WO2004024943A1 - インスリン含量増加剤スクリーニング方法 - Google Patents

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    • G01N2333/726—G protein coupled receptor, e.g. TSHR-thyrotropin-receptor, LH/hCG receptor, FSH

Definitions

  • the present invention relates to a screening tool and a screening method for an insulin content increasing agent based on promotion of insulin production, and a novel insulin content increasing agent.
  • Diabetes is defined as a group of diseases that are characterized by chronic hyperglycemia due to insufficient insulin action and are accompanied by various specific metabolic abnormalities (Non-patent Document 1). ) Classified into “insulin-dependent (type 1)” characterized by insulin deficiency due to destructive lesions of 8 cells, and “insulin-dependent (type 2)” with both reduced insulin sensitivity and reduced insulin secretion Is done.
  • Non-Patent Document 2 In today's clinic, sulfonylurea (SU) is used as one of the treatments for diabetic patients with decreased insulin secretion. This drug has been shown to promote insulin secretion from the ligament without promoting insulin biosynthesis, ie, without increasing the insulin content. Furthermore, this drug is known to cause dysfunction of Teng; 8 cells, particularly insulin deficiency (Non-patent Document 3).
  • SU sulfonylurea
  • a drug that improves ⁇ function reduced by chronic hyperglycemia or the use of a sulfonylurea agent especially a drug that promotes insulin production, increases insulin content, and prevents and / or treats diabetes is expected. It is rare.
  • Non-Patent Documents 4 to 6 Non-Patent Documents 4 to 6
  • substances that increase insulin mRNA eg, substances that enhance insulin promoter activity are thought to have an action to increase insulin content.
  • Patent Document 2 discloses a DNA encoding a polypeptide having the same amino acid sequence as the human and rat receptors disclosed in International Publication W002 / 44362 pamphlet, And the polypeptides they encode are listed, listing the same multiple diseases (including diabetes) as uses for agonists and antagonists.
  • Patent Document 3 European Patent Application Publication No. 1092727A (Patent Document 3) and Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-186888 (Patent Document 4) have a nucleotide sequence encoding a polypeptide having the same amino acid sequence as the human receptor. And an amino acid sequence deleted by one amino acid compared to the sequence described in WO002 / 44362 pamphlet.
  • the use of the substance that regulates the polypeptide is described as a treatment for a number of diseases. Treatment is stated to be preferred.
  • Patent Document 5 International Publication TO01 / 32864 pamphlet (Patent Document 5), International Publication W001 / 36473 pamphlet (Patent Document 6), International Publication W001 / 42288 Pamphlet (Patent Document 7) International Publication W001 / 87929 Pamphlet (Patent Document 8) ), International Publication W002 / 64789, Pan fret (Patent Document 9), and International Publication W002 / 61087, Pamphlet (Patent Document 10) describe the same amino acid sequence as that of the human receptor. The use of substances that modulate peptides is listed for the treatment of a number of diseases, including diabetes.
  • Patent Document 11 The WOOO / 31258 pamphlet (Patent Document 12) and the international publication W002 / 16548 pamphlet (Patent Document 13) describe the same amino acid sequence as that of the human receptor.
  • the use of substances that modulate polypeptides is listed for the treatment of a number of diseases.
  • Non-patent document 1 "Diabetes", 1999, Vol. 42, No. 5, p. 385-404
  • Non-Patent Document 2 Edited by C. Ronald Kahn and Gordon C. Weir, edited by Yasunori Kanazawa and three others, "Jyosulin Diabetes", Medical Shoin Emuwai W., 1995, p.245-268
  • Non-Patent Document 3 G. Ronald Kahn and Gordon G. Weir, edited by G. Ronald Kahn and Gordon G. Weir, translated by Yasunori Kanazawa, et al. , 1995, p.505-525
  • Non-Patent Document 5 "The Journal of Biological Chemistry J, (USA), 1985, Volume 260, p.13590-13594
  • Non-Patent Document 6 "Diabetes j (USA), 1977, Vol. 26, p.538-545
  • Patent Document 1 International Publication No.VV002 / 44362
  • Patent Document 2 International Publication W000 / 50562 /
  • Patent Document 3 European Patent Application No. 1092727A
  • Patent Document 4 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-186888
  • Patent Document 5 International Publication W00V32864 Breadfruit
  • Patent Document 6 International Publication W001 / 36473 Pamphlet
  • Patent Document 7 International Publication W001 / 42288 Breadlet
  • Patent Document 8 International Publication W001 / 87929 Pamphlet
  • Patent Document 9 International Publication W002 / 64789 /
  • Patent Document 10 International Publication W002 / 61087 Pamphlet
  • Patent Document 11 International publication No. 000/22131 pamphlet
  • Patent Document 1 International Publication W000 / 31258 No.
  • Patent Document 13 International Publication W002 / 16548 Pamphlet Invention Disclosure
  • An object of the present invention is to increase insulin content by promoting insulin production and to use a tool useful for screening for a substance useful for preventing and / or treating diabetes, a screening method, a novel insulin production promoter and Another object is to provide a content increasing agent.
  • Whether or not to promote insulin production can be determined by using the activation of the insulin promoter gene as an index.
  • Some of the substances that activate the insulin promoter gene include, for example, those that mediate factors that directly bind to and activate the insulin promoter in cells, and proteins that are on the cell membrane surface [eg, G protein-coupled receptors (GPCR)], and includes a substance that enhances insulin promoter activity by controlling its activity directly.
  • GPCR G protein-coupled receptors
  • substances that increase insulin promoter activity substances that act in the cell must pass through the cell membrane (and even the nuclear membrane), but when proteins on the cell membrane surface are targeted, they do not. unnecessary. More than half of currently known drugs target proteins on the cell membrane surface, making this type of protein an attractive drug target and a potential drug discovery target Think you get.
  • the discovery of a molecule (a target molecule for drug discovery) that can regulate the activity of the insulin promoter gene, which is a protein present in the cell membrane, is very important for the development of a therapeutic drug for diabetes that increases insulin content. It is thought to contribute to the prevention and treatment of diabetes.
  • the present inventors have found that activation of a GPCR consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 increases insulin promoter one activity and increases insulin production promotion. And a method for screening an insulin production promoter and / or an insulin content increasing agent using the GPCR.
  • the substance that activates the GPCR comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 obtained by the screening method of the present invention certainly increases the insulin promoter activity.
  • the present invention has been completed by providing a production promoter.
  • amino acid sequence 1 to 15 amino acids are deleted, substituted, and include a kappa or inserted amino acid sequence, and further, when activated, a polypeptide that exhibits an activity of promoting insulin production. Insulin production promoter and ⁇ or insulin content enhancer screening tool;
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, and further comprising, when activated, a polypeptide having an activity of promoting insulin production;
  • an insulin consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence having a homology of 80% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4;
  • An insulin production promoting agent and / or an insulin content increasing agent screening tool comprising a polypeptide having an activity of promoting production;
  • Insulin production promoter and / or insulin content increasing agent screening tool consisting of a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 (hereinafter, [1] to The insulin production promoting agent and the ⁇ or insulin content increasing agent screening tool according to [4] are collectively referred to as a polypeptide-type screening tool);
  • a screening tool (hereinafter referred to as a cell type screening tool);
  • [8] a step of contacting the cell according to [5] or a cell membrane thereof with a test substance, and a step of analyzing whether or not the polypeptide of claim 1 to 4 is activated; and A method for producing a pharmaceutical composition for promoting insulin production and / or increasing insulin content, which comprises a formulation step;
  • An insulin production enhancer and / or an insulin content enhancer comprising as an active ingredient the substance that activates the polypeptide according to [1] to [4];
  • a method for promoting insulin production and / or increasing insulin content comprising administering a substance which activates the polypeptide according to [1] to [4];
  • screening tool means a substance to be used for screening (specifically, a cell expressing a polypeptide or polypeptide to be used for screening).
  • Insulin production enhancer and / or insulin content enhancer screening tool is a polypeptide or cell used as a subject to be contacted with a test substance in order to screen for an insulin production enhancer and / or insulin content enhancer. is there.
  • Insulin production promoter and / or insulin content enhancer means an insulin production promoter, an insulin content enhancer, and an insulin content enhancer based on insulin production promotion.
  • Figure 1 shows the luciferase activity in NIT1 cells of mouse Teng ⁇ cell line transfected with plasmid pEF-BOSSSF-NA or a control vector (plasmid pEF-BOS) together with plasmid InsPro. This is the Darafu shown.
  • the vertical axis represents luciferase activity.
  • Figure 2 shows that NIT1 cells from a mouse ⁇ / S cell line transfected with plasmid InsPro were treated with 2- (pyridine-41-yl) ethyl thiobenzoate (hereinafter referred to as compound A) and treated with Lucifera.
  • 5 is a graph showing the results of measuring the activity. The vertical axis represents luciferase activity, and the horizontal axis represents compound concentration (imo I ZL).
  • Figure 3 shows that the mouse ⁇ cell line NIT1 cells transfected with the plasmid InsPro were transformed into 4- ⁇ 5-[(E)-(1,3-Jetyl-5-oxo1-2-thioxomidazolidine-1-4).
  • FIG. 4 is a graph showing the results of measurement of luciferase activity after treatment with (H) -1,2,4-triazole-3-amine (hereinafter, referred to as compound E).
  • the vertical axis indicates luciferase activity, and the symbol “R” indicates control.
  • FIG. 4 is a graph showing the time course of plasma insulin concentration after oral administration of glucose in SD rats to which compound A was intraperitoneally administered or to which compound A was not added.
  • the vertical axis shows plasma insulin (ngZmL), and the horizontal axis shows time (min) after oral glucose load.
  • FIG. 5 is a graph showing the time course of blood glucose levels after oral glucose load in SD rats to which compound A was intraperitoneally administered or to which compound A was not added.
  • the vertical axis represents the blood glucose level (mgZd L), and the horizontal axis represents the time (minute) after oral glucose load.
  • FIG. 6 is a graph showing the time course of blood glucose levels after oral administration of glucose in GK rats administered compound A orally or without compound A.
  • the vertical axis represents the blood glucose level (mgZd), and the horizontal axis represents the time (min) after oral glucose load.
  • the screening tool for insulin production promoter and / or insulin content increasing agent of the present invention includes a polypeptide type screening tool and a cell type screening tool.
  • Polypeptides that can be used as the polypeptide-type screening tool of the present invention include, for example,
  • screening tool polypeptides are collectively referred to as screening tool polypeptides.
  • a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is a human-derived G protein-coupled receptor consisting of 335 amino acid residues. is there.
  • one of the polypeptides for a screening tool a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is a rat G protein-coupled receptor consisting of 335 amino acid residues.
  • a human-derived polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and a rat-derived polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 are amino acids It shows 80.6% homology in sequence comparison.
  • the term “homology” as used herein refers to a value obtained by BLAST (Basic local aIgment search tool; Altschul, SF et al., J. Mol. Bio, 215, 403-410, 1990). And the homology of amino acid sequences can be determined using the BLAST search algorithm. Specifically, the bI 2 seq program (Tatiana A. Tatusova and Thomas L Madden, FEMS Microbiol. Lett., 174, 247-250, of the BLAST package (sgi32bit version, version 2.0.12; obtained from NCBI)) 1999) and can be calculated according to the default parameters.
  • cells are each transformed with an expression vector containing the polynucleotide encoding the polypeptide and a control expression vector not containing the polynucleotide.
  • the cells are transformed together with the above-described expression vectors and a plasmid having a reporter gene (eg, luciferase gene) linked downstream of the insulin promoter.
  • the cells are cultured for a predetermined time (for example, 24 hours), the medium is removed, the cells are lysed with a cell lysate, and the reporter activity in the lysate is measured.
  • control cells Compared to the reporter activity in the lysate of the cells transformed with the control expression vector (control cells), the cells transformed with the expression vector containing the polynucleotide encoding the polypeptide (test cells) If the reporter activity in the lysate is increased, the polypeptide is activated to promote insulin production Activity ".
  • a polypeptide for a screening tool which is a G protein-coupled receptor
  • activated j when a signal is generated downstream of the G protein-coupled receptor regardless of the presence or absence of binding to a ligand.
  • the G protein-coupled receptor is in an equilibrium state between the inactive and active forms, and the ligand shifts to the active form when the ligand binds to the G protein-coupled receptor. Even when the G protein-coupled receptor is overexpressed, the absolute amount of the activated G protein-coupled receptor increases, so that even in the absence of ligand, it is activated and a downstream signal is generated. It is known to be transmitted (Milano, CA et al., Science, 264, 582-586, 1994). That is, even if the ligand is not specified, the signal from the G protein-coupled receptor can be detected by overexpressing the G protein-coupled receptor in cells It may be. In the experiment described in Example 3 below, even in the absence of a ligand for a screening tool polypeptide, overexpression of these polypeptides resulted in the same state as activation by agonist binding. Activated.
  • the functional equivalent variants that can be used as the polypeptide-type screening tool of the present invention are not particularly limited in their origin, regardless of whether they are naturally occurring sequences or artificially produced sequences. Not something.
  • it includes not only a human variant of the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a variant in the rat of the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, but also Functionally equivalent variants from organisms other than humans and rats (eg, mice, hamsters, or dogs) are also included in the invention.
  • polypeptides ie, mutants derived from humans or rats, or functionally equivalent variants derived from organisms other than humans and rats
  • variant refers to an individual difference observed in the same polypeptide within the same species, or a difference observed in a homologous polypeptide between several species. means.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 1 to 15, and preferably 1 to 10 in total Consists of an amino acid sequence in which 1 to 7, more preferably 1 to 5 amino acids have been deleted, substituted, inserted, and / or added, or represented by SEQ ID NO: 2.
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 and exhibiting insulin production promoting activity is more preferable.
  • polypeptide represented by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 examples of polypeptides containing an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and a polypeptide comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or a polypeptide comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 N
  • a polypeptide to which an appropriate marker sequence or the like has been added at the terminal and / or C-terminus ie, a fusion polypeptide is also included as long as it exhibits insulin production promoting activity.
