WO2004104210A1 - 無細胞タンパク質合成系によるタンパク質の製造方法及びタンパク質合成用試薬キット - Google Patents

無細胞タンパク質合成系によるタンパク質の製造方法及びタンパク質合成用試薬キット Download PDF

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WO2004104210A1
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amino acids
cell
protein
acid
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Shigeyuki Yokoyama
Takanori Kigawa
Rie Nakajima
Akiko Tanaka
Jun Yokoyama
Yoshihisa Fukai
Takehisa Matsumoto
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Japan Oxygen Co Ltd
RIKEN
Taiyo Nippon Sanso Corp
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Japan Oxygen Co Ltd
Nippon Sanso Corp
RIKEN
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a protein using a cell-free protein synthesis system, more specifically, a protein characterized in that a protein is synthesized in a cell-free protein synthesis system using an amino acid mixture containing at most 19 types of amino acids as a substrate.
  • the present invention relates to a method for producing a stable isotope-labeled protein, and a kit for protein synthesis for performing the method.
  • the cell-free protein synthesis system is a system that synthesizes proteins in vitro using a cell extract. Since the cell-free protein synthesis system can use the DNA fragment as it is as the type I expression, the gene encoding the target protein gene into a vector, which was required for conventional expression systems using living cells such as Escherichia coli, yeast, and cultured cells, was used. Time and labor-intensive steps such as one-shot, transformation, culturing, cell collection, and lysis are not required at all, and proteins can be expressed easily in a short time.
  • cysteine (Cys) and Ributuan ( ⁇ ), asparagine (Asn), and glutamine (Gin) must be replenished because they are lost during the amino acid hydrolysis process, and these amino acids are more expensive than other amino acids, so they are costly. Is causing the rise.
  • stable isotope-labeled proteins that have been produced include the use of an enzyme such as transdarminase in the presence of an isotope-labeled ammonium salt on a protein to convert the functional group of an amino acid residue of the protein into an isotope. Labeling by substituting with an isotope labeling group derived from a labeled ammonium salt (Japanese Patent Application Laid-Open No.
  • an amino acid biosynthesis using a labeled amino acid labeled with a stable isotope such as 13 C or 15 N as a substrate System •
  • a stable isotope-labeled protein in a cell-free protein synthesis system in which enzyme activities other than the protein synthesis system such as an amino acid metabolism system are reduced (Japanese Patent No. 3145431).
  • the former method is a method in which an enzyme is applied to an amino acid residue of a protein after protein synthesis to perform isotope labeling, but the enzyme catalysis to be used is different from that of the present invention in the first place.
  • the amino acids present at the contacting position are labeled, the amino acids located inside the protein or inside the pocket, even on the surface, cannot be labeled.
  • the use of different types of amino acids and the specific labeling of specific amino acids have not been studied at all.
  • an object of the present invention is to provide a method for inexpensively producing a protein, particularly a stable isotope-labeled protein to be used as a sample for NMR measurement, and a reagent kit for protein synthesis. Disclosure of the invention
  • the present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above problems, and as a result, focused on the fact that asparagine (Asn) and glutamine (Gin) are metabolized and produced from aspartic acid (Asp) and glutamic acid (Glu), respectively.
  • Asparagine (Asn) and glutamine (Gin) are metabolized and produced from aspartic acid (Asp) and glutamic acid (Glu), respectively.
  • protein synthesis was performed using 18 amino acids that did not contain asparagine (Asn) and glutamine (Gin). Can be synthesized.
  • ammonium salt labeled with 15 N is added to the cell-free protein synthesis system.
  • the side chains of asparagine (Asn) and glutamine (Gin), which are metabolized and generated from aspartic acid (Asp) and glutamic acid (Glu), respectively, can be specifically labeled without adding paragine (Asn) and glutamine (Gin). It was also found that the use of an unlabeled ammonium salt allows labeling only the main chain of the desired amino acid without labeling the side chains of asparagine (Asn) and glutamine (Gin). The present invention has been completed based on such findings.
  • a method for producing a protein comprising synthesizing a protein using, as a substrate, an amino acid mixture containing at most 19 types of amino acids selected from the group consisting of asparagine, and glutamine.
  • the amino acid mixture contains alanine, arginine, aspartic acid, cystine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine, and valine.
  • the amino acid mixture is alanine, arginine, aspartic acid, cystine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine, triptophan, tyrosine, parin,
  • the method according to (1) which is a mixture containing asparagine.
  • the amino acid mixture is alanine, arginine, aspartic acid, cystine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, fenylalanine, proline, serine, threonine, tributofan, tyrosine, valine, and valine.
  • a method for producing a stable isotope-labeled protein in a cell-free protein synthesis system comprising adding an ammonium salt to the system, and adding alanine, arginine, aspartic acid, cysteine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, Mouth
  • An amino acid mixture containing at most 19 types of amino acids selected from the group consisting of isine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tributofan, tyrosine, norin, asparagine, and glutamine
  • the amino acid mixture contains alanine, arginine, aspartic acid, cystine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine, and valine.
  • the amino acid mixture is alanine, arginine, aspartic acid, cystine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine, valine, and valine.
  • the method according to (8) which is a mixture containing:
  • the amino acid mixture is alanine, arginine, aspartic acid, cysteine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine, parin,
  • the method according to (8) which is a mixture containing glutamine.
  • alanine arginine, aspartic acid, cystine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tributphan, tyrosine, nolin, At least one amino acid selected from the group consisting of asparagine, and glutamine;
  • a reagent kit for synthesizing a stable isotope-labeled protein comprising:
  • the amino acid mixture contains alanine, arginine, aspartic acid, cysteine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine, and valine.
  • the kit according to (13) contains alanine, arginine, aspartic acid, cysteine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine, and valine.
  • the amino acid mixture is alanine, arginine, aspartic acid, cysteine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine, and glutamine.
  • FIG. 1 shows a comparison of the amount of CAT protein obtained by cell-free protein synthesis using a mixture of 20 amino acids or a mixture of 18 amino acids as a substrate.
  • FIG. 2 shows the relationship between the added concentration of ammonium acetate and the amount of synthesized protein.
  • FIG. 3 shows a 15 N HSQC spectrum of a purified sample of labeled Ras protein prepared by the method of the present invention (dialysis method).
  • Figure 4 shows a uniform 15 N-labeled dialysis prepared using 20 types of 15 N-labeled amino acids.
  • 3 shows a 15 N HSQC spectrum of Ras protein.
