WO2003103703A1 - 骨代謝疾患治療剤 - Google Patents

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善恢 本宮
佳之 森口
広行 大川
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Definitions

  • the present invention relates to a therapeutic agent and method for a bone metabolic disease, particularly a bone disease based on abnormal bone metabolism, comprising erythropoietin (EPO) as an active ingredient.
  • EPO erythropoietin
  • the bone metabolic diseases mentioned here include not only so-called degenerative bone diseases, but also bone diseases due to aging, bone metabolism diseases associated with renal failure and diabetes, which are closely related to modern lifestyles. Since the range of bone metabolic disease is wide, how to deal with this disease has become a major social issue. Against this social background, scientific knowledge on bone metabolic disorders has been rapidly accumulating since the late 1980s.
  • bone diseases such as osteoporosis, which has an increased risk of bone fracture, which is an indicator of bone loss
  • the bone mineral density for the purpose of preventing and diagnosing the disease is non-invasive and simple.
  • diagnostic equipment bone mineral density measuring equipment
  • the adenine-induced renal disorder model rat (adenine model) is a model animal for chronic renal failure 1), 2), 3). Focusing on the relationship between renal failure and bone loss in this model, the bone mineral density (bone mineral density) of the femur in the model was measured using a bone mineral density measurement device. There is a report that a tendency to recover bone mineral density was observed when EPO was administered to this condition4).
  • the present inventors have long examined this adenine model from the viewpoint of renal failure and its complications, and found that in the pathology that led to renal failure, secondary parathyroid gland function similar to renal failure complications in humans It has been reported that this animal is a pathological model animal that exhibits complications such as hypertension, ectopic calcification, and renal osteodystrophy, a bone metabolic disease5), 6).
  • the definitive diagnosis of the disease state takes into account not only the quantification but also the findings of histological diagnosis, as in the case of cancer, etc. Must.
  • this method is regarded as the primary purpose, and it is applied to bone metabolic diseases that could not be determined only by measuring bone mineral content. The aim is to confirm the effects of prevention and treatment using this method.
  • An object of the present invention is effective for prevention and treatment of abnormal bone metabolism in patients with renal failure. To provide preventive and therapeutic drugs.
  • the present inventors used an adenine model to investigate the nature of bone metabolic disease in this model, and to further examine the effects of EP0 on bone metabolism, We thought that a final analysis based on the quantitative balance of osteoclasts in bone tissue and its functional and temporal changes was necessary, and we performed a thorough histopathological search. As a result, it has been found that administration of EPO to an adenine model has an effect of improving bone metabolism abnormalities, particularly renal osteodystrophy, and arrived at the present invention. [Brief description of drawings]
  • Figure 1 is a photograph (8x, HE staining) of a tissue sample of the metaphysis of the femur of an adenine nephritis rat (solvent-administered group).
  • FIG. 2 is a photograph of the same tissue specimen as in FIG. However, the magnification is 80 times.
  • FIG. 3 is a photograph (8 ⁇ , HE staining) of a tissue specimen of the metaphysis of the femur of an adenine nephritis rat (EPO administration group).
  • FIG. 4 is a photograph of the same tissue specimen as in FIG. 3 above. However, the magnification is 80 times.
  • Figure 5 is a photograph of a tissue sample of a femur metaphysis of a normal rat (8-fold, HE staining).
  • FIG. 6 is a photograph (8 ⁇ , HE staining) of a tissue sample of the metaphysis of the femur of a normal rat (EPO administration group).
  • the present invention is based on the histopathological findings of the healing effect of EPO on bone lesions in the adenine model, which was impossible with conventional non-invasive diagnostic techniques for bone metabolic diseases, such as measurement of bone mineral density. It was found.
  • the adenine model adjusts diets containing adenine and feeds them for a certain period of time, causing irreversible renal damage and exhibiting the pathology of chronic renal failure.
  • Model. From the 4th day after the start of adenine feeding, 2,8-dihydroxyadenine, a metabolite of adenine, precipitates out and crystallizes to form deposits. This results in obstruction of the tubule, causing tissue damage in the surroundings, leading to irreversible renal damage.At the stage when chronic renal failure is formed, anemia, renal osteodystrophy, It has a similar condition to that of human chronic renal failure such as hyperthyroidism and ectopic calcification.
  • the indication disease of the EPO of the present invention is a bone disease showing abnormal bone metabolism, and includes bone dystrophy associated with renal failure, marble disease, diabetic nephropathy, osteoporosis and the like.
  • EPO normalized the histopathological findings of bone metabolic abnormalities in adenine-induced renal osteodystrophy. The following describes the histopathological findings of bone and bone marrow.
  • the part of the knee joint that is closer to the diaphysis from the metaphysis of the femur is the immature part of the trabecular bone with residual primary trabecular bone or osteogenesis to form a boundary with the bone marrow.
  • Increased bone matrix is observed, lacking continuity with the diaphyseal bone marrow, poor bone marrow tissue and rare angiogenesis (Figure 1).
  • osteoblasts are seen, but osteoclasts are scarcely observed and bone resorption stagnates, resulting in slow bone metabolism and remaining cartilage matrix (Figure 2).
  • osteodystrophy consisting of a small number of osteoclasts, osteoblasts, and fibroblasts around the cancellous bone
  • the cancellous bone tissue is observed in a band across the long axis (Fig. 1).
  • the histopathological improvement effect of EPO administration to bone and bone marrow lesions in the adenine model is summarized as follows.
  • the renal lesions develop several days after adenine feeding, and bone metabolic abnormalities are also induced early due to increased blood phosphorus levels, decreased activated VD, and increased PTH production.