  • marker sequence a sequence for confirming expression of the polypeptide, confirming intracellular localization, or easily performing purification or the like can be used.
  • FLAG peptide hexa-histidine can be used.
  • 'Tag hemagglutinin' tag, or myc epitope.
  • the homologous polypeptide that can be used as the polypeptide-type screening tool of the present invention has a homology of 80 ⁇ 1 ⁇ 2 with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is not particularly limited as long as it is a polypeptide consisting of the amino acid sequence described above and exhibiting insulin production promoting activity.
  • the amino acid sequence preferably has an amino acid sequence having a homology of 90 O / o or more, more preferably 95% or more, even more preferably 98% or more, and particularly preferably 99% or more. it can.
  • Polypeptides for a screening tool that can be used as the polypeptide-type screening tool of the present invention can be obtained by various known methods. For example, it can be produced according to the method described in International Publication W002 / 44362 pamphlet.
  • Cells that can be used as the cell type screening tool of the present invention are not particularly limited as long as they express the polypeptide when used as a cell type screening tool.
  • a cell transformed with the expression vector, or a natural cell known to express a polypeptide for a screening tool or a cell line thereof eg, a T-cell S cell line.
  • NIT 1 cells Preferably NIT 1 cells.
  • a transformed cell is more preferable.
  • the cells for the screening tool can be prepared, for example, by re-integrating the polynucleotide encoding the polypeptide for the screening tool into an appropriate vector DNA to obtain a host cell (preferably eukaryote, particularly preferably 29 3—EBNA cells).
  • a host cell preferably eukaryote, particularly preferably 29 3—EBNA cells.
  • an appropriate promoter and a sequence related to expression it is possible to express the polypeptide in the host cell, respectively.
  • Examples of the cells transformed with the expression vector include, for example, a cell in which a polynucleotide encoding a polypeptide for a screening tool is integrated into the chromosome of a host cell, or a polynucleotide for a screening tool. It may also be a cell containing the polypeptide in the form of an expression vector containing the polynucleotide encoding it.
  • the cells for the screening tool are, for example, desired by an expression vector containing a polynucleotide encoding the polypeptide for the screening tool. Can be obtained by transforming a host cell. More specifically, for example, international publication! C which can be prepared according to the method described in) No. 02/44362 Panfuretsu Bok
  • Insulin production promoter and / or insulin content increasing agent screening method When a polypeptide for a screening tool or a cell for a screening tool is used, a substance capable of controlling the activity of the polypeptide for a screening tool, in particular, screening Substances that activate the polypeptide for tools (ie, agonists) can be screened. As described above, the polypeptide for screening tools has an activity of promoting insulin production by being activated. Therefore, a substance that activates the polypeptide for a screening tool is useful as an active ingredient of an insulin content increasing agent capable of promoting insulin production. Therefore, the polypeptide itself for a screening tool or the cell itself for a screening tool can be used as a screening tool for an insulin production promoter and a Z or insulin content increasing agent.
  • promotion of insulin production means that the activity of promoting insulin production is significantly increased relative to the control group, and the activity of promoting the production of insulin in the test substance-treated group relative to the control group is 1. It means a case of 5 times or more (preferably 5 times or more).
  • test substance that can be subjected to screening using the screening tool of the present invention is not particularly limited.
  • various known compounds (including peptides) registered in the chemical file combinatorial-ke A group of compounds obtained by the mistry technique (Terrett, NK et al., Tetrahedron, 51, 8135-8137, 1995), or a phage 'display method (Felici, F. et al., ⁇ Mol. Biol., 222, 301'-310, 1991) can be used.
  • culture supernatants of microorganisms, natural components derived from plants or marine organisms, or animal tissue extracts can also be used as test substances for screening.
  • a compound (including a peptide) obtained by chemically or biologically modifying a compound (including a peptide) selected by the insulin production promoter and / or the insulin content increasing agent screening tool of the present invention is used. Use be able to.
  • the screening method of the present invention comprises the steps of: contacting a cell for a screening tool or a cell membrane thereof expressing a polypeptide for a screening tool to function as a receptor with a test substance; and activating the polypeptide.
  • the method is not particularly limited as long as it includes a step of analyzing whether or not to be performed.On the basis of the difference in the method used to analyze the activation of the polypeptide, for example,
  • a screening method using the change in intracellular cAMP concentration as an index (hereinafter, referred to as a cAMP type screening method),
  • a method using insulin promoter activity as an index (hereinafter referred to as an insulin promoter activation type screening method)
  • the screening method of the present invention preferably uses a cAMP-type screening method (particularly the method described in Example 4) or an insulin promoter activation type screening method (particularly the method described in Example 5). It is more preferable to use a combination of the screening method (particularly the method described in Example 4) and the insulin promoter-activated screening method (particularly the method described in Example 5).
  • the transformed cells (i) to (iii) may be used as a screening tool in the screening. It is desirable to confirm that the obtained substance activates the polypeptide for screening tools.
  • polypeptides for screening tools ie, agonists
  • the polypeptide is activated by contacting a cell for a screening tool with a test substance and directly or indirectly analyzing (i.e., measuring or detecting) a change in cAMP concentration in the cell. Analyze whether or not. That is, in the cAMP-type screening method of the present invention using the change in intracellular cAMP concentration as an index, the step of contacting a cell for a screening tool with a test substance, and the change in cAMP concentration in the cell are performed. Analyzing.
  • test substance is allowed to act for a certain period of time, and an increase in intracellular cAMP concentration is used as an index, and a 1.5-fold or more (preferably 5-fold or more) increase in activity in a screening tool cell compared to a control cell Can be selected as a substance having agonist activity.
  • the change in the cAMP concentration can be analyzed directly using, for example, a commercially available cAMP measurement kit (Amersham, etc.), or as described in Example 4 below.
  • a gene whose transcription amount is regulated depending on the cAMP concentration for example, a gene having a cAMP responsive element (CRE) inserted upstream of the luciferase gene.
  • CRE cAMP responsive element
  • the test substance can be determined to be an agonist for the polypeptide for the screening tool.
  • the same procedure was performed using control cell cells that did not express the screening tool polypeptide, or transformed cells that had been transformed with an empty vector, instead of the screening tool cells. It is preferable to confirm that the substance does not increase the cAMP concentration in these control cells.
  • a substance that activates the polypeptide for a screening tool is screened by directly analyzing the change in cAMP concentration using a commercially available cAMP measurement kit (Amersham, etc.), for example, It can be implemented by procedures.
  • cells into which the gene encoding the polypeptide for a screening tool has been introduced are cultured for 20 hours after the gene is introduced, and then the medium is aspirated, and then 1 mm o I ZL—I BMX (3-isobutv I — 1— me thy I x Anthine) Bruno DMEM400 ⁇ L were added, 5% C0 2 presence, 3 7 ° incubated for Bok 1 0 min C. Further, add a test substance (eg, compound, peptide, or antibody) diluted with 1 mmo I ZL-I BMXZDMEM 100 UI, and incubate for an additional 30 minutes.
  • a test substance eg, compound, peptide, or antibody
  • the medium is aspirated, and the amount of cAMP in the obtained cells is measured using a commercially available cAMP measurement kit [for example, cAMP enzyme immunoassay system (Amersham pharmacia biotech)].
  • a test substance in which a specific increase in the amount of cAMP in the presence of the test substance is observed is screened as a substance that activates the polypeptide for a screening tool, that is, an insulin production enhancer and / or an insulin content enhancer. be able to.
  • a substance that activates a polypeptide for a screening tool can be identified. Screening can be performed, for example, by the following procedure, as shown in Example 4 described below. That is, a gene encoding a polypeptide for a screening tool and a gene whose transcription amount is regulated depending on the cAMP concentration [for example, a cAMP response sequence (CRE) is inserted upstream of the luciferase gene].
  • CRE cAMP response sequence
  • a substance ie, an agonist
  • a polypeptide for a screening tool which is useful as an insulin production promoter and an active ingredient of a ⁇ or insulin content enhancer.
  • the following procedure can be used. That is, the cell membrane in which the polypeptide for the screening tool was expressed was subjected to 20 mmo I ZL—HEPES (pH 7.4), 100 mmo l Z NaCI, 1 Ommo I / LM gCl 2 , Ommo IZL—Mix with 35 S labeled GT PS (400 pmo I ZL) in a mixed GDP solution.
  • the reaction solution After incubation in the presence of the test substance and in the absence of the test substance, the reaction solution is filtered with a glass filter or the like, and the radioactivity of GT Prs remaining on the filter is measured with a liquid scintillation counter or the like.
  • the agonist against the polypeptide for a screening tool that is, an insulin production promoting agent and / or an insulin content increasing agent can be screened using an increase in specific GTP binding below as an index.
  • the GT prS binding type screening method of the present invention utilizing the GTP s binding method comprises the steps of: contacting the cell membrane of a cell for a screening tool with a test substance in the presence of 35 s-labeled GT prs; to include a bound G tau p r s, and unbound GTP yS separated, the step of analyzing the radiation activity contained in either separated.
  • the following procedure is used. It can be implemented by: That is, a cell for a screening tool expressing the polypeptide for a screening tool, or a cell membrane thereof, or a polypeptide for a screening tool (preferably a purified preparation thereof) is prepared.
  • a buffer, an ion, and / or an assay condition such as pH are optimized, and in the optimized buffer, the transformed cell or the cell membrane expressing the polypeptide, or the polypeptide,
  • a test substance is incubated with a labeled substance (ie, agonist) that can be obtained by the above-mentioned cAMP-type screening method and / or GTPrS-integrated screening method for a certain period of time.
  • filter with a glass filter or the like wash with an appropriate amount of buffer, and measure the radioactivity remaining on the filter with a liquid scintillation counter or the like.
  • a ligand for a polypeptide for a screening tool can be selected. Whether the ligand is an agonist or an antagonist can be confirmed by the cAMP-type screening method and / or the GTPS-binding screening method.
  • a substance ie, an agonist
  • a polypeptide for a screening tool which is useful as an insulin production promoter and / or an active ingredient of an insulin content increasing agent
  • a test cell is brought into contact with a test substance, and a change in the insulin promoter activity in the cell is analyzed (ie, measured or detected) to determine whether the polypeptide is activated. I do.
  • the change in insulin promoter activity can be determined, for example, by analyzing the transcriptional activity of a plasmid having a reporter gene (eg, luciferase gene) linked downstream of the insulin promoter, as shown in Example 5 below. In addition, changes in insulin promoter activity can be analyzed.
  • a reporter gene eg, luciferase gene
  • a plasmid in which a reporter gene (eg, luciferase gene) is linked downstream of the insulin promoter is introduced into cells for screening, and then cultured for 18 to 20 hours, and diluted with the medium. to give a the test substance pressurized, 5% C 0 2 presence and incubated for 24 hours at 3 7 ° C. After aspirating the medium and lysing with a cell lysate, measure its reporter activity (eg, luciferase activity).
  • a reporter gene eg, luciferase gene
  • a substance that activates a polypeptide for a screening tool eg, a DNA, a protein (including an antibody or an antibody fragment), a peptide, or a substance thereof] that can be selected by the screening method of the present invention.
  • a screening tool eg, a DNA, a protein (including an antibody or an antibody fragment), a peptide, or a substance thereof.
  • Compounds for promoting insulin production and increasing the content of Z or insulin which comprise a compound other than the above as an active ingredient.
  • the active ingredient include 2- (pyridine-4-ethyl) ethyl thiobenzoate and 4- ⁇ 5-[(E) -1 (1,3—ethyl 5-oxo-1) described in Example 6.
  • a step of contacting a cell for a screening tool or its cell membrane with a test substance, and a screening tool Analyzing whether or not the polypeptide for screening is activated or (2) contacting the cell for a screening tool or its cell membrane with a test substance in the presence of a labeled agonist of the polypeptide for a screening tool Analyzing the change in the amount of the labeled agonist bound to the cell or its cell membrane, and then formulating the analyzed substance, thereby promoting insulin production and / or insulin.
  • a method for producing a pharmaceutical composition for increasing the content is also included in the present invention.
  • the present invention also includes a method for producing a pharmaceutical composition for promoting insulin production and / or for increasing insulin content, which comprises formulating a substance obtained by the screening method of the present invention including the analysis in the above step.
  • the active ingredient in the pharmaceutical composition of the present invention a substance that activates the polypeptide for a screening tool can be used, and the activating substance can be selected, for example, by the screening method of the present invention.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is limited to a pharmaceutical composition containing the substance obtained by the screening method of the present invention as an active ingredient.
  • the present invention encompasses all pharmaceutical compositions for promoting insulin production and increasing the content of no or insulin, which contain a substance that activates a polypeptide for a screening tool as an active ingredient.
  • the increase in insulin production and insulin content can be confirmed by a method known to those skilled in the art or a modified method thereof. For example, it can be confirmed by continuously administering a substance that activates a polypeptide for a screening tool to a diabetic model animal and measuring the amount of insulin mRNA or insulin protein in the kidney. Under the conditions described above, it is possible to determine the presence or absence of a therapeutic effect on diabetes by confirming the blood glucose lowering effect at any time according to a conventional method, or by confirming the blood glucose increase suppressing effect after an oral glucose tolerance test. Can be.
  • Formulations containing a substance that activates a polypeptide for screening tool are classified into the types of the active ingredient described above. Accordingly, the composition can be prepared as a pharmaceutical composition using pharmacologically acceptable carriers, excipients, and / or other additives commonly used in the formulation thereof.
  • the present invention relates to a method for promoting insulin production and / or insulin content, comprising the step of administering a substance that activates a polypeptide for a screening tool to a subject in need of insulin production promotion and Z or insulin content increase in an effective amount. Increasing methods are included.
  • the present invention also includes the use of a substance that activates a polypeptide for a screening tool for producing a pharmaceutical composition for promoting insulin production and increasing the Z or insulin content.
  • Administration may be, for example, tablet, pill, capsule, granule, fine granule, powder, or oral solution, or injection such as intravenous injection or intramuscular injection, suppository, transdermal
  • parenteral administration using an agent for administration or an agent for transmucosal administration can be mentioned.
