WO2004041988A1 - Procede d'elimination du biofilm - Google Patents

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    • A61L2/16—Disinfection or sterilisation of materials or objects, in general; Accessories therefor using chemical substances
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    • C11D2111/10—Objects to be cleaned
    • C11D2111/14—Hard surfaces

Definitions

  • the present invention relates to the field of disinfection and decontamination of equipment and devices having surfaces capable of serving as a support for depositing a biofilm.
  • This material and / or these devices are for example those used in the medical field, such as analysis apparatus and all the material such as reusable medical devices, such as dialysis generators as well as implants (ocular implants, heart valves) and ' prostheses.
  • reusable medical devices such as dialysis generators as well as implants (ocular implants, heart valves) and ' prostheses.
  • the material used in dentistry, even the mucous membranes . and the teeth, themselves natural or prosthetic, are also likely to be the site of biofilm deposition.
  • Equipment used in the food and or pharmaceutical industry can also be cited as well as air conditioning plants and more generally any equipment in contact with a water medium likely to contain bacteria in suspension.
  • the current major problem is the elimination of the biofilm constituted by the biomass fixed on the surfaces of the material, devices and or mucous membranes and which constitutes a cause of persistent infections and or of contamination.
  • any bacteria suspended in a water medium has the property of adhering to the supports it meets to form a biofilm.
  • This biofilm is an agglomerate of bacteria on a surface surrounded by a matrix of exopolysaccharides, its formation is a natural phenomenon. Once formed the biofilm is very difficult to remove.
  • the biofilm is also reinforced by tartar deposits made up of calcium and magnesium carbonate.
  • WO01 / 53010 discloses an enzymatic process for the elimination of biofilms comprising the use of an enzyme belonging to the group of carbohydrases and proteases and their sequential use and also in combination or independently of agents belonging to the group of biocides , chelating agents, and other cleansers.
  • EP1186574 Also known from EP1186574 is a process for removing biofilms from surfaces in contact with water, characterized in that it comprises cleaning with an active enzymatic principle and cleaning with a disinfectant product intended to kill the bacteria released by the action of the enzyme mixture, but the results obtained are not satisfactory and no process or product currently makes it possible to eliminate these biofilms.
  • the present invention makes it possible to solve the problem by implementing a method and by a selection of products making it possible to obtain an elimination efficiency never obtained until now.
  • the present invention relates to a process for eliminating biofilm, characterized in that it comprises at least the following steps carried out simultaneously or consecutively: a) there is a solution comprising an enzymatic mixture containing at least one enzyme chosen from the group of proteases, at least one enzyme chosen from the group of esterases and an amylase, b) a solution comprising a detergent with an alkaline pH is available, c) said solutions are applied by washing or by circulation on the surface to be treated.
  • the method according to the invention further comprises the following steps carried out simultaneously or consecutively: d) a solution comprising an acid capable of dissolving deposits of mineral salts is available, e) said solution is applied by washing or by circulation to the surface to be treated.
  • the invention also relates to:
  • the method according to the invention characterized in that in the enzyme chosen from the group of proteases is chosen from the group consisting of exopeptidases or endopeptidases such as trypsin; - The method according to the invention, characterized in that the enzyme chosen from the group of esterases is a carboxylester hydrolase such as lipase, a phospholipase and / or a phosphonodiesterase such as - ribonuclease; . - -
  • the method according to the invention characterized in that in the enzymatic mixture further comprises an enzyme chosen from the group consisting of osidases or carbohydrases such as glycosidase and galactosidase;
  • the detergent is an alkaline solution containing surfactants and a quaternary ammonium; - The method according to the invention, characterized in that the detergent also contains a disinfectant such as a solution of sodium hypochlorite, or potassium hypochlorite.
  • the method comprises a washing step with an acid solution to remove deposits of mineral salts
  • the acid is chosen from the group consisting of citric acid, peracetic acid, glycolic acid and hydroxyacetic acid.
  • the invention also relates to a kit intended for the elimination of biofilm, characterized in that it comprises at least one solution of an enzymatic mixture containing at least one enzyme chosen from the group of proteases, at least one enzyme selected from the group of esterases and an amylase, and at least one solution of a detergent, a detergent with an alkaline pH.
  • the invention also relates to: - a kit according to the invention, characterized in that the enzyme chosen from the group of proteases is chosen from the group consisting of exopeptidases or endopeptidases such as trypsin;
  • kits according to the invention characterized in that the enzyme chosen from the group of esterases is a carboxylester hydrolase such as lipase, a phospholipase and / or a phosphonodiesterase such as ribonuclease;
  • the enzyme chosen from the group of esterases is a carboxylester hydrolase such as lipase, a phospholipase and / or a phosphonodiesterase such as ribonuclease;
  • kits according to the invention characterized in that the enzymatic mixture further comprises an enzyme chosen from the group consisting of osidases or carbohydrases such as glycosidase and galactosidase; - a kit according to the invention, characterized in that the enzymatic mixture is pancreatin;
  • the detergent is an alkaline solution containing surfactants
  • kit according to the invention characterized in that the detergent is an alkaline solution containing surfactants and a quaternary ammonium;
  • kit according to the invention characterized in that it further comprises a solution of a disinfectant such as a solution of sodium hypochlorite, or of potassium hypochlorite;
  • a kit according to the invention characterized in that it further comprises a solution of an acid capable of dissolving deposits of mineral salts such as calcium carbonate;
  • kits according to the invention characterized in that in the acid solution for removing deposits of mineral salts, the acid is chosen from the group consisting of citric acid, peracetic acid, glycolic acid and l hydroxyacetic acid.
  • the enzyme mixture is preferably used at a concentration between 0.1 and 10% w / v; the detergent is preferably used at a concentration of between 0.1 and 30% by volume / volume, and when the latter additionally comprises a disinfectant, the disinfectant is preferably added at a concentration of 0.01 to 2%.
  • the duration of application according to the method of the invention of the solution comprising the enzymatic mixture is between 5 min and one hour, depending on the type of biofilm, its age and the material; this application is preferably carried out at a temperature between room temperature and 40 ° C, and preferably at 37 ° C.
