WO2003091433A1 - EXPRESSION SYSTEMS FOR STEM LOOP RNA MOLECULE HAVING RNAi EFFECT - Google Patents

EXPRESSION SYSTEMS FOR STEM LOOP RNA MOLECULE HAVING RNAi EFFECT Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to an RNA molecule expression system capable of suppressing the expression of a target gene, a method for producing knockdown cells using the same, and the like.
  • RNA interference is a double-stranded RNA (hereinafter, referred to as “RNAi”) consisting of sense RNA consisting of a sequence homologous to the mRNA of a target gene and antisense RNA consisting of a sequence complementary thereto. This is a phenomenon that can induce target gene mRNA rupture and suppress target gene expression by introducing “dsRNA” into cells or the like. Since RNAi can suppress the expression of target genes in this way, it can be used as a simple gene knockout method instead of the conventional complicated and inefficient method of gene disruption by homologous recombination, or a method applicable to gene therapy. Has attracted attention.
  • RNAi was initially discovered in nematodes (Fire, A. et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.Nature 391, 806-811, (1998)), It has been observed not only in nematodes, but also in various organisms such as plants, nematodes, Drosophila, and protozoa (Fire, A. RNA-triggered gene silencing. Trends Genet. 15, 358-363 ( Sharp, PA RNA interference 2001. Genes Dev. 15, 485-490 (2001); Sharp, PA RNA interference 2001. Genes Dev.
  • dsRNA is known to target mRNA for cleavage in lysates of Drosophila early embryos or extracts of cultured Drosophila S2 cells (Tuschl T., et al. , Genes Dev. 13: 3191-3197, 1999; Ha maraud ond SM, et al., Nature 404: 293-296, 2000; Zamore P., et al., Cell 101: 25-33, 2000).
  • In vitro RNAi reactions were performed using ATP (Hammond S. M., et al., Nature 404: 293-296, 2000; Zamore P., et al., Cell 101: 25-33,
  • siRNAs were identified in Drosophila and are thought to associate with a multi-component nuclease called RISC and direct this enzyme for sequence-specific degradation of mRNA (Hammond SM, et al., Nature 404: 293-296, 2000; Bernstein E. et al., Nature 409: 363-366, 2001; Hammond SM et al., Science 293: 1146-1150, 2001).
  • RNAi provides a way to inactivate target genes, thus studying gene function in C. elegans, Drosophila and plants Provide powerful tools for Specific inhibition of gene expression can also be obtained by stable and inducible expression of dsRNA in animals and plants
  • Mouse embryonic carcinoma EC and embryonic stem (ES) cells successfully inactivate genes with dsRNA
  • PKR protein kinase kinase kinase kinase PKR, whose active form phosphorylates the translation factor eukaryotic initiation factor (eIF2), leading to general inhibition of protein synthesis and cell death (Clemens MJ and Elia A. , J. Interferon Cytokine Res. 17: 503-524, 1997).
  • eIF2 translation factor eukaryotic initiation factor
  • RNAi or RNAi-related systems exist in mammals.
  • rde-l, mut-7 and da Several mammalian homologues of RNAi-related proteins such as Isa have been identified
  • RNAi will be used for functional analysis and gene therapy by suppressing gene expression. Now that the primary sequence of a gene has been almost elucidated, systematic and efficient methods for searching for a functional gene are being developed to quickly elucidate the function of the gene. If RNAi can be used to suppress the expression of any gene and systematically search for functional genes based on changes in the phenotype of the cell or individual, the elucidation of new functional genes will be further accelerated Can be done. Disclosure of the invention
  • the present invention has been made in view of such a situation, and an object thereof is to provide a novel RNA molecule expression system capable of suppressing the expression of a target gene, and a method for producing a knockdown cell using the system. Is to provide.
  • the present inventors have conducted intensive research to solve the above problems.
  • the present inventors have studied sites in mammalian cells where the RNAi effect occurs.
  • Two dsRNA expression vectors controlled by the tRNA Val or U6 promoter were constructed ("iRNA-dsRNAj" and "U6-dsRNA", respectively). It is known that transcripts from the tRNA Val promoter efficiently move from the nucleus to the cytoplasm, whereas transcripts from the U6 promoter remain in the nucleus.
  • the tRNA-dsRNA transcript was present in the cytoplasm and was efficiently processed by the liponuclease III complex. Furthermore, the mutant k-ras-directed tRNA-dsRNA efficiently cleaved the targeted mRNA in vitro and in vivo. That is, it was shown that the RNAi effect occurred. In contrast, U6-dsRNA is delivered to HeLa cells Had no effect on normal k-ras expression. Thus, these results indicate that RNAi occurs in the cytoplasm in mammalian cells. Furthermore, the present inventors have found that gene expression can be efficiently suppressed also in yeast by the RNAi effect.
  • RNA molecule having a stem-loop structure brings about the RMi effect by translocating to the cytoplasm.
  • RNA molecule that forms a stem-loop structure has the feature that it can be transcribed from DNA as one product.
  • stem-loop RNA molecule expressed by the U6 promoter is usually localized in the nucleus, whereas the stem-loop molecule containing the microRNA loop sequence is transported to the cytoplasm by the present inventors, and RNAi is efficiently expressed. The effect was shown.
  • transport of microRNAs to the cytoplasm is essential for cell maintenance, and U6-stemloop RNA molecules containing microRNA loop sequences act dominant-negative and may show cytotoxicity. Therefore, stem-loop RNA molecules expressed by the tRNA promoter developed by the present inventors are considered to be non-cytotoxic because they are transported to the cell without using a microRNA transport system. Can be
  • the present inventors produced the RNA molecule from the DNA encoding the stem-loop RNA molecule using the tRNA promoter, thereby efficiently transferring the RNA molecule to the cytoplasm, We succeeded in exerting the effect, and completed the present invention.
  • RNA molecules translocate into the cytoplasm to produce an RNAi effect. That is, a recombinant human Dicer (hDicer) is prepared, and a long dsRNA is processed using the recombinant hDicer to produce a 20-25 nt siRNA. Then, the siRNA was directly introduced into the cytoplasm, and the RNAi effect was examined. As a result, siRNA (diced-s iRNA) treated with the above hDicer using long dsRNA as a substrate was found to have an efficient target gene suppression effect by directly introducing it into the cytoplasm.
  • siRNA diced-s iRNA
  • RNAi effect is exhibited by directly introducing the RNA treated with the recombinant hDicer into cells.
  • production of a recombinant protein of hDicer having an activity of producing siRNA was also achieved for the first time by the present inventors.
  • RNAi and other gene functions in mammalian cells By using the stem-loop RNA molecule expression system developed by the present inventors, it is possible to easily produce a cell in which a desired gene is knocked out.
  • the present invention also provides a powerful tool for studying the mechanism of RNAi and other gene functions in mammalian cells, and is expected to have potential utility as a therapeutic application.
  • the present invention relates to a novel RM molecule expression system capable of suppressing the expression of a target gene, and a method for producing a knockdown cell using the system, more specifically,
  • a thigh having a structure in which the DNA and a complementary sequence are linked to face each other across a spacer region, and this is functionally connected to a promoter.
  • the promoter is a tRNA promoter, a pol I I promoter, an ol I I promoter, or a tetracycline-inducible promoter;
  • tetracycline-inducible promoter is a tetracycline-inducible tRNA promoter
  • the promoter is NMT1 promoter or GAL1 promoter
  • DNA encoding a stem-loop RNA molecule having an RNAi effect in a cell which is a sense-encoding DNA encoding a sense RNA in any region of the target gene mRM, and a DNA complementary to the DNA.
  • the length of the sense code DNA is 10 to 5000 bp, (5)
  • the stem region of the expressed stem-loop RNA molecule has a length of 10 to 35 bp, [1] to [4], [6] to [10], [12] or [13]. DNA according to any of the above,
  • the stem region of the expressed stem-loop RNA molecule has a length of 31 to 35 bp, (1) to (4), (6) to (10), (12) or (13) DNA according to any of the above,
  • the stem loop-type RNA molecule to be expressed which is constructed so as to contain a mismatch or bulge of 1 to 100 bases per 300 base pairs in the stem region of the expressed stem-loop RNA molecule, [5] or [11]; DNA,
  • DNA encoding a stem-loop random RNA molecule in a cell wherein a DNA encoding a random sequence of RNA and a sequence complementary to the DNA are sandwiched between spacer regions.
  • (31) a living individual according to (30), which is a target gene knockout non-human animal,
  • [36] (a) a DNA encoding a stem-loop RNA molecule having an RNAi effect in a cell, the DNA encoding a sense RNA of any region of the target gene mRM; A DNA characterized by a structure in which a sequence complementary to DNA is ligated to face each other across a spacer region, and this is functionally connected to a promoter;
  • an siRNA expression system comprising: a DNA encoding a polypeptide region having Dicer activity in a Dicer protein; and a DNA having a structure in which a promoter is functionally connected to a promoter.
  • the sNA expression system according to (38), wherein the stem region of the stem-loop-shaped RNA molecule to be expressed contains a mismatch or a bulge of 1 to 100 bases per 300 base pairs.
  • the length of the stem region of the dsRNA paired with the sense RNA and antisense RNA in any region of the target gene mRNA, or the length of the stem region of the stem-loop RNA molecule having the dsRNA as the stem is at least 30 base pairs or more.
  • dsRNA paired with the sense RNA and antisense RNA in any region of the target gene mRNA, or a stem having the dsRNA as a stem The siRNA expression system according to any one of (36) to (41), wherein the sense strand in the stem region of the RNA molecule comprises a mismatch or bulge of 1 to 100 bases per 300 base pairs.
  • siRNA expression vector containing both (a) and (b) DNAs of [36],
  • RNA expression system a stem-loop RNA molecule and a polypeptide having Dicer activity, using the siRNA expression system according to any of [36] to [43] or the expression vector according to [44].
  • a method for suppressing expression of a target gene which comprises expressing both of
  • a dsRNA paired with a sense RNA and an antisense RNA in a region of the target gene mRNA or a stem-loop RNA molecule having the dsRNA as a stem is treated with a polypeptide having Dicer activity.
  • step (b) introducing the dsRNA generated in the above step (a) into cells containing the target gene
  • polypeptide having Dicer activity is a polypeptide comprising the amino acid sequence of positions 1268 to 1924 of the Dicer protein
  • the polypeptide having Dicer activity is a polypeptide consisting of the amino acid sequence of positions 1296 to 1924 of the Dicer protein
  • the length of the stem region of the paired dsRNA or the stem-loop RNA molecule having the dsRNA as the stem is at least 30 bases
  • stem-loop RNA molecule has an RNAi effect when transferred to the cytoplasm. Then, the present inventors linked the DNA encoding the stem-loop RNA with a tRNA promoter, whereby the transcript from the promoter was efficiently transferred from the nucleus to the cytoplasm, and the transcript was It has been revealed that it has RNAi effect.
  • stem loop refers to a structure consisting of a double-stranded portion (stem) generated by hydrogen bonding between inverted repeat sequences present on single-stranded RNA and a loop portion sandwiched between the two. Also called a hairpin loop.
  • a stem-loop RNA molecule has a double-stranded RNA structure in the stem region, and is treated in the cytoplasm by a liponuclease III complex (RISC) containing Dicer to produce RNAi effects.
  • RISC liponuclease III complex
  • si (short interfering) RNA having the following is generated.
  • siRNA is usually a double-stranded RNA molecule of about 20 bp, and is known to have an RNAi effect.
  • Dicer and RISC are thought to be localized in the cytoplasm, and thus translocation of stem-loop RNA molecules to the cytoplasm It is important for exerting the RNAi effect.
  • the present invention provides a DM encoding a stem-loop RNA molecule having an RNAi effect in a cell. That is, the present invention relates to a DNA encoding a stem-loop RNA molecule having an RNAi effect in a cell, characterized in that the expression product is efficiently transferred to the cytoplasm.
  • a sense (or antisense) coding DNA encoding a sense (or antisense) RNA of any region of the target gene mRNA, and a sequence complementary to the DNA, It is a DNA characterized by a structure in which the spacer region is connected to face each other across the spacer region, and this is operably connected to a promoter.
  • the target gene is a gene whose expression is suppressed by the RNAi effect of the stem-loop RNA molecule of the present invention, and can be arbitrarily selected.
  • the target gene for example, a gene whose sequence is known but whose function is to be elucidated, or a gene whose expression is considered to be a cause of disease can be suitably selected.
  • the target gene can be selected as long as it has a portion of its mRNA sequence, at least 15 bases or more, even if the genome sequence is unknown. Therefore, a part of mRNA such as EST (Expressed Sequence Tag) is known, but a gene whose full length is not known can be selected as a target gene in the present invention.
  • EST Expressed Sequence Tag
  • the DNA of the present invention has a structure in which a DNA sequence encoding a sense RNA forms an inverted repeat sequence with a spacer region interposed therebetween.
  • a DNA sequence (double-stranded) encoding sense RNA is
  • the DNA of the present invention comprises a sense code DNA encoding a sense RNA of any region of the target gene mRNA and a sequence complementary to the DNA, with the spacer region interposed therebetween. It has a structure linked so as to oppose, but this ⁇ complementary sequence '' can be expressed as a DNA encoding an antisense RNA against the above ⁇ any region of the target gene mRNA '' it can. Therefore, in other words, the DNA of the present invention comprises an antisense-encoding DNA encoding an antisense RNA for any region of the target gene mRNA and a sequence complementary to the DNA, with the spacer region interposed therebetween. It can also be expressed as having a structure connected so as to face each other.
  • Efficient transfer of the DNA of the present invention to the cytoplasm can be achieved, for example, by including a cytoplasm transfer signal sequence on the DNA. That is, in a preferred embodiment of the DNA of the present invention, the DNA has a cytoplasmic translocation signal sequence.
  • the cytoplasmic translocation signal sequence is preferably, but not necessarily, present in the spacer region.
  • a DNA sequence to which a cytoplasmic translocation protein can specifically bind can be suitably used.
  • the miR23 loop motif (sequence: 5'-CUUCCUGUCA-3 ') can be shown (Kawasaki, H., Taira, K. Short hairpin type of dsRNAs that are controllol). ed by tRNA (Val) promoter s igni fi cant ly induce RNAi -medi ated gene Silencing in the cytoplasm of human cells. Nucleic Acids Res., 31, 700-707 (2003)).
  • a tRNA promoter described later, or a polll-type or ⁇ -type promoter can be used. Further, a tetracycline-inducible promoter can be suitably used. By using such an inducible promoter, the DNA of the present invention can be expressed at a desired timing.
  • tetracycline-inducible promoters include, for example, U6 promoter inducible by tetracycline (Ohkawa, J. & Taira, K. Control of the functional activity of an antisense RNA by a tetracycline-responsive derivative of the human U6 snRNA promoter. Hum Gene Ther. 11, 577-585 (2000)).
  • a tetracycline-inducible promoter is a promoter containing Tet07. Further, as an example in the case where the tetracycline-inducible promoter is used, the following Examples can be referred to.
  • a tetracycline-inducible tRNA promoter can be suitably used. Further, examples of the promoter which can be suitably used in the present invention include, for example, NMT1 promoter and GAL1 promoter.
  • a sense (or antisense) -encoding DNA encoding a sense (or antisense) RNA in any region of the above-mentioned target gene mRNA; It is a DNA characterized by a structure in which a DNA in which a complementary sequence is opposed to each other across a spacer region is functionally connected to a tRNA promoter.
  • the tRNA promoter In the case of prokaryotes, the tRNA promoter is located upstream of the gene, whereas in the case of eukaryotes, the DNA region corresponding to the D loop and T loop of iRNA is known to function as the tRNA promoter. Have been. Therefore, the tRNA promoter of the present invention generally refers to a DNA region corresponding to the D loop or T loop of tRNA. There are usually multiple tRNAs for each amino acid. As the tRNA motor of the present invention, a tRNA (tRNA Va promoter) corresponding to valine (Val) can be suitably used.
  • the term "operably linked” refers to the above-mentioned "sense-coding DNA that encodes a sense RNA of any region of the target gene mRNA in response to transcription from a tRNA promoter, And a sequence complementary to the tRNA promoter so as to generate a transcript of “DNA in which a sequence complementary to the DNA is opposed to each other across the spacer region”. Therefore, the position of the tRNA promoter relative to the DNA may be upstream or downstream, but is usually located upstream. Further, any DNA sequence may be provided between the DNA and the NA promoter overnight as long as the transcription of the DNA can occur.
  • the tRNA by receiving transcription from the tRNA promoter as described above, the tRNA itself is also bound to the stem-loop RNA molecule as a signal for translocation to the cytoplasm.
  • a terminator may be appropriately provided for the DNA.
  • the sequence of the terminus there are no particular restrictions on the sequence of the terminus, as long as it is a sequence that can terminate the transcription of the promoter.For example, a sequence in which four or more A (adenine) bases are continuous, a sequence that can form a palindromic structure A known terminator can be used.
  • the DNA of the present invention includes single-stranded DNA and double-stranded DNA.
  • RNA molecule When the DNA of the present invention undergoes transcription from a tRNA promoter, a continuous transcript (RNA molecule) is generated.
  • a spacer region is interposed. Therefore, the transcription product of the DNA of the present invention also has a structure containing an inverted repeat sequence interposed between spacer regions.
  • An RNA molecule having such a structure usually forms a hydrogen bond between the repetitive sequences to form a stem loop having the repetitive sequences as stems and a splice region as a loop.
  • the RNA molecule forming the stem loop is referred to as “stem-loop RNA molecule”.
  • the present invention also includes a stem-loop RNA molecule transcribed from the DNA of the present invention.
  • RNAi effect means that a metabolite or the like of the stem-loop RNA molecule of the present invention (for example, a product generated by metabolizing the RNA chain by cleavage or the like) has the RNAi effect. Is also included.
  • the length of the DNA constituting the spacer region of the present invention is not particularly limited as long as the repetitive sequence adjacent thereto can form a hydrogen bond, but is usually from 1 to 10,000 bases, preferably from 1 to 100 bases. More preferably, it is 3 to 30 bases, and still more preferably 5 to 20 bases.
  • the nucleotide sequence of the DNA constituting the spacer region is not particularly limited, and may be any sequence.
  • a spacer region is not particularly necessary. Included in the DNA of the invention. Of the present invention
  • DNA for example, can schematically show the structure shown in the upper part of FIG. 1A.
  • the length of the double-stranded RNA in the stem region of the stem-loop RNA molecule of the present invention is usually within 35 bp, preferably 10 to 35 bp, more preferably 15 to 30 bp, and still more preferably Is 18-30 bp, most preferably 26-30 bp or 31-35 bp.
  • the length of each of the ⁇ sense code DNA '' or the two inverted repeat sequences in the DNA of the present invention is also usually within 35 bp, preferably 10 to 35 bp, more preferably 15 to 30 bp. , More preferably 18-30 bp, most preferably 26-30 bp or 31-35 bp It is.
  • the length of the sense code DNA is preferably 10 to 5000 bp, though not particularly limited.
  • the double-stranded RNA portion (the stem portion of the stem-loop RNA molecule) of the siRNA in which the RNAs are paired is not limited to a completely paired one, but a mismatch (when the corresponding base is An unpaired portion may be included due to, for example, non-complementary) or bulge (there is no base corresponding to one strand).
  • the unpaired portion can be provided in a range that does not hinder sRNA formation.
  • the number of mismatches or bulges present in the stem region of the stem-loop RNA molecule expressed from the DNA of the present invention is not particularly limited, but is usually 1 to 10 bases per 20 base pairs.
  • the promoter region of the DNA of the present invention is not particularly limited in the stem region of the stem-loop-type RNA molecule expressed from the DNA of the present invention when the promoter of the present invention is the awake T1.
  • Promoter or GAL1 promoter. May contain 1-100 base mismatches or bulges per 300 base pairs. Examples of the mismatch include a mismatch in which a G'TJ pair of 1 to 6 bases per 20 base pairs is formed on the sense strand.
  • the above-mentioned DNA of the present invention can be prepared by those skilled in the art by general genetic engineering techniques.
  • the DNA of the present invention containing a tRNA promoter can be prepared, for example, by synthesizing an arbitrary sequence by a well-known oligonucleotide synthesis method.
  • the double-stranded DNA of the present invention can be obtained by separately synthesizing the sense strand and the antisense strand, and subjecting each strand to a single chain.
  • the DNA of the present invention can be directly introduced into a chromosome in a cell and expressed in the cell, it is preferable that the DNA be retained in a vector for efficient cell introduction and the like.
  • a vector containing the DNA of the present invention is also included in the present invention.
  • the “vector” that can be used here can be selected according to the cell or the like to be introduced.
  • retroviral vectors I.
  • non-viral vectors such as cationic ribosomes, ligand DNA complexes, and gene guns (Ni itsu Y. et al., Molecular Medicinine 35: 1385-1395 (1998)). It is not limited.
  • the vector can further carry a selection marker or the like that can select cells into which the vector has been introduced, if necessary.
  • Selectable markers include drug resistance markers such as the neomycin resistance gene, hygromycin resistance gene, and puromycin resistance gene, markers that can be selected using enzyme activities such as galactosidase as an index, or fluorescence emission such as GFP. And markers that can be selected as indicators. Further, a selection marker that can select a surface antigen such as EGF receptor or B7-2 as an index may be used. By using the selection marker in this manner, it becomes possible to select only the cell into which the vector has been introduced, that is, only the cell into which the vector of the present invention has been introduced.
  • the retention time in the cell can be increased, and depending on the vector, the integration into the chromosome can be induced as in a retrovirus vector.
  • a stable supply of a stem-loop RNA molecule can be performed in the above.
  • the expression of the gene in the cell can be suppressed by introducing the DNA of the present invention or a vector containing the DNA into the cell.
  • the present invention provides a method for producing a cell in which the expression of a target gene is suppressed, comprising the steps of: introducing the DNA of the present invention or a vector containing the DNA into the cell; And a selecting step.
  • the present invention provides a cell containing the DNA of the present invention or a vector containing the DNA.
  • the cells of the present invention are not particularly limited, and it is desirable to suppress gene expression. Of cells can be used.
  • RNAi can be induced by the DNA of the present invention or a vector containing the DNA, so that the cells of the present invention are particularly limited.
  • examples thereof include mammalian cells (for example, cells of mouse, rat, porcupine, porcupine, porcupine, bush, hidge, monkey, or chimpanzee), yeast, and the like.
  • cells that are difficult to maintain long-term stable expression of long-chain dsRNA such as plant cells are also suitable as cells into which the DNA of the present invention or a vector containing the DNA is introduced.
  • the method of introducing the DNA of the present invention or a vector containing the DNA into the above-mentioned cells can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the type of the cell.
  • the calcium phosphate method (Virology, Vol. 52, p. 56 (1973))
  • the electoporation method (Nucleic Acids Res., Vol. 15, p. 1311 (1987))
  • Selection from the Poffexion method J. Clin. Biochem. Nutr., Vol. 7, p. 175 (1989)
  • the method of transfection by virus Sci. Am., P. 34, March (1994)
  • gene gun etc.
  • a DNA sequence specific to the DNA of the present invention or a vector containing the DNA is used as a probe or primer. Selection can be performed by known methods such as hybridization and PCR.However, when the DNA of the present invention is retained in a vector having a selectable marker, the phenotype of the selectable marker is used as an index. You can choose.
  • a cell into which the DNA of the present invention or a vector containing the DNA has been introduced is a knockdown cell in which the expression of a target gene is suppressed.
  • “Knockdown “Cells” include cells in which target gene expression is completely suppressed and cells in which target gene expression is not completely suppressed but reduced. Conventionally, such cells have been created by deficient or altering the target gene or its control region.However, by using the present invention, the cells of the present invention can be obtained without altering the target gene on the chromosome.
  • the knockdown cells thus created can be used as research materials for functional analysis of target genes, and as disease model cells for cells whose expression is suppressed by using a disease-causing gene as a target gene. It becomes possible.
  • a target gene knockdown animal, a disease model animal, and the like are created. It is also possible to live.
  • the present invention also includes the above-mentioned knockdown cells produced by the present invention, and further includes the present invention also includes an organism (eg, a target gene knockout nonhuman animal or the like) carrying the above-described MA or vector of the present invention. Examples of the above-mentioned organisms in the present invention include mouse, rat, puppies, puppies, puppies, bush, higgins, monkeys, chimpanzees and the like.
  • the present invention also relates to a composition containing the DNA of the present invention or a vector containing the DNA. Since the expression of a desired target gene can be suppressed by the present invention, the effect of treating or preventing the disease can be expected by suppressing the expression of a gene that causes a disease according to the present invention. Further, the above composition is also useful as a reagent for examining the function of a desired gene.
  • the composition may be a composition to which an appropriate excipient or the like is added.
  • Another aspect of the present invention relates to a vector that expresses a stem-loop random RNA molecule.
  • RNA encoding RNA consisting of a random sequence and a sequence complementary to the DNA are ligated to face each other across a spacer region. And a DNA having a structure in which this is operably connected to a tRNA promoter.
  • a transcript having a random sequence expressed from the DNA is referred to as a “stem-loop type random RNA molecule” in the present invention.
  • stem-loop type random RNA molecule By introducing this stem-loop type random RNA molecule into cells, it is possible to search for functional genes. That is, up to the above, the DNA of the present invention or a vector containing the DNA can suppress the expression of a specific target gene. It can be used to suppress genes, for example, genes whose functions are unknown, and to search for new functional genes.
  • the stem-loop random RNA molecule also preferably has a stem region usually within 30 bp, preferably 15 to 30 bp, more preferably 18 to 30 bp.
  • the present invention includes a step of introducing the stem-loop type random RNA molecule expression vector into a cell, a step of selecting a cell into which the vector has been introduced, and a step of analyzing the phenotype of the selected cell. And a method for searching for a functional gene.
  • one vector that can express a stem-loop type random RNA molecule having a different random sequence can be collected and constructed as a library.
  • the library it is possible to more efficiently search for a functional gene.
  • the introduction of the stem-loop type random RNA molecule expression vector into cells can be performed as described above.
  • the cells into which the stem-loop random RNA molecule expression vector or the library has been introduced are then selected, and the phenotype of the cells is analyzed.
  • This phenotypic analysis can be performed, for example, by comparing with a phenotype of a cell into which no stem-loop random RNA molecule expression vector has been introduced as a control.
  • This phenotype includes not only those occurring on the cell surface but also, for example, intracellular changes.
  • stem-loop random RNA molecules that can be controlled are included. Therefore, in order to screen for functional genes, for example, construct probes and primers based on the DNA sequence encoding the stem-loop random RNA of the stem-loop random RNA molecule expression vector contained in this cell. . Then, by performing hybridization or PCR using these probes and primers, functional genes can be cloned. In addition, functional genes can be searched from a database based on the sequence of the DNA encoding the stem-loop random RNA.
  • the present invention also relates to a DNA having a structure capable of expressing an RNA molecule having an RNAi effect in a cell, and a DNA having a structure capable of expressing a polypeptide having Dicer activity (eg, Dicer protein).
  • S iRNA expression system e.g., the sRNA expression system of the present invention, the sRNA expression system comprises the following DNAs (a) and (b). Dicer activity can reduce cell toxicity due to long dsRNA.
  • DNA encoding a stem-loop RNA molecule having an RNAi effect in a cell which is sense-code DNA encoding a sense RNA in any region of the target gene mRNA; and a DNA complementary to the DNA.
  • polypeptide J having Di cer activity in Di cer protein refers to at least a partial polypeptide fragment having Di cer activity in Di cer protein, or a protein containing the polypeptide (for example, full-length Di cer protein)
  • This Dicer activity usually refers to the activity of cleaving long double-stranded RNA into double-stranded RMs of 21 to 25 bases
  • Di cer activity measures RNacell ll activity.
  • a person skilled in the art can use a known method, For example, the activity can be evaluated (measured) by, for example, in vitro processing 'atsey. For example, in vitro processing access can be carried out by the method described in Examples described later.
  • the origin of the Dicer protein used in the present invention is not particularly limited, and for example, a human Dicer protein can be suitably used.
  • the nucleotide sequence of the gene encoding the Dicer protein can be represented by SEQ ID NO: 55
  • the amino acid sequence of the Dicer protein can be represented by SEQ ID NO: 56.
  • the amino acid sequence of usually preferably 1066 to 1924, more preferably 1268 to 1924, more preferably 1296 to 1924 in Di Dicer protein (E.g., in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 56, preferably the amino acid sequence of positions 1066 to 1924, more preferably 1268 to 1924, still more preferably 1296 to 1924 Polypeptide).
  • the siRNA expression vector having DM of the above (a) and (b) is also included in the present invention.
  • the DNA of the above (a) or (b) can be easily prepared by those skilled in the art using known genetic engineering techniques.
  • the present invention provides a method for suppressing the expression of a target gene.
  • a stem-loop RNA molecule and a polypeptide having Dicer activity (a polypeptide (I)) using the siRNA expression system of the present invention or the expression vector of the present invention.
  • a method for suppressing the expression of a target gene which comprises expressing both of the Dicer protein in a cell.
  • a recombinant protein is suitably used as the Dicer in the method.
  • dsRNA paired with sense RNA and antisense RNA in any region of the target gene mRNA is converted into a polypeptide having Dicer activity (eg, Treated with the recombinant hDicer protein), and then introduce the resulting dsRNA into cells containing the target gene. I do.
  • the method for producing a recombinant hDicer in the above method can be carried out, for example, by the method described in Examples below, but is not necessarily limited to this method. Those skilled in the art can produce recombinant hDicer by appropriately modifying the methods described in the Examples.
  • polypeptide having Dicer activity for example, a full-length Dicer protein or a protein containing the above-mentioned partial polypeptide region in Dicer protein can be suitably used.
  • polypeptide having Dicer activity for example, those expressed in Escherichia coli or insect cells can be suitably used.
  • a person skilled in the art can express a desired protein in Escherichia coli or insect cells using general genetic engineering techniques, and further recover and purify the protein.
  • the introduction of dsRNA into cells can be easily carried out by those skilled in the art by a method known to those skilled in the art, for example, an electro-volume method or a lipofection method.
  • the length of the “dsRNA paired with the sense RNA and antisense RNA in any region of the target gene mRNA” in the above method is not particularly limited, but is preferably one of the target gene mRNA.
  • the stem region of the dsRNA paired with the sense RNA and the antisense RNA or the stem region of the stem-loop RNA molecule having the dsRNA as a stem is at least 30 base pairs or more.
  • 300 base pairs are added in the dsRNA paired with the sense RNA and antisense RNA in any region of the target gene mRNA, or in the sense strand in the stem region of a stem-loop RNA molecule having the dsRNA as a stem. It may contain mismatches or bulges of 1-100 bases per.
  • the target gene can be obtained. It is also possible to create knockdown non-human animals (eg, mice, etc.), disease model non-human animals, and the like.
  • sRNA expression vector is injected into a fertilized egg obtained by crossing F1 female and female.
