WO2004092221A1

WO2004092221A1 - 免疫原及び免疫用組成物、並びにそれらを使用する抗体の製造方法

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Publication number: WO2004092221A1
Application number: PCT/JP2004/005501
Authority: WO
Inventors: Yoshitaka Izumoto; Jun-Ichi Hata; Akira Ideno; Masahiro Furutani
Original assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date: 2003-04-18
Filing date: 2004-04-16
Publication date: 2004-10-28
Anticipated expiration: 2005-10-18
Also published as: CA2522221A1; AU2004230803A1; US20070026501A1; AU2004230803A2; EP1621555A1; JPWO2004092221A1; EP1621555A4

Abstract

種々の原因により有効な免疫応答を誘導できないとされている抗原蛋白であっても、十分な免疫応答を誘導することができる免疫原及び免疫用組成物、並びにそれらを使用する抗体の製造方法を提供する。　本発明の免疫原は、所望の抗原蛋白の全長又は一部と、折り畳み因子又はそのサブユニットが、１又は複数のペプチド結合を介して連結された融合蛋白質を含む。折り畳み因子の作用により、融合蛋白質に含まれる抗原蛋白は正しい立体構造を有し、可溶性蛋白として得られる。また、その抗原蛋白が接種動物の血中で速やかに分解されてしまうことを防ぐことができる。さらに、単独の抗原蛋白に比べて、動物において一層高い免疫応答が引き起こされる。折り畳み因子の例として、シャペロニンとＰＰＩａｓｅが挙げられる。

Description

明細書免疫原及び免疫用組成物、並びにそれらを使用する抗体の製造方法技術分野

本発明は、免疫原及ぴ免疫用組成物、並びにそれらを使用する抗体の製造方法に関し、さらに詳細には、所望の抗原蛋白と折り畳み因子とを融合させた融合蛋白質を含む免疫原及ぴ免疫用組成物、並びにそれらを使用する抗体の製造方法に関する。本発明の免疫原によれば、種々の原因により有効な免疫応答を誘導できないとされている抗原蛋白であっても、十分な免疫応答を誘導することができる。背景技術

バイオテクノロジーの発展に伴い、抗体の重要性はますます高くなつてきている。例えば、抗体の特異的な抗原抗体反応を利用した技術として、ェンザィムィムノアッセィゃラジオイムノアッセィ法等の各種免疫測定法、さらに蛋白質の有効な精製手段であるアブイ二ティークロマトグラフィーがよく用いられている。抗体は、抗原蛋白を免疫原として動物に接種して免疫反応を起こさせ、動物に抗体を産生させることによつて作製されている。最近では、生体試料から抗原蛋白を精製するのではなく、遺伝子組換え技術によって抗原蛋白をコードする遺伝子を取得し、該遺伝子を有する組換え体によって抗原蛋白を発現させて抗原蛋白を得ることもよく行われている。

し力し、このようにして取得した抗原蛋白を免疫原に用いても、目的の抗体が得られない場合がある。例えば、以下の場合が挙げられる。

( a )抗原蛋白が宿主細胞にとつて有毒な蛋白であるためにその抗原蛋白を産生すべき,袓換え体が死滅し、免疫原として充分な蛋白量を確保することが非常に困難な場合。

( b )宿主細胞内で抗原蛋白が正しい立体構造をとることができず、異常型蛋白としてしか得られない場合。

( c )抗原蛋白が疎水性ァミノ酸を多く含む不溶性蛋白のため、このままでは免疫原として充分な免疫応答を引き起こせな、場合。

( d )免疫原として使用した抗原蛋白が接種動物の血中で速やかに分解されてしまうため、充分な免疫応答を引き起こせなレ、場合。このような問題を解決する方法として、抗原決定基と考えられる部位を人工的に合成した、いわゆるペプチド抗原の利用や、蛋白質に脂質を付加修飾することにより免疫原性を高め充分な免疫応答を引き起こす試み等がなされている。し力し、上記全ての問題を同時に解決する方法は開発されていない（例えば、国際公開第 0 2 / 0 5 2 0 2 9号パンフレット参照）。とりわけ免疫原として使用した抗原蛋白が接種動物の血中で速やかに分解されてしまう場合を解決する試みはなされていないのが現状である。

本発明は、種々の原因により有効な免疫応答を誘導できないとされている抗原蛋白であつても、十分な免疫応答を誘導することができる免疫原及び免疫用組成物、並びにそれらを使用する抗体の製造方法を提供することを目的とする。発明の開示

本発明者らは、鋭意検討の結果、抗原蛋白と折り畳み因子とが融合した融合蛋白質を免疫原として使用すると、以下の効果が得られることを見出した。

( a ) 抗原蛋白が宿主細胞にとって有毒な蛋白質であっても、所望する抗原蛋白を産生すベき組換え体が死滅することを防ぐことができる。したがって、免疫原として充分量の抗原蛋白を容易に確保することができる。

( b ) 抗原蛋白がより正しい立体構造をとりやすくなるので、より正しい免疫応答を引き起こすことができる。

( c ) 抗原蛋白が疎水性ァミノ酸を多く含むものであり、単独では不溶性となる場合でも、融合蛋白質とすることにより可溶性となる。したがって、免疫原として充分な免疫応答を引き起こすことができる。

( d ) その抗原蛋白が接種動物の血中で速やかに分解されてしまうことを防ぐことができ、充分な免疫応答を引き起こすことができる。

( e ) 単独の抗原蛋白に比べて、動物において一層高い免疫応答が引き起こされる。すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。

( 1 ) 所望の抗原蛋白に対する免疫応答を誘導するための免疫原であって、前記抗原蛋白の全長又は一部と、折り畳み因子又はそのサブユニットが、 1又は複数のペプチド結合を介して連結された融合蛋白質を含む免疫原。

( 2 ) 前記折り畳み因子が複数のシャぺ口ニンサブュニットにより構成されるシャぺ口ニンであることを特徴とする（1 ) に記載の免疫原。 (3) 前記シャぺ口ニンサブユニットの一部又は全部は、互いにペプチド結合を介して直列に連結されていることを特徴とする（2) に記載の免疫原。

(4) 前記抗原蛋白は、前記シャぺ口ニンサブユニットの N末端及び又は C末端に連結されていることを特徴とする（2) 又は（3) に記載の免疫原。

(5) 前記抗原蛋白は、前記シャぺ口ニンサブユニット同士の間に連結されていることを特徴とする（3) 又は（4) に記載の免疫原。

(6) 前記シャぺ口ニンサブユエットと前記抗原蛋白との間に蛋白質分解酵素の切断ァミノ酸配列を有することを特徴とする（2) 乃至（5) のいずれかに記載の免疫原。

(7) 前記シャぺ口ニンサブュニット同士の連結部に蛋白質分解酵素の切断アミノ酸配列を有することを特徴とする（3) 乃至（6) のいずれかに記載の免疫原。

(8) 前記シャぺ口ニンサブユニットは、パクテリア、古細菌又は真核生物に由来することを特徴とする（2) 乃至（7) のいずれかに記載の免疫原。

(9) 前記抗原蛋白は、前記シャぺ口ニンサブュニットが形成するシャぺ口ニンリングの内部に格納されていることを特徴とする (2) 乃至 (8) のいずれかに記載の免疫原。

(1 0) 前記シャぺ口ニンリングは、 5〜1 0個のシャぺ口ニンサブュニットから構成されることを特徴とする（9) に記載の免疫原。

(1 1) 2個のシャぺ口-ンリングがリング面又は側面を介して非共有結合的に会合していることを特徴とする (9) 又は (1 0) に記載の免疫原。

(1 2) 前記折り畳み因子がフォルダーゼであることを特徴とする (1) に記載の免疫原。

(1 3) 前記抗原蛋白が前記フォルダーゼの N末端及び/又は C末端に連結されていることを特徴とする (1 2) に記載の免疫原。

(14) 前記フォルダーゼが PP I a s eであることを特徴とする (1 2) 又は (1 3 ) に記載の免疫原。

(1 5) 前記 PP I a s eが大腸菌又は古細菌に由来することを特徴とする（14) に記載の免疫原。

(1 6) 前記抗原蛋白は、セロトニンレセプター 5— HT 1 a Rであることを特徴とする（1) 乃至（1 5) のいずれかに記載の免疫原。

(1 7) 前記融合蛋白質は、セロトニンレセプター 5—HT 1 a Rの全長又は 6残基以上の部分蛋白質を含有することを特徴とする（1 6) に記載の免疫原。 (18) 前記抗原蛋白の全長又は一部をコードする遺伝子と前記折り畳み因子又はそのサブュ-ットをコ一ドする遺伝子とを含有する融合遺伝子を転写 ·翻訳することにより製造されることを特徴とする（1) 乃至（17) のいずれかに記載の免疫原。

(19) 前記抗原蛋白の一部をコードする遺伝子は、該抗原蛋白の 6残基以上の部分蛋白質をコードする遺伝子であることを特徴とする（18) に記載の免疫原。

(20) (1) 乃至（19) のいずれかに記載の免疫原とアジュバントとを混合してなる免疫用組成物。 .

(21) (1) 乃至（19) のいずれかに記載の免疫原をヒトを除く動物に免疫し、該動物から抗原蛋白に特異的な抗体を採取することを特徴とする抗体の製造方法。

(22) (20) に記載の免疫用組成物をヒトを除く動物に免疫し、該動物から抗原蛋白に特異的な抗体を採取することを特徴とする抗体の製造方法。図面の簡単な説明

図 1は、シャぺロニン一抗原蛋白複合体における抗原蛋白とシャぺ口ニンサブュニットの組み合わせの第 1の例を示す図である。

図 2は、シャぺ口ニン一抗原蛋白複合体における抗原蛋白とシャぺ口ニンサブュニットの組み合わせの第 2の例を示す図である。

図 3は、シャぺロニン一抗原蛋白複合体における抗原蛋白とシャぺロニンサブュ二ットの,組み合わせの第 3の例を示す図である。

図 4は、シャぺ口ニン一抗原蛋白複合体における抗原蛋白とシャぺ口ニンサブュニットの組み合わせの第 4の例を示す図である。 . 図 5は、シャぺ口ニン一抗原蛋白複合体における抗原蛋白とシャぺ口ニンサブュニットの組み合わせの第 5の例を示す図である。

図 6は、ベクター p T r c (Gr o EL) 7の構成を表す図である。 ' 図 7は、ベクター pTF (TCP |3) 8の構成を表す図である。

図 8は、ベクター T c FK f u s i o n 2の構成を表す図である。

図 9は、大腸菌シャぺ口ニン（Gr o EL) の立体構造を模式的に表す図である。発明を実施するための最良の形態本発明の免疫原は、抗原蛋白の全長又は一部と折り畳み因子又はそのサブュニットが 1 又は複数のペプチド結合を介して連結された融合蛋白質を含む。

ここで折り畳み因子とは、ポリペプチドの折り畳み（f o 1 d i n g)を助ける一連の蛋白質をいう。折り畳み因子は、分子シャペロンとフォルダーゼに大別される。

分子シャペロンの多くは、細胞に熱ショック等のストレスを与えることによりその発現が誘導される。分子シャペロンは、エネルギー物質である AT Pの存在下又は非存在下で蛋白質の折り畳みを支援したり、蛋白質の構造安定ィヒに貢献したりする作用を有する。分子シャペロンの例としては、シャぺ口ニンに属するもの、 H s p 70システムに属するもの、スモーノレヒートショックプロテインに属するもの、 H s p 90に属するもの、プレフオルディン（P r e f o 1 d i n)に属するもの等が挙げられる。本発明の免疫原においては、折り畳み因子としていずれの分子シャペロンも適用可能である。以下、本発明の免疫原に適用可能な各分子シャぺ口ンについて説明する。

まず、シャぺ口ニンについて説明する。シャぺ口ニンは分子量が約 6 0 kD aのサブュニット（シャぺロニンサブユニット）複数個から構成される複合体である。シャぺ口ニンは、バクテリア、古細菌、真核生物等の全ての生物に存在し、蛋白質の折り畳み支援や変性防御の機能を有している。

