WO2004041859A2 - Fragments peptidiques du facteur harp inhibant l'angiogenese - Google Patents

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WO2004041859A2
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Pierre Milhiet
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to peptide fragments of the HARP protein inhibiting angiogenesis.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • FGF fibroblast growth factor
  • HTP Pheparin affin regulatory peptide
  • HARP angiogenic role of the HARP factor has been shown through a set of experiments carried out in vitro and in vivo (Papadimitriou et al. 2001; Papadimitriou et al., 2000).
  • HARP is capable of inducing the formation of pseudo-capillaries thus mimicking the first stages of angiogenesis, ie i.e. activation of endothelial cells and their migration through a partially destroyed extracellular matrix.
  • a synthetic peptide of 43 amino acids corresponding to part of the C-terminal domain of HARP is capable of stimulating the secretion of the plasminogen activator by endothelial cells of beef aorta (ABAE) and d 'inhibit the secretion of its inhibitor PAI-1 (Kojima et al., 1995a; Kojima et al., 1995b).
  • This activator induces the cleavage of plasminogen into plasmin, a protease playing a key role in the degradation of the extracellular matrix.
  • HARP shares this property with another protein which binds to heparin (Matsubara et al., 1990): the Midkine protein (MK) with 50% amino acid sequence homology with which it constitutes a new family of 'HBGF (Tsutsui et al., 1991).
  • MK Midkine protein
  • HARP The role played by HARP in tumor angiogenesis was also underlined by Roy Bicknell's team.
  • the overexpression of HARP in MCF7 mammary carcinoma cells injected into "nude” mice causes an increase in the size of the tumor compared to those obtained without overexpression.
  • the increase in tumor size is linked to vascular density and a multiplication of endothelial cells (Choudhuri et al., 1997).
  • the proliferation of endothelial cells is another key step in angiogenesis in which HARP could play a crucial role.
  • HARP has been shown to stimulate the proliferation of endothelial cells in vitro (Courty et al., 1991).
  • HARP stimulates in vitro the formation of soft agar colonies of non-tumorigenic SW13 epithelial cells (Fang et al., 1992) and the overexpression of its cDNA in NIH cells 3T3 (Chauhan et al., 1993) or SW-13 (Fang et al., 1992) induces the formation of a tumor in "nude” mice.
  • This mitogenic role is reinforced by the expression of the molecule in many cancers.
  • HARP mRNAs were detected in cell lines derived from breast cancer (T47 Dco, MDA-MB231, MDA-MB361, Hs-578T) (Fang et al., 1992), of l ovary (A1827, PA-1) (Riegel et al., 1994), prostate (PC-3) (Vacherot et al., 1999a) and lung (Jager et al., 1997).
  • HARP protein mRNA has been detected in endothelial cells belonging to the blood capillaries of the prostate and human mammary glands (Vacherot et al., 1999a; Ledoux et al., 1997).
  • a increase in the level of mRNA and of the HARP protein associated with the progestin phase of the cycle was also demonstrated. This result was confirmed by the injection of progesterone in ovariectomized rats.
  • Progesterone-induced overexpression is detectable in capillary endothelial cells of the endometrium (Milhiet et al., 1998).
  • the presence of the HARP protein on the surface of endothelial cells has also been indirectly demonstrated during intravenous injections of heparin in humans (Novotny et al., 1993).
  • Deuel's group recently demonstrated an increase in the expression of HARP mRNA in developing microvessels after cerebral ischemia in rats (Yeh et al., 1998).
  • the growth factors HARP and Midkine (MK) are molecules with 50% homology and having mitogenic properties on epithelial, fibroblastic and endothelial cells.
  • Patent application FR 2 799 465 discloses a fragment of HARP with angiogenic activity.
  • HBGF also depends on its interaction with glycoaminoglycans or GAG, of the heparan or chondroitin sulphate type (Vacherot et al., 1999b).
  • HARP mitogenic activity of HARP is potentiated in the presence of heparin, heparan sulfate and chondroitin sulfate type A and B.
  • Cellular treatment with heparinase abolishes the mitogenic activity of HARP.
  • This activity can then be restored in the presence of heparin.
  • a study of the relationships between the structure and function of HARP has suggested that the C-terminal part of HARP corresponding to amino acid residues 111-136 (numbering referring to the form HARP ⁇ 3 ⁇ ) is directly involved in the induction of mitogenic activity (Bernard-Pierrot et al., 2001) and in its interaction with the ALK receptor.
  • the angiogenic factor HARP contains fragments peptides capable of inhibiting angiogenesis, as well as tumor growth.
  • peptides 13-39 or 65-97 act on GAG receptors, which are low affinity receptors that inhibit the angiogenic activity of HARP, while peptide 111-136 acts on the ALK receptor, on high affinity.
  • Blocking the high affinity sites of HARP as well as those of low affinities common to other angiogenic factors allows a particularly effective therapy in the treatment of pathologies associated with an angiogenesis phenomenon.
  • the proposed therapeutic approach consists of the administration of peptides or the administration of nucleic acids encoding these peptides.
  • the HARP factor and its fragments The "heparin affin regulatory peptide” or HARP (Courty et al., 1991) also called “pleiotrophin” (Wellstein et al., 1992) or "heparin binding-growth associated molecule” or HB-GAM (Rauvala et al., 1989) belongs to the family of "heparin binding growth factors” (HBGF).
  • HBGF heparin binding growth factors
  • HARP protein is synthesized as a precursor of 168 amino acids that has two cleavage sites by the signal peptidase resulting in a mature protein of 136 or 139 amino acids (3 HARP ⁇ HARP ⁇ 6 or 39).
  • 36 and HARP- ⁇ 3 g have the same biological activities in vitro, however the specific activity of inducing cell proliferation of the HARP- ⁇ 3 g form is better than that observed for the HARP- ⁇ 36 form (Bernard Pierrot et al., 2001).
  • the amino acid numbering is given according to the HARP protein of 136 amino acids.
  • 36 is also presented in sequence SEQ ID No. 1.
  • the HARP protein or its fragments refers to the human protein or its fragments, but also to any variant of the protein in other species, in particular in mammals such as cattle, rodents, etc.
  • mice Genetic N ° AK017768 or NM 008973
  • rat Genebank N ° NM017066
  • ox Genebank N ° X52945
  • Variants are also known in Zebrafish (Genbank N ° NM131070) and in Drosophila (miple protein Genbank N ° NM 138178).
  • the fragments 13-39, 65-97 or 111-136 are the fragments as numbered in the sequence SEQ ID No. 1, namely the sequences:
  • KLTKPKPQAESKKKKKEGKKQEKMLD SEQ ID No.4
  • biological activity is meant here in particular an activity that inhibits angiogenesis.
  • the antiangiogenic activity of a compound can easily be evaluated in vitro or in vivo, by a person skilled in the art, in particular by means of the following tests:
  • endothelial cells and therefore of capillaries
  • endothelial cells can be carried out by specifically labeling these cells, for example by means of CD131 or of lectin.
  • the biological activity of peptides 13-39 and 65-97 also refers to the capacity of these to bind to GAGs of the heparane or chondroitin sulphate type.
  • the biological activity of peptide 111-136 also refers to the ability of the latter to bind to the ALK receptor.
  • variants are defined as comprising the sequences similar to at least 70%, preferably at least 80%, more preferably at least 90%, or even at least 95%, of the reference sequence.
  • peptides can also be defined as comprising the sequences coded by a nucleic acid sequence hybridizing with the reference sequence or its complementary sequence, under stringent hybridization conditions.
  • similar refers to the perfect resemblance or identity between the amino acids compared but also to the non-perfect resemblance which is called similarity.
  • This search for similarities in a polypeptide sequence takes into account conservative substitutions which are amino acid substitutions of the same class, such as amino acid substitutions with uncharged side chains (such as asparagine, glutamine, serine, threonine, and tyrosine), amino acids with basic side chains (such as lysine, arginine, and histidine), amino acids with acid side chains (such as aspartic acid and glutamic acid); amino acids with apolar side chains (such as glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, praline, phenylalanine, methionine, tryptophan, and cysteine).
  • amino acid substitutions with uncharged side chains such as asparagine, glutamine, serine, threonine, and tyrosine
  • amino acids with basic side chains
  • variant, homologous, or derivative amino acid sequence any amino acid sequence which differs from the reference sequence by substitution, deletion and / or insertion of an amino acid or more acids amino acids, preferably of a reduced number of amino acids, in particular by substitution of natural amino acids with non-natural amino acids or pseudo-amino acids at positions such that these modifications do not significantly affect the biological activity peptides.
  • Homology is generally determined using sequence analysis software (for example, Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wl 53705). Similar amino acid sequences are aligned to obtain the maximum degree of homology (i.e. identity or similarity, as defined above). To this end, it may be necessary to artificially introduce spaces ("gaps") in the sequence. Once the optimal alignment has been achieved, the degree of homology is established by recording all the positions for which the amino acids of the two sequences compared are identical, relative to the total number of positions.
  • the “variant”, “homologous” or “derivative” peptides are the same length as the reference sequences.
  • the fragments of SEQ ID No. 2 and SEQ ID No. 3 containing the motif 18-23 WQWSVC or the motif 71-77 FQAWGEC respectively are of particular interest.
  • the peptides can also be chemically or enzymatically modified to improve their stability or their bioavailability.
  • this modification is simple to accomplish, the positive charge of lysine being substituted by hydrophobic groups (for example, acetyl or phenylacetyl);
  • N-oxide N-nitroso, N-dialkyl phosphoryl, N-sulfenyl, or N-glycoside groups.
  • threonine (T) and / or serine (S) of the peptides in particular by introducing at the level of the OH group of the side chain of threonine and or of the serine, a group ester or ether.
  • Esterification a simple operation, can be carried out using a carboxylic acid, an anhydride, by bridging, etc., to form, for example, acetates or benzoates.
  • Etherification which gives more stable compounds, can be carried out using an alcohol, a halide, etc., to form, for example, a methyl ether or an O-glycoside.
  • Q amino acids glutamine
  • amino acids praline which take part in the secondary structure of the peptides, knowing in addition that amino acids G, A and M generally do not offer possibilities of modification which would be obviously interesting.
  • polypeptides useful in the present invention can be synthesized by any method well known to those skilled in the art.
  • the peptide of the invention can for example be synthesized by the techniques of synthetic chemistry, such as the Merrifield type synthesis which is advantageous for reasons of purity, antigenic specificity, absence of unwanted side products and for its ease of production.
  • a recombinant peptide can also be produced by a method, in which a vector containing a nucleic acid encoding the peptide is transferred into a host cell which is cultured under conditions allowing expression of the corresponding peptide.
  • the peptide produced can then be recovered and purified.
  • the purification methods used are known to those skilled in the art.
  • the recombinant peptide obtained can be purified from lysates and cell extracts, from the culture medium supernatant, by methods used individually or in combination, such as fractionation, chromatography methods, immunoaffinity techniques using specific mono- or polyclonal antibodies, etc.
  • nucleic acid useful for the production of recombinant peptide can in particular have the following sequences:
  • nucleic acids coding for “variant”, “homologous” or “derived” peptides of the HARP peptides described above also form part of the invention.
  • nucleic acids can be defined as comprising: i) sequences similar to at least 70%, preferably at least 80%, preferably at least 90%, or even at least 95% of the sequence SEQ ID No 5, No 6 or No 7; or ii) sequences hybridizing with the sequence SEQ ID No. 5, No. 6 or No. 7 or its complementary sequence, under stringent hybridization conditions, or iii) sequences coding for the reference peptide as defined above .
  • such a homologous nucleotide sequence hybridizes specifically to the sequences complementary to the sequence SEQ
  • Tm 81.5 + 0.41 (% G + C) + 16.6 Log (cation concentration) - 0.63 (% formamide) - ( 600 / number of bases) (Sambrook et al., 1989).
