Rezeptoren binden. Die Herstellung solcher Antikörper erfolgt auf die übliche Weise. Beispielsweise können solche Antikörper produziert werden durch die Injektion eines substantiell immunkompetenten Wirts mit einer für die Antikörperproduktion effektiven Menge eines erfindungsgemäßen Polypeptids oder eines Fragments davon und durch nachfolgende Gewinnung dieses Antikörpers. Weiterhin lässt sich in an sich bekannter Weise eine immortalisierte Zelllinie erhalten, die monoklonale Antikörper produziert. Die Antikörper können gegebenenfalls mit einem Nachweisreagenz markiert sein. Bevorzugte Beispiele für ein solches Nachweis-Reagenz sind Enzyme, radioaktiv markierte Elemente, fluoreszierende Chemikalien oder Biotin. Anstelle des vollständigen Antikörpers können auch Fragmente eingesetzt werden, die die gewünschten spezifischen Bindungseigenschaften besitzen. Daher erstreckt sich der Ausdruck "Antikörper", wie er hierin verwendet wird, auch auf Teile vollständiger Antikörper, wie Fa-, F(ab')2- oder Fv- Fragmente, welche noch die Fähigkeit besitzen, an die Epitope der erfmdungsgemäßen Polypeptide zu binden.
Die erfindungsgemäßen Polynukleotide können insbesondere zur Herstellung transge- ner Invertebraten verwendet werden. Diese können in Testsysteme eingesetzt werden, die auf einer vom Wildtyp abweichenden Expression der erfindungsgemäßen Polypeptide basieren. Ferner kann man auf der Grundlage der hierin offenbarten Informationen transgene Invertebraten herstellen, bei denen durch die Modifikation anderer Gene oder Promotoren eine Veränderung der Expression der erfindungsgemäßen Polypeptide eintritt.
Die Herstellung der transgenen Invertebraten erfolgt beispielsweise bei Drosophila melanogaster durch P-Element vermittelten Gentransfer (Hay et al., 1997) oder in Caenorhabditis elegans durch Transposon-vermittelten Gentransfer (z.B. durch Tel; Plasterk, 1996).
Gegenstand der Erfindung sind somit auch tansgene Invertebraten, die zumindest ein erfindungsgemäßes Polynuldeotid enthalten, vorzugsweise transgene Invertebraten der Arten Drosophila melanogaster oder Caenorhabditis elegans, sowie deren transgene Nachkommen. Vorzugsweise enthalten die transgenen Invertebraten die erfindungsgemäßen Polypeptide in einer vom Wildtyp abweichenden Form. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind weiterhin Verfahren zum Herstellen der erfindungsgemäßen Polypeptide. Zur Herstellung der Polypeptide, die von den erfindungsgemäßen Polynukleotiden codiert werden, können Wirtszellen, die ein erfindungsgemäßes Polynuldeotid enthalten, unter geeigneten Bedingungen kultiviert werden. Dabei kann das zu exprimierende Polynuldeotid an die "Codon Usage" der Wirtszellen angepasst werden. Die gewünschten Polypeptide können danach auf übliche Weise aus den Zellen oder dem Kulturmedium isoliert werden. Die Polypeptide können auch in in vitro-Systemen hergestellt werden.
Ein schnelles Verfahren zum Isolieren der erfindungsgemäßen Polypeptide, die von Wirtszellen unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Polynuldeotids synthetisiert werden, beginnt mit der Expression eines Fusionsproteins, wobei der Fusionspartner auf einfache Weise affmitätsgereinigt werden kann. Der Fusionspartner kann beispielsweise Glutathion S-Transferase sein. Das Fusionsprotein kann dann an einer Glutathion-Affinitätssäule gereinigt werden. Der Fusionspartner kann durch partielle proteolytische Spaltung beispielsweise an Linkern zwischen dem Fusionspartner und dem zu reinigenden erfindungsgemäßen Polypeptid abgetrennt werden. Der Linker kann so gestaltet werden, dass er Ziel-Aminosäuren, wie Arginin- und Lysin-Reste einschließt, die Stellen für eine Spaltung durch Trypsin definieren. Um solche Linker zu erzeugen, können Standard-Klonierungsverfahren unter Verwendung von Oligonukleotiden angewendet werden.
Weitere mögliche Reinigungsverfahren basieren auf präparativer Elektrophorese, FPLC, HPLC (z.B. unter Anwendung von Gelfiltrations-, Reversphasen- oder leicht hydrophoben Säulen), Gelfiltration, differentieller Präzipitation, Ionenaustausch- Chromatographie und Affmitätschromatographie.
Da die erfindungsgemäßen Helico-dnin-Rezeptoren Membranproteine darstellen, werden in den Reinigungsverfahren vorzugsweise Detergensextraktionen durchgeführt, beispielsweise unter Verwendung von Detergenzien, die die Sekundär- und Tertiärstxukturen der Polypeptide nicht oder nur wenig beeinflussen, wie nicht-ionische Detergenzien.