シャぺ口ニンはグループ 1型とグループ 2型とに大別される。バクテリアや真核生物のオルガネラに存在するシャぺ口ニンはグループ 1型に分類され、コシャぺロニンと称される分子量約 1 0 k D aの蛋白質の環状複合体を補因子とする。一方、グループ 2型シャぺ口ニンは、真核生物の細胞質や古細菌に見られ、それらの構造や機能に関しては不明な点が多く残されており、グループ 1型のコシャぺロニンに相当する蛋白質も現在のところ見つかっていない。 (Gu p t a、 Mo l . M i c r o b i o l . 、 1 5、 1一、 1 9 9 5 年）。本発明の免疫原においては、いずれのシャぺ口ニンも使用可能である。例えば、グループ 1型のシャぺ口ニンとしては大腸菌の G r o EL、グループ 2型のシャぺ口ニンとしては古細菌由来の TCPを使用することができる。

代表的なシャぺ口ニンは、 5〜1 0個のシャぺ口ニンサブュ-ットが環状に連なったリング状の複合体（シャぺ口-ンリング）を 2個有する、合計 1 0〜20個のシャぺ口ニンサブユニットからなる複合体である。そして、これら 2個のシャぺ口ニンリングがリング面を介して非共有結合的に会合して、 2層のリング構造を形成する。シャぺ口ニンは、該リング構造の内部にポリべプチドゃ変性した蛋白質を格納し、 ATP等のヌクレオチド 3 リン酸の消費をともなって蛋白質の折り畳み反応を促進する。一方、 1個のシャぺ口ニンリングのみを有し、 1層のリング構造を有するシャぺ口-ン（シングルリングシャぺロニン）も知られている。シングルリングシャぺ口ニンは一部の生物で見つかつている他、ァミノ酸置換等の蛋白工学的手法によって人工的に作ることができる。本発明の免疫原が上記した（a) 〜（d) の作用を有する要因の一つは、抗原蛋白がシャぺ口ニンの内部に格納されていることであると考えられる。

大腸菌由来のシャぺ口ニンである G r o ELは、図 9に示すように、内径 4. 5 nm、高さ 1 4. 5 nmの空洞（キヤビティ）を有する。 1層のシャぺ口ニンリングのキヤビティは 60 kD aの球状蛋白質 1つが充分に納まる空間を有する。シャぺ口ニンはこのキヤビティ内部に、ポリペプチドや変性した蛋白質を一時的に格納し、その折り畳み構造形成を助け、構造を安定ィヒさせる機能をもつ。

種々の細'胞由来のシャぺ口ニンの立体構造が近年、 X線結晶構造解析によつて詳細に明らかにされつつある。隣接するシャぺ口ニンサブュニット間及びシャぺロニンリング間の相互作用により形成されるシャぺ口ニンの構造は、非共有結合的な相互作用、例えばアミノ酸間の疎水的相互作用ゃ静電相互作用等によって保持されている。また、シャぺ口ニンサブュニットの N末端及び C末端はともにキヤビティ側に位置し、フレキシビリティの高い構造となっており、特に大腸菌由来シャぺ口ニン G r o ELは、 C末端の少なくとも 2 3ァミノ酸残基がフレキシビリティの高、構造を示すことがわかっている。

また、シャぺ口ニンが高濃度 (lmg/mL以上）であり、かつ M g -ATPが存在する場合、シャぺ口ェンはリング面又は側面を介して非共有結合的に会合し、繊維状構造を形成する場合がある (T r e n t , J. D. 、 e t a 1. 、 1 9 9 7、 P r o c. N a t 1. Ac a d. S c i . U. S. A. 94、 5 3 8 3- 5 3 8 8 ： Fu r u t a n i , M. e t a 1. 、 1 998、 J . B i o l . Ch em. 27 3、 28399- 2840 7) 。

本発明の免疫原において、シャぺ口ユンは、シャぺ口ニンサブユニットからなるシャぺ口ニンリングがリング面を介して非共有結合的に会合した 2層リング構造を形成している、又は、シャぺ口ニンリングがリング面又は側面を介して非共有結合的に会合し、繊維状構造を形成していることが好ましい。ただし、シングルリングシャぺ口ニンも使用可能である。バクテリア、古細菌由来のシャぺ口ニンは、遺伝子糸且換え手法により大腸菌等の宿主細胞内で生産されることができる。例えば宿主細胞が大昜菌の場合は、その細胞質可溶 1"生画分に容易に大量生産させることが可能である。さらに、大月昜菌の細胞質可溶性画分に発現したシャぺ口ニンの精製品を電子顕微鏡観察することによって、大腸菌によって生産された異種生物由来のシャぺ口ニンが自己集合し、 2層リング構造の複合体を形成することが確認されている。

本発明の免疫原で用いられるシャぺ口ニンの由来は、バクテリア、古細菌及び真核生物のいずれであってもよい。また、シャぺ口ニンは天然から採取したものの他、遺伝子組換え手法によって適宜の宿主細胞内で発現させて生産したものでもよい。また、シャぺ口- ンのリング構造への自己集合能が維持されていれば、野生型のみならずアミノ酸変異体を使用することも可能である。例えば、シャぺ口ニンリングの内部に収納された抗原蛋白を早く放出したい場合には、シャぺ口ニンの各サブュニットの会合力が弱められた変異体を使用することもできる。

次に、 H s p 70システムに属する分子シャぺ口ンについて説明する。 H s p 70システムに属する分子シャぺ口ンと抗原蛋白を複合体とすれば、該抗原は不可逆的な凝集形成を抑制され免疫原として好適である。

H s p 70システムに属する代表的な蛋白質は、大腸菌由来の D n a K：、 Dn a J及ぴ G r p Eである。また、 D n a K：、 D n a J及び G r p Eのホモログは生物種を問わず幅広く存在している。大腸菌の Dn a K/Dn a J/G r p E系のタンパク質フォールディングシステムはよく研究されている。提案されている反応メカニズムとしては、リポゾ一ムで生合成された新生ポリぺプチドが D n a Kと結合し、 ATP存在下でさらに Dn a J が結合することで、不可逆的な凝集形成が抑制される。さらに G r p Eに依存したヌクレォチドの解離に伴い、新生ポリぺプチドも解離され、シャぺ口ニンのフォールディングシステムに受け渡されるというものである（F i n k、 Mo l e c u l a r c h a p e r o n e s i n t h e l i f e c y c l e o i p r o t e i n s、 MAR CEL DEKKER, I NC、 1 9 98 ) 。本発明の免疫原においては、これら大腸菌由来の Dn aK：、 Dn a J及ぴ G r p E並びにこれらと同じ働きをするホモログであれば使用可能である。

次に、スモールヒートショックプロテインに属する分子シャペロンについて説明する。スモールヒートショックプロテインはシャぺ口ニンのリング構造のような複雑で高次の会合体でない、単純な会合体を形成する。そして、スモールヒートショックプロテインと抗原蛋白を複合体とすれば、該抗原蛋白は会合体に巻き込まれて保護される。その結果、免疫原として使用した場合でも、抗原蛋白が接種動物の血中で速やかに分解されることがなく、より確実に免疫応答を誘導することができる。スモールヒートショックプロテインは、分子量約 1 5〜30 kD aのサブユエットが、 24〜 32個程度集まつて巨大な分子構造をとり、分子シャペロン活性を有することが報告されている（J a k o b、 J . B i o 1. Ch em. 268， 1 5 1 7—、 1 99 3年）。例えば、スモールヒートショックプロテインのひとつである H s p 25はサブュニット 1 6個またはそれ以上が会合ししてレヽる (Eh r n s p e r g e r, M e t a 1. , Th e J o u r n a l o f B i o l o g i c a l Ch em i s t r y v o l . 2 74, No. 2 1， p. 1 48 6 7- 148 74) 。また、これらと相同性の高い領域をその C末端領域に有するクリスタリンもまた、スモールヒートショックタンパク質と同様の性質を有している。そして、抗原蛋白とこれらのスモールヒートショックタンパク質を融合蛋白質とすることにより、本発明の免疫原に適用可能である。

次に、プレフォルディンに属する分子シャペロンについて説明する。プレフオルディンもスモールヒートショックプロテインと同様に単純な会合体を形成する。そして、プレフオルディンと抗原蛋白を複合体とすれば、該抗原蛋白は会合体に巻き込まれて保護される。その結果、免疫原として使用した場合でも、抗原蛋白が接種動物の血中で速やかに分解されることがなく、より確実に免疫応答を誘導することができる。プレフォルディンは、真核生物のチューブリンのタンパク質折り畳みに関与する因子として見いだされた分子シャペロンであり (L o p e z、 J . S t r u c t . B i o l . 1 3 5, 2 1 9—、 20 0 1年) 、 6量体を形成し、インビトロでは、変性したタンパク質と相互作用するシャぺロン活性を有することが知られている（S i e g e r t, C e l l 1 03, 6 2 1 -, 2000年）。そして、抗原蛋白とプレフオルディンを融合蛋白質とすることにより、本発明の免疫原に適用可能である。

次に、別の折り畳み因子であるフォルダーゼについて説明する。フォルダーゼは酵素的に働く折り畳み因子である。フォルダーゼと抗原蛋白を融合した融合蛋白質は、該抗原蛋白がより正しい立体構造をとりやすくなるので、免疫原として好適である。フォルダーゼの例としては、ぺプチジルプロリルシス一トランスイソメラーゼ (P e p t i d y l -p r o 1 y 1 c i s— t r a n s i s ome r a s e。以、 P P I a s eと田各する。）、プロテインジスルフィドイソメラーゼ等が挙げられる。 PP I a s eは蛋白質の折り畳みにおけるプロリルペプチド結合の異性ィヒ反応を触媒する酵素である。また、プロテインジスルフィドイソメラーゼはジスルフィド結合の形成を促進する作用を有する酵素である。本発明の免疫原においては使用する折り畳み因子に特に制限はないが、 PP I a s eを使用することがより好ましい。

PP I a s eはその阻害剤に対する感受性から、 FK506 B i nd i n g P r o t e i n型（FKBP型）、シクロフイリン型、及びパーブリン型の 3種類に分類される。 8?型卩？ 1 a s eは免疫阻害剤の 1つである FK506により活性が阻害される P P I a s e及びそのホモログである。シクロフイリン型 P P I a s eは、免疫阻害剤シクロスポリンに対して感受性を持つ PP I a s e又はそのホモログである。一方、パーブリン型 PP I a s eは、いずれの免疫阻害剤に対しても感受性を示さず、ジュグロン（ j g 1 o n e) によりその活性が阻害されるものである。これら 3種類の P P I a s eは、アミノ酸一次配列上の相同性はほとんどないことが知られている。本発明の免疫原においては、上記した全ての型の PP I a s eが使用可能である。

さらに、一部の PP I a s eは、本来の活性であるプロリルべプチド結合の異性化反応を触媒する活'生 (PP I a s e活性）のみならず分子シャペロン活性をも有する。ここで分子シャペロン活性とは、変性した蛋白質を元の天然型にリフォールディングさせる活性

、又は変性した蛋白質の不可逆的な凝集を抑制する活性をいう。この PP I a s eが有する分子シャぺ口ン活性は、その活性発現のために AT P等のヌクレオチド 3リン酸を要求しない点で、分子シャぺ口ンが有する分子シャぺ口ン活性と異なる。分子シャペロン活性を有する PP I a s eは分子シャペロン活性を有さない通常の P P I a s eに比べて蛋白質をより確実に折り畳むことができるので、本発明の免疫原に使用するためにはさらに好適である。

分子シャペロン活性を有する PP I a s eの例としては、古細菌由来の F K B P型 P P l a s eが挙げられる。すなわち、古細菌由来の F K B P型 P P I a s eは、 PP I a s e活性と AT P非依存的な分子シャぺ口ン活性の両方を有するので、抗原蛋白との融合蛋白質とすることにより、該抗原蛋白はより確実に正常型の立体構造をとりやすくなる。古細菌由来 FKB P型 P P I a s eは、分子量が 16〜： 18 k D a程度のショートタイプと分子量が 26〜33 kD a程度のロングタイプに分類される。本発明の免疫原においては両方のタイプが使用可能であるが、ショートタイプの古細菌由来 F KB P型 PP I a s e はより強い分子シャぺ口ン活性を有するので、本発明の免疫原には特に好適である。さらに、ショートタイプの古細菌由来 FK BP型 PP I a s eは分子量が小さいので、遺伝子組み換え手法により抗原との融合蛋白質を宿主細胞内で発現させる場合に有利である。なお、上記し分子量の幅はこれまで見いだされている古細菌由来の FKBP型 PP I a s eの分子量幅であり、本発明の免疫原に使用するための古細菌由来 F KB P型 PP I a s eは、この分子量幅に限定されず、実質的に同じグループに属するものであればいずれであってもよい。

