WO2003104454A1 - 新規オキシダーゼ - Google Patents

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WO2003104454A1
WO2003104454A1 PCT/JP2003/007148 JP0307148W WO03104454A1 WO 2003104454 A1 WO2003104454 A1 WO 2003104454A1 JP 0307148 W JP0307148 W JP 0307148W WO 03104454 A1 WO03104454 A1 WO 03104454A1
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amino acid
acid sequence
seq
screening
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政勝 川上
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Yamanouchi Pharmaceutical Co Ltd
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Yamanouchi Pharmaceutical Co Ltd
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q2600/158—Expression markers
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
    • G01N2333/90209—Oxidoreductases (1.) acting on NADH or NADPH (1.6), e.g. those with a heme protein as acceptor (1.6.2) (general), Cytochrome-b5 reductase (1.6.2.2) or NADPH-cytochrome P450 reductase (1.6.2.4)

Definitions

  • the present invention relates to a polypeptide which is a novel oxidase, a polynucleotide encoding the polypeptide, a vector containing the polynucleotide, a transformed cell containing the vector, and a diagnosis useful for rheumatoid arthritis (abbreviated as RA). Testing methods and screening methods for substances for treating RA and substances for treating Z or osteoarthritis c
  • Nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase is an enzyme that receives electrons from NADPH and ultimately passes them on to oxygen molecules to produce reactive oxygen species (R0S).
  • the enzyme mainly present in phagocytes plays an important role in biological defense such as generation and sterilization of R0S against invasion of foreign substances such as microorganisms. Excessive production of R0S by this enzyme causes proteins and DNA to be cut and membranes damaged by lipid peroxides, etc., resulting in cell and tissue damage, and thus inflammatory diseases, vascular diseases, and neurodegeneration. It is known to cause various diseases including diseases, cancers, and heart diseases (see Non-Patent Documents 1 and 2). However, since the expression of NADPH oxidase, which produces R0S, is distributed systemically, side effects were a concern as a drug discovery target.
  • N0X1 a family of NADPH oxidases present in non-phagocytic cells, and reported that R0S is generated in a tissue-specific manner in addition to phagocytes (see Non-Patent Document 3). . N0X1 is reported to be present in large amounts in the large intestine and induces cell proliferation and induction of various gene expressions, suggesting that it is involved in various diseases in the large intestine.
  • the molecule is described as a factor present and functioning in the large intestine, such as being useful for diagnosis of colorectal cancer and development of a therapeutic agent for colorectal cancer.
  • Patent Document 3 describes a sequence having a high homology to N0X1, and that this sequence is involved in the production of active oxygen and is useful for treating diseases associated with abnormal cell proliferation such as cancer and benign prostatic hyperplasia. Has been described.
  • RA is a chronic inflammatory disease of unknown origin that causes the lesion to reside in the synovial tissue and causes redness, swelling, warmth, pain, restricted movement, and destruction of joints.
  • interleukin-1 interleukin-U IL-1
  • interleukin-6 interleukin-6
  • IL-8 interleukin-8
  • IL-12 interleukin-12
  • IL-15 15
  • interleukin-18 IL-18
  • tumor necrosis factor or tumor necrosis factor-a % TNF-a) Nitric oxide, NO
  • PGs prostaglandins
  • Non-Patent Document 6 Using monoclonal antibodies, soluble receptors, etc., have been developed, and their efficacy has attracted attention (see Non-Patent Document 6). ). However, there is a group of patients who do not achieve complete remission by conventional therapy targeting the therapeutic target molecule (see Non-Patent Document 7). C Therefore, identification of a new therapeutic target molecule that differs from existing reports Is desired.
  • R0S is known to activate NF / cB, a transcription factor that induces the expression of various molecules, through redox control (see Non-Patent Document 8).
  • TNFa known as an inflammatory cytokine
  • C0X-2 known as a prostaglandin synthase
  • Non-Patent Document 11 US universities have defined criteria for classification of RA (see Non-Patent Document 11), but these criteria are merely landmarks and their disease patterns are diverse, so RA diagnosis, c particular quantitative and simple diagnosis has been considered difficult There is a need for a quantitative and simple method of diagnosing RA.
  • Patent Document 1 International Publication W002 / 06515 Pamphlet
  • Patent Document 2 International Publication W001 / 96390 Breadlet
  • Patent Document 3 International Publication W000 / 28031 Pamphlet
  • Non-Patent Document 1 “Trend-in” Pharmacological Science
  • Non-Patent Document 3 “Nature”, (UK), 1999, Vol. 401, pp. 79-82 (Non-Patent Document 4) “Science” (USA), 2000, 287 Vol., P.138 (Non-Patent Document 5) "The 'Journal' ob 'Experimental” Medisin
  • Non-Patent Document 6 "Current Pharmaceutical Biotechnology” J, (USA), 2000, Volume 1, p.217-233
  • Non-Patent Document 7 “Nature Review I” (Nature Reviews I union), (UK), 2002, Volume 2, p.364-371
  • Non-Patent Document 9 “Arthritis & Rheumatism J (US), 1999, Vol. 36, p.1681-1690
  • Non-Patent Document 11 J. Axford (vJ. Axford), ed.
  • NOX1-b novel oxidase gene full-length sequence from synovial cells derived from a human RA patient. Furthermore, they found that the N0X1-b gene was not expressed on synovial cells derived from healthy individuals, but was specifically expressed on synovial cells derived from RA patients.
  • the use of (PGR) primers has enabled a useful test method as a diagnostic method for RA.
  • a screening method for a substance for treating RA or a substance for treating osteoarthritis was constructed by utilizing the N0X1-b gene.
  • the present invention was completed by providing a novel oxidase N0X1-b, a test method useful for diagnosing RA, and a screening method for a substance for treating RA and a substance for treating Z or osteoarthritis. That is, the present invention
  • polypeptide that contains the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and that is specifically expressed in a rheumatoid arthritis patient; or (2) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 Or a polypeptide comprising an amino acid sequence in which several amino acids have been deleted and / or inserted, and which is expressed specifically in a rheumatoid arthritis patient; [2] a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 Beptide,
  • amino acid having a homology of 950/0 or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 A gene containing a nucleotide sequence of a polynucleotide that encodes a polypeptide that specifically expresses a RA patient
  • ii) Includes an amino acid sequence having a homology of 95% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and also includes the nucleotide sequence of a polynucleotide encoding a polypeptide expressed specifically in RA patients.
  • Kit for rehabilitation of joints including forward and reverse brammers designed to specifically amplify
  • polypeptide according to [1] or [2], or an amino acid sequence having a homology of 95% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and is specifically expressed in RA patients The screening method according to [8], wherein the substance that inhibits the activity of the polypeptide is a substance for treating rheumatoid arthritis and / or a substance for treating osteoarthritis.
  • a method for producing a pharmaceutical composition for treating RA and for treating osteoarthritis or RA is provided.
  • a protein having high homology to the polypeptide of the present invention (with 49 amino acids inserted between Nos. 432 and 433 of SEQ ID NO: 2) was found in database GENPEPT under accession numbers AF127763, AF166327, and database SWISSPROT. It has been registered as accession numbers Q9Y5S8 and Q9WV87, and is reported in Science287: 138 (2000), Nature401: 79 (1999), and W002 / 06515.
  • a protein having high homology to the polypeptide of the present invention (16 amino acids are inserted between the 80th and 81st incense of SEQ ID NO: 1 and 49 amino acids are inserted between the 432rd and the 433rd incense).
  • W000 / 28031 describes a protein having high homology to the polypeptide of the present invention (49 amino acids inserted between the 432rd and 433rd scents of SEQ ID NO: 2). It is described that it is involved.
  • the protein is specifically highly expressed in the large intestine, and is useful for treating diseases related to abnormal cell proliferation such as cancer and benign prostatic hyperplasia.
  • diseases related to abnormal cell proliferation such as cancer and benign prostatic hyperplasia.
  • the international publication does not confirm the expression of the protein in synovial tissue and does not confirm whether or not the protein is specifically expressed in RA patients.
  • the protein enhances the expression levels of TNF o? And G0X-2, which are the causes of RA.Therefore, there is no information that the protein is useful as a target for RA testing or RA treatment. Absent.
  • the polypeptide of the present invention is not present in the synovium derived from a healthy subject but specifically present in the synovium derived from an RA patient, and the polypeptide of the present invention is a target for RA treatment. Is a finding that the present inventors have found for the first time, and a method for testing RA and a method for screening a substance for treating RA by using them are the first inventions made by the present inventors. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • FIG. 1 is a diagram showing an increase in N0X1-b mRNA expression in synovial cells derived from RA patients.
  • FIG. 2 is a diagram showing R0S-producing activity of N0X1-b and inhibition by DPI.
  • FIG. 3 is a graph showing an increase in GOX-2 mRNA expression in N0X1-b expressing cells and inhibition by DPI.
  • FIG. 4 is a diagram showing an increase in TNF-of mRNA expression in N0X1-b-expressing cells and inhibition by DPI.
  • RA is used as an abbreviation of “rheumatoid arthritis”.
  • the Japanese translation of RA was “rheumatoid arthritis”, but the Japanese Society for Rheumatoid Arthritis in 2002 announced that the Japanese translation of RA was changed from “rheumatoid arthritis” to "rheumatoid arthritis j". Therefore, it was followed in this specification.
  • polypeptide that contains the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and that is specifically expressed in RA patients, or that one or several amino acids are deleted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, And / or a polypeptide comprising an inserted amino acid sequence and also specifically expressed in RA patients; (hereinafter referred to as a functionally equivalent variant)
  • “Functional equivalent variant J of the present invention” includes "a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and which is specifically expressed in RA patients”; In the amino acid sequence represented by No. 2, 1 to 10, preferably 1 to 7, and more preferably 1 to 5 amino acid sequences are deleted and / or inserted, and And a polypeptide specifically expressed in RA patients.
  • polypeptide of the present invention has been described above, the polypeptide consisting of the amino acid represented by SEQ ID NO: 2 and the functionally equivalent variant of the present invention are collectively referred to as “the polypeptide of the present invention”. Called.
  • a protein that is a polypeptide consisting of the amino acid represented by SEQ ID NO: 2 is referred to as “ ⁇ -b protein”.
  • polypeptide of the present invention examples include “a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2” and “a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and which is specifically expressed in RA patients.
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 1 to 10, preferably 1 to 7, and more preferably 1 to 5 amino acids are deleted and / or inserted amino acids.
  • Preferred is a "polypeptide comprising a sequence and expressed in an RA patient-specific manner", and more preferred is a polypeptide J consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the polynucleotide of the present invention may be any nucleotide sequence encoding the N0X1-b protein represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or a functionally equivalent variant thereof.
  • it is a polynucleotide having a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and further preferably, it is the polynucleotide of SEQ ID NO: 1.
  • the method for producing the polynucleotide of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include (1) a method using PGR, (2) a conventional genetic engineering technique (that is, transformation using a GDNA library).
  • the term “the novel protein J of the present invention” refers to the polypeptide of the present invention (eg, NOX-1b protein) and the term “the gene of the present invention” refers to the polynucleotide of the present invention (eg, N0X1-b). Read as For details,
  • the polynucleotide of the present invention can be produced by the procedure described in the first production method.
