WO2004033679A1 - Abbau und modifizierung von silicaten und siliconen durch silicase und verwendung des reversiblen enzyms - Google Patents

Abbau und modifizierung von silicaten und siliconen durch silicase und verwendung des reversiblen enzyms Download PDF

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Werner E. G. MÜLLER
Heinz SCHRÖDER
Anatoli Krasko
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P3/00—Preparation of elements or inorganic compounds except carbon dioxide

Definitions

  • Silicon is the second most common element in the earth's crust and occurs in a wide variety of compounds. Silicon compounds are not only the most species-rich class of minerals, but are also economically significant. Technically used materials made of silicates are, for example, glass, porcelain, enamel, pottery, cement and water glass. Some silicates have catalytic properties. By partially replacing the lattice sites occupied by silicon with other elements, especially aluminum, the variety in the possible structures and technical applications is expanded. The aluminosilicates, to which the feldspars and the zeolites belong, are of importance u. a. due to their molecular sieve and ion exchange properties. Other silicon compounds such as silicones (siloxanes) have u. a. also medical significance, such as for the manufacture of implants.
  • Silicon dioxide occurs in both crystalline and amorphous form.
  • the various forms of crystalline SiO 2 include quartz, tridymite and cristobalite.
  • Agate, opal and flint are amorphous silicon dioxide minerals. In all these forms, silicon has the coordination number 4 and is tetrahedrally surrounded by four oxygen atoms.
  • the shells of diatoms (diatoms) and the needles (spiculae) of sponges are made of amorphous SiO 2 .
  • the acid molecules formed by proton absorption condense with one another to form polysilicic acids, whereby the solution becomes gel-like.
  • three-dimensional structures, which correspond to the composition SiO 2 result from the initially obtained chains or networks.
  • the silicates can be divided into .1.) Silicates with discrete anions, namely 1a.) Island silicates (ortho-silicates with the anion [SiO 4 ] 2 " ; example: phenakite, olivine, zirconium), 1b.) Group silicates (linking the SiO 4 tetrahedra to short-chain units; example: disilicates and tri-silicates) and 1c.) Ring silicates (ring linking the SiO 4 tetrahedra; example: benitoid with a 3-membered ring, Axinite with 4-membered ring and beryl with 6-membered ring), 2.) chain silicates and band silicates (chain-like interconnected SiO 4 tetrahedra, which are polymers of the anion [SiO 3 ] 2 " , and band-shaped Molecules that are created by linking several SiO 4 chains; examples: hornblende, asbestos), 3.)
  • silicones are formed by partially replacing the OH groups of the silica with monovalent organanyl residues that do not participate in the condensation process. They are divided into: 1.) linear polysiloxanes (type: R 3 SiO [R 2 SiO] nSiR 3 ), 2.) branched polysiloxanes (with trifunctional or tetrafunctional siloxane units at the branching points), 3.) cyclic polysiloxanes (from difunctional siloxane units) and 4.) cross-linked polymers (linking of chain or ring-shaped molecules to two- or three-dimensional networks).
  • linear polysiloxanes type: R 3 SiO [R 2 SiO] nSiR 3
  • branched polysiloxanes with trifunctional or tetrafunctional siloxane units at the branching points
  • cyclic polysiloxanes from difunctional siloxane units
  • cross-linked polymers linking of chain or ring-shaped molecules to two- or three-dimensional networks.
  • Silicones are important technical materials.
  • the viscosity of the chain-shaped silicones increases with increasing chain length.
  • Silicones that are cross-linked to a small extent show rubber elasticity (silicone rubber), highly cross-linked chains are resin-like (silicone resins).
  • silicates are only expensive to produce.
  • the process of chemical synthesis of the silicates often requires drastic conditions such as high pressure and high temperature.
  • Silica sponges like diatoms, are capable of using special enzymes to form silicate structures under mild conditions, ie at a relatively low temperature and pressure.
  • the SiO 2 synthesis in these organisms is characterized by high specificity, controllability and the possibility of the synthesis of defined microstructures (nanostructures).
  • the main elements of the skeleton of the pebble sponges are the acicular spicules, which in the group of demospongia (horn sponges) and hexactinellida (glass sponges) consist of amorphous, non-crystalline silicon dioxide.
  • demospongia and Hexactinellidae are the only metazoa that have silica instead of calcium in their skeleton.
  • the opal silicon dioxide in the spicules of the silica sponges contains 6-13% water, which gives the approximate formula (SiO 2 ) 2 - 5 'H 2 O (Schwab DW, Shore RE (1971) Mechanism of internal stratification of siliceous spicules. Nature 232 : 501-502).
  • silicatein isolated from natural sources is able to synthesize amorphous silicon dioxide (polysilicic acids and polysilicates) from organic silicon compounds (alkoxysilanes) (Cha JN, Shimizu K, Zhou Y, Christiansen SC, Chmelka BF, Stucky GD, Morse DE (1999) Silicatein filaments and subunits from a marine sponge direct the polymerization of silica and silicones in vitro. Proc Natl Acad Sei USA 96: 361-365).
  • sicase an enzyme that is able to dissolve both amorphous and crystalline silicon dioxide.
  • Silicase is able to perform two functions: first, it has the ability (i) to dissolve lime material in analogy to carbonic anhydrase and (ii) - and this was surprising - also to dissolve silicon dioxide with the formation of silica. Therefore, the silicase - first found in S. domuncula - is able to participate both in the catabolism of calcareous material and in the catabolism of the siliceous spicules.
  • the silicase gene can be induced by increasing the silicon concentrations in the medium (to usually 60 ⁇ M) (see Figure 7).
  • a process for the in vitro or in vivo degradation of amorphous or crystalline silicon dioxide (condensation products of silicic acid, silicates), silicones and other silicon (IV) or metal (IV) compounds and of Copolymers of these compounds wherein a polypeptide or a metal complex of a polypeptide is used for degradation, characterized in that the polypeptide comprises an animal, bacterial, vegetable or fungal carbonic anhydrase domain which has at least 25% sequence similarity (see Figure 3 ) to the sequence shown in SEQ ID No. 1. It was not previously known that enzymes containing such carbonic anhydrase domains are able to degrade such silicates or silicones.
  • a further aspect of the present invention relates to a process for the synthesis of amorphous silicon dioxide (condensation products of silicic acid, silicates), silicones and other silicon (IV) or metal (IV) compounds and of mixed polymers of these compounds , wherein a polypeptide or a metal complex of a polypeptide for synthesis is used, characterized in that the polypeptide comprises an animal, bacterial, vegetable or fungal carbonic anhydrase domain which has at least 25% sequence similarity to the sequence shown in SEQ ID No. 1.
  • a process according to the invention is preferred which is characterized in that compounds such as silicas, monoalkoxysilane triols, dialkoxysilane diols, trialkoxysilanols, tetraalkoxysilanes, alkyl or aryl silane triols, alkyl or aryl monoalkoxysilane diols, alkyl or aryl dialkoxysilanols are used for the synthesis - Or aryl trialkoxysilanes or other metal (IV) compounds are used as reactants (substrates).
  • metal (IV) compounds are used as reactants (substrates).
  • the formation can be defined by the polypeptide or a metal complex of the polypeptide or the binding of the polypeptide or a metal complex of the polypeptide to other molecules or the surfaces of glass, metals, metal oxides, plastics, biopolymers or other materials two- and three-dimensional structures.
  • a method for modifying a structure or surface containing silica or silicon (IV) or metal (IV) compound, a polypeptide or a metal complex of a polypeptide being used for the modification characterized in that that the polypeptide comprises an animal, bacterial, vegetable or fungal carbonic anhydrase domain which has at least 25% sequence similarity to the sequence shown in SEQ ID No. 1.
  • the structure or surface containing silicic acid is preferably in the form of a precious stone or semi-precious stone.
  • a method according to the invention is preferred, the modification comprising smoothing, etching or producing bores in the structure or surface containing silica or silicon (IV) or metal (IV) compound by means of the polypeptide or a metal complex of the polypeptide.
  • Another aspect of the present invention relates to a chemical compound or silica-containing structure or surface, which was obtained by a method according to the invention, in particular in the form of a gemstone or semi-precious stone.
  • a further aspect of the present invention also relates to a polypeptide of a silicase from Suberites domuncula according to SEQ ID No. 1 or a polypeptide homologous thereto which has at least 25% sequence similarity in the amino acid sequence of the carbonic anhydrase domain to the sequence shown in SEQ ID No. 1 , a metal complex of the polypeptide, or parts thereof.
  • nucleic acid in particular according to SEQ ID No. 2, characterized in that it essentially codes for a polypeptide of the invention.
  • the nucleic acid according to the invention can be in the form of a DNA, cDNA, RNA or mixture thereof and can be characterized in that the sequence of the nucleic acid has at least one intron and / or a polyA sequence.
  • Another aspect of the present invention relates to the nucleic acid according to the invention in the form of its complementary “antisense” sequence.
  • a still further aspect of the present invention also relates to a nucleic acid according to the invention in the form of a (a) fusion protein (chimeric protein) construct, (b) construct with separate protein expression (protease cleavage site) or (c) construct with separate protein expression (cassette expression).
  • the nucleic acid according to the invention can have been produced synthetically. Methods of doing this are well known in the art.
  • Another aspect of the invention relates to a vector, preferably in the form of a plasmid, shuttle vector, phagemid, cosmid, expression vector, retroviral vector, adenoviral vector or particle, nanoparticle or liposome, the vector containing a nucleic acid according to the invention.
  • vectors can be provided for the transfer of proteins, preferably in the form of a nanoparticle or liposome, which comprise a polypeptide of the invention.
  • a host cell transfected with a vector or infected or transduced with a particle according to the invention.
  • This host cell can be characterized in that it expresses a polypeptide according to claim 1, a metal complex of the polypeptide or parts thereof.
  • All known host cell organisms are suitable as host cells, such as yeasts, fungi, sponges, bacteria, CHO cells or insect cells.
  • the polypeptide according to the invention can be characterized in that it has been produced synthetically or in that the polypeptide or the metal complex of the polypeptide is present in a prokaryotic or eukaryotic cell extract or lysate.
  • the cell extract or lysate can be obtained from a cell ex vivo or ex vitro, for example a recombinant bacterial cell or a sea sponge.
  • polypeptide according to the invention can be purified by conventional methods known in the art and can therefore be essentially free of other proteins.
  • a further aspect of the present invention then relates to a method for finding inhibitors or activators of a polypeptide of a silicase from Subites domuncula according to SEQ ID No. 1 or a polypeptide homologous thereto which has at least 25% sequence similarity in the amino acid sequence of the carbonic anhydrase domain of the sequence shown in SEQ ID No. 1, wherein a) a polypeptide of a silicase from Suberites domuncula according to SEQ ID No. 1 or a homologous polypeptide which has at least 25% sequence similarity in the amino acid sequence of the carbonic anhydrase domain to that in SEQ ID No.
  • step b) the polypeptide from step a) is brought into contact with an optional inhibitor or activator, and c) the ability of the polypeptide is measured to degrade or synthesize silicates or silicones.
  • This procedure can be used to detect valuable substances that may be suitable as therapeutic agents (see below for more information).
  • Methods for finding such substances are known to the person skilled in the art and include, for example, the use of radioactively labeled or enzymatically labeled candidate Connections. Methods for measuring the activity of the silicase are described below and can easily be adapted to a test format by those skilled in the art.
  • An inhibitor substantially completely reduces the activity of the enzyme, an activator induces an activity or increases it above the initial level.
  • the polypeptide of a Silicites from Suberites domuncula according to SEQ ID No. 1 or a polypeptide homologous thereto which has at least 25% sequence similarity to the sequence shown in SEQ ID No. 1 in the amino acid sequence of the carbonic anhydrase domain is provided in vivo, in a prokaryotic or eukaryotic cell extract or lysate or in a purified form for the test.
  • a still further aspect of the invention relates to a method for producing a pharmaceutical composition, comprising a) finding an inhibitor or activator according to claim 25 or 26 and b) mixing the inhibitor or activator found as stated above with a pharmaceutically suitable carrier or auxiliary.
  • This composition provides valuable pharmaceuticals which, like the polypeptide or a nucleic acid of the invention, can be used for the prevention or therapy of silicosis. Use is preferred, the prevention and therapy of silicosis being carried out by dissolving quartz crystals.
  • the use of a polypeptide or a nucleic acid or pharmaceutical composition according to the invention for resorption or for modulating the resorbability of silicones and silicone implants can take place.
  • the present invention can also be used for transfecting cells with nucleic acids according to the invention for resorption or for modulating the resorbability of silicones and silicone implants.
  • the above-mentioned uses and the methods for this are known to the person skilled in the art and can easily be adapted to the needs and requirements present here.
  • the cDNA (called: SDSIA) coding for the silicase from the sea sponge S. domuncula and the polypeptide derived from the nucleotide sequence (called: SIA_SUBDO) have the following properties. Length of the cDNA: 1395 nucleotides (nt); open reading grid: from nt ⁇ 22 - nt ⁇ 24 to nti25_ - nti26i (stop codon); Length of the polypeptide: 379 amino acids; molecular weight (M r ) of the polypeptide: 43131; isoelectric point (pl): 6.5 (calculated with: PC / GENE (1995) Data Banks CD-ROM; Release 14.0. IntelliGenetics, Inc. Mountain View, CA).
  • Figure 2 shows the nucleotide sequence of the sponge silicase cDNA identified using the differential display technique
  • Figure 2 top and bottom
  • Figure 3A show the polypeptide of the sponge silicase (SIA_SUBDO) derived from the nucleotide sequence.
  • the deduced amino acid sequence of the sponge silicase is very similar to the amino acid sequences of the carbonic anhydrase family. So far, more than seven isoenzymes of carbonic anhydrases have been identified in humans (Sun MK, Alkon DL (2002) Carbonic anhydrase gating of attention: memory therapy and enhancement. Trends Pharmac Sei 23: 83-89).
  • the "Expect value” [£] (Coligan JE, Dünn BM, Ploegh HL, Speicher DW, Wingfield PT (2000) Current protocols in protein science.
  • the carbonic anhydrases form a family of zinc metal enzymes that are involved in the reversible hydration of CO 2 (Sly WS, Hu PY (1995) Human carbonic anhydrases and carbonic anhydrase deficiencies. Annu. Rev. Biochem. 64: 375-401).
  • the three conserved histidine residues are found in the silicase at the amino acids aa ⁇ s ⁇ , aai83 and aa 2 _6 ( Figure 3A).
  • Figure 3B shows the position of the sponge silicase among various selected representatives of the carbonic anhydrase family (phylogenetic tree; "rooted tree” with the bacterial carbonic anhydrase sequence from Neisseria gonorrhoeae).
  • the sponge silicase together with the carbonic anhydrase from Caenorhabditis elegans, forms the basis for the carbon anhydrases of the other metazoa.
  • the metazoan enzymes are separated from the plant enzymes and also from the bacterial enzymes.
  • the silicase can be purified from tissues or cells or produced recombinantly.
  • the homogenized tissue (or, for example, in a Tris-SO / sodium sulfate buffer (pH 8.7)) is (which the cells homogenized in this buffer) are centrifuged and an affinity chromatography matrix such as CM-Bio-Gel A, coupled with p-aminomethylbenzenesulfonamide, is added to the supernatant obtained.
  • an affinity chromatography matrix such as CM-Bio-Gel A, coupled with p-aminomethylbenzenesulfonamide
  • the affinity gel is then collected by suction through a glass filter and washed with a buffer (for example 0.1 M Tris-SO 4 , pH 8.7, containing 0.2 M Na 2 SO 4 , 1 mM benzamidine and 20% glycerol). It is then expedient to connect a second washing step with the same buffer at a lower pH (for example pH 7.0) in order to remove non-specifically bound proteins.
