WO2004099424A2 - Anreicherung von enzymatischen spaltprodukten - Google Patents

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WO2004099424A2
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    • C12N9/6408—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Definitions

  • the invention relates to a method . for the enrichment, isolation and / or identification of enzymatic cleavage products as well as certain mutants and their use.
  • proteases as enzymes that catalyze cleavage play a major role in the breakdown of proteins.
  • proteases are the enzymes that catalyze the hydrolytic cleavage (proteolysis) of the peptide bond in proteins and peptides.
  • the proteases can be divided into the so-called proteinases (formerly: endopeptidases) and peptidases (formerly exopeptidases).
  • the former cleave petid bonds inside a protein and thereby produce peptides as cleavage products.
  • the latter cleave proteins at the amino or carboxy end.
  • proteases which are preferably proteinases.
  • proteinases and their cleavage products are of particular interest for degradomics research.
  • the caspases play an important role in the controlled degradation of various cellular substrates, in particular they are involved in apoptotic processes, that is to say in degradation processes which are associated with controlled cell death.
  • the caspases are a highly conserved protease family with at least 12 human members. Because of their role in inflammatory processes and in cell apoptosis, caspases are of enormous scientific interest.
  • the caspases are cysteine proteases, which means that these proteases carry cysteine at a critical point in the active center, which is crucial for proteolytic activity.
  • Caspases are very specific proteases that cleave in their substrate after an aspartic acid residue. All cleavage products of the caspases therefore carry an aspartic acid residue at the C-terminal end of the peptide cleavage product (position P1). At position P3 there is often glutamic acid.
  • the object of the invention is to provide a method with which cleavage products of a specific enzyme or a group of enzymes can be investigated with a few process steps.
  • Claim 16 relates to a specific mutant of a protease and claim 25 relates to a corresponding nucleotide sequence.
  • Claims 27 and 29 deal with the use of the mutant or with a corresponding affinity matrix. Preferred embodiments can be found in the subclaims. By reference, the wording of all claims is made the content of the description.
  • cleavage products of at least one enzyme from a sample can be enriched, isolated and / or identified.
  • This is done using an enzymatically inactive mutant of a protease as affinity material, it being decisive for the method according to the invention that the enzymatically inactive mutant of the protease continues to have its substrate specificity. It is also important that the enzyme or enzymes to be analyzed have at least a structural similarity to the hydrolytic products of the protease, the mutant of which is used.
  • the enzymatic inactivity is advantageous since otherwise the protease used as the affinity material could itself produce fission products which would possibly falsify the results of the method according to the invention.
  • the sample containing the cleavage products to be detected is first incubated with the enzymatically inactive mutant, so that interactions between the cleavage products to be detected in the sample and the mutant can develop. These interactions are based on the fact that the mutant has a high binding affinity for substrates with certain structural features. The cleavage products to be detected have these structural features, so that they are specifically bound by this mutant. In a further step of the method, material that does not interact with the mutant can be removed. The cleavage products that had been bound by the mutant can then be analyzed. Whether a separation of the interacting cleavage products from the mutant before the actual analysis of the cleavage products is useful and possibly necessary depends on the specific design of the method and in particular on the analysis method.
  • the method according to the invention is based on the one hand that the protease, the mutant of which is used as an affinity material, has a high binding affinity for its own substrates and also for the products which result from the proteolytic cleavage of the substrates. Furthermore, it is necessary that this binding activity of the protease can be separated from its catalytic activity. Such a separation of the catalytic activity from the binding activity is already known for the proteases trypsin and chymotrypsin. A so-called anhydro modification in the catalytic center of these proteases can destroy the catalytic activity, that is to say the catalysis of hydrolytic cleavages, while the binding affinity for the cleavage products is retained.
  • anhydrotrypsin or anhydrochymotrypsin
  • the cleavage products are peptides that have arginine and lysine at the C-terminal end.
  • anhydrochymotrypsin these are peptides with hydrophobic amino acids at the C-terminal end.
  • the anhydro mutants of trypsin and chymotrypsin can be achieved by chemical modification or treatment, with serine in the active center of the enzymes being replaced by alanine, ie the anhydro form of serine.
  • the enzyme whose cleavage products are to be enriched, isolated and / or identified is a protease, this protease preferably differing from the protease whose enzymatically inactive mutant is used as affinity material.
  • This embodiment of the invention has the great advantage that the enzymatically inactive mutant of a protease can be used as a universal tool for examining the cleavage products of any enzyme, as long as the cleavage products to be examined have the corresponding structural features as they do for the binding activity of the enzymatically inactive mutant used for certain substrates are required. This makes it a widely applicable process for proteome research, which is based on the use of functional features. With the aid of the method according to the invention, results can be achieved, among other things, which allow conclusions to be drawn about the identity of different substrates or products of certain enzymes. This also enables the activities of enzymes or entire enzyme families to be quantified.
  • the structural similarity between the cleavage products to be investigated and the products which are bound by the protease, the enzymatically inactive mutant of which is used is one or more identical terminal amino acid residues, in particular C-terminal residues.
  • the mutants of which can be used according to the invention the binding affinity to their substrates is based on one or more specific C-terminal amino acids.
  • V8 proteinase from Staphylococcus aureus shows a specific binding affinity for peptides which have glutamic acid (Glu) or aspartic acid (Asp) at the C-terminal end.
  • Glu glutamic acid
  • Asp aspartic acid
  • An enzymatically inactive mutant of this V8 proteinase, which still has its substrate specificity, is therefore suitable according to the method according to the invention for the analysis of cleavage products of other enzymes which have corresponding C-terminal amino acids or corresponding residues.
  • the enzymatically inactive mutant of the protease carries a change in the active center. This destroys the catalytic activity according to the invention, but the binding activity is retained.
  • the protease whose mutant is used is a serine protease.
  • Serine proteases are characterized in that they carry serine at a critical point in the active center. Removing or replacing this serine destroys the enzymatic activity, whereas the substrate specificity is retained. These proteases are therefore particularly suitable according to the invention since a single change which brings about a corresponding amino acid exchange can provide a mutant which can be used according to the invention.
  • These particularly suitable serine proteinases include, for example, the V8 proteinase already mentioned.
  • the enzymatically inactive mutant is advantageously an anhydro mutant.
  • this is an exchange of serine for alanine. Since in the serine proteases mentioned a serine in the catalytic center of the protease is responsible for the hydrolytic activity, such an anhydro mutation can destroy the hydrolytic activity while maintaining the substrate specificity.
  • other mutants of proteases can also be used according to the invention as long as they are enzymatically inactive, that is to say can no longer catalyze hydrolytic cleavage, and continue to have their substrate specificity.
  • the enzymatically inactive mutant is used in immobilized form.
  • the method can be carried out in the form of column chromatography, in which case the enzymatically inactive mutant can be immobilized on a conventional chromatography material, such as, for example, Sepharose, Agarose or Fractogel. Immobilization can be carried out using customary methods.
  • the mutant can be coupled to immobilized nickel ions (eg Ni-NTA agarose) via a sequence of histidines.
  • the enriched fission products can be analyzed using customary methods. Analysis using one- and / or two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis is particularly preferred. Furthermore, the analysis can be carried out using conventional mass spectrometric methods. Mass spectrometry can also be combined with polyacrylamide gel electrophoresis or other common methods.
  • Chromatography in particular column chromatography, for example conventional affinity chromatography, can be carried out to carry out the actual method, that is to say incubating the sample and removing non-interacting material.
  • the analysis can comprise one or more chromatography steps, in particular column chromatography steps.
  • a further separation of different enriched cleavage products can be achieved by one or more chromatography steps.
  • the fission products to be analyzed are modified in the course of the method. In particular, this can involve further cleavage of the cleavage products, which is achieved, for example, by treatment with suitable enzymes. Tryptic digestion or the like is particularly suitable for this. Such a modification takes place above all with regard to an analysis of the fission products, the fission products being further fragmented, for example, for a mass spectrometric analysis.
  • the protease, the enzymatically inactive mutant of which is used is a V8 proteinase, for example a V8 proteinase from Staphylococcus aureus.
  • a corresponding mutant, in particular an anhydro mutant of this enzyme is particularly suitable according to the invention. It is to be used for the enrichment, isolation and / or identification of cleavage products which carry a C-terminal residue of glutamic acid or aspartic acid. It is particularly preferred here to enrich or isolate and / or identify peptides with a C-terminal aspartic acid residue.
  • the method according to the invention can advantageously be used to examine cleavage products of cysteine proteases.
  • the method is very particularly suitable for the investigation and characterization of fission products of one or more caspases.
  • Caspases are very specific proteases whose cleavage products have aspartic acid at the C-terminal end.
  • the use of an enzymatically inactive mutant of V8 proteinase is particularly suitable for the investigation of cleavage products of the caspases, since a corresponding mutant has a high affinity for cleavage products with a C-terminal aspartic acid residue.
  • the invention further comprises an enzymatically inactive mutant of a protease, the substrate specificity being retained in this mutant.
  • a corresponding mutant of a serine protease, in particular a V8 proteinase, for example a V8 proteinase from Staphylococcus aureus, is particularly preferred.
  • Such a mutant can be used with great advantage in the method according to the invention described.
  • this mutant it is the V8 proteinase mentioned, for example from Staphylococcus aureus, in which serine is modified, exchanged or removed at position 237.
  • the serine at this position is preferably replaced by another amino acid, in particular by alanine.
  • the exchange at position 237 from serine to alanine is preferably carried out by a single base exchange at position 712 from thymine to guanine.
  • the serine at position 237 is the critical serine in the active center of the proteinase. A change at this point destroys the catalytic, ie the hydrolytic, activity, while maintaining the substrate specificity.
  • the mutant according to the invention can be produced by chemical modification of the protease. However, it is particularly preferred if the mutant is produced by molecular biological methods.