  • Peripheral blood DNA was obtained from the tail of a mouse generated from a fertilized egg, and genomic Southern blot was performed using a part of the expression vector as a probe. Identify the animal. Backcrossing with any of the F1 8 hybrid mice is repeated to obtain progeny mice.
  • the transgenic positive offspring is identified by genomic Southern blot analysis and PCR analysis.
  • RNAi RNA-like RNA
  • dsRNA RNA-like RNA
  • the effect of RNAi can be maintained by integrating the DNA or vector of the present invention into a chromosome in a plant cell.
  • by creating a transgenic plant from such cells it is possible to create a plant stably retaining the RNAi effect.
  • the creation of plants can be carried out by those skilled in the art by a well-known method.
  • FIG. 1 is a diagram showing the construction of a dsRNA expression plasmid.
  • the tRNA-dsRNA expression plasmid has a human iRNA V a1 promoter sequence and a evening mineral sequence.
  • the plasmid for expressing mouse U6-dsRNA or human U6-dsRNA has a mouse U6 promoter or a human U6 promoter, respectively.
  • Loop 1 sequence (5'-GAAAA-3 ') or loop 2 sequence (mir23 loop sequence (Lagos-Quintana,. Et al. (2001) Science, 294, 853-858.): 5'-CUUCCUGUCA- The 3'Z sequence number: 30) was inserted between the k-ras sense strand sequence (29 bp) and the antisense strand sequence (29 bp).
  • the dsRNA and repeat sequences in U6-dsRNA are the same as tRNA-dsRNA.
  • FIG. 2 is a photograph showing the detection of precursor dsRNA and siRM.
  • Precursor dsRNA and siRNA detection was analyzed by Northern blot analysis. Plasmids encoding NA-dsRNA or U6-dsRNA were introduced into SW480 cells. 48 hours later, collect these cells, cytoplasm (C) and nuclear fraction
  • RNA of each fraction was isolated and fractionated using 15% polyacrylamide gel.
  • Northern blot analysis was performed as described (lane 1, nuclear fraction of cells expressing tRNA-dsRNA; lane 1, cytoplasmic fraction of cells expressing tRNA-dsRNA; lane 3, mU6- Nuclear fraction of cells expressing dsRNA (loop 1); lane 4, cytoplasmic fraction of cells expressing mU6-dsRNA (loop 1): lane 5, of cells expressing WJ6-dsRNA (loop 1) Nuclear fraction; Lane 6, cytoplasmic fraction of cells expressing hU6-dsRNA (Loop 1); Lane 7, nuclear fraction of cells expressing mU6-dsRNA (Loop 2); Lane 8, mU6_dsRNA (Loop 2) Lane 9, cytoplasmic fraction of cells expressing WJ6-dsRNA (loop 2); lane 10, cytoplasmic fraction of cells expressing MJ6-dsRNA (loop 2).
  • FIG. 3 is a photograph showing the effect of Dicer lipozyme on dsRNA treatment.
  • (A) shows the expression level of the dicer gene in cells expressing the poly (A) -linked Dicer lipozyme (Dicer-RzAl00). Dicer mRNA was detected by RT-PCR using primers specific for the dicer gene (see Example 3). GADPH is an endogenous control.
  • FIG. 4 is a photograph showing cleavage of mutant k-ras mRNA by dsRNA and siRNA-mediated degradation.
  • FIG. 5 is a diagram showing the efficiency and specificity of RNAi by tRNA-dsRNA in in vivo.
  • K-ras protein levels in cells expressing tRNA-dsRNA or U6-dsRNA were analyzed by Western blot analysis using a specific k-Ras antibody.
  • the mutant k-ras gene was expressed in SW480 cells.
  • the normal k-ras gene was expressed in HeLa cells.
  • band intensities were analyzed by densitometry using the NIH Image Analyzers.
  • FIG. 6 is a graph showing the effect of NA-dsRNA on cell proliferation.
  • the growth rate was measured as described in the examples. Values are the average soil SD from three replicates in each case.
  • SW480 cells expressing tRNA-dsRNA grew much more slowly than wild-type SW480 cells.
  • the growth rate in tRNA-dsRNA expressing HeLa cells The degree was the same as the growth rate of wild-type SW480 cells.
  • FIG. 7 is a photograph showing (A) detection of diced-siRNA generated by hDicer.
  • Recombinant hDicer was synthesized in E. coli and detected by Western blot analysis as described in the examples.
  • the re-hDicer (0.5 ⁇ g) preparation was fractionated by SDS-PAGE (10% polyacrylamide) and transferred to a PVDF membrane by electroblotting. Next, re-hDicer was visualized by using an ECL kit and streptavidin-binding lipophosphatase.
  • Mock preparation from cells transformed with empty plasmid
  • phDicer preparation from cells infected with an expression plasmid encoding hDicer.
  • FIG. 8 is a diagram showing suppression of the expression of an exogenous pure mouth-mycin resistance gene.
  • sites 1 to 10 were selected as targets for synthetic siRNA.
  • diced-siRNA a long dsRNA corresponding to the 5'-terminal region (1-300 bases) of the puromycin resistance gene was prepared and treated with recombinant hDicer.
  • Fig. 9 is a diagram showing suppression of expression of the endogenous H-ras gene.
  • A As described in the examples, ten sites (sites 1 to 10) were selected as targets of the synthetic siRNA.
  • (B) shows the secondary structure of H-ras mRNA estimated by the mfold program. .
  • diced-siRNA was the most effective suppressor of endogenous H-ras gene expression (far right bar in bar graph). The results were normalized with reference to actin levels (control).
  • (D) A graph showing the effect of diced-siRNA targeting the H-ras gene on the expression of related genes K-ras and N-ras.
  • K-Ras and N-Ras were detected by Western blotting using specific antibodies. Expression levels were quantified by densitometry and NIH Image Analysis.
  • FIG. 10 is a photograph showing suppression of expression of endogenous genes c-jun and c-fos by diced-siRNA.
  • diced- For the preparation of siRNA generates a c- jun gene ⁇ 2 00 nt)
  • Contact Yopi c- fos gene (1 to 200 nt) long dsRNA associated with the 5 'region of, in recombinant hDicer Processed Both c-Jun and c-Fos were detected by stamp lotting using specific antibodies. Actin was used as an endogenous control.
  • WT-Hela wild-type HeLa cells, c-Jun (c-Fos) diced- siRNA; siRNA generated from c-jun-specific (c-fos-specific) dsRNA.
  • FIG. 11 shows the construction of a plasmid for polIII-dependent expression of shRNA and its target erbB2 mRNA.
  • the plasmids for expressing tRAshRA, WJ6-shRA, and mU6-shRNA each contain a terminator sequence together with a promoter sequence from the human tRNA Val gene, a human U6 promoter arrangement IJ, and a mouse U6 promoter sequence.
  • Loop array (5′-GAAAA-3 ′) was inserted between the sense strand sequence (29nt) and the antisense strand sequence (29 ⁇ ) of the erbB2 target.
  • (B) is a diagram showing an RNAi getter site in erbB2 mRNA.
  • the inventors selected five targeting sites for tRNA-shRNA in erbB2 mRNA.
  • precursor dsRNA and s iRNA (0 is a photograph showing detection of precursor dsRNA and s iRNA.
  • pre-dsRNA precursor dsRNA
  • s iRNA s iRNA was analyzed by Northern blotting. TRNA-encodes shRNA, mU6-shRNA, and hU6-sMNA
  • the plasmid was introduced into MCF-7 cells 48 hours later, the cells were harvested and the cytoplasmic (C) and nuclear (N) fractions were prepared.
  • Lane 1 is the nuclear fraction of cells expressing tRNA-shRNA
  • lane 2 is the cytoplasmic fraction of cells expressing tRNA-shRNA
  • Lane 3 nuclear fraction of cells expressing hU6-shRNA
  • lane 4 cytoplasmic fraction of cells expressing MJ6-shRNA
  • lane 5 nuclear fraction of cells expressing mU6-shRNA
  • lane 6 It is a cytoplasmic fraction of cells expressing mU6_shRNA.
  • (D) shows the effect of RNAi by tRNA-shRNA (tRNAi), mU6-shRNA (mU6i), and hU6-shRNA (J6i) in MCF-7 cells.
  • tRNAi tRNA-shRNA
  • mU6i mU6-shRNA
  • J6i hU6-shRNA
  • FIG. 12 shows the effect of RNAi by NA-shRNA, mll6-shRNA, and MJ6-shRNA in mice.
  • (A) shows the construction of tRNA-shRNA, mU6-shRNA, and J6-shRNA expression plasmids targeted to the E126 sequence in GFP mRNA.
  • FIG. 13 shows the effect of RNAi by tRNA-shRNA, mU6-shRNA, and hU6-shRNA in mice.
  • (A) is a photograph showing the effect of RNAi on blastocysts by tRNA-shRNA, mU6-shRNA, and J6-shRNA. See (B) for details.
  • FIG. B is a photograph showing the effect of RNAi by tRNA-shRNA on newborn mice.
  • the tRNA-shRNA transgenic mice were irradiated with ultraviolet light.
  • Green fluorescent GFP emission was imaged using a digital card camera (no filter).
  • Figure 1 4 is a diagram showing a tRNA- tetracycline induction of shRNA (Te t induction) expression c
  • (B) is a photograph showing the detection results of precursor dsRNA (pre-dsRNA) and siRNA in a Tet-dependent shRNA expression system.
  • precursor dsRNA pre-dsRNA
  • siRNA siRNA in a Tet-dependent shRNA expression system.
  • FIG. 15 is a diagram showing tetracycline-induced (Te t-induced) expression of tRNA-shRNA.
  • (A) shows the dependence of Tet07-NA_shRNA expression on doxycycline (Dox) dose. Transcript levels increased rapidly with increasing Dox concentration, with a maximum activation of 100 ng / ml.
  • (B) shows the effect of Tet07-tRNA-shRNA on erbB2 gene expression.
  • ErbB2 protein levels in the presence or absence of 100 ng / ml Dox were quantified and analyzed by Western blotting and densitometry. ErbB2 protein levels were normalized using actin levels.
  • FIG. 16A is a diagram schematically showing the construction of a dsRNA expression vector in yeast.
  • dsRNA and siRNA levels were detected by Northern blot analysis (lane 1 is wild-type (WT) S.
  • Lane 2 is pSPi-LEU2 in ⁇ S. bomb strain
  • lane 3 is pSPi-LEU2 in ydcrl-S. Bomb strain
  • lane 4 is mock vector in WT S. cerevisiae strain
  • lane 5 Is pSCi-LacZ in the WT S. cerevisiae strain
  • Lane 6 is a mock vector in the WT S. bomb strain
  • Lane 7 is pSCi-LacZ in the WT S. bomb strain.
  • s iRNA was detected in the WT S.
  • FIG. 17 is a diagram showing the effect of dsRNA-induced RNAi on exogenous LacZ gene expression in S. bombs and S. cerepiche.
  • FIG. 18 is a photograph showing the effect of dsRNA-induced RNAi on S. bombs.
  • A is a photograph showing the effect of dsRNA-induced RNAi on exogenous LEU2 gene expression in S. bombs. Proliferation of S. bomb cells expressing dsRNA-LEU2 was examined in oral isin deficient medium (LeiT).
  • FIG. 19 is a photograph showing the effect of sRNA-induced RNAi and the detection of RdRP activity in S. bombs.
  • A is a photograph showing the effect of sRNA-induced RNAi on exogenous Zeor gene expression in S. bombs.
  • FIG. B is a diagram and a photograph showing the detection of the extended antisense strand siRNA by the yRdpl complex in S. bomb using the biotin pull-down RT-PCR analysis.
  • extension antisense Chain s iRNA was detected only in 20mM s iRNA-Zeo r treated with Zeo r expressed S. Bon base stock. Rad 17 is an endogenous control.
  • SW480 human colon carcinoma cell line was cultured in L-15 medium (ICN Biomedicals, Inc., Ohio, USA) supplemented with 10% FBS. HeLa cells were cultured in DMEM containing 10% FBS. Transfection was performed with Ifectin TM reagent (Qiagen, Hilden, Germany) according to the manufacturer's protocol. dsRNA expressing SW480 and dsRNA expressing HeLa cells were selected by incubating with puromycin for 2 weeks.
  • tRNA Val (Koseki, S. et al.) between the EcoRI and BamHI sites of pPUR (Clontech, CA, USA). (1999) J. Virol., 73, 1868-1877.), A PIR-NA plasmid containing a chemically synthesized promoter of the human gene was used.
  • Mutant k-ras-directed dsRNA containing loop 1 (5'-GAG CTC GGT AGT TGG AGC TGT TGG CGT AGG CAA GAG AAA ATC TTG CCT ACG CCA ACA GCT CCA ACT ACC GGT ACC-3 'Z SEQ ID NO: 2)
  • the encoding chemically synthesized oligonucleotide was amplified to a double-stranded sequence by PCR. After digestion with Sacl and Kpnl, the fragment was cloned into p JR-tRNA downstream of the tRNA promoter. Construction of a vector for expressing dsRNA from mouse U6 promoter overnight, except for the dsRNA sequence insertion step Acad. Sci. USA, 95, 7327-7332., Kato, Y, et al., Opl elm- Duj mdch, D. & Altman, S. (1998) al. (2001)
  • TTTTTT ol III terminating sequence
  • Dicer-directed lipozyme sequence 5, -TCC CCG GTT CGA AAC CGG GCA CTA CAA AAA CCA ACT TTC AAA GAA AGC TGA TGA GGC CGA AAG GCC GAA ACC CAT TGG GGT ACC CCG GAT ATC TTT TTT-3'Z SEQ ID NO: 7
  • Csp45I and Pstl the fragment was digested with UC-dt (Koseki, S. et al. (1999) J.
  • SW480 or HeLa cells were grown to approximately 5X cells and transfected with tRNA-dsRNA or U6-dsRNA expression vectors with Ifectin® reagent (Qiagen, Hilden, Germany). Cells were harvested 36 hours after transfection. To prepare the cytoplasmic fraction, the collected cells are washed twice with PBS and digitonin lysis buffer (50 mM HEPES / K0H, pH 7.5, 50 mM potassium acetate, 8 mM MgCl2, 2 mM EGTA, and 50 mM (gg / ml digitonin) in ice for 10 minutes.
  • PBS and digitonin lysis buffer 50 mM HEPES / K0H, pH 7.5, 50 mM potassium acetate, 8 mM MgCl2, 2 mM EGTA, and 50 mM (gg / ml digitonin) in ice for 10 minutes.
  • the lysate was centrifuged at l, 000Xg, and the supernatant was collected as the cytoplasmic fraction.
  • the pellet was resuspended in NP-40 lysis buffer (20 mM Tris-HCl, H7.5, 50 mM KCL 10 mM NaCK ImM EDTA, and 0.5% NP-40) and maintained on ice for 10 minutes.
  • the lysate was used as nuclear fraction.
  • RNA and nuclear RNA were extracted and purified from the cellular and nuclear fractions, respectively, using the IS0GEN reagent (Wako, Osaka, Japan). Total RNA per lane 30 g were loaded on a 15% polyacrylamide gel. After electrophoresis, the RNA band was transferred to a Hypound-N® nylon membrane (Amersham, Buckinghamshire, UK). The membrane was probed with synthetic oligonucleotides complementary to the sequence of the k-ras gene. The synthetic probe was 32 P-labeled with T polynucleotide kinase (Takara Shuzo, Kyoto, Japan).
  • RT-PCR was performed using RNA PCR Kit ver. 2 (Yukara, Kyoto, Japan) and dicer upstream (nt. 24) primer and downstream (nt. 435-459) primer, or GADPH upstream (nt. 230-254) and downstream (nt. 442-446) primers.
  • the PCR products were analyzed by electrophoresis on a 2% agarose gel.
  • SW480 cells or HeLa cells in which each dsRM-expression vector was transfected were collected.
  • the protein was digested by SDS-PAGE (10% polyacrylamide) and transferred to a PVDF membrane (Funakoshi, Tokyo, Japan) by electroblotting. Immunocomplexes are visualized using K_Ras (UBI, California, USA) and actin (Santa Cruz, California, USA) with a specific polyclonal antibody ECL kit (Amersham, Buckinghamshire, UK) did.
  • mutant k-ras ⁇ type DNA (70 nt) and normal k-ras ⁇ type DNA (70 nt) using a DNA synthesizer we synthesized mutant k-ras ⁇ type DNA (70 nt) and normal k-ras ⁇ type DNA (70 nt) using a DNA synthesizer.
  • type I DNA is amplified by PCR using a k-ras-specific up-primer containing a T7 promoter sequence and a k-ras-specific down primer. did.
  • These amplified k-ras DNA type I were transcribed by T7 polymerase. Transcribed normal and mutant k-ras mRNA substrates were extracted using PAGE.
  • mRNAs were 32 P-labeled with T4 polynucleotide kinase.
  • 5-10 nM target RNA is combined with each SW480 cell lysate expressing tRNA-dsRNA or U6-dsRNA under standard conditions (Zamore, P. et al. 2000) Cell, 101, 25-33.) 25 for 2 hours.
  • 100 nM siRNA is combined with 5-10 nM target RNA in SW480 cell lysate under standard conditions (Zamore, P. et al. (2000) Cell , 101, 25-33.) Incubated at 25 ° C for 2 hours.
  • the growth rate of each cell line was determined using the Cell Proliferation Kit IKRoche Ltd., Switzerland) according to the manufacturer's instructions.
  • pol III promoters human tRNA Val related genes
  • Promoter and mouse U6 promoter or human U6 promoter If properly designed, transcripts produced by the promoter of the human gene for tRNA Val can be transported efficiently from the cytoplasm. In contrast, transcribed small RNAs under the control of the U6 promoter are present in the nucleus (Koseki, S. et al. (1999) J. Virol., 73, 1868-1877.).
  • the present inventors used dsRNA as an extended stem-loop RNA (FIG. 1A), tRNA Val promoter (tRM-dsRNA), mouse ⁇ 6 promoter (mU6-dsRNA) or human U6 promoter (J6- dsRNA) 3 ' The ends were ligated.
  • the present inventors constructed a dsRNA expression plasmid targeting the mRNA of a K-Ras mutant having a point mutation at codon 12 of the k-ras gene (FIG. 1B).
  • Long dsRNA > 30mer induces nonspecific reduction of mRNA (Manche, L. et al.
  • dsRNA The length of the double-stranded region in dsRNA is If the 29 bp (construct based on U6, the present inventors have used two loop motifs stem-loop RNA. one is Rupumo chief consisting of five nucleotides (5'- GAMA-3 '), i.e. Loop 1 (Fig. 1A) The other is the microRNA (human mir-23; 48) loop motif, Loop 2. (Fig.
  • Precursor microRNA is transported and processed into mic-mouth RNA May be involved in post-transcriptional gene silencing (Lagos-Quintana, M. et al. (2001) Science, 294, 853-858., Lee, Y. et al. (2002) EMB0 J, 21 , 4663-4670., Grishok, A. et al. (2001) Cell, 106, 23-24., Reinhart, BJ et al. (2000) Nature, 403, 90 906, Lau, NC et al. ( 2001) Science, 294, 858-862., Lee, RC & Ambros, V. (2001) Science, 294, 862-864., Mourelatos, Z. et al. (2002) Genes Dev., 16 "720-728.) 0
  • RNAi long dsRNAs are processed into short RNA duplexes, approximately 21 and 22 nucleotides in length, with a twisted 3 'end according to an RNase III-like reaction
  • Dicer-RzAlOO Dicer-directed lipozyme
  • the present inventors performed Northern blot analysis using total RNA from tRNA-dsRNA-expressing cells. As shown in FIG. 3B, in the case of total RNA from Dicer-RzAlOO-expressing cells, siRNA generated from tRNA-dsRNA was not observed in both the nucleus and cytoplasm. Thus, these results suggest that tRNA-dsRNA is processed by Dicer in the cytoplasm. In contrast, Dicer reduction did not affect mU6-dsRNA (Loop 1) treatment. Therefore, processing of mU6-dsRNA (Loop 1) may have been performed by another RNaselll-like enzyme.
  • Example 3 In vitro target mRNA degradation using cell extracts containing IRNA-dsRNA, U6-dsRNA or synthetic siRM
  • RNAi assays To determine in which compartment target mRNA degradation by dsRNA-mediated gene silencing occurs, we performed in vitro RNAi assays using cell extracts containing tRNA-dsRNA transcripts. In these assays, we used mutant and normal k_ras partial mRNA transcribed as substrates by T7 polymerase in vitro. To cleave the target mRNA, each substrate was incubated with a SW480 cell extract transfected with a tRNA-dsRNA expression vector for 2 hours. The 5 'cleavage product was resolved on a sequencing gel. As shown in FIG.
  • the mutant k-ras mRNA substrate was cleaved in the cytoplasmic fraction of the cell extract containing tRNA-dsRNA (lane 4). In contrast, the substrate was not cleaved in the nuclear fraction of the cell extract (lane 3).
  • RNAi-induced silencing complex
  • RNAi-induced silencing complex (RNAi-induced silencing complex; RISC) has been previously reported to be included in the ribosome fraction (Zamore, P. et al. (2000) Cell, 101, 25-33.
  • si RM generated from tRNA-ds RNA has a mismatched base pair to normal k-ras mRNA at the middle position of the si RNA by sequencing analysis (data not shown). Similar results were obtained using synthetic siRNAs targeted to the c mutant k-ras mRNA (FIG. 4B; Hutvagner, G. & Zamore, PD (2002) Science, 297, 2056- 2060.). Thus, our results suggested that target mRNA degradation by dsRNA-mediated gene silencing also occurred in the cytoplasm, and that the siRNA was able to discriminate a single Misuchi base pair at the central position.
  • RNA-dsRNA effectiveness and specificity of RNAi by tRNA-dsRNA in colon cancer cells
  • tRNA-dsRNA and four U6-dsRNA expression plasmids were introduced into SW480 cells and HeLa cells.
  • the mutant k-ras gene was expressed only in SW480 cells (Mitchell, C.E. et al. (1995) Anal Biochem., 224, 148-153.).
  • the present inventors used HeLa cells expressing a normal k-ras gene as a control.
  • the present inventors obtained stable cell lines expressing tRNA-dsRNA or each U6-dsRNA by puromycin selection.
  • the present inventors checked the level of K-Ras protein in cells expressing tRNA- or each U6-dsRNA by Western blot analysis using a K-Ras-specific antibody. For quantification, band intensities were analyzed by densitometry using NIH Image Analysys. As shown in Figure 5, tRNA-dsRNA, mU6-dsRNA (loop 2) The K-Ras protein level of SW480 cells expressing hU6-dsRNA (loop 2) or hU6-dsRNA (loop 2) was significantly reduced compared to wild-type (WT) SW480 cells, but mU6-dsRNA (loop 1).
  • the K_Ras protein level in SW480 cells expressing hU6-dsRNA (Loop 1) hardly changed compared to wild-type SW480 cells. Actin protein levels as an internal control remained constant in these cell lines. Moreover, in HeLa cells expressing tRNA-dsRNA, K_Ras protein level was unchanged compared to wild-type cells and cells expressing each U6-dsRNA. These results clearly demonstrated both the efficiency and specificity of tRNA-dsRNA in human cancer cells.
  • the partial-length human dicer / HERNA gene (nt 379-1657 and nt 1390-7037) integrated into the pBluescr ipt vector (Stratagene, California, USA) Dr. Matsuda (Nagoya University; Matsuda, S., Ichigotani, Y., Okuda, ⁇ ., Irimura, ⁇ ., Nakatsuga a, S. and Hamaguchi, ⁇ . (2000) .Molecular cloning and characterization of a novel human gene (HERNA) which encodes a putative RNA-helicase. Biochira. Biophys. Acta., 1490, 163-169.
  • the present inventors have developed a specific primer (forward primer: 5'-ATG AAA AGC CCT GCT TTG CAA CCC CT-3 '/ SEQ ID NO: 8; reverse primer: 5'-AGT TGC AGT TTC AGC ATT ACT Using CTT-3 '/ SEQ ID NO: 9), the 5' terminal coding region (bases 183 to 902) of dicer is amplified from the HeLa cDNA library by PCR, and the amplified DNA is Cloning vector (Invitrogen, California, USA). Then, the full-length human dicer gene was cloned from the partial-length human dicer (hDicer) cDNA.
  • hDicer cDNAs are then cleaved and their blunt-ended fragments converted to Pinpoint®-Xa vector-1 (Promega, Inc., Isconsin, USA) containing a biotin tag for purification of the recombinant protein. Subcloned using the EcoRV site. Next, the hDicer expression plasmid (phDicer) was introduced into E. coli together with 2 M of biotin, and the expression was induced with 100 M of IPTG.
  • Pinpoint®-Xa vector-1 Promega, Inc., Isconsin, USA
  • the cells are collected, centrifuged at 5,000 ⁇ m for 10 minutes to precipitate, and a cell lysis buffer [100 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 1% Triton X-100, Im DTT, 2 mM PMSF, 50 mM mM Tris-HCl (pH 8.0)].
  • a cell lysis buffer [100 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 1% Triton X-100, Im DTT, 2 mM PMSF, 50 mM mM Tris-HCl (pH 8.0)].
  • an equal volume of the re_hDicer preparation (0.5 g) was obtained by the “puU-down” method using Streptavidin-conjugated SoftLink® resin (Promega).
  • the fluid was purified and isolated from the biotin tag using Factor Xa protease.
  • This hDicer was fractionated by SDS-PAGE (10% polyacrylamide) and transferred to a PVDF membrane (Funakoshi, Tokyo, Japan) by electroblotting. Detection was performed by Western blotting using an ECL kit (Amersham, Buckinghamshire, UK) and streptavidin-alkaline phosphatase. As a result, as shown in FIG. 7A, recombinant hDicer having a biotin tag was detected by Western blotting. The estimated molecular weight of re-hDicer is approximately 220 kDa. In contrast, a mock vector that did not encode the hDicer gene did not yield the protein. Thus, it was found that recombinant hDicer could be made using this expression system.
  • puromycin resistance gene (nt 300), H-ras gene (nt 370-570), c_jun gene (nt 1-200), and c-fos gene were prepared to produce long dsRNA to be used as a substrate. (Nt 1 to 200) were amplified by PCR using a specific forward primer containing the T7 promoter and a specific reverse primer containing the SP6 promoter.
  • sense strand RNA was generated by T7 RNA polymerase, and antisense strand RNA was generated by SP6 RNA polymerase.
  • All siRNAs for nRNA and H-ras mRNA were synthesized by Japan Bio Service (JBioS) Co Ltd. (Saitama, Japan).
  • RNA interference is mediated by 21- and 22-direct leotide RNAs. Genes Dev ., 15, 188-200.).
  • 10 g of the dsRNA has 1 re- HDicer 200 1 of reaction buffer [100 niM NaCl, 20 mM HEPES , 1 mM ATP, 5 mM MgCl z, 50 mM Tris-HCl (pH 7.0)].
  • the above MgCl 2 was used with or without addition.
  • 201 reaction mixtures were fractionated by electrophoresis on a non-denaturing 12% polyacrylamide gel.
  • Syber RNA Band was detected using Green II reagent (Nitsubon Gene, Toyama, Japan).
  • siRNAs having a length of 21 to 23 bases were recovered from the reaction mixture.
  • the siRNA was precipitated with ethanol and then dissolved in TE buffer. The absorbance at 260 nm was measured to calculate the concentration of diced-siRNA.
  • RNAi pathway (2001) .Identification of essential genes in cultured mammalian cells using small interfering RNAs. Cell Sci., 114, 4557-4565 .; Hoi en, T., Amarzguioui, M., Wiiger, MT, Babaie, E. and Prydz, H. (2002). Positional effects of short interfering RNAs. targeting the human coagulation trigger Tissue Factor. Nucleic Acids Res., 30, 1757-1766.). Long dsRNAs (> 30 nt) activate PKR and 2 ', 5'-oligoadenylate synthase involved in IFN-mediated defense pathways, but these relatively short siRNAs It can avoid activation of enzymes and activate the RNAi pathway.
  • siRNAs are useful for sequence-specific gene silencing in gene expression.
  • siRNAs have been reported to have target site dependence (Holen, T., Amarzguioui, M., Wiiger, ⁇ . ⁇ ., Babaie, ⁇ . And Prydz, ⁇ . (2002) .Positional effects. Nucleic Acids Res., 30, 1757-1766.), it is extremely difficult to predict the best (efficient) target site.
  • Target site dependency of siRNA is human tissue factor
  • hTF has only been investigated for genes (Holen, T., Amarzguioui, M., Wiiger, ⁇ . ⁇ ., Babaie, ⁇ . and Prydz, ⁇ . (2002) .Positional effects of short interfering RNAs targeting the Human coagulation trigger Tissue Factor. Nucleic Acids Res., 30, 1757-1766.)
  • the present inventors furthermore set the target site dependency of the siRNA targeting the puromycin resistance gene to the following within this gene. The study was conducted by selecting 10 target sites (sites 1 to 10)
  • Site 8 5'-GGG TCT GGG CAG CGC CGT C -3 '/ SEQ ID NO: 17
  • Site 9 5'-CCT CCC CTT CTA CGA GCG G-3'Z SEQ ID NO: 18;
  • SiRNA targeting GL3-luciferase was used as a control.
  • diced-siRNA both the sense and antisense strands (1 to 300 nt) of the partial length mRNA of the puromycin resistance gene were transcribed in vitro with T7 RNA polymerase and SP6 RNA polymerase, and then recombined. Treated with hDicer. After dsRNA was fragmented in vitro, diced-siRNA was purified by gel extraction using a QIAquick® nucleotide removal kit.
  • each siRNA (20 nM) and the puromycin resistance gene expression plasmid were introduced into HeLa cells using Oligofectamin® (Invitrogen) reagent according to the manufacturer's instructions. HeLa cells were cultured in DMEM supplemented with 10% FBS. After 36 hours, HeLa cells were treated with puromycin and cell viability was measured using trypan blue staining. The transformation efficiency of each siRNA was measured using the Renilla luciferase * reporter gene.
  • siRNA targeting GL3 luciferase As shown in FIG. 8B, in the presence of siRNA targeting GL3 luciferase, cell viability was unchanged compared to wild-type HeLa cells. The viability of cells treated with siRNAs specific for site 2, site 3, site 4, site 5, and site 10 was significantly reduced compared to wild type cells. In contrast, siRNAs for Site 1, Site 6, Site 7, Site 8, and Site 9 showed relatively low inhibitory activity.
  • siRNAs targeting the 20-280 nt region of the target gene and the region near the 3 'end were considerably more efficient than the others when tested.
  • the H-ras gene was selected as a target.
  • the H-ras gene is a member of a ras gene family that also includes K-ras and N-ras (Adjei, AA (2001). Blocking oncogenic Ras signaling for cancer therapy. J. Natl. Cancer Inst., 93, 1062-1074.).
