WO2004018696A2 - VERFAHREN ZUR BESTIMMUNG DES ALLELISCHEN ZUSTANDES AM 5'-ENDE DES αS1-KASEINGENS - Google Patents

VERFAHREN ZUR BESTIMMUNG DES ALLELISCHEN ZUSTANDES AM 5'-ENDE DES αS1-KASEINGENS Download PDF

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    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the invention relates to a genetic marker at the 5 'end of the ⁇ S1-casein gene (CSN1S1) and the Kaseingen complex and a method for age and lactation-independent typing of cattle by determining the allelic state in this area, and the use of this method for selection of organisms with a preferred allele, for example in marker-based selection.
  • CSN1S1 ⁇ S1-casein gene
  • the heredity potential (with regard to the milk protein content and other breeding-relevant characteristics) of breeding animals is currently estimated using the breeding value estimation based on test pairs and performance recording of the offspring.
  • the disadvantage of this conventional method is obvious: in cattle, it takes about 3 years between the first insemination with a test bull and the onset of lactation by the first daughters, or about 4 years until the daughter is completely lactated. Only then can the breeding value be estimated. Until then, keeping the bulls until the first estimated breeding values and test pairs are available will result in costs that are significant over this long period and in the sum of the animals. This applies analogously to the recording of own work and the determination of a breeding value for cows.
  • lactalbumin sequence for the selection of breeding animals is disclosed in EP0555435.
  • Numerous genetic tests also exist for the bovine ⁇ -casein (Denicourt et al., 1990, Animal Genetics 21, 215-216; Medrano & Aguilar-Cordova, 1990, Biotechnology 8, 144-145; Pinder et al., 1991, Animal Genetics 22, 11-20; Schlee & Rottmann, 1992, J Animal Breed. Genet. 109, 153-155; Zadworny & Kuhnlein, 1990, Theor. Appl. Genet. 80, 631-634) because of this Protein influences on the processing properties and cheese suitability of milk are attributed (see Lodes et al., 1996, Milchwissenschaft 51, 368-373 and 543-548).
  • the promoters of the bovine milk protein genes and those of the ⁇ s1-casein gene are also used in the creation of transgenic animals and for expression in cell cultures.
  • DE 38 54 555 T2 the disclosure content of which is included here, describes the use of the ⁇ s1-casein promoter and the signal peptide for the production of recombinant proteins in the milk of mammals.
  • Rudolph (1999, Trends in Biotechnology (TIBTECH) 17, 367-374) also provides an overview of the use of transgenic animals for the production of recombinant proteins and the promoters used for this.
  • microsatellite markers which were determined in QTL analyzes, are only suitable to a limited extent for use in marker-based selection, since the respective marker-QTL coupling must first be clarified. These are Microsatellite markers in each case for indirect tests which, depending on the density of the coupling to the causative gene location, have a reduced reliability of information.
  • the disadvantage of the process of EP 0555435 is that lactalbumin makes up only a small (approx. 2-5%) portion of the total milk protein.
  • the casein ( ⁇ s1-, ⁇ s2-, ß- and ⁇ -casein) represent the largest share with around 80% of the total protein. Therefore, only a little breeding progress can be expected when using this selection marker.
  • the genetic test for DGAT1 by Winter et al. has the disadvantage that from the point of view of breeders and milk producers, the fat content of milk is not of primary interest, but is secondary to protein content.
  • the disadvantage of the Koczan et al. (1993, Animal Genetics 24, 74) consists in the fact that on the one hand the reliability of the differentiation between the variants ⁇ s1-casein B and C (for which the test was developed) has now been refuted, and on the other hand the method has only one position the base substitution is detectable and further mutations in this area are not taken into account.
  • the object of the invention is therefore to provide a genetic marker and a method for typing on milk performance characteristics in order to examine animals for milk performance characteristics regardless of age and lactation on the basis of their genetic material.
  • the problem is solved by providing a genetic marker that is also polymorphic in selected milk breeds in the ⁇ s1-casein gene region and a method that enables the animals to be typed regardless of age and lactation, the genetic mapping of the s1-casein gene, and the investigation of closely linked genes or directly caused effects and a breeding use.
  • the method according to the invention is a genetic test for a functional gene segment, the reliability of the information is greater than with coupled markers and the test result is available within a few days to hours.
  • This test can also be used to select breeding animals which are more likely to have positive inheritance properties, so that the number of test pairs and animals to be tested can be reduced, which can reduce the considerable cost of the test pairs.
  • the method according to the invention thus eliminates the disadvantages described in the prior art.
  • the invention consists of a test kit which contains the oligonucleotides for enriching a partial region of the marker sequence of the ⁇ s1-casein gene, preferably the primer 1 CSN1S1 pro1f (5 'GAA TGA ATG AAC TAG TTA CC 3'), primer 2 CSN1 S1 prol r (5 'GAA GAA GCA GCA AGC TGG 3') and primer 3 CSN1S1 pro2r (5 'CCT TGA AAT ATT CTA CCA G 3') as well as reference samples for one or more sequences of the marker sequence of the ⁇ s1-casein gene and its alleles contains.
  • the primer 1 CSN1S1 pro1f 5 'GAA TGA ATG AAC TAG TTA CC 3'
  • primer 2 CSN1 S1 prol r 5 'GAA GAA GCA GCA AGC TGG 3'
  • primer 3 CSN1S1 pro2r 5 'CCT TGA AAT ATT CTA C
  • the examined sequence section which is delimited by the oligonucleotides CSN1 S1 prolf and CSN1S1pro1 r or CSN1 S1 pro2r (gray box in Figure 1) within the German Holstein breed has four alleles which can be detected by means of a single-strand conformation polymorphism analysis and is therefore sufficiently polymorphic to carry out a genetic mapping and analysis of the effect of the alleles on milk production parameters.
  • the polymorphism found is thus located in a presumably functional gene region and is thus a suitable marker for milk performance characteristics, in particular for the protein content.
  • the sequence section is flanked with the following oligonucleotide sequences according to the invention, which are used as primers for amplification by means of PCR, the combinations of primer 1 with primer 2 and primer 1 with primer 3 being possible:
  • Primer 1 CSN1 S1 prolf (5 'GAA TGA ATG AAC TAG TTA CC 3')
  • Primer 2 CSN1 S1 prol r (5 'GAA GAA GCA GCA AGC TGG 3')
  • Primer 3 CSN1S1 pro2r (5 'CCT TGA AAT ATT CTA CCA G 3 ')
  • the primer binding sites are highlighted in gray in Figure 1.
  • a method according to the invention is provided which can be carried out directly on the genetic material of the organism to be examined.
  • a genetic mapping of the ⁇ s1-casein gene within the coupling map is made possible and the determination of the allelic state in individual organisms, e.g. Cattle, which determines the genetic potential with regard to milk protein content within a few hours.
  • the organism is by definition an animal, in particular a mammal, in particular a cattle, a sheep or a goat including embryos of this species.
  • the organism is also a genetically modified organism (GMO), which contains the sequence section described from the ⁇ s1-casein gene and the 5'-flanking region ( Figure 1) or parts thereof.
  • GMO genetically modified organism
  • the genetic material is by definition genomic DNA or RNA from animals, but also plasmid DNA from bacteria, from artificial chromosomes such as BACs and YACs or constructs made of genetic material from various organisms, e.g. for the production of transgenes.
  • the starting material for obtaining DNA- or RNA-containing material is, for example, blood, leukocytes, tissue including biopsy material, milk, sperm, hair, individual cells including cell material from embryos, a bacterial culture or also isolated chromosomes. Furthermore, amplifi- decorated genetic material, which contains the marker sequence (Figure 1) or parts thereof, again starting material.
  • the genetic material is isolated using standard methods, e.g. in the manual "Molecular Cloning” (Sambrook, Fritsch, Maniatis, 1989; Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) or can be carried out using commercially available kits (e.g. Nucleospin, Machery Nagel, Düren, Germany).