  • Tm 4 (G + C) + 2 (A + T).
  • the hybridization temperature can preferably be 5 to 10 ° C. below Tm, and the hybridization buffers used are preferably force solutions. high ionic content such as a 6xSSC solution for example.
  • similar sequences refers to the perfect resemblance or identity between the nucleotides compared but also to the non-perfect resemblance which is called similarity. This search for similarities in the nucleic sequences distinguishes, for example, purines and pyrimidines.
  • a homologous nucleotide sequence therefore includes any nucleotide sequence which differs from the sequence SEQ ID No 5, No 6 or No 7 by mutation, insertion, deletion or substitution of one or more bases, or by the degeneracy of the genetic code, as long as it codes for a peptide showing the biological activity of the HARP fragments to which they refer.
  • the nucleic acid sequence of interest can be inserted into an expression vector, in which it is operably linked to one or more element (s) allowing its expression or the regulation of its expression, such as in particular promoters , activators and / or transcription terminators.
  • the signals controlling the expression of the nucleotide sequences are chosen as a function of the cell host used.
  • the nucleotide sequences according to the invention can be inserted into vectors with autonomous replication within the chosen host, or vectors integrative of the chosen host.
  • vectors will be prepared according to the methods commonly used by those skilled in the art, and the resulting clones can be introduced into an appropriate host by standard methods, such as for example electroporation or precipitation with calcium phosphate.
  • the cloning and / or expression vectors as described above, containing a nucleotide sequence defined according to the invention also form part of the present invention.
  • the invention further relates to host cells transfected, transiently or stable, with these expression vectors. These cells can be obtained by the introduction into host cells, prokaryotic or eukaryotic, of a nucleotide sequence inserted into a vector as defined above, then the culturing of said cells under conditions allowing replication and / or expression of the transfected nucleotide sequence.
  • host cells examples include mammalian cells such as COS-7, 293, MDCK cells, insect cells such as SF9 cells, bacteria such as E. coli and yeast strains such as L40 and Y90.
  • gene therapy is implemented. It involves administering to a patient an acid nucleic acid which codes for the peptide (s) of interest, under conditions such that the peptide (s) are expressed in vivo by the cells of the patient into which the nucleic acid has been transferred.
  • the nucleic acid administered comprises a nucleotide sequence as defined above, in the “Production of the peptides” section.
  • Such a nucleic acid may in particular be in the form of a DNA vector, for example a plasmid vector.
  • a DNA vector for example a plasmid vector.
  • One or more vectors can be administered, each vector being able to carry one or more sequence (s) coding for at least one of the peptides of interest, namely peptide 13-39, 65-97 or 111-136.
  • a vector carrying a sequence coding for peptide 13-39 can be introduced in vivo by any technique known to those skilled in the art.
  • a gene gun can also be used, for example by depositing DNA on the surface of "gold" particles and projecting them so that DNA penetrates through the skin of a patient (Tang et al., 1992). Liquid gel injections are also possible for transfection of skin, muscle, fatty tissue and breast tissue (Furth et al., 1992; Robinson et al., 1997).
  • Microinjection techniques, electroporation, calcium phosphate precipitation, formulations using nanocapsules or liposomes are other available techniques.
  • Biodegradable polyalkyl cyanoacrylate nanoparticles are particularly advantageous.
  • the use of cationic lipids promotes the encapsulation of nucleic acids which are negatively charged, and facilitates fusion with the negatively charged cell membranes.
  • the vector may be in the form of a recombinant virus comprising, inserted into its genome, a nucleic acid sequence which codes for the said peptide (s).
  • the viral vector may preferably be chosen from an adenovirus, a retrovirus, in particular a lentivirus, as well as an adeno-associated virus (AAV), a herpes virus, a cytomegalovirus (CMV), a vaccinia virus. , etc.
  • AAV adeno-associated virus
  • CMV cytomegalovirus
  • Lentivirus vectors have for example been described by Firat et al., (2002).
  • the recombinant virus is a defective virus.
  • defective virus refers to a virus unable to replicate in a target cell.
  • the genome of defective viruses lacks at least the sequences necessary for the replication of said virus in the infected cell. These regions can be either eliminated, made non-functional or even substituted by other sequences and in particular by the nucleic acid which codes for the peptide of interest. Nevertheless, preferably, the defective virus still retains the sequences of its genome which are necessary for the encapsulation of the viral particles.
  • the peptides of the invention have properties of inhibiting angiogenesis. As such, these peptides or the nucleic acids expressing these peptides are particularly useful for the treatment of various pathologies associated with angiogenesis or involving angiogenic factors.
  • treatment is meant treatment for curative purposes (aimed at at least relieving or stopping the development of the pathology) or prophylactic (aimed at reducing the risk of the appearance of the pathology).
  • the pathologies targeted include but are not limited to: - Proliferative disorders.
  • These tumors include melanomas, carcinomas, sarcomas, rhabdomyosarcoma, retinoblastoma, neuroblastoma, osteosarcoma.
  • tumors primary or not
  • Non-solid tumors are also targeted, namely in particular leukemias or lymphomas.
  • Proliferative disorders can be treated at any stage of proliferation.
  • the peptides or nucleic acids of the invention are in particular useful for combating the development of tumor metastases.
  • benign tumors mention may finally be made in particular of hemangiomas and hepatocellular adenomas.
  • the anti-angiogenic therapeutic effect of the peptides of the invention is concretized in these applications in particular by an effect of inhibition of tumor growth.
  • - Eye damage which includes pathologies of the retina such as diabetic retinopathy, macular degeneration, occlusion of the vein or renal artery, glaucoma, etc.
  • the peptides or nucleic acids of the invention can also be useful for treating ocular lesions which may be the consequence of an act of reconstructive surgery such as a corneal transplant.
  • the peptides of the invention can also be useful as abortive compounds, for birth control, by blocking uterine angiogenesis and therefore the implantation of the embryo.
  • An object of the invention is therefore a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising, as active ingredient, at least one peptide 13-39, or 65-97 of HARP, or a peptide derived from one of them with one or more pharmaceutically acceptable excipients.
  • Another subject of the invention is a pharmaceutical composition
  • a nucleic acid which comprises a sequence coding for at least one peptide 13-39, or 65-97 of HARP, or a peptide derived from l one of these, operably linked to one or more element (s) allowing expression of the peptide or regulation of its expression, with one or more pharmaceutically acceptable excipients. It is understood that the sequence is optionally operably linked to one or more element (s) allowing expression of the peptide or regulation of its expression.
  • excipient or “pharmaceutically acceptable vehicle” is meant any solvent, dispersion medium, agents delaying absorption, etc., which do not produce a side reaction, for example an allergic reaction, in humans or animals.
  • At least one of the peptides 13-39, 65-97, or their derived peptides is associated with the HARP peptide 111-136 or with a derived peptide.
  • the invention therefore also provides a pharmaceutical composition comprising at least one peptide 13-39, or 65-97 of HARP, or a peptide derived from one of these, in combination with a peptide 111-136 of HARP. or a derivative peptide, in the presence of one or more pharmaceutically acceptable excipients.
  • a preferred pharmaceutical composition comprises: peptide 13-39 of sequence SEQ ID No. 2; peptide 65-97 of sequence SEQ ID No.
  • the invention also provides a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a nucleic acid which comprises a sequence coding for a HARP peptide 13-39 or 65-97 or a peptide derived from one of these, the sequence being operably linked to one or more element (s) allowing its expression, in association with a nucleic acid which comprises a sequence coding for a HARP peptide 111-136 or a derivative peptide, in the presence of one or more pharmaceutically acceptable excipients.
  • sequence (s) are optionally linked operatively to one or more element (s) allowing the expression of the peptide (s) or the regulation of its (their) expression.
  • a preferred composition includes:
  • nucleic acid encoding the peptide 111-136 of sequence SEQ ID No. 4.
  • the nucleic acids can be carried by a single vector or be in the form of separate vectors.
  • Another embodiment of the invention includes the essentially simultaneous administration of separate compositions comprising on the one hand at least one peptide 13-39, or 65-97 of HARP, or a peptide derived from one of these or a nucleic acid coding for one of these peptides and on the other hand a peptide 111-136 of HARP or a derivative peptide or a nucleic acid coding for these peptides.
  • Administration can also be carried out sequentially, by means of separate compositions comprising on the one hand at least one peptide 13-39, or 65-97 of HARP, or a peptide derived from one of these or alternatively a nucleic acid coding for one of these peptides and on the other hand a peptide 111-136 of HARP or a derivative peptide or a nucleic acid coding for these peptides.
  • At least one peptide 13-39, or 65-97 of HARP, or a peptide derived from one of these or alternatively a nucleic acid coding for one of these peptides, and a peptide 111-136 of HARP or a derivative peptide or a nucleic acid encoding these peptides can therefore be administered individually in a pharmaceutically acceptable form.
  • the dosage naturally depends on the active ingredient considered, the method of administration, the therapeutic indication, the age of the patient and his condition.
  • the dose of peptide is preferably from 0.1 to 250 mg / kg per day, preferably from 1 to 100 mg / kg per day.
  • the unit dose of the compound of formula (I) preferably comprises from 12.5 to 200 mg of this compound.
  • nucleic acid sequence or vector
  • the doses of nucleic acid (sequence or vector) to be administered are also adapted depending in particular on the mode of administration, the targeted pathology as well as the duration of treatment.
  • these are formulated and administered in the form of doses of about 10 4 to 10 14 pfu / ml, preferably 10 6 to 10 10 pfu / ml.
  • pfu plaque forming unit
  • the pharmaceutical compositions of the invention can be formulated so as to be administered to the patient by a single route or by different routes.
  • compositions of the invention comprising the active principle (s) are in the form of injectable solutions and suspensions packaged in ampoules or vials for slow infusion.
  • the injection can in particular be carried out by subcutaneous, intramuscular or intravenous route.
  • the pharmaceutical composition can be injected at the site of angiogenesis itself.
  • compositions of the invention are in the form of capsules, effervescent tablets, naked or coated tablets, sachets, dragees, ampoules or oral fluids, microgranules or extended-release forms.
  • the forms for parenteral administration are obtained in a conventional manner by mixing the active principle (s) with buffers, stabilizing agents, preservatives, solubilizing agents, isotonic agents and suspending agents. In accordance with known techniques, these mixtures are then sterilized and then packaged in the form of intravenous injections.
  • buffers based on organic phosphate salts.
  • suspending agents examples include methylcellulose, hydroxyethylcellulose, hydroxypropylcellulose, acacia and sodium carboxymethylcellulose.
  • stabilizers useful according to the invention are sodium sulfite and sodium metasulfite, while mention may be made of sodium p-hydroxybenzoate, sorbic acid, cresol and chlorocresol as preservatives.
  • the active ingredients are dissolved or suspended in a suitable vehicle with a dispersing agent, a humectant, a suspending agent (for example polyvinylpyrrolidone), a preservative (such as methylparaben or propylparaben), a taste-correcting agent or a color.
  • the active ingredients are combined with suitable diluents, suitable stabilizers, agents promoting the prolonged release of the active substances or any other type of additive for the formation of a central core which is then coated with a suitable polymer (for example a water-soluble resin or a water-insoluble resin).
  • a suitable polymer for example a water-soluble resin or a water-insoluble resin.
  • Administration by the ocular route can also be envisaged, in particular in the case of treatment of an ocular lesion.
  • the pharmaceutical composition of the invention is then in the form of an ophthalmic composition for local administration in the eye, for example as an eye drop, or an ophthalmic cream.
  • the ophthalmic composition can be an aqueous solution comprising distilled water, a physiological saline solution, in which the peptides of the invention are dissolved.
  • a number of additives can be incorporated into the ophthalmic composition if necessary, for example buffering agents, agents ensuring isotonicity with tears, preservatives, thickeners, stabilizers, antioxidants, agents adjusting pH, chelating agents, etc.
