WO2004029292A1 - Ｄｎａ回収法 - Google Patents

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WO2004029292A1
WO2004029292A1 PCT/JP2003/012214 JP0312214W WO2004029292A1 WO 2004029292 A1 WO2004029292 A1 WO 2004029292A1 JP 0312214 W JP0312214 W JP 0312214W WO 2004029292 A1 WO2004029292 A1 WO 2004029292A1
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primer
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pcr
cdna
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Katsuhisa Suzuki
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Aisin Seiki Co Ltd
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C12Q1/6855—Ligating adaptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/191—Modifications characterised by incorporating an adaptor

Definitions

  • the present invention relates to a method for recovering a target DNA fragment, and more particularly to a DNA recovery method for recovering a target cDNA fragment from a group of cDNA fragments in which various types of cDNA fragments are mixed.
  • a method of recovering a target cDNA fragment from a group of cDNA fragments using a slab gel for example, see Non-Patent Document 1). That is, for the group of cDNA fragments, for example, acrylamide gel electrophoresis is performed. Then, the cDNA fragment in the acrylamide gel is stained with ethidium gel, and the cDNA fragment is detected by illuminating the acrylamide gel with UV transilluminator. Then, an acrylamide gel containing the target cDNA fragment is cut out from the group of fractionated cDNA fragments, and the cDNA fragment is recovered from the gel.
  • a slab gel for example, see Non-Patent Document 1
  • acrylamide gel electrophoresis is performed for the group of cDNA fragments.
  • the cDNA fragment in the acrylamide gel is stained with ethidium gel, and the cDNA fragment is detected by illuminating the acrylamide gel with UV transilluminator.
  • a method of recovering a target cDNA fragment from a group of cMA fragments by using capillary electrophoresis for example, see Patent Documents 1 to 3. That is, a group of c A fragments that have been fluorescently labeled in advance is applied to a capillary column and subjected to electrophoresis. Then, based on the detected peak, estimate the time at which the target cDNA fragment is migrated. Next, electrophoresis is performed again with a cantilever ram, and the target cDNA fragment is recovered based on the estimated time.
  • Patent Document 1 JP2003 / 012214
  • the recovered cDNA fragment may contain a cDNA fragment of almost the same length as the target product in addition to the target cDNA fragment.
  • the collected cDNA fragments may contain non-target substances, or the recovery rate of the target cDNA fragments may decrease. Invite them.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and provides a DNA recovery method capable of more reliably recovering a target cDNA fragment from a group of cDNA fragments in which various types of cMA fragments are mixed. With the goal. Disclosure of the invention
  • a solution for achieving the above object is to provide a group of cDNA fragments having a first adapter sequence at one end and a second adapter sequence at the other end, having a sequence complementary to the first adapter sequence and labeling the group.
  • a first PCR step of performing a PCR reaction using a first primer having a substance and a second primer having a sequence complementary to the second adapter sequence, and the first PCR step An electrophoresis step of performing gel electrophoresis on a group of cDNA fragments amplified in step 2, and a recovery step of cutting out the gel containing the desired cDNA fragment from the gel based on the results of the above electrophoresis step and recovering the cDNA fragment.
  • a DNA recovery method comprising:
  • the DNA recovery method of the present invention is a method for recovering a target cDNA fragment from a group of cDNA fragments having one adapter sequence at both ends.
  • a first primer having a sequence complementary to the first adapter sequence at one end of the cDNA fragment and having a labeling substance, and a sequence complementary to the second adapter sequence at the other end of the cDNA fragment
  • a PCR reaction is performed using the second primer.
  • the group of amplified cDNA fragments (PCR products) is subjected to gel electrophoresis.
  • cut out a gel containing the desired cDNA fragment from the gel and recover the cDNA fragment therefrom.
  • the group of cDNA fragments is subjected to a PCR reaction before the gel electrophoresis, so that the group of cDNA fragments can be amplified in a large amount. Therefore, even if the cDNA fragment of interest is at a low concentration, it can be greatly amplified and detected by gel electrophoresis.
  • the PCR product since a primer having a labeling substance is used, the PCR product also has a labeling substance. Therefore, even if the amount of the target cDNA fragment is still relatively small even after the PCR reaction, the position of the target cDNA fragment in the gel can be easily determined by recognizing this labeling substance in electrophoresis. Can be detected.
  • the size resolution can be improved as compared with, for example, electrophoresis using a capillary column, and only the target cDNA fragment can be recovered more specifically.
  • the group of cDNA fragments composed of various cMA fragments to be used as a sample is not particularly limited as long as it has a first adapter sequence at one end and a second adapter sequence at the other end. Good. That is, regardless of the origin of the cDNA fragment, it may be prepared from BRNA extracted from animal or plant cells, or may be prepared from mRNA extracted from viruses or microorganisms.
  • the group of cDNA fragments may be a group containing almost all genes expressed in the cells used for extraction, or a group containing only a part of the expressed genes.
  • the cDNA fragment may be a full-length cDNA having an adapter sequence at both ends, or a fragment forming a part of the full-length cDNA having an adapter sequence at both ends.
  • the first adapter sequence and the second adapter sequence may be composed of any base sequence, but are preferably designed in consideration of PCR efficiency and the like. That is, when each of these adapter sequences has about 15 bases, a stable PCR reaction can be performed, and a cDNA fragment can be efficiently amplified.
  • the first primer may be any primer as long as it has a sequence complementary to the first adapter sequence and has a labeling substance.
  • complementary sequence as used herein is not limited to a sequence that is 100% complementary to the first adapter sequence, but is a sequence that is substantially complementary to the extent that a cDNA fragment can be amplified in a PCR reaction. Is also included.
  • the first primer is not limited to a sequence consisting of only the sequence complementary to the first sequence of the first adapter, but may be a sequence complementary to the sequence of the first sequence of the first adapter and further to another sequence. You may.
  • the first primer is not limited to one corresponding to the entire first adapter sequence, and may be one corresponding to a part of the first adapter single sequence.
  • any labeling substance can be used as long as it has high detection sensitivity in gel electrophoresis.
  • 6-carboxyfluorescein hereinafter referred to as FAM
  • HEX 4,7,2,4,5,7,7-hexaclo-6-carboxyfluorescein
  • Rox 6-carboxy-X-rhodamine
  • the second primer may be any as long as it has a sequence complementary to the second adapter sequence.
  • the complementary sequence referred to here is not limited to a sequence 100% complementary to the sequence of the second adapter.
  • the second primer is not limited to a sequence consisting only of a sequence complementary to the second adapter sequence, and may be a sequence consisting of a sequence complementary to the second adapter sequence and another sequence connected thereto. Good. Also, the second primer is not limited to one corresponding to the entire second adapter sequence, and may be one corresponding to a part of the second adapter sequence. Further, the above-mentioned labeling substance may be bound to not only the above-mentioned first primer but also this second primer.
  • ⁇ DNA polymerase is not permanently inactivated even if it is heated for a short time to the high temperature used to denature the MA chain in the PCR reaction. Further, those having activity at a high temperature are preferable.
  • Samococcus litoralis ⁇ Bacillus'Stearothermophilus', Methanosa 'Methannthernm fervidus, Samr's aquatics (Thermus agnations ⁇ ) T. flavus (T.fla), T. lacteus (T. rubens (Tn) bens), T. ruba (T.
  • DNA polymerases derived from Thermus' Aquatakes Hifi miiaaaMtiiuis) (Taq DNA polymerase) and ThermoTococcus litoralis (TherTnococc s) are available for reasons such as availability. It is preferable to use MA polymerase derived from P. litoralis or DNA polymerase derived from Pyrococcus kodakaraensis.
  • an antibody specific to DNA polymerase may be mixed with the PCR reaction solution in order to inhibit the activity before nucleic acid amplification by MA polymerase.
  • Such antibodies include monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, recombinantly produced antibodies, and chemically or recombinantly produced antibody fragments (eg, Fab fragments).
  • monoclonal antibodies is particularly preferred.
  • a known monoclonal antibody against Taq DNA polymerase is about 20 ° C to 40 ° C. In C, it can inhibit the enzymatic activity of Taq DNA polymerase and is inactivated by high temperatures in the thermal cycle of PCR.
  • PCR reaction is generally performed in the presence of four types of dNTPs, namely, dATP, dCTP, dGTP, and dTTP.
  • the PC & reaction is generally performed in a reaction solution containing a suitable buffer. This is for efficiently amplifying the nucleic acid.
  • the buffer can be appropriately changed depending on the DNA polymerase to be used and the like in order to obtain optimal conditions for the reaction.
  • a buffer solution obtained by adding potassium chloride or magnesium chloride to a tris-based buffer solution whose pH has been appropriately adjusted can be used.
  • the cDNA fragment (PCR product) is electrophoresed by known plate gel electrophoresis such as acrylamide gel electrophoresis agarose gel electrophoresis, and the cDNA fragment is fractionated.
  • a known electrophoresis apparatus may be used for electrophoresis.
  • any method can be used as long as the gel containing the cDNA fragment of interest is cut out from the gel based on the result of the electrophoresis step and the MA fragment is recovered.
  • the cDNA fragment is subjected to a DNA sequencer capable of detecting a labeling substance, and the electrophoresis step is performed. From the analysis results, determine the cDNA fragment to be recovered. Next, the same sample is electrophoresed again, and when the target cDNA fragment is detected, a gel of that portion is cut out and the cDNA fragment is recovered therefrom.
  • the gel After the gel electrophoresis, the gel is placed on a scanner that can detect the labeling substance, and the cDNA fragment to be recovered is determined from the analysis results. Then, a method of cutting out the gel of the part and recovering the cDNA fragment therefrom can be mentioned.
  • a group of cDNA fragments having an adapter sequence at both ends can be prepared, for example, as follows.
  • a step of synthesizing a cDNA fragment having a tag substance added to its 5 ′ end from mMA extracted from cells a step of cleaving the obtained cDNA fragment with a first restriction enzyme, Recovering a cDNA fragment having a tag substance by binding a high-affinity substance having high affinity to the tag substance, and adding the sequence of the enzyme cleavage site of the first restriction enzyme to the recovered cDNA fragment.
  • Second sequence with a sequence complementary to the sequence A method comprising the steps of: binding an adapter sequence, and preparing a group of cDNA fragments having adapter sequences at both ends. .
  • a primer one to have a NN is any sequence of two bases on and its 3 3 terminus a sequence complementary to the first adapter one sequence, the second adapter
  • the above-described group of cDNA fragments can be reduced to a small scale. It can be classified into a group of cMA fragments.
  • a group of cDNA fragments is prepared by such a method, almost all expressed genes, that is, both known and unknown genes, can be included in the group as well. It is possible. Therefore, it can be effectively used in gene analysis and the like.
  • the group of cMA fragments can be classified into a plurality of small groups to facilitate analysis.
  • the tag substance and the high-affinity substance having a high affinity for the tag substance refer to substances forming a binding pair capable of specifically binding to each other with high affinity.
  • Examples of combinations of tag substances and high affinity substances include biotin and streptavidin, biotin and avidin, FIGT and FITC antibodies, DIG and antitai DIG, protein A and mouse IgG, latex particles, etc. No. In each combination, either one may be used as the evening substance or any of them may be used as the high affinity substance.
  • a restriction enzyme is an enzyme generally called a restriction endonuclease, which is an enzyme that hydrolyzes and cuts double-stranded DNA at a specific sequence.
  • first and second restriction enzymes are used in combination to obtain an appropriate fragment.
  • the restriction enzyme used is preferably one capable of cleaving a cDNA fragment into fragments having a discernable length. Enzymes that cut more, preferably almost all, of the synthesized cDNA fragments are preferred.
  • a 4-base recognition enzyme or a 6-base recognition enzyme may be used, but in particular, the use of a 4-base recognition enzyme is preferred for the above reasons.