  • the enzymatically inactive mutant according to the invention can be characterized in that it comprises at least part of the amino acid sequence according to SEQ ID No. 1 has. Furthermore, the invention comprises a corresponding mutant which is at least 70%, in particular at least 90%, and preferably at least 99% identical to the amino acid sequence according to SEQ ID No. 1 or one or more parts thereof. This mainly includes mutants that the part or parts of the amino acid sequence according to SEQ ID No. 1, which are responsible for the substrate specificity. In addition, the invention also encompasses mutants which are so similar to such sequences that they still bring about a corresponding substrate specificity in the sense of the invention.
  • the enzymatically inactive mutant is further characterized in that it is present in immobilized form.
  • the enzymatically inactive mutant is further characterized in that it is present in immobilized form.
  • the invention furthermore comprises a nucleotide sequence which codes for an enzymatically inactive mutant of a protease, the substrate specificity of which is retained.
  • a nucleotide sequence which codes for an enzymatically inactive mutant of a protease, the substrate specificity of which is retained.
  • the nucleotide sequence according to the invention is characterized in that it comprises at least part of the nucleotide sequence according to SEQ ID No. 2 includes.
  • the parts of the nucleotide sequence which code for the region of the protease and which are decisive for the substrate specificity are preferred.
  • the invention comprises the use of an enzymatically inactive mutant of a protease, the substrate specificity of which is retained, as an affinity material in a process for the enrichment, isolation and / or identification of cleavage products of at least one enzyme, at least one cleavage product of the protease and at least one cleavage product of the enzyme at least have a structural similarity.
  • the invention comprises an affinity matrix for the enrichment, isolation and / or identification of enzymatic cleavage products.
  • This affinity matrix comprises an immobilized, enzymatically inactive mutant of a protease while maintaining its substrate specificity.
  • This affinity matrix according to the invention can be used as a universal tool for investigations in the proteome area or in degradomics research. For example, changes in the activity of entire enzyme families, such as the caspases, can be examined under different conditions.
  • the affinity matrix can be used, for example, as a simple column chromatography matrix, comparable to a conventional affinity chromatography.
  • the cleavage products to be examined can be eluted, for example, by changing the buffer conditions and then analyzed.
  • the analysis can be carried out, for example, with a conventional two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. With such a method, results can be achieved in a few steps, which provide information about enzymatic activities.
  • substrates and products of enzymes, in particular proteinases can also be characterized and / or identified.
  • the method according to the invention provides an effective tool for selectively enriching or purifying specific classes of proteins or peptides which are of great interest in particular for proteome research.
  • Such a group-specific affinity tool opens up the possibility of creating profiles of proteins based on their activity. As a result, changes in the functional status of enzymes can be examined even if the quantitative level of the enzyme remains constant. Furthermore, the invention could be used to carry out tests on the effectiveness of inhibitors which influence the various members of an enzyme family, for example the caspases. For example, the intact cell or a cell extract with a potential inhibitor are treated, then to analyze the activity of the enzyme family according to the invention in the manner described above.
  • Fig. 1 shows a schematic representation of the construction of Ser237Ala-V8 ⁇ 48.
  • Fig. 2 Expression of the anhydro mutant of the V8 proteinase.
  • the protein samples were separated on a 12% SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE) with a discontinuous buffer. The coloring was done with Coomassie Brillantblau R-250. 1: total cell lysate, 2: run, 3: elution, 4: marker proteins.
  • Fig. 3 Enzymatic activities of the wild type and the anhydro mutant of the V8 proteinase.
  • the proteinase activity was measured at 30 ° C. in 0.1 M Tris-HCl pH 7.8, 0.01 M CaCl 2 with 0.4% universal protease substrate (Röche) in a volume of 0.2 ml. The activity was measured by absorption
  • the concentration of the proteinase was 1 ⁇ g / ⁇ l in each case.
  • the Ni-NTA agarose beads were treated with Ser237Ala-V8 ⁇ 48 in 50 mM Tris-HCl, 300 mM Load NaCI, 1% CHAPS at pH 7.4.
  • the neurotropic factor for retinal cholinergic neurons and [Cys (Bz) 84 , Glu (OBz) 85 ] - CD 4 (81-92) were incubated with the loaded agarose.
  • the agarose was washed and eluted with 200 mM acetic acid.
  • the samples were lyophilized in a Speed Vac and for the
  • Fig. 5 Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis of the eluates of the anhydro V8 agarose. Readystrip IPG strips (pH 5-8) were loaded with 40 ⁇ g cell extract. Isoelectric focusing (IEF) was carried out with up to 70 kVh. The SDS-PAGE was carried out with 11% polyacrylamide gels (70x70x1.0 mm) at 11 ° C. with constant current (40 mA). The second
  • the gels were stained with silver nitrate.
  • the left gel shows the control, the right gel shows the separated cell extract of the cells with induced apoptosis.
  • FIG. 6 Two-dimensional polyacrylamide gel of the separated cell extract of the cells with induced apoptosis, the different protein spots compared to the control gel (see FIG. 5) being marked with numbers.
  • FIG. 7 database comparison of mass spectrometric results of different spots from a two-dimensional polyacrylamide gel from cell extract from cells with induced apoptosis (see FIG. 6).
  • FIG. 8 Amino acid (A) and nucleotide sequences (B) and (C) of the 6xHis-Ser237Ala-V8 ⁇ 48 mutant.
  • (A) is the amino acid sequence the mutant including the 6xHis linker is shown (SEQ ID No. 1).
  • the coding nucleotide sequence including the 6xHis linker and the stop codon from the vector pQE9 is shown under (B) (SEQ ID No. 2).
  • the nucleotide sequence which was used as an insert for the cloning into the vector pQE9 is listed under (C) (SEQ ID No. 3).
  • 6xHis is italic and the alanine mutation is shown in bold and underlined.
  • (B) and (C) the restriction sites (BamHI and HindIII) are in italics and the point mutation (t to g) is shown in bold and underlined.
  • Staphylococcus aureus was cultivated in LB medium at 37 ° C. overnight. Genomic DNA was purified using the RNA / DNA QIAGEN mini kit using 1 ml culture. The polymerase chain reaction (PCR) was carried out with the primers PF1 (SEQ ID No. 4) and PR1 (SEQ ID No. 5) (Table 1), a dNTP mix and the PfuTurbo ® DNA polymerase. By means of these primers according to Yabuta et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol.
  • V8 ⁇ 48 protease V8 ⁇ 48 protease
  • the duplication products were separated by electrophoresis on a 1.2% agarose gel and stained with ethidium bromide.
  • the resulting PCR products were purified, digested twice with BamHI and HindIII and ligated into the vector pUC18, so that the plasmid pUC18-V8 ⁇ 48 was formed.
  • the ligation mixture was used to transfect Escherichia coli DH5 (competent cells). All clones produced were checked by DNA sequencing.
  • Table 1 Sequences of the primers used for the cloning and mutagenesis of the anhydro V8 proteinase.
  • the site-directed mutagenesis of V8 ⁇ 48 was performed using QuikChange ® XL site-directed mutagenesis kit and the plasmid pUC 18-V8 ⁇ 48 performed.
  • the mutation of serine (Ser) 237 to alanine (Ala) was achieved with the primers PF2 (SEQ ID No. 6) and PR2 (SEQ ID No. 7) (Table 1).
  • the vectors were isolated and sequenced. Positive clones were digested twice with BamHI and HindIII and ligated into the expression vector pQE9, so that the plasmid pQE9-Ser237Ala-V8 ⁇ 48 was formed.
  • the competent E. co // ' strain BL21 (DE3) was transfected with the plasmid pQE9-Ser237Ala-V8 ⁇ 48.
  • Freshly transfected cells with the plasmid were cultured in 100 ml LB (Luria Bertani) medium with 1 ⁇ g / ml ampicillin at 37 ° C.
  • LB Lia Bertani
  • protein expression was induced by adding isopropyl thiogalactoside to a final concentration of 1 mM.
  • the cells were harvested by centrifugation and suspended in 2 ml of lysis buffer (50 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 1% CHAPS, pH 7.4).
  • lysis buffer 50 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 1% CHAPS, pH 7.4
  • 0.1 ml of a solution with lysozyme (20 mg / ml) was added. The mixtures were for 30 min. Incubated at 37 ° C and sonicated for complete cell destruction. After the solutions had been incubated for 20 min. Centrifuged at 15,000 xg. The supernatant was used further and the pellet was discarded. A 8 ⁇ l sample was saved from each supernatant for SDS gel analysis.
  • Ni-NTA agarose beads were packed in 0.5 ml columns and loaded with the supernatant. The columns were washed with 5 column volumes of lysis buffer and 5 column volumes of lysis buffer with 20 mM imidazole. The bound protein was eluted with elution buffer (50 mM Tris-HCl, 300 M NaCl, 1% CHAPS, 400 mM imidazole, pH 7.4). The protein content was determined using the BCA method with bovine serum albumin as the calibration standard. The eluted fraction were analyzed on a 12% SDS-PAGE with discontinuous buffer according to Laemmli. The coloring was done with Coomassie Brillantblau R-250.
  • elution buffer 50 mM Tris-HCl, 300 M NaCl, 1% CHAPS, 400 mM imidazole, pH 7.4
  • the purified enzyme fractions were combined and desalted using NAP-5 gel filtration columns.
  • the NAP-5 columns were equilibrated with 50mM Tris-HCl, 1% CHAPS, 10% glycerin, pH 7.4 before use.
  • the samples were stored at -20 ° C until further use.
  • V8 protease activity was measured at 30 ° C. in 0.1 M Tris-HCl, pH 7.8, 0.01 M CaCl 2 with 0.4% universal protease substrate (Röche) in a volume of 0.2 ml.
  • the activity of the enzyme was determined by observing the absorption at 574 nm over a period of 10 min. certainly.
  • Ni-NTA agarose beads (20 ⁇ l) were loaded with 20 ⁇ g Ser237Ala-V8 ⁇ 48 in 50 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 1% CHAPS, pH 7.4.
  • the agarose beads were washed with 2 x 200 ⁇ l 0.1 M acetic acid and then 3 x 1 ml 50 mM Na phosphate, 300 mM NaCl, 1% CHAPS, pH 7.2.