  • the eye drops are prepared by aseptic manipulation or sterilization is carried out at an appropriate stage of the preparation.
  • Ophthalmic creams can be prepared aseptically by mixing the active ingredient with a usual base.
  • the bases for ophthalmic creams are for example petrolatum, jelene 50 or plastibase, macrogol, etc.
  • Surfactants can be added to increase hydrophilicity. Additives as described above, for example preservatives, can be added if necessary.
  • a satisfactory effect in adults is obtained by the administration of a droplet in the eye of a preparation containing from 0.001 to 10%, preferably 0.01 to 1% by weight.
  • / volume of the compound of the invention or of a pharmaceutically acceptable salt thereof several times, preferably one to six times a day, and each time with preferably one to four droplets per eye, and in the case of use of an ophthalmic cream, of a preparation containing 0.001 to 10%, preferably 0.01 to 1% w / v of the compound of the invention or of a pharmaceutically acceptable salt thereof, with application preferably one to six times a day in the eye.
  • the peptides of the invention can also be formulated in the form of liposomes.
  • Liposomes are formed from phospholipids which are dispersed in an aqueous medium and spontaneously form multilamellar concentric bilayer vesicles. These vesicles generally have a diameter of 25 nm to 4 ⁇ m and can be sonicated, leading to the formation of smaller unilamellar vesicles, with a diameter of 200 to 500 ⁇ , containing an aqueous solution at their heart.
  • Liposomes may be particularly advantageous for delivering the drug to a specific cell or tissue target.
  • the lipids can be chemically coupled to targeting molecules, such as targeting peptides (for example hormones), or antibodies.
  • the present invention also relates to the use of at least one peptide 13-39, or 65-97 of HARP, or a peptide derived from one of these, optionally in combination with a peptide 111-136 of HARP or a derivative peptide, for the preparation of a medicament intended to inhibit angiogenesis or intended for the treatment of a pathology associated with angiogenesis.
  • the invention further relates to a method for inhibiting angiogenesis or for treating a pathology associated with angiogenesis, in a mammal, more particularly a human, comprising the administration in this mammal of a therapeutically effective amount of at least minus a peptide 13-39, or 65-97 of HARP, or a peptide derived from one of these, optionally in combination with a peptide 111-136 of HARP or a peptide derived from it.
  • the peptides of the invention or nucleic acids can be used alone or in combination with any other active principle. Mention may in particular be made of the peptide 150-183 of Amphoterine, which inhibits the formation of metastases (Taguchi et al., 2000; Huttunen et al., 2002) and moreover exhibits homologies with the HARP peptide.
  • the present invention also relates to the use of a nucleic acid comprising a sequence coding for a peptide 13-39, or 65-97 of HARP, or a peptide derived from one of these, optionally in combination with a peptide 111-136 of HARP or a derivative peptide, for the preparation of a medicament intended to inhibit angiogenesis or intended for the treatment of pathology associated with angiogenesis.
  • the invention further relates to a method for inhibiting angiogenesis or for treating a pathology associated with angiogenesis, in a mammal, more particularly a human, comprising the administration in this mammal of a therapeutically effective amount of a nucleic acid comprising a sequence coding for a peptide 13-39, or 65-97 of HARP, or a peptide derived from one of these, optionally in combination with a nucleic acid comprising a sequence coding for a peptide 111-136 of HARP or a peptide derived therefrom.
  • FIGURES Figure 1 is a graph representing the inhibition of cell proliferation induced by HARP.
  • NIH 3T3 cells are stimulated or not by 4 nM of HARP in the presence or not of peptide 13-39 or 65-97 used at a concentration ranging from 0.1 ⁇ M to 10 ⁇ M. After 24 hours of incubation, cell proliferation is estimated by measuring the tritiated thymidine incorporated by the cells.
  • FIG. 2 is a graph which represents the inhibition of tumor growth in a nude mouse model having received an injection of PC3 cells (line derived from prostate cancer).
  • FIG. 3 is a graph representing the inhibition of tumor angiogenesis in a model of nude mice which have received an injection of PC3 cells (line derived from prostate cancer).
  • Two million PC3 cells are injected into batches of mice treated or not by daily injection at the level of the tumor with PBS (control) or with the peptide P111-136 at a concentration of 5 mg / kg. The mice are sacrificed on day 27.
  • the quantification of angiogenesis is carried out on a section after immunohistological analysis using the isolectin Bandeiraea Simplicifolia as a specific marker for endothelial cells and image analysis.
  • the values presented in the histogram represent the average value obtained by analyzing three independent sections from each of the six tumors obtained in each condition.
  • FIG. 4 is a graph which represents the inhibition of the growth of MDA-MB-231 tumor cells induced by the peptide HARP 13-39.
  • the MDA-MB-231 cells are seeded in a 12-well culture dish containing 1 ml of 0.6% agar with or without the HARP 13-39 peptide. After 13 days of culture, colonies having a diameter equal to or greater than 50 ⁇ m are counted.
  • the results of the graph represent the values of an experiment repeated 2 times with similar values and each measurement is made in triplicate.
  • the bars represent the error standards (*, p ⁇ 0.05; **, p ⁇ 0.01).
  • FIG. 5 is a graph which represents the inhibition of the growth of MDA-MB-231 tumor cells induced by the peptide HARP 65-97.
  • the MDA-MB-231 cells are seeded in a 12-well culture dish containing 1 ml of 0.6% agar with or without the HARP 65-97 peptide. After 13 days of culture, colonies having a diameter equal to or greater than 50 ⁇ m are counted.
  • the results of the graph represent the values of an experiment repeated 2 times with similar values and each measurement is made in triplicate.
  • the bars represent the error standards (*, p ⁇ 0.05; **, p ⁇ 0.01).
  • FIG. 6 represents the inhibition by HARP peptides 13-39 and 65-97 of angiogenesis induced by HARP in an in vivo model.
  • NIH 3T3 type fibroblastic cells are seeded at a density of 3 ⁇ 10 4 cells per cm 2 in DMEM culture medium supplemented with 10% fetal calf serum. After 24 hours of incubation at 37 ° C in an atmosphere containing 7% CO 2 , the culture medium is replaced by DMEM not containing fetal calf serum. Twenty-four hours later, the HARP molecule (4 nM) in the presence or not of the HARP peptides 16-48 or 65-97 of respective sequences SEQ ID N ° 2 and N ° 3 at a concentration ranging from 0.1 to 10 ⁇ M is added for 18 hours.
  • results are presented in FIG. 1 and show that the peptides corresponding to the sequence 13-39 and 65-97 are capable of inhibiting in a dose dependent manner the activity of inducing cell proliferation of HARP.
  • peptide 65-97 inhibits more than 90% of HARP activity, while 60% inhibition is observed for peptide 13-39.
  • Example 2 Effect of the peptide HARP 111-136 on the inhibition of tumor angiogenesis and tumor growth
  • the capacity of the peptide P111-136 (SEQ ID No. 4) to inhibit tumor angiogenesis was tested by inducing tumor growth by injection of PC3 cells into nude mice in the presence or not of peptide P111-136.
  • 2x10 6 PC3 cells are injected into batches of 5 nude mice (nude / nude, IFFA CREDO laboratory) treated or not by injection into the tumor of 100 ⁇ l per day of a PBS solution (control batch) or by a peptide solution P111-136 diluted in PBS at a concentration of 5 mg / kg.
  • the size of the tumor is measured using a caliper.
  • the results are presented in FIG. 3 and indicate that the HARP peptide 111-136 used at a dose of 5 mg per kg induces an inhibition of tumor growth.
  • the tumors are removed and 5 ⁇ m freezing sections are made. After fixing the tissues with acetone (4 ° C, 15 min) and rehydrating them, the presence of endothelial cells is revealed using the lectin Bandeiraea Simplicifolia Isolectin B4 (10 ⁇ g / ml) which binds specifically on the surface of endothelial cells. This lectin is then demonstrated by immunolabelling using a sandwich of specific antibodies labeled with alkaline phosphatase. After incubation with an alkaline phosphatase substrate (Vector red substrate), the endothelial cells are stained red. Quantification of the number of cells Endothelial tumors are performed by image analysis (NIH image) by analyzing the 6 tumors on 3 independent sections of the same tumor.
  • NIH image image analysis
  • MDA-MB-231 cells from human mammary carcinoma are seeded at a density of 3 ⁇ 10 3 cells per cm 2 in DMEM culture medium containing 10% fetal calf serum, 0.35% agar and containing or not concentration of HARP peptides 13-39 and 65-97 (SEQ ID N ° 2 and N ° 3).
  • the cells are seeded in a 12-well culture dish (35 mm in diameter / well) previously covered with 1 ml of 0.6% agar.
  • the peptides are added to the culture medium every 2 days. After 13 days of incubation in a humid atmosphere at 37 ° C and 7% C02, the colonies having a diameter equal to or greater than 50 ⁇ m are counted. Each experience point is performed in triplicate and each experiment is repeated three times.
  • FIGS. 4 and 5 show that the peptides HARP 13-39 and 65-97 inhibit the growth of tumor cells in a dose dependent manner.
  • an inhibition of the growth of tumor cells MDA-MB-231 of 53% is observed in the presence of 1 ⁇ M of peptide HARP 13-39 (Fig. 4) and 41% in the presence of HARP 65-97 used at the same concentration (Fig. 5).
  • HARP being a growth factor involved in the proliferation and differentiation of endothelial cells
  • the inventors have, in the experiment presented below, studied the effect of the peptides HARP 13-39 and 65-97 (SEQ ID N ° 2 and N ° 3) on the angiogenic activity induced by HARP.
  • This experiment was carried out using an in vivo angiogenesis model in mice.
  • This experimental model consists of injecting Matrigel® containing a substance to be analyzed for its stimulating or inhibiting properties of angiogenesis.
  • Four Swiss mice (Janvier, Le Genest St Isle, France) per group are injected with 300 ⁇ l of Matrigel® previously incubated with either 5 nM of HARP, 1 ⁇ M of peptide HARP 13-39 or HARP 65-97, or a mixture of HARP (5 nM) and of peptides HARP 13-39 or HARP 65-97 (1 ⁇ M).
  • the control of the specificity of the inhibition is carried out using another angiogenic factor, FGF-2, tested either alone at a concentration of 10 nM or supplemented with the peptides HARP 13-39 or HARP 65-97 used at a concentration of 1 ⁇ M.
  • FGF-2 another angiogenic factor
  • mice are sacrificed seven days after the injection of Matrigel®. This is taken and frozen in liquid nitrogen. 8 ⁇ M thick sections are then made with a cryostat. The cuts are then colored with Gomori Trichrome. The number of endothelial cells that have invaded Matrigel® is quantified by image analysis using NIH image software. The results presented in Figure 6 indicate that the HARP as well as the
  • FGF-2 induce stimulation of angiogenesis.
  • an increase in the number of endothelial cells by a factor of 3 is observed for HARP and 5.8 times for FGF-2.
  • the peptides HARP 13-39 or HARP 65-97 completely inhibit angiogenesis induced by HARP whereas they have no effect on angiogenesis induced by FGF-2. No significant effect is observed when the HARP 13-39 or HARP 65-97 peptides are used alone.

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Abstract

L'invention concerne les fragments peptidiques 13-39 et 65-97 du facteur HARP, qui inhibent l'angiogénèse. De manière avantageuse, ces peptides peuvent être associés avec le peptide 111-136 d'HARP. L'invention concerne également des compositions pharmaceutiques comprenant ces peptides ou des acides nucléiques codant pour ces peptides, et leurs utilisations pour le traitement de pathologies associées à une angiogénèse, en particulier les désordres prolifératifs comme le cancer.

Description

Fragments peptidiques du facteur HARP inhibant l'angiogénèse
La présente invention concerne des fragments peptidiques de la protéine HARP inhibant l'angiogénèse.