  • the adapter sequence is used to bind the primer used for PCR amplification, and is designed according to the restriction enzyme used. That is, the first adapter sequence for binding to the enzyme cleavage site of the first restriction enzyme has a sequence complementary to the enzyme cleavage site of the first restriction enzyme, and binds to the enzyme cleavage site of the second restriction enzyme.
  • the second adapter sequence has a sequence complementary to the enzyme cleavage site of the second restriction enzyme.
  • the primer set consists of a set of primers used to amplify cDNA fragments by PCII.
  • Any two-base sequence used here NN is a sequence arbitrarily selected from A, T, G, and C.
  • the reason that each arbitrary sequence is set to 2 bases is a result in consideration of the simplicity and analysis accuracy of the method. That is, by setting each arbitrary sequence to 2 bases, a maximum of 256 types of primer sets can be obtained, so that the group of cMA fragments can be classified into a plurality of groups.
  • the arbitrary two-base sequence NN can be three or more bases for one primer or both primers. As a result, the types of primers are increased, and the number of primer sets can be set to a maximum of 104 or a maximum of 496.
  • the cDNA fragment recovered in the recovery step is characterized in that a third primer having a sequence complementary to the first adapter sequence and a second adapter sequence are provided. It is preferable to use a fourth primer having a sequence complementary to the above, and provide a second PCR step in which a PCR reaction is performed again using a fourth primer.
  • the present invention includes a second PCR step for performing a PCR reaction again on the cDNA fragment recovered in the recovery step. Therefore, even if the recovered cDNA fragment is only a small amount, it can be greatly amplified.
  • the third primer used in this PCR step may be any as long as it has a sequence complementary to the first adapter sequence.
  • the above-mentioned first primer may be used.
  • the fourth primer has only to have a sequence complementary to the second adapter sequence.
  • the above-mentioned second primer may be used.
  • a RecA protein and a protein obtained by modifying the RecA protein, the modified RecA protein having a function similar to the RecA protein it is preferable to use an A-recovery method characterized in that a homologous recombinant protein containing at least one of the above-mentioned components is mixed with a reaction solution and PCil is performed.
  • a homologous recombinant protein such as RecA protein is mixed with a reaction solution, PCR is performed, and the recovered cMA fragment is amplified.
  • amplification of by-products non-specific PCR products
  • the presence of the above homologous recombinant protein inhibits the primer from binding to the non-specific region of the cDNA fragment and initiating the primer extension reaction, thereby amplifying the non-specific PCR product. Can be suppressed.
  • the recovered cDM fragment can be specifically amplified even when the temperature conditions of the primer extension reaction such as the annealing temperature are changed. That is, in the conventional PCR method, if the temperature of the primer extension reaction such as the annealing temperature is set low, not only the recovered cMA fragment but also by-products will be amplified in a large amount. Thus, the recovered cDNA fragment can be more specifically amplified.
  • the target cDNA fragment can be more reliably recovered.
  • the above homologous recombinant protein is at least one of a RecA protein and a modified RecA protein, which is a modified RecA protein and has a function similar to that of the HecA protein.
  • the modified RecA protein is, for example, a product of a gene created by site-specific displacement induction or the like from a gene encoding the RecA protein, wherein one or several amino acids are deleted, substituted or added. Examples include those comprising a sequence and having a function similar to that of the RecA protein. Further, it may be a protein fragment of the RecA protein having a function similar to that of protein (RecA fragment).
  • RecA protein and the like are not permanently inactivated even when heated to a high temperature for denaturing a DNA strand in a PCR reaction for a short time, and have activity at a high temperature, similarly to the DNA polymerase described above. Those are preferred. For example, it is preferable to use RecA protein derived from Escherichia coli (R. coli) for reasons such as availability.
  • the above homologous recombination protein It is preferable to mix in the range of 1 ng to 100 ng. By performing PCR in such a range, the cDNA fragment can be more efficiently and specifically amplified.
  • the cDNA fragment may be added to plasmid DNA. It is preferable to provide a DNA recovery method characterized by comprising: a connecting step of forming a recombinant plasmid by linking to a recombinant plasmid; and an introducing step of introducing the recombinant plasmid into Escherichia coli.
  • the target cDNA fragment is converted into a plasmid.
  • the method further includes an introduction step of introducing the recombinant plasmid into Escherichia coli.
  • ligating the recovered cDNA fragment to a plasmid vector and introducing it into Escherichia coli is effective for analyzing the structure of the cDNA fragment. That is, if the transformed Escherichia coli is cultured and a plasmid DNA having a cDNA fragment is extracted therefrom, it can be used for structural analysis such as determination of a base sequence.
  • FIG. 1 is an explanatory diagram showing an outline of a method for preparing a cDNA fragment group serving as a sample for recovering a cDNA fragment of interest in Example 1
  • FIG. 3 is an explanatory diagram showing details of a method for preparing a cDNA fragment group serving as a sample for recovering a target cDNA fragment
  • FIG. 3 is an explanatory diagram relating to Example 1, where A is the first adapter sequence
  • B is an explanatory diagram showing a second adapter sequence.
  • FIG. 4 is an explanatory view showing the sequence of a primer set for classifying into 256 kinds of cDNA fragments in Example 1.
  • FIG. 5 shows that the cDNA fragment of interest was It is explanatory drawing which shows the collection
  • FIG. 6 is a photograph showing a result of electrophoresis of a group of cMA fragments amplified by RT-PCR in Example 3, which is replaced with a drawing.
  • genes expressed in specific cells are classified as follows. First, a cDNA group is synthesized from the extracted mRNA. Then, the obtained cDNA group is digested with two appropriate restriction enzymes, and an adapter sequence is ligated at both ends to have a discernible length and one adapter sequence at both ends. Create a group of cDNA fragments. Thereafter, the obtained groups of cDNA fragments are classified into a plurality of groups using a plurality of types of primer sets.
  • Group 2 of cDNA is synthesized by a known method. This is cleaved with two appropriate restriction enzymes to obtain group 3 of cMA fragments. Then, the cDNA fragment group 3 is classified according to the sequence of 2 bases at both ends of the cDNA fragment, that is, 4 bases in total, that is, whether the 4 bases are A, T, G, or C. For example, by distinguishing the base at the 5 'end (shown in black in FIG. 1), group 3 can be classified into four types of group 4. Then, by distinguishing the second base (shown in black in Fig. 1), Group 4 can be classified into four types of Group 5.
  • group 5 can be classified into four types of group 6 each.
  • group 6 can be classified into four types of group 7 each.
  • a method for preparing a group 7 of a plurality of cDNA fragments from the extracted mMA group 1 will be specifically described with reference to FIG.
  • Each key in Fig. 2 Luffet indicates bases constituting the base sequence, N, M, W, X, Y and ⁇ indicate arbitrary bases, and X and ⁇ and W and ⁇ bind to each other complementarily.
  • iiRNA11 is extracted from a specific cell to be tested (by a known method).
  • 20 g of total mRNA 11 was extracted from yeast using a Fast Track 2.0 kit (manufactured by Invitrogen).
  • Oligo dT primer complementary to the poly A till at the 3 'end of the extracted mAl 1 is labeled with biotin (tag substance) 13.
  • biotin tag substance
  • cDNA12 is synthesized using this as a primer.
  • the extracted 20 mRNAs 11 were mixed with 100 pmole of 5, -pyotinated oligo dT-Blimer-1 (manufactured by BRL) in 0.81 for 5 minutes at 65 ° C. It was inked. Subsequently, after cooling it in water, the final concentration of 5 mM MgC, 0.5 mM dNTP mix (manufactured by BRL) and 10 mM DTT (reverse transcription buffer 20.0 / 1) were used.
  • BRL RNA was incubated at 42 ° C for 60 minutes. Subsequently, a final concentration of 0.27 mM dNTP mix (BRL) and 1.33 mM DTT (BRL) in a double-stranded synthetic buffer 150. 2.0 units of iLjiali ligase (BRL), 40.0 units of iLilliDNA polymerase (BRL) and 2.0 units of RNaseH (BRL) for 120 minutes at 16 ° C The reaction was stopped by incubating at 70 ° C for 15 minutes.
  • BTL iLjiali ligase
  • BRL iLilliDNA polymerase
  • RNaseH RNaseH
  • the synthesized cDNA12 is cleaved using a first restriction enzyme.
  • a restriction enzyme Mspl manufactured by Takara Shuzo
  • Mspl is a 4-base recognition restriction enzyme.
  • the cMA fragment was purified by a known method using ethanol.
  • streptavidin (high-affinity substance) 14 is used to capture biotin 13 and only the 3 'end of the cleaved cDNA fragment is recovered. Specifically, streptavidin 14 (manufactured by Dinal) immobilized on magnetic beads in the reaction solution was combined with biotin 13 to obtain a product.
  • FIG. 3A shows the first adapter arrangement 15 used in this embodiment. Specifically, in 5.01 T4 DNA ligase buffer, the first adapter of 5.0 jug having a CG protruding end (ie, a sequence complementary to the cleavage fragment site of restriction enzyme MspI) ( Ligation was performed using 10 units of T4 DNA ligase (manufactured by BRL) and 10 units.
  • the cDNA fragment is cut with a second restriction enzyme.
  • a restriction enzyme Msel manufactured by NEB
  • Msel is also a 4-base recognition restriction enzyme.
  • the cDNA fragment was purified by a known method using ethanol.
  • biotin 13 is captured using streptavidin 14, the 3 'end of the cleaved cDNA fragment is removed, and the 5' end of the cleaved cDNA fragment is recovered.
  • FIG. 3B shows the second adapter arrangement 16 used in the present embodiment.
  • a second adapter sequence of 1 pmole having a TA-protruding end ie, a sequence complementary to a cleavage site of a restriction enzyme Msel
  • a 10 ⁇ 1 T4 MA ligase buffer. BRL
  • 10 units of T4 DNA ligase were used for ligation.
  • a PCR reaction is performed on one group of the cDNA fragments using the primer set.
  • this primer set as shown in FIG. 4A, a sequence complementary to the first adapter sequence and a sequence of two more bases in the amplification direction (indicated by NN in FIG. 4).
  • FIG. 4B a primer having a sequence complementary to the sequence of the second adapter, and a primer having a sequence of two more bases in the amplification direction (shown by a thigh in FIG. 4).
  • the two bases added in the direction of amplification of each primer are designed by all combinations of four types of bases, A, T and GC, a maximum of 256 types of primer sets can be obtained. Conceivable. Therefore, by performing PCR on the group of cDNA fragments 17 using these primer sets, it is possible to perform grouping into a plurality of groups of cDNA fragments 18 and perform PCR amplification.
  • PCR may be performed by a known method.
  • the group of a plurality of types of cDNA fragments 18 obtained as described above can be used as a sample for recovering a target cDNA fragment in the present example.
  • the group of small-scale cDNA fragments sampled in this example was classified using a primer consisting of oligonucleotide 1 and a primer consisting of oligonucleotide 2. .
  • the first primer having a sequence complementary to the first adapter sequence 15 and having a labeling substance bound thereto
  • Amplification is performed by PCR using a second primer having a sequence complementary to the adapter sequence (16).
  • a PCR reaction was performed using a second primer consisting of the above oligonucleotide 2 having a sequence complementary to the adapter sequence 16.
  • the first and second primers may be synthesized by known methods.
  • the PCR reaction was carried out using GeneAmp 2400 manufactured by PerkinElmer Inc. PCR conditions were performed by Stepdown PCR (see Biotechniques, 1996, 20: 478-485).
  • the enzyme (DNA polymerase) used was KOD Dash enzyme manufactured by Toyobo. This DNA polymerase is derived from Pyrococcus kodakaraensis QDlfefe.
  • the composition of the reaction solution was in accordance with the attached manual.
  • gel electrophoresis is performed on the amplified cDNA fragment group 22 (PCR product).