  • the enrichment is preferably carried out by means of a polymerase chain reaction (PCR, Mullis & Falloona, 1987, Methods in Enzymology 155, 335-350), it also being possible to use fluorescent-labeled, radioactive or chemically labeled primers. If RNA is used as the genetic material, a previous reverse transcription is expediently carried out (Myers & Gelfand 1991, Biochemistry 30, 7661-7666).
  • sequence section is preferably enriched with the following oligonucleotide sequences according to the invention as primers for the amplification, the combinations primer 1 with primer 2 and primer 1 with primer 3 being possible:
  • CSN1 S1 prolf and CSN1S1 pro1 r is limited.
  • a number of standard techniques known to those skilled in the art are available for determining the allelic state, such as the sequencing according to Sanger et al. 1977, the method of pyrosequencing (www.pyrosequencing.com), by displaying single-stranded conformational polymorphisms (SSCP, Orita et al. 1989, Genomics 5, 874-879), using restriction fragment length polymorphisms (RFLP; Botstein et al. 1980, American Journal of Human Genetics 32, 314-331) and PCR-RFLP (Damiani et al.
  • the primers according to the invention with a label (fluorescence, radioactivity and the like) and to carry out the determination of the allelic state on the automatic sequencer, by autoradiography or chemiluminescence. If unlabeled primers are used, the allelic state is determined by displaying the fragments after gel electrophoresis by staining the nucleic acids, e.g. with ethidium bromide (Sambrook et al., 1989) or in the silver staining method (Bassam et al 1991, Analytical Biochemistry 196, 80-83).
  • allelic state is to be understood as the presence of a certain nucleotide sequence within the enriched area.
  • Figure 2 shows an example of the nucleic acid sequence of four different allelic states of the marker according to the invention ( Figure 2, alleles 1, 2, 3 and 4).
  • allelic states by means of single strand conformation polymorphisms (SSCP) is particularly advantageous, since the allelic state can be read off directly from the fragment pattern.
  • the method also enables the detection of further mutations not described here. For this reason it is particularly well suited for the analysis of the homologous genome area in animal species other than cattle.
  • the use of a shorter fragment for example the sequence marked with an arrow in FIG. 1 and determined by the oligonucleotides according to the invention, is recommended as the complete sequence.
  • Figure 4 shows a schematic representation of alleles 1 to 4 of the marker CSN1S1 in the SSCP analysis in 12% acrylamide: bisacrlymide 49: 1 gel with 1% glycerol addition.
  • Fields 1 to 4 represent the four different separation patterns of the alleles. The direction of migration of the molecules in the electric field from cathode (-) to anode (+) is shown with an arrow.
  • the single strands of the alleles show a typical, clearly different separation pattern. Since both DNA single strands are represented by silver staining, each of the alleles is characterized by two bands.
  • allelic state 1 or 4 which differs from allele 2 by the number of potential binding sites for transcription factors.
  • oligonucleotide sequences according to the invention are used as primers to carry out the amplification of the marker by means of a PCR reaction: Primer 1 CSN1S1 prolf (5 'GAA TGA ATG AAC TAG TTA CC 3')
  • the reaction mixtures each contain 20-100 ng of genomic DNA to be tested in 15 ⁇ l, 10pmol of each oligonucleotide CSN1S1 prolf and CSN1S1pro1 r, 0.5 U Taq DNA polymerase (Peqlab Biotechnologie, Er GmbH), 50 ⁇ M dNTPs in a standard buffer (10mM Tris HCl pH 8.8, 50 mM KCI, 1.5 mM MgCl 2 ).
  • the temperature program (in a thermal cycler model iCycler from Biorad) is selected as follows: 1 min. - 93 ° C (1x), (40 sec - 91 ° C, 40 sec. 57 ° C, 40 sec - 70 ° C) (30x) and 3 min - 70 ° C (1x). This was followed by cooling to 4 ° C.
  • 25 ⁇ l of a formamide denaturation buffer are then added to each reaction mixture (95% formamide, 0.025% (w / v) bromophenol blue, 0.025% (w / v) xylene cyanole (FF), 20 mM EDTA), the mixture for 2 min at 93 ° C heated, cooled in ice water and each 4 ⁇ l of the mixture loaded on a 12% 49: 1 acrylamide bisacrlymide gel with 1% glycerol addition. The separation takes place over 20 hours at 420V and 10 ° C in a vertical electrophoresis chamber model Pengiun P9DS (OWL Scientific, Woburn, USA) with a 0.8 mm thin 16x16cm gel.
  • Pengiun P9DS OWL Scientific, Woburn, USA
  • DNA is isolated from blood samples from 503 cows of the German Holstein breed using the method of Mongomery & Sise (1990, NZ J Agric Res 33, 437-441).
  • the sequence shown in FIG. 2 is enriched with the oligonucleotides CSN1S1 prolf and CSN1 S1pro1 r according to the invention, as described above, and the variations present are represented by SSCP technology.
  • all four alleles are also detectable. The following allele frequencies are determined:
  • Allele 3 - 0.194 Allele 4 - 0.036 Allele 2 is the most common allele in the German Holstein breed, followed by allele 3 and the two rare alleles 1 and 4.
  • the frequency of the genotypes is 22> 23> 24> 12> 33> 34. Genotypes 11 and 14 and the combination of these two rare alleles (genotype 14) are not found in the cows examined.
  • the ongoing FLIPS analysis leads to the final mapping of CSN1S1 between the markers FBN14 and CSN3.
  • the total length of the coupling map of BTA6 calculated with the 11 markers in the 8 families is 161.1 cM.
  • the following table 1 shows the position of all markers included in the coupling map and the comparative information from the existing gene maps MARC97 and IBRP97.
  • Table 2 The breeding values of the bulls are estimated centrally by the United Information Systems for Animal Husbandry (VIT) in Verden. A total of over 150,000 daughters and their performance data are included in the breeding value estimation. All bulls use deregistered breeding values for milk quantity, protein and fat quantity, protein content (in%) and fat content (in%) in the variance component estimation. The breeding values are deregression as in Thomsen et al. (2001, J Anim Breed Genet. 118, 357-370).
  • the variance component estimation is carried out with the program package SAS.
  • the marker CSN1S1 is first taken into account in the model, since other influencing factors (e.g. operational effects, milking frequency) are already corrected as part of the breeding value estimation.
  • the analysis shows significant effects of the marker CSN1S1 on all traits examined (deregressed breeding values for protein content (DRG_PP), milk quantity (DRG_MY1), fat quantity (DRG_FY1), protein quantity (DRG_PY1), fat content (DRG_FP)).
  • Table 3 shows the effect of CSN1S1 on deregistered breeding values for milk performance characteristics with indication of the error probabilities (p) for the effects on the individual characteristics.
  • the greatest significance is calculated for the effect on DRG_PP. Since the investigated marker CSN1S1 lies directly in the regulatory region of a milk protein gene, this could be an indication of a direct effect.
  • the marker CSN1S1 fulfills the requirements for a functional candidate gene.
  • Genomic DNA from various European sheep breeds (milk and meat sheep) is used as a template for the amplification of the CSN1S1-5 'region as described above and an SSCP analysis is carried out, whereby 5 different migration patterns occur which are very similar to the migration pattern of DNA from cattle (Data not shown).

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Abstract

Die Erfindung betrifft einen genetischen Marker am 5'-Ende des αS1-Kaseingens (CSN1S1) und des Kaseingen-Komplexes und ein Verfahren zur alters- und laktationsunabhägigen Typisierung von Rindern durch Bestimmung des allelischen Zustands in diesem Bereich, sowie die Verwendung dieses Verfahrens zur Auswahl von Organismen mit einem bevorzugten Allel, beispielsweise in der markergestützten Selektion.

Description

Patentanmeldung
Verfahren zur Bestimmung des allelischen Zustandes am 5'-Ende des αS1-
Kaseingens
Die Erfindung betrifft einen genetischen Marker am 5'-Ende des αS1 -Kaseingens (CSN1S1) und des Kaseingen-Komplexes und ein Verfahren zur alters- und laktationsunabhängigen Typisierung von Rindern durch Bestimmung des allelischen Zustands in diesem Bereich, sowie die Verwendung dieses Verfahrens zur Auswahl von Organismen mit einem bevorzugten Allel, beispielsweise in der markergestützten Selektion.