  • Figure 5 compares the amounts of GFP proteins obtained by cell-free protein synthesis in the presence of various concentrations of ammonium acetate using 20 types of amino acid mixtures or 18 types of amino acid mixtures as substrates. Show.
  • Figure 6 shows GFP proteins obtained by cell-free protein synthesis in the presence of various concentrations of ammonium acetate using a mixture of 20 amino acids or a mixture of 18 amino acids (increased Asp and Glu concentrations) as substrates. 3 shows a comparison of the amounts.
  • Figure 7A shows a mixture of 20 amino acids or a mixture of 18 amino acids.
  • This figure shows the results obtained by detecting the GFP protein synthesized by cell-free protein synthesis under the concentration of 60 mM ammonium acetate using the Asp and Glu concentrations as the substrate by the immunoblot method (lane 1: pQBI T7- Without GFP (control of synthesis with a mixture of 20 amino acids), lane 2: Without pQBI T7-GFP (control with synthesis of a mixture of 18 amino acids), lane 3: synthesis with a mixture of 20 amino acids, Lane 4: Synthesis with a mixture of 18 amino acids).
  • Figure 7B shows a mixture of 20 amino acids or a mixture of 18 amino acids.
  • This figure shows the results of detection of Ras protein synthesized by cell-free protein synthesis at 60 mM ammonium acetate concentration by Immunobut method using (Asp, Glu concentration increased) as a substrate (lane 1: pK7_NHis-Ras not added ( Control of synthesis with a mixture of 20 amino acids), Lane 2: No addition of pK7-NHis-Ras (Control of synthesis with a mixture of 18 amino acids), Lane 3: Synthesis with a mixture of 20 amino acids, Lane 4: Mix of 18 types Synthesis with a mixture of amino acids).
  • This application claims the priority of Japanese Patent Application No. 2003-145390 filed on May 22, 2003 and includes the contents described in the description and drawings of the patent application.
  • Protein production method using cell-free protein synthesis system characterized in that in a cell-free protein synthesis system, a protein is synthesized using an amino acid mixture containing at most 19 kinds of amino acids as a substrate.
  • cell-free protein synthesis system in the present invention refers to a cell-free translation system that reads mRNA information and synthesizes proteins on ribosomes, a cell-free transcription system that synthesizes RNA using DNA as type II, and a cell-free transcription system. Includes both translation systems.
  • the “protein” in the present invention refers to a polypeptide having an arbitrary molecular weight composed of a plurality of amino acid residues, and particularly refers to a polypeptide having a three-dimensional structure.
  • amino acid mixture refers to alanine, arginine, aspartic acid, cysteine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, fenylalanine, proline, serine, threonine, tributanphan, tyrosine, valine.
  • Asparagine, and glutamine refers to a mixture of amino acids containing at most 19 amino acids selected from the group consisting of glutamine, specifically, a mixture of 19 amino acids obtained by removing glutamine from the above amino acid group and excluding asparagine.
  • all amino acids refer to L-form amino acids.
  • Unnatural amino acids other than the above-mentioned amino acid group (20 types) constituting proteins are not included in the above “amino acid mixture”, but they can be added to the present synthesis system.
  • the protein production by the cell-free protein synthesis system of the present invention is performed by using a conventionally known material for cell-free protein synthesis, that is, a cell extract for cell-free protein synthesis, except for using the above-mentioned amino acid mixture as an amino acid substrate. It can be carried out using a type III nucleic acid encoding the target protein, an energy source (a substance containing a high-energy phosphate bond such as ATP, GTP, creatine phosphate).
  • an energy source a substance containing a high-energy phosphate bond such as ATP, GTP, creatine phosphate.
  • Cell extract for cell-free protein synthesis refers to plant cells, animal cells, fungal cells, and other components required for the translation system or transcription system Z translation system involved in protein in vivo synthesis such as ribosomes and tRNA. It refers to an extract from bacterial cells. Specifically, Escherichia coli, wheat germ, egret reticulocytes, mouse L-cells, Ehrlich ascites cancer cells, Extracts of HeLa cells, CHO cells, budding yeast and the like can be mentioned.
  • the cell extract is prepared by, for example, crushing the above cells with French Press® glass beads according to the method described in Pratt, JM et al., Transcription and trasnlation-a practical approach (1984), pp. 179-209. It can be performed by adding a buffer containing several kinds of salts for solubilizing protein components and ribosomes, homogenizing the mixture, and precipitating insoluble components by centrifugation.
  • a preferred cell extract is Escherichia coli S30 cell extract.
  • the S30 cell extract can be prepared from Escherichia coli strain A19 (iM, mel) by a known method (Zubay et al. (1973) Ann. Rev. Genet. 7: 267-287).
  • the amount of the cell extract for cell-free protein synthesis is not particularly limited, but is preferably, for example, in the range of 10 to 40% by weight of the whole reaction solution.
  • nucleic acid encoding the protein of interest is not particularly limited as long as it encodes the protein of interest and contains transcription, Z, or an appropriate sequence that can be translated, and may be any of RNA, mRNA, DNA, and cDNA. Including. When DNA is used, a transcription reaction requiring RNA polymerase or the like is required, and the yield is reduced. Therefore, when large-scale synthesis is required, mRNA is preferably used.
  • DNA or RNA encoding the target protein can be obtained from eukaryotic or prokaryotic cells or tissues by genomic DNA or mRNA using well-known methods (such as phenol Z-cloth form treatment, ethanol precipitation, and cesium chloride density gradient centrifugation).
  • the target protein or the nucleotide sequence encoding the same can be synthesized and isolated by cDNA cloning.
  • it can be chemically synthesized using a DNA synthesizer.
  • the concentration of the nucleic acid to be added to the reaction solution for cell-free protein synthesis (hereinafter also referred to as reaction solution) should be appropriately set depending on the protein synthesis activity of the cell extract for cell-free protein synthesis, the type of protein to be synthesized, and the like. For example, it is usually set to about 0.1 to ⁇ .
  • the energy source in the cell-free protein synthesis system is not particularly limited as long as it is a substance used as an energy source in a living body. Substances having a high-energy phosphate bond such as P and creatine phosphate are exemplified.
  • the concentration of the energy source added to the reaction solution can be appropriately set depending on the protein synthesis activity of the cell extract for cell-free protein synthesis, the type of protein to be synthesized, and the like.
  • an ammonium salt to the cell-free protein synthesis system in order to improve the protein synthesis ability.