  • the gel is then transferred to a column and washed with the same buffer (pH 7.0).
  • a 0.1 M Tris-SO 4 buffer, pH 7.0, containing 0.4 M NaN 3 , 1 mM benzamidine and 20% glycerol can be used to elute the enzyme.
  • the eluted enzyme protein is then dialyzed, for example, against a 10 mM Tris-SO 4 buffer, pH 7.5, containing 1 mM benzamidine and then placed on an ion exchange column (for example DEAE-Sephacel), which is used, for example, with 10 mM Tris SO, pH 7.5, has been equilibrated.
  • an ion exchange column for example DEAE-Sephacel
  • the enzyme is eluted by applying a linear salt gradient (for example 0 to 0.1 M Na 2 SO 4 ) and collected. This procedure can be used to purify the silicase from the S. domuncula sponge, among others.
  • RNA is isolated from control cultures (maintained at a low silicon concentration of 5 ⁇ M) and from cultures treated in the presence of 60 ⁇ M silicon using TRIzol reagent (GibcoBRL).
  • the synthesis of the first strand of cDNA is carried out using "anchored" oligo (dT) primers and AMV reverse transcriptase according to the manufacturer's instructions (Promega).
  • the resulting cDNA is diluted ten-fold with H 2 O and an aliquot part of it (2 ul) subjected to the polymerase chain reaction (PCR).
  • the reaction is carried out in a volume of 20 ⁇ l after addition of the “arbitrary” primer 1 (5'-GTGATCGCAG-3 ') or 2 (5'-CTTGATTGCC-3') and 2 ⁇ M dNTP, TuGC, 5 units of BioThem polymerase ( Genecraft) and [ ⁇ - 32 P] dATP.
  • reaction conditions have proven to be suitable for the PCR: initial denaturation at 95 ° C. for 5 minutes, then 40 amplification cycles at 95 ° C. each for 20 seconds, 42 ° C. for 120 seconds, 72 ° C. for 30 seconds, followed by one Final incubation at 72 ° C for 10 minutes.
  • the samples are then separated in a 5% polyacrylamide gel (in 1 x TBE). After the run, the gel is dried and exposed to an X-ray film for 4 days.
  • the bands of interest, detected in the autoradiogram are cut out, boiled in 200 ⁇ l H 2 O for 15 minutes, cooled on ice and centrifuged for 10 minutes at 14,000 ⁇ g.
  • the resulting supernatants are mixed with the same volume of 10 M ammonium acetate, 20 ⁇ g / ml tRNA and precipitated with 2.5 volumes of ethanol at -80 ° C. overnight.
  • the cDNA pellets are washed three times in 75% ethanol and dissolved in 20 ⁇ l H 2 O.
  • transcripts are selected which are differentially expressed, ie which are additionally obtained in the gels with the RNAs of cells which have been treated with 60 ⁇ M silica ( Figure 1).
  • the identified cDNAs / transcripts are compared with the sequences contained in the BLAST database.
  • CaM kinase II gamma (XM_044349; Expect value [£]: 1e -16 ); hypothetical protein (XP 01359, E 1, 6); MUC3B mucin (AJ291390, E 0.20); hypothetical protein (XP_067115, E 5.9); hypothetical protein (XP_090138, E 2.9); ATP-binding cassette, subfamily A member 4 (XM_001290, E 1.6); Polypeptide similar to zinc finger protein 91 (XM_091947, E 3.1); hypothetical protein (XP_104250, E 0.48), hypothetical protein (XP_169372, E 8.6); hypothetical protein (XP_104250, £ 4.1), hypothetical protein (XP_098020, E 3.3) and hypothetical protein (XP_169372, E 8.6).
  • the silicase was identified as another transcript and analyzed in greater
  • the silicase gene can also be obtained from cDNA libraries, e.g. B. in ZapExpress and in Ash chia coli XL1-Blue MRF ', with suitable degenerate primers using the PCR technique; Appropriate vector-specific primers are used for this.
  • the synthesis products obtained are used for screening in the relevant cDNA libraries.
  • the identified clones are then subcloned into a vector (for example pGem-T) and then sequenced.
  • the recombinant silicase (called: rSIA_SUBDO) is preferably produced in E. coli. However, production in yeast and mammalian cells is also possible and has been carried out successfully.
  • the expression of the SDSIA gene from S. domuncula in E. coli using the "GST (Glutathione-S-Transferase) Fusion" system (Amersham) is described below as an example.
  • GST Glutathione-S-Transferase
  • two inserts are used to eliminate potential effects of signal peptides during expression; one insert comprises the entire derived protein (long form; from amino acid aai to amino acid aa 3 _) and the other insert only amino acids aa_ 6 to aa 3 g (short form) ( Figure 3A).
  • SDSIA-I and SDSIA-s are cloned into an appropriate vector, e.g. B. in the plasmid pGEX-4T-2, which contains the glutathione S-transferase (GST) gene from Schistosoma japonicum.
  • GST glutathione S-transferase
  • Other expression vectors have also been found to be suitable.
  • expression of the silicase is usually induced by IPTG (isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside) and carried out in the presence of 1 mM ZnSO 4 for 4 or 6 hours at 37 ° C.
  • the GST fusion proteins obtained with the designation rSIA_SUBDO-l (long form; Mr 69 kDa) or rSIA_SUBDO-s (short form; M r 58 kDa) are z.
  • the proteins are then subjected to gel electrophoresis in the presence subjected to 2-mercaptoethanol.
  • Gel electrophoresis can be carried out in 10% polyacrylamide gels with 0.1% NaDodSO (PAGE). The gels are stained with Coomassie Brilliant Blue.
  • the isolation, cloning and expression of the silicase cDNA can also be carried out from other organisms, for example from (silicon dioxide-producing) diatoms (for example Cylindrotheca fusiformis).
  • diatoms for example Cylindrotheca fusiformis.
  • the extraction of diatoms in axenic cultures is state of the art (Kroger N, Bergsdorf C, Sumper M (1996) Europ J Biochem 239: 259-264).
  • the silicase is purified on an antibody affinity matrix.
  • the affinity matrix is prepared by immobilizing a silicase-specific antibody on a solid phase (CNBr-activated Sepharose or other suitable carrier). Monoclonal or polyclonal antibodies against the silicase are used as antibodies, which are produced by standard methods (Osterman LA (1984) Method of Protein and Nucleic Acid Research, Vol 2, Springer-Verlag, Berlin). The antibody is coupled to the column matrix according to the manufacturer's instructions (Pharmacia). The pure silicase is eluted by changing the pH or changing the ionic strength.
  • an assay can be used which is based on the hydrolysis of p-nitrophenylacetate (Armstrong JM, Myers DV, Verpoorte JA, Edsall JT (1966) Purification and properties of human erythrocyte carbonic anhydrase. J Biol Chem 241: 5137-5149).
  • 0.5 ml of a 3 mM p-nitrophenylacetate solution (Sigma) is mixed with 0.05 ml of a 0.3 mM Tris-HCl buffer (pH 7.6). After preincubation at 25 ° C for 5 minutes, 50 ul of the recombinant silicase (rSIA_SUBDO) are added and the increase in absorbance at 348 nm is determined over a period of 5 minutes.
  • Figure 5 shows that the activity of the recombinant silicase depends on the concentration of the enzyme in the assay. Enzyme activity is expressed in optical density (OD) units per minute. The addition of 1 ug per assay Silicase (0.56 ul) gave an activity of 0.005 OD 348n m, which increased with increasing protein concentration up to 0.04 OD 3 8nm.
  • Spicule from S. domuncula can serve as the substrate (amorphous silicon dioxide) for the silicase.
  • PBS phosphate buffer salt solution, consisting of 1.15 mM KH 2 PO 4 , 8.1 mM Na 2 HPO 4 , 137 mM NaCI and 2.7 mM KCI
  • Silicase activity can be determined as follows. Usually 100 ⁇ g of the dried spicules (powder) are added to a suitable buffer such as 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.2; 10 mM DL-dithiothreitol, 100 mM NaCI) and 0.5 mM ZnSO 4 in 2 ml Eppendorf- Added vessels. Then usually 50 ul of the recombinant silicase are added and incubated at 25 ° C (the incubation is also possible at other temperatures between 5 ° C and about 65 ° C). The average incu bation time is 60 minutes.
  • a suitable buffer such as 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.2; 10 mM DL-dithiothreitol, 100 mM NaCI) and 0.5 mM ZnSO 4 in 2 ml Eppendorf- Added vessels. Then usually 50 ul of the recombinant silicase are added and in
  • the undissolved spicules are centrifuged off (14000 ⁇ g; 15 minutes; 4 ° C.).
  • the released, soluble silica can e.g. B. with the aid of a molybdate-based detection method, such as. B. the colorimetric "Silicon Test"(Merck; 1.14794) can be determined quantitatively.
  • the amount of silica is calculated using a calibration curve with a silicon standard (Merck 1.09947) from the absorbance values at 810 nm.
  • Figure 5 shows that the recombinant silicase catalyzes the breakdown (dissolution) of amorphous silicon dioxide.
  • 3 ng of silica / assay are released at an enzyme concentration of 1 ⁇ g of recombinant silicase per assay.
  • the release of silica is 20 or 43 ng / assay.
  • sponge spicules needleles; 1 mg
  • lysate 1.5 ml
  • ZnCl 2 and 0.1 M NaCl 1 mM ZnCl 2 and 0.1 M NaCl were added
  • the mixture was then centrifuged (5 min, 14000 rpm) and the molybdate assay (kit from Merck; see above) was carried out to determine the silicate released. It was found that at 4 ° C only a very small amount of silicate was released, but at room temperature (22 ° C) and 56 ° C up to 3.4 and 4.1 ng / ml (24 h).
  • silicate-degrading activity was also present in bacterial cell extracts.
  • Silicase activity is not only measurable with the sponge enzyme, but surprisingly also with commercial carbonic anhydrases.
  • Table 2 shows the release of silicate from diatom skeletons (silicate frameworks of diatoms) and from sand by a commercial carbonic anhydrase preparation (from bovine erythrocytes; Calbiochem company).
  • the silicase reaction is reversible. Therefore, the reaction can also be used to synthesize amorphous silica or silicones.
  • a suitable expression vector for example pQE-30 vector; Qiagen
  • the stop codon in the silicase cDNA is removed.
  • the PCR technique is used and primers which have the relevant restriction sites are used for the amplification.
  • the cDNA for the second protein is obtained accordingly, the same interface at the 5'-terminus as at the 3'-terminus of the silicase cDNA (in the example Sall) and at the 3'- Terminus is different from the others (e.g. an H / ll position). If there are internal restriction sites in the cDNAs in question, alternative restriction enzymes can be used. Linkers can also be inserted between the two cDNAs.
  • the two cDNAs are ligated, purified and ligated into the pQE-30 vector by the usual methods.
  • the ligation follows the histidine tag (about 6 histidine codons).
  • the expression and purification of the fusion protein via e.g. B. the histidine tag, which is present on the recombinant protein, can on appropriate affinity columns, e.g. B. a Ni-NTA matrix can be carried out (Skorokhod A, Schcke H, Diehl-Seifert B, Steffen R, Hofmeister A, Müller WEG (1997) Cell Mol Biol 43: 509-519).
  • a protease cleavage site (such as an enterokinase site) can be cloned between the cDNA for the silicase and the cDNA for another protein.
  • a codon for a new start methionine can be inserted in front of the coding region of the gene for the further protein.
  • the fusion protein is cleaved proteolytically. Now both proteins are available separately.
  • both proteins can be expressed separately on one construct.
  • the silicase gene is connected downstream of the His tag in an expression vector.
  • a stop codon is inserted at the end of the silicase cDNA.
  • a ribosome binding site with a codon for a start methionine is cloned between the cDNA for the silicase and the cDNA for the further protein. Again, a His day precedes the cDNA for the further protein. This gene also receives a stop codon.
  • the His tags can be deleted if the proteins are used for functional analysis in the host cells concerned. 4.4. extensions
  • Both bacterial and eukaryotic cells can be used for the expression described under 4.1 to 4.3.
  • the expression described under 4.1 to 4.3 can also be used for three or more open reading frames.
  • a patent has been filed for the primmorph system (DE 19824384. Production of primmorphs from dissociated cells of sponges, corals and other invertebrates: Process for culturing cells of sponges and other invertebrates for the production and detection of bioactive substances, for the detection of environmental toxins and for Cultivation of these animals in aquariums and outdoors, inventor and applicant: Müller WEG, Brummer F).
  • Primmorphs are aggregates consisting of proliferating and differentiating cells (Müller WEG, Wien M, Batel R, Steffen R, Borojevic R, Custodio MR (1999) Establishment of a primary cell culture from a sponge: Primmorphs from Suberites domuncula. Marine Ecol Progr Ser 178: 205-219). Primmorphs are formed from sponge single cells, which are obtained from sponge tissue after dissociation in Ca 2+ and Mg 2+ -free, EDTA-containing artificial sea water. After transfer into sea water containing Ca 2+ and Mg 2+ , aggregates form from the single sponge cells, which after 3 days reach a size of 1 mm, and after 5 days, primmorphs with a diameter of about 5 mm.
  • the primmorphs are surrounded by epithelial cells, the pinacocytes.
  • the cells within the primmorphs are predominantly spherical cells, along with amoebocytes and archaeocytes. 5.2. Effect of silicon on the formation of spicules
  • the primmorph system of sponges e.g. B. S. domuncula
  • the primmorph system of sponges can be used to study spicula formation or dissolution.
  • primmorphs are cultivated for 8 days in sea water, which is supplemented with 30 ⁇ M Fe (+++) (added as citrate) and 10% RPMI1640 medium.
  • the silicon concentration in the seawater / medium is 5 ⁇ M.
  • the primmorphs are either further incubated in this medium or transferred to a medium which contains 60 ⁇ M silicon (the optimum silicon concentration for the formation of spicules; added as Na hexafluorosilicate) and cultured for 1 or 3 days.
  • Primmorphs which are cultivated without the addition of silicon, show predominantly a round, spherical shape.
  • Figure 6A shows that most of the primmorphs, however, become oval in shape after additional 3 days of cultivation in the presence of 60 ⁇ M silicon. In the presence of silicon, the primmorphs begin to form spicules. The synthesis of long (> 100 ⁇ m) spicules can be observed in some cases ( Figure 6B), but smaller spicules (30 ⁇ m) are usually found ( Figure 6D). In the absence of silicon, no spicules are present (Figure 6C).
  • the expression of the silicase gene is upregulated in primmorphs of S. domuncula in the presence of silicon.
  • the expression of the following genes is increased: silicatein, collagen, myotrophin and isocitrate dehydrogenase.
  • the expression of the silicase gene can be determined by Northem blotting using methods which are state of the art and have been used, for example, to determine the expression of silicatein and collagen (Krasko A, Batel R, Schröder HC, Müller IM, Müller WEG (2000) Expression of silicatein and collagen genes in the marine sponge Suberites domuncula is controlled by silicate and myotrophin. Europ J Biochem 267: 4878-4887).
  • RNA was then extracted. A quantity of 5 ⁇ g total RNA was separated electrophoretically on a 1% formaldehyde / agarose gel and blotted onto a Hybond-N + nylon membrane in accordance with the manufacturer's instructions (Amersham). Hybridization was performed with 400 to 600 bp segments of the following probes: SDSIA (encoded for silicase), SDSILICA (encoded silicatein) and SDIDH (encoded for the ⁇ -subunit of isocitrate dehydrogenase).
  • SDSIA encoded for silicase
  • SDSILICA encoded silicatein
  • SDIDH encoded for the ⁇ -subunit of isocitrate dehydrogenase
  • the probes were labeled with the PCR-DIG-Probe-Synthesis Kit according to the manufacturer's instructions (Röche). After washing, the DIG-labeled nucleic acid with anti-DIG Fab fragments (conjugated with alkaline phosphatase; dilution: 1: 10,000) was detected and visualized using the chemiluminescence technique using CDP (Röche), the chemiluminescent substrate of alkaline phosphatase.