  • [Cys (Bz) 84 , Glu (OBz) 85 ] -CD 4 (81 -92) is the short amino acid sequence AS81 -92 of the CD4 protein, which is at position 84 (Cys) with Bz and at position 85 (Glu) is derivatized with OBz.
  • the beads were washed three times with 500 ul ice-cold buffer and washed 500 ⁇ l of 20 mM NH4HCO3, pH 8.4 and eluted with 20 ⁇ l of 200 mM acetic acid.
  • the samples were lyophilized in a Speed Vac and used for mass spectrometric analysis (MALDI-TOF).
  • the fibroplast cell line from rat kidney NRK-49F was in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (nutrient mixture F12 urine, with 10% fetal calf serum (FCS), 1% antibiotic antifungal (100 X solution with 10,000 U / ml penicillin-G, 10 mg / ml streptomycin and 25 ⁇ l / ml amphotericin-B) cultured in a humidified atmosphere at 5% CO 2 at 37 ° C.
  • the cells were cultivated in 10 cm culture dishes to subconfluence and using trypsin EDTA in a ratio of 1 : 5.
  • 80% confluent NRK-49F cells were immobilized for 24-48 h by incubation in an appropriate medium with 0.5% FCS, and the cells were stored by freezing in 90% FCS, 10% DMSO in liquid nitrogen.
  • Apoptosis in 80% confluent cells was induced by adding 1 M hydrogen peroxide to a final concentration of 1 mM. Control cells were incubated without hydrogen peroxide for a corresponding period of time. The cells were lysed in hypotonic buffer (10 mM Na phosphate, pH 7.2, 1% Triton X-100, 1X complete protease inhibitors) and the insoluble cell debris at 10,000 xg for 20 min. centrifuged. 5 M NaCl was added to the supernatant to reach a final concentration of 300 mM. The samples thus obtained were placed on 100 ⁇ l packed Ni-NTA agarose columns, which were loaded with Ser237Ala-V8 ⁇ 48 protease as described above.
  • the beads were washed 3 ⁇ with 2 ml ice-cold buffer with 300 mM NaCl and with 100 ⁇ l 1% SDS in 10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 300 mM NaCl at 80 ° C. for 5 min. eluted.
  • the salts were removed with Millipore BIOMAX 5K ultrafiltration membrane devices and the samples diluted in electrophoresis sample buffer.
  • Ready-to-use Readystrip IPG strips (pH 5-8) from Bio-Rad were rehydrated overnight with 50 ⁇ l cell extract. The isoelectric focusing was carried out up to a total of 70 kVh.
  • the IPG strips were in a solution of 20 mg / ml dithiothreitol (DTT) in equilibration buffer for 20 min. incubated and then in a solution of 45 mg / ml iodoacetamide in the same buffer for 20 min. given.
  • SDS-PAGE was carried out with an 11% polyacrylamide gel (70x70x1, 0 mm) at 11 ° C. with a constant current of 40 mA. The second dimension was carried out until the bromophenol blue front reached the end of the gel.
  • the gels were coated with silver according to Shevchenko et al. (Anal. Chem. 68, 850-858 (1996)).
  • the samples were analyzed in an Autoflex MALDI-TOF mass spectrometer (Bruker, Germany). All spectra were recorded in a positive ion reflector mode. Typically, the first 10 shots from a new spot were discarded and the next 200 shots were taken.
  • the coding regions of the V8 ⁇ 48 protease were determined by a polymerase chain reaction with the genomic DNA of S. aureus according to Yabuta et al. amplified. The product obtained was ligated into the plasmid pUC18 via the BamHI / HindIII restriction sites. It was shown by double-stranded sequencing that the coding region is identical to the sequence described in previous work.
  • Site-directed mutagenesis was used to produce a mutation from Ser-237 to Ala (T712> G) in the pUC18 plasmid with the .V ⁇ protease gene. This step was checked by DNA sequencing. The identified colony carrying this mutation was cultivated in LB medium and the corresponding plasmid was isolated and included BamHI and Hindill digested. The gene Ser237Ala-V8 ⁇ 48 obtained was subcloned into the expression vector pQE9 using the BamHI / Hindlll restriction sites and used for transfection of E. coli BL21 (DE3).
  • the mutant Ser237Ala-V8 ⁇ 48 with an N-terminal histidine tag (FIG. 1) was successfully expressed in E. coli BL21 (DE3) using isopropyl ⁇ -D-thiogalactopyranoside at 37 ° C. for 3 h. Ni-NTA agarose columns were used to purify the mutant.
  • the protein fractions with Ser237Ala-V8 ⁇ 48 were desalted as soon as possible after purification by NAP5 columns, which were equilibrated with 25 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1% Triton X-100 and 100 mM NaCI.
  • the purity of the enzyme was examined by SDS-PAGE, a single band of 26 kDA with a purity of over 95% being observed (FIG. 2). Almost all of the V8 ⁇ 48 proteinase mutant was expressed as soluble protein, which could be purified in a single step using Ni-NTA agarose affinity columns.
  • the expressed purified protein showed no proteolytic activity.
  • the wild type of V8 proteinase was used as a positive control in the same approach (Fig. 3).
  • the neurotropic factor for retinal cholinergic neurons and [Cys (Bz) 84 , Glu (OBz) 85 ] -CD 4 (81-92) were used to test the binding properties of Ser237Ala-V8 ⁇ 48 against peptides at the C-terminal end Have aspartic acid or glutamic acid.
  • the mutant immobilized on Ni-NTA agarose beads was incubated with each of the peptides and after washing the beads, the bound peptides were eluted with 200 mM acetic acid. Both peptides were detected in the eluates by MALDI-TOF (Fig. 4). As a control for this experiment, calibration peptides were used used for MALDI-TOF mass spectrometry.
  • spots were marked on the two-dimensional gel (FIG. 6) and cut out of the gel.
  • the proteins or peptides were obtained from the gel by tryptic digestion.
  • the fragments obtained were subjected to MALDI-TOF mass spectrometry (Vogt et al., 2003. Rapid Communications in mass spectrometry 17: 1273-1282).
  • the masses found were compared with data from a database (FIG. 7) and the proteins from the two-dimensional gel were identified in this way.

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Abstract

Es wird ein Verfahren zur Anreicherung, Isolierung und/oder Identifizierung von Spaltprodukten mindestens eines Enzyms aus einer Probe bereitgestellt, wobei eine enzymatisch inaktive Mutante einer Protease als Affinitätsmaterial verwendet wird, welche ihre Substratspezifität weiterhin aufweist. Hierbei weisen mindestens ein Spaltprodukt der Protease, deren Mutante verwendet wird, und mindestens ein Spaltprodukt des Enzyms, dessen Spaltprodukte analysiert werden sollen, mindestens eine strukturelle Ähnlichkeit auf.

Description

Anreicherung von enzymatischen Spaltprodukten
Die Erfindung betrifft ein Verfahren. zur Anreicherung, Isolierung und/ oder Identifizierung von enzymatischen Spaltprodukten sowie bestimmte Mutanten und deren Verwendung.
Der Abbau von Proteinen ist eine wesentliche Komponente von biologischen Regulationsmechanismen, wie sie in allen lebenden Organismen stattfinden. An dem Abbau von Proteinen sind die sogenannten Protea- sen als Enzyme, die eine Spaltung katalysieren, maßgeblich beteiligt.
Als Proteasen werden die Enzyme bezeichnet, die die hydrolytische Spaltung (Proteolyse) der Peptid-Bindung in Proteinen und Peptiden katalysieren. Die Proteasen lassen sich in die sogenannten Proteinasen (früher: Endopeptidasen) und Peptidasen (früher Exopeptidasen) unterteilen. Erstere spalten Petid-Bindungen im Inneren eines Proteins und produzieren dadurch Peptide als Spaltprodukte. Letztere spalten Proteine am Amino- oder Carboxy-Ende. Im folgenden wird in der Regel nur von Proteasen gesprochen, wobei hierunter vorzugsweise Proteinasen zu verstehen sind.
Ein wichtiges Gebiet in der Proteomforschung ist die Identifizierung von Substraten der Proteasen und von den proteolytischen Produkten, also den Spaltprodukten, dieser Enzyme. Dies ist eine wichtige Voraussetzung dafür, daß die Funktion von bereits bekannten und auch neuen Proteasen erforscht werden kann. Man spricht in diesem Zusammenhang auch von dem Forschungsfeld „Degradomics", welches sich zum Ziel setzt, alle Proteasen eines Proteoms sowie auch die Substrate, die von einer bestimmten Protease gespalten werden, zu identifizieren. Definitionsgemäß ist „Degradomics" die Anwendung von genomischen und proteomischen Ansätzen, um Proteasen sowie deren Substrate und Inhibitoren in einem komplexen System, wie es ein lebender Organismus darstellt, zu charakterisieren.
Insbesondere die Proteinasen und ihre Spaltprodukte sind für die De- gradomics-Forschung von besonderem Interesse. Beispielsweise ist die Erforschung der Familie der Caspasen ein besonderer Schwerpunkt. Die Caspasen spielen bei dem kontrollierten Abbau verschiedener zellulärer Substrate eine wichtige Rolle, insbesondere sind sie an apoptotischen Vorgängen beteiligt, d. h. also an Abbauvorgängen, die mit dem kontrollierten Zelltod einhergehen. Die Caspasen sind eine hoch konservierte Proteasenfamilie mit wenigstens 12 humanen Mitgliedern. Wegen ihrer Rolle in Entzündungsprozessen und bei der Apoptose von Zellen sind die Caspasen von enormem wissenschaftlichen Interesse. Die Caspasen zählen zu den Cystein-Proteasen, d. h., daß diese Proteasen im aktiven Zentrum an einer kritischen Stelle Cystein tragen, welches für die proteolytische Aktivität entscheidend ist. Caspasen sind sehr spezifische Proteasen, die nach einem Asparaginsäurerest in ihrem Substrat spalten. Alle Spaltprodukte der Caspasen tragen daher einen Asparaginsäurerest am C-terminalen Ende des peptidischen Spaltproduktes (Position P1). An der Position P3 befindet sich oftmals Glutaminsäure. Durch Untersuchung der verschiedenen Spaltprodukte können interessante Rückschlüsse auf die Funktion und die Rolle der verschiedenen Caspasen in der Zelle bzw. im Organismus gezogen werden. Unter anderem können durch den allgemeinen Nachweis von Spaltprodukten der Caspasen Hinweise auf die Aktivität dieser multiplen Enzymgruppe gezogen werden, ohne daß ein einzelner Vertreter der Caspasen, der unter Umständen nur sehr geringe Aktivität entfaltet, nachgewiesen werden müßte.