本発明の免疫原に使用するための古細菌由来 F KB P型 PP I a s eの由来となる古細菌としては特に限定はない。例えば、ショートタイプの FKB P型 P P I a s eの由来としては、好熱性及又は超好熱性古細菌である Me t h a n o c o c c u s t h e rmo 1 i t h o t r o p h i c u s Th e rmo c o c c u s s p . KS_1、 Me t h a n o c o c c u s j a n n a s c h i i等が挙げられる。さらに、常温性古細菌である Me t h a n o s a r c i n a ma z e i Me t h a n o s a r c i n a a c e t i v o r a n s _N Me t h a n o s a r c i n a b a r k e r i等力 S挙げられる (M a r u y a m a , F r o n t. B i o s c i 5、 821—、 2000) 。また、口ングタイプの FKB P型 P P I a s eの由来としては、好熱 1生又は超好熱性古細菌である P y r o c o c c u s h o r i k o s h i i、 Ae r o p y r um p e r n i x、 Su l f o 1 o b u s s o l i a t a r i c u s^ e t h a n o c o c c u s ] a nn a s c h i i、 Ar c h a e o g 1 o b u s f u 1 g i d u s、 Me t h a n o b a c t e r i um a u t o t r o p h i c u m、 Th e rmo p 1 a sma a c i d o p h i 1 um等が挙げられる。さらに、常温性好塩菌である Ha l o b a c t e r i um c u t i r u b r u m等力 S挙けられる (M a r uy ama、 F r o n t. B i o s c i 5、 821 -, 2000年）。

分子シャぺ口ン活性を有する P P I a s eの他のタイプについて説明する。 FKBP型 P P I a s eにはトリガーファクタータイプ、 Fk pAタイプ、 FKBP 52タイプがある。また、シクロフィリン型 P P I a s eには C yP40タイプ PP I a s eがある。さらに、パープリン型 PP I a s eには Su r Aタイプ PP I a s eがある。

トリガーファクタータイプ PP I a s eはほとんど全てのバクテリアのゲノム上でその遺伝子が見つかつている。トリガーファクタータイプ P P I a s eの由来の例としては、大腸 ¾、 My c o p l a sma g e n i t a l i um_s B a c i l l u s s ub t i l i s、 S a l mo n e l l a e n t e r i c a、 S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s、 My c o b a c t e r i um l e p r a e、 Ag r o b a c t e r i um t ume f a c i um、 L a c t o c o c c u s l a c t i s、 C amp y r o b a c t e r ； j e j u n i、 S t r e p t o c o c c u s p y o g e n e s、 C o r y n e b a c t e r i um d i p h t h e r i a e等が挙げられる。

F k p Aタイプ P P I a s e及ぴ S u r Aタイプ P P I a s eは、いずれも大腸菌をはじめとするグラム陰性パクテリアのペリプラズム領域に存在している P P I a s eである。 F k p Aタイプ P P I a s e及び S u r Aタイプ P P I a s eの由来の例としては、大腸-囷、 Py r o b a c u l um a e r o p h i 1 i u m、 P s e u d omo n a s a e r u g i n o s a Xy l e l l a f a s t i d i o s a、 Ne i s s e r i a m e n i n g i t i d e s^ Me s o r h i z o b i um l o t i、 He amo p h i 1 u s i n f l u e n z a e、 R a i s t o n i a s o l a n a c e a r u m等力 S挙りられる。また、これらのバクテリア由来のものだけでなく、それらと同じグループに属し、実質的に同等の活性を有するものであれば、いずれの生物由来の P P I a s eであってもよい。例えば、酵母等の真核生物のゲノムでもそのホモログの遗伝子が見つかつている

FKB P 52タイプ PP I a s e及ぴ C y P 40タイプ PP I a s eは、いずれも真核生物中に見いだされる P P I a s eである。 FKB P 5 2タイプ P P I a s eは、約 5 2 kD a程度の FKB P型 P P I a s eであり、 p 5 9又は HS P 5 6等とも呼ばれている。また Cy P 40タイプ PP I a s eは 40 kD a程度の分子量を持つ。 FKB P 5 2タィプ P P I a s e及ぴ C y P 40タイプ P P I a s eの由来としては特に限定されず、例えば、ヒト、マウス、ゥシ、ブタ、ゥサギ、ラット等の真核生物が挙げられる。また本発明の免疫原で用いられる F KB P 5 2タイプ P P I a s e及び C y P 40タイプ P P I a s eは、真核生物由来のものだけでなく実質的に同じ物と認められるグループに属するものであれば、いずれの生物由来の P P I a s eであってもよい。

なお、上記した PP I a s eはその全長だけでなく、同様の活性を保持する部分べプチドも使用可能である。例えば、ショートタイプの古細菌由来 FKB P型 P P I a s eは、 FK 5 0 6との結合に関与する FKB Pドメインと I F ( I n s e r t i n t h e f l a p) ドメインを有しており、これらのドメインが分子シャペロン活性を司っている。したがって、これらのドメインを有する部分ペプチドで PP I a s e活性を有するものであれば、分子シャペロン活性を有する P P I a s eとして使用可能である。また、ロングタイプの古細菌由来 F K B P型 P P I a s eは、上記の F K B Pドメインと I Fドメインの他に、 C末端ドメインも分子シャペロン活性を司っている。したがって、これらのドメインを有する部分ペプチドで P P I a s e活 14を有するものであれば、分子シャペロン活性を有する P P I a s eとして使用可能である。また、分子シャペロン活性を有しない P P I a s e、例えばヒト F K B P 1 2に、上記の古細菌由来 P P I a s eの I Fドメインゃ C末端ドメインを蛋白工学的手法によって導入すれば、分子シャペロン活^~生を有するキメラ P P I a s eを作製することができる。

次に、本発明の免疫原に含まれる融合蛋白質について説明する。上記のとおり、該融合蛋白質は抗原蛋白の全長又は一部と折り畳み因子の融合蛋白質である。

まず、折り畳み因子がシャぺ口ニンである場合について説明する。シャぺ口ニンは複数のシャぺ口ニンサブュニットの複合体であるが、本発明の免疫原に使用される融合蛋白質においては、抗原蛋白がシャぺ口ニンサブュニットとぺプチド結合を介して連結されている。抗原蛋白が連結される位置としては、シャぺ口ニンサブユニットの N末端、 C末端のいずれでもよい。シャぺ口ニンサブユニット同士が連結されたシャぺ口ニンサブユニット連結体に抗原蛋白が連結される場合は、連結体の N末端、 C末端、連結体のシャぺ口ニンサブユニット間のいずれでもよい。また抗原蛋白が複数の場合は、これらの部位から選択される複数の部位に連結すればよい。特に、抗原蛋白がシャぺ口ユンリングのキヤビティ内に確実に納まるように、抗原蛋白の連結部位を選択することが望ましい。

例えば、抗原蛋白が、天然においてホモ又はへテロの形態で 2量体又はそれ以上の四次構造を形成するものである場合には、抗原蛋白を構成する 1種又は 2種のサブュニットが、互いに連結したシャぺ口ニンサブュニットの N末端及び C末端にぺプチド結合を介して連結されることが好ましい。例えば、抗原蛋白が 2量体を形成することにより抗原性を発現するものであり、 8個のシャぺ口ニンサブュ-ットから構成される古細菌由来シャぺ口ニンとの複合体を免疫原とする場合は、シャぺ口ニンサブユニットを 8個連結した 8量体シャぺ口ニン（シャぺロニンサブユニット 8回連結体）の N末端及び C末端に、抗原蛋白のそれぞれのサブュニットをぺプチド結合を介して連結すればよい。このようにすると、シャぺ口ニンリング内の極めて近接した領域にそれぞれのサブュニットが存在するため、

2量体からなる四次構造を形成しやすく、安定した抗原性の発現が可能となる。

シャぺ口ニンと抗原蛋白の複合体（以下、「シャぺロニン一抗原蛋白複合体」と呼ぶ。 ) における、融合蛋白質-とシャぺ口ニンサブユニットの組み合わせの例を、シャぺ口ニンサブユニットの数が 8個の例をもって図 1〜5を参考にしながら順に説明する。図中、白丸はシャぺ口ニンサブユニット、黒丸は抗原蛋白、実線はペプチド結合である。第 1の例は、シャぺ口ニン一抗原蛋白複合体が融合蛋白質のみで構成される場合である。図 1にいくつかの例の概念図を示す。すなわち、図 1 ( a ) に示されるシャぺ口ニン一抗原蛋白複合体は、 1個の抗原蛋白にシャぺ口ニンサブュニット 8連結体が連結されている融合蛋白質で構成されている。図 1 ( b ) に示されるシャぺ口ニン一抗原蛋白複合体は、 2個の抗原蛋白がシャぺ口ニンサブュニット 8連結体の N末端と C末端に連結されている融合蛋白質で構成されている。図 1 ( c ) に示されるシャぺ口ニン一抗原蛋白複合体は、 1個の抗原蛋白にシャぺ口ニンサブュニット 4連結体が連結された融合蛋白質 2個で構成されている。図 1 ( d ) に示されるシャぺ口ニン一抗原蛋白複合体は、 1個の抗原蛋白にシャぺ口ニンサブユニット 2連結体が連結された融合蛋白質 4個で構成されている。図 1 ( e ) に示されるシャぺ口ニン一抗原蛋白複合体は、 1個の抗原蛋白に 1個のシャぺ口ニンサブュニットが連結された融合蛋白質 8個で構成されている。

第 2の例は、シャぺ口ニン一抗原蛋白複合体が融合蛋白質と単独のシャぺ口ニンサブュニットから構成される場合である。ここで単独のシャぺロニンサブュニットとは、他の分子が共有結合で連結されていないシャぺ口ニンサブュニット、すなわちシャぺ口ニンサブュニットモノマーのことをいう。図 2にいくつかの例の概念図を示す。すなわち、図 2 ( a ) に示されるシャぺロニンー抗原蛋白複合体は、 1個の抗原蛋白と 1個のシャぺ口ニンサブユニットからなる融合蛋白質と、単独のシャぺ口ニンサブユニット 7個で構成されている。図 2 ( b ) に示されるシャぺ口ニン一抗原蛋白複合体は、 1個の抗原蛋白にシャぺロニンサプュニット 4連結体が連結された融合蛋白質と、単独のシャぺ口ニンサブュニット 3個で構成されている。図 2 ( c ) に示されるシャぺ口ニン一抗原蛋白複合体は、 1個の抗原蛋白にシャぺ口ニンサブュニット 2連結体が連結された融合蛋白質 2個と、単独のシャぺ口ニンサブユニット 2個で構成されている。図 2 ( d ) に示されるシャぺ口ニン一抗原蛋白複合体は、 1個の抗原蛋白に 1個のシャぺ口ニンサブュ-ットが連結された融合蛋白質、 2個の抗原蛋白にシャぺ口ニンサブュニット 2連結体の N末端と C末端に連結された融合蛋白質、 1個の抗原蛋白にシャぺ口ニンサブュニット 3連結体が連結された融合蛋白質、及ぴ単独のシャぺ口ニンサブュニット 2個で構成されている。

第 3の例は、シャぺ口ニン一抗原蛋白複合体が融合蛋白質とシャぺ口ニンサブユニット連結体から構成される場合である。図 3にいくつかの例の概念図を示す。すなわち、図 3 ( a ) に示されるシャぺ口ニン一抗原蛋白複合体は、 1個の抗原蛋白と 1個のシャぺロニンサブュニットからなる融合蛋白質と、シャぺ口ニンサブュニット 7回連結体で構成されている。図 3 ( b ) に示されるシャぺ口ニン一抗原蛋白複合体は、 1個の抗原蛋白と 1個のシャぺ口ニンサブュニットからなる融合蛋白質、シャぺ口ニンサブュニット 3回連結体、及びシャぺ口ニンサブユニット 4回連結体で構成されている。図 3 ( c ) に示されるシャぺロニン一抗原蛋白複合体は、 2個の抗原蛋白がシャぺ口ニンサブュニット 5連結体の N末端と C末端に連結されている融合蛋白質、及びシャぺ口ニンサブュニット 3連結体で構成されている。図 3 ( d ) に示されるシャぺ口ニン一抗原蛋白複合体は、 2個の抗原蛋白がシャぺ口ニンサブュニット 2連結体の N末端と C末端に連結されている融合蛋白質、 2個の抗原蛋白がシャぺ口ニンサブュニット 4連結体の N末端と C末端に連結されている融合蛋白質、及びシャぺロェンサブュニット 2回連結体で構成されている。