  • ammonium salt examples include ammonium acetate, ammonium benzoate, ammonium citrate, and ammonium chloride, with ammonium acetate being preferred.
  • concentration of the ammonium salt added to the reaction solution is 20 to 120 mM, preferably 20 to 100 raM, more preferably 40 to 80 mM.
  • the above reaction solution may contain, if necessary, enzymes involved in ATP regeneration (for example, a combination of phosphoenolpyruvate and pyruvate kinase or a combination of creatine phosphate and creatine kinase), various RNA polymerases (T7 , ⁇ 3, and SP6 RNA polymerase, etc.) and chaperone proteins (eg, DnaJ, DnaK, GroE, GroEL, GroES, HSP70, etc.) having a function of forming a three-dimensional structure of the protein may be added.
  • enzymes involved in ATP regeneration for example, a combination of phosphoenolpyruvate and pyruvate kinase or a combination of creatine phosphate and creatine kinase
  • various RNA polymerases T7 , ⁇ 3, and SP6 RNA polymerase, etc.
  • chaperone proteins eg, DnaJ, DnaK, GroE, GroEL,
  • reaction solution may be supplemented with a non-proteinaceous component, if necessary.
  • a non-proteinaceous component is a component originally contained in a cell extract for cell-free protein synthesis, but can be added separately to improve the protein synthesis ability. Can be
  • the above reaction solution may contain various additives for protection and Z or stabilization of protein or RNA as necessary.
  • the additive include a liponuclease (RNase) inhibitor (placental RNase inhibitor), a reducing agent (such as dithiothreitol), an RNA stabilizer (such as spermidine), and a protease inhibitor (phenyl). Methanesulfonyl fluoride (PMSF) and the like.
  • the concentration to be added to these reaction solutions may be appropriately set according to the protein synthesis activity of the cell extract for cell-free protein synthesis to be used, the type of target protein to be synthesized, and the like.
  • any of the conventionally known batch and dialysis methods May be used.
  • the reaction solution contains nucleic acid encoding the target protein.
  • RNA a cell extract for cell-free protein synthesis, the amino acid mixture described above as a constituent material of the target protein, ATP (adenosine 5'-triphosphate), GTP (guanosine 5'-triphosphate), In addition to CTP (cytidine 5'-triphosphate), UTP (peridine 5'-triphosphate), buffers, salts, RNAse inhibitors, and antibacterial agents, if necessary, RNA polymerases such as T7 RNA polymerase ( When DNA is used as type II), tRNA and the like can be contained.
  • ATP adenosine 5'-triphosphate
  • GTP guanosine 5'-triphosphate
  • CTP cytidine 5'-triphosphate
  • UTP peridine 5'-triphosphate
  • buffers salts
  • salts RNAse inhibitors
  • antibacterial agents if necessary, RNA polymerases such as T7 RNA polymerase ( When DNA is used as type II), tRNA
  • ATP regeneration systems include a combination of phosphoenol pyruvate and pyruvate kinase or a combination of creatine phosphate and creatine kinase, polyethylene glycol (eg, # 800), 3 ', 5'-c AMP. , Folic acids, reducing agents (eg, dithiothreitol), and the like.
  • a buffer such as Hepes-KOH or Tris-OAc can be used.
  • the salts for example, magnesium acetate, magnesium chloride, potassium acetate, calcium chloride, and the like can be used.
  • the antibacterial agent for example, sodium azide, ampicillin, and the like can be used.
  • the reaction conditions may be appropriately set depending on the cell extract for cell-free protein synthesis to be used, the target protein to be synthesized, and the like, but the temperature is usually 20 to 40 ° C, preferably 23 to 37 ° C, and Is usually 1 to 5 hours, preferably 3 to 4 hours.
  • the batch-type reaction solution was used as the inner solution for dialysis, and dialysed against 5 to 10 times the volume of the outer solution of the dialysis solution.
  • the target protein is recovered from the inner or outer dialysis solution.
  • the dialysis external solution a solution obtained by removing the cell extract for cell-free protein synthesis, the RNase inhibitor, the nucleic acid encoding the target protein, and the RNA polymerase from the composition of the internal solution for the dialysis can be used.
  • the external dialysis solution includes, for example, buffer solution, ATP, GTP, CTP, UTP, salts, the above-mentioned amino acid mixture which is a constituent material of the target protein, AT AT regenerating system, phosphoenol pyruvate and pyruvate kinase, antibacterial agent And so on.
  • the molecular weight cut-off of the dialysis membrane separating the inner and outer dialysis solutions is from 3,500 to 100,000, preferably from 10,000 to 50,000.
  • Dialysis is usually at 20-40 ° C, preferably at 23-37 ° C Perform with agitation and replace with a new external solution periodically (usually every 24 hours).
  • a new nucleic acid preferably mRNA
  • the dialysis can be performed using a dialysis device capable of shaking or stirring (eg, rotary stirring) containing the inner solution and the outer solution separated via a dialysis membrane.
  • a dialysis device capable of shaking or stirring (eg, rotary stirring) containing the inner solution and the outer solution separated via a dialysis membrane.
  • i spoDi alyzer registered trademark
  • Sli dealyzer registered trademark
  • Spectra / Por (registered trademark) dialysis tube manufactured by Spectra
  • the shaking speed or stirring speed is low, for example, 100 to 200 m, and the reaction time can be appropriately selected while monitoring the production of the target protein.
  • Purification of the synthesized protein can be performed relatively easily because the amount and type of contaminants contaminating is significantly smaller than that of separation from living cells.
  • Purification methods include, for example, ammonium sulfate or acetone precipitation, acid extraction, anion or cation exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography, gel filtration chromatography, hydroxyaperite, isoelectric chromatography, Chromatography and the like can be mentioned, and purification can be performed by these methods alone or in an appropriate combination depending on the properties of the protein.
  • an affinity purification method using a peptide sequence called a tag previously added to the protein and specifically recognizing and adsorbing the tag can be used.
  • the purification method is particularly preferable for obtaining a protein of high purity.
  • the tag is not particularly limited, a 6-histidine tag (6 ⁇ His), a GST fragment, a Maltose binding fragment and the like are generally used.
  • Identification and quantification of the protein synthesized and purified as described above can be performed by comparing activity with standard samples as necessary by activity measurement, immunological measurement, spectroscopic measurement, amino acid analysis, etc. .