  • the solution comprising a detergent whose pH is alkaline is applied for a period which can vary from 5 min to 24 hours, at a temperature between room temperature and 90 ° C., depending on the type of biofilm and the material treated.
  • the invention also relates to a composition intended for the elimination of biofilm, characterized in that it comprises an enzymatic mixture containing at least one enzyme chosen from the group of proteases, at least one enzyme chosen from the group of esterases and an amylase, and a detergent with an alkaline pH.
  • composition according to the invention is characterized in that the enzymatic mixture is pancreatin.
  • the solution comprising the enzymatic mixture and the solution comprising the detergent forms a single solution; the invention therefore also relates to a composition intended for the elimination of biofilm, characterized in that it comprises an enzymatic mixture containing at least one enzyme chosen from the group of proteases, at least one enzyme chosen from the group of esterases and an amylase, and a detergent with an alkaline pH.
  • the method according to the invention characterized in that the detergent is a neutral solution or an acid solution containing surfactants; in this variant when the detergent is an acid solution it allows without additional step to dissolve deposits of mineral salts, when the scaling phenomenon is very important.
  • biofilm means a set of microorganisms developed on a support, in particular bacteria, viruses, parasites and fungi. This biofilm develops and the microorganisms secrete a gangue of exopolymers containing inter alia exopolysaccharides which will form a biological film called "slime” or "glycocalix” and which is in the form of a gelatinous deposit on the surface of the walls.
  • Panten is understood to mean an extract from the pancreas, containing all of the digestive enzymes of this gland, in particular proteolytic enzymes or proteases and hydrolases in particular esterases such as lipase, amylase, ribonuclease and trypsin, we will refer to the definition of the European Pharmacopoeia.
  • Detergent is understood to mean any product the composition of which has been specially studied to contribute to the development of detergency phenomena and which comprises essential components surfactants which are surfactants and possibly complementary components (adjuvants, reinforcers, fillers, various additives).
  • surfactants are chemical compounds which, when introduced into a liquid, lower the surface tension, which has the effect of increasing its wetting properties.
  • alkaline pH means an aqueous solution having a pH greater than 7, and preferably in the present invention a pH greater than or equal to 9.
  • laminate of the biofilm is meant the detachment of the biofilm from its support.
  • Biofilms 1, 2, 3 and 5 were obtained thanks to an in vitro model mimicking the hemodialysis generator.
  • Biofilml enriched with accelerated growth nutrients (3 days) of medium thickness (about 10 5 CFU / cm 2 ), very rich in “slime”
  • Biofilm 2 not enriched in nutrients, having developed in 1 month, equivalent to those actually encountered in dialysis generators (around 10 3 CFU / cm 2 ), very rich in tartar crystals
  • Biofilm 3 enriched with nutrients for accelerated growth (5 days) thick (around 10 9 CFU / cm 2 ), very rich in “slime”
  • Biofilm 4 sample of tubing conveying water for hemodialysis, taken in a center, covered with a biofilm of approximately 10 3 CFU / cm 2 but having developed in more than a year.
  • Biofilm 5 enriched with accelerated growth nutrients, having developed in a "preventive" model in 3 weeks.
  • a 250 ml reactor body was filled with a non-sterile dialysate, prepared by dilution of concentrated non-pyrogenic sterile hemodialysis solutions (Clearflex®, Bieffe Millonai), with non-sterile reverse osmosis water containing Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Flavimonas orizibitans, produced continuously in the laboratory.
  • a non-sterile dialysate prepared by dilution of concentrated non-pyrogenic sterile hemodialysis solutions (Clearflex®, Bieffe Mloisai), with non-sterile reverse osmosis water containing Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Flavimonas orizibitans, produced continuously in the laboratory.
  • the contaminating medium circulated in a closed circuit in a loop of silicone tubing 1.5 meters long and 5 mm in internal diameter at a flow rate of 500 ml / min thanks to a peristaltic pump. All the tubes and the reactor body were previously sterilized in an autoclave at 121 ° C for 30 minutes. Thus, the dialysate naturally contaminated by water bacteria was the only source of microorganisms.
  • the entire system was maintained at a temperature of 37 ° C thanks to a heating plate on which the reactor body was placed.
  • the tubing covered with biofilms 1, 2, and 3 were cut into segments 5 cm long. For screening on biofilms 1 and 2, each segment was selected by lot to undergo one of the different treatments to be studied. Control samples taken at random from the silicone loop were kept untreated
  • the segments of tubing to be treated have been fixed to the descending tubing of an assembly consisting of 2 tubings, one ascending, the other descending, a peristaltic pump and a water bath (for treatments carried out at a temperature above 20 ° C).
  • the product to be tested in "recirculation" mode was dissolved in a 100 ml flask and was driven by the peristaltic pump at a flow rate of 500 ml / min in a closed circuit through the pipes for a period respecting the times of contact described in table 11.
  • the product to be tested in "static" mode was dissolved in a 100 ml flask and was driven by the peristaltic pump until the tubes were filled; then, the pump was stopped and the product kept in stasis for the desired contact time. After each treatment with a given product, the tubing samples were rinsed for 5 minutes with osmosis water.
  • the silicone tubing samples covered with colored biofilms were attached to glass slides and observed under an optical microscope, itself connected to a camera and to “Scion Images” image analysis software. Thus, several photographs of the same sample (6 to 10) were taken, the colored surface was evaluated quantitatively by the image analysis software, and an average value of surface covered per sample was calculated. This mean value was compared with the area covered by the untreated control samples: a percentage reduction in the area covered was then calculated.
  • the biofilm covering the tubing samples was detached from the support by a mechanical scraper ensuring a complete, homogeneous and reproducible stall.
  • This scraper consisted of an electric screwdriver at the end of which was fixed a stainless steel flame sterilizable spatula. Rotation of the spatula in the lumen of the tubing resulted in biomass at the bottom of a sterile tube. Training was facilitated by a sterile stream of water. Any bacterial aggregates were then dissociated through the needle of a syringe. The number of cultivable bacteria was determined by counting the CFU after spreading the resulting bacterial suspension on agar R 2 A incubated at room temperature for 7 days.