Stand der Technik
Das Vererbungspotential (im Hinblick auf den Milchproteingehalt und andere züchterisch relevante Merkmale) von Zuchttieren wird derzeit mittels der Zuchtwertschätzung anhand von Testpaarungen und Leistungserfassung der Nach- kommen abgeschätzt. Der Nachteil dieses konventionellen Verfahrens ist offensichtlich, beim Rind vergehen zwischen der ersten Besamung mit einem Testbullen und dem Einsetzen der Laktation der ersten Töchter ca. 3 Jahre, bis zur Erfassung einer kompletten Laktation der Tochter also ca. 4 Jahre. Erst danach kann der Zuchtwert abgeschätzt werden. Bis dahin entstehen durch die Haltung der Bullen bis zum Vorliegen der ersten geschätzter Zuchtwerte und den Testpaarungen Kosten, die über diesen langen Zeitraum und in der Summe der Tiere erheblich sind. Für die Erfassung der Eigenleistung und Ermittlung eines Zuchtwertes bei Kühen gilt dies analog.
Daher werden seit einigen Jahren international Anstrengungen unternommen, mit Hilfe der Fortschritte in der Genomanalyse genetische Marker und direkte Gentests für züchterisch relevante Leistungsparameter zu entwickeln. Genomweite Markeranalysen haben dabei mit Hilfe der Kopplungsanalyse die Eingrenzung von Chromsomenbereichen, in denen leistungsbestimmende Genorte liegen - sogenannte QTL-Regionen (QTL = Quantitative Trait Loci) - ermöglicht. Derartige QTL-Studien und daraus resultierende Tests sind unter anderem in der WO 20000 36143 und der WO 2001 57250 A2/A3 beschrieben. Weitere Details der QTL-Analyse beim Nutztier und ein Verfahren, mit dem basierend auf QTL- Studien auch ursächliche Kandidatengene isoliert werden können beschreibt die DE 100 17 675 A1 , deren Offenbarungsgehalt hier mit einbezogen wird. Beim Rind und anderen zur Milchproduktion gezüchteten Spezies stellen die Milchmenge, Proteingehalte und Fettgehalte die entscheidenden Kriterien dar. Für diese Merkmale sind verschiedene QTL, unter anderem auf dem Chromosom BTA 6 identifiziert worden. Die potentiellen QTL-Regionen für Proteingehalte werden von verschiedenen Arbeitsgruppen relativ einheitlich mit dem Bereich um oder zwischen den Mikrosatellitenmarkern BM143 und TGLA37 und damit rund 20-30 Centimorgan (cM) vom Kaseinlocus entfernt angegeben (Spelman et al. 1996, Genetics 144, 1799-1808; Georges et al. 1995, Genetics 139, 907-920; Kühn et al. 1996, J Anim Breed Genet 133, 355-362; Zhang et al. 1998, Genetics 149, 1959-1973). Nach Nadesalingam et al. (2001 , Mammalian Genome 12, 27- 31) sind allerdings die Kaseingene aufgrund ihren Position (40cM entfernt vom QTL) als Kandidat für die beobachteten QTL-Effekte ebenfalls ausgeschlossen.
Bereits seit Mitte der 80er Jahre wurden auch die genetisch bedingten Milch proteinvarianten des Rindes im Hinblick auf einen Einfluss auf Milchmengen- und Milchqualitätsmerkmale untersucht. Dies erfolgte teils mittels Erfassung der phänotypisch (in der Milch) unterscheidbaren Proteinvarianten (Ng-Kwai-Hang et al., 1984, J Dairy Sei 67, 835-840 und Ng-Kwai-Hang et al., 1986, J Dairy Sei 69, 22-26,), später auch mittels molekulargenetischer Verfahren, die die den Protein- Varianten zugrundeliegenden genetischen Mutationen nachwiesen (Sabour et al., 1996, J Dairy Sei 79, 1050-1056). Die bisherigen Untersuchungen zeigen dabei teilweise widersprüchliche Effekte der untersuchten Varianten, die sich zwischen Rassen und regionalen Herkünften nicht immer bestätigen lassen (zusammenge- fasst bei Prinzenberg, 1998, ISBN 3-922306-68-3, Kap 2.4, S. 14-21 ). Die Mehr- zahl dieser Untersuchungen konzentriert sich auf die Varianten des ß- Laktoglobulins, des ß- und -Kaseins, da im αs1-Kasein nur zwei Proteinvarianten in nennenswerter Häufigkeit vorkommen und insbesondere in den bereits stark selektierten Milchrassen wie Holstein Friesian / Deutsche Holstein nahezu ausschliesslich die Proteinvariante s1 -Kasein B zu finden ist (Ng-Kwai-Hang et al., 1990, J Dairy Sei 73, 3414-3420; Erhardt et al., 1993, J Animal Breed Genet 36, 145-152; Lien et al., 1999, Animal Genetics 30, 85-91 ). In einer neueren Untersuchung an Milchrindern mit unterschiedlichem Holstein Blutanteil (Freyer et al., 1999, J Animal Breed Genet 116, 87-97) wurde αs1 -Kasein in den Kopplungsanalysen ebenfalls nicht verwendet, da keine ausreichende Variabilität vorhanden war.
Zur molekulargenetischen Differenzierung der αs1 -Kaseinvarianten B und C sind verschiedene Tests beschrieben (David & Deutch 1992, Animal Genetics 23, 425- 429; Schlee & Rottmann 1992, J Anim Breed Genet 109, 316-319). Für die seltenen Allele A, D und F existieren ebenfalls einzelne Gentestverfahren (Prin- zenberg 1998, ISBN 3-922306-68-3; Kap Kap 4.1 , S 61-71 ), wie auch für den Nachweis einer quantitativen Variante αs1 -Kasein G (Mariani et al 1995, L'industria del Latte 31 , 3-13). Schild & Geldermann (1996) zeigten mitteis Sequenzierung von rund 1000 Basenpaaren (bp) aus dem 5'-Bereich des αs1- Kaseingens bei verschiedenen Rinderrassen 17 variable Positionen im 5'- flankierenden Bereich des CSN1S1 Gens, von denen 5 aufgrund variabler Erkennungssequenzen für Restriktionsendonukleasen mit Restriktionsfragment- längenpolymorphismen (PCR-RFLP) nachweisbar waren. Nach Ehrmann et al. (1997, J Animal Breed Genet 114, 121-132) sind die 5'-flankierenden Varianten jeweils mit bestimmten Proteinallelen gekoppelt, so dass von den vorhandenen Proteinvarianten auch auf bestimmte Varianten im δ'-flankierenden Bereich geschlossen werden kann. Einen Gentest zur Unterscheidung von αs1 -Kasein B und C bei Deutschen Schwarzbunten, Fleckvieh und Jersey-Kühen, welcher auf einem Fragment aus dem 5'-flankierenden Bereich des αs1 -Kaseingens basiert, beschrieben auch Koczan et al. (1993, Animal Genetics 24, 74). Für den letztgenannten Test wurde die strikte Kopplung mit den Proteinvarianten αs1 -Kasein B und C und damit die Gültigkeit für die Rassen Aberdeen Angus, Anatolisches Schwarzvieh, Angler, Asturian Valley, Ayrshire, British Frisian, Casta Navarra, Charolais, Chianina, Fighting Bull, Hereford, Jersey, Maremmana, Pezzata Rossa, Piemonteser, Scottish Highland, Türkisches Graues Steppenrind inzwischen jedoch widerlegt (Jann et al., 2001 ; Arch. Tierz, Dummerstorf 45, 13-21 ). Die Kaseingene sind als eng gekoppelter Genlocus beim Rind und beim Schaf auf Chromosom 6, beim Menschen auf Chromosom 4 und bei der Maus auf Chromo- som 5 kartiert. Auch für andere Tierarten (Kaninchen, Schwein, Ziege) ist die Kopplung der Kaseingene nachgewiesen. Aufgrund dieser engen Kopplung, ist die derzeitige Angabe der Lokalisation des αs1 -Kaseingens in genetischen Karten beim Rind an die Lokalisation des κ-Kaseingens gebunden. Für beide Gene wird in der aktuellen Genkarte des Rindes die physische Position BTA6q31-33 und die genetische Position 82,6 cM (MARC97) bzw. 103,0 cM (IBRP97) angegeben. Die Rekombinationsrate zwischen αs1 -Kasein- und κ-Kaseingen wird damit als Null angenommen.