  • a method for producing a stable isotope-labeled protein in a cell-free protein synthesis system comprising adding an ammonium salt to the system, and adding alanine, arginine, aspartic acid, cystine, glutamic acid, glycine.
  • the above method is provided, wherein the method is used as a substrate, and wherein at least one of the ammonium salt and / or the amino acid in the mixture is labeled with a stable isotope.
  • This method is a method for synthesizing a stable isotope-labeled protein to be used as a sample for R measurement in a cell-free protein synthesis system, in which an ammonium salt is added to the system, and the ammonium salt and / or amino acid mixture is added.
  • the procedure may be performed in the same manner as in 1. except that at least one of the amino acids is labeled with a stable isotope.
  • the synthesized stable isotope-labeled protein may be purified by the above-mentioned various means for a sample for NMR measurement.
  • the ammonium salt is a donor of ammonia in the metabolic system from aspartic acid (Asp) and glutamic acid (Glu) to asparagine (Asn) and glutamine (Gin) represented by the following formula, and serves as a donor of asparagine and glutamine.
  • Asp aspartic acid
  • Glu glutamic acid
  • Asn asparagine
  • Gin glutamine
  • ammonium acetate, ammonium benzoate, ammonium citrate, ammonium chloride and the like with preference given to ammonium acetate.
  • the concentration of the ammonium salt added to the reaction solution is 20 to 120 mM, preferably 20 to 100 mM, more preferably 40 to 80 mM.
  • Stable isotopes refer to 2 H, 15 N, and the like. Acid and glutamic acid metabolism
  • amino acid mixture H00C- (CH 2) 2 - CH (NH 2) -COOH H 2 N- CO- (CH 2) 2 -CH (NH 2) -COOH
  • amino acid mixture similar to the above, Aranin, The group consisting of arginine, aspartic acid, cystine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, fenylalanine, proline, serine, threonine, tributphan, tyrosine, valine, asparagine, and glutamine.
  • Amino acid mixture containing at most 19 different amino acids specifically 19 amino acid mixtures excluding glutamine from the above amino acid group, 19 amino acid mixtures excluding asparagine, glutamine, and asparagine A mixture of eighteen kinds of amino acids excluding carboxylic acid.
  • an amino acid mixture of, for example, 18 kinds of amino acids is used, a mixture of 18 kinds of amino acids alone may be used, or a commercially available Algal mixtue may be used, and amino acids such as cysteine and tryptophan which are not contained therein may be used. Acids may be added as needed to provide 18 types.
  • Stable isotopes include 2 H, 13 C, 15 N and the like.
  • amino acid mixture for a substrate in which several kinds of labeled amino acids are combined. Therefore, at least one kind of amino acid contained in the amino acid mixture may be labeled, and all kinds of amino acids may be labeled.
  • the number and type of amino acids to be labeled may be appropriately selected depending on the type of protein to be analyzed, the purpose of analysis, and the like.
  • Stable isotope labeled protein synthesis reagent kit As mentioned above, ammonium salt labeled with a stable isotope is asparagine.
  • a stable isotope-labeled or unlabeled ammonium salt preferably a stable isotope-labeled or unlabeled ammonium acetate
  • a stable isotope-labeled amino acid mixture as necessary. It can be provided in the form of a kit for the synthesis of stable isotope-labeled proteins, together with other components necessary for protein production by the cell-free protein synthesis system.
  • kit for synthesizing a stable isotope-labeled protein of the present invention comprises the following components:
  • At least one of the amino acids in the ammonium salt and / or the mixture is labeled with a stable isotope.
  • At least one of the amino acids in the amino acid mixture may be labeled with a stable isotope.
  • ammonium salt and the meaning of the amino acid mixture are as described in 2.
  • the kit can include liponucleotides such as ATP, GTP, CTP, and UTP, and a buffer for adjusting the pH of the substrate solution.
  • Example 1 Cell-free protein synthesis using 18 kinds of amino acids (batch method) A reaction solution having the following composition (total amount 30 ⁇ 1) was incubated at 37 ° C for 1 hour to perform a protein synthesis reaction. .
  • pK7-CAT: is a CAT expression vector prepared according to the description of Kim et al. (1996) Eur. J. Biochem. 239: 881-886.
  • E. coli total tRNA (MRE600, Roche) 175 g / ml
  • CAT activity was quantified from the increase in absorbance per unit time at 37 ° C. and 4121, and the amount of CAT protein was determined using this as an index.
  • Fig. 1 When comparing the amounts of proteins synthesized using 20 or 18 amino acids, there was no difference between 0.551 mg and 0.529 nig, respectively (Fig. 1). As a result, it was found that protein synthesis in a cell-free protein synthesis system was possible even with a mixture of 18 amino acids except for asparagine (Asn) and glutamine (Gin).
  • Protein synthesis was performed in the same manner as in Example 1 except that various concentrations of ammonium acetate were used in the reaction solution for cell-free protein synthesis by the above batch method, and the amount of CAT protein was quantified. The result is shown in figure 2. It was found that as the concentration of ammonium acetate increased, the amount of CAT protein increased, reaching a maximum at 80.
  • a lmg / ml cyclic double-stranded MA expression vector (pK7-) containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and containing the gene encoding Ras protein as type I DNA was added.
  • HEPES-KOH 60 mM dithiothreitol 1.8 mM ATP 1.3 mM
  • the purified sample was replaced with a solution consisting of 20 mM sodium phosphate (pH 6.5), 100 mM sodium chloride, 5 magnesium chloride, 5 mM DTT, 0.01 wt% NaN 3 to make the solvent suitable for NMR measurement. Thereafter, the sample was concentrated to 0.25 ml (sample concentration 0.28 mM). An ultrafiltration device (Vivaspin 2: Sartorius) was used for the above operations. Finally, 0.03 ml of heavy water was added to obtain a sample for ⁇ R measurement.
  • a protein synthesis reaction was performed using a reaction solution having the following composition (total amount 30 ⁇ 1).
  • pQBI T7-GFPJ is a GFP expression vector
  • E. coli total tRNA (MRE600, Roche) 175 xg / ml
  • the concentration of ammonium acetate at which the maximum amount of GFP was obtained was 40 in both cases of using 20 kinds of amino acids and 18 kinds of amino acids.
  • Protein synthesis reaction was performed using a reaction solution of the following composition (total amount 30 / il).
  • T Asphaltic acid (Asp) was added to the reaction solution of the following composition.
  • glutamic acid was added to the reaction solution of the following composition.
  • the concentration of (Glu) was 1.5 times the normal concentration (1.5 mM).