  • the amplified cDNA fragment group 22 was tested on a DNA sequencer (LIC-4200L (S) -1) manufactured by LI-C0R, which can read fluorescent dyes, and acrylamide was used for size fractionation. Degel electrophoresis was performed. The composition of acrylamide gel 23 was in accordance with the manual attached to the above-mentioned DNA sequencer.
  • a gel containing the desired cDNA fragment 24 is cut out from the gel based on the result of the electrophoresis step, and the cDNA fragment 24 is recovered.
  • the cMA fragment 24 to be extracted was determined from the results of acrylamide gel electrophoresis analysis.
  • the 0 ⁇ fragment 24 is derived from a known gene, A gene, and has a length of 202 bp (including both adapter sequences).
  • the same sample was subjected to acrylamide gel electrophoresis again, and as soon as the desired cDNA fragment 24 appeared on the analysis screen, the electrophoresis was terminated, and the gel at the portion of the detector that was irradiated by the laser was cut out. .
  • the excised acrylamide gel was reacted in a buffer at 65 ° C. overnight, and cDNA fragment 24 was recovered from the acrylamide gel.
  • a kit EZNA Poly-Gel DNA extraction kit manufactured by Omega Bio-tek was used.
  • the recovered cDNA fragment 24 was combined with a third primer having a sequence complementary to the first adapter sequence 15 and a second primer sequence 16
  • the PCR reaction is performed again using the fourth primer having a complementary sequence.
  • a third primer having a sequence complementary to the first adapter sequence and a sequence of a restriction enzyme Not I site is provided on the forward side and complementary to the second adapter sequence on the reverse side.
  • PCR was carried out using a fourth primer having a specific sequence and a sequence of a restriction enzyme Spel site.
  • the third primer consists of oligonucleotide 3
  • the fourth primer consists of oligonucleotide 4.
  • the PCR reaction was carried out under the conditions of Stepdown PCR (Biotechniques, 1996, 20: 478-485) using GeneAmp 2400 manufactured by PerkinElmer Inc.
  • the enzyme (DNA polymerase) used was KOD Dash enzyme manufactured by Toyobo.
  • the composition of the reaction solution was in accordance with the attached manual.
  • the product of cDNA fragment 24 amplified in the second PCR step is ligated to plasmid vector 125 to form recombinant plasmid 26.
  • the amplified cDNA fragment 24 was treated with restriction enzymes Not I and Spe I, ligated to plasmid vector 25 (pbluescriptll) 25, and the recombinant plasmid 26 was ligated. Formed. This connection was performed using Takara Shuzo's Reige Syon Kit ver. 2 according to the attached manual.
  • the recombinant plasmid 26 is introduced into E. coli.
  • E. coli DH5 strain was used as a competent cell, and recombinant plasmid 26 was introduced into E. coli by a known method.
  • the desired cDNA fragment 24 can be more reliably recovered from the group 21 of cDNA fragments.
  • the first primer- ⁇ fourth primer used had a slightly different base sequence. Specifically, to recover the cDNA fragment derived from the B gene, oligonucleotide 5 was used as the first primer, oligonucleotide 6 was used as the second primer, oligonucleotide 7 was used as the third primer, and the fourth primer was used. The oligonucleotide 8 was used as —.
  • oligonucleotide 9 was used as the first primer
  • oligonucleotide 10 was used as the second primer
  • oligonucleotide 11 was used as the third primer
  • primer 4 was used as the fourth primer
  • Oligonucleotide 12 was used as one.
  • oligonucleotide 13 was used as the first primer and oligonucleotide 1 was used as the second primer.
  • oligonucleotide 15 as the fourth primer
  • Oligonucleotide 16 was used as —.
  • Oligonucleide 10 5, -acgactgtagtccaagtaagg-3 5
  • a recombinant plasmid was extracted from the transformed E. coli by a known method. The extraction of this plasmid was performed on multiple colonies. Then, for each of the extracted recombinant plasmids, the nucleotide sequence of the integrated cDNA fragment was determined. Such gene analysis was similarly performed on each cDNA fragment derived from gene A to gene D. The results are shown in Table 1. The numbers in parentheses indicate the length of each cDNA fragment (including one sequence for both adapters).
  • the target cDNA fragment is recovered from the group of cDNA fragments according to the method of the present example, the target cDNA fragment can be recovered more reliably.
  • a PCR reaction is performed in advance on a group of selected cDNA fragments, so that the group of cDNA fragments can be amplified in a large amount. Therefore, even if the target cDNA fragment is at a low concentration, it can be greatly amplified, and it can be detected by gel electrophoresis.
  • the PCR product since a primer having a labeling substance is used, the PCR product also contains the labeling substance. Therefore, even if the target cDNA fragment is small, the position of the target cDNA fragment in the gel can be easily detected by recognizing this labeling substance in electrophoresis. Furthermore, since the group of cDNA fragments is fractionated by gel electrophoresis, the size resolution can be improved as compared to, for example, electrophoresis using a capillary column, and only the desired cMA fragment can be recovered more specifically.
  • first adapter sequence and the second adapter sequence each have about 15 bases, a stable PCR reaction can be performed, and a cDNA fragment can be efficiently amplified.
  • the near-infrared fluorescent dye IRD-800 which is a fluorescent substance
  • the detection sensitivity of cDNA fragments in gel electrophoresis can be improved.
  • the present example includes a second PCR step of performing a PCR reaction again on the cDNA fragment recovered in the recovery step. For this reason, a small amount of the recovered cDNA fragment If not, it can be greatly amplified.
  • the cMA fragment was ligated to plasmid reagent to form a recombinant plasmid, and this recombinant plasmid was introduced into E. coli. And an introduction step. Therefore, it is effective when analyzing the structure of a cMA fragment. That is, if the transformed Escherichia coli is cultured, and plasmid MA having a cDNA fragment is extracted therefrom, it can be easily used for structural analysis (for example, determination of a base sequence).
  • acrylamide gel electrophoresis was performed in the same manner as in Example 1 above. Then, instead of electrophoresing the same sample again, the gel that had been electrophoresed first was peeled off from the gel plate using filter paper. Subsequently, the gel attached to the filter paper was placed on a scanner capable of detecting a fluorescent dye, and the entire gel was imaged. By doing so, it was possible to accurately collect only the gel containing the cDNA fragment even at a lower concentration of the cDNA fragment.
  • the recombinant plasmid was extracted from the transformed E. coli by a known method, and the nucleotide sequence of the inserted cDNA fragment was determined. Were determined. Such gene analysis was similarly performed on the cDNA fragment derived from gene E.
  • the first primer and the fourth primer used had slightly different base sequences. Specifically, oligonucleotide 17 is used as the first primer, oligonucleotide 18 is used as the second primer, oligonucleotide 19 is used as the third primer, and oligonucleotide 20 is used as the fourth primer. It was used.
  • the target cDNA fragment when the target cDNA fragment is recovered from the group of cDNA fragments according to the method of this example, the target cDNA fragment can be recovered more reliably than in the method of Example 1 above. .
  • Examples 1 and 2 a cDNA fragment derived from a known gene was recovered and analyzed. In this example, a cDNA fragment derived from an unknown gene was recovered and analyzed. When analyzing cDNA fragments from unknown genes, there are two methods to determine whether the recovered cDNA fragments are the ones of interest o
  • the length of the target cDNA fragment can be accurately determined, for example, the length of the target cDNA fragment and the length of the marker match. In such a case, determine whether or not the cDNA fragment is the target cDNA fragment based on the length of the collected and analyzed cDNA fragment.
  • the connecting step and the introducing step were performed in the same manner as in Examples 1 and 2.
  • the first primer used in the first PCR step is composed of oligonucleotide 21 and the second primer is composed of oligonucleotide 22.
  • the third primer used in the second PCR step is composed of oligonucleotide 23, and the fourth primer is composed of oligonucleotide 24.
  • the recombinant plasmid was extracted from the transformed E. coli by a known method, and the nucleotide sequence of the inserted cDNA fragment was determined.
  • the cDNA fragment is a target cDNA fragment. If the length of the nucleotide sequence is not 200 bp, the target cDNA fragment is not. I decided not to.
  • the PCR reaction was performed only with DNA polymerase (KOD Dash) without adding the RecA protein, and the other steps were performed as described above. The rates were investigated.
  • the PCR reaction was performed by adding iSci protein (single strand DNA binding protein) of iLciili instead of the RecA protein, and the other steps were the same as above. Then, the recovery rate of the target cDNA fragment was investigated.
  • iSci protein single strand DNA binding protein
  • the RecA protein is mixed with the reaction solution, and PCR is performed to amplify a group of cDNA fragments.
  • amplification of by-products can be kept low without reducing the yield of the group of cDNA fragments. That is, the presence of the homologous recombinant protein suppresses the primer from binding to the non-specific region of the cDNA fragment and initiating the primer extension reaction. Can be suppressed.
  • a group of cDNA fragments can be specifically amplified even when the temperature conditions of the primer extension reaction such as the annealing temperature are changed. That is, in the conventional PCR method, when the temperature of the primer extension reaction such as the annealing temperature is set low, not only the group of cDNA fragments but also by-products are amplified in large amounts. For example, a group of cDNA fragments can be more specifically amplified.
  • the desired cDNA fragment can be more reliably recovered.
  • the RecA protein is mixed in a range of 1 ng to 100 ng per primer per 20 pmol, so that the cDNA fragment can be more efficiently and specifically amplified. Can be.
  • a cDNA fragment of about 230 bp in length was focused on and used as a cDNA fragment to be recovered. Thereafter, the target cDNA fragment was recovered in the same manner as in Example 1 above.
  • the connecting step and the introducing step were performed in the same manner as in Examples 1 and 2.
  • the first primer used in the first PCR step was composed of oligonucleotide 25, and the second primer was composed of oligonucleotide 26.
  • the third primer used in the second PCR step is composed of oligonucleotide 27, and the fourth primer is composed of oligonucleotide 28.
  • the recombinant plasmid was extracted from the transformed Escherichia coli by a known method, and the nucleotide sequence of the inserted cDNA fragment was determined. Then, a set of primers was prepared based on the nucleotide sequence of the cDNA fragment with high recovery. These primers consist of oligonucleotides 29 and oligonucleotides 30.
  • an MA recovery method capable of more reliably recovering a desired cDNA fragment from a group of cDNA fragments in which various types of cMA fragments are mixed. Can be.

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Abstract

　様々な種類のcDNA断片が混在するcDNA断片の群から目的とするcDNA断片をより確実に回収することができるDNA回収法を提供することを目的とする。DNA回収法は、一端に第１アダプター配列を有し他端に第２アダプター配列を有するcDNA断片の群について、第１アダプター配列に相補的な配列を有すると共に標識物質を有する第１プライマーと、第２アダプター配列に相補的な配列を有する第２プライマーとを用いて、PCR反応を行う第１PCR工程を備える。また、第１PCR工程で増幅されたcDNA断片の群についてゲル電気泳動を行う電気泳動工程と、電気泳動の結果に基づいて、ゲルから目的のcDNA断片を含むゲルを切り出し、当該cDNA断片を回収する回収工程とを備える。

Description

明 細 書
D N A回収法 技術分野
本発明は、 目的とする DNA断片を回収する方法に関し、 特に、 様々な 種類の cDNA断片が混在する cDNA断片の群から目的とする cDNA断片を回 収する DNA回収法に関するものである。 背景技術
従来より、 様々な cMA断片が混在する cDNA断片の群から、 目的とする cDNA断片を回収する DNA回収法が、 いくつか知られている。
例えば、 平板ゲルを利用して、 cDNA断片の群から目的とする cDNA断片 を回収する方法がある （例えば、 非特許文献 1参照。）。 即ち、 cDNA断片 の群について、 例えばアクリルアミ ドゲル電気泳動を行う。 その後、 ァ クリルアミ ドゲル中の cDNA断片をェチジゥムブ口ミ ドで染色し、 U V ト ランスイルミネー夕によりァクリルアミ ドゲルを照ら して cDNA断片を検 出する。 そして、 分画された cDNA断片の群から目的の cDNA断片を含むァ クリルアミ ドゲルを切り出し、 そのゲルから当該 cDNA断片を回収する。 また、 例えば、 キヤビラリ一電気泳動を利用して、 cMA断片の群から 目的とする cDNA断片を回収する方法もある （例えば、 特許文献 1〜 3参 照。）。 即ち、 予め蛍光標識した c A断片の群をキヤビラ リ一カラムに供 試し電気泳動を行う。そして、検出されたピークに基づいて、 目的の cDNA 断片が泳動されて来る時間を推測する。 次に、 再びキヤビラ リ一力ラム で電気泳動を行い、 その推定時間をもとに目的の cDNA断片を回収する。
【非特許文献 1】
A new method for sequencing DNA.