  • the following 10 target sites (sites 1 to 10) in the H-ras gene were selected (FIGS. 9A and 9B) to confirm the target site dependency of siRNA (FIGS. 9A and 9B).
  • Site 2 5'-GTT GGC GCC GGC GGT GTG G-3 '/ SEQ ID NO: 21;
  • Site 3 5'-TAC GAC CCC ACT ATA GAG G -3 '/ SEQ ID NO: 22
  • diced-siRNA To construct diced-siRNA, we first searched for a region of the H-ras gene that had low homology with other ras family members. A region corresponding to the 3 'region of the H-ras gene (300 to 500 nt) was selected as a long dsRNA substrate and treated with recombinant hDicer. A diced-siRNA targeting the H-ras gene was produced in the same manner as in Example 6. Each siRNA (20 nM) was introduced into HeLa cells using 01 igoiectamin® reagent (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions. After 36 hours, HeLa cells transfected with each siRNA were collected and total protein was extracted from each cell.
  • 01 igoiectamin® reagent Invitrogen
  • H-Ras protein The level of H-Ras protein was detected by ⁇ stan blotting using an H-ras specific antibody. Actin was used as an internal control. Specifically, H-Ras protein was fractionated by SDS-PAGE (10% polyacrylamide), and then transferred to a PVDF membrane (Funakoshi, Tokyo, Japan) by electroblotting.
  • diced-siRNA-treated cells were unchanged compared to wild-type HeLa cells (FIG. 9D). Therefore, diced-siRNA did not affect the expression of the K-ras gene or the N-ras gene.
  • Example 9 Effect of diced-siRNA targeting c-jun mRNA or c-fos mRNA Furthermore, in order to confirm the effect of diced-siRNA, the present inventors investigated the effects of c-jun mRNA or c-fos mRNA, respectively.
  • a diced-siRNA against was constructed. First, a long dsRNA corresponding to the 5 'region of the c-jun gene (1-200 nt) or the c_fos gene (1-200 nt) was prepared, and then treated with recombinant hDicer. The diced-siRNA was prepared using the same method as in Example 6. Next, these diced-siRNAs were introduced into HeLa cells. After 36 hours, the cells were harvested and total protein was extracted from each cell. The level of c-Jun or c-Fos protein was detected using pastelotting with each specific antibody.
  • diced-s iRNA may be extremely useful for silencing specific genes in human cells.
  • shRNA a shRNA based on the tRNA Val promoter.
  • tRNAi shRNA that are based on human U6 promoter one (hU6i), and mouse U6 flop port mode evening - Vectors were constructed for the three types of tRNA-shRNA expression in based shRNA (mU 6i).
  • the present inventors have found that five target sites within erbB2 mRNA (site 1: site 5: -AAG UGU GCA CCG GCA CAG ACA UGA AGC UG-3 'SEQ ID NO: 31; site 2: 5; -ACC CAC CUG GAC AUG CUC CGC CAC CUC UA-3 '/ SEQ ID NO: 32, site 3: 5'-UGC UCA UCG CUC ACA ACC AAG UGA GGC AG-3' / SEQ ID NO: 33, site 4: 5, -AAG AUG CGG AAG UAC ACG AUG CGG AGA CU-3 '/ SEQ ID NO: 34, site 5: 5, -GAC ACA GCU UAU GCC CUA UGG CUG CCU CU-3' Z SEQ ID NO: 35), and within GFP mRNA
  • site 5, -GGC AAG CUG ACC CUG AAG UUC ATC TGC AC-3 '/ SEQ ID NO: 36 was selected (FIG.
  • MCF-7 human breast cancer cells were cultured in MEM (ICN Biomedicals (ICN) supplemented with 10% FBS, 1% non-essential amino acid solution, and ImM sodium pyruvate.
  • MEM ICN Biomedicals (ICN) supplemented with 10% FBS, 1% non-essential amino acid solution, and ImM sodium pyruvate.
  • MCF-7 cells are grown to about 5 ⁇ 10 6 cells / 10 cm dish, then
  • transformed MCF-7 cells stably expressing tRNA-shRNA or U6_shRNA were selected.
  • cytoplasmic fraction Cells were harvested 36 hours after transfection. To prepare the cytoplasmic fraction, the collected cells were washed twice with PBS, then digitonin lysis buffer (50 mM HEPES / K0H (pH 7.5) 50 mM potassium acetate, 8 mM MgCl2, 2 mM EGTA, and 50 mM (M / ml digitonin) on ice for 10 minutes. The lysate was centrifuged at 1,000 ⁇ g and the supernatant was collected as the cytoplasmic fraction.
  • digitonin lysis buffer 50 mM HEPES / K0H (pH 7.5) 50 mM potassium acetate, 8 mM MgCl2, 2 mM EGTA, and 50 mM (M / ml digitonin)
  • the pellet was resuspended in NP-40 lysis buffer (20 niM Tris-HCl (pH 7.5), 50 mM KC1, 10 mM NaCK ImM EDTA, and 0.5% NP-40) and kept on ice for 10 minutes. . The resulting lysate was used as a nuclear fraction.
  • RNA and nuclear RNA were extracted, and the cytoplasmic fraction and nuclear fraction were purified using IS0GEN TM reagent (Wako Pure Chemical Industries (Wako), Osaka, Japan), respectively. 30 micrograms of total RNA per lane was loaded on a 12% polyacrylamide gel for electrophoresis, after which the RNA bands were transferred to a Hybond-N (trademark) nylon membrane (Amersham Co., Buckinghamshire, UK).
  • the membrane was probed with a synthetic oligonucleotide (5'-AAG TGT GCA CCG GCA CAG ACA TGA AGC TG-3'Z SEQ ID NO: 37) complementary to a sequence within the erbB2 gene.
  • a synthetic oligonucleotide (5'-AAG TGT GCA CCG GCA CAG ACA TGA AGC TG-3'Z SEQ ID NO: 37) complementary to a sequence within the erbB2 gene.
  • Each synthetic probe is compatible with the AlkPhos Direct Labeling and Detection system.
  • the precursor shRNA and the processed siRNA were detected in the cytoplasm of the tRNA-shRNA-expressing cells (lane 2).
  • precursor shRNA and small amounts of siRNA were detected in the nuclei of cells expressing hU6-shRNA or mU6-shRNA (lanes 3 and 5), but not in the cytoplasm (lanes 4 and 6).
  • Example 14 Construction of a tetracycline-dependent induction system for regulating expression of tRNA-shRNA
  • 7 copies of the tetracycline operator sequence (5, -TTT ACC ACT CCC TAT CAG TGA TAG AGA AAA GTG AAA GTC GAG-3'Z SEQ ID NO: 38) were replaced with pPUR-tRNA-
  • the shRNA was inserted downstream of the tRNA promoter.
  • pTet-Tts (Clontech) encoding the tetracycline ribosomal gene is replaced with pcDNA3.
  • Neo Invitrogen encoding the neomycin resistance gene. (CA, USA) into MCF-7 cells.
  • the MCF-7-TR cell line was obtained by selection with neomycin.
  • doxycycline Clontech
  • the present inventors produced transgenic mice expressing tRNA-shRNA and examined whether the tRNA-shRNA of the present invention could function in mice.
  • Green fluorescent protein (GFP) (Okabe M ,, Ikawa. Kominami K. Nakanishi T., & Nishiwake e Y. 'Green mice' as a source of ubiquitous green eel Is.FEBS Lett., 407, 313-319 (1997 ).) was used as a target for tRNA-shRNA (tRNAi-E126), J6-shRNA (hU6-E126), and mU6-shRNA 0nU6_E126.
  • green fluorescence was detected by irradiation with ultraviolet light (254 nm).
  • tRNA-shRNA transgenic mice were irradiated with ultraviolet light (254 nm). Take a picture using a digital card camera (DS-505; Fuji X, Japan) did.
  • tRNAi_E126 induces sequence-specific gene silencing not only in 8-cell morulae and blastocysts but also in newborn mice.
  • the present inventors considered the potential usefulness of tRNAi and attempted to develop an RNAi inducible expression system with the goal of analyzing the function of housekeeping genes in the future. Specifically, the present inventors attempted to control tRNAi expression using Tet07 attached to the tRNA Val promoter (FIGS. 14 and 15). The Tet07 system functions as an "on / off" switch for gene expression.
  • the present inventors have proposed a vector in which Tet07 is attached to a tRNA Val promoter, and a stable MCF-7 cell line (MCF-cell) expressing a tetracycline-responsive repressor (tTS; Clontech (C1ontech)). 7-TR).
  • MCF-7 cell stable MCF-7 cell line
  • tTS tetracycline-responsive repressor
  • 7-TR 7-TR.
  • Dox doxycycline
  • FIG. 14B expression of tRNAi-ErbB2 was negligible in MCF-7-TR cells in the absence of Dox (lane 3).
  • significant levels of precursor shRNA and siRNA were detected in cells in the presence of Dox (lane 4). From these results, it was found that the tetracycline induction system of the present invention can regulate the expression of tRNAi-ErbB2.
  • tRNAi-ErbB2 Were expressed for 72 hours with various concentrations of Dox, and then transcript levels were analyzed by RT-PCR. Induction of tRNAi-ErbB2 was detected by a slight Dox of lng / ml in the medium. As Dox concentration increased, transcript levels increased rapidly and were fully activated at 100 ng / ml. This dose was equal to 80% of the Dox activation level in the Tet07-free system. Furthermore, there was no apparent change in the growth behavior and morphology of the cultured cells at this saturating concentration of Dox.
  • the present inventors have constructed a tRNA-based RNAi expression system in which tRNA-shRNA is localized in the cytoplasm.
  • S. bomb TCP1 strain Invitrogen, CA, USA
  • S. cerepiche EGY48 strain Invitrogen, CA, USA
  • the ydcr l- and yrdpl- deletion strains were created by homologous recombination of the ura4 gene. These deletion strains were confirmed by RT-PCR analysis using specific primers of the ydcr1, yrdpK and ura4 genes, respectively.
  • S. bomb expressing the LacZ gene was prepared using a pNMT-LacZ vector containing the LacZ gene and the nmt promoter.
  • S. cerepiche expressing the LacZ gene introduced the pYes2-LacZ plasmid (Invitrogen) into the cells.
  • yeast strains are yeast extract / peptone / dextro Were grown in medium (YPD).
  • YPD medium
  • a ⁇ - ⁇ cloning kit (Invitrogen) containing the nmt promoter was used.
  • LEU2 nt. 300
  • LacZ site A (nt. 1-300): site B [nt. 1000-1300); site C (nt. 2000-2300)] Encoding sense strand DNA, specific up primer
  • PCNA 5'-ACA ACG GTA TCT CTC TGC AGG CTA-3'Z SEQ ID NO: 40); LacZ- site ⁇ (5'-ATG ATA GAT CCC GTC GTT TTA CAA-3 'Z SEQ ID NO: 4 1); LacZ-site B (5, -GAA AAT GGT CTG CTG CTG CTG AAC-3 '/ SEQ ID NO: 42); LacZ-site C (5, -ATG TCG CTC CAC AAG GTA AAC AGT-3 'Z SEQ ID NO: 43)], and a down primer having an Xhol site [LEU2 (5'-GAT TTT TAG TAA ACC TTG TTC AGG-3, Z SEQ ID NO: 44); PCNA (5'-one TCG ATA TCT) GGT ATA CCC AAG TGT-3, Z sequence number: 45); LacZ-site ⁇ (5'-GGT TAC GTT GGT GTA GAT GGG CGC-3 '/ SEQ ID NO: 46); LacZ-
  • the PCR product was cloned into pNMT TOPO.
  • the antisense strand DNA was replaced with an up-primer having an Xhol site [LEU2 (5′-GAT TTT TAG TAA ACC TTG TTC AGG-3′Z SEQ ID NO: 44); PCNA (5′-TCG ATA TCT GGT ATA CCC AAG TGT-3, Z SEQ ID NO: 45); LacZ-site ⁇ (5'-GGT TAC GTT GGT GTA GAT GGG CGC-3 '/ SEQ ID NO: 46); LacZ-site ⁇ (5'-CGC TCA TCG CCG GTA GCC AGC GCG-3'Z SEQ ID NO: 47); LacZ-site C (5'-CCA ATC CAC ATC TGT GAA AGA AAG-3'Z SEQ ID NO: 48)], and a down primer having a Sail site [ LEU2 (5 '-ATG TCT GCC CCT ATG TCT GCC CCT-3' Z SEQ ID NO:
  • LacZ-site ⁇ (5′-ATG ATA GAT CCC GTC GTT TTA CM-3 ′ Z SEQ ID NO: 4
  • LacZ-site B (5, -GAA AAT GGT CTG CTG CTG CTG AAC-3, SEQ ID NO: 4
  • LacZ-site C (5, -ATG TCG CTC CAC AAG GTA AAC AGT-3'Z SEQ ID NO: 4
  • LacZ ⁇ position A (nt. 1-300) for S. cerepiche; site B [nt. 1000-1300); site
  • LacZ-site ⁇ (5'-CG CTC ATC GCC GGT AGC CAG CGC G-3 'Z SEQ ID NO: 4
  • LacZ-site C (5, -CC AAT CCA CAT CTG TGA AAG AAA G / SEQ ID NO: 48)] and down primer having Xhol site [LacZ-site ⁇ (5'-ATG ATA GAT CCC GTC GTT TTA CAA-3 '/ SEQ ID NO: 4 1); LacZ-site ⁇ (5'-GAA AAT GGT CTG CTG CTG AAC-3' / SEQ ID NO: 42); LacZ-site C (5, -ATG Amplified by PCR using TCG CTC CAC AAG GTA AAC AGT-3 '/ SEQ ID NO: 43)]. These amplified DNAs were then digested with Notl and Xhol. The fragment was cloned into the Notl-Xhol site of pYes3CT containing the sense strand gene.
  • the present inventors confirmed the expression of precursor dsRNA in S. bomb cells and S. cerevisiae cells and the processing of these dsRNA by Northern blot analysis using each dsRNA-specific probe.
  • Example 21 Effect of dsRNA-induced RNAi on exogenous LacZ gene expression in S. bomb and S. cerepiche
  • dsRNA expression vector pSCi-LacZ
  • dsRNA expression plasmids were introduced into S. cerevisiae cells expressing the LacZ gene.
  • the / 3 galactosidase activity of each cell extract was determined using the Yeast3-Galactosidase Reporter Assay Kit (Pierce, Rockford, IL, USA). It was measured according to the protocol. Values are the mean and SD of three replicates in each case.
  • Example 22 Effect of dsRNA-induced RNAi on exogenous LEU2 gene expression in S. bomb
  • the dsRNA expression plasmid (pSPi-LEU2) targeted to LEU2 mRNA and the dsRNA expression plasmid (pSPi-LacZ) targeted to LacZ mRNA were each introduced into S. bomb cells.
  • wild-type (WT) cells expressing the LEU2 gene grew normally in LeiT medium.
  • dsRNA-LEU2-expressing cells did not grow in this medium.
  • dsRNA-LEU2 did not induce gene silencing, and as a result, these cells also grew in Leu-medium. Furthermore, LEU2 mRNA levels in dsRNA-LEU2-expressing cells were significantly reduced as compared to WT cells (data not shown). Thus, exogenous dsRNA was able to induce RNAi-mediated gene silencing in S. bomb cells, indicating that yDcrl was required for dsRNA-mediated gene silencing. [Example 23] Effect of dsRNA-induced RNAi on expression of endogenous PCNA gene in S. bomb
  • a dsRNA expression plasmid targeted to PCNA mRNA was introduced into S. bomb cells. did.
  • the present inventors analyzed PCNA protein levels and Radl7 protein levels as endogenous controls, respectively, using mouse PCNA monoclonal antibodies (Waseem, NH, & Lane, DP, Monoclonal antibody analysis of the proliferating cell nuclear antigen (PCNA): Structural conservation and the detection of a nucleolar form. J. Cell Sci. 96 121-129 (1990).) And mouse Radl7 monoclonal antibody (Li, L., Peterson,
  • CA Kanter-Smoler, G., Wei, YF, Ramagli, LS, Sunnerhagen, P., Siciliano, MJ, & Legerski, RJ hRAD17, a structural homolog of the Schizosaccharomyces pombe RAD 17 cell cycle checkpoint gene, stimulates p53 accumulation Oncogene 18, 1689-1699 (1999).).
  • cell extracts were prepared from each transformant using Y-PER yeast protein extraction reagent (Pierce) according to the manufacturer's protocol. Proteins were separated by SDS-PAGE (10% polyacrylamide) and described elsewhere (Kawasaki, H., Eckner, R., Yao, ⁇ . P., Taira, ⁇ , u., Chiu, R., Livingston ,
  • PCNA proliferating cell nuclear antigen
  • siRNA-Zeor targeted to the Zeocin TM resistance (Zeo 1 ") gene.
  • Zeocin-directed siRNA (sense strand: 5, -CUG CGU GCA CUU CGU GGC CGA-3 '/ SEQ ID NO: 49; antisense strand: 5, -GGC CAC GAA GUG CAC GCA GUU-3' / SEQ ID NO: 50) was synthesized by Japan Bio Service (JBioS) Co Ltd. These RNAs were prepared using standard methods (Elbashir, SM, Lendeckel, W., & Tuschl, T., RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs. Genes & Dev., 15, 188-200 (2001).).
  • the Frozen-EZ Yeast Transformation II kit (Zymo Research, In CA, USA) was used to transfect 5-20 nM zeocin-directed siRNA into S. bomb cells containing zeocin according to the manufacturer's protocol. did.
  • the present inventors selected a strain expressing the zeocin resistance gene in a YPD medium containing 50 g / ml zeocin (Invitrogen) and examined the growth of siRNA-zeor-treated cells. As shown in FIG. 19A, WT cells expressing the Zeo gene grew in a medium containing Zeocin. However, proliferation levels of cells treated with siRNA-Zeo f (20 nM) were significantly reduced as compared to WT cells expressing the Zeof gene.
  • the present inventors synthesized 5′-biotin-conjugated siRNA targeted to the Zeof gene.
  • 5 'Piotin-labeled zeocin resistance gene Zeo-siRNA Synthesized by this bioservice. These RNAs were prepared by standard methods (Fire A., Xu S., Montgomery, MK, Kostas, SA, Driver, SE, & Mello, CC, Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans., Nature, 391, 806-811 (1998).). The 5 'biotin-labeled Zec ⁇ -siRNA was transfected into S.
  • RT-PCR analysis was performed using RNA PCR Kit ver.2 (TaKaRa, Kyoto, Japan), and Zeo r upstream primer (5'-GGC CAC GAA GTG CAC GCA GTT-3 '/ SEQ ID NO: 51) and below Flow primer (5'-CAC CCT GGC CTG GGT GTG GGT-3 'SEQ ID NO: 52) or Rad upstream primer (5'-TCT GGT TGT GGA AAG AGT ACC GCA-3' Z SEQ ID NO: 53) as a control and The extended antisense strand RNA was amplified using a downstream primer (5′-CCT CTT TAC GTA GAA TAG AGC CAA G-3 ′ / SEQ ID NO: 54). The PCR products were analyzed by electrophoresis on a 2% agarose gel.