Daher stellt sich die Erfindung die Aufgabe, ein Verfahren bereitzustellen, mit welchem Spaltprodukte eines bestimmten Enzyms oder einer Gruppe von Enzymen mit wenigen Verfahrensschritten untersucht werden können. Durch die Untersuchung der Spaltprodukte eines Enzyms sollen unter anderem Aussagen über die Aktivität des oder der für die Spaltung verantwortlichen Enzyme gemacht werden können.
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, wie es im Anspruch 1 dargestellt ist. Der Anspruch 16 betrifft eine bestimmte Mutante einer Protease und der Anspruch 25 eine entsprechende Nukleotidsequenz. Die Ansprüche 27 und 29 beschäftigen sich mit der Verwendung der Mutante bzw. mit einer entsprechenden Affinitätsmatrix. Bevorzugte Ausführungsformen finden sich in den Unteransprüchen. Durch Bezugnahme wird der Wortlaut sämtlicher Ansprüche zum Inhalt der Beschrei- bung gemacht.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren können Spaltprodukte mindestens eines Enzyms aus einer Probe angereichert, isoliert und/oder identifiziert werden. Dies geschieht unter Verwendung einer enzymatisch inaktiven Mutante einer Protease als Affinitätsmaterial, wobei es für das erfindungsgemäße Verfahren entscheidend ist, daß die enzymatisch inaktive Mutante der Protease ihre Substratspezifität weiterhin aufweist. Weiterhin ist es wichtig, daß das oder die Spaltprodukte des Enzyms, welche zu analysieren sind, mindestens eine strukturelle Ähnlichkeit mit den hydrolytischen Spaltprodukten der Protease aufweisen, deren Mutante eingesetzt wird. Die enzymatische Inaktivität ist vorteilhaft, da an- sonsten durch die als Affinitätsmaterial eingesetzte Protease selbst Spaltprodukte produziert werden könnten, die die Ergebnisse des erfindungsgemäßen Verfahrens möglicherweise verfälschen würden.
Bei diesem Verfahren wird zunächst die Probe, die die nachzuweisen- den Spaltprodukte enthält, mit der enzymatisch inaktiven Mutante inku- biert, so daß sich Wechselwirkungen zwischen den nachzuweisenden Spaltprodukten in der Probe und der Mutante ausbilden können. Diese Wechselwirkungen beruhen darauf, daß die Mutante für Substrate mit bestimmten Strukturmerkmalen eine hohe Bindungsaffinität hat. Die nachzuweisenden Spaltprodukte weisen diese Strukturmerkmale auf, so daß sie von dieser Mutante spezifisch gebunden werden. In einem weiteren Schritt des Verfahrens kann Material, welches nicht mit der Mutante wechselwirkt, entfernt werden. Anschließend können die Spaltprodukte, die von der Mutante gebunden worden waren, analysiert werden. Ob eine Abtrennung der wechselwirkenden Spaltprodukte von der Mutante vor der eigentlichen Analyse der Spaltprodukte sinnvoll und eventuell notwendig ist, hängt von der konkreten Ausgestaltung des Verfahrens und insbesondere von der Analysemethode ab.
Das erfindungsgemäße Verfahren beruht darauf, daß zum einen die Protease, deren Mutante als Affinitätsmaterial eingesetzt wird, eine hohe Bindungsaffinität für ihre eigenen Substrate und auch für die Produkte aufweist, die durch die proteolytische Spaltung der Substrate entstehen. Weiterhin ist es erforderlich, daß diese Bindungsaktivität der Protease von ihrer katalytischen Aktivität getrennt werden kann. Eine solche Trennung der katalytischen Aktivität von der Bindungsaktivität ist bereits für die Proteasen Trypsin und Chymotrypsin bekannt. Durch eine sogenannte Anhydro-Modifikation im katalytischen Zentrum dieser Proteasen läßt sich die katalytische Aktivität, also die Katalyse von hydrolytischen Spaltungen, zerstören, wohingegen die Bindungsaffinität für die Spaltprodukte erhalten bleibt. Diese als Anhydrotrypsin bzw. als Anhydrochymotrypsin bezeichneten Formen sind also nicht mehr in der Lage, Proteine zu spalten. Sie können jedoch weiterhin ihre Spaltprodukte binden. Im Fall von Anhydrotrypsin sind die Spaltprodukte Peptide, die am C-terminalen Ende Arginin und Lysin aufweisen. Im Fall von Anhydrochymotrypsin sind dies Peptide mit hydrophoben Aminosäuren am C-terminalen Ende. Die Anhydro-Mutanten von Trypsin und Chymotrypsin können hierbei durch eine chemische Modifizierung bzw. Behandlung erzielt werden, wobei Serin im aktiven Zentrum der Enzyme durch Alanin, also die Anhydro-Form von Serin, ersetzt wird.
Eine ähnliche Trennbarkeit von katalytischer Aktivität und Bindungsaffinität für Substrate bzw. Spaltprodukte wurde für die Protease ClpXP beschrieben (Molecular Cell, Vol. 11 , 671 -683, 2003).
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Enzym, dessen Spaltprodukte angereichert, isoliert und/oder identifiziert werden sollen, eine Protease, wobei sich diese Protease vorzugsweise von der Protease unterscheidet, deren enzyma- tisch inaktive Mutante als Affinitätsmaterial verwendet wird. Diese Ausführungsform der Erfindung hat den großen Vorteil, daß die enzymatisch inaktive Mutante einer Protease als universelles Werkzeug eingesetzt werden kann, um die Spaltprodukte eines beliebigen Enzyms zu untersuchen, solange die zu untersuchenden Spaltprodukte die entsprechen- den strukturellen Merkmale aufweisen, wie sie für die Bindungsaktivität der eingesetzten enzymatisch inaktiven Mutante für bestimmte Substrate erforderlich sind. Hierdurch wird also ein breit einsetzbares Verfahren für die Proteomforschung bereitgestellt, welches auf der Ausnutzung von funktionalen Merkmalen beruht. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens können unter anderem Ergebnisse erzielt werden, die Rückschlüsse auf die Identität verschiedener Substrate bzw. Produkte von bestimmten Enzymen erlauben. Weiterhin wird hierdurch auch eine Quantifizierung der Aktivitäten von Enzymen oder ganzen Enzymfamilien ermöglicht.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfah- rens handelt es sich bei der strukturellen Ähnlichkeit zwischen den zu untersuchenden Spaltprodukten und den Produkten, die von der Protease, deren enzymatisch inaktive Mutante eingesetzt wird, gebunden werden, um einen oder mehrere übereinstimmende terminale Aminosäurereste, insbesondere um C-terminale Reste. Bei einer Vielzahl von Prote- äsen, deren Mutanten erfindungsgemäß eingesetzt werden können, beruht die Bindungsaffinität zu ihren Substraten auf einer oder mehreren bestimmten C-terminalen Aminosäuren. Beispielsweise zeigt die V8-Pro- teinase aus Staphylococcus aureus (Endoproteinase Glu(Asp)-C) eine spezifische Bindungsaffinität für Peptide, die Glutaminsäure (Glu) oder Asparaginsäure (Asp) am C-terminalen Ende aufweisen. Die Aminosäurereste an anderen Positionen spielen keine wesentliche Rolle. Eine enzymatisch inaktive Mutante dieser V8-Proteinase, die ihre Substratspezifität weiterhin aufweist, ist daher gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignet, für die Untersuchung von Spaltprodukten anderer En- zyme eingesetzt zu werden, die entsprechende C-terminale Aminosäuren bzw. entsprechende Reste aufweisen. Dies gilt beispielsweise für die Spaltprodukte der Caspasen, die, wie anfangs erwähnt, Asparaginsäure am C-terminalen Ende tragen. Besonders bevorzugt ist daher eine Ausführungsform der Erfindung, bei welcher die strukturelle Ähnlichkeit ein C-terminaler Glutaminsäure- und/oder Asparaginsäurerest ist. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens trägt die enzymatisch inaktive Mutante der Protease eine Veränderung im aktiven Zentrum. Hierdurch wird erfindungsgemäß die katalytische Aktivität zerstört, wobei aber die Bindungsaktivität bei- behalten wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens handelt es sich bei der Protease, deren Mutante eingesetzt wird, um eine Serin-Protease. Serin-Proteasen sind dadurch gekennzeichnet, daß sie an einer kritischen Stelle im aktiven Zentrum Serin tragen. Durch ein Entfernen oder einen Austausch dieses Serins wird die enzymati- sche Aktivität zerstört, wohingegen die Substratspezifität beibehalten wird. Diese Proteasen sind daher erfindungsgemäß besonders geeignet, da durch eine einzelne Veränderung, die einen entsprechenden Amino- säureaustausch bewirkt, eine Mutante bereitgestellt werden kann, die erfindungsgemäß eingesetzt werden kann. Zu diesen besonders geeigneten Serin-Proteinasen zählt beispielsweise die bereits erwähnte V8- Proteinase.