  • These bone lesions are bisected in cancellous bone. Bone metabolic abnormalities during the 4-week period of the initial adenine feeding period are observed in the distal part of the cancellous bone, where the increase in osteoid tissue mainly due to the delay of remodeling due to decreased bone resorption and the remaining bone matrix To be observed.
  • EPO induces erythropoiesis, induces angiogenesis based on stimulation of VEGF production, induces hematopoietic stem cell engraftment from the bone marrow bone marrow, initiates bone resorption by influx of pre-osteoclasts, and induces bone formation as a result It is thought that it was done.
  • administration of EPO resulted in the formation of mature lamellar bone in the cancellous bone with abnormal bone metabolism observed in both cancellous bone parts, and the tendency of bone marrow tissue to recover simultaneously progressed. The healing of the lesion was observed histopathologically.
  • Erythropoietin which is the active ingredient used in the present invention, is, for example, a natural human EPO obtained by extracting from urine of a patient with aplastic anemia (Japanese Patent Publication No. 1-38,800).
  • a suitable host eg, E. coli
  • the EP ⁇ usable in the present invention may be, in addition to those derived from the above, modified forms thereof.
  • EPO variants include the variants described in Japanese Patent Application Laid-Open No. H3-151599.
  • the EPO variants mentioned above there are those in which A sn of the peptide chain of the original glycoprotein is mutated to G 1 n and the number of N-linked sugar chains to be bound is mutated.
  • the amino acid mutation include those described in JP-A-2-59599 and JP-A-3-72855. That is, any number of amino acid mutations, deletions, and additions may be used as long as the action characteristics of the EPO to the EPO receptor are not lost.
  • a suspending agent As for the preparation containing the EPO of the present invention as an active ingredient, a suspending agent, a solubilizing agent, a stabilizing agent, a tonicity agent, a preservative, an anti-adsorption agent, etc. are required depending on the administration method and dosage form.
  • a suspending agent include methyl cellulose, polysorbate 80, hydroxyethyl cellulose, gum arabic, tragacanth powder, sodium carboxymethyl cellulose, polyoxyethylene sorbitan monolaurate, and the like.
  • solubilizers include polyoxyethylene hydrogenated castor oil, polysorbate 80, nicotinic acid amide, polyoxyethylene sorbitan monolaurate, magrogol, castor oil fatty acid ethyl ester, and the like.
  • agent include human serum albumin, dextran 40, methylcellulose, gelatin, sodium sulfite, and sodium metasulfite.
  • tonicity agent include D-mannitol and sorbitol. To mention Can also methyl Examples of the preservative Paraokishi benzoate, Paraokishi benzoate Echiru, sorbic acid, phenol, cresol, a black hole cresol Ichiru etc.
  • examples of the adsorption inhibitor include human serum albumin, lecithin, dextran, ethylene oxide / propylene oxide copolymer, hydroxypropyl cellulose, methyl cellulose, poloxyethylene hydrogenated castor oil, Polyethylene Dalicol can be mentioned.
  • EPO of the present invention as an active ingredient and adding a certain amino acid as a stabilizer, a stable EPO solution preparation containing no human serum albumin-purified gelatin can be used.
  • This stable EPO solution preparation is described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 10-182481. The description in this publication is included in a part of this specification.
  • the amino acids added as stabilizers in this EPO solution preparation include free amino acids and salts thereof such as sodium salts, potassium salts, and hydrochlorides.
  • Preferred amino acids are D-, L- and DL-forms of leucine, tryptophan, serine, glutamic acid, arginine, histidine and lysine and their salts, more preferably L-leucine, L-tryptophan, L-glutamic acid, L-arginine, L-histidine and L-lysine and their salts.
  • Particularly preferred are L-arginine, L-histidine and L-lysine and salts thereof.
  • the dose of these EP0s in the prophylactic and therapeutic agents of the present invention can be appropriately determined in consideration of the disease to be treated and the condition of the disease. 0.1 to 500 g per person, preferably 5 to: LOO g.
  • EPO Epogin Injection 3000 (Epoetin j3, Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.). Formulation
  • Adenine A mixed solid feed containing 0.75% by weight of adenine (6-aminopurine) in the composition of a rat normal solid sample (CE-2, CLEA Japan) was prepared (CLEA Japan). T (2) administration group as a feed sample
  • the administration group was
  • adenine vehicle administration group (Adenine sample is fed and vehicle is administered)
  • adenine EPO administration group (Adenine sample is fed and EPO administered)
  • CE-2 group Normal diet is fed and administration is not performed) . It was set.
  • the starting day of adenine feeding was Day 0.
  • Adenine was administered to the adenine vehicle-administered group and the adenine EPO-administered group by feeding adenine-mixed food samples for 4 weeks from the start of the experiment. Normal diet was fed for 4 weeks from the 5th to 8th week of the experiment. The C E-2 group was fed a normal diet from the beginning to the end of the experiment.
  • EP ⁇ was administered 200 IU / kg subcutaneously (back of the neck) three times a week for 4 weeks from the 5th to 8th week of the experiment. Vehicle was administered subcutaneously on the back three times a week for 4 weeks from the 5th to 8th week of the experiment.
  • EP 0 or vehicle is the dose volume was adjusted to 1 mL / kg.
  • femur was decalcified.
  • the kidney, parathyroid gland, and decalcified femur were embedded in paraffin vesicles to prepare paraffin sections. Each section was stained with hematoxylin and eosin (HE) and histopathologically examined.
  • HE hematoxylin and eosin
  • Wistar rats were fed an adenine-mixed food sample for 4 weeks, and then fed a normal diet for 4 weeks.