  • Bacterial endotoxins were quantified in the bacterial suspension resulting from the dropout (see above) by the standardized reference test: the kinetic chromogenic LAL test (Charles River Endosafe).
  • Pantoeia Pancreatin ® , laboratory reagent marketed by Sigma. Extract from the pig pancreas, it is an enzymatic mixture containing among other lipase, protease, amylase, trypsin, ribonuclease (see European Pharmacopoeia).
  • Product B citric acid
  • this product acts as a decalcifier and eliminates the tartar crystals which trap bacteria and promote the adhesion of the biofilm to the support.
  • Product C RBS ® , alkaline foaming detergent solution, sold by the company Chemical Products, with bactericidal, virucidal and fungicidal properties, containing surfactants and quaternary ammonium (disinfecting agent).
  • Photographs of biofilms 1 and 2 before and after the action of the combination K made it possible to visually quantify the action of the combination.
  • Table IV gives the values of the parameters measured before and after the action of the combination K.
  • Tables IV Quantitative data for the evaluation of the efficacy of the combination K on biofilms 1 and 2
  • RBS solutions at concentrations of 100%, 50%, 10%, 5%, 1%, 0.5% and 0.1% were made by cascade dilutions, then 300 ⁇ l of each of these solutions were added 3 ml of the contaminated mixture. After 12 hours of incubation at room temperature, the CFUs were counted on R 2 A agar for each of the concentrations of RBS tested.
  • the MIC is defined as being the lowest concentration which leads to the inhibition of the growth of germs.
  • the results are given in Table V.
  • Pancreatin 0.5%, pH 7.3 Preparation for 100 ml: 500 mg of Pancreatin powder + 1 g of sprayed PBS (phosphate buffer saline) (Sigma) buffer, diluted in 100 ml of water for hemodialysis (EHD) . Passage of the solution in a closed circuit in the tubes at a flow rate of 500 ml / min for 5 minutes at 37 ° C.
  • PBS phosphate buffer saline
  • EHD hemodialysis
  • RBS ® 7% pH 10 preparation for 100 ml: 7 ml of concentrated solution + 566 mg of sodium carbonate sprayed + 388 mg of sodium bicarbonate sprayed, diluted in QSP 100 ml of EHD.
  • the combination K in its initial form described above has left some adherent cells on biofilms 3 and 4, particularly thick or old. For the elimination of such biofilms, an “enriched formula” of the combination K has been developed.
  • Pancreatin 1%, pH 7.3 Preparation for 100 ml: 1 g of Pancreatin powder + 1 g of sprayed PBS (phosphate buffer saline) (Sigma) buffer, diluted in 100 ml of water for hemodialysis (EHD).
  • PBS phosphate buffer saline
  • Photographs of the biofilm 4 before and after the action of the enriched combination K made it possible to visually quantify the effectiveness of the process according to the invention.
  • Table VI gives the values of the parameters measured before and after the action of the enriched combination K on the biofilm 4 - -
  • Photographs of the control biofilm and of the treated samples made it possible to verify the effectiveness of the process according to the invention.
  • the method, the kit and the composition according to the invention can be used in the circuits of hemodialysis machines, in the fight against legionellosis, for example in hot water circuits and air conditioning systems and cooling towers, in the food industry, in rooms with controlled atmosphere or in rooms with confined atmospheres, for cleaning dental equipment for reusable and non-autoclavable medical devices.
  • the method according to the invention will be implemented, by introducing the solution (s) simultaneously or sequentially into the circuits in which the biofilm must be eliminated, circulating for a period sufficient to allow the elimination of the biofilm, then purging and rinsing if necessary.
  • the method according to the invention will be implemented by application or by soaking of the solution (s) according to the invention sequentially or simultaneously then rinsing if necessary.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé d'élimination du biofilm caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes effectuées simultanément ou consécutivement: a) on dispose d'une solution comprenant un mélange enzymatique contenant au moins une enzyme choisie dans le groupe des protéases, au moins une enzyme choisie dans le groupe des estérases et une amylase, b) on dispose d'une solution comprenant un détergent dont le pH est alcalin, c) on applique par lavage ou par circulation lesdites solutions sur la surface à traiter. Elle concerne également un kit destiné à l'élimination du biofilm caractérisé en ce qu'il comprend les solutions précédemment définies et les compositions comprenant lesdites solutions.

Description

Procédé d'élimination du biofilm
La présente invention a trait au domaine de la désinfection et de la décontamination de matériel et d'appareils présentant des surfaces susceptibles de servir de support au dépôt d'un biofilm.
Ce matériel et/ou ces appareils sont par exemple ceux utilisés dans le domaine médical, comme les appareils d'analyse et tout le matériel comme les dispositifs médicaux réutilisables, comme les générateurs de dialyse ainsi que les implants (implants oculaires, valves cardiaques) et' prothèses. Le matériel utilisé en dentisterie, voire les muqueuses. et les dents elles-mêmes naturelles ou prothétiques sont susceptibles également d'être le siège de dépôt de biofilm. Le matériel utilisé dans l'industrie alimentaire et ou pharmaceutique peut également être cité ainsi que les centrales de climatisation et de manière plus générale tout matériel en contact avec un milieu hydrique susceptible de contenir des bactéries en suspension.
Le problème majeur actuel est l'élimination du biofilm constitué par la biomasse fixée sur les surfaces du matériel, des appareils et ou des muqueuses et qui constitue une cause d'infections persistantes et ou de contamination. En effet toute bactérie en suspension dans un milieu hydrique a la propriété d'adhérer aux supports qu'elle rencontre pour former un biofilm. Ce biofilm est un agglomérat de bactéries sur une surface entourées d'une matrice d'exopolysaccharides, sa formation est un phénomène naturel. Une fois formé le biofilm est très difficile à éliminer.
Les procédés actuels de décontamination et/ou de désinfection proposés pour lutter contre le biofilm, bien qu'ayant une certaine efficacité notamment antibactérienne n'éliminent cependant pas le biofilm du support, ce qui favorise son redéveloppement, et dans le cas particulier de l'hémodialyse, laisse en surface des supports des pyrogènes.
