WO2004093900A1 - アポトーシス誘導剤及びアポトーシス誘導方法 - Google Patents

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fir
cell
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Hideaki Shimada
Kazuyuki Matsushita
Takeshi Tomonaga
Fumio Nomura
Takenori Ochiai
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    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • the present invention relates to an apoptosis inducer and an apoptosis induction method. More specifically, the present invention relates to a drug for inducing apoptosis in cells (for example, cancer cells) whose presence is harmful to the host animal, and apoptosis induction and cancer treatment method using this drug.
  • apoptosis inducer for example, cancer cells
  • apoptosis induction and cancer treatment method using this drug for example, cancer cells
  • Apoptosis is cell death that is actively caused by the cell itself under physiological conditions, and is clearly distinguished from cell death (necrosis: necrosis) due to environmental deterioration.
  • This apoptosis is characterized by morphological features such as chromosome aggregation of cell nucleus, fragmentation of cell nucleus, disappearance of cell surface microvilli, aggregation of cytoplasm and the like.
  • Cells that have undergone apoptosis shrink, and the cell contents are not released to the outside but are rapidly taken up by the surrounding cells, so that inflammation is not caused and the surrounding cells are not affected. Therefore, many attempts have been made to treat diseases by inducing apoptosis in cells whose presence is harmful to the host organism (for example, cancer cells).
  • the means and factors that induce apoptosis include, for example, darcocorticoid treatment, cytotoxic T cell damage, hormone-dependent tissue atrophy, irradiation, NK cells, killer cells, tumor necrosis factor (TNF) Lymphotoxin
  • c-Myc protein encoded by c-myc gene is not only important for cell proliferation and differentiation, cell cycle and life activity of cells, but also deeply for tumor cell transformation (transformation). Is involved. Increased expression of c-Myc protein is observed in many cancer tissues, and cell tumorigenesis is observed by c-myc gene transfer. Furthermore, this c-Myc protein is also associated with apoptosis, and apoptosis is induced regardless of whether the intracellular expression level of c-Myc protein increases or decreases (Thompson, E. B. Ann. Rev.
  • Apoptosis is induced when c-myc antisense oligonucleotide is introduced into several types of cells (Thompson, EB, Ann. Rev. Physiol. 60: 575-600, 1998).
  • IL-3 dependent bone marrow cells induce apoptosis when IL-3 is depleted and the C-myc gene is forcibly expressed (Ask, DS et al., Oncogene 6: 1915-1922, 1991)
  • Apoptosis is also induced when c-myc gene is forcibly expressed in Rati fibroblasts in serum-free medium (Evan, GI et al., Cell 69: 119-128, 1992) ⁇
  • This c-Myc protein is produced by transcription of the c_myc gene, and the c-myc gene is strictly regulated by many transcription factors, but there is an unclear point about how it is regulated by transcription.
  • the APC adenomatous polyposis coli
  • APC protein inhibits its action by binding to / 3 catenin, which is stabilized by the Wnt / Wingless signaling pathway.
  • j3catenin activates transcription of c-myc gene by binding to transcription factor Tci / Lei. Therefore, if an abnormality occurs in the APC gene, the activity of / 3 catenin cannot be suppressed, and the c-myc gene is activated continuously, causing cell proliferation.
  • c-Myc protein expression is influenced by many transcription factors in addition to the Wnt / Wingless signaling pathway.
  • human promyelocytic leukemia cell HL60 is ⁇ S0
  • the FBP protein itself has a strong transcriptional activity and has been shown to regulate the c-myc gene (Bazar, L. et al., J. Biol. Chem., 270 : 8241-8248, 1995; Duncan, R. et al., Genes Dev., 8: 465-480, 1994; Mic elotti, GA et al., Mol. Cell. Biol. 16: 2656-2669, 1996). Furthermore, FIR (FBP Interacting Repressor) was identified as a protein that binds (interacts with) this FBP protein (Liu, J. et al., Mol. Cell, 5: 331-341, 2000).
  • c-Myc protein is deeply involved in canceration and apoptosis of cells, and is expected to kill cancer cells by controlling its expression.
  • C-Myc protein induces apoptosis regardless of whether its expression level increases or decreases, and thus it is not easy to induce apoptosis by controlling its expression.
  • a method using the antisense strand of darcocorticoid C-myc gene has been proposed as a means of inducing apolysis by suppressing the expression of c-Myc protein (Thompson, EB, Ann. Rev. Physiol). 60: 575-600, 1998; Thulasi, R., et al., J. Biol. Chem.
  • an object of the present invention is to provide a new means for stably and reliably inducing cell apoptosis by targeting the C-myc gene.
  • FUSE binding protein which binds to the transcription factor FUSE (Far Upstream Element) upstream of the c-myc gene
  • FIR FBP Intracing Repressor
  • the present invention includes the following inventions.
  • An apoptosis inducer containing a protein that interacts with FBP protein as an active ingredient (1) An apoptosis inducer containing a protein that interacts with FBP protein as an active ingredient.
  • a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing;
  • a protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing and having apoptosis-inducing activity; or a partial peptide thereof (1) The apoptosis-inducing agent described in).
  • An apoptosis inducer containing, as an active ingredient, a polynucleotide encoding a protein that interacts with the FBP protein.
  • polynucleotide comprising a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, wherein the polynucleotide encoding a protein that interacts with the FBP protein;
  • the apoptosis-inducing agent according to (3) which is a nucleotide; or a partial fragment thereof.
  • the apoptosis-inducing agent according to (5), wherein the form that can be introduced into cells is a vector.
  • a method for inducing apoptosis in a cell proliferating by c-niyc gene expression comprising a step of contacting the cell with the apoptosis-inducing agent according to any one of (1) to (7). To induce apoptosis.
  • a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing; one or several amino acids deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing
  • a method for treating cancer comprising administering an effective amount of a protein comprising the above-described amino acid sequence and having apoptosis-inducing activity; or a partial peptide thereof.
  • a polynucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing; a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing; and a string
  • a method for treating cancer comprising administering an effective amount of a polynucleotide that hybridizes under mild conditions and encodes a protein having apoptosis-inducing activity; or a fragment thereof.
  • protein that interacts with FBP protein means a protein that binds to FBP protein and suppresses the function of FBP protein (ie, transcriptional activity of C-myc gene). To do.
  • the “form in which the polynucleotide can be introduced into the cell” means a form in which the polynucleotide is introduced into the cell and the protein or peptide encoded by the polynucleotide can be expressed.
  • Protein and “peptide” mean a molecule composed of a plurality of amino acid residues linked to each other by amide bonds (peptide bonds).
  • Polynucleotide refers to a nucleoside phosphate ester (ATP, GTP, CTP, ⁇ ; or dATP, dGTP ⁇ dCTP, dTTP) in which purine or pyrimidine is linked to the sugar by / 3-N-daricoside linkage.
  • oligonucleotide is 2-99 linked. Divided.
  • Fig. 1 shows the results of CAT assay for examining whether FIR protein has the ability to suppress c-myc transcription.
  • FIG. 2 shows fluorescence micrographs of HeLa cells transfected with the full-length FIR gene (HA-FIR) or its deletion mutant (HA-FIRAN77) visualized by immunohistochemical staining of c_Myc protein. is there.
  • FIG. 3 shows flow cytometry analysis (two-color FACScan analysis) of C-Myc protein for HeLa cells into which full-length FIR gene (HA-FIR) or its deletion mutant (HA-FIRAN77) has been introduced. Shows the results of quantification of expression
  • Fig. 4 is a fluorescence micrograph showing the induction of apoptosis in HeLa cells into which the full-length FIR gene (HA-FIR) or its deletion mutant (HA-FIRAN77) was introduced.
  • Fig. 5 shows that apoptotic cells were analyzed by flow cytometry analysis (two-color FACScan analysis) of HeLa cells into which full-length FIR gene (HA-FIR) or its deletion mutant (HA-FIRAN77) was introduced. Show the quantified result
  • FIG. 6 is a fluorescence micrograph showing the expression of FIR protein and c-Myc protein visualized by immunohistochemical staining of HeLa cells into which only the FIR gene and both the FIR gene and the c-myc gene were introduced.
  • Figure 7 is a fluorescence micrograph of apoptosis induction in HeLa cells into which only the FIR gene and both the FIR gene and the c-myc gene were introduced.
  • FIG. 8A shows the results of immunoblotting analysis of FIR protein levels in large intestine tumor tissue (T) and non-tumor tissue (N).
  • Figure 8B shows the results of ⁇ -PCR performed on the total RNA of tumor tissue (T) and non-tumor tissue (N) of the large intestine.
  • FIG. 8C shows a histogram of FIR mRNA expression levels in colon tumor tissue (T) and non-tumor tissue (N) detected by real-time quantitative PCR.
  • Figure 8D shows the correlation between the expression ratio of FIR and C-myc mRNA in the tumor tissue (T) / non-tumor tissue (N) in the large intestine.
  • Figure 9 shows the expression of c-Myc protein in HeLa cells into which full-length FIR gene (FIR wild type) and FIR mutants derived from colon cancer tissues (118T-FIR mutant, 28T-FIR mutant) were introduced. Is a fluorescence micrograph visualized by immunohistochemical staining.
  • Figure 10 shows the fluorescence of the apoptotic induction of HeLa cells into which full-length FIR gene (FIR wild type) and FIR mutants derived from colon cancer tissues (118T-FIR mutant, 28T-FIR mutant) were introduced. It is a micrograph.
  • Figure 11 shows a graph of the survival rate of cervical cancer (HeLa) and esophageal cancer (T. Tn) cells measured by MTT assay.
  • Figure 12 shows immunoblotting of FIR protein expression in the nucleus and cytoplasm in colon cancer (SW480, DLD1), cervical cancer (HeLa), and esophageal cancer (T. Tn) cell lines after infection with FIR adenovirus vector. Shows the result of analysis.
  • SW480, DLD1 colon cancer
  • HeLa cervical cancer
  • T. Tn esophageal cancer
  • the apoptosis-inducing agent of the present invention comprises, as an active ingredient, a protein encoding a protein that interacts with FBP protein or a protein that interacts with FBP protein. It is characterized by containing renucleotide in a form that can be introduced into cells.
  • proteins that interact with the above FBP protein include human FIR protein (Liu, J. et al., Mol. Cel l, 5: 331-341, 2 000; Liu, J. et al. al., Cell, 104: 353-363, 2001; GenBank / NM_14281), human SIA HBPl (siah bind ing prote in 1: GenBank / BC008875), human SIAHBP 1 transcriptional variant 1 (GenBank / NM— 078480) ), Human SIAHBP 1 transcription variant 2 (GenBank / NM_01 4281) and the like.
  • human FIR protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is particularly preferable.
  • the human FIR protein used in the present invention consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and has an apoptosis-inducing activity. Protein is also included.
  • the number of amino acids that may be deleted, substituted or added is preferably 1 to several.
  • 1 to 10, preferably 1 to 5 amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 may be deleted, and 1 to 10 amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, preferably 1 to Five amino acids may be added, or 1 to 10, preferably 1 to 5 amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 may be substituted with other amino acids.
  • Deletion, addition and substitution of amino acids can be performed by modifying a gene encoding the above protein by a technique known in the art.
  • Mutation can be introduced into a gene by a known method such as the Kunkel method or the Gapped duplex method or a method equivalent thereto, for example, a mutation introduction kit using site-directed mutagenesis (for example, Mutant-K (TAKARA) or Mutant-G (TAKARA)), or the TAKARA LA PCR in vitro Mutagenes is series kit is used to introduce mutations.
  • TAKARA Mutant-K
  • TAKARA Mutant-G
  • TAKARA LA PCR in vitro Mutagenes is series kit is used to introduce mutations.
  • apoptosis-inducing activity refers to the activity of contracting cells and fragmenting the nucleus. For example, this activity introduces genes into HeLa cells and overexpresses them, resulting in changes in the morphology of the cells. This can be confirmed by observation and FACS analysis.
  • “having apoptosis-inducing activity” means substantially equivalent to the activity retained by the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • Peptides containing partial amino acid sequences in the above proteins are also included in the scope of the present invention.
  • the number of amino acids constituting such a partial peptide is at least 10 or more, preferably 30 or more, more preferably 80 or more.
  • the above protein or a partial peptide thereof can be provided in the form of a salt, preferably in the form of a physiologically acceptable acid addition salt, if necessary.
  • Such salts include salts of inorganic acids (eg hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid), organic acids (eg acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, tartaric acid). , Succinic acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like.
  • inorganic acids eg hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, tartaric acid.
  • Succinic acid malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid
  • the above protein can be chemically synthesized based on a known amino acid sequence (for example, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in the case of FIR protein), in vitro transcription from an expression vector, or transformed cells by an expression vector. It can be obtained by a method such as isolation and purification as an expression product.
  • an expression vector having a polymerase promoter may be added to an in vitro translation system such as a rabbit reticulocyte lysate or wheat germ extract containing an RNA polymerase corresponding to the promoter.