  • various lesions were observed in the kidney, such as dilation of tubular tubules, degeneration and atrophy of tubules and tubular epithelium, proliferation of epithelium with giant cell formation, and thickening of interstitium with cell infiltration.
  • These were histopathological findings that caused renal dysfunction due to adenine feeding, and were moderately or severely chronic.
  • proliferative swelling was observed in all the observed adenine models, and gland cell division was also observed in many individuals. No such changes were seen in normal diet-fed animals.
  • the part of the knee joint that is closer to the diaphysis from the metaphysis of the femur is the immature part of the trabecular bone with residual primary trabecular bone or osteogenesis to form a boundary with the bone marrow.
  • An increase in bone matrix is observed, lacking continuity with the diaphyseal bone marrow, poor bone marrow tissue and rare angiogenesis (Figure 1).
  • osteoblasts are seen, but osteoclasts are scarcely observed, and bone resorption stagnates, resulting in slow bone metabolism and remaining cartilage matrix (Figure 2).
  • EPO administration shows an increase in bone resorption and activated osteoblasts due to osteoclasts on the bone surface of these proximal and distal cancellous bones.
  • This increase in red blood cells in the blood vessels was also observed in the diaphysis cortical bone and in small blood vessels in the bone resorption space.
  • fibroblasts remained around the cancellous bone, but activated osteoclasts and osteoblasts were observed, and the bone matrix was thinned to form lamellar bone, which was observed as mature marine bone ( ( Figure 4).
  • the histopathological improvement effect of EPO administration to bone and bone marrow lesions in the adenine model is summarized as follows.
  • the renal lesions begin several days after adenine feeding, and bone metabolic abnormalities are caused early due to increased blood phosphorus levels, decreased activated VD, and increased PTH production.
  • These bone lesions are bisected in cancellous bone.
  • Bone metabolic abnormalities during the 4-week period of the initial adenine feeding period are observed in the distal part of the cancellous bone, where the increase in osteoid tissue mainly due to the delay of remodeling due to decreased bone resorption and the remaining bone matrix To be observed.
  • EPO administration induces erythropoiesis, induces angiogenesis based on stimulation of VEGF production, initiates hematopoietic stem cell engraftment from the bone marrow bone marrow, initiates bone resorption due to influx of pre-osteoclasts, and results in bone formation. It is thought that it was.
  • administration of EPO resulted in the formation of mature lamellar bone in the cancellous bone with abnormal bone metabolism observed in both cancellous bone parts, and the tendency of bone marrow tissue to recover simultaneously progressed. The healing of the lesion was observed histopathologically. No significant morphological changes were observed when EPO was administered to normal rats (Fig. 5) (Fig. 6).
  • a solution was aseptically prepared with the above composition ratio, dispensed into vials, and sealed.
  • a solution was aseptically prepared with the above composition ratio, dispensed into vials, lyophilized and sealed. .
  • a solution was aseptically prepared with the above composition ratio, dispensed into vials, and sealed.
  • a solution was aseptically prepared with the above composition ratio, dispensed into vials, lyophilized and sealed.
  • a solution was aseptically prepared with the above composition ratio, dispensed into a vial bottle, and sealed.
  • a solution was aseptically prepared with the above composition ratio, dispensed into vials, lyophilized and sealed.
  • a solution was aseptically prepared with the above composition ratio, dispensed into vials, and sealed.
  • a solution was aseptically prepared with the above composition ratio, dispensed into vials, lyophilized and sealed.
  • Injections were prepared in the same manner as in Examples 5 to 8, except that 5 mg of dextran 40 was used instead of human serum albumin in Examples 5 to 8.
  • the prepared solution was filled into a 5 ml glass vial in an amount of 1 ml, stoppered, sealed and provided for a solution preparation.
  • a solution formulation was prepared in the same manner as in Example 14 above.
  • the formulation of the present invention as an active ingredient of EP0 has an effect of improving bone and bone marrow lesion healing for bone diseases, particularly bone diseases caused by abnormal bone metabolism, in addition to the previously reported erythrocytosis effect of EPO. It is a new prophylactic and therapeutic agent, and its target condition is a bone disease showing abnormal bone metabolism, such as bone dystrophy associated with renal failure, marble disease, diabetic nephropathy, and osteoporosis.