  • parenteral administration such as intravenous injection is preferred for peptides digested in the stomach.
  • one or more active substances and at least one inert diluent such as lactose, mannitol, glucose, microcrystalline cellulose, hydroxypropylcellulose, starch, or It can be mixed with polyvinyl pyrrolidone, magnesium aluminate metasilicate and the like.
  • the pair The composition may contain additives other than inert diluents, for example, lubricants, disintegrants, stabilizers, or solubilizing or solubilizing agents, according to a conventional method.
  • the tablets or pills can be coated with a sugar coating or a film of a gastric or enteric substance, if necessary.
  • Liquid compositions for oral use can include, for example, emulsions, solutions, suspensions, syrups, or elixirs; commonly used inert diluents, such as purified water Or it may include ethanol.
  • the composition can contain additives other than inert diluents, for example, wetting agents, suspending agents, sweetening agents, fragrances, or preservatives.
  • Parenteral injections can include sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions, or emulsions.
  • the water-soluble solution or suspension may contain, as a diluent, for example, distilled water for injection or physiological saline.
  • examples of the diluent for the water-insoluble solution or suspension include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil (for example, olive oil), alcohols (for example, ethanol), and polysorbate. 80 and the like.
  • the composition may further contain a wetting agent, an emulsifier, a dispersant, a stabilizer, a solubilizing or solubilizing agent, or a preservative.
  • the composition can be sterilized by, for example, filtration through a bacteria-retaining filter, blending of a bactericide, or irradiation.
  • a sterile solid composition can be produced and dissolved in sterile water or another sterile injectable medium before use.
  • the dose can be appropriately determined in consideration of the activity of the active ingredient, symptoms, age, sex, and the like of the administration subject.
  • the dosage is usually about 0.1 to 10 Omg, preferably 0.1 "! To 50 mg, per adult (assuming a body weight of 6 Okg).
  • parenteral administration in the form of injections, 0.01 to 50 mg per day, preferably 0.01 to 1 "! O mg.
  • Example 1 Production of an expression vector containing a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • plasmid p EF—BOS—NA pEF-BOS plasmid
  • pEF having introduced the full-length DNA encoding the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • plasmid P EF—BOS SS F—NA A BOS signal sequence flag plasmid
  • the nucleotide sequence of the 5 'expression control region of the human insulin gene has been identified (Nature, 284, 26-32, 1980), and multiple cis (cis) elements known as transcription factor binding sites It is also common in the 5 'expression control region of the rat insulin gene (Diabetes, 44, 1002-1004, 1995). A region that contains a common cis element across these species and is considered to be sufficient to exhibit promoter activity (in this example, the region from ⁇ 342 to +37 was used. Describes the putative transcription start site shown in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 11572-11577, 1998) using the human genome DNA (Cat. No. 6550-1;
  • the specific PCR amplification conditions are as follows. DNA polymerase (Ampl i Using Taq DNA polymerase (Applied Biosystems), heat-denatured double-stranded DNA at 94 ° C for 30 seconds per cycle, and denatured primers at 55 ° C for 30 seconds 1 This was annealed to the single-stranded DNA, followed by a DNA extension reaction at 72 ° C for 1 minute. This was repeated for 30 cycles. Primers used for PCR
  • the plasmid into which the amplified fragment was cloned was digested with the restriction enzymes Hindill (Takara Shuzo) and NcoI (Takara Shuzo) to cut out the amplified fragment from the plasmid, and the plasmid containing the luciferase gene (Gat No. 306-04831, luciferase vector pGV-B2; Toyo Ink) was cloned between the NcoI site of the initiation codon of the luciferase gene and the HindII site located 5 'upstream thereof.
  • the nucleotide sequence of the cloned human insulin promoter was determined by the dideoxy terminator method using a DNA sequencer (ABI377 DNA Sequencer; Applied Biosystems). See Figure 7.
  • plasmid InsPro a human insulin promoter reporter plasmid pIns-Luc380 (hereinafter, referred to as plasmid InsPro) was constructed.
  • this plasmid is introduced into cells and the insulin promoter portion contained in this plasmid is activated, the luciferase gene is biosynthesized. By measuring the luciferase activity, the insulin promoter activity can be measured.
  • Example 3 Changes in insulin promoter reporter activity due to overexpression of a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • One of the second messengers of the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is known to be cAMP (see Example 4 of the international publication W002 / 44362 Pfret).
  • mouse Teng iS cell line NIT 1 cell (4 ⁇ 10 4 cell Z ⁇ ) ATGG: GRL-2055), and cultured in F-12 medium containing 10% fetal calf serum (FCS), followed by transfection reagent (FuGENE6; Boeringer Mannheim).
  • FCS fetal calf serum
  • FuGENE6 Boeringer Mannheim
  • Example 2 (10 ng) and the plasmid InsPro (1 ng) prepared in Example 2 were transfected. As controls, plasmid 'pEF-BOS (empty vector for control) and plasmid InsPro were transfected. After gene transfer, the cells are further cultured for 24 hours, the medium is aspirated, and then lysed with a cell lysate (cell lysate LG ⁇ ; Toyo Ink), and the luciferase activity is measured using a commercially available measurement kit (Picagene luminescence kit; The measurement was performed using a Toyo Ink) and a measurement device (WIL3000 microtiter plate luminometer; Dynatech Laboratories).
  • P 0.0018. Therefore, it was found that insulin promoter activity was increased by overexpressing the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, that is, by activating it.
  • agonist of the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 would be a prophylactic and / or therapeutic drug for diabetes, particularly a drug for increasing insulin content (biosynthesis).
  • agonist means to enhance the signal of the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and to enhance the action of the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, It is a generic term for substances that activate this polypeptide.
  • Example 4 Screening for a substance that modifies the activity of the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 using the change in intracellular cAMP concentration as an index
  • human embryonic kidney-derived HEK293 cells 293 EBN A cells transfected with Tyne-Eber virus EBN A-1 gene
  • the luciferase activity is measured using a commercially available measurement kit (Pitka Gene luminescence kit; Toyo Ink) and a measurement device (ML3000 microcrot iter). The plate luminometer was measured using Dynatech Laboratories II).
  • the increase in reporter activity due to the treatment with the test substance in the cells into which the plasmid pEF-BOS was introduced was 1.5 times (preferably 5 times) in the cells into which the plasmid pEF-BOS-NA was introduced by the treatment with the test substance. If the above increase in reporter activity can be confirmed, it can be selected as a compound having an activity of activating the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. In addition, using cells expressing a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and directly measuring the amount of intracellular cAMP after treatment with the test substance by an existing method, Can also measure the activity of the test substance.
  • Example 5 The method described in this example is also used to confirm whether or not the compound selected in Example 5 is a compound that activates a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. be able to.
  • Example 5 Screening using insulin promoter reporter activity as an index
  • the substance that activates the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 can be used in a cell that does not express the polypeptide to produce the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. It is also possible to carry out screening by introducing a polypeptide consisting of and plasmid InsPro. Also, as shown in this example, it is known that a mouse-derived polypeptide corresponding to the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is expressed (International publication TO02 / (See Examples 2 and 3 of No. 44362) It is also possible to evaluate the compounds by introducing plasmid InsPro into the Teng cell line.
  • the screening method described in this example can also be used to confirm the action of the compound selected in Example 4 to enhance the insulin promoter activity.
  • Example 2 (LIPOFECTAMINE 2000; GIBGO BRL or FuGEI € 6; Boeringer Mannheim), the plasmid InsPro (1 to 10 ng ) prepared in Example 2 was introduced, and seeded on a 96-well plate. Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) or F-12 medium containing 10% fetal calf serum (FCS) was used as the medium. After seeding, 1 8 and cultured for 20 hours, added the test substances diluted in medium, 5% C0 2 presence and incubated for 24 hours at 3 7 ° C. After aspirating the medium and lysing with a cell lysate (cell lysate LG ⁇ ; Toyo Ink), the luciferase activity is measured using a commercially available assay kit.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • FCS 10% fetal calf serum
  • Example 4 or Example 5 alone or in combination activates the polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and increases the insulin promoter activity.
  • the compound can be selected.
  • Example 6 Screening for a substance that modifies the activity of a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 using changes in intracellular cAMP concentration and insulin promoter reporter activity as indices
  • Each of the compounds ⁇ to ⁇ was 10 jumo I ZL and the reporter activity in the cells transfected with plasmid p EF—BOS was increased in the cells transfected with plasmid p EF—BOS—NA.
  • Compound A, Compound D, and Compound E can increase the reporter activity by 3 times or more
  • Compound B and Compound C can increase the reporter activity by 5 times or more
  • Compound E was evaluated as a compound having the action of activating a polypeptide consisting of: A to E according to Example 5.
  • the 96-well plate used was a collagen-coated 96-well plate, and the medium was DMEM.
  • the compounds A to E which activate the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, increase the insulin promoter activity, that is, have an insulin production promoting activity, and have an insulin content. was found to increase.
  • SD rats (4 weeks old; CLEA Japan) were fasted and orally administered with 2 gZkg of glucose.
  • Compound A 10 Omg / kg was administered intraperitoneally 5 minutes before the glucose load.
  • An appropriate amount of blood was collected at 0, 30, 60, and 120 minutes after glucose loading, and used for measurement of blood glucose level and plasma insulin concentration.
  • the administration of Compound A1OOmgZkg significantly increased the plasma insulin concentration 30 minutes after the glucose load. Further, 30 minutes after the glucose load, the increase in blood glucose level due to the glucose load was significantly suppressed in the compound A 10 OmgZkg administration group.
  • Compound A increased plasma insulin levels in glucose-loaded SD rats, PT / JP2003 / 011548
  • GK Goto-Kakizaki rats
  • the GK rat was a strain established by selective breeding in 1975 by Professor Emeritus Yoshio Goto of Tohoku University School of Medicine, using poor glucose tolerance during an oral glucose tolerance test in a Wister-type rat as an index.
  • the oral glucose tolerance test was performed in the same manner as for the SD rat except that compound A was orally administered (p.o.).
  • the symbol “*” shown in FIG. 6 means that the significant difference from the group without Compound A was p ⁇ 0.05 (Student's t test), and the symbol “**” means that the significant difference was not significant. It means that p ⁇ 0.01.
  • the insulin content increasing agent which can promote insulin production can be screened.