Proc . Natl . Acad. Sc i . 1977, 74: 560-564
【特許文献 1】 JP2003/012214
2 特開 2 0 0 0— 8 8 8 0 3号公報
【特許文献 2】
特閧平 7 - 1 8 1 1 6 4号公報
【特許文献 3】
特開平 6 — 1 3 8 0 3 7号公報
しかしながら、 前者の方法では、 目的とする cDNA断片が少量しか存在 しない場合、 ゲル電気泳動後、 cDNA断片を染色しても、 U V トランスィ ルミネー夕下でそれを検出することができないため、 目的とする cDNA断 片を回収できないという問題がある。
一方、 後者の方法では、 蛍光標識した. cDNA断片を使用しているので、 目的とする cMA断片が少量であっても、 これを検出することは可能であ る。 しかしながら、 この方法では、 cDNA断片を目視しながら回収するこ とができないため、 目的の cDNA断片がキヤビラリ一カラムの先端部分に 現れる時間を予想して回収する。 そのため、 回収した cDNA断片には、 目 的とする cDNA断片に加え、 目的物とほぼ同じく らいの長さの cDNA断片が 混在する可能性がある。 また、 サイズ分画能が平板ゲルを使用した場合 と比較すると良くないため、 回収した cDNA断片の中に目的物以外のもの が混在したり、 また、 目的とする cDNA断片の回収率の低下を招く ことも める。
本発明はかかる現状に鑑みてなされたものであって、 様々な種類の cMA断片が混在する cDNA断片の群から目的とする cDNA断片をより確実に 回収することができる DNA回収法を提供することを目的とする。 発明の開示
前記目的を達成するための解決手段は、 一端に第 1アダプター配列を 有し他端に第 2アダプタ一配列を有する cDNA断片の群について、上記第 1アダプター配列に相補的な配列を有すると共に標識物質を有する第 1 プライマーと、 上記第 2アダプター配列に相補的な配列を有する第 2プ ライマ一とを用いて、 PCR反応を行う第 1 PCR工程と、 上記第 1 PCR工程 で増幅された cDNA 断片の群についてゲル電気泳動を行う電気泳動工程 と、 上記電気泳動工程の結果に基づいて、 ゲルから目的の cDNA断片を含 むゲルを切り出し、 当該 cDNA断片を回収する回収工程と、 を備えること を特徴とする DNA回収法である。
本発明の DNA回収法は、両端にアダプタ一配列を有する cDNA断片の群か ら、 目的とする cDNA断片を回収する方法である。 まず、 cDNA断片の一端 にある第 1アダプター配列に相補的な配列を有すると共に標識物質を有 する第 1プライマーと、 cDNA断片の他端にある第 2アダプタ一配列に相 補的な配列を有する第 2プライマーとを用いて、 PCR反応を行う。そして、 増幅された cDNA断片の群 （PCR産物） をゲル電気泳動する。 その後、 その 電気泳動の結果に基づいて、 ゲルから目的の cDNA断片を含むゲルを切り 出し、 そこから cDNA断片を回収する。
このような方法によれば、 予めゲル電気泳動前に cDNA断片の群につい て PCR反応を行うので、 cDNA断片の群を多量に増幅することができる。従 つて、 目的とする cDNA断片が低濃度であっても、 それを大幅に増幅する ことができ、 ゲル電気泳動においてそれを検出することができる。
また、 この PCR反応では、標識物質を有するプライマ一を用いているの で、 PCR産物も標識物質を有することになる。 従って、 PCR反応を行って も依然として目的とする cDNA断片が比較的少ない場合であっても、 電気 泳動においてこの標識物質を認識することで、 目的とする cDNA断片のゲ ル中の位置を容易に検出することができる。
さらに、 cDNA断片の群をゲル電気泳動によって分画するため、 例えば キヤビラリ一カラムによる電気泳動に比べ、 サイズ分解能を向上させ、 目的とする cDNA断片のみをより特異的に回収することができる。
ここで、 サンプルとする様々な cMA断片からなる cDNA断片の群につい ては、 一端に第 1アダプタ一配列を有し他端に第 2アダプター配列を有 するものであれば、 いかなるものであってよい。 即ち、 cDNA断片の由来 は問われず、動植物細胞から抽出した] BRNAから作製したものであっても、 ゥィルスや微生物から抽出した mRNAから作製したものであってもよい。 また、 cDNA断片の群は、 抽出に用いた細胞で発現されたほとんどすべて の遺伝子が含まれる群であっても、 その発現された遺伝子の一部だけが 含まれる群であってもよい。 また、 cDNA断片は、 全長 cDNAの両端にァダ プ夕ー配列が付いたものでも、 全長 cDNAの一部分をなす断片の両端にァ ダブ夕一配列が付いたものでもよい。 また、 第 1アダプタ一配列及び第 2アダプター配列は、 それそれいかなる塩基配列からなるものであって も構わないが、 PCRの効率等を考慮して設計されたものであるのが好まし い。 即ち、 これらのアダプター配列がそれそれ 1 5塩基前後であると、 安定した PCR反応を行うことができ、効率よく cDNA断片を増幅することが できる。
第 1プライマーは、第 1アダプター配列に相補的な配列を有し、かつ、 標識物質を有するものであれば、 いかなるものであってもよい。 ここで いう相補的な配列とは、 第 1アダプター配列に対し 1 0 0 %相補的な配 列に限られず、 PCR反応において cDNA断片を増幅されることができる程度 に実質的に相補的な配列も含まれる。 また、 第 1 プライマーは、 第 1ァ ダブ夕一配列に相補的な配列のみからなるものに限られず、 第 1ァダプ 夕一配列に相補的な配列に、 さらに他の配列が繋がったものであっても よい。 第 1プライマーは、 第 1アダプタ一配列全体に対応するものに限 られず、 第 1アダプタ一配列の一部に対応するものでもよい。
また、 標識物質は、 ゲル電気泳動において検出感度が高いものであれ ば、 いずれのものを使用することもできる。 例えば、 6 -カルボキシフル ォレヅセイン （以下、 FAMと称す。）、 4, 7，2，，4，，5，，7 へキサクロ口- 6- カルボキシフルォレヅセイン （以下、 HEXと称す。）、 NED (アプライ ドバ ィォシステムズジャパン社）、 6-カルポキシ -X -ローダミン （以下、 Rox と称す。）等の蛍光物質などを使用することができる。 これらの標識物質 は、例えば、プライマ一 DNAの末端（例えば 5'末端）に結合させればよい。 第 2プライマ一は、 第 2アダプタ一配列に相補的な配列を有するもの であれば、 いかなるものであってもよい。 ここでいう相補的な配列も、 第 2アダプタ一配列に対し 1 0 0 %相補的な配列に限られず、 PCR反応に おいて cDNA断片を増幅させることができる程度に実質的に相補的な配列 も含まれる。 また、 第 2プライマーについても、 第 2アダプタ一配列に 相補的な配列のみからなるものに限られず、 第 2アダプタ一配列に相補 的な配列に、 さらに他の配列が繋がったものであってもよい。 また、 第 2プライマ一についても、 第 2アダプター配列全体に対応するものに限 られず、 第 2アダプター配列の一部に対応するものでもよい。 さらに、 上述の第 1プライマ一だけでなく、 この第 2プライマーにも、 上述の標 識物質が結合されていても構わない。
次に、その他一般に PCR反応で用いられる種々の試薬について説明する < DNAポリメラ一ゼは、 PCR反応において MA鎖を変性させる際の高温に短 時間加熱されても永久的には不活性化されず、 しかも、 高温における活 性を有するものが好適である。 例えば、 サ一モコッカス ' リ トラ リス ( Thermo oncns litoralis^、 バチルス ' ステアロザ一モフ ィ ルス ( Bacil Ins stearothermophilus )、 メタノサ一マス ' フエルビ ド ウス ( Methannthernm fervidus)、 サ一マス ' アクアテイ クス （ Thermus agnations^ T.フラブス (T.fla ）、 T..ラクテウス (T.lacteusK T. ルベンス (T.n】bens)、 T.ルバ一 (T. ruber などの高熱菌由来の DNAポリ メラーゼゃ、デスルフロコヅカス -モピリス (Desulfurococcus mobilisk メタノバクテリウム ' サ一モォ一卜 トロフィルクム (Mfithanobacterium thermomito rophilnnm^ スルホロブス ' ソルフアタリクス (Snlfolobus sol f atari cns S.ァシドカルダリウス f S.aoidocaldari s), サ一モプ ラスマ ' ァシドフィルム (Ther画 lasma acidophilum), ピロコヅカス · コダカラエンシス (Pvrnc cnns kodakaraensis KODl株） などの高熱性古 細菌由来の DNAポリメラ一ゼなどが挙げられる。 これらのうち、 入手容易 性等の理由から、 サーマス ' アクアテイクス （Hifi miiaaaMtiiuis) 由来 の DNAポリメラ一ゼ （Taq DNAポリメラ一ゼ）、 サ一モコヅカス · リ トラ リ ス (TherTnococc s litoralis) 由来の MAポリメラ一ゼ、 あるいは、 ピロ コ ヅカス ' コダカラエンシス (Pyrococcus kodakaraensis 跌) 由来 の DNAポリメラ一ゼを利用するのが好ましい。 さらに、 PCR反応液には、 MAポリメラ一ゼによる核酸増幅前の活性を 阻害するために、 DNAポリメラ一ゼに特異的な抗体を混合してもよい。 こ の抗体には、 モノクローナル抗体、 ポリクローナル抗体、 組換え法によ り製造された抗体、 化学的または組換え法により製造された抗体フラグ メン ト （例えば、 Fabフラグメント） が挙げられる。 これらのうち、 モノ ク口一ナル抗体を用いるのが特に好ましい。 例えば、 Taq DNAポリメラ一 ゼに対する公知のモノクロ一ナル抗体は、約 2 0 °C〜4 0。Cにおいて Taq DNAポリメラーゼの酵素活性を阻害することができると共に、 PCRの熱的 サイクルにおける高温によって不活性化される。
また、 PCR反応は、 一般に、 4種類の dNTP、 即ち、 dATP、 dCTP、 dGTP 及び dTTPの存在化において行う。
さらに、 PC&反応は、一般に、適当な緩衝剤を含む反応液中で行われる。 効率よく核酸を増幅させるためである。緩衝液は、使用する DNAポリメラ —ゼ等により、 反応の最適条件を得るため適宜変更することができる。 例えば、 pHを適当に調整したト リス系の緩衝液に、 塩化カリウムや塩化 マグネシゥムを加えた緩衝液を利用することができる。
また、 PCR反応液には、 5 %〜； I 0 %の DMS0と 1 % ~ 2 %のべ夕インを 添加してもよい。銃型 DNAとなる cDNA断片が二字構造を有する場合に産物 が増幅されにくいという問題を、 最小限に留める効果を有するものであ る。
電気泳動工程では、 アク リルアミ ドゲル電気泳動ゃァガロースゲル電 気泳動など、 公知の平板ゲル電気泳動などにより、 cDNA断片 （PCR産物） を電気泳動し、 cDNA断片を分画する。 電気泳動には、 公知の電気泳動装 置を利用すればよい。
回収工程は、電気泳動工程の結果に基づいて、ゲルから目的とする cDNA 断片を含むゲルを切り出し、 その MA断片を回収する工程であれば、 いか なる方法を利用することもできる。
即ち、 例えば、 後述する実施例に示すように、 標識物質を検出するこ とができる DNAシークェンサ一に cDNA断片を供試して電気泳動工程を行 い、 その解析結果から、 回収する cDNA断片を決定する。 次に、 再度同一 サンプルを電気泳動して、 目的とする cDNA断片が検出されたときに、 そ の部分のゲルを切り出し、 そこから cDNA断片を回収する方法が挙げられ る
また、 ゲル電気泳動後、 標識物質を検出することができるスキャナ一 上にゲルを載置し、 その解析結果から回収する cDNA断片を決定する。 そ して、 その部分のゲルを切り出し、 そこから cDNA断片を回収する方法が 挙げられる。
ところで、 両端にアダプタ一配列を有する cDNA断片の群は、 例えば、 次のようにして作製することができる。
即ち、 細胞から抽出した mMAから、 その 5'末端にタグ物質を付加され た cDNA断片を合成する工程と、 得られた cDN A断片を第 1制限酵素によつ て切断する工程と、 上記夕グ物質に高親和性を有する高親和性物質を結 合させることにより、 タグ物質を有する cDNA断片を回収する工程と、 回 収された cDNA断片に、 上記第 1制限酵素の酵素切断部位の配列に相補的 な配列を有する第 1アダプタ一配列を結合させる工程と、 上記第 1ァダ プ夕ー配列を結合させた cDNA断片を第 2制限酵素によって切断する工程 と、 上記高親和性物質を結合させて、 上記タグ物質を有する cDNA断片を 除去し、 上記タグ物質を有しない cDNA断片を回収する工程と、 上記夕グ 物質を有しない cDNA断片に、 上記第 2制限酵素の酵素切断部位の配列に 相補的な配列を有する第 2アダプタ一配列を結合させる工程と、 を備え る方法によって、 両端にアダプター配列を有する cDNA断片の群を作製す ることができる.。 .