Pour certains appareils ou matériels le biofilm est en outre renforcé par des dépôts de tartre constitués de carbonate de calcium et ou de magnésium.
L'utilisation actuelle de solutions décalcifiantes en renforcement des solutions purement désinfectantes pour le traitement de certain matériel ne permet cependant pas l'élimination totale de ce biofilm sauf à utiliser des produits comme l'eau de Javel qui si elles sont efficaces sur le biofilm sont souvent destructrices pour le matériel et les appareils médicaux. Ces solutions sont en outre inutilisables sur des surfaces en contact avec des tissus et ou directement sur les muqueuses.
On connaît de Jacquelin L.F., Pathologie Biologie, mai 1994, p. 425 l'utilisation séquentielle d'enzymes et de désinfectant phénolique pour la destruction des biofilms. On connaît de Johansen C, Applied and Environmental Microbiology, septembre 1997, p. 3724 , l'utilisation de combinaisons enzymatiques comme les glucose oxydases et la lactoperoxydase. On connaît de WO01/53010 un procédé enzymatique d'élimination des biofilms comprenant l'utilisation d'une enzyme appartenant au groupe des carbohydrases et des proteases et leur utilisation séquentielle et également en combinaison ou de façon indépendante d'agents appartenant au groupe des biocides, chélatants, et autres nettoyants.
On connaît également de EP1186574, un procédé d'élimination des biofilms des surfaces en contact avec de l'eau caractérisé en ce qu'il comporte un nettoyage avec un principe actif enzymatique et un nettoyage avec un produit désinfectant destiné à tuer les bactéries libérées par l'action du mélange enzymatique, mais les résultats obtenus ne sont pas satisfaisants et aucun procédé, ni produit ne permet actuellement d'éliminer ces biofilms.
La présente invention permet de résoudre le problème par la mise en œuvre d'un procédé et par une sélection de produits permettant d'obtenir une efficacité d'élimination jamais obtenue jusqu'à présent.
La présente invention concerne un procédé d'élimination du biofilm caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes effectuées simultanément ou consécutivement : a) on dispose d'une solution comprenant un mélange enzymatique contenant au moins une enzyme choisie dans le groupe des proteases, au moins une enzyme choisie dans le groupe des esterases et une amylase, b) on dispose d'une solution comprenant un détergent dont le pH est alcalin, c) on applique par lavage ou par circulation lesdites solutions sur la surface à traiter.
Dans une variante, le procédé selon l'invention comprend en outre les étapes suivantes effectuées simultanément ou consécutivement : d) on dispose d'une solution comprenant un acide susceptible de dissoudre des dépôts de sels minéraux, e) on applique par lavage ou par circulation ladite solution sur la surface à traiter.
L'invention concerne également :
- le procédé selon l'invention, caractérisé en ce que en ce que l'enzyme choisie dans le groupe des proteases est choisie dans le groupe constitué par les exopeptidases ou les endopeptidases comme la trypsine ; - le procédé selon l'invention, caractérisé en ce que l'enzyme choisie dans le groupe des esterases est une carboxylester-hydrolase comme la lipase, une phospholipase et/ou une phosphonodiestérase comme la - ribonucléase ; . - —
- le procédé selon l'invention, caractérisé en ce que en ce que le mélange enzymatique comprend en outre une enzyme choisie dans le groupe constitué par les osidases ou carbohydrases comme la glycosidase et la galactosidase ;
- le procédé selon l'invention, caractérisé en ce que le mélange enzymatique est la pancréatine ; - le procédé selon l'invention, caractérisé en ce que le détergent est une solution alcaline contenant des agents tensioactifs ;
- le procédé selon l'invention, caractérisé en ce que le détergent est une solution alcaline contenant des agents tensioactifs et un ammonium quaternaire ; - le procédé selon l'invention, caractérisé en ce que le détergent contient en outre un désinfectant comme une solution d'hypochlorite de sodium, ou d'hypochlorite de potassium.
Lorsque dans une variante le procédé comprend une étape de lavage par une solution acide pour éliminer les dépôts de sels minéraux, l'acide est choisi dans le groupe constitué par l'acide citrique, l'acide peracétique, l'acide glycolique et l'acide hydroxyacétique.
L'invention concerne également un kit destiné à l'élimination du biofilm caractérisé en ce qu'il comprend au moins une solution d'un mélange enzymatique contenant au moins une enzyme choisie dans le groupe des proteases, au moins une enzyme choisie dans le groupe des esterases et une amylase, et au moins une solution d'un détergent un détergent dont le pH est alcalin.
L'invention concerne également : - un kit selon l'invention, caractérisé en ce que l'enzyme choisie dans le groupe des proteases est choisie dans le groupe constitué par les exopeptidases ou les endopeptidases comme la trypsine ;
- un kit selon l'invention, caractérisé en ce que l'enzyme choisie dans le groupe des esterases est une carboxylester-hydrolase comme la lipase, une phospholipase et/ou une phosphonodiestérase comme la ribonucléase ;
- un kit selon l'invention, caractérisé en ce que le mélange enzymatique comprend en outre une enzyme choisie dans le groupe constitué par les osidases ou carbohydrases comme la glycosidase et la galactosidase ; - un kit selon l'invention, caractérisé en ce que le mélange enzymatique est la pancréatine ;
- un kit selon l'invention, caractérisé en ce le détergent est une solution alcaline contenant des agents tensioactifs ;
- un kit selon l'invention caractérisé en ce que le détergent est une solution alcaline contenant des agents tensioactifs et un ammonium quaternaire ;
- un kit selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comporte en outre une solution d'un désinfectant comme une solution d'hypochlorite de sodium, ou d'hypochlorite de potassium ; - un kit selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comporte en outre une solution d'un acide susceptible de dissoudre des dépôts de sels minéraux comme le carbonate de calcium ;
- un kit selon l'invention, caractérisé en ce que dans la solution acide pour éliminer les dépôts de sels minéraux, l'acide est choisi dans le groupe constitué par l'acide citrique, l'acide peracétique, l'acide glycolique et l'acide hydroxyacétique.