  • MRNA is extracted from cells or tissues capable of producing the protein of the present invention, for example, from synovium derived from a human RA patient.
  • the mRNA is subjected to a reverse transcription enzyme reaction in the presence of a random primer or an oligo dT primer to synthesize a first-strand cDNA.
  • the polynucleotide of the present invention or a part thereof is obtained.
  • PGR polymerase chain reaction
  • the target gene is amplified by the method described in Example 1 using, for example, the sequences represented by SEQ ID NOS: 5 and 6 as primers.
  • SEQ ID NOS: 5 and 6 the sequences represented by SEQ ID NOS: 5 and 6 as primers.
  • the expression vector, the host cell, and the method for producing the protein of the present invention are described in, for example, “Embodiments of the Invention” in the above-mentioned patent document. 2) Production of the vector, the host cell of the present invention, and the recombinant protein of the present invention. It can be performed by the method described in the method. More specifically, the expression vector of the present invention is expressed in mammalian cells by the method described in Example 2 using pcDNA3.1 / HisB, and the host cell and protein of the present invention are NI H3T3 It can be produced by the method described in Example 3 in which cells are transformed with a transfection reagent.
  • the polynucleotide of the present invention itself can be used as a hybridizing probe in the RA test method described below, and is useful for RA test. Further, the polypeptide of the present invention can be used as a control for producing an antibody that specifically recognizes the polypeptide of the present invention, and for detecting and / or quantifying the expression level.
  • NOXl-b was not expressed in samples derived from healthy subjects, and N0X1-b was specifically expressed in samples derived from RA patients. Expression can be used to detect RA disease. Specifically, an embodiment including the following steps is exemplified. That is,
  • a gene containing the nucleotide sequence of the polynucleotide of the present invention that is, i) a polypeptide that contains the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and that is expressed specifically in RA patients;
  • a polypeptide containing an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, inserted, or inserted, and further expressed specifically in RA patients, or ii)) SEQ ID NO: 2 A gene comprising a nucleotide sequence of a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by :), or
  • the homologous polypeptide in the present invention is a “polypeptide containing an amino acid sequence having a homology of 95% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and specifically expressed in RA patients”.
  • the homology is not particularly limited, a polypeptide containing an amino acid sequence whose homology is preferably 97% or more, more preferably 99% or more is preferable.
  • the homologous polypeptide in the present invention can be produced by the same production method as the polypeptide of the present invention.
  • the polypeptide of the present invention and the homologous polypeptide of the present invention are collectively referred to as the screening polypeptide of the present invention.
  • As the polypeptide for screening of the present invention a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is particularly preferable.
  • the expression level of a gene in the method for testing RA of the present invention includes transcription of the gene into mRNA and translation into a protein. Therefore, the method for testing RA according to the present invention provides an expression level of mRNA corresponding to a polynucleotide (eg, N0X1-b gene) encoding the polypeptide for screening of the present invention, or a method coded by the gene. This is based on a comparison of the expression levels of the proteins.
  • a polynucleotide eg, N0X1-b gene
  • the method of measuring the expression level of a gene (eg, NOX1-b gene) in step [1] can be performed according to a known gene analysis method.
  • a hybridization technique using a nucleic acid that hybridizes to the N0X1-b gene as a probe or a gene amplification technique using a DNA that hybridizes to the N0X1-b gene as a primer can be used.
  • the measurement can be carried out using synovial cell-derived nucleic acid obtained from a subject, such as mRNA.
  • the amount of mRNA is measured by a gene amplification reaction using a primer designed to specifically amplify a polynucleotide (eg, N0X1-b sequence) encoding the screening polypeptide of the present invention. It can be measured by the method.
  • the method of the gene amplification reaction is not particularly limited, but a PGR method, a nucleic acid amplification method using an RNA polymerase, or the like can be used. More specifically, it can be carried out by the method described in Example 4.
  • the primer used in the RA test method of the present invention or the primer contained in the RA test kit is the primer of the present invention.
  • the screening polypeptide of the present invention is not particularly limited as long as it can specifically amplify a polynucleotide encoding the screening polypeptide (eg, NOX1-b sequence). It can be designed based on the polynucleotide (eg, N0X1-b base sequence). Preferably, they are the oligonucleotides described in SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6.
  • the RA inspection using the hybridization technology can be performed using, for example, Northern hybridization, dot plotting, DNA microarray, and the like. Furthermore, it can be implemented by using gene amplification technology such as RT-PGR.
  • gene amplification technology such as RT-PGR.
  • the gene containing the polynucleotide encoding the screening polypeptide of the present invention (for example, N0X1-b gene) is used by using the PGR amplification monitor (real-time PGR) method in the gene amplification process. It is possible to perform a more quantitative analysis on the occurrence of As a PCR amplification monitoring method, for example, ABI PRI SM7700 (Applied Biosystems) can be used.
  • the expression level is determined by using a protein comprising the screening polypeptide of the present invention.
  • a method of measuring by detecting NOX1-b protein is possible.
  • a test method for example, a cell extract derived from synovial cells obtained from a subject is used.
  • An antibody that binds to a protein comprising the screening polypeptide of the present invention preferably a NOXl-b protein More preferably, Western blotting, an immunoprecipitation method, an ELISA method, or the like using an antibody that specifically binds to N0X1-b can be used (in step [2], obtained in step [1]).
  • the comparison method is not particularly limited as long as the expression level is compared with the expression level in a healthy subject, and the comparison can be made by, for example, the method described in Example 4.
  • the RA test kit of the present invention contains at least forward and reverse primers designed to specifically amplify a polynucleotide encoding the screening polypeptide of the present invention.
  • forward and reverse primer pairs include primers represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6. It is.
  • Other reagents that can be included in the RA test kit of the present invention include reagents necessary for performing PGR (eg, Taq polymerase, nucleotide substrate, buffer, etc.).
  • the screening method of the present invention includes a method of screening a substance that suppresses the activity of the screening polypeptide of the present invention, and a method of screening a substance for treating RA and a substance for treating Z or osteoarthritis. It is.
  • the method for screening a substance that suppresses the activity of the polypeptide for screening of the present invention is not particularly limited as long as the method includes the following steps ( ⁇ ) to (iiii).
  • a substance that suppresses the activity of the screening polypeptide of the present invention can be screened by the method described in Example 5.
  • TNF known as an inflammatory cytokine
  • G0X-2 known as a prostaglandin synthase
  • a substance for treating RA and / or a substance for treating osteoarthritis can be screened.
  • C0X-2 expression level and TNF expression level were significantly enhanced in cells expressing N0X1-b, one of the polypeptides of the present invention. (Examples 6 and 7).
  • this G0X-2 expression induction and TNFo? Expression induction was inhibited by DPI, which is an inhibitor of N0X1-b, so that G0X-2 and TNFo; were controlled through redox control by R0S derived from ⁇ -b, one of the polypeptides of the present invention.
  • the method for screening a substance that suppresses the activity of the screening polypeptide of the present invention can be used as a method for screening a substance for treating RA and / or a substance for treating osteoarthritis.
  • the method of screening for a substance for treating osteoarthritis is not particularly limited as long as it includes the following steps (i) to (iii).
  • the substance obtained by the above screening method By subjecting the substance obtained by the above screening method to a known evaluation system for RA therapeutic agents or an improved evaluation system, it is determined whether or not the substance is useful as a therapeutic agent for RA.
  • the confirmation of RA treatment activity was confirmed in collagen-induced arthritis model mice (Fiona ⁇ Duris et al., Glin. I ⁇ unol.
  • screening method of the present invention for example, based on the difference in the method used to analyze (measure or detect) the activity of the screening polypeptide of the present invention, for example,
  • the substance that suppresses the activity of the screening polypeptide, the substance for treating RA, and / or the substance for treating osteoarthritis of the present invention can be screened using a chemico-biochemical method.
  • chemical-biochemical methods include (i) a screening method using the cytochrome G reduction method, (ii) a screening method using the reduction of nitro blue tetrazolium (NBT), and ((i) ) A screening method utilizing reduction of water-soluble triazolum salt can be mentioned.
  • the detection by the cytochrome G reduction method utilizes the fact that when oxidized cytochrome G is reduced, it changes to a reduced form with a strong absorption at 550 nm ( ⁇ M. McCord and I.
  • the NBT reduction method utilizes the fact that NBT is reduced by O 2 — to produce water-insoluble blue formazan (absorption maximum 560 nm) (C. Beauchamp and Fridovich, Anal. Biochem., 44, 276 ( 1971)).
  • a cell expressing the screening polypeptide of the present invention is prepared. Add the test substance, add an appropriate amount of probe (eg, cytochrome G), and incubate for a certain period of time. After the reaction, the absorbance at 550 ntn is measured. If the conversion to the reduced form is suppressed when the test substance is added, it can be determined that the test substance is a substance that suppresses the activity of the screening polypeptide of the present invention.
  • a screening method using the cytochrome G reduction method which is one of the methods, is preferably performed under the conditions described in Example 5.
  • the substance that suppresses the activity of the polypeptide for screening of the present invention it is preferable to select a substance that is 10i ⁇ M or lower, preferably lower than or equal to 0.1, more preferably lower than or equal to 0.1 ⁇ M.
  • Examples of the chemiluminescence method include (i) a screening method using a firefly luciferin derivative and a (ij) screening method using a luminol method.
  • the firefly luciferin derivative utilizes the fact that it reacts with O 2 — in an aqueous solution near neutrality to produce an excitable liponyl body, which emits strong light at 380 nm in the process of transition to the ground state ( Goto, T: Pure Appl Chem, Vol 7, 421-441, 1968).
  • Luminol detection is for aqueous alkaline solutions in the presence of O 2 — or H 2 O 2 HOG and K 3 produced Fe (GN) 6, K 2 S 2 0 8, Fe 2+ salt, Go 3+ Aminofuta Ichiru acid Jiani on is oxidized such as by (excited state), it transitions to the ground state It uses light emission during the process (Roswell, DFeta Method in Enzymology, Vol 5, 409-423, 1972).
  • a cell expressing the screening polypeptide of the present invention is prepared.
  • the test substance is added, and a probe (eg, firefly luciferin derivative) is added in an appropriate amount and allowed to act for a certain period of time. After the reaction, the emission at 380 nm is measured. If luminescence is suppressed when a test substance is added, it can be determined that the test substance is a substance that suppresses the activity of the screening polypeptide of the present invention.
  • a substance that suppresses the activity of the screening polypeptide of the present invention a substance that is preferably 1 uM or less, more preferably 0.1 uM or less is preferably selected.
  • ESR signal can be measured indirectly by using a spin trap method.
  • the ESR method utilizes the reaction of short-lived radical species with a trapping agent to generate stable radicals, and analyzes the ESR spectrum.
  • the most versatile spin trapping agent currently used is 5,5-dimethyl-1-pyrroline oxide (DMP0) (Y. Noda, K. Anzai, A. Mori, M. Kohno, M. Shinmei and L. Packer, Biochem. Mo I. Biol. Int., 42, 35 (1997)).
  • DMP0 5,5-dimethyl-1-pyrroline oxide
  • a cell expressing the screening polypeptide of the present invention is prepared. Add the test substance, and add an appropriate amount of a spin trap (eg, DMP0) and allow it to act for a certain period of time.
  • the test substance is a substance that suppresses the activity of the polypeptide for screening of the present invention.