Die Nutzung einer Lactalbuminsequenz für die Auswahl von Zuchttieren ist in der EP0555435 offenbart. Für das bovine κ-Kasein existieren ebenfalls zahlreiche Gentests (Denicourt et al., 1990, Animal Genetics 21 , 215-216; Medrano & Aguilar-Cordova, 1990, Biotechnology 8, 144-145; Pinder et al., 1991 , Animal Genetics 22, 11-20; Schlee & Rottmann, 1992, J Animal Breed. Genet. 109, 153- 155; Zadworny & Kuhnlein, 1990, Theor. Appl. Genet. 80, 631-634), da diesem Protein Einflüsse auf die Verarbeitungseigenschaften und die Käsereieignung der Milch zugeschrieben werden (siehe Lodes et al., 1996, Milchwissenschaft 51 , 368- 373 und 543-548).
Aufgrund der milchdrüsenspezifischen Expression werden die Promotoren der bovinen Milchproteingene und die des αs1 -Kaseingens auch bei der Erstellung von transgenen Tieren und zur Expression in Zellkulturen genutzt. Die DE 38 54 555 T2, deren Offenbarungsgehalt hier mit einbezogen wird, beschreibt die Verwendung des αs1 -Kaseinpromotors und des Signalpeptids zur Produktion von rekombinanten Proteinen in der Milch von Säugetieren. Einen Überblick über die Nutzung von transgenen Tieren zur Produktion von rekombinanten Proteinen und die dazu verwendeten Promotoren gibt auch Rudolph (1999, Trends in Biotechnology (TIBTECH) 17, 367-374).
Einen direkten Gentest für ein Gen aus dem Fettsäurestoffwechsel (DGAT1) beschreiben Winter et al. (2002, PNAS 99, 9300-9305) und schreiben diesem Gen einen Effekt auf den Milchfettgehalt zu.
Der Nachteil aller Verfahren, die basierend auf einer Milchprobe die genetischen Varianten phänotypisch (d.h. in Milchproben) differenzieren besteht darin, dass nur laktierende Kühe untersucht werden können. Daher besteht der Bedarf, die Tiere laktationsunabhängig untersuchen zu können. Weiterhin stellen die im codierenden Bereich der Milchproteingene nachgewiesenen Polymorphismen nach derzeitigem Stand der Technik keine zuverlässigen Marker für Milchleistungsmerkmale dar. Die bisherigen QTL-Analysen weisen auf einen ausserhalb der Milchproteingene liegenden QTL hin. Für αs1 -Kasein ist derzeit kein Marker mit ausreichender Variabilität vorhanden, so dass sich dieses Gen einer näheren Analyse von Effekten auf Milchleistungsund Inhaltsstoffmerkmale weitgehend entzieht. Alle vorhandenen Testverfahren beruhen auf der molekulargenetischen Differenzierung der auch phänotypisch vorhandenen Variation. Die Mikrosatellitenmarker, welche bei QTL-Analysen ermittelt wurden, eignen sich nur bedingt zum Einsatz in der markergestützten Selektion, da die jeweilige Marker-QTL-Kopplung zunächst geklärt werden muss. Es handelt sich bei diesen Mikrosatellitenmarkern jeweils um indirekte Tests, die je nach Dichte der Kopplung zum ursächlichen Genort eine reduzierte Aussagesicherheit haben. Der Nachteil des Verfahrens der EP 0555435 besteht darin, dass -Lactalbumin nur einen geringen (ca. 2-5%) Anteil des gesamten Milcheiweiss ausmacht. Den größten Anteil stellen die Kaseine (αs1-, αs2-, ß- und κ-Kasein) mit rund 80% am Gesamteiweiss dar. Daher ist bei Anwendung dieses Selektionsmarkers nur ein geringer züchterischer Fortschritt zu erwarten.
Der Gentest für DGAT1 von Winter et al. hat den Nachteil, dass aus Sicht der Züchter und der Milcherzeuger der Fettgehalt der Milch nicht das primäre Interes- se geniesst, sondern hinter dem Proteingehalt zweitrangig ist.
Der Nachteil des Verfahrens der DE 38 54 555 T2 besteht darin, dass der verwendete Anteil des αs1 -Kaseinpromotors nicht näher anhand einer Nukleotidse- quenz charakterisiert ist. Es wird ein 9kb Fragment mit den Exons I und II, welches durch die Schnittstellen für Kpn\ und ßamHI flankiert wird, verwendet. Es erfolgt keine Berücksichtigung der genauen Basenfolge oder von möglichen Variationen, die die Effektivität der Expression mit diesem Abschnitt des Promotors beeinflussen können.
Der Nachteil des Testverfahrens von Koczan et al. (1993, Animal Genetics 24, 74) besteht darin, dass zum einen die Zuverlässigkeit der Differenzierung zwischen den Varianten αs1 -Kasein B und C (für die der Test entwickelt wurde) inzwischen widerlegt wurde, zum anderen ist mit dem Verfahren nur eine einzige Position der Basensubstitution nachweisbar und weitere Mutationen in diesem Bereich bleiben unberücksichtigt.
Derzeit gibt es keinen zuverlässigen Marker für Milchproteingehalt und keinen direkten genetischen Test für einen funktionalen Genabschnitt, um Tiere alters- und laktationsunabhängig auf ihr genetisches Potential hin zu testen.
Aufgabe der Erfindung
Aufgabe der Erfindung ist es daher einen genetischen Marker und ein Verfahren zur Typisierung auf Milchleistungsmerkmale bereitzustellen, um Tiere alters- und laktationsunabhängig auf Milchleistungsmerkmale anhand ihres genetischen Materials zu untersuchen. Die Lösung der Aufgabe erfolgt durch Bereitstellung eines auch in selektierten Milchrassen polymorphen genetischen Markers in der αs1 -Kaseingenregion und eines Verfahrens, das eine alters- und laktationsunabhängige Typisierung der Tiere, die genetische Kartierung des s1 -Kaseingens, die Untersuchung von eng an diesen Genort gekoppelten oder direkt dadurch hervorgerufenen Effekten und eine züchterische Nutzung ermöglicht.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren handelt es sich um einen genetischen Test für einen funktionalen Genabschnitt, die Aussagesicherheit ist größer als bei gekoppelten Markern und das Test-Ergebnis liegt innerhalb weniger Tage bis hin zu Stunden vor. Anhand dieses Tests können auch Zuchttiere ausgewählt werden, die mit höherer Wahrscheinlichkeit positive Vererbungseigenschaften haben, so dass die Anzahl Testpaarungen und zu testenden Tiere verringert werden können, wodurch die erheblichen Kosten der Testpaarungen reduziert werden können. Das erfindungsgemäße Verfahren beseitigt somit die beschriebe- nen Nachteile im Stand der Technik.
Mit dem erfindungsgemäßen Marker ist auch die Auswahl von besonders vorteilhaften Promotoren zur Erzeugung von Expressionsvektoren und transgenen Tieren möglich.