Le mélange enzymatique est de préférence utilisé à une concentration comrise entre 0,1 et 10 % en poids/volume ; le détergent est de préférence utilisé à une concentration comprise entre 0,1 et 30 % en volume/volume, et lorsque celui-ci comprend en outre un désinfectant, le désinfectant est additionné de préférence à une concentration de 0,01 à 2%.
La durée d'application selon le procédé de l'invention de la solution comprenant le mélange enzymatique est comprise entre 5 mn et une heure, en fonction du type de biofilm, de son ancienneté et du matériau ; cette application est de préférence effectuée à une température comprise entre la température ambiante et 40 °C, et de préférence à 37 °C.
La solution comprenant un détergent dont le pH est alcalin est appliquée pendant une durée qui peut varier de 5 mn à 24 heures, à une température comprise entre la température ambiante et 90 °C, en fonction du type de biofilm et du matériel traité.
L'invention concerne également une composition destinée à l'élimination du biofilm caractérisée en ce qu'elle comprend un mélange enzymatique contenant au moins une enzyme choisie dans le groupe des proteases, au moins une enzyme choisie dans le groupe des esterases et une amylase, et un détergent dont le pH est alcalin.
Plus particulièrement la composition selon l'invention est caractérisée en ce que le mélange enzymatique est la pancréatine.
Dans une variante de l'invention la solution comprenant le mélange enzymatique et la solution comprenant le détergent forme une solution unique ; l'invention concerne donc également une composition destinée à l'élimination du biofilm caractérisée en ce qu'elle comprend mélange enzymatique contenant au moins une enzyme choisie dans le groupe des proteases, au moins une enzyme choisie dans le groupe des esterases et une amylase, et un détergent dont le pH est alcalin.
Dans un mode de réalisation particulier le procédé selon l'invention, caractérisé en ce que le détergent est une solution neutre ou une solution acide contenant des agents tensioactifs ; dans cette variante lorsque le détergent est une solution acide il permet sans étape supplémentaire de dissoudre les dépôts de sels minéraux, lorsque le phénomène d'entartrage est très important. On entend par « biofilm », un ensemble de microorganismes développés sur un support, notamment bactéries, virus, parasites et champignons. Ce biofilm se développe et les microorganismes sécrètent une gangue d'exopolymères contenant entre autre des exopolysaccharides qui va former un film biologique appelé « slime » ou « glycocalix » et qui se présente sous forme d'un dépôt gélatineux à la surface des parois.
On entend par « pancréatine », un extrait de pancréas, contenant l'ensemble des enzymes digestives de cette glande, notamment des enzymes protéolytiques ou proteases et des hydrolases notamment les esterases comme la lipase, de l'amylase, de la ribonucléase et de la trypsine, on se référera à la définition de la Pharmacopée Européenne.
On entend par « détergen »t tout produit dont la composition a été spécialement étudiée pour concourir au développement des- phénomènes-de détergence et qui comprend des composants essentiels les agents de surface qui sont des tensio-actifs et éventuellement des composants complémentaires (adjuvants, renforçateurs, charges, additifs divers). Les tensio-actifs sont des composés chimiques qui introduits dans un liquide, en abaissent la tension superficielle, ce qui a pour effet d'en augmenter les propriétés mouillantes.
On entend par « pH alcalin » une solution aqueuse présentant un pH supérieur à 7, et de préférence dans la présente invention un pH supérieur ou égal à 9.
On entend par « élimination du biofilm », le décrochage du biofilm de son support.
L'efficacité du procédé selon l'invention a été testée selon le plan d'expérience décrit ci-après.
Le procédé a été testé et mis en œuvre expérimentalement sur 5 types de biofilms ; les biofilms 1 , 2, 3 et 5 ont été obtenus grâce à un modèle in vitro mimant le générateur d'hémodialyse.
Biofilml : enrichi en nutriments de croissance accélérée (3 jours) d'épaisseur moyenne (environ 105 UFC/cm2), très riche en « slime »
Biofilm 2 : non enrichi en nutriments, s'étant développé en 1 mois, équivalent à ceux rencontrés réellement dans les générateurs de dialyse (environ 103 UFC/cm2), très riche en cristaux de tartre Biofilm 3 : enrichi en nutriments de croissance accélérée (5 jours) épais (environ 109 UFC/cm2), très riche en « slime »
Biofilm 4 : échantillon de tubulure véhiculant de l'eau pour hémodialyse, prélevé dans un centre, recouvert d'un biofilm d'environ 103 UFC/cm2 mais s'étant développé en plus d'un an.
Biofilm 5 : enrichi en nutriments de croissance accélérée, s'étant développé dans un modèle « préventif » en 3 semaines.
Réalisation du modèle in vitro
Un corps de réacteur de 250 ml a été rempli par un dialysat non stérile, préparé par dilution de solutions concentrées pour hémodialyse stériles apyrogènes (Clearflex®, Bieffe Méditai), avec de l'eau osmosée non stérile contenant Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Flavimonas orizibitans, produite en continu au laboratoire.
Le milieu contaminant circulait en circuit fermé dans une boucle de tubulure en silicone de 1 ,5 mètres de long et de 5 mm de diamètre interne à un débit de 500 ml/min grâce à une pompe péristaltique. L'ensemble des tubulures et le corps de réacteur ont été préalablement stérilisés à l'autoclave à 121 °C pendant 30 minutes. Ainsi, le dialysat contaminé naturellement par les bactéries de l'eau était la seule source de micro-organismes.
L'ensemble du système a été maintenu à une température de 37°C grâce à une plaque chauffante sur laquelle était posé le corps de réacteur.
