WO2004018669A1

WO2004018669A1 - 塩誘導性キナーゼ２及びその用途

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Publication number: WO2004018669A1
Application number: PCT/JP2003/010535
Authority: WO
Inventors: Hiroshi Takemori; Mitsuhiro Okamoto
Original assignee: ProteinExpress Co Ltd
Current assignee: ProteinExpress Co Ltd
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Filing date: 2003-08-20
Publication date: 2004-03-04
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Abstract

本発明のポリペプチドは、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０又は配列番号：１２で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドである。本発明のポリペプチドは、脂肪細胞等における代謝異常が関与する疾患の予防・改善薬等として有用である。

Description

明細書塩誘導性キナーゼ 2及びその用途技術分野

本発明は、マウス由来の塩誘導性キナ一ゼ 2 (Salt- inducible kinase 2 ： S I K 2) ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリべプチドに対する抗体、該ポリペプチドの活性を促進する、または阻害する化合物のスクリーユング方法、および該ポリペプチドの作用を抑制または亢進する組成物等に関する。背景技術

各種のホルモンや神経伝達物質が細胞内の c AMP濃度を増加させることが知られている。細胞内 c AMP濃度が上昇すると、 c AMP依存性プロテインキナーゼ (PKA) を活性化させる。 PKAの触媒ドメインが、 PKA活性を負に調節する調節ドメインから解離されることによって PKAが活性化されることが報告されてレヽる（Mayrら、ネイチヤー ' レビューズ 'モレキュラー ' セル 'バイオロジー（Nat- Rev. Mol. Cell Biol) 2, 599-609(2001)) 。活性化された P K Aは c AM P応答配列（以下、本明細書において「CRE」ともいう）に結合する転写因子である c A MP responsive element binding protein (以下、本明細書において「CREB」という」）をリン酸ィ匕し、リン酸化された CREBが CREに結合し、遺伝子の転写活性を制御することが知られている。

脂細胞の分化および機能も、やはり細胞内 cAMPによって調節されており (Reuschら、モレキュラー 'セルラー 'バイオロジー（Mol. Cell. Biol. ) 20, 1008-1020(2000)) 、 C R E Bの活性化は脂肪細胞の分化誘導に必要不可欠であり、主に CREBが脂肪細胞分化を調節していることが報告されている。また、プレ- レーシヨンの阻害によりインスリン誘導性の脂肪細胞の分化機構が阻害された場合、 C R E Bの活性化により脂肪細胞の分化が補完されることも報告されている。一方、 CREBは血糖ホメォスタシスの機構を制御している。すなわち、 cAMP -PKA-CREB-CREシグナルは脂肪細胞の分化や機能、血糖の調節において非常に重要な役割を果たしており、 c AMP— PKA— CREB— CREシグナルをコントロールすることで肥満や糖尿病等を予防、改善できると考えられる。しかしながら、現在までに報告されている CREBバインディングプロテイン（C B P) は脂肪細胞以外の組織においても発現しているため、それらを利用して脂肪細胞の機能を制御することは困難である。したがって、脂肪細胞で特異的に発現する CRE Bのモジュレーターを同定し、そのモジュレーターの生理活性を制御することができれば、肥満や糖尿病等の発症を予防、改善できると考えられる。従って、脂肪細胞に特異的な CREBのモジュレーターが望まれていた。

高塩食ストレス処理したラットの副腎皮質において、塩誘導性キナーゼ（S I K) をコードしている c DNAが同定された [Wang, et al. , FEBS Letters 453, 135-139

(1999) ]。 S I Kは、ストレス刺激下における脂肪代謝の調節に重要な役割を有するセリン . スレオニンキナーゼである AMP活性化プロティンキナーゼファミリ一に属する酵素であり、この酵素（S I K)は c AMP- PKAシグナルで誘導され、 PKAで活性化された CRE Bの遺伝子発現活性を制御し、その制御は S I Kのタンパク質リン酸化活性と相関することが報告されている [J. Doi, et al. , Journal of Biological Chemistry 277, 15629-15637 (2002)]。しかしながら、 S I Kも広い範囲の組織で発現しており [X. Lin, et al., Molecular Endocrinology 15(8), 1264-1276(2001) ； J. D. Feldman, et al.， Journal of Neurochemistry 74, 2227-2238

(2000) ]、脂肪細胞に特異的な CREBのモジュレーターとはいい難い。

一方、脂肪細胞組織における脂質代謝は 2つのホルモンシグナル経路の制御下にあることが報告ざれている。すなわち、インシュリンはグルコースの吸収および脂質生成を誘導しており、一方、アドレナリンゃグルカゴン等の外因性の刺激により生成される c AMPは脂質分解を誘導しており、この 2つのシグナル系の間のバランスがくずれると、脂肪組織が高インシュリン血症に曝され、脂肪組織は徐々にィンシュリン刺激に対して耐性となる [Sul.H.S. et al. , Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 60， 317-345 (1998), Saltiel, A. R. , and ahn, C. R. Nature 414, 799-806 (2001)]。脂肪組織や肝、骨格筋等の生物学的代謝に関与している組織でインシユリン耐性が生じると、最終的には肥満や 2型糖尿病等の全身のエネルギー代謝異常を引き起こすことになる。インシュリンレセプタ一基質 1 ( I RS— 1) タンパク質はインシュリン一シグナルカスケードの鍵となる分子である。すなわち、 I R S— 1タンパク質はィンシュリン依存的に活性化されたィンシュリンレセプタ一キナーゼの作用によってチロシン残基がリン酸化され、チロシンがリン酸化された I R S 一 1タンパク質は、続いて細胞内カスケードを誘発する。 I RS— 1タンパク質がある非生理学的な条件下でセリン残基がリン酸化されたことが報告されている。 I R S— 1タンパク質のセリンーリン酸化は、ィンシュリンーシグナルカスケ一ドの効率を制御しており、その結果として、インシュリン刺激に対して動物を耐性化していると思われる。 I R S— 1タンパク質のセリン一リン酸化に関与するいくつかのプロテインキナーゼ分子が同定され、報告されている [Tanasijevic.M. J. et al. , J Biol Chem 268, 18157-18166 (1993)]。

上述したように、肥満や糖尿病等の発症を予防、改善するためには、脂肪細胞に特異的な CREBおよび I RS— 1のモジュレーターの役割が重要である。

本発明は、上述したような脂肪細胞に特異的な CREBのモジュレーターとしての活性を有すると共に I R S— 1に対してモジュレーターとしての活性を有するぺプチド等を提供することを目的とする。発明の開示

上述した、 S I Kにはァイソフォームが存在することが判明し、従来の S I Kを S I K 1 とし、新たに見出された S I Kは S I K 2と命名された。これらの S I K の分析の結果、 S I K 1は主に副腎や卵巣に主に発現しており、 S I K2は主に脂肪細胞に発現していることが明らかになつたため、 S I K 2が脂肪細胞の分化成熟を制御している可能性について研究を進めると共に、マウス S I K2の完全長 c D N A配列が明らかにされている。

さらに、 S I K2の生理'機能の解析を行った結果、 S I K2は CREBの活性化を CREBのロイシンジッパー部分（b Z I P) を介して制御することが明らかになった。また、本発明者らは、 S I K2は 3つのドメイン部分を有することを見出し、それらはキナーゼ活性を有するキナーゼドメイン (ドメイン 1) 、タンパクの安定化の役割を果たしている安定化ドメイン（ドメイン 2) およびキナーゼ活性を制御している制御ドメイン（ドメイン 3) であり、ドメイン 2がリン酸化制御を受け、リン酸化により転写抑制活性を失うことを明らかにした。すなわち、ドメイン 2はタンパク質の安定化だけを司っているのではないことが明らかになった。

さらに、ドメイン 3は転写抑制に特に重要な役割を有しており、 3 11：2のじ1 EBの活性化機能を制御していること、特にドメイン 3がリン酸化されると、 SIK1 および SIK2の CREBの抑制活性が低下する。この効果は脂肪細胞においては SIK2では顕著であるが SIK1はそれほど顕著ではない。また、ドメイン 3は、 SIK1 においては SIK1タンパクを核内へ移行する機能および核外へ排出する機能を有するのに対して、 SIK2においては SIK2タンパクを核外へ排出する機能のみ有する。ドメイン 3 がリン酸化された状態で SIK1 と SIK2の酵素活性が消失した場合、 SIK1および SIK2 は CREBを活性化する。しかし、 SIK1のドメイン 3が核内移行にも働くこと力ゝら、低 cAMP刺激状態では SIK1は CREBを活性化できない。これは、 S I K1と S I K2のドメイン 3の機能の違い、すなわち細胞内局在によるものであり、核内型 S I Kは如何なる条件でも CREBを活性化することができないのに対し、細胞質型 S I K は上述の条件下で CREBを活性化することができること、 S I K 2が脂肪細胞で多量に発現されること、 S I K2および S I K1はヒト I RS— 1のセリン（794) をリン酸化すること、褐色脂肪細胞では SIK2 の活性および量が減少していること、および糖尿病動物の白色脂肪細胞において、その活性および量が上昇していることを本発明者らは見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、以下の（A) 〜（L) のいずれか 1のポリペプチドと少なくとも 90%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリべプチドまたはその塩を提供するものである。

(A) 配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号： 1で表わされる塩基配列にハイプリダイズ可能な c DN Aによってコードされるアミノ酸配列よりなるポリべプチド；

(B) 配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有し、かつ c AMP応答配列の制御下にある遺伝子の転写調節活性を有するポリペプチド、または配列番号： 1で表わされる塩基配列にハイプリダイズ可能な c D NAによってコードされるァミノ酸配列よりなり、かつ c AM P応答配列の制御下の遺伝子の転写調節活性を有するポリぺプチド；

(C) 配列番号： 4で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号： 3で表わされる塩基配列にハイブリダイズ可能な c D NAによってコードされるアミノ酸配列よりなるポリペプチド；

(D) 配列番号： 4で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を有し、かつ c AMP応答配列の制御下の遺伝子の転写調節活性を有するポリペプチド、または配列番号： 3で表わされる塩基配列にハイブリダイズ可能な c D NAによってコードされるァミノ酸配列よりなり、かつ c AMP応答配列の制御下の遺伝子の転写調節活性を有するポリべプチド；

(E) 配列番号： 6で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号： 5で表わされる塩基配列にハイブリダィズ可能な c D NAによってコ一ドされるアミノ酸配列よりなるポリべプチド

(F) 配列番号： 6で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有し、かつ c AMP応答配列の制御下の遺伝子の転写調節活性を有するポリペプチド、または配列番号： 5で表わされる塩基配列にハイブリダィズ可能な c D NAによってコードされるアミノ酸配列よりなり、かつ c AM P応答配列の制御下の遺伝子の転写調節活性を有するポリぺプチド； (G) 配列番号： 8で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号： 7で表わされる塩基配列にハイブリダイズ可能な c D NAによってコードされるアミノ酸配列よりなるポリべプチド； (H) 配列番号： 8で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を有し、かつ c AM P応答配列の制御下にある遺伝子の転写調節活性を有するポリペプチド、または配列番号： 7で表わされる塩基配列にハイプリダイズ可能な c DNAによってコードされるアミノ酸配列よりなり、かつ c AMP応答配列の制御下の遺伝子の転写調節活性を有するポリペプチド；

( I ) 配列番号： 1 0で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号： 9で表わされる塩基配列にハイプリダイズ可能な c DNAによってコ一ドされるアミノ酸配列よりなるポリべプチド；

( J) 配列番号： 1 0で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有し、かつ c AMP応答配列の制御下にある遺伝子の転写調節活性を有するポリペプチド、または配列番号： 9で表わされる塩基配列にハイブリダィズ可能な c DNAによってコードされるアミノ酸配列よりなり、かつ c AMP応答配列の制御下の遺伝子の転写調節活性を有するポリべプチド； (K) 配列番号： 1 2で表されるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号： 1 1で表される塩基配列にハイブリダィズ可能な c DNAによってコードされるアミノ酸配列よりなるボリぺプチド；

( L ) 配列番号： 1 2で表されるァミノ酸配列よりなるポリぺプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有し、かつ c AMP応答配列の制御下にある遺伝子の転写調節活性を有するポリペプチド、または配列番号： 1 1で表される塩基配列にハイブリダィズ可能な c DNAによってコードされるアミノ酸配列よりなり、かつ c AMP応答配列の制御下の遺伝子の転写調節活性を有するポリぺプチド。また、本発明は、以下の（a) 〜 (m) のいずれか 1のポリヌクレオチドと少なくとも 95%以上の相同性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドを提供するものである。

(a) 配列番号： 1で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号： 1で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダィズ可能な c D N Aであるポリヌクレオチド；

( b ) 配列番号： 3で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号： 3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイプリダイズ可能な c D N Aであるポリヌクレオチド；

( c ) 配列番号： 5で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号： 5で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイプリダイズ可能な c D N Aであるポリヌクレオチド；

( d ) 配列番号： 7で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号： 7で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダィズ可能な c D N Aであるポリヌクレオチド；

( e ) 配列番号： 9で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号： 9で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイプリダイズ可能な c D N Aであるポリヌクレオチド；

( f ) 配列番号： 11で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号： 11で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダィズ可能な c D N Aであるポリヌクレオチド；

( g ) 配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリべプチドをコ一ドする塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリぺプチドをコ一ドする塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能な c D N Aであるポリヌクレオチド；

( h ) 配列番号： 4で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリべプチドをコ一ドする塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号： 4で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリぺプチドをコ一ドする塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイプリダイズ可能な c D N Aであるポリヌクレオチド；

( i ) 配列番号： 6で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリべプチドをコ一ドする塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号： 6で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリぺプチドをコ一ドする塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能な c D N Aであるポリヌクレオチド；

( j ) 配列番号： 8で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリべプチドをコ一ドする塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号： 8で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリぺプチドをコ一ドする塩墓配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能な c D N Aであるポリヌクレオチド；

( k ) 配列番号： 1 0で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を有するポリべプチドをコ一ドする塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号： 1 0で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリぺプチドをコ一ドする塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイプリダイズ可能な c D N A.であるポリヌクレオチド；

( 1 ) 配列番号： 1 2で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリべプチドをコ一ドする塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号： 1 2で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリぺプチドをコ一ドする塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能な c D N Aであるポリヌクレオチド；

(m) ( a ) 〜 ( 1 ) のいずれか 1のボリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチド。

また、本発明は、上記ポリヌクレオチドを含有する組換ベクターおよび発現べクターを提供するものである。

また、本発明は、上記発現ベクターを保持する宿主細胞を提供するものである。また、本発明は、上記宿主細胞をポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、得られた培養物からポリペプチドを回収することを含む、上記ポリペプチドまたはその塩の製造方法を提供するものである。

また、本発明は、上記核酸、または上記ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの検出に有用な核酸プローブを提供するものである。また、本発明は、上記ポリペプチドに対して親和性を有する抗体、または該抗体のフラグメント、並びに上記ポリべプチドに対して親和性を有する抗体を産生するハイプリドーマを提供するものである。

また、本発明は、上記ポリペプチド、または本発明の組換ベクターを含有する医薬組成物を提供するものである。

また、本発明は、上記抗体、該抗体のフラグメント、または上記ポリヌクレオチドに相補的に結合するアンチセンスヌクレオチドを含有する医薬組成物を提供するものである。

また、本発明は、上記ポリヌクレオチドを含有する遺伝子診断用組成物を提供するものである。」

また、本発明は、上記医薬組成物を投与することを含む、疾患または生理状態の予防または改善方法を提供するものである。

また、本発明は、上記ポリペプチドを含有する検体を試験化合物と接触させ、上記ポリべプチドの活性を促進または阻害する活性を検出する工程を含むことを 1特徴とする、上記ポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法を提供するものである。

また、本発明は、本発明のポリヌクレオチド、および c AM P応答配列の制御下にあるレポーター遺伝子を含む発現ベクターを試験化合物と接触させ、本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する活性を検出する工程を含むことを特徴とする、本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法を提供するものである。

また、本発明は、上記スクリーニング方法によって同定された、上記ポリべプチドの活性を促進または阻害する化合物を含有する医薬組成物を提供するものである。

また、本発明は、塩誘導性キナーゼ 2の発現が亢進することによって生じる疾患または生理状態の予防または改善方法であって、上記医薬組成物を投与することを含むことを特徴とする、疾患または生理状態の予防または改善方法を提供するものである。 3 010535

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また、本発明は、塩誘導性キナーゼ 2の発現が低下することによって生じる疾患または生理状態の予防または改善方法であって、上記医薬組成物を投与することを含むことを特徴とする、疾患または生理状態の予防または改善方法を提供するものである。

また、本発明は、上記ポリペプチドを試験化合物と接触させ、該試験化合物と該ポリべプチドとの結合を検出し、上記ポリぺプチドに対して特異的に結合する化合物を同定する工程を含むことを特徴とする、上記ポリぺプチドに特異的に結合する化合物のスクリ一エング方法を提供するものである。

また、本発明は、上記ポリペプチドが活性を示す条件下で該ポリペプチドと試験化合物とを接触させ、該試験化合物の存在下における該ポリペプチドの活性を評価し、該試験化合物の非存在下における該ポリペプチドの活性と比較し、その比較結果により上記試験化合物の上記ポリべプチドの活性調節能を同定する工程を含むことを特徴とする、上記ポリペプチドに対する活性調節能を有する化合物のスクリー二ング方法を提供するものである。

また、本発明は、上記ポリヌクレオチドを含む標的ポリヌクレオチド検体を該標的ポリヌクレオチドの発現に適した条件下で試験化合物と接触させ、上記標的ヌクレオチドの発現の変化を検出し、上記試験化合物の非存在下および種々の量の存在下における上記標的ポリヌクレオチドの発現を比較する工程を含むことを特徴とする、上記ポリヌクレオチドの発現に影響を与える化合物のスクリ一ユング方法を提供するものである。

また、本発明は、試験化合物の存在下、自己リン酸化能を有するタンパク質をリン酸化させるリン酸化工程、リン酸化された状態のリン酸化部位を認識する抗体、またはリン酸化されていない状態の自己リン酸化部位を認識する抗体と、上記タンパク質とを結合させる抗体結合工程、および上記タンパク質と上記抗体との反応を検出する測定工程を含むことを特徴とする、自己リン酸化能を有するタンパク質の活性を促進または阻害する化合物のスクリ一二ング方法を提供するものである。また、本発明は、自己リン酸化能を有するタンパク質を産生する能力を有する細胞を、上記タンパク質の発現に適した条件で培養する工程、該細胞を、試験化合物の存在下、リン酸化された状態の自己リン酸化部位を認識する抗体、またはリン酸化されていない状態の自己リン酸化部位を認識する抗体と接触させる抗体結合ェ程、および上記タンパク質と上記抗体との反応を検出する測定工程を含むことを特徴とする、上記タンパク質の活性を促進または阻害する化合物のスクリーユング方法を提供するものである。

また、本発明は、試験化合物の存在下、塩誘導性キナーゼと、塩誘導性キナーゼによってリン酸化される基質とを接触させて該基質をリン酸化させるリン酸化工程、リン酸化された状態の基質を認識する抗体、またはリン酸化されていない状態の基質を認識する抗体と、上記リン酸化された基質とを反応させる抗体結合工程、および上記基質と上記抗体との反応を検出する測定工程とを含むことを特徴とする、塩誘導性キナーゼの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法を提供するものである。

また、本発明は、上記ポリペプチドを含有するこ.とを特徴とする、上記ポリぺプチドの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング用キットを提供するものである。

また、本発明は、自己リン酸化能を有するタンパク質と、リン酸化された状態の自己リン酸化部位を認識する抗体、またはリン酸化されていない状態の自己リン酸化部位を認識する抗体とを含有することを特徴とする、自己リン酸化能を有するタンパク質の活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング用キットを提供するものである。図面の簡単な説明

図 1は、ラット S I K 1とマウス S I K 2蛋白のアミノ酸配列を示す。

図 2は、各組織における S I K 1および S I K 2の m R N Aの存在を調べた結果である。

図 3は、ラット S I K 1およびマウス S I K 2のタンパク質リン酸化活性を比較した結果である。

図 4は、ラット S I K 1およびマウス S I K 2の C R E抑制活性を比較した結果である。

図 5は、スタウロスポリンによるマウス S I K2のタンパク質リン酸化活性の阻害を示す結果である。

図 6は、抗体の検出を行った結果である。

図 7は、抗体とペプチドとの反応性を示す結果である。

図 8は、 S I Kの阻害剤の検討結果を示す図である。

図 9は、 CRE抑制活性を比較した結果である。

図 1 0は、 3 T 3 _ L 1細胞内における、ラット S I K 1およびマウス S I K 2 の細胞内分布を示す結果である

図 1 1は、脂肪細胞分化の過程において誘導される、各種脂肪細胞分化マーカーおよび S I K1、 S I K2の mRN Aの定量を行った結果を示す図である。

図 1 2は、 S I K2の GST—ヒト I RS 1、 GST—ヒト I RS 1 (S 7 94 A) に対するタンパク質リン化酸活性を比較した結果である。

図 1 3は、各種細胞における S I K 2 niRNAおよび S I K 2タンパク質の量、および S I Kの活性を調べた結果である。

図 14は、 S I Kの自己リン酸化部位を調べた結果である。

図 1 5は、二重リン酸化を認識する抗体と、リン酸化された S I Kとの反応を示す結果である。

図 1 6は、各種抗体と S I Kとを、 S I K阻害剤の存在下で反応させた結果である。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明について詳細に説明する。

まず、本発明のポリペプチドについて説明する。

本発明のポリペプチドは、以下の（A) 〜（L) のいずれか 1のポリペプチドと少なくとも 90%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリべプチドまたはその塩である。

(A) 配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号： 1で表わされる塩基配列にハイブリダィズ可能な c DNAによってコ一ドされるアミノ酸配列よりなるポリぺプチド；

(B) 配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有し、かつ c AMP応答配列の制御下にある遺伝子の転写調節活性を有するポリペプチド、または配列番号： 1で表わされる塩基配列にハイブリダイズ可能な cDNAによってコードされるァミノ酸配列よりなり、かつ c AMP応答配列の制御下の遺伝子の転写調節活性を有するポリペプチド；

(C) 配列番号： 4で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号： 3で表わされる塩基配列にハイブリダィズ可能な c DNAによってコードされるアミノ酸配列よりなるポリぺプチド；

(D) 配列番号： 4で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有し、かつ c AMP応答配列の制御下の遺伝子の転写調節活性を有するポリペプチド、または配列番号： 3で表わされる塩基配列にハイプリダイズ可能な c DNAによってコードされるアミノ酸配列よりなり、かつ c AMP応答配列の制御下の遺伝子の転写調節活性を有するポリぺプチド；