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Abstract

　ＥＰＯを有効成分として含有する骨代謝疾患治療剤又は骨代謝疾患患者の治療方法を提供する。ＥＰＯを有効成分とする製剤は、既報のＥＰＯによる赤血球増加作用とは別に、骨疾患、特に骨代謝異状に基づく骨疾患に対して、骨および骨髄の病変治癒による改善作用をもたらす新規の予防・治療剤であり、その対象病態は、骨代謝異状を示す骨疾患であり、腎不全に伴う骨異栄養症、大理石病、糖尿病性腎症、骨粗鬆症等である。

Description

骨代謝疾患治療剤 [技術分野]
本発明は、 エリスロポエチン （E P O ) を有効成分とした骨代謝疾患、 特に骨代謝異状に基づく骨疾患に対する治療剤及び治療方法に関する。 明
[背景技術]
近年、 人口の高齢化や寿命の延長田により、 骨代謝疾患に関する医療は Q〇 Lや医療費の増大化の観点から大いに注目が集まっている。 ここで 言う骨代謝疾患とは、 いわゆる退行性骨疾患のみならず、 高齢化による 骨疾患、 現代の生活習慣とも深く関係する腎不全や糖尿病に合併する骨 代謝疾患も含まれている。 骨代謝疾患の範囲は広範であることから、 本 疾患への対処を如何に進めていくかが大きな社会的課題となっている。 このような社会的背景のもとに、 骨代謝疾患に関する科学的知見は 1980 年代後半から急速に蓄積されてきた。
骨代謝疾患に対する治療は、 治療技術や薬物の開発とあいまって集約 的に実施されている。 この結果、 それぞれの薬物の持つ多面的特性 (Redundancy)が見出され、 たとえば造血因子と骨代謝関連薬物は相互に 作用機序または類似した作用を示し、 両者の深い相関が示唆されつつあ る。 骨代謝疾患を罹患したモデル動物を用いて、 骨代謝疾患治療法を検 討 · 確立することは、 骨代謝疾患患者の Q O Lの改善につながる有用な 情報を提供することを可能とする。
骨疾患の中でも、 骨量低下を指標とする骨粗鬆症等の骨折の危険率が 上がる骨疾患に関しては、 非侵襲的かつ簡便という理由から、 その疾患 の予防と診断を目的とした骨塩量をパラメ一夕とした診断機器 （骨塩量 測定装置） の開発と技術の向上には著しいものがあった。
一方、 骨代謝疾患に関する診断については、 1970年代に骨標識法を用 いた形態学的観察に基づく骨形態計測診断法が開発されたものの.、 利便 性に難点があるため、 臨床現場では骨塩量測定装置ほどは汎用されてい ない。'
アデニン誘発腎障害モデルラッ ト （アデニンモデル） は、 慢性腎不全 1),2),3) のモデル動物である。 このモデルの腎不全と骨量低下の関係に 着目し、 モデルの大腿骨の骨密度 （骨塩量） を骨塩量測定装置で測定し た結果、 骨塩量には減少傾向が観察され、 この病態に E P Oを投与する と、 骨塩量に回復傾向が観察されたという報告がある 4)。
本発明者らは、 以前よりこのアデニンモデルを腎不全とその合併症の 観点から精査し、 腎不全を来たした病態では、 ヒトでの腎不全合併症と 同様の、 二次性副甲状腺機能亢進症、 異所性石灰化、 また骨代謝疾患で ある腎性骨異栄養症といった合併症を呈する病態モデル動物であること を報告してきた 5), 6)。
腎性骨異栄養症等の骨代謝疾患の本態を探るためには、 骨代謝に関連 する骨芽細胞や破骨細胞の骨組織における量的バランスと、 時間的概念 を加味した機能的かつ経時変化に基づく、 病理組織学的手法による最終 解析が必要不可欠である。 骨塩量の測定による非侵襲的診断法のみでは 骨代謝疾患の一部である骨粗鬆症等の疑いがわずかに判明するだけであ り、 骨代謝疾患の本態を解析し、 類推することは不可能であった。
[発明の開示]
このように骨代謝疾患のみならず形態学的変化を伴う疾患であれば、 他領域例えば癌などの場合も同様に、 その病態の確定診断は、 定量化に 加え、 組織診断の所見をも加味しなければならない。 ここに病理組織学 的診断が、 最終診断とされる科学的根拠があり、 本発明においてはこの 手法を第一義と捉え、 骨塩量の測定だけでは判定できなかった骨代謝疾 患への予防 · 治療効果を、 この手法を用いて確認しょうとするものであ る。
本発明の目的は、 腎不全患者の骨代謝異状の予防と治療に有効である 予防 ·治療薬を提供することにある。
本発明者らは、 アデニンモデルを用いて、 このモデルでの骨代謝疾患 の本態を探るために、 さらに E P 0の骨代謝への影響を精査するために、 骨代謝に関連する骨芽細胞や破骨細胞の骨組織における量的バランスと 機能的かつ経時変化に基づく最終解析が必要と考え、 十分な病理組織学 的検索を実施した。 その結果、 アデニンモデルへ E P Oの投与を行うこ とで、 骨代謝異状、 特に腎性骨異栄養症を改善する作用があることを見 出し、 本発明に到達した。 [図面の簡単な説明]
図 1は、 アデニン腎炎ラッ ト （溶媒投与群） の大腿骨骨幹端の組織標 本を撮影した写真である （ 8倍、 H E染色）。
図 2は、 上記図 1 と同様の組織標本を撮影した写真である。 但し、 倍 率は 8 0倍である。
図 3は、 アデニン腎炎ラッ 卜 （E P O投与群） の大腿骨骨幹端の組織 標本を撮影した写真である （ 8倍、 H E染色）。
図 4は、 上記図 3 と同様の組織標本を撮影した写真である。 但し、 倍 率は 8 0倍である。