  • the substance that suppresses the activity of the screening polypeptide of the present invention it is preferable to select a substance that is 10 jwM or less, preferably ⁇ ; / M or less, more preferably 0.1 j «M or less.
  • the test substance to be selected by the screening method of the present invention is not particularly limited.
  • various known compounds including peptides registered in a chemical file, combinatorial chemistry techniques ( Terrett, NK et al., Tetrahedron, 51, 8135-8137, 1995), or a phage display method (Fe lici, F. et al., ⁇ Mol. Biol., 222, 301-). 310, 1991) can be used.
  • Natural components derived from microorganisms, plants, marine organisms, or animals for example, culture supernatants or tissue extracts
  • a compound (including a peptide) obtained by chemically or biologically modifying a compound (including a peptide) selected by the screening method of the present invention can be used.
  • the present invention comprises a step of screening using the screening method of the present invention, and a step of formulating a substance using the substance obtained by the screening, for RA treatment and Z or A method for producing a pharmaceutical composition for treating osteoarthritis is included.
  • Formulations containing a substance obtained by the screening method of the present invention as an active ingredient include, depending on the type of the active ingredient, carriers, excipients, and / or other additives that are commonly used for the formulation thereof. It can be prepared using
  • Administration may be, for example, oral administration of tablets, pills, capsules, granules, fine granules, powders, or oral solutions, or injections such as intravenous, intramuscular, or joint injections, suppositories.
  • parenteral administration such as intravenous injection is preferred for peptides digested in the stomach.
  • one or more active substances and at least one inert diluent such as lactose, mannitol, glucose, microcrystalline cellulose, hydroxypropylcellulose, starch, polyvinyl It can be mixed with pyrrolidone or magnesium aluminate metasilicate.
  • the composition may contain additives other than an inert diluent, for example, a lubricant, a disintegrant, a stabilizer, or a solubilizing or solubilizing agent, according to a conventional method. Tablets or pills may be coated, if necessary, with a sugar coating or a gastric or enteric substance. / 07148
  • Liquid compositions for oral use can include, for example, emulsions, solutions, suspensions, syrups, or elixirs; commonly used inert diluents, such as purified water Or it may include ethanol.
  • the composition can contain additives other than inert diluents, for example, wetting agents, suspending agents, sweetening agents, fragrances, or preservatives.
  • Parenteral injections may include sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions, or emulsions.
  • the water-soluble solution or suspension may contain, as a diluent, for example, distilled water for injection or physiological saline.
  • examples of the diluent of the water-insoluble solution or suspension include, for example, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil (eg, olive oil), alcohols (eg, ebobo, ethanol), and polysorbate 80. be able to.
  • the composition may further contain a wetting agent, an emulsifier, a dispersant, a stabilizer, a solubilizing or solubilizing agent, a preservative, and the like.
  • the composition can be sterilized by, for example, filtration through a bacteria-retaining filter, blending of a bactericide, or irradiation.
  • a sterile solid composition can be produced and dissolved in sterile water or another sterile injectable medium before use.
  • the dose can be appropriately determined in consideration of the active ingredient, that is, the activity intensity, symptoms, age, sex, etc. of the substance obtained by the screening method of the present invention.
  • the dose is usually about 0.1 to 100 mg, preferably 0.1 to 50 mg per day for an adult (assuming a body weight of 60 kg).
  • the dosage is 0.01 to 50 mg, preferably 0.01 to 10 mg per day in the form of injection.
  • RNAeasy Protect Mini Kit RNAeasy Protect Mini Kit
  • mRNA was purified from synovial cells (HS-RA) derived from Toyobo's RA patients, and Superscript 11 (SUPERSCRIPT First-Strand Synthesis System for RT-PCR) was purified.
  • HS-RA synovial cells
  • Superscript 11 SUPERSCRIPT First-Strand Synthesis System for RT-PCR
  • a homemade GDNA produced by converting it to GDNA using (Gibco-BRL) was designated as type I.
  • An oligo DNA encoding the outside of the 0RF of N0X1 represented by SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 was synthesized, and after 94 minutes at 94 ° C using DNA polymerase (PLATINUM TM Taq DNA polymerase; Invitrogen).
  • the PGR reaction was performed 35 times at a cycle of 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, and 68 ° C for 3 minutes.
  • the GDNA obtained by this reaction was inserted into a cloning vector (TA Cloning Kit; Invitrogen) (N0X1 vector), and analyzed with the ABI3700 DNA Sequencer (Applied Biosystems) by the dideoxy terminator method. It was determined.
  • This gene was named N0X1-b.
  • the full-length nucleotide sequence of the gene is shown in SEQ ID NO: 1, and the deduced amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2.
  • N0X1-b encoded a novel protein in which the 433rd to 481st positions of N0X1 (Genbank accession number: AF127763) were spliced out.
  • Example 2 Cloning of M0X1-b full-length 0RF and construction of a protein expression plasmid
  • the N0X1-b vector prepared in Example 1 was EGORed, cut with Xhol, and a protein expression vector (PGDNA3.1 / HisB; Invitrogen) ) And inserted into the Xhol site to complete the full-length protein expression plasmid PGDNA3.1 / HisB ⁇ N0X1-b.
  • NIH3T3 cells (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) on a 10 cm plate at 1 ⁇ 10 6 cells and culturing for 12 hours
  • the expression plasmid pcDNA3.1 / HisB ⁇ bandage 1-b and empty vector prepared in Example 2 were prepared.
  • PGDNA3.1 / HisB was introduced into IH3T3 cells using a transfection reagent (FuGENE TM 6 Transfection Reagent; manufactured by Roche) according to the attached instructions.
  • the medium was replaced with serum-free 12 to 16 hours after introduction of the plasmid, and an additional 48- The culture was continued for 60 hours.
  • the transfected cells were washed with PBS and recovered with SDS sample buffer (SB).
  • the presence of the target protein in the SB was confirmed by Western blotting using an antibody that recognizes the G-terminal sequence common to the N0X1 protein and the N0X1-b protein as an epitope (Egret anti-M0X antibody; manufactured by Santa Cruz Inc.). That is, the collected S and B were electrophoresed on SDS / 4 ° / »to 20% acrylamide gel (Daiichi Pure Chemicals) (reduction conditions) and then applied to a PVDF membrane (Millipore) using a blotting device. Transcribed. Block ace (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) is added to the PVDF membrane after transfer, and blocking is performed.
  • biotinylated rabbit herb anti-IgG antibody M2; Sigma
  • horseradish baroxidase-labeled streptavidin Amersham Pharmacia
  • the expression of the target protein was confirmed using an EGL western blotting detection system (Amersham Pharmacia).
  • a band with a molecular weight of 52 ⁇ 0.5 kD was detected in the sample obtained from the cells transfected with pcDNA3.1 / HisB'N0X1-b, but no band was detected in the sample obtained from the cells transfected with the empty vector. It was found that HisB ⁇ N0X1-b was expressed in the pcDNA3.1 / HisB ⁇ N0X1-b transfected cells.
  • Example 4 Increased expression of N0X1-b mRNA in synovial cells derived from RA patients
  • the primer sequence represented by SEQ ID NO: 5 is a nucleotide sequence encoding a connection site where N0X1 is spliced out, that is, a site where the 432th and 482nd positions of the N0X1 protein are connected, and thus a sequence that does not recognize N0X1. Column. Therefore, the PGR products according to SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 are N0X1-b specific. Electrophorese the PCR product onto an agarose gel and mix with ethidium
  • the R0S productivity was measured by the cytochrome G reduction method.
  • empty vector-expressing cells and N0X1-b-expressing cells were placed in a 96-well multi-well plate for cell culture (abbreviated as multi-well plate) at 0.5 x 10 6 cells / 100. 1 / hole. Approximately 12 hours later Under each condition, 4.62 mg / ml of cytochrome C was added in 100 1 / well and mixed, and then the MultiI plate was set in a plate reader, and the absorbance at 550 nm was measured over time. .
  • Figure 2 shows the integrated value after one hour.
  • N0X1-b-expressing cells have remarkable R0S-producing activity compared to empty vector-expressing cells.
  • this activity was significantly suppressed by adding 1 M of diphenylene lodonium chloride (abbreviated as DPI), which is known as a NADPH oxidase inhibitor, 30 minutes before the addition of cytochrome G. ( Figure 2 ).
  • DPI diphenylene lodonium chloride
  • Figure 2 a NADPH oxidase inhibitor
  • the N0X1-b inhibitor DP I was added to the N0X1-b-expressing cells to a final concentration of I juM, and 3 hours later, the same RT-PGR as described above was prepared using a sample prepared by mRNA extraction. As a result, it was revealed that the induction of G0X-2 expression by NOX-1b expression was inhibited by DPI (Fig. 3). G0X-2 expression-inducing ability ⁇ Inhibition by DP I, suggesting that C0X-2 expression was induced via redox regulation by R0S derived from ⁇ -b.
  • Example 7 Increased expression of TNF mRNA in N0X1-b expressing cells
  • a probe primer encoding the TNFa-specific sequence represented by SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12 was synthesized, and a DNA polymerase (rTaq DNA po) was prepared for each GDNA sample prepared in Example 6. After 1 minute at 94 ° C, the cycle of 94 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 20 seconds, and 72 ° C for 30 seconds was performed 45 times using RT-PGR reaction (Lymerase; Toyobo Co., Ltd.). When the PGR reaction product was electrophoresed on agarose gel and DNA was detected by EtBr staining, a band of the size expected to be TNF was confirmed in the sample derived from N0X1-b-expressing cells.
  • the increased expression of the polynucleotide of the present invention was found to be an indicator of RA diagnosis because its increased expression is linked to the disease state.
  • the polynucleotide of the present invention and the expression of the polypeptide of the present invention encoded by the polynucleotide as an index, it has become possible to carry out an RA diagnosis test.
  • the present invention provides a novel oxidase that is specifically expressed in synovial cells derived from RA patients, and is expected to be applicable to an RA diagnosis test using PGR using its specific primer sequence.
  • the screening method of the present invention is useful for screening a substance for treating RA and / or a substance for treating osteoarthritis.