In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform besteht die Erfindung aus einem Testkit, der die Oligonukleotide zur Anreicherung eines Teilbereiches der Markersequenz des αs1 -Kaseingens, vorzugsweise die Primer 1 CSN1S1 pro1f (5' GAA TGA ATG AAC TAG TTA CC 3'), Primer 2 CSN1 S1 prol r (5' GAA GAA GCA GCA AGC TGG 3') und Primer 3 CSN1S1 pro2r (5' CCT TGA AAT ATT CTA CCA G 3') sowie Referenzproben für eine oder mehrere Sequenzen der Markerse- quenz des αs1 -Kaseingens und dessen Allele enthält.
Folgende Abbildungen sind der Beschreibung beigefügt: Abbildung 1 DNA-Sequenz aus dem 5'-flankierenden Bereich des αs1-
Kaseingens, im folgenden als Markersequenz bezeichnet. Abbildung 2 Alignment der Nukleinsäuresequenzen der allelischen Zustände des αs1 -Kaseingens Allel 1 , Allel 2, Allel 3, Allel 4 (Unterschiede in potentiellen Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen sind hervorgehoben) Abbildung 3 Schematische Darstellung der Wanderungsmuster der Allele 1 bis 4 des Markers CSN1S1 in der SSCP-Analyse Abbildung 4 Ergebnis der Varianzanalyse
Überraschender weise wurde gefunden, dass der untersuchte Sequenzabschnitt, welcher durch die Oligonukleotide CSN1 S1 prolf und CSN1S1pro1 r bzw. CSN1 S1 pro2r begrenzt wird (grauer Kasten in Abbildung 1 ) innerhalb der Rasse Deutsch Holstein vier mittels einer Einzelstrang-Konformationspolymorphismen- Analyse detektierbare Allele aufweist und damit ausreichend polymorph ist, um eine genetische Kartierung und Analysen zum Effekt der Allele auf Milchleistungsparameter durchzuführen.
Es handelt sich dabei um einen 1061 bp großen Abschnitt aus dem 5'- flankierenden Bereich und des Exon 1 (siehe Abbildung 1), im besonderen um den 654 bp großen Abschnitt, der durch die beiden Oligonukleotide CSN1 S1 prolf und CSN1S1 pro1 r begrenzt wird.
Die vier Allele wurden kloniert und sequeriziert. Die Sequenzanalyse zeigt bis auf die Länge des poly-T (ab Position 390 der Abbildung 1 ) Übereinstimmung von Allel 2 mit der von Koczan et al. (1991 , Nucleic Acids Research 19, 5591-56596; Genbank Acc. No. X59856) publizierten Sequenz. Die Allele 1 , 3 und 4 unterscheiden sich durch verschiedene Substitutionen und Deletionen von dieser Sequenz. Die variablen Positionen sind im Sequenzalignment (Abbildung 2) hervorgehoben. In den Allelen 1 und 4 sind jeweils potentielle Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen durch Mutationen betroffen. Im Allel 1 fallen demnach zwei potentielle Bindungsstellen (für AP-1 und YY1 ) weg, wohingegen im Allel 4 eine potentielle ABF1 -Bindungsstelle neu entsteht.
Der gefundene Polymorphismus ist damit in einer vermutlich funktionalen Genregion lokalisiert und somit ein geeigneter Marker für Milchleistungsmerkmale, insbesondere für den Proteingehalt. Der Sequenzabschnitt wird mit folgenden erfindungsgemäßen Oligonukleotidse- quenzen flankiert, die als Primer für die Amplifikation mittels PCR verwendet werden, wobei die Kombinationen Primer 1 mit Primer 2 und Primer 1 mit Primer 3 möglich sind: Primer 1 : CSN1 S1 prolf (5' GAA TGA ATG AAC TAG TTA CC 3') Primer 2: CSN1 S1 prol r (5' GAA GAA GCA GCA AGC TGG 3') Primer 3: CSN1S1 pro2r (5' CCT TGA AAT ATT CTA CCA G 3')
Die Primerbindungsstellen sind in der Abbildung 1 grau unterlegt.
Es wird ein erfindungsgemäßes Verfahren bereitgestellt, das direkt am Erbmaterial des zu untersuchenden Organismus durchgeführt werden kann. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Markers wird eine genetische Kartierung des αs1 -Kaseingens innerhalb der Kopplungskarte ermöglicht und die Ermittlung des allelischen Zustands bei einzelnen Organismen, z.B. Rindern, vorgenommen, die innerhalb weniger Stunden das genetische Potential im Hinblick auf Milchproteingehalt ermittelt.
Das Verfahren zur Ermittlung des genetischen Potentials im Hinblick auf Milchpro- teingehalt durch Ermittlung des allelischen Zustands des erfindungsgemäßen Markers besteht im Einzelnen aus:
1. Bereitstellung des genetischen Materials des zu untersuchenden Organismus, eines männlichen oder weiblichen Zuchtrindes oder eines Embryos.
Der Organismus ist dabei definitionsgemäß ein Tier, insbesondere ein Säugetier, im besonderen ein Rind, ein Schaf oder eine Ziege einschließlich Embryonen dieser Spezies.
Der Organismus ist auch ein gentechnisch veränderter Organismus (GVO), welcher den beschriebenen Sequenzabschnitt aus dem αs1 -Kaseingen und des 5'-flankierenden Bereich (Abbildung 1) oder Teile dessen enthält. Das genetische Material ist definitionsgemäß genomische DNS oder RNS von Tieren, aber auch Plasmid-DNS aus Bakterien, von artifiziellen Chromosomen wie BACs und YACs oder für spezielle Anwendungen erstellte Konstrukte aus genetischem Material verschiedener Organismen, z.B. zur Herstellung von Transgenen.
Das Ausgangsmaterial zur Gewinnung von DNS- oder RNS-haltigem Material ist z.B. Blut, Leukozyten, Gewebe einschließlich Biopsiematerial, Milch, Sperma, Haare, einzelne Zellen einschließlich Zellmaterial aus Embryonen, eine Bakterienkultur oder auch isolierte Chromosomen. Weiterhin ist auch bereits zuvor amplifi- ziertes genetisches Material, welches die Markersequenz (Abbildung 1) oder Teile daraus enthält, erneut Ausgangsmaterial.
2. Gezielte Isolierung oder Anreicherung des Sequenzabschnitts der Abbildung 1 oder einer Sequenz, die Teilbereiche davon enthält, vorzugsweise den dargestellten Sequenzabschnitt Position 1 bis 655 der Abbildung 1.
Die Isolierung des genetischen Materials erfolgt nach Standardmethoden, wie sie z.B. im Handbuch „Molecular Cloning" (Sambrook, Fritsch, Maniatis, 1989; Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York) beschrieben sind oder kann mittels kommerziell erhältlicher Kits (z.B. Nucleospin, Machery Nagel, Düren, Deutschland) durchgeführt werden.
Die Anreicherung erfolgt vorzugsweise mittels Polymerase Kettenreaktion (PCR, Mullis & Falloona, 1987, Methods in Enzymology 155, 335-350), wobei auch fluoreszenzmarkierte, radioaktiv oder chemisch markierte Primer eingesetzt werden können. Bei Verwendung von RNS als genetisches Material wird zweckmäßigerweise eine vorherige reverse Transkription (Myers & Gelfand 1991 , Biochemistry 30, 7661-7666) durchgeführt.
Der Sequenzabschnitt wird vorzugsweise mit folgenden erfindungsgemäßen Oligonukleotidsequenzen als Primer für die Amplifikation angereichert, wobei die Kombinationen Primer 1 mit Primer 2 und Primer 1 mit Primer 3 möglich sind:
Primer 1 : CSN1S1 prolf (5' GAA TGA ATG AAC TAG TTA CC 3')
Primer 2: CSN1S1pro1 r (5' GAA GAA GCA GCA AGC TGG 3')
Primer 3: CSN1S1pro2r (5' CCT TGA AAT ATT CTA CCA G 3')
Die Auswahl weiterer Primer, die die Amplifikation einer Teilsequenz der in Abbildung 1 beschriebenen Sequenz ermöglicht, innerhalb derer variable Nukeo- tidpositionen zur Unterscheidung der Allele 1 bis 4 liegen, ist ausdrücklich möglich.