図 5は、 正常ラッ 卜の大腿骨骨幹端の組織標本を撮影した写真である ( 8倍、 H E染色）。
図 6は、 正常ラッ ト （E P O投与群） の大腿骨骨幹端の組織標本を撮 影した写真である （ 8倍、 H E染色）。
[発明を実施するための形態]
本発明は、 従来の骨代謝疾患の非侵襲性診断技術， 例えば、 骨塩量の 測定等、 によっては不可能であった、 アデニンモデルの骨病変に対する E P Oの治癒効果を病理組織学的所見として見出したものである。
アデニンモデルは、 アデニンを含む餌を調整し、 これを一定期間摂餌 させることにより、 不可逆的な腎障害を惹起し、 慢性腎不全の病態を呈 するモデルである。 アデニン摂餌開始 4 日目より、 アデニンの代謝物で ある 2， 8—ジヒ ドロキシアデニン （2,8-dihydroxyadenine) が析出 ' 結晶化して沈着物となる。 このために尿細管には閉塞が起こり、 周囲の 組織障害が惹起されて不可逆的な腎障害に至り、 慢性腎不全が形成され る段階では、 貧血、 腎性骨異栄養症、 2次性副甲状腺機能亢進症、 異所 性石灰化等のヒトの慢性腎不全患者の合併症と類似の病態を呈する。 本発明の E P Oの適応疾患としては、骨代謝異状を示す骨疾患であり、 腎不全に伴う骨異栄養症、 大理石病、 糖尿病性腎症、 骨粗鬆症等が挙げ られる。
E P Oは、 アデニン誘発による腎性骨異栄養症の骨代謝異状の病理組 織学的所見を正常化させた。 以下に、 骨および骨髄の病理組織学的所見 を説明する。
後の実験例において述べるが、 使用した全てのアデニンモデルについ て、 骨幹部皮質骨における腎性骨異栄養症が、 軽度ないし重度に観察さ れた。 これら中等度以上の骨異栄養症の骨幹端においては、 2つの異な る特徴的な病理組織学的所見が得られた。
まず、 膝関節部の大腿骨骨幹端からより骨幹部により近い部分 （海綿 骨近位部） は、 骨髄と境界を形成するように第一次海綿骨の残存ないし は類骨形成を伴う未熟な骨基質の増加が観られ、 骨幹部骨髄との連続性 を欠き骨髄組織に乏しく血管形成は稀である （図 1 )。 これらの海綿骨で は、 骨芽細胞は見られるが、 破骨細胞は殆ど観察されず骨吸収は停滞し その結果、 骨代謝が遅延し軟骨基質を残存している （図 2 )。 これらの海 綿骨近位部の病変部と骨端軟骨の間 （海綿骨遠位部） には、 少数ながら 破骨細胞、 骨芽細胞、 海綿骨周囲の線維芽細胞から成る骨異栄養症の典 型的な海綿骨組織が長軸に対して横断的に帯状に観察される （図 1 )。
E P O投与によりこれら海綿骨近位部、 遠位部ともにそれらの骨表面 には破骨細胞による骨吸収腔や活性化骨芽細胞の増加が見られ、 同時に 骨髄腔には、 赤血球を入れる血管形成が多くの部位で観られた （図 3 )。 この血管内の赤血球増加は、 骨幹部皮質骨内や骨吸収腔の小血管におい ても観られた。 また海綿骨周囲には、 線維芽細胞が残存するが、 活性化 した破骨細胞と骨芽細胞が観られ骨基質は非薄化して層状骨を形成し、 成熟した海面骨として観察された （図 4 )。
アデニンモデルにおける骨および骨髄病変への E P O投与による病理 組織学的改善効果として以下の様に要約される。 アデニンモデルでは、 その腎病変はアデニン摂餌数日後より発症し血中リン値の上昇、 活性化 VDの低下、 P THの産生亢進等により骨代謝異状も早期に惹起される。 これらの骨病変は、 海綿骨において二分される。 初期アデニンの摂餌期 間である 4週間の骨代謝異状は、 海綿骨遠位部に観られ、 骨吸収低下に 基づく リモデリングの遅延を主体とする類骨組織の増加と骨基質の残存 として観察される。 さらにその後、 正常食摂餌への代替後 4週間におけ る腎機能の一過性の正常化があり、 その期間に骨代謝が行われる海綿骨 近位部では、 線維性骨炎を特徴とする病変が観察された。 これら両海綿 骨部に認められた経時的骨代謝異状の変化は、 摂餌切り替えにより惹起 された。 E P〇は後半の 4週間投与され、 骨髄では赤血球造血が亢進し 多数の赤血球を入れ充血した静脈 （類洞） が多数観察された。 E P O投 与により赤血球造血亢進のほか、 VE G F産生刺激に基づく血管形成と 骨幹部骨髄からの造血幹細胞生着と前破骨細胞の流入による骨吸収開始 とその結果惹起される骨形成とが誘導されたものと考えられる。 最終的 には E P O投与により、 両海綿骨部に認められた経時的骨代謝異状の海 綿骨は、成熟した層状骨を形成し骨髄組織の回復化傾向が同時に進行し、 骨骨髄両組織の病変の治癒が病理組織学的に観察された。
正常ラッ ト （図 5 ) に E P Oを投与しても顕著な形態学的変化は認め られなかった （図 6 )。