  • the insulin content increasing agent is a substance effective for diabetes prevention and / or treatment. Sequence listing free text

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Abstract

　活性化されることにより、インスリン産生を促進する活性を示すＧタンパク質共役型受容体からなるか、あるいは、前記ポリペプチドを発現している細胞からなる、インスリン産生促進剤及び／又はインスリン含量増加剤スクリーニングツールを開示する。また、前記細胞、又はその細胞膜と、試験物質とを接触させる工程、及び前記ポリペプチドが活性化されるか否かを分析する工程を含む、インスリン産生促進剤及び／又はインスリン含量増加剤スクリーニング方法を開示する。　前記スクリーニングツール及びスクリーニング方法は、インスリン含量を増加させ、糖尿病を予防及び／又は治療するために有用な物質のスクリーニングに有用である。　更には、前記スクリーニングで得られる物質を有効成分とする、新規なインスリン含量増加剤を開示する。

Description

^ 明 細 書 ィンスリン含量増加剤スクリーニング方法 技術分野
本発明は、 ィンスリン産生促進に基づくィンスリン含量増加剤のスクリーニン グツール及びスクリーニング方法、 並びに新規なインスリン含量増加剤に関する, 背景技術
「糖尿病」 は、 インスリン作用の不足による慢性高血糖を主徴とし、 種々の特 徵的な代謝異常を伴う疾患群であると定義され （非特許文献 1 ) 、 その成因によ つて、 fl萃) 8細胞の破壊性病変によるインスリン欠乏を特徴とする 「インスリン依 存型 （1型） 」 と、 インスリン感受性の低下とインスリン分泌低下の両者を伴う 「インスリン非依存型 （2型） 」 に分類される。
特に糖尿病患者の約 9割を占める 2型糖尿病においては、 慢性的な高血糖によ リ、 滕 細胞の機能低下、 すなわち、 インスリン分泌能の低下及びインスリン含 量の低下を引き起こすと理解されている （非特許文献 2 ) 。 今日の臨床において は、 ィンスリン分泌低下が認められる糖尿病患者に対する治療薬の 1つとして、 スルホニルゥレア （S U ) 剤が用いられている。 この薬剤は、 インスリンの生合 成を促進することなく、 すなわち、 インスリン含量を増加させることなく、 滕臓 からのインスリン分泌を促進させることがわかっている。 更に、 この薬剤は、 滕 ;8細胞の機能障害、 特にインスリン欠乏を引き起こしてしまうことが知られてい る （非特許文献 3 ) 。 従って、 慢性的高血糖又はスルホニルゥレア剤の使用など により低下した塍機能を改善させる薬剤、 特にインスリン産生を促進し、 インス リン含量を増加させ、 糖尿病を予防及び 又は治療する薬剤の開発が望まれてい る。
塍 /S細胞のィンスリン含量を増加させるためには、 ィンスリン遺伝子の転写及 び 又は翻訳の過程を増強させて、 ィンスリン生合成を促進させることが必要と 考えられる。 インスリンの生合成を促進させるものとして、 グルコースや c A M Pが知られており、 その作用メカニズムとして、 転写の亢進及び m R N Aの安定 化によるインスリン m R N A量の増加が知られている （非特許文献 4〜6 ) 。 従 つて、 インスリン m R N Aを増加させる物質 （例えば、 インスリンプロモーター 活性を增強させる物質） は、 インスリン含量を増加させる作用を有すると考えら れている。
インスリン分泌の制御に関与する分子として、 つまり、 インスリン分泌促進作 用を有する分子として報告されている Gタンパク質共役型受容体が存在する [国 際公開 W002/44362号パンフレツ卜 （特許文献 1 ) ] 。 しかし、 「インスリン産生 促進作用-! 及び 「インスリン含量増加作用」 についてはこれまで全く知られてい ない。 また、 インスリン含量を増加させる物質をスクリーニングするための適し たアツセィ方法についても報告はない。
国際公開 W000/50562号パンフレット （特許文献 2 ) には、 国際公開 W002/44362 号パンフレツ卜に開示されているヒト及びラット受容体と同一のアミノ酸配列を 有するポリべプチドをコ一ドする D N A、 及びそれがコードするポリべプチドが 記載されており、 ァゴニスト及びアンタゴニストの用途として、 同一の多数の疾 患 （糖尿病を含む） を列挙している。
欧州特許出願公開第 1092727A号明細書 （特許文献 3 ) 及び特開 2001-186888号 公報 （特許文献 4 ) には、 前記ヒト受容体と同一のアミノ酸配列を有する ·ポリべ プチドをコードする塩基配列、 及び国際公開 W002/44362号パンフレツト記載の配 列に比べ 1アミノ酸欠失したアミノ酸配列が記載されており、 前記ポリぺプチド を調節する物質の用途として、 多数の疾患の治療を列挙し、 糖尿病治療が好まし いと記載されている。
国際公開 TO01 /32864号パンフレット （特許文献 5 ) 、 国際公開 W001/36473号パ ンフレット （特許文献 6 ) 、 国際公開 W001 /42288号パンフレット （特許文献 7 ) 国際公開 W001 /87929号パンフレット （特許文献 8 ) 、 国際公開 W002/64789号パン フレット （特許文献 9 ) 、 及び国際公開 W002/61087号パンフレット （特許文献 1 0 ) には、 前記ヒト受容体と同一のアミノ酸配列が記載されており、 前記ポリべ プチドを調節する物質の用途として、 多数の疾患 （糖尿病を含む） の治療を列挙 している。 また 国際公開 W000/22131号パンフレット （特許文献 1 1 ) 、 国際公 開 WOOO/31258号パンフレット （特許文献 1 2) 、 及び国際公開 W002/16548号パン フレツ卜 （特許文献 1 3) には、 前記ヒ卜受容体と同一のアミノ酸配列が記載さ れており、 前記ポリペプチドを調節する物質の用途として、 多数の疾患の治療を 列挙している。
し力、し、 いずれにも、 これらの受容体を活性化することによりインスリン産生 を促進すること、 及びこれらの受容体がィンスリン産生促進剤又はィンスリン含 量増加剤のスクリーニングツールになることの開示も示唆もなく、 これらの受容 体を用いたィンスリン産生促進剤又はィンスリン含量増加剤のスクリーニング方 法についても開示も示唆もない。
(非特許文献 1 ) 「糖尿病」 ， 1999年， 第 42巻， 第 5号， p.385-404
(非特許文献 2) シ一■ ロナルド■カーン及びゴードン■シー 'ウイァー (C. Ronald Kahn and Gordon C. Weir) 編， 金澤康徳， 他 3名訳， 「ジヨスリン 糖尿病学」 ， 医学書院ェムワイダブリュー， 1995年， p.245- 268
(非特許文献 3) シ一 ' ロナルド■カーン及びゴードン 'シ- ウイァー (G.Ronald Kahn and Gordon G.Weir) 編， 金澤康徳， 他 3名訳 Γジヨスリン 糖尿病学」 ， 医学書院ェムワイダブリュー， 1995年， p.505- 525
(非特許文献 4) 「ザ■ジャーナル■ォブ 'バイオロジカル■ケミストリー (The Journal of Biological Chemistry) J ， (米国) ， 1985年, 第 260巻， p.13585 - 13589
(非特許文献 5) 「ザ■ジャーナル■ォブ■バイオロジカル■ケミストリー (The Journal of Biological Chemistry) J , (米国) ， 1985年, 第 260巻， p.13590-13594
(非特許文献 6) 「ダイアビーテイーズ （Diabetes) j (米国) , 1977年， 第 26巻， p.538-545
(特許文献 1 ) 国際公開 VV002/44362号パンフレツ卜
(特許文献 2) 国際公開 W000/50562号/ ンフレット
(特許文献 3) 欧州特許出願公開第 1092727A号明細書
(特許文献 4 ) 特開 2001- 186888号公報
(特許文献 5) 国際公開 W00V32864号パンフレツト (特許文献 6 ) 国際公開 W001 /36473号パンフレツト
(特許文献 7 ) 国際公開 W001/42288号パンフレツト
(特許文献 8 ) 国際公開 W001 /87929号パンフレツト
(特許文献 9 ) 国際公開 W002/64789号/ ンフレット
(特許文献 1 0 ) 国際公開 W002/61087号パンフレツト
(特許文献 1 1 ) 国際公開 ΙΙΪ000/22131号パンフレツ卜
(特許文献 1 2 ) 国際公開 W000/31258号パンフレツト
(特許文献 1 3 ) 国際公開 W002/16548号パンフレツ卜 発明の開示
本発明の課題は、 インスリン産生を促進することにより、 インスリン含量を増 加させ、 糖尿病を予防及びノ又は治療するために有用な物質のスクリーニングに 役立つツール、 スクリーニング法及び新規なインスリン産生促進剤及び 又は含 量増加剤を提供することにある。
ィンスリン産生を促進するか否かは、 ィンスリンプロモーター遺伝子の活性化 を指標に判断することができる。 インスリンプロモーター遺伝子を活性化する物 質の中には、 例えば、 細胞内でインスリンプロモーターに直接結合して活性化す る因子を介するものや、 細胞膜表面上にあるタンパク質 [例えば、 Gタンパク質 共役型受容体 （G P C R ) ] に直接作用して、 その活性を制御することにより、 インスリンプロモータ一活性を増強させる物質が含まれる。 インスリンプロモー ター活性を上げるような薬剤のうち、 細胞内で作用する物質は、 細胞膜 （更には 核膜） を通過する必要があるが、 細胞膜表面のタンパク質が標的である場合は、 細胞膜の通過は必要ない。 現在知られている薬の約半数以上が、 細胞膜表面にあ るタンパク質を標的としていることから、 この種のタンパク質は医薬品の標的と して魅力的であり、 創薬上可能性の高い標的となり得ると考える。 従って、 細胞 膜に存在するタンパク質で、 インスリンプロモーター遺伝子の活性を制御するこ とのできる分子 （創薬標的分子） の発見は、 インスリン含量を増加させるという 糖尿病治療薬開発にとって非常に重要であり、 糖尿病の予防と治療に貢献するも のと考えられる。 本発明者は、 鋭意研究の結果、 配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなる G P C Rが活性化されることにより、 インスリンプロモータ一活性を上昇させ、 ィ ンスリン産生促進が増加することを見出し、 これに基づき、 前記 G P C Rを用い たィンスリン産生促進剤及び 又はィンスリン含量増加剤のスクリ一ニング法を 提供した。 また、 本発明のスクリーニング法で得られた、 配列番号 2で表される ァミノ酸配列からなる G P C Rを活性化する物質が、 確かにィンスリンプロモー ター活性を上昇させることを確認し、 新たなインスリン産生促進剤を提供し、 本 発明を完成した。
すなわち、 本発明は、
[ 1 ] ( 1 ) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列又は配列番号 4で表されるアミ ノ酸配列、 あるいは、 （2 ) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列又は配列番号 4 で表されるアミノ酸配列において、 1〜 1 5個のアミノ酸が欠失、 置換、 及び κ 又は挿入されたアミノ酸配列を含み、 しかも、 活性化されることにより、 インス リン産生を促進する活性を示すポリぺプチドからなる、 ィンスリン産生促進剤及 び Ζ又はィンスリン含量増加剤スクリ一ニングツール；
[ 2 ] 配列番号 2で表されるァミノ酸配列又は配列番号 4で表されるアミノ酸配 列を含み、 しかも、 活性化されることにより、 インスリン産生を促進する活性を 示すポリべプチドからなる、 ィンスリン産生促進剤及び 又はィンスリン含量増 加剤スクリーニングツール；
[ 3 ] 配列番号 2で表されるァミノ酸配列又は配列番号 4で表されるアミノ酸配 列との相同性が 8 0 %以上であるアミノ酸配列からなり、 活性化されることによ リ、 インスリン産生を促進する活性を示すポリペプチドからなる、 インスリン産 生促進剤及び 又はィンスリン含量増加剤スクリーニングツール；
[ ] 配列番号 2で表されるァミノ酸配列又は配列番号 4で表されるアミノ酸配 列からなるポリべプチドからなる、 インスリン産生促進剤及び 又はインスリン 含量増加剤スクリーニングツール （以下、 [ 1 ] ~ [ 4 ] に記載のインスリン産 生促進剤及び Ζ又はインスリン含量増加剤スクリーニングツールを、 総称して、 ポリべプチド型スクリーニングツールと称する） ；
[ 5 ] [ 1 ] 〜 [ 4 ] に記載のポリペプチドを発現している細胞からなる、 イン スリン産生促進剤及び/又はィンスリン含量増加剤スクリ一二ングツール （以下, 細胞型スクリーニングツールと称する） ；
[6] 請求項 1〜4に記載のポリペプチド又は請求項 5に記載の細胞の、 インス リン産生促進剤及び 又はィンスリン含量増加剤スクリーニングのための使用；
[7] [5] に記載の細胞、 又はその細胞膜と、 試験物質とを接触させる工程、 及び [1 ] 〜 [4] に記載のポリペプチドが活性化されるか否かを分析する工程 を含む、 ィンスリン産生促進剤及び 又はィンスリン含量増加剤スクリ一二ング 方法；
[8] [5] に記載の細胞、 又はその細胞膜と、 試験物質とを接触させる工程、 及び請求項 1〜 4に記載のポリぺプチドが活性化されるか否かを分析する工程、 並びに、 製剤化工程を含む、 インスリン産生促進用及び 又はインスリン含量増 加用医薬組成物の製造方法；
[9] [1 ] 〜 [4] に記載のポリペプチドを活性化する物質を有効成分として 含む、 ィンスリン産生促進剤及び 又はィンスリン含量増加剤；
[1 0] [1 ] 〜 [4] に記載のポリペプチドを活性化する物質を投与すること からなる、 インスリン産生促進及び 又はィンスリン含量増加方法；並びに
[1 1 ] インスリン産生促進用及び Z又はインスリン含量増加用医薬組成物製造 のための、 [1 ] ~ [4] に記載のポリペプチドを活性化する物質の使用 に関する。
本明細書において、 「スクリーニングツール」 とは、 スクリーニングに用いる ための物 （具体的には、 スクリーニングに用いるためのポリペプチド又はポリべ プチドを発現している細胞） を意味する。 「インスリン産生促進剤及び 又はィ ンスリン含量増加剤スクリーニングツール」 とは、 ィンスリン産生促進剤及び 又はインスリン含量増加剤をスクリーニングするために、 試験物質を接触させる 対象として用いるためのポリべプチド又は細胞である。 「インスリン産生促進剤 及び 又はインスリン含量増加剤」 とは、 インスリン産生促進剤、 インスリン含 量増加剤、 及び、 インスリン産生促進に基づくインスリン含量増加剤を意味する < 図面の簡単な説明 図 1は、 プラスミド I n s P r oと一緒に、 プラスミド p E F— BOS SS F— N A又はコントロールベクター （プラスミド p E F— BOS) を遺伝子導入 されたマウス滕^細胞株 N I T 1細胞における、 ルシフェラーゼ活性を示すダラ フである。 縦軸は、 ルシフヱラーゼ活性を表わす。