さらに、 このような cDNA断片の群について、 上記第 1アダプタ一配列 に相補的な配列を有しかつその 33末端に任意の 2塩基配列である NNを有 するプライマ一と、 上記第 2アダプタ一の配列に相補的な配列を有しか つその 3'末端に任意の 2塩基配列である NNを有するプライマーとを用い て、 PCR反応を行う工程により、 上記の cDNA断片の群を小規模な cMA断片 の群に分類することもできる。 このような方法によって cDNA断片の群を作製すれば、 発現されたほと んど全ての遺伝子、 即ち、 公知の遺伝子も未知の遺伝子も同様に、 その 群の中に含まれるようにすることが可能である。 従って、 遺伝子解析等 において有効に活用することができる。また、解析が容易となるように、 cMA断片の群を複数の小規模な群に分類することができる。
なお、 タグ物質とタグ物質に高親和性を有する高親和性物質とは、 互 いに高親和性をもって特異的に結合することが可能な結合対を構成する 物質を示す。 タグ物質と高親和性物質の組合せとしては、 例えば、 ピオ チンとス トレプトアビジン、 ビォチンとアビジン、 F IGTと F ITC抗体、 D IG とアンタイ D IG、 プロティン Aとマウス IgG、 ラテックス粒子等が挙げられ る。 また、 各組合せにおいて、 いずれを夕グ物質として使用しても、 い ずれを高親和性物質として使用してもよい。
また、 制限酵素とは、 一般的に、 制限エン ドヌクレアーゼとも称され る酵素であり、特定の配列において二本鎖 DNAを加水分解し切断する酵素 である。 上記の方法においては、 適切な断片を得るために 2種類の制限 酵素 （第 1制限酵素及び第 2制限酵素） を組み合わせて使用する。 使用 する制限酵素は、 cDNA断片を識別可能な長さを有する断片に切断するこ とが可能なものが好ましい。 また、 合成された cDNA断片のより多くを、 好ましくは、 ほとんど全てを切断するような酵素が好ましい。 また、 制 限酵素は、 4塩基認識酵素を使用しても 6塩基認識酵素を使用してもよ いが、 特に、 上記の理由から、 4塩基認識酵素の使用が好ましい。
また、 アダプタ一配列は、 PCR増幅の際に用いるプライマ一を結合させ るために用いるものであるが、 使用する制限酵素に応じて設計される。 即ち、 第 1制限酵素の酵素切断部位に結合させるための第 1アダプター 配列は、 第 1制限酵素の酵素切断部位に相補的な配列を有し、 また、 第 2制限酵素の酵素切断部位に結合させるための第 2アダプター配列は、 第 2制限酵素の酵素切断部位に相補的な配列を有する。
また、 プライマ一セッ トは、 cDNA断片を PCIIにより増幅するために使用 する 1組のプライマ一からなる。 ここで使用される 「任意の 2塩基配列 である NN」 は、 A、 T、 G、 Cから任意に選択される配列である。 ここで、 各任意の配列を 2塩基としたのは、 当該方法の簡便性と解析精度を考慮 した結果である。 つまり、 各任意の配列を 2塩基とすることにより、 最 大 2 5 6種類のプライマ一セヅ トが得られるため、 cMA断片の群を複数 の群に分類することができる。 なお、 この任意の 2塩基配列 NNを、 一方 のプライマーまたは両方のプライマ一について 3塩基以上とすることも 可能である。 それによつてプライマーの種類が増え、 プライマーセッ ト を最大 1 0 2 4個や最大 4 0 9 6個とすることができる。
さらに、 上記のいずれかに記載の DNA回収法であって、 前記回収工程で 回収した cDNA断片について、 前記第 1アダプター配列に相補的な配列を 有する第 3 プライマ一と、 前記第 2アダプタ一配列に相補的な配列を有 する第 4プライマ一とを用いて、 再度 P CR反応を行う第 2 PCR工程を備え ることを特徴とする DNA回収法とすると良い。
本発明では、 回収工程で回収した cDNA断片について、 再度 PCR反応を行 う第 2 PCR工程を備える。 このため、 回収した cDNA断片が少量しかなくて も、 それを大幅に増幅させることができる。
なお、 この PCR工程で使用する第 3プライマーは、 第 1アダプター配列 に相補的な配列を有するものであればよく、 例えば、 上記の第 1プライ マ一を利用しても良いが、 この PCR工程では標識物質は特に要しない。同 様に、 第 4プライマ一は、 第 2アダプター配列に相補的な配列を有する ものであればよく、 例えば、 上記の第 2プライマーを利用しても良い。 さらに、 上記の DNA回収法であって、 前記第 2 PCR工程において、 RecA 夕ンパク質及びこの RecA夕ンパク質を改変したタンパク質であってこの RecA夕ンパク質と類似する機能を有する RecA改変夕ンパク質の少なく と もいずれかを含む相同的組換えタンパク質を反応液に混合して、 PCilを行 うことを特徴とする A回収法とすると良い。
本発明によれば、 第 2 PCR工程において、 RecA夕ンパク質等の相同組み 換えタンパク質を反応液に混合して PCRを行い、回収した cMA断片を増幅 させる。 このように PCRを行えば、 cDNA断片の収量を減少させることなく、 副産 物 （非特異的な PCR産物） の増幅を低く抑えることができる。 即ち、 上記 の相同組み換えタンパク質が存在することにより、 プライマ一が cDNA断 片の非特異的な領域に結合してプライマ一伸長反応を起こすことが抑制 されるため、 非特異的な PCR産物の増幅を抑制することができる。
また、 本発明では、 上記のように特異性が高いため、 アニーリング温 度等、 プライマ一伸長反応の温度条件を変えても、 回収した cDM断片を 特異的に増幅させることができる。 即ち、 従来の PCR方法では、 ァニーリ ング温度等、プライマ一伸長反応の温度を低く設定すると、回収した cMA 断片だけでなく、 副産物も多量に増幅されることとなるが、 本発明によ れば、 回収した cDNA断片をより特異的に増幅させることが可能となる。
これらの結果、 目的とする cDNA断片をさらに確実に回収することがで きる。
ここで、 上記の相同組み換えタンパク質は、 RecAタンパク質、 及び、 RecAタンパク質を改変したものであって HecAタンパク質と類似する機 能を有する RecA改変夕ンパク質、 の少なく ともいずれかを含むものであ れば、 いかなるものを用いてもよい。 RecA改変タンパク質としては、 例 えば、 RecAタンパク質をコードする遺伝子から、 部位特異的変位誘発等 により作出された遺伝子の産物であって、 1または数個のアミノ酸が欠 損、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ、 RecAタンパ ク質と類似する機能を有するものが挙げられる。 また、 RecAタンパク質 のタンパク質断片であって、 夕ンパク質と類似する機能を有するもの ( RecAフラグメン ト） などであってよい。
また、 RecAタンパク質等は、 上述した DNAポリメラーゼと同様に、 PCR 反応において DNA鎖を変性させる際の高温に短時間加熱されても永久的 には不活性化されず、 しかも、 高温における活性を有するものが好適で ある。 例えば、 入手容易性等の理由から、 大腸菌 ( R . col i ) 由来の RecA 夕ンパク質を利用するのが好ましい。
なお、上記の相同組み換えタンパク質は.、プライマー 2 O pmolあたり、 1 ng〜 1 0 0 O ngの範囲で混合するのが好ましい。このような範囲で PCR を行えば、 より効率よく特異的に、 cDNA断片を増幅することができるか らである。
さらに、上記のいずれかに記載の MA回収法であって、前記回収工程後、 または、前記第 2 PCR工程を有する場合にはこの第 2 PCR工程後、前記 cDNA 断片をプラスミ ドぺク夕一に連結し、 組換え体プラスミ ドを形成する連 結工程と、 上記組換え体プラスミ ドを大腸菌に導入する導入工程と、 を 備えることを特徴とする DNA回収法とすると良い。
本発明の DNA回収法は、 第 2 PCR工程を有しない場合には回収工程後、 または、 第 2 PCR工程を有する場合には第 2 PCR工程後、 目的の cDNA断片 をプラスミ ドぺク夕一に連結し、 組換え体プラスミ ドを形成する連結ェ 程を備える。 そしてさらに、 この組換え体プラスミ ドを大腸菌に導入す る導入工程を備える。
このように、 回収した cDNA断片をプラスミ ドベクターに連結し、 大腸 菌に導入しておけば、 cDNA断片の構造解析をする場合などに有効である。 即ち、 形質転換したその大腸菌を培養し、 それから cDNA断片を有するプ ラスミ ド DNAを抽出すれば、これを例えば塩基配列の決定等の構造解析に 用いることができる。 図面の簡単な説明
第 1図は、 実施例 1に関し、 目的とする cDNA断片を回収するためのサ ンプルとなる cDNA断片群の作成方法についての概要を示す説明図である ( 第 2図は、 実施例 1に関し、 目的とする cDNA断片を回収するためのサ ンプルとなる cDNA断片群の作成方法についての詳細を示す説明図である ( 第 3図は、 実施例 1に関し、 Aは第 1アダプター配列を示す説明図で あり、 Bは第 2アダプター配列を示す説明図である。
第 4図は、 実施例 1に関し、 2 5 6種類の cDNA断片群に分類するため のプライマーセッ 卜の配列を示す説明図である。
第 5図は、 実施例 1に関し、 cDNA断片の群から目的とする cDNA断片を 回収する方法を示す説明図である。
第 6図は、 実施例 3に関し、 RT-PCRで増幅した cMA断片の群を電気泳 動した結果を示す、 図面に変わる写真である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明の実施例を、 図を参照しつつ説明する。
(実施例 1 )
本実施例においては、 まず、 特定の細胞において発現された遺伝子を 以下のように分類する。 まず、 抽出した mRNAから cDNA群を合成する。 そ して、 得られた cDNA群を適切な 2つの制限酵素によって切断し、 また、 両端にアダプター配列を結合して、 識別可能なだけの長さを有しかつ両 端にアダプタ一配列を有する cDNA断片の群を作成する。 その後、 得られ た cDNA断片の群を、 複数種類のプライマーセッ トを用いて複数の群に分 類する。
この分類の手法を第 1図を参照しつつ説明する。 発現された mRNAから なる群 1から公知の手法により cDNAの群 2を合成する。 これを適切な 2 つの制限酵素によって切断して cMA断片の群 3を得る。そして、この cDNA 断片の両末端の各 2塩基、 全 4塩基の配列に応じて、 即ち、 4塩基が A、 T、 G、 Cのいずれであるかにより、 cDNA断片の群 3を分類する。 例えば、 5'末端の塩基 （第 1図中に黒塗りで示す。） を区別することで、 群 3を 4 種類の群 4に分類することができる。 そして、 次の 2番目の塩基 （第 1 図中に黒塗りで示す。） を区別することで、 群 4をそれそれ 4種類の群 5 に分類することができる。 さらに、 3'末端の 2番目の塩基 （第 1図中に 黒塗りで示す。） を区別することで、 群 5をそれそれ 4種類の群 6に分類 することができる。 またさらに、 3'末端の塩基 （第 1図中に黒塗りで示 す。） を区別することで、 群 6をそれそれ 4種類の群 7に分類することが できる。