  • the protein can be produced in vitro.
  • RNA polymerase promoters include T7, T3, and SP6.
  • RNA polymerase promoters examples include pKAl, pCDM8, pT3 / T718, pT7 / 319, and pBluescript II.
  • a protein when expressed in a microorganism such as E. coli, the protein is encoded in an expression vector having an origin, promoter, ribosome binding site, DNA cloning site, and night and night that can be replicated in the microorganism. Recombine DNA fragments to create an expression vector.
  • transformant cells that express the protein can be obtained, and by culturing this transformant, the target protein can be mass-produced from the culture. . Examples of expression vectors for E.
  • coli include PUC, pBluescript II, pET expression system, and pGEX expression system. Furthermore, when a protein is expressed in a eukaryotic cell, the DNA fragment encoding the protein is inserted into an expression vector for a eukaryotic cell having a promoter, a splicing region, a poly (A) addition site, etc. Vector Make one. When this vector is introduced into a eukaryotic cell, a transformed eukaryotic cell expressing the target protein can be obtained. Examples of expression vectors include pKAl, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV vector, pRS, and pYES2.
  • mammalian cultured cells such as human fetal kidney cells HEK293, monkey kidney cells C0S7, Chinese hamster ovary cells CH0, or primary cultured cells isolated from rabbit organs can be used. Saccharomyces cerevisiae, fission yeast, silkworm cells, and Xenopus egg cells can also be used.
  • known methods such as electroporation, calcium phosphate method, ribosome method, DEAE dextran method and the like can be used.
  • known separation operations can be combined.
  • treatment with denaturing agents and surfactants such as urea, sonication, enzyme digestion, salting out solvent precipitation method, dialysis, centrifugation, ultrafiltration, gel filtration, SDS-PAGE, isoelectric focusing,
  • denaturing agents and surfactants such as urea, sonication, enzyme digestion, salting out solvent precipitation method, dialysis, centrifugation, ultrafiltration, gel filtration, SDS-PAGE, isoelectric focusing
  • examples include ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, affinity mouth chromatography, and reverse phase chromatography.
  • the partial peptide can be produced by a known peptide synthesis method or by cleaving the above protein with an appropriate peptidase (eg, trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase).
  • an appropriate peptidase eg, trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase.
  • a peptide synthesis method for example, either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method may be used.
  • the polynucleotide used for the apoptosis-inducing agent of the present invention is preferably a polynucleotide encoding the human FIR protein having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • a polynucleotide encoding a human FIR protein used in the present invention or hybridized under stringent conditions with a polynucleotide consisting of a base sequence complementary to the polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and inducing apoptosis
  • a polynucleotide encoding a protein having activity is included.
  • One example is a condition in which a complementary strand of DNA consisting of a base sequence is hybridized and a complementary strand of a nucleic acid having a lower homology is not hybridized. More specifically, it refers to a condition in which the sodium concentration is 150 to 900 mM, preferably 600 to 900 mM, and the temperature is 60 to 68 ° C, preferably 65 ° C.
  • Genomic RNA encoding each of the above proteins, III RNA which is a transcription product of genomic DNA, cDNA synthesized using this mMA as a cage, and the like can be used, and cDNA is particularly preferable.
  • This cDNA can be obtained by a known method using the aforementioned known sequence.
  • a cDNA library is synthesized using a known method (Mol. Cell Biol. 2, 161-170, 1982; J. Gene 25, 263-269, 1983; Gene, 150, 243-250, 1994).
  • the target cDNA can be isolated using the probe DNA prepared based on the base sequence of the aforementioned known sequence (for example, SEQ ID NO: 1 encoding FIR protein).
  • the obtained cDNA can be obtained, for example, by PCR (Polymerase Chain Reaction) method, NASBN (Nucleic acid sequence based amplification) method, TMA
  • Amplification can be performed by a commonly performed gene amplification method such as (Transcription-mediated amplification) method or SDA (Strand Displacement Amplification) method.
  • a necessary amount of each cDNA can also be obtained by RT-PCR method using a primer set prepared based on a known sequence and using mRNA isolated from human cells as a saddle type.
  • Primer sets are commercially available software for primer design, such as OligoTM
  • Proteins can be made into a form that can be introduced into cells, for example, by changing the structure and function of the protein and mixing it with a pharmacologically acceptable carrier solution to prepare a protein.
  • Such a drug can be introduced into cells by, for example, microinjection for invitro cells.
  • lipid intracellular introduction methods BioPORTE (Gene Therapy Systems, USA), Chariot (Active Motif, USA), etc.
  • the protein (polypeptide) can be introduced into the cell by using a fusion polypeptide in which a peptide passing through the cell membrane is linked to the N-terminal side of the protein (polypeptide). By providing this cell membrane-passing peptide, the protein passes through the cell membrane and is taken into the cell.
  • HIV-1 ⁇ TAT PTD protein transduction ion domain
  • Drosophila homeobox protein antenna PTD can be used as the cell membrane transit peptide.
  • the amino acid sequence and the nucleotide sequence of the cDNA are known (Science, 285: 1569-1572, 1999; GenBank Accession NO. U39362 M96155) and correspond to the PTD.
  • a fusion DNA fragment is created by ligating the A fragment encoding the region (amino acid sequence 47 to 57 of HIV ⁇ TAT) with d) NA described above, and expressing this fusion DNA fragment in a host cell such as E. coli.
  • a fusion polypeptide can be prepared by linking a PTD peptide to the N-terminal side.
  • PTDs of antenna pedia are also known (for example, GenBank Accession No.
  • a fusion polypeptide in which PTDs are linked can be similarly prepared.
  • a fusion polypeptide in which a cell membrane-passing peptide is linked by a method of binding a polypeptide and a PTD peptide via a divalent cross-linking agent for example, EDC, i3-alanine, etc.
  • a divalent cross-linking agent for example, EDC, i3-alanine, etc.
  • the polynucleotide can be made into a form that can be introduced into a cell, for example, by incorporating it into an expression vector.
  • an expression vector a known eukaryotic expression vector having a promoter, a splicing region, a poly (A) addition site, etc. can be used, and the aforementioned polypeptide is encoded at the cloning site of this expression vector.
  • a polypeptide expression vector can be constructed by inserting a polynucleotide.
  • This expression vector can be introduced into cells by known methods such as electroporation, calcium phosphate method, ribosome method and DEAE dextran method for in vitro cells (cultured cells).
  • in vivo cells ie, cells within an animal individual
  • viral or non-viral genes for the purpose of promoting uptake into cells and increasing directivity to target cells. It can be introduced into cells by means such as vectors
  • the drug in such a form can be introduced into a living body for gene therapy (for example, JP 2003-24092 A, JP 2003-501445 A, etc.).
  • viral vectors include adenovirus vectors, retrovirus vectors, lentivirus vectors, AAV (adeno-associated virus) vectors, vaccinia virus vectors, human immunodeficiency virus (HIV) vectors, herpes virus vectors, etc. Is mentioned.
  • non-viral vectors examples include high-molecular compounds such as ribosomes, artificial lipid vesicles, hollow nanoparticles, and dendrimers.
  • introduction reagents lipofectin, ribofectamine, MRIE-C (manufactured by Invitrogen), Metafectene, DOTAP (manufactured by BioTex), T fx reagent (manufactured by Promega) and the like can be used.
  • Apoptosis is a physiological cell death that is indispensable for normal development and differentiation, and occurs in individual cells during cell rotation of normal living tissues. Therefore, it has been found that excessive reduction in apoptosis can cause many functional problems. Therefore, the apoptosis inducer of the present invention can be used as a therapeutic and / or prophylactic agent for diseases caused by a decrease in apoptosis.
  • Typical diseases caused by a decrease in apoptosis include malignant tumors (stomach cancer, colon cancer, breast cancer, lung cancer, esophageal cancer, prostate cancer, liver cancer, kidney cancer, bladder cancer, skin cancer, uterine cancer, brain tumor Leukemia, autoimmune diseases (eg type I diabetes, multiple sclerosis, systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis), viral infections (eg HIV infection), But not limited to hepatitis.
  • the apoptosis-inducing agent of the present invention can be prepared in various pharmaceutical forms and administered systemically or locally orally or parenterally.
  • this drug When this drug is administered orally, it can be formulated into tablets, capsules, granules, powders, pills, water for internal use, suspensions, emulsions, syrups, etc., or redissolved when used. It may be a product.
  • this drug when administered parenterally, it is formulated into intravenous injections (including infusion), intramuscular injections, intraperitoneal injections, subdermal injections, suppositories, etc. Provided in unit-dose ampoules or multi-dose containers.
  • compositions include excipients, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, lubricants, surfactants, dispersants, buffers, preservatives, solubilizers, preservatives,
  • a flavoring agent, a soothing agent, a stabilizer, a tonicity agent and the like can be appropriately selected and produced by a conventional method.
  • the dosage of the apoptosis-inducing agent of the present invention varies depending on the age of administration subject, administration route, number of administrations, symptoms, dosage form, etc., but the therapeutically effective amount of protein or polypeptide
  • an effective amount is in the range of about 0.001 to 30 mg / kg body weight, preferably about 0.01 to 25 nig / kg body weight, more preferably about 0.1 to 20 mg / kg body weight, even more preferably about 1 -10 mg / kg, 2-9 mg / kg, 3-8 mg / kg, 4-7 mg / kg or 5-6 mg / kg body weight,
  • a polynucleotide encoding a protein is introduced by a method such as gene therapy, a polynucleotide capable of expressing the protein in the above range may be administered.
  • the apoptosis-inducing method of the present invention is characterized in that the apoptosis-inducing agent is brought into contact with a cell proliferating by C-niyc gene expression.
  • the method of the present invention can actually be applied to induce apoptosis of all animal cells. It is preferable to target cells that have become cancerous due to overexpression of the ciyc gene.
  • the method of the present invention can target in vitro cells (cultured cells), and can also target in vivo cells (cells in an animal body).
  • protein expression vectors can be introduced into cells by known methods such as electroporation, calcium phosphate method, ribosome method, DEAE dextran method, and proteins. It can be carried out by a method of microinjecting its own solution, a method of introducing it into cells via lipids, or a method of bringing PTD peptide fusion protein into contact with cultured cells.
  • a method of introducing a polynucleotide into a body cell by a method according to gene therapy a method of microinjecting the lysate of the protein itself into the body cell, or via lipids.
  • a method of microinjecting the lysate of the protein itself into the body cell or via lipids.
  • In vivo cells can be cells in all animals, but apoptosis induction for the purpose of cancer treatment of useful animals (domestic animals, pets, etc.) is particularly preferable. Further, apoptosis induction for the purpose of treating cancer of baboon is more preferable.
  • the cancer treatment method of the present invention is characterized in that the apoptosis-inducing agent is administered to a mammal having cancer in a therapeutically effective amount.
  • “Therapeutically effective amount of cancer” refers to an amount of administration of this drug to proliferating cancer cells that causes the growth of cancer cells to be stopped, the size of the tumor to be reduced, or disappearance.
  • the specific dose should be adjusted according to the route of administration, the age and weight of the patient, the type and grade of cancer, the presence or absence of metastasis or recurrence, etc.
  • Examples of gene therapy include an in vitro method (ex vivo method) in which target cells are removed from the body and introduced into the body, and an in vivo method (in vivo method) in which the gene is introduced into the body.
  • the apoptosis inducer of the present invention Applies to any form of treatment.
  • the patient-derived cells are cultured outside the body, and after the introduction of the polynucleotide described above, it can be administered to the patient.
  • the above-described polynucleotide introduction vector is directly applied to the patient's body (organ tissue, skin). , Muscle, etc.).
  • Such cancer treatment may also be used in combination with well-known cancer treatment means including surgery, chemotherapy, and radiation therapy.
  • FIR lacking full-length FIR cDNA (SEQ ID NO: 2) and N-terminal amino acid sequence (amino acid sequence from position 1 to position 77 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2), the transcription active site of FIR Mutants were cloned into PCGNM2 vector plasmids (Liu, J. et al., Cell, 104: 353-363, 2001), and the respective expression plasmids (HA-FIR and HA-FIRANTT) were prepared.
  • Tissues were surgically removed from 15 patients with primary colorectal cancer who had written consent prior to surgery.
  • Excised samples were collected within 1 hour after surgical excision from tumor epithelial tissue and non-tumor epithelial tissue 5-10 cm away from the tumor. Two pathologists confirmed by microscopic observation that all tissue samples were adenocarcinoma. All excised samples were immediately placed in liquid nitrogen and stored at -80 ° C until analysis.
  • Plasmid is HA-FIR prepared in Example 1 or
  • HA- or HA-FIRA N77 and c-myc promoter are chloramphenicol acetyl transferase. It was introduced together with a reporter plasmid having upstream of the (CAT) gene. 48 hours after gene transfer, the expression of CAT was examined as described in the literature (Tomonaga, T. et al., J. Biol. Chem., 270: 4875-4881, 1995).