Die Reinigung der erfindungsgemäßen Polypeptide kann die Isolierung von Membranen ausgehend von Wirtszellen, die die erfindungsgemäßen Polynukleotide exprimieren, umfassen. Vorzugsweise exprimieren solche Zellen die erfindungsgemäßen Polypeptide in einer ausreichenden Kopienanzahl, so dass die Menge der Polypeptide in einer Membranftaktion mindestens 10-fach höher ist als diejenige, die in vergleichbaren Membranen - von Zellen gefunden wird, die Helicokinin-Rezeptoren natürlicherweise exprimieren; besonders bevorzugt ist die Menge mindestens 100-fach, ganz besonders bevorzugt mindestens 1000-fach höher.
Die Ausdrücke "Isolierung oder Reinigung", wie sie 'hierin verwendet werden, bedeuten, dass die erfindungsgemäßen Polypeptide von anderen Proteinen oder anderen Makromolekülen der Zelle oder des Gewebes abgetrennt werden. Vorzugsweise ist eine die erfmdungsgemäßen Polypeptide enthaltende Zusammensetzung hinsichtlich des Proteingehalts an erfindungsgemäßen Polypeptiden gegenüber einem Rohextrakt aus Wirtszellen mindestens 10-fach und besonders bevorzugt mindestens 100-fach angereichert. Die Reinheit bzw. der Proteingehalt der Präparationen kann auf an sich bekannte Weise, beispielsweise durch SDS-Poly- acrylamid-Gelelektrophorese, bestimmt werden.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können auch ohne Fusionspartner mit Hilfe von Antikörpern, die an die Polypeptide binden, affimtätsgereinigt werden.
Ferner sind auch Verfahren zum Herstellen der erfindungsgemäßen Polynukleotide Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Die erfindungsgemäßen Polynukleotide können auf die übliche Weise hergestellt werden. Beispielsweise können die Polynukleotide vollständig chemisch synthetisiert werden. Man kann auch nur kurze Stücke der erfindungsgemäßen Polynukleotide chemisch synthetisieren und solche Oligo- nukleotide radioaktiv oder mit einem Fluoreszenzfarbstoff markieren. Die markierten Oligonuldeotide können verwendet werden, um ausgehend von Insekten-mRNA hergestellte cDNA-Banken oder ausgehend von genomischer Insekten-DNA hergestellte genomische Banken zu durchsuchen. Klone, an die die markierten Ohgonuldeotide hybridisieren, werden zur Isolierung der betreffenden DNA ausgewählt. Nach der Charakterisierung der isolierten DNA erhält man auf einfache Weise die erfindungsgemäßen Polynukleotide.
Die erfindungsgemäßen Polynukleotide können auch mittels PCR- Verfahren unter Verwendung chemisch synthetisierter Ohgonuldeotide hergestellt werden.
Der Ausdruck 'Oligonukleotid(e)", wie er hierin verwendet wird, bedeutet DNA- Moleküle, die aus 10 bis 50 Nukleotiden, vorzugsweise 15 bis 30 Nuldeotiden, bestehen. Sie werden chemisch synthetisiert und können als Sonden verwendet werden.
Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Polynukleotide bzw. Polypeptide können neue Wirkstoffe für den Pflanzenschutz bzw. pharmazeutische Wirkstoffe für die Behandlung von Mensch und Tier, wie chemische Verbindungen, welche als Modulatoren, insbesondere als Agonisten oder Antagonisten, die Eigenschaften der erfindungsgemäßen Helicokinin-Rezeptoren verändern, identifiziert werden. Dazu wird ein rekombinantes DNA-Molekül, das zumindest ein erfindungsgemäßes Polynuldeotid umfasst, in eine geeignete Wirtszelle eingebracht. Die Wirtzelle wird in Gegenwart einer Verbindung oder einer Probe, welche eine Vielzahl von Verbindungen umfasst, unter Bedingungen kultiviert, die die Expression der erfindungsgemäßen Rezeptoren erlauben. Eine Veränderung der Rezeptoreigenschaften kann beispielsweise wie nachstehend in Beispiel 2 beschrieben detektiert werden. Auf diese Weise ist es möglich, beispielsweise insek- tizide Substanzen aufzufinden.
Rezeptoren verändern vorzugsweise nach Aktivierung die Konzentration von intrazellulärem cAMP oder intrazellulärem Calcium über eine Interaktion mit G-Proteinen. Veränderungen der Rezeptoreigenschaften durch chemische Verbindungen können deshalb nach heterologer Expression zum Beispiel durch Messung der intrazellulären cAMP-Konzentrationen direkt über ELISA-Assaysysteme (Biomol, Hamburg, Deutschland) oder RIA-Assaysysteme (NEN, Schwalbach, Deutschland) im HTS- Format gemessen werden. Eine indirekte Messung der cAMP-Konzentration ist mit Hilfe von Reportergenen (z.B. Luziferase) möglich, deren Expression von der cAMP- Konzentration abhängig ist (Stratowa et al, 1995). Die Koexpression von Rezeptoren mit besonderen G-Proteinen, z.B. Gαl5, G l6 oder auch chimären G-Proteinen, in heterologen Systemen und die Messung des Anstiegs von Calcium, z.B. mit Fluoreszenzfarbstoffen oder Äquorin, ist eine alternative Screeningmöglichkeit (Stahles et al., 1997; Conklin et al., 1993).
Weiterhin kann die Bindung von GTP an das aktivierte G-Protein als read-out-System für die Prüfung von Substanzen herangezogen werden.