第 4の例は、シャぺ口ニン一抗原蛋白複合体が融合蛋白質、単独のシャぺ口二ンサブュニット、及ぴシャぺロニンサブュニット連結体で構成されるシャぺ口ニン一抗原蛋白複合体である。図 4にいくつかの例の概念図を示す。すなわち、図 4 ( a ) に示されるシャぺ口ニン一抗原蛋白複合体は、 1個の抗原蛋白と 1個のシャぺロニンサプュニットからなる融合蛋白質、 1個の単独のシャぺ口ニンサブユニット、及び 1個のシャぺ口ニンサブュニット 6回連結体で構成されている。図 4 ( b ) に示されるシャぺ口ニン一抗原蛋白複合体は、 1個の抗原蛋白と 1個のシャぺ口ニンサブュニットからなる融合蛋白質、 2個の単独のシャぺ口ニンサブユニット、 1個のシャぺ口ニンサブユニット 2回連結体、及ぴ 1個のシャぺ口ニンサブユニット 3回連結体でされている。図 4 ( c ) に示されるシャぺ口ニン —抗原蛋白複合体は、 2個の抗原蛋白がシャぺ口ニンサブュニット 5連結体の N末端と C 末端に連結されている融合蛋白質、 1個の単独のシャぺ口ニンサブユニット、及び 1個のシャぺ口ニンサブュニット 2回連結体で構成されている。図 4 ( d ) に示されるシャぺ口ニン一抗原蛋白複合体は、 2個の抗原蛋白がシャぺ口ニンサブユニット 2連結体の N末端と C末端に連結されている融合蛋白質が 2個、 2個の単独のシャぺ口ニンサブュニット、及ぴ 1個のシャぺ口ニンサブュニット 2回連結体で構成されている。

さらに、抗原蛋白がシャぺ口ニンサブュニット連結体のシャぺ口ニンサブュニット間に連結されている場合を第 5の例として、図 5にいくつかの例の概念図を示す。図 5 ( a ) に示されるシャぺ口ニン一抗原蛋白複合体は、図 1 ( a ) に示されるシャぺ口ニン一抗原蛋白複合体の変形例である。図 5 ( b ) に示されるシャぺ口ニン一抗原蛋白複合体は、図 2 ( b ) に示されるシャぺ口ニン一抗原蛋白複合体の変形例である。図 5 ( c ) に示されるシャぺ口ニン一抗原蛋白複合体は、図 3 ( c ) に示されるシャぺ口ニン一抗原蛋白複合体の変形例である。図 5 ( d ) に示されるシャぺ口ニン一抗原蛋白複合体は、図 4 ( c ) に示されるシャぺ口ニン一抗原蛋白複合体の変形例である。

また、シャぺ口ユン一抗原蛋白複合体においては、シャぺ口ニンサブユニットと抗原蛋白との間やシャぺ口二ンサブュニット同士の連結部に蛋白質分角军酵素の切断ァミノ酸配列を設けてもよい。すなわち、この場合のシャぺ口ニンと抗原蛋白の融合蛋白質においては、抗原蛋白とシャぺ口ニンサブユニットが複数のペプチド結合を介して連結される。この場合、動物に接種されたシャぺ口ニン—抗原蛋白複合体は、生体内の蛋白質分解酵素によつて、まず、シャぺ口ニンサブュニット同士の結合部位が攻撃されてそのリング構造が徐々に破壊され、その次に、抗原蛋白とシャぺ口ニンサブユニットの結合部位が攻撃されて抗原蛋白が放出される。すなわち、抗原蛋白自身への蛋白質分解酵素の攻撃は最後となるため、該抗原蛋白の免疫原性の発揮を延長させることができる。蛋白質分解酵素の切断ァミノ酸配列としては特に限定されず、例えば、 P r e S c i s s i o nプロテアーゼ、トロンビン、 F a c t o r X a、プラスミン、キモトリプシン等の蛋白質分解酵素の認識部位が挙げられる。

次に、融合蛋白質の折り畳み因子がフォルダーゼである場合について説明する。 P P I a s e等のフォルダーゼは単量体であるので、抗原蛋白の結合部位はその N末端及び Z又は C末端である。したがって、フォルダーゼの C末端及び/又は N末端に所望の抗原蛋白を連結して融合蛋白質を形成すればよい。

また、シャぺ口ユン以外の分子シャペロンについても抗原蛋白との融合蛋白とすることにより免疫原として使用可能である。

なお、本発明の免疫原においては、融合蛋白質は必ずしも抗原蛋白の全長を含む必要はなく、抗原蛋白の一部と折り畳み因子を連結したものでもよい。すなわち、その抗原蛋白の一部によって抗原蛋白の全長と同等の免疫応答を誘導することができる場合は、抗原蛋白の一部と折り畳み因子の融合蛋白質によつて本発明の免疫原を構成することができる。例えば、抗原蛋白の特定の抗原決定基に対する抗体を取得するために本発明の免疫原を使用する場合は、その抗原決定基を含む抗原蛋白の一部と折り畳み因子を連結した融合蛋白質によって本発明の免疫原を構成すればよい。例えば、抗原蛋白の一部としては、その抗原蛋白のァミノ酸配列のうち 6残基以上を含むことが好ましい。

なお、本発明の免疫原に含まれる所望の抗原蛋白としては特に限定はなく、抗原性を有する蛋白質であれば全て適用可能である。特に好適な抗原蛋白としては、例えば、宿主細胞に有毒な抗原蛋白、精製方法が確立されていない抗原蛋白、非常に変性しやすい抗原蛋白、その他組換え体を作製することが困難な抗原蛋白、組換え体内で合成すると間違った立体構造をとつてしまう抗原蛋白が挙げられる。すなわち、これらの蛋白質はそのままでは免疫原として使用することが困難であるが、折り畳み因子との融合蛋白質とすることにより免疫原として使用可能となる。

次に、本発明の免疫原の製造方法について説明する。本発明の免疫原は、抗原蛋白と折り畳み因子の融合蛋白質を含むものである。該融合蛋白質を製造する方法としては、抗原蛋白をコードする遺伝子と折り畳み因子をコードする遺伝子を連結させた融合遺伝子を作製し、該融合遺伝子を適宜の宿主細胞内で発現させることによって融合蛋白質を合成することが挙げられる。例えば、該融合遺伝子をプラスミドベクターに組込み、該糸且換えプラスミドベクターを宿主細胞に導入して組換え体を作製する。そして該組換え体を培養して該融合遺伝子を発現させ、組換え体抽出物から融合蛋白質を得ることができる。なお、折り畳み因子がシャぺ口ニンの場合は、抗原蛋白とシャぺ口ニンサブュニットの融合蛋白質の他に、単独のシャぺ口ニンサブュニット及ぴ _/又はシャぺ口ニンサブュニット連結体力 s 必要な場合がある。これらの場合は、例えば、単独のシャぺ口ニンサブユニットをコードする遺伝子及び/又はシャぺ口ニン連結体をコードする遣伝子を宿主細胞内で別途発現させればよい。例えば、プラスミドベクタ一にこれらの遺伝子を組込んで宿主細胞に導入することができる。なお、前記融合遺伝子と、単独のシャぺ口ニンサブユニットをコードする遺伝子及び/又はシャぺ口ニン連結体をコードする遗伝子は、同一のプラスミドべクタ一上にポリシストロニックに連結してもよいし、同一の宿主内で共存 ·複製することが可能な 2種の異なるプラスミド上にそれぞれに導入して、同一の宿主内で共発現させてもよレ、。さらに、単独のシャぺ口ニンサブユニットは天然に存在するものなので、宿主細胞のゲノム D NA上のシャぺ口ニンサブュニットをコ一ドする遺伝子から転写 ·翻訳させて、宿主細胞由来のシャぺ口ニンサブユニットを供給してもよい。さらに、融合遺伝子、単独のシャぺ口ニンサブュニット、シャぺ口-ンサブュ-ット連結体をそれぞれ別の宿主細胞で発現させて、別々に精製した後に混合してもよい。どのような抗原蛋白でもシャぺロニンと融合した融合蛋白質とすれば、シャぺ口ニン一抗原蛋白複合体を形成することができる。

なお、一般に、宿主細胞に外来遺伝子を導入して発現させる際は、外来遺伝子のサイズが大きすぎる場合には宿主細胞に過度の負担がかかり、外来遺伝子の発現量が低下することがある。例えば、シャぺ口ニンサブユニット 8個でリングを構成する古細菌由来シャぺ口ニンの場合、シャぺ口ニンサブュニットをコードする遺伝子を 8個連結した遺伝子に抗原蛋白をコードする遺伝子を連結した融合遺伝子を発現させようとすると、宿主細胞の種類によっては効率的な発現ができないことがある。したがって、本発明の免疫原を構成する融合蛋白質においても、大量生産の観点ではそのサイズはできるだけ小さレ、方がよレ、。そのためには、例えば、抗原蛋白の全長ではなくその一部を折り畳み因子との融合蛋白質とすることが挙げられる。さらに折り畳み因子がシャぺ口ニンである場合は、融合蛋白質に含まれるシャぺ口ニンサブュニットの数を調節することにより、融合蛋白質のサイズをより小さくすることができる。

上記の融合遺伝子等を導入する宿主細胞としては特に限定はなく、例えば、バクテリア等の原核生物、酵母、真菌、植物、昆虫細胞、ほ乳類細胞等を使用することができる。より好適には、大腸菌等のバクテリアを宿主細胞に使用すれば、組換え体の増殖が他の宿主細胞に比べて格段に速く、融合蛋白質等を大量に生産することができる。大腸菌の場合は、融合蛋白質は細胞質へ発現されてもよいし、ペリブラズム領域へ分泌発現されてもよい。ぺリブラズム領域に折り畳み因子と抗原蛋白との融合蛋白質を分泌発現させる場合は、該融合蛋白質の 5 ' 末端に分泌シグナル配列領域を設ける必要がある。該分泌シグナル配列によって、融合蛋白質はペリブラズム領域に分泌発現される。

また、本来的に細胞内では膜に存在する折り畳み因子を用いれば、融合蛋白質の発現量がさらに向上することがある。そのような折り畳み因子の例として、 F K B P型 P P I a s eである F k p Aタイプ P P I a s eや、パープリン型 P P I a s eである S u r Aタィプ P P I a s e等が挙げられる。これらの P P I a s eは、元々は生体内においてグラム陰性菌のペリブラズム領域に存在しているものである。したがって、抗原蛋白が膜蛋白質などの場合、本来これらのタンパク質は細胞質外に発現している蛋白質であるため、上記 F k p Aタイプ P P I a s eや S u r Aタイプ P P I a s eとの融合蛋白質として発現させれば、その発現量が向上させるのに好適である。

その他の宿主細胞を用いる場合においても、その細胞質に融合蛋白質を発現させてもよいし、細胞外に分泌発現させてもよい。この際、宿主細胞と発現ベクターの組み合わせには、より好適なものを選ぶ必要がある。例えば、ほ乳類細胞系において融合蛋白質を発現する場合、発現ベクターのプロモーターは、ほ乳類細胞のゲノムから単離された、例えばマウスメタロチォネィンプロモーター等のプロモーターや、これらの細胞で成長するウイルスから単離された、例えばパキュロウィルスプロモーター、ワクシニアウィルス 7. 5 Kプロモーター等のプロモーターであることが好ましい。

プラスミドベクターを宿主細胞に導入する方法としては特に限定はなく、公知の種々の方法を用いることがでる。例えば、トランスフエクシヨンとしてリン酸カルシウム沈殿法、電気穿孔、リボソーム融合、核注入、ウィルス又はファージ感染等が挙げられる。一方、宿主細胞を用いることなく、パクテリアまたは真核生物抽出液等を用いた無細胞翻訳系（S p i r i n, A. S. , 1 9 9 1， S c i e n c e 1 1， 26 56 -26 64： F a l c o n e, D. e t a 1. , 1 9 9 1, Mo 1. C e 1 1. B i o l . 1 1, 26 56— 26 64) にて、融合蛋白質を可溶性蛋白質として発現させることも可能である。