La thérapie actuelle du cancer repose sur la radiothérapie, la chirurgie, parfois très invalidante et/ou l'utilisation de drogues anti-cancéreuses bloquant les mitoses et qui peuvent être très agressives limitant parfois leurs emplois. Il n'existe pas actuellement de thérapie universelle contre cette pathologie. Le rôle de l'angiogénèse dans la croissance tumorale a fait l'objet d'intenses recherches et il est maintenant admis par toute la communauté scientifique que la croissance -tumorale ne peut se faire sans angiogénèse. Ce mécanisme qui est défini comme un processus dynamique induit par un certain nombre de facteurs angiogènes dont les principaux sont : le "vascular endothelial growth factor" (VEGF), le "fibroblast growth factor" (FGF) ou Pheparin affin regulatory peptide" (HARP) qui sont dans plusieurs cas sur-exprimés par les tumeurs elles-mêmes. Puisqu'une tumeur ne peut se développer sans néo- vascularisation, la suppression ou l'inhibition des facteurs angiogènes doit conduire à une régression de la croissance tumorale et ceci quel que soit le type de tumeur. Aujourd'hui, plusieurs sociétés développent dans le traitement du cancer ou des maladies prolifératives, une stratégie anti-angiogénèse basée par exemple soit sur des inhibiteurs de facteurs angiogènes (ou de leur récepteurs quand ceux-ci sont identifiés), soit en induisant des micro thromboses vasculaires en utilisant la cellule endothéliale comme ancrage de catalyseurs de la thrombose, soit encore en utilisant des agents peptidiques qui inhibent l'angiogénèse par des mécanismes pas toujours identifiés. Ces approches n'ont pas encore débouché sur des résultats clairs et il apparaît que les inhibiteurs basés sur le blocage d'une seule voie de l'angiogénèse induisent des effets rebonds aggravants. Ces résultats conduisent actuellement ces sociétés à proposer des cocktails d'inhibiteurs permettant d'espérer une destruction radicale et simultanée des vaisseaux et de cellules tumorales.
Le rôle angiogène du facteur HARP a été montré au travers d'un ensemble d'expérimentations réalisées in vitro et in vivo (Papadimitriou et al. 2001 ; Papadimitriou et al., 2000). Ainsi dans un modèle in vitro dans lequel des cellules endothéliales sont ensemencées sur un gel de collagène, il a été montré que l'HARP est capable d'induire la formation de pseudo-capillaires mimant ainsi les premières étapes de l'angiogénèse, c'est-à-dire l'activation des cellules endothéliales et leur migration à travers une matrice extracellulaire partiellement détruite. Renforçant cette observation, un peptide synthétique de 43 acides aminés correspondant à une partie du domaine C-terminal de l'HARP est capable de stimuler la sécrétion de l'activateur du plasminogène par des cellules endothéliales d'aorte de bœuf (ABAE) et d'inhiber la sécrétion de son inhibiteur PAI-1 (Kojima et al., 1995a ; Kojima et al., 1995b). Cet activateur induit le clivage du plasminogène en plasmine, une protéase jouant un rôle clef dans la dégradation de la matrice extracellulaire. L'HARP partage cette propriété avec une autre protéine se liant à l'héparine (Matsubara et al., 1990) : la protéine Midkine (MK) présentant 50% d'homologie de séquence en acides aminés avec laquelle elle constitue une nouvelle famille d'HBGF (Tsutsui et al., 1991).
Le rôle joué par l'HARP dans l'angiogénèse tumorale a également été souligné par l'équipe de Roy Bicknell. Ainsi, la surexpression d'HARP dans des cellules de carcinome mammaire MCF7 injectées à des souris "nude" entraîne une augmentation de la taille de la tumeur par rapport à celles obtenues sans surexpression. L'augmentation de la taille de la tumeur est reliée à la densité vasculaire et à une multiplication des cellules endothéliales (Choudhuri et al., 1997). La prolifération des cellules endothéliales est une autre étape clef de l'angiogénèse dans laquelle l'HARP pourrait jouer un rôle crucial. En effet, dès 1991 , il a été montré que l'HARP stimulait la prolifération des cellules endothéliales in vitro (Courty et al., 1991). Cette activité mitogène a pu être mise en évidence dans d'autres modèles : HARP stimule in vitro la formation en agar mou de colonies de cellules épithéliales SW13 non tumorigènes (Fang et al., 1992) et la surexpression de son ADNc dans les cellules NIH 3T3 (Chauhan et al., 1993) ou SW-13 (Fang et al., 1992) induit la formation d'une tumeur chez la souris "nude". Ce rôle mitogène est renforcé par l'expression de la molécule dans de nombreux cancers. En utilisant des tests de protection à la RNAse et/ou la technique Northern blot, les ARNm de l'HARP ont été détectés dans les lignées cellulaires issues de cancers du sein (T47 Dco, MDA-MB231 , MDA- MB361 , Hs-578T) (Fang ét al., 1992), de l'ovaire (A1827, PA-1 ) (Riegel ét al., 1994), de la prostate (PC-3) (Vacherot et al., 1999a) et du poumon (Jager et al., 1997).
In vivo, dans différents modèles tissulaires, la localisation de l'HARP est notamment associée aux cellules endothéliales des capillaires sanguins. De l'ARNm de la protéine HARP a été mis en évidence au niveau des cellules endothéliales appartenant aux capillaires sanguins de prostate et de glandes mammaires humaines (Vacherot et al., 1999a ; Ledoux et al., 1997). Dans le modèle utérin de rate, a également été mise en évidence une augmentation du taux d'ARNm et de la protéine HARP associée à la phase progestative du cycle. Ce résultat a été confirmé par l'injection de progestérone chez des rates ovariectomisées. La surexpression induite par la progestérone est détectable dans lés cellules endothéliales capillaires de l'endomètre (Milhiet et al., 1998). La présence de la protéine HARP à la surface des cellules endothéliales a également été démontrée indirectement lors d'injections intraveineuses d'héparine chez l'homme (Novotny et al., 1993). Récemment, le groupe de Deuel a mis en évidence une augmentation de l'expression de l'ARNm de l'HARP dans les microvaisseaux en développement après une ischémie cérébrale chez le rat (Yeh et al., 1998). Les facteurs de croissance HARP et Midkine (MK) sont des molécules présentant 50% d'homologie et possédant des propriétés mitogènes sur des cellules épithéliales, fibroblastiques et endothéliales. L'expression de chacun de ces facteurs de croissance (ARNm, protéine) a été mise en évidence dans des tumeurs humaines d'origine variée (sein, poumon, ovaire, neuroblastome, estomac, colon), suggérant leur rôle potentiel au cours de la progression tumorale. Peu d'études cliniques ont évalué la coexpression de HARP et de MK et en particulier le taux sanguin de ces molécules angiogènes chez des patients porteurs de tumeurs. Récemment, a été développé un dosage immunologique pour ces deux molécules, basé sur leur affinité pour l'héparine. La sensibilité de la méthode est de 80 pg/ml pour l'HARP et de 40 pg/ml pour la MK (Stoica et al., 2001). Le brevet U.S. 5,641 ,743 et le brevet U.S. 6,103,880 décrivent de manière générale la protéine HARP et l'utilisation de cette protéine pour stimuler l'angiogénèse.
La demande de brevet FR 2 799 465 divulgue un fragment de HARP à activité angiogène.
Il a en effet été montré que l'activité angiogène de HARP se retrouvait au travers d'un plus petit peptide. Une séquence consensuelle de 18 acides aminés issue de la séquence peptidique de HARP mais retrouvée également sur un grand nombre de facteurs angiogènes possédait ainsi par elle même une activité angiogène.
Comme la plupart des facteurs de croissance, le mécanisme d'action de HARP passe par une interaction avec un récepteur membranaire à activité tyrosine kinase de haute affinité (Ko = 50 pM) nommé "anaplastic lymphoma kinase" ou ALK (Stoica et al., 2001 ). De plus, l'activité biologique de HARP, comme la majorité des
HBGF, dépend également de son interaction avec des glycoaminoglycanes ou GAG, de type héparanes ou chondroïtine sulfates (Vacherot et al., 1999b).
Ainsi l'activité mitogène de l'HARP est potentialisée en présence d'héparine, d'héparane sulfate et de chondroïtine sulfate de type A et B. Un traitement cellulaire à l'héparinase abolit l'activité mitogène de l'HARP. Cette activité peut alors être restaurée en présence d'héparine. Une étude portant sur les relations entre la structure et la fonction de HARP a suggéré que la partie C-terminale de HARP correspondant aux résidus d'acides aminés 111- 136 (numérotation faisant référence à la forme HARPι3β) est directement impliquée dans l'induction de l'activité mitogène (Bernard-Pierrot et al., 2001) et dans son interaction avec le récepteur ALK. Il a par ailleurs été établi que le peptide 111-136 n'est ni mitogène, ni angiogène et que la molécule HARP dont les acides aminés 111-136 ont été délétés inhibe spécifiquement l'activité biologique de HARP en présentant des effets dominants négatifs vis-à-vis de HARP (Bernard-Pierrot et al. 2002).
Les inventeurs ont maintenant mis en évidence de manière surprenante que le facteur angiogène HARP contient des fragments peptidiques capables d'inhiber l'angiogénèse, ainsi que la croissance tumorale.
Il s'agit de tout ou partie des séquences d'acides aminés 13-39 et 65-97 localisés dans les domaines en feuillet beta de HARP. Ces fragments sont donc particulièrement intéressants pour inhiber l'angiogénèse et la croissance tumorale, et peuvent, par conséquent, être mis à profit dans le traitement des désordres prolifératifs tels que le cancer, ou des pathologies pour lesquelles une angiogénèse excessive est observée, à savoir par exemple la rétinopathie diabétique. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, il est proposé d'associer l'un et/ou l'autre de ces peptides à un peptide correspondant à tout ou partie de la séquence 111-136 de HARP. Cette association offre l'avantage d'éviter "l'effet rebond" observé pour les autres techniques d'inhibition de certains facteurs angiogènes. En effet, il semble que l'inhibition in vivo d'un facteur angiogène soit compensée par l'activation d'un autre facteur angiogène.
Dans la présente invention, les peptides 13-39 ou 65-97 agissent sur les récepteurs GAG, qui sont des récepteurs de basse affinité inhibant l'activité angiogène de HARP, tandis que le peptide 111-136 agit sur le récepteur ALK, de haute affinité.
Le blocage des sites de hautes affinités de HARP ainsi que ceux de basses affinités communs à d'autres facteurs angiogènes permet une thérapeutique particulièrement efficace dans le traitement des pathologies associées à un phénomène d'angiogénèse. L'approche thérapeutique proposée consiste en une administration de peptides ou une administration d'acides nucléiques codant pour ces peptides.
Le facteur HARP et ses fragments L'"heparin affin regulatory peptide" ou HARP (Courty et al., 1991) également appelée "pleiotrophin" (Wellstein et al., 1992) ou "heparin binding- growth associated molécule" ou HB-GAM (Rauvala et al., 1989) appartient à la famille des "heparin binding growth factors" (HBGF). La séquence peptidique humaine et le gène humain correspondant sont accessibles sur la base de données (Genbank n° X52946).
La protéine HARP est synthétisée sous la forme d'un précurseur de 168 acides aminés qui possède deux sites de clivage par la signal peptidase aboutissant à une protéine mature de 136 ou 139 acides aminés (HARP-ι36 ou HARPι39). Les formes matures HARP-|36 et HARP-ι3g possèdent les mêmes activités biologiques in vitro, néanmoins l'activité spécifique d'induction de la prolifération cellulaire de la forme HARP-ι3g est meilleure que celle observée pour la forme HARP-ι36 (Bernard Pierrot et al., 2001). La numérotation des acides aminés est donnée en fonction de la protéine HARP de 136 acides aminés.
La séquence peptidique humaine de HARP-|36 est également présentée en séquence SEQ ID N° 1.