次に、 抽出した mMAの群 1から複数の cDNA断片の群 7を調製する手法 について、 第 2図を参照しつつ具体的に説明する。 第 2図における各ァ ルファベッ トは塩基配列を構成する塩基を示すが、 N、 M、 W、 X、 Y 及び Ζは任意の塩基を示し、 Xと Υ及び Wと Ζは、 互いに相補的に結合 する。
まず、 試験対象となる特定の細胞から公知の手法により) iiRNAl 1を抽 出する。 本実施例では、 酵母から、 Fast Track 2.0 kit ( Invitrogen社 製） を用いて、 総 mRNAl 1を 20 g抽出した。
次に、抽出された m Al 1の 3'末端側のポリ Aティルに相補的なォリゴ dTプライマ一をピオチン （タグ物質） 13で標識化する。 そして、 これ をプライマーとして用いて cDNAl 2を合成する。 具体的には、 抽出した 20 の mRNA 1 1を、 0. 8 1中で 1 00 pmoleの 5，-ピオチン化オリ ゴ dTブラィマ一 （BRL社製） と混合し、 6 5 °Cで 5分間ィンキュぺートし た。 続いて、 それを水冷した後、 逆転写バヅ ファー 20. 0 /1中で、 最 終濃度 5 mMの MgC と 0. 5 mMの dNTPミ ックス（BRL社製）と 1 0 mMの DTT(BRL社製）を 42°Cで 60分間ィンキュベ一トした。 続いて、 二本鎖 合成バヅ フ ァー 1 5 0. 0^1中で最終濃度0. 2 7 mMの dNTPミ ックス (BRL社製）と 1. 33mMの DTT(BRL社製）と 20. 0ユニッ トの iLjialiリガ —ゼ（BRL社製） と 40. 0ュニヅ 卜の iLilliDNAポリメラーゼ（BRL社製） と 2. 0ユニッ トの RNaseH(BRL社製）を 1 6 °Cで 1 20分間ィンキュベ —卜し、 続いて、 70 °Cで 15分間ィンキュベ一トし反応を止めた。
次に、 合成された cDNAl 2を第 1制限酵素を用いて切断する。 具体的 には、 1 0 Ο zl中で最終濃度 20ュニッ 卜の制限酵素 Mspl (宝酒造社 製）と 10 gの cDNAl 2とを、 37°Cで 360分間反応させた。 なお、 Msplは、 4塩基認識制限酵素である。 その後、 エタノールを用いて cMA 断片を公知の手法により精製した。
次に、 ス トレプトアビジン （高親和性物質） 14を用いてピオチン 1 3を捕捉し、 切断された cDNA断片の 3'末端側のみを回収する。 具体的に は、 反応液に磁気ピーズに固定したス 卜レプトアビジン 14 (ダイナル 社製） に対して、 ピオチン 13を結合し、 産物を得た。
次に、 回収された cMA断片の 5 ' 末端側に、 第 1制限酵素の認識切断 部位に相補的な配列を有する第 1アダプタ一配列 1 5を結合させる。 本 実施例で使用した第 1アダプタ一配列 1 5について、 第 3 A図に示す。 具体的には、 1 5 〃1の T4 DNAリガ一ゼパヅファー中で CG突出末端（即ち、 制限酵素 Msp lの切断断片部位の相補的配列である） を有する 5 . 0 ju g の第 1アダプター （BRL社製） と、 1 0ユニッ トの T4 DNAリガ一ゼ （NEB 社製） を用いてライゲーシヨンを行った。
次に、 この cDNA断片を第 2制限酵素を用いて切断する。 具体的には、 2 0 0 1中で最終濃度 5 0ュニッ トの制限酵素 Mse l ( NEB社製） と cDNA 断片とを、 3 7 °Cで 3 6 0分間反応させた。 なお、 この Mse lも、 4塩基 認識制限酵素である。 その後、 エタノールを用いて cDNA断片を公知の手 法により精製した。
次に、 ス トレプトアビジン 1 4を用いてビォチン 1 3を捕捉し、 切断 された cDNA断片の 3'末端側を除去し、 切断された cDNA断片の 5'末端側を 回収する。
そして、 回収された cDNA断片の： T末端側に、 第 2制限酵素の認識切断 部位に相補的な配列を有する第 2アダプター配列 1 6を接合させる。 本 実施例で使用した第 2アダプタ一配列 1 6について、 第 3 B図に示す。 具体的には、 1 0〃1の T4 MAリガーゼバヅファー中で TA突出末端（即ち、 制限酵素 Mse lの切断断片部位の相補的配列である） を有する 1 O pmole の第 2アダプタ一配列（BRL社製）と、 1 0ュニヅ トの T4 DNAリガーゼ（NEB 社製） を用いてライゲ一シヨンを行った。
以上の処理によって、 両末端に既知配列を含む cDNA断片 1 7の群が構 築される。
次に、 この cDNA断片 1 Ίの群について、 プライマ一セヅ トを用いて PCR 反応を行う。 このプライマ一セッ トには、 第 4 A図に示すように、 第 1 アダプター配列に相補的な配列と、 増幅させる方向にさらに 2塩基の配 列 （第 4図中に NNで示す。） を有するプライマ一と、 第 4 B図に示すよう に、 第 2アダプタ一配列に相補的な配列と、 増幅させる方向にさらに 2 塩基の配列を有するプライマー （第 4図中に腿で示す。） とを使用する。 それそれのプライマ一の増幅される方向に付与した 2塩基は、 A、 T、 G Cの 4種類の塩基からなる全ての組合せによって設計されるので、最大 2 5 6種類のプライマ一セ ヅ 卜が考えられる。 従って、 これらのプライマ —セ ヅ トを用いて、 cDNA断片 1 7の群について PCRを行うことにより、 複 数種類の cDNA断片 1 8の群に分類すると共に、 PCR増幅を行うことが可能 である。 なお、 PCRは、 公知の手法により行えばよい。
以上のようにして得た複数種類の cDNA断片 1 8の群は、 それぞれ本実 施例において、 目的とする cDNA断片を回収するためのサンプルとして利 用することができる。
次に、 上述のようにして作成した小規模な cDNA断片の群の 1つをサン プルとし、 以下に示す手法により、 目的とする cDNA断片を回収する。 こ の手法については、 第 5図を参照しつつ説明する。
なお、 本実施例でサンプルとした小規模な cDNA断片の群は、 オリゴヌ クレオチド 1からなるプライマーと、 オリゴヌクレオチド 2からなるプ ライマ一を用いて、 分類したものである。 .
才リゴヌクレオチド 1 ：
5' -aagtctgatacgacccggac-3'
ォリゴヌクレオチド 2 ：
5， -acgactgtagtccaagtaata-3'
まず、 第 1 PCR工程において、 作成した cDNA断片の群 2 1について、 第 1アダプタ一配列 1 5に相補的な配列を有し、 かつ、 標識物質が結合さ れた第 1プライマ一と、 第 2アダプタ一配列 1 6に相補的な配列を有す る第 2ブラ一マーとを用いて、 PCR反応により増幅させる。
具体的には、 第 1アダプター配列 1 5に相補的な配列を有する上記ォ リゴヌクレオチ ド 1に、蛍光物質である近赤外蛍光色素 IRD-800が結合さ れた第 1プライマ一と、 第 2アダプター配列 1 6に相補的な配列を有す る上記オリゴヌクレオチ ド 2からなる第 2プライマーとを用いて、 PCR 反応を行った。 第 1 , 第 2プライマ一は、 それそれ公知の手法により合 成すればよい。 また、 PCR反応は、 パーキンエルマ一社製の GeneAmp 2400 を用いて行 つた。 PCR条件は、 Stepdown PCR ( Biotechniques , 1996， 20 ： 478-485 を参照されたい。） により行った。使用した酵素（DNAポリメラーゼ） は、 東洋紡社製の KOD Dash酵素である。 この DNAポリメラ一ゼは、 ピロコヅ カス ' コダカラエンシス ( Pyrococcus kodakaraensi s QDlfefe に由来す るものである。 反応液の組成は、 添付のマニュアルに従った。
次に、 電気泳動工程において、 増幅した cDNA断片の群 2 2 ( PCR産物） についてゲル電気泳動を行う。
具体的には、増幅した cDNA断片の群 2 2を、 蛍光色素の読み取れる DNA シークェンサ一 （L I- C0R社製 L IC- 4200L ( S )-1 ) に供試し、 サイズ分画の ためにァクリルアミ ドゲル電気泳動を行った。 ァクリルアミ ドゲル 2 3 の組成は、 上記 DNAシークェンサ一に付属のマニュアルに従った。
次に、 回収工程において、 電気泳動工程の結果に基づいて、 ゲルから 目的の cDNA断片 2 4を含むゲルを切り出し、 当該 cDNA断片 2 4を回収す る。
具体的には、 アクリルアミ ドゲル電気泳動の解析結果から、 抽出する cMA断片 2 4を決定した。 なお、 この0 ^断片 2 4は、 既知の遺伝子で ある A遺伝子由来のものであり、 長さは 2 0 2 bp (両アダプタ一配列を 含む。） である。 そして、 再度同一サンプルをァクリルアミ ドゲル電気泳 動し、 目的とする cDNA断片 2 4が解析画面上に出現するとすく、に電気泳 動を終了して、 検出器のレーザーが当たる部分のゲルを切り出した。 そして、 切り出したアク リルアミ ドゲルを、 緩衝液中において 6 5 °C で一晩反応させ、 アク リルアミ ドゲルから cDNA断片 2 4を回収した。 な お、 この cDNA断片 2 4 の回収には、 Omega B io-tek社製のキ ヅ ト ( E. Z . N.A. Poly-Gel DNA extraction kit) を使用した。
次に、 第 2 PCID:程において、 回収した cDNA断片 2 4について、 第 1ァ ダブ夕一配列 1 5に相補的な配列を有する第 3プライマーと、 第 2ァダ プ夕ー配列 1 6に相補的な配列を有する第 4プライマーとを用いて、 再 度 PCR反応を行う。 具体的には、 フォワード側には、 第 1アダプター配列に相補的な配列 を有すると共に制限酵素 Not I部位の配列を有する第 3プライマ一を、 リ バース側には、 第 2アダプタ一配列に相補的な配列を有すると共に制限 酵素 Spe l部位の配列を有する第 4プライマ一を用いて、 PCR反応を行つ た。 第 3プライマ一は、 オリゴヌクレオチド 3からなり、 第 4プレイマ —は、 オリゴヌクレオチド 4からなる。
オリゴヌクレオチド 3 ：
5 -tagcggccgcaagtctgatacgacccggac-35
才リゴヌクレオチド 4 ：
5' -gaactagtaacgactgtagtccaagtaata-3'
また、 この PCR工程においても、 PCR反応は、 パーキンエルマ一社製の GeneAmp 2400を用い、 Stepdown PCR ( B i otechniques , 1996， 20： 478-485 を参照されたい。） の条件により行った。 使用した酵素 （DNAポリメラー ゼ） は、 東洋紡社製の KOD Dash 酵素である。 反応液の組成は、 添付の マニュアルに従った。
次に、連結工程において、第 2 PCR工程で増幅した cDNA断片 2 4の産物 をプラスミ ドベクタ一 2 5に連結し、 組換え体プラスミ ド 2 6を形成す る。
具体的には、 増幅した cDNA断片 2 4の産物を制限酵素 Not I と Spe Iで 処理した上で、 プラスミ ドベクタ一 （pb luescr ipt l l ) 2 5に連結し、 組 換え体プラスミ ド 2 6を形成した。 この連結は、 宝酒造社製のライゲ一 シヨンキッ ト ver . 2 を使用し、 その添付マニュアルに従って行った。