Die erfindungsgemäßen Polynukleotide bzw. Polypeptide ermöglichen auch das Auffinden von Verbindungen, die an die erfindungsgemäßen Rezeptoren binden, ohne dass eine Aktivitätsänderung der Rezeptoren gemessen werden muss. Beispielsweise werden Wirtszellen, die die erfindungsgemäßen Polynukleotide enthalten und die entsprechenden Rezeptoren bzw. Polypeptide exprimieren oder die Genprodukte selbst mit einer Verbindung oder einem Gemisch von Verbindungen unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die die Wechselwirkung zumindest einer Verbindung mit den Wirtszellen, den Rezeptoren oder den einzelnen Polypeptiden erlauben. In solchen Bindungsexperimenten können die erfindungsgemäßen Polypeptide in markierter Form eingesetzt werden.
Der Ausdruck "Agonist", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein Molekül, das die erfindungsgemäßen Rezeptoren aktiviert.
Der Ausdruck "Antagonist", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein Molekül, das einen Agonisten von seiner Bindungsstelle verdrängt. Der Ausdruck "Modulator", wie er hierin verwendet wird, stellt den Oberbegriff zu Agonist bzw. Antagonist dar. Modulatoren können kleine organisch-chemische Moleküle, Peptide oder Antikörper sein, die an die erfindungsgemäßen Polypeptide binden. Weiterhin können Modulatoren kleine organisch-chemische Moleküle, Peptide oder Antikörper sein, die an ein Molekül binden, welches wiederum an die erfmdungsgemäßen Polypeptide bindet, und dadurch deren biologische Aktivität beein- flusst. Modulatoren können Mimetika von natürlichen Substraten und Liganden ' darstellen.
Vorzugsweise handelt es sich bei den Modulatoren um kleine organisch-chemische Verbindungen.
Die Bindung der Modulatoren an die erfmdungsgemäßen Polypeptide kann die zellulären Vorgänge auf eine Weise verändern, die zum Absterben, zur Paralyse oder zur Sterilität der damit behandelten Insekten führt. In vivo-Tests an Insekten, Insektenlarven oder Insekteneiern zum Verifizieren der insektiziden Eigenschaften der aufgefundenen Modulatoren sind hinlänglich bekannt.
Daher erstreckt sich die vorliegende Erfindung auch auf die Verwendung von Modulatoren der erfindungsgemäßen Polypeptide als Insektizide oder Arzneimittel - im Folgenden "Wirkstoffe" genannt.
Die Wirkstoffe können in die üblichen Formulierungen überführt werden, wie Lösungen, Emulsionen, Spritzpulver, Suspensionen, Pulver, Stäubemittel, Pasten, lösliche Pulver, Granulate, Suspensions-Emulsions-Konzentrate, Wirkstoff-imprägnierte Natur- und synthetische Stoffe sowie Feinstverkapselungen in polymeren Stoffen.
Diese Formulierungen werden in bekannter Weise hergestellt, z.B. durch Vermischen der Wirkstoffe mit Streckmitteln,- also flüssigen Lösungsmitteln und/oder festen Trägerstoffen, gegebenenfalls unter Verwendung von oberflächenaktiven Mitteln, also Emulgiermitteln und/oder Dispergiermitteln und/oder schaumerzeugenden Mitteln. Im Falle der Benutzung von Wasser als Streckmittel können z.B. auch organische Lösungsmittel als Hilfslösungsmittel verwendet werden. Als flüssige Lösungsmittel kommen im wesentlichen in Frage: Aromaten, wie Xylol, Toluol, oder Alkylnaph- thaline, chlorierte Aromaten und chlorierte aliphatische Kohlenwasserstoffe, wie Chlorbenzole, Chlorethylene oder Methylenchlorid, aliphatische Kohlenwasserstoffe, wie Cyclohexan oder Paraffine, z.B. Erdölfraktionen, mineralische und pflanzliche Öle, Alkohole, wie Butanol oder Glykol sowie deren Ether und Ester, Ketone wie Aceton, Methylethylketon, Methylisobutylketon oder Cyclohexanon, stark polare Lösungsmittel, wie Dimeth.ylform.amid und Dimethylsulfoxid, sowie Wasser.
Als feste Trägerstoffe kommen in Frage: z.B. Ammoniumsalze und natürliche Gesteinsmehle, wie Kaoline, Tonerden, Talkum, Kreide, Quarz, Attapulgit, Montmorillonit oder Diatomeenerde und synthetische Gesteinsmehle, wie hochdisperse Kieselsäure, Aluminiumoxid und Silikate, als feste Trägerstoffe für Granulate kommen in Frage: z.B. gebrochene und fraktionierte natürliche Gesteine, wie Calcit, Marmor, Bims, Sepiolith, Dolomit sowie synthetische Granulate aus anorganischen und organischen Mehlen sowie Granulate aus organischem Material, wie Sägemehl, Kokosnussschalen, Maiskolben und Tabak- stängeln; als Emulgier- und/oder schaumerzeugende Mittel kommen in Frage: z.B. nichtionogene und anionische Emulgatoren, wie Polyoxyethylen-Fettsäure-Ester, Polyoxyethylen-Fettalkohol-Ether, z.B. Alkylaryl-polyglykolether, Alkylsulfonate, Alkylsulfate, Arylsulfonate sowie Einweißhydrolysate; als Dispergiermittel kommen infrage: z.B. Lignin- Sulfitablaugen und Methylcellulose.