次に、本発明の免疫原を構成する融合蛋白質を精製する方法について説明する。融合蛋白質を精製する方法は特に限定されず、従来公知の方法を用いることができる。例えば、抗原蛋白とシャぺ口ニンの融合蛋白質の場合には、以下の方法等が挙げられる。すなわち、組換え体内で融合蛋白質を発現させた後、該組換え体を回収して破砕し、細胞抽出液を回収する。細胞抽出液中の融合蛋白質を硫安塩析で回収したのち、適当な緩衝液に溶解し、ィオン交換ク口マトグラフィ一や疎水性ク口マトグラフィ一等によつて該融合蛋白質を回収する。これを限外濾過によつて濃縮したのち、濃縮液を 5〜 50 mM程度の塩化マグネシゥムと 50〜 3 00 mM程度の塩化ナトリゥム又は塩化力リゥムが含有された緩衝液を展開液としてゲル濾過をおこない、排出限界値直後のフラクションを回収することにより該融合蛋白質を精製することができる。融合蛋白質の N末端又は C末端に 6— 1 0個のヒスチジン（「ヒスチジンタグ」と呼ばれる）を連結させた場合には、ニッケル等の金属キレートカラムを用いれば、融合蛋白質の精製はより簡便で効率的となる。また用いるシャぺロニンに対する抗体を用いて、免疫沈降又はァフィ二ティークロマトグラフィーを行うことによっても迅速 '簡便に精製することができる。ただし、リング構造を形成した融合蛋白質のみを回収するには、イオン交換クロマトグラフィーとゲル濾過を組み合わせることが好ましい。シャぺ口ニンが耐熱性のものである場合には、宿主からの抽出液を 6 0 ^

~ 8 0 °Cで加熱処理することによって宿主由来の夾雑蛋白質の大部分を沈殿させて除去することができ、融合蛋白質の精製をより簡略化することができる。このとき、抗原蛋白自身が耐熱性を有していなくても、該融合蛋白質はシャぺ口ニンの内部に保持されているので変性することはない。

上記のいずれの方法によっても、得られた融合蛋白質の形態は透過型電子顕微鏡によつて観察することができる。所望の抗原蛋白がシャぺ口ニンリングの内部に収納されていると、外径約 1 4〜1 6 n m程度のシャぺ口ニン特有のリング構造が観察される。融合蛋白質のリング構造が不安定な場合は、精製の過程でマグネシウム及ぴ A T Pを存在させておくことで、リング構造をもつ融合蛋白質を効率的に回収できる。

目的とする抗原蛋白が膜結合性蛋白質又は膜貫通性蛋白質である場合には、融合蛋白質を精製した後、疎水性アルキル基がォクチル ( C 8 ) からドデシル ( C 1 2 ) である非ィオン性界面活性剤を作用させると、ミセルの直径がほぼ生体膜に相当し、シャぺ口ユン内部で正しい構造を形成しやすい。上記非イオン性界面活性剤としては、例えば、一オタチノレグルコシド、 T r i t o n X 1 0 0、 N o n i d e t P— 4 0 0、 T w e e n 2 0等が挙げられる。

シャぺ口ニン一抗原蛋白複合体が、融合蛋白質だけでなく、単独のシャぺ口ニンサブュ -ットゃシャぺロニンサブュニット連結体を含む場合は、それぞれを別々の宿主細胞で発現させて、別々に精製してから混合する方法によってもシャぺ口ニン一抗原蛋白複合体を得ることができる。

本発明の免疫原は、そのまま動物に接種しても高い免疫応答を誘導することができるが、アジュバントと混合して免疫用組成物とすることで、さらに免疫原性を高めることができる。すなわち、該免疫用組成物を用いることにより、より高効率で抗体を産生させることができる。アジュバン卜の例としては、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、アルミニウムアジュバント、百日咳菌アジュバント等が挙げられる。次に、本発明の免疫原を使用することによる抗体の製造方法について説明する。

本発明の免疫原を使用して動物に免疫する方法としては、通常公知の免疫法を用いることができる。例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ゥサギ、ィヌ、ネコ、ヒッジ、ャギ、ゥマ等の動物に、本発明の免疫原を静脈内、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内に注射等の手段で投与することで、動物を目的の抗原蛋白で免疫しうる。ポリクローナル抗体を製造する場合には、上記の方法で本発明の免疫原を動物に投与し、該動物の血液を採取し血清を得る。そして、この血清からポリクローナル抗体を取得することができる。血清からポリクローナル抗体を精製する方法としては、例えば、プロティン Aァフィ二ティーク口マトグラフィ一が挙げられる。

一方、モノクローナル抗体を製造する場合は、まず、抗体産生細胞（脾臓細胞）と骨髄腫細胞とを融合させてハイプリドーマの集団を作製する。そして該ハイプリドーマの集団から目的の抗原蛋白と結合する抗体を分泌するハイプリドーマをスクリーニングし、目的とする抗体を産生する単一クローンを分離する。この方法は細胞融合法と呼ばれ、現在では日常的にこの方法によりモノクローナル抗体の製造が行われている（富山朔二、安東民衛編「単クローン抗体実験マニュアル」、講談社発行、 1987) 。

さらに詳細には、本発明の免疫原を上記手段で免疫の対象となる動物に投与して免疫することにより、モノクローナル抗体製造のための免疫細胞、例えば、免疫後の脾臓細胞を得ることができる。さらにこの免疫細胞と動物の骨髄腫細胞とのハイプリドーマを作製し、所望する抗原決定基を認識する抗体を産生するクローンを選択し、このクローンを培養することにより目的とするモノクローナル抗体を製造することができる。この免疫細胞と細胞融合する他方の親細胞としての骨髄腫細胞としては、既に公知のものを適宜選択して用いることができ、例えば、 SP 2/0— Ag l 4、 P 3—NS 1— 1— Ag 4— 1、 M PC 1 1_45、 6. TGI . 7 (以上、マウス由来）； 210. RCY. Ag 1. 2. 3 (ラット由来）； SKO—0◦ 7、 GM15006 TG-A 12 (以上、ヒト由来) 等が挙げられる。

上記の免疫細胞とこれらの骨髄 S重細胞との細胞融合は、例えば、ケーラーとミルシュタィンの方法 (Ko e h l e r、 G. a n d Mi l s t e i n、 C. 、 Na t u r e, 256、 495 (1 975) ) 等の通常公知の方法に準じて行うことができる。より具体的には、この細胞融合は、例えば、ポリエチレンダリコール (PEG) 、センダイウィルス（HVJ) 等の通常公知の融合促進剤の存在下において、融合効率を向上させるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を必要に応じて添加した通常の培養培地中で行われ、ハイブリドーマの集団が調製される。

ハイブリドーマの集団からの所望のハイプリドーマの分離は、例えば、 HAT (ヒポキサンチン、アミノプテリン及ぴチミジン）培地等の通常の選別用培地でハイブリドーマを培養することにより行うことができる。すなわち、この選別用培地において目的とするハイブリドーマ以外の細胞が死滅するのに充分な時間をかけて培養することによりハイプリドーマの分離を行う。このようにして得られたハイプリドーマは、通常の限界希釈法により目的とするモノクローナル抗体の検索及び単一クローン化に供することができる。

得られたハイプリドーマの中から目的とするモノクローナル抗体産生株を検索するには、例えば、 E L I S A法、プラーク法、スポット法、凝集反応法、ォクタロニー法、 R I A法等の一般的な検索法を用いることができる。

ハイプリドーマは、通常の培地で継代培養することが可能であり、さらに液体窒素中で長時間保存することもできる。

ハイブリドーマから目的とするモノクローナル抗体を採取するには、ハイブリドーマを常法に従って培養して、その培養上清から得る方法や、このハイブリドーマに適合性が認められる動物に投与して増殖させ、その腹水から得る方法等を用いることができる。このようにして得られたモノクローナル抗体は、さらに塩析、ゲル濾過法、ァフィ-ティーク口マトグラフィ一等の通常の手段により精製することができる。このようにして得られたモノクローナノレ抗体は、免疫した融合蛋白質が有する抗原決定基を特異的に認識するモノクローナル抗体である。

一方近年は、抗体産生細胞 (脾臓細胞) から抗体遺伝子をクローニングすることによりモノクローナル抗体を生産する技術が開発されている。例えば、遺伝子組換え技術により

、抗体産生細胞から抗体をコードする遺伝子でファージを形質転換し、ファージ表面に目的の抗体を発現させて所望の抗体の遗伝子を簡便にスクリーニングするファージディスプレイ法が挙げられる。

ファージディスプレイ法で目的とするモノク口ーナル抗体を作製する場合には、特開平 7 - 5 0 2 1 6 7号公報に開示されている方法を用いることができる。すなわち上記の融合蛋白質で免疫した動物の抗体産生細胞から mR NAを分離し、抗体の相補性決定領域（ C D R) をはさむ部分に特異的なプライマーを用いた R T— P C R法で F a bに相当する部分を増幅し、ファージミッドベクターに組み込んで多様性を高度に保持した抗体ライブラリーを作製することができる。ヘルパーファージの存在下に F a bを発現させ、免疫抗原を用いて特異 F a. b産生クローンを濃縮及ぴ選別し、目的 F a bを大腸菌で大量に発現させる。免疫学的活性を充分に検索した後、 F c部分を含んだ発現ベクターに組込み、培養細胞に完全型 I g Gを発現させることができる。抗原蛋白としてセロトニンレセプターを用いた本発明の免疫原について、例に挙げて以下に説明する。しかしながら、本 I明は、この特定の抗原蛋白に限られるものではない。当業者であればセロトニンレセプターを他の所望の抗原蛋白と置き換えることにより不必要な実験を行うことなく本発明の利点を得ることは容易である。

セロトニン（5—ヒドロキシトリプタミンとも呼ぶ）は、セロトニン作動性神経細胞にて見られる細胞表面レセプターを介してその効果を発揮する、有効な天然に存在する神経伝達物質である。セロトニンは中枢神経系（C N S ) 及ぴ末梢系の両方で哺乳動物の体の機能に重要な役割を演じていることが明らかにされてきている。 C N Sでは脳幹を起点とするセロトニン作動性ニューロンが脳及び脊髄の殆どの領域に広がる非常に広汎性の系を形成することが解明されている。このような広汎性の系であることから、セロトニンが、生理学的応答、及び C N Sから生ずる疾病の発現、すなわち、睡眠、食餌、痛みの知覚、体温調節、血圧の調節、抑欝、分裂病等の幾つかの行動に関与していると考えられているセロトニンは末梢系においても同様に重要な役割を演じている。例えば、多くのセロトニンが胃腸系に見いだされ、セロトニンはこの系において種々の収縮、分泌、及び電気生理作用を仲介する。セロトニンに対して極めて感受性の強いもう一つの例として心血管系が挙げられる。

セロトニンは、細胞表面のレセプターに結合することにより、細胞生理学上の作用を引き起こす。現在、多数のタイプのセロトニンレセプターが存在することが確認されている。セロトニンレセプターとしては、少なくとも 4種の主要フアミリー（5—H T 1 R— 4 R) が知られており、各ファミリ一は薬理学的及び Z又は構造的な相違に基づいて分類された 8ないし 1 0のレセプターを含んでいる。各フアミリ一は、例えば、 5 - H T 1 a R 、 5— H T l b R、 5—H T l c R、 5— H T 1 d R又は 5— H T 1 e Rと称される 1又はそれ以上のタイプからなる。さらには、あるタイプのセロトニンレセプターには、 5― H T 1 d CK R又は 5— H T 1 d j3 Rのような種々のサブタイプが知られている。

多数の構造的に分化したセロトユンレセプターの存在は、サブタイプ選択性の薬理学的物質が生成され得る可能性を提供している。個々のレセプターのサブタイプは中枢末梢セ口トニン作動性系の異なった部分に特異的な作用を及ぼすよう機能し得ることから、サブタイプ選択性の薬理学的物質を開発することにより、副作用のより少ない、選択性を増した新しい治療物質が得られる。一例として或る血管系において、内皮細胞上の 5— H T 1 レセプターの刺激は血管拡張を引き起し、一方平滑筋細胞上の 5 -HT 2レセプターの刺激は血管収縮を引き起こす。いろいろな型のセロトニンレセプターの薬理作用及び臨床的知見は、例えば、グレノン（G l e nn o n RA. ) 等、ニューロサイエンス 'アンド • ビへィビフル · レビューズ (Ne u r o s c i e n c e a n d B e h a v i o r a 1 Re v i ew s) 14 (1) 卷： 35ページ（1990) に詳述されている。