  • a DNA encoding a stem-loop RNA having an RNAi effect, and a vector containing the DNA are provided.
  • the present invention is a powerful tool for studying the mechanism of RNAi and other gene functions in mammalian cells, and is expected to have great potential for therapeutic use.

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Description

RNAi効果を有するステムループ形 RNA分子発現システム 技術分野
本発明は、 標的遺伝子の発現を抑制し得る RNA分子発現システムおよび、 これ を用いたノックダウン細胞の生産方法等に関する。 背景技術
RNA干渉 （RNA interference, 以下 「RNAi」 と略称する） は、 標的遺伝子の mRNAと相同な配列からなるセンス RNAとこれと相補的な配列からなるァンチセ ンス RNAとからなる二本鎖 RNA (以下、 「dsRNA」 と略称する） を細胞等に導入 することにより、 標的遺伝子 mRNAの破壌を誘導し、 標的遺伝子の発現を抑制し 得る現象である。 このように RNAi は、 標的遺伝子の発現を抑制し得ることから、 従来の煩雑で効率の低い相同組換えによる遺伝子破壊方法に代わる簡易な遺伝子 ノックアウト方法として、 または、 遺伝子治療への応用可能な方法として注目を 集めている。 上記 RNAiは、 当初、 線虫において発見されたが （Fire, A. et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391, 806-811, (1998)) 、 現在では、 線虫の みならず、 植物、 線形動物、 ショウジヨウバエ、 原生動物などの種々の生物にお いて観察されている （Fire, A. RNA-triggered gene silencing. Trends Genet. 15, 358-363 (1999)； Sharp, P. A. RNA interference 2001. Genes Dev. 15, 485-490 (2001)； Sharp, P. A. RNA interference 2001. Genes Dev. 15, 485- 490 (2001)； Hammond, S. M. , Caudy, A. A. & Harmon, G. J. Post- transcriptional gene silencing by double - stranded RNA. Nature Rev. Genet. 2， 110-119 (2001)； Zamore, P. D. RNA interference: listening to the sound of silence. Nat Struct Biol. 8, 746-750 (2001)) 。 これら生物では、 実際に外来より dsRNAを導入することにより標的遺伝子の発現が抑制されること が確認され、 さらにはノックァゥト個体を創生する方法としても利用されつつあ る。
インビト口において、 dsRNAは、 ショウジヨウバエの初期胚の溶解物または培 養ショウジヨウバエ S2細胞の抽出物における切断に関して mRNAを標的とするこ とが知られている (Tuschl T. , et al., Genes Dev. 13: 3191-3197, 1999; Ha匪 ond S. M.， et al. , Nature 404: 293-296, 2000; Zamore P. , et al. , Cell 101: 25-33， 2000) 。 インビトロでの RNAiの反応は ATP (Hammond S. M. , et al., Nature 404: 293-296, 2000; Zamore P., et al., Cell 101: 25-33,
2000) を必要とする。
合成 RNA二本鎖による最近の研究により、 それぞれの siRNA二本鎖が標的 RNA を切断することが証明された （Elbashir S. M. et al., Genes Dev. 15: 188- 200, 2001) 。 siRNA二本鎖内の 2ヌクレオチドまたは 3ヌクレオチドの突出 3' 末端が、 効率的な標的切断にとって必要であることが明らかになった （Elbashir S. M. et al., Genes Dev. 15: 188-200, 2001) 。 そのような 3'突出末端は、 RNァーゼ III切断反応の産物に特徴的であり、 培養ショウジヨウバエ S2細胞に おいて、 dsRNAの siRNAへの切断は、 ダイサ一として知られる多数のドメイン RN ァーゼ III酵素を必要とする (Bernstein E. et al., Nature 409: 363-366,
2001) 。 その後、 siRNAは、 ショウジヨウバエにおいて同定され、 RISCと呼ばれ る多成分ヌクレアーゼと会合し、 mRNAの配列特異的分解に関してこの酵素を誘 導するものと考えられる （Hammond S. M. , et al., Nature 404: 293-296, 2000; Bernstein E. et al., Nature 409: 363-366, 2001; Hammond S. M. et al., Science 293: 1146-1150, 2001) 。
RNAiは標的遺伝子を不活化する方法を提供し、 このように、 エレガンス (C. elegans) 、 ショウジヨウバエおよび植物における遺伝子機能を研究するた めの強力なツールを提供する。 遺伝子発現の特異的阻害はまた、 動物および植物 における dsRNAの安定な発現および誘導型発現によって得ることができる
(Hammond, S. M. , Caudy, A. A. & Hannon, G. J. Post- transcriptional gene silencing by double-stranded RNA. Nature Rev. Genet. 2, 110-119 (2001)； Kennerdell and Carthew Nature Biotechnol. 18: 896-898, 2000;
Tavernarakis N. et al. , Nature Genetics 24: 180-183, 2000) 。 マウス胚癌 EC細胞および胚幹 （ES) 細胞では、 dsRNAによる遺伝子の不活化は成功したが
(Billy E. et al., PNAS 98: 14428-14433, 2001; Paddison P. J. et al.， PNAS 99: 1443-1448, 2002) 、 培養哺乳類細胞における長い dsRNAによる RNAi の誘発は一般的にあまり成功していない。 これらの失敗は、 長い dsRNA (〉30塩 基対） （Stark G. R. et al., Annu. Rev. Biochem. 67: 227-264, 1998) によ つて活性化されるインタ一フエロン （IFN) 防御経路の一部を形成する 2つの潜 在型酵素の作用によって、 容易に説明される。 その一つは、 2'- 5'-オリゴァデニ レート （2- 5A) シンターゼであり、 これは dsRNAによって活性化されて、 RNァ ーゼ Lと呼ばれる配列非特異的 RNァーゼの活性化にとって必要である 2- 5Aの合 成 増カロさせる (Silverman R. H. in Ribonucleases： Structures and
Functions, eds. D Alessio, G. and Riordan J. F. (Academic, New York) DP.515-551) 。 もう一つは、 蛋白質キナーゼ PKRであり、 その活性型は翻訳因子 真核細胞開始因子 （eIF2) をリン酸化して、 蛋白質合成の全般的な阻害と細胞死 に至る （Clemens M. J. and Elia A., J. Interferon Cytokine Res. 17: 503- 524, 1997) 。
最近、 21ヌクレオチドの siRNA二本鎖がいくつかの哺乳類細胞において内因 性遺伝子の発現を特異的に抑制することが報告された （Elbashir S. M. et al., Nature 411: 494-498, 2001) 。 この場合、 21ヌクレオチド siRNA二本鎖は、 IFN防御システムから逃れることができる。 この知見は、 RNAiまたは RNAi関連 システムが哺乳類に存在することを示唆した。 実際に、 rde-l、 mut- 7およびダ ィサ一のような RNAi関連蛋白質の哺乳類相同体がいくつか同定されている
(Berns tein E. e t al . , Nature 409 : 363-366, 2001 ; Tabara H. et al .， Ce l l 99 : 123-132, 1999 ; Ket t ing R. F. et al . , Ce l l 99 : 133-141 , 1999) 。 しか し、 哺乳類体細胞における RNAiの特徴およびメカニズムはあまり詳しくは分か つていない。
また、 RNAiを利用して遺伝子発現抑制による機能解析や遺伝子治療を行うこ とが期待されている。 遺伝子の一次配列がほぼ明らかにされた現在、 遺伝子の機 能を迅速に解明するために、 系統的かつ効率的な機能遺伝子探索方法の開発が進 められている。 RNAiを利用して任意の遺伝子の発現を抑制し、 その細胞あるい は個体の表現型の変化から系統的に機能遺伝子の探索を行うことができれば、 新 規な機能遺伝子の解明をより一層加速させることができる。 発明の開示
本発明は、 このような状況に鑑みてなされたものであり、 その目的は、 標的遺 伝子の発現を抑制し得る新規な RNA分子発現システム、 および該システムを用い たノックダウン細胞の作製方法を提供することにある。
本発明者らは、 上記課題を解決するために鋭意研究を行った。 本発明者らは、 哺乳類細胞において RNAi効果が生じる細胞中の部位を検討した。 まず、 tRNAVal または U6プロモーターによって制御される 2種類の dsRNA発現べクタ一を構築 した （それぞれ、 「iRNA - dsRNAj 、 「U6 - dsRNA」 ) 。 tRNAValプロモータ一から の転写産物は、 核から細胞質へ効率的に移行するのに対し、 U6プロモーターか らの転写産物は、 核内に留まることが知られている。
実験の結果、 tRNA-dsRNAの転写物は細胞質に存在し、 リポヌクレア一ゼ I I I 複合体によって効率よく処理された。 さらに、 変異体 k- ras指向 tRNA- dsRNAは、 ターゲッティングされた mRNA をインビトロおよびインビボで効率よく切断した。 即ち、 RNAi効果が生じたことが示された。 対照的に、 U6-dsRNAは、 HeLa細胞に おいて正常な k-rasの発現に影響を及ぼさなかった。 従って、 これらの結果は、 哺乳類細胞において RNAiが細胞質において起こることを示すものである。 さら に本発明者らは、 酵母においても RNAi効果によって効率的に遺伝子の発現を抑 制できることを見出した。
また上記実験に使用した dsRNAは、 細胞においてステムループ構造を形成する ものと考えられた。 従って、 上記実験結果は、 ステムループ構造を有する RNA分 子 （ステムループ形 RM分子） が、 細胞質へ移行することにより、 RMi効果を もたらすことを示すものでもある。
また、 ステムループ構造を形成する RNA分子は、 1つの産物として DNAから転 写させることが可能である特長を有する。
さらに、 U6プロモーターで発現されたステムループ形 RNA分子は、 通常核に 局在するが、 本発明者らによるマイクロ RNAのループ配列を含むステムループ形 分子は、 細胞質へと輸送され、 効率良く RNAi効果を示した。 しかし、 マイクロ RNAの細胞質への輸送は細胞の維持に必須であり、 マイクロ RNAのループ配列を 含む U6-ステムループ形 RNA分子は、 ドミナントネガティブに働き、 細胞毒性を 示す可能性もある。 そこで、 本発明者らが開発した tRNAプロモーターで発現さ れたステムループ形 RNA分子は、 マイクロ RNAの輸送システムを使用せずに、 細 胞質へと輸送されるため、 細胞毒性が無いと考えられる。
上記の如く本発明者らは、 ステムループ形 RNA分子をコードする DNAから、 tRNAプロモー夕一を利用して該 RNA分子を産生させることにより、 該 RNA分子 を効率的に細胞質へ移行させ、 RNAi効果を発揮させることに成功し、 本発明を 完成させた。
また本発明者らは、 上記の RNA分子が細胞質へ移行することにより RNAi効果 をもたらすという本発明者らによって今回見出された知見に基づいて、 以下の実 験を行った。 即ち、 組換えヒト Di cer (hDi cer)を作製し、 この組換え hDicerを 用いて、 長鎖 dsRNAをプロセシングすることにより 20〜25ntの s iRNAを生成さ せ、 この s iRNAを直接細胞質へ導入し、 RNAi効果の検討を行った。 その結果、 長鎖 dsRNAを基質として上記 hDi cerで処理された s iRNA(di ced-s iRNA)は、 細胞 質へ直接導入することにより、 効率的な標的遺伝子の抑制効果が見られた。 組換 え hDi cerで処理された RNAを直接細胞へ導入することにより RNAi効果を発揮さ せることは、 本発明者らによって初めて達成されたことである。 また、 s iRNAを 生成し得る活性を持つ hDi cerについての組換えタンパク質の製造も、 本発明者 らによって初めて成し遂げられたことである。
本発明者らによって開発されたステムループ形 RNA分子発現システムを用いる ことにより、 簡便に所望の遺伝子がノックアウトした細胞を作製することが可能 である。 また本発明は、 哺乳類細胞における RNAiのメカニズムおよび他の遺伝 子機能を研究するための強力なツールとなり、 さらには、 治療用途として潜在的 有用性を持つものと大いに期待される。
本発明は、 標的遺伝子の発現を抑制し得る新規 RM分子発現システム、 および 該システムを用いたノックダウン細胞の作製方法に関し、 より具体的には、
〔1〕 細胞内で RNAi効果を有するステムループ形 RNA分子をコードする DNAと細胞質移行シグナル配列を有する DNAであって、 標的遺伝子 mRNAのいず れかの領域のセンス RNAをコードするセンスコード DNAと、 該 DNAと相補的な配 列とを、 スぺ一サー領域を挟んで対向するように連結させ、 これをプロモー夕一 と機能的に接続させた構造を特徴とする腿、
〔 2〕 前記スぺーサ一領域中に細胞質移行シグナル配列を有する、 〔 1〕 に記載の DNA、
〔3〕 プロモーターが、 tRNAプロモータ一、 pol I I系プロモ一夕一、 ol I I I系プロモーター、 またはテトラサイクリン誘導型プロモー夕一である、 〔1〕 または 〔2〕 に記載の DNA、
〔4〕 テトラサイクリン誘導型プロモーターがテトラサイクリン誘導型 tRNAプロモーターである 〔3〕 に記載の DNA、 〔5〕 プロモー夕一が、 NMT1プロモータ一または GAL1プロモー夕一であ る 〔1〕 または 〔2〕 に記載の DNA、
〔6〕 細胞内で RNAi効果を有するステムループ形 RNA分子をコードする DNAであって、 標的遺伝子 mRMのいずれかの領域のセンス RNAをコ一ドするセ ンスコード DNAと、 該 DNAと相補的な配列とを、 スぺーサ一領域を挟んで対向す るように連結させ、 これを tRNAプロモーターと機能的に接続させた構造を特徴 とする DNA、
〔7〕 tRNAプロモータ一が tRNA™プロモーターである、 〔3〕 、 〔4〕 または 〔6〕 に記載の DNA、
〔8〕 センスコード DNAの長さが 10〜35bpである、 〔1〕 〜 〔4〕 、 〔6〕 または 〔7〕 のいずれかに記載の DNA、
〔9〕 センスコード DNAの長さが 26〜30bpである、 〔1〕 〜 〔4〕 、 [ 6 3 または 〔7〕 のいずれかに記載の DNA、
〔1 0〕 センスコード DNAの長さが 31〜35bpである、 〔1〕 〜 〔4〕 、 〔6〕 または 〔7〕 のいずれかに記載の DNA、
〔1 1〕 センスコード DNAの長さが 10〜5000bpである、 〔5〕 に記載の
DNA、
〔1 2〕 スぺーサー領域の長さが 1〜10000ベースである 〔1〕 〜 〔1 1〕 のいずれかに記載の DNA、
〔1 3〕 スぺーサ一領域の長さが 1〜100ベースである 〔1〕 〜 〔1 1〕 のいずれかに記載の DNA、
〔1 4〕 発現するステムループ形 RNA分子のステム領域の長さが 10〜 35bpである、 〔1〕 〜 〔4〕 、 〔6〕 〜 〔1 0〕 、 〔1 2〕 または 〔1 3〕 の いずれかに記載の DNA、
〔1 5〕 発現するステムループ形 RNA分子のステム領域の長さが 26〜 30bpである、 〔1〕 〜 〔4〕 、 〔6〕 〜 〔： L 0〕 、 〔1 2〕 または 〔1 3〕 の いずれかに記載の DNA、
〔1 6〕 発現するステムループ形 RNA分子のステム領域の長さが 31〜 35bpである、 〔1〕 〜 〔4〕 、 〔6〕 〜 〔1 0〕 、 〔1 2〕 または 〔1 3〕 の いずれかに記載の DNA、
〔1 7〕 発現するステムループ形 RNA分子のステム領域中にミスマッチま たはバルジを含むように構築されたものである、 〔1〕 〜 〔1 6〕 のいずれかに 記載の DNA、
〔1 8〕 センス鎖に 20塩基対あたり 1〜6塩基の6 ' 1]ぺァを組むょぅな ミスマッチを含むように構築されたものである、 〔1 7〕 に記載の DNA、
〔1 9〕 発現するステムループ形 RNA分子のステム領域中に 20塩基対あ たり 1〜 10塩基のミスマッチまたはバルジを含むように構築されたものである、 〔1〕 〜 〔1 8〕 のいずれかに記載の DNA、
〔2 0〕 ミスマッチがセンス鎖に 20塩基対あたり 1〜6塩基の6 ' 1]ぺァ を組むようなミスマッチである、 〔1 9〕 に記載の DNA、
〔2 1〕 発現するステムループ形 RNA分子のステム領域中に 300塩基対あ たり 1〜100 塩基のミスマッチまたはバルジを含むように構築されたものである、 〔5〕 または 〔1 1〕 に記載の DNA、
〔2 2〕 細胞が哺乳動物細胞もしくは酵母細胞である、 〔 1〕 〜 〔2 1〕 のいずれかに記載の DNA、
〔2 3〕 〔1〕 〜 〔2 2〕 のいずれかに記載の DNAの転写産物である、 細 胞内で RNAi効果を有するステムループ形 RNA分子、
〔2 4〕 〔1〕 〜 〔2 2〕 のいずれかに記載の DNAを含むベクター、
〔2 5〕 〔1〕 〜 〔2 2〕 のいずれかに記載の DNA、 または 〔2 4〕 に記 載のベクターを保持する細胞、
〔2 6〕 細胞が哺乳動物細胞もしくは酵母細胞である、 〔2 5〕 に記載の 細胞、 〔2 7〕 〔1〕 〜 〔2 2〕 のいずれかに記載の DNA、 または 〔2 4〕 に記 載のベクターを含む組成物、
〔2 8〕 標的遺伝子の発現が抑制された細胞を生産する方法であって、 〔1〕 〜 〔2 2〕 のいずれかに記載の DNA、 または 〔2 4〕 に記載のベクタ一を 細胞に導入する工程、 および前記 DNAもしくはベクタ一が導入された細胞を選択 する工程、 を含む生産方法、
〔2 9〕 細胞内でステムループ形ランダム RNA分子をコードする DNAであ つて、 ランダムな配列からなる RNAをコードする DNAと、 該 DNAと相補的な配列 とを、 スぺーサー領域を挟んで対向するように連結させ、 これを tRNAプロモー 夕一と機能的に接続させた構造を有する DNAを含むベクター、
〔3 0〕 〔1〕 〜 〔2 2〕 のいずれかに記載の DNA、 または 〔2 4〕 もし くは 〔2 9〕 に記載のベクターを保持した生物個体、
〔3 1〕 標的遺伝子ノックアウト非ヒト動物である、 〔3 0〕 に記載の生 物個体、
〔3 2〕 生物がマウス、 ラット、 ゥサギ、 ゥシ、 ゥマ、 ブ夕、 ヒッジ、 サ ル、 およびチンパンジーからなる群より選択される、 〔3 0〕 または 〔3 1〕 に 記載の生物個体、
〔3 3〕 発現するステムループ形ランダム RNA分子のステム領域の長さが 10〜35bpである、 〔2 9〕 に記載のベクター、
〔3 4〕 以下の工程 （a ) 〜 （c ) を含む、 機能遺伝子探索方法、
( a ) 〔2 9〕 または 〔3 3〕 に記載のベクターを細胞へ導入する工程
( b ) 前記ベクターが導入された細胞を選択する工程
( c ) 選択された細胞の表現型を解析する工程
〔3 5〕 表現型解析により表現型が変化していた細胞中のベクタ一配列中 のランダムな配列に基づいて機能遺伝子をスクリーニングする工程をさらに含む、 〔3 4〕 に記載の機能遺伝子探索方法、 〔36〕 （a) 細胞内で RNAi効果を有するステムループ形 RNA分子をコ 一ドする DNAであって、 標的遺伝子 mRMのいずれかの領域のセンス RNAをコ一 ドするセンスコード DNAと、 該 DNAと相補的な配列とを、 スぺ一サー領域を挟ん で対向するように連結させ、 これをプロモーターと機能的に接続させた構造を特 徴とする DNAと、
(b) Dicerタンパク質における Dicer活性を有するポリペプチド領域をコード する DNAとプロモ一ターとを機能的に接続させた構造を特徴とする DNA、 とを含 む siRNA発現システム、
〔37〕 （a) に記載のプロモーターが tRNA プロモーターまたは Pol III系プロモー夕一である、 〔36〕 に記載の siRNA発現システム、
〔38〕 (a) に記載のプロモーターが NMT1プロモーター、 GAL1プロモ 一夕一または Pol II系プロモー夕一である、 〔36〕 に記載の siRNA発現シス アム、
〔39〕 発現するステムループ形 RNA分子のステム領域中に、 300塩基対 あたり 1〜100塩基のミスマッチまたはバルジを含む、 〔38〕 に記載の s NA 発現システム、
〔40〕 (b) に記載のプロモーターが PolII系プロモーターである、 〔36〕 に記載の siRNA発現システム、
〔41〕 細胞が哺乳動物細胞もしくは酵母細胞である、 〔36〕 〜 〔4 0〕 のいずれかに記載の siRM発現システム、
〔42〕 標的遺伝子 mRNAのいずれかの領域におけるセンス RNAおよびァ ンチセンス RNAが対合した dsRNA、 または該 dsRNAをステムとするステムループ 形 RNA分子のステム領域の長さが、 少なくとも 30塩基対以上である、 〔36〕 〜 〔41〕 のいずれかに記載の siRNA発現システム、
〔43〕 標的遺伝子 mRNAのいずれかの領域におけるセンス RNAおよびァ ンチセンス RNAが対合した dsRNA中、 または該 dsRNAをステムとするステムル一 プ形 RNA分子のステム領域中のセンス鎖に、 300塩基対あたり 1〜100塩基のミ スマッチまたはバルジを含む、 〔36〕 〜 〔41〕 のいずれかに記載の siRNA発 現システム、
〔44〕 〔36〕 の （a) および （b) の両方の DNAを含む si RNA発現べ ク夕一、
〔45〕 〔36〕 〜 〔43〕 のいずれかに記載の siRNA発現システム、 ま たは 〔44〕 に記載の発現べクタ一を用いて、 ステムループ形 RNA分子と Dicer 活性を有するポリぺプチドの両方を発現させることを特徴とする、 標的遺伝子の 発現を抑制する方法、
〔46〕 以下の工程 （a) および （b) を含む、 標的遺伝子の発現を抑制 する方法、
( a ) 標的遺伝子 mRNAのレずれかの領域におけるセンス RNAおよびアンチセン ス RNAが対合した dsRNA、 または該 dsRNAをステムとするステムループ形 RNA分 子を、 Dicer活性を有するポリべプチドで処理する工程、
(b) 上記工程 （a) で生成した dsRNAを、 標的遺伝子を含む細胞へ導入するェ 王、
〔47〕 Dicer活性を有するポリペプチドが、 Dicerタンパク質の 1066位 〜1924位のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、 〔46〕 に記載の方法、
〔48〕 Dicer活性を有するポリペプチドが、 Dicerタンパク質の 1268位 〜1924位のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、 〔46〕 に記載の方法、
〔49〕 Dicer活性を有するポリペプチドが、 Dicerタンパク質の 1296位 〜1924位のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、 〔46〕 に記載の方法、
〔50〕 Dicer活性を有するボリペプチドが全長 Dicerタンパク質である、 〔46〕 に記載の方法、
〔51〕 細胞が哺乳動物細胞もしくは酵母細胞である、 〔 45〕 〜 〔 5 0] のいずれかに記載の方法、 〔5 2〕 Di cer活性を有するポリペプチドが大腸菌で発現させた 〔4 7〕 〜 〔5 0〕 のいずれかに記載のポリペプチドである、 〔4 6〕 に記載の方法、
〔5 3〕 Di cer活性を有するポリペプチドが昆虫細胞で発現させた 〔4 4〕 〜 〔4 7〕 のいずれかに記載のポリペプチドである、 〔4 6〕 に記載の方法、
〔5 4〕 標的遺伝子 mRNAのいずれかの領域におけるセンス RNAおよびァ ンチセンス RNA力 ί対合した dsRNA、 または該 dsRNAをステムとするステムループ 形 RNA分子のステム領域の長さが、 少なくとも 3 0塩基対以上である、 〔4 5〕 〜 〔5 3〕 のいずれかに記載の方法、
〔5 5〕 標的遺伝子 mRNAのいずれかの領域におけるセンス RNAおよびァ ンチセンス RNAが対合した dsRNA中、 または該 dsRNAをステムとするステムル一 プ形 RNA分子のステム領域中のセンス鎖に、 300塩基対あたり 1〜100塩基のミ スマッチまたはバルジを含む、 請求項 〔4 5〕 〜 〔5 3〕 のいずれかに記載の方 法、 を提供するものである。
本発明者らは、 ステムループ形 RNA分子が細胞質へ移行すると、 RNAi効果を 有することを見出した。 そして本発明者らは、 ステムル一プ形 RNAをコードする DNAを tRNAプロモーターと連結させることにより、 該プロモ一夕一による転写 産物は、 核から細胞質へ効率的に移行し、 該転写産物は、 RNAi効果を有するこ とを明らかにした。 「ステムループ」 とは、 一本鎖 RNA上に存在する逆方向反復 配列間で水素結合によって生じる二本鎖の部分 （ステム； s tem) とそれに挟まれ るループの部分から成る構造を言い、 ヘアピンループとも呼ばれる。 ステムルー プ形 RNA分子は、 ステム領域が二本鎖 RNA構造をしており、 細胞質において、 ダ ィサ一 (Di cer)を含むリポヌクレア一ゼ I I I複合体 (RISC)によつて処理され、 RNAi効果を有する s i (短鎖干渉； shor t in terfer ing) RNAが生成されるものと考 えられる。 s iRNAは、 通常 20bp程度の二本鎖 RNA分子であり、 RNAi効果を有す ることが知られている。 ダイサーおよび RISCは、 細胞質に局在しているものと 考えられており、 従って、 ステムループ形 RNA分子を細胞質へ移行させることは、 RNAi効果を発揮させるために重要である。
本発明は、 細胞内で RNAi効果を有するステムループ形 RNA分子をコ一ドする DMを提供する。 即ち本発明は、 発現産物が効率的に細胞質へ移行することを特 徵とする、 細胞内で RNAi効果を有するステムループ形 RNA分子をコードする DNAに関する。
本発明の上記 DNAの好ましい態様においては、 標的遺伝子 mRNAのいずれかの 領域のセンス (もしくはアンチセンス) RNAをコードするセンス (もしくはアン チセンス） コード DNAと、 該 DNAと相補的な配列とを、 スぺーサー領域を挾んで 対向するように連結させ、 これをプロモーターと機能的に接続させた構造を特徴 とする DNAである。
本発明において標的遺伝子とは、 その遺伝子の発現が本発明のステムループ形 RNA分子の RNAi効果により抑制される遺伝子であり、 任意に選択することがで きる。 この標的遺伝子として例えば、 配列は判明しているがどのような機能を有 するかを解明したい遺伝子や、 その発現が疾患の原因と考えられる遺伝子などを 好適に選択することができる。 標的遺伝子は、 その mRNA配列の一部、 少なくと も 1 5塩基以上が判明しているものであれば、 ゲノム配列まで判明していない遺 伝子であっても選択することができる。 したがって、 EST (Expressed Sequence Tag) などの mRNAの一部は判明しているが、 全長が判明していない遺伝子なども 本発明における標的遺伝子として選択することができる。
上記 「対向する」 とは、 2つの配列が互いに逆方向となるように配置すること を指す。 本発明の上記 DNAは、 センス RNAをコードする DNA配列が、 スぺーサー 領域を挟んで、 逆方向反復配列を形成した構造を有する、 と換言することができ る。 具体的に説明すると、 例えば、 センス RNAをコードする DNA配列 （二本鎖） が、
AGTC (センス鎖） TCAG (アンチセンス鎖）
である場合には、 上記のセンス RNAをコードする DNA配列が、 スぺーサー領域を 挟んで、 逆方向反復配列を形成した構造は、
AGTC-SSS-GACT
TCAG-SSS-CTGA
と表わすことができる。 （上記の 「S」 はスぺーサ一領域の任意の塩基であり、 「：」 は水素結合を表す。 ）
本発明の DNAは、 上記のように標的遺伝子 mRNAのいずれかの領域のセンス RNAをコ一ドするセンスコ一ド DNAと、 該 DNAと相補的な配列とを、 スぺーサ一 領域を挟んで対向するように連結させた構造を有するが、 この 「相補的な配列」 は、 即ち、 上記の 「標的遺伝子 mRNAのいずれかの領域」 に対するアンチセンス RNAをコードする DNAである、 と表わすこともできる。 従って本発明の DNAは換 言すると、 標的遺伝子 mRNAのいずれかの領域に対するアンチセンス RNAをコー ドするアンチセンスコード DNAと、 該 DNAと相補的な配列とを、 スぺ一サー領域 を挟んで対向するように連結させた構造を有する、 と表現することもできる。 本発明の上記 DNAを細胞質へ効率的に移行させるためには、 例えば、 上記 DNA 上へ細胞質移行シグナル配列を含ませることによって、 達成させることができる。 即ち、 本発明の DNAの好ましい態様のおいては、 細胞質移行シグナル配列を有す る前記 DNAである。 細胞質移行シグナル配列は、 必ずしも限定されないが、 スぺ ーサー領域中へ存在することが好ましい。 本発明の細胞質移行シグナル配列とし ては、 公知の細胞質移行シグナルの他、 例えば、 細胞質移行タンパク質が特異的 に結合し得る DNA配列を好適に用いることができる。 細胞質移行シグナル配列の 一例として、 miR23のループモチーフ （配列： 5' -CUUCCUGUCA- 3' ) を示すことが できる (Kawasaki, H. , Tai ra, K. Short hai rpin type of dsRNAs that are cont rol l ed by tRNA(Val) promo ter s igni f i cant ly induce RNAi -medi ated gene silencing in the cytoplasm of human cells. Nucleic Acids Res. , 31, 700- 707 (2003)) 。
また本発明の上記 DNAにおける 「プロモータ一」 としては、 後述の tRNAプロ モーター、 あるいは、 polll系、 ροΙΙΠ系プロモーターを使用することができる。 また、 テトラサイクリン誘導型プロモー夕一を好適に使用することができる。 こ のような誘導可能なプロモーターを用いることにより、 所望のタイミングで本発 明の DNAを発現させることも可能となる。 テトラサイクリン誘導型プロモーター としては、 例えば、 テトラサイクリンで誘導可能な U6プロモータ （Ohkawa, J. & Taira, K. Control of the functional activity of an antisense RNA by a tetracycline- responsive derivative of the human U6 snRNA promoter. Hum Gene Ther. 11, 577-585 (2000)) 等が挙げられる。 例えば、 テトラサイクリン 誘導型プロモ一夕一の例として、 Tet07を含むプロモーターを挙げることができ る。 また、 テトラサイクリン誘導型プロモータ一を利用した場合の一例として、 後述の実施例を参照することができる。 また、 本発明のプロモー夕一として、 テ トラサイクリン誘導型 tRNAプロモーターを好適に使用することができる。 さら に本発明の好適に使用可能なプロモ一夕一として、 例えば、 NMT1 プロモ一夕一、 GAL1プロモータ一を挙げることができる。
また、 本発明の別の好ましい態様においては、 上記の標的遺伝子 mRNAのいず れかの領域のセンス （もしくはアンチセンス） RNAをコードするセンス （もしく はアンチセンス) コード DNAと、 該 DNAと相補的な配列とを、 スぺ一サー領域を 挟んで対向するように連結させた DNAを、 tRNAプロモ一ターと機能的に接続さ せた構造を特徴とする DNAである。
tRNAプロモーターは、 原核生物の場合は遺伝子の上流に存在するのに対し、 真核生物の場合は、 iRNAの Dループ、 Tループに対応する DNA領域が tRNAプロ モー夕一として機能することが知られている。 従って本発明の tRNAプロモ一夕 一とは、 通常、 tRNAの Dループまたは Tループに対応する DNA領域を言う。 tRNAは各アミノ酸に対して、 通常複数個の tRNAが存在する。 本発明の tRNAプ 口モーターとしては、 バリン (Val)に対応した tRNA (tRNAVaりのプロモーターを 好適に使用することができる。
本発明に使用することができる tRNAプロモーターとしては、 具体的には、 以 下の塩基配列をコ一ドするプロモーターを挙げることができる。
5' - AC
CACUACAAAMCCAAC -3' (配列番号： 1 )
本発明において上記 「機能的に連結した」 とは、 tRNAプロモーターからの転 写を受けて、 上記の 「標的遺伝子 mRNAのいずれかの領域のセンス RNAをコ一ド するセンスコード DNAと、 該 DNAと相補的な配列とを、 スぺーサー領域を挟んで 対向するように連結させた DNA」 の転写産物が生成するように、 該 DNAと tRNA プロモータ一とが結合していることを言う。 従って、 該 DNAに対する tRNAプロ モーターの位置は、 その上流、 下流を問わないが、 通常上流に位置する。 また、 該 DNAと NAプロモ一夕一との間には、 該 DNAの転写が起こり得る限り、 任意 の DNA配列を有していても良い。
本発明においては、 上記のように tRNAプロモーターからの転写を受けること によって、 細胞質への移行シグナルとしてその tRNA自体も上記ステムループ形 RNA分子と結合している。
さらに本発明においては、 上記 DNAにターミネータ一を適宜備えることができ る。 タ一ミネ一夕一は、 プロモータ一の転写を終結し得る配列であれば、 特に制 限されず、 例えば、 A (アデニン)塩基が 4つ以上連続した配列、 パリンドローム 構造を形成し得る配列等の公知のターミネータ一を用いることができる。 なお、 本発明の DNAには、 一本鎖 DNAおよび二本鎖 DNAが含まれる。