Dans le contexte de la présente invention, la protéine HARP ou ses fragments fait référence à la protéine humaine ou ses fragments, mais aussi à tout variant de la protéine chez d'autres espèces, notamment chez des mammifères de type bovins, rongeurs, etc. Ainsi, les séquences de souris (Genbank N° AK017768 ou NM 008973), rat (Genbank N° NM017066), bœuf (Genbank N° X52945) sont disponibles. Sont également connus des variants chez Zebrafish (Genbank N° NM131070) et chez la drosophile (protéine miple Genbank N° NM 138178).
Il a été mis en évidence que des motifs d'homologie avec la thrombospondine de type TSR-1 (thrombospondin repeat type 1), présents dans les domaines en feuillet beta de HARP, notamment au niveau des acides aminés contenus dans les deux peptides 13-39 et 65-97, sont impliqués dans la fixation de l'HARP à l'héparine (Kilpelainen et al., 2000). Ces peptides se lient en fait aux récepteurs de basse affinité de type GAG.
De manière préférée, les fragments 13-39, 65-97 ou 111-136 sont les fragments tels que numérotés dans la séquence SEQ ID N° 1 , à savoir les séquences :
13-39 : SDCGEWQWSVCVPTSGDCGLGTREGTRT (SEQ ID N° 2)
65-97 : AECKYQFQAWGECDLNTALKTRTGSLKRALHNA (SEQ ID N° 3)
111 -136 : KLTKPKPQAESKKKKKEGKKQEKMLD (SEQ ID N° 4). Tout peptide « variant », « homologue », ou « dérivé » de ces peptides, qui présente la même activité biologique que ces peptides, fait également partie de l'invention.
Par « activité biologique », on entend ici notamment une activité inhibitrice de l'angiogénèse. L'activité antiangiogene d'un composé peut aisément être évaluée in vitro ou in vivo, par l'homme du métier, notamment au moyen des tests suivants :
- in vitro, par mise en contact des peptides avec des cellules endothéliales sur du collagène, et observation de l'inhibition de la formation de capillaires ;
- in vivo, par injection de matrice de type Matrigel®, et observation de l'inhibition de la formation de capillaires au sein de la matrice ;
- ou encore en déposant le peptide sur une membrane choriantoallantoïdienne d'un œuf (de poule par exemple), et en observant l'effet de ce peptide sur la vascularisation de cette membrane.
L'observation des cellules endothéliales (et par conséquent des capillaires) peut être réalisée en marquant spécifiquement ces cellules, par exemple au moyen de CD131 ou de lectine.
L'activité biologique des peptides 13-39 et 65-97 fait également référence à la capacité de ceux-ci de se fixer aux GAG de type heparanes ou chondroïtine sulfates. L'activité biologique du peptide 111-136 fait par ailleurs référence à la capacité de celui-ci de se fixer au récepteur ALK.
Les peptides « variants », « homologues», ou « dérivés » sont définis comme comprenant les séquences similaires à au moins 70 %, de préférence au moins 80 %, de préférence encore au moins 90 %, voire au moins 95 %, de la séquence de référence.
Ces peptides peuvent également être définis comme comprenant les séquences codées par une séquence d'acide nucléique hybridant avec la séquence de référence ou sa séquence complémentaire, dans des conditions stringentes d'hybridation.
Le terme "similaires" se réfère à la ressemblance parfaite ou identité entre les acides aminés comparés mais aussi à la ressemblance non parfaite que l'on qualifie de similitude. Cette recherche de similitudes dans une séquence polypeptidique prend en compte les substitutions conservatives qui sont des substitutions d'acides aminés de même classe, telles que des substitutions d'acides aminés aux chaînes latérales non chargées (tels que l'asparagine, la glutamine, la serine, la thréonine, et la tyrosine), d'acides aminés aux chaînes latérales basiques (tels que la lysine, l'arginine, et l'histidine), d'acides aminés aux chaînes latérales acides (tels que l'acide aspartique et l'acide glutamique) ; d'acides aminés aux chaînes latérales apolaires (tels que la glycine, l'alanine, la valine, la leucine, l'isoleucine, la praline, la phénylalanine, la méthionine, le tryptophane, et la cystéine). Plus généralement, par « séquence d'acides aminés variante, homologue, ou dérivée », on entend donc toute séquence d'acides aminés qui diffère de la séquence de référence par substitution, délétion et/ou insertion d'un acide aminé ou plusieurs acides aminés, de préférence d'un nombre réduit d'acides aminés, notamment par substitution d'acides aminés naturels par des acides aminés non naturels ou pseudo-acides aminés à des positions telles que ces modifications ne portent pas significativement atteinte à l'activité biologique des peptides.
L'homologie est généralement déterminée en utilisant un logiciel d'analyse de séquence (par exemple, Séquence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wl 53705). Des séquences d'acides aminés similaires sont alignées pour obtenir le maximum de degré d'homologie (i.e. identité ou similitude, comme défini plus haut). A cette fin, il peut être nécessaire d'introduire de manière artificielle des espaces (« gaps ») dans la séquence. Une fois l'alignement optimal réalisé, le degré d'homologie est établi par enregistrement de toutes les positions pour lesquelles les acides aminés des deux séquences comparées sont identiques, par rapport au nombre total de positions.
De préférence, les peptides « variants », « homologues », ou « dérivés » sont de même longueur que les séquences de référence.
Les fragments de SEQ ID N° 2 et SEQ ID N° 3 contenant respectivement le motif 18-23 WQWSVC ou le motif 71-77 FQAWGEC sont particulièrement intéressants. Conformément à l'invention, les peptides peuvent être par ailleurs modifiés chimiquement ou enzymatiquement pour améliorer leur stabilité ou leur biodisponibilité.
De manière non limitative, on peut par exemple modifier un ou plusieurs des acides aminés lysine (K) des peptides, notamment par :
- amidation : cette modification est simple à accomplir, la charge positive de la lysine étant substituée par des groupements hydrophobes (par exemple, acétyle ou phénylacétyle) ;
- amination : par formation d'amides secondaires à partir de l'aminé primaire R = (CH2)4-NH3 +, par exemple en formant des groupements N- méthyle, N-allyle ou N-benzyle ;
- ou encore par formation des groupements N-oxyde, N-nitroso, N- dialkyl phosphoryle, N-sulfényle, ou N-glycoside.
On peut par ailleurs aussi ou alternativement modifier un ou plusieurs acides aminés thréonine (T) et/ou serine (S) des peptides, notamment en introduisant au niveau du groupe OH de la chaîne latérale de la thréonine et ou de la serine, un groupement ester ou éther. L'estérification, opération simple, peut être réalisée à l'aide d'un acide carboxylique, d'un anhydride, par pontages, etc, pour former par exemple des acétates ou des benzoates. L'etherification, qui donne des composés plus stables, peut être effectuée à l'aide d'un alcool, d'un halogénure, etc, pour former par exemple un méthyl éther ou un O-glycoside.
On peut par ailleurs aussi ou alternativement modifier un ou plusieurs acides aminés glutamine (Q) par exemple par amidation, en formant des aminés secondaires ou tertiaires, notamment avec des groupements de type méthyl, éthyl, fonctionnalisés ou non.
On peut par ailleurs aussi ou alternativement modifier un ou plusieurs acides aminés glutamate (E) et/ou aspartate (D), par exemple :
. par estérification, pour former des méthyl esters substitués ou non, des éthyl esters, benzyl esters, des thiols (esters activés), etc,
. par amidation, notamment pour former des groupements N,N diméthyle, nitroanilides, pyrrolidinyles, etc. En revanche, il est préférable de ne pas modifier les acides aminés praline, qui participent à la structure secondaire des peptides, sachant en outre que les acides aminés G, A et M n'offrent généralement pas de possibilités de modification qui seraient manifestement intéressantes.
Production des peptides Les polypeptides utiles dans la présente invention peuvent être synthétisés par n'importe quelle méthode bien connue de l'homme du métier. Le peptide de l'invention peut par exemple être synthétisé par les techniques de la chimie de synthèse, telles que la synthèse de type Merrifield qui est avantageuse pour des raisons de pureté, de spécificité antigénique, d'absence de produits secondaires non désirés et pour sa facilité de production.
Un peptide recombinant peut également être produit par un procédé, dans lequel un vecteur contenant un acide nucléique codant pour le peptide est transféré dans une cellule hôte qui est mise en culture dans des conditions permettant l'expression du peptide correspondant.
Le peptide produit peut ensuite être récupéré et purifié. Les procédés de purification utilisés sont connus de l'homme du métier. Le peptide recombinant obtenu peut être purifié à partir de lysats et extraits cellulaires, du surnageant du milieu de culture, par des méthodes utilisées individuellement ou en combinaison, telles que le fractionnement, les méthodes de chromatographie, les techniques d'immunoaffinité à l'aide d'anticorps mono- ou polyclonaux spécifiques, etc.
L'acide nucléique utile pour la production de peptide recombinant peut notamment présenter les séquences suivantes :
- séquence codant pour le peptide 13-39 (SEQ ID N° 5)
- séquence codant pour le peptide 65-97 (SEQ ID N° 6)
- séquence codant pour le peptide 111-136 (SEQ ID N° 7)
Les acides nucléiques codant pour des peptides « variants », « homologues », ou « dérivés » des peptides de HARP décrits ci-dessus, font également partie de l'invention.
Ces acides nucléiques peuvent être définis comme comprenant : i) des séquences similaires à au moins 70 %, de préférence au moins 80 %, de préférence au moins 90 %, voire au moins 95 % de la séquence SEQ ID n° 5, n° 6 ou n° 7 ; ou ii) des séquences hybridant avec la séquence SEQ ID n° 5, n° 6 ou n° 7 ou sa séquence complémentaire, dans des conditions stringentes d'hybridation, ou iii) des séquences codant pour le peptide de référence tel que défini précédemment.
De manière préférentielle, une telle séquence nucleotidique homologue hybride spécifiquement aux séquences complémentaires de la séquence SEQ
ID n° 5, n° 6 ou n° 7 dans des conditions stringentes. Les paramètres définissant les conditions de stringence dépendent de la température à laquelle
50% des brins appariés se séparent (Tm).
Pour les séquences comprenant plus de 30 bases, Tm est définie par la relation : Tm=81 ,5+0,41 (%G+C)+16,6Log(concentration en cations) - 0,63(%formamide) -(600/nombre de bases) (Sambrook et al., 1989).
Pour les séquences de longueur inférieure à 30 bases, Tm est définie par la relation : Tm= 4(G+C) + 2 (A+T).
Dans des conditions de stringence appropriées, auxquelles les séquences aspécifiques n'hybrident pas, la température d'hybridation peut être de préférence de 5 à 10°C en dessous de Tm, et les tampons d'hybridation utilisés sont de préférence des solutions de force ionique élevée telle qu'une solution 6xSSC par exemple.
Le terme "séquences similaires" employé plus haut se réfère à la ressemblance parfaite ou identité entre les nucléotides comparés mais aussi à la ressemblance non parfaite que l'on qualifie de similitude. Cette recherche de similitudes dans les séquences nucléiques distingue par exemple les purines et les pyrimidines.
Une séquence nucleotidique homologue inclut donc toute séquence nucleotidique qui diffère de la séquence SEQ ID n° 5, n° 6 ou n° 7 par mutation, insertion, délétion ou substitution d'une ou plusieurs bases, ou par la dégénérescence du code génétique, pour autant qu'elle code pour un peptide présentant l'activité biologique des fragments de HARP auxquels ils se réfèrent.
La séquence d'acide nucléique d'intérêt peut être insérée dans un vecteur d'expression, dans lequel elle est liée de manière opérante à un ou des élément(s) permettant son expression ou la régulation de son expression, tels que notamment des promoteurs, activateurs et/ou terminateurs de transcription.