セロトェンは広い体内分布を示すことから、セロトニン作動性系に影響を及ぼす薬物の開発に大きな関心が持たれている。とりわけ、レセプター特異性ァゴニスト及びアンタゴ二ストは、不安、欝、高血圧、偏頭痛、強迫性疾患、及び、癌の化学療法によって誘発される嘔吐を含む広範囲の疾病の治療薬としての関心がもたれている。セロトニンレセプタ一に対する抗体は研究上有用であるのみならず、治療薬としてのレセプター特異性ァゴニスト及ぴアンタゴニストのひとつの候補となるものである。

このようなセロトニンレセプターのひとつである 5— HT 1 a Rは 7回膜貫通性の膜蛋白質であり、現在のところ組換え蛋白質を入手することが難しく、また良い抗体を得がたい抗原蛋白として知られている。

本発明を適用して、折り畳み因子と 5— HT 1 aRとの複合体を作製し免疫原として用いれば、免疫動物において高い免疫反応が引き起こされる。とりわけ FKBP型 PP I a s eあるいはシャぺ口ニンと 5_HT 1 a Rとの融合蛋白質を作製し、これを免疫原として用いることが好適である。シャぺ口ニンとしては大腸菌シャぺ口ニン G r o ELまたは古細菌シャぺ口ニン T C Pを用いることが好適である。この場合、抗原蛋白としては、セ口トニンレセプター 5—HT 1 a Rの全長又はその 6残基以上の部分蛋白質が用いられるいずれの場合にも、 5—HT 1 a Rが折り畳み因子との融合蛋白質である場合にのみ特異的な免疫応答が見られることから、本発明の免疫原が 5— HT 1 a Rに対する免疫応答の強化に有効であることは明らかである。

本発明はいかなる抗原蛋白であっても、折り畳み因子との融合蛋白質とすることによつて、折り畳み因子を用いない対応の抗原蛋白に比べて一層高い免疫応答を引き起こすことができる。実施例以下に実施例を掲げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。

なお以下の実施例においては、分子生物学、蛋白質化学及び免疫学の分野における当業者によく知られ利用可能な多くの技術を用いているが、そのような方法は、必ずしも詳細には記載していない。酵素等の試薬類は市販のものを入手し、供給者のプロトコールに従つて使用した。その他の実験手法は、サンブルック（S amb r o o k) らのモレキユラ一 ·クローニング：ァラボラトリー 'マ二ユアノレ (Mo l e c u l a r C l o n i n g ： A L a b o r a t o r y Ma nu a l、 C SHプレス、 1989年）等に記載の方法を用いた。

(実施例 1) 大腸菌シャぺ口ニン Gr o ELと抗原蛋白の複合体からなる免疫原

1. Gr o ELとの融合蛋白質を発現するためのベクターの構築

大腸菌シャぺ口ニン G r o E Lの遺伝子の塩基配列は既知であり、その配列を配列番号 1に示した。この塩基配列情報を元に配列番号 2と 3に示されるオリゴヌクレオチドを作製した。大腸菌 HMS 1 74株（No v a g e n社）のゲノム DN Aを錶型とし、配列番号 2と 3に示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとして PC Rを行い、 G r o E L遺伝子を含む DNA断片を増幅した。なお、この増幅 DNA断片の両端には、プライマーに由来する S p e Iサイトと Xb a Iサイ卜が導入されている。この増幅 DNA断片を pT 7 Β 1 u e Tベクター（No ν a g e ri社）に TAクローニングによって導入し、塩基配列を決定したところ、配列番号 1に示される塩基配列と一致していた。

一方、互いに相補的な塩基配列をもつ配列番号 4と 5に示される合成 DNAをァニーリングさせ、 2本鎖 DN Aを調製した。該 2本鎖 DN Aは順番に、 Xb a Iサイト、プレシジョンプロテアーゼ認識部位をコードする塩基配列、 B g 1 I Iサイトを有する。この 2 本鎖 DNAを Xb a Iと B g 1 I Iで処理して回収し、あらかじめ Xb a Iと B g 1 I I で処理した pT r c 99ALTCF (P h a r ma c i a社）に導入し、プラスミド pT RC 99 -P Sを作成した。すなわち、 pTRC99- PSは、 Xb a lサイトと B g l I Iサイトの間にプレシジョンプロテアーゼの切断部位をコードする塩基配列を含む発現用プラスミドである。

次に、増幅 DNA断片が導入された p T 7 B 1 u e Tベクターを制限酵素 S p e Iと X b a lで処理し、 G r o EL遺伝子を含む DNA断片を回収した。該 DNA断片を、あらかじめ Xb a Iで処理した pTRC 99- PSに導入し、 pTr cGr o ELベクターを作製した。

次に、 pTr cGr o ELベクターを Xb a Iで処理し、再度上記増幅 D N A断片が導入された p T 7 Β 1 u e Tベクターを制限酵素 S p e Iと Xb a Iで処理することにより得た G r o EL遺伝子を含む DNA断片を導入して、 G r o E L 2回連結体を発現するべクタ一 pTr c (Gr o EL) 2を作製した。さらに同様の操作を繰り返すことにより、 G r o EL 7回連結体を発現するベクター p T r c (Gr oEL) 7を作製した。図 6に p T r c (Gr oEL) 7の構成を示す。すなわち、 pTr c (Gr oEL) 7は t r c プロモーターと r r n Bターミネータ一を有している。そして、 t r cプロモーターの下流に 7個の G r o EL遺伝子がタンデムに並んだ G r o EL 7回連結体の遺伝子、プレシジョンプロテアーゼの認識ァミノ酸配列をコードする塩基配列、及び FLAGのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。

—方、所望の抗原蛋白としてヒト由来のセロトニンレセプター 5— HT 1 a Rを選択した。 5 _HT 1 a R遺伝子の塩基配列は既知であり、その配列を配列番号 6に示した。この塩基配列情報を元に配列番号 7と 8に示されるオリゴヌクレオチドを作製した。ヒト脳 cDNAライブラリー (タカラバイオ社) を铸型とし、配列番号 7と 8に示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとして PCRを行い、 5 -HT 1 a R遣伝子を含む D N A断片を増幅した。なお、この増幅 DNA断片の両端には、プライマーに由来する B g 1 I Iサイトと Xh o Iサイトが導入されている。この増幅 DNA断片を p T 7 B 1 u e Tベクタ一に TAクローユングによって導入し、塩基配列を決定したところ、配列番号 6に示される塩基配列と一致していた。次いで、この増幅 DNA断片をあらかじめ B g 1 I Iと Xh o lで処理した pTr c (Gr oEL) 7に導入し、 G r o E L 7回連結体と 5— HT 1 a Rの融合蛋白質を発現するベクター pT r c (Gr o EL) 7 . 5HT1ARを作製した。一方、コントロールとして融合蛋白質ではなく 5 -HT 1 a R遺伝子のみを単独で組み込んだ発現ベクター pTHT 1 ARを作製した。

2. Gr o EL 7回連結体とセロトニンレセプター 5— HT 1 a Rの融合蛋白質の発現得られた発現ベクター p T r c (Gr oEL) 7 . 5 HT 1 ARで大腸菌 B L 21 (D E 3) 株（No v a g e n社）を形質転換し、 Gr oEL 7回連結体とセロトニンレセプター 5_HT l a Rの融合蛋白質を発現する組換え体を得た。得られた組換え体のコロニー 20〜2 5個を 50 OmLの 2 XYT培地（1 6 g/L 酵母エキス、 20 _§ バタトトリプトン、 1 5 g/L N a C 1 0. 1 mg/mL アンピシリン）に接種した。 25° ( 、 1 1 0 r pmで 24時間培養し、培養液を得た。培養液を 1 0000 r pmで 1 0分間遠心分離し、菌体を回収した。

得られた菌体を FLAG結合緩衝液（5 OmM トリス _HC 1 pH7. 5、 1 50 mM Na C l、 5mM Mg C l、 1 mM EDTA) に懸濁し、超音波処理を行って菌体を破砕した。この菌体破碎液を、 30000 r pmで 1時間遠心分離し、可溶画分である上清を得た。一方、コントロールとして、ベクター pTHT 1 ARを導入した大腸菌 BL 2 1 (DE 3) 株を使用して、同様の操作を行った。

大腸菌抽出液の上清と沈澱画分とを SDS— PAGEによって分析したところ、発現べクタ一 p T r c (G r o EL) 7 · 5 H T 1 ARを保持する大腸菌の抽出液サンプルのみにおいて、可溶性画分に融合蛋白質の分子量に相当する位置にバンドが検出された。一方、コントロールの発現ベクター p THT 1 A Rを保持する大腸菌の抽出液サンプルでは可溶性画分に抗原蛋白は検出されなかった。ただし、 p THT l ARを保持する大腸菌の抽出液サンプルでは不溶性画分に弱い強度のバンドが検出された。以上のことから、 5— H T 1 a R遺伝子は単独では大腸菌可溶性画分で発現することはできないが、 G r o E L 7 回連結体との融合蛋白質として発現させることで、可溶性蛋白質として発現することがわかった。

次に、得られた上淸に対して塩祈し、沈澱した融合蛋白質を回収した。沈殿を 5 OmM T r i s—HC l (pH7. 5) 緩衝液に溶解し、 5 mM M g C 1 ₂を含む 50 mM

T r i s -HC 1 (pH 7. 5) に対して透析した。透析後、透析内液を DEAE—セフ了口―ス (Am e r s h am B i o s c i e n c e†土) 及び T SKg e l S u p e r Q- 5 PWカラム (東ソ一社) によるァニオン交換クロマトグラフィー及び S u p e r o s e 6 (Am e r s h a m B i o s c i e n c e社）によるゲノレろ過によって、融合蛋白質を精製した。これにより G r o EL 7回連結体とセロトニンレセプター 5— HT 1 a Rとが融合した融合蛋白質を得ることができた。

3. 電子顕微鏡観察による融合蛋白質の構造確認

得られた G r o EL 7回連結体と 5— HT 1 a Rの融合蛋白質の構造を確認するために、以下の手順で透過型電子顕微鏡 (TEM) による観察を行った。まず、約 0. 0 5mg /mLの濃度に調整した該融合蛋白質の精製標品 1 0 Lをカーボン蒸着済み銅メッシュグリッドに固定ィ匕し、 2 %酢酸ゥラエル溶液で染色し加速電圧 75 k Vで観察した。その結果、融合蛋白質はシャぺ口ニン特有のリング構造をとつており、 5— HT l a Rは G r o ELリングの内部に 1分子ごとに格納されていることが確認された。すなわち、該融合蛋白質は天然の G r o ELと同様にリング構造の複合体を形成していることが確認された

4. プロテアーゼによる消化

得られた融合蛋白質の G r o EL 7回連結体と 5— HT 1 a Rとの間に存在するプレシジョンプロテアーゼの認識配列が、プレシジョンプロテアーゼにより認識されるかどうかを検討した。得られた融合蛋白質を 2. 5M尿素の存在下でィンキュベートした後、 50 mM K—リン酸緩衝液 (pH7. 0) に対して透析を行った。透析後の溶液にプレシジ aンプロテアーゼを作用させ、 1 5 °Cで一昼夜インキュベーションした。その後、その反応液を SDS— PAGEで分析したところ、 5— HT l a Rに相当するバンドが検出され、プレシジョンプロテアーゼによって融合蛋白質が切断されていた。一方、尿素処理を行わなかった場合は、 5— HT 1 a Rに相当するバンドは検出されず、プレシジョンプロテァーゼによって融合蛋白質は切断されていなかった。以上より、融合蛋白質は G r o EL と 5— HT 1 a Rの複合体を形成しており、そのために 5— HT 1 a Rが G r o ELによつて保護されていると考えられた。