  • Figure 1 shows the results of the CAT assembly. FIR significantly suppressed CAT expression. However, the mutant FIR from which the amino terminal was deleted showed less attenuation of CAT expression than the normal FIR (Fig. 1).
  • HeLa cells were cultured on a cover glass and transfected with plasmids (M-FIR and HA FIRAN) using Lipofec tamine Plus reagent s (Gibco BRU). , ei al., Embo J, 19: 1034-1044, 2000).
  • the cells on the bar glass were fixed with 4% -paraformaldehyde, washed with PBS, and reacted with the primary antibody for 1 hour at room temperature.
  • Mouse anti-HA monoclonal antibody (Santa Cruz
  • Cells were subjected to two-color FACScan analysis (He, L., et al., Embo J, 19: 1034-1044, 2000) to quantify the suppression of C-Myc expression by FIR. That is, 22 hours after transfection, the cells were trypsinized, washed with PBS, fixed with ethanol at 20 ° C for at least 2 hours, washed twice with cold PBS, mouse anti-HA antibody and Heron anti-c-Myc antibody was reacted as the primary antibody. After washing with PBS, the secondary antibody [FITC-conjugated-anti-rabbit IgG (Sigma) and R-PE-conjugated-anti-mouse IgG (PharMingen) diluted 200-fold each] was reacted. .
  • Fig. 2 shows the results of transfecting HA-FIR and HA-FIRAN77 into HeLa cells and visualizing the expression of endogenous c-Myc by immunohistochemical staining.
  • Fig. 3 shows the results of quantitative analysis of endogenous c_Myc expression by flow cytometry analysis (two-color FACScan analysis) after transfecting HA-FIR and HA-FIRAN77 into HeLa cells.
  • HA-FIR suppresses c-Myc expression (Fig. 3, upper panel, left panel), but HA-FIR ⁇ N77 has no such effect ( Figure 3, upper panel, middle panel), but HA vector alone does not. Not suppressed (Fig. 3, upper panel, right panel).
  • C-Myc levels are markedly bimodal in the gate region (Fig. 3, upper panel, left panel), and c-Myc levels are rapidly increased in HA-FIR transfected cells. Decreased. In HA-FIRAN77 or HA-tag transfected cells, c-Myc expression levels could not be uniformly differentiated between transfected and non-transfected cells (Fig. 3, upper middle and right panels).
  • the lower panel shows the c-Myc source in the gate area marked on the upper panel.
  • the current histogram is shown.
  • the c-Myc average value (Geo-mean) in the gate area is 19.4 (8. 0) for HA-FIIU, 22.6 (9. 6) for HA-FIRAN77, HA empty It was 35.5 (30. 0) for Beck Yuichi.
  • FIR suppresses endogenous c-myc expression
  • whether full FIR expression can induce apoptosis was investigated using full-length FIR and a mutant FIR lacking the 76 amino acid sequence on the N-terminal side.
  • HA-FIR or HA-FIRAN77 and empty vector plasmid were transfected into HeLa cells in 6-well plates, and apoptosis induction was examined 60 hours later. Apoptotic cells were detected by the TUNEL method (Apoptos is Detection System, Fluorescein. Promega, WI, USA) according to the manufacturer's instructions. That is, HeLa cells cultured on force burglar were fixed with 4% paraformaldehyde for 10 minutes on ice. After washing with PBS, the cells were dialyzed against 0.5% Triton-X-100 in PBS for 5 minutes.
  • TdT terminal deoxytransferase
  • FITC labeling-dUTP MEBSTAIN Apop tos is Kit: Medical & Biological Laboratories, JAPAN
  • HeLa cells were treated with 1 unit / nil DNase I (GenHunter Corporation, Arlington, TN) and used as a positive control.
  • the sample was stained with DNA tt DAP IIII Counterstain (Vys is ( Abbot Park, IL)) and observed with a fluorescence microscope (Leica QFISH; Leica Microsystems, Tokyo, Japan).
  • PI propidium iodide
  • FITC-positive cells were analyzed with FITC as FL1 intensity and PI as FL2 intensity. PI-positive cells are shown on the X-axis, and FITC-positive cells (apoptosis-positive cells) are shown on the Y-axis.
  • HA-FIR induced apoptosis with DNA fragmentation
  • Fig. 4 upper panel, left panel, arrow
  • HA-FIRA N77 or control vector (HA empty vector) Fig. 4, upper panel, middle panel and right panel.
  • FIG. 5 shows the results of quantifying apo! ⁇ Cis cells by two-color analysis.
  • the apoptotic cells found in the upper-gate region in each panel are shown in the figure.
  • the percentage of apoptotic cells per 10,000 cells was 16.5% for HA-FIR, 6.6% for HA-FIRAN77, 2.0% for HA empty vector, and 75% for ⁇ asel-treated cells (positive control). It was 6%.
  • the number of apoptotic cells was 21.1% for FIR-alone apoptotic cells, compared to 4.2% when cotransfected with the C-myc expression plasmid. The width decreased ( Figure 7).
  • Table 1 shows the results of examining the number of apoptotic cells when co-transfecting the c-myc plasmid with the FIR plasmid at various ratios. These results indicate that FIR induces apoptosis due to c-Myc suppression.
  • pcDNA3.1-FIR 600 600 600 600 600 600 0 pcDNA3.
  • l-c-myc 0 0 10 20 50 60 60 pc ⁇ A3.1 vector (ng) 0 60 50 40 10 0 0
  • Total protein lysates were prepared from the above paired samples as follows. Lyse frozen tissue samples using Polytron homogenizer (Kinematica, Switzerland) Buffer [7M urea, 2M thiourea, 2% 3- [3- ChoIamidopropy dimethyla thigh on io-31-propanesulfate (CHAPS), 0.1M dithiothreitol (DTT), 2% IPG buffer (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK), M Tris] and centrifuged at 4 for 1 hour (100, 0OOX g) 0 Protein content of supernatant was measured by Protein Atsey (Bio-Rad, Hercules, CA).
  • Buffer 7M urea, 2M thiourea, 2% 3- [3- ChoIamidopropy dimethyla thigh on io-31-propanesulfate (CHAPS), 0.1M dithiothreitol (DTT), 2% IPG buffer
  • Proteins were electrophoresed on 8% acrylamide gels and transferred to poly (vinylidene fluoride) membranes (Millpore, Bedford, MA) in tank transfer appraius (Bio-ad, Hercules, CA). The membrane was blocked with 5% skim milk 'PBS solution for 1 hour.
  • Usagi anti-FIR polyclonal antibody diluted 1000x and 500x respectively in blocking buffer (2 synthetic peptides to increase antibody production: GDK KPPQGTDSI ME (30-45) and EVYDQE FDNSDLSA (5
  • RNA and genomic DNA were extracted from tumor and non-tumor epithelial tissues using the RNeasy TM Mini Kit and DN easy TM Tissues Kit (Qiagen).
  • cDNA was synthesized from total RNA using the 1st strand cDNA Synthesis Kit for RT-PCR (Roche, Mannheim, Germany).
  • RT-PCR using this cDNA as a saddle and FIR cDNA as a primer (forward: 5 '-GGCCCCAT CAAGAGCATC-3' (SEQ ID NO: 3), reverse: 5 '-GGGGCTGGGCCAGGGTCAG-3') (SEQ ID NO: 4) Amplified.
  • GAPDH cDNA was amplified.
  • Light Cycler TM instrument (Roche, Mannheim, Germany) to perform real-time quantitative PC analysis of FIR cDNA in a master mixture [LightCycler TM -FastStart DNA Master SYB Green I; FastStart Taa DNA polymerase, dNTP mixture, buffer ⁇ (LightCycler TM DNA Master hybridization probes, Roche), 3. OmM MgCl 2 , 0.5 liU each sense and antisense primer, and 1 cDNA cage type in a LightCycler TM capillary].
  • Light Cycle ⁇ software version 3.3 (Roche) was used for quantitative RT-PCR analysis. Optimal optimization of primers and LightCycler TM conditions was performed at Nihon Gene Research Laboratories, Inc.
  • FIR genomic DNA was also quantified by real-time quantitative PCR using the following primers.
  • Fig. 8A shows the immunoblotting results.
  • the intensity of each band was measured by NIH Image, and the relative average value for 3-actin between (T) and (N) of the FIR protein level was measured (bottom of the figure).
  • the Dukes stage is added at the top of Figure 8.
  • FIR levels were increased in most colon cancer tissues compared to the corresponding non-tumor epithelium ( Figure 8A).
  • Fig. 8B shows the results of RT-PCR performed on whole pan A prepared from the paired samples (T) and (N).
  • the FIR mRNA in (T) was higher than that in (N) except in one case (case number 5).
  • GAPDH mRNA levels were also shown as an internal control.
  • FIG. 8C A histogram of FIR mRNA expression levels (T) and (N) detected by real-time quantitative PCR is shown in Figure 8C.
  • the FIR mRNA in (T) was significantly higher than the (N) FIR mRNA (rho 0.0056 for t-test; p ⁇ 0.ri 008 for Wilcoxon test).
  • FIR and c-niycmRNA ( ⁇ ) / ⁇ ) expression ratios were significantly correlated in each colon cancer tissue (Fig. 8D).
  • the correlation coefficient is 0.70 and the p value is 0.00019.
  • the amino terminal region of F was amplified by PCR using the following primers. Forward: 5'-AGACAGCGGAAGGAGCAAGAGTGG-3 '(SEQ ID NO: 1 3)
  • FIR-wild type, 118T-FIR mutant, and 28T-FIR mutant were stained in red (Fig. 9, upper panel).
  • the FIR-wild type, 118T-FIR mutant was expressed in all cells, whereas the 28T-FIR mutant was localized only in the nucleus.
  • c-Myc was stained in green (Fig. 9, middle panel) and DNA was counterstained with DAPI I I I (Fig. 9, lower panel). Both 118T-FIR mutant and 28T-FIR mutant had reduced c-Myc inhibitory activity compared to FIR-wild type.
  • FIR adenovirus vector (1. Ol x i0 1D i iu / ml) and infect cervical cancer (HeLa) and esophageal cancer (T. Tn) cell lines. Quantified. As a control, the galactosidase gene was expressed and compared with the FIR adenovirus vector.
  • the FIR adenoviral vector M0I which reduces the number of cells to 50%, was measured to be 191.4 (532.8) for HeLa cells and 615.1 (1410.6) for T. Tn cells (in parentheses). Is the 3-galactosidase gene M0I).
  • Figure 11 shows a graph of the survival rate of HeLa cells and T. Tn cells measured by MTT assay. The anti-tumor effect of the FIR adenovirus vector was confirmed in these cancer cells that highly express c-Myc.
  • colon cancer SW480, DLD1
  • cervical cancer after FIR adenovirus vector infection SW480, DLD1
  • Fig. 12 shows the results of immunoblotting analysis of nuclear and cytoplasmic FIR proteins in (HeLa) and esophageal cancer (T. Tn) cancer cell lines.

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Abstract

　本発明は、c-myc遺伝子を標的として、細胞アポトーシスを安定かつ確実に誘導するための新しい手段を提供することを目的とする。　本発明は、FBPタンパク質と相互作用するタンパク質、又はこのタンパク質をコードするポリヌクレオチドを有効成分とする含有するアポトーシス誘導剤、ならびに該アポトーシス誘導剤を細胞に接触させる工程を含むことを特徴とするアポトーシス誘導方法である。

Description

明 細 書 アポ卜一シス誘導剤及びアポトーシス誘導方法 技術分野
本発明は、 アポトーシス誘導剤及びアポ卜一シス誘導方法に関する。 さらに詳 しくは、 本発明は、 その存在が宿主動物にとって有害となるような細胞 （例えば 癌細胞） にアポトーシスを誘導するための薬剤、 ならびにこの薬剤を用いるアポ ト一シス誘導及び癌の治療方法に関する。 背景技術
アポトーシス （apoptosis) は、 生理的条件下で細胞自らが積極的に引き起こす 細胞死であり、 環境悪化による細胞死 （壊死：ネクローシス） と明確に区別され ている。 このアポトーシスは、 細胞核の染色体凝集、 細胞核の断片化、 細胞表層 微絨毛の消失、 細胞質の凝集等を形態学的な特徴としている。 アポトーシスを生 じた細胞は萎縮し、 細胞内容物は外部に放出されずにマクロファージゃ周囲の細 胞に速やかに取り込まれるため、 炎症が引き起こされず、 周囲の細胞に影響を与 えることはない。 従って、 その存在が宿主生物にとって有害である細胞 （例えば 癌細胞等） にアポトーシスを誘導することによって疾患を治療する試みが多くな されている。
これまでに、 アポトーシスを誘導する手段、 因子としては、 例えばダルココル チコィド処理、 サイトトキシック- T細胞による細胞障害、 ホルモン依存性組織の 萎縮、 放射線照射、 NK細胞、 キラー細胞、 腫瘍壊死因子 （TNF)、 リンホトキシン
(LT) 等のサイト力イン類等が報告されている （Wyllie, A. H. , Nature 284:555
-556, 1986; Wyllie, A. H. et al. , Int. Rev. Cytol. 68:251, 1980; Duvall, E. and Wyllie, A. H. , Immunology Today, 7:115-119, 1986; Sellins, K. S. et al. , J. I顏 unol. 139:3199, 1987; Yamada, T. et al. , Int. J. Radiat. Biol.