(E) 配列番号： 6で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号： 5で表わされる塩基配列にハイプリダイズ可能な c DNAによってコードされるアミノ酸配列よりなるポリぺプチド

(F) 配列番号： 6で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有し、かつ c AMP応答配列の制御下の遺伝子の転写調節活性を有するポリペプチド、または配列番号： 5で表わされる塩基配列にハイブリダィズ可能な c DNAによってコードされるアミノ酸配列よりなり、かつ c AMP応答配列の制御下の遺伝子の転写調節活性を有するポリぺプチド；

(G) 配列番号： 8で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号： 7で表わされる塩基配列にハイブリダィズ可能な c DNAによってコードされるアミノ酸配列よりなるポリぺプチド；

(H) 配列番号： 8で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有し、かつ c AMP応答配列の制御下にある遺伝子の転写調節活性を有するポリペプチド、または配列番号： 7で表わされる塩基配列にハイブリダィズ可能な c DN Aによってコードされるアミノ酸配列よりなり、 ' かつ c AMP応答配列の制御下の遺伝子の転写調節活性を有するポリぺプチド；

( I) 配列番号： 1 0で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号： 9で表わされる塩基配列にハイプリダイズ可能な c DNAによってコードされるアミノ酸配列よりなるポリぺプチド；

( J) 配列番号： 10で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有し、かつ c AMP応答配列の制御下にある遺伝子の転写調節活性を有するポリペプチド、または配列番号： 9で表わされる塩基配列にハイブリダィズ可能な c DNAによってコードされるアミノ酸配列よりなり、かつ c AMP応答配列の制御下の遺伝子の転写調節活性を有するポリべプチド； (K) 配列番号： 1 2で表されるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号： 1 1で表される塩基配列にハイプリダイズ可能な c DNAによってコードされるアミノ酸配列よりなるポリペプチド；

(L) 配列番号： 1 2で表されるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有し、かつ c AMP応答配列の制御下にある遺伝子の転写調節活性を有するポリペプチド、または配列番号： 1 1で表される塩基配列にハイブリダイズ可能な c DNAによってコードされるァミノ酸配列よりなり、かつ c AMP応答配列の制御下の遺伝子の転写調節活性を有するポリべプチド。本明細書において、「実質的に同一」とは、ポリペプチドの活性が実質的に同一であることを意味する。一部のアミノ酸が欠失、置換または付加された場合、その欠失、置換または付加がなされたポリペプチドは、欠失、置換または付加がなされていないものと活性が同一であれば、実質的に同一である。一般的に、相同性の程度が、全体の 9 0 %、好ましくは 9 5 %であるアミノ酸配列を有するポリペプチドであれば、実質的に同一であると解釈される。一般には、アミノ酸配列中の一部（好ましくは 1〜2 0個、更に好ましくは 1〜1 0個、最も好ましくは数個）のァミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸からなるポリペプチドは実質的に同一である。以下、本発明のポリペプチドについて説明する。

本発明のポリペプチドは、上記（A) 〜（L ) のいずれか 1のポリペプチドと少なくとも 9 0 %以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリぺプチドまたはその塩である。

配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドとは、マウス由来の塩誘導性キナ一ゼ 2 ( S I K 2 ) の N末端のメチォユンから C末端のスレオニンまでの 9 3 1個のアミノ酸からなるペプチド配列である。このポリぺプチドと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、配列番号： 2で表わされるァミノ酸配列よりなるポリペプチドとの相同性の程度が、全体の約 9 0 %、好ましくは 9 5 %以上であるアミノ酸配列を有するポリペプチドであれば、実質的に同一であると解釈される。従って、配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列中の一部（好ましくは 1〜2 0個、更に好ましくは 1〜1 0個程度、最も好ましくは数個）のァミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドも実質的に同一である。このようなポリペプチドをコードする D N Aとしては、配列番号： 1 で表わされる塩基配列にハイプリダイズ可能な c D N Aが用いられる。

配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列よりなるポリぺプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリぺプチドは、 S I K 2のタンパク質リン酸化活性を担うとともに、脂肪細胞を含む一般的な培養細胞内で発現させた場合には c AM P応答配列（C R E ) 制御下にある遺伝子の転写調節活性を有する。すなわち、配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリべプチドは、 S I K 2のタンパク質リン酸化活性を担うとともに、脂肪細胞を含む一般的な培養細胞内で発現させた場合には c AM P応答配列（C R E ) 制御下にある遺伝子の転写を抑制する活性を有する。配列番号： 4で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドとは、配列番号： 2で表わされるポリペプチドである、マウス由来の塩誘導性キナーゼ 2 ( S I K 2 ) の 5 7 7番目のプロリンから 6 2 3番目のグルタミンまでの 4 7アミノ酸からなる制御ドメイン部分（ドメイン 3部分）である、ペプチド配列である。このポリぺプチドと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、配列番号： 4で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドとの相同性の程度が、全体の約 9 0 %、好ましくは 9 5 %以上であるァミノ酸配列を有するポリぺプチドであれば、実質的に同一であると解釈される。従って、配列番号： 4で表わされるアミノ酸配列中の一部（好ましくは 1〜5個）のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドも実質的に同一である。このようなポリペプチドをコードする D N Aとしては、配列番号： 3で表わされる塩基配列にハイブリダィズ可能な c D N Aが用いられる。

配列番号： 4で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリべプチドは、 S I K 2のタンパク質リン酸化活性を制御しているとともに、脂肪細胞を含む一般的な培養細胞内で発現させた場合にはリン酸化を受けることによって c AM P応答配列（C R E ) 制御下にある遺伝子の転写調節活性を有する。すなわち、配列番号： 4で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリぺプチドは、 S I K 2のタンパク質リン酸化活性を制御するとともに、脂肪細胞を含む一般的な培養細胞内で発現させた場合にはリン酸化を受けることによって c A M P応答配列（C R E ) 制御下にある遺伝子の転写活性のモジユレータとしての機能を有する。

配列番号： 6で表わされるァミノ酸配列よりなるポリぺプチドとは、配列番号： 2で表わされるポリペプチドである、マウス由来の塩誘導性キナーゼ 2 ( S I K 2 ) の 2 0番目のチロシンから 2 7 1番目のメチォユンまでの 2 5 2アミノ酸からなる、キナーゼ活性を有するドメイン部分（ドメイン 1部分）である、ペプチド配列である。このポリべプチドと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリべプチドとは、配列番号： 6で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドとの相同性の程度が、全体の約 90%、好ましくは 9 5%以上であるアミノ酸配列を有するポリぺプチドであれば、実質的に同一であると解釈される。従って、配列番号： 6で表わされるアミノ酸配列中の一部（好ましくは 1〜20個、更に好ましくは 1〜 10個程度、最も好ましくは数個）のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなるポリべプチドも実質的に同一である。このようなポリぺプチドをコードする DNAとしては、配列番号： 5で表わされる塩基配列にハイプリダイズ可能な c DNAが用いられる。

配列番号： 6で表わされるァミノ酸配列よりなるポリぺプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、 S I K 2のタンパク質リン酸化活性を担うとともに、脂肪細胞を含む一般的な培養細胞内で発現させた場合には c AMP応答配列（CRE) 制御下にある遺伝子の転写調節活性を有する。すなわち、配列番号： 6で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、 S I K2のタンパク質リン酸化活性を担うとともに、脂肪細胞を含む一般的な培養細胞内で発現させた場合には c AMP応答配列（CRE) 制御下にある遺伝子の転写を抑制する活性を有する。さらに、配列番号： 6で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、そのリン酸化活性を失うと、 CRE制御下にある遺伝子の転写を亢進する。

配列番号： 8で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドとは、配列番号： 2で表わされるポリペプチドである、マウス由来の塩誘導性キナーゼ 2 (S I K2) の 293番目のィソロイシンから 345番目のプロリンまでの 5 3アミノ酸からなる安定化ドメイン部分（ドメイン 2部分）であるペプチド配列である。このポリぺプチドと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリべプチドとは配列番号： 8で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドとの相同性の程度が、全体の約 90%、好ましくは 9 5%以上であるアミノ酸配列を有するボリペプチドであれば、実質的に同一であると解积される。従って、配列番号： 8で表わされるアミノ酸配列中の一部（好ましくは 1〜5個）のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列 00雇 0535

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からなるポリべプチドも実質的に同一である。このようなポリぺプチドをコードする DNAとしては、配列番号： 7で表わされる塩基配列にハイブリダィズ可能な c DNAが用いられる。配列番号： 8で表わされるアミノ酸配列よりなるポリぺプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリべプチドは、タンパク質の安定化を担うとともに、脂肪細胞を含む一般的な培養細胞内で発現させた場合にはリン酸化を受けることによって c AMP応答配列（CRE) 制御下にある遺伝子の転写を調節する活性を有する。すなわち、配列番号： 8で表わされるアミノ酸配列よりなるポリべプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、タンパク質の安定化を担うとともに、脂肪細胞を含む一般的な培養細胞内で発現させた場合には、リン酸化を受けることによって、 c AMP応答配列 (CRE) 制御下にある遺伝子の転写活性のモジュレータとしての機能を有する。配列番号： 1 0で表わされるァミノ酸配列よりなるポリペプチドとは、配列番号： 2で表わされるポリペプチドである、マウス由来の塩誘導性キナーゼ 2 (S I K2) の 5 7 7番目のプロリンから 5 94番目のダリシンまでの 1 8アミノ酸からなる制御ドメイン部分（ドメイン 3 a部分）であるペプチド配列である。このポリべプチドと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリぺプチドとは配列番号： 10で表わされるアミノ酸配列よりなるポリぺプチドとの相同性の程度が、全体の約 90%、好ましくは 95%以上であるアミノ酸配列を有するポリぺプチドであれば、実質的に同一であると解釈される。従って、配列番号： 10で表わされるアミノ酸配列中の一部（好ましくは 1〜2個）のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなるポリぺプチドも実質的に同一である。このようなポリぺプチドをコ一ドする DNAとしては、配列番号： 9で表わされる塩基配列にハイプリダイズ可能な c DNAが用いられる。配列番号： 1 0で表わされるアミノ酸配列よりなるポリぺプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリべプチドは、 S I K 2タンパク質の核外への排出に関与しているとともに、脂肪細胞を含む一般的な培養細胞内で発現させた場合には、リン酸化を受けることによって c AMP応答配列（CRE) 制御下にある遺伝子の転写を調節する活性を有する。すなわち、配列番号： 1 0で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的 PC漏 003細 535

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に同一のアミノ酸配列を有するポリべプチドは、 S I Kタンパク質の核外への排出に関与しているとともに、脂肪細胞を含む一般的な培養細胞内で発現させた場合には、リン酸化を受けることによって、 c AM P応答配列（C R E ) 制御下にある遺伝子の転写活性のモジュレータとしての機能を有する。

配列番号： 1 2で表されるァミノ酸配列よりなるポリペプチドとは、配列番号： 2で表されるポリペプチドである、マウス由来の塩誘導性キナーゼ 2 ( S I K 2 ) の 5 9 5番目のィソロイシンから 6 2 3番目のグルタミンまでの 2 9アミノ酸からなる制御ドメイン部分（ドメイン 3 b部分）を含むペプチド配列を意味する。このポリぺプチドと実質的に同一のァミノ酸配列よりなるポリぺプチドとは配列番号： 1 2で表されるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと相同性の程度が、全体の約 9 0 %、好ましくは 9 5 %以上であるアミノ酸配列を有するポリペプチドであれば、実質的に同一であると解釈される。従って、配列番号： 1 2で表されるアミノ酸配列中の一部（好ましくは 1 〜 2個）のアミノ酸が欠失、置換または付加したァミノ酸配列からなるポリぺプチドも実質的に同一である。このようなポリべプチドをコードする D N Aとしては、配列番号： 1 1で表される塩基配列にハイブリダィズ可能な c D N Aが用いられる。配列番号： 1 2で表されるアミノ酸配列よりなるポリぺプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリぺプチドは、 S

1 K 2タンパク質の細胞質局在に関与している。

配列番号： 2、配列番号： 4、配列番号： 6、配列番号： 8、配列番号： 1 0おょぴ配列番号： 1 2で表わされるポリペプチドは、マウスおよび他の温血動物（例えば、ヒト、ラット、ニヮトリ、ゥサギ、ブタ、ヒッジ、ャギ、ゥシ、ゥマ、サル等）の脂肪細胞に特異的に発現しているポリペプチドである。従って、配列番号：

2、配列番号： 4、配列番号： 6、配列番号： 8、配列番号： 1 0または配列番号： 1 2で表わされるアミノ酸配列、特に配列番号： 4で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、マウス組織もしくは細胞から採取される S I K 2タンパク質に由来するもの、またはマウス以外の温血動物の組織もしくは細胞から採取される S I K 2ホモログ、該ポリべプチドをコードするヌクレオチド配列に基づいて遺伝子工学的に作製されるポリぺプチド、あるいは該アミノ酸配列に基づいて化学的に合成されるポリべプチドであってもよレ、。

配列番号： 2、配列番号： 4、配列番号： 6、配列番号： 8、配列番号： 1 0又は配列番号： 1 2で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドとしては、 CRE制御下にある遺伝子の転写を制御する活性を有するポリペプチドであって、具体的には、配列番号： 2、配列番号： 4、配列番号： 6、配列番号： 8、配列番号： 1 0又は配列番号： 1 2で表わされるァミノ酸配列と約.90%以上、好ましくは約 9 5%以上の相同性を有するポリべプチドである。これら実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、配列番号： 2、配列番号： 4、配列番号： 6、配列番号： 8、配列番号： 1 0又は配列番号： 1 2で表わされるアミノ酸配列において、 1もしくは 2以上のアミノ酸が欠失、揷入または付加されたアミノ酸配列、 1もしくは 2以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、リン酸、糖鎮ゃ脂肪酸等で修飾されたアミノ酸配列、またはそれらが組み合わされたァミノ酸配列を含有するポリペプチドが含まれる。また、タンパク質の発現の際に使用される融合タンパク質、例えば、ダルタチオン- S-トランスフェラーゼ（GST) 、マルトース結合タンパク質（MB P) 、ヒスチジンへキサマー等が結合した S I K 2も実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリぺプチドに含まれる。

本発明のポリペプチドは、左端が N末端（ァミノ基末端）、右端が C末端（カルボキシル基末端）であり、 C末端がカルボキシル基（一 COOH) 、カルボキシレート（一 COO— ) 、アミド（一 CONH₂) 、またはエステル（一 COOR) の何れであっても良い。また、上記エステルにおける Rとしては、例えばメチル、ェチル、 n—プロピル、イソプロピル、 n—ブチル等の炭素数が 1〜 6個のアルキル基、シク口ペンチル、シク口へキシル等の炭素数が 3〜 8個のシク口アルキル基ゃァリール基、ァラルキル基等が挙げられる。さらに、本発明のポリペプチドには、 N末端のアミノ酸残基のァミノ基が保護基で保護されているもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合した糖タンパク質等の複合タンパク質等も含まれる。本発明のポリぺプチドの塩としては、生理学的に許容される無機酸および有機酸、アル力リ金属塩等の塩基等との塩が用いられ、生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。無機酸としては、例えば塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸、有機酸としては、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クェン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸等が挙げられる。

本発明のポリべプチドまたはその塩は、前述した温血動物の細胞または組織をホモジナイズした後、酸等で抽出を行い、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、ィォン交換クロマトグラフィ一等のクロマトグラフィーを組み合わせことによる公知のタンパク質の精製方法によって S I K 2タンパク質を単離精製し、必要に応じてぺプチダーゼ等を用いて配列番号： 2、配列番号： 4、配列番号： 6、配列番号： 8、配列番号： 1 0または配列番号： 1 2で表わされるアミノ酸配列に相当する部分を含むポリペプチドを調製することにより製造することができる。また、該ポリぺプチドをコードす'る D N A配列を逆転写ポリメレースチェインリアクション法 ( R T— P C R法）等を用いて調製し、これを適当な発現ベクターに挿入して宿主細胞に導入し、得られた形質転換体を培養することによつても製造することができる。すなわち、組換えタンパク質であってもよい。上記宿主細胞の培養は、脂肪分化誘導作用を有する物質の存在下で行ってもよい。上記宿主細胞の培養を脂肪分化誘導作用を有する物質の存在下で行うことにより、本発明のポリべプチドをコードする m R N Aが誘導され、本発明のポリペプチドの産生が促進されるので好ましい。また、前駆脂肪細胞を、脂肪分化誘導作用を有する物質の存在下で培養し、得られた培養物から、本発明のポリペプチドまたはその塩を製造することができる。この場合も、脂肪分化誘導作用を有する物質によって、本発明のポリペプチドをコードする m R N Aが誘導され、本発明のポリペプチドの産生が促進される。なお、脂肪分化誘導作用を有する物質としては、例えばデキサメタゾン、インスリン、 c A M P、チアゾリジン誘導体等が挙げられる。

また、市販のタンパク質合成樹脂を用いて化学合成することによつても製造することができる。配列番号： 4で表わされるドメイン 3に相当するポリべプチドまたはその塩は、従来より公知のペプチドの合成方法に従って製造することができる。また、配列番号： 2で表わされるポリペプチドを適当なぺプチダーゼで切断することによって製造することができる。

また、配列番号： 6で表わされるドメイン 1に相当するポリペプチドまたはその塩は、従来より公知のペプチドの合成方法に従って製造することができる。また、配列番号： 2で表わされるポリぺプチドを適当なぺプチダ一ゼで切断することによつて製造することができる。

配列番号： 8で表わされるドメイン 2に相当するポリぺプチドまたはその塩は、従来公知のペプチドの合成方法に従って製造することができる。また、配列番号： 2で表わされるポリペプチドを適当なぺプチダーゼで切断することによつて製造することができる。

配列番号： 1 0で表わされるドメイン 3 aに相当するポリべプチドまたはその塩は、従来より公知のペプチドの合成方法に従って製造することができる。また、配列番号： 2または配列番号： 4で表わされるポリペプチドを適当なぺプチダーゼで切断することによって製造することができる。

配列番号： 1 2で表されるドメイン 3 bに相当するポリべプチドまたはその塩は、従来公知のペプチドの合成方法に従って製造することができる。また、配列番号： 2または配列番号： 4で表されるポリぺプチドを適当なぺプチダーゼで切断することによって製造することができる。

得られたポリべプチドが遊離体である場合には、公知の方法によって適当な塩に変換することができる。また塩として得られた場合には、公知の方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。

本発明のポリべプチドをコ一ドするポリヌクレオチドとしては、上述した本発明のポリべプチドをコ一ドする塩基配列を含有するものであればいかなるものであつてもよい。また、ゲノム D N A、前述した細胞または組織由来の m R N Aまたはそれから逆転写酵素によって調製された c D N A、合成 D N A、二本鎖 R N A、 R N A— D N Aハイプリッドであってもよい。 5

23 次に、本発明のポリヌクレオチドについて説明する。

本発明のポリヌクレオチドは、以下の（a) 〜（m) のいずれか 1のポリヌクレォチドと少なくとも 95%以上の相同性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドである。

(a) 配列番号： 1で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号： 1で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダィズ可能な cDNAであるポリヌクレオチド；

(b) 配列番号： 3で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号： 3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダィズ可能な c

DNAであるポリヌクレオチド；

(c) 配列番号： 5で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号： 5で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダィズ可能な c DNAであるポリヌクレオチド；

(d) 配列番号： 7で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号： 7で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダィズ可能な c D N Aであるポリヌクレオチド；

(e) 配列番号： 9で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号： 9で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダィズ可能な c DN Aであるポリヌクレオチド；

(f ) 配列番号： 11で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号： 11で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダィズ可能な c D N Aであるポリヌクレオチド；

(g) 配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリぺプチドをコ一ドする塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列と同—もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリぺプチドをコ一ドする塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイプリダイズ可能な c DNAであるポリヌクレオチド； ( h ) 配列番号： 4で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号： 4で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリぺプチドをコ一ドする塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイプリダイズ可能な c D N Aであるポリヌクレオチド；

( i ) 配列番号： 6で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリべプチドをコ一ドする塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号： 6で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリぺプチドをコ一ドする塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイプリダイズ可能な c D N Aであるポリヌクレオチド；

( j ) 配列番号： 8で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリべプチドをコ一ドする塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号： 8で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリべプチドをコ一ドする塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダィズ可能な c D N Aであるポリヌクレオチド；

( k ) 配列番号： 1 0で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を有するポリぺプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号： 1 0で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリべプチドをコ一ドする塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダィズ可能な c D N Aであるポリヌクレオチド；

( 1 ) 配列番号： 1 2で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリべプチドをコ一ドする塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号： 1 2で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリぺプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイプリダイズ可能な c D N Aであるポリヌクレオチド；

(m) ( a )〜（ 1 ) のいずれか 1のポリヌクレオチドとストリンジヱントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチド。

本発明のポリヌクレオチドは、上述した本発明のポリべプチドをコ一ドするポリペプチドである。具体的には、配列番号： 1、配列番号： 3、配列番号： 5、配列番号： 7、 S列番号： 9又は配列番号： 1 1で表わされるポリヌクレオチドにハイプリダイズ可能な c D N Aであるポリヌクレオチドを含む。

また、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号： 2、配列番号： 4、配列番号： 6、配列番号： 8、配列番号： 1 0又は配列番号： 1 2で表わされるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリべプチドをコ一ドする塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイプリダイズ可能な c D N Aであるポリヌクレオチドを含む。

また、本発明のポリヌクレオチドは、上記のポリヌクレオチドのいずれか 1とストリンジ工ントな条件下でハイプリダイズし得るポリヌクレオチドを含む。

上述の配列番号： 2、配列番号： 4、配列番号： 6、配列番号： 8、配列番号： 1 0又は配列番号 1 2で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリぺプチドとは、脂肪細胞を含む一般的な培養細胞内で発現させた場合には c AM P応答配列（C R E ) 制御下にある遺伝子の転写を制御する活性を有するポリペプチドである。

本明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、配列番号： 1、配列番号： 3、配列番号： 5、配列番号： 7、配列番号： 9又は配列番号： 1 1で表わされる塩基配列と約 9 5 %以上、好ましくは 9 7 %以上の同一性を有する塩基配列を含有するポリヌクレオチドがハイプリダイズし得る条件である。このような条件としては、例えば、ナトリウム濃度が約 1 9〜2 O mMの濃度で、かつ温度が約 6 0〜 6 5 °Cの温度である条件が好ましく、ナトリウム濃度が約 1 9 mMの濃度で、かつ温度が約 6 5 °Cの温度である条件が更に好ましい。ハイプリダイゼ一ションは、公知の方法に従って行なうことができる。