Les signaux contrôlant l'expression des séquences nucleotidiques (promoteurs, activateurs, séquences de terminaison...) sont choisis en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences nucleotidiques selon l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi. De tels vecteurs seront préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones en résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standard, telles que par exemple l'électroporation ou la précipitation au phosphate de calcium.
Les vecteurs de clonage et/ou d'expression tels que décrits ci-dessus, contenant une séquence nucleotidique définie selon l'invention font également partie de la présente invention. L'invention vise en outre les cellules hôtes transfectées, de manière transitoire ou stable, par ces vecteurs d'expression. Ces cellules peuvent être obtenues par l'introduction dans des cellules hôtes, procaryotes ou eucaryotes, d'une séquence nucleotidique insérée dans un vecteur tel que défini ci-dessus, puis la mise en culture desdites cellules dans des conditions permettant la réplication et/ou l'expression de la séquence nucleotidique transfectée.
Des exemples de cellules hôtes incluent notamment des cellules de mammifères, telles que les cellules COS-7, 293, MDCK, des cellules d'insectes telles que les cellules SF9, des bactéries telles que E. coli et des souches de levures telles que L40 et Y90.
Thérapie génique
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, une thérapie génique est mise en œuvre. Il s'agit d'administrer à un patient un acide nucléique qui code pour le ou les peptides d'intérêt, dans des conditions telles que le ou les peptides sont exprimés in vivo par les cellules du patient dans lesquelles l'acide nucléique a été transféré.
L'acide nucléique administré comprend une séquence nucleotidique telle que définie ci-dessus, dans la partie « Production des peptides ».
Un tel acide nucléique peut être notamment sous la forme d'un vecteur d'ADN, par exemple un vecteur plasmidique. On peut administrer un ou plusieurs vecteurs, chaque vecteur pouvant porter une ou plusieurs séquence(s) codant pour au moins un des peptides d'intérêt, à savoir le peptide 13-39, 65-97 ou 111-136.
Selon un mode de réalisation préféré, on utilise un vecteur portant une séquence codant pour le peptide 13-39, un autre vecteur portant une séquence codant pour le peptide 65-97 et enfin éventuellement, un autre vecteur comprenant une séquence codant pour le peptide 111-136. Le ou les vecteurs d'ADN peuvent être introduits in vivo par toute technique connue de l'homme du métier. En particulier, il est possible d'introduire le vecteur d'ADN in vivo sous une forme nue, c'est-à-dire sans l'aide d'un quelconque véhicule ou système qui faciliterait la transfection du vecteur dans les cellules (EP 465 529). Un canon à gènes peut être également employé, par exemple en déposant l'ADN à la surface de particules « en or » et en projetant celles-ci de manière à ce que l'ADN pénètre à travers la peau d'un patient (Tang et al., 1992). Des injections au moyen d'un gel liquide sont également possibles pour transfecter à la fois peau, muscle, tissu gras et tissu mammaire (Furth et al., 1992 ; Robinson et al., 1997).
Des techniques de microinjection, électroporation, précipitation au phosphate de calcium, formulations à l'aide de nanocapsules ou de liposomes sont d'autres techniques disponibles.
Des nanoparticules en polyalkyl cyanoacrylate biodégradables sont particulièrement avantageuses. Dans le cas de liposomes, l'utilisation de lipides cationiques favorise l'encapsulation des acides nucléiques qui sont chargés négativement, et facilite la fusion avec les membranes cellulaires chargées négativement. De manière alternative, le vecteur peut être sous la forme d'un virus recombinant comprenant, insérée dans son génome, une séquence d'acide nucléique qui code pour le ou Iesdits peptide(s).
Le vecteur viral peut être de préférence choisi parmi un adénovirus, un retrovirus, en particulier un lentivirus, ainsi qu'un virus adéno-associé (AAV), un virus de l'herpès, un cytomégalovirus (CMV), un virus de la vaccine, etc.
Des vecteurs lentivirus ont par exemple été décrits par Firat et al., (2002). De manière avantageuse, le virus recombinant est un virus défectif.
Le terme « virus défectif » désigne un virus incapable de se répliquer dans une cellule cible. Généralement, le génome des virus défectifs est dénué d'au moins les séquences nécessaires pour la réplication dudit virus dans la cellule infectée. Ces régions peuvent être soit éliminées, soit rendues non fonctionnelles ou encore substituées par d'autres séquences et en particulier par l'acide nucléique qui code pour le peptide d'intérêt. Néanmoins, de préférence, le virus défectif conserve malgré tout les séquences de son génome qui sont nécessaires pour l'encapsulation des particules virales.
Une administration ciblée de gènes est par exemple décrite dans la demande WO 95/28 494.
Pathologies visées
Les peptides de l'invention présentent des propriétés d'inhibition de l'angiogénèse. A ce titre, ces peptides ou les acides nucléiques exprimant ces peptides sont particulièrement utiles pour le traitement de diverses pathologies associées à une angiogénèse ou faisant intervenir des facteurs angiogènes.
Par « traitement », on entend traitement à titre curatif (visant à au moins soulager ou stopper le développement de la pathologie) ou prophylactique (visant à réduire le risque d'apparition de la pathologie).
Les pathologies visées incluent mais ne sont pas limitées à : - Les désordres prolifératifs. On entend ici toute prolifération anormale de cellules, quelle soit bénigne ou maligne. Ces tumeurs incluent les mélanomes, les carcinomes, les sarcomes, rhabdomyosarcome, rétinoblastome, neuroblastome, ostéosarcome. Parmi les tumeurs solides, on peut citer notamment les tumeurs (primitives ou non) mammaires, ovariennes, pulmonaires, du col de l'utérus, du tractus digestif, notamment du colon, du système urologique, du foie, du pancréas, des os. Les tumeurs non solides sont également visées, à savoir notamment les leucémies ou les lymphomes. Les désordres prolifératifs peuvent être traités à tout stade de la prolifération. Les peptides ou les acides nucléiques de l'invention sont en particulier utiles pour lutter contre le développement des métastases tumorales. Parmi les tumeurs bénignes, on peut enfin citer notamment les hémangiomes et les adénomes hépatocellulaires. L'effet thérapeutique anti-angiogène des peptides de l'invention se concrétise dans ces applications notamment par un effet d'inhibition de la croissance tumorale.
- Les lésions oculaires, qui incluent notamment des pathologies de la rétine telles que la rétinopathie diabétique, la dégénérescence maculaire, l'occlusion de la veine ou de l'artère rénale, le glaucome, etc. Les peptides ou acides nucléiques de l'invention peuvent également être utiles pour traiter des lésions oculaires pouvant être la conséquence d'acte de chirurgie réparatrice comme la greffe de cornée.
- La polyarthrite rhumatol'de, qui est une maladie inflammatoire associée à une intense angiogénèse (Jackson et al., 1988).
- et les maladies de peau comme le psoriasis.
Les peptides de l'invention peuvent également être utiles comme composés abortifs, pour le contrôle des naissances, en bloquant l'angiogénèse utérine et donc l'implantation de l'embryon.
Compositions pharmaceutiques
Un objet de l'invention est donc une composition pharmaceutique comprenant, en tant que principe actif, au moins un peptide 13-39, ou 65-97 d'HARP, ou un peptide dérivé de l'un de ceux-ci avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables.
Un autre objet de l'invention est une composition pharmaceutique comprenant, en tant que principe actif, un acide nucléique qui comprend une séquence codant pour au moins un peptide 13-39, ou 65-97 d'HARP, ou un peptide dérivé de l'un de ceux-ci, liée de manière opérante à un ou des élément(s) permettant l'expression du peptide ou la régulation de son expression, avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables. ll est entendu que la séquence est éventuellement liée de manière opérante à un ou des élément(s) permettant l'expression du peptide ou la régulation de son expression.
Par "excipient" ou "véhicule pharmaceutiquement acceptable", on entend tout solvant, milieu de dispersion, agents retardant l'absorption etc, qui ne produisent pas de réaction secondaire, par exemple allergique, chez l'humain ou l'animal.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, au moins l'un des peptides 13-39, 65-97, ou de leurs peptides dérivés, est associé au peptide 111-136 d'HARP ou à un peptide dérivé. L'invention fournit donc également une composition pharmaceutique comprenant au moins un peptide 13-39, ou 65-97 d'HARP, ou un peptide dérivé de l'un de ceux-ci, en association avec un peptide 111-136 d'HARP ou un peptide dérivé, en présence d'un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables. Une composition pharmaceutique préférée comprend : le peptide 13-39 de séquence SEQ ID N° 2 ; le peptide 65-97 de séquence SEQ ID N° 3 ; et le peptide 111-136 de séquence SEQ ID N° 4. De manière alternative ou combinée, l'invention fournit également une composition pharmaceutique comprenant un acide nucléique qui comprend une séquence codant pour un peptide 13-39 ou 65-97 d'HARP ou un peptide dérivé de l'un de ceux-ci, la séquence étant liée de manière opérante à un ou des élément(s) permettant son expression, en association avec un acide nucléique qui comprend une séquence codant pour un peptide 111-136 d'HARP ou un peptide dérivé, en présence d'un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables.
Il est entendu que la ou les séquence(s) sont éventuellement liée(s) de manière opérante à un ou des élément(s) permettant l'expression du ou des peptide(s) ou la régulation de son(leur) expression.
Une composition préférée comprend :
- un acide nucléique codant pour le peptide 13-39 de séquence SEQ ID N° 2 ; - un acide nucléique codant pour le peptide 65-97 de séquence SEQ
ID N° 3 ;
- un acide nucléique codant pour le peptide 111-136 de séquence SEQ ID N° 4.
Les acides nucléiques peuvent être portés par un vecteur unique ou être sous la forme de vecteurs séparés.
Un autre mode de réalisation de l'invention inclut l'administration essentiellement simultanée de compositions séparées comprenant d'une part au moins un peptide 13-39, ou 65-97 de HARP, ou un peptide dérivé de l'un de ceux-ci ou un acide nucléique codant pour l'un de ces peptides et d'autre part un peptide 111-136 de HARP ou un peptide dérivé ou un acide nucléique codant pour ces peptides.
L'administration peut également être réalisée de manière séquentielle, au moyen de compositions séparées comprenant d'une part au moins un peptide 13-39, ou 65-97 de HARP, ou un peptide dérivé de l'un de ceux-ci ou encore un acide nucléique codant pour l'un de ces peptides et d'autre part un peptide 111-136 de HARP ou un peptide dérivé ou un acide nucléique codant pour ces peptides.
Au moins un peptide 13-39, ou 65-97 de HARP, ou un peptide dérivé de l'un de ceux-ci ou encore un acide nucléique codant pour l'un de ces peptides, et un peptide 111-136 de HARP ou un peptide dérivé ou un acide nucléique codant pour ces peptides, peuvent donc être individuellement administrés sous une forme pharmaceutiquement acceptable. La posologie dépend naturellement de l'actif considéré, du mode d'administration, de l'indication thérapeutique, de l'âge du patient et de son état.
La dose de peptide est préférablement de 0,1 à 250 mg/kg par jour, de préférence de 1 à 100 mg/kg par jour.
La dose unitaire du composé de formule (I) comprend de préférence de 12,5 à 200 mg de ce composé.
Quand les compositions pharmaceutiques comprennent des acides nucléiques, les doses d'acide nucléique (séquence ou vecteur) à administrer sont adaptées également en fonction notamment du mode d'administration, de la pathologie ciblée ainsi que de la durée de traitement. Généralement, lorsque des virus recombinants sont utilisés, ceux-ci sont formulés et administrés sous la forme de doses d'environ 104 à 1014 pfu/ml, de préférence 106 à 1010 pfu/ml. Le terme « pfu » (unité formant plage) correspond à l'infectivité d'une solution virale, et peut être déterminée en infectant une culture cellulaire appropriée et en mesurant, généralement après 48 heures, le nombre de plages de cellules infectées. Les techniques pour déterminer le titre pfu d'une solution virale sont bien décrites par la littérature. Les compositions pharmaceutiques de l'invention peuvent être formulées de manière à être administrées au patient par une unique voie ou par des voies différentes.