  • Creatine kinase (Roche) 25 ( ⁇ g / ml
  • E. coli total tRNA (MRE600, Roche) 175 g / ml
  • the concentration of ammonium acetate at which the maximum amount of GFP was obtained was 40 mM when 20 kinds of amino acids were used, and when 18 kinds of amino acids were used (aspartic acid (Asp) and glutamic acid (Glu) At a 5-fold concentration (1.5 mM), the concentration was 60 mM.
  • the amount of GHP synthesized at the peak when 18 kinds of amino acids were used was almost the same as that when 20 kinds of amino acids were used. Therefore, it was shown that by adding 1.5 times the usual amount of aspartic acid (Asp glutamic acid (Glu)), the same amount of amino acid synthesis as in the conventional method can be obtained.
  • Example 6 Comparison of protein synthesis amount in a cell-free protein synthesis system (batch method) using 20 or 18 amino acids
  • acetic acid Synthesis of GFP protein and Ras protein was performed at an ammonium concentration of 6 (kM).
  • reaction solution The composition of the reaction solution is shown below.
  • pQBI T7-GFPJ and “pK7-NHis-Ras” are as described above.
  • E. coli total tRNA (MRE600, manufactured by Roche) 175 g / ml ammonium acetate 60 mM

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Abstract

本発明は、タンパク質立体構造解析のためのNMR測定試料となる同位体標識タンパク質を安価にかつ迅速に製造する方法を提供することを目的する。　本発明は、無細胞タンパク質合成系においてアラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、アスパラギン、及びグルタミンから成る群から選択されるアミノ酸を多くとも１９種類含むアミノ酸混合物を基質として用いてタンパク質を合成することを特徴とするタンパク質の製造方法である。

Description

W 明 細 書
無細胞タンパク質合成系によるタンパク質の製造方法及びタンパク質合成用試 薬キット 技術分野
本発明は、 無細胞タンパク質合成系によるタンパク質の製造方法、 詳しくは無 細胞タンパク質合成系において多くとも 1 9種類のアミノ酸を含むアミノ酸混合 物を基質として用いてタンパク質を合成することを特徴とするタンパク質、 特に は安定同位体標識タンパク質の製造方法、 ならびにその方法を実施するための夕 ンパク質合成用試薬キッ卜に関する。 冃景技術
無細胞タンパク質合成系は、 細胞抽出液を用いて試験管内でタンパク質を合成 する系である。 無細胞タンパク質合成系は D N A断片をそのまま発現の錶型とし て利用できるため、 従来の大腸菌、 酵母、 培養細胞などの生細胞を用いる発現系 に必要とされた、 目的タンパク質遺伝子のベクターへのライゲ一シヨン、 卜ラン スフォーメーション、 培養、 集菌、 溶菌といった時間と手間のかかる工程が一切 不要となり、 短時間で容易にタンパク質を発現することができる。
近年、 ゲノムにコードされたタンパク質の構造や機能を網羅的に解明しようと する、 いわゆる構造 ·機能ゲノム科学研究が急速に発展し始め、 解析対象とすべ きタンパク質の数は飛躍的に多くなつた。 このために、 多数のタンパク質試料を 迅速に調製できる、 ハイスループッ卜なタンパク質発現系が必要となってきてお り、 その意味でも無細胞タンパク質合成系に対する注目が集まっている。
これまで、 無細胞タンパク質合成系においては、 タンパク質合成に必要なアミ ノ酸基質としてタンパク質を構成する 20 種類のアミノ酸を使用している （特開 2000- 175695号、 特開 2002- 125698号など参照） 。 しかしながら、 N M R法によ るタンパク質の立体構造解析用試料を作成するためには安定同位体標識アミノ酸 を用いなければならず、 コストが高くなるという問題がある。 特に、 N M R測定 用試料に用いられる Alga l由来の標識化アミノ酸のうち、 システィン （Cys)、 ト リブトフアン （ΤΓΡ)、 ァスパラギン （Asn) 、 グルタミン （Gin)はアミノ酸加水 分解の過程で脱落してしまうために補充しなければならず、 またこれらのァミノ 酸は他のアミノ酸に比べて高いのでコス卜が上がる原因になっている。
これまで安定同位体標識タンパク質を製造した例としては、 同位体標識アンモ ニゥム塩の存在下でトランスダル夕ミナ一ゼなどの酵素をタンパク質に作用させ、 タンパク質のアミノ酸残基の官能基を同位体標識アンモニゥム塩に由来する同位 体標識基で置換することによって標識する方法 （特開 2002-332295 号） 、 13C、 15N などの安定同位体で標識された標識アミノ酸を基質とし、 アミノ酸生合成 系 ·アミノ酸代謝系などのタンパク質合成系以外の酵素活性を低下させた無細胞 タンパク質合成系において安定同位体標識タンパク質を製造する方法 （特許第 3145431 号） がある。 しかしながら、 前者は、 タンパク質合成後にタンパク質の アミノ酸残基に酵素を作用させて同位体標識する方法であるが、 そもそも利用す る酵素触媒反応が本願発明のものとは異なり、 またこの方法では酵素と接触する 位置に存在するアミノ酸は標識されても、 タンパク質の内側や、 また表面部分で もポケッ卜の内部に位置するようなアミノ酸については標識することができなレ^ また後者はアミノ酸基質として 20 種類のアミノ酸を使用しており、 また特定の アミノ酸を特異的に標識することについては何ら検討されていない。