本発明のポリぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチドのクローニングの手段としては、ヒトまたは他の温血動物由来の S I K 2遺伝子の部分塩基配列を有する合成 D N Aプライマーを用いて P C R法によって增幅するか、または適当なベクターに組み込んだポリヌクレオチドを本発明のポリべプチドの一部または全領域をコードするヌクレオチド断片もしくは合成ヌクレオチドを用いて標識したものとのハイプ PC漏 003/010535

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リダイゼーシヨンによつて選別することができる。

DN Aの塩基配列を変換し、部分的に変異が導入されたポリぺプチドを製造することができる。 DN Aの塩基配列の変換は、市販のキット、例えば、 Mutan^TM-super ExpressKm (宝酒造）、 Mutan^TM-K (宝酒造）等を用いて行うことができる。

クローン化された本発明のポリヌクレオチドは、目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカ一を付加して使用することができる。該ポリヌクレオチドはその 5 ' 末端側に翻訳開始コドンとしての ATG、また 3 ' 末端側に翻訳終止コドンとしての TAA、 TGAまたは TAGを有していてもよい。これらのコドンは、適当な合成アダプターを用いて付加することもできる。

本発明のポリヌクレオチドは、例えばヒト、ラット、マウス、モルモット、ゥサギ、トリ、ヒッジ、プタ、ゥシ、ゥマ、ネコ、ィヌ、サル、チンパンジー等の温血動物における S I K 2をコードする DNAまたは mRNA (本発明のポリヌクレオチド、本発明のポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド）の皋常（遺伝子異常）を検出するためのプローブとして用いることができる。次に、本発明の組換ベクタ二、発現ベクターについて説明する。

本発明のポリぺプチドの発現ベクターとしては、本発明のポリぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチドから目的とするポリヌクレオチド断片を切り出し、該ポリヌクレオチド断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することによつて製造することができる。ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えば p BR 3 22、 p BR 325、 pUC 1 8または pUC 1 1 8等）、枯草菌由来のプラスミド（例えば p UB 1 1 0、 p T P 5または p C 1 94) 、酵母由来のプラスミド（例えば p SH1 9または p SH 1 5) 、えファージ等のバタテリオファージ、レトロウイルス、ヮクシニアウィルスまたはバキュ口ウィルス等のウィルス等の動物ウィルスの他、 pA l— 1 1、 p XT l、 p R c/CMV、 p R c /R S V, p c DNA I /N e o等が用いられる。本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、宿主が大腸菌である場合は、 t r pプロモーター、 1 a cプロモー PC蘭 003/0画

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タ一、 r e c Aプロモーター、； I PLプロモーター、 I p pプロモーター、 T7プロモ一ター、 T3プロモーター、 araBADプロモーター等が、宿主がバチルス属菌である場合は、 SP01プロモーター、 penPプロモータ一、 XYLプロモータ一、 HWPプロモーター、 CWPプロモーター等が好ましく、宿主が枯草菌である場合は、 S PO 1プロモーター、 S P02プロモーター、 p e n Pプロモーター等が好ましく、宿主が酵母である場合は、 PH05プロモーター、 PGKプロモーター、 GAPプロモーター、 ADH プロモーター等が好ましい。動物細胞を宿主として用いる場合は、 SR aプロモーター、 SV40プロモータ一、 LTRプロモーター、 CMVプロモーター、 H S V— TKプロモーター等が好ましく用いられる。また、昆虫細胞を宿主として用いる場合はポリヘドリンプロモーター、 0plE2プロモーター等が用いられる。

発現ベクターには、以上の他に、所望により当該技術分野で公知の、ェンハンサ一、スプライシングシグナル、ポリ A付加シグナル、選択マーカー、 SV40複製オリジン（以下、 SV40 o rgdi と略称する場合がある）等を付加することができる。また、必要に応じて、本発明の DNAにコードされた蛋白質を他の蛋白質（例えば、グルタチオン S トランスフェラーゼおよびプロテイン A) との融合蛋白質として発現させることも可能である。このような融合蛋白質は、部位特異的プロテアーゼを使用して切断し、それぞれの蛋白質に分離することができる。

上記選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、 d h f r と略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（MTX) 耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、 Amp^rと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、 N e o^rと略称する場合がある、 G41 8耐性）等があげられる。特に、 d h f r遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いて d h f r遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。宿主細胞としては、例えば、ェシエリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞等が用いられる。ェシヱリヒア属菌の具体例としては、ェシヱリヒァ ' コリ（Escherichia coli) K 1 2 ' DH 1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60卷， 1 60 (1 96 8)), JM1 0 3 (Nucleic Acids Research, 9卷， 309 (1 98 1)), J A 2 21 (Journal of Molecular Biology, 1 20卷， 5 1 7 (1 TJP2003/010535

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9 78)), HB 1 0 1 (Journal of Molecular Biology, 4 1卷， 4 5 9 (1 96 9))、 C 6 0 0 (Genetics, 39卷， 440 (1 9 54)、 D H 5 αおよび J M 1 0 9等が用いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス ·サチルス（Bacillus subtilis) M I 1 1 4 (Gene, 2 4卷， 2 5 5 ( 1 9 8 3 ))， 2 0 7— 2 1 [Journal of Biochemistry, 9 5卷， 8 7 ( 1 98 4 )〕およびバチルス ·ブレビス等が用いられる。酵母としては、例えば、サッカロマイセスセレビシェ (Saccaromyces cerevisiae) AH 2 2 , AH 2 2 R―， Ν A 8 7- 1 1 A, DKD— 5 D, 20 B— 1 2、シゾサッカロマイセスボンべ (Schizosaccaromyces pombe) NCYC 1 9 1 3, N C Y C 20 3 6、ピキアパストリス（Pichia pastoris) M 7 1およびハンセヌラ ' ポリモーファ（Hansenula polymorpha)等が用いられる。昆虫細胞としては、例えば、ウイルスが A c N P Vの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell； S f 細胞）、 Trichoplusia ni の中腸由来の MG 1細胞、 Trichoplusia ni の卵由来の High Five™細胞、 Mamestra brassicae由来の細胞または Estigmena acrea 由来の細胞等が用いられる。ウィルスが B mN P Vの場合は、蚕由来株化細胞 (Bombyx mori N 細胞； BmN細胞）等が用いられる。該 S f 細胞としては、例えば、 S f 9細胞（ATCC CRL1711), S f 2 1細胞（以上、 Vaughn, J.L.ら、イン ' ヴイボ（In Vivo) , 13, 213-217, (1977)) 等が用いられる。昆虫としては、例えば、カイコの幼虫等が用いられる〔前田ら、ネイチヤー（Nature), 3 1 5卷， 5 9 2 (1 9 8 5〉〕。哺乳動物細胞としては、例えば、サル細胞 CO S— 7， Vero, チヤィニーズハムスター細胞 CHO (以下、 CHO細胞と略記）， d h f r遺伝子欠損チヤィニーズハムスター細胞 CHO (以下、 CHO (d h f r— ) 細胞と略記），マウス L細胞，マウス A t T— 2 0, マウスミエローマ細胞，ラット GH 3, ヒト F L細胞等が用いられる。

また、必要に応じて、宿主細胞に適したシグナル配列をコードするポリヌクレオチドを、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの 5 ' 端末側に付加してもよい。宿主細胞としてェシエリヒア属菌を用いる場合は、 PhoA 'シグナル配列、 OmpA · シグナル配列等が用いられ、宿主細胞としてバチルス属菌を用いる場合は、 _α—アミラーゼ · シグナル配列、サブチリシン · シグナル配列等が用いられ、宿主細胞として酵母を用いる場合は、 MF a · シグナル配列、 S U C 2 · シグナル配列等が用いられ、宿主細胞として動物細胞を用いる場合には、インシュリン * シグナル配列、 α—インターフェロン · シグナル配列、抗体分子 . シグナル配列等のシグナル配列が用いられる。このようにして構築された本発明のポリぺプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。

上述した宿主細胞の形質転換は、当該技術分野で公知の方法に従って行うことができる。ェシエリヒア属菌を形質転換するには、例えば、 Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 6 9卷， 2 1 1 0 (1 9 7 2) ; Gene, 1 7卷， 1 0 7 ( 1 9 8 2 )等に記載の方法に従って行なうことができる。バチルス属菌を形質転換するには、例えば、

Molecular & General Genetics, 1 6 8卷， 1 1 1 ( 1 9 7 9)等に記載の方法に従つて行なうことができる。酵母を形質転換するには、例えば、 Methods in Enzymology, 1 9 4卷， 1 8 2— 1 8 7 ( 1 9 9 1 ) 、 Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 7 5卷， 1 9 2 9 ( 1 9 7 8)等に記載の方法に従って行なうことができる。昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、 Bio/Technology, 6, 47 - 55 (1988)等に記載の方法に従って行なうことができる。哺乳動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞ェ学別冊 8 新細胞工学実験プロトコール. 2 6 3— 2 6 7 ( 1 9 9 5 ) (秀潤社発行）、 Virology, 5 2卷， 4 5 6 ( 1 9 7 3 )に記載の方法に従って行なうことができる。このようにして、本発明のポリぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。

上述した形質転換体の培養は、当該技術分野で公知の方法に従って行うことができる。宿主がヱシエリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が好ましく用いられ、該液体培地中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。上記炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖等が挙げられ、上記窒素源としては、例えば、アンモニゥム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ' リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液等の無機または有機物質等が挙げられ、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム等が挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子等を上記液体培地に添加してもよい。培地の p Hは約 5〜8 であることが好ましい。ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含む M9培地〔Miller， Journal of Experiments in Molecular Genetics, 4 3 1— 4 3 3 , Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1 9 7 2] 等を用いることが好ましい。培地には、必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、 3 J3—インドリルアクリル酸等の薬剤を加えてもよレ、。宿主細胞がェシエリヒア属菌の場合、培養は通常約 1 5〜4 3 °Cの温度で約 3 〜 24時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えてもよい。宿主細胞がバチルス属菌の場合、培養は通常約 3 0〜40°Cの温度で約 6〜24時間行ない、必要により通気や撹拌を加えてもよい。宿主細胞が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Burkholder) 最小培地〔Bostian, K. L. ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. US A, 7 7卷， 4 50 5 ( 1 9 8 0 )〕や 0. 5 %カザミノ酸を含有する S D培地 [Bitter, G. A. ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8 1卷， 5 3 30 ( 1 9 84) 〕があげられる。培地の p Hは約 5〜 8に調整することが好ましい。培養は通常約 20 ° (：〜 3 5 °Cの温度で約 24〜 7 2時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加えてもよい。

宿主細胞が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、 Grace's Insect Medium (Grace, T. C. C.， Nature, 195, 788(1962)) に非働化した 1 0 %ゥシ血清等の添加物を適宜加えたもの等が好ましく用いられる。培地の p Hは約 6. 2〜6. 4に調整することが好ましい。培養は通常約 2 7°Cの温度で約 3〜 5日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加えてもよい。宿主が哺乳動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約 5〜 20%の胎児牛血清を含む MEM培地 [Science, 1 2 2卷， 5 0 1 (1 95 2)〕， DMEM培地 [Virology, 8卷， 3 9 6 (1 9 5 9)〕， RPM I 1 64 0培地〔The Journal of the American Medical Association, 1 9 9卷， 5 1 9 (1 9 6 7)] , 1 9 9培地 [Proceeding ofthe Society for the Biological Medicine, 7 3卷， 1 (1 9 5 0)〕等が用いられる。培地の pHは約 6〜8に調整することが好ましい。培養は通常約 3 0°C〜40°Cの 2003/010535

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温度で約 1 5〜6 0時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加えてもよい。

以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外に本発明のポリべプチドを生成することができる。上記培養物から本発明のポリペプチドを分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。本発明のポリペプチドを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、当該技術分野で公知の方法で菌体または細胞を集め、この菌体または細胞を適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム処理および Zまたは凍結融解等によって菌体または細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により蛋白質の粗抽出液を得る方法等が適宜用いられる。緩衝液には尿素や塩酸グァニジン等の蛋白質変性剤や、トリトン X— 1 0 0™等の界面活性剤を含有させてもよい。培養液中に本発明のポリペプチドが分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体または細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清、または抽出液中に含まれる本発明のポリぺプチドの精製は、自体公知の分離 ·精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析ゃ溶媒沈澱法等の溶解度を利用して分離 '精製を行う方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、および S D S— ポリアクリルアミドゲル電気泳動法等の主として分子量の差を利用して分離 ·精製を行う方法、イオン交換クロマトグラフィー等の荷電の差を利用して分離 ·精製を行う方法、ァフィ二ティークロマトグラフィ一等の特異的親和性を利用して分離 · 精製を行う方法、逆相高速液体ク口マトグラフィ一等の疎水性の差を利用して分離 ·精製を行う方法、等電点電気泳動法等の等電点の差を利用して分離 ·精製を行う方法等が用いられる。

上述のようにして得られる本発明のポリペプチドが遊離体で得られる場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。なお、形質転換体が産生するポリペプチドを、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリブシン、アルギニルエンドべプチダーゼ、プロティンキナーゼ、グリコシダーゼ等が用いられる。かくして生成する本発明のポリぺプチドの存在は、特異抗体を用いたェンザィムィムノアツセィゃウェスタンブ口ッテイング等により測定することができる。本発明のポリペプチドまたはその塩に対する抗体は、本発明のポリペプチドまたはその塩を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。本発明のポリペプチドまたはその塩（以下、本発明のポリペプチドと略記することもある）に対する抗体は、本発明のポリペプチドを抗原として用い、自体公知の抗体、または抗血清の製造法に従って製造することができる。抗原として用いられる本発明のポリぺプチドとしては、上記の本発明のポリぺプチドまたはその塩であればいずれのものを用いてもよレヽ。次に、本発明の抗体、または該抗体のフラグメント、上記抗体を産生するハイブリドーマについて説明する。

本発明の抗体、または該抗体のフラグメントは、上述した本発明のポリペプチドに対して親和性を有するものであり、上述した本発明のポリペプチドに対して親和性を有するものであれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであつてもよい。該抗体は、本発明のポリペプチドまたはその塩を抗原として用い、従来公知の抗体または抗血清の製造方法に従って製造することができる。また、上記抗体を産生するハイプリドーマは、従来公知の方法に従って製造することができる。以下、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の作製方法について、以下に説明する。

〔モノク口一ナル抗体の作製〕

( a ) モノクローナル抗体産生細胞の作製

本発明のポリべプチドは、温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常 2〜6週毎に 1回ずつ、計 2〜 1 0回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ゥサギ、ィヌ、モルモット、マウス、ラッ T JP2003/010535

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ト、ヒッジ、ャギ、ニヮトリが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜 5 日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイプリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、標識化させたポリべプチドと抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタィンの方法 [： Nature、 256、 495 (1975)〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（P E G ) やセンダイウィルス等が挙げられるが、好ましくは P E Gが用いられる。

骨髄腫細胞としては、例えば、 N S— 1、 P 3 U 1、 S P 2 Z 0、 A P— 1等の温血動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、 P 3 U 1が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 ： 1〜 2 0 ： 1程度であり、 P E G (好ましくは P E G 1 0 0 0〜P E G 6 0 0 0 ) が 1 0〜8 0 %程度の濃度で添加され、 2 0〜4 0 °C、好ましくは 3 0〜 3 7 °Cで 1〜 1 0分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。モノクローナル抗体産生ハイプリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、タンパク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイプリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素等で標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテイン Aを加え、固相に結合したモノクロ一ナル抗体を検出する方法、抗免疫グ口ブリン抗体またはプロテイン Aを吸着させた固相にハイプリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素等で標識したタンパク質を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法等が挙げられる。モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常 H A T (ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブ 3 010535

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リドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、 1〜 2 0 %、好ましくは 1 0〜 2 0 %の牛胎児血清を含む R P M I 1 6 4 0培地、 1〜 1 0 %の牛胎児血清を含む G I T培地（和光純薬工業（株））あるいはハイプリドーマ培養用無血清培地（S F M— 1 0 1、日水製薬（株））等を用いることができる。培養温度は、通常 2 0〜4 0 ΐ、好ましくは約 3 7 °Cである。培養時間は、通常 5 日〜3週間、好ましくは 1週間〜 2週間である。培養は、通常 5 %炭酸ガス下で行なうことができる。ハイプリドーマ培養上清の抗体価は、前記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。

( b ) モノクローナル抗体の精製

モノクローナル抗体の分離精製は、自体公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、 D E A E ) による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロティン Aあるいはプロティン G等の活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。

〔ポリクローナル抗体の作製〕本発明のポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原であるポリペプチド自体、あるいはそれとキャリアー蛋白質との複合体をつくり、前記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明のポリペプチドに対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造することができる。温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリァ一蛋白質との複合体に関し、キヤリァー蛋白質の種類およびキヤリァ一とハプテンとの混合比は、キヤリァ一に架橘させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ゥシ血清アルブミンゃゥシサイ口グロプリン、へモシァニン等を重量比でハプテン 1 に対し、約 0 . 1〜2 0、好ましくは約 1〜5の割合でカプルさせる方法が用いられる。また、ハプテンとキャリアーの力プリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、ダルタルアルデヒドゃカルポジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。縮合生 3 010535

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成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントァジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約 2 〜 6週毎に 1回ずつ、計約 3〜1 0回程度行なわれる。ポリクローナル抗体は、前記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水等、好ましくは血液から採取することができる。抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、前記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、前記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロプリンの分離精製法に従って行なうことができる。

本発明のポリペプチドに対して親和性を有する抗体は、被検液中の本発明のポリペプチド（例えば、生体試料中の S I K 2蛋白質）のィムノアッセィによる定性、定量や組織染色等に使用することができる。さらに、本発明の抗体は S I K 2の発現量や細胞内局在から判断される C R E抑制活性の検討に利用できる。特に S I K 1と S I K 2を区別することのできる抗体は、 S I K 1および S I K 2の発現量や活性等を個別に検討するために用いることができる。また、 S I K 1および S I K 2の活性を特異的に中和、制御することも可能である。

さらに、 S I K 1および/または S I K 2の翻訳後修飾、例えばリン酸化等、を特異的に認識する抗体は、抗体を用いる治療に応用することができる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子の F ( a b ' ) ₂、 F a b '、あるいは F a b画分を用いてもよい。本発明の抗体を用いる本発明のポリペプチドの定量法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（すなわち、本発明のポリペプチド）に対応した抗体、抗原もしくは抗体一抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出する。このような検出手段としては、例えば、ネフロメトリー、競合法、ィムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられる。標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質等が用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔¹²⁵ I〕、 C¹³¹ I ] 、〔³H〕、〔"C〕等が用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きいものが好ましく用いられる。このような酵素としては、例えば、 βーガラクトシダ一ゼ、 —ダルコシダーゼ、アル力リフォスファターゼ、パ一ォキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等が挙げられる。蛍光物質としては、例えば、フルォレスカミン、フルォレツセンイソチオシァネート等が挙げられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ノレシフェリン、ルシゲニン等が挙げられる。さらに、抗体または抗原と標識剤との結合にピオチン一アビジン系を用いてもよい。抗原または抗体の不溶化に際しては、物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、ァガロース、デキストラン、セルロース等の不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、ガラス、磁気粒子等が用いられる。

また、本発明の抗体を用いることによって、本発明のポリペプチドを感度良く定量することができる。さらには、本発明の抗体を用いて生体試料中の S I Κ 2の濃度を定量することによって、 S I Κ 2の濃度の増加が検出された場合、例えば、月旨肪細胞の分化抑制もしくは脂肪細胞の代謝機能不全が関与する疾患（例えば、糖尿病、肥満、高脂血症、高血圧、動脈硬化、高尿酸血症、循環器疾患等）等の疾病に罹患しているか、または将来上記疾患に罹患する可能性が高いと診断することができる。 S I Κ 2の濃度が減少した場合は、 C R Eの過剰な活性化が持続し、細胞の異常增殖やそれに伴う癌の危険度の予測に利用可能である。

また、本発明の抗体は、脂肪細胞 ·組織等に存在する S I Κ 2または本発明の組換えポリペプチドを分離精製するための抗体カラムの作製、精製時の各分画中の S I Κ 2または組換えポリペプチドの検出に使用することができる。さらに、本発明の抗体は、被検細胞内における S I Κ 2もしくは本発明のポリペプチドの挙動の分析等のために使用することができる。次に、本発明の医薬組成物について説明する。

本発明の医薬組成物は、本発明のポリペプチド、または本発明の組換ベクターを含有する。

また、本発明の医薬組成物は、本発明の抗体またはそのフラグメント、または本 10535

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発明のポリヌクレオチドに相補的に結合するアンチセンスヌクレオチドを含有する。

本発明のポリペプチド、または本発明の組換ベクターを含有する医薬組成物（本発明の第 1の実施の形態にかかる医薬組成物）について説明する。

S I K 2は、脂肪細胞における C R Eの制御下にある遺伝子の転写を調節することにより、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化や脂肪細胞における糖代謝および脂質代謝機能を調節している。従って、本発明のポリペプチドは、脂肪細胞の分化亢進、代謝機能亢進が関与する種々の疾患の予防 ·改善剤として使用することができる。例えば、生体内において S I K 2が減少または欠損しているために、脂肪細胞の分化抑制および代謝機能の調節が十分に、あるいは正常に発揮されない患者に対して、（ィ）本発明のポリヌクレオチドを標的細胞内で機能し得るプロモーターの制御下におレ、た発現べクターを該患者に投与して生体内で本発明のポリペプチドを発現させることによって、（口）取り出した細胞に本発明のポリヌクレオチドを上記と同様に導入し、本発明のポリペプチドを発現させた後に、該細胞を患者に移植することによって、または（ハ）本発明のポリペプチドを該患者に投与すること等によって、該患者における S I K 2の役割を補完することができる。本発明のポリヌクレオチドを上記の予防 ·改善剤として使用する場合は、該ポリヌクレオチドを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスァソシエーテツドウィルスベクター等の適当なベクターに揷入した後、常套手段に従って投与することができる。

本発明のポリヌクレオチドは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤等の生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲル力テーテル等のカテーテルによって投与できる。本発明のポリべプチドを上記の予防 ·改善剤として使用する場合は、好ましくは 9 0 %、更に好ましくは 9 5 %以上、更に好ましくは 9 8 %以上、最も好ましくは 9 9 %以上に精製されたポリペプチドを使用することが好ましい。本発明のポリペプチドは、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤等として経口的に、あるいはエアロゾル化して吸入剤の形で、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容 P2003/010535