その後、 導入工程において、 組換え体プラスミ ド 2 6を大腸菌に導入 する。
具体的には、 コンビテン トセルとして E . col i DH5ひを使用し、 公知の 手法により、 組換え体プラスミ ド 2 6を大腸菌に導入した。
以上のようにすれば、 cDNA断片の群 2 1から目的とする cDNA断片 2 4 をより確実に回収することができる。
次に、 他の既知の遺伝子 （B遺伝子、 C遺伝子及び D遺伝子） 由来の cMA断片についても、 それそれ上記の手法により回収した。
各 cDNA断片の回収にあたり、 サンプルには、 上記 A遺伝子を回収した cDNA断片の群とは、 それそれ異なる cDNAの群を前述の方法により作成し た。
また、 サンプルとした cMA断片の群が異なることに伴い、 第 1プライ マ一-^ ^第 4プライマーも、 その塩基配列が若干異なるものを使用した。 具体的には、 B遺伝子由来の cDNA断片の回収には、 第 1プライマーと してオリゴヌクレオチド 5を、 第 2プライマーとしてオリゴヌクレオチ ド 6を、 第 3プライマ一としてオリゴヌクレオチド 7を、 第 4プライマ —としてオリゴヌクレオチド 8を使用した。
また、 C遺伝子由来の cDNA断片の回収には、 第 1プライマ一としてォ リゴヌクレオチ ド 9を、 第 2ブラィマーとしてオリゴヌクレオチ ド 1 0 を、 第 3プライマ一としてオリゴヌクレオチ ド 1 1を、 第 4プライマ一 としてオリゴヌクレオチド 1 2を使用した。
また、 D遺伝子由来の c.DNA断片の回収には、 第 1プライマ一としてォ リゴヌクレオチド 1 3を、 第 2プライマーとしてオリゴヌクレオチド 1
4を、 第 3プライマ一としてオリゴヌクレオチド 1 5を、 第 4プライマ
—としてオリゴヌクレオチド 1 6を使用した。
オリゴヌクレオチド 5 ：
b' -aagtctgatacgacccggtt-33
オリゴヌクレオチド 6 ：
5， -acgactgtagtccaagtaagt-3'
ォリゴヌクレオチド 7 ：
b' -tagcggccgcaagtctgatacgacccggtt-3'
ォリゴヌクレオチド 8 ：
5， -gaactagtaacgactgtagtccaagtaagt-35
オリゴヌクレオチド 9 ：
5， -aagtctgatacgacccggtc-3'
ォリゴヌクレ才チド 1 0 ： 5, -acgactgtagtccaagtaagg-35
オリゴヌクレオチド 1 1 ：
5' -tagcggccgcaagtctgatacgacccggtc-35
ォリゴヌクレオチド 1 2 ：
5' -gaactagtaacgactgtagtccaagtaagg-35
オリゴヌクレオチド 1 3 ：
5， -aagtctgatacgacccggta-3'
オリゴヌクレオチド 1 4 ：
5' -acgactgtagtccaagtaacg-33
オリゴヌクレオチド 1 5 ：
5， -tagcggccgcaagtctgatacgacccggta-3'
オリゴヌクレオチド 1 6 ：
5' -gaactagtaacgactgtagtccaagtaacg-3'
次に、 形質転換した大腸菌から、 公知の手法により組換え体プラスミ ドを抽出した。 このプラスミ ドの抽出は、 複数個のコロニ一について行 つた。 そして、 抽出したそれそれの組換え体プラスミ ドについて、 組み 込まれた cDNA断片の塩基配列を決定した。 このような遺伝子解析を、 遺 伝子 A〜遺伝子 D由来の各 cDNA断片について同様に行った。 その結果を 表 1に示す。 なお、 かっこ内の数値は、 各 cDNA断片の長さ （両アダプタ 一配列を含む。） を表す。
【表 1】
Figure imgf000020_0001
表 1から明らかなように、 A遺伝子由来の cDNA断片の回収においては、 遺伝子解析を行った組換え体プラスミ ドのうち、 約 6 7 %が目的とする cMA断片を含むものであった。 また、 B遺伝子由来の cDNA断片の回収に おいては、 遺伝子解析を行った組換え体プラスミ ドのうち、 約 5 7 %が 目的とする cDNA断片.を含むものであった。 また、 C遺伝子由来の cDNA断 片の回収においては、 遺伝子解析を行った組換え体プラスミ ドのうち、 1 0 0 %が目的とする cDNA断片を含むものであった。 同様に、 D遺伝子 由来の cDNA断片の回収においては、 遺伝子解析を行った組換え体プラス. ミ ドのうち、 1 0 0 %が目的とする cDNA断片を含むものであった。
この結果から、 本実施例の方法に従って cDNA断片の群から目的とする cDNA断片を回収すれば、 より確実に目的の cDNA断片を回収することがで きることが判る。
以上で説明したように、 本実施例の DNA回収法によれば、選択した cDNA 断片の群について予め PCR反応を行うので、その cDNA断片の群を多量に増 幅することができる。従って、目的とする cDNA断片が低濃度であっても、 それを大幅に増幅することができ、 ゲル電気泳動におい tそれを検出す ることができる。
また、 この PCR反応では、 標識物質を有するプライマーを用いているの で、 PCR産物も標識物質を含むことになる。 従って、 目的とする cDNA断片 が少なかったとしても、 電気泳動においてこの標識物質を認識すること で、目的とする cDNA断片のゲル中の位置を容易に検出することができる。 さらに、 cDNA断片の群をゲル電気泳動によって分画するため、 例えば キヤビラリ一カラムによる電気泳動に比べ、 サイズ分解能を向上させ、 目的とする cMA断片のみをより特異的に回収することができる。
また、 第 1アダプタ一配列及び第 2アダプター配列は、 それぞれ 1 5 塩基前後としてあるので、 安定した PCR反応を行い、 効率よく cDNA断片を 増幅することができる。
また、標識物質として、 蛍光物質である近赤外蛍光色素 IRD- 800を使用 しているので、 ゲル電気泳動において cDNA断片の検出感度を向上させる ことできる。
また、 本実施例では、 回収工程で回収した cDNA断片について、 再度 PCR 反応を行う第 2 PCR工程を備える。 このため、 回収した cDNA断片が少量し かなくても、 それを大幅に増幅させることができる。
さらに、 本実施例では、 第 2 PCR工程後、 cMA断片をプラスミ ドぺク夕 —に連結し、 組換え体プラスミ ドを形成する連結工程と、 さらに、 この 組換え体プラスミ ドを大腸菌に導入する導入工程とを備える。このため、 cMA断片の構造解析をする場合などに有効である。 即ち、 形質転換した その大腸菌を培養し、それから cDNA断片を有するプラスミ ド MAを抽出す れば、 これを容易に構造解析 （例えば、 塩基配列の決定） に用いること ができる。
(実施例 2 )
次いで、 第 2の実施例について説明する。 なお、 上記実施例 1 と同様 な部分の説明は、 省略または簡略化する。
上記の方法を用いて目的とする cDNA断片を回収しても、 回収率のやや 低いサンプルもあった （表 1参照）。 これは、 目的の cDNA断片の量そのも のが少ないためである。 従って、 目的の cDM断片が存在する所のゲルの みを正確に切り出すことができれば、他の cMA断片の混入は少なくなり、 目的の cDNA断片の回収率も向上するはずである。 そこで、 目的の cDNA断 片の回収率の向上させるため、 以下の方法を用いて実験を行った。
上記実施例 1 と同様にして第 1 PCR工程までの作業を行った。
そして、 電気泳動工程において、 上記実施例 1 と同様にアクリルアミ ドゲル電気泳動を行った。 その後は、 再度同一サンプルを電気泳動する のではなく、 最初に電気泳動を行ったゲルについて、 濾紙を使用してゲ ルをゲル板から剥がした。 続いて、 濾紙にくっついたゲルを蛍光色素の 検出できるスキャナ一上に載置し、 ゲル全体をイメージ化した。 そうす ることにより、 より低濃度の cDNA断片につても、 その cDNA断片を含むゲ ルのみを正確に回収することができた。
回収工程後は、上記実施例 1 と同様にして、 第 2 PCR工程と連結工程と 導入工程を行った。
また、 上記実施例 1 と同様に、 形質転換した大腸菌から、 公知の手法 により組換え体プラスミ ドを抽出し、 挿入された cDNA断片の塩基配列を 決定した。 このような遺伝子解析を、 遺伝子 E由来の cDNA断片について 同様に行った。
なお、 E遺伝子由来の cDNA断片の回収にあたり、 サンプルには、 上記 A〜D遺伝子を回収した cDNA断片の群とは異なる cDNAの群を前述の方法 により作成した。
また、 サンプルとした cDNA断片の群が異なることに伴い、 第 1 プライ マ一^ ^第 4プライマーも、 その塩基配列が若干異なるものを使用した。 具体的には、 第 1プライマ一としてオリゴヌクレオチ ド 1 7を、 第 2プ ライマ一としてオリゴヌクレオチド 1 8を、 第 3プライマーとしてオリ ゴヌクレオチド 1 9を、 第 4プライマ一としてオリゴヌクレオチ ド 2 0 を使用した。
ォリゴヌクレオチド 1 7 ：
5， -aagtctgatacgacccggta-3'
オリゴヌクレオチド 1 8 ：
5' -acgactgtagtccaagtaacg-35
オリゴヌクレオチド 1 9 ：
5， -tagcggccgcaagtctgatacgacccggta-35
オリゴヌクレオチド 2 0 ：
5 -gaactagtaacgactgtagtccaagtaacg-3'
その結果、 比較例として、 実施例 1 と同様にして E遺伝子由来の cDNA 断片を回収した場合には、 遺伝子解析を行った組換え体プラスミ ドのう ち、 約 8 0 %が目的とする cDNA断片を含むものであった。 これに対し、 本実施例の方法により E遺伝子由来の cDNA断片を回収した場合には、 遺 伝子解析を行った組換え体プラスミ ドのうち、 約 1 0 0 %が目的とする cDNA断片を含むものであった。
この結果から、 本実施例の方法に従って cDNA断片の群から目的とする cDNA断片を回収すれば、 上記実施例 1の方法に比ぺ、 さらに確実に目的 の cDNA断片を回収することができることが判る。
また、 その他、 上記実施例 1 と同様な部分については、 同様な効果を 奏する。
(実施例 3 )
次いで、 第 3の実施例について説明する。 なお、 上記各実施例のいず れかと同様な部分の説明は、 省略または簡略化する。
実施例 1及び実施例 2では、 既知の遺伝子由来の cDNA断片を回収して 解析したが、 本実施例では、 未知の遺伝子由来の cDNA断片を回収して解 析する。 未知の遺伝子由来の cDNA断片を解析する場合、 回収した cDNA断 片が目的のものであるか否かを判断するために、 2つの方法が考えられ る o
即ち、 1つは、 cDNA断片の群をマーカ一と共にゲル電気泳動した場合 に目的とする cDNA断片の長さとマーカ一の長さとがー致するなど、 目的 の cDNA断片の長さが正確に判る場合には、 回収して解析した cDNA断片の 長さから、 それが目的の cDNA断片か否かを判断する。