本発明で使用する活性成分であるエリスロポエチン （E P O) は 、 例 えば、 ヒト再生不良性貧血患者の尿から抽出して得られた天然のヒト E P O (特公平 1 — 3 8， 8 0 0号公報） や、 ヒ ト E P Oのアミノ酸配列 に対応するメッセンジャー RN A (mRNA) を採取し、 その mRNA を利用して組換 DNA体を作成し、 次いで適当な宿主 （例えば、 大腸菌 の如き菌類や、 酵母類や、 植物の細胞株や、 C O S細胞、 チャイニーズ ハムスター卵巣細胞 (CHO)、 マウス C— 1 2 7細胞等の動物の細胞株 等） で生産させる遺伝子組換技術により製造きれたもの 〔例えば、 特公 平 1 一 44， 3 1 7号公報、 K e n n e t h J a c o b s等， N a t u r e , 3 1 3 , 8 0 6〜8 1 0 ( 1 9 8 5 )〕 等を挙げることができる < また、 本発明で使用できる E P〇は、 上記由来のものの外に、 それら の改変体であってもよい。 E P O改変体としては、 例えば、 特開平 3 _ 1 5 1 3 9 9号公報に記載された改変体が挙げられる。 上記 E P O改変 体としては、 もとの糖蛋白質のペプチド鎖の A s nが G 1 n に変異し、 結合する N結合型糖鎖の結合数が変異したものがある。 また他に、 アミ ノ酸変異としては、 特開平 2— 5 9 5 9 9号公報、 特開平 3— 7 2 8 5 5号公報記載のものが挙げられる。 即ち、 E P Oの有する E P Oレセプ ターへの作用特性を失わない限り、 アミノ酸の変異、 欠失、 付加は何個 でもよい。
本発明の E P Oを有効成分とする製剤については、 その投与方法や剤 型に応じて必要により、 懸濁化剤、 溶解補助剤、 安定化剤、 等張化剤、 保存剤、 吸着防止剤等を添加することができる。 ここで、 懸濁化剤の例 としては例えばメチルセルロース、 ポリソルべ一ト 8 0、 ヒ ドロキシェ チルセルロース、 アラビアゴム、 トラガント末、 カルポキシメチルセル ロースナトリウム、 ポリオキシエチレンソルビ夕ンモノラウレート等を 挙げることができ、 溶解補助剤としては例えばポリオキシエチレン硬化 ヒマシ油、 ポリソルベート 8 0、 ニコチン酸アミ ド、 ポリオキシェチレ ンソルビタンモノラウレート、 マグロゴール、 ヒマシ油脂肪酸ェチルェ ステル等を挙げることができ、 安定化剤としては例えばヒ卜血清アルブ ミン、 デキストラン 4 0、 メチルセルロース、 ゼラチン、 亜硫酸ナトリ ゥム、 メタ亜硫酸ナトリウム等を挙げることができ、 等張化剤としては 例えば D—マンニトール、 ソルビ卜一ル等を挙げることができ、 また、 保存剤としては例えばパラォキシ安息香酸メチル、 パラォキシ安息香酸 ェチル、 ソルビン酸、 フエノール、 クレゾール、 クロ口クレゾ一ル等を 挙げることができ、 更に、 吸着防止剤としては例えばヒ ト血清アルブミ ン、 レシチン、 デキス トラン、 エチレンォキサイ ド · プロピレンォキサ イ ド共重合体、 ヒドロキシプロピルセルロース、 メチルセルロース、 ポ リォキシエチレン硬化ヒマシ油、 ポリエチレンダリコール等を挙げるこ とができる。
本発明の E P Oを有効成分とし、 安定化剤としてある種のアミノ酸を 添加することにより、 ヒ ト血清アルブミンゃ精製ゼラチンを含まない安 定な E P O溶液製剤を使用することもできる。 この安定な E P O溶液製 剤は特開平 1 0— 1 8 2 4 8 1号公報に記載されている。 この公報の説 明は本明細書の一部に含まれるものとする。
この E P O溶液製剤で安定化剤として添加するアミノ酸には、 遊離の アミノ酸ならびにそのナトリウム塩、 カリウム塩、 塩酸塩などの塩を含 む。 本発明の溶液製剤には、 これらのアミノ酸の 1種または 2種以上を 組み合わせて添加することができる。 好ましいアミノ酸は、 D—、 L 一 および D L—体のロイシン、 トリプトファン、 セリン、 グルタミン酸、 アルギニン、 ヒスチジンおよびリジンならびにその塩であり、 より好ま しいのは L —ロイシン、 L— トリプトファン、 L—グルタミン酸、 L 一 アルギニン、 L 一ヒスチジンおよび L —リジンならびに.その塩である。 特に好ましいのは、 L —アルギニン、 L —ヒスチジンおよび L —リジン ならびにその塩である。 最も好ましいのは L —ヒスチジンならびにその 塩である。
この安定な E P O溶液製剤の製法等の詳細については上記公報に記載 された通りである。
本発明の目的の予防、 治療薬における、 これら E P 0の投与量につい ては、 対象となる疾患やその病状等を配慮して適宜決定できるものであ るが、 投与量については、 通常成人 1人当たり 0 . l 〜 5 0 0 g、 好 ましくは 5〜： L O O gである。
以下に、 実験例及び実施例により、 本発明を更に詳細に説明する。 た だし、 本発明はこれら実施例、 実験例によって限定されるものではない。 なお、 実験例において、 本発明の効果を確認している。
[実験例]
(実験動物）
雄性 Wistar Rat (日本チャールズリバ一）を 5週齢で導入し、 2週間の馴 化の後、 7週齢にて実験に供した。
(投与薬剤および投与スケジュール）
( 1 ) 投与薬剤
E P O : ェポジン注 3000 (ェポェチン j3、 中外製薬（株））。 製剤を
vehicleにて 200 IU/mLに希釈した。
vehicle： 0.25%ゼラチン、 1.25% D-マンニト一ル含有 ImMリン酸
緩衝液 pH 7.4。
アデニン ： ラッ ト正常固形試料 （CE-2、 日本クレア（株）） の組成に、 アデニン（6-aminopurine)を重量比で 0.75%含む混餌固形 飼料を調製 （日本クレア（株）） し、 adenine混餌試料とした t ( 2 ) 投与群
投与群は、
adenine vehicle投与群 （アデニン試料を摂餌させ、 vehicleを投与） adenine E P O投与群 （アデニン試料を摂餌させ、 E P Oを投与） C E— 2群 （正常食を摂餌させ、 投与は実施せず） . を設定した。