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し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤等の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、本発明のポリペプチドを生理学的に許容し得る担体、香味剤、賦形剤、べヒクル、防腐剤、安定化剤、結合剤等とともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによつて製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。錠剤、カプセル剤等に混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴム等の結合剤、結晶性セルロース等の賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸等の膨化剤、ステアリン酸マグネシゥム等の潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリン等の甘味剤、ペパーミント、ァカモノ油またはチェリー等の香味剤等が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂等の液状担体を含有することができる。注射剤は、本発明のポリペプチドを通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルべ一ト 8 0、 H C O— 5 0 (polyoxyethylene ( 5 O mol) adduct of hydrogenated castor oil) 〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニゥム、塩酸プロ力イン等）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコール等）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フエノール等）、酸化防止剤等を配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。

本発明のポリヌクレオチドが揷入されたベクターも上記と同様に製剤化され、通常、非経口的に使用される。このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、温血動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ゥサギ、トリ、ヒッジブタ、ゥシ、ゥマ、ネコ、ィヌ、サル、チンパンジー等）に対して投与することができる。本発明のポリペプチドの投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルート等により差異はあるが、例えば、抗肥満薬として本発明のポリペプチドを経口投与する場合、一般的に成人（6 O k _gとして）においては、一日につき該ポリペプチドを好ましくは約 0. lmg〜1 00mg、更に好ましくは約 1. 0〜5 Omg、最も好ましくは約 1. 0〜2 Omg投与する。非経口的に投与する場合は、該ポリペプチドの 1回投与量は投与対象、対象疾患等によっても異なるが、例えば、抗肥満薬として本発明のポリペプチドを注射剤の形で成人（体重 60 k gとして）に投与する場合、一日につき該ポリペプチドを好ましくは約 0. 01〜³ 0mg程度、更に好ましくは約 0. 1〜2 Omg程度、最も好ましくは約 0. l〜1 0mg 程度投与するのが好都合である。他の動物の場合も、 60 k g当たりに換算した量を投与することができる。

上記医薬組成物は、脂肪分化誘導作用を有する物質を含有していてもよい。該脂肪分化誘導作用を有する物質としては、例えばデキサメタゾン、インスリン、 c A MP、チアゾリジン誘導体等が挙げられる。脂肪分化誘導作用を有する物質は、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化を促進するため、 S I K 2の産生を促進するものと考えられる。

次に、本発明のポリヌクレオチドに相補的に結合するアンチセンスヌクレオチドを含有する医薬組成物（本発明の第 2の実施の形態にかかる医薬組成物）について説明する。

本発明のポリヌクレオチドに相捕的に結合し、該ポリヌクレオチドの発現を抑制することができるアンチセンスヌクレオチドは、生体内における本発明のポリヌクレオチドの産生を抑制することができるので、 S I K2の発現を抑制し、 S I K2 の発現過多が関与する疾患（例えば糖尿病、肥満、高脂血症、高血圧、動脈硬化、高尿酸血症、循環器疾患等）の予防 '治療剤として使用することができる。アンチセンスヌクレオチドを予防 '治療剤として使用する場合、上述した本発明のポリヌクレオチドを含有する各種の予防 ·治療剤と同様にして実施することができる。例えば、該アンチセンスヌクレオチドを用いる場合、該アンチセンスヌクレオチドを単独あるいはレトロウイルスベクタ一、アデノウイルスベクター、アデノウイルス P T/JP2003/010535

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ァソシエーテッドウィルスベクター等の適当なベクターに揷入した後、常套手段に従って実施することができる。該アンチセンスヌクレオチドは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤等の生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテル等のカテーテルによって投与できる。あるいは、エアロゾル化して吸入剤として気管内に投与することもできる。該アンチセンスヌクレオチドの投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルート等により差異はあるが、例えば、本発明のアンチセンスヌクレオチドを吸入剤として気管内に局所投与する場合、一般的に成人（体重 6 O k g ) においては、一日につき該アンチセンスヌクレオチドを約 0 . 1〜： L 0 0 m g投与する。

なお、本発明のポリヌクレオチドに相補的に結合するアンチセンスヌクレオチドとしては、本発明のポリヌクレオチドの塩基配列に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列を有し、該ポリヌクレオチドの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスヌクレオチドであってもよいが、アンチセンス D N Aが好ましい。本発明のポリヌクレオチドに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明のポリヌクレオチドに相補的な塩基配列（すなわち、本発明のポリヌクレオチドの相補鎖）の全塩基配列と好ましくは約 7 0 %以上、更に好ましくは約 8 0 %以上、更に好ましくは約 9 0 %以上、最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有する塩基配列が挙げられる。

さらに、該アンチセンスヌクレオチドは、組織や細胞における本発明のポリヌクレオチドの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできる。

次に、本発明の抗体、または該抗体のフラグメントを含有する医薬組成物（本発明の第 3の実施の形態にかかる医薬組成物）について説明する。

S I K 2の活性を中和する作用を有する本発明の抗体は、 S I K 2の発現過多が関与する疾患（例えば、糖尿病、肥満、高脂血症、高血圧、動脈硬化、高尿酸血症、循環器疾患、等）に対する医薬（予防 .治療剤）として使用することができる。本発明の抗体を含有する上記疾患の予防 .治療剤は、そのまま液剤として、または適当な剤形の医薬組成物として、温血動物（例えば、ヒト、ラット、ゥサギ、ヒッジ、 2003/010535

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プタ、ゥシ、ネコ、ィヌ、サル等）に対して経口的または非経口的に投与することができる。投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルート等によっても異なる力例えば、成人の糖尿病の治療 ·予防のために使用する場合には、本発明の抗体を 1回量として、好ましくは 0 . 0 1〜2 0 m g ^/ k g体重程度、更に好ましくは 0 . l l O m g / k g体重程度、最も好ましくは 0 . 1〜 5 m g Z k g体重程度を、好ましくは 1 日 1〜5回程度、更に好ましくは 1 日 1〜3回程度、注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。

症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。本発明の抗体は、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、本発明の抗体と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。すなわち、例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等があげられる。かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシゥム等が用いられる。非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含する。かかる注射剤は、自体公知の方法に従って、例えば、上記抗体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコ一ル、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート 8 0、 H C O— 5 0 (.polyoxyethylene ( 5 0 mol) adduct of hydrogenated castor oi l) 〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等 P2003/010535

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が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによつて調製される。上記の経口用または非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。かかる投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤等が例示され、それぞれの投薬単位剤形当たり通常 5〜5 0 O m g、とりわけ注射剤では 5〜 1 0 Omg、その他の剤形では 1 0〜 2 50 m gの上記抗体が含有されていることが好ましい。なお前記した各組成物は、上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。次に、本発明の遺伝子診断用組成物について説明する。

本発明の遺伝子診断用組成物は、本発明のポリヌクレオチドを含有する。

本発明のポリヌクレオチドは、例えば、プローブとして使用することにより、温血動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ゥサギ、トリ、ヒッジ、プタ、ゥシ、ゥマ、ネコ、ィヌ、サル、チンパンジー等）における S I K 2をコードする DNAまたは mRNAの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該 DNAまたは mRNAの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該 DNAまたは mRNAの増加あるいは発現過多等の遺伝子診断剤として有用である。本発明のポリヌクレオチドを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼーションゃ PCR— S S C P法（Genomics, 第 5卷， 8 74〜 8 7 9 頁い上 9 8 9年) 、 Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 第 8 6卷， 2 7 6 6〜 2 7 70頁（1 9 8 9年））等に記載の方法により実施することができる。例えば、ノーザンハイプリダイゼーシヨンにより発現過多が検出された場合や P CR— S S C P法により DNAの突然変異が検出された場合は、例えば、脂肪細胞の分化抑制もしくは脂肪細胞の代謝機能不全が関与する疾患（例えば、糖尿病、肥満、高脂血症、高血圧、動脈硬化、高尿酸血症、循環器疾患等）等の疾病に罹患している、または将来罹患する可能性が高いと診断 T JP2003/010535

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することができる。次に、本発明の疾患または生理状態の予防または改善方法について説明する。本発明の疾患または生理状態の予防または改善方法は、塩誘導性キナーゼ 2の発現が低下することによって生じる疾患または生理状態、および塩誘導性キナーゼ 2 の発現が亢進することによって生じる疾患または生理状態を予防または改善するものである。

塩誘導性キナーゼ 2の発現が低下することによって生じる疾患または生理状態の予防または改善方法は、本発明の第 1の実施の形態にかかる医薬組成物を投与することを含む。

また、塩誘導性キナーゼ 2の発現が亢進することによって生じる疾患または生理状態の予防または改善方法は、本発明の第 2または第 3の実施の形態にかかる医薬組成物を投与することを含む。

S I K 2は、脂肪細胞における C R Eの制御下にある遺伝子の転写を調節することにより、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化や脂肪細胞における糖代謝および脂質代謝機能を調節している。従って、本発明のポリペプチドまたは本発明のポリヌクレオチドは、脂肪細胞の分化亢進、代謝機能亢進が関与する種々の疾患を予防または改善するために用いられる。例えば、生体内において S I K 2が減少あるいは欠損しているために、脂肪細胞の分化抑制および代謝機能の調節が十分に、あるいは正常に発揮されない患者に対しては、本発明の第 1の実施の形態にかかる医薬組成物を用いることにより、糖代謝異常.、脂質代謝異常または脳神経障害等の疾患または生理状態を予防または改善することができる。

また、本発明の第 2または第 3の実施の形態にかかる医薬組成物を用いることにより、 S I K 2の発現が亢進することによって生じる疾患または生理状態を予防または改善することが可能である。

このような疾患または生理状態としては、糖代謝異常、脂質代謝異常または脳神経障害等が挙げられる。 PC蘭画画

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次に、本発明のスクリ一二ング方法について説明する。

本発明の第 1の実施の形態にかかるスクリーニング方法は、本発明のポリべプチドを含有する検体を試験化合物と接触させ、本発明のポリぺプチドの活性を促進または阻害する活性を検出する工程を含むことを特徴とする。本発明のスクリーニング方法によって、本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物をスクリーニングすることができる。

本発明の第 1の実施の形態にかかるスクリーニング方法は、本発明のポリべプチドを試験化合物と接触させ、該試験化合物と該ポリペプチドとの結合を検出し、上記ポリぺプチドに対して特異的に結合する化合物を同定する工程を含んでいてもよい。

また、本発明の第 1の実施の形態にかかるスクリーニング方法は、本発明のポリぺプチドが活性を示す条件下で該ポリべプチドと試験化合物とを接触させ、上記試験化合物の存在下における該ポリべプチドの活性を評価し、上記試験化合物の非存在下における該ポリペプチドの活性と比較し、その比較結果により上記試験化合物の上記ポリべプチドの活性調節能を同定する工程を含んでいてもよい。

また、本発明の第 2の実施の形態にかかるスクリーニング方法は、本発明のポリヌクレオチド、および c AM P応答配列の制御下にあるレポーター遺伝子を含む発現ベクターを試験化合物と接触させ、本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する活性を検出する工程を含むことを特徴とする。

また、本発明の第 2の実施の形態にかかるスクリーニング方法は、本発明のポリヌクレオチドを含む標的ポリヌクレオチド検体を該標的ポリヌクレオチドの発現に適した条件下で試験化合物と接触させ、上記標的ヌクレオチドの発現の変化を検出し、上記試験化合物の非存在下および種々の量の存在下における上記標的ポリヌクレオチドの発現を比較する工程を含んでいてもよい。

S I K 2は、例えば脂肪細胞における C R E活性を負に調節して脂肪細胞の分化および機能を制御することができる。キナーゼドメインの C R E活性調節活性はタンパク質リン酸化活性と互いに相関しているので、本発明のポリべプチドのタンパク質リン酸化活性を阻害する化合物は、同時に C R E活性調節作用（C R E抑制効果）を阻害し、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化および/または脂肪細胞における代謝機能を促進することができ、耐糖能異常、糖尿病、肥満、高脂血症等の疾病に対する予防 ·改善剤として有用である。

—方、本発明のポリべプチドのタンパク質リン酸化活性を促進する化合物は C R E活性化を介した細胞生存活性を阻害し細胞死を引き起こす可能性があり、癌治療への応用が期待される。また、 S I K 1および S I K 2のキナーゼドメインの一次構造が非常に類似していることから、本発明のポリペプチドの活性を阻害する化合物または促進する化合物は同時に S I K 1の機能にも影響を及ぼすと期待される。また、その様な場合は各組織、臓器における S 1 1ぉょび3 I K 2の発現量の差により上記化合物が効率良く作用する組織、臓器を左右する。例えば、 S I K 1は痙攣誘発時に脳の海馬で異常誘導される。この様な状態で本発明のポリぺプチドの活性を阻害する化合物または促進する化合物は S I K 1により特異的に作用し、細胞生存に関わる C R E活性を調節することで脳障害等の予防に役立つものと期待される。海馬に着目した場合は同様の C R E活性調節効果でアルツハイマー病等への改善効果が期待される。

したがって、本発明のポリぺプチドの蛋白質リン酸化活性に及ぼす試験化合物の効果を検出することにより、 S I K 2キナーゼドメインの C R E活性調節活性阻害剤もしくは促進剤をスクリーニングすることができる。あるいは、 S I K 2キナーゼドメインの C R E活性調節活性阻害剤もしくは促進剤は、 C R Eの制御下にあるレポ一ター遺伝子を導入された細胞における該レポーター遺伝子の発現を指標としてもスクリーニングすることができる。

なお、 S I K 1及び S I K 2の各ドメインがリン酸化された場合の C R E調節活性について下記表 1にまとめた。

表 1

ドメイン 1 ドメイン 2 ドメイン 3 S I K 1 S I K 2 リン酸化ありありあり弱い亢進弱い亢進リン酸化ありありなし弱い抑制弱い抑制リン酸化ありなしなし強く抑制強い抑制リン酸化なしなしなし変化なし几進リン酸化なしありあり

リン酸化なしなしあり几進几進リン酸化なしありなし変化なし几進本発明のスクリーニング方法には、本発明のポリペプチドが用いられる。また、本発明のスクリーユング方法は、本発明のポリべプチドを産生する能力を有する細胞（好ましくは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換された形質転換体（例、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の細胞））を用いてもよレ、。該形質転換体は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび C R Eの制御下にあるレポーター遺伝子を含むポリヌクレオチドで形質転換されたものであることが好ましい。

本発明の第 3及び第 4の実施の形態にかかるスクリ一ユング方法は、タンパク質の自己リン酸化能を指標とするスクリーニング方法である。第 3の実施の形態にかかるスクリーニング方法は、試験化合物の存在下、自己リン酸化に適した条件下でタンパク質をリン酸化する工程、リン酸化された状態の自己リン酸化部位を認識する抗体、またはリン酸化されていない状態の自己リン酸化部位を認識する抗体と上記タンパク質を反応させる抗体結合工程、および上記タンパク質と上記抗体との反応を検出する測定工程を含むことを特徴とする。

本発明の第 4の実施の形態にかかるスクリーニング方法は、タンパク質を産生する能力を有する細胞を、上記タンパク質の発現に適した条件下で培養する工程、該細胞により産生されたタンパク質を試験化合物の存在下、自己リン酸化に適した条件下でリン酸化する工程、リン酸化された状態の自己リン酸化部位を認識する抗体またはリン酸化されていない状態の自己リン酸化部位を認識する抗体と、上記タンパク質を反応させる抗体結合工程、および上記タンパク質と上記抗体との反応を検出する測定工程を含むことを特徴とする。

また、本発明の第 5の実施の形態にかかるスクリーニング方法は、試験化合物の存在下、塩誘導性キナーゼと、塩誘導性キナーゼによってリン酸化される基質とを接触させて該基質をリン酸化させるリン酸化工程、リン酸化された状態の基質を認識する抗体、またはリン酸化されていない状態の基質を認識する抗体と、上記基質とを反応させる抗体結合工程、および上記基質と上記抗体との反応を検出する測定工程とを含むことを特徴とする。

以下、本発明のスクリーユング方法について具体的に説明する。

本発明の第 1の実施の形態にかかるスクリ一ユングである、リン酸化活性を指標とするスクリーニング方法について説明する。

本発明のポリペプチドを、二価カチオン存在下で試験化合物および [³² P ] - ATP [必要に応じて、さらに S I K 2でリン酸化される基質蛋白質もしくはペプチド（例えば、 GST - Syntide2 (Lin, et al. , Molecular Endocrinology (2001) 15, 1264 - 1276) 、 Syntide2、ヒストン脱ァセチル化酵素、 HDAC5、ヒストンァセチル化酵素、 p300等） ] と反応させ、反応液をゲル電気泳動した後、ゲル上のタンパク質の³² Pの取り込みを X線フィルムで検出することにより、タンパク質リン酸化活性（自己リン酸化活性および Zまたは他の基質タンパク質をリン酸化する活性）を測定する。試験化合物の存在により³² Pの取り込みが消失するか、非存在下に比して減少していれば、用いた試験化合物はタンパク質リン酸化阻害効果、したがって C R E活性調節活性阻害効果を有すると結論できる。反対に、 ³² Pの取り込みが試験化合物の非存在下に比して増加していれば、用いた試験化合物はタンパク質リン酸化促進効果、したがって C R E活性調節活性促進効果を有すると結論できる。また、 SDS-PAGE-X線フィルム法以外にも、ペプチドやタンパク質をトラップできる素材（例えば DES1セルロース膜、 PVDF膜）も利用でき、そこに結合している³² Pを測定してもよレ、。さらに、ぺプチドゃタンパク質にリン酸基が結合することによる総電荷の変化、分子量変化または抗原抗体反応性の変化も既に一般にタンパク質リン酸化酵素のリン酸化活性測定に利用されており、ラジオアイソトープを用いる方法以外にも S I K 2キナーゼドメインのリン酸化活性の検出に利用可能である。

次に、本発明の第 2の実施の形態にかかる、本発明のポリヌクレオチド、および C R E—レポーター遺伝子を含む発現ベクターを用いたスクリーニング方法について説明する。

上記の本発明のポリぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチドを含む発現べクタ一、および C R Eの制御下にあるレポーター遺伝子（例えば、ルシフヱラ一ゼ、ク 03 010535

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口ラムフエニコ一ルァセチルトランスフェラーゼ、 /3 -ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ペルォキシダーゼ等）を含む発現ベクターを、これらのベクターに適合した宿主細胞に導入する。なお、発現ベクターは当該技術分野において公知の方法により製造することができる。

上記宿主細胞としては、好ましくは 3T3-L1等の前駆脂肪細胞の他、 COS - 7、 COS - 1、 CH0、 Yl細胞等を使用することができるが、これらに限定されるものではない。また、 C R Eの代わりに、同様に c AM P依存的に遺伝子の転写を活性化するプロモータ一 [例えば、 CYP11A (Linら, 上述）、 c/EBP j3 (Reusch, et al. , Molecular Cellular Biology (2000) 20, 1008-1020) 等] を用いることもできる。宿主細胞への遺伝子導入法も特に制限されず、例えばリポフエクシヨン法、リン酸カルシウム法、電気パルス法、マイクロインジェクション法等が利用可能である。一定時間培養後、試験化合物の存在下で C R Eを活性化させるための試薬（例えば、 l t M デキサメタゾン， I mM ジブチリル- c AM Pおよび 1 μ g /ni L インスリンを含有する溶液等）および試験化合物を含む環境下で数時間程度刺激した後、細胞を回収し、レポ一ター遺伝子の発現量をそれぞれ自体公知の手法を用いて測定する。レポーター遺伝子の発現が上昇すれば、用いた試験化合物は S I K 2の C R E活性調節活性を阻害する効果を有すると結論できる。反対にレポーター遺伝子の発現が減少すれば、該化合物は S I K 2の C R E活性調節活性を促進する効果を有すると結論できる。また、 c AM Pの効果を検討するために、フオルスコリン処理を施したり、 P K A発現ベクターを上記の発現ベクターと共に導入することも可能である。

上述した、本発明のスクリーニング方法における試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液等があげられ、これら化合物は新規な化合物であつてもよいし、公知の化合物であってもよい。

次に、本発明の第 3の実施の形態にかかる、スクリーニング方法について説明する。

本発明の第 3の実施の形態にかかるスクリーニング方法は、試験化合物の存在下、自己リン酸化能を有するタンパク質をリン酸化させるリン酸化工程、リン酸化された状態の自己リン酸化部位を認識する抗体、またはリン酸化されていない状態の自己リン酸化部位を認識する抗体と、上記タンパク質とを反応させる抗体結合工程、および上記タンパク質と上記抗体との反応を測定する測定工程を含むことを特徴とする。

上記自己リン酸化能を有するタンパク質としては、例えば塩誘導性キナーゼ等が挙げられる。また、本発明の第 3の実施の形態にかかるスクリーニング方法においては、本発明のポリペプチドを用いることができる。以下、本発明の第 3の実施の形態にかかるスクリ一ユング方法において用いられる自己リン酸化能を有するタンパク質を、単にタンパク質等ともいう。

本発明第 3の実施の形態にかかるスクリーニング方法においては、試験化合物の存在下、タンパク質等をリン酸化させる。本発明のスクリーニング方法において用いられる試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液等があげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。

上記タンパク質等のリン酸化は、上記タンパク質のリン酸化を誘導することが可能なバッファ一中で行うことができる。該バッファ一としては、例えば、 5 0 mM T r i s— H C 1 ( p H 7 . 4 ) 、 1 mM d T T (ジチオスレィトール）、 5 mM M n C l ₂、 5 mM A T P等が挙げられる。タンパク質等をリン酸化させる条件としては、 4〜4 0 °Cの温度で 3 0秒〜 9 0分程度放置することが好ましい。また、タンパク質等のリン酸化は、上記バッファ一中に上記タンパク質等を溶解させて行つてもよいが、担体に固相化した上記タンパク質をリン酸化させてもよい。例えば、タンパク質を直接または抗体等を介して固相（例えばァガロース、デキストラン、セルロース等の不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、ガラス等）に固定化する。

また、自己リン酸化能を有するタンパク質として塩誘導性キナーゼを産生する細胞、または塩誘導性キナーゼを発現する組換えベクターを保持する宿主細胞を、本発明の宿主細胞をポリペプチド（自己リン酸化能を有するタンパク質）の発現に適 5