  • Figure 7 shows the Northern blots obtained. It can be seen that the genes for the silicase and silicatein are highly upregulated in response to higher silicon concentrations. Furthermore, the isocitrate dehydrogenase gene (encoded for an enzyme involved in the citrate cycle) is upregulated, which indicates that the formation of amorphous silicon dioxide requires an increased metabolic rate of the cells.
  • the silicase also has carbon anhydrase activity, such as with a colorimetric assay (Armstrong JM, Myers DV, Verpoorte JA, Edsall JT (1966) Purification and properties of human erythrocyte carbonic anhydrase. J Biol Chem 241: 5137-5149) can be demonstrated.
  • a colorimetric assay Armstrong JM, Myers DV, Verpoorte JA, Edsall JT (1966) Purification and properties of human erythrocyte carbonic anhydrase. J Biol Chem 241: 5137-5149
  • the silicase causes a change in pH due to the conversion of CO 2 to HCO 3 " ( Figure 8 [1]). This enables etching of lime substrates, but not of silica materials, whose solubility increases with increasing, but does not increase with falling pH.
  • a method which is "mild” and gentle on biomaterials compared to the physical / chemical methods used represents a modification of the surfaces which is based solely on biochemical / enzymatic reactions, which is possible with the aid of the method according to the invention (silicase-mediated enzymatic degradation and - as a reversible reaction - enzymatic synthesis of S1O 2 - or siloxane-containing surfaces with the help of recombinant / purified silicase).
  • the recombinant or purified from natural sources silicase in the production of surface modifications (in the coating) of silicone materials, such as silicone breast implants, endoprostheses or metal implants (improving the connection between bone and metal -Implant, biologization of the metal implants) and contact / plastic lenses.
  • silicone materials such as silicone breast implants, endoprostheses or metal implants (improving the connection between bone and metal -Implant, biologization of the metal implants) and contact / plastic lenses.
  • Other uses relate to the coating of collagen, which serves as a bone replacement material, and of collagen nonwovens, which, for. B. can be used for "tissue engineering". The aim here is to increase the stability and porosity and to improve the resorbability.
  • Crystalline silica (silicon dioxide) in the form of quartz, tridymite or cristobalite is probably one of the most important workplace hazardous substances. The severity of the Health impairments and the variety of possible sources of exposure have long been known. Because of the widespread occurrence of crystalline silica in the earth's crust and the frequent use of materials containing it, workers in a variety of different industries are particularly exposed to crystalline silica. It can be assumed that in agriculture, mining, in the glass and fiber glass industry, in cement production, in the production of ceramics, in foundries, in the production of paints, soaps and cosmetics or in the dental manufactory / repair, millions of employees are regularly exposed to crystalline silicon dioxide. According to the American Thoracic Society, silicon dioxide is one of the main causes of lung diseases worldwide. There is therefore a great need to develop strategies for prevention and therapy.
  • silica Inhaled crystalline silica is known to cause lung fibrosis (silicosis) and lung cancer.
  • Silicosis is a malignant pneumoconiosis, which is caused by an accumulation of silicon dioxide particles in the lung tissue and is characterized by the appearance of silicotic nodules. There is no rational therapy for this disease, which leads to severe disabilities.
  • Silicosis generally develops very slowly over decades. It is a progressive disease that is not curable. It first manifests itself through shortness of breath, irritable cough and stinging in the chest. Overworking the heart and restricting breathing and circulation ultimately lead to death. The average period between exposure to dust and the appearance of silicosis is around 20 years. A dangerous complication of silicosis is the culosis. The mechanism that leads to the development of lung cancer by crystalline silicon dioxide is still poorly understood.
  • Silicosis is the most common dust lung disease among occupational diseases.
  • the average total cost of a silicosis patient is around 130,000 euros.
  • the silicase which is involved in the dissolution of biogenic silicon dioxide, can be used as a therapeutic / protective agent for the treatment of silicosis.
  • Silicase is not only able to dissolve amorphous, but also crystalline silicon dioxide (quartz crystals).
  • the silicase thus has the properties necessary to eliminate silicon dioxide from the lungs and / or to modulate the course of this lung disease.
  • Microspheres as a carrier system for the recombinant silicase for the treatment of silicosis can, for. B. from sponge collagen analogous to calf callagen microspheres (Rössler et al., Pharmazie 49 (1994) 175-179).
  • the sponge collagen microparticles are loaded by adsorption of the recombinant protein (silicase) as described (Roessler et al., J. Microencapsulation 12 (1995) 49-57; Berthold et al., Eur. J. Pharm. Biopharm 45 (1998) 23-29).
  • the advantages of collagen are its biodegradability as well as its low toxicity and immunogenicity.
  • Other delivery systems include liposomes with the enclosed recombinant enzyme and lipid nanoparticles (Jenning et al., Eur. J. Pharm. Biopharm. 49 (2000) 211-218).
  • SEQ ID No. 1 the amino acid sequence of the silicase according to the invention from S. domuncula (SIA_SUBDO),
  • SEQ ID No. 2 The nucleic acid sequence of the cDNA of the silicase according to the invention from S. domuncula.
  • Illustration 1
  • FIG. 3 (A) Alignment of S. domuncula silicase (SIA_SUBDO) with human carbonic anhydrase II (carbonate dehydratase II) (CAH2_HUMAN; P00918).
  • the carbonic anhydrase domain is boxed (
  • the characteristic amino acids which form the eukaryote-type carbonic anhydrase signature are marked (A: found in both sequences; ⁇ : only present in the carbonic anhydrase, but not in the silicase).
  • the additional signs (+) show those residues that form the hydrogen network of the active center.
  • the three zinc-binding histidine residues are marked (Z).
  • PCC 7120 (CAH_ANASP; P94170).
  • the latter sequence served as an outgroup.
  • the measurement bars indicate an evolutionary distance of 0.1 amino acid substitutions per position in the sequence.
  • the phylogenetic tree was constructed using "neighbor joining"("Neighbor” program: Felsenstein, J. (1993). PHYLIP, ver. 3.5. University of Washington, Seattle).
  • the recombinant S. domuncula silicase (rSIA_SUBDO) was produced as a GST fusion protein. Both the long and the short SDSIA were cloned into a pGEX-4T-2 plasmid containing the glutathione S-transferase (GST) gene. The fusion proteins were either outgoing induction with IPTG (-IPTG) or after incubation with IPTG (+ IPTG) isolated for 4 or 6 hours, then split, cleaned and then subjected to Na-DodSO 4 -PAGE. The gel was stained with Coomassie Brilliant Blue. The purified long form rSIA_SUBDO-l with a size of 43 kDa and the short form (M r 32 kDa) of the silicase were obtained.
  • RNA was extracted from primmorphs, which in the absence of additional silicon (- Si) or in the presence of 60 ⁇ M silicon (+ Si) had been incubated for 1 to 3 days. 5 ⁇ g of the total RNA was separated electrophoretically, blotted on nylon membranes and hybridized with the following probes: SDSIA (silicase), SDSILICA (silicatein) and SDIDH ( ⁇ -subunit of isocitrate dehydrogenase). The sizes of the transcripts are given.

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Abstract

Die Silicase ist ein Enzym, das in der Lage ist, die Auflösung von amorphem und kristallinem Siliciumdioxid unter Bildung von freier Kieselsäure zu bewirken. Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von rekombinanter oder aus natürlichen Quellen isolierter Silicase sowie von Silicase-Fusionsproteinen und Carboanhydrase sowie Carboanhydrase-verwandter Enzyme zum Abbau, zur Modifizierung und zur Synthese (reversible Silicase-Reaktion) von Siliciumdioxid (Kondensationsprodukte der Kieselsäure, Silicate), Siliconen und anderen Silicium(IV)- oder Metall(IV)-Verbindungen und deren technische Verwendung.

Description

Abbau und Modifizierung von Silicaten und Siliconen durch Silicase und Verwendung des reversiblen Enzyms
Beschreibung
1. Stand der Technik .
Silicium ist das zweithäufigste Element der Erdkruste und kommt in verschiedenartigsten Verbindungen vor. Siliciumverbindungen stellen nicht nur die artenreichste Klasse der Mineralien dar, sondern sind auch in wirtschaftlicher Hinsicht bedeutsam. Technisch angewandte, aus Silicaten bestehende Materialien sind beispielsweise Glas, Porzellan, Email, Tonwaren, Zement und Wasserglas. Einige Silicate besitzen katalytische Eigenschaften. Durch teilweisen Austausch der von Silicium eingenommenen Gitterstellen gegen andere Elemente, insbesondere Aluminium, wird die Vielfalt in den möglichen Strukturen und technischen Einsatzmöglichkeiten noch erweitert. So besitzen die Alumosilicate, zu denen die Feldspäte und die Zeolithe gehören, Bedeutung u. a. auf Grund ihrer Molekularsieb- und Ionenaustauscher- Eigenschaften. Weitere Silicium-Verbindungen, wie die Silicone (Siloxane), besitzen u. a. auch medizinische Bedeutung, wie zur Herstellung von Implantaten.
1.1. Siliciumdioxid
Siliciumdioxid (SiO2) kommt sowohl in kristalliner als auch in amorpher Form vor. Zu den verschiedenen Formen des kristallinen SiO2 gehören u. a. Quarz, Tridymit und Cristobalit. Achat, Opal und Feuerstein stellen amorphe Siliciumdioxid-Mineralien dar. In allen diesen Erscheinungsformen besitzt Silicium die Koordinationszahl 4 und ist tetraedrisch von vier Sauerstoff-Atomen umgeben.
Aus amorphem SiO2 bestehen auch die Schalen von Kieselalgen (Diatomeen) und die Nadeln (Spiculae) von Kieselschwämmen. 1.2. Kieselsäuren und Silicate
Das tetraedrisch gebaute [SiO4]4"-lon neigt zur Polymerisation durch Verknüpfung von SiO4-Einheiten, wobei jeweils zwei Si-Atome über ein O-Atom miteinander verbunden werden. Durch Kondensation (Wasserabspaltung) entsteht dabei aus der Orthokieselsäure zunächst die Orthodikieselsäure (Pyrokieselsäure; H6Si2O ). Die weitere Kondensation führt über die Polykieselsäuren zu den Metakieselsäuren [(H2SiO3)n]. Bei kleinerer Zahl der SiO -Einheiten (n = 3, 4 oder 6) können sich dabei auch ringförmige Moleküle bilden.
Die wasserlöslichen Salze der Kieselsäuren, die Alkalisilicate, welche beispielsweise durch Schmelzen von Quarz mit Soda, Lauge oder Kaliumcarbonat gewonnen werden, enthalten neben [SiO ]4"- auch [Si2O7]6"-, [Si3Oιo]8"- und größere Anionen. Nach Ansäuerung einer solchen Alkalisilicatlösung kondensieren die durch Protonenaufnahme gebildeten Säuremoleküle untereinander zu Polykieselsäuren, wobei die Lösung gelartig wird. Bei weiterem Fortschreiten der Kondensation entstehen aus den zunächst erhaltenen Ketten oder Netzen dreidimensionale Strukturen, welche der Zusammensetzung SiO2 entsprechen.
Die Silicate lassen sich einteilen in .1.) Silicate mit diskreten Anionen, nämlich 1a.) Insel-Silicate (Ortho-Silicate mit dem Anion [SiO4]2"; Beispiel: Phenakit, Olivin, Zir- kon), 1b.) Gruppen-Silicate (Verknüpfung der SiO4-Tetraeder zu kurzkettigen Einheiten; Beispiel: Di-Silicate und Tri-Silicate) und 1c.) Ring-Silicate (ringförmige Verknüpfung der SiO4-Tetraeder; Beispiel: Benitoid mit 3-er-Ring, Axinit mit 4-er-Ring und Beryll mit 6-er-Ring), 2.) Ketten-Silicate und Band-Silicate (kettenartig miteinander verbundenen SiO4-Tetraedem, die Polymere des Anions [SiO3]2" darstellen, und bandförmige Moleküle, die durch Verknüpfung mehrerer SiO4-Ketten entstehen; Beispiele: Hornblenden, Asbeste), 3.) Schicht-oder Blatt-Silicate (aus ebenen Schichten von SiO4-Tetraeder, die Polymere des Anions [Si4θιo]4" darstellen und durch dazwischen gelagerte Kationen zusammengehalten werden; Beispiel: Talk, Kaolinit) und 4.) Gerüstsilicate (Verknüpfung der tetraedrischen SiO4-Gruppen zu dreidimensionalen Gittern; Beispiel: verschiedene Modifikationen von Siliciumdioxid wie Feldspäte). Allgemeine Literatur: Hinz, Silicat-Lexikon (2 Bd.), Berlin: Akademie Verl. 1985; Lie- bau, Structural Chemistry of Silicates, Berlin: Springer 1985; Petzold und Hinz, Einführung in die Grundlagen der Silicatchemie, Stuttgart: Enke 1979; CD Römpp Chemie Lexikon - Version 1.0, Stuttgart/New York: Georg Thieme Verlag 1995.
1.3. Silicone
Durch teilweises Ersetzen der OH-Gruppen der Kieselsäure durch einbindige Or- ganylreste, die sich nicht am Kondensationsvorgang beteiligen, entstehen verschiedene Silicone (Siloxane). Sie werden eingeteilt in: 1.) lineare Polysiloxane (Bautyp: R3SiO[R2SiO]nSiR3), 2.) verzweigte Polysiloxane (mit trifunktionelle oder tetrafunktio- nelle Siloxan-Einheiten an den Verzweigungsstellen), 3.) cyclische Polysiloxane (aus difunktionellen Siloxan-Einheiten) und 4.) vernetzte Polymere (Verknüpfung von ketten- oder ringförmige Moleküle zu zwei- oder dreidimensionalen Netzwerken).
Silicone sind bedeutsame technische Werkstoffe. Die Viskosität der kettenförmig aufgebauten Silicone (Siliconöle) nimmt mit wachsender Kettenlänge zu. Silicone, die in geringem Maß vernetzt sind, zeigen Kautschuk-Elastizität (Siliconkautschuk), stark vernetzte Ketten sind harzartige (Siliconharze).
1.4. Biomineralisation (Bildung von biogenem Siliciumdioxid) in Kieselschwämmen
Viele Siliciumverbindungen sind nur kostenintensiv herzustellen. Der Prozess der chemischen Synthese der Silicate bedarf oft drastischer Bedingungen wie hoher Druck und hohe Temperatur. Kieselschwämme sind dagegen - ebenso wie Kieselalgen - befähigt, mit Hilfe spezifischer Enzyme Silicatgerüste unter milden Bedingungen, d. h. bei relativ niedriger Temperatur und niedrigem Druck, zu bilden. Weiterhin ist die SiO2-Synthese bei diesen Organismen durch hohe Spezifität, Regulierbarkeit und die Möglichkeit der Synthese von definierten MikroStrukturen (Nanostrukturen) ausgezeichnet. Die Hauptelemente des Skeletts der Kieselschwämme sind die nadeiförmigen Spi- culae, die bei der Gruppe der Demospongien (Hornschwämme) und Hexactinellida (Glasschwämme) aus amorphem nichtkristallinem Siliciumdioxid bestehen. Die Demospongien und Hexactinellidae sind die einzigen Metazoen, die Siliciumdioxid anstelle von Calcium in ihrem Skelett besitzen.
Das opale Siliciumdioxid in den Spiculae der Kieselschwämme enthält 6-13% Wasser, was die ungefähre Formel (Siθ2)2-5'H2O ergibt (Schwab DW, Shore RE (1971) Mechanism of internal stratification of siliceous spicules. Nature 232:501-502).