Es können in den Formulierungen Haftmittel, wie Carboxymethylcellulose, natürliche und synthetische pulvrige, körnige oder latexförmige Polymere verwendet werden, wie Gummiarabicum, Polyvinylalkohol, Polyvinylacetat, sowie natürliche Phospholipide, wie Kephaline und Lecithine und synthetische Phospholipide. Weitere Additive können mineralische und vegetabile Öle sein. Es können Farbstoffe, wie anorganische Pigmente, z.B. Eisenoxid, Titanoxid, Ferro- cyanblau und organische Farbstoffe, wie Alizarin-, Azo- und Metallphthalocyanin- farbstoffe und Spurennährstoffe, wie Salze von Eisen, Mangan, Bor, Kupfer, Kobalt, Molybdän und Zink verwendet werden.
Die Formulierungen enthalten im allgemeinen zwischen 0,1 und 95 Gew.-% Wirkstoff, vorzugsweise zwischen 0,5 und 90 %.
Die Wirkstoffe können vorzugsweise als Pflanzenschutzmittel eingesetzt werden, insbesondere zur Bekämpfung von Insekten aus der Ordnung der Lepidoptera, wie z.B. Pectinophora gossypiella, Bupalus piniarius, Cheimatobia brumata, Li hocolletis blancardella, Hyponomeuta padella, Plutella xylostella, Malacos.oma neustria, Euproctis chrysorrhoea, Lymantria spp., Bucculatrix thurberiella, Phyllocnistis citrella, Agrotis spp., Euxoa spp., Feltia spp., Earias insulana, Heliothis spp., Mame- stra brassicae, Panolis flammea, Spodoptera spp., Trichoplusia ni, Carpocapsa pomonella, Pieris spp., Chilo spp., Pyrausta nubilalis, Ephestia kuehniella, Galleria mellonella, Tineola bisselliella, Tinea pellionella, Hofmannophila pseudospretella, Cacoecia podana, Capua reticulana, Choristoneura fυmiferana, Clysia ambiguella, Homona magnanima, Tortrix viridana, Cnaphalocerus spp., Oulema oryzae.
Die Behandlung der Pflanzen und Pflanzenteile mit den Wirkstoffen erfolgt direkt oder durch Einwirkung auf deren Umgebung, Lebensraum oder Lagerraum nach den üblichen Behandlungsmethoden, z.B. durch Tauchen, Sprühen, Verdampfen, Vernebeln, Streuen, Aufstreichen und bei Vermehrangsmaterial, insbesondere bei Samen, weiterhin durch ein- oder mehrschichtiges Umhüllen.
Die Wirkstoffe eignen sich auch zur Bekämpfung von Insekten, die landwirtschaftliche Nutztiere, wie z.B. Rinder, Schafe, Ziegen, Pferde, Schweine, Esel, Kamele, Büffel, Kaninchen, Hühner, Puten, Enten, Gänse, Bienen, sonstige Haustiere, wie z.B. Hunde, Katzen, Stubenvögel, Aquarienfische sowie sogenannte Versuchstiere, wie z.B. Hamster, Meerschweinchen, Ratten und Mäuse befallen. Durch die Bekämpfung dieser Insekten sollen Todesfälle und Leistungsminderungen (bei Fleisch, Milch, Wolle, Häuten, Eiern, Honig usw.) vermindert werden, so dass durch den Einsatz der Wirkstoffe eine wirtschaftlichere und einfachere Tierhaltung möglich ist.
Die Anwendung der Wirkstoffe geschieht im Veterinärsektor in bekannter Weise durch enterale Verabreichung in Form von beispielsweise Tabletten, Kapseln, Tränken, Drenchen, Granulaten, Pasten, Boli, des feed-through- Verfahrens, von Zäpfchen, durch parenterale Verabreichung, wie zum Beispiel durch Injektionen (intramuskulär, subcutan, intravenös, intraperitonal u.a.), Implantate, durch nasale Applikation, durch dermale Anwendung in Form beispielsweise des Tauchens oder Badens (Dippen), Sprühens (Spray), Aufgießens (Pour-on und Spot-on), des Waschens, des Einpuderns sowie mit Hilfe von wirkstoffhaltigen Formkö ern, wie Halsbändern, Ohrmarken, Schwanzmarken, Gliedmaßenbändern, Halftern, Markierungsvorrichtungen usw.
Bei der Anwendung für Vieh, Geflügel, Haustiere etc. kann man die Wirkstoffe als Formulierungen (beispielsweise Pulver, Emulsionen, fließfähige Mittel), die die Wirkstoffe in einer Menge von 1 bis 80 Gewi-% enthalten, direkt oder nach 100 bis 10 000-facher Verdünnung anwenden oder sie als chemisches Bad verwenden.
Unter Verwendung von Wirtszellen oder transgenen Invertebraten, die die erfmdungsgemäßen Polynukleotide enthalten, ist es auch möglich, Substanzen aufzufinden, welche die Expression der Rezeptoren verändern.