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した条件で培養し、得られた培養物から得られたポリペプチドを用いてもよい。この場合、塩誘導性キナーゼは、例えばデキサメタゾン等の化合物によって誘導されるので、このような化合物を細胞培養培地中に添加してもよい。

次いで、リン酸化された状態の自己リン酸化部位を認識し、自己リン酸化されていない状態のタンパク質と反応しない抗体、またはリン酸化されていない状態の上記タンパク質を認識し、自己リン酸化された状態の上記タンパク質と反応しない抗体と、上記タンパク質を反応させる。反応は 4〜4 0 °Cの温度で、 1〜2 4時間程度放置あるいは撹拌することにより行う。上記抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。該抗体は、自己リン酸化される部位に対応する配列を有する合成ペプチドを作製し、該合成ペプチドあるいはリン酸化した該合成ぺプチドを抗原として用い、従来公知の抗体の製造方法に従って製造することができる。該抗体の製造方法については、上述した本発明の抗体の製造方法と同様である。

次いで、リン酸化された上記タンパク質等と、リン酸化された状態またはリン酸化されていない状態の自己リン酸化部位を認識する抗体との反応を測定する。該タンパク質と抗体との結合を測定する方法としては、当業者に知られた抗原一抗体反応を利用した方法が挙げられる。例えば、該タンパク質に結合したリン酸化部位を認識する抗体（以下、一次抗体ともいう）に対する抗体（以下、二次抗体ともいう）を標識して用いる方法が挙げられる。標識は、酵素、蛍光物質、金属、色素等を用いて当業者に公知の方法によって行うことができる。

例えば、以下に説明する方法によって測定することができる。固相化されたタンパク質等に一次抗体を結合させ、洗浄した後、標識剤で標識された二次抗体を反応させ、洗浄した後、一次抗体を介して固相化された二次抗体を検出する。この標識二次抗体は、例えば a— D—ガラクトシダーゼ、ペルォキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースォキシダーゼ等の酵素で標識し、用いた酵素の酵素活性を利用して発色または比色させて検出を行う。ただし、必ずしも二次抗体を用いることは必要ではなく、一次抗体を標識することによって直接一次抗体の反応を測定することもできる。上述のようにしてタンパク質と抗体との結合物を測定し、試験化 2003/010535

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合物を存在させない場合と比較する。

抗体としてリン酸化された状態の自己リン酸化部位を認識する抗体を用いた測定系では、試験化合物の存在下における抗体の結合が増加した場合、自己リン酸化活性が促進され、減少した場合には、自己リン酸化活性が阻害されたことがわかる。抗体としてリン酸化されていない状態の自己リン酸化部位を認識する抗体を用いた測定系では、試験化合物の存在における抗体の結合が増加した場合、自己リン酸化活性が阻害され、減少した場合には、自己リン酸化活性が促進されたことがわかる。次に、本発明の第 4の実施の形態にかかる、スクリーニング方法について説明する。

本発明の第 4の実施の形態にかかるスクリーニング方法は、自己リン酸化能を有するタンパク質を産生する能力を有する細胞を、上記タンパク質の発現に適した条件で培養する工程、該細胞により産生されたタンパク質を試験化合物の存在下、自己リン酸化に適した条件下でリン酸化する工程、リン酸化された状態の自己リン酸化部位を認識する抗体またはリン酸化されていない状態の自己リン酸化部位を認識する抗体と上記タンパク質を反応させる抗体結合工程、および上記タンパク質と上記抗体との反応を検出する測定工程を含むことを特徴とする。

自己リン酸化能を有するタンパク質、リン酸化された状態またはリン酸化されていない状態の自己リン酸化部位を認識する抗体、タンパク質と抗体との複合体の測定方法については、第 3の実施の形態にかかるスクリーエング方法と同様である。自己リン酸化能を有するタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、前駆脂肪細胞、本発明の宿主細胞等が挙げられる。該細胞を、増殖飽和になるまで培養し、次いでタンパク質等の発現に適した条件下でタンパク質の発現を誘導する。誘導後、試験化合物を添加して更に培養した後、細胞をパラホルムアルデヒド等を含有する固定液で固定化し、上記抗体と反応させることが好ましい。

前駆脂肪細胞を使用する場合には、タンパク質の発現を誘導させる際に脂肪分化誘導作用を有する物質の存在下で培養することが好ましい。該脂肪分化誘導作用を有する物質としては、デキサメタゾン、インスリン、 c AM P、チアゾリジン誘導体等が挙げられる。脂肪分化誘導作用を有する物質は、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化を促進するため、塩誘導性キナーゼの産生を促進するので、上記細胞を培養する場合に培地に添加しておくことが好ましい。

上述のようにしてタンパク質等と抗体との反応を測定し、試験化合物を存在させない場合と比較する。

抗体としてリン酸化された状態の自己リン酸化部位を認識する抗体を用いた測定系では、試験化合物の存在下における抗体の結合が増加した場合、自己リン酸化活性が促進され、減少した場合には、自己リン酸化活性が阻害されたことがわかる。抗体としてリン酸化されていない状態の自己リン酸化部位を認識する抗体を用いた測定系では、試験化合物の存在下における抗体の結合が増加した場合、自己リン酸化活性が阻害され、減少した場合には、自己リン酸化活性が促進されたことがわかる。

次に、本発明の第 5の実施の形態にかかる、スクリーニング方法について説明する。

本発明の第 5の実施の形態にかかるスクリー-ング方法は、試験化合物の存在下、塩誘導性キナーゼと、塩誘導性キナーゼによってリン酸化される基質とを接触させて該基質をリン酸化させるリン酸化工程、リン酸化された状態の基質を認識する抗体、またはリン酸化されていない状態の基質を認識する抗体と、上記基質とを反応させる抗体結合工程、および上記基質と上記抗体との反応を検出する測定工程とを含むことを特徴とする。

上記スクリーニング方法において用いられる基質としては、例えば p 3 0 0、 H D A C 5、 GST-Syntide2 (Lin ら，上述）、 Syntide2、ヒストン脱ァセチル化酵素、ヒストンァセチル化酵素及び I R S— 1等が挙げられる。このような基質がリン酸化された状態を認識する抗体、リン酸化されていない状態を認識する抗体は、常法に従って製造することができる。

また、第 5の実施の形態にかかるスクリーニング方法においては、塩誘導性キナ一ゼを基質として用いてもよく、この場合には塩誘導性キナーゼの有する自己リン酸化活性を指標としてスクリーニングを行う。また、この場合に用いる抗体は、上述した第 3の実施の形態にかかるスクリ一ユング方法において用いられるものと同 P T/JP2003/010535

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様である。

上述のようにして基質と抗体との反応を測定し、試験化合物を存在させない場合と比較する。

抗体としてリン酸化された状態の基質を認識する抗体を用いた測定系では、試験化合物の存在下における抗体の結合が増加した場合、リン酸化活性が促進され、減少した場合には、リン酸化活性が阻害されたことがわかる。抗体としてリン酸化されていない状態の基質を認識する抗体を用いた測定系では、試験化合物の存在下における抗体の結合が增加した場合、リン酸化活性が阻害され、減少した場合には、リン酸化活性が促進されたことがわかる。

上述した、本発明のスクリーニング方法は、糖尿病、肥満、高脂血症、高血圧、動脈硬化、高尿酸血症および循環器疾患の予防 ·治療用化合物を探索するために用いられる。すなわち、本発明のスクリーニング方法によって同定された、本発明のポリべプチドの活性を促進または阻害する化合物は医薬組成物として用いられる。すなわち、本発明のポリペプチドの活性を促進する化合物は、上述した本発明の第 1の実施の形態にかかる医薬組成物と同様に用いられる。

また、本発明のポリペプチドの活性を阻害する化合物は、上述した本発明の第 2 および第 3の実施の形態にかかる医薬組成物と同様に用いられる。すなわち、糖尿病、肥満、高脂血症、高血圧、動脈硬化、高尿酸血症および循環器疾患の予防 '治療用医薬組成物として用いられる。次に、本発明のスクリーユング用キットについて説明する。

本発明の第 1の実施の形態にかかるスクリーユング用キットは、本発明のポリべプチドを含有することを特徴とし、本発明のポリぺプチドの活性を促進または阻害する化合物をスクリ一ユングするために用いられる。

本発明の第 1の実施の形態にかかるスクリーニング用キットには、本発明のポリぺプチド、または他の基質をリン酸化するためのリン酸基供与体を含有することが好ましい。また、本発明のポリペプチドによってリン酸化される基質ポリペプチドを含有してもよい。本発明の第 1の実施の形態にかかるスクリーニング用キットは、リン酸化活性を指標とする。

リン酸化活性を指標とする本発明のスクリ一二ング方法のために用いられるキットは、上記した本発明のキナーゼ活性を有するアミノ酸配列を含有するポリべプチドまたはそれと実質的に同等のポリペプチドを構成として含有する。好ましくは、該スクリーニング用キットは、本発明のポリペプチドが自身もしくは他の基質をリン酸化するためのリン酸基供与体（例えば、 [³² P ] 標識もしくは非標識 A T P等）をさらに含有する。また、必要に応じて、該スクリーニング用キットは、本発明のポリべプチドによってリン酸化され得る基質タンパク質もしくはぺプチドを構成として含むことが好ましい。このような基質タンパク質もしくはペプチドとしては、例えば、 GST-Syntide2 (Linら，上述）、 Syntide2、ヒストン脱ァセチル化酵素、 HDAC5, ヒストンァセチル化酵素、 _P300等が挙げられる。さらに、リン酸化活性の検出に必要な他の試薬や器具等を含んでいてもよい。

また、本発明の第 2の実施の形態にかかるスクリーニング用キットは、本発明の発現ベクターで形質転換された宿主細胞を含有することを特徴とし、本発明のポリぺプチドの活性を促進または阻害する化合物をスクリーニングするために用いられる。

本発明の第 2の実施の形態にかかるスクリーニング用キットには、上記宿主細胞用の培地、 c AM P応答配列を活性化するための試薬を含有することが好ましい。本発明の第 2の実施の形態にかかるスクリーニング用キットは、 C R E制御下にあるレポーター遺伝子の発現を指標とする。

本発明の第 2の実施の形態にかかるスクリーニング用キットは、本発明のキナーゼ活性を有するアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはそれと実質的に同等のポリぺプチドを産生する能力を有し、且つ C R Eもしくは代替の c AM P依存的シスエレメント [例えば、 CYP11A (Linら，上述）、 c/EBP i3 (Reuschら，上述）等； ] の制御下にあるレポーター遺伝子（以下、 C R E—レポ一ターと略記する場合もある）を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞 [好ましくは、本発明のポリべプチドをコ一ドするポリヌクレオチドおよび C R E—レポーターを共導入された形 10535

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質転換体（例えば、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の細胞） ] を含有する。本発明のポリペプチドを内因的に産生する細胞としては、ヒトまたは他の温血動物由来の脂肪細胞等が挙げられる。本発明のポリぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチド、 C R E—レポーターを担持する発現ベクターとしては、上記した通りのものが使用され得る。該ベクターの導入法も上述の方法を使用することができる。また、該スクリーニング用キットは、任意で、上記細胞用の培地、 C R Eを活性化させるための試薬（例えば、 l M デキサメタゾン， I mM ジブチリル- c AM Pおよび 1 g /m L インスリンを含有する溶液等）、内因的に c AM Pを上昇させるための試薬（例えば、フオルスコリン等）をさらに構成として含有していてもよい。

本発明の第 3の実施の形態にかかるスクリーニング用キットは、自己リン酸化能を有するタンパク質と、リン酸化された状態の自己リン酸化部位を認識する抗体またはリン酸化されていない状態の上記タンパク質の自己リン酸化部位を認識する抗体とを含有することを特徴とする。

上記自己リン酸化能を有するタンパク質としては、例えば塩誘導性キナーゼ、等が挙げられる。

リン酸化された状態の自己リン酸化部位を認識する抗体またはリン酸化されていない状態の上記タンパク質の自己リン酸化部位を認識する抗体としては、上述した本発明のスクリ一二ング方法において用いたものと同様である。

本発明の第 4の実施の形態にかかるスクリーエング用キットは、自己リン酸化能を有するタンパク質を産生する能力を有する細胞と、リン酸化された状態の上記タンパク質の自己リン酸化部位を認識する抗体またはリン酸化されていない状態の上記タンパク質の自己リン酸化部位を認識する抗体とを含有することを特徴とする。上記自己リン酸化能を有するタンパク質としては、例えば塩誘導性キナーゼ等が挙げられる。

また、リン酸化された状態の自己リン酸化部位を認識する抗体またはリン酸化されていない状態の上記タンパク質の自己リン酸化部位を認識する抗体としては、上述した本発明のスクリ一二ング方法において用いたものと同様である。

本発明のスクリ一ユング方法またはスクリ一エング用キットを用いて得られる化 PC蘭 00删 535

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合物またはその塩は、上記した試験化合物、例えば、ペプチド、タンパク質、非べプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿等から選ばれた化合物であり、例えば、本発明のキナーゼドメインのタンパク質リン酸化活性および C R E活性調節活性を阻害もしくは促進する化合物等である。具体的には、公知のタンパク質リン酸化酵素阻害剤であるジメチルスルホキシドゃスタウロスポリン等が本発明のポリべプチドの阻害剤として例示される。本発明のポリペプチドの C R E活性調節活性を阻害する化合物は、例えば、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化抑制、または脂肪細胞における糖もしくは脂質代謝機能の不全等が関与する疾患（例えば、糖尿病、肥満、髙脂血症、高血圧、動脈硬化、高尿酸血症、循環器疾患等）に対する予防 ·改善剤等として有用である。本発明のポリペプチドの C R E活性調節活性を促進する化合物は、例えば、 C R E活性化を阻害することによる細胞死を促進させ、癌に対する治療効果の改善が期待できる。さらに、該剤が S I K 1の活性へも影響及ぼす場合は脳障害の改善に利用できる。

本発明のスクリーユング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩を上述の予防 ·治療剤として使用する場合、常套手段に従って製剤化することができる。例えば、前記した本発明のポリペプチドを含有する医薬と同様にして、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性溶液、懸濁液剤等に製剤化し、経口的または非経口的に投与することができる。このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、温血動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ゥサギ、ヒッジ、プタ、ゥシ、ゥマ、トリ、ネコ、ィヌ、サル、チンパンジー等）に対して投与することができる。該化合物またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルート等により差異はあるが、例えば、糖尿病治療の目的で本発明のポリぺプチドの C R E活性調節活性を阻害する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重 6 O k gとして）においては、一日につき該化合物を約 0 . l〜 1 0 0 m g、好ましくは約 1 . 0〜 5 0 m g、より好ましくは約 1 . 0〜 2 0 m g投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の 1回投与量は投与対象、対象疾患等によっても異なるが、例えば、糖尿病治療の目的で本発 P T/JP2003/010535

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明のポリべプチドを阻害する化合物を注射剤の形で成人（60 k gとして）に投与する場合、一日につき該化合物を通常約 0. 01〜3 Omg程度、好ましくは約 0. l〜20mg程度、より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度投与するのが好都合である。他の動物の場合も、 6 0 k g当たりに換算した量を投与することができる。次に、本発明のポリペプチドの誘導を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法について説明する。本発明のポリべプチドの誘導を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法は、本発明のポリペプチドをコードする mRNA、本発明のポリペプチドの自己リン酸化活性およぴ /または他のタンパク質のリン酸化活性、または c AMP応答配列の制御下にある遺伝子の転写調節活性を指標として、本発明のポリべプチドの誘導を促進または阻害する活性を検出する工程を含むことを特徴とする。 mRNAの検出は従来公知のノーザンプロット法等により実施することができる。リン酸化活性、転写調節活性は、上述した方法により検出することができる。

本明細書および図面において、塩基やアミノ酸等を略号で表示する場合、 I UP AC— I U B Commission on Biochemical Nomenclature による略号または当該分野における慣用略号に基づくものである。本明細書において用いられる略号の例を以下に示す。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければ L体を示すものとする。

DN A：デォキシリボ核酸、 c DN A：相補的デォキシリボ核酸、 A：アデニン、 T ：チミン、 G ：グァニン、 C ：シトシン、 RNA ：リボ核酸、 mRNA：メッセンジャーリボ核酸、 d AT P ：デォキシアデノシン三リン酸、 dTTP :デォキシチミジン三リン酸、 d GT P ：デォキシグアノシン三リン酸、 d CTP :デォキシシチジン三リン酸、 AT P ：アデノシン三リン酸、 EDTA：エチレンジァミン四酢酸、 SDS ：ドデシル硫酸ナトリウム、 G 1 y ：ダリシン、 A 1 a ：ァラニン、 V a 1 ：ノ《リン、 L e u ：ロイシン、 I 1 e ：ィソロイシン、 S e r ：セリン、 T h r ：スレオニン、 C y s ：システィン、 Me t ：メチォェン、 G 1 u ：グルタミン酸、 A s p : ァスパラギン酸、 L y s ：リジン、 A r g ：アルギニン、 H i s : ヒスチジン、 P h e ：フエ二ルァラニン、 T y r ：チロシン、 T r p ：トリプトフ P 雇画画

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アン、 P r o ：プロリン、 A s n ：ァスパラギン、 G i n : グルタミン、 p G 1 u ：ピログルタミン酸

また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。

Me ：メチル基、 E t ：ェチル基、 B u ：プチル基、 P h ：フエニル基、 TC ：チアゾリジン一 4 (R) —カルボキサミド基、 T o s ： p— トルエンスルフォニル、 CHO ：ホルミル、 B z 1 ：ベンジル、 C 1₂-B z 1 ： 2 , 6—ジク口口ベンジル、 B om :ベンジルォキシメチノレ、 Z ：ベンジルォキシカルボニル、 C 1一 Z ： 2— クロ口べンジノレォキシカノレボニノレ、 B r— Z ： 2—ブロモベンジ /レオキシカノレボニル、 B o c ： t—ブトキシカルボニル、 DNP ：ジニトロフエニル、 T r t ：トリチル、 B u m： t—ブトキシメチル、 Fmo c ： N— 9一フルォレニルメトキシカノレボニル、 HOB t ： 1ーヒドロキシベンズトリァゾール、 HOOB t ： 3, 4—ジヒドロー 3—ヒドロキシー 4一ォキソ一 1， 2, 3—ベンゾトリアジン、 HONB ： 1-ヒドロキシ- 5-ノルボルネン -2， 3 -ジカルボキシイミド、 DCC ： N, N' —ジシク口へキシルカルボジィミド

実施例

以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。なお、本発明の範囲は、かかる実施例に限定されないことはいうまでもない。

ラット S I K 1 (Genbank Accession No. AB020480) およびマウス S I K 2

(Genbank Accession No. AB067780) 蛋白のアミノ酸配列を図 1 Aに示す。図 1 Aにおいて共通領域は四角で囲ってある。ラット S I K 1蛋白およびマウス S I K2の —次構造の比較から、 S I Kファミリーキナーゼは 3個以上のドメイン（以下、 3 個のドメインをそれぞれ、ドメイン 1、 .2、 3と称する）を有していることが明らかである。なお、ドメイン 1の一致率は 78 %であり、ドメイン 2の一致率は 70% であり、ドメイン 3の一致率は 7 3%であった。従って、ドメイン 1〜3を有しているタンパク質は S I Kファミリーとみなすことができ、その生理活性作用も、以下に示す実施例 3および 4の結果から相同であるといえる。 JP2003/010535

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B l a s tサーチによりヒトにはマウス S I K 2に相同であるが機能が不明のタンパク質が存在していることが示唆されている（GenBank Accession No.XM 041314) 。

図 I Bにマウス S I K2蛋白と、そのヒト相同遺伝子（以後ヒト S I K2) 由来予想タンパク質との比較を示す。マウス S I K 2とヒト S I K 2の相同性は非常に高く、ラット S I K 1、.とマウス S I K 2の相同性よりも高い。すなわち、ラット S I K1 とマウス S I K 2の比較や特異性に関しての知見は当然ヒト S I K2にも当てはまると予想される。

また、実施例 4の結果から、 S I K2は 2つのタンパク質リン酸化活性（自己リン酸化活性および G S T— S y n t i d e 2リン酸化活性）を有しており、これらは互いに相関することが判明した。 S I K 1および S I K 2は同一の酵素活性を有しており、相同なアミノ酸の置換（S I K 1 (K 56M) 、 S I K 2 (K 49 M) ) により双方とも酵素活性を消失した。すなわち、 S I K1および S I K2の相同性はその生理機能に反映されると判断される。

さらに、以下に示す実施例 7、 8において S I K 1特異的、 S I K 2特異的、ドメイン 3のリン酸化状態を認識する抗体が作製された。 S I K1および S I K 2のドメイン 3に存在するセリン（S I K 1では 577番目、 S I K 2では 58 7番目）が PKAによりリン酸化されると、キナーゼドメインの活性の有無にかかわりなく CRE抑制活性が減少する。これらの抗体を使い分けることにより S I Kの CRE 抑制活性を間接的に評価できる試薬として利用するのみならず、 S I K 1および S I K 2が原因の疾患の臨床検查試薬への応用が期待できる。 - 以下に、実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作法は、モレキュラークローニング（Molecular cloning) に記載されている方法に従った。実施例 1

ラット S I K 1と 5' 端が相同である E STクローン（I D ： 2842716、 GenBank acc:AV146436) 、および 3 ' 端が相同である E S Tクローン（ I D： IMAGE1230878, P2003/010535

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GenBank acc： AA880086) の c DNA配列を参考に、配列番号： 1 3で表わされるマウス S I K2の 5' 端プライマー、および配列番号： 14で表わされるマウス S I K2の 3 ' 端プライマーを作製した。なお、配列番号： 1 3の 5' 端から 8番目の塩基までは B a mH I リンカーである。また、配列番号： 14の 46番目の Gは元々は Tであるため B a mH Iで切断されるが、以下のクローニング作業により B a m H I切断部位は c DNAの 5 ' に存在することが好ましいため、この位置の Tを G に置換している。次いで、マウス白色脂肪細胞（S 1 c ： d d y (日本エスエルシ一） ) 由来 RNAから S I K2の蛋白翻訳領域全長 cDNAを RT— PCR法を用いて増幅した。