5. 免疫原としての評価

得られた G r o EL 7回連結体と 5— HT 1 a Rの融合蛋白質の 5— HT 1 a Rに対する免疫応答を誘導する能力を、以下の手順で評価した。まず、得られた融合蛋白質と不完全フロイントアジュパントを混合して免疫用組成物を調製し、ゥサギの皮下に注射した。通常、抗体価は感作後 7 一 1 0日に上昇すると考えられているので、免疫応答の強さを評価するために、免疫後 3， 5, 7、 1 0日目に血清を回収し EL I SA法により分析した。 EL I SAでは、 9 6穴プレートに 5— HT 1 a R溶液 (Eu r o s e c r e e n S . A. 社）を添加し、 30°Cにて 3時間インキュベーションすることにより、 5— HT 1 a Rをプレート上に固定化した。リン酸緩衝液（PB S) で洗浄したのち、 PB S中の 1 %B S Aでブロックした。採取した血清を、 0. 05%トウィーン 20を含有する 1⁰/οΒ S A/PB S中で系列希釈した。希釈した血清を 5— HT 1 a Rでコーティングしたゥェルに加え、 35 o 7室温にて 1時間インキュベートした。プレートを、 0. 05%トウィーン 20 曰曰曰曰

を含有する P B後i後 Sで洗浄した後、ペルォキシダーゼ標識抗ゥサギ I g G抗体（V e c t o r社）を加え、室温にて 1時間ィンキュベートした。各ゥエルに 100 μ Lのペルォキシダーゼ基質（ABTS) 溶液（KPL社）を加え、波長 410 nmにおける吸光度（A4 10) を測定した。血清の EL I SA力価の終点は、対照ゥサギの平均値に比べて吸光度の値が 2 SD大きい血清希釈となるように設計した。対照実験として、 5— HT l aRをゥサギに注射し同様の実験を行った。その結果、 5— HT 1 a Rとシャぺ口ニンとの融合蛋白を免疫原として用いた場合、 5— HT 1 a Rのみを用いた場合に比べて、ゥサギにおいて高い免疫反応が引き起こされることが明らかになった（表 1) 。

以上より、 5— HT 1 aRJ Gr o E L 7回連結体との融合蛋白質にすることによって可溶性となり免疫原として使用可能になること、及び G r o EL 7回連結体と 5—HT 1 a Rの融合蛋白質からなる免疫原が、 5— HT 1 a Rに対する免疫応答の強化にも有効であることが明らかになった。

(表 1) G r o E L 7回連結体と融合した 5- HT 1aXtt5-HT 1sで免疫した

ゥサギの血清の EUSA 融合蛋白質 5-H T 1 a 対照 (^a)

_ ^血日 ELISA力価 ^(b) EL ISA力価 EL ISA力価

1/10 〈1/10 く 1/10

1/500 <1/10 く 1/10

1/2000 1/10 く 1/10

1/4000 1/10 〈1/10

(a)対照では不完全フロイントァジュバントのみをゥサギに注射した ₍

(b)力価は血清の希釈倍率で表されている。

(実施例 2) 古細菌シャぺ口ニン TCPと抗原蛋白の複合体からなる免疫原

1. TCP 8回連結体との融合蛋白質を発現するためのベクターの構築

超高熱性古細菌 Th e r mo c o c c u s s p. KS— 1株（J CM No. 1 1 816) のシャぺ口ニンサブユニット（TCP 3) の遺伝子の塩基配列は既知であり、その配列を配列番号 9に示した。この塩基配列情報を元に配列番号 10と 1 1に示されるオリゴヌクレオチドを作製した。 Th e r mo c o c c u s s p . KS— l株（J C M No. 1 1 8 1 6) のゲノム DNAを铸型とし、配列番号 1 0と 1 1に示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとして PC Rを行い、 TCP j8遺伝子を含む DN A断片を増幅した。なお、この増幅 DNA断片の両端には、プライマーに由来する B g 1 I Iサイトと B amH Iサイトが導入されている。この増幅 D N A断片を p T 7 B 1 u e Tベクターに TAクローニングによって導入して p T 7 (TCP j3) を作製した。 pT 7 (TCP ;3 ) に挿入されている DNA断片の塩基配列を決定したところ、配列番号 9に示される塩基配列と一致していた。次に、 p T 7 (TCP jS) を制限酵素 B g 1 I Iと B amH Iで処理し、 TCP 遺伝子を含む DNA断片を回収した。この DNA断片同士を T4DNAリガーゼによって連結し、反応液を電気泳動によって分離し、 TCP ;3遺伝子が同一方向に 2個連結した遺伝子（TCP |3) 2遺伝子を回収した。（TCP J3) 2遺伝子をあらかじめ B g 1 I Iと B amH Iで切断したプラスミド pKF 3 (タカラバイオ社）に導入し、 pKF (TCP i3) 2を作製した。同様にして、 pKF (TCP β) 2を制限酵素 B g l

I Iと B amH Iで処理し、（TCP jS) 2遺伝子を含む D N A断片を回収した。この D NA断片同士を T4DNAリガ一ゼによって連結し、反応液を電気泳動によつて分離し、

TCP 遺伝子が同一方向に 4個連結した（TCP 0) 4遺伝子を回収した。（TCP ]3 ) 4遺伝子をあらかじめ B g 1 I Iと B amH Iで切断したプラスミド pKF 3に導入し、 pKF (TCP j3) 4を作製した。同様にして、 pKF (TCP j3) 4を制限酵素 B g

I I Iと B amH Iで処理し、（TCP ） 4遺伝子を含む D N A断片を回収した。この DNA断片同士を T4DNAリガーゼによって連結し、反応液を電気泳動によつて分離し

、 TCP ]3遺伝子が同一方向に 8個連結した（TCP ） 8遺伝子を回収した。

次に、互いに相補的な塩基配列をもつ配列番号 1 2と 1 3に示される合成 DNAをァニ一リングさせ、 2本鎖 DNAを調製した。該 2本鎖 DNAは順番に、 Nd e lサイト、 B a πιΗ Iサイト、トロンビン認識部位をコードする塩基配列、 B g 1 I Iサイト、 X h ο Iサイト、 6個の連続したヒスチジン（H i sタグ）をコードする塩基配列、及び E c o R Iサイトを有する。

上記 2本鎖合成 DNAを Nd e Iと E c oR Iで処理し、あらかじめ Nd e Iと E c o R Iで処理したプラスミド p ET 2 1 d (No v a g e n社）に導入して、プラスミド p TFを作製した。さらに、プラスミド p TFを B amH Iで処理し、（TCP ^) 8遺伝子を導入してプラスミド p TCP 8を作製した。図 7に p TCP 8の構成を示す。すなわち、 p TCP 8は T 7プロモーターと T 7ターミネータ一を有する。そして、 Τ 7プロモ一ターの下流に、 8個の TCP i3遺伝子がタンデムに並んだ TCP 8回連結体（TCP β ) 8の遺伝子、トロンビンの認識ァミノ酸配列をコードする塩基配列、及び H i sタグをコードする塩基配列を含む。

一方、所望の抗原蛋白として実施例 1と同様に 5 -HT 1 a Rを選択した。実施例 1で取得した 5—HT 1 a R遺伝子を含む増幅 DNA断片を B g 1 I Iと Xh o lで処理し、あらかじめ B amH Iで処理した p TCP 8に導入し、 T C P 8回連結体と 5— HT 1 a Rの融合蛋白質を発現するベクター p TCP 8 · 5HT 1 ARを作製した。すなわち、 p TCP 8 · 5HT 1 ARによれば、 T C P /3 8回連結体がト口ンビン切断ァミノ酸配列を介して 5— HT 1 a Rが連結された融合蛋白質を得ることができる。一方、コントロールとしては実施例 1と同様に 5 -HT 1 a R遺伝子のみを単独で組み込んだ発現ベクター p THT 1 ARを使用した。

2. TCP β 8回連結体とセロトニンレセプタ一 5— HT 1 a Rの融合蛋白質の発現得られた発現ベクター pTCP 8 · 5HT 1 ARで大腸菌 B L 2 1 (DE 3) 株を形質転換し、 TCP ;3 8回連結体とセロトニンレセプター 5— HT 1 a Rの融合蛋白質を発現する組換え体を得た。

得られた組換え体の 1 0個のコロニーを 5 00mLの 2 XY T培地に接種した。 3 5 °C で培養し、菌濃度が OD 600 = 0. 6〜1. 0になった時点で I PTGを添加して発現誘導し、さらに 1 0時間培養した。実施例 1と同様にして菌体を回収した。

得られた菌体を H i sタグ結合緩衝液 (2 OmM N a—リン酸緩衝液 p H 7. 4、 500 mM N a C 1、 1 0 mM ィミダゾール）に懸濁し、超音波処理を行って菌体を破碎した。この菌体破碎液を、 1 0000 r pmで 1時間遠心分離し、可溶画分である上清を得た。一方、コントロールとして、ベクター pTHT 1 ARを導入した大腸菌 BL 2 1 (DE 3) 株を使用して、同様の操作を行った。

大腸菌抽出液の上清と沈澱画分とを SDS— PAGEによって分析したところ、発現べクタ一 p TCP 8 · 5 HT 1 ARを保持する大腸菌の抽出液サンプルのみにおいて、可溶性画分に融合蛋白質の分子量に相当する位置にパンドが検出された。一方、コントロールの発現べクタ一 p THT lARを保持する大腸菌の抽出液サンプルでは可溶性画分に抗原蛋白は検出されなかった。ただし、 pTHT 1 ARを保持する大腸菌の抽出液サンは不溶性画分に弱い強度のバンドが検出された。以上のことから、 5— HT l a R遺伝子は単独では大腸菌可溶性画分で発現することはできないが、 T C P 8回連結体との融合蛋白質として発現させることで、可溶性蛋白質として発現することがわかった。

得られた上清の一部を、 H i T r a p C h e l a t i n g 5mL カラム（Ame r s h am B i o s c i e n c e社）にアプライした。次に、上記 H i sタグ結合緩衝液で力ラムを洗浄した後、 H i sタグ溶出緩衝液 (2 OmM N a—リン酸緩衝液 p H 7. 4、 5 0 OmM N a C 1 , 5 0 OmM イミダゾール）にて融合蛋白質を溶出させた。この画分を 5 OmM Mg C l ₂、 0. 2 mM ATP、及ぴ 1 5 OmM N a C 1 を含む緩衝液に対して透析を行なった。次に、同じ緩衝液を展開液として T S KG e 1 G 4 0 0 0 (東ソ一社）によるゲルろ過クロマトグラフィーを行い、排除限界値直後のピークし、精製された TC P J3 8回連結体と 5— HT 1 a Rの融合蛋白質を得た。

3. 電子顕微鏡観察による融合蛋白質の構造確認

得られた T C P；8 8回連結体と 5 _HT l a Rの融合蛋白質の構造を確認するために、実施例 1と同様にして透過型電子顕微鏡による観察を行った。その結果、融合蛋白質はシャぺロニン特有のリング構造をとつており、 5—HT 1 a Rは TCPリングの内部に 1分子ごとに格納されていることが確認された。すなわち、該融合蛋白質は天然の TC Pと同様にリング構造の複合体を形成していることが確認された。 4. プロテア一ゼによる消ィ匕

得られた融合蛋白質の TC P j8 8回連結体とセロトニンレセプター 5— HT 1 a のとの間に存在するトロンビンプロテアーゼの認識配列が、トロンビンにより認識されるかどうかを検討した。まず、得られた融合蛋白質を 1 OmM EDTAの存在下でインキュべ一トした後、 5 OmM Kーリン酸緩衝液 (p H 7. 0) に対して透析を行った。透析後の溶液にトロンビンを作用させ、 1 5 °Cで一昼夜インキュベーションした。その後、その反応液を SD S— PAGEで分析したところ、 5— HT 1 a Rに相当するバンドが検出され、トロンビンによって融合蛋白質が切断されていた。一方、 EDTA処理を行わなかつた場合は、 5— HT 1 a Rに相当するバンドは検出されず、トロンビンによって融合蛋白質は切断されていなかった。以上より、融合蛋白質は TC Pと 5— HT 1 a Rの複合体を形成しており、そのために 5—HT 1 a Rが TCPによって保護されていると考えられた

5. 免疫原としての評価

得られた TCP 8回連結体と 5— HT 1 a Rの融合蛋白質の 5— HT 1 a Rに対する免疫応答を誘導する能力を、実施例 1と同様にして行った。その結果、 5— HT l aRと TCP /38回連結体との融合蛋白を免疫原として用いた場合、 5—HT1 a Rのみを用いた場合に比べて、ゥサギにおいて高い免疫反応が引き起こされることが明らかになった（表 2) 。よって本実施例により作製された TCP /38回連結体と 5— HT 1 a Rの融合蛋白質からなる免疫原が、 5— HT1 a Rに対する免疫応答の強化に有効であることが明らかになつた。