3. Nachweis des allelischen Zustands im isolierten oder angereicherten Sequenz- bereich der Abbildung 1 , vorzugsweise innerhalb der Teilsequenz, die durch
CSN1 S1 prolf und CSN1S1 pro1 r begrenzt wird. Zur Bestimmung des allelischen Zustands stehen eine Reihe von Standard- Techniken, die dem Fachmann bekannt sind, zur Verfügung, wie die Sequenzierung nach Sanger et al. 1977, das Verfahren des Pyrosequencing (www.pyrosequencing.com), durch Darstellung von Einzelstrang Konformations- polymorphismen (SSCP, Orita et al. 1989, Genomics 5, 874-879), mittels Restriktionsfragment Längenpolymorphismen (RFLP; Botstein et al. 1980, American Journal of Human Genetics 32, 314-331 ) und PCR-RFLP (Damiani et al. 1990, Animal Genetics 21 , 107-114; Medrano & Aguilar-Cordova 1990, Animal Biotech- nology 1 ,73-77), allelspezifischer PCR (= ARMS, ASPCR, PASA; Newton et al. 1989, Nueleic Aeids Research 17, 2503-2516; Sakar et al. 1990, Analytical Biochemistry 186, 64-68; David & Deutch 1992, Animal Genetics 23, 425-429), Oligonukleotid-Ligations-Test (= OLA; Beck et al. 2002, J Clinical Mikrobiol 40, 1413-1419), Temperaturgradienten Gel Elektrophorese (= TGGE, Tee et al. 1992, Animal Genetics 23, 431-435) und analoge, zum Stand der Technik gehörende Verfahren.
Es wird vorgeschlagen, die erfindungsgemäßen Primer mit einer Markierung (Fluoreszenz, Radioaktivität und ähnliches) zu versehen und die Bestimmung des allelischen Zustands am Sequenzierautomaten, durch Autoradiografie oder Chemilumineszenz durchzuführen. Bei Verwendung nicht-markierter Primer erfolgt die Bestimmung des allelischen Zustands durch Darstellung der Fragmente nach Gelelektrophorese durch Färbung der Nukleinsäuren, z.B. mit Ethidiumbromid (Sambrook et al., 1989) oder im Silberfärbeverfahren (Bassam et al 1991 , Analytical Biochemistry 196, 80-83).
Weiterhin ist es möglich, verschiedene Hochdurchsatzverfahren zum Mutations- nachweis, darunter die Verwendung von Oligonukleotid-Arrays (Dong et al 2001 , Genome Research 11 , 1418-1424), das TaqMan-Verfahren (Ranade et al 2001 , Genome Research 11 , 1262-1268), Fluoreszenz-Polarisationsverfahren (Chen et al 1999, Genome Research 9, 492-498), Massenspektrometrische Verfahren (MALI-TOF; Sauer et al. 2002, Nueleic Aeids Research 30, e22) einzusetzen. Diese Aufzählung ist beispielhaft und nicht limitierend zu verstehen.
Der allelische Zustand ist dabei als das Vorhandensein einer bestimmten Nukleo- tidsequenz innerhalb des angereicherten Bereiches zu verstehen. Abbildung 2 zeigt beispielhaft die Nukleinsäuresequenz von vier verschiedenen allelischen Zuständen des erfindungsgemäßen Markers (Abbildung 2, Allele 1 , 2, 3 und 4).
Im Falle der Sequenzierung muss ein Vergleich mit den korrespondierenden Nukleotidsequenzen in Abbildung 2 1 , 2, 3 und 4 erfolgen, um die zu Typ Allel 1 bis Allel 4 analogen Zuordnungen vorzunehmen. Basierend auf den angegebenen Nukleotidsequenzen ist es einer mit dem Stand der Technik vertrauten Person auch möglich, die benötigten Restriktionsenzyme und Fragmentlängen bei einer PCR-RFLP Analyse zu. bestimmen oder Oligonukleotide zum Nachweis über allelspezifische PCR (ASPCR) zu konzipieren. Auch die Anpassung der weiteren zuvor genannten Techniken zum Mutationsnachweis ist dem Fachmann möglich.
Besonders vorteilhaft ist die Darstellung der allelischen Zustände mittels Einzel- strang-Konformationspolymorphismen (SSCP), da der allelische Zustand direkt anhand des Fragmentmusters abzulesen ist. Das Verfahren ermöglich zusätzlich zur Detektion der hier beschriebenen 4 Allele auch die Erkennung von weiteren, hier nicht beschriebenen Mutationen. Aus diesem Grund eignet es sich besonders gut auch zur Analyse des homologen Genombereiches bei anderen Tierarten als beim Rind. Um die Dauer der Gelelektrophorese zu reduzieren, ist die Verwendung eines kürzeren Fragmentes beispielsweise die in Abbildung 1 mit Pfeil markierte Sequenz, die durch die erfindungsgemäßen Oligonukleotide festgelegt wird, als der kompletten Sequenz empfehlenswert.
Abbildung 4 zeigt eine schematische Darstellung der Allele 1 bis 4 des Markers CSN1S1 in der SSCP-Analyse im 12%igen Acrylamid:Bisacrlymid 49:1 Gel mit 1 % Glycerolzusatz. Die Felder 1 bis 4 repräsentieren die vier verschiedenen Auftrennungsmuster der Allele. Die Wanderungsrichtung der Moleküle im elektrischen Feld von Kathode (-) zur Anode (+) ist mit einem Pfeil dargestellt. Die Einzelstränge der Allele zeigen ein typisches, deutlich voneinander verschiedenes Auftrennungsmuster. Da mittels Silberfärbung beide DNS-Einzelstränge dargestellt werden, ist jedes der Allele durch zwei Banden charakterisiert.
4. Auswahl von Organismen, die den jeweils vorteilhaften allelischen Zustand des erfindungsgemässen Markers tragen. Dies kann z.B. der allelische Zustand 1 oder 4 sein, welcher sich von Allel 2 durch die Anzahl der potentiellen Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren unterscheidet. Ausführungsbeispiele
1. Verfahren zur Typisierung auf Milchleistungsmerkmale durch Ermittlung des allelischen Zustands des erfindungsgemäßen Markers Als Ausgangsmaterial wird Rinderblut verwendet. Die Isolierung des genetischen Materials (genomische DNS) erfolgt nach der Hochsalzmethode von Montgomery & Sise (1990, NZ J Agric Res 33, 437-441 ).
Für die Durchführung der Amplifizierung des Markers mittels PCR-Reaktion werden die erfindungsgemäßen Oligonukleotidsequenzen als Primer verwendet: Primer 1 CSN1S1 prolf (5' GAA TGA ATG AAC TAG TTA CC 3')
Primer 2 CSN1 S1 prol r (5' GAA GAA GCA GCA AGC TGG 3')
Die Reaktionsansätze enthalten in 15μl jeweils 20-100 ng zu testende genomische DNS, 10pmol jedes Oligonukleotids CSN1S1 prolf und CSN1S1pro1 r, 0,5 U Taq-DNA-Polymerase (Peqlab Biotechnologie, Erlangen), 50 μM dNTPs in einem Standardpuffer (10mM Tris-HCI ph 8,8, 50 mM KCI, 1.5mM MgCl2). Das Temperaturprogramm (in einem Thermocycler Modell iCycler der Firma Biorad) wird wie folgt gewählt: 1 min. - 93°C (1x), (40 sec - 91 °C, 40 sec. 57°C, 40 sec - 70°C) (30x) und 3 min - 70°C (1x). Danach erfolgte die Kühlung auf 4°C.