增幅した c DNAを p T a r g e tベクター（ P r o m e g a社製）へ付属の酵素を使用して導入し、得られた独立クローン 5種の配列を決定した（図 1 A) 。 5 種のクローンの配列は完全に一致したことから、決定した塩基配列には P CRによる変異は含まれないものと判断した。マウス S I K 2の塩基配列から予想されるァミノ酸配列を NCB Iの B 1 a s tサーチで確認したところ、既知のタンパク質のアミノ酸配列とは一致しなかった。すなわち、マウス S I K 2は新規のタンパク質であることが確認された。図 1 Aに、マウス S I K 2およびラット S I K 1の配列を示した。マウス S I K2は 93 1個のアミノ酸残基を有する、分子量約 1 20 k D aのタンパク質である。マウス S I K 2は、ラット S I K 1とは 33. 5 %の相同性を有していた。マウス S I K 2およびラット S I K 1は、類似の配列を有しており、 3つの高度に保存されたドメインを有している。ドメイン 1はセリン Zスレォニンプロテインキナーゼドメインであり、 S I K 2の N末端付近に存在し、マウス S I K 2とラット S I K1との間で 78%の相同性を有する。ドメイン 2はタンパク質の中央部に存在しており、マウス S I K2とラット S I Kとの間で 70%の相同性を有する。ドメイン 3は C末端の 3分の 1の位置に存在し、プロテインキナ —ゼ A依存性リン酸化部位を有する。実施例 2

マウス S I K 1 (mS I Kl) およびマウス S I K2 (mS I K 2) の c DNA TJP2003/010535

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をプローブ（Amercham-Bioscience社製キットを利用して³² Pで標識）としてマウスの種々の組織における m R N Aの存在をノーザン法により解析した。結果を図 2に示す。図 2は、各,袓織における S I K 1および S I K 2の mRNAの存在を調べた結果である。図 2において、 Brainは脳、 Adrenalは副腎、 Ovaryは卵巣、 Testisは精巣、 WATは白色脂肪組織、 BATは褐色脂肪組織、 Liverは肝臓、 Sk Muscleは骨格筋、 Heart は心臓、 Kidneyは腎臓、 Lungは肺、 Spleenは脾臓を用いたときの結果を示す。なお、 G3PDHはグリセロアルデヒドー 3—ホスホデヒドロゲナーゼを示す。図 2に示すように、 S I K 2は精巣においても弱く発現しているが、脂肪細胞において特異的に発現していることがわかった。また、 X線フィルムを利用した S I K2の mRNA 検出には一晚で可能であつたが、 S I K1の mRNAの検出には 1週間を有した。このことから、 S I K 2の高発現組織である脂肪細胞での S I K2の発現量は S I K 1の高発現組織である副腎での発現量の 10倍以上であると推定された。実施例 3

次に、タンパク.質リン酸化活性を欠損させた mS I K 2 (K 49 M) を、配列番号： 1 5で表わされるオリゴ DNA、および p T a r g e t—mS I K 2ベクターを铸型とし、 G e nE d i t o rMu t a g e n e s i sキット (P r ome g a社製) を利用して部位特異的変異法により作製した。作製した変異 S I K 2 c DNAは全長 S I K2の 49番目のリジンがメチォニンに置換された変異 S I K2をコードしている。

mS I K 2を培養細胞で発現.精製し、 mS I K 2の生理活性を検出する目的で、野生型および変異型 S I K 2 (K49M) をコードする c DNA断片を B a mH I と N o t I消化（No t lは p T a r g e tのクローニング部位に存在するもので mS I K 2 c DNAに由来しない）で p T a r g e tベクターから切り出し、グルタチオン S トランスフェラーゼ（GST) タグ融合発現ベクター p EBG (C e l l S i g n a l i n g社製）の B a mH I -N o t I間へ導入し、 p E B G 一 S I K 2を作製した。 P T/JP2003/010535

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実施例 4

次に、 mS I K 2が有する酵素活性を検出した。 G S Τ— mS I Κ 2または G S T-mS I K 2 (K49M) の発現には C O S— 7細胞を用いた。比較のために G ST—ラット S I K1および G ST—ラット S I K 1 (K5 6M :全長 S I K 1の 56番目のリジンがメチォニンに置換された変異 S I K 1 ： Lin, et al., Molecular Endocrinology (2001) 15, 1264-1276)を作製した。

実施例 3で得られた p EBG—S I K2 (3 μ g) を L i p o i e c t o am i n 2000試薬（1 0 /x L : I n v i t r o g e n社製）を用い、 COS— 7細胞へ導入した。導入後 2日目に C O S— 7細胞をリン酸緩衝液（ P B S ) で 2回洗浄した後、細胞溶解液（Lin，etal.，上述） 700 Lで細胞を溶解し、 Linらの方法（上述）で細胞抽出液を調製した。次に、細胞抽出液中の GST— mS I K2または GST ~mS I K 2 (K49M) タンパク質を M i c r o S p i n GST— P u r i f i c a t i o n Mo d u l e (Amersham— Biosciences社製）を利用して精製した。精製した GST— mS I K2または GST— mS I K2 (K49M) タンパク質について、抗 GST抗体（Amersham— Biosciences社製）および抗ャギ一 HRP融合 2次抗体（Rockland社製）を用いたウェスタンプロット法で量および質を確認した。得られた GST— mS I K2を 50mM トリス塩酸緩衝液（pH8. 0) , 1 0 mM Mn C 1 ₂存在下 (全量 20 μ L)で l L GST-S y n t i d e 2 (L i n ら、上述）と [³²P]— ATP (3 7 k B q ： I CN社製）と混合し、 30°Cで 1時間反応させた。反応は 1 0 μ Lの SDS—サンプルバッファーを加え 1 00°Cで 5分間加温することで停止させた。反応済みサンプルの 1 0 を 1 5%の305—？八 GEで分離した後、その SD S— PAGEゲルを乾燥させて³² Pの取り込みを X線フィルム（MS— f i 1 m： K o d a c社製）で 30分間感光させて検出した。結果を図 3に示す。図 3は、ラット S I K 1およびマウス S I K 2のタンパク質リン化酸活性を比較した結果である。図 3から明らかなように、野生型 GST— mS I K 2は自己リン酸化活性と GST— S y n t i d e 2リン酸化活性を有することが判明した。一方、 GST単独おょぴ変異型 GST— mS I K2 (K49M) にはそれらの活性は存在しなかった。比較のため G S T—ラット S I K 1および G S T—ラ TJP2003/010535

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ット S I K 1 (K 56M) を用いて同様の実験を行なったところ、同様の結果が得られた。実施例 5

S I Κ2の CRE転写抑制活性を検出する目的で、 pT a r g e t— S I K2および pT a r g e t - S I K 2 (K49 M) 各 200 n gを、 CRE制御下にルシフェラーゼ遺伝子を配置した発現ベクター（p TAL— CRE : 200 n g : C l o n t e c h社製）と共に L i p o f e c t o am i n 2000試薬 ( 2 μ L : I n v i t r o g e n社製）を用いて前駆脂肪細胞 3 T 3— L 1へ導入した。また、ラット S I K 1の知見からマウス S I K 2 ドメイン 3に存在することが予想される P KAリン酸化部位を破壊した mS I K 2 (S 58 7 A) を、配列番号： 1 6で表わされるオリゴ DNAを用いて導入した。

作製した mS I K2 (S 58 7 A) は全長 S I K 2の 58 7番目のセリンがァラニンに置換されている。導入効率の捕正のためゥミシィタケ由来のルシフェラーゼを SV40プロモーター下に発現するベクター（p RL— SV40 ： 30 n g ： P r ome g a社製）を共導入した。 1 6時間後、 C R Eを活性化させるためにフォルスコリン（5 0 μΜ) を用いて 6時間の刺激を行った後、細胞を回収し、レポ一タ一遺伝子の発現量を Dual Luciferase Assayキット（Promega社製）を利用して検討した。 ' CRE特異的活性の指標はまず、 p TAL— CRE若しくは CREが結合していないルシフェラーゼベクター（p TAL) 導入細胞のルシフェラーゼ活性をそれぞれゥミシィタケ由来ルシフェラ一ゼの活性で補正し、補正後の p T AL— CREに由来する活性を P T A Lに由来する活性で割ることで C R Eに由来する特異的活性を求めた。結果を図 4に示す。図 4は、ラット S I K 1およびマウス S I K 2の C RE抑制活性を比較した結果である。図 4から明らかなように、 S I K2の強制発現は CREの活性化を阻害することがわかった。この CRE抑制活性は、ベクターのみ導入した場合やリン酸化活性欠損 mS I K 2 (K49M) においては観察されなかった。このことから、 S I K 2が有するリン酸化活性と CRE抑制活性とは互 P2003/010535

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いに相関していることが判明した。また、リン酸化活性欠損 S I K2 (K49M) の強制発現は、ベクターのみを導入した場合（コントロール）よりもさらに CRE を活性化させた。したがって、マウス S I K 2キナーゼドメイン（ドメイン 1) のリン酸化活性欠損変異は、正常キナーゼドメインとは異なり、 CRE制御下にある遺伝子の転写促進作用を有することが示唆された。

比較のため pIRES -ラット SIK1、 pIRES-ラット SIK1(K56M) およぴラット S I K 1 ドメイン 3に存在する 5 7 7番目のセリンをァラニンに置換した pIRES - S I K 1 (S 5 77 A) を用いて同様の実験を行ない、マウス S I K 2と同様の結果を得た。図 4に結果を示した。実施例 6

COS一 7細胞で発現させ精製した G S T— mS I K 2タンパク質を、 5 %DM SOおよびスタウロスポリン（S i gma社）の 1、 1 0、 1 00 nMの各 5%D MS O溶液と実施例 3の試験管内反応系で混合した後、 SD S— P AGE法でリン酸化活性を検出することにより、マウス S I K2の酵素活性阻害を評価した。結果を図 5に示す。図 5は、スタウロスポリンによるマウス S I K2のタンパク質リン酸化活性の阻害を示す結果である。 GST— mS I K2の自己リン酸化および GS T一 S y n t i d e 2リン酸化活性は、 DM S O単独でも 3割程度阻害された。さらに、 S I K2のリン酸化活性はスタウロスポリンで濃度依存的に阻害されたが、 1 nMで残存活性 2割程度まで阻害された。 1 0 nMおよび 1 00 nM濃度においては、ほぼ 100%阻害された。実施例 7

ラット S I K1の 342番目から 776番目、マウス S I K2の 346番目から 779番目までのアミノ酸をコードする cDNA領域を T 7プロモーターの制御下に発現させるベクター（p ET 28 a ： No v a g e n社製）に導入し、 B L 21 (DE 3) 株を用いて発現させ、目的ポリペプチドを精製し、抗原とした。体重が 1. 9 k gの雌ゥサギ（系統：日本白色種）に、抗原 0. 4mgを 3回投与した。アジュバントとして Titer Max Gold 0. 5 m l /回を使用した。

抗体の検出をゥヱスタンプロットにより行った。結果を図 6に示す。図 6に示すように、ラット S I K 1およびマウス S I K 2それぞれに特異的な反応性を示す抗体が作製された。実施例 8

ラット S I K 1のドメイン 3に存在するセリン（577番目に存在するセリン）がリン酸化されたぺプチド（CQEGRRApSDTSLT： 57 1番目から 582番目のアミノ酸の N—末端にシスティンを導入、 p Sはホスホセリン）を SigmaGenosys Co.， LTD から購入し、このペプチドをキーホールリンペットへモシァニン（KLH) に結合させた KLH—ペプチド複合体を免疫原として抗体を作製した。体重が 1. 9 k g の雌ゥサギ（系統：日本白色種）に、免疫原 0. 4mgを 3回投与した。アジュパントとして Titer Max Gold 0. 5mL/回を使用した。

次いで、上述のようにして得られた、 577番目に存在するセリンがリン酸化されたペプチドをピオチンに結合させたピオチン結合ペプチドをストレブトアビジンカラムに結合させたァフィ二ティーカラムを用いて特異的抗体を精製した。

抗血清 1 0 m 1を P B Sにて 2倍に希釈した後、ァフィ二ティーカラムへ通し、結合しないタンパク質を 2 Om lの PB Sで洗い流した。結合した特異的抗体の溶出は 5 m 1の T r i s— G l y c i n e (p H 2. 0) で行い、 SDS— PAGE で抗体の溶出を検出後、 1/5量の T r i s— HC 1 (p H 9. 5) で中和して保存した。

図 7 (a) に、野生株のペプチド、 5 77番目のセリンをァラニンに置換したぺプチドと抗体との反応を調べた結果を示す。 CBBはクーマーシープリリアントプルー染色を意味し、何もない場合には反応がなく、存在する場合には反応があることを示すコントロール物質として用いられている。図 7 (a) に示すように、キヤリアプロテインの GSTは反応せず、 PKAによってリン酸化された野生株のぺプチドは反応するが、 577番目のセリンをァラニンに置換されることによってリン酸化されなくなったペプチドが反応しないことがわかる。図 7 (a) の下側の実験は、野生株のぺプチドが PK Aによるリン酸化を受けない場合には反応しないことを示す。

HAタグ付きの S I K1および S 5 77 A変異 S I K 1を CO S— 7細胞で高発現させた後、 8 B r— c AMPで 30分間処理し、細胞から H A—タグ抗体を利用して S I K 1を免疫沈降させた。次いで、抗 S I K 1抗体およぴ抗リン酸化 S e r 5 77 A抗体を用いてウェスタンプロットを行い、 S I K 1およびリン酸化 S e r 5 77を検出した。

図 7 (b) から明らかなように、本抗体はドメイン 3のリン酸化状態を検出できることが確認された。実施例 9 ,

p 300の 8 9番目のセリンをァラニンに置換（S 8 9A) することによって、 p 300が S I Kによるリン酸化を受けないかどうかを検討した。さらに、ぺプチド p 300 [84 - 93 (S 8 9A) 〕が S I Kのリン酸化活性を阻害すること力できるかどうかを検討した。 Linらの方法で S I K2の活性を測定する際、 DMSO (ジメチルスルフォキシド）の 5%溶液およびスタウロスポリンを含有する DM S 〇溶液を加えた。 S I K2は GST結合体として COS— 7細胞で発現させ、アマ一シャム · フアルマシア社の G S T— M i r o s p i nキットで精製した。

結果を図 8に示す。図 8は、 S I Kの阻害剤の検討結果を示す図である。

図 8 (a) に示すように、 p 300の 89番目のセリンがァラニンに置換されたぺプチドはリン酸化されなくなることがわかる。

図 8 (b) に示すように、 89番目のセリンがァラニンに置換された、リン酸化されない p 300ペプチドは S I Kの酵素活性を阻害することがわかる。また、左のレーンおよび中央のレーンは、 S I Kが合成基質（Syntide2) をリン酸化した結果を示す。 - 図 8 (c) は、阻害活性を有するペプチドの CRE活性への影響を調べた実験結果である。 GF PCは緑蛍光タンパクの C一末端結合型であり、ペプチドのキヤリァ一として用いており、 GF Pの C末端に目的ペプチドを結合したものであり、左はコントロールであり、右が p 3 0 0 [ 8 4 - 9 3 (S 8 9 A) 〕を結合した時の CR E活性である。黒が P KAのみで S I Kが存在しない場合の C R E活性、であり、灰色が PKAおよび S I Kが存在する場合の C R E活性である。 p 3 0 0 〔8 4 - 9 3 (S 8 9 A) 〕は、細胞内で S I Kの C R E抑制活性、すなわち、リン酸化活性を阻害していることが示された。実施例 1 0

実施例 5における前駆脂肪細胞での CREのアツセィ系に、 Tumor Necrosis Factor- α (TNF a ) 50ng/ml を加え、実施例 5と同様の実験を行った。なお、 TN F aは C R E Bを阻害することが報告されている。結果を図 9に示す。図 9 Aから明らかなように、 TNFctは S I K 2の高発現がなされていない場合でも、 P KAによる C R E の活性化を十分に抑制していた。

また、出芽酵母の Gal 4タンパク質の N末端側（Gal4 DNA binding domain: Gal4 D B) に C R E Bを導入し、 G a I 4結合配列が 5つ連続した配列を有するプロモ一ターの下流にレポーター遺伝子（ホタルルシフェラーゼ）を導入したプラスミドを利用して D Bを CREを介さずに CR E Bの転写能を検討した。 Gal4-CREB (全長）の系においては、 bZIP domainを有するため、転写が SIK2および TNF αのそれぞれで抑制された（図 9Β参照）。

また、 Gal4-CREB( - bZIP)の系では、 SIK2の作用点（bZIP) が無いため SIK2では転写の抑制が起こらなかったが、 TNFaでは抑制が起こっていることがわかった（図 9C参照）。

上記の結果から、 SIK2は bZIP ドメインを作用点にして転写活性を抑制していることが確認された。

従って、 SIK2阻害剤のスクリーユングに応用することができることが明らかとなつた。すなわち、 CREB (全長）と CREB ( - bZIP) を別々の DNA結合因子に結合させ、その下流にそれぞれの DN A結合因子に対応する配列を異なるレポーター遺伝子を導入する。例えば、 GaU- CREB (全長）に対して 5 X G a 1 4結合配列-ホタルルシフエラ一ゼ、 LexA - CREB( - bZIP)に対して 5 XLexA結合配列-ゥミシィタケルシフェラーゼという組み合わせを作製し、これらと SIK2を細胞に共導入して、検討する化合物を加え、ホタルルシフェラーゼおよぴゥミシィタケルシフェラーゼの活性の比から、化合物が SIK2を阻害するか否かを検討することができる。実施例 1 1

マウス S I K2のドメイン 3に存在することが予想される PKAリン酸化部位を破壊した mS I K 2 (S 58 7 A) を、配列番号： 1 6で表わされるオリゴ DNA、および T a r g e t— mS I K 2ベクターを铸型として、 G e nE d i t o rMu t a g e n s i sキット（ P r o m e社製）を用いて部位特異的変位法により作製した。作製した S I K2 c DN Aは全長 S I Kの 5 8 7番目のセリンがァラニンに置換された変異 S I K 2をコードしている。

mS I K 2を培養細胞で発現し、 xnS I K2の細胞内分布を調べる目的で、野生型おょぴ変異型 S I K2 (S 58 7 A) をコードする c D N A断片を B a mH I _ No t Iフラグメントを p GF PCの B a mH I一 N o t I位置にそれぞれ組み、緑色蛍光タンパク質（GF P) タグ融合発現ベクター、 p GF P— S I K2および pGF P-S I K2 (S 58 7 A) を作製した。

上述のようにして得られた p GF P— S I K2および p GF P— S I K2 (S 5 87 A) (0. 5 μ g ) を L i p o f e c t o am i n 2000試薬（ 10 μ L ： I η V i t r o g e n社製）を用い、 3 T 3— L 1細胞へ導入した。 3 T 3— L 1細胞は、 10%ゥシ胎児血清および抗生剤を含有する Dulbecco'S Modified Eagle's培地 (DMEM: Sigma Chemical, St. Louis, M0)中で 37°C、 5%- C0₂ - 95%空気雰囲気中で培養した。 1 6時間培養を行った後、細胞を分化カクテルミックス（0. 5mM 3 —メチル一 1一イソプチルキサンチン、 1 μ g / m L インシュリンおよび 1 μ M デキサメタゾン）で 1 2時間処理した後、固定し、 GF P (緑蛍光タンパク質）の発光により細胞を観察した。

比較として、分化カクテルミックスで処理せずに同様の実験を行い、また GF P 一ラット S I K 1および G F P—ラット S I K 1 (S 5 77 A) を用いて同様の実験を行った。結果を図 1 0に示す。図 1 0は、 3 T 3— L 1細胞内における、ラッ 10535

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ト S I K 1およびマウス S I Κ 2の細胞内分布を示す結果である。図 1 0において WTは G F P—ラット S Ι Κおよび G F P—マウス S Ι Κ 2を示し、 S 5 7 7 Aおよび S 5 8 7 Aは、それぞれ G F Ρ—ラット S I K ( S 5 7 7 Α) および G F P— マウス S I K 2 (S 5 8 7 A) を示す。

図 1 0に示すように、 3 Τ 3— L 1細胞内で発現された G F P— S I Κ 1は、ほとんどが核内に存在し、細胞を分化力クテルミックスで処理した場合には細胞質へ移行した。一方、 G F Ρ—マウス S I Κ 2は、核内において弱い緑色蛍光シグナルが検出されたが、静止期および分化カクテルミックスで処理した細胞のいずれにおいても、そのほとんどが細胞質に存在していた。実施例 1 2

脂肪細胞組織において S I Κ 2遺伝子が高度に発現していることがわかったので、前駆脂肪細胞一脂肪細胞分化の過程における S I Κ 2 mRN Αの量を測定した。具体的には、 3 T 3— L 1繊維芽細胞を 4日間 DMEM培地中で培養し、細胞を飽和させた。細胞が飽和した後、細胞を分化カクテルミックス（0. 5mM メチルイソブチルキサンチン、 1 μ g /m 1ィンシュリンおよび 1 デキサメタゾン）と高濃度グルコース（2. 5 g /L) を含む DMEM培地中で 2日間培養し、細胞の分化を開始した。培地を 2日毎に高グルコース含有新鮮培地と交換しながら 7日間培養した。細胞が飽和する前（G r o w t h)、飽和後（C o n f 1 u e n t ) および処理後一定時間毎に細胞を取り出し、 S I K 2および S I K 1の mRNAレべル、および他の脂肪細胞分化マーカー（Pref- 1、 c/EBPj3、 c/EBP δ、 SREBP-1, c/EBP ct、 PPARyおよび aP2) の定量を行った。これらの定量は、必要な c DNAプローブを用いたノーザンプロット分析により行った。

結果を図 1 1に示す。図 1 1は、脂肪細胞分化の過程において誘導される、各種脂肪細胞分化マーカーの mRNAの定量を行った結果を示す図である。図 1 1 ( a ) に示すように、最初の 2 4時間の培養後に、 S I K 2の mRNAが顕著に発現し、そのレベルは 7 3後に前駆脂肪細胞がほとんど成熟脂肪細胞に分化（oil Rel- 0染色による判定）するまで高く維持された。一方、 S I K 1の mRNAは、 S I K 2の niR NAと比較するとかなり濃度は低かった（図 1 1 ( a ) において、 S I K 1 と S I K 2とはフィルムの露光時間が異なっている）力;、最初の 2 4時間で濃度が上昇し、 7日目までその濃度が維持された。前駆脂肪細胞のマーカーである Pref- 1 mR NAのレベルは、 2日目から減少し始めた。脂肪分化の初期の段階で出現することが知られている転写因子である c/EBPjS、 c/EBP Sの mRNAのレベルは、 S I K 2と同様に最初の 2 4時間で上昇した。 SREBP-1、 c/EBP a , PPAR γおよび aP2は、脂肪生成の遅応答性遺伝子として知られているが、これらの rxiRNAのレベルは、 2日目または 4日目から上昇し始めた。