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Abstract

RAの診断、RA治療用物質及び／又は変形性関節炎治療用物質のスクリーニングに有用なオキシダーゼ遺伝子を開示する。また、RA診断法として有用な検査方法を開示する。更に、前記新規オキシダーゼ遺伝子を利用することによるRA治療用物質及び／又は変形性関節炎治療用物質をスクリーニングする方法を開示する。また、前記スクリーニング方法により得ることができる、前記オキシダーゼ阻害剤を有効成分とするRA治療用物質及び／又は変形性関節炎治療用医薬組成物の製造方法を開示する。

Description

明 細 書 新規ォキシダーゼ 技術分野
本発明は、 新規なォキシダーゼであるポリペプチド、 該ポリペプチドをコード するポリヌクレオチド、 該ポリヌクレオチドを含有するベクター、 該ベクタ一を 含有する形質転換細胞、 関節リウマチ （RA と略す） 診断に有用な検査方法及び RA治療用物質及び Z又は変形性関節炎治療用物質のスクリーニング方法に関する c
背景技術
ニコチンアミ ド -アデニンジヌクレオチドリン酸 （NADPH) ォキシダーゼは NADPH から電子を受け取り、 それを最終的に酸素分子に渡して活性酸素種 （R0S と略す） を生成する酵素である。 生理的には主に食細胞に存在する前記酵素は微 生物等の異物の侵入に対し、 R0S を生成し殺菌するような生体防御に重要な働き をしている。 し力、し、 この酵素による R0S の過剰な生成はタンパク質、 DNAの切 断や過酸化脂質による膜の損傷などを引き起こし、 細胞および組織の障害、 ひい ては炎症性疾患、 血管病、 神経変性疾患、 癌、 心疾患などをはじめとする様々な 疾患の原因となることが知られている （非特許文献 1、 非特許文献 2参照） 。 し かしながら、 R0S を生成する NADPHォキシダーゼはその発現が全身性に分布する ため、 創薬の標的としては副作用が懸念されていた。
一方、 最近の研究により非食細胞に存在する NADPHォキシダーゼファミリ一、 N0X1が同定され、 食細胞以外にも R0Sが組織特異的に生成されていることが報告 された （非特許文献 3参照） 。 N0X1 は大腸に多量に存在し、 細胞増殖や様々な遺 伝子発現誘導を引き起こすことが報告され、 大腸における様々な疾患に関わるこ とが示唆されている。
N0X1 と高い相同性を有するアミノ酸配列及び該配列をコードする塩基配列につ いては種々の報告がある。 データベースにおいてァクセッション番号 AF166328 48
2
( GENPEPT ) 、 AJ438989 ( GENPEPT ) 、 HSA438989 ( GENBANK ) 、 AF127763 ( GENPEPT ) 、 AF166327 ( GENPEPT ) 、 Q9Y5S8 (SWISSPROT) 、 及び Q9WV87 (SW!SSPROT) として登録され、 非特許文献 4、 特許文献 1、 特許文献 2に報告 されている。 これらの文献には当該分子は大腸癌の診断、 大腸癌治療薬の開発に 有用である等、 大腸に存在し機能する因子として記載されている。 特許文献 3に は、 N0X1 と相同性の高い配列が記載され、 当該配列が活性酸素の産生に関わるこ と、 癌、 前立腺肥大症等の異常細胞増殖に関わる疾患の治療に有用であることが 記載されている。
RAは滑膜組織に病変の主座を持ち、 関節の発赤、 腫脹、 熱感、 疼痛、 運動制限、 および破壊をもたらす原因不明の慢性炎症性疾患である。 RAの滑膜組織では、 ィ ンターロイキン- 1 (interleukin-U IL-1) 、 インターロイキン- 6 (IL-6) 、 ィ ンタ一ロイキン- 8 (IL-8) 、 インターロイキン- 12 (IL-12) 、 インタ一ロイキ ン- 15 ( - 15) 、 インターロイキン- 18 (IL-18) 、 腫瘍壊死因子 or (tumor necrosis factor- a % TNF- a ) などの炎症性サイト力イン、 一酸化窒素 （nitric oxide, NO) 、 プロスタグランジン （prostaglandins, PGs) などの過剰産生が知 られている （非特許文献 5参照） 。 近年、 モノクローナル抗体、 可溶性受容体な どを用い、 IL - 1、 IL-6 や TNF-0?を標的とした治療法が開発されその有効性が注 目を集めている （非特許文献 6参照） 。 しかし、 従来の治療標的分子を機序とす る治療法では完全寛解導入には至らない患者群が存在する （非特許文献 7参照） c 従って、 既存の報告とは異なる新しい治療標的分子の同定が望まれている。
R0S は酸化還元制御を介して （非特許文献 8参照） 、 様々な分子を発現誘導す る転写因子である NF/cB を活性化することが知られている。 NF/iB により発現誘 導を受ける分子のうち炎症性サイトカインとして知られる TNFaは抗 RA薬の標的 として （非特許文献 9参照） 、 プロスタグランジンの合成酵素として知られる C0X-2は RAや変形性関節炎の治療薬の標的として広く臨床においても認知されて いる （非特許文献 1 0参照） 。
一方、 米国の大学から RAの分類に関する基準が定義されているが （非特許文献 1 1参照） 、 これらの基準は単なるランドマークであり、 その病状パターンが多 様であるため、 RAの診断、 特に定量的かつ簡便な診断は困難であるとされてきた c 定量的かつ簡便な RAの診断方法が待望されている。
(特許文献 1) 国際公開 W002/06515号パンフレツト
(特許文献 2) 国際公開 W001/96390号パンフレツト
(特許文献 3) 国際公開 W000/28031号パンフレツト
(非特許文献 1) 「トレンド ·イン 'ファーマコロジカル■サイエンス（Trends
In Pharmacological Science) J , (米国) , 2000年, 第 21巻， p.119-120
(非特許文献 2) 「フェデレーション■ォブ■ ョ一口ビアン■バイオケミカル■ ソサエティ一 (Federation of European Biochemical - Society) J , (独国)， 1991 年， 第 281巻， p.9-19
(非特許文献 3) Γネイチヤー (Nature)」 ，（英国）， 1999年， 第 401巻， p.79-82 (非特許文献 4) 「サイエンス （Science) 」 （米国） ， 2000年， 第 287巻， p.138 (非特許文献 5) 「ザ'ジャーナル 'ォブ'エキスペリメンタル■メデイシン
(The Journal of Experimental Medicine) J , (米国）， 1991年， 第 173巻， p.569-
574
(非特許文献 6) 「カレント 'ファーマシューティカル 'バイオテクノロジー （ Current Pharmaceutical Biotechnology) J ，（米国）， 2000年， 第 1卷, p.217- 233
(非特許文献 7) Γネイチヤー■ レビューズ 'ィムノロジー（Nature Reviews I國 unology)」 ， （英国） ' 2002年， 第 2巻， p.364- 371
(非特許文献 8) 「ザ 'ジャーナル 'ォブ 'バイオロジカルケミストリー（The Journal of Biologicalchemistry) J ，（米国）， 1993年， 第 268巻， p.11380-11388
(非特許文献 9) 「アースライティス■アンド ' リウマテイズム (Arthritis & Rheumatism) J ，（米国）， 1999年， 第 36卷， p.1681-1690
(非特許文献 10) 「アースライティス 'アンド ' リウマテイズム (Arthritis & Rheumatism) J ，（米国）， 1998年, 第 41卷， p.1591-1602
(非特許文献 11) ジエー 'アツクスフォード（vJ.Axford)編， Γメデイシン
(Medicine) j , (米国) ,ブラックゥエルサイセンス（Blackwel I Science), 1996' 年， p3.18-3.22 発明の開示
本発明者は、 鋭意研究を重ねた結果、 ヒト RA患者由来滑膜細胞から新規なォ キシダーゼ （N0X1-bと称する） 遺伝子全長配列を取得することに成功した。 さら に、 N0X1 - b遺伝子は、 健常人由来滑膜細胞には発現しておらず、 RA患者由来滑 膜細胞に特異的に発現していることを見出し、 N0X1-b特異的なポリメラーゼ連鎖 反応 （PGR) プライマーを用いることにより RA診断法として有用な検査方法を可 能にした。 加えて、 N0X1- b遺伝子を利用することにより RA治療用物質及び 又 は変形性関節炎治療用物質のスクリーニング方法を構築した。 N0X1-bが発現して いない細胞に比較して N0X1-bが発現している細胞において、 RAや変形性関節症 治療薬の標的として知られる GOX - 2及び RA治療薬の標的として知られる TNFo?の 発現が有為に亢進していること、 また、 この G0X-2及び TNF の発現亢進は N0X1-b阻害剤により阻害されることを明らかにした。 これらの結果、 新規ォキシ ダーゼ N0X1-b、 RAの診断に有用な検査方法及び RA治療用物質及び Z又は変形性 関節炎治療用物質のスクリーニング方法を提供し本発明を完成した。 すなわち本発明は、
[1 ] (1 ) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列を含み、 しかも、 関節リウマチ 患者特異的に発現するポリペプチド、 あるいは、 （2) 配列番号 2で表されるァ ミノ酸配列において、 1または数個のアミノ酸が欠失、 及びノ又は挿入されたァ ミノ酸配列を含み、 しかも、 関節リウマチ患者特異的に発現するポリペプチド、 [2] 配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるポリべプチド、
[3] [1 ] または、 [2] に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
[4] [3] に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター、
[5] [4] に記載の発現ベクターで形質転換された細胞、
[6] (1 ) 被験者における、
ί ) [3] に記載の塩基配列を含む遺伝子、 又は
i i ) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列との相同性が 950/0以上であるアミノ酸 配列を含み、 しかも、 RA患者特異的に発現するポリペプチドをコードするポリヌ クレオチドの塩基配列を含む遺伝子
の発現レベルを測定する工程、 及び
( 2 ) 健常者における前記遺伝子の発現レベルと比較する工程
を含むことを特徴とする、 関節リウマチの検査方法、
[7] i ) [3] に記載の塩基配列を含む遺伝子、 又は
i i ) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列との相同性が 95%以上であるアミノ酸 配列を含み、 し力、も、 RA患者特異的に発現するポリペプチドをコードするポリヌ クレオチドの塩基配列を含む遺伝子