Dans le cas des biofilms 1 , 3 et 5 la croissance bactérienne et par conséquent le développement du biofilm ont été accélérés par ajout de bouillon de culture LB dilué au 1/50 eme, soit une solution de bouillon LB diluée au 1/5eme apportée à un débit égal au 1/10eme de celui du dialysat.Les débits d'apport du dialysat et du bouillon de culture, régulés par une pompe péristaltique, étaient respectivement de 5 et 0,5 ml/minute. Dans le cas du biofilm 5, le modèle a été modifié de la façon suivante :
Des segments de tubulures en silicone connectés entre-eux par des raccords en polypropylène, ont été parcourus pendant 4 heures par un dialysat non stérile enrichi en milieu de culture. Toutes les 4 heures, les tubulures ont été déconnectées et intégrées à des systèmes de désinfection (voir ci -après) Après traitement, les tubulures ont été reconnectées et le milieu contaminant a été remis à circuler pendant 4 heures. En parallèle, des tubulures témoins ont été réparties dans le circuit et sans jamais subir de désinfection. Chaque jour, 2 séances d'hémodialyse entrecoupées chacune d'une séance de désinfection ont ainsi pu être effectuées. La nuit et les week- end, le système était arrêté après la dernière désinfection et les tubulures étaient maintenues vides à température ambiante. Le système a fonctionné jusqu'au développement d'un biofilm mature sur les tubulures témoins.
Produits et combinaisons testés
17 produits ont été testés appartenant à 6 familles différentes. La liste de ces produits est donnée dans le tableau I. Ces produits ont été évalués seuls ou en combinaisons. Ainsi, un screening complet de 60 combinaisons a été réalisé sur le biofilm 1 ; 9 combinaisons ont ensuite été évaluées sur le biofilm 2 ; enfin, la meilleure combinaison sélectionnée a été testée sur les biofilms 3, 4 et 5.
Tableau I : Liste des produits testés
Figure imgf000009_0001
Echantillonnage
Les tubulures recouvertes des biofilms 1 , 2, et 3 ont été découpées en segments de 5 cm de long. Pour le screening sur les biofilms 1 et 2, chaque segment a été sélectionné par tirage au sort pour subir l'un des différents traitements à étudier. Des échantillons contrôle prélevés au hasard sur la boucle en silicone ont été conservés non traités
Traitement des échantillons
Les segments de tubulure à traiter ont été fixés sur la tubulure descendante d'un montage constitué de 2 tubulures, l'une ascendante, l'autre descendante, d'une pompe péristaltique et d'un bain marie (pour les traitements effectués à une température supérieure à 20°C). Le produit à tester en mode « recirculation »a été mis en solution dans une fiole de 100 ml et a été entraînée par la pompe péristaltique à un débit de 500 ml/min en circuit fermé à travers les tubulures pendant une durée respectant les temps de contact décrits dans le tableau 11. Le produit à tester en mode « statique » a été mis en solution dans une fiole de 100 ml et a été entraînée par la pompe péristaltique jusqu'à remplissage des tubulures ; puis, la pompe a été arrêtée et le produit maintenu en stase pendant le temps de contact souhaité. Après chaque traitement par un produit donné, les échantillons de tubulures ont été rincés 5 minutes par de l'eau osmosée.
Méthodes d'étude de l'efficacité des traitements
Trois paramètres fondamentaux ont été retenus pour l'évaluation de l'efficacité des traitements la réduction de la surface couverte la réduction du nombre de bactéries cultivables la réduction du taux d'endotoxines
Les screening sur les biofilms 1 et 2 n'ont tenu compte que du premier paramètre. La meilleure combinaison retenue a ensuite été évaluée de manière approfondie pour son efficacité sur la mortalité bactérienne et l'élimination des endotoxines. M. . hpde^d'éyajuation . quant
Les biofilms témoins et traités ont été colorés :
-soit par une solution de cristal violet à 0,25% -soit par une solution de fluorochromes Baclight® (Syto 9 et iodure de propidium). Les bactéries viables apparaissent vertes ; les mortes apparaissent jaunes ou rouges.
Les échantillons de tubulure en silicone recouvertes de biofilms coloré ont été attachés sur des lames de verre et observés au microscope optique, relié lui-même à une caméra et à une logiciel d'analyse d'images « Scion Images ». Ainsi, plusieurs photographies d'un même échantillon (6 à 10 ) ont été prises, la surface colorée a été évaluée quantitativement par le logiciel d'analyse d'images, et une valeur moyenne de surface couverte par échantillon a été calculée. Cette valeur moyenne a été comparée à la surface couverte des échantillons témoins non traités : un pourcentage de réduction de la surface couverte a alors été calculé.
D'autre part, pour une observation plus précise, les échantillons traités par la combinaison la plus efficace ont été observés au microsocpe confocal laser.
Méthode de quantification des bactéries cultivables
Le biofilm recouvrant les échantillons de tubulure a été détaché du support par un grattoir mécanique assurant un décrochage complet, homogène et reproductible. Ce grattoir était constitué d'un tournevis électrique à l'extrémité duquel était fixée une spatule en acier inoxydable stérilisable à la flamme. La rotation de la spatule dans la lumière de la tubulure a entraîné la biomasse au fond d'un tube stérile. L'entraînement a été facilité par un filet d'eau stérile. Les éventuels agrégats bactériens ont ensuite été dissociés au travers de l'aiguille d'une seringue. Le nombre de bactéries cultivables a été déterminé par dénombrement des UFC après étalement de la suspension bactérienne résultante sur gélose R2A incubée à température ambiante pendant 7 jours.
Pour plus de précision, les échantillons se révélant non contaminés après étalement ont été totalement filtrés et la membrane de filtration a été incubée sur gélose R2A à température ambiante pendant 7 jours. Méthode de dosage des endotoxines
Les endotoxines bactériennes ont été quantifiées dans la suspension bactérienne résultant du décrochage (voir ci-dessus) par les test standardisé de référence : le test LAL chromogénique cinétique (Charles River Endosafe).