脂肪分化の初期の段階で出現することが知られている、 c/ΕΒΡ c/ΕΒΡ δについては、分化カクテルミックスのメチルイソプチルキサンチンに代えて、ジブチル c AMP ( I mM) を分化カクテルミックスの構成物として使用し、分化刺激後 1〜 1 2時間までの mRNAの発現を調べた。結果を図 1 1 ( b ) に示す。図 1 1 ( b ) に示すように、 c/EBP i3、 c/EBP δのいずれの mRNAも 1時間以内に上昇したが、 c/EBP δの mRNAのレベルは 2時間後には徐々に下降した。

3種のホルモン、インシュリン（Insulin)、 c AM Pおよびデキサメタゾン（D X) の混合物の中の、いずれが S I K 2遺伝子の転写を刺激しているかを調べるため、これらのホルモン単独、および 3種の混合物とともに 2時間インキュベートし、 S I K 2の mRNAのレベルを測定した。用いたホルモンの濃度は、それぞれ、インシュリンが 1 _μ g /m 1、 c AMPが 1 mM、デキサメタゾンが 1 μΜであった。測定は、それぞれの c DNAプローブを用いたノーザンブロット分析により行った。結果を図 1 1 ( c ) に示す。図 1 1 ( c ) に示すように、インシュリンおよび c A MPは単独でも S I K 2遺伝子の転写を促進したが、デキサメタゾンは単独で、 3 種のホルモンの混合物と同程度の S I K 2遺伝子の活性化を示した。実施例 1 3

上述の結果は、 S I K 2が脂肪細胞組織においてシグナル変換経路に関与していることを強く示唆しているが、そのためには S I K 2活性の細胞内檩的分子を特定する必要がある。ヒトインシュリンレセプター基質（ I R S) 1のアミノ酸配列の 5

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一部が S I Kのリン酸化モチーフと一致するので、このぺプチドが S I K 2の基質として機能し得るか否かを調べた。

ヒト IRS - 1に使用する哺乳類の発現ベクターを用意するために pEBG-hIRS- 1， Spe I および οί I 部位を 5， -および 3， -末端においてヒト IRS - 1 cDNAの部位特異的変異法により作製した。得られた完全長ヒト IRS - 1 cDNAは Spe I -および Not I - 消化により単離し、 pEBGベクターの Spe I/Not I部位中へ連結させ、ベクターを得た。変異型ヒト IRS - 1(S794A)用のベクターは、配列番号： 1 7で表されるオリゴ D NAを用いて、部位特異的変異法により作製した。

上述のようにして得られたベクターを L i p o f e c t o a m i n 2 0 0 0試薬 ( 1 0 M L : I n v i t r o g e n社製）を用い、 CO S— 7細胞へ導入した。また、実施例 3で得られた G S T— S I K 2を発現するベクターを導入し、 H ₃ ³² P O ₄によりプレインキュベートした後、 G S T—ヒト I R S— 1または G S T—ヒト I R S - 1 ( S 7 9 4 A) と G S T— S I K 2または G S T— S I K 2 (K 4 9M) とを共発現させた。 ^{3 2} P〇₄ ( 0. 0 5 mC i : 1 . 8 5MB q ) と共に 1 2時間培養を行った後、細胞溶解液（Lin, et al. , 上述） 700 Lで細胞を溶解した。 G S Tーヒト I R S— 1はグルタチオンカラム（M i c r o S p i n G S T P u ri f i c a t i o n Mo d u l e ：アマ一シャムバイオサイエンス社製）により精製し、 S D S— PAGE ( 1 0 %) を行い、オートラジオグラフィ一によりリン酸化のレベルを可視化した。結果を図 1 2の上段に示す。図 1 2は、 G S T—ヒト I R S - 1および G S T—ヒト I R S— 1 (S 7 9 4 A) のリン酸化を比較した結果である。図 1 2に示すように、 G S T—ヒト I R S— 1は、 S I K 2によって速やかにリン酸化されたが、 S I K 2 (K 4 9 M) 発現細胞中においてもわずかにリン酸化された。これは、 I R S— 1が C O S— 7細胞中で S I K 2以外のプロティンキナーゼによりリン酸化されたためである。一方、 G S T—ヒト I R S— 1 (S 7 9 4 A) は、 3 1 1：2ぉょび3 1 1：2 (K 4 9M) によってほとんどリン酸化されなかった。この結果は、ヒト I R S— 1の 7 9 4位のセリンが細胞中で S I K 2 によってリン酸化されたことを示唆する。実施例 14

C 5 7 B LK s/ J d b/d bマウス（以下、 db/db肥満'糖尿病マウスという）および C 5 7 B L/6 C rマウス（以下、野生型マウスという）から、白色脂肪細胞組織、褐色脂肪細胞組織、肝臓および骨格筋を採取し、それぞれ mRNAを抽出した。白色脂肪細胞組織および褐色脂肪細胞組織から 5 g、肝臓および骨格筋から 30 μ gの RNAをノーザンブロット分析して、 S I K2 mRNAの検出を行つた。

結果を図 1 3 (a) に示す。図中において WTは野生型マウスを意味し、 d bは db/db肥満 '糖尿病マウスを意味する。また、 WATは白色脂肪細胞組織、 BATは褐色脂肪組織、 L i v e rは肝臓、 S k Mは骨格筋を意味する。図 1 3 (a) に示すように、野生型マウスおよび db/db 肥満 '糖尿病マウスのいずれにおいても、白色脂肪細胞組織、褐色脂肪細胞組織において S I K 2 mR N Aが同レベルで検出された。これに対し、肝臓および骨格筋においては、野生型マウスおよび db/db肥満 ' 糖尿病マウスのいずれにおいても S I K 2 mRNAの濃度は非常に低かった。また、野生型マウスおよび db/db 肥満 '糖尿病マウスの間で mRNAの量に相違はなかつた。比較として、 S I K 1 mRNAの量を検出した。 S I K 1 m R N Aの量は、褐色脂肪細胞組織、肝臓おょぴ骨格筋において db/db肥満 '糖尿病マウスにおいては野生型マウスよりも上昇していた。実施例 1 5

実施例 14で得られた、白色脂肪細胞組織およぴ褐色脂肪細胞組織から 3 m _g、肝臓および骨格筋から 18 mgのタンパク質を含有するホモジネートから免疫沈降法によりタンパク質を精製し、ウェスタンプロット分析により S I K2の検出を行つた。ウェスタンプロット分析は、 S D S— P AGE後、抗 S I K 2抗体を用いて行った。結果を図 1 3 (b) に示す。図 1 3 (b) に示すように、 db/db肥満 ·糖尿病マウスの白色脂肪細胞組織における S I K 2タンパクの量は野生型マウスに比べて高いことがわかる。一方、褐色脂肪細胞組織においては、 db/db肥満 '糖尿病マウスの方が量は少なかった。肝臓および骨格筋においては、 S I K2の量が少ないの 10535

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で、 db/db肥満 ·糖尿病マウスと野生型マウスとの間でほとんど差が認められなかつた。実施例 1 6

次いで、実施例 14および 1 5で用いた組織から免疫精製した S I K 2について、 GST-S y n t i d e 2を基質として用いて in vitroにおけるキナーゼ活性のアツセィを行った。結果を図 1 3 (c) に示す。図 1 3 (c) に示すように、 db/db肥満 ' 糖尿病マウスの白色脂肪細胞組織の S I K 2活性は野生型マウスよりも高いことがわかる。一方、褐色脂肪細胞組織においては、 S I K 2活性は野生型マウス、 db/db 肥満 .糖尿病マウス共に低かったが、野生型マウスの方が db/db肥満 '糖尿病マウスよりも高かった。この結果は、図 1 3 (b) の結果から明らかなように、 S I K 2タンパク質の含有量の相違に一致していることを示唆する。肝臓ホモジネートは、 S I K 2活性を有していたが、 db/db肥満 ·糖尿病マウスの方が野生型マウスよりもわずかに高い活性であった。骨格筋では、認識できる S I K 2活性を示さなかった。これらの結果は、 S I K2タンパク質が、その活性と同様に糖尿病マウスの白色脂肪細胞組織において上昇していることを示す。実施例 1 7

実施例 8で示したように、ラット S I K 1の 577番目に存在するセリンがリン酸化されることがわかった。また、 c AMP— PKA系が亢進していない状態の C OS— 7細胞（8 B r— c AMP未処理）でも、 5 77番目のセリンはかなりリン酸化されていることがわかった。また、 577番目のセリンがリン酸化されると、 S I K 1が核外移行する現象から判断すると、 577番目のセリンは未処理細胞内でも PKA以外のリン酸化酵素によってリン酸化されることが予想される。例えば、 PKA活性がほとんど検出されない Y 1変異株内でも、未処理細胞内の S I Kの核外移行が観察されている。また、 5 7 5位のアルギニンをァラニンに変異した変異体は PKAでリン酸化されないにもかかわらず、核外移行が亢進することが報告されてレヽる (Takemori, H, et al. , Journal of Biological Chemistry 277(44) 42334-42343 (2002) )₀ 上述したことから、 S I Kの 5 77番目のセリンは P K A以外によつてもリン酸化され、リン酸化された S I Kが核外移行を行うことがわかる。そこで、 S I K 1自身が 5 77番目のセリンをリン酸化するか否かを検討した。実施例 4で得られた G S T—ラット S I K 1を用い、実施例 4と同様に実験を行つた。基質としては、野生型ラッ 'ト S I K 1、 577番目のセリンがァラニンに置換された変異体（S 5 7 7 A)、 574番目のアルギニンがァラニンに置換された変異体（R 5 74 A；)、 575番目のアルギニンがァラニンに置換された変異体（R 57 5 A), 及び 5 74番目及び 575番目のアルギニンがァラニンに置換された変異体 (R 5 74/5 75 A) を用いた。

変異体の作製は、 Takemori, H, et al. , Journal of Biological Chemistry 277(44) 42334-42343 (2002)) に記載した方法に従って実施した。

結果を図 14 Aに示す。図 14 Aに示すように、野生型 S I K 1はリン酸化されたが、 S 577A、 R 574A、 R 574 Z 575 Aはリン酸化されなかった。これに対し、 R 5 75 Aは野生型よりも遙かに効率よくリン酸化された。本実施例の反応は S I Kペプチドを基質とした分子間反応であるが、 S I K 1の 577番目のセリンは S I K 1の分子内に存在しているので、その基質濃度は試験管內に比べ遙かに高く、 5 7 7番目のセリンは S I K 1のドメイン 1によって効率良くリン酸化されると予想される。実施例 1 8

次に、リン酸化された G S T— S I K 1及びリン酸化された G S T— S I K 2を基質として用い、抗体として実施例 8で得られたものを用いてウェスタンプロット分析を行った。結果を図 14Bに示す。図 14Bに示すように、実施例 8で得られた抗体は、 S I K1の 577番目のセリン、及ぴ S I K2の 587番目のセリンの自己リン酸化状態を認識することがわかった。なお、 S I K 1の 577番目の近傍の配列はマウス、ラット及びヒトで保存されている。実施例 1 9 10535

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上述したように、 S I K 1の 57 7番目のセリンがリン酸化部位であることが判明したが、 S I K 1のドメイン 1及ぴドメイン 2の一部だけでも自己リン酸化活性があることがわかっている（X. Lin, et al. , Molecular Endocrinology 15(8), 1264-1276(2001))。すなわち、 577番目のセリン以外にも自己リン酸化部位が存在している。そこで、どのアミノ酸がリン酸化されているかを、 GST—ラット S I K 1 ( 1— 343アミノ酸）及ぴ G S T—ヒト S I K 2 (3— 348アミノ酸） (GenBank EMBL/DDBJ Accession No. BAB91442)を³² P— AT P存在下で反応させて自己リン酸化させた。次いで、 6N塩酸で S I Kポリペプチドを加水分解し、個々のアミノ酸に分解し、薄層クロマトグラフィーにて分離した。結果は示さないが、自己リン酸化されているアミノ酸は、 S I K 1及び S I K 2共にセリンであった。 S I K 1及び S I K 2の領域で共通のセリンは 4つあり、 S I K 1で示すと、 1 3 5 番目、 1 86番目、 209番目及び 248番目のセリンである。 4つのセリンを、それぞれ個々にァラニンに置換し、それら変異体 S I K 1のタンパク質リン酸化活性及び自己リン酸化活性の比を測定した。結果を示さないが、 1 86番目のセリンをァラニンに置換した場合に、タンパク質リン酸化及び自己リン酸化活性が消失した。この結果より、 1 86番目のセリンが自己リン酸化部位であることが判明した。また、 S I K 1の 1 8 2番目のスレオニンをァラニンに置換し、同様に活性を測定した。その結果、 S I K 1のリン酸化活性が非常に低くなつた。この結果より、 S I K 1においては 1 82番目のスレオニンが細胞内でリン酸化されており、 S I K 1の酵素活性に必要であることがわかった。

次いで、 S I K 1の 1 8 2番目のスレオニン及び 1 8 6番目のセリンの二重リン酸化を認識する抗体を以下のようにして作製した。

合成ぺプチド GEP L S p TWCGp S P PYAA (p T : リン酸化スレオニン、 p S ：リン酸化セリン）を Sigma Genosys Co., LTDから購入し、これを KLHに結合させ、抗原として利用した。抗体の作製法は、実施例 8と同様である。

得られた抗体を用いて、実施例 4で用いた GST— S I 1及び03丁—3 I K 2を基質として用い、ウェスタンプロット分析を行った。結果を図 1 5に示す。図 1 5に示すように、得られた抗体は S I K 1とは良く反応するが、 S I K 2とはわずかに反応した。実施例 20

3丁 3—し 1細胞を、 96穴プレートにまき、細胞が増殖飽和になるまで培養した。なお、プレート内に入れた培地は DMEMZ 1 0 % F C Sであり、培養は 3 7 °C で 5%C0₂で行った。次いで、デキサメタゾンを濃度 1〃Mとなるように各プレートに加え、 S I Κを誘導した。誘導して 1時間経過した後、 S I Kの阻害剤であるスタウロスポリンを、 1 0、 100及び 1 Ο Ο Ο ηΜとなるようにプレートに加え、更に 1時間培養を行った。なお、 0は溶媒のみを加えた。次いで、細胞を PB Sに 4%パラホルムアルデヒドを加えて室温で 1 5分間放置して固定した。次いで、 Ρ B Sで 4回洗浄した後、 TB ST (0. 1 %の Tween20を含有する TBS) に 1%スキムミルクを溶解させたブロッキング溶液で細胞を反応させた。次いで、同じブロッキング溶液に、 577番目のセリンがリン酸化された S I K 1に対する抗体、 1 8 2番目のスレオニン及び 1 86番目のセリンがリン酸化された S I K 1に対する抗体、抗 S I K1抗体、 577番目のセリンがリン酸化されていない S I K 1に対する抗体を含む抗血清（500倍希釈）を Ι Ο Ο ί 1加え、一晚反応させた。一晚反応させた後、未反応抗体を P B Sで 4回洗浄して除去し、丁83に1%スキムミルクを溶解させた反応液に HR Ρ標識抗ゥサギ I g G二次抗体を 1 000倍に希釈した溶液を加え、室温で 2時間反応させた。次いで、 PB Sで 4回洗浄した後、コニカイムノスティン HRP試薬（コニ力社製）を利用して抗原抗体反応を可視化した。結果を図 1 6に示す。図 1 6に示すように、抗リン酸化 Ser577抗体、及ぴ抗リン酸化 Thrl82 - Serl86抗体と S I Kとの反応性は、スタウロスポリン 1 0 nMで有意に低下した。これに対し、抗 S I K 1抗体との反応はスタウロスポリンの添加によつて極端には変化しなかった。更に、 577番目のセリンがリン酸化されていない S I K1に対する抗体は、スタウロスポリン濃度に依存して反応性が高まった。

上記の結果より、上記の系を利用することにより、 S I Kの活性を促進または阻害する物質をスクリ一ユングすることが可能であることがわかる。実施例 2 1

ヒト SIK2の 170番目のグリシンから 184番目のァラニンまでの 15アミノ酸の 175 番目のスレオニンと 179 番目のセリンがリン酸化されたペプチド、 GELLApTWCGpSPPYAA (pT；リン酸化スレオニン、 pS；リン酸化セリン）、を合成した。スレオニン及びセリンは予めリン酸化したものを用いた。このペプチドを KLH に結合させた KLH-ペプチド複合体を免疫原として作成し、雌ゥサギ（日本白色種）に初回 0.4m_gを皮下注射し、その後 2週間毎に 0.2mgを 3回皮下注射した。最終免疫の 10 日後に抗血清を採取した。 175番目のスレオニンと 179番目のセリンがリン酸化されたぺプチドをセファロース榭脂に共有結合させたァフィ二ティーカラムを PBS で平衡化した後、採取した抗血清を流した。 PBS でカラムを洗浄後、 0.1M グリシン塩酸緩衝液（PH2.7) で溶出される分画を 1M トリス塩酸緩衝液（pH9.2) で直ちに中和、分取した。この分画を PBSに対し透析し特異抗体を得た。ゥサギ 1羽に対し約 0.5mgの特異抗体が得られた。実施例 22

S I K 2の CRE転写抑制活性を検出する目的で、 S I K 2をコ一ドする遺伝子を E c R 2 9 3細胞へ導入した。

p I NDベクター 5 μ 1、 10 ΧΗバッファー（東洋紡（株）製、組成： 5 00 mM T r i s— HC 1 (p H 7. 5) 、 1 00 mM M g C 1 ₂、 10 mM D T T、 1 00 OmM N a C 1 ) 5 μ 1、 B a mH I 2 1に、蒸留水を加えて全量を 50 1 とし、混和した後、 37°Cの温度で 1. 5時間、制限酵素処理を行つた。

また、別に、上記 p i NDベクターを、実施例 3で得られた p EBG— S I K2 に代えて同様の操作を行った。

上記制限酵素処理を行った後、反応系を、フエノールノクロ口ホルム処理し、ェタノ一ル沈殿を行った。エタノール沈殿物に、 1 0 XHバッファー 2 1、 N o t I 1 μ 1を加え、蒸留水を加えて全量を 20 μ 1 とし、混和した後、 37°Cの温度で 1. 5時間、制限酵素処理を行った。反応終了後、 DNAを 1%LMPァガロースで電気泳動（1 00V、 30分）を行った。泳動後、目的のパンドをメスで切り出し、切り出したゲルバンドをゲルバンド切り出し回収キットを用いて精製した。精製した DNA断片（p I NDベクタ一及び p EBG— S I K2) を含む溶液各 2 μ 1、 DNAリガーゼ 1 μ 1 を試験管に入れ、蒸留水を加えて全量を 20 1 とし、ライゲ一シヨン反応を行った。ライゲーシヨン反応は、 1 6°Cの温度で 3時間行った。ライゲーシヨン反応終了後、 JM109 コンビテントセル 15 1 にトランスフォーメーションを行い、 LB— amp培地上に塗布し、 37°Cで、 16時間培養した。得られたコロエーを、液体培地（LB— amp) 3m 1 にて 37 °Cで 1 6 時間培養した後、プラスミド（p I ND—S I K2) の回収を行った。得られたプラスミドを、再度 BamHI Notl で制限酵素処理した後、電気泳動確認を行った。

Ecr 293細胞に pVgRXRプラスミドをトランスフエクシヨンした後、プラスミドが導入された細胞をゼォシンで選択した。生き残った EcR293 細胞を 4種類の濃度で 60cm シャーレで培養し（3 7°C、 1〜2 S)、細胞の状態が 50 %コンフレントになっている細胞を選び、 opti- MEM 2ml で細胞を 2回洗浄した後、トランスフエクシヨンを行った。

トランスフエクシヨンする DNAは、 p I ND— S I K 2 0.5 g pTAL-CRE 1.5μ gを 200 xl の 1 0 % F C S含有 DMEM溶液に加えて、さらにリポフエクタミン 2000 試薬を 6μ 1 加え混和後、 1 5分間、室温でインキュベートしたものを用いた。トランスフエクシヨン反応は、上記の処理後の細胞に対して、上記処理後の DNA 溶液を加えて、 37°Cで 3時間反応させた。反応終了後、培地を 1 0%FC S含有 DMEM溶液 4 ml に代えて、 37°Cで 1 6時間培養した。

細胞を培養している培地を DMEM + 10%FCS+ Geneticin (500 μ g/ μ 1 ) に代え、 2日間の間隔で培地交換をしながら約 1週間細胞培養を行った。細胞が程良く死亡したところで、 24穴プレートに細胞を 1 つずつチップで吸い上げて移した。さらに培養を行い、程良く細胞が増えたところでレポーターアツセィを行い安定化株を採取した。採取した細胞を、上記記載の方法で再度セレクションをかけた後、安定化株を採取した。 2度のスクリーニングを行い採取した細胞を大量に増殖し、 S I Κ 2の C R Ε転写抑制活性を検出する細胞を得た。 96穴プレートの各ゥエルに、 10 %FCS含有 DMEM培地（ 0. 2m l ) を入れ、それぞれのゥヱルに、上述のようにして得られた細胞を入れ、 3 7°Cで 5 %C0₂環境下で細胞が繁殖飽和になるまで培養する。次いで、ボナステロン A (Invitorgen社製、 4. 3 μΜ) 、フオルスコリン（40 /iM) 及ぴ試験化合物を各ゥヱルに加え、 6時間の刺激を行った。 6時間の刺激終了後、細胞を回収し、ルシフェラーゼ活性を Dual Luciferase Assayキット（Promega社）を用いて測定し、試験化合物の S I K 2阻害活性を調べる。本発明は脂肪組織に特異的に発現している S I K2、 S Ι Κ2に特異的な抗体、および S I Κ2のリン酸化状態を認識する抗体を提供することにより、 S I K2の生理活性を制御あるいは促進する化合物の同定や C R Ε抑制活性を評価するための試薬を提案することができる。また、 S I K2のァゴニスト、アンタゴニストのスクリーユングにより S I Κ 2の作用を抑制または亢進する組成物を提供することができる。さらに、脂肪細胞の分化や脂肪細胞における糖および脂質代謝の異常が関与する疾患、特に糖尿病や高脂血症、高血圧、動脈硬化等代謝異常が原因の疾患、および肥満そのものの予防 ·改善薬としての応用が期待できる。

さらに、本発明のポリべプチドのタンパク質リン酸化活性を促進する化合物は C R Ε活性化を介した細胞生存活性を阻害し細胞死を引き起こさせる可能性があり、癌への応用が期待される。 S I Κ機能阻害剤もしくは促進剤は S Ι Κにより特異的に作用するような状態では、細胞生存に関わる CRE活性を調節することで脳障害等の予防に役立つものと期待され、アルツハイマー病等への改善効果が期待される。