Vorteilhafterweise handelt es sich bei der enzymatisch inaktiven Mutante um eine Anhydro-Mutante. In besonders bevorzugter Weise handelt es sich hierbei um einen Austausch von Serin zu Alanin. Da bei den erwähnten Serin-Proteasen ein Serin im katalytischen Zentrum der Protease für die hydrolytische Aktivität verantwortlich ist, kann durch eine solche Anhydro-Mutation die hydrolytische Aktivität zerstört werden, wobei die Substratspezifität beibehalten wird. Selbstverständlich können auch andere Mutanten von Proteasen erfindungsgemäß eingesetzt werden, solange sie enzymatisch inaktiv sind, also keine hydrolytische Spaltung mehr katalysieren können, und weiterhin ihre Substratspezifität aufweisen. In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die enzymatisch inaktive Mutante in immobilisierter Form eingesetzt. Hierdurch wird die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wesentlich erleichtert, da das Inkubieren der Probe, das Entfernen von Material und gegebenenfalls die Abtrennung von Spaltprodukten an einer festen Phase durchgeführt werden kann. In besonders vorteilhafter Weise kann das Verfahren in Form einer Säulenchromatographie durchgeführt werden, wobei die enzymatisch inaktive Mutante auf einem üblichen Chromatographiematerial, wie beispielsweise Sepharose, Agarose oder Fraktogel immobilisiert sein kann. Die Immobilisierung kann mit üblichen Methoden erfolgen. Beispielsweise kann die Mutante über eine Sequenz von Histidinen an immobilisierte Nickelionen (z. B. Ni-NTA Agarose) gekoppelt werden.
Die Analyse der angereicherten Spaltprodukte kann mit üblichen Methoden erfolgen. Besonders bevorzugt ist eine Analyse unter Verwendung von ein- und/oder zweidimensionaler Polyacrylamidgelelektrophorese. Weiterhin kann die Analyse mit üblichen massenspektrometrischen Methoden durchgeführt werden. Die Massenspektrometrie kann auch mit einer Polyacrylamidgelelektrophorese oder anderen üblichen Methoden kombiniert werden.
Für die Durchführung des eigentlichen Verfahrens, also das Inkubieren der Probe und das Entfernen von nicht wechselwirkendem Material, kann eine Chromatographie, insbesondere eine Säulenchromatographie, beispielsweise eine übliche Affinitätschromatographie, durchgeführt werden. Weiterhin kann die Analyse einen oder mehrere Chromatographieschritte, insbesondere Säulenchromatographieschritte, umfassen. Außerdem kann beispielsweise eine weitere Auftrennung von ver- schiedenen angereicherten Spaltprodukten durch einen oder mehrere Chromatographieschritte erreicht werden. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden die zu analysierenden Spaltprodukte im Verlauf des Verfahrens modifiziert. Hierbei kann es sich insbesondere um eine weitere Spaltung der Spaltprodukte handeln, die beispielsweise durch Behandlung mit geeigneten Enzymen erreicht wird. Insbesondere ist hierfür ein tryptischer Verdau oder ähnliches geeignet. Eine derartige Modifizierung erfolgt vor allem im Hinblick auf eine Analyse der Spaltprodukte, wobei die Spaltprodukte beispielsweise für eine massenspektrometrische Analyse weiter fragmentiert werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens handelt es sich bei der Protease, deren enzymatisch inaktive Mutante eingesetzt wird, um eine V8-Proteinase, beispielsweise um eine V8-Proteinase aus Staphylococcus aureus. Eine entsprechende Mutante, insbesondere eine Anhydro-Mutante dieses Enzyms, ist erfindungsgemäß besonders geeignet. Sie ist für eine Anreicherung, Isolierung und/oder Identifizierung von Spaltprodukten zu verwenden, die C- terminal einen Glutaminsäure- oder Asparaginsäurerest tragen. Besonders bevorzugt ist es hierbei, Peptide mit einem C-terminalen Aspara- ginsäurerest anzureichern bzw. zu isolieren und/oder zu identifizieren.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann vorteilhafterweise dazu eingesetzt werden, Spaltprodukte von Cystein-Proteasen zu untersuchen. Ganz besonders geeignet ist das Verfahren für die Untersuchung und Charakterisierung von Spaltprodukten einer oder mehrerer Caspasen. Caspasen sind sehr spezifische Proteasen, deren Spaltprodukte Asparaginsäure am C-terminalen Ende aufweisen. Somit ist insbesondere die Verwendung einer enzymatisch inaktiven Mutante der V8-Proteinase für die Untersuchung von Spaltprodukten der Caspasen geeignet, da eine entsprechende Mutante eine hohe Affinität zu Spaltprodukten mit C-ter- minalem Asparaginsäurerest aufweist. Weiterhin umfaßt die Erfindung eine enzymatisch inaktive Mutante einer Protease, wobei bei dieser Mutante die Substratspezifität erhalten ist. Besonders bevorzugt ist hierbei eine entsprechende Mutante einer Se- rin-Protease, insbesondere einer V8-Proteinase, beispielsweise einer V8-Proteinase aus Staphylococcus aureus. Eine derartige Mutante kann mit großem Vorteil im beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden. Bezüglich weiterer Merkmale dieser Mutante wird auf die obige Beschreibung verwiesen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform dieser Mutante handelt es sich um die erwähnte V8-Proteinase, beispielsweise aus Staphylococcus aureus, bei welcher an Position 237 Serin modifiziert, ausgetauscht oder entfernt ist. Bevorzugterweise ist das Serin an dieser Positi- ton durch eine andere Aminosäure, insbesondere durch Alanin, ersetzt. Der Austausch an der Position 237 von Serin zu Alanin erfolgt hierbei vorzugsweise durch einen einzelnen Basenaustausch an Position 712 von Thymin zu Guanin. Bei dem Serin an Position 237 handelt es sich um das kritische Serin im aktiven Zentrum der Proteinase. Eine Veränderung an dieser Stelle bewirkt eine Zerstörung der katalytischen, also der hydrolytischen Aktivität, wobei die Substratspezifität erhalten bleibt.
Die erfindungsgemäße Mutante kann durch chemische Modifikation der Protease hergestellt werden. Besonders bevorzugt ist es jedoch, wenn die Mutante durch molekularbiologische Methoden hergestellt wird.
Die erfindungsgemäße enzymatisch inaktive Mutante kann dadurch gekennzeichnet sein, daß sie zumindest einen Teil der Aminosäure-Sequenz gemäß SEQ ID No. 1 aufweist. Weiterhin umfaßt die Erfindung eine entsprechende Mutante, die zumindest zu 70 %, insbesondere zu- mindest zu 90 %, und vorzugsweise zumindest zu 99 %, identisch mit der Aminosäure-Sequenz gemäß SEQ ID No. 1 oder einem oder mehreren Teilen davon ist. Hiervon werden vor allem Mutanten umfaßt, die den Teil bzw. die Teile der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 1 aufweisen, die für die Substratspezifität verantwortlich sind. Darüber hinaus umfaßt die Erfindung auch solche Mutanten, die derartige Ähnlichkeiten mit solchen Sequenzen aufweisen, daß sie noch eine entspre- chende Substratspezifität im erfindungsgemäßen Sinne bewirken.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dieses Aspektes der Erfindung ist die enzymatisch inaktive Mutante femer dadurch gekennzeichnet, daß sie in immobilisierter Form vorliegt. Auch diesbezüglich wird auf die obige Beschreibung verwiesen.
Weiterhin umfaßt die Erfindung eine Nukleotidsequenz, die für eine enzymatisch inaktive Mutante einer Protease kodiert, deren Substratspezifität beibehalten ist. Bezüglich der weiteren Merkmale der von dieser Nukleotidsequenz kodierten Protease wird auf die obige Beschreibung verwiesen. Insbesondere ist die erfindungsgemäße Nukleotidsequenz dadurch gekennzeichnet, daß sie zumindest einen Teil der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 2 umfaßt. Insbesondere sind hierbei die Teile der Nukleotidsequenz bevorzugt, die für den Bereich der Protease ko- dieren, die für die Substratspezifität entscheidend sind.
Ferner umfaßt die Erfindung die Verwendung einer enzymatisch inaktiven Mutante einer Protease, deren Substratspezifität erhalten ist, als Affinitätsmaterial in einem Verfahren zur Anreicherung, Isolierung und/ oder Identifizierung von Spaltprodukten mindestens eines Enzyms, wobei mindestens ein Spaltprodukt der Protease und mindestens ein Spaltprodukt des Enzyms mindestens eine strukturelle Ähnlichkeit aufweisen. Bezüglich weiterer Merkmale dieser erfindungsgemäßen Verwendung wird auf die obige Beschreibung verwiesen.
Schließlich umfaßt die Erfindung eine Affinitätsmatrix zur Anreicherung, Isolierung und/oder Identifizierung von enzymatischen Spaltprodukten. Diese Affinitätsmatrix umfaßt eine immobilisierte, enzymatisch inaktive Mutante einer Protease unter Beibehalt ihrer Substratspezifität. Auch diesbezüglich wird auf die obige Beschreibung verwiesen. Diese erfindungsgemäße Affinitätsmatrix ist als universelles Werkzeug für Untersu- chungen im Proteom-Bereich bzw. in der Degradomics-Forschung einsetzbar. Hiermit können beispielsweise Aktivitätsänderungen von ganzen Enzym-Familien, wie beispielsweise den Caspasen, unter verschiedenen Bedingungen untersucht werden.