(表 2) TCPyS 8回連結体と融合した 5 - H 1 aXIi5-HT 1aで免疫した

ゥサギの血清の ELISA 融合蛋白質 5-H T 1 a 対照 ^ω

採血曰 ELISA力価 (^b) ELISA力価 ELISA力価

3日後 1/10 く 1/10 く 1/10

5日後 1/500 く 1/10 く 1/10

7曰後 1/2000 1/10 く 1/10

10日後 1/4000 1/10 く 1/10

(a)対照では不完全フロイントアジュバントのみをゥサギに注射した。

(b)力価は血清の希釈倍率で表されている。

(実施例 3 ) 超好熱性古細菌 T h e rmo c o c c u s s p . KS— 1由来ショートタィプ FKB P型 P P I a s e (T c FKB P 18) との融合蛋白質を発現するためのベタターの構築

1. T c FKBP 18との融合蛋白質を発現するためのベクターの構築

超好熱性古細菌 Th e r mo c o c c u s s p . K S— 1由来ショートタイプ F KB P型 PP I a s e (T c FKB P 18) (I d e n o e t a l.、 B i o c h em. J. 、 357、 465—、 2001) の塩基配列は既知であり、その配列を配列番号 14 に示した。この塩基配列情報を元に配列番号 15と 16に示されるオリゴヌクレオチドを作製した。 T c FKB P 1 8を含有するプラスミド p EFE 1— 3 (I i d a e t a l .、 G e n e, 222、 249—、 1 9 98) を铸型とし、配列番号 1 5と 1 6に示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとして PC Rを行い、 T c FKBP 1 8遺伝子を含む DN A断片を増幅した。なお、この増幅 DN A断片の両端には、プライマーに由来する N c o Iサイトと S p e Iサイトが導入されている。この増幅 DNA断片を p T 7 B 1 u e Tベクターに TAクローニングによって導入し、塩基配列を決定したところ、配列番号 14に示される塩基配列と一致していた。

一方、配列番号 1 7及ぴ 1 8に示されるオリゴヌクレオチドを合成した。これらのオリゴヌクレオチドは互いに相補的な配列を有している。これらのオリゴヌクレオチドをァ二一リングして、 2本鎖の DNA断片 Th r om-F 2を作成した。 Th r om— F 2は S p e Iサイト、トロンビンの切断アミノ酸配列をコードする塩基配列、 B amH Iサイト、 Nd e Iサイト、および E c 0 R Iサイトを含んでいる。

得られた T c FKB P 1 8遗伝子を含む DN A断片を N c o lと S p e lで、 Th r o m— F 2断片を S p e Iと E c o R Iで処理し、それぞれの D N A断片を回収した。回収したそれぞれの D N A断片を、あらかじめ N c o Iと E c o R Iにて処理したプラスミド p ET 2 1 d (No v a g e n社) に、 T c FKB P I S遺伝子一 T h e r mo— F 2断片の順で導入し、 T c FKB P 1 8との融合蛋白質を発現できるプラスミド T c FK f u s i o n 2を構築した。図 8に T c F K f u s i ο η 2の構成を示す。すなわち、 T c F K f u s i o n 2は T 7プロモーターと Τ 7ターミネ一ターを有している。そして、 Τ 7 プロモーターの下流に T c FKB P 1 8遺伝子、トロンビンの認識アミノ酸配列をコードする塩基配列、及び p ET 2 1 d由来のマルチクローユングサイトを含む。そして、目的の抗原蛋白の遗伝子を T c FK f u s i o n 2のマルチクローニングサイトに導入することにより、 T c FKB P 1 8と抗原蛋白の融合蛋白質を得ることができる。

一方、所望の抗原蛋白として実施例 1及び 2と同様に 5— HT 1 a Rを選択した。ただし、 5—HT 1 a R遺伝子を取得するための P CRは、配列番号 1 9及ぴ 20に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用した。これにより、 5— HT 1 a R遺伝子の 5' 末端に N d e Iサイト、 3 ' 末端に H i sタグをコードする塩基配列と S a c Iサイトが導入された。この増幅 DNA断片を pT 7 B l e Tベクターに T Aクローニングによつて導入し、塩基配列を決定したところ、配列番号 6に示される塩基配列と一致していた。次いで、この増幅 DNA断片をあらかじめ Nd e Iと S a c Iで処理した T c FK f u s i o n 2に導入し、 T c FKB P 1 8と 5— HT 1 a Rの融合蛋白質を発現するベクター T c FK f u s i o n 2 · 5HT 1 a Rを作製した。

2. T c FKB P 1 8とセロト-ンレセプター 5— HT 1 a Rの融合蛋白質の発現得られた発現ベクター T c FK f u s i ο η 2 · 5HT 1 a Rで大腸菌 BL 2 1 (DE 3) 株を形質転換し、 T c FKBP 1 8とセロトニンレセプター 5— HT 1 a Rの融合蛋白質を発現する糸且換え体を得た。

得られた組換え体 1〜2白金耳を 70 OmLの 2 XYT培地に接種した。 3 5°C、 1 1 0 r p mで 24時間培養し、培養液を得た。培養液を l O O O O r pmで 1 0分間遠心分離し、菌体を回収した。得られた菌体を H i sタグ結合緩衝液 (2 OmM N a—リン酸緩衝液 p H 7. 4、 500 mM N a C 1、 1 0 mM ィミダゾール）に懸濁し、超音波処理を行って菌体を破碎した。この菌体破碎液を、 l O O O O r pmで 1 0分間遠心分離し、可溶画分である上清を得た。この上清の一部を SDS— PAGEによって分析したところ、 T c FKB P I Sと 5 -HT 1 a Rの融合蛋白質の分子量に相当する位置にバンドが検出された。さらに、このバンドについて抗セロトニンレセプター抗体（コスモバイォ社）を用いてウェスタンブロッテイングを行い、このバンドが 5—HT 1 a Rを含んでいることを確認した。

得らた上清の一き βを、 H i T r a p Ch e l a t i n g 5mL カラム（Ame r s h am B i o s c i e n c e社）にアプライした。次に、上記 H i sタグ結合緩衝液でカラムを洗浄した後、 H i sタグ溶出緩衝液にて T C FKB P 1 8と 5— HT 1 a R の融合蛋白質を溶出させた。

3. 免疫原としての評価

得られた T c FKB P 1 8と 5— HT 1 a Rの融合蛋白質の 5— HT 1 a Rに対する免疫応答を誘導する能力を、実施例 1と同様にして行った。その結果、 T c FKBP 1 8と 5-HT 1 a Rとの融合蛋白を免疫原として用いた場合、 5— HT 1 a Rのみを用いた場合に比べて、ゥサギにおいて高い免疫反応が引き起こされることが明らかになった（表 3 ) 。よって本実施例により作製された T c FKB P 1 8と 5— HT 1 a Rの融合蛋白質からなる免疫原が、 5— HT 1 a Rに対する免疫応答の強化に有効であることが明らかになつた。 (表 3) T c FKBP 1 8と融合した 5-HT 13または5-1~1丁 1aで免疫したゥサギの血清の EUSA 融合蛋白質 5-H T 1 a 対照 (^a)

採血曰 ELISA力価 ^(b) ELISA力価 EUSA力通

3曰後 1/10 く 1/10 く 1/10

5曰後 1/500 く 1/10 く 1/10

7曰後 1/2000 1/10 く 1/10

10曰後 1/4000 1/10 く 1/10

(a)対照では不完全フロイントアジュバントのみをゥサギに注射した _c

(b)力価は血清の希釈倍率で表されている。

産業上の利用可能性

本発明の免疫原によれば、種々の原因により有効な免疫応答を誘導できないとされている抗原蛋白であっても、十分な免疫応答を誘導することができる。したがって、所望の抗原蛋白に対する抗体をより確実に製造することができる。

Claims

請求の範囲

1 . 所望の抗原蛋白に対する免疫応答を誘導するための免疫原であって、前記抗原蛋白の全長又は一部と、折り畳み因子又はそのサブユニットが、 1又は複数のペプチド結合を介して連結された融合蛋白質を含む免疫原。

2 . 前記折り畳み因子が複数のシャぺ口ニンサブュニットにより構成されるシャぺロニンであることを特徴とする請求の範囲第 1項に記載の免疫原。

3 . 前記シャぺ口ニンサブユニットの一部又は全部は、互いにペプチド結合を介して直列に連結されていることを特徴とする請求の範囲第 2項に記載の免疫原。

4 . 前記抗原蛋白は、前記シャぺ口ニンサブユニットの N末端及びノ又は C末端に連結されていることを特徴とする請求の範囲第 2項又は第 3項に記載の免疫原。

5 . 前記抗原蛋白は、前記シャぺ口ニンサブユニット同士の間に連結されていることを特徴とする請求の範囲第 3項又は第 4項に記載の免疫原。

6 . 前記シャぺ口ニンサブュニットと前記抗原蛋白との間に蛋白質分解酵素の切断アミノ酸配列を有することを特徴とする請求の範囲第 2項乃至第 5項のいずれかに記載の免疫原。

7 . 前記シャぺ口ニンサブュ-ット同士の連結部に蛋白質分解酵素の切断アミノ酸配列を有することを特徴とする請求の範囲第 3項乃至第 6項のいずれかに記載の免疫原。

8 . 前記シャぺ口ニンサブユニットは、バクテリア、古細菌又は真核生物に由来することを特徴とする請求の範囲第 2項乃至第 7項のいずれかに記載の免疫原。

9 . 前記抗原蛋白は、前記シャぺ口ニンサブュニットが形成するシャぺロニンリングの内部に格納されていることを特徴とする請求の範囲第 2項乃至第 8項のいずれかに記載の免疫原。

1 0 . 前記シャぺ口ニンリングは、 5〜1 0個のシャぺ口ニンサブュニッ卜から構成されることを特徴とする請求の範囲第 9項に記載の免疫原。

1 1 . 2個のシャぺ口ニンリングがリング面又は側面を介して非共有結合的に会合していることを特徴とする請求の範囲第 9項又は第 1 0項に記載の免疫原。

1 2 . 前記折り畳み因子がフォルダーゼであることを特徴とする請求の範囲第 1項に記載の免疫原。

1 3 . 前記抗原蛋白が前記フォルダーゼの N末端及ぴ Z又は C末端に連結されていることを特徴とする請求の範囲第 1 2項に記載の免疫原。

1 4 . 前記フォルダーゼが P P I a s eであることを特徴とする請求の範囲第 1 2項又は第 1 3項に記載の免疫原。

1 5 . 前記 P P I a s eが大腸菌又は古細菌に由来することを特徴とする請求の範囲第 1 4項に記載の免疫原。

1 6 . 前記抗原蛋白は、セロトニンレセプター 5—H T 1 a Rであることを特徴とする請求の範囲第 1項乃至第 1 5項のいずれかに記載の免疫原。

1 7 . 前記融合蛋白質は、セロトニンレセプター 5 _ H T 1 a Rの全長又は 6残基以上の部分蛋白質を含有することを特徴とする請求の範囲第 1 6項に記載の免疫原。

1 8 . 前記抗原蛋白の全長又は一部をコードする遺伝子と前記折り畳み因子又はそのサブュニットをコードする遺伝子とを含有する融合遺伝子を転写 ·翻訳することにより製造されることを特徴とする請求の範囲第 1項乃至第 1 7項のいずれかに記載の免疫原。

1 9 . 前記抗原蛋白の一部をコードする遺伝子は、該抗原蛋白の 6残基以上の部分蛋白質をコードする遺伝子であることを特徴とする請求の範囲第 1 8項に記載の免疫原。

2 0 . 請求の範囲第 1項乃至第 1 9項のいずれかに記載の免疫原とアジュパントとを混合してなる免疫用,組成物。

2 1 . 請求の範囲第 1項乃至第 1 9項のいずれかに記載の免疫原をヒトを除く動物に免疫し、該動物から抗原蛋白に特異的な抗体を採取することを特徴とする抗体の製造方法。

2 2 . 請求の範囲第 2 0項に記載の免疫用組成物をヒトを除く動物に免疫し、該動物から抗原蛋白に特異的な抗体を採取することを特徴とする抗体の製造方法。