具体的には、 上記各実施例 1， 2と同様にして第 l PCiOl程までの作業 を行った。 その後、 増幅された cDNA断片の群について、 アク リルアミ ド ゲル電気泳動を行った。 そして、 分画された cDNA断片のうち、 2 0 0 bp の長さのマーカ一にちようど一致する 2 0 0 bpの長さ （両アダプタ一配 列を含む。）の cDNA断片に着目し、 これを回収の目的とする cDNA断片とし た。 その後、 上記実施例 1 と同様にして、 目的の cDNA断片を回収した。 回収工程後は、 第 2 PCR工程を行った。 本実施例では、 PCR反応液にさ らに iL ifiiiの RecA夕ンパク質をプライマー 2 0 pmolあたり、 5 0 0 ngの 割合で混合した。
その後は、上記実施例 1， 2 と同様に、連結工程と導入工程を行った。 なお、第 1 PCR工程に用いた第 1 プライマーはォリゴヌクレオチ ド 2 1 からなり、 第 2プライマーはオリゴヌクレオチド 2 2からなる。 また、 第 2 PCR工程に用いた第 3プライマ一はオリゴヌクレオチ ド 2 3からな り、 第 4プライマーはォリゴヌクレオチド 2 4からなる。
ォリゴヌクレオチド 2 1 ：
5， -aagtctgatacgacccggtt-35 W
24 オリゴヌクレオチド 2 2 ：
5' -acgactgtagtccaagtaagt-3
ォリゴヌクレオチド 2 3 ：
5' -tagcggccgcaagtctgatacgacccggtt-3"
オリゴヌクレオチド 2 4 ：
5' -gaactagtaacgactgtagtccaagtaagt-3'
次に、 上記各実施例 1 , 2 と同様に、 形質転換した大腸菌から、 公知 の手法により組換え体プラスミ ドを抽出し、 挿入された cDNA断片の塩基 配列を決定した。その結果、塩基配列の長さが 2 0 O bpである場合には、0 目的の cDNA断片であると判断し、 塩基配列の長さが 2 0 0 bpでない場合 には、 目的の cDNA断片ではないと判断した。 また、 比較例として、 第 2 PCR工程で RecAタンパク質を加えず、 DNAポリメラ一ゼ （KOD Dash) だけ で PCR反応を行い、 その他の工程は上記と同様にした場合も、 目的の cDNA 断片の回収率を調査した。
5 また、 別の比較例として、 第 2 PCR工程で RecAタンパク質の代わりに iLciiliの SSBタンパク質 （s ingle strand DNA binding protein) を加え て PCR反応を行い、 その他の工程は上記と同様にした場合も、 目的の cDNA 断片の回収率を調査した。
これらの結果を表 2に示す。
0
【表 2】
Figure imgf000025_0001
表 2から明らかなように、 2 0 O bpの cDNA断片の回収においては、 解 析を行った組換え体プラスミ ドのうち、約 3 3 . 3 0 %が目的とする cDNA5 断片を含むものであった。 これに対し、 第 2 PCIO:程で RecA夕ンパク質を 加えなかった場合には、 この回収率が約 8 . 3 0 %まで低下した。また、 第 2 PCR工程で RecA夕ンパク質の代わりに SSBタンパク質を加えた場合に は、 この回収率が 1 %以下にまで低下した。
この結果から、第 2 PCEI工程において RecA夕ンパク質を加えることによ り、 目的とする cDNA断片の回収率を大幅に向上させることができること が判る。 この理由は、 RecAタンパク質を反応液に混合して PCRを行うと、 cDNA断片の収量を減少させることなく、 副産物 （非特異的な PCR産物） の 増幅を低く抑えることができるためであると考えられる。
このように、 本実施例では、 第 2 PCR工程において、 RecAタンパク質を 反応液に混合して PCRを行い、 cDNA断片の群を増幅させる。このため、 cDNA 断片の群の収量を減少させることなく、 副産物 （非特異的な PCR産物） の 増幅を低く抑えることができる。 即ち、 上記の相同組み換えタンパク質 が存在することにより、 プライマ一が cDNA断片の非特異的な領域に結合 してプライマ一伸長反応を起こすことが抑制されるため、非特異的な PCR 産物の増幅を抑制することができる。
また、 上記のように特異性が高いため、 アニーリング温度等、 プライ マー伸長反応の温度条件を変えても、 cDNA断片の群を特異的に増幅させ ることができる。 即ち、 従来の PCR方法では、 アニーリング温度等、 ブラ イマ一伸長反応の温度を低く設定すると、 cDNA断片の群だけでなく、 副 産物も多量に増幅されることとなるが、 本実施例によれば、 cDNA断片の 群をより特異的に増幅させることが可能となる。
これらの結果、 より確実に目的の cDNA断片を回収することができる。 さらに、 本実施例では、 RecAタンパク質を、 プライマ一 2 0 pmolあた り、 l ng〜 1 0 0 O ngの範囲で混合しているので、 より効率よく特異的 に、 cDNA断片を増幅することができる。
次に、 未知の遺伝子由来の cDNA断片を回収して解析するもう一つの方 法について説明する。 cDNA断片の群をゲル電気泳動しても、 目的とする cMA断片の長さが正確には判らない場合には、 回収して解析した cDNA断 片の塩基配列に基づいて適当な一組のプライマーを作製し、 RT-PCRによ り解析した cDNA断片が目的のものであるか否かを判断する。 具体的には、.上記各実施例 1 , 2 と同様にして第 1 PCR工程までの作業 を行った。 その後、 増幅された cDNA断片の群について、 アクリルアミ ド ゲル電気泳動を行った。 そして、 分画された cDNA断片のうち、 約 2 3 0 bpの長さ （両アダプタ一配列を含む。） の cDNA断片に着目し、 これを回収 の目的とする cDNA断片とした。 その後、 上記実施例 1 と同様にして、 目 的の cDNA断片を回収した。
回収工程後は、 第 2 PCR工程を行った。
その後は、上記実施例 1 , 2 と同様に、連結工程と導入工程を行った。 なお、第 1 PCR工程に用いた第 1プライマ一はォリゴヌクレオチド 2 5 からなり、 第 2プライマーはオリゴヌクレオチド 2 6からなる。 また、 第 2 PCR工程に用いた第 3プライマ一はオリゴヌクレオチド 2 7からな り、 第 4プライマ一はォリゴヌクレオチド 2 8からなる。
オリゴヌクレオチド 2 5 ：
5， -aagtctgatacgacccgggt-3'
オリゴヌクレオチド 2 6 ：
5， -acgactgtagtccaagtaagt-3'
オリゴヌクレオチド 2 7 ：
5' -tagcggccgcaagtctgatacgacccgggt-3
オリゴヌクレオチド 2 8 ：
5 -gaactagtaacgactgtagtccaagtaagt-3'
次に、 上記各実施例 1， 2 と同様に、 形質転換した大腸菌から、 公知 の手法により組換え体プラスミ ドを抽出し、 挿入された cDNA断片の塩基 配列を決定した。 そして、 回収率の高かった cDNA断片の塩基配列に基づ いて一組のプライマ一を作製した。 これらのプライマーは、 オリゴヌク レオチド 2 9 とオリゴヌクレオチド 3 0からなる。
オリゴヌクレオチド 2 9 ：
5' -ccagcaacctacaacaaca-3
オリゴヌクレオチド 3 0 ：
5' -caactggtgcatcgccttcat-35 次に、 これらのプライマ一を用いて、 サンプルとした元の cDNA断片の 群について PCR反応を行った。 また、 比較例として、 同一のサンプルにつ いて、 RecA夕ンパク質を加えず、 MAポリメラーゼ （KOD Dash) だけで PCR 反応を行った。 また、 別の比較例として、 同一のサンプルについて、 RecA 夕ンパク質の代わりに SSB夕ンパク質を加えて PCR反応を行った。続いて、 これらの反応物についてゲル電気泳動を行った。 その結果を第 6図に示 す。
第 6図から明らかなように、 RT - PCRによる抽出断片の確認においても、 PCR条件により良好な結果が得られる場合と、そうでない場合に分かれた c 即ち、レーン 2に示すように、 RecA夕ンパク質を PCR反応液に添加すると、 目的の cDNA断片が特異的に増幅された。 これに対し、 レーン 1に示すよ うに、 KOD Dash ( MAポリメラ一ゼ） のみで PC&反応を行った場合には、 レーン全体がスメァ状になり、目的の DNA断片のみを増幅させることがで きなかった。 また、 レーン 3に示すように、 RecAタンパク質の代わりに SSB夕ンパク質を添加した場合には、スメァ状になることは改善されたが、 エキス トラパン ドが見られた。このことは目的物以外の DNA断片の増幅が 考えられる。
この結果から、 RT- PCRによる目的とする cDNA断片の確認においても、 RecAタンパク質を加えることにより、 目的とする cDNA断片だけを特異的 に増幅させることができることが判る。 また、 回収した cDNA断片の確認 にも効果がある。
以上において、 本発明の実施の形態を実施例に即して説明したが、 本 発明は上記各実施例に限定されるものではなく、 その要旨を逸脱しない 範囲で、 適宜変更して適用できることは言うまでもない。 産業上の利用可能性
以上の説明から明らかなように本発明によれば、 様々な種類の cMA 断片が混在する cDNA断片の群から目的とする cDNA断片をより確実に回 収することができる MA回収法を提供することができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 一端に第 1アダプター配列を有し他端に第 2アダプタ一配列を有 する cDNA断片の群について、 上記第 1アダプタ一配列に相補的な配列を 有すると共に標識物質を有する第 1プライマ一と、 上記第 2アダプター 配列に相補的な配列を有する第 2プライマーとを用いて、 PCR反応を行う 第 1 PCR工程と、
上記第 1 PCR工程で増幅された cDNA断片の群についてゲル電気泳動を 行う電気泳動工程と、
上記電気泳動工程の結果に基づいて、 ゲルから目的の cDNA断片を含む ゲルを切り出し、 当該 cDNA断片を回収する回収工程と、
を備えることを特徴とする DNA回収法。
2 . 請求項 1に記載の DNA回収法であって、
前記回収工程で回収した cDNA断片について、 前記第 1アダプター配列 に相補的な配列を有する第 3プライマ一と、 前記第 2アダプタ一配列に 相補的な配列を有する第 4プライマーとを用いて、再度 PCR反応を行う第 2 PCR工程を備える
ことを特徴とする DNA回収法。
3 . 請求項 2に記載の DNA回収法であって、
前記第 2 PCR工程において、 RecA夕ンパク質及びこの RecA夕ンパク質を 改変したタンパク質であってこの RecA夕ンパク質と類似する機能を有す る RecA改変夕ンパク質の少なく ともいずれかを含む相同的組換えタンパ ク質を反応液に混合して、 PCRを行う
ことを特徴とする MA回収法。
4 . 請求項 1〜請求項 3のいずれか一項に記載の DNA回収法であって、 前記回収工程後、 または、 前記第 2 PCR工程を有する場合には第 2 PCR 工程後、 前記 cDNA断片をプラスミ ドぺク夕一に連結し、 組換え体プラス ミ ドを形成する連結工程と、
上記組換え体プラスミ ドを大腸菌に導入する導入工程と、 を備えることを特徴とする DNA回収法。
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