Résultats de l'étude sur les biofilms 1 et 2
Les résultats des screening sur les biofilms 1 et 2 sont présentés dans les tableaux II et III
Tableau II : Screening sur le Biofilm 1
Figure imgf000012_0001
Figure imgf000013_0001
Figure imgf000014_0001
+ mélange et application séquentielle
Tableau III : Screening sur le biofilm 2
Figure imgf000014_0002
La combinaison retenue suite à ces screening a été celle permettant la meilleure élimination des 2 biofilms, à savoir, la « combinaison K » suivante :
Produit A = Pancreatin®, réactif de laboratoire commercialisé par Sigma. Extrait du pancréas de porc, il s'agit d'un mélange enzymatique contenant entre autre lipase, protéase, amylase, trypsine, ribonucléase (voir Pharmacopée Européenne).
Produit B = acide citrique Dans le cas particulier de la désinfection des générateurs de dialyse, ce produit agit comme décalcifiant et élimine les cristaux de tartre qui emprisonnent les bactéries et favorisent l'adhésion du biofilm au support.
Produit C = RBS® , solution détergente alcaline moussante, commercialisée par la société Chemical Products , à propriétés bactéricides, virucides et fongicides, contenant des agents tensio-actifs et un ammonium quaternaire (agent désinfectant).
P.QH.nées ..qualitatives . et.guantjtatiyes
Des photographies des biofilms 1 et 2 avant et après action de la combinaison K ont permis de quantifier visuellement l'action de la combinaison.
Le tableau IV donne les valeurs des paramètres mesurés avant et après action de la combinaison K.
Tableaux IV : Données quantitatives de l'évaluation de l'efficacité de la combinaison K sur les biofilms 1 et 2
Tableau IN a) Biofilm 1
Figure imgf000015_0001
Détermination de la MIC du RBS
Le pouvoir antibactérien de cette combinaison étant porté par le RBS, sa concentration minimale inhibitrice a été déterminée sur les germes constituant les biofilms étudiés.
Un mélange de dialysat frais contaminé (préparé avec de l'eau osmosée non stérile contenant les germes décrits précédemment) et de bouillon LB dans les proportions 50/50 v/v a été réalisé. Des solutions de RBS aux concentrations de 100 %, 50 %, 10 %, 5 %, 1 %, 0,5 % et 0,1 % ont été faites par dilutions en cascades, puis 300 μl de chacune de ces solutions ont été ajoutés à 3 ml du mélange contaminé. Après 12 heures d'incubation à température ambiante, les UFC ont été dénombrées sur gélose R2A pour chacune des concentrations de RBS testées.
La MIC est définie comme étant la plus faible concentration qui conduit à l'inhibition de la croissance des germes. Les résultats sont donnés dans le tableau V.
Tableau V : Détermination de la MIC du RBS
Figure imgf000016_0001
Par sécurité, on choisit d'utiliser la solution de RBS diluée de manière à obtenir 1 ,5 MIC.
Protocole initial retenu
Pancréatine 0,5 %, pH 7,3 : Préparation pour 100 ml : 500 mg de poudre de Pancréatine + 1 g de tampon PBS (phosphate buffer saline) (Sigma) pulvérisé, dilués dans 100 ml d'eau pour hémodialyse (EHD). Passage de la solution en circuit fermé dans les tubulures à un débit de 500 ml/min pendant 5 minutes à 37°C.
Rinçage 5 minutes par de l'EHD à 500ml/min en circuit ouvert.
Acide citrique 3%, pH 2,2 : Préparation pour 100 ml : 3 g d'acide citrique pulvérisé (Merck) dans 100 ml d'EHD. Passage de la solution en circuit fermé dans les tubulures à un débit de 500 ml/min pendant 5 minutes à 20°C
Rinçage 5 minutes par de l'EHD à 500ml/min en circuit ouvert.
RBS® 7% pH 10 : préparation pour 100 ml : 7 ml de solution concentrée + 566 mg de carbonate de sodium pulvérisés + 388 mg de bicarbonate de sodium pulvérisé , dilués dans QSP 100 ml d'EHD.
Passage de la solution en circuit fermé dans les tubulures à un débit de 500 ml/min pendant 30 minutes à 20°C Rinçage 5 minutes par de l'EHD à 500ml/min en circuit ouvert.
Résultats de l'étude sur les biofilms 3 et 4
La combinaison K sous sa forme initiale décrite ci-dessus a laissé quelques cellules adhérentes sur les biofilms 3 et 4, particulièrement épais ou anciens. Pour l'élimination de tels biofilms, une « formule enrichie »de la combinaison K a été développée.
Formule « enrichie » :
Pancréatine 1 %, pH 7,3 : Préparation pour 100 ml : 1 g de poudre de Pancréatine + 1g de tampon PBS (phosphate buffer saline) (Sigma) pulvérisé, dilués dans 100 ml d'eau pour hémodialyse (EHD).
Passage de la solution en circuit fermé dans les tubulures à un débit de 500 ml/min pendant 5 minutes à 37°C.
Rinçage 5 minutes par de l'EHD à 500ml/min en circuit ouvert.
Acide citrique 5%, pH 2,2 : Préparation pour 100 ml : 5 g d'acide citrique pulvérisé (Merck) dans 100 ml d'EHD. Passage de la solution en circuit fermé dans les tubulures à un débit de 500 ml/min pendant 30 minutes à 20°C
Rinçage 5 minutes par de l'EHD à 500ml/min en circuit ouvert.
RBS® 15% pH 10 : préparation pour 100 ml : 15 ml de solution concentrée + 566 mg de carbonate de sodium pulvérisés + 388 mg de bicarbonate de sodium pulvérisé + 6 ml d'eau de Javel concentrée à 5,2 % (concentration finale en hypochlorite de sodium de 0,3 %), dilués dans QSP 100 ml d'EHD
Passage de la solution en circuit fermé dans les tubulures à un débit de 500 ml/min pendant 1 nuit à 20°C Rinçage 5 minutes par de l'EHD à 500ml/min en circuit ouvert.
Figure imgf000018_0001
Des photographies du biofilm 4 avant et après action de la combinaison K enrichie ont permis de quantifier visuellement l'efficacité du procédé selon l'invention..