従って、 本発明の目的は、 タンパク質、 特には N M R測定用試料となる安定同 位体標識タンパク質を安価に製造するための方法及びタンパク質合成用試薬キッ トを提供することにある。 発明の開示
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、 ァスパラギン (Asn) 及びグルタミン （Gin) がァスパラギン酸 （Asp) 及びグルタミン酸 (Glu) からそれぞれ代謝 ·生成されることに着目し、 無細胞タンパク質合成系 においてァスパラギン （Asn) 及びグルタミン （Gin) を含まない 18 種類のアミ ノ酸を用いてタンパク質の合成を行ったところ、 20 種類のアミノ酸を用いたと きと同等な活性を有するタンパク質を合成できることを見出した。 また、 同時に、 15N にて標識したアンモニゥム塩を無細胞タンパク質合成系に添加すると、 ァス パラギン （Asn) 及びグルタミン （Gin) を入れなくてもァスパラギン酸 （Asp) 及びグルタミン酸 （Glu) からそれぞれ代謝 ·生成されたァスパラギン （Asn) 及 びグルタミン （Gin) の側鎖を特異的に標識でき、 また非標識のアンモニゥム塩 を用いれば、 ァスパラギン （Asn) 及びグルタミン （Gin) の側鎖を標識させずに 所望のアミノ酸の主鎖のみを標識できることを見出した。 本発明はかかる知見に より完成されたものである。
すなわち、 本発明は以下の発明を包含する。
(1) 無細胞タンパク質合成系において、 ァラニン、 アルギニン、 ァスパラギン 酸、 システィン、 グルタミン酸、 グリシン、 ヒスチジン、 イソロイシン、 口イシ ン、 リジン、 メチォニン、 フエ二ルァラニン、 プロリン、 セリン、 トレオニン、 トリプトファン、 チロシン、 バリン、 ァスパラギン、 及びグルタミンから成る群 から選択されるアミノ酸を多くとも 1 9種類含むアミノ酸混合物を基質として用 いてタンパク質を合成することを特徴とする、 タンパク質の製造方法。
(2) アミノ酸混合物が、 ァラニン、 アルギニン、 ァスパラギン酸、 システィン、 グルタミン酸、 グリシン、 ヒスチジン、 イソロイシン、 ロイシン、 リジン、 メチ ォニン、 フエ二ルァラニン、 プロリン、 セリン、 トレォニン、 トリプトファン、 チロシン、 及びバリンを含む混合物である、 （1)に記載の方法。
(3) アミノ酸混合物が、 ァラニン、 アルギニン、 ァスパラギン酸、 システィン、 グルタミン酸、 グリシン、 ヒスチジン、 イソロイシン、 ロイシン、 リジン、 メチ ォニン、 フエ二ルァラニン、 プロリン、 セリン、 トレォニン、 トリプ卜ファン、 チロシン、 パリン、 及びァスパラギンを含む混合物である、 （1)に記載の方法。
(4) アミノ酸混合物が、 ァラニン、 アルギニン、 ァスパラギン酸、 システィン、 グルタミン酸、 グリシン、 ヒスチジン、 イソロイシン、 ロイシン、 リジン、 メチ ォニン、 フエ二ルァラニン、 プロリン、 セリン、 トレォニン、 トリブトファン、 チロシン、 バリン、 及びグルタミンを含む混合物である、 （1)に記載の方法。
(5) 無細胞タンパク質合成系に、 アンモニゥム塩を添加することを特徴とする、 (1)〜（4)のいずれかに記載の方法。
(6) アンモニゥム塩を 20〜120mMの最終濃度となるように添加することを特徴 とする、 （5)に記載の方法。 (7) アンモニゥム塩が酢酸アンモニゥムである、 （5)又は（6)に記載の方法。
(8) 無細胞タンパク質合成系において安定同位体標識タンパク質を製造する方 法であって、 該系にアンモニゥム塩を添加し、 ァラニン、 アルギニン、 ァスパラ ギン酸、 システィン、 グルタミン酸、 グリシン、 ヒスチジン、 イソロイシン、 口 イシン、 リジン、 メチォニン、 フエ二ルァラニン、 プロリン、 セリン、 卜レオニ ン、 トリブトファン、 チロシン、 ノ リン、 ァスパラギン、 及びグルタミンから成 る群から選択されるアミノ酸を多くとも 1 9種類含むアミノ酸混合物を基質とし て用い、 かつ、 前記アンモニゥム塩及び/又は前記混合物中のアミノ酸の少なく とも 1種が安定同位体で標識されていることを特徴とする、 上記方法。
(9) アミノ酸混合物が、 ァラニン、 アルギニン、 ァスパラギン酸、 システィン、 グルタミン酸、 グリシン、 ヒスチジン、 イソロイシン、 ロイシン、 リジン、 メチ ォニン、 フエ二ルァラニン、 プロリン、 セリン、 トレォニン、 トリプトファン、 チロシン、 及びバリンを含む混合物である、 （8)に記載の方法。
(10) アミノ酸混合物が、 ァラニン、 アルギニン、 ァスパラギン酸、 システィン、 グルタミン酸、 グリシン、 ヒスチジン、 イソロイシン、 ロイシン、 リジン、 メチ ォニン、 フエ二ルァラニン、 プロリン、 セリン、 卜レオニン、 トリプトファン、 チロシン、 バリン、 及びァスパラギンを含む混合物である、 （8)に記載の方法。
( 1 1) アミノ酸混合物が、 ァラニン、 アルギニン、 ァスパラギン酸、 システィン、 グルタミン酸、 グリシン、 ヒスチジン、 イソロイシン、 ロイシン、 リジン、 メチ ォニン、 フエ二ルァラニン、 プロリン、 セリン、 トレオニン、 卜リプトフアン、 チロシン、 パリン、 及びグルタミンを含む混合物である、 （8)に記載の方法。
( 12) アンモニゥム塩が酢酸アンモニゥムである、 ）〜（1 1)のいずれかに記載 の方法。
(13) 以下の成分：
(a) アンモニゥム塩
(b) ァラニン、 アルギニン、 ァスパラギン酸、 システィン、 グルタミン酸、 グ リシン、 ヒスチジン、 イソロイシン、 ロイシン、 リジン、 メチォニン、 フエニル ァラニン、 プロリン、 セリン、 トレォニン、 トリブトファン、 チロシン、 ノ リン、 ァスパラギン、 及びグルタミンから成る群から選択されるアミノ酸を多くとも 1