Die vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Polynukleotide, Vektoren und regulatorischen Regionen können außerdem zum Auffinden von Genen verwendet werden, die für Polypeptide codieren, welche am Aufbau von funktioneil ähnlichen Rezeptoren in Insekten beteiligt sind. Unter funktionell ähnlichen Rezeptoren werden gemäß der vorliegenden Erfindung Rezeptoren verstanden, die Polypeptide umfassen, welche sich zwar hinsichtlich der Aminosäuresequenz von den hierin beschxiebenen Polypeptiden unterscheiden, aber im wesentlichen dieselben Funktionen haben.
Erläuterungen zum Sequenzprotokoll und zur Abbildung! :
SEQ ID NO: 1 zeigt die Polynukleotidsequenz der isolierten Helicokinin-Rezeptor- cDNA. SEQ ID NO: 2 zeigt die Aminosäuresequenz des Polypeptids, das von der Polynukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 codiert wird.
Die Abbildung 1 zeigt das Ergebnis der elektrophysiologischen Messung nach Injektion von Helicokinin-Rezeptor-DNA in Xenopus-Oocyten und der Zugabe von Helicokinin-Peptid (Helicokinin III, lOOnM, Blackburn et al, 1995) im Vergleich zur Applikation von Peptid an Kontroll-Oocyten, in denen vorher keine Helicokinin- Rezeptor-DNA injiziert wurde.
Beispiele:
Beispiel 1
Isolierung der beschriebenen Polynukleotidsequenzen
Die Manipulation von Polynukleotiden erfolgte nach Standardmethoden der rekombi- nanten DNA-Technologie (Sambroσk et al., 1989). Die bioinformatische Bearbeitung von Nuldeotid- und Aminosäuresequenzen erfolgte mit dem Programmpaket GCG Version 9.1 (GCG Genetics Computer Group, Inc., Madison Wisconsin, USA).
Beispiel 2
Generierung der Expressionskonstrukte
Mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) wurde der Sequenzbereich der SEQ ID NO: 1 amplifiziert und in den Vektor pCMV Script EX (Stratagene, La Jolla, USA) einkloniert.
Heterologe Expression .
Die fαnktionelle Expression des Helicokinin-Rezeptors aus Heliothis vireszens erfolgt in Xenopus-Oocyten. Dazu werden teilweise auch G-Protein aktivierbare Kalium-Kanäle (GIRK1 und GIRK4) koexprimiert, um die die Aktivierung der Rezeptoren zu messen (White et al., 1998).
Oocyten-Messungen
1. Präparation der Oocyten
Die Oocyten stammen von einem adulten weiblichen Xenopus laevis-Frosch (Firma Horst Kahler, Hamburg, Deutschland). Die Frösche werden in großen Tanks mit zirkulierendem Wasser bei einer Wassertemperatur von 18-20°C gehalten. Teile des Frosch-Ovars werden unter vollständiger Anaesthesie durch einen Meinen Schnitt im Abdomen (ca. 1cm) entnommen. Anschließend wird das Ovar unter ständigem Schütteln für ca. 140min in 25ml Kollagenase (Typ I, C-0130, SIGMA-ALDRICH CHEMIE GmbH, Deisenhofen, Deutschland; 355U/ml, angesetzt in Barth's Lösung ohne Calcium in mM: NaCl 88, KC1 1, MgSO4 0,82, NaHCO3 2,4, Tris/HCl 5, pH 7,4) behandelt. Die Oocyten werden dann mit Barth's Lösung ohne Calcium gewaschen. Nur Oocyten im Reifestadium V (Dumont, 1972) werden für die weitere Behandlung ausgewählt und in Mikrotiterplatten (Nunc Micro Well™ Platten, Kat. Nr. 245128 + 263339 (Deckel), Nunc GmbH & Co. KG, Wiesbaden, Deutschland), gefüllt mit Barth' s-Lösung (in mM: NaCl 88, KC1 1, MgSO4 0,82, Ca(NO3)2 0,33, CaCl2 0,41, NaHCO3 2,4, Tris/HCl 5, pH7.4) sowie Gentamicin (Gentamicin Sulfate, G-3632, SIGMA-ALDRICH CHEMIE GmbH, Deisenhofen, Deutschland; lOOU/ml), überführt. Die Oocyten werden dann bei 19.2°C in einem Kühl- Brutschrank (Typ KB 53, WTB Binder Labortechnik GmbH, Tuttlingen, Deutschland) aufbewahrt.