Claims

請求の範囲

1. 以下の（A) 〜（L) のいずれか 1のポリペプチドと少なくとも 90%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリぺプチドまたはその塩。

(A) 配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号： 1で表わされる塩基配列にハイプリダイズ可能な c DNAによってコードされるアミノ酸配列よりなるポリべプチド；

(B) 配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有し、かつ c AMP応答配列の制御下にある遺伝子の転写調節活性を有するポリペプチド、または配列番号： 1で表わされる塩基配列にハイブリダィズ可能な c DNAによってコードされるアミノ酸配列よりなり、かつ c AMP応答配列の制御下の遺伝子の転写調節活性を有するポリぺプチド；

(C) 配列番号： 4で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号： 3で表わされる塩基配列にハイプリダイズ可能な c D N Aによってコードされるアミノ酸配列よりなるポリべプチド；

(D) 配列番号： 4で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有し、かつ c AMP応答配列の制御下の遺伝子の転写調節活性を有するポリペプチド、または配列番号： 3で表わされる塩基配列にハイプリダイズ可能な c DNAによってコードされるアミノ酸配列よりなり、かつ c AMP応答配列の制御下の遺伝子の転写調節活性を有するポリべプチド；

(E) 配列番号 6 ：で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号： 5で表わされる塩基配列にハイプリダイズ可能な c DNAによってコードされるアミノ酸配列よりなるポリぺプチド

(F) 配列番号： 6で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を有し、かつ c AMP応答配列の制御下の遺伝子の転写調節活性を有するポリペプチド、または配列番号： 5で表わされる塩基配列にハイプリダイズ可能な c DNAによってコードされるアミノ酸配列よりなり、かつ c AMP応答配列の制御下の'遺伝子の転写調節活性を有するポリべプチド；

(G) 配列番号： 8で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号： 7で表わされる塩基配列にハイプリダイズ可能な c DNAによってコードされるアミノ酸配列よりなるポリぺプチド；

(H) 配列番号： 8で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を有し、かつ c AM P応答配列の制御下にある遺伝子の転写調節活性を有するポリペプチド、または配列番号： 7で表わされる塩基配列にハイプリダイズ可能な c DNAによってコードされるアミノ酸配列よりなり、かつ c AMP応答配列の制御下の遺伝子の転写調節活性を有するポリぺプチド；

(I ) 配列番号： 10で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号： 9で表わされる塩基配列にハイブリダィズ可能な c DNAによってコードされるアミノ酸配列よりなるポリぺプチド；

( J) 配列番号： 10で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有し、かつ c AMP応答配列の制御下にある遺伝子の転写調節活性を有するポリペプチド、または配列番号： 9で表わされる塩基配列にハイプリダイズ可能な c DNAによってコードされるアミノ酸配列よりなり、かつ c AMP応答配列の制御下の遺伝子の転'写調節活性を有するポリぺプチド； (K) 配列番号： 1 2で表されるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号： 1 1で表される塩基配列にハイプリダイズ可能な c DNAによってコ一ドされるアミノ酸配列よりなるポリペプチド；

( L ) 配列番号： 1 2で表されるァミノ酸配列よりなるポリぺプチドと同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を有し、かつ c AMP応答配列の制御下にある遺伝子の転写調節活性を有するポリペプチド、または配列番号： 1 1で表される塩基配列にハイプリダイズ可能な cDNAによってコードされるアミノ酸配列よりなり、かつ c AMP応答配列の制御下の遺伝子の転写調節活性を有するポリぺプチド。

2. 温血動物細胞から分離、精製して得られたものである、請求項 1に記載のポリぺプチドまたはその塩。

3. 上記動物細胞がマウス由来のものである、請求項 2に記載のポリペプチドまたはその塩。

4. 以下の（a) 〜（m) のいずれか 1のポリヌクレオチドと少なくとも 95%以上の相同性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド。

(a) 配列番号： 1で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号： 1で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイプリダイズ可能な c DNAであるポリヌクレオチド；

(b) 配列番号： 3で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号： 3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能な c DNAであるポリヌクレオチド；

(c) 配列番号： 5で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号： 5で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイプリダイズ可能な c DNAであるポリヌクレオチド；

(d) 配列番号： 7で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号： 7で表わされる塩墓配列からなるポリヌクレオチドにハイプリダイズ可能な c DNAであるポリヌクレオチド；

(e ) 配列番号： 9で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号： 9で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダィズ可能な c DN Aであるポリヌクレオチド；

( f ) 配列番号： 11で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号： 11で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイプリダイズ可能な cD NAであるポリヌクレオチド；

(g) 配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリべプチドをコ一ドする塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリべプチドをコ一ドする塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能な c D N Aであるポリヌクレオチド；

( h ) 配列番号： 4で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号： 4で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリべプチドをコ一ドする塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイプリダイズ可能な c D N Aであるポリヌクレオチド；

( i ) 配列番号： 6で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリべプチドをコ一ドする塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号： 6で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリべプチドをコ一ドする塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイプリダイズ可能な c D N Aであるポリヌクレオチド；

( j ) 配列番号： 8で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ一ドする塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号： 8で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ一ドする塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイプリダイズ可能な c D N Aであるポリヌクレオチド；

( k ) 配列番号： 1 0で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号： 1 0で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリべプチドをコ一ドする塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイプリダイズ可能な c D N Aであるポリヌクレオチド；

( 1 ) 配列番号： 1 2で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリぺプチドをコ一ドする塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号： 1 2で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能な c D N Aであるポリヌクレオチド； (m) ( a ) - ( 1 ) のいずれか 1のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし得るポリヌクレオチド。

5 . 請求項 4に記載のポリヌクレオチドを含有する組換ベクター。

6 . 請求項 4に記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。

7 . 請求項 6に記載の発現べクタ一を保持する宿主細胞。

8 . 請求項 7に記載の宿主細胞をポリぺプチドの発現に適した条件下で培養し、得られた培養物からポリぺプチドを回収することを含む、請求項 1に記載のポリぺプチドまたはその塩の製造方法。

9 . 上記宿主細胞の培養を、脂肪分化誘導作用を有する物質の存在下で行う、請求項 8に記載のポリべプチドまたはその塩の製造方法。

1 0 . 前駆脂肪細胞を、脂肪分化誘導作用を有する物質の存在下で培養し、得られた培養物から、請求項 1に記載のポリべプチドまたはその塩を回収することを含む、請求項 1に記載のポリべプチドまたはその塩の製造方法。

1 1 . 請求項 8〜 1 0のいずれか 1項に記載のポリべプチドまたはその塩の製造方法によつて製造されたポリぺプチドまたはその塩。

1 2 . 請求項 4に記載のポリヌクレオチド、または請求項 1に記載のポリべプチドをコ一ドしているポリヌクレオチドの検出に有用な核酸プローブ。

1 3 . 請求項 1に記載のポリペプチドに対して親和性を有する抗体、または該抗体のフラグメント。

1 4 . 請求項 1に記載のポリペプチドに対して親和性を有する抗体を産生するハィプリドーマ。

1 5 . 請求項 1に記載のポリペプチド、または請求項 5に記載の組換ベクターを含有する医薬組成物。

1 6 . 更に、脂肪分化誘導作用を有する物質を含有する、請求項 1 5に記載の医薬組成物。

1 7 . 脂肪細胞の分化、または糖または脂質の代謝機能亢進が関与する疾患の予防または改善剤として用いられる、請求項 1 5または 1 6に記載の医薬組成物。

1 8 . 上記疾患が、糖尿病、肥満、髙脂血症、高血圧、動脈硬化、高尿酸血症または循環器疾患である、請求項 1 5または 1 6に記載の医薬組成物。

1 9 . 請求項 4に記載のポリヌクレオチドを含有する遺伝子診断用組成物。

2 0 . 塩誘導性キナーゼ 2をコードする D N Aまたは m R N Aの発現を検出する、請求項 1 9に記載の遺伝子診断用組成物。

2 1 . 脂肪細胞の分化、または糖または脂質の代謝機能不全が関与する疾患の診断に用いられる、請求項 1 9に記載の遺伝子診断用組成物。

2 2 . 上記疾患が、糖尿病、肥満、高脂血症、高血圧、動脈硬化、高尿酸血症または循環器疾患である、請求項 2 1に記載の遺伝子診断用組成物。

2 3 . 請求項 1 3に記載の抗体、該抗体のフラグメント、または請求項 4に記載のポリヌクレオチドに相補的に結合するアンチセンスヌクレオチドを含有する医薬組成物。

2 4 . 脂肪細胞の分化、または糖または脂質の代謝が関与する疾病の予防または改善剤として用いられる、請求項 2 3に記載の医薬組成物。

2 5 . 上記疾患が、糖尿病、肥満、高脂血症、高血圧、動脈硬化、高尿酸血症または循環器疾患である、請求項 2 3に記載の医薬組成物。

2 6 . 脂肪細胞の分化抑制または脂肪細胞の代謝機能不全が関与する疾患の診断に用いられる、請求項 2 3に記載の医薬組成物。

2 7 . 上記疾患が、糖尿病、肥満、高脂血症、高血圧、動脈硬化、高尿酸血症または循環器疾患である、請求項 2 3に記載の医薬組成物。

2 8 . 塩誘導性キナーゼ 2の発現が低下することによって生じる疾患または生理状態の予防または改善方法であって、

請求項 1 5または 1 6に記載の医薬組成物を投与することを含むことを特徴とする、疾患または生理状態の予防または改善方法。

2 9 . 上記疾患または生理状態が、糖代謝異常、脂質代謝異常または脳神経障害である、請求項 2 8に記載の疾患または生理状態の予防または改善方法。

3 0 . 塩誘導性キナーゼ 2の発現が亢進することによって生じる疾患または生理状態の予防または改善方法であって、

請求項 2 3に記載の医薬組成物を投与することを含むことを特徴とする、疾患または生理状態の予防または改善方法。

3 1 . 上記疾患または生理状態が、糖代謝異常、脂質代謝異常または脳神経障害である、請求項 3 0に記載の疾患または生理状態の予防または改善方法。

3 2 . 請求項 1に記載のポリペプチドを含有する検体を試験化合物と接触させ、請求項 1に記載のポリべプチドの活性を促進または阻害する活性を検出する工程を含むことを特徴とする、請求項 1に記載のポリべプチドの活性を促進または阻害する化合物のスクリ一ユング方法。

3 3 . 請求項 1に記載のポリペプチドの自己リン酸化活性および/または他のタンパク質のリン酸化活性を指標として、請求項 1に記載のポリべプチドの活性の促進または阻害活性を検出する、請求項 3 2に記載のスクリーニング方法。

3 4 . 請求項 4に記載のポリヌクレオチド、および c AM P応答配列の制御下にあるレポーター遺伝子を含む発現ベクターを試験化合物と接触させ、請求項 1に記載のポリぺプチドの活性を促進または阻害する活性を検出する工程を含むことを特徴とする、請求項 1に記載のポリべプチドの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法。

3 5 . 請求項 1に記載のポリペプチドを試験化合物と接触させ、該試験化合物と該ポリべプチドとの結合を検出し、上記ポリべプチドに対して特異的に結合する化合物を同定する工程を含むことを特徴とする、請求項 1に記載のポリペプチドに特異的に結合する化合物のスクリ一ユング方法。

3 6 . 請求項 1に記載のポリペプチドが活性を示す条件下で該ポリペプチドと試験化合物とを接触させ、上記試験化合物の存在下における該ポリべプチドの活性を評価し、上記試験化合物の非存在下における該ポリペプチドの活性と比較し、その比較結果により上記試験化合物の上記ポリべプチドの活性調節能を同定する工程を含むことを特徴とする、請求項 1に記載のポリべプチドに対する活性調節能を有する化合物のスクリーニング方法。

3 7 . 請求項 4に記載のポリヌクレオチドを含む標的ポリヌクレオチド検体を該標的ポリヌクレオチドの発現に適した条件下で試験化合物と接触させ、上記標的ヌクレオチドの発現の変化を検出し、上記試験化合物の非存在下および種々の量の存在下における上記標的ポリヌクレオチドの発現を比較する工程を含むことを特徴とする、請求項 4に記載のポリヌクレオチドの発現に影響を与える化合物のスクリーユング方法。

3 8 . 脂肪分化誘導作用を有する物質の存在下で行う、請求項 3 2 ~ 3 7のいずれか 1項に記載のスクリーニング方法。

3 9 . 試験化合物の存在下、自己リン酸化能を有するタンパク質をリン酸化させるリン酸化工程、

上記タンパク質のリン酸化された状態の自己リン酸化部位を認識する抗体、またはリン酸化されていない状態の自己リン酸化部位を認識する抗体と、上記タンパク質とを反応させる抗体結合工程、および

上記タンパク質と上記抗体との反応を測定する測定工程を含むことを特徴とする、自己リン酸化能を有するタンパク質の活性を促進または阻害する化合物のスクリーユング方法。

4 0 . 試験化合物の存在下、塩誘導性キナーゼをリン酸化させるリン酸化工程、上記塩誘導性キナーゼのリン酸化された状態の自己リン酸化部位を認識する抗体、またはリン酸化されていない状態の自己リン酸化部位を認識する抗体と、上記塩誘導性キナーゼとを反応させる抗体結合工程、および

上記塩誘導性キナーゼと上記抗体との反応を測定する測定工程を含むことを特徴とする、塩誘導性キナーゼの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法。

4 1 . 試験化合物の存在下、請求項 1に記載のぺプチドをリン酸化させるリン酸化工程、

上記ポリペプチドのリン酸化された状態の自己リン酸化部位を認識する抗体、またはリン酸化されていない状態の自己リン酸化部位を認識する抗体と、上記ポリべプチドとを反応させる抗体結合工程、および

上記ポリべプチドと上記抗体との反応を検出する測定工程とを含むことを特徴とする、上記ポリべプチドの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法。

4 2 . 自己リン酸化能を有するタンパク質として、自己リン酸化能を有するタンパク質を産生する能力を有する細胞、または該自己リン酸化能を有するタンパク質の発現ベクターで形質転換された宿主細胞をタンパク質の発現に適した条件で培養し、得られた培養物から得られたポリペプチドを用いる、請求項 3 9に記載のスクリーニング方法。

4 3 . 塩誘導性キナーゼとして、塩誘導性キナーゼを産生する能力を有する細胞、または請求項 6に記載の発現べクタ一で形質転換された宿主細胞をポリペプチドの発現に適した条件で培養し、得られた培養物から得られたポリべプチドを用いる、請求項 4 0に記載のスクリ一ユング方法。

4 4 . 上記ポリペプチドまたはその塩として、請求項 6に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞をポリペプチドの発現に適した条件で培養し、得られた培養物から得られたポリぺプチドを用いる、請求項 4 1に記載のスクリーニング方法。

4 5 . 脂肪分化誘導作用を有する物質の存在下で行う、請求項 3 9〜4 4のいずれか 1項に記載のスクリ一ユング方法。

4 6 . 試験化合物の存在下、自己リン酸化能を有するタンパク質を産生する能力を有する細胞を、上記タンパク質の発現に適した条件で培養する工程、

該細胞を、上記タンパク質のリン酸化された状態の自己リン酸化部位を認識する抗体、またはリン酸化されていない状態の自己リン酸化部位を認識する抗体と接触させ、上記タンパク質と上記抗体とを反応させる抗体結合工程、および

上記タンパク質と上記抗体との反応を検出する測定工程を含むことを特徴とする、上記タンパク質の活性を促進または阻害する化合物のスクリーユング方法。

4 7 . 上記細胞の培養を、脂肪分化誘導作用を有する物質の存在下で行う、請求項 4 6に記載のスクリ一ユング方法。

4 8 . 試験化合物の存在下、塩誘導性キナーゼを産生する能力を有する細胞を、塩誘導性キナーゼの発現に適した条件で培養する工程、

該細胞を、上記塩誘導性キナーゼのリン酸化された状態の自己リン酸化部位を認識する抗体、またはリン酸化されていない状態の自己リン酸化部位を認識する抗体と接触させ、上記塩誘導性キナーゼと上記抗体とを反応させる抗体結合工程、および上記塩誘導性キナーゼと上記抗体との反応を検出する測定工程とを含むことを特徴とする、塩誘導性キナーゼの活性を促進または阻害する化合物のスクリーユング方法。

4 9 . 上記細胞の培養を、脂肪分化誘導作用を有する物質の存在下で行う、請求項 4 8に記載のスクリーニング方法。

5 0 . 試験化合物の存在下、請求項 4に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクターを保持する宿主細胞をポリぺプチドの発現に適した条件で培養するェ程、

該宿主細胞を、上記ポリペプチドのリン酸化された状態の自己リン酸化部位を認識する抗体、またはリン酸化されていない状態の自己リン酸化部位を認識する抗体と接触させ、上記ポリペプチドと上記抗体とを反応させる抗体結合工程、および上記ポリぺプチドと上記抗体との反応を検出する測定工程とを含むことを特徴とする、上記ポリぺプチドの活性を促進または阻害する化合物のスクリーユング方法。

5 1 . 上記細胞の培養を、脂肪分化誘導作用を有する物質の存在下で行う、請求項 5 0に記載のスクリーニング方法。

5 2 . 試験化合物の存在下、塩誘導性キナーゼと、塩誘導性キナーゼによってリン酸化される基質とを接触させて該基質をリン酸化させるリン酸化工程、リン酸化された状態の基質を認識する抗体、またはリン酸化されていない状態の基質を認識する抗体と、上記基質とを反応させる抗体結合工程、および上記基質と上記抗体との反応を検出する測定工程とを含むことを特徴とする、塩誘導性キナーゼの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法。

5 3 . 請求項 3 2〜5 2のいずれか 1項に記載のスクリーニング方法によって同定された、請求項 1に記載のポリべプチドの活性を促進または阻害する化合物を含有する医薬組成物。

5 4 . 糖尿病、肥満、高脂血症、高血圧、動脈硬化、高尿酸血症または循環器疾患の予防 ·治療用化合物を探索するための請求項 3 2〜5 2のいずれか 1項に記載のスクリーニング方法。

5 5 . 請求項 1に記載のポリペプチドを含有することを特徴とする、請求項 1に記載のポリぺプチドの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング用キット。

5 6 . 請求項 1に記載のポリペプチド、または他の基質をリン酸化するためのリン酸基供与体を含有する、請求項 5 5に記載のスクリーニング用キット。

5 7 . 請求項 1に記載のポリぺプチドによってリン酸化される基質ポリぺプチドを含有する、請求項 5 5または 5 6に記載のスクリーニング用キット。

5 8 . 請求項 6に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞を含有することを特徴とする、請求項 1に記載のポリべプチドの活性を促進または阻害する化合物のスクリ一ユング用キット。

5 9 . 上記宿主細胞用の培地、 c AM P応答配列を活性化するための試薬を含有する、請求項 5 8に記載のスクリーニング用キット。

6 0 . 脂肪分化誘導作用を有する物質を含有する、請求項 5 5〜 5 9のいずれか 1項に記載のスクリーニング用キット。

6 1 . 自己リン酸化能を有するタンパク質と、リン酸化された上記タンパク質の自己リン酸化部位を認識する抗体、またはリン酸化されていない状態の上記タンパク質の自己リン酸化部位を認識する抗体とを含有することを特徴とする、自己リン酸化能を有するタンパク質の活性を促進または阻害する化合物のスクリーユング用キット。

6 2 . 塩誘導性キナーゼと、リン酸化された状態の塩誘導性キナーゼの自己リン酸化部位を認識する抗体、またはリン酸化されていない塩誘導性キナーゼの自己リン酸化部位を認識する抗体とを含有することを特徴とする、塩誘導性キナーゼの活性を促進または阻害する化合物のスクリーユング用キット。

6 3 . 請求項 1に記載のポリペプチドと、リン酸化された上記ポリペプチドの自己リン酸化部位を認識する抗体、またはリン酸化されていない状態の上記ポリぺプチドの自己リン酸化部位を認識する抗体とを含有することを特徴とする、請求項 1 に記載のポリぺプチドの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング用キッ

6 4 . 自己リン酸化能を有するタンパク質を産生する能力を有する細胞と、リン酸化された状態の上記タンパク質の自己リン酸化部位を認識する抗体、またはリン酸化されていない状態の上記タンパク質の自己リン酸化部位を認識する抗体とを含有することを特徴とする、自己リン酸化能を有するタンパク質の活性を促進または阻害する化合物のスクリ一ニング用キット。

6 5 . 塩誘導性キナーゼを産生する能力を有する細胞と、リン酸化された状態の塩誘導性キナーゼの自己リン酸化部位を認識する抗体、またはリン酸化されていない状態の塩誘導性キナ一ゼの自己リン酸化部位を認識する抗体とを含有することを特徴とする、自己リン酸化能を有するタンパク質の活性を促進または阻害する化合物のスクリ一二ング用キット。

6 6 . 請求項 4に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクターを保持する宿主細胞と、リン酸化された状態のタンパク質の自己リン酸化部位を認識する抗体、またはリン酸化されていない状態のタンパク質の自己リン酸化部位を認識する抗体とを含有することを特徴とする、自己リン酸化能を有するタンパク質の活性を促進または阻害する化合物のスクリーユング用キット。

6 7 . 請求項 4に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクターを保持する宿主細胞と、リン酸化された状態の塩誘導性キナーゼの自己リン酸化部位を認識する抗体、またはリン酸化されていない状態の塩誘導性キナーゼの自己リン酸化部位を認識する抗体とを含有することを特徴とする、塩誘導性キナーゼの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング用キット。

6 8 . 請求項 4に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクターを保持する宿主細胞と、リン酸化された請求項 1に記載のポリペプチドを認識する抗体、またはリン酸化されていない請求項 1に記載のポリぺプチドを認識する抗体とを含有することを特徴とする、請求項 1に記載のポリべプチドの活性を促進または阻害する化合物のスクリ一ユング用キット。

6 9 . 脂肪分化誘導作用を有する物質を含有する、請求項 6 ：!〜 6 8のいずれか 1項に記載のスクリーニング用キット。

7 0 . 請求項 1に記載のポリペプチドをコードする m R N A、請求項 1に記載のポリぺプチドの自己リン酸化活性およびノまたは他のタンパク質のリン酸化活性、または c AM P応答配列の制御下にある遺伝子の転写調節活性を指標として、請求項 1に記載のポリぺプチドの誘導を促進または阻害する活性を検出する工程を含むことを特徴とする、請求項 1に記載のポリぺプチドの誘導を促進または阻害する化合物のスクリ一二ング方法。