Le tableau VI donne les valeurs des paramètres mesurés avant et après action de la combinaison K enrichie sur le biofilm 4 - —
Tableaux VI : Données quantitatives de l'évaluation de l'efficacité de la combinaison K enrichie sur le biofilm 4
Figure imgf000018_0002
Résultats de l'étude sur le biofilm 5
Un biofilm très épais (plus de 3.109 UFC/cm2) très riche en slime, très riche en endotoxines bactériennes et couvrant totalement la surface de l'échantillon (30 Inches2) s'est développé à la surface des échantillons contrôles non traités, alors que seulement quelques cellules adhérentes mortes se sont déposées en surface des échantillons traités toutes les 4 heures par le combinaison K non enrichie (formule initiale). Les données quantitatives sont présentées dans le tableau VII. Tableau VII ; Efficacité de la combinaison K sur le biofilm 5
Figure imgf000019_0001
Des photographies du biofilm contrôle et des échantillons traités ont permis de vérifier l'efficacité du procédé selon l'invention.
Le procédé, le kit et la composition selon l'invention peuvent être utilisés dans les circuits des appareils d'hémodialyse, dans la lutte contre la légionellose par exemple dans les circuits d'eau chaude et les systèmes de climatisation et les tours de refroidissement, dans l'industrie agroalimentaire, dans les salles à atmosphère contrôlée ou dans les salles à atmosphères confinées, pour le nettoyage du matériel en dentisterie pour les dispositifs médicaux réutilisables et non autoclavables.
Dans les appareils de circulation de fluides, le procédé selon l'invention sera mis en œuvre, par introduction de la ou des solutions simultanément ou séquentiellement dans les circuits dans lesquels le biofilm doit être éliminé, mise en circulation pendant une période suffisante pour permettre l'élimination du biofilm, puis purge et rinçage si nécessaire.
Pour le traitement de surfaces, plans de travail, prothèses, le procédé selon l'invention sera mis en œuvre par application ou par trempage de la ou des solutions selon l'invention de façon séquentielle ou simultanée puis rinçage si nécessaire.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé d'élimination du biofilm caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes effectuées simultanément ou consécutivement : a) on dispose d'une solution comprenant un mélange enzymatique contenant au moins une enzyme choisie dans le groupe des proteases, au moins une enzyme choisie dans le groupe des esterases et une amylase, b) on dispose d'une solution comprenant un détergent dont le pH est alcalin, c) on applique par lavage ou par circulation lesdites solutions sur la surface à traiter.
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu'il comprend en outre les étapes suivantes effectuées simultanément ou consécutivement : d) on dispose d'une solution comprenant un acide susceptible de dissoudre des dépôts de sels minéraux, e) on applique par lavage ou par circulation ladite solution sur la surface à traiter.
3. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que en ce que l'enzyme choisie dans le groupe des proteases est choisie dans le groupe constitué par les exopeptidases ou les endopeptidases comme la trypsine ;
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que en ce que l'enzyme choisie dans le groupe des esterases est une carboxylester-hydrolase comme la lipase, une phospholipase et/ou une phosphonodiestérase comme la ribonucléase
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le mélange enzymatique comprend en outre une enzyme choisie dans le groupe constitué par les osidases ou carbohydrases comme la glycosidase et la galactosidase ;
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le mélange enzymatique est la pancréatine.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le détergent est une solution alcaline contenant des agents tensioactifs .
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le détergent est une solution alcaline contenant des agents tensioactifs et un ammonium quaternaire ;
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la solution détergente contient en outre un désinfectant comme une solution d'hypochlorite de sodium, ou d'hypochlorite de potassium.
10. Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que dans l'acide pour éliminer les dépôts de sels minéraux, l'acide est choisi dans le groupe constitué par l'acide citrique, l'acide peracétique, l'acide glycolique et l'acide hydroxyacétique.
11. Kit destiné à l'élimination du biofilm caractérisé en ce qu'il comprend au moins une solution d'un mélange enzymatique contenant au moins une enzyme choisie dans le groupe des proteases, au moins une enzyme choisie dans le groupe des esterases et une amylase, et en ce qu'il comprend au moins une solution d'un un détergent dont le pH est alcalin.
12. Kit selon la revendication 11 , caractérisé en ce que l'enzyme choisie dans le groupe des proteases est choisie dans le groupe constitué par les exopeptidases ou les endopeptidases comme la trypsine.
13. Kit selon l'une quelconque des revendications 11 ou 12 caractérisé en ce que l'enzyme choisie dans le groupe des esterases est une carboxylester-hydrolase comme la lipase, une phospholipase et/ou une phosphonodiestérase comme la ribonucléase
14. Kit selon l'un quelconque des revendications 11 à 13, caractérisé en ce que le mélange enzymatique comprend en outre une enzyme choisie dans le groupe constitué par les osidases ou carbohydrases comme la glycosidase et la galactosidase.
15. Kit selon l'une quelconque des revendications 11 à 14 caractérisé en ce que le mélange enzymatique est la pancréatine.
16. Kit selon l'une quelconque des revendications 11 à 15 caractérisé en ce que le détergent est une solution alcaline contenant des agents tensioactifs.
17. Kit selon l'un quelconque des revendications 11 à 15, caractérisé en ce que le le détergent est une solution alcaline contenant des agents tensioactifs et un ammonium quaternaire.
18. Kit selon l'une quelconque des revendications 11 à 17 caractérisé en ce qu'il comporte en outre une solution d'un désinfectant comme une solution d'hypochlorite de sodium, ou d'hypochlorite de potassium.
19. Kit selon l'une quelconque des revendications 11 à 18 caractérisé en ce qu'il comporte en outre une solution d'un acide susceptible de dissoudre des dépôts de sels minéraux comme le carbonate de calcium.
20. Kit selon la revendication 19 caractérisé en ce que l'acide est choisi dans le groupe constitué par l'acide citrique, l'acide peracétique, l'acide glycolique et l'acide hydroxyacétique.
21. Composition destinée à l'élimination du biofilm caractérisée en . ce qu'elle comprend un mélange enzymatique contenant au moins une enzyme choisie dans le groupe des proteases, au moins une enzyme choisie dans le groupe des esterases et une amylase, et un détergent dont le pH est alcalin.
22. Composition selon la revendication 25, caractérisée en ce que le mélange enzymatique est la pancréatine.
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