2. Injektion der Oocyten
Injektionselel troden, mit einem Durchmesser von 10 - 15 μm, werden mit einem Pipetten-Puller (Typ L/M-3P-A, List-electronic, Darmstadt-Eberstadt, Deutschland) hergestellt. Vor der Injektion werden Aliquots mit der Rezeptor-DNA bzw. GIRK1/4-DNA aufgetaut und mit Wasser auf eine Endkonzentration von lOng/μl verdünnt. Die DNA-Proben werden mit 3200g für 120s zentrifugiert (Typ Biofuge 13, Heraeus Instruments GmbH, Hanau, Deutschland). Anschließend wird ein ausgezogener PE-Schlauch als Transferschlauch benutzt, um die Pipetten von hinten zu befüllen. Die Injektionselektroden werden an einer X,Y,Z- Verfahreinheit (Bear- beitungszentrum EP 1090, isel-automation, Eiterfeld, Deutschland) befestigt. Mit Hilfe eines Macintosh Computers wird die Oocyten in den Vertiefungen der Mikrotiterplatten angefahren und durch kurze Druckapplikation (0,5-3 bar, 3-6s) ca. 50nl der DNA-Lösung in die Oocyte injiziert. 3. Elektrophysiologische Messungen
Für die elektrophysiologischen Messungen wird eine Zwei-Elektroden- Spannungsklemme mit einem TURBO TEC-10CD (npi electronic GmbH, Tamm, Deutschland) Verstärker durchgeführt. Die hierfür notwendigen Mikropipetten werden aus Aluminiumsilikatglas (Kapillarrohr, Art. -Nr. 14 630 29, l=100mm, 0a=l,6Omm, 0i= 1,22mm, Hilgenberg GmbH, Malsfeld, Deutschland) in zwei Zügen gezogen (Hamill et al., 1981). Strom- und Spannungselektroden haben einen Durchmesser von 1 - 3μm und werden mit 1,5M KCl und 1.5M Kaliumacteat gefüllt. Die Pipetten haben einen kapazitiven Widerstand von 0,2 — 0,5 MW. Für die elektrophysiologischen Messungen werden die Oocyten in eine kleine Kammer überführt, die kontinuierlich mit normaler Rimland-Lösung (in mM: KCl 90, MgCl2 3, HEPES 5, pH 7,2) gespült wird. Für eine Substanzapplikation wird die Perfusionslösung durch eine Substanzlösung mit gleicher Zusammensetzung und zusätzlich der gewünschten Substanzkonzentration ausgetauscht. Bei einem Klemmpotential von -60mV wird die erfolgreiche Expression der Rezeptor-DNA nach einer Woche überprüft. Nicht reagierende Oocyten werden verworfen. Alle weiteren werden für die Substanztestung verwendet. Die Daten werden mittels eines YT-Schreibers (YT- Schreiber, Model BD 111, Kipp & Zonen Delft BV, AM Delft, Niederlande) dokumentiert. Die einzelnen Werte werden in Origin (Auswertesoftware Microcal Origin, Microcal Software, Inc., Northampton, MA 01060-4410 USA (Additive GmbH, Friedrichsdorf/Ts, Deutschland) eingegeben. Mittelwerte, Standardabweichung, IC5o-Werte und IC5n-Kurven werden mit Origin berechnet. Diese Messungen wurden mindestens zweimal durchgeführt.
Literatur:
Birgul, N. et al. (1999). Reverse physiology in Drosophila: identification of a nόvel allatostatin-like neuropeptide and its cognate receptor structurally related to the mammalian somatostatin/galanin/opioid receptor family. EMBO Journal 18: 5892- 5900
Blackburn, M. B. et al. (1995). The isolation and identification of three diuretic kinins from the abdominal ventral nerve cord of adult Helicoverpa zea. J. Insect Physiol. 41 (8): 723-730
Brown, B.E. und Starrall, A.N. (1975). Isolation of proctolin, a myotropic peptide from Periplaneta americana. J.Insect Physiol. 21: 1879-1881
Coast, G.M. (1998). Insect Diuretic Peptides: Structures, Evolution and Actions. American Zoology 38 : 442-449
Conklin et al. (1993). Substitution of three amino acids switches receptor specificity of Gq alpha to that of Gi alpha. Nature 363 -.214-216
Cox, K.J. et al. (1997). Cloning, characterization, and expression of a G-protein- coupled receptor from Lymnea stagnalis and identification of a leucokinin-like peptide, PSFHSWSamide, as ist endogenous ligand. J. Neurosci. 17:1197-1205
Devereux et al. (1984). Nucleic Acids Research 12: 387
Dumont, J.N. (1972). Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). 1. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals. J. Morphol. 136: 153-180
Eriksen, K.K. (2000). Molecular cloning, genomic organization, developmental regulation, and a knock-out mutant of a novel leu-rich repeats-containing G-protein- coupled receptor (DLGR-2) from Drosophila melanogaster. Genome Res. 10:924- 938
ffrench-Constant, R.H. et al. (1991). Molecular cloning and transformation of cyclodiene resistance on Drosophila and invertebrate GABAA receptor locus. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A.88: 7209-7213
Gäde, G. et al. (1997a). Hormonal regulation in Insects: Facts, Gaps, and Future Directions. Physiological Reviews 77: 963-1032
Gäde, G. (1997b). The explosion of structural information on insect neuropeptides, In: Progress in the chemistry of organic natural produets (Herz, W., Kirby, G.W., Moore, R.E., Steglich, W., Tamm, C. eds): 1-128
Ha, S.-D. et al (2000). Cloning and sequence analysis of cDNA for Diuretic Hormone Receptor from the Bombyx mori. Mol. Cells 10: 13-17
Hamill, O.P. et al. (1981). Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pfügers Arch. 391: 85- 100
Hauser, F. et al. (1998). Molecular cloning, genomic organization and developmental regulation of a novel receptor from Drosophila melanogaster structurally related to Gonadotropin-Releasing Hormone Receptors from vertebrates. Biochem Biophys. Res. Comm. 249: 822-828