を特異的に増幅できるように設計した順方向及び逆方向ブラィマ一を含む関節リ ゥマチ検査用キッ卜、
[8] (1 ) [1 ] 若しくは [2] に記載のポリペプチド、 又は配列番号 2で表 されるアミノ酸配列との相同性が 95%以上であるアミノ酸配列を含み、 しかも、 RA患者特異的に発現するポリべプチドを発現している細胞に試験物質を接触させ る工程、 （2) 前記ポリペプチドの活性が抑制されるか否かを分析する工程、 及 び （3) 前記ポリペプチドの活性を抑制する物質を選択する工程
を含むことを特徴とする、 前記ポリペプチドの活性を抑制する物質をスクリー二 ングする方法、
[9] [1 ] 若しくは [2] に記載のポリペプチド、 又は配列番号 2で表される アミノ酸配列との相同性が 95%以上であるアミノ酸配列を含み、 しかも、 RA患者 特異的に発現するポリべプチドの活性を抑制する物質が関節リウマチ治療用物質 及ぴ 又は変形性関節炎治療用物質である、 [8] 記載のスクリーニングする方 法、
[1 0] [8] 又は [9] に記載のスクリーニング方法を用いてスクリーニング する工程、 及び
前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程
を含むことを特徴とする、 RA治療用及びノ又は変形性関節炎治療用医薬組成物の 製造方法
に関する。 配列番号 2からなる N0X1 - bの全長アミノ酸配列及び該配列をコードする塩基 配列と同一な配列に関する報告はないが、 高い相同性を有するアミノ酸配列及び 該配列をコードする塩基配列については種々の報告がある。 データベース GENPEPT 及び GENBANK においてァクセッション番号 AF166328 として本発明の N0X1-b配列と 1 アミノ酸、 1塩基異なる配列が登録されている。 また、 データべ ース GENPEPT及び GENBANKにおいてァクセッション番号 AJ438989及び HSA438989 として本発明の N0X1- b配列と 2アミノ酸、 4塩基異なる配列が登録されている。 しかしながら、 いずれにもこれらの配列からなる蛋白質が RA患者の滑膜に発現 することや RA治療の標的になることを示唆する記載はない。 本発明のポリぺプ チドと高い相同性を有する蛋白質 （配列番号 2の第 432番と第 433香の間に 49 ァミノ酸が挿入） がデータベース GENPEPTにおいてァクセッション番号 AF127763、 AF166327, データベース SWISSPROTにおいてァクセッション番号 Q9Y5S8、 Q9WV87 と して登録され、 Sc i ence287 ： 138 ( 2000 ) 、 Nature401 : 79 ( 1999 ) 、 W002/06515に報告されている。 また、 本発明のポリペプチドと高い相同性を有す る蛋白質 （配列番号 1の第 80香と第 81香の間に 16アミノ酸が挿入、 第 432番 と第 433香の間に 49アミノ酸が揷入) が蘭 1/96390に報告されている。 しかし ながら、 これらの文献には当該分子は大腸癌の診断、 大腸癌治療薬の開発に有用 である等、 大腸に存在し機能する因子として記載されており、 Aとの関連につい ては記載されていない。 W000/28031 には、 本発明のポリペプチドと高い相同性を 有する蛋白質 （配列番号 2の第 432香と第 433香の間に 49アミノ酸が挿入） が 記載され、 当該配列が活性酸素の産生に関わることが記載されている。 前記蛋白 質は大腸に特異的に高発現し、 癌、 前立腺肥大症などの異常細胞増殖に関わる疾 患の治療に有用であることが記載されている。 RAは滑膜で診断する必要があるが、 当該国際公開パンフレツ卜では滑膜組織における前記蛋白質の発現は確認してお らず、 RA患者特異的に発現しているか否かも確認していない。 更には、 前記蛋白 質が、 RAの原因である TNF o?及び G0X-2発現量を亢進させるか否かも確認してお らず、 RAの検査や RA治療の標的として有用であるという情報はない。
従って、 本発明のポリべプチドが健常人由来滑膜には存在せず RA患者由来滑 膜に特異的に存在すること、 本発明のポリペプチドが RA治療の標的となること は本発明者が初めて見出した知見であり、 更には、 これらを用いることにより RA を検査する方法、 RA治療用物質をスクリーニングする方法は本願発明者が初めて 行った発明である。 図面の簡単な説明
図 1は、 RA患者由来滑膜細胞における N0X1-b mRNAの発現上昇を示す図である。 図 2は、 N0X1 - bの R0S産生活性及び DP Iによる阻害を示す図である。
図 3は、 N0X1- b発現細胞における GOX-2 mRNAの発現上昇と DPI【こよる阻害を示す 図である。
図 4は、 N0X1- b発現細胞における TNF- of mRNAの発現上昇と DP Iによる阻害を示す 図である。
発明を実施するための最良の形態
本明細書において、 「RA」 は 「関節リウマチ」 の略 ΐ吾として用いる。 従来 RAの 日本語訳は 「慢性関節リウマチ」 であったが、 2002年の日本リウマチ学会におい て RAの日本語訳を 「慢性関節リウマチ」 から「関節リウマチ jと変更するとの発表 がなされているので、 本明細書ではそれに従った。
<本発明のポリぺプチド及びポリヌクレオチド>
本発明のポリぺプチドには、
( 1 ) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるポリべプチド；
( 2 ) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列を含み、 しかも、 RA患者特異的に発現 するポリペプチド、 あるいは、 配列番号 2で表されるアミノ酸配列において、 1 または数個のアミノ酸が欠失、 及び 又は挿入されたアミノ酸配列を含み、 しか も、 RA患者特異的に発現するポリペプチド； （以下、 機能的等価改変体と称する )
が含まれる。
「本発明の機能的等価改変体 J としては、 「配列番号 2で表されるアミノ酸配列 を含み、 しかも、 RA患者特異的に発現するポリペプチド」 、 あるいは、 「配列番 号 2で表されるアミノ酸配列において、 1〜1 0個、 好ましくは 1〜7個、 より 好ましくは 1〜 5個のァミノ酸が欠失、 及び 又は挿入されたァミノ酸配列を含 み、 しかも、 RA患者特異的に発現するポリペプチド」 が好ましい。
以上、 本発明のポリペプチドについて説明したが、 配列番号 2で表されるアミ ノ酸からなるポリべプチド及び本発明の機能的等価改変体を総称して、 以下、 「本発明のポリペプチド」 と称する。 「本発明のポリペプチド」 のうち、 配列番 号 2で表されるアミノ酸からなるポリべプチドである蛋白質を ΓΝΟΧ ΐ -b蛋白 質」 と称する。
本発明のポリべプチドとしては、 「配列番号 2で表されるアミノ酸配列からな るポリペプチド」 、 「配列番号 2で表されるアミノ酸配列を含み、 しかも、 RA患 者特異的に発現するポリペプチド、 あるいは、 配列番号 2で表されるアミノ酸配 列において、 1〜 1 0個、 好ましくは 1〜7個、 より好ましくは 1〜5個のアミ ノ酸が欠失、 及び 又は挿入されたアミノ酸配列を含み、 しかも、 RA患者特異的 に発現するポリべプチド」 が好ましく、 「配列番号 2で表されるアミノ酸配列か らなるポリペプチド J がより好ましい。
また、 本発明のポリヌクレオチドは、 配列番号 2記載のアミノ酸配列で示され る N0X 1 -b蛋白質、 その機能的等価改変体をコードする塩基配列なら何れでもよ し、。 好ましくは、 配列番号 2記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する ポリヌクレオチドであり、 さらに好ましくは、 配列番号 1記載の塩基配列である。 本発明のポリヌクレオチドの製造方法は、 特に限定されるものではないが、 例 えば、 （1 ) PGR を用いた方法、 （2 ) 常法の遺伝子工学的手法 （すなわち GDNA ライブラリ一で形質転換した形質転換株から所望のァミノ酸を含む形質転換株を 選択する方法） を用いる方法、 又は （3 ) 化学合成法などを挙げることができる 各製造方法については、 新規酵素の発明を開示した W001 /34785 の記載と同様に 実施できる。 ただし、 上記特許出願明細書における 「本発明の新規蛋白 J を本発 明のポリペプチド （例えば NOX- 1 b 蛋白質） 、 「本発明の遺伝子」 を本発明のポ リヌクレオチド （例えば N0X1-b) と読み替える。 詳細には、
PCR を用いた方法では、 例えば、 前記特許文献の 「発明の実施の形態」 1 ) 蛋 白質遺伝子の製造方法 a)第 1製造法に記載された手順により、 本発明のポリヌク レオチドを製造することができる。 本発明の蛋白質を産生する能力を有する細胞 あるいは組織、 例えば、 ヒ ト RA患者由来滑膜から mRNAを抽出する。 次いで、 こ の mRNAをランダムプライマ一またはオリゴ dTプライマーの存在下で、 逆転写酵 素反応を行い、 第一鎖 cDNAを合成することが出来る。 得られた第一鎖 GDNAを用 し、、 目的遺伝子の一部の領域をはさんだ 2種類のプライマーを用いてポリメラー ゼ連鎖反応 （PGR) に供し、 本発明のポリヌクレオチドまたはその一部を得るこ とができる。 より具体的には、 例えば配列番号 5及び配列番号 6で表される配列 をプライマーとして、 実施例 1に記載の方法により目的遺伝子を増幅する。 つい で、 増幅した遺伝子が RA患者特異的に発現しているか否かを例えば実施例 4に 記載の方法により確認し、 健常人に比して RA患者特異的に発現している遺伝子 を本発明のポリヌクレオチドとして選択することが出来る。
常法の遺伝子工学的手法を用いる方法では、 例えば、 前記特許文献の 「発明の 実施の形態」 1 ) 蛋白質遺伝子の製造方法 b)第 2製造法に記載された手順により、 本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。
化学合成法を用いた方法では、 例えば、 前記特許文献の 「発明の実施の形態」 1 ) 蛋白質遺伝子の製造方法 c)第 3製造法、 d)第 4製造法に記載された方法によ つて、 本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。
本発明の発現ベクター、 宿主細胞、 蛋白質の製造方法は、 例えば、 前記特許文 献の 「発明の実施の形態」 2 ) 本発明のベクター、 本発明の宿主細胞、 本発明の 組換え蛋白の製造方法に記載された方法により実施できる。 より具体的には、 本 発明の発現べクタ一はほ乳類動物細胞の発現べクタ一 pcDNA3. 1/H i sBを用い実施 例 2に記載の方法で、 本発明の宿主細胞及び蛋白質は N I H3T3細胞をトランスフエ クシヨン試薬で形質転換する実施例 3に記載の方法で製造できる。
本発明のポリヌクレオチドは、 それ自体後述の RAの検査方法においてハイブ リダィズプローブとして用いることができ、 RAの検査に有用である。 また、 本発 明のポリべプチドは、 本発明のポリべプチドを特異的に認識する抗体の作製や、 発現レベルを検出及び 又は定量する際のコントロールとして用いることができ る。 <RAの検査方法 ZRA検査用キット>