本発明の上記 DNAが tRNAプロモータ一からの転写を受けることにより、 一続 きの転写産物 (RNA分子)が生成される。 本発明の DNAには、 スぺーサー領域を間 にして逆方向反復配列を有することから、 本発明の DNAの転写産物もまた、 スぺ ーサー領域を間にする逆方向反復配列を含む構造をしている。 このような構造を 有する RNA分子は、 通常、 該反復配列間で水素結合を形成し、 該反復配列をステ ムとし、 スぺ一サ一領域をループとするステムループを形成する。 本明細書にお いては、 このステムループを形成する RNA分子を 「ステムループ形 RNA分子」 と 記載する。 本発明は、 本発明の上記 DNAから転写されるステムループ形 RNA分子 もまた、 本発明に含まれる。 なお、 本発明において 「RNAi 効果を有する」 とは、 本発明のステムループ形 RNA分子の代謝産物等 （例えば、 RNA鎖に切断等の代謝 を受けて生成される産物） が RNAi効果を有する場合も含まれる。
本発明のスぺーサー領域を構成する DNAは、 それに瞵接する反復配列が水素結 合をし得る限り、 その長さは特に制限されないが、 通常 1〜10000 ベースであり、 好ましくは 1〜100ベース、 より好ましくは、 3〜30ベースであり、 さらに好ま しくは 5〜20ベースである。 スぺーサー領域を構成する DNAの塩基配列は、 特に 規定されず、 任意の配列とすることができる。 また、 上記のように逆方向反復配 列間で水素結合を形成し得るものであれば、 特にスぺーサー領域は必要とせず、 スぺ—サ—領域を有しない場合であっても、 本発明の DNAに含まれる。 本発明の
DNAは、 例えば、 図 1 Aの上段のような構造を模式的に示すことができる。
哺乳動物細胞へ、 通常約 30bp以上の長さの二本鎖 RNAを導入すると、 ィンタ 一フエロン（IFN)防御経路によって、 該ニ本鎖 RNAが消化されることが知られて いる。 従って、 本発明のステムループ形 RNA分子は、 ステム領域の二本鎖 RNAの 長さが、 通常、 35bp以内であり、 好ましくは 10〜35bpであり、 より好ましくは 15〜30bpであり、 さらに好ましくは 18〜30bpであり、 最も好ましくは 26〜30bp もしくは 31〜35bpである。 また、 本発明の DNAにおける 「センスコード DNA」 あるいは、 上記の 2つの逆方向反復配列のそれぞれの長さもまた、 通常、 35bp 以内であり、 好ましくは 10〜35bpであり、 より好ましくは 15~30bpであり、 さ らに好ましくは 18〜30bpであり、 最も好ましくは 26〜30bpもしくは 31〜35bp である。 ただし、 本発明のプロモ一夕一として、 匪 Πプロモーターまたは GAL 1 プロモーターを用いる場合には、 特に制限されるものではないが、 センスコード DNAの長さは 10〜5000bpであることが好ましい。
また本発明において、 s iRNAにおける RNA同士が対合した二重鎖 RNAの部分 (ステムループ形 RNA分子のステム部分） は、 完全に対合しているものに限らず、 ミスマッチ （対応する塩基が相補的でない） 、 バルジ （一方の鎖に対応する塩基 がない） などにより不対合部分が含まれていてもよい。 不対合部分は s iRNA形成 に支障がない範囲で設けることができる。 その際、 本発明の DNAから発現するス テムループ形 RNA分子のステム領域中に存在するミスマッチまたはバルジの数は、 特に制限されないが、 通常、 2 0塩基対あたり 1〜10塩基である。 また、 本発明 の DNAが有するプロモー夕一が醒 T1.プロモー夕一あるいは GAL1プロモータ一で ある塲合には、 本発明の DNAから発現するステムループ形 RNA分子のステム領域 中に、 特に制限されないが、 300塩基対あたり 1〜100塩基のミスマッチまたは バルジを含んでいてもよい。 また、 上記ミスマッチとしては例えば、 センス鎖に 2 0塩基対あたり 1〜6塩基の G'TJペアを組むようなミスマッチを挙げることが できる。
本発明の上記 DNAは、 当業者においては、 一般的な遺伝子工学技術により作製 することができる。 tRNAプロモータ一を含む本発明の DNAは、 例えば、 周知の オリゴヌクレオチド合成法によって任意の配列を合成して作製することができる。 本発明の二本鎖 DNAは、 センス鎖とアンチセンス鎖とをそれぞれ個別に合成し、 それぞれの鎖をァ二一リングさせることにより取得することができる。
本発明の DNAは、 そのまま細胞内の染色体に導入し、 細胞内で発現させること もできるが、 効率的な細胞導入などを行うために、 上記 DNAをベクターに保持さ せることが好ましい。 本発明の DNAを含むベクターもまた、 本発明に含まれる。 ここで用いることができる 「ベクター」 は、 導入したい細胞などに対応して選択 することができる。 例えば、 哺乳動物細胞では、 例えば、 レトロウイルスベクタ 一、 アデノウイルスベクター、 アデノ関連ウィルスベクター、 ワクシニアウィル スベクター、 レンチウィルスベクター、 ヘルぺスウィルスベクター、 アルファゥ ィルスベクター、 EBウィルスベクター、 パピローマウィルスベクター、 フ才一 ミ一ウィルスベクターなどのウィルスベクターやカチォニックリボソーム、 リガ ンド DNA複合体、 ジーンガンなどの非ウィルスベクターなどが挙げられるが (Ni i t su Y. et al. , Mol ecul ar Medi c ine 35 : 1385-1395 (1998) ) 、 これらに 限定されるものではない。
ベクターには、 必要に応じて、 ベクターが導入された細胞を選択し得る選択マ —カーなどをさらに保持させることができる。 選択マーカーとしては、 ネオマイ シン耐性遺伝子、 ハイグロマイシン耐性遺伝子、 ピューロマイシン耐性遺伝子の ような薬剤耐性マ一カー、 ガラクトシダーゼなどの酵素活性を指標に選択し得る マ一カー、 あるいは、 GFPなどの蛍光発光などを指標に選択し得るマーカーなど が挙げられる。 また、 EGFレセプ夕一、 B7- 2などの表面抗原を指標に選択し得る 選択マーカーなども用いてもよい。 このように選択マーカ一を用いることにより、 該ベクタ一が導入された細胞、 すなわち、 本発明のベクターが導入された細胞の みを選択することが可能となる。 また、 ベクターを用いることにより、 細胞内で の保持時間を高め、 またべクタ一によってはレトロウイルスベクタ一などのよう に染色体へのィンテグレ一シヨンを誘導するため、 本発明の DNAからの細胞内で の安定的なステムループ形 RNA分子の供給を行うことが可能となる。
本発明の好ましい態様においては、 本発明の DNAまたは該 DNAを含むベクター を、 細胞へ導入することにより、 該細胞における遺伝子の発現を抑制することが できる。 従って本発明は、 標的遺伝子の発現が抑制された細胞を生産する方法で あって、 本発明の DNAまたは該 DNAを含むベクターを細胞に導入する工程、 およ び前記ベクターが導入された細胞を選択する工程、 を含む生産方法を提供する。 さらに本発明は、 本発明の DNAまたは該 DNAを含むベクターを保持する細胞を提 供する。 本発明の上記細胞は、 特に限定されず、 遺伝子の発現を抑制したい所望 の細胞を使用することができる。 従来 RNAiの誘導が困難であった哺乳動物細胞 においても、 本発明の DNAまたは該 DNAを含むベクターにより、 RNAiを誘導す ることが可能であることから、 本発明の細胞としては、 特に制限されず、 例えば、 哺乳動物細胞 （例えば、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ゥシ、 ゥマ、 ブ夕、 ヒッジ、 サル、 またはチンパンジー等の細胞） 、 酵母等を挙げることができる。 また、 植 物細胞などの長鎖の dsRNAでは、 長期の安定な発現保持が難しい細胞も、 本発明 の DNAまたは該 DNAを含むベクターを導入される細胞として好適である。
また、 本発明の DNAまたは該 DNAを含むベクターの上記細胞への導入方法は、 当業者においては、 細胞の種類により適宜選択することができる。 例えば、 哺乳 動物細胞への導入では、 リン酸カルシウム法 (Virology, Vol.52, p. 56 (1973))、 エレクト口ポレーシヨン法（Nucleic Acids Res., Vol.15, p.1311 (1987)) 、 リ ポフエクシヨン法（J. Clin. Biochem. Nutr., Vol.7, p.175 (1989))、 ウィルス により感染導入方法（Sci. Am., p.34, March (19 94)) 、 ジーンガンなどから選 択することができ、 植物細胞への導入では、 エレクト口ポレーシヨン法 (Nature, Vol.319, p.791 (1986)) 、 ポリエチレングリコール法 (EMBO J., Vol.3, p.2717 (1984)) 、 パーティクルガン法 (Pro Natl. Acad. Sci. USA, Vo 1.85, p.8502 (1988)) 、 ァグロパクテリユウムを介した方法（Nucleic. Acids Res., Vol.12, p.8711 (1984)) 等により行うことができる。
本発明の DNAまたは該 DNAを含むベクターが導入された細胞を選択する方法と しては、 本発明の DNAまたは該 DNAを含むベクタ一に特異的な DNA配列をプロ一 ブぁるいはプライマーとしてハイブリダイゼ一ション、 PCR法等の公知の手法に より選択することもできるが、 選択マーカーを備えたベクタ一に本発明の DNAが 保持されている場合には、 その選択マーカーによる表現型を指標に選択すること ができる。
上記のように本発明の DNAまたは該 DNAを含むベクターが導入された細胞は、 標的遺伝子の発現が抑制されたノックダウン細胞となる。 ここで 「ノックダウン 細胞」 には、 標的遺伝子の発現が完全に抑制された細胞と、 標的遺伝子の発現が 完全には抑制されていないが低減されている細胞とが含まれる。 従来、 このよう な細胞は、 標的遺伝子をあるいはその制御領域を欠損 ·改変させることにより創 生されていたが、 本発明を用いることにより、 染色体上の標的遺伝子を改変する ことなく、 単に本発明の DNAまたは該 DNAを含むベクターを導入し、 導入された 細胞を選択するという簡易な方法により標的遺伝子の発現が抑制された細胞を作 ることができる。 このように創生されたノックダウン細胞は、 標的遺伝子の機能 解析のための研究材料として、 また疾患原因遺伝子を標的遺伝子として発現が抑 制されている細胞では疾患モデル細胞などとして利用することが可能となる。 ま た、 生殖細胞に本発明の DNAまたは該 DNAを含むベクターを導入し、 この本シス テムを保持した生殖細胞より生物個体を発生させることにより、 標的遺伝子ノッ クダウン動物、 疾患モデル動物などを創生することも可能となる。 本発明には、 本発明によって生産される上記ノックダウン細胞も含まれ、 さらに上記本発明の MAもしくはベクターを保持する生物個体 （例えば、 標的遺伝子ノックアウト非 ヒト動物等） も本発明に含まれる。 本発明における上記生物としては、 例えば、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ゥシ、 ゥマ、 ブ夕、 ヒッジ、 サル、 またはチンパンジ 一等を挙げることができる。
また本発明は、 本発明の DNAまたは該 DNAを含むベクターを含有する組成物に 関する。 本発明により所望の標的遺伝子の発現を抑制し得るため、 本発明により 疾患の原因となる遺伝子発現を抑制することにより、 該疾患の治療または予防効 果が期待できる。 さらに上記組成物は、 所望の遺伝子の機能を検討するための試 薬としても有用である。 本発明の DNAまたは該 DNAを含むベクターを医薬品とし て用いる場合には、 適切な賦形剤等を添加した組成物とすることもできる。 本発明の別の態様においては、 ステムループ形ランダム RNA分子を発現するべ クタ一に関する。 該ベクターは、 ランダムな配列からなる RNAをコードする DNA と、 該 DNAと相補的な配列とを、 スぺーサー領域を挟んで対向するように連結さ せ、 これを tRNAプロモーターと機能的に接続させた構造を有する DNAを含む。 該 DNAから発現するランダムな配列を有する転写産物を、 本発明においては 「ス テムループ形ランダム RNA分子」 と呼ぶ。 このステムループ形ランダム RNA分子 を細胞へ導入することにより、 機能遺伝子の探索が可能である。 つまり、 上述ま での本発明の DNAまたは該 DNAを含むベクタ一は特定の標的遺伝子の発現を抑制 し得るものであるが、 上記態様においては、 ステムループ形ランダム RNAを発現 して、 任意の遺伝子、 例えば機能未知の遺伝子配列未知の遺伝子を抑制し、 新規 な機能遺伝子を探索するために用いることができる。 上記ステムループ形ランダ ム RNA分子もまた、 好ましくは、 ステム領域の長さが、 通常 30bp以内であり、 好ましくは 15〜30bpであり、 より好ましくは 18〜30bpである。
本発明は、 上記ステムル一プ形ランダム RNA分子発現ベクターを細胞へ導入す る工程、 前記ベクターが導入された細胞を選択する工程、 および、 選択された細 胞の表現型を解析する工程、 を含む機能遺伝子探索方法を提供する。
本発明においては、 異なるランダム配列を有するステムループ形ランダム RNA 分子を発現し得るベクタ一を集めてライブラリ一として構築することもできる。 該ライブラリ一を用いることにより、 機能遺伝子の探索を一層効率的に行うこと が可能となる。
上記方法における、 ステムル一プ形ランダム RNA分子発現ベクターの細胞への 導入は前述のように行うことができる。
上記方法においては、 次いで、 ステムループ形ランダム RNA分子発現ベクター またはライブラリ一が導入された細胞が選択された後に、 その細胞の表現型を解 析する。 この表現型の解析は、 例えば、 コントロールとしてステムループ形ラン ダム RNA分子発現べクタ一が導入されていない細胞の表現型と比較することによ り行うことができる。 この表現型は、 細胞表面に生じるものだけではなく、 例え ば、 細胞内の変化なども含まれる。
上記解析の結果、 表現型が変化した細胞には、 何らかの機能遺伝子の発現を抑 制し得るステムループ形ランダム RNA分子が含まれている可能性が高い。 そのた め、 機能遺伝子をスクリーニングするために、 例えば、 この細胞に含まれるステ ムループ形ランダム RNA分子発現べクターのステムループ形ランダム RNAをコー ドする DNAの配列に基づき、 プローブ、 プライマーを構築する。 そして、 このプ ローブ、 プライマーを用いて、 ハイブリダィゼーシヨンまたは PCRを行うことに より、 機能遺伝子のクロ一ニングを行うことができる。 また、 ステムループ形ラ ンダム RNAをコードする DNAの配列に基づいて、 データベースから機能遺伝子を 検索することもできる。
また本発明は、 細胞内で RNAi効果を有する RNA分子が発現可能な構造を有す る DNA、 および Di cer活性を有するポリペプチド （例えば、 Di cerタンパク質） の発現が可能な構造を有する DNAを含む、 s iRNA発現システムに関する。 本発明 の s iRNA発現システムの好ましい態様においては、 以下の （a ) および （b ) の DNAを含む、 s iRNA発現システムである。 Di cer活性により長鎖 dsRNAによる細 胞毒性を軽減させることが可能である。
( a ) 細胞内で RNAi効果を有するステムループ形 RNA分子をコードする DNAで あって、 標的遺伝子 mRNAのいずれかの領域のセンス RNAをコ一ドするセンスコ ード DNAと、 該 DNAと相補的な配列とを、 スぺ一サー領域を挟んで対向するよう に連結させ、 これをプロモーターと機能的に接続させた構造を特徴とする DNA
( b ) Di cerタンパク質における Dicer活性を有するポリペプチド領域をコード する DNAとプロモーターとを機能的に接続させた構造を特徴とする DNA
本発明において 「Di cerタンパク質における Di cer活性を有するポリべプチ ド J とは、 Di cerタンパク質において、 少なくとも、 Di cer活性を有する部分ポ リペプチド断片、 あるいは該ポリペプチドを含むタンパク質 （例えば、 全長 Di cerタンパク質） を言う。 この Dicer活性とは、 通常、 長い二本鎖 RNAを 21〜 25塩基の二本鎖 RMに切断する活性を言う。 一般的に Di cer活性は、 RNasel l l 活性を測定することにより評価することができる。 当業者においては公知の方法、 例えば、 インビトロ ·プロセシング'アツセィ等によって該活性について評価 (測定） することができる。 例えば、 インビトロ ·プロセシング ·アツセィは、 後述の実施例に記載の方法によって実施することができる。
また、 本発明において使用される Di cerタンパク質は、 特にその由来は制限さ れず、 例えば、 ヒト Di cerタンパク質を好適に用いることができる。 例えば、 Di cerタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号： 5 5に、 Di cer夕 ンパク質のアミノ酸配列を配列番号： 5 6に示すことができる。
本発明における上記 Di cer活性を有するポリペプチドの具体例としては、 通常 Di cerタンパク質において好ましくは 1066位〜 1924位、 より好ましくは 1268位 〜 1924位、 さらに好ましくは 1296位〜 1924位のアミノ酸配列からなるポリぺプ チド （例えば、 配列番号： 5 6に記載のアミノ酸配列において、 好ましくは 1066位〜 1924位、 より好ましくは 1268位〜 1924位、 さらに好ましくは 1296位 〜1924位のアミノ酸配列からなるポリペプチド） である。
上記 （a ) および （b ) の DMを有する s iRNA発現ベクターもまた本発明に含 まれる。 上記 （a ) または （b ) の DNAは、 当業者においては、 公知の遺伝子ェ 学技術を用いて、 容易に作製することができる。
さらに本発明は、 標的遺伝子の発現を抑制する方法を提供する。 本発明の標的 遺伝子抑制方法の好ましい態様においては、 本発明の s iRNA発現システム、 また は本発明の発現べクタ一を用いて、 ステムル一プ形 R N A分子と Di cer活性を有 するポリペプチド （例えば、 Di cerタンパク質） の両方を細胞において発現させ ることを特徴とする、 標的遺伝子の発現抑制方法である。 該方法における Di cer としては、 組換えタンパク質が好適に使用される。
また本発明の標的遺伝子抑制方法の他の好ましい態様においては、 まず、 標的 遺伝子 mRNAのいずれかの領域におけるセンス RNAおよびアンチセンス RNAが対 合した dsRNAを、 Dicer活性を有するポリペプチド （例えば、 組換え hDi cerタ ンパク質） で処理し、 次いで、 生成した dsRNAを、 標的遺伝子を含む細胞へ導入 する。
上記方法における組換え hDi cerの製造方法は、 例えば、 後述の実施例で示す 方法により、 実施することができるが、 必ずしもこの方法のみに制限されるもの ではない。 当業者においては、 実施例に示される方法を適宜改変して組換え hDi cerの製造を行うことが可能である。
また、 上記方法における 「Di cer活性を有するポリペプチド」 としては、 例え ば、 全長 Di cerタンパク質、 または Di cerタンパク質における上述の部分ポリべ プチド領域を含むタンパク質を、 好適に使用することができる。 また、 「Di cer 活性を有するポリペプチド」 は、 例えば、 大腸菌もしくは昆虫細胞等で発現させ たものを好適に利用することができる。 当業者においては一般的な遺伝子工学技 術を用いて、 大腸菌もしくは昆虫細胞において所望のタンパク質を発現させ、 さ らに該タンパク質を回収 ·精製することが可能である。
また上記方法において dsRNAの細胞への導入は、 当業者においては公知の方法、 例えば、 エレクトロボレ一シヨン法、 またはリポフエクシヨン法等により、 容易 に実施することができる。
上記方法における 「標的遺伝子 mRNAのいずれかの領域におけるセンス RNAお よびアンチセンス RNAが対合した dsRNA」 の長さは、 特に制限されるものではな いが、 好ましくは、 標的遺伝子 mRNAのいずれかの領域におけるセンス RNAおよ びアンチセンス RNAが対合した dsRNA、 または該 dsRNAをステムとするステムル ープ形 RNA分子のステム領域は少なくとも 30塩基対以上である。 また、 標的遺 伝子 mRNAのいずれかの領域におけるセンス RNAおよびアンチセンス RNAが対合 した dsRNA中、 または該 dsRNAをステムとするステムループ形 RNA分子のステム 領域中のセンス鎖に、 300塩基対あたり 1〜100塩基のミスマッチまたはバルジ を含んでいてもよい。
また、 生殖細胞に本発明の DNAもしくはベクタ一を導入し、 該 DNAもしくはべ クタ一を保持した生殖細胞より生物個体を発生させることによって、 標的遺伝子 ノックダウン非ヒト動物 （例えば、 マウス等） 、 疾患モデル非ヒト動物などを創 生することも可能となる。
本発明の DNAもしくはべクタ一を用いた標的遺伝子ノックダウン動物は、 当業 者においては、 一般的なノックアウト動物作製技術によって作製することができ る。 一例を示せば、 s iRNA発現べクタ一を F1のメスとォスとを交配して得られ た受精卵に注入する。 受精卵から発生させたマウスの尾部から末梢血 DNAを得て、 発現べクタ一の一部をプロ一ブとして用いたゲノミックサザンブロットを行い、 染色体に s iRNA発現ベクターが組み込まれた陽性の創始動物を同定する。 F1八 イブリツドマウスのいずれかとの戻し交配を繰り返して後代マウスを得る。 そし て、 ゲノミツクサザンブロット解析および PCR解析により、 遺伝子組換え陽性の 子孫を同定する。
また、 上記では主に哺乳動物に s iRNA発現システムを用いる場合を説明したが、 本発明の s iRNA発現システムは植物に用いてもよい。 特に、 従来の二重鎖 RNAを 直接植物細胞に導入して RNAiを誘導していたが、 細胞を継代している過程で dsRNAが欠落し RNAiの効果を維持することが困難であった。 そのため、 本発明 の DNAもしくはベクターを植物細胞中の染色体にインテグレーションさせること により、 RNAiの効果を維持することが可能となる。 また、 こうした細胞よりト ランスジエニック植物を創生することにより、 RNAi効果を安定的に保持した植 物を創生することもできる。 なお、 植物の創生は、 当業者においては、 周知の方 法により実施することが可能である。 図面の簡単な説明
図 1は、 dsRNA発現プラスミドの構築を示す図である。
(A) tRNA- dsRNA発現用プラスミドは、 ヒト iRNAV a 1プロモー夕一配列および夕 一ミネ一夕一配列を有する。 マウス U6-dsRNAまたはヒト U6- dsRNA発現用プラス ミドは、 それぞれ、 マウス U6プロモーターまたはヒ卜 U6プロモー夕一を有する。 ループ 1配列（5' -GAAAA-3' )またはループ 2配列（mi r23ループ配列（Lagos- Quintana, . et al . (2001) Sc i ence, 294， 853 - 858. ) : 5' - CUUCCUGUCA - 3' Z配列 番号： 3 0 )を、 k- rasセンス鎖配列（29bp)とアンチセンス鎖配列（29bp)との間 に挿入した。 U6 - dsRNAにおける dsRNAおよびリレ一プ配列は、 tRNA - dsRNAと同じ である。
(B) dsRNAによって夕一ゲッティングされる変異体および正常 k- ras mRNAの配 列。 変異体 k-ras遺伝子は点突然変異を有する （コドン 12GGT -〉 GTT) 。
図 2は、 前駆体 dsRNAおよび s iRMの検出を示す写真である。 前駆体 dsRNAお よび s iRNAの検出はノーザンブロット分析によって分析した。 NA- dsRNAをコ ードするプラスミドあるいは U6- dsRNAをコードするプラスミドを、 SW480細胞 に導入した。 48時間後、 これらの細胞を回収して、 細胞質 （C ) と核分画
(N) に分離した。 各分画の tot al RNAを単離して 15 %ポリアクリルアミドゲ ルを用いて分画した。 ノーザンプロット分析は、 本文記載のように行った （レー ン 1、 tRNA-dsRNAを発現する細胞の核画分；レーン 1、 tRNA-dsRNAを発現する細 胞の細胞質画分；レーン 3、 mU6-dsRNA (ループ 1)を発現する細胞の核画分；レーン 4、 mU6-dsRNA (ループ 1)を発現する細胞の細胞質画分：レーン 5、 WJ6-dsRNA (ル一 プ 1)を発現する細胞の核画分； レーン 6、 hU6- dsRNA (ループ 1)発現する細胞の 細胞質画分； レーン 7、 mU6- dsRNA (ループ 2)を発現する細胞の核画分； レーン 8、 mU6_dsRNA (ループ 2)を発現する細胞の細胞質画分； レーン 9、 WJ6-dsRNA (ループ 2)を発現する細胞の核画分； レーン 10、 MJ6- dsRNA (ループ 2)を発現する細胞の 細胞質画分） 。
図 3は、 dsRNA処理に及ぼす Di cerリポザィムの影響を表わす写真である。
(A) ポリ (A)連結 Dicerリポザィム（Dicer- RzAl 00)発現細胞における di cer遺伝 子の発現レベルを示す。 dicer mRNAは、 di cer遺伝子に特異的なプライマーを用 いて RT- PCRによつて検出した（実施例 3参照）。 GADPHは内因性対照である。
(B) Di cer- RzAl 00発現細胞における前駆体 dsRNAおよび s iRNAの検出。 （レー ン 1、 tRNA-dsRNAおよび Di cer- RzAl OOを発現する細胞の核画分；レーン 、 tRNA-dsRNAおよび Di cer- RzAl OOを発現する細胞の細胞質画分；レーン 3、 U6- dsRNAおよび Di cer-RzAl OOを発現する細胞の核画分； レーン 4、 U6- dsRNAおよ び Di cer- RzAl 00を発現する細胞の細胞質画分）。
図 4は、 dsRNAおよび s iRNA-媒介分解による変異体 k- ras mRNAの切断を示す 写真である。
(A) tRM- dsRNAを含む細胞抽出物による変異体 k- ras mRNAの切断。 インビトロ RNAiァッセィを実験技法として記述した。 （レーン 1 ： tRNA- dsRNAと正常 k- ras RNAとを発現する細胞の核分画 （N) 、 レーン 2 ： tRNA- dsRNAと正常 k-ras mRNAとを発現する細胞の細胞質分画 （C ) 、 レーン 3 ： tRNA- dsRNAと変異体 k- ras mRNAとを発現する細胞の核分画、 レーン 4 ： tRNA- dsRNAと変異体 k- ras mRNAとを発現する細胞の細胞質分画） 。
(B) k-ras指向 s iRNAおよび SW480細胞抽出物による変異体 k_ras mRNAの切断 (レーン 1 ： SW480細胞の核分画と正常 k- ras mRNA, レーン 2 ： SW480細胞の細 胞質分画と正常 k - ras mRNA, レ一ン 3 ： SW480細胞の核分画と変異体 k-ras mRNA, レーン 4： SW480細胞の細胞質分画と変異体 k - ras mRNA) 。
図 5は、 ィンビポで tRNA- dsRNAによる RNAiの効率と特異性を示す図である。 tRNA-dsRNAまたは U6- dsRNAを発現する細胞における K-ras蛋白質レベルを、 特 異的 k-Ras抗体を用いてウエスタンブロット分析によって分析した。 変異体 k- ras遺伝子は SW480細胞において発現させた。 対照的に、 正常 k- ras遺伝子は HeLa細胞において発現させた。 定量のために、 バンドの強度を、 NIH Image Analys i sを用いてデンシトメトリーによって分析した。
図 6は、 NA-dsRNAによる細胞増殖の影響を示す図である。 実施例に記載の ように増殖速度を測定した。 値は、 それぞれの場合での 3回の反復実験からの結 果の平均土 S. D.である。 tRNA-dsRNA発現 SW480細胞は、 野生型 SW480細胞より かなり緩やかに増殖した。 対照的に、 tRNA-dsRNA発現 HeLa細胞における増殖速 度は、 野生型 SW480細胞の増殖速度と同じであった。
図 7は、 （A) hDicerによって生成された diced- siRNAの検出を示す写真であ る。 実施例中に記載した通り、 組換え hDicerを大腸菌の中で合成し、 ウェス夕 ンブロット解析によって検出を行った。 re-hDicer (0.5^g) の調製物は、 SDS - PAGE (10%ポリアクリルアミド） によって分画し、 エレクトロブロッテイングに よって PVDF膜に転写した。 次に、 ECLキットとストレプトアビジン結合アル力 リホスファターゼによって、 re- hDicerを可視化した。 Mock：空のプラスミドで 形質転換した細胞からの調製物； phDicer： hDicerをコ一ドする発現プラスミド を感染させた細胞からの調製物。
(B) re-Dicerによる siRNAの生成を示す写真である。 200 1の反応用緩衝液の 中、 5 mM MgCl2を添加あるいは添加せずに、 長鎖 dsRNA (10 g) と l gの re - hDicerを混合した。 反応混合液を 37°Cで 30分間インキュベートした。 そして、 20^1の各反応混合液を 12%非変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動して分画 した。 20〜25塩基長の siRNAを Syber (登録商標） グリーン IIで検出した。
図 8は、 外来性ピュー口マイシン耐性遺伝子の発現抑制を示す図である。
(A) 実施例にて説明したとおり、 合成 siRNAの標的として 10個の部位 （部位 1 〜10) を選択した。 diced- siRNAを調製するため、 ピュ一ロマイシン耐性遺伝子 の 5'末端側領域 （1-300位の塩基） に対応する長鎖 dsRNAを作製し、 組換え hDicerで処理した。
(B) infoldブロクラム (Provost, P. et al. , Ribonuclease activity and RNA binding of recombinant human Dicer. , EMB0 J" 21, 5864-5874, (2002)) に よつて推定されたピュー口マイシン耐性 mRNAの二次構造を表わす図である。
(0 diced- siRNAが、 外来性ピューロマイシン耐性遺伝子の発現に対する最も 有効なサプレッサ一であった （棒グラフの一番右側のバー） 。 レニラ由来のルシ フェラーゼのレポーター遺伝子によって、 siRNA による形質転換効率を観察した。 図 9は、 内因性 H- ras遺伝子の発現抑制を示す図である。 (A) 実施例にて説明した通り、 合成 siRNAの標的として 10個の部位 （部位 1〜 10) を選択した。 diced- siRNAを調製するため、 関連 ras遺伝子の配列と相同性 が低い H-ras遺伝子 （370〜570 nt) の 3'領域に対応する長鎖 dsR Aを作製し、 組換え hDicerで処理した。
(B) mfoldプログラムによって推定された H- ras mRNAの二次構造を表わす図で あ。。
(C) diced- siRNAが、 内因性 H- ras遺伝子の発現に対する最も有効なサプレツ サ一であった （棒グラフの一番右側のバー） 。 ァクチンレベル （対照） を参照と して結果を標準化した。
(D) H-ras遺伝子を標的とする diced - siRNAの関連遺伝子 K- rasおよび N - ras の発現に対する効果を示すグラフである。 K- Rasおよび N-Rasは、 特異的抗体を 用いてウェスタンブロッテイングにより検出した。 発現レベルはデンシトメトリ 一および NIH Image Analysisにより定量した。
図 1 0は、 diced- siRNAによる内因性遺伝子 c- junおよび c- fosの発現の抑制 を示す写真である。 diced- siRNAの調製のために、 c- jun遺伝子 〜200 nt) お ょぴ c- fos遺伝子 （1〜200 nt) の 5'領域に関連する長鎖 dsRNAを生成し、 組換 え hDicerで処理した。 c - Junおよび c- Fos双方ともに特異的抗体を用いたゥェ スタンプロッティングにより検出した。 ァクチンを内因性対照として利用した。 WT-Hela；野生型 HeLa細胞、 c- Jun (c- Fos) diced- siRNA； c - jun特異的 （c-fos 特異的） dsRNAより生成される siRNA。
図 1 1は、 shRNAおよびその標的 erbB2 mRNAの polIII依存発現用のプラスミ ドの構築を示す図である。
(A) polIIIプロモーターの制御下で shRNAを発現する shRNA発現プラスミドの 構築図である。 tR A shR A、 WJ6 - shR A、 および mU6 - shRNA発現用プラスミドは、 それぞれ、 ヒト tRNAVal遺伝子からのプロモーター配列、 ヒト U6プロモーター配 歹 IJ、 マウス U6プロモーター配列と共にターミネータ一配列を含む。 ループ配列 (5 ' -GAAAA-3 ' )を、 erbB2ターゲットのセンス鎖配列（29n t)とアンチセンス鎖 配列 (29η ί)との間に挿入した。
(B) erbB2 mRNAにおける RNAiの夕一ゲッティング部位を示す図である。 本発 明者らは、 erbB2 mRNA内に tRNA- shRNAの 5つのターゲッティング部位を選択し た。
(0 前駆体 dsRNAおよび s iRNAの検出を示す写真である。 前駆体 dsRNA (プレ dsRNA)および s iRNAの存在をノザンブロッティングによって分析した。 tRNA - shRNA, mU6-shRNA、 および hU6-sMNAをコードするプラスミドを MCF- 7細胞に導 入した。 48 時間後、 細胞を収集し、 細胞質 (C)画分および核 (N)画分を調製した。 各画分の総 RNAを単離し、 12 %ポリアクリルアミドゲルで分画した。 ノザンブロ ッティング分析は他に記載のように行った。 レ一ン 1は tRNA- shRNAを発現する 細胞の核画分、 レーン 2は tRNA- shRNAを発現する細胞の細胞質画分、 レーン 3 は hU6- shRNAを発現する細胞の核画分、 レーン 4は MJ6- shRNAを発現する細胞の 細胞質画分、 レーン 5は mU6- shRNAを発現する細胞の核画分、 レーン 6は mU6_ shRNAを発現する細胞の細胞質画分である。
(D) MCF- 7細胞における tRNA-shRNA (tRNAi)、 mU6-shRNA (mU6 i) , および hU6 - shRNA ( J6 i)による RNAiの効果について示す図である。 ErbB2タンパク質レベル は、 ウェスタンプロッティング分析およびデンシトメトリ一による定量によって 調べた。 ErbB2タンパク質レベルはァクチンレベルを用いて標準化した。
図 1 2は、 マウスにおける NA-shRNA、 mll6- shRNA、 および MJ6- shRNAによる RNAiの効果を示す図である。
(A) GFP mRNA内の E126配列にターゲッティングされた tRNA-shRNA、 mU6- shRNA、 および J6- shRNA発現プラスミドの構築を示す図である。