Hay et al. (1997). P element insertion-dependent gene activation in the Drosophila eye. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A 94 (10): 5195-5200
Hewes, R. und Taghert, P. (2001). Neuropeptides and neuropeptide receptors in the Drosophila melanogaster genome. Genome Research 11 (6): 1126-1142 Holman, G.M. et al. (1986). Isolation, primary structure and synthesis of two neuropeptides from Leucophaea maderae: Members of a new family of Cephalomaotrophins. Comparative Biochemical Physiology 84C: 205
Holmes, S.P. et al. (2000). Cloning and transcriptional expression of a leucokinin- like peptide receptor from the Southern cattle tick, Boophilus microplus (Acaridxodidae). Insect Molecular Biol. 9 (5): 457-465
Ηolman, G.M. (1991). Insect myotropic peptides: isolation, structural characterization and biological properties. In: Insect Neuropeptides: Chemistry, Biology and Action (Menn, J.J., Kelly, T.J., Masler, E.P., eds): 40-50
King, F.D. und Wilson, S. (1999). Recent advances in 7-transmembrane receptor research. Current Opinion in Drug Discovery & Development 2: 83-95
Lagueux, M. et al. (1990). cDNAs from neurosecretory cells of brains of Locusta migratoria encoding a novel member of the superfamily of insulins. Europe.an Journal of Biochemistry 187: 249-254
Lenz et al. (2000a). Molecular cloning and genomic organizatiori qf a novel receptor from Drosophila melanogaster structurally related to mammalian Galanin Receptors. Biochem.Biophys.Res.Comm. 269: 91-96
Lenz et al. (2000b). Molecular cloning and genomic organization of a second probable allatostatin receptor from Drosophila melanogaster. Biochem.Biophys.Res.Comm. 273: 571-577
Li, X.J. et al. (1991). Cloning, heterologous expression and developmental regulation of a Drosophila receptor for tachykinin-like peptides. EMBO J. 10: 3221-3229 Monnier, D. et al. (1992). NKD, a developmentally regulated tachy-dnin receptor in Drosophila. J.Biol.Chem. 267: 1298-1302
Osborne, R.H. (1996). Insect Neurotr.ansmission: Neurotransmitters and their Receptors. Pharmacology & Therapeutics 69: 117-142
Pietrantonio, P.V. et al. (2000). Characterization of a leucokinin binding protein in Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) Malpighma tubule. Insect Biochemistry and Molecular Biology 30: 1147-1159
Plasterk (1996). The Tcl/mariner transposon family, Transposable Elements/Current Topics in Microbiology and Immunology 204: 125-143
Ramsey, J.A. (1954). Active transport of water by the Malpighian tubules of the stick insect, Dixippus morosus. Journal of Experimental Biology 31: 104- 113
Reagan, J.D. (1994). Expression cloning of an insect diuretic hormone receptor. Journal of Biological Chemistry 269: 9-12
Sambrook et al. (1989). Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbour Press
Seinsche, A.' et al. (2000). Effect of helicokinins and ACE inhibitors on water balance and development of Heliotl is virescens larvae. Journal of Insect Physiology 46: 1423-1431 .
Stahles et al. (1997). A Bioluminescent Assay for Agonist Activity at Potentially Any G-protein coupled Receptor. Analytical Biochemistry 252: 115-126
Stratowa C. et al. (1995). Use of a luciferase reporter system for characterizing G- protein-linked receptors. Current Opinion in Biotechnology 6: 574-581 Terhzaz, S. et al. (1999). Isolation and characterization of a leucokinin-like peptide of Drosophila melanogaster. J. Exp. Biol. 202: 3667-3676
Tobe, S.S. et al. (1994). Allatostatins, peptide inhibitors of juvenile hormone production in insects. In: Perspectives in Comparative.Endocrinology (Davey, K.G., Peter, R.E., Tobe, S.S., eds): 12-19
Torfs, P. et al. (1999). The kinin petide family in invertebrates. Am . NY Acad. Sei. 897: 367-373
Vanden Broeck, J. et al. (1997). Insect Neuropeptides and Their Receptors. Trends in Endocrinology & Metabolism 8: 321-326
Vanden Broeck, J. (2001). Insect G protein-coupled receptors and signal transduetion. Archieves of Insect Biochemistry and Physiology 48: 1-12
White J.H. et al. (1998). Heterodimerization is required for the formation of a functional GABA(B) receptor. Nature 396: 679-82

Claims

Patentansprüehe
1. Polypeptid, welches die biologische Aktivität eines Helicokinin-Rezeptors ausübt und eine Aminosäuresequenz umfasst, die eine zumindest 70%ige' Identität mit einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 2 aufweist.
2. Polypeptid gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuresequenz einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 2 entspricht.
3. Polynuldeotid umfassend eine Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid gemäß Anspruch 1 codiert.
4. Polynukleotid gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einzelsträngige oder doppelsträngige DNA oder RNA handelt.
5. Polynuldeotid gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Fragmente genomischer DNA oder cDNA handelt.
6. Polynukleotid gemäß Ansprach 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 entspricht.
7. Polynukleotid gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass es unter stringenten Bedingungen an die Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 hybridisiert.