図 2は、 プラスミド I n s P r oを遺伝子導入したマウス塍/ S細胞株 N I T 1 細胞を、 2— (ピリジン一 4一ィル） ェチル チォベンゾエー卜 （以下、 化合物 Aと称する） 処理し、 ルシフェラ一ゼ活性を測定した結果を示すグラフである。 縦軸はルシフヱラーゼ活性、 横軸は化合物濃度 （ imo I ZL) を表わす。
図 3は、 プラスミ ド I n s P r oを遺伝子導入したマウス塍 細胞株 N I T 1 細胞を、 4— {5-[ (E) ― ( 1 , 3—ジェチルー 5—ォキソ一2—チォキソィ ミダゾリジン一 4—イリデン） メチル ]— 2—フリル } 安息香酸 （以下、 化合物 Bと称する） 、 （2Z) — 2， 3—ビス （3, 4—ジメ トキシフエ二ル） ァクリ ロニトリル （以下、 化合物 Cと称する） 、 4— [ (E) —2— (3， 4ージメ ト キシフエニル） ビニル] ピリジン （以下、 化合物 Dと称する） 、 又は 5— { [4 - (3—メチルー 1 , 2, 4—ォキサジァゾール一 5— Tル） ベンジル] チォ } — 1 H— 1 , 2, 4—トリァゾールー 3—ァミン （以下、 化合物 Eと称する） で 処理し、 ルシフ Iラーゼ活性を測定した結果を示すグラフである。 縦軸はルシフ エラ一ゼ活性、 記号 「R」 はコントロールを表わす。
図 4は、 化合物 Aを腹腔内投与した、 または、 化合物 A無添加 SDラットにお ける、 グルコース経口負荷後の血漿中インスリン濃度の経時変化を示すグラフで ある。 縦軸は血漿中インスリン （n gZmL) 、 横軸はグルコース経口負荷後の 時間 （分） を表す。
図 5は、 化合物 Aを腹腔内投与した、 または、 化合物 A無添加 S Dラットにお ける、 グルコース経口負荷後の血糖値の経時変化を示すグラフである。 縦軸は血 糖値 （mgZd L) 、 横軸はグルコース経口負荷後の時間 （分） を表す。
図 6は、 化合物 Aを経口投与した、 または、 化合物 A無添加 GKラットにおけ る、 グルコース経口負荷後の血糖値の経時変化を示すグラフである。 縦軸は血糖 値 （mgZdし） 、 横軸はグルコース経口負荷後の時間 （分） を表す。 3 011548
発明を実施するための最良の形態
1 - 本発明のスクリーニングツール
本発明のィンスリン産生促進剤及び 又はィンスリン含量増加剤スクリ一ニン グツールには、 ポリペプチド型スクリーニングツールと、 細胞型スクリーニング ツールとが含まれる。
( 1 ) ポリペプチド型スクリーニングツール
本発明のポリべプチド型スクリーニングツールとして用いることのできるポリ ペプチドとしては、 例えば、
( i ) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列又は配列番号 4で表されるアミノ酸配 列からなるポリペプチド；
( i i ) 配列番号 2で表されるァミノ酸配列又は配列番号 4で表されるァミノ酸配 列において、 1〜1 5個のアミノ酸が欠失、 置換、 及び 又は挿入されたァミノ 酸配列、 あるいは、 配列番号 2で表されるアミノ酸配列又は配列番号 4で表され るアミノ酸配列を含み、 しかも、 活性化されることにより、 インスリン産生を促 進する活性を示すポリペプチド （以下、 機能的等価改変体と称する） ；及び
( i i i ) 配列番号 2で表されるァミノ酸配列又は配列番号 4で表されるアミノ酸 配列との相同性が 8 0 %以上であるアミノ酸配列からなり、 しかも、 活性化され ることにより、 インスリン産生を促進する活性を示すポリペプチド （以下、 相同 ポリべプチドと称する）
を挙げることができる。 以下、 本発明のポリペプチド型スクリーニングツールと して用いることのできるこれらの各種ポリペプチドを、 総称して、 スクリ一ニン グツール用ポリペプチドと称する。
スクリーニングツール用ポリべプチドの 1つである、 配列番号 2で表されるァ ミノ酸配列からなるポリべプチドは、 3 3 5個のアミノ酸残基からなるヒト由来 の Gタンパク質共役型受容体である。 また、 スクリーニングツール用ポリべプチ ドの 1つである、 配列番号 4で表されるアミノ酸配列からなるポリべプチドは、 3 3 5個のアミノ酸残基からなるラット由来の Gタンパク質共役型受容体である ( 配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるヒト由来のポリペプチドと、 配列番 号 4で表されるアミノ酸配列からなるラット由来のポリべプチドとは、 アミノ酸 配列の比較において 80. 6%の相同性を示す。
なお、 本明細書における前記 「相同性」 とは、 B LAST (Basic local a I ignment search tool； Altschul, S. F. ら， J. Mol. Bioに， 215, 403-410, 1990) により得られた値を意味し、 アミノ酸配列の相同性は、 BLAST検索ァ ルゴリズムを用いて決定することができる。 具体的には、 BLASTパッケージ (sgi32bit版， バージョン 2.0.12; NCBIより入手） の b I 2 s e qプログラム (Tat i ana A. Tatusova及び Thomas L Madden, FEMS Microbiol. Lett. , 174, 247-250, 1999) を用い、 デフォルトパラメータ一に従って算出することができ る。 ペアワイズ 'アラインメント■パラメータ一として、 プログラム名 「b I a s t p」 を使用し、 G a p揷入 C o s t値を 「0J で、 G a p伸長 C o s t値を 「0J で、 Q u e r y配列のフィルターとして 「S E G」 を、 M a t r ί xとし て 「BLOSUM62」 をそれぞれ使用して得られる 「同一性」 を意味する。 配列番号 2で表されるァミノ酸配列又は配列番号 4で表されるァミノ酸配列か らなるこれらのポリペプチドは、 活性化されることにより、 インスリン産生を促 進する活性 （以下、 インスリン産生促進活性と称することがある） を示す。 本明細書において、 或るポリペプチドが 「活性化されることにより、 インスリ ン産生を促進する活性」 を示すか否かは、 特に限定されるものではないが、 例え ば、 以下の方法 （好ましくは、 後述の実施例 3に記載の方法） により確認するこ とができる。 すなわち、 前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む 発現ベクターと、 前記ポリヌクレオチドを含まないコントロール用発現ベクター とで、 それぞれ、 細胞を形質転換する。 この際、 前記の各発現ベクターに加え、 インスリンプロモーターの下流にレポ一ター遺伝子 （例えば、 ルシフェラーゼ遺 伝子） を連結したプラスミドと一緒に、 細胞を形質転換する。 形質転換後、 所定 時間 （例えば、 24時間） 培養した後、 培地を除去し、 細胞溶解液で細胞を溶解 し、 溶解液中のレポーター活性をそれぞれ測定する。 コントロール用発現べクタ 一で形質転換した細胞 （コントロール細胞） における溶解液中のレポーター活性 に比べて、 前記ポリぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチドを含む発現ベクター で形質転換した細胞 （試験細胞） における溶解液中のレポーター活性が上昇して いれば、 前記ポリペプチドが 「活性化されることにより、 インスリン産生を促進 する活性」 を示すと判定することができる。
本明細書において、 Gタンパク質共役型受容体であるスクリーニングツール用 ポリペプチドが 「活性化 j された状態とは、 リガンドとの結合の有無に関わらず、 Gタンパク質共役型受容体の下流にシグナルが伝達されている状態を意味する。 活性型 Gタンパク質共役型受容体の絶対量が一定量を越えた場合に、 これらのポ リペプチドは活性化される。
Gタンパク質共役型受容体は、 不活性型と活性型との間の平衡状態にあり、 リ ガンドが Gタンパク質共役型受容体に結合することにより、 平衡が活性型にシフ 卜する。 Gタンパク質共役型受容体を過剰に発現させた場合にも、 活性型 Gタン パク質共役型受容体の絶対量が増えるため、 リガンド非存在下であっても、 活性 化され、 下流にシグナルが伝達されることが知られている （M i l ano, C. A. ら， Sc i ence, 264， 582-586, 1994) 。 すなわち、 Gタンパク質共役型受容体は、 リ ガンドが特定されていない場合であっても、 Gタンパク質共役型受容体を細胞に 過剰発現させることにより、 その受容体からのシグナルを検出することが可能な 場合がある。 後述の実施例 3に記載の実験では、 スクリーニングツール用ポリべ プチドに対するリガンド非存在下であっても、 これらのポリべプチドを過剰発現 させることにより、 ァゴニス卜の結合による活性化と同じ状態に活性化されてい る。
本発明のポリべプチド型スクリーニングツールとして用いることのできる機能 的等価改変体は、 天然に存在する配列であるか、 人工的に製造した配列であるか を問わず、 その起源も特に限定されるものではない。 例えば、 配列番号 2で表さ れるアミノ酸配列からなるポリペプチドのヒトにおける変異体、 あるいは、 配列 番号 4で表されるァミノ酸配列からなるポリペプチドのラッ卜における変異体が 含まれるだけでなく、 ヒト及びラット以外の生物 （例えば、 マウス、 ハムスター， 又はィヌ） 由来の機能的等価改変体も本発明に含まれる。 更には、 それらの天然 ポリペプチド （すなわち、 ヒ卜又はラット由来の変異体、 あるいは、 ヒ卜及びラ ット以外の生物由来の機能的等価改変体） 、 あるいは、 配列番号 2で表されるァ ミノ酸配列又は配列番号 4で表されるアミノ酸配列からなるポリべプチドのァミ ノ酸配列を、 遺伝子工学的に人為的に改変したポリペプチドなども、 前記機能的 等価改変体に該当する限り、 本発明に含まれる。 なお、 本明細書において 「変異 体」 (var i at i on) とは、 同一種内の同一ポリペプチドにみられる個体差、 ある いは、 数種間の相同ポリべプチドにみられる差異を意味する。
機能的等価改変体としては、 配列番号 2で表されるアミノ酸配列又は配列番号 4で表されるアミノ酸配列の 1又は複数の箇所において、 全体として 1〜 1 5個、 好ましくは 1〜 1 0個、 より好ましくは 1〜7個、 特に好ましくは 1〜5個のァ ミノ酸が欠失、 置換、 挿入、 及ぴノ又は付加されたアミノ酸配列からなり、 ある し、は、 配列番号 2で表されるァミノ酸配列又は配列番号 4で表されるァミノ酸配 列を含み、 しかも、 インスリン産生促進活性を示すポリペプチドがより好ましい 配列番号 2で表されるァミノ酸配列又は配列番号 4で表されるァミノ酸配列を 含み、 しかも、 インスリン産生促進活性を示すポリペプチドとして、 例えば、 配 列番号 2で表されるァミノ酸配列又は配列番号 4で表されるァミノ酸配列からな るポリべプチドの N末端及び 又は C末端に、 適当なマーカー配列等を付加した ポリペプチド （すなわち、 融合ポリペプチド） も、 インスリン産生促進活性を示 す限り、 含まれる。
前記マーカー配列としては、 ポリペプチドの発現の確認、 細胞内局在の確認、 あるいは、 精製等を容易に行なうための配列を用いることができ、 例えば、 F L A Gェピ!一プ、 へキサ一ヒスチジン 'タグ、 へマグルチニン 'タグ、 又は m y cェピトープなどを挙げることができる。
本発明のポリべプチド型スクリ一ニングツールとして用いることのできる相同 ポリべプチドは、 配列番号 2で表されるアミノ酸配列又は配列番号 4で表される アミノ酸配列との相同性が 8 0 <½以上であるアミノ酸配列からなり、 しかも、 ィ ンスリン産生促進活性を示すポリべプチドである限り、 特に限定されるものでは ないが、 配列番号 2で表されるァミノ酸配列又は配列番号 4で表されるアミノ酸 配列に関して、 好ましくは 9 O o/o以上、 より好ましくは 9 5 %以上、 更に好まし くは 9 8 %以上、 特に好ましくは 9 9 %以上の相同性を有するアミノ酸配列から なることができる。
本発明のポリべプチド型スクリーニングツールとして用いることのできるスク リーニングツール用ポリべプチドは、 種々の公知の方法によって得ることができ. 例えば、 国際公開 W002/44362号パンフレツ卜に記載の方法に従って製造すること ができる。
( 2 ) 細胞型スクリーニングツール
本発明の細胞型スクリーニングツールとして用いることのできる細胞 （以下、 スクリーニングツール用細胞と称する） は、 細胞型スクリーニングツールとして 用いる際に前記ポリべプチドを発現している限り、 特に限定されるものではなく 前記発現ベクターで形質転換された細胞であることもできるし、 あるいは、 スク リーニングツール用ポリぺプチドを発現することが知られている天然の細胞又は その細胞株 （例えば、 滕臓S細胞株、 好ましくは N I T 1細胞） であることもで きる。
本発明の細胞型スクリーニングツールとして用いることのできるスクリーニン グツール用細胞としては、 形質転換細胞がよリ好ましく、 例えば、
( i ) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列又は配列番号 4で表されるアミノ酸配 列からなるポリべプチドを発現している形質転換細胞；
( i i ) 機能的等価改変体を発現している形質転換細胞；及び
( i i i ) 相同タンパク質を発現している形質転換細胞
を挙げることができる。
スクリーニングツール用細胞は、 例えば、 スクリーニングツール用ポリべプチ ドをコ一ドするポリヌクレオチドを、 適当なベクター D N Aに再び組込むことに よリ、 宿主細胞 （好ましくは真核生物、 特に好ましくは 2 9 3— E B N A細胞） を形質転換させることにより取得することができる。 また、 これらのベクターに 適当なプロモーター及び形質発現にかかわる配列を導入することにより、 それぞ れめ宿主細胞においてポリべプチドを発現させることが可能である。
発現ベクターで形質転換された細胞としては、 例えば、 スクリーニングツール 用ポリべプチドをコ一ドするポリヌクレオチドが、 宿主細胞の染色体に組み込ま れた細胞であることもできるし、 あるいは、 スクリーニングツール用ポリべプチ ドをコ一ドするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの形で含有する細胞である こともできる。 スクリーニングツール用細胞は、 例えば、 スクリーニングツール 用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現べクターにより、 所望 の宿主細胞を形質転換することにより得ることができ、 より具体的には、 例えば, 国際公開！) 02/44362号パンフレツ 卜に記載の方法に従って製造することができる c