(B) 8細胞桑実胚における tRNA- shRNA、 mU6-shRNA, および hU6- shRNAによる RNAiの効果を示す写真である。 細胞に紫外線を照射した。 GFP発光は蛍光顕微鏡 によって検出された（右パネル）。 左パネルは位相差顕微鏡写真を示す。 図 1 3は、 マウスにおける tRNA-shRNA、 mU6- shRNA、 および hU6- shRNAによる RNAiの効果を示す図である。
(A) 胚盤胞における tRNA-shRNA、 mU6- shRNA、 および J6-shRNAによる RNAiの 効果を示す写真である。 詳細については (B)を参照のこと。
(B) マウス新生仔における tRNA- shRNAによる RNAiの効果を示す写真である。 tRNA-shRNAトランスジエニックマウスに紫外線を照射した。 緑色蛍光 GFP発光 は、 デジタルカードカメラ（フィルターなし）を用いて撮影した。
図 1 4は、 tRNA- shRNAのテトラサイクリン誘導 (Te t誘導)発現を示す図である c
(A) tRNA-shRNAの Te t依存発現の模式図である。 Doxはドキシサイクリン、 Te t-tTSはテトラサイクリンリプレッサー、 Te t07は 7コピーのテ卜ラサイクリ ンオペレータ一系。
(B) Te t依存 shRNA発現系における前駆体 dsRNA (プレ dsRNA)および s iRNAの検 出結果を示す写真である。 100ng/ml Doxの存在下または非存在下での前駆体 dsRNAおよび s iRNAの存在を、 ノザンブロッティングによって分析した。
図 1 5は、 tRNA- shRNAのテトラサイクリン誘導 (Te t誘導)発現を示す図である
(A) Te t07- NA_shRNA発現のドキシサイクリン （Dox) 用量依存性について示 す図である。 Dox濃度を上げるにつれて、 転写物レベルが急速に増加し、 最大活 性化は l OOng/mlであった。
(B) erbB2遺伝子発現に及ぼす Te t07-tRNA-shRNAの影響を示す図である。
100ng/ml Doxの存在下または非存在下での ErbB2タンパク質レベルは、 ウェス 夕ンブロッティングおよびデンシトメトリーで定量し分析した。 ErbB2タンパク 質レベルはァクチンレベルを用いて標準化した。
図 1 6 Aは、 酵母における dsRNA発現ベクターの構築を模式的に表した図であ る。
Bは、 dsRNAの発現および s iRNAの作成を示す写真である。 dsRNAおよび s iRNA のレベルはノーザンブロット分析によって検出した （レーン 1は野生型 (WT) S.ポ ンべ株におけるモックベクター、 レーン 2は π S.ボンべ株における pSPi- LEU2、 レーン 3は ydcrl—S.ボンべ株における pSPi- LEU2、 レーン 4は WT S.セレビシェ 株におけるモックベクター、 レーン 5は WT S.セレピシェ株における pSCi- LacZ、 レ一ン 6は WT S.ボンべ株におけるモックベクター、 レーン 7は WT S.ボンべ株 における pSCi- LacZ)。 s iRNAは、 pSPi_LEU2および pSPi- LacZを発現する WT S. ボンべ株において検出された。 しかしながら、 s iRNAは、 pSPi- LEU2を発現する yDcr l—S.ボンべ株および pSCi- LacZを発現する WT S.セレピシェ株においてほと んど検出されなかった。
図 1 7は、 S.ボンベおよび S.セレピシェにおける外因性 LacZ遺伝子の発現に 及ぼす dsRNA誘導性 RNAiの影響を示す図である。
図 1 8は、 S.ボンベにおける dsRNA誘導性 RNAiの影響を示す写真である。
Aは、 S.ボンベにおける外因性 LEU2遺伝子の発現に及ぼす dsRNA誘導性 RNAiの 影響を示す写真である。 dsRNA- LEU2を発現する S.ボンべ細胞の増殖を、 口イシ ン欠損培地 (LeiT)において調べた。
Bは、 S.ボンベにおける内因性 PCNA遺伝子の発現に及ぼす dsRNA誘導性 RNAiの '影響を示す写真である。 PCNAタンパク質レベルはウェスタンブロット分析によ つて検出された。 Radl 7は内因性対照である。
図 1 9は、 S.ボンベにおける s iRNA誘導性 RNAiの影響および RdRP活性の検出 を示す写真である。
Aは、 S.ボンベにおける外因性 Zeor遺伝子の発現に及ぼす s iRNA誘導性 RNAiの 影響を示す写真である。
Bは、 ピオチンプルダウン RT- PCR分析を用いた、 S.ボンベにおける yRdpl複合 体による伸長アンチセンス鎖 s iRNAの検出を示す図および写真である。 （レーン 1は Zeor遺伝子を発現する WT株、 レーン 2は 20mM s iRNA-Zeorで処理された WT 株、 レーン 3は Ze ( 遺伝子を発現する yrdp—株における 20mM s iRNA- Zeor、 レー ン 4は 20mM s iRNA-Zeorで処理された Zeor発現 S.ボンべ株）。 伸長アンチセンス 鎖 s iRNAは、 20mM s iRNA-Zeorで処理された Zeor発現 S.ボンべ株でしか検出され なかった。 Rad 17は内因性対照である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を実施例により具体的に説明するが、 本発明はこれら実施例に制 限されるものではない。
本実施例における実験材料、 および実験方法は下記の通りである。
( 1 ) 細胞培養とトランスフエクシヨン
SW480ヒト結腸癌細胞株を、 10%FBSを加えた L- 15培地 （ICNバイオメディ力 ルズインク、 オハイオ、 アメリカ） において培養した。 HeLa細胞を 10%FBSを 含む DMEM中で培養した。 トランスフエクシヨンは、 イフェクチン™試薬 （キア ゲン社、 ヒルデン、 ドイツ） によって製造元のプロトコールに従って実施した。 dsRNA発現 SW480および dsRNA発現 HeLa細胞は、 ピューロマイシンと共に 2週 間インキュベートすることによって選択した。
( 2 ) dsRNA発現プラスミドの構築
tRNA- dsRNAを発現するベクターを構築するために、 本発明者らは、 pPUR (ク ロンテック社、 カリフォルニア州、 アメリカ） の EcoRIと BamHI部位とのあいだ に、 tRNAVal (Koseki, S. et al . (1999) J. Vi rol. , 73, 1868-1877. ) に関するヒ ト遺伝子の化学合成されたプロモーターを含む P IR- NAプラスミドを用いた。 ループ 1 (5' -GAG CTC GGT AGT TGG AGC TGT TGG CGT AGG CAA GAG AAA ATC TTG CCT ACG CCA ACA GCT CCA ACT ACC GGT ACC-3' Z配列番号： 2 )を含む変異体 k - ras指向 dsRNAをコードする化学合成されたオリゴヌクレオチドを、 PCRによつ て二本鎖配列に増幅した。 Saclおよび Kpnlによる消化後、 断片を p JR-tRNAの tRNAプロモ一夕一の下流にクローニングした。 マウス U6プロモ一夕一から dsRNAを発現させるためのベクタ一の構築について、 dsRNA配列の揷入工程以外 は他の文献で述べられている OPl elm- Duj md ch, D. & Al tman, S. (1998) Pro Nat l . Acad. Sc i . USA, 95, 7327-7332. , Kato, Y， et al . (2001)
J. Biol . Chem.， 276, 15378-15385. ) Q ループ 1 (5' -GAA TTC GGT AGT TGG AGC TGT TGG CGT AGG CAA GAG AAA ATC TTG CCT ACG CCA ACA GCT CCA ACT ACC TCT AGA- 3'ノ配列番号： 3 )またはループ 2 (5' -GAA TTC GGT AGT TGG AGC TGT TGG CGT AGG CAA GAC UUC CUG UCA TCT TGC CTA CGC CAA CAG CTC CAA CTA CCC TCG AG - 3' Z配列番号： 4)を含む、 k- ras指向 dsRNAをコードする化学合成オリゴヌ クレオチドを、 特異的ァッププライマーおよびダウンプライマー（それぞれ、 EcoRIおよび Xholリンカ一配列を含む）を用いて、 二本鎖配列として PCRで増幅 した。 EcoRIおよび Xholで消化後、 断片をマウス U6遺伝子プロモーターの下流 にクロ一ニングした。 ヒト U6プロモー夕一の場合、 本発明者らは pTZ
U6+1 (Bert rand, E. et al . (1997) RNA, 3, 75-88. )を使用した。 ループ 1 (5' - GTC GAC GGT AGT TGG AGC TGT TGG CGT AGG CAA GAG AAA ATC TTG CCT ACG CCA ACA GCT CCA ACT ACC TCT AGA- 3' /配列番号： 5 )またはループ 2 (5' - GTC GAC GGT AGT TGG AGC TGT TGG CGT AGG CAA GAC UUC CUG UCA TCT TGC CTA CGC CAA CAG CTC CAA CTA CCT CTA GA-3' /配列番号： 6 )を含む、 k-ras指向性 dsRNAを コードする化学合成ォリゴヌクレオチドを、 特異的ァッププライマーおよびダウ ンプライマー（それぞれ、 Sai lおよび ¾alリンカ一配列を含む）を用いて、 二本 鎖配列として PCRで増幅した。 Sai lおよび Xbalで消化した後、 断片を pTZ U6+1 のヒト U6遺伝子プロモ一夕一の下流にクロ一ニングした。
( 3 ) Dicer指向リポザィム発現プラスミドおよび Dicer cDNA発現プラスミド の構築
ol I I I終結配列 (TTTTTT)を有する、 Dicer指向性リポザィム配列をコードする 化学合成オリゴヌクレオチド（5， -TCC CCG GTT CGA AAC CGG GCA CTA CAA AAA CCA ACT TTC AAA GAA AGC TGA TGA GGC CGA AAG GCC GAA ACC CAT TGG GGT ACC CCG GAT ATC TTT TTT- 3' Z配列番号： 7)を、 PCRによって二本鎖 DNAに変換し た。 Csp45Iおよび Pstlで消化後、 断片を、 UC-dt(Koseki, S.et al. (1999) J.Virol., 73, 1868—1877·、 Kawasaki H. , et al. (1998) Nature, 393, 284- 289·、 Kawasaki, H.， & Taira, K. (2002) EMBO rep., 3, 443- 450· )の tRNAプ 口モーターの下流にクロ—ニングした。 ポリ（A)連結リポザィムを作成するため に、 本発明者らは、 リポザィムと poll II終結配列との間に 100ヌクレオチドの ポリ（A)配列を挿入した（Kawasaki, H. , & Taira, K. (2002) EMBO rep., 3, 443-450. > Kawasaki, H. et al. (2002) Nature Biotechnol. , 0, 376— 380.、 Kawasaki, H. , & Taira, K. (2002) Nucleic Acids Res., 30, 3609 - 3614.、 Warashina, M. et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 5572-5577) 0
(4) 細胞の核分画と細胞質分画の調製
SW480細胞または HeLa細胞を細胞約 5X 個に増殖させ、 イフェクチン (登 録商標） 試薬 （キアゲン社、 ヒルデン、 ドイツ） によって tRNA-dsRNAまたは U6 - dsRNA発現べクタ一をトランスフエクトした。 トランスフエクションの 36時 間後、 細胞を回収した。 細胞質分画を調製するため、 回収した細胞を PBSによつ て 2回洗浄し、 ジギトニン溶解緩衝液 (50 mM HEPES/K0H, pH 7.5、 50 mM酢酸 カリウム、 8mM MgCl2、 2mM EGTA、 および 50 zg/mlジギトニン） 中に氷中で 10分間再浮遊させた。 溶解物を l,000Xgで遠心し、 上清を細胞質分画として回 収した。 ペレツトを NP-40溶解緩衝液 （20 mM トリス塩酸、 H 7.5、 50 mM KCL 10 mM NaCK ImM EDTA、 および 0.5%NP- 40) 中に再浮遊し、 氷中で 10分間維 持し、 得られた溶解物を核分画として用いた。
(5) ノーザンプロット分析
細胞質 RNAおよび核 RNAを抽出して、 IS0GEN試薬 （和光、 大阪、 日本） によ つて細包質分画および核分画からそれぞれ精製した。 1レーンあたり total RNA 30 gを 15 %ポリアクリルアミドゲルにローデイングした。 電気泳動後、 RNAの バンドをハイポンド- N (登録商標） ナイロンメンブレン （アマシャム社、 バツキ ンガムシヤー、 イギリス） に転写した。 k-ras遺伝子の配列と相補的な合成オリ ゴヌクレオチドによってメンプレンをプロ一ビングした。 合成プローブを T ポ リヌクレオチドキナーゼ (宝酒造、 京都、 日本） によって32 P標識した。
( 6 ) RT - PCR分析
RT - PCRは、 RNA PCR Ki t ver. 2 (夕カラ， Kyoto, Japan)と dicer上流 (nt .卜 24) プライマ一および下流 (nt. 435-459)プライマ一、 または対照として GADPH上流 (nt. 230-254)プライマーおよび下流（nt.442- 446)プライマーを用いて行った。 PCR産物を 2 %ァガロースゲルでの電気泳動によつて分析した。
( 7 ) ウエスタンプロット分析
個々の dsRM-発現べク夕一を卜ランスフエク卜した SW480細胞または HeLa細 胞を回収した。 蛋白質を SDS- PAGE (10%ポリアクリルアミド） によって分解し、 エレクトロブロッテイングによって PVDFメンブレン （フナコシ社、 東京、 日 本） に転写した。 免疫複合体は、 K_Ras (UBI、 カリフォルニア、 アメリカ） およ びァクチン （サンタクルーズ、 カリフォルニア、 アメリカ） を用いて特異的ポリ クロ一ナル抗体 ECLキット (アマシャム社、 バッキンガムシャ一、 イギリス） に よって可視化した。
( 8 ) インビ卜ロ RNAiアツセィ
標的 RNA切断に関して、 本発明者らは変異体 k-ras铸型 DNA (70nt) および正 常 k- ras铸型 DNA (70nt) を DNAシンセサイザ一によって合成した。 k- ras mRNA 基質を調製するため、 錶型 DNAを、 T7プロモータ一配列を含む k-ras特異的ァ ッププライマ一および k- ras特異的ダウンプライマーを用いて PCRによって増幅 した。 これらの増幅された k - ras DNA錶型を T7ポリメラーゼによって転写した。 転写された正常および変異体 k-ras mRNA基質を、 PAGEを用いて抽出した。 これ ら mRNAは、 T4ポリヌクレオチドキナーゼによって32 P標識した。 標的 RNA切断 を検出するために、 5〜10 nM標的 RNAを、 tRNA- dsRNAまたは U6- dsRNAを発現す る各 SW480細胞溶解物と共に、 標準的な条件下で （Zamore, P. et al. (2000) Cell, 101, 25-33.) 25でで 2時間インキュベートした。 k - ras mRNAにタ一ゲッ ティングされる siRNAの場合、 100 nM si RNAを SW480細胞溶解物において 5〜10 nM標的 RNAと共に標準的な条件下で (Zamore, P. et al. (2000) Cell, 101, 25-33.) 25°Cで 2時間インキュベートした。
(9) 細胞増殖速度の検出
各細胞系の増殖速度は、 細胞増殖キット IKRoche Ltd.，スイス）を用いて製造 業者の説明書に従つて測定した。
[実施例 1] ol IIIプロモーターによって制御される 2種類の dsRNA発現プ ラスミドの構築
長い dsRNAが核または細胞質で Dicerにより、 どのように作用するかは不明で あるため、 本発明者らは、 哺乳類細胞における dsRNAの発現のために 2種類の pol IIIプロモーター （ヒト tRNAValに関する遺伝子のプロモー夕一、 およびマ ウス U6プロモーターあるいはヒト U6プロモーター） を用いた。 適切にデザイン されれば、 tRNAValに関するヒト遺伝子のプロモータ一で生成される転写物を、 細胞質から効率よく輸送することができると考えられる。 対照的に、 U6プロモ 一夕の制御下での転写された小さい RNAsは、 核に存在する （Koseki, S.et al. (1999) J.Virol., 73, 1868-1877.) 。 次に、 本発明者らは、 伸長したステムル ープ RNA (図 1A) として dsRNAを tRNAValプロモーター （tRM- dsRNA) 、 マウ ス ϋ6プロモー夕 （mU6- dsRNA) またはヒト U6プロモー夕一 （ J6- dsRNA) の 3' 末端に結合させた。
本発明者らは、 k-ras遺伝子のコドン 12において点突然変異を有する K- Ras 変異体の mRNAを標的とした dsRNA発現プラスミドを構築した（図 1 B)。 長い dsRNA(>30mer)は mRNAの非特異的縮小を誘導するため（Manche， L. et al.
(1992) Mol. Cell. Biol. 12, 5238—5248.、 Minks, M. A. et al. (1979) J. Biol. Chem. 254, 10180-10183.)、 dsRNA 内の二本鎖領域の長さは 29bp とした ( U6に基づく構築物の場合、 本発明者らは、 ステムループ RNAの 2種類のループ モチーフを使用した。 一方は、 5ヌクレオチド（5'- GAMA-3')からなるループモ チーフ、 すなわちループ 1である（図 1 A)。 他方は、 マイクロ RNA (ヒト mir- 23 ;48) ループモチーフ、 すなわちループ 2である（図 1A)。 前駆体マイクロ RNAは輸送され、 処理されたマイク口 RNAは、 転写後遺伝子サイレンシングを務 めると考えられる（Lagos- Quintana, M. et al. (2001) Science, 294, 853-858. , Lee, Y. et al. (2002) EMB0 J, 21, 4663 - 4670.、 Grishok, A. et al. (2001) Cell, 106, 23-24. , Reinhart, B.J. et al. (2000) Nature, 403, 90卜 906·、 Lau, N.C. et al. (2001) Science, 294, 858-862.、 Lee, R.C. & Ambros, V. (2001) Science, 294, 862-864.、 Mourelatos, Z. et al. (2002) Genes Dev., 16" 720-728. )0
[実施例 2] t NAValプロモーター制御下の dsRNAの細胞質における Dicer複 合体による処理
RNAiにおいて、 長い dsRNAは、 長さが約 21および 22ヌクレオチドで、 RNァ —ゼ III様反応に従ってねじれた 3'末端を有する短い RNA二本鎖に処理される
(Bernstein, E. et al. (2001) Nature, 409, 363-366.) 。 tRNA - dsRNAおよび U6-dsRNAが哺乳類細胞において RNァ一ゼ III複合体によって処理されるか否か を調べるため、 本発明者らは、 k- ras mRNA特異的プローブを用いてノーザンブ ロット分析を行った。 tRNAValまたは U6プロモーターの制御下で、 SW480細胞に dsRNA発現プラスミドをトランスフエクトさせた。 トランスフエクションの 48 時間後、 細胞を回収して、 細胞質と核分画に分離した。 各分画の total UNAを単 離し、 15%ポリアクリルアミドゲルで分画した。 図 2に示すように、 tRNA- dsRNA を発現する細胞において、 処理された si Aが細胞質分画において検出されたが、 核分画では検出されなかった。 更に、 処理された siRNAsの配列は、 siRNAクロ 一二ングおよびシークェンシングによって確認された （データは示していない） 。 対照的に、 mU6- dsRNAまたは hU6- dsRNA (ループ 1)を発現する細胞では、 大部 分が処理されていない前駆体 dsRNAが核に検出された。 mU6_dsRNAまたは WJ6- dsRNA (ループ 1)を発現する細胞の核画分は siRNAをほとんど含まなかった。 し かし、 mU6- dsRNA (ループ 2)および MJ6- dsRNA (ループ 2)は細胞質へ輸送され、 効 率的に処理された（図 2)。
哺乳動物の Dicerの大部分が、 in '/ における免疫染色によって細胞質に検 出されている（Billy, E.et al. (2001) Pro Natl. Acad. Sci. USA, 98, 14428-14433. そのため、 細胞質へ輸送された tRNA- dsRNA、 mU6-ds腿 (ループ 2)、 および I6 - dsRNA (ループ 2)は、 Dicer様 RNaselll複合体によって処理され たと考えられる。
tRNA-dsRNAが Dicerによって処理されるかどうかを確認するために、 本発明 者らは、 ポリ（A)連結 Dicer指向リポザィム（Dicer-RzAlOO)発現プラスミドを構 築した。 次いで、 このプラスミドを HeLa細胞に安定に導入した。 安定な細胞系 はネオマイシンによる選抜によって得られた。 次に、 Dicer- RzAlOOによる dicer 遺伝子の発現抑制を調べるために、 dicer mRNA特異的プライマ一を用いて RT- PCR分析を行った。 図 3 Aに示すように、 Dicer- RzAlOO発現細胞における dicer mRNAレベルは、 WT_HeLa細胞における dicer mRNAレベルと比較して減少した。 対照である GADPH mRNAレベルは両細胞系において変化がなかった。 これらの結 果から、 Dicer- RzAlOOは dicer mRNAを特異的に切断することが分かった。
Dicerの減少が tRNA- dsRNAの処理に影響しているかどうかを調べるために、 本発明者らは、 tRNA - dsRNA発現細胞からの total RNAを用いてノーザンブロッ ト分析を行った。 図 3Bに示すように、 Dicer- RzAlOO発現細胞からの total RNA の場合、 tRNA- dsRNAから生じた siRNAは、 核および細胞質の両方において観察 されなかった。 従ってこれらの結果から、 tRNA - dsRNAが細胞質において Dicer により処理されることが示唆される。 対照的に、 Dicerの減少は、 mU6- dsRNA (ル ープ 1)の処理に影響しなかった。 従って、 mU6-dsRNA (ループ 1)の処理は、 別の RNaselll様酵素により行われている可能性がある。
[実施例 3] IRNA-dsRNA, U6- dsRNAあるいは合成 siRMを含む細胞抽出物を 用いた in vitro標的 mRNA分解
dsRNA-媒介遺伝子サイレンシングによる標的 mRNA分解がどの区画において起 こるかを調べるために、 本発明者らは、 tRNA- dsRNAの転写物を含む細胞抽出物 を用いて in vitro RNAiアツセィを行った。 これらアツセィにおいて、 本発明者 らは、 in w rりで T7ポリメラ一ゼによって基質として転写される変異体および 正常 k_ras部分的 mRNAを用いた。 標的 mRNAを切断するために、 各基質を、 tRNA- dsRNA発現ベクターをトランスフエクトした SW480細胞抽出物と共に で 2時間ィンキュベ一トした。 5'切断産物をシークェンシングゲル上で分解した。 図 4 Aに示すように、 変異体 k- ras mRNA基質は、 tRNA- dsRNAを含む細胞抽出物 の細胞質分画において切断された （レーン 4) 。 対照的に、 細胞抽出物の核分画 では、 基質は切断されなかった （レーン 3) 。 RNAi誘導サイレンシング複合体
(RNAi- induced silencing complex; RISC) はリボソーム分画に含まれることが 以前に報告されている (Zamore, P. et al. (2000) Cell, 101, 25 - 33.、
Bernstein, E. ei al. (2001) Nature, 409, 363-366. , Hammond, S.M. et al. (2001) Science, 293, 1146-1150.) が、 これらの結果はそれを支持するもの である。
これらの結果とは対照的に、 正常 k- ras mRNA基質の場合、 基質の 5'切断産物 は、 有意により少ない量が検出され、 tRNA- dsRNAの転写物を含む細胞抽出物の 細胞質分画のみに見られた （図 4A、 レーン 2) 。 これらの結果は、 siRNAの中 心部にミスマツチ塩基対 1個を有する合成 s iRNAでは、 ドロソフイラ ·メラノガ スター U osophila melanogaster) の溶解物と in vi tro RNAiアツセィを用い る標的 RNAの抑制効率が減少したという報告と一致した （Elbashir, S. . et al. (2001) EMBO J., 20, 6877-6888.) 。 本発明者らは、 tRNA- ds RNAから生成し た s i RMが、 シークェンシング分析によって s i RNAの中央の位置において正常な k-ras mRNA に対するミスマッチ塩基対を有することを確認した （データなし） c 変異体 k- ras mRNAにターゲッティングされる合成 siRNAsを用いて類似の結果を 得た （図 4B ； Hutvagner, G. & Zamore, P.D. (2002) Science, 297, 2056- 2060.) 。 このように、 本発明者らの結果により、 dsRNA媒介遺伝子サイレンシ ングによる標的 mRNA分解も同様に細胞質で起こり、 siRNAが中央の位置におけ る一つのミスマツチ塩基対を区別できることが示唆された。
[実施例 4] 結腸癌細胞における tRNA- dsRNAによる RNAiの有効性と特異性 ヒト結腸癌 SW480細胞における tRNA-dsRNAによる RNAiの特異性と有効性を調 ベるために、 本発明者らは、 tRNA- dsRNAおよび 4種類の U6- dsRNA発現プラスミ ドを SW480細胞および HeLa細胞に導入した。 変異体 k- ras遺伝子は SW480細胞 に限り発現した (Mitchell, C.E. et al. (1995) Anal Biochem. , 224, 148- 153.) 。 本発明者らは、 対照として正常な k-ras遺伝子を発現する HeLa細胞を 用いた。 次に、 本発明者らは、 ピューロマイシン選抜により、 tRNA-dsRNAまた は各 U6-dsRNAを発現する安定な細胞株を得た。
次に、 本発明者らは、 K- Ras特異的抗体を用いたウエスタンプロット分析によ り、 tRNA-または各 U6- dsRNAを発現する細胞における K-Ras蛋白質レベルをチェ ックした。 定量のため、 バンド強度を NIH Image Analysysを用いてデンシトメ トリ一により分析した。 図 5に示すように、 tRNA- dsRNA、 mU6 - dsRNA (ループ 2) あるいは hU6- dsRNA (ループ 2 ) を発現する SW480細胞の K- Ras蛋白質レべ ルは、 野生型 （WT) SW480細胞と比較して有意に減少したが、 mU6- dsRNA (ルー プ 1 ) あるいは hU6- dsRNA (ループ 1 ) を発現する SW480細胞における K_Ras蛋 白質レベルは、 野生型 SW480細胞と比較してほとんど変化しなかった。 内部対照 としてのァクチン蛋白質レベルは、 これらの細胞株において一定のままであった。 その上、 tRNA- dsRNAを発現する HeLa細胞において、 K_Ras蛋白質レベルは、 野 生型細胞および各 U6 - dsRNAを発現する細胞と比較して変化しなかった。 これら の結果は、 tRNA- dsRNAのヒト癌細胞における効率性および特異性の双方を明確 に示した。
次に、 tRNA-dsRNAを発現する細胞の表現型を調べるために、 本発明者らは、 これらの細胞株の増殖速度を分析した。 図 6に示すように、 tRNA-dsRNAを発現 する SW480細胞における増殖速度は、 野生型 SW480細胞より有意に遅かった。 対 照的に、 tRNA-dsRNAを発現する HeLa細胞における増殖速度は、 野生型 SW480細 胞と比較して変化なかった。 これらの結果は、 tRNA- dsRNAを発現する SW480細 胞における増殖速度の減少が、 細胞における K-Ras蛋白質レベルの減少と相関す ることを示した。 本発明者らの tRNA- dsRNAを変異体 k-rasに夕一ゲッティング することは、 治療物質としての潜在的有用性を有するであろう。
[実施例 5 ] ヒト Di cer遺伝子のクロ一ニングおよび組換えヒト Di cer (re- Di cer) の精製
特定の標的 mRMの中のさまざまな部位を夕一ゲットできる.不均一な s ί RNAを 調製するために、 ヒト細胞における RNAi に関与するヒト Di cerを用いた。 まず、 本発明者らは、 細菌発現系を使用して、 組換えヒト Dicer/HERNA (hDicer) を作 製した。
pBluescr iptベクタ一 （ストラタジーン社、 カリフォルニア、 米国） に組み込 まれた部分長ヒト di cer/HERNA遺伝子 （nt 379〜1657および nt 1390〜7037) を、 Dr.Matsuda (名古屋大学； Matsuda, S. , Ichigotani, Y. , Okuda, Τ. , Irimura, Τ. , Nakatsuga a, S. and Hamaguchi, Μ. (2000) . Molecular cloning and characterization of a novel human gene (HERNA) which encodes a putative RNA-helicase. Biochira. Biophys. Acta., 1490, 163-169.) より譲り受けた。 本 発明者らは、 特異的プライマ一 （フォワードプライマー： 5'-ATG AAA AGC CCT GCT TTG CAA CCC CT- 3' /配列番号： 8 ； リバ一スプライマ一： 5'-AGT TGC AGT TTC AGC ATT ACT CTT- 3' /配列番号： 9) を用いて、 HeLa cDNAライブラリ一か ら dicerの 5'末端側コード領域 （183〜902位の塩基） を PCRによって増幅し、 増幅された DNAを TAクロ一ニングベクター （インビトロジェン社、 カリフオル ニァ、 米国） にクローニングした。 そして、 前記部分長ヒト dicer (hDicer) cDNAから全長ヒト dicer遺伝子をクロ一ニングした。 次いで、 hDicerの全長 cDNAを切断し、 それらの平滑末端断片を、 組換えタンパク質の精製のためのビ ォチンタグを含有している Pinpoint (登録商標） - Xaベクタ一 （プロメガ社、 ゥ イスコンシン、 米国） へ EcoRV部位を用いてサブクローニングした。 次に、 hDicer 発現プラスミド （phDicer) を 2 M のピオチンとともに大腸菌へ導入し、 100 M IPTGにより発現を誘導した。 その後、 細胞を回収し、 5,000 卬 mで 10分 間遠心分離して沈殿させ、 細胞溶解用緩衝液 [100 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 1% Triton X- 100, Im DTT, 2 mM PMSF, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)] に再懸濁した。 次に、 製造業者のプロトコ一ルに従い、 ストレプトアビジンを結合させた SoftLink (登録商標） 樹脂 （プロメガ） を用いた 「プルダウン (puU-down) 」 法によって re_hDicerの調製液 （0.5 g) の等量液を精製し、 Xa因子プロテア ーゼを使用してピオチンタグから単離した。 この hDicerを、 SDS-PAGE (10%ポ リアクリルアミド） で分画し、 エレクトロブロッテイングによって PVDF膜 （フ ナコシ社、 東京、 日本） に転写した。 そして、 ECLキット （アマシャム社、 バッ キンガムシヤー、 イギリス) とストレプトアビジン ·アルカリホスファターゼを 使用して可視化するウエスタンプロッティングにより検出した。 その結果、 図 7 Aに示したように、 ピオチンタグを有する組換え hDicerが、 ウエスタンブロッテイングにより検出された。 re- hDicerの推定分子量は、 およ そ 220kDaである。 対照的に、 hDicer遺伝子をコードしていないモックベクタ一 では、 同タンパク質を得られなかった。 従って、 組換え hDicerは、 この発現系 を使用して作製されうることが分かった。
[実施例 6] インビトロ ·プロセシング ·アツセィ
次に、 組換え hDicerが RNasel II活性を有することを確認するため、 インビト 口転写により作製した長鎖 dsRNAを使用してインビトロ ·プロセシング ·アツセ ィを実施した。
まず、 基質として用いる長鎖 dsRNAを作製するため、 ピューロマイシン耐性遺 伝子 (nt ト 300) 、 H - ras遺伝子 (nt 370〜570) 、 c_jun遺伝子 (nt 1〜200) 、 および c- fos遺伝子 （nt 1〜200) を、 T7プロモーターを含む特異的フォワード プライマーと、 SP6プロモー夕一を含む特異的リバースプライマ一を用いて PCR により増幅した。 次いで、 T7 RNAポリメラ一ゼによりセンス鎖 RNA を生成させ、 SP6 RNAポリメラーゼによりアンチセンス鎖 RNAを生成させた。 ピューロマイシ ン耐性! nRNAおよび H- ras mRNAに対する siRNAは、 全て Japan Bio Service (JBioS) Co Ltd. (埼玉、 日本） により合成した。 次いで、 これらの RNAを標準 的な方法を使用してアニーリングさせた （Elbashir, S.M., Lendeckel, W. and Tuschl, T. (2001) RNA interference is mediated by 21- and 22 -直 leotide RNAs. Genes Dev. , 15, 188-200.) 。
hDicerの活性を調べるため、 10 gの dsRNAと 1 の re- hDicerを 200 1の 反応用緩衝液 [100 niM NaCl, 20 mM HEPES, 1 mM ATP, 5 mM MgClz, 50 mM Tris-HCl (pH 7.0)] の中で混合した。 上記 MgCl2は添加あるいは添加せずに使 用した。 この混合液を 37°Cで 30分間ィンキュベートした後、 20 1の反応混合 液を、 非変性 12%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動して分画した。 Syber (登 録商標） グリーン II試薬 （二ツボンジーン社、 富山、 日本） を用いて、 RNAバ ンドを検出した。 QIAquick (登録商標） ヌクレオチド除去用キット （QIAGEN社、 ヒルデン、 ドイツ） を用いて、 この反応混合液から 21〜23塩基長の siRNAを回 収した。 siRNAは、 エタノールで沈殿させてから、 TE緩衝液に溶解した。 260 nm における吸光度を測定して、 diced- siRNAの濃度を算定した。