Jedem Reaktionsansatz werden anschließend je 25μl eines Formamid- Denaturierungspuffers zugegeben (95% Formamid, 0,025% (w/v) Bromphenolblau, 0,025% (w/v) Xylencyanol (FF), 20 mM EDTA), die Mischung für 2 min bei 93°C erhitzt, in Eiswasser abgekühlt und je 4μl der Mischung auf ein 12%iges 49:1 Acrylamid-Bisacrlymidgel mit 1% Glycerolzusatz geladen. Die Auftrennung erfolgt über 20h bei 420V und 10°C in einer Vertikalelektrophoresekammer Modell Pengiun P9DS (OWL Scientific, Woburn, USA) mit einem 0,8 mm dünnen 16x16cm großen Gel. Als Lauf- und Gelpuffer wurde 0,5x TBE verwendet. Nach der Elektrophorese werden die Gele mit Silbernitrat nach dem Protokoll von Bassam et al. (1990, Analytical Biochemistry 196, 80-83) gefärbt. Die Entwicklungsreaktion wird durch Überführen der Gele in eiskalte 0.04M EDTA-Lösung gestoppt. Das Wanderungsmuster der Allele 1 bis 4 zeigt schematisch Abbildung 3. Da mittels Silberfärbung beide DNS-Stränge (codierender und nicht-codierender DNS-Strang) angefärbt werden, sind jeweils zwei Fragmente pro Allel vorhanden.
2. Darstellung der Variabilität der Markers CSN1S1 bei verschiedenen Rinderrassen
Aus DNS von 83 Rindern der Rassen Deutsche Schwarzbunte (6 Rinder), Deutsches Rotvieh (4 Rinder), Gelbvieh (7 Rinder), Deutsch Holstein (18 Rinder), Fleckvieh (9 Rinder), Jersey (13 Rinder), Pinzgauer (20 Rinder) und Simbrah (6 Rinder) wird mit den erfindungsgemäßen Oligonukleotiden CSN1S1 prolf (5' GAA TGA ATG AAC TAG TTA CC 3') und CSN1S1pro1 r (5' GAA GAA GCA GCA AGC TGG 3') die in Abbildung 1 dargestellte Nukleinsäuresequenz Position 1 bis 655 mittels PCR amplifiziert. Das weitere Vorgehen erfolgt wie unter Beispiel 1 beschrieben.
In den untersuchten Rassen tauchen die typischen, wie in Abbildung 3 gezeigten Auftrennungsmuster auf.
3. Darstellung der Variabilität der Markers CSN1S1 innerhalb der Rasse Deutsch Holstein
Aus Blutproben von 503 Kühen der Rasse Deutsch Holstein wird DNA nach der Methode von Mongomery & Sise (1990, NZ J Agric Res 33, 437-441 ) isoliert. Die Anreicherung der in Abbildung 2 dargestellten Sequenz erfolgt mit den erfindungsgemäßen Oligonukleotiden CSN1S1 prolf und CSN1 S1pro1 r wie oben beschrieben, die Darstellung der vorhandenen Variationen erfolgt mittels SSCP- Technik. Bei den untersuchten Kühen dieser Rasse sind alle ebenfalls vier Allele nachweisbar. Folgende Allelfrequenzen werden bestimmt:
Allel 1 - 0,031 Allel 2 - 0,739
Allel 3 - 0,194 Allel 4 - 0,036 Das Allel 2 stellt damit das häufigste Allel in Rasse Deutsch Holstein dar, gefolgt von Allel 3 und den zwei seltenen Allelen 1 und 4.
Die Genotypen treten in der Häufigkeit 22> 23 > 24 > 12 > 33 > 34 auf. Die Genotypen 11 und 14 sowie die Kombination dieser zwei seltenen Allele (Genotyp 14) werden bei den untersuchten Kühen nicht gefunden.
4. Genetische Kartierung des Markers CSN1S1
Mittels des erfindungsgemäßen Verfahren mit dem Marker CSN1S1 werden acht Halbgeschwisterfamilien der Rassen Deutsch Holstein (7) und Fleckvieh (1) typisiert und mit den Ergebnissen von Thomsen et al. 2000 (J Anim Breed Genet 117, 289-306) verglichen, der diese Familien bereits für 10 weitere Marker auf BTA 6 (Mikrosatellitenmarker) typisiert und eine Kopplungskarte erstellt hat. Die Typisierungsdaten für CSN1S1 werden in diesen bestehenden Datensatz integriert. Die Kartierung unter Verwendung der Funktion BUILD des Programmpaketes CRI-MAP (Version 2.4; Green et al. 1990, Documentation of CRI-MAP, Washington School of Medicine, St. Louis, MO, USA) führt zu zwei möglichen Positionen des Markers CSN1 S1 : zwischen den Markern IL97 und FBN14 oder FBN14 und CSN3. Die weiterhin durchgeführte FLIPS-Analyse führt zur endgültigen Kartierung von CSN1S1 zwischen den Markern FBN14 und CSN3. Die Gesamtlänge der mit den 11 Markern in den 8 Familien berechneten Kopplungskarte von BTA6 beträgt 161.1 cM. Die Position aller in die Koppiungskarte einbezogenen Marker und die vergleichenden Angaben aus den vorhandenen Genkarten MARC97 und IBRP97 zeigt die folgenden Tabelle 1. Dargestellt sind die Marker zur Erstellung der Kopplungskarte von BTA6, die Anzahl der informativen Meiosen und mit CRI- MAP berechnete Positionen (cM) auf der genetischen Karte (die erfindungsgemäße Karte ist mit „ADR" bezeichnet) im Vergleich zu den beiden veröffentlichten Genkarten MARC97 and IBRP97. Für die mit n.a. eingetragenen Marker ist keine Kartierung in den jeweiligen Genkarten angegeben.
Figure imgf000017_0001
Tabelle 1
5. Varianzanalyse zur Schätzung von Effekten auf Milchleistungsmerkmale
Mittels des erfindungsgemäßen Verfahren werden insgesamt 729 Bullen aus 9 Halbgeschwisterfamilien der Rassen Deutsch Holstein und Simmental mit dem Marker CSN1S1 typisiert. Die Verteilung der Genotypen in den 9 Halbgeschwisterfamilien zeigt Tabelle 2.
Figure imgf000017_0002
Tabelle 2 Die Zuchtwerte der Bullen werden zentral durch die Vereinigten Informationssysteme Tierhaltung (VIT) in Verden geschätzt. Insgesamt gehen über 150.000 Töchter und deren Leistungsdaten in die Zuchtwertschätzung ein. Von allen Bullen werden deregressierte Zuchtwerte für die Milchmenge, Protein- und Fettmenge, Proteingehalt (in %) und Fettgehalt (in %) in der Varianzkomponentenschätzung verwendet. Die Deregression der Zuchtwerte erfolgt wie bei Thomsen et al. (2001 , J Anim Breed Genet. 118, 357-370) beschrieben.
Die Varianzkomponentenschätzung wird mit dem Programmpaket SAS durchgeführt. Als einziger fixer Effekt wird zunächst der Marker CSN1S1 im Modell berücksichtigt, da andere Einflussfaktoren (z.B. Betriebseffekte, Melkhäufigkeit) bereits im Rahmen der Zuchtwertschätzung korrigiert werden. Die Analyse ergibt signifikante Effekte des Markers CSN1S1 auf alle untersuchten Merkmale (deregressierte Zuchtwerte für Proteingehalt (DRG_PP), Milchmenge (DRG_MY1), Fettmenge (DRG_FY1 ), Proteinmenge (DRG_PY1 ), Fettgehalt (DRG_FP)). Tabelle 3 zeigt den Effekt von CSN1S1 auf deregressierte Zuchtwerte für Milchleistungsmerkmale mit Angabe der Irrtumswahrscheinlichkeiten (p) für die Effekte auf die Einzelmerkmale.
Figure imgf000018_0001
Tabelle 3
Die höchste Signifikanz wird für den Effekt auf DRG_PP berechnet. Da der untersuchte Marker CSN1S1 direkt im regulatorischen Bereich eines Milchproteingens liegt, könnte dies ein Hinweis auf einen direkten Effekt sein. Der Marker CSN1S1 erfüllt die Anforderungen an ein funktionelles Kandidatengen.