2 . インスリン産生促進剤及び 又はィンスリン含量増加剤スクリ一二ング方法 スクリーニングツール用ポリぺプチド又はスクリーニングツール用細胞を用い ると、 スクリーニングツール用ポリペプチドの活性を制御可能な物質、 特には、 スクリーニングツール用ポリペプチドを活性化する物質 （すなわち、 ァゴニス 卜） をスクリーニングすることができる。 先に述べたように、 スクリーニングッ ール用ポリペプチドは、 活性化されることにより、 インスリン産生を促進する活 性を有する。 従って、 スクリーニングツール用ポリペプチドを活性化する物質は, ィンスリン産生を促進することのできるインスリン含量増加剤の有効成分として 有用である。 従って、 スクリーニングツール用ポリペプチドそれ自体、 あるいは, スクリーニングツール用細胞それ自体を、 ィンスリン産生促進剤及び Z又はィン スリン含量増加剤のスクリ一ニングツールとして使用することができる。
本明細書において、 「インスリン産生促進」 とは、 コントロール群に対して有 意にインスリン産生促進活性が増加しており、 かつ、 コントロール群に対する試 験物質処理群のインスリン産生促進活性が、 1 . 5倍以上 （好ましくは 5倍以 上） である場合を意味する。
本発明のスクリーニングツールを用いてスクリーニングにかけることのできる 試験物質としては、 特に限定されるものではないが、 例えば、 ケミカルファイル に登録されている種々の公知化合物 （ペプチドを含む） 、 コンビナトリアル -ケ ミストリー技術 （Terrett, N. K. ら， Tetrahedron, 51 , 8135-8137, 1995) に よって得られた化合物群、 あるいは、 ファージ 'ディスプレイ法 （Fe l i c i , F. ら， 丄 Mo l . B i o l . , 222, 301 -310, 1991 ) などを応用して作製されたランダ 厶 'ペプチド群を用いることができる。 また、 微生物の培養上清、 植物若しくは 海洋生物由来の天然成分、 又は動物組織抽出物などもスクリーニングの試験物質 として用いることができる。 更には、 本発明のインスリン産生促進剤及び/又は ィンスリン含量増加剤スクリーニングツールによリ選択された化合物 （ぺプチド を含む） を、 化学的又は生物学的に修飾した化合物 （ペプチドを含む） を用いる ことができる。
本発明のスクリーニング方法は、 受容体として機能するようにスクリーニング ツール用ポリべプチドを発現しているスクリーニングツール用細胞又はその細胞 膜と試験物質とを接触させる工程、 及び前記ポリべプチドが活性化されるか否か を分析する工程を含む限り、 特に限定されるものではないが、 前記ポリペプチド の活性化を分析するのに用いる方法の違いに基づいて、 例えば、
1 ) 細胞内 cAM P濃度の変動を指標とするスクリーニング方法 （以下、 cAM P型スクリーニング方法と称する） 、
2) GT P 結合法を利用するスクリーニング方法 （以下、 GTPyS結合型 スクリーニング方法と称する） 、
3) リガンド結合アツセィ法を利用するスクリーニング方法 （以下、 リガンド結 合型スクリーニング方法と称する） 、 及び
4) インスリンプロモーター活性を指標とした方法 （以下、 インスリンプロモー ター活性型スクリーニング方法と称する）
を挙げることができる。
本発明のスクリーニング方法は、 c AMP型スクリーニング方法 （特には実施 例 4に記載の方法） 又はインスリンプロモーター活性型スクリーニング方法 （特 には実施例 5に記載の方法） を用いることが好ましく、 cAMP型スクリーニン グ方法 （特には実施例 4に記載の方法） 及びインスリンプロモーター活性型スク リーニング方法 （特には実施例 5に記載の方法） を組み合わせて用いることがよ リ好ましい。
また、 形質転換細胞でなく、 天然の細胞又はその細胞株を用いてスクリ一ニン グを行なった場合には、 前記 （ i ) 〜 （iii) の形質転換細胞をスクリーニング ツールとして用い、 前記スクリーニングで得られた物質がスクリーニングツール 用ポリベプチドを活性化することを確認することが望ましい。
1 ) c AMP型スクリーニング方法
細胞内 c AM P濃度の変動を指標として、 ィンスリン産生促進剤及び Z又はィ ンスリン含量増加剤の有効成分として有用な、 スクリーニングツール用ポリぺプ チドを活性化する物質 （すなわち、 ァゴニスト） をスクリーニングする場合には, スクリーニングツール用細胞と、 試験物質とを接触させ、 前記細胞内の c AMP 濃度の変化を直接的又は間接的に分析 （すなわち、 測定又は検出） することによ リ、 前記ポリペプチドが活性化されるか否かを分析する。 すなわち、 細胞内 cA MP濃度の変動を指標とする本発明の cAM P型スクリーニング方法では、 スク リーニングツール用細胞と試験物質とを接触させる工程、 及び前記細胞内におけ る cAM P濃度の変化を分析する工程を含む。 より具体的には、 後述の実施例 4 に記載の方法により実施することが好ましい。 例えば、 試験物質を一定時間作用 させ、 細胞内 cAM P濃度の上昇を指標に、 コントロール細胞に対して、 スクリ 一二ングツール用細胞において 1. 5倍以上 （好ましくは 5倍以上） の活性上昇 を示す試験物質をァゴニスト活性を有する物質として選択することができる。
c AMP濃度の変化は、 例えば、 市販の c AMP測定キット （Amersham社等） を用いて、 直接的に c AMP濃度の変化を分析することもできるし、 あるいは、 後述の実施例 4に示すように、 c AM P濃度に依存して転写量が調節される遺伝 子 [例えば、 ルシフ Iラーゼの遺伝子の上流に c AMP応答配列 （CRE) を揷 入した遺伝子] の転写活性を分析することにより、 間接的に cAM P濃度の変化 を分析することもできる。
スクリーニングツール用細胞と試験物質とを接触させた場合に、 前記細胞内の c AMP濃度が上昇すれば、 前記試験物質は、 スクリーニングツール用ポリぺプ チドに対するァゴニストであると判定することができる。 なお、 コントロール細 胞として、 スクリーニングツール用細胞の代わりに、 スクリーニングツール用ポ リペプチドが発現されていない宿主細胞、 あるいは、 空ベクターで形質転換した 形質転換細胞を用いて同様の操作を行ない、 前記試験物質によリこれらのコント 口ール細胞内の c A M P濃度が上昇しないことを確認することが好ましい。 市販の cAMP測定キット （Amersham社等） を用いて、 直接的に c AMP濃度 の変化を分析することにより、 スクリーニングツール用ポリべプチドを活性化す る物質をスクリーニングする場合には、 例えば、 以下の手順により実施すること ができる。 すなわち、 スクリーニングツール用ポリペプチドをコードする遺伝子 を導入した細胞を、 遺伝子導入した後、 20時間培養し、 続いて、 培地を吸引し た後、 1 mm o I ZL— I BMX (3— i s o b u t v I — 1— me t h y I x a n t h i n e) ノ DMEM400 μ Lを加え、 5%C02存在下、 3 7°Cで 1 0分間インキュベー卜する。 更に、 1 mmo I ZL— I BMXZDMEM 1 00 U Iで希釈した試験物質 （例えば、 化合物、 ペプチド、 又は抗体等） を添加し、 更に 30分間インキュベートする。 培地を吸引し、 得られた細胞における c AM P量を、 市販の c AMP測定キット [例えば、 c AMP酵素免疫アツセィ系 (cA P enzyme immunoassay system; Amersham pharmacia biotech社) ] を用しゝ て測定する。 試験物質存在下における特異的な c AM P量の上昇が観察された試 験物質を、 スクリーニングツール用ポリペプチドを活性化する物質、 すなわち、 ィンスリン産生促進剤及び 又はィンスリン含量増加剤としてスクリーニングす ることができる。
c AMP濃度に依存して転写量が調節される遺伝子の転写活性を分析し、 間接 的に c AM P濃度の変化を分析することにより、 スクリ一ニングツール用ポリぺ プチドを活性化する物質をスクリーニングする場合には、 例えば、 後述の実施例 4に示すように、 以下の手順により実施することができる。 すなわち、 スクリー ニングツール用ポリペプチドをコードする遺伝子と、 c A M P濃度に依存して転 写量が調節される遺伝子 [例えば、 ルシフ Iラーゼの遺伝子の上流に c AMP応 答配列 （C R E) を挿入した遺伝子；例えば、 p C RE— L u cベクター
(CL0NTEGH社） ] とを導入した細胞を、 遺伝子導入した後、 1 8〜20時間培養 し、 培地で希釈した試験物質を加え、 5%C02存在下、 37°Cで 5~ 6時間ィ ンキュペートする。 培地を吸引し、 細胞溶解液で溶解した後、 そのルシフェラー ゼ活性を測定する。 試験物質存在下における特異的なレポーター活性の上昇が観 察された物質等を、 スクリーニングツール用ポリペプチドを活性化する物質、 す なわち、 インスリン産生促進剤及び Z又はインスリン含量増加剤としてスクリー ニングすることができる。
2) GT P r s結合型スクリーニング方法
GT P yS結合法 （Lazareno, S .及び Birdsal l, N. J. M.， Br. J.
Pharmacol. , 109, 1120-1127, 1993) を利用して、 インスリン産生促進剤及び Ζ 又はィンスリン含量増加剤の有効成分として有用な、 スクリーニングツール用ポ リペプチドを活性化する物質 （すなわち、 ァゴニスト） をスクリーニングする場 合には、 例えば、 以下の手順により実施することができる。 すなわち、 スクリー ニングツール用ポリペプチドを発現させた細胞膜を、 20mmo I ZL— HEP E S ( p H 7. 4) 、 1 00mmo l Zし一 N a C I、 1 Ommo I /L-M gC l 2、 及び 5 Ommo I Z L— G D P混合溶液中で、 35Sで標識された GT P S (400 pmo I ZL) と混合する。 試験物質存在下と試験物質不在下と でインキュベートした後、 反応液をガラスフィルタ一等で濾過し、 フィルターに 残存する GT P rsの放射活性を液体シンチレーシヨンカウンタ一等で測定する, 試験物質存在下における特異的な GT P 結合の上昇を指標に、 スクリーニン グツール用ポリペプチドに対するァゴニスト、 すなわち、 インスリン産生促進剤 及び 又はインスリン含量増加剤をスクリーニングすることができる。
GTP s結合法を利用する本発明の G T p r S結合型スクリーニング方法で は、 35sで標識された GT p r s存在下において、 スクリーニングツール用細胞 の細胞膜と試験物質とを接触させる工程、 及び前記細胞膜と結合した G τ prs と、 未結合の GTP ySとを分離し、 分離されたいずれか一方に含まれる放射活 性を分析する工程を含む。
3) リガンド結合型スクリーニング方法
リガンド結合ァッセィ法を利用して、 ィンスリン産生促進剤及びノ又はィンス リン含量増加剤の有効成分として有用な、 スクリーニングツール用ポリべプチド に結合する物質をスクリーニングする場合には、 例えば、 以下の手順により実施 することができる。 すなわち、 スクリーニングツール用ポリペプチドを発現させ たスクリーニングツール用細胞、 若しくはその細胞膜、 又はスクリーニングツー ル用ポリペプチド （好ましくはその精製標品） を調製する。 緩衝液、 イオン、 及 ぴ 又は p Hのようなアツセィ条件を最適化し、 最適化したバッファ一中で、 前 記ポリべプチドを発現させた形質転換細胞若しくはその細胞膜、 又は前記ポリぺ プチドと、 例えば、 前記 cAMP型スクリーニング方法及び/又は GTPrS翁 合型スクリーニング方法で取得することができる物質 （すなわち、 ァゴニスト） の標識体とを、 試験物質と共に一定時間インキュベーションする。 反応後、 ガラ スフィルタ一等で濾過し、 適量のバッファーで洗浄した後、 フィルターに残存す る放射活性を液体シンチレーシヨンカウンタ一等で測定する。 得られた標識体の 結合阻害を指標に、 スクリーニングツール用ポリべプチドのリガンドを選択する ことができる。 なお、 このリガンドが、 ァゴニス卜又はアンタゴニストであるか については、 前記 c A M P型スクリーニング方法及び 又は G T P S結合型ス クリ一二ング方法などによリ確認することができる。
4 ) インスリンプロモーター活性型スクリーニング方法
ィンスリンプロモーター活性を指標として、 ィンスリン産生促進剤及び 又は インスリン含量増加剤の有効成分として有用な、 スクリーニングツール用ポリべ プチドを活性化する物質 （すなわち、 ァゴニスト） をスクリーニングする場合に は、 スクリーニングツール用細胞と、 試験物質とを接触させ、 前記細胞内のイン スリンプロモーター活性の変化を分析 （すなわち、 測定又は検出） することによ リ、 前記ポリべプチドが活性化されるか否かを分析する。
インスリンプロモーター活性の変化は、 例えば、 後述の実施例 5に示すように, インスリンプロモーターの下流にレポーター遺伝子 （例えば、 ルシフェラーゼ遺 伝子） を連結したプラスミドを用いて、 その転写活性を分析することにより、 ィ ンスリンプロモータ一活性の変化を分析することができる。
より具体的には、 例えば、 インスリンプロモーターの下流にレポーター遺伝子 (例えば、 ルシフェラーゼ遺伝子） を連結したプラスミドを、 スクリーニングッ ール用細胞に導入した後、 1 8〜2 0時間培養し、 培地で希釈した試験物質を加 え、 5 % C 0 2存在下、 3 7 °Cで 2 4時間インキュベートする。 培地を吸引し、 細胞溶解液で溶解した後、 そのレポーター活性 （例えば、 ルシフェラーゼ活性） を測定する。 試験物質存在下における特異的なレポーター活性の上昇が観察され た物質等を、 スクリーニングツール用ポリペプチドを活性化する物質、 すなわち. ィンスリン産生促進剤及び Z又はィンスリン含量増加剤としてスクリーニングす ることができる。 なお、 コントロール細胞として、 スクリーニングツール用細胞 の代わりに、 スクリーニングツール用ポリべプチドを発現していない細胞を用い て同様の操作を行ない、 前記試験物質によりこれらのコントロール細胞では、 ィ ンスリンプロモーターレポーター活性が上昇しないことを確認することが好まし い。 3 . インスリン産生促進用及びノ又はィンスリン含量増加用医薬組成物
本発明には、 例えば、 本発明のスクリーニング方法で選択することのできる、 スクリーニングツール用ポリペプチドを活性化する物質 [例えば、 D N A、 タン パク質 （抗体又は抗体断片を含む） 、 ペプチド、 又はそれ以外の化合物] を有効 成分とするインスリン産生促進用及び Z又はィンスリン含量増加用医薬組成物が 包含される。 有効成分として、 例えば、 実施例 6に記載した、 2— （ピリジン一 4一ィル） ェチル チォベンゾェ一ト、 4一 { 5 - [ ( E ) 一 （1 , 3—ジェチ ルー 5—ォキソ一2—チォキソイミダゾリジン一 4一イリデン） メチル] —2— フリル } 安息香酸、 （2 Z ) - 2 , 3—ビス （3 , 4—ジメ トキシフエ二ル） ァ クリロニトリル、 4— [ ( E ) 一 2— （3 , 4—ジメ トキシフエ二ル） ビニル] ピリジン、 及び 5— { [ 4— （3—メチルー 1 , 2， 4—ォキサジァゾール一 5 —ィル） ベンジル] チォ } - 1 H - 1 , 2， 4一トリァゾ一ルー 3—ァミンなど が挙げられる。