Ein Enzym, das bei silicatbildenden Organismen an der Synthese des SiO2-Skeletts beteiligt ist, und seine technische Verwendung wurden beschrieben (PCT/US99/30601. Methods, compositions, and biomimetic catalysts, such as silica- teins and block copolypeptides, used to catalyze and spatially direct the polyconden- sation of Silicon alkoxides, metal alkoxides, and their organic conjugates to make sili- ca, polysiloxanes, polymetallo-oxanes, and mixed poly(silicon/ metallo)oxane materi- als under environmentally benign conditions. Inventors/ Applicants: Morse DE, Stucky GD, Deming, TD, Cha J, Shimizu K, Zhou Y; DE 10037270 A 1. Silicatein- vermittelte Synthese von amorphen Silicaten und Siloxanen und ihre Verwendung. Deutsches Patentamt 2000. Anmelder und Erfinder: Müller WEG, Lorenz B, Krasko A, Schröder HC; PCT/EP01/08423. Silicatein-mediated synthesis of amorphous silicates and siloxanes and use thereof. Inventors/Applicants: Müller WEG, Lorenz B, Krasko A, Schröder HC). Dieses Enzym wurde aus dem marinen Kieselschwamm Suberites domuncula kloniert (Krasko A, Batel R, Schröder HC, Müller IM, Müller WEG (2000) Expression of silicatein and collagen genes in the marine sponge S. domuncula is controlled by silicate and myotrophin. Europ J Biochem 267:4878- 4887). Das aus natürlichen Quellen isolierte Enzym ("Silicatein") ist in der Lage, aus organischen Siliciumverbindungen (Alkoxysilanen) amorphes Siliciumdioxid (Polykieselsäuren und Polysilicate) zu synthetisieren (Cha JN, Shimizu K, Zhou Y, Christi- anssen SC, Chmelka BF, Stucky GD, Morse DE (1999) Silicatein filaments and su- bunits from a marine sponge direct the polymerization of silica and silicones in vitro. Proc Natl Acad Sei USA 96:361-365). Überraschenderweise konnte von den Erfindern - zunächst in dem Meeresschwamm S. domuncula als Modellsystem, ein Enzym (genannt: "Silicase") entdeckt werden, das in der Lage ist, sowohl amorphes als auch kristallines Siliciumdioxid aufzulösen.
Dieses Enzym, das am Katabolismus von Siliciumdioxid in Schwämmen beteiligt ist, wurde unter Anwendung der Technik des "Differential Display" der mRNA unter Benutzung des in vitro Primmorphe-Zellkultursystems (siehe unten) aufgefunden.
Die Silicase ist in der Lage, zwei Funktionen auszuüben: erstens besitzt sie die Fähigkeit (i) - in Analogie zu der Carboanhydrase - Kalkmaterial aufzulösen und (ii) - und dies war überraschend - auch Siliciumdioxid aufzulösen unter Bildung von Kieselsäure. Deshalb ist die - zuerst in S. domuncula aufgefundene - Silicase in der Lage, sowohl beim Katabolismus von kalkhaltigem Material als auch beim Katabolismus der kieselsäurehaltigen Spiculae mitzuwirken.
Neu an der vorliegenden Erfindung ist außerdem, daß das Silicase-Gen durch Erhöhung der Silicium-Konzentrationen im Medium (auf gewöhnlicherweise 60 μM) induziert werden kann (siehe Abbildung 7).
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird allgemein ein Verfahren zum in vitro oder in vivo Abbau von amorphem oder kristallinem Siliciumdioxid (Kondensationsprodukte der Kieselsäure, Silicate), Siliconen und anderen Silici- uιm(IV)- oder Metall(IV)-Verbindungen sowie von Mischpolymeren dieser Verbindungen zur Verfügung gestellt, wobei ein Polypeptid oder ein Metallkomplex eines Poly- peptids zum Abbau eingesetzt wird, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid eine tierische, bakterielle, pflanzliche oder Pilz Carboanhydrase-Domäne umfaßt, die mindestens 25% Sequenzähnlichkeit (siehe Abbildung 3) zu der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Sequenz aufweist. Bisher war es nicht bekannt, daß solche Carboanhydra- sen-Domänen enthaltende Enzyme in der Lage sind, solche Silikate oder Silicone abzubauen. Aufgrund der Reversibilität dieses Prozesses betrifft ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Synthese von amorphem Siliciumdioxid '(Kondensationsprodukte der Kieselsäure, Silicate), Siliconen und anderen Silici- um(IV)- oder Metall(IV)-Verbindungen sowie von Mischpolymeren dieser Verbindungen, wobei ein Polypeptid oder ein Metallkomplex eines Polypeptids zur Synthese eingesetzt wird, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid eine tierische, bakterielle, pflanzliche oder Pilz Carboanhydrase-Domäne umfaßt, die mindestens 25% Sequenzähnlichkeit zu der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Sequenz aufweist.
Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß zur Synthese Verbindungen wie Kieselsäuren, Monoalkoxysilantriole, Dialkoxy- silandiole, Trialkoxysilanole, Tetraalkoxysilane, Alkyl- oder Aryl-Silantriole, Alkyl- oder Aryl-Monoalkoxysilandiole, Alkyl- oder Aryl-Dialkoxysilanole, Alkyl- oder Aryl- Trialkoxysilane oder andere Metall(IV)-Verbindungen als Reaktanten (Substrate) eingesetzt werden. Durch Verwendung definierter Mischungen der Verbindungen können Mischpolymere definierter Zusammensetzung hergestellt werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung kann durch das Polypeptid oder ein Metallkomplex des Polypeptids oder die Bindung des Polypeptids oder eines Metallkomplex des Polypeptids an andere Moleküle oder die Oberflächen von Glas, Metallen, Metalloxiden, Kunststoffen, Biopolymeren oder anderen Materialien als Template die Ausbildung definierter zwei- und dreidimensialer Strukturen erfolgen.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Modifikation einer Kieselsäure oder Silicium(IV)- oder Metall(IV)-Verbindung enthaltenden Struktur oder Oberfläche zur Verfügung gestellt, wobei ein Polypeptid oder ein Metallkomplex eines Polypeptids zur Modifikation eingesetzt wird, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid eine tierische, bakterielle, pflanzliche oder Pilz Carboanhydrase-Domäne umfaßt, die mindestens 25% Sequenzähnlichkeit zu der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Sequenz aufweist. Bevorzugterweise liegt die Kieselsäure enthaltende Struktur oder Oberfläche in Form eines Edelsteins oder Halbedelsteins vor.
Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei die Modifikation eine Glättung, ein Anätzen oder ein Herstellen von Ausbohrungen der Kieselsäure oder Silici- um(IV)- oder Metall(IV)-Verbindung enthaltenden Struktur oder Oberfläche durch das Polypeptid oder einen Metallkomplex des Polypeptids umfaßt. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine chemische Verbindung oder Kieselsäure-enthaltende Struktur oder Oberfläche, die mit einem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wurde, insbesondere in Form eines Edelsteins oder Halbedelsteins.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft auch ein Polypeptid einer Silicase aus Suberites domuncula gemäß SEQ ID Nr. 1 oder ein dazu homologes Polypeptid, das in der Aminosäuresequenz der Carboanhydrase-Domäne mindestens 25% Sequenzähnlichkeit zu der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Sequenz besitzt, ein Metallkomplex des Polypeptids, oder Teile davon.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft auch eine Nukleinsäure, insbesondere gemäß SEQ ID Nr. 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie im wesentlichen für ein Polypeptid der Erfindung kodiert. Die erfindungsgemäße Nukleinsäure kann in Form einer DNA, cDNA, RNA oder Gemischs davon vorliegen und dadurch gekennzeichnet sein, daß die Sequenz der Nukleinsäure mindestens ein Intron und/oder eine polyA-Sequenz aufweist. Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die erfindungsgemäße Nukleinsäure in Form ihrer komplementären „antisense"- Sequenz.
Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft auch eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in Form eines (a) Fusionsprotein- (chimäres Protein) Konstrukts, (b) Konstrukts mit getrennter Protein-Expression (Protease-Spaltstelle) oder (c) Konstrukts mit getrennter Protein-Expression (Kassetten-Expression). Die erfindungsgemäße Nukleinsäure kann synthetisch hergestellt worden sein. Verfahren dazu sind im Stand der Technik gut bekannt.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft einen Vektor, vorzugsweise in Form eines Plasmids, Shuttle Vektors, Phagemids, Cosmids, Expressionsvektors, retroviralen Vektors, adenoviralen Vektors oder Partikels, Nanopartikeln oder Liposomen, wobei der Vektor eine erfindungsgemäße Nukleinsäure enthält. Weiterhin können Vektoren zum Transfer von Proteinen vorgesehen werden, vorzugsweise in Form eines Nano- partikels oder Liposoms, die ein Polypeptid der Erfindung umfassen. Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Wirtszelle, transfiziert mit einem Vektor oder infiziert oder transduziert mit einem Partikel gemäß der Erfindung, zur Verfügung gestellt. Diese Wirtszelle nach kann dadurch gekennzeichnet sein, daß sie ein Polypeptid nach Anspruch 1 , einen Metallkomplex des Polypeptids oder Teile davon exprimiert. Als Wirtzellen eignen sich alle bekannten Wirtszeil-Organismen, so u.a. Hefen, Pilze, Schwämmw, Bakterien, CHO-Zellen oder Insektenzellen.
Das erfindungsgemäße Polypeptid kann dadurch gekennzeichnet sein, daß es synthetisch hergestellt worden ist oder daß das Polypeptid oder der Metallkomplex des Polypeptids in einem prokaryotischen oder eukaryotischen Zellextrakt oder -lysat vorliegt. Der Zellextrakt oder das Lysat kann aus einer Zelle ex vivo oder ex vitro gewonnen werden, zum Beispiel einer rekombinanten bakteriellen Zelle oder einem Meeresschwamm.
Das erfindungsgemäße Polypeptid kann nach herkömmlichen im Stand der Technik bekannten Verfahren gereinigt werden und somit im wesentlichen frei von anderen Proteinen vorliegen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft dann ein Verfahren zur Auffindung von Inhibitoren oder Aktivatoren eines Polypeptids einer Silicase aus Sube- rites domuncula gemäß SEQ ID Nr. 1 oder einem dazu homologen Polypeptid, das in der Aminosäuresequenz der Carboanhydrase-Domäne mindestens 25% Sequenzähnlichkeit zu der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Sequenz besitzt, wobei a) ein Polypeptid einer Silicase aus Suberites domuncula gemäß SEQ ID Nr. 1 oder ein dazu homologes Polypeptid, das in der Aminosäuresequenz der Carboanhydrase-Domäne mindestens 25% Sequenzähnlichkeit zu der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Sequenz besitzt zur Verfügung gestellt wird, b) das Polypeptid aus Schritt a) mit einem opotenti- ellen Inhibitor oder Aktivator in Kontakt gebracht wird, und c) die Fähigkeit des Polypeptids gemessen wird, Silikate oder Silicone abzubauen oder zu synthetisieren. Mit diesem Verfahren lassen sich wertvolle Substanzen aufspühren, die sich unter Umständen als Therapeutika eignen (dazu siehe im folgenden). Verfahren zur Auffindung solcher Substanzen sind dem Fachmann bekannt und schließen z.B. die Verwendung von radioaktiv markierten oder enzymatisch markierten Kandidaten- Verbindungen ein. Verfahren zur Messung der Aktivität der Silicase sind im folgenden beschrieben und können leicht durch den Fachmann auf ein Testformat hin angepaßt werden. Ein Inhibitor verringert dabei die Aktivität des Enzyms im wesentlichen vollständig, ein Aktivator induziert eine Aktivität oder verstärkt diese über den Ausgangsspiegel.
Gemäß einer Alternative des Verfahrens kann das Polypeptid einer Silicase aus Su- berites domuncula gemäß SEQ ID Nr. 1 oder ein dazu homologes Polypeptid, das in der Aminosäuresequenz der Carboanhydrase-Domäne mindestens 25% Sequenzähnlichkeit zu der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Sequenz besitzt in vivo, in einem pro- karyontischen oder eukaryontischen Zellextrakt oder -lysat oder in gereinigter Form für den Test zur Verfügung gestellt wird.
Ein noch weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend a) Auffinden eines Inhibitors oder Aktivators nach Anspruch 25 oder 26 und b) Mischen des wie oben angegeben aufgefundenen Inhibitors oder Aktivators mit einem pharmazeutisch geeigneten Träger oder Hilfsstoff. Mittels dieser Zusammensetzung werden wertvolle Pharmazeutika zur Verfügung gestellt, die, wie das Polypeptid oder eine Nukleinsäure der Erfindung zur Prävention oder Therapie der Silikose verwendet werden können. Bevorzugt ist eine Verwendung, wobei die Prävention und Therapie der Silikose durch Auflösen von Quarzkristallen erfolgt. Weiterhin kann die Verwendung eines Polypeptids oder einer Nukleinsäure oder pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß der Erfindung zur Resorption oder zur Modulation der Resorbierbarkeit von Siliconen und Silicon- Implantaten erfolgen. Schließlich läßt sich die vorliegende Erfindung auch zur Transfektion von Zellen mit erfindungsgemäßen Nukleinsäuren zur Resorption oder zur Modulation der Resorbierbarkeit von Siliconen und Silicon-Implantaten verwenden. Die oben genannten Verwendungen und die Verfahren dazu sind dem Fachmann bekannt und können leicht auf die hier vorhandenen Bedürfnisse und Anforderungen angepaßt werden.
1.5. Klonierung des die Silicase codierenden Gens Unter Anwendung der Technik des "Differential Display" wurde eine cDNA identifiziert, die für eine Carboanhydrase codiert. Bei Carboanhydrasen war bisher lediglich eine Beteiligung an der pH-Regulation, der HCO3"-Reabsorption und der CO2- Exspiration bekannt, nicht jedoch eine Beteiligung an der - bisher unbekannten - en- zymatischen Auflösung von Siliciumdioxid-Materialien.
Die für die Silicase aus dem Meeresschwamm S. domuncula codierende cDNA (genannt: SDSIA) sowie das aus der Nucleotidsequenz abgeleitete Polypeptid (genannt: SIA_SUBDO) besitzen folgende Eigenschaften. Länge der cDNA: 1395 Nucleotide (nt); offenes Leseraster: von ntι22 - ntι24 bis nti25_ - nti26i (Stoppcodon); Länge des Polypeptids: 379 Aminosäuren; relative Molekülmasse (Mr) des Polypeptids: 43131 ; isoelektrischer Punkt (pl): 6,5 (berechnet mit: PC/GENE (1995) Data Banks CD- ROM; Release 14.0. IntelliGenetics, Inc. Mountain View, CA).
Die Northern-Blot-Analyse mit dem Schwamm SDSM-Klon als Sonde ergibt eine Bande von « 1 ,5 kb.
Abbildung 2 (unten) zeigt die Nucleotidsequenz der - mit Hilfe der Differential- Display-Technik identifizierten - Schwamm-Silicase-cDNA und Abbildung 2 (oben und unten) sowie Abbildung 3A zeigen das aus der Nucleotidsequenz abgeleitete Polypeptid der Schwamm-Silicase (SIA_SUBDO).