Lorsque l'administration par voie parentérale est envisagée, plus particulièrement par injection, les compositions de l'invention comprenant le ou les principes actifs se trouvent sous la forme de solutés et suspensions injectables conditionnées en ampoules ou flacons pour perfusion lente. L'injection peut notamment être réalisée par voie sous-cutanée, intramusculaire ou intraveineuse.
De manière préférée, en particulier dans le cas d'une tumeur solide, la composition pharmaceutique peut être injectée au site-même de l'angiogénèse.
Dans le cas d'une administration par voie orale, les compositions de l'invention se trouvent sous la forme de gélules, comprimés effervescents, comprimés nus ou enrobés, sachets, dragées, ampoules ou solutés buvables, microgranules ou formes à libération prolongée.
Les formes pour l'administration parentérale sont obtenues de façon conventionnelle par mélange du ou des principes actifs avec des tampons, des agents stabilisants, des conservateurs, des agents solubilisants, des agents isotoniques et des agents de mise en suspension. Conformément aux techniques connues, ces mélanges sont ensuite stérilisés puis conditionnés sous la forme d'injections intraveineuses.
A titre de tampon, l'homme du métier pourra utiliser des tampons à base de sels de phosphate organique.
Des exemples d'agents de mise en suspension englobent le méthylcellulose, Phydroxyéthylcellulose, hydroxypropylcellulose, l'acacia et la carboxyméthylcellulose sodique.
En outre, des stabilisants utiles selon l'invention sont le sulfite de sodium et le métasulfite de sodium, tandis que l'on peut citer le p- hydroxybenzoate de sodium, l'acide sorbique, le crésol et le chlorocrésol en tant que conservateurs. Pour la préparation de solution ou de suspension orale, les principes actifs sont dissous ou mis en suspension dans un véhicule approprié avec un agent dispersant, un agent humectant, un agent de mise en suspension (par exemple la polyvinylpyrrolidone), un conservateur (tel que le méthylparaben ou le propylparaben), un agent correcteur de goût ou un colorant.
Pour la préparation de microcapsules, les principes actifs sont combinés à des diluants appropriés, des stabilisants appropriés, des agents favorisant la libération prolongée des substances actives ou tout autre type d'additif pour la formation d'un noyau central qui est ensuite revêtu d'un polymère approprié (par exemple une résine hydrosoluble ou une résine insoluble dans l'eau). Les techniques connues de l'homme du métier seront utilisées à cet effet. Les microcapsules ainsi obtenues sont ensuite éventuellement formulées dans des unités de dosage appropriées.
Une administration par voie oculaire peut également être envisagée, en particulier dans le cas d'un traitement d'une lésion oculaire. La composition pharmaceutique de l'invention se présente alors sous la forme d'une composition ophtalmique pour administration locale dans l'œil, par exemple comme un collyre, ou une crème ophtalmique.
La composition ophtalmique peut être une solution aqueuse comprenant de l'eau distillée, une solution saline physiologique, dans laquelle les peptides de l'invention sont dissous. Un certain nombre d'additifs peut être incorporé dans la composition ophtalmique si nécessaire par exemple des agents de tampon, des agents assurant l'isotonicité avec les larmes, des conservateurs, des épaississants, des stabilisants, des anti- oxydants, des agents ajustant le pH, des agents chélatants, etc.
Les gouttes pour les yeux sont préparées par manipulation aseptique ou la stérilisation est réalisée à une étape appropriée de la préparation.
Les crèmes ophtalmiques peuvent être préparées de manière aseptique en mélangeant le principe actif à une base usuelle. Les bases pour les crèmes ophtalmiques sont par exemple la vaseline, le jelene 50 ou le plastibase, le macrogol, etc. Des surfactants peuvent être ajoutés pour augmenter l'hydrophilie. Des additifs tels que décrits ci-dessus, par exemple les conservateurs, peuvent être ajoutés si nécessaire. En général, pour une application ophtalmique locale, un effet satisfaisant chez l'adulte est obtenu par l'administration d'une gouttelette dans l'œil d'une préparation contenant de 0,001 à 10 %, de préférence 0,01 à 1 % poids/volume du composé de l'invention ou d'un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci plusieurs fois, de préférence une à six fois par jour, et à chaque fois avec de préférence une à quatre gouttelettes par oeil, et dans le cas d'utilisation d'une crème ophtalmique, d'une préparation contenant 0,001 à 10 %, de préférence 0,01 à 1 % poids/volume du composé de l'invention ou d'un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, avec une application de préférence une à six fois par jour dans l'œil.
Les peptides de l'invention peuvent également être formulés sous la forme de liposomes. Les liposomes sont formés à partir de phospholipides qui sont dispersés dans un milieu aqueux et forment spontanément des vésicules bicouches concentriques multilamellaires. Ces vésicules ont généralement un diamètre de 25 nm à 4 μm et peuvent être soniquées, conduisant à la formation de vésicules plus petites unilamellaires, de diamètre de 200 à 500 Â, contenant une solution aqueuse en leur cœur. Les liposomes peuvent être particulièrement avantageux pour administrer le médicament à une cible cellulaire ou tissulaire précise. Pour cela, les lipides peuvent être couplés chimiquement à des molécules de ciblage, tels que des peptides de ciblage (par exemple hormones), ou des anticorps. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'au moins un peptide 13-39, ou 65-97 de HARP, ou un peptide dérivé de l'un de ceux- ci, éventuellement en association avec un peptide 111-136 de HARP ou un peptide dérivé, pour la préparation d'un médicament destiné à inhiber l'angiogénèse ou destiné au traitement d'une pathologie associée à une angiogénèse.
Les pathologies visées sont telles que mentionnées plus haut. L'invention a en outre pour objet une méthode pour inhiber l'angiogénèse ou pour traiter une pathologie associée à une angiogénèse, chez un mammifère, plus particulièrement un humain, comprenant l'administration chez ce mammifère d'une quantité thérapeutiquement efficace d'au moins un peptide 13-39, ou 65-97 de HARP, ou un peptide dérivé de l'un de ceux-ci, éventuellement en association avec un peptide 111-136 de HARP ou un peptide dérivé de celui-ci.
Bien entendu, les peptides de l'invention ou acides nucléiques peuvent être utilisés seuls ou en association avec tout autre principe actif. On peut notamment citer le peptide 150-183 de l'Amphotérine, qui inhibe la formation des métastases (Taguchi et al., 2000 ; Huttunen et al., 2002) et présente d'ailleurs des homologies avec le peptide d'HARP.
On peut également choisir d'employer une thérapie génique en exprimant également un acide nucléique codant pour le peptide 150-183 de l'amphotérine.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un acide nucléique comprenant une séquence codant pour un peptide 13-39, ou 65-97 de HARP, ou un peptide dérivé de l'un de ceux-ci, éventuellement en association avec un peptide 111-136 de HARP ou un peptide dérivé, pour la préparation d'un médicament destiné à inhiber l'angiogénèse ou destiné au traitement d'une pathologie associée à une angiogénèse. L'invention a en outre pour objet une méthode pour inhiber l'angiogénèse ou pour traiter une pathologie associée à une angiogénèse, chez un mammifère, plus particulièrement un humain, comprenant l'administration chez ce mammifère d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un acide nucléique comprenant une séquence codant pour un peptide 13-39, ou 65-97 de HARP, ou un peptide dérivé de l'un de ceux-ci, éventuellement en association avec un acide nucléique comprenant une séquence codant pour un peptide 111-136 de HARP ou un peptide dérivé de celui-ci.
Les exemples et figures suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée.
FIGURES : La figure 1 est un graphe représentant l'inhibition de la prolifération cellulaire induite par HARP. Des cellules NIH 3T3 sont stimulées ou non par 4 nM d'HARP en présence ou non de peptide 13-39 ou 65-97 utilisé à une concentration allant de 0,1 μM à 10 μM. Après 24 heures d'incubation, la prolifération cellulaire est estimée par mesure de la thymidine tritiée incorporée par les cellules.
La figure 2 est un graphe qui représente l'inhibition de la croissance tumorale dans un modèle de souris nude ayant reçu une injection de cellules PC3 (lignée issue de cancer de prostate).
Deux millions de cellules PC3 sont injectées à des lots de 5 souris nude traitées ou non par injection quotidienne au niveau de la tumeur par du PBS (contrôle) ou par le peptide HARP 111-136 à une concentration de 5 mg/kg. La croissance tumorale pour chaque lot d'animaux est évaluée par mesure de la taille de la tumeur au jour 9, 13, 16, 20, 23 et 27. La figure 3 est un graphe représentant l'inhibition de l'angiogénèse tumorale dans un modèle de souris nude qui ont reçu une injection de cellules PC3 (lignée issue de cancer de prostate). Deux millions de cellules PC3 sont injectées à des lots de souris traitées ou non par injection quotidienne au niveau de la tumeur par du PBS (contrôle) ou par le peptide P111-136 à une concentration de 5 mg/kg. Les souris sont sacrifiées au jour 27. La quantification de l'angiogénèse est effectuée sur coupe après analyse immunohistologique en utilisant Pisolectine Bandeiraea Simplicifolia comme marqueur spécifique des cellules endothéliales et analyse d'images. Les valeurs présentées dans l'histogramme représentent la valeur moyenne obtenue en analysant trois coupes indépendantes issues de chacune des six tumeurs obtenues dans chaque condition.
La figure 4 est un graphe qui représente l'inhibition de la croissance des cellules tumorales MDA-MB-231 induite par le peptide HARP 13-39. Les cellules MDA-MB-231 sont ensemencées dans une boîte de culture de 12 puits contenant 1 ml d'agar à 0,6% en présence ou non de peptide HARP 13-39. Après 13 jours de culture les colonies ayant un diamètre égal ou supérieur à 50 μm sont comptées. Les résultats du graphe représentent les valeurs d'une expérience répétée 2 fois avec des valeurs similaires et chaque mesure est faite en triple. Les barres représentent les standards d'erreurs (*, p < 0.05; **, p < 0.01).
La figure 5 est un graphe qui représente l'inhibition de la croissance des cellules tumorales MDA-MB-231 induite par le peptide HARP 65-97. Les cellules MDA-MB-231 sont ensemencées dans une boîte de culture de 12 puits contenant 1 ml d'agar à 0,6% en présence ou non de peptide HARP 65-97. Après 13 jours de culture les colonies ayant un diamètre égal ou supérieur à 50 μm sont comptées. Les résultats du graphe représentent les valeurs d'une expérience répétée 2 fois avec des valeurs similaires et chaque mesure est faite en triple. Les barres représentent les standards d'erreurs (*, p < 0.05; **, p < 0.01 ).
La figure 6 représente l'inhibition par les peptides HARP 13-39 et 65- 97 de l'angiogénèse induite par l'HARP dans un modèle in vivo. Trois cents microlitres de Matrigel® incubés avec de 5 nM d'HARP en présence ou non des peptides HARP 13-39 et 65-97 utilisés à une concentration de 1 μM sont injectés en sous cutané à une souris. Le contrôle de l'expérience est réalisé en utilisant du FGF-2. Sept jours plus tard, les souris sont sacrifiées et le Matrigel® est prélevé. Des coupes d'une épaisseur de 8 μM sont réalisées. Les coupes sont ensuite colorées au Trichrome de Gomori. Le nombres de cellules ayant envahi le Matrigel® est quantifié par analyse d'image avec le logiciel NIH. Les résultats représentent la valeur moyenne d'une analyse de 7 coupes par souris (n = 4 souris/groupe). Les barres représentent les standards d'erreurs (**, p < 0.01 ).