結果、 図 7Bに示したように、 組換え hDicer の存在下では、 20〜25ntの siRNAが生成した。 対照的に、 組換え hDicer または Mg2+イオンの非存在下では、 これらの siRNAは検出されなかった （レーン 1および 3) 。 従って、 組換え hDicerは、 dsRNAプロセシング活性を有意に示し、 また re - hDicerは、 Mgwに依 存した dsRNAプロセッシング活性を示した。 昆虫細胞においても組換え hDicer がリポヌクレア一ゼ III活性を示すことが最近報告された (Harborth, J.et al., Identification oi essential genes in cultured mammalian eel Is using small interfering RNAs. J. Cell Sci. , 114, 4557-4565, (2001)、 Provost, P. et al. , Ribonuclease activity and RNA binding of recombinant human Dicer. EMB0 J" 21, 5864-5874, (2002)) 。
[実施例 7 ] ピュ一ロマイシン耐性遺伝子を標的とした d i c ed-s i RNAの効果 哺乳動物細胞において、 合成 21nt siRNAが、 レポーター遺伝子および内因性 遺伝子の両方の発現を有意に抑制することが知られている （Elbashir, S.M., Harborth, J. , Lendeckel, W. , Yalcin, A. , Weber, K. and Tuschl, T. (2001) Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in mammalian cell culture. Nature, 411， 494-498.； Harborth, J., Elbashir, S.M.， Bechert, K. , Tuschl, T. and Weber, K. (2001) . Identification of essential genes in cultured mammalian cells using small interfering RNAs. J. Cell Sci. , 114, 4557-4565.； Hoi en, T.， Amarzguioui, M. , Wiiger, M.T. , Babaie, E. and Prydz, H. (2002). Positional effects of short interfering RNAs targeting the human coagulation trigger Tissue Factor. Nucleic Acids Res., 30, 1757-1766.) 。 長鎖 dsRNA (>30nt) は、 IFNにより媒介される防御 経路に関与している PKRおよび 2' , 5' -オリゴアデニル酸合成酵素を活性化する が、 これらの比較的短い siRNAは、 これらの酵素の活性化を回避するとともに、 RNAi経路を活性化することができる。 従って、 これらの siRNAは、 遺伝子発現 における配列特異的遺伝子サイレンシングに有用である。 しかしながら、 siRNA は標的部位依存性を有することが報告されており (Holen, T. , Amarzguioui, M. , Wiiger, Μ.Τ. , Babaie, Ε. and Prydz, Η. (2002) . Posi tional effects of short interfering RNAs targeting the human coagulation trigger Tissue Factor. Nucleic Acids Res., 30, 1757-1766.) 、 最高の (効率的な) 標的部位 を予測することは極めて困難である。 siRNAの標的部位依存性は、 ヒト組織因子
(hTF) 遺伝子でしか調査されていないため (Holen, T. , Amarzguioui, M. , Wiiger, Μ.Τ. , Babaie, Ε. and Prydz, Η. (2002). Positional effects of short interfering RNAs targeting the human coagulation trigger Tissue Factor. Nucleic Acids Res., 30, 1757-1766.) 、 本発明者らは、 さらに、 ピュ —ロマイシン耐性遺伝子を標的とする siRNAの標的部位依存性を、 この遺伝子内 の以下に示す 10個の標的部位 （部位 1〜10) を選択することにより検討した
(図 8 Aおよび 8 B) 。
部位 1 : 5'- ATG ACC GAG TAG AAG CCC A _3' Z配列番号 10
部位 2： 5' - CTC GCC ACC CGC GAC GAC G -3' Z配列'番号 1 1
部位 3 : 5'- CAC CGT CGA CCC GGA CCG C -3' /配列番号 12
部位 4 : 5'- GAA CTC TTC CTC ACG CGC G -3' /配列番号 13
M I 立 5 : 5'- GGT GTG GGT CGC GGA CGA C -3' /配列番号 14
部位 6： 5' _ CAG ATG GAA GGC CTC CTG G -3' /配列番号 15
部位 7： 5' - GGA GCC CGC GTG GTT CCT G -3' 配列番号 16
部位 8 : 5'- GGG TCT GGG CAG CGC CGT C -3' /配列番号 17 部位 9： 5'- CCT CCC CTT CTA CGA GCG G - 3' Z配列番号： 1 8 ;
部位 10： 5'- GCC CGG TGC CTG ACG CCC G -3' Z配列番号： 19
GL3-ルシフェラーゼを標的とする siRNAを、 対照として使用した。 diced- siRNA構築のため、 ピュー口マイシン耐性遺伝子の部分長 mRNAのセンス鎖およ びアンチセンス鎖 （l〜300nt) の両方を、 T7 RNAポリメラーゼおよび SP6 RNA ポリメラーゼによりインビトロで転写し、 次いで組換え hDicer により処理した。 dsRNAをインビトロで断片ィヒしてから、 QIAquick (登録商標） ヌクレオチド除去 用キットを用いてゲル抽出法により diced-siRNAを精製した。 次に、 各 siRNA (20 nM) およびピュ一ロマイシン耐性遺伝子発現プラスミドを、 Oligofectamin (登録商標） (インビトロジェン社) 試薬を使用して製造業者の指示に従い、 HeLa細胞へ導入した。 HeLa細胞は、 10%FBSを添加した DMEM中で培養した。 36 時間後、 HeLa細胞をピューロマイシンで処理し、 細胞生存率をトリパンブルー 染色を使用して測定した。 各 siRNAの形質転換効率は、 Renillaルシフェラ一 ゼ*レポーター遺伝子を用いて測定した。
図 8 Bに示すように、 GL3ルシフェラーゼを標的とする siRNAの存在下では、 細胞生存率は、 野生型 HeLa細胞と比較して変化がなかった。 部位 2、 部位 3、 部 位 4、 部位 5、 および部位 10に対し特異的な siRNAで処理した細胞の生存率は、 野生型細胞と比較して有意に減少していた。 対照的に、 部位 1、 部位 6、 部位 7、 部位 8、 および部位 9に対する siRNAは、 比較的低い阻害活性を示した。
これらの結果は、 ピューロマイシン耐性遺伝子に特異的な s NAの効率は、 標 的 mRNA内の標的部位に依存していることを示している。 予想通り、 特定の mRNA に対し制限を設けない夕一ゲッティング部位からなる diced- siRNAは、 何れの特 異的な siRNAよりも、 または、 部位 部位 2、 部位 3、 部位 4、 および部位 5の siRNAを混合したものよりも効率的であった。
さらに、 標的部位の GC含量および標的遺伝子の二次構造を解析したところ、 mfoidプログラムの予想によれば （図 8 B:Zuker， M. et al., Algorithms and Thermodynamics for RNA Secondary Structure Prediction: A Practical Guide. RNA Biochemistry and Biotechnology, Barciszewski, J. , & Clark, B. F. C. (eds), Kluwer Academic Publishers, Hingham, MA, USA. (1999)) 二次構造ま たは GC含量 （表 1) のいずれも、 標的部位の有効性の高さに明確に相関関係が あるとは認められなかつた。
表 1
Figure imgf000050_0001
標的遺伝子の場合には、 標的遺伝子の 20〜280 nt領域、 および 3'末端近傍領 域を標的とする siRNAが、 試験した限りでは他のものと比べても、 かなり効率的 であった。
[実施例 8] H-ras遺伝子を標的とした diced-siRNAの効果
さらに、 内因性遺伝子発現に対する diced- siRNAの効果を確認するため、 標的 として H- ras遺伝子を選択した。 H- ras遺伝子は、 K - rasおよび N- rasも含む ras遺伝子ファミリ一のメンバ一である （Adjei, A. A. (2001). Blocking oncogenic Ras signaling for cancer therapy. J.Natl. Cancer Inst. , 93， 1062-1074.) 。 また、 siRNAの標的部位依存性を確認するため、 H- ras遺伝子内 の以下に示す 10個の標的部位 （部位 1〜10) を選択した （図 9 Aおよび 9 B) 部位 1： 5' _ ATG ACG GAA TAT AAG CTT G -3' Z配列番号： 20 ;
部位 2 : 5'- GTT GGC GCC GGC GGT GTG G -3'/配列番号： 21 ; 部位 3 : 5'- TAC GAC CCC ACT ATA GAG G -3' /配列番号： 22
部位 : 5'- AGG AGG AGT ACA GCG CCA T 3' Z配列番号： 23
部位 5 : 5'- CAA CAC CAA GTC TTT TGA G -3' Z配列番号： 24
部位 6： 5' - GGA CTC GGA TGA CGT GCC C -3' Z配列番号： 25
部位 7： 5' - TCT CGG CAG GCT CAG GAC C 3' 配列番号： 26
部位 8 : 5'- GAC CCG GCA GGG AGT GGA G -3' Z配列番号： 27
部位 9： 5' - GCT GCG GAA GCT GAA CCC T -3' Z配列番号： 28
部位 10： 5' - GTG TGT GCT CTC CTG AGG A -3' Z配列番号： 29
diced-siRNAを構築するため、 まず H- ras遺伝子における他 rasファミリーメ ンバーとの相同性が低い領域を探索した。 H-ras遺伝子の 3'領域に相当する領域 (300〜500nt) を長鎖 dsRNA基質として選択し、 組換え hDicerにより処理した。 H- ras遺伝子を標的とする diced- siRNAを、 実施例 6と同様の方法により作製し た。 各 siRNA (20 nM) を、 01 igoiectamin (登録商標） 試薬 （インビトロジェン 社） を使用して製造業者の指示に従い、 HeLa細胞へ導入した。 36時間後、 各 siRNAでトランスフエクトされた HeLa細胞を収集し、 各細胞から全タンパク質 を抽出した。 H- Rasタンパク質のレベルを、 H- ras特異的抗体を用いてゥエスタ ンブロッテイングにより検出した。 内部対照としてァクチンを使用した。 詳しく は、 H- Rasタンパク質を SDS-PAGE (10%ポリアクリルアミド） により分画してか ら、 エレクトロブロッテイングにより PVDF膜 （フナコシ社、 東京、 日本） へと 転写した。 H - Ras、 N - Ras、 K- Ras、 c-Jun、 c-Fos, および、 内部対照としてのァ クチンに対する特異的ポリクローナル抗体 （抗 H- Rasポリクロ一ナル抗体： Oncogene Research Products社製、 カリフォルニア、 米国；抗 N- Rasポリクロ —ナル抗体： Oncogene Research Products社製；抗 K- Rasポリクローナル抗 体 ·· Oncogene Research Products社製、 抗 c— Junポリクローナレ抗体 ·· Santa Cruz Biotechnology社製、 サンタクルーズ、 カリフォルニア、 米国；抗 c- Fos ポリクローナル抗体 （Santa Cruz Biotechnology社製） ；および抗ァクチンポ リクローナル抗体： Oncogene Research Products社製） を用い、 ECL (登録商 標） キットによって、 免疫複合体を可視化した。 デンシトメトリーおよび NIH Image Analysisによって定量化を行った。
結果、 図 9 Cに示したように、 部位 2、 部位 3、 部位 4、 部位 5および部位 9 に対する siRNAで処理された細胞においては、 H-Rasのレベルが、 野生型 HeLa 細胞と比較して有意に減少していた。 対照的に、 部位 1、 部位 6、 部位 7、 およ び部位 8に対する siRNAは、 比較的低い阻害活性を示した。
ァクチンのレベルを参照して結果を標準化したところ、 siRNAの効率は、 内因 性 H-ras遺伝子における標的部位に依存することを示している。 ピュ一ロマイシ ン耐性遺伝子の場合も、 H- ras遺伝子の場合にも、 これらの遺伝子の中央の領域 を標的とした合成 siRNAの効率は低かった。 diced-siRNAについては、 調べた限 りでは、 他の siRNAのいずれよりも有効であり、 また、 H-ras遺伝子を標的とす る siRNAを混合したもの （部位 7、 部位 8、 部位 9および部位 10の siRNA) より も有効であった。
さらに、 diced- siRNA処理細胞における、 関連タンパク質 K- Rasおよび N-Ras のレベルは、 野生型 HeLa細胞と比較して変化がなかった （図 9D) 。 従って、 diced-siRNAは、 K- ras遺伝子の発現にも N- ras遺伝子の発現にも影響を与えな かった。
さらに、 図 8 Bに示したものと同様の構造解析を行ったが （図 9B) 、 GC含 量 （表 1) と siRNAによる阻害程度とが相関することを示せなかった。 以前の研 究で得られた結果は、 siRNA、 オリゴヌクレオチド、 およびリポザィムの効果に は共通の特徴があることを示唆していたため （Miyagishi, M. et al.,
Comparison of the suppressive effects of antisense oligonucleotides and siRNAs directed against the same targets in mammalian eel Is. Antisense Nucleic Acid Drug Develop., in press. (2003)) 、 このような推定上の関係を より正確に調べるためには、 （例えば、 図 9 Bに示したコンピュータ予測による 二次構造よりも） インビト口およびインビボにおける標的 mRNAとの接触可能性 に関する実験データがさらに必要になる可能性が高いと考えられる。 ここでも、 H_rasの場合には、 標的遺伝子の一定の領域 （20〜280 nt、 および 3'末端近傍） を標的とする siRNAが、 他の領域を標的とする siRNAよりも有効であり、 また、 ここでも、 断片化した siRNAの方が、 各 siRNAや混合 siRNAよりもずつと有効で あった （図 9 C) 。 これらの結果は、 ピューロマイシン耐性遺伝子で得られた結 果と同様であった。 diced-siRNAの方が各 siRNAより活性が高いのは、 単に、 メ ッセンジャー RNA上の多数の部位を標的とすることの相加効果によるとも考えら れる。 しかし、 siRNAを混合したもの （部位 7、 部位 8、 部位 9および部位 10の siRNA) による結果は、 この解釈を裏付けられなかった。 それよりも、 siRNAの 効果は、 標的部位の僅かな違いによっても （ほんの数塩基異なるだけでも） 変化 するという可能性の方が高く、 そのため、 diced- siRNAは、 各 siRNAの組み合わ せよりも、 更に有効性の高い siRNA集団をいくつか含んでいると考えられる。 こ れらの結果は、 diced-siRNAが、 個々の合成 siRNAよりも明らかに有益であるこ とを示唆するものである。
[実施例 9] c-jun mRNA又は c- fos mRNAを標的とした diced- siRNAの効果 さらに、 diced- siRNAの効果を確認するため、 本発明者らは c- jun mRNA又は c-fos mRNAそれぞれに対する diced- siRNAを構築した。 まず、 c- jun遺伝子 （1 〜200nt) 、 又は c_fos遺伝子 （l〜200nt) の 5'領域に相当する長鎖 dsRNAを作 製し、 次いで組換え hDicerにより処理した。 diced- siRNAは、 実施例 6と同様 の方法を使用して作製した。 次いで、 これらの diced-siRNAを HeLa細胞へ導入 した。 36 時間後、 これらの細胞を収集し、 各細胞から全タンパク質を抽出した。 c - Junタンパク質又は c- Fosタンパク質のレベルを、 各特異的抗体を用いたゥェ スタンプロッティングを使用して検出した。
その結果、 図 10に示すように、 diced-siRNAで形質転換した細胞においては、 c-Junのレベルが、 野生型 HeLa細胞と比較して有意に減少していた。 形質転換 細胞でも野生型細胞でも、 ァクチンの発現レベルは変化しなかった。 同様の結果 が、 c-fos mRNAに対する diced-s iRNAの場合にも得られた。
これらの結果より、 diced-s iRNAが、 ヒト細胞において特定の遺伝子をサイレ ンシング状態にするのに極めて有用である可能性が示された。
[実施例 1 0 ] 種々の shRNAをコ一ドするプラスミドの構築
本発明者らは、 shRNA、 すなわち、 tRNAValプロモーターに基づく shRNA
(tRNAi) 、 ヒト U6プロモータ一に基づく shRNA (hU6i) 、 およびマウス U6プ 口モー夕—に基づく shRNA (mU6i) の 3種類の tRNA- shRNA発現用のベクターを 構築した。 pPUR (クロンテック (C Ion tech) , CA, USA) の EcoRI部位と BamHI部 位との間に、 ヒト NAVal遺伝子の化学合成プロモータ一を含む pPUR- tRNAプラ スミドを使用した。 これら構築物は、 各々ヒト erbB2遺伝子の転写物を標的とし たものである （図 1 1 A)。
本発明者らは、 erbB2 mRNA内に 5つの標的部位 （部位 1 : 5' -AAG UGU GCA CCG GCA CAG ACA UGA AGC UG-3' ノ配列番号： 3 1、 部位 2 : 5， -ACC CAC CUG GAC AUG CUC CGC CAC CUC UA-3' /配列番号： 3 2、 部位 3 : 5 ' -UGC UCA UCG CUC ACA ACC AAG UGA GGC AG-3' /配列番号： 3 3、 部位 4: 5， -AAG AUG CGG AAG UAC ACG AUG CGG AGA CU-3' /配列番号： 3 4、 部位 5 : 5， -GAC ACA GCU UAU GCC CUA UGG CUG CCU CU-3' Z配列番号： 3 5 ) 、 および GFP mRNA内に 1つの 部位（5， -GGC AAG CUG ACC CUG AAG UUC ATC TGC AC- 3' /配列番号： 3 6 )を 選択した（図 1 1 B)。 ループ配列（5 ' -GAAAA-3' )で連結された、 センス鎖（29nt) およびアンチセンス鎖（29nt) erbB2遺伝子をコードする化学合成オリゴヌクレオ チドを、 特異的アッププライマ一およびダウンプライマーを用いて二本鎖配列と して PCRで増幅した。 Saclおよび Kpnlで消化した後、 断片を、 pPUR- tRNAの tRNA遺伝子プロモータ一下流にクローニングした。 mU6および MJ6プロモーター からの dsRNA発現用のベクターの構築は文献 （Tuschl, T. Expanding small RNA interference. , Nature Biotechnol., 20, 446-448 (2002). , Kato, Y. ,
Kuwabara, T. , Warashina, M.， Toda, H. , & Taira, K. Relationships between the activities in vitro and in vivo of various kinds of ribozyme and their intracellular localization in mammalian eel Is. J. Biol. Chem.， 276, 15378-15385 (2001). , Ohkawa, J. , & Taira, K. Control of the functional activity of an antisense RNA by a tetracycl ine-responsive derivative of the human U6 snRNA promoter. Human Gene Therapy 11, 577-585 (2000).) に 記載されている。
[実施例 11] 細胞の培養および卜ランスフエクシヨン
MCF-7ヒト乳癌細胞は、 10%FBS、 1%非必須アミノ酸溶液、 および ImMピルビ ン酸ナトリゥムを添加した MEM (アイシ一ェヌバイオメディカルズ（ICN
Biomedicals, Inc. )， USA)中で培養した。
MCF-7細胞を約 5X106細胞/ 10cmディッシュまで増殖させ、 次いで、
Effectin (商標）試薬（キアゲン）を用いて tRNA- dsRNA、 hU6-dsRNA、 または mU6- dsRNA発現べクタ一でトランスフエクトした。
ピューロマイシンと 2週間インキュべ一ションし、 安定して tRNA- shRNAまた は U6_shRNAを発現する形質転換 MCF- 7細胞を選択した。
[実施例 12] 細胞の核画分および細胞質画分の調製
トランスフエクシヨンの 36時間後に、 細胞を採取した。 細胞質画分を調製す るために、 収集した細胞を PBSで 2回洗浄し、 次いで、 ジギトニン溶解緩衝液 (50mM HEPES/K0H(pH7.5) 50mM酢酸カリウム、 8mM MgCl2、 2mM EGTA、 および 50 M/mlジギトニン）に氷上で 10分間、 再懸濁した。 溶解産物を 1 , 000 X gで遠心 分離し、 上清を細胞質画分として収集した。 また、 ペレツトを、 NP - 40溶解緩衝液（20niM Tris—HCl (pH7.5)、 50mM KC1、 lOmM NaCK ImM EDTA、 および 0.5%NP- 40)に再懸濁し、 氷上で 10分間、 保持し た。 結果として得られた溶解産物を核画分として使用した。
[実施例 1 3 ] MCF-7細胞における shRNAの発現確認
さらに実施例 1 1で得られた形質転換 MCF - 7細胞において、 様々な shRNAの発 現を確認した。 細胞質 RNAおよび核 RNAを抽出し、 IS0GEN (商標） 試薬 （和光純 薬工業 （Wako)、 大阪、 日本） を用いて、 それぞれ細胞質画分および核画分を精 製した。 レーン 1つにつき 30マイクログラムの総 RNAを電気泳動のために 12% ポリアクリルアミドゲルにロードし、 この後、 RNAのバンドを、 Hybond-N (商 標）ナイロン膜 （アマシャム （Amersham Co. ), Buckinghamshire, UK)に転写した。 膜を、 erbB2遺伝子内の配列に相補的な合成オリゴヌクレオチド （5' -AAG TGT GCA CCG GCA CAG ACA TGA AGC TG-3' Z配列番号： 37)でプローブした。 それ ぞれの合成プローブは、 AlkPhos Direct Labelling and Detectionシステム
(アマシャム）を用いて標識した。
結果、 図 1 1Cに示すように、 tRNA- shRNA発現細胞の細胞質において、 前駆体 shRNAおよびプロセシングされた siRNAを検出した （レーン 2) 。 対照的に、 hU6-shRNAまたは mU6- shRNA発現細胞の核において、 前駆体 shRNAおよび少量の siRNAを検出したが （レーン 3および 5) 、 細胞質では検出しなかった （レーン 4および 6) 。
これらの結果から、 tRNA-shRNAが細胞質に効率的に輸送されたことが分かり、 siRNAが Dicerによつて前駆体 shRNAから生成された可能性があることが示唆さ れた。
[実施例 14] tRNA-shRNAの発現調節のためのテ卜ラサイクリン依存誘導系 の構築 テトラサイクリン依存誘導系を構築するために、 7コピーのテトラサイクリン オペレーター配列 （5， -TTT ACC ACT CCC TAT CAG TGA TAG AGA AAA GTG AAA GTC GAG-3 ' Z配列番号： 3 8 ) を、 pPUR- tRNA- shRNAの tRNAプロモ一ター下 流に挿入した。 MCF-7-TR細胞系を構築するために、 テトラサイクリンリブレツ サ一遺伝子をコードする pTet-Tt s (クロンテック）を、 ネオマイシン耐性遺伝子 をコードする pcDNA3.卜 neo (インビトロゲン （Invi t rogen) , CA，USA) と共に MCF-7細胞に導入した。 MCF-7- TR細胞系はネオマイシンによる選択によって得た。 tRNA-shRNAの発現調節のために、 本発明者らは、 shRNA転写の誘導物質として 様々な濃度のドキシサイクリン （クロンテック）を使用した。
[実施例 1 5 ] erbB2遺伝子発現に対する shRNAの影響
MCF-7細胞で erbB2遺伝子発現に対する shRNAの影響、 すなわち、 tRNAi- ErB2、 MJ6 i-ErB2、 および mU6i-ErB2の影響を調べるために、 ErB2特異的抗体を用いて 個々の shRNAをコードするべクタ一でトランスフエクトされた MCF- 7細胞を収 集した。 タンパク質を SDSHPAGE (10%ポリアクリルアミド）によって分離し、 ェ レクトロブロッテイングによって PVDF膜 （フナコシ （Funakoshi Co. ) , 東京、 日本） に転写した。 ECL検出キット （アマシャム）ならびに ErbB2に対するポリ クローナル抗体 （オンコジーン （Oncogene)，CA, USA) および内因性対照としてァ クチンに対するポリクローナル抗体 （オンコジーン）を用いて、 免疫複合体を視 覚化した。 定量のために、 バンドの強度を、 NIH Image Analys i sプログラムを 用いてデンシトメトリーによって分析した。 ErbB2タンパク質レベルはァクチン レベルを用いて標準化した。
結果、 図 1 1 Dに示すように、 tRNAi- ErB2 (部位 2および 3に向けられる） 、 hU6 i-ErB2 (部位 2)、 および mU6 i- ErB2 (部位 2)を発現する MCF- 7細胞における ErB2タンパク質レベルは、 野生型 MCF- 7細胞より有意に少なかった。 さらに、 その効果は標的部位の選択によって左右されたが、 tRNAi- ErB2の影響は少なく とも J6i-ErB2の影響と同程度、 あるいはそれ以上だった。 内因性対照として選 択されたァクチンのレベルは、 全ての細胞系において一定のままであった。 これ らの結果から、 erbB2転写物に対する RNAiにおいて細胞質 tRNA-shRNAの有用性 がはっきりと証明された。
[実施例 1 6] tRNA-shRNA発現トランスジエニックマウス
さらに、 本発明者らは、 本発明の tRNA-shRNAがマウスにおいて機能し得るか どうかを、 tRNA- shRNA を発現するトランスジエニックマウスを作製して調べた。 緑色蛍光タンパク質 （GFP) (Okabe M,， Ikawa . Kominami K. Nakanishi T.， & Nishi醒 e Y. ' Green mice' as a source of ubiquitous green eel Is. FEBS Lett., 407, 313-319 (1997).) の遺伝子を有するトランスジエニックマウスを 使用し、 この遺伝子を、 tRNA-shRNA (tRNAi-E126)、 J6- shRNA (hU6- E126)、 お よび mU6- shRNA 0nU6_E126)の標的として使用した （図 12 A;E126は GFP遺伝子 配列の一部である）。 tRNAi-E126、 mU6- E126、 および mU6-E126をそれぞれコード する発現プラスミドの精製 Sail断片を、 GFP発現雄マウス （Baer， M. , Nilsen, T. W. , Costigan, C. , & Altman, S. Structure and transcription of a human gene for HI RNA, the RNA component of human RNase P. Nucleic Acids Res. 18, 97-103 (1990)) からの精子と受精させた野生型卵に注入した。 次いで、 100 個の DNA注入卵を偽妊娠マウスに移植した。 トランスジーンが組み込まれたこと はサザンブロッテイング分析で調べた。 注入卵から、 tRNAi- E126、 mU6- E126、 お よび mU6-E126をそれぞれ発現するトランスジエニック 8細胞桑実胚および胚盤 胞を発生させた。 これらの細胞における GFP発現を調べるために、 緑色蛍光の検 出を紫外線 （254nm) 照射によって行った。 さらに、 生まれて 3日後の tRNA- shRNAトランスジエニックマウスに紫外線 (254nm)を照射した。 紫外線下、 デジ タルカードカメラ （DS- 505; Fuji X, Japan) (フィル夕一なし）を用いて写真を撮影 した。
結果、 図 1 2 Bに示すように、 tRNAi-E126を発現する桑実胚に紫外線を照射し た時、 桑実胚は緑色蛍光を発した。 対照的に、 mU6- E126または mU6-E126を発現 する桑実胚は緑色蛍光を発した。 同様の結果が胚盤胞期で得られたことから （図
1 3 A)、 tRNAi - E126の効力が保持されていることが分かった。 さらに、 tRNAi- E126トランスジエニックマウス新生仔が発する緑色蛍光は、 π (GFP発現）マウ スより有意に少なかった （図 1 3 B)。 これらの結果から、 tRNAi_E126は、 8細胞 桑実胚および胚盤胞だけでなくマウス新生仔においても配列特異的ジーンサイレ ンシングを誘導することが分かつた。
[実施例 1 7 ] RNAi誘導発現系の開発
次に、 本発明者らは、 tRNAiの潜在的な有用性を考慮し、 将来ハウスキーピン グ遺伝子の機能分析を目標として、 RNAiの誘導発現系の開発を試みた。 詳細に 述べると、 本発明者らは、 tRNAValプロモータ一に取り付けた Tet07を用いて tRNAi発現の制御を試みた （図 1 4および 1 5 ) 。 Tet07系は、 遺伝子発現の 「オン/オフ」 スィッチとして機能する。
まず、 本発明者らは、 Te t07を tRNAValプロモーターに取り付けたベクター、 およびテトラサイクリン応答リブレッサー （ t TS；クロンテック（C 1 on t ech) )を発 現する安定な MCF-7細胞系 (MCF-7- TR)を構築した。 次いで、 テトラサイクリンに 関連した試薬であるドキシサイクリン (Dox)の存在下および非存在下で tRNAi - ErbB2の発現を調べた。 図 1 4 Bに示すように、 Dox非存在下の MCF- 7-TR細胞で は、 tRNAi- ErbB2の発現はごくわずかであった（レーン 3)。 対照的に、 Dox存在 下の細胞では、 かなりのレベルの前駆体 shRNAおよび s iRNAが検出された（レ一 ン 4)。 これらの結果から、 本発明のテトラサイクリン誘導系は tRNAi - ErbB2の 発現調節が可能であることが分かつた。
本発明者らはまた、 Doxに対する用量反応を調べた （図 1 5 A) 。 tRNAi-ErbB2 を発現する細胞を、 様々な濃度の Doxと共に 72時間培養し、 次いで、 転写物の レベルを RT- PCRによって分析した。 tRNAi- ErbB2は、 培地中に lng/mlというわ ずかな Doxにより、 誘導が検出された。 Dox濃度が増加するにつれて、 転写物の レベルは急速に増加し、 100ng/mlで完全に活性化した。 この用量は、 Te t07非存 在系における Dox活性化レベルの 80%と等しかった。 さらに、 この飽和濃度の Doxでは、 培養細胞の増殖挙動および形態に明らかな変化はなかった。
Te t07-tRNAi-ErbB の影響を確かめるために、 本発明者らはウェスタンブロッ ティング分析を行った。 図 1 5 Bに示すように、 Dox非存在下では、 Te t07- tRNAi-ErbB2構築物を含む細胞における ErbB2タンパク質レベルは WT MCF-7-TR 細胞と同様であった。 対照的に、 Dox存在下では、 ErbB2タンパク質レベルは WT MCF-7-TR細胞より有意に少なかった。 これらの結果から、 本発明者らのテトラ サイクリン誘導系は tRNAi-ErbB2の機能調節を可能にしたことが分かった。 tRNAi- ErbB2の影響は、 予想されるように、 Doxと無関係である。
本発明において、 本発明者らは、 tRNA-shRNAが細胞質に局在する、 tRNAに基 づく RNAi発現系を構築した。
〔実施例 1 8〕 酵母株および培養
本発明では、 S.ボンべ TCP1株 （インビトロゲン （Invi t rogen) , CA, USA) およ び S.セレピシェ EGY48株 （インビトロゲン， CA, USA)を使用した。
ydcr l—および yrdpl—欠失株は ura4遺伝子の相同組換えによって作成した。 こ れらの欠失株を、 それぞれ ydcr l、 yrdpK および ura4遺伝子の特異的プライマ —を用いた RT- PCR分析によって確認した。
LacZ遺伝子を発現する S.ボンべは、 LacZ遺伝子および nmtプロモータ一を含 む pNMT- LacZベクターを用いて調製した。
LacZ遺伝子を発現する S.セレピシェは、 pYes 2- LacZプラスミド （インビトロ ゲン） を細胞に導入した。 これらの酵母株は、 酵母エキス/ペプトン/デキストロ ース （YPD)培地にて増殖させた。 様々な dsRNAまたは外因性遺伝子を発現する株 の選択には、 -Leu、 - Trp、 または- Ura Do Supplement (クロンテック
(Clontech) , CA, USA) を含む合成デキストロース （SD)培地を使用した。 ゼォシン 耐性遺伝子を発現する株は、 50 i g/mlゼォシン （インビトロゲン）を含む YPD培 地において選択した。
〔実施例 1 9〕 dsRNA発現プラスミドの構築