Die abgeleitete Aminosäuresequenz der Schwamm-Silicase besitzt eine große Ähnlichkeit zu den Aminosäuresequenzen der Carboanhydrase-Familie. Bis jetzt wurden mehr als sieben Isoenzyme der Carboanhydrasen bei Menschen identifiziert (Sun MK, Alkon DL (2002) Carbonic anhydrase gating of attention: memory therapy and enhancement. Trends Pharmac Sei 23:83-89). Der "Expect value" [£] (Coligan JE, Dünn BM, Ploegh HL, Speicher DW, Wingfield PT (2000) Current protocols in protein science. John Wiley & Sons, Chichester) der Schwamm-Silicase mit der humanen Carboanhydrases II (CAH2_HUMAN; P00918) beträgt 2e"29. Die Eukaryonten-Typ- Carboanhydrase-Domäne (PFAM00194 [www.ncbi.nlm.nig.gov]) wird bei der Schwamm-Silicase im Aminosäure-Bereich von aa87 bis aa335 gefunden (Abbildung 3A). Das Alignment der Schwamm-Silicase mit der humanen Carboanhydrase II zeigt, daß die meisten der charakteristischen Aminosäuren, welche die Eukaryonten- Typ-Carboanhydrase-Signatur bilden (Fujikawa-Adachi K, Nishimori I, Taguchi T, Yuri K, Onishi S (1999) cDNA sequence, mRNA expression, and chromosomal loca- lization of human carbonic anhydrase-related protein, CA-RP XI. Biochim Biophys Acta 1431 :518-524; Okamoto N, Fujikawa-Adachi K, Nishimori I, Taniuchi K, Onishi S (2001) cDNA sequence of human carbonic anhydrase-related protein CA-RP X and XI in human brain. Biochim Biophys Acta 1518:311-316), auch in der Schwamm- Silicase vorhanden sind. Bei der Schwamm-Sequenz sind jedoch die Aminosäurereste 192 (Alanin), 205 (Phenylalanin) und 207 (Phenylalanin) ersetzt (Abbildung 3A).
Die Carboanhydrasen bilden eine Familie von Zinkmetall-Enzymen, die an der reversiblen Hydratation von CO2 beteiligt sind (Sly WS, Hu PY (1995) Human carbonic anhydrases and carbonic anhydrase deficiencies. Annu. Rev. Biochem. 64:375-401). Die drei konservierten Histidinreste werden in der Silicase bei den Aminosäuren aaιsι, aai83 und aa2_6 gefunden (Abbildung 3A).
1.6. Phylogenetische Analyse der Silicase
Abbildung 3B zeigt die Position der Schwamm-Silicase unter verschiedenen, ausgewählten Vertretern der Carboanhydrase-Familie (phylogenetischer Baum; "rooted tree" mit der bakteriellen Carboanhydrase-Sequenz von Neisseria gonorrhoeae). Die Schwamm-Silicase bildet mit der Carboanhydrase von Caenorhabditis elegans die Basis für die Carbonanhyd rasen der anderen Metazoen. Die Metazoen-Enzyme sind von den Pflanzen-Enzymen und auch von den bakteriellen Enzymen getrennt.
2. Herstellung der Silicase
Die Silicase kann aus Geweben oder Zellen gereinigt oder rekombinant hergestellt werden.
2.1. Reinigung der Silicase aus natürlichen Quellen
Alle Schritte werden bei 4°C durchgeführt. Zur Reinigung der Silicase (oder Carboanhydrase oder Carboanhydrase-verwandtes Enzym) wird das - beispielsweise in einem Tris-SO / Natriumsulfat-Puffer (pH 8,7) - homogenisierte Gewebe (oder wer- den die in diesem Puffer homogenisierten Zellen) zentrifugiert und zu dem erhaltenen Überstand eine Affinitätschromatographie-Matrix wie beispielsweise CM-Bio-Gel A, gekoppelt mit p-Aminomethylbenzolsulfonsäureamid, hinzugegeben. Danach wird die Suspension auf einem Rotationsschüttler (beispielsweise für 24 h) inkubiert. Das Affinitätsgel wird dann durch Absaugen über einen Glasfilter gesammelt und mit einem Puffer (beispielsweise 0,1 M Tris-SO4, pH 8,7, enthaltend 0,2 M Na2SO4, 1 mM Benzamidin und 20% Glycerin) gewaschen. Danach ist es zweckmäßig, einen zweiten Waschschritt mit demselben Puffer bei einem niedrigeren pH (beispielsweise pH 7,0) anzuschließen, um unspezifisch gebundene Proteine zu entfernen. Das Gel wird dann in eine Säule überführt und mit demselben Puffer (pH 7,0) gewaschen. Zur Elu- tion des Enzyms kann beispielweise ein 0,1 M Tris-SO4-Puffer, pH 7,0, enthaltend 0,4 M NaN3, 1 mM Benzamidin und 20% Glycerin, benutzt werden. Das eluierte Enzymprotein wird dann beispielsweise gegen einen 10 mM Tris-SO4-Puffer, pH 7,5, enthaltend 1 mM Benzamidin, dialysiert und danach auf eine Ionenaustauscher- Säule (beispielsweise DEAE-Sephacel) gegeben, die beispielsweise mit 10 mM Tris- SO , pH 7,5, äquilibriert worden ist. Nach dem Waschen mit demselben Puffer wird das Enzym durch Anlegen eines linearen Salz-Gradienten (beispielsweise 0 bis 0,1 M Na2SO4) eluiert und gesammelt. Mit Hilfe dieser Prozedur kann die Silicase unter anderem aus dem Schwamm S. domuncula gereinigt werden.
2.2. Herstellung der rekombinanten Silicase
2.2.1. Clonierung der cDNAs aus marinen Schwämmen
Die Durchführung der Technik des "Differential Display" der mRNA/Transkripte ist Stand der Technik (Müller WEG, Krasko A, Skorokhod A, Bünz C, Grebenjuk VA, Steffen R, Batel R, Müller IM, Schröder HC (2002) Histocompatibility reaction in the sponge Suberites domuncula on tissue and cellular level: central role of the allograft inflammatory factor 1. Immunogenetics 54, 48-58). Gesamt-RNA wird von Kontrollkulturen (gehalten bei einer niedrigen Silicium-Konzentration von 5 μM) sowie von in Gegenwart von 60 μM Silicium behandelten Kulturen unter Benutzung von TRIzol Reagens (GibcoBRL) isoliert. Die Synthese des ersten cDNA-Stranges wird mit "an- chored" oligo(dT)-Primern und AMV Reverser Transkriptase nach den Vorschriften des Herstellers (Promega) durchgeführt. Nach der Synthese des ersten Stranges wird die resultierende cDNA zehnfach mit H2O verdünnt und ein aliquotes Teil davon (2 μl) der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) unterworfen. Die Reaktion wird in einem Volumen von 20 μl nach Zugabe des "arbitrary" Primers 1 (5'-GTGATCGCAG- 3') oder 2 (5'-CTTGATTGCC-3') sowie von 2 μM dNTP, TuGC, 5 Units BioThem Polymerase (Genecraft) und [α-32P] dATP durchgeführt. Folgende Reaktionsbedingungen haben sich bei der PCR als geeignet erwiesen: initiale Denaturierung bei 95°C für 5 Minuten, dann 40 Amplifizierungscyclen bei je 95°C für 20 Sekunden, 42°C für 120 Sekunden, 72°C für 30 Sekunden, gefolgt von einer Endinkubation von 10 Minuten bei 72°C. Die Proben werden dann in einem 5%igen Polyacrylamidgel (in 1 x TBE) aufgetrennt. Nach dem Lauf wird das Gel getrocknet und 4 Tage mit einem Röntgenfilm exponiert. Die interessierenden, im Autoradiogramm detektierten Banden werden ausgeschnitten, 15 Minuten in 200 μl H2O gekocht, auf Eis gekühlt und 10 Minuten bei 14000 x g zentrifugiert. Die resultierenden Überstände werden mit dem gleichen Volumen an 10 M Ammoniumacetat, 20 μg/ml tRNA versetzt und mit 2,5 Volumina an Ethanol bei -80°C über Nacht präzipitiert. Die cDNA-Pellets werden dreimal in 75% Ethanol gewaschen und in 20 μl H2O gelöst.
Etwa 2 μl der eluierten Banden werden in 50 μl-Reaktionsansätzen unter Benutzung der oben beschriebenen Primer unter denselben Bedingungen reamplifiziert, in einem pGEM-T-Vector (Promega) subcloniert und sequenziert.
Diejenigen Transkripte werden ausgewählt, die differentiell exprimiert werden, d. h. die zusätzlich in den Gelen mit den RNAs von Zellen erhalten werden, die mit 60 μM Silica behandelt wurden (Abbildung 1). Die identifizierten cDNAs/Transkripte werden mit den in der BLAST Data Base enthaltenen Sequenzen verglichen. In dem in Abbildung 1 gegebenen Beispiel zeigten die folgenden Moleküle die größte Verwandtschaft: CaIcium/Calmodulin-abhängige Proteinkinase (CaM Kinase) II gamma (XM_044349; Expect value [£]: 1e-16); hypothetisches Protein (XP 01359, E 1 ,6); MUC3B Mucin (AJ291390, E 0,20); hypothetisches Protein (XP_067115, E 5,9); hypothetisches Protein (XP_090138, E 2,9); ATP-bindende Kassette, Unterfamilie A Mitglied 4 (XM_001290, E 1,6); Polypeptid ähnlich dem Zinkfingerprotein 91 (XM_091947, E 3,1); hypothetisches Protein (XP_104250, E 0,48), hypothetisches Protein (XP_169372, E 8,6); hypothetisches Protein (XP_104250, £ 4,1), hypothetisches Protein (XP_098020, E 3,3) und hypothetisches Protein (XP_169372, E 8,6). Zusätzlich zu diesen Sequenzen wurde die Silicase als weiteres Transkript identifiziert und in größerem Detail analysiert.
Das Silicase-Gen kann auch aus cDNA-Bibliotheken, z. B. in ZapExpress und in Esche chia coli XL1-Blue MRF', mit geeigneten degenerierten Primern mittels der PCR-Technik identifiziert werden; hierzu werden entsprechende vektorspezifische Primer eingesetzt. Die erhaltenen Syntheseprodukte werden zum Screenen in den betreffenden cDNA-Bibliotheken benutzt. Danach werden die identifizierten Clone in einen Vektor (beispielsweise pGem-T) subcloniert und anschließend sequenziert.
2.2.2. Expression und Isolierung der rekombinanten Silicase
Die Herstellung der rekombinanten Silicase (genannt: rSIA_SUBDO) erfolgt bevorzugt in E coli. Aber auch die Herstellung in Hefen und Säugerzellen ist möglich und wurde erfolgreich durchgeführt. Im Folgenden ist als Beispiel die Expression des SDSIA-Gens von S. domuncula in E. coli unter Benutzung des "GST (Glutathion-S- Transferase) Fusions"-Systems (Amersham) beschrieben. In dem Beispiel werden zwei Inserte benutzt, um potentielle Effekte von Signalpeptiden während der Expression zu eliminieren; ein Insert umfaßt das gesamte abgeleitete Protein (lange Form; von der Aminosäure aai bis zur Aminosäure aa3 _) und das andere Insert lediglich die Aminosäuren aa_6 bis aa3 g (kurze Form) (Abbildung 3A). Die entsprechenden Klone werden als SDSIA-I und SDSIA-s bezeichnet. Sie werden in einen entsprechenden Vektor eincloniert, z. B. in das Plasmid pGEX-4T-2, welches das Glutathion S-Transferase (GST)-Gen von Schistosoma japonicum enthält. Auch andere Expressionsvektoren haben sich als geeignet erwiesen. Nach Transformation von E. coli wird die Expression der Silicase üblicherweise durch IPTG (Isopropyl-ß-D- thiogalactopyranosid) induziert und in Gegenwart von 1 mM ZnSO4 für 4 oder 6 Stunden bei 37°C durchgeführt (Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Smith JA, Seidmann JG, Struhl K (1995) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, New York). Die erhaltenen GST-Fusionsproteine mit der Bezeichnung rSIA_SUBDO-l (lange Form; Mr 69 kDa) bzw. rSIA_SUBDO-s (kurze Form; Mr 58 kDa) werden z. B. durch Affinitätschromatographie an Glutathion- Sepharose 4B gereinigt. Zur Abtrennung der Glutathion-S-transferase von der rekombinanten Schwamm-Silicase werden die Fusionsproteine mit Thrombin (10 Units/mg) gespalten. Die Proteine werden dann der Gelelektrophorese in Gegenwart von 2-Mercaptoethanol unterworfen. Die Gelelektrophorese kann in 10%igen Po- lyacrylamidgelen mit 0,1 % NaDodSO (PAGE) durchgeführt werden. Die Gele werden mit Coomassie Brillant Blau gefärbt.
Nach der Spaltung, Reinigung und anschließender PAGE werden die lange Form (rSIA_SUBDO-l [43 kDa]) und die kurze Form (rSIA_SUBDO-s [32 kDa]) der rekombinanten Proteine erhalten (Abbildung 4).
2.2.3. Expression und Isolierung der rekombinanten Silicase aus weiteren Organismen
Entsprechend der oben beschriebenen Vorgehensweise kann die Isolierung, Clonie- rung und Expression der Silicase-cDNA auch aus anderen Organismen durchgeführt werden, beispielsweise aus (Siliciumdioxid-produzierenden) Diatomeen (z. B. Cylind- rotheca fusiformis). Die Gewinnung von Diatomeen in axenischen Kulturen ist Stand der Technik (Kroger N, Bergsdorf C, Sumper M (1996) Europ J Biochem 239:259- 264).
2.3. Isolierung und Reinigung der Silicase mittels Antikörper
Nach Extraktion oder partieller Renigung nach einem der oben geschilderten Verfahren wird die Silicase an einer Antikörper-Affinitätsmatrix gereinigt. Die Affinitätsmatrix wird hergestellt, indem ein Silicase-spezifischer Antikörper an eine feste Phase (CNBr-akti vierte Sepharose oder anderer geeigneter Träger) immobilisiert wird. Als Antikörper werden monoklonale oder polyklonale Antikörper gegen das Silicase eingesetzt, die nach Standard-Methoden hergestellt werden (Osterman LA (1984) Methode of Protein and Nucleic Acid Research, Vol 2, Springer-Verlag, Berlin). Die Kopplung des Antikörpers an die Säulenmatrix wird nach den Angaben des Herstellers (Pharmacia) durchgeführt. Die Elution der reinen Silicase erfolgt mittels pH- Änderung oder Änderung der lonenstärke.
3. Nachweis der Silicase-Aktivität
Im Folgenden werden lediglich die Aktivitäten, die für die kurze Form der rekombinanten Schwamm-Silicase (rSIA_SUBDO-s) gefunden werden, angegeben. 3.1. Carboanhydrase-Aktivität
Zur Bestimmung der Carboanhydrase-Aktivität der rSIA_SUBDO-s kann ein Assay angewandt werden, der auf der Hydrolyse von p-Nitrophenylacetat basiert (Armstrong JM, Myers DV, Verpoorte JA, Edsall JT (1966) Purification and properties of human erythrocyte carbonic anhydrase. J Biol Chem 241:5137-5149). 0,5 ml einer 3 mM p-Nitrophenylacetat-Lösung (Sigma) wird mit 0,05 ml eines 0,3 mM Tris-HCI- Puffers (pH 7,6) gemischt. Nach Präinkubation bei 25°C für 5 Minuten werden 50 μl der rekombinanten Silicase (rSIA_SUBDO) hinzugefügt, und der Anstieg der Extinktion bei 348 nm wird über einen Zeitraum von 5 Minuten bestimmt.
Abbildung 5 zeigt, daß die Aktivität der rekombinanten Silicase von der Konzentration des Enzyms im Assay abhängt. Die Enzymaktivität wird in optische Dichte (OD)- Einheiten pro Minute angegeben. Der Zusatz von 1 μg Silicase pro Assay (0,56 μl) ergab eine Aktivität von 0,005 OD348nm, die mit steigender Proteinkonzentration bis auf 0,04 OD3 8nm anstieg.