53:65, 1988; Schmid, D. S. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 83:1881-1885,
1986; John, C. et al. , J. I蘭漏 1. 129 (4) :1782-1787, 1982; Howell, D. M. et al. , J. I醒 imol. 140:689-692, 1988; Gillian, B. et al. , Eur. J. I腿 unol. 17:689-693, 1987)。 また、 ある種の抗体 （例えば抗 CD3抗体、 抗 AP0 - I抗体等）によってもアポ卜一シスが誘導されることも知られている（Trauth, B. C. et al. , Science 245:301-305, 1989; Smith, A. et al. , Nature 337:1 81-184, 1989; Tadakuma, T. et al. , Eur. J, I醒 unol. 20:779, 1990)。 さら に、 タンパク質合成阻害剤である Cycloheximideは急性白血病細胞に、 RNA合成 阻害剤である Actinomycin Dは小腸陰窩細胞に、 そして両者が HL- 60細胞にそれ ぞれアポトーシスを誘導することも報告されている （Martin, S. J. et al. , J. Immunol. 145:1859-1867, 1990)。
アポトーシスに関連する治療法としては、 前記抗 Apo- 1抗体による癌治療の試 みの他、芽球の活発な増殖に起因する骨髄異形成症候群（MDS)に対する etoposide や aclarubicin の投与が検討されている （Shibuya, T. , J. Clinical and Experimental Medicine 160 (5) :319-323, 1992)。 これらの他にも、 アポトーシ スの誘導方法やそのための薬剤組成物の発明が知られている （例えば、 特開 2001- 275681号公報；特表 2002-526109号公報; 特表平 10-508575号公報; 特開 平 9-328425号公報； 国際公開第 W095/28154号パンフレツト等）。
一方、 c-myc遺伝子にコードされる c-Mycタンパク質は、 細胞の増殖や分化、 細胞周期といつた細胞の生命活動に極めて重要であるばかり力 細胞の腫瘍化（形 質転換） にも深く関与している。 多くの癌組織で c-Mycタンパク質の発現増大が 認められ、 c-myc遺伝子導入により細胞の腫瘍化が認められる。 さらにこの c - Myc タンパク質はアポトーシスとも関係しており、 c- Myc タンパク質の細胞内の発現 量が増加しても減少してもアポトーシスが誘導される（Thompson, E. B. Ann. Rev.
Physiol. 60: 575-600, 1998)。 例えばヒト白血病細胞におけるダルココルイチコ イドを用いた実験ではアポトーシス誘導に c- myc 遺伝子の抑制が必須である
(T ulasi, . et al. , J. Biol. diem. 268: 18306-18312, 1993; Zhou, F. et al. '
J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 73:195-202, 2000; Thompson, E. A. et al.，
Cancer Res. , 51: 5544-5550, 1991; Helmberg, A. et al., EMB0 J., 14: 452-60,
1995) c B細胞を用いた系ではアポトーシスを誘導する化学物質はいずれも c- myc 遺伝子の発現抑制と深くかかわつている （McCormack, J. E. et al., Pro Natl. Acad. Sci. U S A. 81:5546-5550, 1984; Sonenshein, G. E. , J. I腿 unol. 158:1994-1997, 1997; Fischer, G. et al. , J. Exp. Med., 179:221-228, 1994; Wu, M. et al., Mol. Cell. Biol. 16:5015-5025, 1996)。 また、 c - mycのアンチ センスオリゴヌクレオチドをいくつかの種類の細胞に導入するとアポトーシスが 誘導される （Thompson, E. B. , Ann. Rev. Physiol. 60: 575-600, 1998)。 一方、 IL - 3依存性の骨髄細胞において、 IL- 3を枯渴させると同時に C- myc遺伝子を強制 発現させるとアポトーシスが誘導される （Ask ， D. S. et al. , Oncogene 6: 1915-1922, 1991) oまた血清を取り除いた培地で Rati線維芽細胞に c- myc遺伝子 を強制発現させるとアポ卜一シスが誘導される（Evan, G. I. et al. , Cell 69: 119-128, 1992) ο
この c- Mycタンパク質は c_myc遺伝子の転写により産生され、 c-myc遺伝子は 多くの転写因子によって厳密に制御されているが、 それがどのように転写制御さ れているのかについては不明の点が多い。例えば、 70-80%の大腸癌で異常の見ら れる APC (adenomatous polyposis coli)遺伝子は、 癌発生の最も初期に異常が起 こるといわれている。 APCタンパク質は、 Wnt/Winglessシグナル伝達経路により 安定化される /3カテニンに結合してその働きを抑制している。 j3カテニンは転写 因子 Tci/Leiと結合して c - myc遺伝子の転写を活性化する。 従って APC遺伝子に 異常が起こると /3カテニンの活性を抑制できずに c-myc遺伝子が持続的に活性化 され、 細胞の増殖がひきおこされると考えられている。
c - Mycタンパク質の発現は Wnt/Winglessシグナル伝達経路以外にも多くの転写 因子の影響を受けている。 例えばヒト前骨髄性白血病細胞である HL60 は 丽 S0
(Dimethyl sulfoxide;Me2S0)、 retinoic acid, phorbol esters、 ビタミン D誘 導体等種々の化学物質により分化誘導され、 その際には細胞内 C-Mycタンパク質 の発現が減弱することが知られている。 これらの事実は、 種々の分化誘導物質が 様々な転写因子を活性化し c- myc遺伝子に影響を与えるが、 最終的には一つの経 路に集約されて c_myc遺伝子の転写を抑制していることが示唆される。
このような考えから c-myc遺伝子の上流のどの部位がその転写に影響を与える かが解析された結果、 C- myc遺伝子の転写開始部位の 1.5kbも上流の百数十塩基 の部位が C- myc 遺伝子の転写に極めて重要であることが示され、 FUSE (Far Upstream Element) と命名された （Avigan, M. et al. , J. Biol. Chem. , 265:18538-18545, 1990)。 次に FUSE に結合する蛋白質が oligonucleotide affinity cliromatograpliyによって解析され、 70kDaの分子量を有する FBP (FUSE 結合タンパク質； FUSE Binding Protein) が同定された。 またこの FBPタンパク 質はそれ自体が強力な転写活性を有し、 c-myc 遺伝子を制御している可能性が示 されている （Bazar, L. et al. , J. Biol. Chem. , 270: 8241-8248, 1995; Duncan, R. et al. , Genes Dev. , 8:465-480, 1994; Mic elotti, G. A. et al.， Mol. Cell. Biol. 16:2656-2669, 1996)。 そしてさらに、 この FBPタンパク質に結合 （相互作 用） するタンパク質として FIR (FBP Interacting Repressor) が同定され （Liu, J. et al. , Mol. Cell, 5: 331-341, 2000)、 この FIRは基本転写因子 TFIIHの機 能を抑制することにより c- myc遺伝子を転写抑制することが示されている（Liu, J. et al. , Cell, 104: 353-363, 2001) 0 ただし、 この FIRがアポト一シスを誘導す ることは一切知られていない。
このように、 c- Myc タンパク質は細胞の癌化とアポトーシスに深く関与してお り、その発現を制御することによって癌細胞を死滅させることが期待されている。 しかしながら、 前記のとおり C- Mycタンパク質はその発現量が増大しても減少し てもアポトーシスを生じさせるため、 その発現制御によるアポ卜一シス誘導は容 易ではない。 また、 c-Myc タンパク質の発現抑制によるアポ卜一シス誘導の手段 としてダルココルチコィドゃ C- myc遺伝子のアンチセンス鎖を用いる方法が提案 されているが（Thompson, E. B. , Ann. Rev. Physiol. 60: 575-600, 1998; Thulasi, R. , et al., J. Biol. Chem. 268: 18306-18312, 1993; Zhou, F. et al,, J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 73:195-202, 2000; Thompson, E. A. et al., Cancer Res., 51: 5544-5550, 1991; Helmberg, A. et al. , EMB0 J. , 14: 452-60, 1995)、 副 作用の点や安定した効果の点で臨床的使用には好ましいものではない。
従って、 本発明の課題は、 C- myc 遺伝子を標的として、 細胞アポトーシスを安 定かつ確実に誘導するための新しい手段を提供することにある。
本発明のさらなる課題は、 前記アポトーシス誘導の手段を用いて動物個体内の 細胞、 特にその存在が宿主動物にとって有害となるような細胞にアポトーシスを 誘導する方法を提供することにある。 発明の開示
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、 c- myc 遺伝子の上 流にある転写因子 FUSE (Far Ups t ream El ement) に結合する FUSE結合タンパク 質 （FUSE結合タンパク質；以下、 「FBPタンパク質」 という） と相互作用する FIR (FBP Int erac t ing Repressor) タンパク質が、 c- Mycタンパクの発現を抑制する とともに、 アポトーシスを誘導できることを見出し、 本発明を完成させるに至つ た。
すなわち、 本発明は以下の発明を包含する。
(1) FBP タンパク質と相互作用するタンパク質を有効成分として含有するアポト 一シス誘導剤。
(2) FBPタンパク質と相互作用するタンパク質が、
配列表の配列番号 2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質；
配列表の配列番号 2に示すアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠 失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつアポトーシス誘導活性 を有するタンパク質；又は、それらの部分ペプチドである、 （1)に記載のアポトー シス誘導剤。
(3) FBP タンパク質と相互作用するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを 有効成分として含有するアポトーシス誘導剤。
(4) FBP タンパク質と相互作用するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、 配列表の配列番号 1に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
配列表の配列番号 1に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配 列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハィブリダイズし、 かつアポ 1 ^一シス誘導活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド ； 又は、 それらの部分断片である、 （3)に記載のアポトーシス誘導剤。
(5) 細胞内に導入可能な形態を有していることを特徴とする、 （1)〜（4)のいずれ かに記載のアポトーシス誘導剤。
(6) 細胞内に導入可能な形態がベクターである、（5)に記載のアポトーシス誘導剤。
(7) 癌の治療のために用いる、（1)〜（6)のいずれかに記載のアポト一シス誘導剤。 (8) c-niyc 遺伝子発現により増殖する細胞にアポトーシスを誘導する方法であつ て、 （1)〜（7)のいずれかに記載のアポトーシス誘導剤を細胞に接触させる工程を 含むことを特徴とするアポトーシス誘導方法。
(9) 細胞が癌細胞である、 （8)に記載の方法。
(10) 細胞が哺乳動物の体内にある細胞である、 （8)又は（9)に記載の方法。
(11) 哺乳動物がヒトである、 （10)に記載の方法。
(12) 哺乳動物に対して、配列表の配列番号 2に示すアミノ酸配列からなるタンパ ク質；配列表の配列番号 2に示すアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ 酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつアポトーシス誘 導活性を有するタンパク質；又はそれらの部分ペプチドの有効量を投与すること を特徴とする、 癌の治療方法。
(13) 哺乳動物に対して、配列表の配列番号 1に示す塩基配列からなるポリヌクレ ォチド ；配列表の配列番号 1に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的 な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェン卜な条件下でハイブリダ ィズし、 かつアポトーシス誘導活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレ ォチド；又はそれらの断片の有効量を投与することを特徴とする、癌の治療方法。