EXEMPLES :
Exemple 1 : Effet des peptides HARP 13-39 et 65-97 sur l'inhibition de la prolifération des cellules NIH 3T3 stimulées par HARP
Des cellules fibroblastiques de type NIH 3T3 sont ensemencées à une densité de 3 x 104 cellules par cm2 dans du milieu de culture DMEM supplémenté avec 10% de sérum de veau fœtal. Après 24 heures d'incubation à 37°C dans une atmosphère contenant 7 % de CO2, le milieu de culture est remplacé par du DMEM ne contenant pas de sérum de veau fœtal. Vingt- quatre heures après, la molécule HARP (4 nM) en présence ou non des peptides HARP 16-48 ou 65-97 de séquences respectives SEQ ID N° 2 et N° 3 à une concentration allant de 0,1 à 10 μM est ajoutée pendant 18 heures. Après cette période d'incubation, 0,5 μCi of [mefΛy/-3H]thymidine est ajouté et 6 heures après, les cellules sont fixées par une solution de 10% d'acide trichloracétique. La radioactivité incorporée par les cellules est alors comptée par scintillation liquide après avoir effectué une lyse cellulaire avec une solution de soude à une concentration de 0,1 N.
Les résultats sont présentés sur la figure 1 et montrent que les peptides correspondant à la séquence 13-39 et 65-97 sont capables d'inhiber d'une façon dose dépendante l'activité d'induction de la prolifération cellulaire d'HARP. A une dose de 10 μM, le peptide 65-97 inhibe plus de 90% de l'activité d'HARP, alors que l'on observe 60% d'inhibition pour le peptide 13- 39.
Exemple 2 : Effet du peptide HARP 111-136 sur l'inhibition de l'angiogénèse tumorale et de la croissance tumorale
La capacité du peptide P111-136 (SEQ ID N° 4) d'inhiber l'angiogénèse tumorale a été testée en induisant une croissance tumorale par injection de cellules PC3 à des souris nude en présence ou non de peptide P111-136. On injecte 2x106 cellules PC3 à des lots de 5 souris nude (nude/nude, Laboratoire IFFA CREDO) traités ou non par injection au niveau de la tumeur de 100 μl par jour d'une solution de PBS (lot contrôle) ou par une solution de peptide P111-136 diluée dans du PBS à une concentration de 5 mg/kg. Au jour 9, 13, 16, 20, 23 et 27, la taille de la tumeur est mesurée à l'aide d'un pied à coulisse. Les résultats sont présentés à la figure 3 et indiquent que le peptide HARP 111-136 utilisé à une dose de 5 mg par kg induit une inhibition de la croissance des tumeurs.
L'analyse des données indique que la vitesse de croissance tumorale est 4 fois moins grande pour les souris traitées avec 5 mg/kg de peptide HARP 111-136 que celles non traitées. Au jour 27, on observe que pour le groupe de souris traitées, la taille moyenne des tumeurs est 80% moins grosse que chez celles n'ayant pas reçu de traitement.
Au jour 27, les tumeurs sont prélevées et des coupes à congélation de 5 μm sont réalisées. Après fixation des tissus à l'acétone (4°C, 15 min) et réhydratation de celles-ci, la présence des cellules endothéliales est révélée à l'aide de la lectine Bandeiraea Simplicifolia Isolectine B4 (10 μg/ml) qui se fixe spécifiquement à la surface des cellules endothéliales. Cette lectine est alors mise en évidence par immuno-marquage à l'aide d'un sandwich d'anticorps spécifiques marqués à la phosphatase alcaline. Après incubation avec un substrat de la phosphatase alcaline (Vector red substrat), les cellules endothéliales sont colorées en rouge. La quantification du nombre de cellules endothéliales dans la tumeur est réalisée par analyse d'image (NIH image) en analysant les 6 tumeurs sur 3 coupes indépendantes d'une même tumeur.
On observe un nombre de cellules endothéliales moins important pour les tumeurs traitées par le peptide que pour les tumeurs non traitées. La quantification de cet effet est montrée sur la figure 3. L'analyse de l'histogramme indique que l'injection du peptide P111-136 induit une diminution des vaisseaux intra-tumoraux de 55% démontrant que le peptide P111-136 est capable d'inhiber l'angiogénèse tumorale.
Exemple 3 : Effet des peptides HARP 13-39 et 65-97 sur l'inhibition de la croissance sur agar mou des cellules tumorales
Des cellules MDA-MB-231 issues de carcinome mammaire humain, sont ensemencées à une densité de 3x103 cellules par cm2 dans du milieu de culture DMEM contenant 10% de sérum de veau fœtal, 0.35% d'agar et contenant ou non des concentration de peptides HARP 13-39 et 65-97 (SEQ ID N° 2 et N°3). Les cellules sont ensemencées dans une boite de culture de 12 puits (35 mm de diamètre/puits) préalablement couverte par 1 ml d'agar à 0.6%. Les peptides sont ajoutés dans le milieu de culture tous le 2 jours. Après 13 jours d'incubation dans une atmosphère humide à 37°C et 7% C02, les colonies ayant un diamètre égal ou supérieur à 50 μm sont comptées. Chaque point d'expérience est réalisé en triple et chaque expérience est répétée trois fois.
Les résultats représentés sur les figures 4 et 5 montrent que les peptides HARP 13-39 et 65-97 inhibent la croissance des cellules tumorales de façon dose dépendante. Ainsi, une inhibition de la croissance des cellules tumorales MDA-MB-231 de 53% est observée en présence de 1 μM de peptide HARP 13-39 (Fig. 4) et 41% en présence HARP 65-97 utilisé à la même concentration (Fig. 5).
Exemple 4 : Inhibition par les peptides 13-39 et 65-97 de l'angiogénèse induite par HARP
HARP étant un facteur de croissance impliqué dans la prolifération et la différenciation des cellules endothéliales, les inventeurs ont, dans l'expérience présentée ci-dessous, étudié l'effet des peptides HARP 13-39 et 65-97 (SEQ ID N° 2 et N°3) sur l'activité angiogène induite par HARP.
Cette expérience a été réalisée en utilisant un modèle d'angiogénèse in vivo chez la souris. Ce modèle expérimental consiste à injecter du Matrigel® contenant une substance à analyser pour ses propriétés stimulantes ou inhibitrices de l'angiogénèse. Quatre souris Swiss (Janvier, Le Genest St Isle, France) par groupe sont injectées avec 300 μl de Matrigel® préalablement incubé avec soit 5 nM d'HARP, 1 μM de peptide HARP 13-39 ou HARP 65-97, soit un mélange d'HARP (5 nM) et de peptides HARP 13-39 ou HARP 65-97 (1 μM). Le contrôle de la spécificité de l'inhibition est réalisé en utilisant un autre facteur angiogène, le FGF-2, testé soit seul à une concentration de 10 nM ou supplémenté des peptides HARP 13-39 ou HARP 65-97 utilisés à une concentration de 1 μM.
Les souris sont sacrifiées sept jours après l'injection du Matrigel®. Celui-ci est prélevé et congelé dans l'azote liquide. Des coupes de 8 μM d'épaisseur sont alors effectuées avec un cryostat. Les coupes sont ensuite colorées au Trichrome de Gomori. Le nombre de cellules endothéliales ayant envahi le Matrigel® est quantifié par analyse d'images en utilisant le logiciel NIH image. Les résultats présentés à la figure 6 indiquent que l'HARP ainsi que le
FGF-2 induisent une stimulation de l'angiogénèse. En comparaison au Matrigel® utilisé seul, une augmentation du nombre de cellules endothéliales d'un facteur 3 est observée pour HARP et de 5,8 fois pour le FGF-2. Utilisés à une concentration de 1 μM, les peptides HARP 13-39 ou HARP 65-97 inhibent totalement l'angiogénèse induite par l'HARP alors qu'ils n'ont aucun effet sur l'angiogénèse induite par le FGF-2. Aucun effet significatif n'est observé lorsque les peptides HARP 13-39 ou HARP 65-97 sont utilisés seuls.
Ces résultats montrent que les peptides HARP 13-39 ou HARP 65-97 sont des inhibiteurs spécifiques de l'activité angiogène induite par l'HARP. REFERENCES
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Claims

REVENDICATIONS
1. Peptide consistant en la séquence d'acides aminés choisie parmi : la séquence 13-39 du facteur HARP ; et - la séquence 65-97 du facteur HARP.
2. Peptide consistant en une séquence d'acides aminés similaire à au moins 80 % de la séquence SEQ ID N° 2 ou N° 3, et présentant une activité d'inhibition de l'angiogénèse , et une capacité de se fixer aux glycoaminoglycanes (GAG).
3. Peptide selon la revendication 2, dont la séquence diffère de la séquence SEQ ID N° 2 ou N° 3 par la substitution conservative d'au moins un acide aminé.
4. Acide nucléique consistant en une séquence codant pour un peptide tel que défini à l'une des revendications 1 à 3.
5. Acide nucléique selon la revendication 4, consistant en la séquence SEQ ID N° 5 ou SEQ ID N° 6.
6. Procédé de production d'un peptide tel que défini à l'une des revendications 1 à 3, comprenant la synthèse dudit peptide par voie chimique .
7. Procédé de production d'un peptide tel que défini à l'une des revendications 1 à 3, dans lequel un vecteur contenant un acide nucléique tel que défini à l'une des revendications 4 ou 5 est transféré dans une cellule hôte qui est mise en culture dans des conditions permettant l'expression du peptide correspondant.
8. Composition pharmaceutique comprenant un peptide tel que défini à l'une des revendications 1 à 3, et un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables.
9. Composition selon la revendication 8, comprenant en outre un peptide ayant la séquence d'acides aminés 111-136 du facteur HARP ou à un peptide consistant en une séquence d'acides aminés similaire à au moins 80 % de la séquence SEQ ID N° 4, et présentant une activité d'inhibition de l'angiogénèse, et une capacité de se fixer au récepteur ALK.
10. Composition selon la revendication 9, comprenant : le peptide 13-39 de séquence SEQ ID N° 2 ; le peptide 65-97 de séquence SEQ ID N° 3 ; et le peptide 111-136 de séquence SEQ ID N° 4.
11. Composition pharmaceutique comprenant un acide nucléique consistant en une séquence codant pour un peptide tel que défini à l'une des revendications 1 à 3.
12. Composition selon la revendication 11 , comprenant en outre un acide nucléique comprenant une séquence codant pour un peptide tel que défini à la revendication 9.
13. Composition selon la revendication 12, comprenant : - un acide nucléique codant pour le peptide 13-39 de séquence SEQ
ID N° 2 ;
- un acide nucléique codant pour le peptide 65-97 de séquence SEQ ID N° 3 ;
- un acide nucléique codant pour le peptide 111-136 de séquence SEQ ID N° 4.
14. Composition selon la revendication 12 ou 13, dans laquelle lesdites acides nucléiques sont portés par un unique vecteur.
15. Utilisation d'un peptide tel que défini à l'une des revendications 1 à 3, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement d'une pathologie associée à une angiogénèse.
16. Utilisation selon la revendication 15, dans laquelle le peptide tel que défini à l'une des revendications 1 à 3 est associé à un peptide ayant la séquence d'acides aminés 111-136 du facteur HARP ou à un peptide consistant en une séquence d'acides aminés similaire à au moins 80 % de la séquence SEQ ID N° 4, et présentant une activité d'inhibition de l'angiogénèse, et une capacité de se fixer au récepteur ALK.
17. Utilisation d'un acide nucléique tel que défini à l'une des revendications 4 ou 5, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement d'une pathologie associée à une angiogénèse.
18. Utilisation selon la revendication 17, dans lequel l'acide nucléique tel que défini à l'une des revendications 4 ou 5 est associé à un acide nucléique comprenant une séquence codant pour un peptide tel que défini à la revendication 9.
19. Utilisation selon l'une des revendications 15 à 18, dans laquelle la pathologie est une tumeur, une lésion oculaire, la polyarthrite rhumatoïde ou une maladie de peau.
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