9種類含むアミノ酸混合物
(c) 無細胞タンパク質合成用細胞抽出液
を含み、 かつ、 前記アンモニゥム塩及び/又は前記混合物中のアミノ酸の少なく とも 1種が安定同位体で標識されていることを特徴とする、 安定同位体標識タン パク質合成用試薬キッ卜。
(14) アミノ酸混合物が、 ァラニン、 アルギニン、 ァスパラギン酸、 システィン、 グルタミン酸、 グリシン、 ヒスチジン、 イソロイシン、 ロイシン、 リジン、 メチ ォニン、 フエ二ルァラニン、 プロリン、 セリン、 トレオニン、 トリプトファン、 チロシン、 及びバリンを含む混合物である、 （13)に記載のキット。
(15) アミノ酸混合物が、 ァラニン、 アルギニン、 ァスパラギン酸、 システィン、 グルタミン酸、 グリシン、 ヒスチジン、 イソロイシン、 ロイシン、 リジン、 メチ ォニン、 フエ二ルァラニン、 プロリン、 セリン、 トレォニン、 トリブトファン、 チロシン、 バリン、 及びァスパラギンを含む混合物である、 （13)に記載のキット。
(16) アミノ酸混合物が、 ァラニン、 アルギニン、 ァスパラギン酸、 システィン、 グルタミン酸、 グリシン、 ヒスチジン、 イソロイシン、 ロイシン、 リジン、 メチ ォニン、 フエ二ルァラニン、 プロリン、 セリン、 トレォニン、 トリプトファン、 チロシン、 パリン、 及びグルタミンを含む混合物である、 （13)に記載のキット。
(17) アンモニゥム塩が酢酸アンモニゥムである、 （13)〜（16)のいずれかに記載 のキッ卜。 図面の簡単な説明
図 1は、 20種類のアミノ酸混合物、 又は 18種類のアミノ酸混合物を基質とし て用いて無細胞系タンパク質合成によってそれぞれ得られた CATタンパク質量の 比較を示す。
図 2は、 酢酸アンモニゥムの添加濃度とタンパク合成量との関係を示す。
図 3は、 本発明方法 （透析法） にて調製した標識 Ras タンパク質精製試料の 15N HSQCスぺクトルを示す。
図 4は、 20種類の 15N標識アミノ酸を用いて透析法にて調製した均一 15N標識 Rasタンパク質の 15N HSQCスぺク トルを示す。
図 5は、 20種類のアミノ酸混合物、 又は 18種類のアミノ酸混合物を基質とし て用い、 種々の濃度の酢酸アンモニゥム存在下で無細胞系タンパク質合成によつ てそれぞれ得られた GFPタンパク質量の比較を示す。
図 6は、 20 種類のアミノ酸混合物、 又は 18 種類のアミノ酸混合物 （Asp，Glu 濃度を増量） を基質として用い、 種々の濃度の酢酸アンモニゥム存在下で無細胞 系タンパク質合成によってそれぞれ得られた GFPタンパク質量の比較を示す。
図 7 Aは、 20 種類のアミノ酸混合物、 又は 18 種類のァミ ノ酸混合物
(Asp，Glu濃度を増量） を基質として用い、 60mM酢酸アンモ-ゥム濃度下で無細 胞系タンパク質合成した GFPタンパク質をィムノブ口ッ ト法により検出した結果 を示す （レーン 1 ： pQBI T7 - GFP無添加 （20種類のアミノ酸混合物による合成の コントロール） 、 レーン 2 ： pQBI T7- GFP無添加 （18種類のアミノ酸混合物によ る合成のコントロール） 、 レーン 3 ： 20 種類のアミノ酸混合物による合成、 レ ーン 4 ： 18種類のアミノ酸混合物による合成）。
図 7 Bは、 20 種類のァミノ酸混合物、 又は 18 種類のァミ ノ酸混合物
(Asp，Glu濃度を増量） を基質として用い、 60mM酢酸アンモニゥム濃度下で無細 胞系タンパク質合成した Rasタンパク質をィムノブ口ット法により検出した結果 を示す （レーン 1 ： pK7_NHis-Ras 無添加 （20 種類のアミノ酸混合物による合成 のコントロール） 、 レーン 2 ： pK7-NHis-Ras 無添加 （18 種類のアミノ酸混合物 による合成のコントロール） 、 レーン 3 : 20 種類のアミノ酸混合物による合成、 レーン 4： 18種類のアミノ酸混合物による合成）。 以下、 本発明を詳細に説明する。 本願は、 2003年 5月 22 日に出願された日本 国特許出願 2003-145390号の優先権を主張するものであり、 該特許出願の明細書 及ぴ 又は図面に記載される内容を包含する。
1 . 無細胞タンパク質合成系によるタンパク質の製造方法 本発明によれば、 無細胞タンパク質合成系において、 多くとも 1 9種類のアミ ノ酸を含むアミノ酸混合物を基質として用いてタンパク質を合成することを特徵 とするタンパク質の製造方法が提供される。
本発明における 「無細胞タンパク質合成系」 とは、 m R NAの情報を読み取つ てリボソーム上でタンパク質を合成する無細胞翻訳系、 D N Aを铸型として R N Aを合成する無細胞転写系と無細胞翻訳系の両者を包含する。
本発明における 「タンパク質」 とは、 複数のアミノ酸残基から構成される任意 の分子量のポリペプチドをいい、 特にポリペプチドが立体構造を形成したものを いう。
本発明において 「アミノ酸混合物」 とは、 ァラニン、 アルギニン、 ァスパラギ ン酸、 システィン、 グルタミン酸、 グリシン、 ヒスチジン、 イソロイシン、 ロイ シン、 リジン、 メチォニン、 フエ二ルァラニン、 プロリン、 セリン、 トレオニン、 トリブトファン、 チロシン、 バリン、 ァスパラギン、 及びグルタミンから成る群 から選択されるアミノ酸を多くとも 1 9種類含むアミノ酸混合物をいい、 具体的 には、 上記のアミノ酸群からグルタミンを除いた 1 9種類のアミノ酸混合物、 ァ スパラギンを除いた 1 9種類のアミノ酸混合物、 グルタミン、 ァスパラギンを除 いた 1 8種類のアミノ酸混合物などをいう。 なお、 本明細書において全てのアミ ノ酸は L体のアミノ酸をいう。 また、 タンパク質を構成する上記のアミノ酸群 ( 2 0種類） 以外の非天然型アミノ酸は、 上記の 「アミノ酸混合物」 には含まれ ないが、 これらを本合成系に添加することもできる。
本発明の無細胞タンパク質合成系によるタンパク質製造は、 アミノ酸基質とし て上記のアミノ酸混合物を用いる以外は、 従来から知られる無細胞タンパク質合 成のための材料、 すなわち無細胞タンパク質合成用細胞抽出液、 目的タンパク質 をコードする銬型となる核酸、 エネルギー源 （A T P、 G T P、 クレアチンホス フエ一ト等の高エネルギーリン酸結合含有物） 等を用いて行うことができる。