(14) 哺乳動物がヒ卜である（12)又は（13)に記載の方法。 なお、 本発明において、 「FBPタンパク質と相互作用するタンパク質」 とは、 FBP タンパク質と結合して、 FBPタンパク質の機能 （すなわち C- myc遺伝子の転写活 性） に対して抑制的に働くタンパク質を意味する。
また 「ポリヌクレオチドが細胞内に導入可能な形態」 とは、 ポリヌクレオチド が細胞内に導入され、 そのポリヌクレオチドがコードするタンパク質又はべプチ ドが発現可能である形態を意味する。
また 「タンパク質」 及び 「ペプチド」 とは、 アミド結合 （ペプチド結合） によ つて互いに結合した複数個のアミノ酸残基から構成された分子を意味する。「ポリ ヌクレオチド」 とは、プリン又はピリミジンが糖に /3 - N-ダリコシド結合したヌク レオシドのリン酸エステル （ATP、 GTP、 CTP、 ϋΤΡ ;又は dATP、 dGTPゝ dCTP、 dTTP) が 100個以上結合した分子を言い、 「オリゴヌクレオチド」 とは 2- 99個連結した 分于を つ。
本発明におけるその他の用語や概念は、 発明の実施形態の説明や実施例におい て詳しく規定する。 また本発明を実施するために使用する様々な技術は、 特にそ の出典を明示した技術を除いては、 公知の文献等に基づいて当業者であれば容易 かつ確実に実施可能である。 例えば、 本発明の治療方法等に使用可能な薬剤の調 製は Remington' s Pharmaceut ical Sciences, 18th Edi t ion, ed. A. Gennaro, Mack Publ ishing Co. , Eastern, PA, 1990 に、 遺伝子工学及び分子生物学的技術は Sambrook and Maniat is, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989 ; Ausubel, F. M. et al.， Current Protocols in Molecular Biology, John Wi ley & Sons, New York, N. Y, 1995等 に記載されている。 図面の簡単な説明
図 1は、 FIRタンパク質が c-myc転写抑制能を有するか否かを調べた CATアツ セィの結果である。
図 2は、 完全長 FIR遺伝子 （HA-FIR) 又はその欠失変異体 （HA- FIRAN77) を導 入した HeLa細胞について、 c_Mycタンパク質の発現を免疫組織化学染色により可 視化した蛍光顕微鏡写真である。
図 3は、 完全長 FIR遺伝子 （HA- FIR) 又はその欠失変異体 （HA- FIRAN77) を導 入した HeLa細胞について、 フローサイトメトリー解析 （2色 FACScan解析） によ つて C- Mycタンパク質の発現を定量した結果を示す
図 4は、 完全長 FIR遺伝子 （HA- FIR) 又はその欠失変異体 （HA- FIRAN77) を導 入した HeLa細胞について、 アポトーシス誘導を調べた蛍光顕微鏡写真である。 図 5は、 完全長 FIR遺伝子 （HA- FIR) 又はその欠失変異体 （HA- FIRAN77) を導 入した HeLa細胞について、 フローサイトメトリー解析 （2色 FACScan解析） によ つてアポト一シス細胞を定量した結果を示す
図 6は、 FIR遺伝子のみ、 FIR遺伝子と c-myc遺伝子の両方を導入した HeLa細 胞について、 FIRタンパク質及び c- Mycタンパク質の発現を免疫組織化学染色に より可視化した蛍光顕微鏡写真である。 図 7は、 FIR遺伝子のみ、 FIR遺伝子と c-myc遺伝子の両方を導入した HeLa細 胞について、 アポトーシス誘導を調べた蛍光顕微鏡写真である。
図 8 Aは、 大腸の腫瘍組織 （T)及び非腫瘍組織 （N)の FIRタンパク質レベルを ィムノブロッテイングにより分析した結果を示す。
図 8 Bは、 大腸の腫瘍組織 （T)及び非腫瘍組織 （N)の全 RNA に対して Π- PCR を行った結果を示す。
図 8 Cは、 リアルタイム定量的 PCRによって検出した大腸の腫瘍組織 （T)及び 非腫瘍組織 （N)の FIR mRNA発現レベルのヒストグラムを示す。
図 8 Dは、 FIRと C- myc mRNAの大腸の腫瘍組織 （T) /非腫瘍組織 （N)発現比の 相関を示す。
図 9は完全長 FIR遺伝子 （FIR 野生型）、 及び大腸癌組織由来の FIR 変異体 ( 118T- FIR変異体、 28T- FIR変異体） を導入した HeLa細胞について、 c-Mycタン パク質の発現を免疫組織化学染色により可視化した蛍光顕微鏡写真である。
図 1 0は完全長 FIR遺伝子 （FIR野生型）、 及び大腸癌組織由来の FIR変異体 ( 118T- FIR変異体、 28T- FIR変異体） を導入した HeLa細胞について、 アポトーシ ス誘導を調べた蛍光顕微鏡写真である。
図 1 1は、 子宮頸癌 （HeLa)、 食道癌 （T. Tn)細胞の生存率を MTTアツセィによ つて測定したグラフを示す。
図 1 2は、 FIR アデノウイルスベクター感染後の大腸癌 （SW480, DLD1)、 子宮 頸癌 （HeLa)、 食道癌 （T. Tn)細胞株における核内及び細胞質内の FIRタンパク質 発現をィムノブロッティングにより分析した結果を示す。 以下、 本発明を詳細に説明する。 本願は、 2003年 4月 21 日に出願された日本 国特許出願 2003-116299号の優先権を主張するものであり、 該特許出願の明細書 及び/又は図面に記載される内容を包含する。
1 . アポトーシス誘導剤
本発明のアポトーシス誘導剤は、 有効成分として、 FBP タンパク質と相互作用 するタンパク質、 又は FBPタンパク質と相互作用するタンパク質をコードするポ リヌクレオチドを細胞内に導入可能な形態で含有することを特徴とする。
上記 FBPタンパク質、 好ましくはヒト FBPタンパク質と相互作用するタンパク 質としては、 ヒト FIRタンパク質 （Liu, J. et al. , Mo l. Cel l, 5 : 331-341, 2 000 ; Liu, J. e t al. , Ce l l, 104： 353-363, 2001 ; GenBank/NM_14281) , ヒト SIA HBPl (s iah bind ing prote in 1： GenBank/BC008875) , ヒト SIAHBP 1の転写バリア ント 1 (GenBank/NM— 078480)、 ヒト SIAHBP 1の転写バリアント 2 (GenBank/NM_01 4281) 等が挙げられるが、 これらの中でも配列番号 2に示すアミノ酸配列を有す るヒト FIRタンパク質が特に好ましい。
本発明で用いるヒト FIRタンパク質には、 配列番号 2に示すアミノ酸配列にお いて 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列か らなり、 かつアポ卜一シス誘導活性を有するタンパク質も含まれる。
ここで、 欠失、 置換若しくは付加されてもよいアミノ酸の数としては、 好まし くは、 1個から数個である。例えば、配列番号 2に示すァミノ酸配列の 1〜 10個、 好ましくは 1〜 5個のアミノ酸が欠失してもよく、 配列番号 2に示すアミノ酸配 列に 1〜10個、 好ましくは 1〜5個のアミノ酸が付加してもよく、 あるいは、 配 列番号 2に示すアミノ酸配列の 1〜10個、好ましくは 1〜 5個のアミノ酸が他の アミノ酸に置換してもよい。
アミノ酸の欠失、 付加及び置換は、 上記タンパク質をコードする遺伝子を、 当 該技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。 遺伝 子に変異を導入するには、 Kunke l法又は Gapped duplex法等の公知手法又はこれ に準ずる方法により行うことができ、 例えば部位特異的突然変異誘発法を利用し た変異導入用キット (例えば Mut ant-K (TAKARA社製) や Mutant - G (TAKARA社製) ) などを用いて、 あるいは、 TAKARA社の LA PCR in vi t ro Mutagenes is シリーズキ ットを用いて変異が導入される。
ここで、 「アポトーシス誘導活性」 とは、 細胞を収縮させ、 核を断片化させる活 性をいい、 この活性は、 例えば、 遺伝子を HeLa細胞等に導入し、 過剰発現させ、 その細胞の形態変化の観察、 FACS分析により確認することができる。
また、 「アポトーシス誘導活性を有する」 とは、 配列番号 2に記載のアミノ酸配 列を有するタンパク質が保持する該活性と実質的に同等であることをいう。 上記のタンパク質中の部分アミノ酸配列を含むペプチド （部分ペプチドともい う） も本発明の範囲に含まれる。 かかる部分ペプチドを構成するアミノ酸数は、 少なくとも 10個以上、 好ましくは 30個以上、 より好ましくは 80個以上である。 上記のタンパク質又はその部分ペプチドは、 必要に応じて塩の形態、 好ましく は生理学的に許容される酸付加塩の形態で提供され得る。そのような塩としては、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） の塩、 有機酸 （例えば、 酢 酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 シユウ酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸） の塩 等が挙げられる。
上記タンパク質は、 公知のアミノ酸配列 （例えば FIRタンパク質の場合は配列 番号 2のアミノ酸配列） に基づいて化学合成する方法や、 発現べクタ一からのィ ンビトロ転写や、 発現べクタ一による形質転換細胞の発現産物として単離精製す る方法等によって取得することができる。 例えば、 タンパク質をインビトロ翻訳 で発現させる場合には、 ポリメラーゼプロモーターを有する発現ベクターを、 プロモーターに対応する RNAポリメラ一ゼを含むゥサギ網状赤血球溶解物や小麦 胚芽抽出物などのインピトロ翻訳系に添加すれば、 タンパク質をインビトロで生 産することができる。 RNAポリメラーゼプロモー夕一としては、 T7、 T3、 SP6など が例示できる。これらの RNAポリメラーゼプロモーターを含むベクターとしては、 pKAl、 pCDM8、 pT3/T7 18、 pT7/3 19、 pBluescript I I などが例示できる。 また、 タンパク質を、 大腸菌などの微生物で発現させる場合には、 微生物中で複製可能 なオリジン、 プロモーター、 リボソーム結合部位、 DNA クローニング部位、 夕一 ミネ一夕一等を有する発現ベクターに該タンパク質をコードする DNA断片を組換 えて発現ベクターを作成する。 この発現ベクターで宿主細胞を形質転換すれば、 タンパク質を発現する形質転換体細胞を得ることができ、 この形質転換体を培養 すれば、 その培褰物から目的のタンパク質を大量生産することができる。 大腸菌 用発現ベクターとしては、 PUC系、 pBluescr ipt I I、 pET発現システム、 pGEX発 現システムなどが例示できる。 さらに、 タンパク質を真核細胞で発現させる場合 には、 該タンパク質をコードする DNA断片を、 プロモーター、 スプライシング領 域、ポリ（A)付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに挿入して組換えべクタ 一を作製する。 このべクタ一を真核細胞内に導入すれば、 目的のタンパク質を発 現する形質転換真核細胞を得ることができる。発現ベクターとしては、 pKAl、pCDM8、 pSVK3、 pMSG、 pSVL、 pBK-CMV, pBK-RSV, EBVベクター、 pRS、 pYES2などが例示で きる。 真核細胞としては、 ヒト胎児腎臓細胞 HEK293、 サル腎臓細胞 C0S7、 チヤィ ニーズハムスター卵巣細胞 CH0などの哺乳動物培養細胞、 あるいはヒ卜臓器から 単離した初代培養細胞などが使用できる。 出芽酵母、 分裂酵母、 カイコ細胞、 ァ フリカツメガエル卵細胞なども使用できる。発現ベクターを細胞に導入するには、 電気穿孔法、 リン酸カルシウム法、 リボソーム法、 DEAEデキストラン法など公知 の方法を用いることができる。 形質転換細胞で発現させたタンパク質を単離精製 するためには、 公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。 例えば、 尿素 などの変性剤や界面活性剤による処理、 超音波処理、 酵素消化、 塩析ゃ溶媒沈殿 法、 透析、 遠心分離、 限外濾過、 ゲル濾過、 SDS-PAGE、 等電点電気泳動、 イオン 交換クロマトグラフィー、 疎水性クロマトグラフィー、 ァフィ二ティーク口マト グラフィー、 逆相クロマトグラフィーなどが挙げられる。
また、 部分ペプチドは、 公知のペプチド合成法又は上記タンパク質を適当なぺ プチダーゼ （例えば、 トリプシン、 キモトリブシン、 アルギニルエンドべプチダ —ゼ）で切断することによって製造することができる。ペプチド合成法としては、 例えば、 固相合成法、 液相合成法のいずれによってもよい。
また、 本発明のアポトーシス誘導剤に使用するポリヌクレオチドとしては、 配 列番号 1に示す塩基配列を有する、 ヒト FIRタンパク質をコードするポリヌクレ ォチド好ましい。
本発明で用いるヒト FIRタンパク質をコードするポリヌクレオチドまた、 配列 番号 1に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポ リヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、 かつアポトー シス誘導活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。
ここで、 ストリンジエンドな条件とは、 いわゆる特異的なハイブリッドが形成 され、 非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。 例えば、 相同性が高 い核酸、 すなわち配列番号 1で表わされる塩基配列と 7 0 %以上、 好ましくは 8