後述のように、 健常者由来のサンプルには NOX l -bが発現しておらず、 RA患者 由来のサンプルに特異的に N0X 1 - bが発現していることを見出したことから、 こ の発現を利用して RA疾患を検出することが出来る。 具体的には、 次の工程を含 む態様が例示される。 すなわち、
[ 1 ] 被験者における、
( 1 ) 本発明のポリヌクレオチドの塩基配列を含む遺伝子 （すなわち、 i ) 配列 番号 2で表されるアミノ酸配列を含み、 しかも、 RA患者特異的に発現するポリべ プチド、 ί ί ) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列において、 1または数個のァ ミノ酸が欠失、 及ぴ 又は挿入されたアミノ酸配列を含み、 しかも、 RA患者特異 的に発現するポリペプチド、 又は i i ί ) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列か らなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含む遺伝子） 、 又は
( 2 ) 配列番号 2で表されるァミノ酸配列との相同性が 95%以上であるアミノ酸 配列を含み、 しかも、 RA患者特異的に発現するポリペプチドをコードするポリヌ クレオチドの塩基配列を含む遺伝子
の発現レベルを測定する工程、 及び
[ 2 ] 健常者における前記遺伝子の発現レベルと比較する工程
、 である。
前記 （2 ) における 「配列番号 2で表されるアミノ酸配列との相同性が 90<½以上 であるアミノ酸配列を含み、 しかも、 RA患者特異的に発現するポリペプチド」 を 「本発明における相同ポリペプチド」 と称する。 本発明における相同ポリべプチ ドは、 「配列番号 2で表されるアミノ酸配列との相同性が 95%以上であるアミノ 酸配列を含み、 しかも、 RA患者特異的に発現するポリペプチド」 である限り、 特 に限定されるものではないが、 該相同性が、 好ましくは 97%以上、 更に好ましく は 99%以上であるアミノ酸配列を含むポリべプチドが好ましい。
なお、 本明細書における前記 「相同性」 とは、 BLAST (Bas i c l oca l a I i ngment search too A I tschu I， S. F.ら， J. Mo I . B i o I . , 215， 403-410, 1990)検索により得ら れた I dent it i es値を意味する。 なお、 パラメータ一では、 ペアワイズァラインメ ントパラメータ一として、
Γプログラム名」 として rb l astpj を、
「Gap揷入 Cost値」 を roj で、
「Gap伸長 Cost値」 を 「0」 で、
rwiatr i xj として 「BL0SUM62j を、
それぞれ使用する。
本発明における相同ポリべプチドは、 本発明のポリべプチドと同様の製造方法に より製造できる。 本発明のポリべプチドと本発明における相同ポリべプチドとを 併せて本発明のスクリーニング用ポリべプチドと称する。 本発明のスクリーニン グ用ポリべプチドとしては、 配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるポリぺ プチドが特に好ましい。
本発明の RAの検査方法における遺伝子の発現レベルとは、 該遺伝子の mRNAへの 転写、 並びに蛋白質への翻訳を含む。 従って、 本発明による RAの検査方法は、 本 発明のスクリーニング用ポリべプチドをコ一ドするポリヌクレオチド （例えば N0X 1 - b遺伝子） に対応する mRNAの発現レベル、 または、 該遺伝子によってコー ドされる蛋白質の発現レベルの比較に基づいて行われる。
工程 [ 1 ] における遺伝子 （例えば NOX l -b遺伝子） の発現レベルを測定する 方法は公知の遺伝子解析法に従って実施することが出来る。 例えば、 N0X 1 - b遺 伝子にハイプリダイズする核酸をプローブとしたハイプリダイゼーション技術、 または、 N0X 1 - b遺伝子にハイプリダイズする DNAをプライマーとした遺伝子増幅 技術等を利用することが出来る。 具体的には、 被験者から得た滑膜細胞由来の核 酸、 例えば mRNA等を用いて測定することが出来る。 mRNA量の測定は、 本発明のス クリーニング用ポリべプチドをコ一ドするポリヌクレオチド （例えば N0X 1 - b配 列） を特異的に増幅できるように設計したプライマ一を用いて遺伝子増幅反応方 法にて測定できる。 遺伝子増幅反応方法としては、 特に限定されないが、 PGR法, RNAポリメラーゼを利用した核酸増幅法などを利用することが出来る。 よリ具体 的には、 実施例 4に記載の方法により実施できる。 本発明の RAの検査方法に用い られるプライマ一、 または、 RA検査用キットに含まれるプライマーは、 本発明の スクリーニング用ポリべプチドをコ一ドするポリヌクレオチド （例えば NOX l -b 配列） を特異的に増幅できるものであれば、 特には限定されず、 本発明のスクリ 一二ング用ポリべプチドをコ一ドするポリヌクレオチド （例えば N0X1- b塩基配列 ) に基づいて設計できる。 好ましくは、 配列番号 5及び配列番号 6に記載された オリゴヌクレオチドである。
ノ \ィブリダィゼーシヨン技術を利用した RAの検査は、 例えば、 ノーザンハイブ リダィゼーシヨン、 ドットプロット法、 DNAマイクロアレイ法などを使用して行 うことが出来る。 さらには、 RT- PGR等の遺伝子増幅技術を利用することによリ実 施できる。 RT-PGR法においては、 遺伝子の増幅過程において PGR増幅モニター （ リアルタイム PGR) 法を用いることにより、 本発明のスクリーニング用ポリぺプ チドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子 （例えば N0X 1 - b遺伝子） の発 現について、 より定量的な解析を行うことが可能である。 PCR増幅モニター法と しては、 例えば、 ABI PRI SM7700 (アプライドバイオシステムズ社） を用いるこ とが出来る。
また、 工程 [ 1 ] において、 本発明のスクリーニング用ポリペプチドをコード するポリヌクレオチドの塩基配列を含む遺伝子の発現レベルを測定する方法とし て、 発現レベルを本発明のスクリーニング用ポリペプチドからなる蛋白質、 好ま しくは、 NOX l -b蛋白質の検出によって測定する方法が可能である。 このような 検査方法としては、 例えば、 被験者から得た滑膜細胞由来の細胞抽出液を用いて. 本発明のスクリーニング用ポリべプチドからなる蛋白質、 好ましくは NOX l -b蛋 白質に結合する抗体、 よリ好ましくは N0X1- bに特異的に結合する抗体を利用した ウェスタンブロッテイング、 免疫沈降法、 ELISA法などを利用することが出来る ( 工程 [ 2 ] においては、 工程 [ 1 ] で得られた発現レベルと健常者における発 現レベルと比較するのであれば、 比較方法は特に限定されず、 例えば実施例 4に 記載の方法で比較できる。
本発明の RA検査用キットには、 少なくとも、 本発明のスクリーニング用ポリべ プチドをコ一ドするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計した順方 向及び逆方向プライマーが含まれる。 順方向及び逆方向プライマー対の例として は、 配列番号 5及び配列番号 6に記載の塩基配列で表されるブラィマ一が挙げら れる。 本発明の RA検査用キットに含めることが出来る他の試薬としては、 PGRを 行うのに必要な試薬 （例えば、 Taqポリメラーゼ、 ヌクレオチド基質、 緩衝液な ど） などを挙げることができる。
<本発明のスクリーニングする方法 >
本発明のスクリーニングする方法には、 本発明のスクリーニング用ポリべプチ ドの活性を抑制する物質をスクリーニングする方法と、 RA治療用物質及び Z又は 変形性関節炎治療用物質をスクリーニングする方法とが含まれる。
( 1 ) 本発明のスクリーニング用ポリべプチドの活性を抑制する物質をスクリー ニングする方法
本発明のスクリーニング用ポリべプチドの活性を抑制する物質のスクリーニン グ方法は、 下記工程 （ ί ) ~ ( i i i ) を含む限り、 特に限定されるものではない
( i ) 本発明のスクリーニング用ポリべプチドを発現している細胞に試験物質を 接触させる工程、
( i i ) 前記ポリペプチドの活性が抑制されるか否かを分析する工程、 及び
( i i i ) 前記ポリべプチドの活性を抑制する物質を選択する工程。
好ましくは実施例 5に記載の方法によリ本発明のスクリーニング用ポリべプチド の活性を抑制する物質をスクリーニングすることができる。
( 2 ) RA治療用物質及び 又は変形性関節炎治療用物質をスクリーニングする方 法
背景技術の欄で述べたように炎症性サイトカインとして知られる TNF は RA治 療薬の標的として、 プロスタグランジンの合成酵素として知られる G0X-2 は RA や変形性関節炎の治療薬の標的として広く臨床においても認知されている。
従って、 TNFof又は G0X- 2の発現量を減少させる物質を選択することにより、 RA 治療用物質及び 又は変形性関節炎治療用物質をスクリーニングすることができ る。 後述の実施例に示す様に、 本発明のポリペプチドの一つである N0X1-bを発現 する細胞において C0X - 2発現量及び TNF 発現量が有意に亢進していることが明ら かとなつた （実施例 6及び実施例 7) 。 また、 この G0X-2発現誘導及び TNFo?発現誘 導が N0X1 - bの阻害剤である DPIにより阻害されたことから、 本発明のポリべプチ ドの一つである ΝΟΧΙ-b由来の R0Sによる酸化還元制御を介して G0X- 2及び TNFo;が 発現誘導されていると考えられた。 本発明のポリべプチドの活性を抑制すること によリ G0X - 2発現及ぴノ又は TNF aの発現誘導が抑制されるという本発明者らが見 出した新規な知見から、 本発明のスクリーニング用ポリべプチドの活性を抑制す る物質は、 RA治療効果を有すると考えられた。 即ち、 本発明のスクリーニング用 ポリべプチドの活性を抑制する物質をスクリーニングする方法は、 RA治療用物質 及び 又は変形性関節炎治療用物質をスクリーニングする方法として利用できる, 本発明の RA治療用物質及び 又は変形性関節炎治療用物質をスクリーニングす る方法は、 下記工程 （ i ) 〜 （iii) を含む限り、 特に限定されるものではない
( i ) 本発明のスクリーニング用ポリべプチドを発現している細胞に試験物質を 接触させる工程、
(M) 前記ポリペプチドの活性が抑制されるか否かを分析する工程、 及び
(i ii) 前記ポリぺプチドの活性を抑制する物質を選択する工程。
上記スクリーニング方法で得られた物質を、 RA治療剤に関する公知の評価系あ るいは、 それを改良した評価系にかけることにより、 RA治療用物質として有用な 物質であるか否かを判定することができる。 例えば、 RA治療作用の確認は、 コラ 一ゲン誘発関節炎モデルマウス （Fiona Η· Durisら， Glin. I瞧 unol.