また、 ィンスリン産生促進用及び 又はィンスリン含量増加用医薬組成物の品 質規格の確認試験において、 （1 ) スクリーニングツール用細胞、 又はその細胞 膜と、 試験物質とを接触させる工程、 及びスクリ一ニンツール用ポリペプチドが 活性化されるか否かを分析する工程、 あるいは、 （2 ) スクリーニングツール用 細胞、 又はその細胞膜と、 試験物質とを、 スクリーニングツール用ポリペプチド の標識ァゴニスト存在下で、 接触させる工程、 及び前記細胞又はその細胞膜への 標識ァゴニス卜の結合量の変化を分析する工程からなる分析を行ない、 次いで、 分析した物質を製剤化することからなる、 ィンスリン産生促進用及び 又はィン スリン含量増加用医薬組成物の製造方法も本発明に含まれる。
また、 前記工程による分析を含む本発明のスクリーニング方法で得られた物質 を製剤化することからなる、 インスリン産生促進用及び 又はィンスリン含量増 加用医薬組成物の製造方法も本発明に含まれる。
本発明の医薬組成物における有効成分としては、 スクリーニングツール用ポリ ペプチドを活性化する物質を用いることができ、 前記活性化物質は、 例えば、 本 発明のスクリーニング方法により選択することができる。 本発明の医薬組成物は, 本発明のスクリーニング方法で得られた物質を有効成分とする医薬組成物に限定 されず、 スクリーニングツール用ポリべプチドを活性化する物質を有効成分とす るインスリン産生促進用及びノ又はィンスリン含量増加用医薬組成物であれば全 て包含される。
なお、 インスリン産生及びインスリン含量の増加の確認は、 当業者に公知の方 法、 あるいは、 それを改良した方法を用いることにより実施することができる。 例えば、 スクリーニングツール用ポリべプチドを活性化する物質を糖尿病モデル 動物に連続投与し、 塍臓中のィンスリン m R N A又はィンスリンタンパク質の量 を測定することにより確認することができ、 更には、 前述の条件のもと、 常法に 従って随時血糖低下作用を確認することにより、 あるいは、 経口糖負荷試験後の 血糖上昇抑制作用の確認を行なうことによリ、 糖尿病治療効果の有無を判定する ことができる。
スクリーニングツール用ポリペプチドを活性化する物質 [例えば、 D N A、 タ ンパク質 （抗体又は抗体断片を含む） 、 ペプチド、 又はそれ以外の化合物] を有 効成分とする製剤は、 前記有効成分のタイプに応じて、 それらの製剤化に通常用 いられる薬理学上許容される担体、 賦形剤、 及び/又はその他の添加剤を用いて, 医薬組成物として調製することができる。 本発明には、 スクリーニングツール用 ポリべプチドを活性化する物質を、 インスリン産生促進及び Z又はインスリン含 量増加の必要な対象に、 有効量で投与する工程を含む、 インスリン産生促進及び 又はインスリン含量の増加方法が含まれる。 また、 本発明には、 スクリーニン グツール用ポリべプチドを活性化する物質の、 インスリン産生促進用及び Z又は インスリン含量増加用医薬組成物を製造するための使用が含まれる。
投与としては、 例えば、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 顆粒剤、 細粒剤、 散剤、 又 は経口用液剤などによる経口投与、 あるいは、 静注若しくは筋注などの注射剤、 坐剤、 経皮投与剤、 又は経粘膜投与剤などによる非経口投与を挙げることができ る。 特に胃で消化されるペプチドにあっては、 静注等の非経口投与が好ましい。 経口投与のための固体組成物においては、 1又はそれ以上の活性物質と、 少な くとも一つの不活性な希釈剤、 例えば、 乳糖、 マンニトール、 ブドウ糖、 微結晶 セルロース、 ヒドロキシプロピルセルロース、 デンプン、 又はポリビニルピロリ ドン、 メタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合することができる。 前記組 成物は、 常法に従って、 不活性な希釈剤以外の添加剤、 例えば、 滑沢剤、 崩壊剤, 安定化剤、 又は溶解若しくは溶解補助剤などを含有することができる。 錠剤又は 丸剤は、 必要によリ糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質などのフィルムで被覆す ることができる。
経口のための液体組成物は、 例えば、 乳濁剤、 溶液剤、 懸濁剤、 シロップ剤、 又はエリキシル剤を含むことができ、 一般的に用いられる不活性な希釈剤、 例え ば、 精製水又はエタノールを含むことができる。 前記組成物は、 不活性な希釈剤 以外の添加剤、 例えば、 湿潤剤、 懸濁剤、 甘味剤、 芳香剤、 又は防腐剤を含有す ることができる。
非経口のための注射剤としては、 無菌の水性若しくは非水性の溶液剤、 懸濁剤, 又は乳濁剤を含むことができる。 水溶性の溶液剤又は懸濁剤には、 希釈剤として, 例えば、 注射用蒸留水又は生理用食塩水などを含むことができる。 非水溶性の溶 液剤又は懸濁剤の希釈剤としては、 例えば、 プロピレングリコール、 ポリエチレ ングリコール、 植物油 （例えば、 オリ一ブ油） 、 アルコール類 （例えば、 ェタノ ール） 、 又はポリソルべ一ト 8 0等を含むことができる。 前記組成物は、 更に湿 潤剤、 乳化剤、 分散剤、 安定化剤、 溶解若しくは溶解補助剤、 又は防腐剤などを 含むことができる。 前記組成物は、 例えば、 バクテリア保留フィルターを通す濾 過、 殺菌剤の配合、 又は照射によって無菌化することができる。 また、 無菌の固 体組成物を製造し、 使用の際に、 無菌水又はその他の無菌用注射用媒体に溶解し, 使用することもできる。
投与量は、 有効成分の活性の強さ、 症状、 投与対象の年齢、 又は性別等を考慮 して、 適宜決定することができる。
例えば、 経口投与の場合、 その投与量は、 通常、 成人 （体重 6 O k gとして） において、 1曰につき約 0 . 1〜 1 0 O m g、 好ましくは 0 . "！〜 5 0 m gであ る。 非経口投与の場合、 注射剤の形では、 1 日につき 0 . 0 1〜5 0 m g、 好ま しくは 0 . 0 1〜"！ O m gである。 実施例
以下、 実施例によって本発明を具体的に説明するが、 これらは本発明の範囲を 限定するものではない。 なお、 特に断らない限り、 公知の方法 （"Molecular Cloning— A Laboratory annual , Gold Spring Harbor Laboratory, NY, 1982 等） に従って実施した。
実施例 1 ：配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるポリべプチドを含む発現 ベクターの製造
国際公開 W002/44362号パンフレツ卜の実施例 1に記載の手順に従って、 配列番 号 1で表される塩基配列を有する DN Aを取得し、 p E F— BOSプラスミドに 導入した （以下、 プラスミ ド p E F— BOS— N Aと称する） 。 次いで、 配列番 号 2で表されるアミノ酸配列からなるポリべプチドを発現させるために、 配列番 号 2で表されるアミノ酸配列からなるポリべプチドをコードする全長 DN Aを導 入した p E F— BOSシグナルシークェンスフラッグプラスミド （以下、 プラス ミド P E F— BOS SS F— NAと称する） を製造した。 これは、 目的とする ポリべプチドの N末端にシグナルシークェンスを付加することができる発現べク ターを用いることにより、 目的ポリべプチドを細胞膜に高頻度に発現させるため である。
実施例 2 ： ヒトインスリンプロモーターレポータープラスミドの構築
ヒトのインスリン遺伝子の 5 ' 発現制御領域は、 塩基配列が同定されておリ (Nature, 284, 26 - 32, 1980) 、 転写因子結合部位として知られる複数のシス (c i s) エレメントは、 マウスゃラッ卜のインスリン遺伝子の 5' 発現制御領 域にも共通に存在している （Diabetes, 44， 1002-1004, 1995) 。 これらの種を 越えて共通のシスエレメントを含み、 且つプロモーター活性を示すのに充分と考 えられる領域 （本実施例では、 ー342から +37の領域を使用した。 なお、 数 字の + 1は、 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 95， 11572-11577， 1998に示され た想定上の転写開始点を表す） を、 ヒトゲノム DN A (Cat. No. 6550-1；
Glontech社） を用いて 5' 側に H i n d i llサイ ト、 3' 側に N c o lサイトが できるようにしてポリメラーゼ連鎖反応 （PCR) により増幅し、 プラスミド p CR2. 1一 To p o (Cat. No. 455001 , ΤΑクローニングシステム；
Invitrogen社） にクローニングした。
具体的な P CRの増幅条件は次の通りである。 DNAポリメラーゼ （Ampl i Taq DNAポリメラーゼ； App I i ed B i osystems社） を用いて、 1サイクル当たり、 94°Cで 30秒間、 2本鎖 DN Aを熱変性し、 55°Cで 30秒間、 プライマーを 変性した 1本鎖 DNAにアニーリングさせ、 引き続き、 72°Cで 1分間、 DNA 伸長反応させた。 これを 30サイクル繰り返した。 P CRに用いたプライマー
[ I n s 1 7 ( ) 及び I n s 1 9 (h) ] の塩基配列を配列番号 5及び 6に示 す。
次に、 増幅断片がクローニングされたプラスミ ドを、 制限酵素 H i n d ill (宝酒造） 及び N c o I (宝酒造） を用いて消化することによりプラスミドから 増幅断片を切り出し、 ルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミ ド （Gat. No. 306- 04831, ルシフェラーゼベクター pGV- B2; 東洋インキ） のルシフェラーゼ遺伝子 の開始コドンの N c o Iサイトとその 5' 上流に位置する H i n d I IIサイ 卜と の間にクローニングした。 クローニングしたヒトインスリンプロモーターの塩基 配列は、 ジデォキシターミネ一ター （dideoxy terminator) 法により DNAシ一 クェンサー （ABI377 DNA Sequencer； Appl ied Bi osystems社） を用いて決定した ( 決定した塩基配列を配列番号 7に示す。
このようにして、 ヒトインスリンプロモーターレポータープラスミド p I n s -L u c 380 (以下、 プラスミ ド I n s P r oと称する） を構築した。 なお、 このプラスミドを細胞に導入し、 このプラスミドに含まれるインスリンプロモー ター部分が活性化されれば、 ルシフェラーゼ遺伝子が生合成される。 このルシフ ェラーゼ活性を測定することにより、 インスリンプロモーター活性を測定するこ とができる。
実施例 3 ：配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるポリぺプチドの過剰発現 によるインスリンプロモーターレポーター活性の変化
配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるポリべプチドのセカンドメッセン ジャーの 1つは、 c AMPであることが知られている （国際公開 W002/44362号パ ンフレツ卜の実施例 4参照） 。
本実施例では、 配列番号 2で表されるァミノ酸配列からなるポリべプチドの過 剰発現によるインスリンプロモーター活性に与える影響を検討した。
96穴プレー卜に、 マウス滕 iS細胞株 N I T 1細胞 （4X 104細胞 Zゥェ ル； ATGG : GRL- 2055) を播種し、 1 0%牛胎児血清 （FCS) を含む F— 1 2培 地中でー晚培養した後、 トランスフエクシヨン試薬 （FuGENE6; Boeringer Mannheim社） を用いて、 前記細胞にプラスミ ド p E F— B O S SS F— NA
(1 0 n g) と実施例 2で作製したプラスミド I n s P r o (1 n g)とを遺伝子 導入した。 なお、 コントロールとして、 プラスミド' p E F— BOS (コントロー ル用の空ベクター） とプラスミ ド I n s P r oとを遺伝子導入した。 遺伝子導入 した後、 更に 24時間培養し、 培地を吸引した後、 細胞溶解液 （細胞溶解液 LG β ；東洋インキ） で溶解し、 そのルシフヱラーゼ活性を、 市販の測定キット （ピ ッカジーン発光キッ卜；東洋インキ） 及び測定装置 （WIL3000 microtiter plate luminometer； Dynatech Laborator ies¾) を用しゝて測定した。
結果 （平均値土標準誤差， n = 4) を図 1に示す。 図 1に示すように、 プラス ミド p EF— BOS S S F— N Aを導入した細胞では、 プラスミド p EF— B OSを導入した細胞と比較して、 有意なインスリンプロモーター活性の上昇が確 認された。 スチューデントの t—テストによれば、 P = 0. 001 8であった。 従って、 配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるポリぺプチドを過剰発現さ せることにより、 すなわち、 活性化させることにより、 インスリンプロモーター 活性が上昇することが判明した。
以上の結果よリ、 配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるポリべプチドを 活性化してィンスリンプロモーター活性を上昇させることにより、 インスリン生 合成が増加し、 結果としてインスリン含量が増えると考えられた。 従って、 配列 番号 2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの 「ァゴ二スト」 は、 糖尿 病の予防及び 又は治療薬、 特には、 インスリン含量 （生合成） 増加薬となると 考えられた。 ここでいう Γァゴニスト」 とは、 配列番号 2で表されるアミノ酸配 列からなるポリペプチドのシグナルを増強させ、 配列番号 2で表されるアミノ酸 配列からなるポリペプチドの作用を増強させる、 すなわち、 このポリペプチドを 活性化させる、 物質の総称である。
実施例 4 ：細胞内 cAM P濃度の変化を指標とした、 配列番号 2で表されるアミ ノ酸配列からなるポリべプチドの活性を修飾する物質のスクリーニング
本実施例では、 宿主細胞として、 ヒ卜胎児腎臓由来 H EK293細胞にェプス タイン■バーウィルスの EBN A— 1遺伝子を導入した 293— EBN A細胞
(Invitrogen社) を使用した。
コラーゲンコートした 96穴プレートに 293— EBN A細胞 （ 1 X 1 04細 胞 ウエル） を播種し、 1 0%牛胎児血清 （FCS) を含むダルベッコ変法ィー ダル培地 （DMEM) 中で一晩培養した後、 トランスフエクシヨン試薬