0 %以上、 より好ましくは 9 0 %以上、 最も好ましく 9 5 %以上の相同性を有す る塩基配列からなる D N Aの相補鎖がハイブリダィズし、 それより相同性が低い 核酸の相補鎖がハイブリダィズしない条件が挙げられる。 より具体的には、 ナト リウム濃度が 150〜900mM、 好ましくは 600〜900mMであり、 温度が 60~68°C、 好 ましく 65°Cでの条件をいう。
前記の各タンパク質をコードするゲノム丽 、ゲノム丽 Aの転写産物である IIIRNA、 この mMAを錶型として合成される cDNA等を利用することができるが、 cDNAが特 に好ましい。 この cDNAは、 前記の公知配列を利用し、 公知の方法によって取得す ることができる。 例えば、 公知の方法 （Mol. Cell Biol. 2, 161-170, 1982； J. Gene 25, 263 - 269， 1983； Gene, 150, 243-250, 1994) を用いて cDNAライブラ リ一を合成し、前記の公知配列（例えば FIRタンパク質をコードする配列番号 1) の塩基配列に基づいて作製したプローブ DNAを用いて、目的の cDNAを単離するこ とができる。 得られた cDNAは、 例えば、 PCR (Polymerase Chain Reaction) 法、 NASBN ( Nucleic acid sequence based amplification ) 法 、 TMA
(Transcription-mediated amplification) 法及び SDA (Strand Displacement Amplification)法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅することができる。 また、 公知配列に基づいて作製したプライマーセットを用い、 ヒト細胞から単離 した mRNAを鍀型とする RT- PCR法によっても必要量の各 cDNAを得ることができる。 プライマーセットは、 プライマ一設計用の市販のソフトウェア、 例えば OligoTM
[National Bioscience Inc. (米国） 製]、 GENETYX [ソフトウェア開発 （株） （日 本） 製] 等を用いることによって作製することができる。
上記のタンパク質又はポリヌクオチドを細胞内に導入可能な形態とするために は、 例えば以下の手段がある。
タンパク質は、 例えば、 その構造や機能を変更することなく、 かつ薬理学的に 許容される担体溶液にタンパク質分子を混合して製剤化することにより細胞内に 導入可能な形態とすることができる。
このような薬剤は、例えば invitro細胞に対してはマイクロインジェクション 法により細胞内に導入することができる。 あるいは、 脂質による細胞内導入法 (BioPORTE (Gene Therapy Systems社、 米国）、 Chariot (Active Motif 社、 米 国） 等） を採用することもできる。 また別の態様としては、 タンパク質 （ポリペプチド） の N端側に細胞膜通過べ プチドを連結させた融合ポリペプチドとすることによって、 タンパク質を細胞内 に導入可能な形態することもできる。 この細胞膜通過ペプチドを備えることによ つて、 タンパク質は細胞膜を通過して細胞内に取り込まれる。 細胞膜通過べプチ ドとしては、 HIV- 1 · TATの PTD (protein t ransduct ion domain) 又はショウジョ ゥバエのホメォボックスタンパク質アンテナべディアの PTD等を使用することが できる。 例えば HIV- 1 · TATの場合にはそのアミノ酸配列及ぴその cDNAの塩基配 列が公知であり (Science, 285 : 1569-1572, 1999 ; GenBank Access ion NO. U39362 M96155) , その PTDに相当する領域 （HIV · TATの 47〜57番アミノ酸配列） をコー ドする爾 A断片を前記 d)NAと連結して融合 DNA断片を作成し、この融合 DNA断片 を大腸菌等の宿主細胞で発現させることによって、 N末端側に PTDぺプチドを連 結し融合ポリペプチドを作成することができる。 また、 アンテナぺディアの PTD も公知であり （例えば、 GenBank Access i on No. AE001573) , 同様にして PTDを連 結した融合ポリペプチドを作成することができる。 あるいはまた、 2 価の架橋剤 (例えば、 EDCや i3—ァラニン等） を介して、 ポリペプチドと PTDペプチドを結 合させる方法によって細胞膜通過ペプチドを連結した融合ポリペプチドを作成す ることもできる。
一方、 ポリヌクレオチドは、 例えば、 発現ベクターに組み込むことによって細 胞内に導入可能な形態とすることができる。 発現ベクターは、 プロモーター、 ス プライシング領域、ポリ（A)付加部位等を有する公知の真核細胞用発現ベクターを 使用することができ、 この発現ベクターのクローニングサイトに、 前記のポリぺ プチドをコードするポリヌクレオチドを挿入することによってポリペプチド発現 ベクタ一を構築することができる。
この発現ベクターは、 in vi t ro細胞 （培養細胞） に対しては、 例えば電気穿孔 法、 リン酸カルシウム法、 リボソーム法、 DEAEデキストラン法等の公知の方法に よって細胞内に導入することができる。
また、 in vivo 細胞 （すなわち動物個体内の細胞） に対しては、 細胞への取り 込みの促進や標的細胞への指向性を高める目的で、 例えば、 ウィルス性又は非ゥ ィルス性の遺伝子導入用ベクターなどの手段により細胞内に導入することができ る。 このような形態にした薬剤は、 遺伝子治療用として生体内に導入することが できる （例えば、特開 2003- 24092号公報、特開 2003-501445号公報等）。 ここで、 ウィルス性ベクターとしては、 例えばアデノウイルスベクター、 レトロウイルス ベクター、 レンチウィルスベクター、 AA V (アデノ随伴ウィルス） ベクター、 ワクシニアウィルスベクター、 ヒト免疫不全ウィルス （H I V) ベクター、 ヘル ぺスウィルスベクター等が挙げられる。 また、 非ウィルス性ベクターとしては、 リボソーム、 人工脂質べシクル、 中空ナノ粒子、 デンドリマーなどの高分子化合 物等が挙げられる。 この場合、 市販の導入用試薬 （リポフエクチン、 リボフェク トァミン、 MRIE- C (Invi trogen社製）、 Metafectene, DOTAP (BioTex社製）、 T f x試薬 （Promega社製） 等が利用できる。
アポトーシスは正常な発生 ·分化に不可欠な生理的細胞死であり、 正常な生体 組織の細胞回転などにおいて個々の細胞に起こっている。 そのため、 アポトーシ スが過剰に減少すると多くの機能障害の原因になることが判明している。従って、 本発明のアポトーシス誘導剤は、 アポト一シスの減少に起因する疾患の治療及び /又は予防剤として使用できる。 アポト一シスの減少に起因する疾患としては、 代表的には、 悪性腫瘍 （胃癌、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 食道癌、 前立腺癌、 肝癌、 腎臓癌、 膀胱癌、 皮膚癌、 子宮癌、 脳腫瘍、 骨肉種、 骨髄腫瘍など） であるが、 白血病、 自己免疫疾患 （例えば、 I型糖尿病、 多発性硬化症、 全身性エリマト一 デス、 慢性関節リウマチなど）、 ウィルス感染疾患 （H I V感染など）、 肝炎、 な 'が挙げられ、 これらに限定はされない。
本発明のアポトーシス誘導剤は、 各種製剤形態に調製し、 経口又は非経口的に 全身又は局所投与することができる。 本剤を経口投与する場合は、 錠剤、 カプセ ル剤、 顆粒剤、 散剤、 丸剤、 内用水剤、 懸濁剤、 乳剤、 シロップ剤等に製剤化す るか、 使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよい。 また、 本剤を非経口 投与する場合は、 静脈内注射剤 （点滴を含む）、 筋肉内注射剤、 腹腔内注射剤、 皮 下注射剤、 坐剤などに製剤化し、 注射用製剤の場合は単位投与量アンプル又は多 投与量容器の状態で提供される。
これらの各種製剤は、製剤上通常用いられる賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、 崩壊剤、 潤滑剤、 界面活性剤、 分散剤、 緩衝剤、 保存剤、 溶解補助剤、 防腐剤、 矯味矯臭剤、 無痛化剤、 安定化剤、 等張化剤等などを適宜選択し、 常法により製 造することができる。
本発明のアポトーシス誘導剤の投与量は、 投与対象の年齢、 投与経路、 投与回 数、 症状、 剤型等により異なるが、 タンパク質又はポリペプチドの治療的有効量
(すなわち、 有効量） は、 約 0. 001〜30mg/kg体重の範囲、 好ましくは約 0. 01〜 25nig/kg体重、 より好ましくは約 0. 〜 20mg/kg体重、 さらにより好ましくは約 1 〜10mg/kg、 2〜9mg/kg、 3〜8mg/kg、 4〜7mg/kg又は 5〜6mg/kg体重の範囲であり、
1日 1回から数回に分けて 1日以上投与される。 またタンパク質をコードするポ リヌクレオチドを遺伝子治療等の方法によつて導入する場合は、 前記の範囲量の タンパク質を発現しうるポリヌクレオチドを投与すればよい。
2 . アポ卜一シス誘導方法
本発明のアポトーシス誘導方法は、 C- niyc 遺伝子発現により増殖する細胞に前 記アポトーシス誘導剤を細胞に接触させることを特徴とする。
なお、 c-myc 遺伝子は殆ど全ての動物細胞においてその増殖に関与することか ら、 本発明の方法は実際には全ての動物細胞のアポトーシスを誘導するために適 用することができるが、 特に、 ciyc 遺伝子の過剰発現によって癌化した細胞を 対象とすることが好ましい。
本発明の方法は、 in vi tro細胞 （培養細胞） を対象とすることもでき、 in vivo 細胞 （動物体内の細胞） を対象とすることができる。 in vi tro細胞を対象とする 場合は、 前記のとおり、 タンパク質発現ベクターを電気穿孔法、 リン酸カルシゥ ム法、 リボソーム法、 DEAEデキストラン法など公知の方法で細胞内に導入する方 法、 またタンパク質それ自体の溶液をマイクロインジェクションする方法や脂質 を介して細胞に導入する方法、 あるいは PTDペプチド融合タンパク質を培養細胞 に接触させる方法等によって実施することができる。
in vivo細胞を対象とする場合は、 前記のとおり、 ポリヌクレオチドを遺伝子 治療に準じた方法により体内細胞に導入する方法や、 タンパク質それ自体の溶夜 を体内細胞にマイクロインジェクションする方法や脂質を介して細胞に導入する 方法、 あるいは PTDペプチド融合タンパク質溶液を体内に投与する方法等によつ て実施することができる。
in vivo細胞は、全ての動物個体内の細胞を対象とすることができるが、特に、 有用動物 （家畜、 愛玩動物等） の癌治療等を目的とするアポトーシス誘導が好ま しい。 また、 ヒ卜の癌治療を目的とするアポトーシス誘導がさらに好ましい。
3 . 癌の治療方法
本発明の癌の治療方法は、 癌を有する哺乳動物に対して前記アポトーシス誘導 剤を癌の治療上有効な量で投与することを特徵とする。
ここで、 哺乳動物としては、 ヒト、 ィヌ、 ネコ、 ヒッジ、 ャギ、 ゥシ、 ゥマ、 ブタ等が挙げられる。 「癌の治療上有効な量」 とは、 増殖中の癌細胞に対する本剤 の投与によって、 癌細胞の増殖の停止、 腫瘤サイズの縮小又は消失をもたらす量 をいう。 具体的な投与量は、 投与経路、 患者の年齢及び体重、 癌の種類及び悪性 度、 転移又は再発の有無などにより適宜増減すべきである。
投与形態としては、 静脈内、 動脈内、 筋肉内、 腹腔内、 皮下、 局所、 腫瘤内、 経口、 経皮、 直腸内、 膣内、 鼻腔内、 舌下投与等が挙げられる。 具体的には、 例 えば、 外科手術により容易に接近可能な各種臓器内の固形腫瘍に対しては腫瘍内 に又はその近傍に定位固定針などを用いて局所注入することによって投与すれば よく、 白血病などの非固形腫瘍、 脳腫瘍などの外科的手術により接近しにくい部 位の癌、 転移性癌については、 静脈内注射によって投与することができる。 その 他、 癌の種類や部位によって、 上記の投与方法を適宜選択して使用することがで さる。
遺伝子治療の形態としては、 標的細胞を体外に取り出して遺伝子導入を行う体 外法 （ex vivo法）、 体内に遺伝子を導入する体内法 （in vivo法） があるが、 本 発明のアポトーシス誘導剤はいずれの治療形態にも適用される。 体外法では患者 由来の細胞を一旦体外で培養し、 上記ポリヌクレオチドの導入処理をした後に患 者に投与すればよいし、 体内法では上記のポリヌクレオチド導入ベクターを直接 患者体内 （臓器組織、 皮膚、 筋肉など） へ投与すればよい。
また、 かかる癌治療は、 外科的手術、 化学療法、 及び放射線治療を含む、 周知 の癌治療手段と併用してもよい。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を実施例により具体的に説明するが、 本発明はこれらの実施例に より限定されるものではない。
(実施例 1 ) 発現プラスミドの作製と癌組織標本試料の採取
(1)発現プラスミドの作製
完全長 FIR c DNA (配列番号 2 ) 及び FIRの転写活性部位である N末側 Π個の アミノ酸配列 （配列番号 2のアミノ酸配列の 1位から 77位までのアミノ酸配列:) が欠失した FIR変異体を PCGNM2 ベクタープラスミド （Liu, J. et al. , Cel l, 104 : 353-363, 2001)にクローニングし、 それぞれの発現プラスミド （HA- FIR と HA-FIRANTT) を作製した。
また、 ヒ ト c- Myc 発現べクタ一として、 pcDNA3. 1-c-myc、 GeneStorm™ Express ion-Ready Clones (Invi torogen Co. , AL〉を購入した。
(2) ヒト大腸癌組織標本の採取