3.2. Silicase-Aktivität
Als Substrat (amorphes Siliciumdioxid) für die Silicase können beispielsweise Spicu- lae von S. domuncula dienen. Die Spiculae können aus Schwammgewebe durch 12- stündige Inkubation in Gegenwart von Ethylendiamintetraessigsäure (20 mM, in PBS; PBS = Phosphatpuffer-Salz-Lösung, bestehend aus 1 ,15 mM KH2PO4, 8,1 mM Na2HPO4, 137 mM NaCI und 2,7 mM KCI) erhalten werden. Nach Waschen mit destilliertem Wasser und mit Ethanol (zweimal) werden die Spiculae getrocknet (56°C) und dann in einem Mörser zu einem Pulver zerrieben.
Die Silicase-Aktivität kann wie folgt bestimmt werden. Üblicherweise werden 100 μg der getrockneten Spiculae (Pulver) zu einem geeigneten Puffer wie 50 mM Tris-HCI- Puffer (pH 7,2; 10 mM DL-Dithiothreitol, 100 mM NaCI) und 0,5 mM ZnSO4 in 2 ml Eppendorf-Gefäßen hinzugegeben. Dann werden üblicherweise 50 μl der rekombinanten Silicase hinzugefügt und bei 25°C inkubiert (die Inkubation ist auch bei anderen Temperaturen zwischen 5°C und etwa 65°C möglich). Die durchschnittliche Inku- bationszeit beträgt 60 Minuten. Zur quantitativen Bestimmung der Menge an gelöstem Siliciumdioxid werden die nichtgelösten Spiculae abzentrifugiert (14000 x g; 15 Minuten; 4°C). Die freigesetzte, lösliche Kieselsäure kann z. B. mit Hilfe eines Mo- lybdat-gestützten Nachweisverfahrens, wie z. B. dem kolorimetrischen "Silicon Test" (Merck; 1.14794), quantitativ bestimmt werden. Die Menge an Kieselsäure wird in diesem Fall anhand einer Kalibrierungskurve mit einem Siliciumstandard (Merck 1.09947) aus den Extinktionswerten bei 810 nm berechnet.
Abbildung 5 zeigt, daß die rekombinante Silicase den Abbau (Auflösung) von amorphem Siliciumdioxid katalysiert. Üblicherweise werden bei einer Enzym- Konzentration von 1 μg rekombinante Silicase pro Assay 3 ng Kieselsäure/Assay freigesetzt. Bei höheren Proteinkonzentrationen (3 oder 10 μg/Assay) beträgt die Freisetzung von Kieselsäure 20 bzw. 43 ng/Assay.
3.3. Silicase-Aktivität in Escherichia coli-Lysa
Die Silicase-Aktivität ist auch in Lysaten von E. coli nachweisbar, die mit dem SDSIA- Gens von S. domuncula (in dem folgenden Beispiel wurde die kurze Form verwendet; = SDSIA-s) unter Benutzung des "GST Fusions"-Systems transformiert wurden. Bei dem in Tabelle 1 gezeigten Experiment wurden Schwamm-Spiculae (Nadeln; 1 mg) mit 1 ,5 ml Lysat, dem 1 mM ZnCI2 und 0,1 M NaCI hinzugefügt wurden, bei verschiedenen Temperaturen inkubiert. Nach 1 , 3, 6 und 24 h wurden die Proben durch Erhitzen auf 95°C für 10 min denaturiert (zur Inaktivierung der Silicase) und dann mit Proteinase K (30 Units/ml) bei 37°C für 1 h inkubiert. Danach wurde zentrifugiert (5 min, 14000 rpm) und der Molybdat-Assay (Kit der Firma Merck; siehe oben) zur Bestimmung des freigesetzten Silicats durchgeführt. Es wurde gefunden, daß bei 4°C nur eine sehr geringfügige Menge an Silicat freigesetzt wurde, bei Raumtemperatur (22°C) und 56°C jedoch bis zu 3,4 bzw. 4,1 ng/ml (24 h).
Eine etwas geringere Menge an freigesetztem Silicat ließ sich auch in Lysaten aus nichttransformierten E. coli nachweisen, was zeigt, daß auch in bakteriellen Zellextrakten eine deutliche Silicat-abbauende Aktivität vorhanden ist. Tabelle 1. Silicase-Aktivität in Lysaten von transformierten (+) und nichttransfor- mierten (-) E. coli bei verschiedenen Inkubationstemperaturen. Zur Transformation wurde die kurze Form des SDSIA-Gens von S. domuncula (= SDSIA-s) verwendet. Die Freisetzung von Silicat wurde nach einer Inkubationszeit von 1 , 3, 6 und 24 Stunden bestimmt.
Figure imgf000019_0001
3.4. Silicase-Aktivität kommerzieller Carboanhydrasen
Silicase-Aktivität ist nicht nur bei dem Schwammenzym, sondern überraschenderweise auch bei kommerziellen Carboanhydrasen meßbar. Tabelle 2 zeigt die Freisetzung von Silicat aus Diatomeen-Skeletten (Silicat-Gerüsten von Kieselalgen) sowie aus Sand durch eine kommerzielle Carboanhydrase-Präparation (aus Rinder- Erythrozyten; Firma Calbiochem). In dem Experiment wurden die Silicat-Proben zunächst zweimal mit Wasser und zweimal mit Äthanol gewaschen und danach getrocknet. Anschließend wurden die Proben in 50 mM Tris-HCI-Puffer, pH 7,6, suspendiert (1 mg/ml) und in 2 ml-Eppendorf-Reaktionsgefäße verteilt (100 μl pro Reaktionsgefäß; = 100 μg Silicat pro Reaktionsgefäß). Danach wurde 1 ,4 ml bovine Carboanhydrase (10 Units; Firma Calbiochem) in 50 mM Tris-HCI-Puffer, pH 7,6 (mit und ohne 1 mM ZnCI2) pro Reaktionsgefäß hinzugefügt. Die Gefäße wurden bei Raumtemperatur (22°C) unter Schütteln für 24 h inkubiert. Danach wurden die Ansätze zentrifugiert (14000xg, 15 min, 4°C). Der Silicat-Gehalt im Überstand wurde mit Hilfe des Molybdat-Assay der Firma Merck (siehe oben) bestimmt. Tabelle 2. Silicase-Aktivität einer kommerziellen Carboanhydrase-Präparation (Firma Calbiochem) mit und ohne Zusatz von ZnCI2. Die Freisetzung von Silicat wurde nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden bestimmt.
Figure imgf000020_0001
3.5. Reversiblität der Silicase-Aktivität
Die Silicase-Reaktion ist prinzipiell reversibel. Deshalb kann die Reaktion auch zur Synthese von amorphem Siliciumdioxid oder Siliconen verwendet werden. Für die Silicase-vermittelten Synthese können auch Alkyl- oder Aryl-substituierte Alkoxyver- bindungen von Silicium(IV) wie Tetraalkoxysilane, Trialkoxysilanole, Dialkoxysilan- diole, Monoalkoxysilantriole, Alkyl- oder Aryl-Trialkoxysilane, Alkyl- oder Aryl- Dialkoxysilanole oder Alkyl- oder Aryl-Monoalkoxysilandiole eingesetzt werden. Auch Mischungen dieser Substrate werden polymerisiert. Somit können auch Mischpolymere hergestellt werden.
4. Ligation der cDNA für Silicase mit einer oder mehreren cDNA(s) für anderer Proteine
4.1. Herstellung von Silicase-Fusionsproteinen
Zur Herstellung von Fusionsproteinen mit der Silicase wird ein geeigneter Expressionsvektor (beispielsweise pQE-30-Vektor; Qiagen) eingesetzt. Die Silicase-cDNA - mit z. B. einer ßamHI-Restriktionsstelle am 5'-Terminus und z. B. einer Sa/I- Restriktionsstelle am 3'-Terminus - wird hergestellt. Das Stopp-Codon in der Silicase- cDNA wird entfernt. Hierzu wird die PCR-Technik eingesetzt und zum Amplifizieren Primer, welche die betreffenden Restriktionsstellen besitzen, benutzt. Die cDNA für das zweite Protein wird entsprechend gewonnen, wobei am 5'-Terminus die gleiche Schnittstelle wie am 3'-Terminus der Silicase-cDNA (im Beispiel Sall) und am 3'- Terminus eine von den anderen verschiedene (z. B. eine H/ndlll-Stelle) vorliegt. Falls sich in den betreffenden cDNAs interne Restriktionsstellen befinden, können alternative Restriktionsenzyme eingesetzt werden. Darüber hinaus können auch Linker zwischen die beiden cDNAs eingesetzt werden.
Die beiden cDNAs werden nach den üblichen Verfahren ligiert, gereinigt und in den pQE-30-Vektor einligiert. Die Ligation erfolgt im Anschluß an das Histidin-Tag (etwa 6 Histidin-Codons). Die Expression und Reinigung des Fusionsproteins über z. B. das Histidin-Tag, das an dem rekombinanten Protein vorliegt, kann an entsprechenden Affinitätssäulen, z. B. einer Ni-NTA-Matrix, durchgeführt werden (Skorokhod A, Schäcke H, Diehl-Seifert B, Steffen R, Hofmeister A, Müller WEG (1997) Cell Mol Biol 43:509-519).
4.2. Getrennte Expression I (Protease-Spaltstelle)
Alternativ zu dem Verfahren unter 4.1. kann zwischen der cDNA für die Silicase und der cDNA für ein weiteres Protein eine Protease-Spaltstelle (wie z. B. eine Enterokinase-Stelle) eincloniert werden. In diesem Falle kann ein Codon für ein neues Start- Methionin vor den codierenden Bereich des Gens für das weitere Protein insertiert werden. Nach Expression und Reinigung wird das Fusionsprotein proteolytisch gespalten. Jetzt liegen beide Proteine separat vor.
4.3. Getrennte Expression II (Kassetten-Expression)
Alternativ können beide Proteine auf einem Konstrukt separat exprimiert werden. Hierzu wird in einem Expressions-Vektor das Silicase-Gen dem His-Tag nachgeschaltet. Am Ende der Silicase-cDNA wir ein Stopp-Codon insertiert. Zwischen der cDNA für die Silicase und der cDNA für das weitere Protein wird eine Ribosomen- Bindungsstelle mit Codon für ein Start-Methionin eincloniert. Wiederum wird ein His- Tag der cDNA für das weitere Protein vorgeschaltet. Ebenfalls erhält dieses Gen ein Stopp-Codon.
Die His-Tags können deletiert werden, wenn die Proteine zur Funktionsanalyse in den betreffenden Wirtszellen benutzt werden. 4.4. Erweiterungen
Für die unter 4.1 bis 4.3 beschriebene Expression können sowohl bakterielle als auch eukaryotische Zellen benutzt werden.
Die unter 4.1 bis 4.3 beschriebene Expression kann auch für drei und mehr offene Leserahmen eingesetzt werden.
5. Das Modellsvstem für die Synthese/den Abbau von biogenem Siliciumdioxid: Primmorphe
5.1. Primmorphe
Das Primmorphe-System wurde zum Patent angemeldet (DE 19824384. Herstellung von Primmorphe aus dissoziierten Zellen von Schwämmen, Korallen und weiteren Invertebraten: Verfahren zur Kultivierung von Zellen von Schwämmen und weiteren Invertebraten zur Produktion und Detektion von bioaktiven Substanzen, zur Detektion von Umweltgiften und zur Kultivierung dieser Tiere in Aquarien und im Freiland. Erfinder und Anmelder: Müller WEG, Brummer F).
Primmorphe sind Aggregate, die aus proliferierenden und differenzierenden Zellen bestehen (Müller WEG, Wiens M, Batel R, Steffen R, Borojevic R, Custodio MR (1999) Establishment of a primary cell culture from a sponge: Primmorphs from Suberites domuncula. Marine Ecol Progr Ser 178:205-219). Primmorphe werden aus Schwamm-Einzelzellen, die aus Schwammgewebe nach Dissoziation in Ca2+- und Mg2+-freiem, EDTA enthaltendem künstlichem Seewasser erhalten werden, gebildet. Aus den Schwamm-Einzelzellen bilden sich nach Überführung in Ca2+- und Mg2+- enthaltendes Seewasser Aggregate, die nach 3 Tagen eine Größe von 1 mm erreichen, und nach 5 Tagen Primmorphe mit einem Durchmesser von etwa 5 mm.
Die Primmorphe werden von epithelartigen Zellen, den Pinacocyten, umgeben. Die Zellen innerhalb der Primmorphe sind überwiegend sphärulöse Zellen, daneben kommen Amoebocyten und Archaeocyten vor. 5.2. Effekt von Silicium auf die Spiculae-Bildung
Das Primmorphe-System von Schwämmen, z. B. S. domuncula, kann zur Untersuchung der Spiculae-Bildung oder -Auflösung benutzt werden.
Dazu werden Primmorphe für 8 Tage in Seewasser, das mit 30 μM Fe(+++) (hinzu- gegegeben als Citrat) und 10% RPMI1640-Medium ergänzt wird, kultiviert. Die Silici- um-Konzentration im Seewasser/Medium ist 5 μM. Nach 8 Tagen werden die Primmorphe entweder in diesem Medium weiter inkubiert oder in ein Medium, das 60 μM Silicium enthält (die für die Spiculae-Bildung optimale Silicium-Konzentration; hinzugegeben als Na-Hexafluorosilicat), überführt und für 1 oder 3 Tage kultiviert.
Primmorphe, die ohne Zugabe von Silicium kultiviert werden, zeigen überwiegend eine runde, sphärische Gestalt.
Abbildung 6A zeigt, daß die meisten der Primmorphe nach zusätzlicher 3-tägiger Kultivierung in Gegenwart von 60 μM Silicium jedoch ovalförmig werden. In Gegenwart von Silicium beginnen die Primmorphe mit der Spiculae-Bildung. Teilweise kann die Synthese von langen (>100 μm) Spiculae beobachtet werden (Abbildung 6B), meist werden jedoch kleinere Spiculae (30 μm) gefunden (Abbildung 6D). In Abwesenheit von Silicium sind keine Spiculae vorhanden (Abbildung 6C).
5.3. Silicium-responsive Gene
In Primmorphen von S. domuncula wird in Gegenwart von Silicium die Expression des Silicase-Gens hochreguliert. Daneben wird auch die Expression der folgenden Gene erhöht: Silicatein, Kollagen, Myotrophin und Isocitrat-Dehydrogenase.
Die Expression des Silicase-Gens kann durch Northem-Blotting unter Anwendung von Methoden, die Stand der Technik sind und beispielsweise zur Bestimmung der Expression von Silicatein und Kollagen angewandt wurden, bestimmt werden (Krasko A, Batel R, Schröder HC, Müller IM, Müller WEG (2000) Expression of silicatein and collagen genes in the marine sponge Suberites domuncula is controlled by silicate and myotrophin. Europ J Biochem 267:4878-4887).
In dem in Abbildung 7 gezeigten Experiment blieben die Primmorphe entweder un- behandelt oder wurden mit 60 μM Silicium für 1 bis 3 Tage inkubiert. Die RNA wurde dann extrahiert. Eine Menge von je 5 μg Gesamt-RNA wurde elektrophoretisch an einem 1%igen Formaldehyd/Agarose-Gel aufgetrennt und auf eine Hybond-N+ Nylon-Membran entsprechend der Vorschrift des Herstellers (Amersham) geblottet. Die Hybridisierung wurde mit 400 bis 600 bp großen Segmenten der folgenden Sonden durchgeführt: SDSIA (codiert für Silicase), SDSILICA (codiert Silicatein) und SDIDH (codiert für die α-Untereinheit der Isocitrat-Dehydrogenase). Die Sonden wurden mit dem PCR-DIG-Probe-Synthesis Kit entsprechend der Vorschrift des Herstellers (Röche) markiert. Nach dem Waschen wurde die DIG-markierte Nucleinsäure mit anti- DIG Fab Fragmenten (konjugiert mit alkalischer Phosphatase; Verdünnung: 1 :10000) detektiert und mit Hilfe der Chemolumineszenztechnik unter Verwendung von CDP (Röche), dem Chemolumineszenzsubstrat der alkalischen Phosphatase, sichtbar gemacht.