Die Affinitätsmatrix kann beispielsweise als einfache Säulenchromatographie-Matrix, vergleichbar mit einer üblichen Affinitätschromatographie, eingesetzt werden. Nach dem Auftragen der zu untersuchenden Probe und einem oder mehreren Waschschritten können die zu untersuchenden Spaltprodukte beispielsweise durch Wechsel der Pufferbedin- gungen eluiert und anschließend analysiert werden. Die Analyse kann beispielsweise mit einer üblichen zweidimensionalen Polyacrylamidgelelektrophorese durchgeführt werden. Mit einem solchen Verfahren können in wenigen Schritten Ergebnisse erzielt werden, die Aussagen über enzymatische Aktivitäten liefern. Weiterhin können auch Substrate und Produkte von Enzymen, insbesondere von Proteinasen, charakterisiert und/oder identifiziert werden. Das erfindungsgemäße Verfahren stellt ein wirksames Werkzeug bereit, um selektiv spezifische Klassen von Proteinen bzw. Peptiden anzureichern bzw. zu reinigen, die insbesondere für die Proteomforschung von großem Interesse sind. Solch ein gruppen- spezifisches Äff initäts- Werkzeug eröffnet die Möglichkeit, Profile von Proteinen aufgrund von deren Aktivität zu erstellen. Hierdurch können Veränderungen im funktionellen Status von Enzymen sogar dann untersucht werden, wenn der mengenmäßige Level des Enzyms konstant bleibt. Weiterhin könnten mit Hilfe der Erfindung Untersuchungen zur Wirksamkeit von Inhibitoren vorgenommen werden, die die verschiedenen Mitglieder einer Enzymfamilie, beispielsweise die Caspasen, beeinflussen. Hierfür kann z.B. die intakte Zelle oder ein Zellextrakt mit einem potentiellen Inhibitor behandelt werden, um dann anschließend die Aktivität der Enzymfamilie gemäß der Erfindung in der oben beschriebenen Weise zu analysieren.
Weitere Merkmale ergeben sich aus den Beispielen in Verbindung mit den Figuren und den Unteransprüchen. Hierbei können die verschiedenen Merkmale jeweils für sich oder in Kombination miteinander verwirklicht sein.
In den Figuren zeigt:
Fig. 1 schematische Darstellung der Konstruktion von Ser237Ala- V8Δ48.
Fig. 2 Expression der Anhydro-Mutante der V8-Proteinase. Die Proteinproben wurden auf einem 12 % SDS-Polyacrylamidgel (SDS- PAGE) mit einem diskontinuierlichen Puffer aufgetrennt. Die Färbung erfolgte mit Coomassie Brillantblau R-250. 1 : gesamtes Zellysat, 2: Durchlauf, 3: Elution, 4: Markerproteine.
Fig. 3 Enzymatische Aktivitäten vom Wildtyp und der Anhydro-Mutante der V8-Proteinase. Die Proteinaseaktivität wurde bei 30 °C in 0,1 M Tris-HCI pH 7,8, 0,01 M CaCI2 mit 0,4 % universellem Proteasesubstrat (Röche) in einem Volumen von 0,2 ml gemessen. Die Aktivität wurde durch Absorptionsmessung bei
574 nm mit einem Spektrophotometer für eine Zeitperiode von 10 min. bestimmt. Die Konzentration der Proteinase war jeweils 1 μg/μl.
Fig. 4 Massenspektrometriemessung (MALDI-TOF) der von der An- hydro-V8-Agarose eluierten Peptide. Die Ni-NTA-Agarosekügel- chen wurden mit Ser237Ala-V8Δ48 in 50 mM Tris-HCI, 300 mM NaCI, 1 % CHAPS bei pH 7,4 beladen. Der neurotrope Faktor für retinale cholinerge Neuronen und [Cys(Bz)84, Glu(OBz)85]- CD4(81 -92) wurden mit der beladenen Agarose inkubiert. Die Agarose wurde gewaschen und mit 200 mM Essigsäure eluiert. Die Proben wurden in einem Speed Vac lyophilisiert und für die
MALDI-Analyse verwendet. Spektrum 1 : Eluat des neurotropi- schen Faktors für retinale cholinerge Neuronen, Spektrum 2: E- luat von Cys[(Bz)84, Glu(OBz)85]-CD4(81 -92).
Fig. 5 Zweidimensionale Polyacrylamidgelelektrophorese der Eluate der Anhydro-V8-Agarose. Readystrip IPG-Streifen (pH 5-8) wurden mit 40 μg Zellextrakt beladen. Die isoelektrische Fokussie- rung (IEF) wurde mit bis zu 70 kVh durchgeführt. Das SDS- PAGE wurde mit 11 % Polyacrylamidgelen (70x70x1 ,0 mm) bei 11 °C bei konstantem Strom (40 mA) durchgeführt. Die zweite
Dimension wurde durchgeführt, bis die Bromphenolblaufront das Ende des Gels erreicht hatte. Die Gele wurden mit Silbernitrat gefärbt. Das linke Gel zeigt die Kontrolle, das rechte Gel zeigt das aufgetrennte Zellextrakt der Zellen mit induzierter Apoptose.
Fig. 6 Zweidimensionales Polyacrylamidgel des aufgetrennten Zellextrakts der Zellen mit induzierter Apoptose, wobei die im Vergleich mit dem Kontrollgel (siehe Fig. 5) unterschiedlichen Proteinspots mit Zahlen markiert sind.
Fig. 7 Datenbankvergleich von massenspektrometrischen Ergebnissen verschiedener Spots aus einem zweidimensionalen Polyacrylamidgel von Zellextrakt aus Zellen mit induzierter Apoptose (siehe Fig. 6).
Fig. 8 Aminosäure- (A) und Nukleotidsequenzen (B) und (C) der 6xHis- Ser237Ala-V8Δ48-Mutante. Unter (A) ist die Aminosäuresequenz der Mutante inklusiv dem 6xHis-Linker gezeigt (SEQ ID No. 1 ). Unter (B) ist die kodierende Nukleotidsequenz inklusiv dem 6xHis-Linker und den Stop-Codon aus dem Vektor pQE9 dargestellt (SEQ ID No. 2). Unter (C) ist die Nukleotidsequenz aufgeführt, welche als Insert für die Klonierung in den Vektor pQE9 verwendet wurde (SEQ ID No. 3). Bei (A) ist 6xHis kursiv und die Alanin-Mutation fett und unterstrichen dargestellt. Bei (B) und (C) sind die Restriktionsschnittstellen (BamHI und Hindlll) kursiv und die Punktmutation (t zu g) fett und unterstrichen dargestellt.
Übersicht über das Sequenzprotokoll
SEQ ID No. 1 Aminosäuresequenz der 6xHis-Ser237Ala-V8Δ48-Mu- tante SEQ ID No. 2 kodierende Nukleotidsequenz inklusiv 6xHis-Linker und Stop-Codon
SEQ ID No. 3 Nukleotidsequenz-Insert für die Klonierung in den
Vektor pQE9
SEQ ID No. 4 Klonierungsprimer PF1 SEQ ID No. 5 Klonierungsprimer PR1
SEQ ID No. 6 Klonierungsprimer PF2
SEQ ID No. 7 Klonierungsprimer PR2
BEISPIELE
1. Methoden
1.1 Klonierung der V8Δ48-Protease
Staphylococcus aureus (ATCC 25923) wurde in LB-Medium bei 37 °C über Nacht kultiviert. Genomische DNA wurde mit dem RNA/DNA QIAGEN Minikit ausgehend von 1 ml Kultur gereinigt. Die Polymerase Kettenreaktion (PCR) wurde mit den Primern PF1 (SEQ ID No. 4) und PR1 (SEQ ID No. 5) (Tabelle 1 ), einem dNTP-Mix und der PfuTurbo® DNA-Polymerase durchgeführt. Durch diese Primer gemäß Yabuta et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol. 44, 118-125 (1995)) wurde eine Sequenz vervielfältigt, die für die Aminosäuren 1 bis 663 der V8-Protease kodiert (V8Δ48 Protease). Die Vervielfältigungsprodukte wurden durch Elektrophorese auf einem 1 ,2 % Agarosegel aufgetrennt und mit Ethidiumbro- mid gefärbt. Die resultierenden PCR-Produkte wurden gereinigt, mit BamHI und Hindlll doppelt verdaut und in den Vektor pUC18 ligiert, so daß das Plasmid pUC18-V8Δ48 entstand. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli DH5 (kompetente Zellen) zu transfizie- ren. Alle produzierten Klone wurden durch DNA-Sequenzierung überprüft.
Tabelle 1 : Sequenzen der Primer, die für die Klonierung und die Mutagenese der Anhydro-V8-Proteinase verwendet wurden.
Figure imgf000017_0001
1.2. Site-directed Mutagenese und Subklonierung in den Vektor pQE9
Die site-directed Mutagenese von V8Δ48 wurde unter Verwendung von QuikChange® XL site-directed Mutagenese-Kit und dem Plasmid pUC 18-V8Δ48 durchgeführt. Die Mutation von Serin (Ser) 237 zu Alanin (Ala) wurde mit den Primern PF2 (SEQ ID No. 6) und PR2 (SEQ ID No. 7) (Tabelle 1 ) erreicht. Die Vektoren wurden isoliert und sequenziert. Positive Klone wurden mit BamHI und Hindlll doppelt verdaut und in den Ex- pressionsvektor pQE9 ligiert, so daß das Plasmid pQE9-Ser237Ala- V8Δ48 entstand.
1.3. Expression und Reinigung der V8-Protease aus E. coli
Der kompetente E. co//'-Stamm BL21 (DE3) wurde mit dem Plasmid pQE9-Ser237Ala-V8Δ48 transfiziert. Frisch transfizierte Zellen mit dem Plasmid wurden in 100 ml LB (Luria Bertani)-Medium mit 1 μg/ml Ampi- cillin bei 37 °C kultiviert. Bei einer Zelldichte von 0,6 (Absorption bei λ=660 nm) wurde die Proteinexpression durch Zugabe von Isopropyl- Thiogalaktosid bis zu einer finalen Konzentration von 1 mM induziert. Nach 3 h weiterer Inkubation wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet und in 2 ml Lysispuffer (50 mM Tris-HCI, 300 mM NaCI, 1 % CHAPS, pH 7,4) suspendiert. Für die Lyse der Zellen wurden 0,1 ml einer Lösung mit Lysozym (20 mg/ml) zugegeben. Die Gemische wurden für 30 min. bei 37 °C inkubiert und für die vollständige Zellzerstörung sonifiziert. Nach der Inkubation der Lösungen wurde für 20 min. bei 15.000 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde weiter verwendet und das Pellet verworfen. Eine Probe von 8 μl wurde von jedem Überstand für eine SDS-Gelanalyse aufgehoben.