術前に文書による同意を得た原発性大腸癌の患者 15 例から外科的に組織を切 除した。切除試料は、腫瘍上皮組織及び腫瘍から 5-10cm離れた非腫瘍上皮組織か ら手術による切除後、 1 時間以内に採取した。 二人の病理医が全ての組織試料が 腺癌であることを顕微鏡観察によって確認した。 全ての切除試料は直ちに液体窒 素中に置き、 -80°Cにて分析まで保存した。
(実施例 2 ) FIRによる外来性 c- myc遺伝子の転写抑制試験
外来性の C- mycプロモーターに対して FIRが転写抑制能を有するか否かを調べ るため、 c-myc フロモ一ターを chloramphenico l acetyl transferase (CAT) 遺 伝子の上流に持つレポ一夕一プラスミドを、 実施例 1で作製した HA- FIR 又は
HA-FI A N77と HeLa細胞にコトランスフエクトし、 CATの発現を調べた。
(1)方法 （CATアツセィ）
HeLa細胞を 10% fet al cal f serumをカロえた Dulbecco' s Mod i f i ed Eagle' s Medium
(丽 EM, Gibco-BRL) で培養し、 電気穿孔法 (e lctroporat ion) により HA- 又 は HA-FIRA N77を、 c- myc プロモーターを chloramphenicol acetyl transferase (CAT)遺伝子の上流に持つレポータープラスミドとともに導入した。遺伝子導入 から 48時間後、 文献 (Tomonaga, T. e t al. , J. B iol. Chem. , 270 : 4875-4881, 1995) の記載に従い、 CATの発現を調べた。
(2)結果
図 1に CATアツセィの結果を示す。 FIRは顕著に CATの発現を抑制した。 しか し、 ァミノ末端を削除した変異 FIRは正常の FIRに比べ CATの発現抑制が減弱し ていた （図 1 )。
(実施例 3 ) FI による内在性 c- niyc遺伝子の転写抑制試験
細胞内にもともと存在する c-myc遺伝子のプロモーター （内在性の C- mycプロ モーター） が FIIUこよって転写抑制されるか否かを免疫組織化学染色、 及びフロ 一サイトメトリー解析により調べた。
(1) 方法
(1-1) 免疫組織化学染色
HeLa細胞をカバ一グラス上でー晚培養し、 Lipofec tamine Plus reagent s (Gibco BRUを用い、 プラスミド （M- FIR及び HA FIRAN ) をトランスフエクトした。 プラスミド導入から 24時間後、 既報 （He, L. , e i al. , Embo J, 19 : 1034-1044, 2000) の記載に従い、 細胞を処理した。
一力バーグラス上の細胞を 4%-パラホルムアルデヒドで固定後、 PBSで洗浄し、室 温で 1次抗体と 1時間反応させた。マウス抗- HAモノクローナル抗体（Santa Cruz
Biotechnology, CA )、 ゥサギ抗- c- Myc ポリ ク ローナル抗体 （Ups tate
Biotechnology, NY)、 マウス抗 c-Myc モノクローナル抗体 (Oncogene Research
Produc ts, CA)をブロッキングバッファーで 500倍、 1， 000倍、 500倍にそれぞれ 希釈したものを 1次抗体として使用した。
その後 PBSで再度洗浄し、二次抗体 [ローダミン標識ー抗マウス IgG (Roche)、 蛍光イソチオシァネート （FITC) 標識ー抗ゥサギ IgG (Sigma) をそれぞれ前記ブ ロッキングバッファ一で 1, 000倍及び 500倍に希釈してもの] を反応させた。 細 胞核の DNAを diamid inophenyl indole (DAPI, 1 x g/ml ) で染色し、 免疫蛍光顕微 鏡（Leica QFISH; Le ica Microsys tems, Tokyo, Japan)で観察した。 (1-2) フローサイトメトリー解析
FIRによる C- Myc発現抑制を定量するために細胞を 2色 FACScan解析（He, L. , e t al. , Embo J, 19 : 1034-1044, 2000) に供した。 すなわち、 トランスフエクシ ヨン 22時間後、 細胞をトリプシン処理し、 PBSで洗浄後、 一 20°Cのエタノールで 少なくとも 2時間固定し、 細胞を冷 PBSで二回洗浄後、 マウス抗- HA抗体及びゥ サギ抗 -c- Myc抗体を 1次抗体として反応させた。 PBSで洗浄後、 二次抗体 [FITC - 結合-抗-ゥサギ IgG (S igma)及び R-PE-結合-抗-マウス IgG (PharMingen)をそれ ぞれ 200倍に希釈したもの] を反応させた。
各サンプルにっき 000個の細胞を、 c- Myc- FITC を FL1強度、 HA- PEを FL2 強度として検出するフローサイトメトリーで解析した。 トランスフエクトされた 細胞 （PE-陽性細胞） を X軸にとり、 TC-陽性細胞 （c- Myc 発現細胞） を Y軸に とって表示した。
(2) 結果
HA-FIR及び HA- FIRAN77を HeLa細胞にトランスフエクトし、 内在性 c- Mycの 発現を免疫組織化学染色によつて可視化した結果を図 2に示す。
HA - FIR発現細胞では c- Myc発現レベルが大きく抑制されたのに対し （図 2、 上 段のパネル、 A印）、 HA-FIRAN77発現細胞ではその抑制活性が弱まっていた （図 2、 下段のパネル、 矢印）。
HA - FIR及び HA- FIRAN77を HeLa細胞にトランスフエク卜し、 内在性 c_Mycの 発現をフローサイトメトリ一解析 （2色 FACScan解析） より定量した結果を図 3 に示す。 HA- FIRは c-Myc発現を抑制するが（図 3、 上段、 左側のパネル）、 HA-FIR △ N77ではそのような作用はなく （図 3、 上段、 中央のパネル）、 HAベクターのみ では抑制しなかった （図 3、 上段、 右側のパネル）。
また、 HA- F 陽性集団内では、 C- Mycレベルが顕著にゲート領域で二峰性とな り （図 3、 上段、 左側のパネル）、 c-Myc レベルが HA- FIR トランスフエクト細胞 において急激に減少した。 HA- FIRAN77又は HA-tagトランスフエクト細胞におい ては、 c- Myc 発現レベルがトランスフエクト細胞及び非トランスフエクト細胞間 で一様に区別できなかった （図 3、 上段の中央及び右側のパネル）。
下段のパネルは上段のパネルにおいて印をつけたゲート領域における c- Myc発 現のヒストグラムを示す。 ゲート領域における c- Myc の平均値 （Geo- mean)は、 HA - FIIUこ対しては 19. 4 (8. 0)、 HA - FIRAN77に対しては 22. 6 (9. 6)、 HA空べク 夕一に対しては 35. 5 (30. 0) であった。
以上より、 FIRは内在性 c- Myc発現を抑制し、 FIRァミノ末端ドメィンはその抑 制に必須であることが確認された。
(実施例 4 ) ΗΙΠこよる細胞死 （アポトーシス） 誘導
FIRは内在性の c-myc発現を抑制するので、 FIR高発現によってアポトーシスを 誘導できるかどうかを、 全長 FIR、 及び N端側の 76アミノ酸配列を欠失した変異 FIRを用いて調べた。
(1) 方法（TUNEL法）
150fmolの HA- FIR又は HA- FIRAN77、空べクタ一プラスミドを 6 -ゥエルプレ一 ト内の HeLa細胞にトランスフエクトし、 60時間後にアポトーシス誘導を調べた。 アポトーシス細胞は製造業者の指示に従い、 TUNEL 法 （Apoptos is Detect ion Sys tem, Fluorescein. Promega, WI, USA) により検出した。 すなわち、 力バーグ ラス上で培養した HeLa細胞を 4%-パラホルムアルデヒドにて 10分間氷上で固定 した。 PBSで洗浄後、細胞を 0. 5%トリ トン- X- 100の PBS溶液で 5分間透析した。 PBSで二度洗浄後、 FITC標識- dUTP(MEBSTAIN Apop tos is Ki t : Medical & Biological Laboratories, JAPAN) を含むターミナルデォキシトランスフェラ一ゼ （TdT) に よる in s i tu nick-end label ingを用いて DNAのヌクレオゾーム内断片化を検出 することでアポトーシス細胞を可視化した。
HeLa細胞を 1 uni t/nil DNase I (GenHunter Corporat ion, Nashvi l le, TN) で 処理し、この細胞を陽性コントロールとした。 DNA tt DAP I I I I Counterstain(Vys is( Abbot t Park, IL)で染色し、蛍光顕微鏡（Leica QFISH; Leica Microsystems, Tokyo, Japan) で観察した。
2色 FACScan解析を行うに際し、 細胞をトリプシン処理後、 -20°Cエタノールで 少なくとも 2時間固定した。 PBSで二度洗浄後、 細胞を FITC標識- dUTPを含む 50 il lの TdT tmifer中でインキュベートした。その後、 250 g の DNase- free RNase
Aを含む 0. 5 mlのヨウ化プロピジゥム （PI) 溶液 （PBSで 5 g/mlに新たに希釈） に細胞を再懸濁した。
各サンプルにっき 10， 000個の細胞を、 FITCを FL1強度、 PIを FL2強度として 分析した。 PI-陽性細胞を X-軸にとり、 FITC-陽性細胞 （アポトーシス陽性細胞） を Y-軸にとって表示した。
(2)結果
HA-FIRは DNA断片化を伴ったアポトーシスを誘導した （図 4、 上段、 左側のパ ネル、 矢印）。 一方、 HA-FIRA N77又はコントロールベクター （HA空ベクター） で トランスフエクトした細胞においてはほとんどアポト一シスは起こらなかつた (図 4、 上段、 中央及び右側のパネル）。
図 5は、 2色解析によってアポ! ^一シス細胞を定量した結果を示す。 各パネル における上部-ゲート領域に見られるアポト一シス細胞を図に示した。 10, 000 個 あたりのアポトーシス細胞のパーセンテージは、 HA-FIRでは 16. 5 %、HA- FIRAN77 では 6. 6%、 HA空ベクターでは 2. 0%、そして丽 asel処理細胞（陽性コントロール） では 75. 6%であった。
(実施例 5 ) FIRと C- Myc共発現による細胞死 (アポ卜一シス) 誘導
(1) 方法（TUNEL法）
600ng の pcDNA3. 1-FI を 6 -ゥエルプレートに撒いたセミコンフルェントな He l a細胞に、 60ngの c- Myc発現プラスミド （pcDNA3.卜 c- myc)とともに、 又は単 独でトランスフエク卜し、 上記と同様に TUNEL法にて分析を行った。
(2) 結果
c - Myc発現は、 c-mycプラスミドを FIRプラスミドとコトランスフエク卜した場 合に顕著に上昇したのに対し （図 6、 中段、 右側のパネル）、 FIR単独をトランス フエクトした場合は顕著に抑制された （図 6、 中段、 左側のパネル）。 核蛍光標識 像 （DAPI染色） では、 c-inyc共発現細胞 （図 6、 下段、 右側のパネル） に比べて、 FIR単独発現細胞では核が膨張し、分解していることが確認された（図 6、下段、 左側のパネル）。
また、 アポト一シス細胞の数は、 FIR単独によるアポ卜一シス細胞は 21. 1 %で あるのに対し、 C- myc発現プラスミドとコトランスフエクトした場合は 4. 2 %と大 幅に減少した （図 7)。
また、 c- mycプラスミドを FIRプラスミドと種々の割合でコトランスフエク卜 した場合のアポトーシス細胞の数を調べた結果を表 1に示す。 これらの結果は FIRによるアポトーシス誘導が c- Myc抑制のため 起こることを示している。
表 1 導入プラスミド
pcDNA3.1-FIR (ng) 600 600 600 600 600 600 0 pcDNA3. l-c-myc (ng) 0 0 10 20 50 60 60 pc丽 A3.1 ベクター (ng) 0 60 50 40 10 0 0
10, 000個細胞当たりの 17.3 21.1 4.2 5.6 6.7 7.0 7.5 アポ卜一シス細胞の割合は）
(実施例 6) 腫瘍及び正常組織における FIRタンパク質、 FIR mRNAの解析 (1) 方法
(1-1) タンパク質抽出及びィムノブロッティング
全タンパク質溶解物は、 上記のペアサンプルより以下のようにして調製した。 凍結組織試料を Polytron homogenizer (Kinematica, Switzerland)を用いて溶解 バッファー [7M尿素、 2Mチォ尿素、 2 % 3- [3- ChoIamidopropy dimethyla腿 on io-31-propanesulfate (CHAPS), 0.1M ジチオスレィトール （DTT)、 2% IPGバッ ファ一 (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK)、 翻 M Tris]に溶 解し、 4でにて 1時間遠心分離した （100， 0OOX g)0上清のタンパク質量をプロテ インアツセィ（Bio- Rad, Hercules, CA)によって測定した。 タンパク質は 8 %ァク リルアミドゲルで電気泳動し、 tank transfer appraius (Bio- ad, Hercules, CA) 内のフッ化ポリピニリデン膜 (Millpore, Bedford, MA)に移した。膜を 5%スキムミ ルク' PBS溶液で 1 時間ブロックした。 それぞれブロッキングバッファ一で 1000 倍、 500倍に希釈したゥサギ抗- FIRポリクローナル抗体 （抗体産生の可能性を高 めるため 2つの合成べプチド： GDK KPPQGTDSI ME (30-45) と EVYDQE FDNSDLSA (5