( 3 ) 投与スケジュール
アデニン摂餌開始日を Day 0とした。
アデニンは、 adenine vehicle投与群および adenine E P O投与群に 対し、 実験開始から 4週間、 adenine 混餌試料を摂餌させて投与した。 実験開始 5週目から 8週目までの 4週間は正常餌を摂餌させた。 C E— 2群は、 実験開始から終了時まで正常餌を摂餌させた。
E P〇は、 実験開始 5週目から 8週目の 4週間、 2 0 0 IU/kg を背部皮 下（頸背部）に週 3回投与した。 Vehicleは、 実験開始 5週目から 8週目の 4週間、 背部皮下に週 3回投与した。 E P 0または vehicleは、 投与液量 をそれぞれ 1 mL/kgとした。
(臓器採取）
実験開始 8週目に解剖を行い、 腎臓、 副甲状腺、 大腿骨等を採取して ホルマリン固定を行った。
(組織標本作製）
ホルマリン固定の後、 大腿骨は脱灰操作を行った。 腎臓、 副甲状腺お よび脱灰後の大腿骨はパラフィン胞埋して、パラフィン切片を作製した。 それぞれ切片はへマトキシリン ^ェォジン （H E ) 染色して、 病理組織 学的検索を実施した。
(結果）
Wistar系ラッ トにアデニン混餌試料を 4週間摂餌させ、 その後正常食 を 4週間摂餌させた。 この処置により腎臓は、 尿細管腔の拡張、 尿円柱、 尿細管上皮の変性萎縮、 巨細胞形成を伴う上皮の増殖、 細胞浸潤を伴う 間質の肥厚など多彩な病変が観察された。 これらは、 アデニン摂餌によ つて腎機能低下を来たす病理組織学的所見であり、 彌慢性に中等度ない し重度に認められた。 副甲状腺は、 観察したアデニンモデル全例に増殖 性の腫大が観察され、 腺細胞の分裂像も多くの個体に認められた。 正常 食摂餌動物には、 この様な変化は見られなかった。 また、 この副甲状腺 の増殖性腫大の所見には、 E P O投与による影響は見られなかった。 骨および骨髄に関しては、 全例のアデニンモデルの骨幹部皮質骨にお いて腎性骨異栄養症が、 軽度ないし重度に観察された。 これら中等度以 上の骨異栄養症の骨幹端においては、 2つの異なる特徴的な病理組織学 的所見が得られた。
まず、 膝関節部の大腿骨骨幹端からより骨幹部により近い部分 （海綿 骨近位部） は、 骨髄と境界を形成するように第一次海綿骨の残存ないし は類骨形成を伴う未熟な骨基質の増加が観られ、 骨幹部骨髄との連続性 を欠き骨髄組織に乏しく血管形成は稀である （図 1)。 これらの海綿骨で は、 骨芽細胞は見られるが、 破骨細胞は殆ど観察されず骨吸収は停滞し その結果、 骨代謝が遅延し軟骨基質を残存している（図 2)。 これらの海綿 骨近位部の病変部と骨端軟骨の間 （海綿骨遠位部） には、 少数ながら破 骨細胞、 骨芽細胞、 海綿骨周囲の線維芽細胞から成る骨異栄養症の典型 的な海綿骨組織が長軸に対して横断的に帯状に観察される。
E P O投与により これら海綿骨近位部、 遠位部ともにそれらの骨表面 には破骨細胞による骨吸収腔や活性化骨芽細胞の増加が見られ、 同時に 骨髄腔には、 赤血球を入れる血管形成が多くの部位で観られた （図 3)。 この血管内の赤血球増加は、 骨幹部皮質骨内や骨吸収腔の小血管におい ても観られた。 また海綿骨周囲には、 線維芽細胞が残存するが、 活性化 した破骨細胞と骨芽細胞が観られ骨基質は非薄化して層状骨を形成し、 成熟した海面骨として観察された （図 4 )。
アデニンモデルにおける骨および骨髄病変への E P O投与による病理 組織学的改善効果として以下の様に要約される。 アデニンモデルでは、 その腎病変はアデニン摂餌数日後より発症し血中リン値の上昇、 活性化 VD の低下、 P T Hの産生亢進等により骨代謝異状も早期に惹起される。 これらの骨病変は、 海綿骨において 2分される。 初期アデニンの摂餌期 間である 4週間の骨代謝異状は、 海綿骨遠位部に観られ、 骨吸収低下に 基づくリモデリングの遅延を主体とする類骨組織の増加と骨基質の残存 として観察される。 さらにその後、 正常食摂餌への代替後 4週間におけ る腎機能の一過性の正常化があり、 その期間に骨代謝が行われる海綿骨 近位部では、 線維性骨炎を特徴とする病変が観察された。 これら両海綿 骨部に認められた経時的骨代謝異状の変化は、 摂餌切り替えにより惹起 された。 E P Oは後半の 4週間投与され、 骨髄では赤血球造血が亢進し 多数の赤血球を入れ充血した静脈 （類洞） が多数観察された。 E P O投 与により赤血球増殖亢進のほか、 V E G F産生刺激に基づく血管形成と 骨幹部骨髄からの造血幹細胞生着と前破骨細胞の流入による骨吸収開始 とその結果惹起される骨形成とが誘導されたものと考えられる。 最終的 には E P O投与により、 両海綿骨部に認められた経時的骨代謝異状の海 綿骨は、成熟した層状骨を形成し骨髄組織の回復化傾向が同時に進行し、 骨骨髄両組織の病変の治癒が病理組織学的に観察された。 正常ラッ ト（図 5)に E P Oを投与しても顕著な形態学的変化は認めら れなかった （図 6 )。
以下に、 製剤に関する実施例を示す。
[実施例 1 ]
エリスロポエチン 8 g
注射用蒸留水にて全量 2 m l
上記組成比で無菌的に溶液を調製し、 バイアル瓶に分注し、 密封した。
[実施例 2 ]
エリスロポエチン
注射用蒸留水にて全量 2 m l
上記組成比で無菌的に溶液を調製し、 バイアル瓶に分注し、 凍結乾燥し て密封した。 .