(LIPOFECTA INE 2000； GIBGO BRL社) を用いて、 前記細胞にプラスミド p E F 一 BOS— N A又はプラスミド p E F— BOS (コントロール用の空ベクター） 0. 01 n gと p CRE— L u cベクター （GL0NTECH社） 5 n gとを遺伝子導入 した。 遺伝子導入した後、 更に 1 8〜20時間培養し、 培地で希釈した試験物質 を加え、 5%C02存在下、 37°Cで 5~6時間インキュベートした。 培地を吸 引し、 細胞溶解液 （細胞溶解液 LG j8 ；東洋インキ） で溶解した後、 そのルシフエ ラーゼ活性を、 市販の測定キット （ピツカジーン発光キット ；東洋インキ） 及び 測定装置 (ML3000 mi crot iter plate luminometer； Dynatech Laborator ies¾) を用いて測定した。
プラスミド p E F— B O Sを導入した細胞における試験物質処理によるレポ一 ター活性値の上昇に対し、 試験物質処理により、 プラスミド p E F— BOS— N Aを導入した細胞で 1. 5倍 （好ましくは 5倍） 以上のレポーター活性値の上昇 を確認することができれば、 配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるポリぺ プチドを活性化させる作用を有する化合物として選択することができる。 また、 配列番号 2で表されるァミノ酸配列からなるポリべプチドを発現させた細胞を用 いて、 試験物質処理後の細胞内 c AMP量を既存の方法によリ直接測定すること によつても試験物質の活性を測定することができる。
本実施例に記載の方法は、 実施例 5により選択される化合物が、 配列番号 2で 表されるァミノ酸配列からなるポリぺプチドを活性化する化合物であるか否かの 確認にも利用することができる。
実施例 5 ：インスリンプロモーターレポーター活性を指標としたスクリーニング 逢
配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるポリぺプチドを活性化する物質は, 前記ポリべプチドを発現していない細胞に、 配列番号 2で表されるアミノ酸配列 からなるポリべプチド及びプラスミド I n s P r oを導入し、 スクリーニングす ることも可能である。 また、 本実施例で示すように、 配列番号 2で表されるアミ ノ酸配列からなるポリべプチドに対応するマウス由来ポリべプチドが発現してい ることが知られている （国際公開 TO02/44362号パンフレツ卜の実施例 2及び 3参 照） 滕 細胞株にプラスミ ド I n s P r oを導入し、 化合物を評価することも可 能である。
本実施例に示すスクリニーング法は、 実施例 4で選択される化合物のインスリ ンプロモータ一活性増強作用の確認としても使用することができる。
マウス滕S細胞株 N I T 1 (4 X 1 04細胞） に、 トランスフエクシヨン試薬
(LIPOFECTAMINE 2000； GIBGO BRL社又は FuGEI€6; Boeringer Mannheim社) を用 いて、 実施例 2で作製したプラスミド I n s P r o (1〜1 0 n g) を導入し、 96穴プレートに播種した。 培地としては、 1 0%牛胎児血清 （FCS) を含む、 ダルベッコ変法イーグル培地 （DMEM) 又は F— 1 2培地を用いた。 播種後、 1 8〜 20時間培養し、 培地で希釈した試験物質を加え、 5%C02存在下、 3 7°Cで 24時間インキュベートした。 培地を吸引し、 細胞溶解液 （細胞溶解液 LG β ；東洋インキ） で溶解した後、 そのルシフェラーゼ活性を、 市販の測定キット
(ピツカジーン発光キット ；東洋インキ） 及び測定装置 （ML3000 microtiter plate luminometer; Dynatech Laboratories社) を用いて測定した。 試験物質処 理により、 コントロール （溶媒のみ） に対し有意なレポーター活性の上昇を確認 することができた場合、 インスリンプロモーター活性化作用を有する化合物と判 断することができる。 更に、 コントロール細胞として、 スクリーニングツール用 細胞の代わりに、 スクリ一ニングツール用ポリべプチドを発現していない細胞を 用いて同様の操作を行ない、 前記試験物質によりこれらのコントロール細胞では, インスリンプロモーターレポーター活性が上昇しない場合、 配列番号 2で表され るアミノ酸配列からなるポリペプチドを活性化する化合物として判断することが できる。
. 以上、 実施例 4又は実施例 5単独で、 あるいはこれらを組み合わせて行なうこ とにより、 配列番号 2で表されるァミノ酸配列からなるポリぺプチドを活性化さ せ、 インスリンプロモーター活性を上昇させる化合物を選択することができる。 実施例 6 ：細胞内 c AMP濃度の変化及びインスリンプロモーターレポーター活 性を指標とした、 配列番号 2で表されるァミノ酸配列からなるポリぺプチドの活 性を修飾する物質のスクリーニング
実施例 4に記載の方法で化合物スクリーニングを行った結果、 2— （ピリジン 一 4—ィル） ェチル チォベンゾエー卜 （LT- 1 Z 0059519； LaboTest社、 以下、 化合物 Aと称する） を取得することができた。 また、 細胞播種 3時間後に遺伝子 導入する点以外は実施例 4に準じて化合物スクリーニングを行った結果、 4一
{5-[ (E) 一 （1 , 3—ジェチルー 5—ォキソ一 2—チォキソイミダゾリジン 一 4一イリデン） メチル ]一 2—フリル } 安息香酸 （AN - 465/14458032； SPECS社, 以下、 化合物 Bと称する） 、 （2Z) -2, 3—ビス （3， 4—ジメ トキシフエ ニル） アクリロニトリル (J. Org. Chem. , 48, 4222-4232, 1983、 以下、 化合物 Cと称する） 、 4一 [ (Ε) 一 2— （3， 4ージメ トキシフエ二ル） ビニル] ピ リジン （BAS 1550277； ASINEX社、 以下、 化合物 Dと称する） 、 及び 5— { [4 - (3—メチルー 1， 2， 4一ォキサジァゾ一ルー 5—ィル） ベンジル] チォ } - 1 Η- 1 , 2, 4一トリァゾールー 3—ァミン （Η- 066028； SGIEXCH社、 以下, 化合物 Εと称する） を取得することができた。 各化合物 Α〜Εは、 それぞれ、 1 0 jumo I ZLで、 プラスミ ド p E F— B OSを導入した細胞におけるレポータ 一活性値の上昇に対し、 プラスミ ド p EF— BOS— NAを導入した細胞で、 化 合物 A、 化合物 D、 及び化合物 Eは 3倍以上、 化合物 B及び化合物 Cは 5倍以上 のレポータ一活性値の上昇を確認することができ、 配列番号 2で表されるァミノ 酸配列からなるポリぺプチドを活性化させる作用を有する化合物として選択した, 次に、 実施例 5に準じて化合物 Aから化合物 Eを評価した。 但し、 96穴プレ ートは、 コラーゲンコートされた 96穴プレートを使用し、 培地は、 DMEMを 用いた。 また、 化合物処理を化合物 Aは 31時間、 化合物 Bから化合物 Eは 24 時間行った。 結果 （平均値土標準誤差、 n = 6) を図 2及び図 3に示す。 化合物 A (30 /mo I ZL) 又は化合物 Bから化合物 E (いずれも 1 0〃mo l Z L) 処理群のレポーター活性値は、 いずれもコントロール （すなわち、 化合物濃 度 Ojumo I ZL群） のレポーター活性値よりも 1 · 5倍以上と有意に大きかつ た。 図 2及び図 3に示す記号 「* *」 は、 コントロール群 [すなわち、 化合物 A 00雇 1548
28 から化合物 E無添加群] に対する有意差が、 p<0. 01 (スチューデントの t 検定） であることを意味する。
以上、 配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるポリべプチドを活性化させ る化合物 Aから化合物 Eは、 インスリンプロモーター活性を上昇させること、 す なわち、 インスリン産生促進活性を有し、 インスリン含量を増加させることがわ かった。
参考例： S Dラット及び GKラットを用いた単回経口糖負荷試験
SDラット （4週齡； 日本クレア社） は、 ー晚絶食させ、 グルコース 2 gZk gを経口投与した。 なお、 グルコース負荷 5分前に、 化合物 A 1 0 Omg/k g を腹腔内投与 （に P. ) した。 グルコース負荷後、 0分間、 30分間、 60分 間、 及び 1 20分間経過後に適量採血し、 血糖値及び血漿中インスリン濃度の測 定に供した。
血糖値の測定には、 血液と 0. 33 mo I ZL過塩素酸とを混合 （血液： 0. 33mo I L過塩素酸 = 1 : 1 0) した後、 遠心分離 （3000 X g, 10分 間， 4°C) した上澄液を用いた。 血漿中インスリン濃度の測定には、 血液を遠心 分離 （3000 X g, 1 0分間， 4°C) した上澄液を用いた。 また、 血糖値の測 定には、 グルコース Cテストヮコー （Wa k o社） を用いた。 また、 血漿中イン スリン濃度の測定には、 ラット一インスリンアツセィシステム （Ame r s h a m社） を用いた。
結果を図 4及び図 5に示す。 図 4は、 グルコース経口負荷後の血漿中インスリ ン濃度 （単位 =n gZmし） の経時変化を示し、 図 5は、 グルコース経口負荷後 の血糖値 （単位 = mgZd L) の経時変化を示す。 図 4及び図 5に示す記号
Γ* J は、 化合物 A無添加群に対する有意差が、 p<0. 05 (スチューデント の t検定） であることを意味する。
図 4に示すように、 化合物 A 1 OOmgZk g投与により、 グルコース負荷後 30分間経過後において、 血漿中インスリン濃度の有意な上昇が認められた。 ま た、 グルコース負荷後 30分間経過後において、 化合物 A 1 0 OmgZk g投与 群で、 糖負荷による血糖値の上昇が有意に抑制された。
従って、 糖負荷 SDラットにおいて、 化合物 Aの血漿中インスリン量増加作用, P T/JP2003/011548
29 及び血糖低下作用が確認された。
次に、 GK (Go t o— Ka k i z a k i ) ラット （インスリン分泌不全 2型 糖尿病モデル、 7週齡； 日本チヤ一ルスリバ一社） を用いた単回経口糖負荷試験 を行なった。 なお、 GKラットは、 1975年東北大学医学部後藤由夫名誉教授 らによって、 W i s t a r系ラッ卜における経口糖負荷試験時の耐糖能の悪さを 指標に、 選択交配により確立された系統である。
経口糖負荷試験は、 化合物 Aを経口投与 （p. o. ) したこと以外は、 SDラ ッ卜の場合と同様に行なった。
グルコース経口負荷後の血糖値 （単位 =mgZd L) の経時変化を、 図 6に示 す。 図 6に示す記号 「*」 は、 化合物 A無添加群に対する有意差が、 p<0. 0 5 (スチューデントの t検定） であることを意味し、 記号 「* *」 は、 前記有意 差が p<0. 01であることを意味する。
図 6に示すように、 グルコース負荷後 30分間及び 60分間経過後において、 化合物 A 1 OOmgZk g投与により、 血糖値の上昇が有意に抑制され、 化合物 Aの有効性が糖尿病モデルラットでも確認できた。 産業上の利用可能性
本発明のスクリーニングツール又はスクリーニング方法によれば、 インスリン 産生を促進することのできるインスリン含量増加剤をスクリーニングすることが できる。 前記インスリン含量増加剤は、 糖尿病予防及び/又は治療に有効な物質 である。 配列表フリーテキスト
配列表の配列番号 5及び 6の配列で表される各塩基配列は、 人工的に合成した プライマー配列である。 以上、 本発明を特定の態様に沿って説明したが、 当業者に自明の変形や改良は 本発明の範囲に含まれる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . ( 1 ) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列又は配列番号 4で表されるァミノ 酸配列、 あるいは、 （2 ) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列又は配列番号 4で 表されるアミノ酸配列において、 1〜 1 5個のアミノ酸が欠失、 置換、 及び 又 は挿入されたアミノ酸配列を含み、 しかも、 活性化されることにより、 インスリ ン産生を促進する活性を示すポリべプチドからなる、 インスリン産生促進剤及び 又はィンスリン含量増加剤スクリーニングツール。
2 . 配列番号 2で表されるァミノ酸配列又は配列番号 4で表されるァミノ酸配列 を含み、 しかも、 活性化されることにより、 インスリン産生を促進する活性を示 すポリぺプチドからなる、 ィンスリン産生促進剤及び 又はィンスリン含量増加 剤スクリーニングツール。
3 . 配列番号 2で表されるアミノ酸配列又は配列番号 4で表されるアミノ酸配列 との相同性が 8 0 0/0以上であるアミノ酸配列からなリ、 活性化されることにより ィンスリン産生を促進する活性を示すポリべプチドからなる、 ィンスリン産生促 進剤及び 又はィンスリン含量増加剤スクリーニングツール。
4 . 配列番号 2で表されるァミノ酸配列又は配列番号 4で表されるァミノ酸配列 からなるポリぺプチドからなる、 インスリン産生促進剤及び 又はィンスリン含 量増加剤スクリーニングツール。
5 . 請求項 1〜 4のいずれか一項に記載のポリべプチドを発現している細胞から なる、 インスリン産生促進剤及び 又はインスリン含量増加剤スクリーニングッ ール。
6 . 請求項 1〜4のいずれか一項に記載のポリべプチド又は請求項 5に記載の細 胞の、 インスリン産生促進剤及び 又はインスリン含量増加剤スクリーニングの ための使用。
7 . 請求項 5に記載の細胞、 又はその細胞膜と、 試験物質とを接触させる工程、 及び請求項 1〜4のいずれか一項に記載のポリべプチドが活性化されるか否かを 分析する工程を含む、 ィンスリン産生促進剤及び 又はィンスリン含量増加剤ス クリーニング方法。
8. 請求項 5に記載の細胞、 又はその細胞膜と、 試験物質とを接触させる工程、 及び請求項 1 ~ 4のいずれか一項に記載のポリぺプチドが活性化されるか否かを 分析する工程、 並びに、 製剤化工程を含む、 インスリン産生促進用及び Z又はィ ンスリン含量増加用医薬組成物の製造方法。
9. 請求項 1〜4のいずれか一項に記載のポリべプチドを活性化する物質を有効 成分として含む、 ィンスリン産生促進剤及び Z又はィンスリン含量増加剤。
1 0. 請求項 1〜4のいずれか一項に記載のポリペプチドを活性化する物質を投 与することからなる、 インスリン産生促進及び 又はィンスリン含量増加方法。
1 1 . インスリン産生促進用及び 又はィンスリン含量増加用医薬組成物製造の ための、 請求項 1〜4のいずれか一項に記載のポリべプチドを活性化する物質の 使用。
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