外因的に発現された長い dsRNAが、 S.ボンベおよび S.セレピシェにおいて RNAiを介する遺伝子サイレンシングを誘導するかどうかを確かめるために、 本 発明者らは、 S.ボンベおよび S.セレピシェにおける dsRNA発現ベクターをそれ ぞれ構築した。 （図 1 6 A)。 本発明者らは、 これらの dsRNAの標的として外因性 LEU2遺伝子、 LacZ遺伝子、 および内因性 PCNA遺伝子を選択した。 S.ボンべ (pSPi)において、 LEU2- ds醒、 PCNA- dsRNA、 および LacZ- dsRNA(300nt)の発現は、 nmt lプロモータ一によって制御される。 S.セレピシェ（pSCi)において、 LacZ- dsRNA(300nt)の発現は、 GAL1プロモ一夕一によつて制御される。
S.ボンベにおける dsRNA発現用べクタ一構築には、 nmtプロモータ一を含む ρΝΜΤ-ΤΟΡΟクローニングキット（インビトロゲン）を使用した。 LEU2 (nt.卜 300)、 PCNAdit. 1050-1350)、 または LacZ (部位 A(nt. 1-300)：部位 B [nt. 1000-1300)；部 位 C (nt. 2000-2300)]をコードするセンス鎖 DNAを、 特異的アッププライマー
[LEU2 (5' -ATG TCT GCC CCT ATG TCT GCC CCT-3' Z配列番号： 3
9 ) ;PCNA(5 ' -ACA ACG GTA TCT CTC TGC AGG CTA-3' Z配列番号： 4 0 ) ;LacZ- 部位 Α(5' -ATG ATA GAT CCC GTC GTT TTA CAA-3' Z配列番号： 4 1 ) ;LacZ -部 位 B(5， - GAA AAT GGT CTG CTG CTG CTG AAC-3' /配列番号： 4 2 )； LacZ-部位 C (5， -ATG TCG CTC CAC AAG GTA AAC AGT-3' Z配列番号： 4 3 )]、 および Xhol部位を有するダウンプライマー [LEU2 (5 ' -GAT TTT TAG TAA ACC TTG TTC AGG - 3， Z配列番号： 4 4 )； PCNA (5 ' 一 TCG ATA TCT GGT ATA CCC AAG TGT - 3， Z配列番号： 45) ;LacZ-部位 Α(5' -GGT TAC GTT GGT GTA GAT GGG CGC-3' / 配列番号： 46) ;LacZ-部位 B(5， -CGC TCA TCG CCG GTA GCC AGC GCG-3' ノ配 列番号： 47) :LacZ-部位 C(5， -CCA ATC CAC ATC TGT GAA AGA AAG-3' Z配列 番号： 48)]によって増幅した。 PCR産物を pNMT TOPOにクロ一ニングした。 次 いで、 アンチセンス鎖 DNAを、 Xhol部位を有するアッププライマ一 [LEU2(5' - GAT TTT TAG TAA ACC TTG TTC AGG-3' Z配列番号： 44)； PCNA(5' -TCG ATA TCT GGT ATA CCC AAG TGT- 3， Z配列番号： 45 ) ;LacZ-部位 Α(5' -GGT TAC GTT GGT GTA GAT GGG CGC-3' /配列番号： 46 ) ;LacZ -部位 Β(5' -CGC TCA TCG CCG GTA GCC AGC GCG-3' Z配列番号： 47) ;LacZ -部位 C(5' - CCA ATC CAC ATC TGT GAA AGA AAG-3' Z配列番号： 48)]、 および Sail部位を有する ダウンプライマー [LEU2(5' - ATG TCT GCC CCT ATG TCT GCC CCT-3' Z配列番 号： 39) ;PCNA(5' - ACA ACG GTA TCT CTC TGC AGG CTA-3' Z配列番号： 4
0) ;LacZ-部位 Α(5' -ATG ATA GAT CCC GTC GTT TTA CM- 3' Z配列番号： 4
1) ;LacZ-部位 B(5， -GAA AAT GGT CTG CTG CTG CTG AAC - 3， ノ配列番号： 4
2)； LacZ-部位 C(5， -ATG TCG CTC CAC AAG GTA AAC AGT-3' Z配列番号： 4
3) ]を用いて PCRで増幅した。 PCR産物を Sailおよび Xholで消化した。 断片を、 センス鎖遺伝子を含む pNMT- T0P0の Xhol- Sail部位に揷入した。
S.セレピシェ用の LacZ ^位 A(nt.1-300)；部位 B[nt.1000-1300)；部位
C(nt.2000- 2300)] - dsRNA発現プラスミドを構築する場合、 本発明者らは pYes3CT プラスミド（ィンビトロゲン）を使用した。 LacZほ位 A(nt.1-300)；部位
B[nt.1000-1300)；部位 C(nt.2000-2300)]をコ一ドするセンス鎖 DNAを、 Hindlll 部位を有する特異的アッププライマー [LacZ-部位 Α(5' -ATG ATA GAT CCC GTC GTT TTA CAA-3' Z配列番号： 41 ) ;LacZ-部位 B(5， -GAA AAT GGT CTG CTG CTG CTG AAC - 3， Z配列番号： 42 ) ;LacZ-部位 C(5' -ATG TCG CTC CAC AAG GTA AAC AGT-3' ノ配列番号： 43]および Kpnl部位を有するダウンプライマ一 [LacZ-部位 A(5， -GG TTA CGT TGG TGT AGA TGG GCG CZ配列番号： 49) ;LacZ- 部位 B (5， -CG CTC ATC GCC GGT AGC CAG CGC G- 3， Z配列番号： 5 0 ) ;LacZ - 部位 C (5 ' -CC AAT CCA CAT CTG TGA AAG AAA G-3' Z配列番号： 5 1 )]を用い て PCRで増幅した。 次いで、 これらの増幅 DNAを Hindl l lおよび Kpnlで消化し た。 断片を pYes3CTの Hindll l- Kpnl部位にクローニングした。 LacZ (部位 A、 部 位 B、 および部位 C)のアンチセンス鎖 DNAを、 Not l部位を有するアッププライ マー [LacZ-部位 A (5 ' -GG TTA CGT TGG TGT AGA TGG GCG C- 3， Z配列番号： 4
6 ) ;LacZ-部位 Β (5 ' - CG CTC ATC GCC GGT AGC CAG CGC G-3' Z配列番号： 4
7 ) ; LacZ-部位 C (5， -CC AAT CCA CAT CTG TGA AAG AAA G/配列番号： 4 8 )]お よび Xhol部位を有するダウンプライマー [LacZ-部位 Α(5' -ATG ATA GAT CCC GTC GTT TTA CAA-3' /配列番号： 4 1 ) ;LacZ-部位 Β (5' -GAA AAT GGT CTG CTG CTG CTG AAC-3' /配列番号： 4 2 ) ;LacZ-部位 C (5， -ATG TCG CTC CAC AAG GTA AAC AGT-3' /配列番号： 4 3 )]を用いて PCRで増幅した。 次いで、 こ れらの増幅 DNAを Not lおよび Xholで消化した。 断片を、 センス鎖遺伝子を含む pYes3CTの Not l- Xhol部位にクロ一ニングした。
〔実施例 2 0〕 dsRNAの発現および s iRNAの作成
本発明者らは、 S.ボンべ細胞および S.セレピシェ細胞における前駆体 dsRNA の発現およびこれらの dsRNAのプロセシングについて、 各 dsRNA特異的プローブ を用いてノーザンブロット分析を行い確認した。
総 RNAは、 YeaStar RNAキット （ザィモリサーチ， CA， USA) を用いて得た。 レ —ン 1つにつき 30マイクログラムの総 RNAを 2. 5%ァガロースゲルにロードし た。 電気泳動後、 RNAのバンドを、 Hybond-N (商標）ナイロン膜 （アマシャム (Amersham Co. ) , Buckinghamshi re, )に転写した。 膜を、 dsRNA - LEU2 (nt. 1- 300)および dsRNA- LacZ (nt. 1-300)遺伝子の配列に相補的な特異的オリゴヌクレ ォチドでプローブした。 これらのプロ一ブは、 ECL標識キット （アマシャム、 Buckinghamshire, UK)を用いて標識した。 結果、 図 1 6 Bに示すように、 dsRNAを発現する S.セレピシェ細胞においては、 LacZ mRNAにターゲッティングされたプロセシングを受けていない前駆体 dsRNA が検出されたが、 s iRNAはほとんど検出されなかつた（図 1 6 B、 レーン 5)。 対照 的に、 dsRNA発現 S.ボンべ細胞においては、 前駆体 dsRNAおよび s iRNAの両方と も検出された （レーン 2)。 また、 dsRNA- LacZ発現 S.ボンべ細胞では、 前駆体 dsRNAおよび s iRNAの両方が検出された（図 1 6 B、 レーン 7)。 結果を裏付けるよ うに、 S,セレピシェのゲノム配列中に RNasel l l Di cer様タンパク質は見出され なかった。 これらの結果から、 s iRNAは S.ボンベにおいて前駆体 dsRNAから生成 されるが、 S.セレピシェでは生成されないことが示唆された。
また、 S.ボンべ細胞での dsRNAプロセシングにおける yDcrlの役割を調べるた めに、 本発明者らは ydcrl欠失株を構築した。 ydcrl欠失株構築は実施例 1 8に 記載のように行った。
本発明者らが予想したように、 dsRNA発現 ydcrl欠失株では、 s iRNAは前駆体 dsRNAから生成されなかった （図 1 6 B、 レーン 3)。 従って、 S.ボンべ Di cerホ モログ yDcr lは、 S.ボンべ細胞における s iRNAの生成に必要であることがわかつ た。
〔実施例 2 1〕 S.ボンベおよび S.セレピシェにおける外因性 LacZ遺伝子の 発現に及ぼす dsRNA誘導性 RNAiの影響
dsRNAが S.セレピシェにおいて配列特異的な遺伝子サイレンシングを誘導でき るかどうかを調べるために、 本発明者らは、 LacZに夕ーゲッティングされた dsRNA発現ベクター （pSCi- LacZ)を構築した。
本発明者らは、 LacZ mRNA内に dsRNAの 3つの標的部位を選択した。 次いで、 これらの dsRNA発現プラスミドを、 LacZ遺伝子を発現する S.セレピシェ細胞に 導入した。 各細胞抽出物の /3ガラクトシダ一ゼ活性は、 Yeas t 3 -Gal ac tos idase Repor ter Assayキット （ピアス、 Rockford、 IL、 USA) を用いて製造業者のプロ 卜コールに従って測定した。 値は、 それぞれの場合で 3回の反復実験を行い、 そ の結果の平均と S. D.である。
結果、 図 1 7に示すように、 dsRNA- cZを発現する S.ボンべ細胞の LacZ活性 レベルは、 野生型 S.ボンべ細胞と比較して減少した。 対照的に、 dsRNA- LacZを 発現する S.セレピシェ細胞における LacZ活性レベルは、 野生型 S.セレピシェ細 胞と比較して十分に減少しなかった。 これらの結果から、 外因性の dsRNAは、 S. セレピシェでは配列特異的な遺伝子サイレンシングを誘導しない可能性があるこ とが示唆された。 S.セレピシェ細胞では、 内因性遺伝子にタ一ゲッティングされ た dsRNAについても、 同様の結果が得られた （データ示さず)。
[実施例 2 2 ] S.ボンベにおける外因性 LEU2遺伝子の発現に及ぼす dsRNA誘 導性 RNAiの影響
s iRNAが、 dsRNA- LEU2を発現する S.ボンべ細胞において検出されたので、 本 発明者らは、 ロイシン欠損培地 （LeiT)にて、 S.ボンべ細胞の増殖を調べた。
LEU2 mRNAに夕一ゲッティングされた dsRNA発現プラスミド （pSPi- LEU2)、 LacZ mRNA にターゲッティングされた dsRNA発現プラスミド （pSPi-LacZ)それぞれを、 S.ボンべ細胞に導入した。
結果、 図 1 8 Aに示すように、 LEU2遺伝子を発現する野生型 (WT)細胞は、 LeiT 培地において正常に増殖した。 しかしながら、 dsRNA-LEU2発現細胞は、 この培 地では増殖しなかった。
ydcr l欠失株の場合、 dsRNA-LEU2は遺伝子サイレンシングを誘導せず、 結果、 これらの細胞は Leu—培地でも増殖した。 さらに、 dsRNA- LEU2発現細胞における LEU2 mRNAレベルは、 WT細胞と比較して有意に減少した （デ一夕示さず)。 従つ て、 外因性 dsRNAは、 S.ボンべ細胞では RNAiを介する遺伝子サイレンシングを 誘導することができ、 yDcrlが、 dsRNAを介する遺伝子サイレンシングに必要で あることがわかった。 〔実施例 23〕 S.ボンベにおける内因性 PCNA遺伝子の発現に及ぼす dsRNA 誘導性 RNAiの影響
外因性 dsRNAが、 S.ボンべ細胞における内因性遺伝子の発現を抑制するかどう かを調べるために、 PCNA mRNAに夕ーゲティングされた dsRNA発現プラスミド (pSPi- PCNA)を S.ボンべ細胞に導入した。 次いで、 本発明者らは、 PCNAタンパク 質レベルおよび内因性対照として Radl7タンパク質レベルを、 それぞれマウス PCNAモノクローナル抗体 (Waseem, N.H. , & Lane, D.P., Monoclonal antibody analysis of the proliferating cell nuclear antigen (PCNA)： Structural conservation and the detection of a nucleolar form. J. Cell Sci. 96 121- 129 (1990).) およびマウス Radl7モノクローナル抗体 （Li， L.， Peterson,
C. A. , Kanter-Smoler, G.， Wei, Y.F. , Ramagli, L. S.， Sunnerhagen, P., Siciliano, M. J. , & Legerski, R.J. hRAD17， a structural homo log of the Schizosaccharomyces pombe RAD 17 cell cycle checkpoint gene, stimulates p53 accumulation. Oncogene 18, 1689- 1699 (1999).) を用いたウエスタンブ ロット分析によつて調べた。
ウェスタンブロット分析は、 Y- PER酵母タンパク質抽出試薬（ピアス）を用いて 製造業者のプロトコールに従って、 細胞抽出物を各形質転換体から調製した。 タ ンパク質を SDS- PAGE (10%ポリアクリルアミド）によって分離し、 他に記載 (Kawasaki, H. , Eckner, R. , Yao, Τ. P. , Taira, , Κ. , Chiu, R. , Livingston,
D. Μ. , & Κ. Κ. Yokoyama. , Distinct roles of the co-activators p300 and CBP in retinoic— acid - induced F9 - cell differentiation. , Nature, 393, 284- 289 (1998)., Kawasaki H, Schiltz L, Chiu R, Itakura K, Taira K， Nakatani Y, Yokoyama KK， ATF-2 has intrinsic histone acetyl transferase activity which is modulated by phosphorylation, Nature, 405, 195-200 (2000).) の ようにエレクトロプロッティングによって PVDF膜（フナコシ（Funakoshi Co.), Tokyo, Japan)に転写した。 マウス PCNAに対する特異的ポリクローナル抗体 （ザ ィメッドラボラトリーズ（ZYMED Lab. Inc.), CA、 USA)およびマウス Radl 7に対す る特異的ポリクローナル抗体 （ザィメッドラポラトリーズ）を用いた ECLキット (アマシャム）によって、 免疫複合体を視覚化した。 これらの抗体はそれぞれ、 S. ボンベの PCNAおよび Radl7と反応する （Waseem, N.H., & Lane, D.P.,
Monoclonal antibody analysis of the proliferating cell nuclear antigen (PCNA)： Structural conservation and the detection of a nucleolar form. J. Cell Sci. 96 121-129 (1990)., Li, L. , Peterson, C.A.， Kanter-Smoler, G. , Wei, Y.F. , Ramagli, L.S., Sunnerhagen, P. , Sici liano, M.J.， & Legerski, R.J. hRAD17, a structural homo log of the Schizosaccharomyces pombe RAD 17 cell cycle checkpoint gene, stimulates p53 accumulation. Oncogene 18, 1689- 1699 (1999).) 。
結果、 図 18 Bに示すように、 dsRNA- PCNA発現細胞における PCNAタンパク質 レベルは、 野生型 (WT)細胞と比較して有意に減少した。 対照として使用した Radl7タンパク質レベルは両細胞とも変化しなかった。 これらの結果から、 外因 性 dsRNAは、 S.ボンべ細胞における RNAiシステムを介して外因性 LEU2遺伝子の 発現だけでなく内因性 PCNA遺伝子の発現も抑制することが分かった。
〔実施例 24〕 S.ボンベにおける siRNA誘導性 RNAiの影響および RdRP活性 次に、 合成 siRNAも S.ボンべ細胞では配列特異的な遺伝子サイレンシングを 誘導できるかどうかを試験するために、 本発明者らは、 ゼォシン (商標)耐性 (Zeo1")遺伝子に夕ーゲッティングされた siRNA(siRNA-Zeor)を合成した。
ゼォシン指向性 siRNA (センス鎖： 5， -CUG CGU GCA CUU CGU GGC CGA-3' /配 列番号： 49；アンチセンス鎖： 5， -GGC CAC GAA GUG CAC GCA GUU-3' /配列番 号： 50)は、 日本バイオサービス（Japan Bio Service(JBioS)Co Ltd)によって 合成された。 これらの RNAを、 標準的な方法 （Elbashir, S.M., Lendeckel, W. , & Tuschl, T.， RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleot ide RNAs. Genes&Dev. , 15, 188-200 (2001).) を用いてァニールさせた。 次いで、 Frozen - EZ Yeast Transformation II キット (ザィモリサーチ (Zymo Research, In CA、 USA)を用いて製造業者のプロトコールに従って、 5〜20nMのゼォシン指向性 siRNAを、 ゼォシンを含む S.ボンべ細胞にトランスフエクトした。
次に、 本発明者らは、 50 g/mlゼォシン （インビトロゲン）を含む YPD培地に おいて、 ゼォシン耐性遺伝子を発現する株を選択し、 siRNA- Zeor処理細胞の増殖 を調べた。 図 1 9 Aに示すように、 Zeo遺伝子を発現する WT細胞がゼォシン含 有培地において増殖した。 しかしながら、 siRNA- Zeof(20nM)で処理した細胞の増 殖レベルは、 Zeof遺伝子を発現する WT細胞と比較して有意に減少した。
さらに、 S.ボンベの RdRPホモログ （yrdpl) が DNAデ一夕ベース検索によって 同定されたので、 本発明者らは、 RNAiを介する遺伝子サイレンシングにおける yRdplの役割について調べるために yrdpl欠失株を構築した。 yrdpl欠失株の構 築は、 実施例 18に記載のようにして行った。
結果、 yrdpl欠失株では、 siRNA - Zeorは遺伝子サイレンシングを効率的に誘導 しなかった （図 19 A:右下 4分の 1の増殖レベルと左下 4分の 1の増殖レベルを 比較のこと） 。 従って、 これらの結果から、 合成 siRNAも、 S.ボンベにおいて RNAiを介する遺伝子サイレンシングを誘導することができ、 yRdplが RNAiを介 する遺伝子サイレンシングに少なくとも部分的に関与することが分かった。
〔実施例 25〕 5' ピオチン標識アンチセンス鎖 siRNA 「プルダウン」 およ び逆転写 (RT)- PCR分析
伸長アンチセンス鎖 RNAが、 si RNA-RdRP複合体によって生成されるかどうか を確かめるために、 本発明者らはピオチンプルダウン RT-PCR分析を行った。
最初に、 本発明者らは、 Zeof遺伝子にターゲッティングされた 5' ピオチン結 合 siRNAを合成した。 5' ピオチン標識ゼォシン耐性遺伝子 (Zeo - siRNAは、 日 本バイオサービスによって合成された。 これらの RNAを、 標準的な方法 （Fire A., Xu S. , Montgomery, M. K. , Kostas, S.A. , Driver, S.E., & Mello, C.C., Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans., Nature, 391, 806-811 (1998).) を用いてァニール させた。 Frozen- EZ Yeast Transformation IIキット（ザィモリサーチ）を用いて 製造業者のプロトコールに従って、 5' ピオチン標識 Zec^-siRNAを S.ボンべ細 胞または yrdpl欠失株にトランスフエクトした。 48時間後、 細胞を収集し、 総 RNAを各細胞から、 YeaStar RNAキット（ザィモリサーチ）を用いて得た。 ストレ プトァビジン樹脂を含む Sof tLink (商標)樹脂（プロメガ (Promega)， USA)を用いて 製造業者のプロトコールに従って、 ピオチン標識アンチセンス鎖 siRNAを精製し
RT-PCR分析を、 RNA PCR Kit ver.2 (夕カラ（TaKaRa) , Kyoto, Japan)と Zeor上流 プライマー（5 ' -GGC CAC GAA GTG CAC GCA GTT-3' /配列番号： 51)および下 流プライマー（5' -CAC CCT GGC CTG GGT GTG GGT-3' ノ配列番号： 52)または 対照として Rad 上流プライマー（5' -TCT GGT TGT GGA AAG AGT ACC GCA-3' Z配列番号： 53)および下流プライマー（5' -CCT CTT TAC GTA GAA TAG AGC CAA G-3' /配列番号： 54)を用いて伸長アンチセンス鎖 RNAを増幅した。 PCR 産物を、 2 %ァガロースゲルでの電気泳動によつて分析した。
結果、 図 1 9Bに示すように、 siRNAから生じた伸長アンチセンス鎖 RNAは siRNAを含む細胞（Zeof)でしか検出されなかった（レーン 4)。 対照的に、 siRNA- Zeorを含む WT細胞は伸長ァンチセンス鎖 RNAを含まなかった（レーン 2)。 これ らの結果から、 siRNAはターゲッティング mRNAの非存在下では増幅されないこ とが示唆された。
さらに、 これらの伸長 RNAは、 siRNA- Ze (^を含む yrdpl s欠失株では生成され なかった（レーン 3)。 これらの結果から、 siRNAが、 S.ボンべ細胞において RNAi 誘導性サイレンシング複合体 (RISC)のガイドとしてだけでなく、 siRNA増幅のた めのプライマーとしても働くことが示唆された。 産業上の利用の可能性
本発明により、 RNAi効果を有するステムループ形 RNAをコードする DNA、 およ び該 DNAを含むベクターが提供された。 これらを用いることにより、 簡便に所望 の遺伝子がノックアウトした細胞を作製することが可能である。 また本発明は、 哺乳類細胞における RNAiのメカニズムおよび他の遺伝子機能を研究するための 強力なツールとなり、 さらには、 治療用途として潜在的有用性を持つものと大ぃ に期待される。

Claims

請求の範囲 細胞内で RNAi効果を有するステムループ形 RNA分子をコードする DNAと 細胞質移行シグナル配列を有する DNAであつて、 標的遺伝子 niRNAのいずれ かの領域のセンス RNAをコードするセンスコ一ド DNAと、 該 DNAと相補的な 配列とを、 スぺ一サ一領域を挟んで対向するように連結させ、 これをプロモ —夕一と機能的に接続させた構造を特徴とする DNA。
前記スぺーサー領域中に細胞質移行シグナル配列を有する、 請求項 1に記 載の DNA。
プロモ一夕一が、 tRNAプロモーター、 pol I I系プロモーター、 ρο Ι Π Ι系 プロモーター、 またはテトラサイクリン誘導型プロモーターである、 請求項 1または 2に記載の DNA。
テトラサイクリン誘導型プロモータ一がテトラサイクリン誘導型 tRNAプ ロモ一ターである請求項 3に記載の DNA。
プロモーターが、 丽 T1プロモータ一または GAL1プロモーターである請求 項 1または 2に記載の DNA。
細胞内で RNAi効果を有するステムル一プ形 RNA分子をコードする DNAで あって、 標的遺伝子 mRNAのいずれかの領域のセンス RNAをコードするセン スコード DNAと、 該 DNAと相補的な配列とを、 スぺ一サー領域を挟んで対向 するように連結させ、 これを tRNAプロモー夕一と機能的に接続させた構造 を特徴とする DNA。
tRNAプロモーターが tRNA™プロモーターである、 請求項 3、 4または 6 に記載の DNA。
センスコード DNAの長さが 10〜35bpである、 請求項 1〜4、 6または 7 のいずれかに記載の DNA。
センスコード DNAの長さが 26〜30bpである、 請求項 1〜4、 6または 7 のいずれかに記載の DNA。
10. センスコード DNAの長さが 31〜35bpである、 請求項 1〜4、 6または 7 のいずれかに記載の DNA。
1 1. センスコード DNAの長さが 10〜5000bpである、 請求項 5に記載の DNA
12. スぺ一サー領域の長さが 1〜10000ベ一スである請求項 1から 1 1のいず れかに記載の DNA。
1 3. スぺ一サー領域の長さが 1〜100ベースである請求項 1から 1 1のいずれ かに記載の DNA。
14. 発現するステムループ形 RNA分子のステム領域の長さが 10〜35bpである、 請求項 1〜4、 6〜1 0、 12または 1 3のいずれかに記載の DNA。
1 5. 発現するステムループ形 RNA分子のステム領域の長さが 26〜30bpである、 請求項 1〜4、 6〜10、 12または 1 3のいずれかに記載の DNA。
16. 発現するステムループ形 RNA分子のステム領域の長さが 31〜35bpである、 請求項 1〜4、 6〜10、 12または 1 3のいずれかに記載の DNA。
17. 発現するステムループ形 RNA分子のステム領域中にミスマッチまたはバ ルジを含むように構築されたものである、 請求項 1〜16のいずれかに記載 の赚。
1 8. センス鎖に 20塩基対あたり 1〜6塩基の G · Uペアを組むようなミスマ ツチを含むように構築されたものである、 請求項 17に記載の DNA。
1 9. 発現するステムループ形 RNA分子のステム領域中に 20塩基対あたり 1 〜 10塩基のミスマッチまたはバルジを含むように構築されたものである、 請求項 1〜 18のいずれかに記載の DNA。
20. ミスマッチがセンス鎖に 20塩基対あたり 1〜6塩基の G · ϋペアを組む ようなミスマッチである、 請求項 1 9に記載の DNA。
2 1. 発現するステムループ形 RNA分子のステム領域中に 300塩基対あたり 1
〜 100塩基のミスマッチまたはバルジを含むように構築されたものである、 請求項 5または 1 1に記載の DNA。
. 細胞が哺乳動物細胞もしくは酵母細胞である、 請求項 1〜 2 1のいずれ かに記載の DNA。
. 請求項 1〜 2 2のいずれかに記載の DNAの転写産物である、 細胞内で
RNAi効果を有するステムループ形 RNA分子。
. 請求項 1〜 2 2のいずれかに記載の DNAを含むベクター。
. 請求項 1〜 2 2のいずれかに記載の DNA、 または請求項 2 4に記載のベ クタ一を保持する細胞。
. 細胞が哺乳動物細胞もしくは酵母細胞である、 請求項 2 5に記載の細胞。 . 請求項 1〜 2 2のいずれかに記載の DNA、 または請求項 2 4に記載のベ クタ一を含む組成物。
. 標的遺伝子の発現が抑制された細胞を生産する方法であって、 請求項 1
〜 2 2のいずれかに記載の DNA、 または請求項 2 4に記載のベクタ一を細胞 に導入する工程、 および前記 DNAもしくはベクタ一が導入された細胞を選択 する工程、 を含む生産方法。
. 細胞内でステムループ形ランダム RNA分子をコードする DNAであって、 ランダムな配列からなる RNAをコードする DNAと、 該 DNAと相補的な配列と を、 スぺーサー領域を挟んで対向するように連結させ、 これを tRNAプロモ 一夕一と機能的に接続させた構造を有する DNAを含むベクタ一。
. 請求項 1〜 2 2のいずれかに記載の DNA、 または請求項 2 4もしくは 2
9に記載のベクタ一を保持した生物個体。
. 標的遺伝子ノックアウト非ヒト動物である、 請求項 3 0に記載の生物個 体。
. 生物がマウス、 ラット、 ゥサギ、 ゥシ、 ゥマ、 ブタ、 ヒッジ、 サル、 お よびチンパンジーからなる群より選択される、 請求項 3 0または 3 1に記載 の生物個体。
33. 発現するステムループ形ランダム RNA分子のステム領域の長さが 10〜
35bpである、 請求項 29に記載のベクター。
34. 以下の工程 (a) 〜 （c) を含む、 機能遺伝子探索方法。
(a) 請求項 29または 33に記載のベクターを細胞へ導入する工程
(b) 前記ベクターが導入された細胞を選択する工程
(c) 選択された細胞の表現型を解析する工程
35. 表現型解析により表現型が変化していた細胞中のベクタ一配列中のラン ダムな配列に基づいて機能遺伝子をスクリーニングする工程をさらに含む、 請求項 34に記載の機能遺伝子探索方法。
36. (a) 細胞内で RNAi効果を有するステムループ形 RNA分子をコードする
DNAであって、 標的遺伝子 mRNAのいずれかの領域のセンス RNAをコードす るセンスコード DNAと、 該 DNAと相補的な配列とを、 スぺ一サ一領域を挟ん で対向するように連結させ、 これをプロモーターと機能的に接続させた構造 を特徵とする DNAと、
(b) Dicerタンパク質における Dicer活性を有するポリペプチド領域をコ ードする DNAとプロモーターとを機能的に接続させた構造を特徴とする DNA、 とを含む siRM発現システム。
37. (a) に記載のプロモーターが tRNA プロモーターまたは Pol III系プ ロモ—ターである、 請求項 36に記載の siRNA発現システム。
38. (a) に記載のプロモ一ターが NMT1プロモーター、 GAL1プロモ一夕一 または Pol II系プロモーターである、 請求項 36に記載の siRNA発現シス テム。
39. 発現するステムループ形 RNA分子のステム領域中に、 300塩基対あたり 1
〜100塩基のミスマッチまたはバルジを含む、 請求項 38に記載の siRNA発 現システム。
40. (b) に記載のプロモーターが ΡοΙΠ系プロモーターである、 請求項 3 6に記載の siRNA発現システム。
41. 細胞が哺乳動物細胞もしくは酵母細胞である、 請求項 36〜40のいず れかに記載の siRNA発現システム。
42. 標的遺伝子 mRNAのいずれかの領域におけるセンス RNAおよびアンチセン ス RNAが対合した dsRNA、 または該 dsRNAをステムとするステムループ形 RNA分子のステム領域の長さが、 少なくとも 30塩基対以上である、 請求項 36〜41のいずれかに記載の siRNA発現システム。
43. 標的遺伝子 mRNAのいずれかの領域におけるセンス RNAおよびアンチセン ス RNAが対合した dsRNA中、 または該 dsRNAをステムとするステムループ形 RNA分子のステム領域中のセンス鎖に、 300塩基対あたり 1〜100塩基のミス マッチまたはバルジを含む、 請求項 36〜41のいずれかに記載の siRNA発 現システム。
44. 請求項 36の （a) および （b) の両方の DNAを含む siRNA発現べクタ
45. 請求項 36〜43のいずれかに記載の siRNA発現システム、 または請求 項 44に記載の発現ベクターを用いて、 ステムループ形 RNA分子と Dicer活 性を有するポリぺプチドの両方を発現させることを特徴とする、 標的遺伝子 の発現を抑制する方法。
46. 以下の工程 （a) および （b) を含む、 標的遺伝子の発現を抑制する方 法。
(a) 標的遺伝子 mRNAのいずれかの領域におけるセンス RNAおよびアン チセンス RNAが対合した dsRNA、 または該 dsRNAをステムとするステム ループ形 RNA分子を、 Dicer 活性を有するポリペプチドで処理する工程、
(b) 上記工程 （a) で生成した dsRNAを、 標的遺伝子を含む細胞へ導 入する工程、
47. Dicer活性を有するポリペプチドが、 Dicerタンパク質の 1066位〜 1924 位のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、 請求項 4 6に記載の方法。. Di cer活性を有するポリペプチドが、 Di cerタンパク質の 1268位〜 1924 位のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、 請求項 4 6に記載の方法。. Dicer活性を有するポリペプチドが、 Di cerタンパク質の 1296位〜 1924 位のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、 請求項 4 6に記載の方法。. Di cer活性を有するポリペプチドが全長 Di cerタンパク質である、 請求 項 4 6に記載の方法。
. 細胞が哺乳動物細胞もしくは酵母細胞である、 請求項 4 5〜5 0のいず れかに記載の方法。
. Dicer活性を有するポリペプチドが大腸菌で発現させた請求項 4 7〜 5 0のいずれかに記載のポリべプチドである、 請求項 4 6に記載の方法。 . Di cer活性を有するポリペプチドが昆虫細胞で発現させた請求項 4 4〜 4 7のいずれかに記載のポリペプチドである、 請求項 4 6に記載の方法。 . 標的遺伝子 mRNAのいずれかの領域におけるセンス RNAおよびアンチセン ス RNAが対合した dsRNA、 または該 dsRNAをステムとするステムループ形 RNA分子のステム領域の長さが、 少なくとも 3 0塩基対以上である、 請求項 4 5〜 5 3のいずれかに記載の方法。
. 標的遺伝子 mRNAのいずれかの領域におけるセンス RNAおよびアンチセン ス RNAが対合した dsRNA中、 または該 dsRNAをステムとするステムループ形 RNA分子のステム領域中のセンス鎖に、 300塩基対あたり 1〜100塩基のミス マッチまたはバルジを含む、 請求項 4 5〜5 3のいずれかに記載の方法。
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