I瞧 unopatho卜， 73, 11-18, 1994) を用いる方法により行なうことができる。 ま た、 上記スクリーニング方法で得られた物質を、 変形性関節炎治療剤に関する公 知の評価系にかけることにより、 変形性関節炎治療用物質として有用な物質であ るか否かを判定することができる。
本発明のスクリーニングする方法として、 本発明のスクリーニング用ポリぺプ チドの活性を分析 （測定又は検出） するために用いる方法の違いに基づいて、 例 えば、
(a) 化学-生化学的方法
(b) 化学発光法
(c) 電子スピン共鳴分光 (ESR)法 などを挙げることができる。 各スクリーニング方法について以下に説明する。
(a) 化学-生化学的方法
本発明のスクリーニング用ポリべプチドの活性を抑制する物質、 RA治療用物質 及び 又は変形性関節炎治療用物質は、 化学-生化学的方法を利用してスクリー ニングすることができる。 化学-生化学的方法としては、 例えば （ i ) のシトク ロム G還元法を利用したスクリーニング方法、 （ ί i ) ニトロブルーテトラゾリ ゥム （NBT) の還元を利用したスクリーニング方法、 （ ί i ί ) 水溶性亍トラゾ リウ厶塩の還元を利用したスクリーニング方法を挙げることができる。 シトク口 厶 G還元法による検出は酸化型シ卜クロム Gが還元されると 550 nmに強い吸収をも つ還元型に変わることを利用したものである （丄 M. McCord and I. Fridovich, J. Biol. Chem. , 244， 6049(1969)) 。 NBT還元法は NBTが 02—により還元され水不 溶性のブル一ホルマザン（吸収極大 560nm)を生じることを利用したものである （C. Beauchamp and に Fridovich, Anal. Biochem. , 44, 276 (1971)) 。
本発明のスクリーニング用ポリべプチドを発現させた細胞を調製する。 試験物 質を添加し、 更にプローブ （例えばシトクロム G) を適量添加して一定時間イン キュベーシヨンする。 反応後、 550ntnの吸光度を測定する。 試験物質を添加した 場合に、 還元型への転換が抑制されれば、 前記試験物質は、 本発明のスクリー二 ング用ポリべプチドの活性を抑制する物質であると判定することができる。 本方 法のうちの一つであるシトクロム G還元法を利用したスクリーニング方法は、 実 施例 5に記載の条件で実施することが好ましい。 本発明のスクリーニング用ポリ ペプチドの活性を抑制する物質としては、 10i«M以下、 好ましくは 以下、 更 に好ましくは 0.1 μ Μ以下のものを選択することが好ましい。
( b) 化学発光法
化学発光法としては、 例えば （ i ) ゥミホタルルシフェリン誘導体を利用した スクリ一ニング法、 （ i j ) ルミノール法を利用したスクリーニング法を挙げる ことができる。 ゥミホタルルシフェリン誘導体は中性付近の水溶液で 02—と反応し て励起力ルポ二ル体を生じ、 それが基底状態に遷移する過程で 380nmに強く発光 することを利用したものである（Goto, T: Pure Appl Chem, Vol 7, 421-441, 1968)。 ルミノール法による検出はアルカリ水溶液で、 02—または H202の存在下で HOGし K3Fe(GN)6、K2S208、Fe2+塩、 Go3+などにより酸化されてァミノフタ一ル酸ジァニ オン （励起状態） を生じ、 それが基底状態に遷移する過程で発光することを利用 したものである（Roswel l，D.F.et a Method in Enzymo logy, Vol 5, 409-423, 1972)。
本発明のスクリーニング用ポリべプチドを発現させた細胞を調製する。 試験物 質を添加し、 更にプローブ （例えばゥミホタルルシフェリン誘導体） を適量添加 して一定時間作用させる。 反応後、 380nmの発光を測定する。 試験物質を添加し た場合に、 発光が抑制されれば、 前記試験物質は、 本発明のスクリーニング用ポ リベプチドの活性を抑制する物質であると判定することができる。 本発明のスク リーニング用ポリペプチドの活性を抑制する物質としては、 以下、 好まし くは 1 u M以下、 更に好ましくは 0.1 u M以下のものを選択することが好ましい。
(c) 電子スピン共鳴分光 (ESR)法
02一の ESRシグナルは、 スピントラップ法を用いることで間接的に測定すること ができる。 つまり ESR法は短い寿命のラジカル種をトラップ剤と反応させ、 生成 する安定なラジカルとし、 その ESRスぺクトルを解析することを利用したもので ある。 現在用いられている最も汎用性の高いスピントラップ剤は 5， 5-ジメチル- 1—ピロリン ォキシド（DMP0)である （Y. Noda, K. Anzai, A. Mori, M. Kohno, M. Shinmei and L. Packer, Biochem. Mo I. Biol. Int. , 42, 35 (1997)) 。 本発明のスクリーニング用ポリべプチドを発現させた細胞を調製する。 試験物 質を添加し、 更にスピントラップ剤 （例えば DMP0) を適量添加して一定時間作用 させる。 反応後、 ラジカル付加体のスぺクトル解析をする。 試験物質を添加した 場合に、 ラジカル付加体のシグナルが抑制されれば 前記試験物質は、 本発明の スクリーニング用ポリべプチドの活性を抑制する物質であると判定することがで きる。 本発明のスクリーニング用ポリべプチドの活性を抑制する物質としては、 10jwM以下、 好ましくは〗；/ M以下、 更に好ましくは 0.1 j«M以下のものを選択する ことが好ましい。
本発明のスクリーニング方法によって選択対象とする試験物質としては、 特に 限定されるものではないが、 例えば、 ケミカルファイルに登録されている種々の 公知化合物 （ペプチドを含む） 、 コンビナトリアル 'ケミストリ一技術 （ Terrett, N. K. ら， Tetrahedron, 51 , 8135-8137, 1995) によって得られた化 合物群、 あるいは、 ファージ 'ディスプレイ法 （Fe l i c i , F. ら， 丄 Mo l . B i o l . , 222， 301-310, 1991 ) などを応用して作成されたランダム■ペプチド群を用いる ことができる。 また、 微生物、 植物、 海洋生物、 又は動物由来の天然成分 （例え ば、 培養上清又は組織抽出物） などもスクリーニングの試験物質として用いるこ とができる。 更には、 本発明のスクリーニング方法により選択された化合物 （ぺ プチドを含む） を、 化学的又は生物学的に修飾した化合物 （ペプチドを含む） を 用いることができる。
<RA治療用及び Z又は変形性関節炎治療用医薬組成物の製造方法 >
本発明には、 本発明のスクリ一ニングする方法を用いてスクリーニングするェ 程、 及び前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程を含む ことを特徴とする、 RA治療用及び Z又は変形性関節炎治療用医薬組成物の製造方 法が包含される。
本発明のスクリーニングする方法によリ得られる物質を有効成分とする製剤は、 前記有効成分のタイプに応じて、 それらの製剤化に通常用いられる担体、 賦形剤, 及び 又はその他の添加剤を用いて調製することができる。
投与としては、 例えば、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 顆粒剤、 細粒剤、 散剤、 又 は経口用液剤などによる経口投与、 あるいは、 静注、 筋注、 若しくは関節注など の注射剤、 坐剤、 経皮投与剤、 又は経粘膜投与剤などによる非経口投与を挙げる ことができる。 特に胃で消化されるペプチドにあっては、 静注等の非経口投与が 好ましい。
経口投与のための固体組成物においては、 1又はそれ以上の活性物質と、 少な くとも一つの不活性な希釈剤、 例えば、 乳糖、 マンニトール、 ブドウ糖、 微結晶 セルロース、 ヒドロキシプロピルセルロース、 デンプン、 ポリビニルピロリ ドン, 又はメタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合することができる。 前記組成 物は、 常法に従って、 不活性な希釈剤以外の添加剤、 例えば、 滑沢剤、 崩壊剤、 安定化剤、 又は溶解若しくは溶解補助剤などを含有することができる。 錠剤又は 丸剤は、 必要によリ糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質などのフィル厶で被覆す /07148
18 ることができる。
経口のための液体組成物は、 例えば、 乳濁剤、 溶液剤、 懸濁剤、 シロップ剤、 又はエリキシル剤を含むことができ、 一般的に用いられる不活性な希釈剤、 例え ば、 精製水又はエタノールを含むことができる。 前記組成物は、 不活性な希釈剤 以外の添加剤、 例えば、 湿潤剤、 懸濁剤、 甘味剤、 芳香剤、 又は防腐剤を含有す ることができる。
非経口のための注射剤としては、 無菌の水性若しくは非水性の溶液剤、 懸濁剤、 又は乳濁剤を含むことができる。 水溶性の溶液剤又は懸濁剤には、 希釈剤として, 例えば、 注射用蒸留水又は生理用食塩水などを含むことができる。 非水溶性の溶 液剤又は懸濁剤の希釈剤としては、 例えば、 プロピレングリコール、 ポリエチレ ングリコール、 植物油 （例えば、 ォリーブ油） 、 アルコール類 （例えぼ、 ェタノ ール） 、 又はポリソルベート 80等を含むことができる。 前記組成物は、 更に湿潤 剤、 乳化剤、 分散剤、 安定化剤、 溶解若しくは溶解補助剤、 又は防腐剤などを含 むことができる。 前記組成物は、 例えば、 バクテリア保留フィルターを通す濾過, 殺菌剤の配合、 又は照射によって無菌化することができる。 また、 無菌の固体組 成物を製造し、 使用の際に、 無菌水又はその他の無菌用注射用媒体に溶解し、 使 用することもできる。
投与量は、 有効成分、 すなわち、 本発明のスクリーニング方法により得られる 物質の活性の強さ、 症状、 投与対象の年齢、 又は性別等を考慮して、 適宜決定す ることができる。
例えば、 経口投与の場合、 その投与量は、 通常、 成人 （体重 60kgとして） にお いて、 1日につき約 0. 1〜100mg、 好ましくは 0· 1〜50mgである。 非経口投与の場 合、 注射剤の形では、 1日につき 0. 01〜50mg、 好ましくは 0. 01〜10mgである。
実施例
以下に実施例によリ本発明を詳述するが， 本発明は該実施例によって限定され るものではない。 なお、 特に断りがない場合は、 公知の方法 (Sambrook, J. et a l . , "Mo l ecu l ar C l on i ng - A Laboratory Manua l , Go l d Spr i ng Harbor 7148
19
Laboratory, NY, 1989) 等の遺伝子操作実験マニュアルや試薬等に添付のマニュ アルに従った。
(実施例 1 ) 新規ォキシダーゼ N0X1-bの取得と全長オープンリーディングフレー ム （open reading frame, ORF) 配列の決定
キアゲン社の RNA抽出キット （RNAeasy Protect Mini Kit) を用いて東洋紡績 社の RA 患者由来滑膜細胞 （HS-RA) より mRNA を精製し、 スーパースクリプト 11 (SUPERSCRIPT First-Strand Synthesis System for RT-PCR) (Gibco-BRL 社）を 用い GDNAに転換することにより作製した自家製の GDNAを錶型とした。 配列番号 3と配列番号 4で表される N0X1 の 0RFの外側をコードするオリゴ DNA を合成し、 DNA ポリメラ一ゼ （PLATINUM™ Taq DNA polymerase；インビトロジェン社） を用 いて、 94°C1 分の後、 94°C30秒、 55°C30秒、 68°C3分のサイクルを 35 回の PGR 反応を行った。 この反応により得られた GDNA をクローニングベクター （TAクロ 一二ングキット； インビトロジェン社） に挿入 （N0X1 ベクター） し、 ジデォキシ ターミネータ一法により ABI3700 DNA シークェンサ一 （アプライドバイオシステ ムズ社） で解析し、 0RF配列を決定した。 この遺伝子を N0X1- bと名付けた。 該遺 伝子の全長塩基配列を配列番号 1に、 推定アミノ酸配列を配列番号 2に示した。
N0X1 - bの 0RF配列は N0X1 (Genbankァクセッション番号： AF127763) の第 433番 目から第 481 番目までがスプライシングァゥ卜された新規蛋白質をコードしてい た。
(実施例 2) M0X1- b全長 0RFのクローニングと蛋白質発現プラスミドの構築 実施例 1で作製した N0X1-b ベクターを EGORし Xhol で切断し、 蛋白質発現べ クタ一 （PGDNA3.1/HisB; インビトロジェン社） の EcoRし Xhol 部位に挿入して、 全長蛋白質発現プラスミド PGDNA3.1/HisB■ N0X1-bを完成した。
(実施例 3) HisB ' N0X1-bの動物細胞株での発現