Abbildung 7 zeigt die erhaltenen Northern-Blots. Es ist sichtbar, daß die Gene für die Silicase und Silicatein als Antwort auf höhere Siliciumkonzentrationen stark hochreguliert werden. Weiterhin wird auch das Isocitrat-Dehydrogenase-Gen (codiert für ein am Citratcyclus beteiligtes Enzym) hochreguliert, was anzeigt, daß die Bildung von amorphem Siliciumdioxid eine erhöhte metabole Rate der Zellen erfordert.
6. Wirkmechanismus der Silicase
Überraschend war der durch Sequenzvergleiche erhaltenen Befund, daß die Silicase ein Mitglied der Familie der Carboanhydrasen (Carbonat-Hydrolase; EC 4.2.1.1) ist. Diese Enzyme katalysieren die reversible Hydration von Kohlendioxid (Abbildung 8 [1]). Kohlendioxid wird durch die Carboanhydrase in HCO3" und H+ umgewandelt.
Die Silicase besitzt in der Tat auch eine Carbonanhydrase-Aktivität, wie mit einem kolorimetrischen Assay (Armstrong JM, Myers DV, Verpoorte JA, Edsall JT (1966) Purification and properties of human erythrocyte carbonic anhydrase. J Biol Chem 241 :5137-5149) nachgewiesen werden kann. Demzufolge ist es möglich, daß die Silicase infolge der Umwandlung von CO2 zu HCO3" eine Änderung des pH bewirkt (Abbildung 8 [1]). Dies ermöglicht eine Anätzung von Kalksubstraten, aber nicht von Siliciumdioxid-Materialien, deren Löslichkeit mit steigendem, aber nicht mit fallendem pH ansteigt.
Es ist bekannt, daß einige Schwammspezies wie Spezies des Genus Cliona fähig sind, Calciumcarbonat aufzulösen und Löcher in Calcit/Aragonit-Substrate zu boren (Rützler K, Rieger G (1973) Sponge burrowing: fine structure of Cliona lampa pene- trating calcareous substrata. Mar Biol 21 :144-162).
Unbekannt und überraschend war jedoch die Silicase-Aktivität des Enzyms.
Es ist bekannt, daß am Wirkmechanismus (Carboanhydrase-Aktivität) der Carboanhydrasen drei Histidinreste beteiligt sind, die an ein divalentes Zinkion binden; dementsprechend kann für die Silicase-Aktivität folgender Wirkmechanismus formuliert werden (Abbildung 8 [2]). Bei der Silicase von S. domuncula werden die Histidinreste in dem abgeleiteten Polypeptid bei den Aminosäurepositionen aaιβι, aa-ι.3 und aa206 gefunden (Abbildung 3A). In Wasser (Lewis-Base) wird ein an das Zn2+ (Lewis- Säure) gebundenes Hydroxidanion gebildet. Dieses führt einen nucleophilen Angriff an einem der Siliciumatome durch, die über Sauerstoffatome miteinander verknüpft sind (Abbildung 8). Im nächsten Schritt bindet der Zink-Komplex an das Siliciumatom unter Spaltung der Sauerstoffbindung. Unter Verbrauch von H2O wird letztendlich eine freie Kieselsäure freigesetzt und das initiale Zink(ll)-gebundene Hydroxidanion wieder gebildet.
7. Verwendungen der Silicase und Silicase-Fusionsproteine
Für die rekombinante Silicase, die aus verschiedenen Quellen gereinigte Silicase und die Silicase-Fusionsproteine ergeben sich eine Reihe unterschiedlicher industriell-technischer Verwendungen, und zwar:
1.) Verwendung zur Oberflächenmodifikation von Biomaterialien (Verbesserung der Biokompatibilität). Oberflächen-modifizierte Biomaterialien finden u. a. Verwendung zur Beeinflussung von Zelladhäsion und Wachstum, zur Modifizierung der Blut- Kompatibilität oder zur Kontrolle der Protein-Adsorption (z. B. Herabsetzung der Adsorption von Kontaktlinsen). Eine Literatur-Übersicht findet sich in: Ratner BD et al (Hrsg) Biomaterials Science - An Introduction to Materials in Medicine. Academic Press, San Diego, 1996. Ein Problem besteht darin, daß die zur Herstellung dieser Modifikationen angewandten Bedingungen oft einen schädlichen (destruierenden) Effekt auf die benutzten Biomaterialien haben. Eine im Vergleich zu den benutzten physikalisch/chemischen Verfahren "milde", Biomaterialien schonenden Methode stellt eine Modifikation der Oberflächen dar, die allein auf bioche- misch/enzymatischen Reaktionen beruht, was mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens möglicht wird (Silicase-vermittelter enzymatischer Abbau und - als reversible Reaktion - enzymatische Synthese von S1O2- oder Siloxan-enhaltenden Oberflächen mit Hilfe der rekombinanten/gereinigten Silicase). Insbesondere ergibt sich auch eine Verwendung der rekombinanten oder aus natürlichen Quellen gereinigten Silicase bei der Herstellung von Oberflächen-Modifikationen (beim Coating) von Silicon-Materialien, wie Silicon-Brust-Implantaten, Endoprothesen oder Metall- Implantaten (Verbesserung der Verbindung zwischen Knochen und Metall-Implantat, Biologisierung der Metall-Implantate) sowie Kontakt/Plastiklinsen. Weitere Verwendungen betreffen das Coating von Collagen, das als Knochenersatzmaterial dient, und von Collagen-Vliesen, die z. B. für das "Tissue Engineering" benutzt werden. Das Ziel ist hierbei die Erhöhung der Stabilität und der Porosität sowie die Verbesserung der Resorbierbarkeit.
2.) Verwendung zur Herstellung neuer Biomaterialien wie Knochenersatzmaterialien oder Zahnersatzmaterialien durch Co-Synthese von Polysilicaten, Siliconen oder Mischpolymeren.
3.) Verwendung zur Oberflächen-Modifikation (Kontaktzonen-Behandlung) von (Sili- cium)-Halbleitern oder Silicium-Chips. 4.) Verwendung zur Modifikation oder zur Synthese von Nano-Strukturen aus amorphem Siliciumdioxid. Mittels der rekombinanten Silicase, der rekombinanten Silicase- Fusionsproteine oder der gereinigten Silicase ist es möglich, spezifische zwei- und dreidimensionale Strukturen aus amorphem Siliciumdioxid im Nano-Maßstab zu modifizieren oder zu synthetisieren. Die gebildeten Strukturen können in der Nanotechnologie angewandt werden.
5.) Verwendung zur Oberflächenmodifikation von Silicium-haltigen Edelsteinen und Halbedelsteinen. Zu den amorphen bzw. feinkristallinen Modifikationen des Siθ2 zählen u. a. Achat, Jaspis und Onyx. Aufgrund der Möglichkeit, mit Hilfe der Silicase unter kontrollierten Bedingungen die Oberfläche dieser Minerale zu modifizieren, ergibt sich die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens bei der Herstellung oder Bearbeitung dieser Edelsteine/Halbedelsteine. Hierbei ergibt sich auch die Möglichkeit, gezielt Fremdmoleküle/atome einzufügen.
6. Verwendung bei der Modifikation oder Synthese von Silicium-organischen Verbindungen einschließlich Sila-Pharmaka. Für einen Überblick über die Herstellung von Silicium-organischen Verbindungen als Grundlage für sogenannte Sila-Pharmaka (Pharmaka, bei denen C durch Si ersetzt ist), siehe: Chem. unserer Zeit 14, 197-207 (1980), sowie: Bioactive Organo-Silicon Compounds (Topics Curr. Chem. 84), Berlin, Springer 1979). Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens sind neue, enzymatische Wege zur Modifikation oder Synthese derartiger Verbindungen möglich.
8. Verwendungen der Silicase und Silicase-Fusionsproteine zur Prävention und Therapie der Silikose (Quarzstaublungenerkrankung)
8.1. Silikose
Kristalline Kieselsäure (Siliciumdioxid) in Form von Quarz, Tridymit oder Cristobalit ist wahrscheinlich einer der wichtigsten Arbeitsplatzgefahrenstoffe. Die Schwere der Gesundheitsbeeinträchtigungen und die Vielfalt der möglichen Expositionsquellen sind lange bekannt. Auf Grund des weitverbreiteten Auftreten von kristallinem Siliciumdioxid in der Erdkruste und des häufigen Gebrauchs von Materialien, die es enthaltenden, sind insbesondere Arbeiter in einer Vielzahl unterschiedlicher Industriebetriebe gegenüber kristallinem Siliciumdioxid ausgesetzt. Es kann davon ausgegangen werden, daß in der Landwirtschaft, im Bergbau, in der Glas- und Faser- glaslndustrie, bei der Zement-Produktion, bei der Herstellung von Keramiken, in Gießereien, in der Farben-, Seifen- und Kosmetika-Produktion oder in der Dental-Manufaktur/Reparatur Millionen von Beschäftigten regelmäßig gegenüber kristallinem Siliciumdioxid exponiert sind. Nach der "American Thoracic Society" ist Siliciumdioxid weltweit eine der Hauptursachen von Lungenerkrankungen. Somit besteht ein großer Bedarf zur Entwicklung von Strategien zur Prävention und Therapie.
Es ist bekannt, daß inhaliertes kristallines Siliciumdioxid Lungenfibrose (Silikose) und Lungenkrebs verursacht. Die Silikose ist eine maligne Pneumokoniose, die durch eine Akkumulation von Siliciumdioxid-Partikeln im Lungengewebe verursacht wird und durch das Auftreten von silikotischen Knötchen charakterisiert ist. Eine rationale Therapie dieser zu schweren Behinderungen führenden Krankheit existiert nicht.
Ein Hauptgrund für die Toxizität von staubförmigen, kristallinem Siliciumdioxid liegt darin, daß die Lunge nicht in der Lage ist, die eingeatmeten Staubpartikel zu eliminieren. Die im Lungengewebe verbleibenden Siliciumdioxid-Partikel führen zu Entzündungsreaktionen und zur Bildung von zelltoxischen Zytokinen, Proteasen und reaktive Sauerstoffradikalen. Bei Fortdauer dieser Erscheinungen kommt es zu einer Bindegewebsvermehrung mit einer gesteigerten Bildung von Kollagen in der Lunge, was zur Entstehung der Pneumokoniose führt.
Die Silikose entwickelt sich im allgemeinen sehr langsam über Jahrzehnte. Sie ist eine fortschreitende Erkrankung, die nicht heilbar ist. Sie zeigt sich zunächst durch Atemnot, Reizhusten und Stechen in der Brust. Durch Überlastung des Herzens und Einschränkung von Atmung und Kreislauf kommt es schließlich zum Tod. Der durchschnittliche Zeitraum zwischen der Staubexposition und dem Auftreten der Silikose liegt bei etwa 20 Jahre. Eine gefährliche Komplikation der Silikose ist die Silikotuber- kulose. Der Mechanismus, der zur Entstehung von Lungenkrebs durch kristallines Siliciumdioxid führt, wird noch wenig verstanden.
Die Silikose ist die häufigste Staublungenerkrankung unter den Berufskrankheiten. Die mittleren Gesamtkosten eines Silikose-Patienten liegen bei etwa 130.000 Euro.
8.2. Therapeutika/Protektiva bei Silikose
Die Silicase, die an der Auflösung von biogenem Siliciumdioxid beteiligt ist, kann als Therapeutikum/Protektivum zur Behandlung der Silikose eingesetzt werden.
Die Silicase ist nicht nur zur Auflösung von amorphem, sondern auch von kristalinem Siliciumdioxid (Quarzkristallen) in der Lage.
Die Silicase besitzt somit die notwendigen Eigenschaften, um Siliciumdioxid aus der Lunge zu eliminieren und/oder den Verlauf dieser Lungenerkrankung zu modulieren.
Verschieden Methoden zur Administration des rekombinanten Enzyms kommen in Betracht: a) als Enzympräparation, b) verpackt in Liposomen, c) assoziiert mit Mikrosphären oder d) Adenovirus-vermittelter Gentransfer.
Mikrosphären als Carrier-Systems für die rekombinante Silicase zur Behandlung der Silikose (Auflösung von SiO2) können z. B. aus Schwamm-Collagen analog zu Käl- ber-Callagen-Mikrosphären hergestellt werden (Rössler et al., Pharmazie 49 (1994) 175-179). Die Schwammm-Collagen-Mikropartikel werden durch Adsorption des rekombinanten Proteins (Silicase) beladen, wie beschrieben (Rössler et al., J. Microen- capsulation 12 (1995) 49-57; Berthold et al., Eur. J. Pharm. Biopharm. 45 (1998) 23- 29). Die Vorteile des Collagens sind seine Bioabbaubarkeit sowie seine niedrige To- xizität und Immunogenität. Als weitere "Delivery"-Systeme kommen u. a. auch Liposomen mit dem eingeschlossenen rekombinanten Enzym sowie Lipid-Nanopartikel in Frage (Jenning et al., Eur. J. Pharm. Biopharm. 49 (2000) 211-218).
8.3. Veränderung der Eigenschaften von Zellen durch Transfektion mit einem Sili- case-Gen/cDNA-enthaltenden Plasmid Durch Transfektion von Zellen mit einem Silicase-Gen/cDNA-enthaltenden Plasmid lassen sich deren Eigenschaften verändern, was u. a. eine Verwendung bei der Herstellung von Knochenersatzmaterialien oder eine Gentherapie (z. B. bei Silikose) ermöglicht.
Erläuterungen zu den Abbildungen:
Im nachfolgenden sind die erläuternden Legenden zu den beigefügten Abbildungen und dem Sequenzprotokoll aufgeführt. Es zeigen:
SEQ ID No. 1 : Die Aminosäuresequenz der erfindungsgemäßen Silicase aus S. domuncula (SIA_SUBDO),
SEQ ID No. 2: Die Nukleinsäuresequenz der cDNA der erfindungsgemäßen Silicase aus S. domuncula.
Abbildung 1 :
Identifizierung von Transkripten in Primmorphen, die nach Inkubation in 60 μM Silicium für 1 oder 3 Tage hochreguliert wurden, mit Hilfe der Technik des Differential Display. Die Primmorphe blieben entweder bei der normalen Silicium-Konzentration von 5 μM (Spur a) oder wurden in Gegenwart von 60 μM Silicium inkubiert (Spur b und c). Die RNA wurde extrahiert und für die Analyse benutzt. Zur Amplifizierung der Transkripte wurden zwei unterschiedliche willkürliche Primer (1 und 2) benutzt. Diejenigen Transkripte, die lediglich bei höherer Silicium-Konzentration (Spur b und c) auftraten und analysiert wurden, sind markiert (>).
Abbildung 2:
Oben: Aus der Nucleotidsequenz des offenen Leserahmens (codierende Region) der S. domuncula Silicase-cDNA (SIA_SUBDO) abgeleitete Aminosäuresequenz. Unten: Nucleotidsequenz der S. domuncula Silicase-cDNA (SIA_SUBDO). Die aus der Nucleotidsequenz des offenen Leserahmens abgeleitete Aminosäuresequenz ist unterhalb der Nucleotidsequenz angegeben.