Die höchsten Zuchtwerte für Milchmenge (DRG_MY1) erzielen im Mittel Bullen mit dem Genotyp 12, wohingegen die höchsten Zuchtwerte für Proteingehalte (DRG_PP) in der Gruppe mit Genotyp 24 gefunden werden. Eine Zusammenstel- lung der Least Square Mittelwerte (LS_means) für die Gruppen mit den Genotypen 12, 22, 23, und 24 zeigt Tabelle 4. Dargestellt sind die LSjneans sowie Standardfehler für die deregressierten Zuchtwerte für Milchmenge (DRG_MY1 ) und Proteingehalt (DRG_PP) in Gruppen mit verschiedenen CSN1S1 Genotypen.
Figure imgf000019_0001
Tabelle 4
Zur genaueren Abklärung wird die Varianzanalyse innerhalb einzelner Familien und Gruppen von Familien mit denselben Genotypen erneut durchgeführt. Dabei zeigt sich, dass der Effekt auf die Milchmenge nicht in allen Familien bestätigt werden kann. In Familie 9, in welcher vom Vater ausschließlich das Allele 2 vererbt wird, ist der einzige verbleibende Effekt in der Nähe der 5% Signifikanzschwelle für DRG_PP zu finden (p = 0.0610). Weiterhin wird für alle Genotypgruppen und einzelne Familien ein Vergleich der LS-means für die Merkmale DRG_MY1 , DRG_PP, DRG_FP durchgeführt und die Differenz der LS-means für die Genotypen 12, 23 und 24 zum häufigsten Genotyp 22 auf Signifikanz geprüft. Die Ergebnisse sind grafisch dargestellt in Abbildung 5.
6. Allelische Variabilität im Schaf
Genomische DNS von verschiedenen europäischen Schafrassen (Milch- und Fleischschaf) wird als Template zur Amplifikation der CSN1S1-5' Region wie vorher beschrieben eingesetzt und eine SSCP-Analyse durchgeführt, wobei 5 verschiedene Migrationsmuster auftreten, die dem Migrationsmuster von DNS aus Rindern sehr ähnlich sind (Daten nicht gezeigt).

Claims

Ansprüche
1. Genetischer Marker am δ'-Ende des αs1 -Kaseingens dadurch gekennzeichnet, dass er die Nukleotidsequenz 1 - 1061 , bevorzugt die Nukleotidsequenz 1 - 655 am 5'-Ende des αs1 -Kaseingens beinhaltet.
2. Genetischer Marker gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet dass er durch die
Primer 1 CSN1S1 prolf (5' GAA TGA ATG AAC TAG TTA CC 3') Primer 2 CSN1S1 pro1 r (5' GAA GAA GCA GCA AGC TGG 3') oder durch die
Primer 1 CSN1S1 prolf (5' GAA TGA ATG AAC TAG TTA CC 3') Primer 3 CSN1 S1 pro2r (5' CCT TGA AAT ATT CTA CCA G 3') in der PCR-Reaktion amplifiziert wird.
3. Genetischer Marker gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet dass er innerhalb von Milchrassen variabel ist.
4. Genetischer Marker gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet dass er zur Bestimmung des allelischen Zustandes am 5'-Ende des αS1- Kaseingens verwendet wird.
5. Verfahren zur Ermittlung des allelischen Zustands des 5Λ-Ende des αs1- Kaseingens, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte, a) Bereitstellen des Ausgangsmaterials des zu untersuchenden Organismus b) Isolierung des genetischen Materials c) Gezielte Isolierung oder Anreicherung des Markerabschnittes des 5'-
Bereiches αs1 -Kaseingens oder einer Sequenz, die Teilbereiche des Mar- kerabschnittes, vorzugsweise den Abschnitt 1 bis 655 der Markersequenz aus dem αs1 -Kaseingen enthält d) Nachweis des allelischen Zustands im isolierten oder angereicherten Sequenzbereich des Markerabschnitt des αs1 -Kaseingens.
6. Verfahren gemäß Anspruch 5, gekennzeichnet dadurch dass, das Ausgangsmaterial aus einem Tier, insbesondere einem Säugetier, im besonderen einem Rind, einem Schaf oder einer Ziege einschließlich Zuchttieren und Embryonen dieser Spezies stammt.
7. Verfahren gemäß Anspruch 5, gekennzeichnet dadurch dass, das Ausgangsmaterial Blut, Leukozyten, Gewebe einschließlich Biopsiematerial, Milch, Sperma, Haare, einzelne Zellen einschließlich Zellmaterial aus Embryonen, eine Bakterienkultur oder auch isolierte Chromosomen ist.
8. Verfahren gemäß Anspruch 5, gekennzeichnet dadurch dass das Aus- gangsmaterial aus einem gentechnisch veränderten Organismus
(GVO)stammt, der den Markerabschnitt des αs1 -Kaseingens enthält.
9. Verfahren gemäß Anspruch 5, gekennzeichnet dadurch dass das genetische Material genomische DNS oder RNS von Tieren, Plasmid-DNA aus Bakterien, von artifiziellen Chromosomen wie BACs und YACs ist.
10. Verfahren gemäß Anspruch 5, gekennzeichnet dadurch dass die Anreicherung des Markerabschnittes des αs1 -Kaseingens mittels Polymerase- Kettenreaktion erfolgt.
11. Verfahren gemäß Anspruch 5, gekennzeichnet dadurch das die Anreicherung des Markerabschnittes des αs1 -Kaseingens in der Polymerase- Kettenreaktion mit den Oligonukleotiden
Primer 1 CSN1S1 prolf (5' GAA TGA ATG AAC TAG TTA CC 3')
Primer 2 CSN1 S1 prol r (5' GAA GAA GCA GCA AGC TGG 3')
Primer 3 CSN1 S1 pro2r (5' CCT TGA AAT ATT CTA CCA G 3') als Primer erfolgt, wobei die Kombination Primer 1 mit Primer 2 und Primer 2 mit Primer 3 gewählt werden.
12. Verfahren gemäß Anspruch 5, gekennzeichnet dadurch das die Bestimmung des allelischen Zustands mittels SSCP, RFLP, OLA, TGGE, ASPCR, PCR-ELISA, Microarray-Verfahren oder durch Nukleinsäuresequenzierung erfolgt.
13. Verfahren gemäß Anspruch 5, gekennzeichnet dadurch das einer oder mehrere der allelischen Zustände der Markersequenz des αs1 -Kaseingens nachgewiesen werden
14. Verwendung des Verfahrens gemäß der vorangegangenen Ansprüche zur alters- und laktationsunabhängigen Untersuchung von Tieren auf Milchleistungsmerkmale.
15. Verwendung des Verfahrens gemäß der vorangegangenen Ansprüche zur Auswahl von Organismen, die eine bestimmte allelische Form oder einen bestimmten Genotyp der Markersequenz des αs1 -Kaseingens oder eines Teilbereiches derer tragen.
16. Verwendung des Verfahrens gemäß der vorangegangenen Ansprüche in Zuchtprogrammen, insbesondere zur markergestützten Selektion.
17. Verwendung des Verfahrens gemäß der vorangegangenen Ansprüche zur Selektion auf erhöhte Milchproteingehalte.
18. Verwendung eines Markers gemäß Anspruch 1 zur Genomanalyse, insbesondere zur Genkartierung und/oder Kopplungsanalyse.
19. Verwendung eines Markers gemäß Anspruch 1 zur Erzeugung von Expressionsvektoren.
20. Verwendung eines Markers gemäß Anspruch 1 zur Herstellung transgener Tiere.
21. Testkit, enthaltend Oligonukleotide zur Anreicherung eines Teilbereiches der Markersequenz des αs1 -Kaseingens, vorzugsweise die Primer 1 CSN1 S1 prolf (5' GAA TGA ATG AAC TAG TTA CC 3'), Primer 2 CSN1 S1 pro1 r (5' GAA GAA GCA GCA AGC TGG 3') und Primer 3 CSN1S1 pro2r (5' CCT TGA AAT ATT CTA CCA G 3') sowie Referenzproben für eine oder mehrere Sequenzen der Markersequenz des αs1- Kaseingens und dessen Allele.
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