10cmプレートに NIH3T3細胞 （大日本製薬社） を 1 x 106細胞でプレーティング して 12時間培養後、 実施例 2において作製した発現プラスミド pcDNA3.1/HisB■ 匪 1-b 及び空べクタ一 PGDNA3.1/HisB を、 トランスフエクシヨン試薬（FuGENE™6 Transfection Reagent;ロシュ社製）を用いて添付指示書に従い、 IH3T3細胞に導 入した。 プラスミ ド導入後 12 - 16 時間で培地を無血清に置換した後、 さらに 48- 60 時間培養を継続した。 導入細胞を PBS で洗浄後、 SDS サンプルバッファー (S.B) で回収した。 S.B中に目的蛋白質が存在することを N0X1蛋白質と N0X1-b 蛋白質共通の G末端配列をェピトープとして認識する抗体 （ゥサギ抗 M0X抗体； サンタクルズ社製） を用いたウェスタンブロッテイングで確認した。 すなわち、 回収した上記 S,Bを SDS/4°/»〜20% アクリルアミ ドゲル （第一化学薬品社） に電気 泳動 （還元条件） 後、 ブロッテイング装置を用いて PVDF膜（ミリポア社）に転写 した。 転写後の PVDF 膜にブロックエース （大日本製薬社） を添加してブロッキ ングした後、 ビォチン化ゥサギ抗 IgG抗体 （M2 ; シグマ社） 、 西洋わさびバーオ キシダーゼ標識ストレプトアビジン （アマシャムフアルマシア社製） を順次反応 させた。 反応後、 EGL ウェスタンブロッテイング検出システム （アマシャムファ ルマシア社) を用いて目的蛋白の発現を確認した。 pcDNA3.1/HisB ' N0X1-b 導入 細胞より得たサンプルには、 分子量 52±0.5kD のバンドが検出されたが、 空べク ター導入細胞よリ得たサンプルにはバンドは検出されず、 pcDNA3.1/HisB■ N0X1- b導入細胞で HisB · N0X1-bが発現していることがわかった。
(実施例 4 ) RA患者由来滑膜細胞における N0X1- b mRNAの発現上昇
実施例 1で示した mRNA抽出法を用いて、 大日本製薬社の健常人由来滑膜細胞 (Cel l System- SS eel Is)から自家製の GDNAを作製した。 配列番号 5と配列番号 6 で表される N0X1 - b特異的な配列をコードするプローブプライマーを合成し、 RA患 者、 健常人由来の各サンプル （各錶型 cDNAを 1、 1 /10、 1/100の希釈倍率で希釈 したもの） に対して DNAポリメラーゼ （rTaq DNA polymerase；東洋紡績社） を用 いて、 94°C1分の後、 94°C10秒、 55°C20秒、 72°C30秒のサイクルを 45回の半定量 的 RT-PGR反応を行った。 配列番号 5で表されるプライマー配列は、 N0X1がスプラ イシングアウトされた接続部位、 すなわち N0X1蛋白質の第 432番目と第 482番目を 接続した部位をコードするヌクレオチド配列であり、 よって N0X1を認識しない配 列である。 従って、 配列番号 5と配列番号 6による PGR産物は N0X1-b特異的なも のである。 PCR反応物をァガロースゲルに電気泳動し、 ェチジゥムブ口マイ ド
(EtBr) 染色により DNAを検出したところ、 N0X1-bと予想されるサイズのバンド が RA患者由来のサンプルでは認められたが、 健常人のサンプルでは認めることが できなかった。 一方、 コントロールである、 配列番号 7と配列番号 8で表される 48
21 プライマ一を用いたグリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素 (G3PDH)の PGR反応に おいては、 RA患者、 健常人サンプル共に同様な EtBr染色によるバンドが認められ た （図 U) 。 また配列番号 13と配列番号 6で表される既知の N0X1特異的な配列を コードするプローブプライマーを用い、 上記と同様に RA患者及び健常人由来の各 サンプルを用いて RT-PGR反応を行い、 N0X1-b特異的プローブプライマ一を用いた データと比較した。 その結果、 N0X1-bとは異なり、 N0X1と予想されるサイズのバ ンドは RA患者由来のサンプルだけではなく、 健常人由来のサンプルでも検出され た。 また、 RA患者由来のサンプルと健常人由来のサンプルとで EtBrで染色される N0X1のバンド量に変化は認められなかった （図 1 B) 。 これらのことより、 健常人 に対し、 RA患者由来滑膜細胞において、 N0X1-b発現量が有意に亢進していること が明らかとなった。 また、 本実施例記載の方法で RA診断の検査が可能であること がわかった。
(実施例 5 ) N0X1-bの R0S産生活性
実施例 3で示した N0X1- b発現細胞を用いてシトクロム G還元法により R0S産 生能を測定した。 シトクロム G還元法により R0Sを測定するために空ベクター発 現細胞と N0X1- b発現細胞を 96穴の細胞培養用マルチウヱルプレート （マルチウ エルプレートと略す） に 0. 5 x 106個/ 100 1/穴の割合で撒いた。 約 12時間後に 各条件下において 4. 62 mg/mlのシトクロム Cを 100 1/穴加えて混合した後マル チウ Iルプレートをプレートリーダーにセットし、 550 nmの吸光度を経時的に測 定した。 1時間後の積算値を図 2に示した。 その結果 N0X1 - b発現細胞においては 空ベクター発現細胞に比べ顕著な R0S産生活性を有することが明らかになった。 またこの活性は、 NADPH Oxi dase 阻害剤として知られる Dipheny lene l odon ium Ch l or i de (DPI と略す） 1 Mをシトクロム G添加の 30分前に加えることにより 大きく抑制されることがわかった（図 2 )。 これらのことにより N0X1-b は R0S産 生活性を有し、 その活性は DPI により阻害されることが明らかになった。 本実施 例の測定法により、 N0X1- bの活性を抑制する物質をスクリーニングすることがで きる。
(実施例 6) N0X1- b発現細胞における G0X- 2 mRNAの発現上昇
実施例 1で示した mRNA抽出法を用いて、 空ベクター発現細胞及び N0X1- b発現細 胞から各々 GDNAを作製した。 配列番号 9と配列番号 1 0で表される G0X - 2特異的 な配列をコードするプローブプライマーを合成し、 空べクタ一発現細胞、 N0X1 -b 発現細胞由来の各サンプルに対して DNAポリメラーゼ （rTaq DMA po l ymerase；東 洋紡績社） を用いて、 94°C1分の後、 94°C10秒、 55°C20秒、 72°C30秒のサイクル を 45回の RT-PGR反応を行った。 PGR反応物をァガロースゲルに電気泳動し、 EtBr 染色により DNAを検出したところ、 C0X - 2と予想されるサイズのバンドが空べクタ 一由来のサンプルよリも N0X1 - b由来のサンプルで著しく上昇することカ確認でき た （図 3 ) 。 一方、 コントロールである、 配列番号 7と配列番号 8で表されるプ ライマーを用いた G3PDHの PGR反応においては空ベクター発現細胞、 N0X1- b発現細 胞由来のサンプル共に同様な EtBr染色によるバンドが認められた （図 3 ) 。 した がって空ベクター発現細胞に対し、 N0X1-b発現細胞は G0X - 2発現量が有意に亢進 していることが明らかとなった。
N0X1-b阻害剤である DP Iを終濃度 I ju Mとなるように N0X1-b発現細胞に添加し、 3 時間後に mRNA抽出法にて調製したサンプルを用いて上記と同様の RT-PGRを行った ところ、 NOX-1 b発現による G0X-2発現誘導が DP Iにより阻害されることが明らかに なった（図 3 )。 G0X- 2発現誘導力《DP Iにより阻害されたことから、 ΝΟΧΙ-b由来の R0Sによる酸化還元制御を介して C0X-2が発現誘導されたと考えられた。
(実施例 7) N0X1- b発現細胞における TNF mRNAの発現上昇
配列番号 1 1と配列番号 1 2で表される TNF a特異的な配列をコードするプロ一 ブプライマーを合成し、 実施例 6で調製した各 GDNAサンプルに対して DNAポリメラ ーゼ （rTaq DNA po l ymerase；東洋紡績社） を用いて、 94°C1分の後、 94°C10秒、 55°C20秒、 72°C30秒のサイクルを 45回の RT-PGR反応を行った。 PGR反応物をァガ ロースゲルに電気泳動し、 EtBr染色により DNAを検出したところ、 TNF と予想さ れるサイズのバンドが N0X1-b発現細胞由来のサンプルでは確認できたが、 空べク ター発現細胞由来のサンプルにおいては認めることができなかった。 一方、 コン トロールである、 配列番号 7と配列番号 8で表されるプライマーを用いた G3PDH の PGR反応においては空ベクター発現細胞、 N0X1 - b発現細胞由来のサンプル共に 同様な EtBr染色によるバンドが認められた。 さらに、 N0X1 - b由来細胞に対し N0X1- b阻害剤である DP Iを 1 w M、 3時間前処理すると TNF a発現誘導が阻害される ことが明らかになった（図 4)。 したがって空ベクター発現細胞に対し、 N0X1-b発 現細胞は TNF a発現量が有意に亢進していることが明らかとなった。 また、 この TNF a発現誘導は DP Iにより阻害されることからも、 N0X1 - b由来の R0Sによる酸化 還元制御を介して行われていることが考えられる。 産業上の利用可能性
本発明のポリヌクレ才チドは、 その発現亢進が病態と結びついていることか ら、 RA診断の指標となることが解かった。 本発明のポリヌクレオチド、 該ポリヌ クレオチドによってコードされる本発明のポリぺプチドの発現を指標にすること により RA診断の検査を行うことが可能となった。 また、 本発明は、 RA患者由来滑 膜細胞に特異的に発現する新規ォキシダーゼを提供するものであり、 その特異的 なプライマー配列を用いた PGRにより RA診断の検査へ応用できることが期待され る。 本発明のスクリーニング方法は、 RA治療用物質及び 又は変形性関節炎治療 用物質のスクリーニングに有用である。
以上、 本発明を特定の態様に沿って説明したが、 当業者に自明の変形や改良は 本発明の範囲に含まれる。

Claims

請 求 の 範 囲
1. ( 1 ) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列を含み、 しかも、 関節リウマチ患 者特異的に発現するポリペプチド、 あるいは、 （2 ) 配列番号 2で表されるアミ ノ酸配列において、 1または数個のアミノ酸が欠失、 及びノ又は挿入されたアミ ノ酸配列を含み、 しかも、 関節リウマチ患者特異的に発現するポリペプチド。
2. 配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
3. 請求の範囲 1または、 請求の範囲 2に記載のポリペプチドをコードするポリ ヌクレオチド。
4. 請求の範囲 3に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
5. 請求の範囲 4に記載の発現べクタ一で形質転換された細胞。
6. ( 1 ) 被験者における、
i ) 請求の範囲 3に記載の塩基配列を含む遺伝子、 又は
i i ) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列との相同性が 95%以上であるアミノ酸 配列を含み、 しかも、 RA患者特異的に発現するポリペプチドをコードするポリヌ クレオチドの塩基配列を含む遺伝子
の発現レベルを測定する工程、 及び
( 2 ) 健常者における前記遺伝子の発現レベルと比較する工程
を含むことを特徴とする、 関節リウマチの検査方法。
7. i ) 請求の範囲 3に記載の塩基配列を含む遺伝子、 又は
i i ) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列との相同性が 95%以上であるアミノ酸 配列を含み、 しかも、 RA患者特異的に発現するポリペプチドをコードするポリヌ クレオチドの塩基配列を含む遺伝子
を特異的に増幅できるように設計した順方向及び逆方向ブラィマーを含む関節リ ゥマチ検査用キット。
8. ( 1 ) 請求の範囲 1若しくは請求の範囲 2に記載のポリぺプチド、 又は配列 番号 2で表されるァミノ酸配列との相同性が 95%以上であるアミノ酸配列を含み, しかも、 RA患者特異的に発現するポリべプチドを発現している細胞に試験物質を 接触させる工程、 （2 ) 前記ポリべプチドの活性が抑制されるか否かを分析する 工程、 及び （3 ) 前記ポリペプチドの活性を抑制する物質を選択する工程 を含むことを特徴とする、 前記ポリペプチドの活性を抑制する物質をスクリー二 ングする方法。
9. 請求の範囲 1若しくは請求の範囲 2に記載のポリペプチド、 又は配列番号 2 で表されるアミノ酸配列との相同性が 95%以上であるアミノ酸配列を含み、 しか も、 RA患者特異的に発現するポリべプチドの活性を抑制する物質が関節リウマチ 治療用物質及びノ又は変形性関節炎治療用物質である、 請求の範囲 8記載のスク リーニングする方法。
10.請求の範囲 8又は請求の範囲 9に記載のスクリーニング方法を用いてスクリー ニングする工程、 及び
前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程
を含むことを特徴とする、 RA治療用及ぴ 又は変形性関節炎治療用医薬組成物の 製造方法。
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