[実施例 3 ]
エリスロポエチン 1 6 g
注射用蒸留水にて全量 2 m l
上記組成比で無菌的に溶液を調製し、 バイアル瓶に分注し、 密封した。
[実施例 4]
エリスロポエチン 1 6 z g
注射用蒸留水にて全量 2 m l
上記組成比で無菌的に溶液を調製し、 バイアル瓶に分注し、 凍結乾燥し て密封した。
[実施例 5 ]
エリスロポエチン 8 a g
ヒ ト血清アルブミン 5 m g
注射用蒸留水にて全量 2 m l
上記組成比で無菌的に溶液を調製し、 パイアル瓶に分注し、 密封した。
[実施例 6 ]
エリスロポエチン 8 β g
ヒト血清アルブミン 5mg 注射用蒸留水にて全量 2m l
上記組成比で無菌的に溶液を調製し、 バイアル瓶に分注し、 凍結乾燥し て密封した。
[実施例 7 ]
エリスロポエチン 1 6 g
ヒ ト血清アルブミン 5 m g
注射用蒸留水にて全量 2 m l
上記組成比で無菌的に溶液を調製し、 バイアル瓶に分注し、 密封した。
[実施例 8 ]
エリスロポエチン 1 6 z g
ゼラチン 5 m g
注射用蒸留水にて全量 2 m l
上記組成比で無菌的に溶液を調製し、 バイアル瓶に分注し、 凍結乾燥し て密封した。
[実施例 9〜 1 2 ]
実施例 5〜 8におけるヒ ト血清アルブミンに代えて 5 mgのデキスト ラン 4 0を用い、 これら実施例 5〜 8と同様にして注射剤を調製した。
[実施例 1 3 ]
注射用蒸留水 1 0 0 m l 中に D—マンニトール 5 g、 エリス口ポェチ ン l mg、 ヒ ト血清アルブミン 1 0 0 m gを無菌的に溶解して水溶液を 調製し、 1 m 1ずつバイアル瓶に分注し、 凍結乾燥して密封した。
[実施例 1 4 ]
調剤溶液 1 m 1 中に以下の成分 ：
E P O 1 5 0 0国際単位 非イオン性界面活性剤 0. 0 5 m g
(ポリソルべ一ト 8 0 ： 日光ケミカル社製）
塩化ナトリウム 8. 5 m g
L一アルギニン塩酸塩 （S i gm a社製） 1 0 m g
を含み、 1 0 mMリン酸緩衝溶液 （和光純薬社製） にて p H 6. 0に調 整した溶液を、 5m l のガラスバイアルに 1 m 1充填し、 打栓、 密封し 溶液製剤に供した。
[実施例 1 5 ]
調剤溶液 1 m 1 中に以下の成分 ：
E P O 1 5 0 0国際単位 非イオン性界面活性剤 0. 0 5 mg
(ポリソルベート 8 0 ： 日光ケミカル社製)
塩化ナトリウム 8. 5 m g
L—ヒスチジン塩酸塩 （S i gm a社製） 1 0 m g
上記実施例 1 4と同様に溶液製剤を調製した。
[実施例 1 6 ]
調剤溶液 1 m 1 中に以下の成分 ：
E P O 1 5 0 0国際単位 非イオン性界面活性剤 0. 0 5 mg
(ポリソルベート 8 0 ： 日光ケミカル社製）
塩化ナトリウム 8. 5 m g
L一リジン塩酸塩 （S i gm a社製） 1 O mg
上記実施例 1 4と同様に溶液製剤を調製した。 [産業上の利用可能性]
本発明の E P 0有効成分とする製剤は、 既報の E P Oによる赤血球増 加作用とは別に、 骨疾患、 特に骨代謝異状に基づく骨疾患に対して、 骨 および骨髄の病変治癒による改善作用をもたらす新規の予防 · 治療剤で あり、 その対象病態は、 骨代謝異状を示す骨疾患であり、 腎不全に伴う 骨異栄養症、 大理石病、 糖尿病性腎症、 骨粗鬆症等である。
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6) Imazeki, 上., hkawa, H., Moriguchi, f., Imai, ., Matsubara, S., Saito, M. Rapidly progressive renal failure model rat induced by adenine diet. (「アデニン食により誘発された急速進行性腎不全モデルラ ッ ト」） J. Am. Soc. Nephrol. (ジャーナル · ォブ · ジ · アメリカン · ソサエティ · ォブ ' ネフロロジ一） ， 12: 816A (2001).
14
差替え用紙（繊 !J26)

Claims

請求の範囲
1. エリスロポエチン （E P O) を有効成分として含有する骨代謝疾 患治療剤。
2. 前記骨代謝疾患が、 腎不全に伴う骨異栄養症、 大理石病、 糖尿病 性腎症又は骨粗鬆症である、 請求項 1記載の治療剤。
3. 骨代謝疾患患者にエリスロポェチンを投与することからなる骨代 謝疾患の治療方法。
4. エリスロポエチンを通常成人 1人当たり 0. l〜 5 0 0 g、 好 ましくは 5〜 1 0 0 gを投与する、 請求項 2に記載の治療方法。
5. 前記骨代謝疾患患者が、 腎不全に伴う骨異栄養症、 大理石病、 糖 尿病性腎症又は骨粗鬆症のいずれかの疾患の患者である、 請求項 3に記 載の治療方法。
6. エリスロポエチン （E P O) を有効成分として配合する骨代謝疾 患治療剤の製造方法。
7. 前記骨代謝疾患が、 腎不全に伴う骨異栄養症、 大理石病、 糖尿病 性腎症又は骨粗鬆症のいずれかの疾患、 請求項 7に記載の治療剤の製造 方法。
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