Ni-NTA Agarosekügelchen wurden in 0,5 ml Säulen gepackt und mit dem Überstand beladen. Die Säulen wurden mit 5 Säulenvolumen Lysispuffer und 5 Säulenvolumen Lysispuffer mit 20 mM Imidazol gewaschen. Die Elution des gebundenen Proteins erfolgte mit Elutionspuffer (50 mM Tris-HCI, 300 M NaCI, 1 % CHAPS, 400 mM Imidazol, pH 7,4). Der Proteingehalt wurde mit der BCA-Methode mit bovinem Serumalbumin als Kalibrierungsstandard bestimmt. Die eluierten Fraktio- nen wurden auf einem 12 %igen SDS-PAGE mit diskontinuierlichem Puffer gemäß Laemmli analysiert. Die Färbung erfolgte mit Coomassie Brillantblau R-250. Die gereinigten Enzymfraktionen wurden kombiniert und mit NAP-5 Gelfiltrationssäulen entsalzt. Die NAP-5 Säulen wurden mit 50 mM Tris-HCI, 1 % CHAPS, 10 % Glyzerin, pH 7,4 vor der Verwendung equilibriert. Die Proben wurden bei -20 °C bis zur weiteren Verwendung gelagert.
1.4. Enzym-Aktivitätstest
Die V8-Proteaseaktivität wurde bei 30 °C in 0,1 M Tris-HCI, pH 7,8, 0,01 M CaCI2 mit 0,4 % universellem Proteasesubstrat (Röche) in einem Volumen von 0,2 ml gemessen. Die Aktivität des Enzyms wurde durch Beobachtung der Absorption bei 574 nm über einen Zeitraum von 10 min. bestimmt.
1.5. Bindung von N-Asp und N-Glu-Peptiden an die immobilisierte Ser237Ala-V8Δ48 Protease
Die Ni-NTA-Agarosekügelchen (20 μl) wurden mit 20 μg Ser237Ala- V8Δ48 in 50 mM Tris-HCI, 300 mM NaCI, 1 % CHAPS, pH 7,4 beladen. Die Agarosekügelchen wurden mit 2 x 200 μl 0,1 M Essigsäure und dann 3 x 1 ml 50 mM Na-Phosphat, 300 mM NaCI, 1 % CHAPS, pH 7,2 gewaschen. Neurotropischer Faktor für retinale cholinerge Neuronen und [Cys(Bz)84, Glu(OBz)85]-CD4(81 -92), jeweils 20 μl einer 1 mg/ml Lösung von jedem Peptid im selben Puffer, wurden mit den beladenen A- garosekügelchen für 20 min. bei Raumtemperatur unter konstantem Schütteln inkubiert. Bei [Cys(Bz)84, Glu(OBz)85]-CD4(81 -92) handelt es sich um die kurze Aminosäuresequenz AS81 -92 des CD4-Proteins, welches an Position 84 (Cys) mit Bz und an Posititon 85 (Glu) mit OBz deri- vatisiert ist. Die Kügelchen wurden dreimal mit je 500 μl eiskaltem Puffer und je 500 μl 20 mM NH4HCO3, pH 8,4 gewaschen und mit 20 μl 200 mM Essigsäure eluiert. Die Proben wurden in einem Speed Vac lyophili- siert und für die massenspektrometrische Analyse (MALDI-TOF) verwendet.
1.6. Zellkultur
Die Fibroplasten-Zelllinie aus Rattenniere NRK-49F wurde in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (Nährstoffmischung F12 Harn, mit 10 % fötalem Kälberserum (FCS), 1 % Antibiotika-Antimykotica (100 X-Lösung mit 10.000 U/ml Penicillin-G, 10 mg/ml Streptomycin und 25 μl/ml Amphote- ricin-B) bei 37 °C in befeuchteter Atmosphäre bei 5 % C02 kultiviert. Die Zellen wurden in 10 cm-Kulturschalen bis zur Subkonfluenz kultiviert und unter Verwendung von Trypsin-EDTA im Verhältnis 1 :5 gesplittet. Für alle Experimente wurden 80 % konfluente NRK-49F Zellen durch Inkubation in entsprechendem Medium mit 0,5 % FCS für 24-48 h ruhig gestellt. Eine Lagerung der Zellen erfolgte durch Einfrieren in 90 % FCS, 10 % DMSO in flüssigem Stickstoff.
1.7. Induktion der Apoptose und Herstellung des Zellextraktes
Die Apoptose bei 80 % konfluenten Zellen wurde durch Zugabe von 1 M Hydrogenperoxid bis zu einer finalen Konzentration von 1 mM induziert. Kontrollzellen wurden ohne Hydrogenperoxid für einen entsprechenden Zeitraum inkubiert. Die Zellen wurden in hypotonischem Puffer (10 mM Na-Phosphat, pH 7,2, 1 % Triton X-100, 1X komplete Protease-Inhibito- ren) lysiert und die unlöslichen Zelltrümmer bei 10.000 x g für 20 min. abzentrifugiert. 5 M NaCI wurde zum Überstand zugegeben, um eine finale Konzentration von 300 mM zu erreichen. Die so erhaltenen Proben wurden auf 100 μl gepackte Ni-NTA-Agarosesäulen gegeben, die mit Ser237Ala-V8Δ48 Protease wie oben beschrieben beladen waren. Die Kügelchen wurden 3 x mit 2 ml eiskaltem Puffer mit 300 mM NaCI gewaschen und mit 100 μl 1 % SDS in 10 mM Tris-HCI, pH 7,4, 300 mM NaCI bei 80 °C für 5 min. eluiert. Die Salze wurden mit Millipore BIOMAX 5K Ultrafiltrationsmembran-Vorrichtungen entfernt und die Proben in Elektrophorese-Probenpuffer verdünnt.
1.8. Zweidimensionale Gelelektrophorese
Ready-to-use Readystrip IPG Streifen (pH 5-8) von Bio-Rad wurden über Nacht mit 50 μl Zellextrakt rehydriert. Die isoelektrische Fokussie- rung wurde bis zu insgesamt 70 kVh durchgeführt. Vor der SDS-Gel- elektrophorese wurden die IPG-Streifen in einer Lösung von 20 mg/ml Dithiothreitol (DTT) in Equilibrierungspuffer für 20 min. inkubiert und anschließend in eine Lösung von 45 mg/ml lodoacetamid in demselben Puffer für 20 min. gegeben. SDS-PAGE wurde mit einem 11 % Polyacrylamidgel (70x70x1 ,0 mm) bei 11 °C bei einem konstanten Strom von 40 mA durchgeführt. Die zweite Dimension wurde durchgeführt, bis die Bromphenolblaufront das Ende des Gels erreicht hatte. Die Gele wurden mit Silber gemäß Shevchenko et al. (Anal. Chem. 68, 850-858 (1996)) gefärbt.
1.9. Probenvorbereitung für die MALDI-TOF Massenspektrometrie
Um massenspektrometrische Peptidkarten der Proteine zu erhalten, wurden 0,5 μl Aliquots der generierten Spaltprodukte auf dem Probenträger verteilt und 0,5 μl einer Lösung von -Cyano-4-Hydroxyzimtsäure in 35 % Acetonitril/0,1 % Trifluoressigsäure aufgegeben. 1.10. MALDI-TOF Massenspektrometrie
Die Proben wurden in einem Autoflex MALDI-TOF Massenspektrometer (Bruker, Germany) analysiert. Alle Spektren wurden in einem positiven lonenreflektor-Modus aufgenommen. Typischerweise wurden die ersten 10 Schüsse eines neuen Spots verworfen und die nächsten 200 Schüsse aufgenommen.
1.11. Kalibrierung der MALDI-TOF Spektren
Als externe Standards für die Kalibrierung wurde humanes Angiotensin I und II, Adrenocorticotropisches Hormon, [Glu]-Fibrinopeptid B, Rennin- substrat Tetradecapeptid und die Insulin B-Kette verwendet. Die Menge jedes Peptides war 0,25 pmol pro Spot.
2. Ergebnisse
Die kodierenden Regionen der V8Δ48-Protease wurden durch eine Po- lymerasekettenreaktion mit der genomischen DNA von S. aureus gemäß Yabuta et al. amplifiziert. Das erhaltene Produkt wurde über die Bam- Hl/Hindlll-Restri\ύ\onsstel\en in das Plasmid pUC18 ligiert. Durch dop- pelsträngige Sequenzierung wurde gezeigt, dass die kodierende Region mit der beschriebenen Sequenz früherer Arbeiten identisch ist.
Eine site-directed Mutagenese wurde eingesetzt, um eine Mutation von Ser-237 zu Ala (T712>G) im pUC18-Plasmid mit dem .Vδ-Proteasegen zu produzieren. Dieser Schritt wurde durch DNA-Sequenzierung kontrolliert. Die identifizierte Kolonie, die diese Mutation trug, wurde in LB- Medium kultiviert und das korrespondierende Plasmid isoliert und mit BamHI und Hindill verdaut. Das erhaltene Gen Ser237Ala-V8Δ48 wurde in den Expressionsvektor pQE9 unter Verwendung der BamHI/Hindlll- Restriktionsstellen subkloniert und zur Transfektion von E. coli BL21 (DE3) verwendet.
Die Mutante Ser237Ala-V8Δ48 mit einem N-terminalen Histidin-Tag (Fig. 1 ) wurde erfolgreich in E. coli BL21 (DE3) bei Verwendung von Isopropyl ß-D-Thiogalaktopyranosid bei 37 °C für 3 h exprimiert. Ni-NTA Agarose- säulen wurden für die Reinigung der Mutante eingesetzt. Die Protein- fraktionen mit Ser237Ala-V8Δ48 wurden sobald wie möglich nach der Reinigung durch NAP5-Säulen entsalzt, welche mit 25 mM Tris-HCI, pH 7,4, 1 % Triton X-100 und 100 mM NaCI equilibriert waren. Die Reinheit des Enzyms wurde durch SDS-PAGE untersucht, wobei eine einzelne Bande von 26 kDA mit einer Reinheit von über 95 % beobachtet wurde (Fig. 2). Nahezu die gesamte Menge der V8Δ48 Proteinasemutante wurde als lösliches Protein exprimiert, welches in einem einzigen Schritt unter Verwendung von Ni-NTA Agarose-Affinitätssäulen gereinigt werden konnte.