8. DNA-Konstrukt umfassend ein Polynuldeotid gemäß einem der Ansprüche 3 bis 7 und einen heterologen Promotor.
9. Vektor umfassend ein Polynuldeotid gemäß einem der Ansprüche 3 bis 7 oder ein DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 8.
10. Vektor gemäß nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Polynuldeotid funktionell mit regulatorischen Sequenzen verknüpft ist, die die Expression des Polynukleotids in pro- oder eukaryotischen Zellen gewährleisten.
11. Wirtszelle enthaltend ein Polynuldeotid gemäß einem der Ansprüche 3 bis 7, ein DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 8 oder einen Vektor gemäß Anspruch 9 oder 10.
12. Wirtszelle gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine prokaryotische Zelle, insbesondere um E. coli, handelt.
13. Wirtszelle gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine eukaryotische Zelle, insbesondere um eine Säuger- oder Insektenzelle, handelt.
14. Antikörper, welcher spezifisch an ein Polypeptid gemäß Ansprach 1 bindet.
15. Transgener Invertebrat enthaltend ein Polynuldeotid gemäß einem der Ansprüche 3 bis 7.
16. Transgener Invertebrat nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Drosophila melanogaster oder Caenorhabditis elegans handelt.
17. Transgene Nachkommen eines Invertebraten gemäß Anspruch 15 oder 16.
18. Verfahren zum Herstellen eines Polypeptids gemäß Anspruch 1, umfassend
(a) das Kultivieren einer Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 11 bis 13 unter Bedingungen, die die Expression des Polynukleotids gemäß einem der Anspruch 3 bis 7 gewährleisten, oder (b) das Exprimieren eines Polynukleotids gemäß einem der Ansprüche 3 bis 7 in einem in vitro-System, und
(c) die Gewinnung des Polypeptids aus der Zelle, dem Kulturmedium oder dem in vitro-System.
19. Verfahren zum Herstellen eines Polynukleotids gemäß einem der Ansprüche 3 bis 7, umfassend die folgenden Schritte:
(a) Vollständige chemische Synthese auf an sich bekannte Weise, oder
(b) chemische Synthese von Oligonukleotiden, Markieren der Oligo- nukleotide, Hybridisieren der Oligonukleoti.de an DNA einer genomischen oder cDNA-Bank, die ausgehend von genomischer DNA bzw. mRNA aus Insektenzellen hergestellt wurde, Selektieren von positiven Klonen und Isolieren der hybridisierenden DNA aus positiven Klonen, oder
(c) chemische Synthese von Oligonukleotiden und Amplifizierung der Ziel-DNA mittels PCR.
20. Verfahren zum Herstellen eines transgenen Invertebraten gemäß Anspruch 15 oder 16, umfassend das Einbringen eines Polynukleotids gemäß einem der Ansprüche 3 bis 7 oder eines Vektors gemäß Anspruch 9 oder 10.
21. Verfahren zum Auffinden neuer Wirkstoffe für den Pflanzenschutz, insbesondere von Verbindungen, welche die Eigenschaften von Polypeptiden gemäß Anspruch 1 verändern, umfassend die folgenden Schritte:
(a) Bereitstellen einer Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 11 bis 13, (b) Kultivieren der Wirtszelle in der Gegenwart einer chemischen Verbindung oder einer Probe, welche eine Vielzahl von chemischen Verbindungen umfasst, und
(c) . Detektieren veränderter Eigenschaften.
22. Verfahren zum Auffinden einer chemischen Verbindung, die an ein Polypeptid gemäß Anspruch 1 bindet, umfassend die folgenden Schritte:
(a) Inkontaktbringen eines Polypeptids gemäß Anspruch 1 oder einer Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 11 bis 13 mit einer chemischen Verbindung oder einem Gemisch von chemischen Verbindungen unter Bedingungen, die die Interaktion einer chemischen Verbindung mit dem Polypeptid erlauben, und
(b) Bestimmen der chemischen Verbindung, die spezifisch an das Polypeptid bindet.
23. Verfahren zum Auffinden einer chemischen Verbindung, die die Expression eines Polypeptids gemäß Anspruch 1 verändert, umfassend die folgenden Schritte:
(a) ■ Inkontaktbringen einer Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 11 bis
13 oder eines transgenen Invertebraten gemäß Ansprach 15 oder 16 mit einer chemischen Verbindung oder einem Gemisch von chemischen Verbindungen,
(b) Bestimmen der Konzentration des Polypeptids gemäß Anspruch 1, und (c) Bestimmen der chemischen Verbindung, die die Expression des Polypeptids spezifisch beeinflusst.
24. Verwendung eines Polypeptids gemäß Anspruch 1, eines Polynukleotids gemäß einem der Ansprüche 3 bis 7, eines Vektors gemäß Anspruch 9 oder 10, einer Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 11 bis 13, eines Antikörpers gemäß Anspruch 14 oder eines transgenen Invertebraten gemäß Anspruch 15 oder 16 zum Auffinden neuer Wirkstoffe für den Pflanzenschutz oder zum Auffinden von Genen, die für Polypeptide codieren, welche am Aufbau von funktioneil ähnlichen Helicokinin-Rezeptoren in Inseiden beteiligt sind.
25. Verwendung eines Modulators eines Polypeptids gemäß Anspruch 1 als Insektizid.
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