28-542)を同時に免疫することによって調製したもの）及びャギ抗 -；6-ァクチンポ リクローナル抗体（Santa Cruz, Santa Cruz, CA)をプロッキングバッファ一にて それぞれ 1000倍、 500倍に希釈したものを 1次抗体として用いた。 3000倍に希釈 したャギ抗-ゥサギ IgGホースラディッシュパーォキシダーゼ結合体 （HRP) (Jack son, West Grove, PA)及び 500倍に希釈したゥサギ抗-ャギ IgG HRP (Cappel, We st Chester, PA)を二次抗体として用いた。 膜上の抗原を ECL ™ detection reag ent (Amers am Pharmacia Biotech)によって検出した。 loadingコン卜ロールとし て -ァクチン抗体を用いるィムノブロッティングを行った。各バンドの強度を N IH Imageによって測定した。
(1 - 2 ) RT-PCR及びリアルタイム定量的 PCR
全 RNA及びゲノム DNAを腫瘍及び非腫瘍上皮組織から RNeasy ™ Mini Kit及び DN easy ™ Tissues Kit (Qiagen)を用いて抽出した。 cDNAを全 RNAから RT-PCR 用 1st strand cDNA Synthesis Kit (Roche, Mannheim, Germany)を用いて合成 した。 この cDNAを铸型とし、 FIR cDNAをプライマー （フォワード： 5' - GGCCCCAT CAAGAGCATC-3' (配列番号 3 )、 リバース： 5' -GGGGCTGGGCCAGGGTCAG-3' ) (配列番号 4) を用いて RT-PCRによって増幅した。 対照として、 GAPDH cDNAを増幅した。
Light Cycler ™ instrument (Roche, Mannheim, Germany)を用レ て FIR cDNA のリアルタイム定量的 PC を、 master mixture [LightCycler™ -FastStart DNA Master SYB Green I; FastStart Taa DNA polymerase, dNTP mixture, バッファ ― (LightCycler™ DNA Master hybridization probes, Roche)、 3. OmM MgCl2、 0.5 liU 各センス及びアンチセンスプライマー、 及ぴ 1 の cDNA 鍀型を LightCycler™ capillary 内に含む]からなる 20 1 反応混合物中で実施した。 Light Cycle ^ソフトウェア version3.3 (Roche)を定量的 RT- PCRの分析のために 用いた。 プライマーと LightCycler™条件の最適の最適化は Nihon Gene Research Laboratories, Inc.で行った。
リアルタイム定量的 PCRによる FIRcDNA増幅のためのプライマーは以下のとお りである CPCR産物サイズは 275bp)。
フォワード： 5'- GCACCTGGAGTCATCACA - 3' (配列番号 5 )
リバース ： 5'-CGCAGAACCATCACTGTAG-3' (配列番号 6 ) これらのプライマーによる PCR産物を、 Light Cycler™の定量カーブを決定す るために Qiagen PCR product purification kitにて精製した。
FIRゲノム DNAもまた以下のプライマーを用いてリアルタイム定量的 PCRによ つて定量した。
フォワード： 5'-GGAGTCTACAGTGATGGTTC-3' (配列番号 7 )
リバース： 5'-TCCTGGTCGTACACTTCA-3' (配列番号 8 )
ヒト C- myc cDNA及びヒト j3-ァクチン c丽 Aに対するプライマ一は以下のとおり である。
(c-myc用）
フォワード ： 5'-GCCTCAGAGTGCATCGAC-3' (配列番号 9 )
リバース： 5'-TCCACAGAAACAACATCG-3' (配列番号 1 0)
ァクチン用）
フォワード ： 5' -TGGAGAAAATCTGGCACCAC-3' (配列番号 1 1)
リバース： 5' -AATGGTGATGACCTGGCCGT-3' (配列番号 1 2)
(2)結果
図 8 Aにィムノブロッテイング結果を示す。 各バンドの強度を NIH Imageにて 測定し、 FIRタンパク質レベルの （T)及び （N)間の 3 -ァクチンに対する相対平均 値を測定した （図の下部）。 Dukes stageを図 8の上部に付記した。 FIRレベルは 意外にもほとんどの大腸癌組織において対応する非腫瘍上皮と比べて増加してい た （図 8A)。
(T)及び（N)のペアサンプルから調製した全颜 Aに対して RT-PCRを行った結果 を図 8 Bに示す。 （T)における FIR mRNAは、 （N)の FIR mRNAより一例 （ケース番 号 5) を除いて高かった。 GAPDHmRNAレベルもまた内部コントロールとして示し た。
リアルタイム定量的 PCRによって検出された （T)及び（N)の FIRmRNA発現レべ ルのヒストグラムを図 8 Cに示す。 （T)における FIRmRNAは （N)の FIRmRNAより 有意に高かった （t- testでは ρく 0.0056； Wilcoxon testでは p〈0.り 008)。
また、 各大腸癌組織における FIRと c- niycmRNAの （Τ) / Ν)発現比は有意に相関 していた（図 8 D)。 FIR発現レベルの平均は c- myc 発現レベルの平均と顕著に関 連しており、 Y=0. 72+0. 22X (Y : F IR発現比 （T/N)、 X： c-niyc 発現比 (T/N) ) で表 された。 相関係数は 0. 70で、 p値は 0. 00019。
これらの結果より、 大腸癌における c-Mycの脱制御は FIRのダウンレギユレ一 シヨンによるのではなく、 FIR 機能の損傷による可能性が高いといえる。 逆にい えば、 FIRは c-Myc増加と相関する大腸癌においてアップレギュレートされてい ると考えられる。
(実施例 7 ) FIRのァミノ末端変異の検出及び解析
( 1) 方法
F のァミノ末端領域を以下のプライマーを用いて PCRによって増幅した。 フォワード： 5' -AGACAGCGGAAGGAGCAAGAGTGG-3' (配列番号 1 3 )
リバース ： 5' -CTGTGCAGCTTCGGGGACCTCATA-3' (配列番号 1 4 )
FIR ァミノ末端領域 （NTD)の PCR産物を 1 %ァガ口一スゲルに載せ、 pGEM™ - T Easy vector sys t em (Promega, WI) へのクローニング前【こ Gel Ext rac t ion Ki t™ (Qiagen)によって精製し、 DNA配列決定した。 直接的な丽 A配列は少なくとも 4 つの異なるプライマ一で （フォワード方向から 2つ、 リバ一ス方向から 2つ） 確 認した。 変異が検出された場合、 DNA配列決定をフォワード及びリバース方向の 両方から少なくとも計 8回行った。 さらに、 pGEMTM - T Easyベクターにクローン化 した FIRの NTDに変異がある場合、 RT- PCR産物を直接に配列決定してその正確性 を確認した。
(2)結果
大腸癌組織から単離された全長 FIRcDNAを配列決定したところ、 驚くべきこと に、 FIRのァミノ末端（1位〜 156位のアミノ酸） において少なくとも一つの変異 を含んでいる例が数例確認された。
完全長 FIRcDNA (HA- FIR)、 及び上記変異体のうちの 2例、 28T- FIR変異体 （コド ン 55において G欠損 （GGGから GG— ) を有し、 コドン 59で停止する変異体） と
118T- FIR変異体（4つの点変異を有し、 そのうち、 コドン 90の変異はアミノ酸置 換変異（His (CGC)から Arg (CAC) )を有する変異体） cDNAクローンを pcDNA3. 1ブラ スミドにそれぞれクローニングし、 He 1 a細胞へ導入して c- Myc抑制活性とアポト 一シス誘導について調べた結果をそれぞれ図 9及び図 1 0に示す。
FIR-野生型、 118T- FIR変異体、 28T- FIR変異体の発現を赤色で染色した（図 9、 上段のパネル）。 FIR-野生型、 118T- FIR 変異体は、 全細胞において発現している のに対し、 28T- FIR変異体は核内だけに局在化していた。 c-Mycを緑色で染色し（図 9、 中段のパネル）、 DNA を DAPI I I I で対比染色した （図 9、 下段のパネル）。 118T- FIR変異体及び 28T- FIR変異体は両方とも FIR-野生型に比べて c-Myc抑制活 性が減少していた。
また、 118T- FIR変異体及び 28T-FIR変異体は両方ともアポトーシス誘導が損な われていた（図 1 0 )。
以上より、 ヒト大腸癌組織において FIRはそのアミノ末端領域において変異が 生じており、 この変異が FIRの有する c-Mycの抑制とアポトーシス誘導の機能を 損なう原因となっていることが示唆される。
(実施例 8 ) FIRアデノウイルスベクターによる感染試験
FIRアデノウイルスベクタ一 （1. Ol x i01Di iu/ml)を作成し、 子宮頸癌 （HeLa)、 食道癌（T. Tn)の各細胞株に感染させ、細胞増殖抑制を ΜΤΤアツセィによって定量 化した。 コントロールとして _ガラクトシダーゼ遺伝子を発現させ、 FIR アデ ノウィルスベクターと比較した。細胞数を 50%に減少させる FIRアデノウイルス ベクターの M0Iを測定したところ、 HeLa細胞では 191. 4 (532. 8)、 T. Tn細胞では 615. 1 (1410. 6) であった （括弧内は 3—ガラクトシダーゼ遺伝子の M0I)。 図 1 1 に HeLa細胞及び T. Tn細胞の生存率を MTTアツセィによつて測定したグラフを示 す。 c - Mycを高発現するこれらの癌細胞において FIRアデノウイルスベクターの 抗腫瘍効果が確認された。
また、 FIR アデノウイルスベクタ一感染後の大腸癌 （SW480, DLD1)、 子宮頸癌
(HeLa) , 食道癌 （T. Tn)の各癌細胞株における核内及び細胞質内の FIRタンパク 質発現をィムノブロッティングにより分析した結果を図 1 2に示す。 大腸癌
(SW480, DLD1)細胞、 食道癌 （T. Tn)細胞において、 FIRアデノウイルスベクター の感染効率に相違が認められた。 T. Tn細胞では FIRアデノウイルスベクターの感 染効率が低い（タンパク質発現量が低い）にも関わらず、殺細胞効果は高かった。 本明細書で引用した全ての刊行物、 特許及び特許出願をそのまま参考として本 明細書に組み入れるものとする。 産業上の利用可能性
本発明によれば、 c-myc 遺伝子を標的として、 細胞アポ ] ^一シスを安定かつ確 実に有効するための新しい手段が提供される。 これによつて癌治療に新たな途が 拓かれる。

Claims

請求の範囲
1 . FUSE 結合タンパク質 （FUSE bind ing pro te in)と相互作用するタンパク質を 有効成分として含有するアポトーシス誘導剤。
2 . FUSE結合タンパク質と相互作用するタンパク質が、
配列表の配列番号 2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質；
配列表の配列番号 2に示すアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠 失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつアポトーシス誘導活性 を有するタンパク質；又はそれらの部分ペプチドである、 請求項 1に記載のアポ トーシス誘導剤。
3 . FUSE結合タンパク質と相互作用するタンパク質をコードするポリヌクレオチ ドを有効成分として含有するアポトーシス誘導剤。
4 . FUSE結合タンパク質と相互作用するタンパク質をコードするポリヌクレオチ ドが、
配列表の配列番号 1に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド ；
配列表の配列番号 1に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配 列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、 かつアポト一シス誘導活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド ； 又は、 それらの部分断片である、 請求項 3に記載のアポト一シス誘導剤。
5 . 細胞内に導入可能な形態を有していることを特徴とする、 請求項 1 ~ 4のい ずれかに記載のアポトーシス誘導剤。
6 . 細胞内に導入可能な形態がベクターである、 請求項 5に記載のアポトーシス 誘導剤。
7 . 癌の治療のために用いる、 請求項 1〜6のいずれかに記載のアポトーシス誘 導剤。
8 . c-myc 遺伝子発現により増殖する細胞にアポト一シスを誘導する方法であつ て、 請求項 1〜7のいずれかに記載のアポトーシス誘導剤を細胞に接触させるェ 程を含むことを特徴とするアポトーシス誘導方法。
9 . 細胞が癌細胞である請求項 8の方法。
1 0 . 細胞が哺乳動物の体内 ある細胞である請求項 8又は 9に記載の方法。
1 1 . 哺乳動物がヒ卜である請求項 1 0に記載の方法。
1 2 . 哺乳動物に対して、 配列表の配列番号 2に示すアミノ酸配列からなるタン パク質；配列表の配列番号 2に示すアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミ ノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつアポトーシス 誘導活性を有するタンパク質；又はそれらの部分ペプチドの有効量を投与するこ とを特徴とする、 癌の治療方法。
1 3 . 哺乳動物に対して、 配列表の配列番号 1に示す塩基配列からなるポリヌク レオチド；配列表の配列番号 1に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補 的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイプリ ダイズし、 かつアポ卜一シス誘導活性を有するタンパク質をコードするポリヌク レオチド；又はそれらの断片の有効量を投与することを特徴とする、 癌の治療方 法。
1 4 . 哺乳動物がヒ卜である請求項 1 2又は 1 3に記載の方法。
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