Abbildung 3: (A) Alignment der S. domuncula Silicase (SIA_SUBDO) mit der humanen Carboanhydrase II (Carbonat-Dehydratase II) (CAH2_HUMAN; P00918). Die Carboanhydrase-Domäne ist eingerahmt ( |j= e-CAdom =j|). Die charakteristischen Aminosäuren, welche die Eukaryonten-Typ-Carboanhydrase-Signatur bilden, sind markiert (A: in beiden Sequenzen gefunden; ■: lediglich in der Carboanhydrase, aber nicht in der Silicase vorhanden). Die zusätzlichen-Zeichen (+) zeigen diejenigen Reste, die das Hydrogen-Netzwerk des aktiven Zentrums bilden. Die drei Zink-bindenden Histidin- Reste sind markiert (Z). Ähnliche Aminosäurereste zwischen den beiden Sequenzen sind hervorgehoben. Die Grenzen der langen (~rec~ bis ~rec~) sowie der kurzen rekombinanten Silicase (~rec-s~ bis ~rec~) sind markiert und doppelt unterstrichen. (B) Phylogenetischer Baum, konstruiert mit der Schwamm-Silicase und folgenden verwandten Enzymen: humane Carbonanhydrase I (Carbonatdehydratase I) (CAH1JHUMAN; P00915), II (CAH2JHUMAN), III (CAH3JHUMAN; P07451), IV (CAH4JHUMAN; P22748), VI (CAH6JHUMAN; P23280), VII (CAH7JHUMAN; P43166), VIII (CAH8JHUMAN; . P35219), IX (CAH9_HUMAN; Q16790), X (CAHA_HUMAN; Q9NS85), VA (CAH5JHUMAN; P35218), VB (CA5B_HUMAN; Q9Y2D0), XII (CAHC_HUMAN; O43570), XIV (CAHE_HUMAN; Q9ULX7), Carboanhydrase von Caenorhabditis elegans (CAH_CAEEL; NP_510674.1), Carboanhydrase von Drosophila melanogaster (CAH1_DROME; NP_523561.1), Carboanhydrase der Pflanzen Arabidopsis thaliana (CAH-I_ARATH; NP_196038.1) und Chlamydomonas reinhardtii (Carbonatdehydratase 1) (CAH1_CHLRE; P20507) sowie bakterielle Carboanhydrasen von Neisseria gonorrhoeae (CAH_NEIGO; Q50940), Klebsiella pneu- moniae (CAH_KLEPN; 052535) und den Cyanobakterien Nostoc sp. PCC 7120 (CAH_ANASP; P94170). Die letztgenannte Sequenz diente als Outgroup. Die Meßbalken zeigen eine evolutionäre Distanz von 0,1 Aminosäure-Substitutionen pro Position in der Sequenz an. Der phylogenetische Baum wurde mittels "Neighbour- Joining" konstruiert ("Neighbor" Programm: Felsenstein, J. (1993). PHYLIP, ver. 3.5. University of Washington, Seattle).
Abbildung 4:
Herstellung der rekombinanten Silicase. Die rekombinante S. domuncula Silicase (rSIA_SUBDO) wurde als GST-Fusionsprotein hergestellt. Sowohl die lange als auch die kurze SDSIA wurden in ein pGEX-4T-2-Plasmid kloniert, das das Glutathion S- Transferase (GST)-Gen enthielt. Die Fusionsproteine wurden entweder ohne vorher- gehende Induktion mit IPTG (-IPTG) oder nach Inkubation mit IPTG (+IPTG) für 4 oder 6 Stunden isoliert, danach gespalten, gereinigt und anschließend der Na- DodSO4-PAGE unterworfen. Das Gel wurde mit Coomassie Brillant Blau gefärbt. Die gereinigte lange Form rSIA_SUBDO-l mit einer Größe von 43 kDa sowie die kurze Form (Mr 32 kDa) der Silicase wurden erhalten.
Abbildung 5:
Bestimmung der Enzymaktivität der Silicase im Carboanhydrase- und im Silicase- Assay. Die rekombinante Silicase wurde zu den Reaktionsmischungen hinzugefügt in Konzentrationen zwischen 1 und 10 μg pro Assay (0,56 μl). Zur Bestimmung der Carboanhydrase-Aktivität (■) wurde p-Nitrophenylacetat als Substrat benutzt. Das freigesetzte p-Nitrophenol wurde bei einer Wellenlänge von 348 nm gemessen. Die Aktivität der Silicase (•) wurde unter Verwendung von S. domuncula Spiculae bestimmt. Die freigesetzte, durch Depolymerisation (Abbau) von amorphen Siliciumdioxid gebildete Kieselsäure wurde mit Hilfe der "Silicon Test" kolorimetrischen Reaktion bestimmt.
Abbildung 6:
Effekt von Silicium auf die Bildung von Spiculae in Primmorphen. Für die Bildung der Primmorphe wurden dissoziierte Zellen des Meeresschwammes S. domuncula in Seewasser, ergänzt mit 10% RPMI1640-Medium und 30 μM Fe(+++), inkubiert. Die Primmorphe wurden dann für 3 Tage in ein Medium (RPMI 1640, Fe(+++)), das mit 60 μM Silicium angereichert wurde, überführt. (A) Die Primmorphe wurden in Medium plus Silicium inkubiert. Vergrößerung: x6. (B) In einigen Fällen begannen die Primmorphe mit der Synthese von Spiculae (sp). Vergrößerung: x10. Zur semiquantitativen Messung wurden die Primmorphe zwischen zwei Deckgläser gepresst (C und D). (C) Primmorphe, die in Abwesenheit von Silicium inkubiert wurden, waren fast komplett ohne Spiculae, während diejenigen, die in Gegenwart von Silicium kultiviert wurden, neugebildete Spiculae enthielten (>) (D); Vergrößerung: x200.
Abbildung 7:
Expression der Silicase, des Silicateins und der Isocitrat-Dehydrogenase, bestimmt durch Northem-Blotting. Die RNA wurde aus Primmorphen extrahiert, die in Abwesenheit von zusätzlichem Silicium (- Si) oder in Gegenwart von 60 μM Silicium (+ Si) für 1 bis 3 Tage inkubiert worden waren. 5 μg der Gesamt-RNA wurde elektrophore- tisch aufgetrennt, auf Nylonmembranen geblottet und mit den folgenden Sonden hybridisiert: SDSIA (Silicase), SDSILICA (Silicatein) und SDIDH (α-Untereinheit der Isocitrat-Dehydrogenase). Die Größen der Transkripte sind angegeben.
Abbildung 8:
Enzymatische, von der Silicase (Carboanhydrase) von S. domuncula vermittelte Reaktionen. In [1] ist die Überführung von CO2 in HCO3" gezeigt. In [2] ist die Reaktion der Silicase gezeigt. Die Silicase bindet mit ihren drei Histidin-Resten ein Zinkatom. Das Zinkion, eine Lewis-Säure, bindet ein Hydroxid-Anion, das aus Wasser, einer Lewis-Base, stammt. Der Silicase/Zink-Komplex unternimmt einen nucleophilen Angriff auf ein Siliciumatom zwischen den Sauerstoffbindungen. Dadurch wird die Hydrolyse des polymeren Siliciumdoxids bewirkt, das zunächst - mit einer der beiden Produkthälften - an das Enzym gebunden bleibt. Unter weiterem Verbauch von H2O wird das Produkt freigesetzt bis nach mehreren Cyclen letztendlich freie Kieselsäure zurückbleibt.
Abbildung 9:
Links: Spiculae (Nadeln) von Suberites domuncula nach 6 stündiger Inkubation in Abwesenheit von Silicase. Rechts: Spiculae von Suberites domuncula nach 6 stündiger Inkubation in Gegenwart von Silicase. Die Inkubation erfolgte unter den in Tabelle 2 beschriebenen Bedingungen.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum in vitro oder in vivo Abbau von amorphem oder kristallinem Siliciumdioxid (Kondensationsprodukte der Kieselsäure, Silicate), Siliconen und anderen Silicium(IV)- oder Metall(IV)-Verbindungen sowie von Mischpolymeren dieser Verbindungen, wobei ein Polypeptid oder ein Metallkomplex eines Polypeptids zum Abbau eingesetzt wird, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid eine tierische, bakterielle, pflanzliche oder Pilz Carboanhydrase-Domäne umfaßt, die mindestens 25% Sequenzähnlichkeit zu der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Sequenz aufweist.
2. Verfahren zur Synthese von amorphem Siliciumdioxid (Kondensationsprodukte der Kieselsäure, Silicate), Siliconen und anderen Silicium(IV)- oder Metall(IV)- Verbindungen sowie von Mischpolymeren dieser Verbindungen, wobei ein Polypeptid oder ein Metallkomplex eines Polypeptids zur Synthese eingesetzt wird, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid eine tierische, bakterielle, pflanzliche oder Pilz Carboanhydrase-Domäne umfaßt, die mindestens 25% Sequenzähnlichkeit zu der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Sequenz aufweist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß zur Synthese Verbindungen wie Kieselsäuren, Monoalkoxysilantriole, Dialkoxysilandiole, Trialkoxysilanole, Tetraalkoxysilane, Alkyl- oder Aryl-Silantriole, Alkyl- oder Aryl- Monoalkoxysilandiole, Alkyl- oder Aryl-Dialkoxysilanole, Alkyl- oder Aryl- Trialkoxysilane oder andere Metall(IV)-Verbindungen als Reaktanten (Substrate) eingesetzt werden.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei durch Verwendung definierter Mischungen der Verbindungen Mischpolymere definierter Zusammensetzung hergestellt werden.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei durch das Polypeptid oder einen Metallkomplex des Polypeptids oder die Bindung des Polypeptids oder eines Metallkomplexes des Polypeptids an andere Moleküle oder die Oberflächen von Glas, Metallen, Metalloxiden, Kunststoffen, Biopolymeren oder anderen Ma- terialien als Template die Ausbildung definierter zwei- und dreidimensialer Strukturen erfolgt.
6. Verfahren zur Modifikation einer Kieselsäure oder Silicium(IV)- oder Metall(IV)- Verbindung enthaltenden Struktur oder Oberfläche, wobei ein Polypeptid oder ein Metallkomplex eines Polypeptids zur Modifikation eingesetzt wird, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid eine tierische, bakterielle, pflanzliche oder Pilz Carboanhydrase-Domäne umfaßt, die mindestens 25% Sequenzähnlichkeit zu der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Sequenz aufweist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Kieselsäure enthaltende Struktur oder Oberfläche in Form eines Edelsteins oder Halbedelsteins vorliegt.
8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei die Modifikation eine Glättung, ein Anätzen oder ein Herstellen von Ausbohrungen der Kieselsäure oder Silicium(IV)- oder Metall(IV)-Verbindung enthaltenden Struktur oder Oberfläche durch das Polypeptid oder einen Metallkomplex des Polypeptids umfaßt.
9. Chemische Verbindung oder Kieselsäure-enthaltende Struktur oder Oberfläche, die nach einem Verfahren der voranstehenden Ansprüche erhalten wurde.
10. Kieselsäure enthaltende Struktur oder Oberfläche nach Anspruch 9 in Form eines Edelsteins oder Halbedelsteins.
11. Polypeptid einer Silicase aus Suberites domuncula gemäß SEQ ID Nr. 1 oder ein dazu homologes Polypeptid, das in der Aminosäuresequenz der Carboanhydrase-Domäne mindestens 25% Sequenzähnlichkeit zu der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Sequenz besitzt, ein Metallkomplex des Polypeptids, oder Teile davon.
12. Nukleinsäure, insbesondere gemäß SEQ ID Nr. 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie im wesentlichen für ein Polypeptid gemäß Anspruch 11 kodiert.
13. Nukleinsäure, nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß sie im Form einer DNA, cDNA, RNA oder Gemischs davon vorliegt.
14. Nukleinsäure nach Anspruch 12 oder 13 , dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz der Nukleinsäure mindestens ein Intron und/oder eine polyA-Sequenz aufweist.
15. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 12 bis 14 in Form ihrer komplementären „antisense"-Seq uenz.
16. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 12 bis 15 in Form eines (a) Fusionsprotein- (chimäres Protein) Konstrukts, (b) Konstrukts mit getrennter Protein- Expression (Protease-Spaltstelle) oder (c) Konstrukts mit getrennter Protein- Expression (Kassetten-Expression).
17. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 12 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure synthetisch hergestellt worden ist.
18. Vektor, vorzugsweise in Form eines Plasmids, Shuttle Vektors, Phagemids, Cos- mids, Expressionsvektors, retroviralen Vektors, adenoviralen Vektors oder Partikels, Nanopartikels oder Liposoms, umfassend eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 12 bis 17.
19. Vektor, vorzugsweise in Form eines Nanopartikels oder Liposoms, umfassend ein Polypeptid nach Anspruch 11.
20. Wirtszelle, transfiziert mit einem Vektor oder infiziert oder transduziert mit einem Partikel gemäß Anspruch 18 oder 19.
21. Wirtszelle nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Polypeptid nach Anspruch 1 , einen Metallkomplex des Polypeptids oder Teile davon expri- miert.
22. Polypeptid nach Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid synthetisch hergestellt worden ist.
23. Polypeptid nach Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid oder der Metallkomplex des Polypeptids in einem prokaryotischen oder eukaryotischen Zellextrakt oder -lysat vorliegt.
24. Polypeptid nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid oder der Metallkomplex des Polypeptids im wesentlichen frei von anderen Proteinen gereinigt vorliegt.
25. Verfahren zur Auffindung von Inhibitoren oder Aktivatoren eines Polypeptids einer Silicase aus Suberites domuncula gemäß SEQ ID Nr. 1 oder eines dazu homologen Polypeptids, das in der Aminosäuresequenz der Carboanhydrase-Domäne mindestens 25% Sequenzähnlichkeit zu der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Sequenz besitzt, wobei a) ein Polypeptid einer Silicase aus Suberites domuncula gemäß SEQ ID Nr. 1 oder ein dazu homologes Polypeptid, das in der Aminosäuresequenz der Carboanhydrase-Domäne mindestens 25% Sequenzähnlichkeit zu der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Sequenz besitzt, zur Verfügung gestellt wird, b) das Polypeptid aus Schritt a) mit einem potentiellen Inhibitor oder Aktivator in Kontakt gebracht wird, und c) die Fähigkeit des Polypeptids gemessen wird, Silikate oder Silicone abzubauen oder zu synthetisieren.
26. Verfahren nach Anspruch 25, wobei das Polypeptid einer Silicase aus Suberites domuncula gemäß SEQ ID Nr. 1 oder ein dazu homologes Polypeptid, das in der Aminosäuresequenz der Carboanhydrase-Domäne mindestens 25% Sequenzähnlichkeit zu der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Sequenz besitzt in vivo, in einem Zellextrakt oder -lysat oder in gereinigter Form zur Verfügung gestellt wird.
27. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend a) Auffinden eines Inhibitors oder Aktivators nach Anspruch 25 oder 26 und b) Mischen des aufgefundenen Inhibitors oder Aktivators mit einem pharmazeutisch geeigneten Träger oder Hilfsstoff.
28. Verwendung eines Polypeptids oder einer Nukleinsäure oder pharmazeutischen Zusammensetzung nach einem der voranstehenden Ansprüche zur Prävention oder Therapie der Silikose.
29. Verwendung gemäß Anspruch 28, wobei die Prävention und Therapie der Silikose durch Auflösen von Quarzkristallen erfolgt.
30. Verwendung eines Polypeptids oder einer Nukleinsäure oder pharmazeutischen Zusammensetzung nach einem der voranstehenden Ansprüche zur Resorption oder zur Modulation der Resorbierbarkeit von Siliconen und Silicon-Implantaten.
31. Verwendung einer Nukleinsäure nach einem der voranstehenden Ansprüche zur Transfektion von Zellen zur Resorption oder zur Modulation der Resorbierbarkeit von Siliconen und Silicon-Implantaten.
PCT/EP2003/010983 2002-10-03 2003-10-02 Abbau und modifizierung von silicaten und siliconen durch silicase und verwendung des reversiblen enzyms Ceased WO2004033679A1 (de)

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