Das exprimierte gereinigte Protein zeigte keine proteolytische Aktivität. Der Wildtyp der V8-Proteinase wurde als positive Kontrolle in dem gleichen Ansatz eingesetzt (Fig. 3).
Der neurotropische Faktor für retinale cholinerge Neuronen und [Cys(Bz)84, Glu(OBz)85]-CD4(81-92) wurden verwendet, um die Bindungseigenschaften von Ser237Ala-V8Δ48 gegenüber Peptiden zu testen, die am C-terminalen Ende Asparaginsäure oder Glutaminsäure aufweisen. Die an Ni-NTA-Agarosekügelchen immobilisierte Mutante wurde mit jedem der Peptide inkubiert und nach dem Waschen der Kü- gelchen wurden die gebundenen Peptide mit 200 mM Essigsäure eluiert. Beide Peptide wurden in den Eluaten durch MALDI-TOF detektiert (Fig. 4). Als eine Kontrolle für dieses Experiment wurden Kalibrierungspeptide für die MALDI-TOF Massenspektrometrie eingesetzt. Mit diesen Kon- trollpeptiden wurden keine Signale im MALDI-TOF-Spektrum detektiert. Um die Bindungseigenschaften dieses neuen Affinitätsmaterials gegenüber Spaltprodukten von Caspasen zu testen, wurde wiederum auf Ni- NTA-Agarose immobilisiertes gereinigtes Ser237Ala-V8Δ48 verwendet. Für diesen Versuch wurde die Apoptose in NRK-49F Zellen unter Verwendung von Hydrogenperoxid induziert. Nach der Isolierung wurden die Proteine und Peptide auf die Ni-NTA-Agarose mit Ser237Ala-V8Δ48 gegeben. Nach dem Waschen des ungebundenen Materials wurden die gebundenen Peptide mit einer SDS-Lösung bei einer erhöhten Temperatur eluiert. Als eine Kontrolle für dieses Experiment wurden nicht apop- totische NRK-49F Zellen benutzt. Beide Proben wurden auf 2D-PAGE analysiert, wobei deutliche Unterschiede in den Protein- bzw. Peptid- mustern zu beobachten waren (Fig. 5). Viele der Proteinspots in Fig. 5 konnten sowohl in der Kontrolle als auch in dem Gel des apoptotischen Zellextraktes beobachtet werden. Dies ist damit zu begründen, daß alle Proteine mit Asparaginsäure oder Glutaminsäure am C-terminalen Ende durch das Affinitätsmaterial gebunden wurden. All diese Proteine sind als Hintergrund zu betrachten. Die Proteinspots, die ausschließlich in dem Gel des apoptotischen Zellextraktes zu beobachten waren, sind die Spaltprodukte, die auf eine Caspaseaktivität zurückzuführen sind.
Zur Identifizierung der Spaltprodukte, die auf eine Caspaseaktivität zurückzuführen sind, wurden entsprechende Spots auf dem zweidimensio- nalen Gel markiert (Fig. 6) und aus dem Gel ausgeschnitten. Die Proteine bzw. Peptide wurden aus dem Gel durch tryptischen Verdau gewonnen. Die erhaltenen Fragmente wurden einer MALDI-TOF-Massenspek- trometrie unterzogen (Vogt et al., 2003. Rapid Communications in mass spectrometry 17: 1273 - 1282). Die gefundenen Massen wurden mit Da- ten aus einer Datenbank verglichen (Fig. 7) und auf diese Weise die Proteine aus dem zweidimensionalen Gel identifiziert. Hierbei erwies sich das in Fig. 6 als Spot 5 bezeichnete Protein als ß-Tubulin, das als Spot 8 bezeichnete Protein als ß-Aktin und das als Spot 16 bezeichnete Protein als Nukleosid-Diphosphatkinase (nm23). Diese Proteine werden in der Literatur als Caspase-Substrate beschrieben (z. B. J. Urol. 2003 May; 169 (5): 1729 - 1734; J. Neuroscience 2003 Mar. 1 ; 23 (5): 1742- 1749; J. Neuroscience Research 2002 Oct. 15; 70 (2): 180 - 189; J. Comp. Neurol. 2002 Oct. 7; 452 (1 ): 65 - 79; J. Comp. Neurol. 2000 Aug. 28; 424 (3): 476 - 488; Brain Res. Mol. Brain Res. 2000 Jan. 10; 75 (1 ): 143 - 149; Cell 2003 Mar. 7; 112 (5): 659 - 672; Cell 2003 Mar. 7; 112 (5): 589 - 591 ; Blood 2003 Apr. 15; 101 (8): .3212 - 3219). Das als Spot 3 bezeichnete Protein wurde als γ-Aktin identifiziert (Eur. J. Biochem. 2003 Jan.; 270 (2): 342 - 349; Arch. Dermatol. Res. 2001 Jun.; 293 (6): 283 - 290; Mol. Endocrinol. 1991 Oct; 5 (10): 1381 - 1388). Dieses Protein zeigt große Homologie mit ß-Aktin, so daß angenommen werden kann, daß γ-Aktin ebenfalls ein Caspase-Substrat ist.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Anreicherung, Isolierung und/oder Identifizierung von Spaltprodukten mindestens eines Enzyms aus einer Probe unter Verwendung einer enzymatisch inaktiven Mutante einer Protease unter Beibehalt der Substratspezifität als Affinitätsmaterial, wobei mindestens ein Spaltprodukt der Protease und mindestens ein Spaltprodukt des Enzyms mindestens eine strukturelle Ähnlichkeit aufweisen, umfassend die Schritte
Inkubieren der Probe mit der enzymatisch inaktiven Mutante zur Ausbildung von Wechselwirkungen zwischen möglichen Spaltprodukten des Enzyms in der Probe und der Mutante, Entfernen von nicht-wechselwirkendem Material, gegebenenfalls Abtrennung der wechselwirkenden Spaltprodukte von der Mutante, gegebenenfalls Analyse der Spaltprodukte.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym eine Protease ist, wobei das Enzym eine andere Protease als die Protease ist, deren enzymatisch inaktive Mutante verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als strukturelle Ähnlichkeit mindestens ein Spaltprodukt der Protease mindestens eine gleiche terminale Aminosäure wie mindestens ein Spaltprodukt des Enzyms aufweist, insbesondere eine gleiche C-terminale Aminosäure.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die C- terminale Aminosäure Glutaminsäure und/oder Asparaginsäure ist.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die enzymatisch inaktive Mutante der Protease eine Veränderung im aktiven Zentrum trägt.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Protease eine Serin-Protease ist.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die enzymatisch inaktive Mutante eine Anhydro-Mutante ist.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, insbesondere nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Mutante einen Austausch von Serin durch Alanin aufweist.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die enzymatisch inaktive Mutante immobilisiert ist.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Analyse mit Polyacrylamidgelelektrophorese, insbesondere mit eindimensionaler und/oder zweidimensio- naler Polyacrylamidgelelektrophorese, und/oder Massenspektro- metrie durchgeführt wird.
1 1. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, insbesondere nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Analyse mindestens einen Chromatographieschritt umfaßt.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Spaltprodukte im Verlauf des Verfahrens, insbesondere während der Analyse, modifiziert, insbesondere gespalten, vorzugsweise enzymatisch gespalten, werden.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Protease eine V8-Proteinase ist, insbesondere eine Anhydro-Mutante der V8-Proteinase.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym mindestens eine Cystein -Protease ist.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym mindestens eine Caspase ist.
16. Enzymatisch inaktive Mutante einer Protease, insbesondere einer Sehn-Protease, dadurch gekennzeichnet, daß die Substratspezifität erhalten ist.
17. Mutante nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Protease eine V8-Proteinase ist.
18. Mutante nach Anspruch 16 oder Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Veränderung im aktiven Zentrum trägt.
19. Mutante nach einem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Anhydro-Mutante ist.
20. Mutante nach einem der Ansprüche 16 bis 19, insbesondere nach Anspruch 18 oder Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Austausch von Serin durch Alanin aufweist.
21. Mutante nach einem der Ansprüche 16 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß das Serin an Position 237 ausgetauscht ist.
22. Mutante nach einem der Ansprüche 16 bis 21 , dadurch gekennzeichnet, daß sie zumindest einen Teil der Aminosäure-Sequenz gemäß SEQ ID No. 1 aufweist.
23. Mutante nach einem der Ansprüche 16 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Aminosäuresequenz aufweist, die zumindest zu 70 %, insbesondere zumindest zu 90 %, vorzugsweise zumindest zu 99 % identisch mit zumindest einem Teil der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 1 ist.
24. Mutante nach einem der Ansprüche 16 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß sie immobilisiert ist.
25. Nukleotidsequenz, die für eine enzymatisch inaktive Mutante einer Protease gemäß einem der Ansprüche 16 bis 24 kodiert.
26. Nukleotidsequenz nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß sie zumindest einen Teil der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 2 aufweist.
27. Verwendung einer enzymatisch inaktiven Mutante einer Proteina- se gemäß einem der Ansprüche 16 bis 24 als Affinitätsmaterial in einem Verfahren zur Anreicherung, Isolierung und/oder Identifizierung von Spaltprodukten mindestens eines Enzyms, wobei mindestens ein Spaltprodukt der Protease und mindestens ein Spaltprodukt des Enzyms mindestens eine strukturelle Ähnlichkeit aufweisen.
28. Verwendung nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß die Verwendung mindestens ein Merkmal gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15 aufweist.
29. Affinitätsmatrix zur Anreicherung, Isolierung und/oder Identifizierung von enzymatischen Spaltprodukten, umfassend eine immobilisierte, enzymatisch inaktive Mutante einer Protease unter Beibehalt der Substratspezifität gemäß einem der Ansprüche 16 bis 24.
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