「無細胞タンパク質合成用細胞抽出液」 とは、 リボソーム、 t R N Aなどの夕 ンパク質インビポ合成に関与する翻訳系又は転写系 Z翻訳系に必要な成分を含む 植物細胞、 動物細胞、 真菌細胞、 細菌細胞からの抽出液をいう。 具体的には、 大 腸菌、 小麦胚芽、 ゥサギ網赤血球、 マウス L一細胞、 エールリツヒ腹水癌細胞、 He L a細胞、 CHO細胞、 出芽酵母等の抽出液が挙げられる。 細胞抽出液の調 製は、 例えば Pratt, J. M. ら、 Transcript ion and trasnlation-a practical approach (1984) 、 pp.179-209 に記載の方法に従い、 上記細胞をフレンチプレ スゃグラスビーズにて破砕し、 タンパク質成分やリボソームを可溶化するための 数種類の塩を含有する緩衝液を加えてホモジナイズし、 遠心分離にて不溶成分を 沈殿させることによって行うことができる。
好ましい細胞抽出液としては大腸菌 S30細胞抽出液を例示することができる。 当該 S30細胞抽出液は、 大腸菌 A19株 （iM， mel) から既知の方法 （Zubayら (1973) Ann. Rev. Genet.7:267-287)により調製することができ、 また市販品
(Promega社や Novagen社からも入手可能） を用いてもよい。
上記無細胞タンパク質合成用細胞抽出液の量は、 特に限定されないが、 例えば、 反応液全体の 10〜40重量％の範囲が好ましい。
「目的タンパク質をコードする核酸」 は、 当該目的タンパク質をコードし、 転 写及び Z又は翻訳され得る適切な配列を含むものであれば特に限定されず、 RN A、 mRNA、 DNA、 c D N Aのいずれをも含む。 DNAを使用する場合、 R NAポリメラ一ゼなどを必要とする転写反応が必要となり、 収量が低下すること から大量合成を必要とする場合は、 mRNAを用いることが好ましい。 目的タン パク質をコードする DNA又は RNAは、 真核又は原核生物の細胞若しくは組織 からゲノム DNA、 mRNAとして周知の方法 （フエノール Zクロ口ホルム処理、 エタノール沈殿、 塩化セシウム密度勾配遠心など） で得るか、 又は、 cDNAク ローニングで合成 ·単離することができる。 あるいは、 目的タンパク質のァミノ 酸配列又はそれをコードするヌクレオチド配列が判明している場合には、 D N A 合成機を用いて化学的に合成することもできる。
上記核酸の無細胞タンパク質合成用反応液 （以下、 反応液ともいう） への添加 濃度は、 無細胞タンパク質合成用細胞抽出液のタンパク質合成活性、 合成する夕 ンパク質の種類等によって適宜設定することができるが、 例えば、 通常 0.1〜 ΙΟηΜ程度とされる。
上記無細胞タンパク質合成系におけるエネルギー源は、 生体内でエネルギー源 として利用される物質であれば特に限定はされないが、 好ましくは ATP， GT P , クレアチンリン酸等の高エネルギーリン酸結合を有する物質が挙げられる。 また、 当該エネルギー源の反応液への添加濃度は、 無細胞タンパク質合成用細月 抽出液のタンパク質合成活性、 合成するタンパク質の種類等によって適宜設定す ることができる。
本発明においては、 タンパク質合成能を向上させる上で、 無細胞タンパク質合 成系にアンモニゥム塩を添加することが好ましい。
アンモニゥム塩としては、 例えば酢酸アンモニゥム、 安息香酸アンモニゥム、 クェン酸アンモニゥム、 塩化アンモニゥム等が挙げられるが、 酢酸アンモニゥム が好ましい。 アンモニゥム塩の反応液への添加濃度は、 20〜120mM、 好ましくは 20〜100raM、 より好ましくは 40〜80mMである。
上記反応液には、 必要に応じて、 A T P再生に関与する酵素 （例えば、 ホスホ エノ一ルビルベー卜とピルビン酸キナーゼの組み合わせ又はクレアチンホスフエ —卜とクレアチンキナーゼの組み合わせ） 、 各種の RNAポリメラーゼ （T7、 Τ3、 及び SP6 RNA polymerase 等） 、 タンパク質の三次元構造を形成する働きを持つ シャペロンタンパク質類 （例えば、 DnaJ、 DnaK、 GroE、 GroEL、 GroES及び HSP70 等） を添加してもよい。
また、 上記反応液には、 必要に応じて、 非タンパク質性成分を補強することが できる。 非タンパク質性成分とは、 もともと無細胞タンパク質合成用細胞抽出液 中に含まれている成分であるが、 別途添加することでタンパク質合成能を向上さ せることができる成分であり、 例えば tRNAが挙げられる。
さらに、 上記反応液は、 必要に応じて、 タンパク質や RNAの保護及び Z又は安 定化のための各種の添加剤を含有させてもよい。 当該添加剤としては、 例えば、 リポヌクレアーゼ （R Nァーゼ） 阻害剤 （胎盤 RNaseインヒビ夕一等） ；還元剤 (ジチオトレイトール等） ； RNA安定化剤 （スペルミジン等） ；プロテアーゼ阻 害剤 （フエニルメタンスルホニルフルオリド （PMSF) 等） などが挙げられる。 こ れらの反応液への添加濃度は、 使用する無細胞タンパク質合成用細胞抽出液の夕 ンパク質合成活性、 合成する目的タンパク質の種類等に応じて適宜設定すればよ い。
無細胞タンパク質合成には、 従来から知.られているバッチ法、 透析法のいずれ の方法を用いてもよい。
例えば、 バッチ法を用いる場合、 反応液には目的タンパク質をコードする核酸
(好ましくは niRNA) 、 無細胞タンパク質合成用細胞抽出液、 目的タンパク質の 構成材料となる前記のアミノ酸混合物、 ATP (アデノシン 5'-三リン酸） 、 GTP (グ ァノシン 5'-三リン酸） 、 CTP (シチジン 5'-三リン酸） 、 UTP (ゥリジン 5'-三リ ン酸） 、 緩衝液、 塩類、 RNァーゼ阻害剤、 抗菌剤のほか、 必要により T 7 RN Aポリメラーゼなどの RNAポリメラーゼ （DNAを鍀型として用いる場合） 、 t RNAなどを含むことができる。 その他、 ATP再生系としてホスホェノール ピルべ一卜とピルビン酸キナーゼの組み合わせ又はクレアチンホスフエ一トとク レアチンキナーゼの組み合わせ、 ポリエチレングリコール （例えば # 8 0 0 0) 、 3', 5'— c AMP、 葉酸類、 還元剤 （例えばジチオトレイトール） などを含む ことができる。
ここで、 緩衝液としては、 例えば Hepes- K0H、 Tris- OAcのような緩衝剤が使用 できる。 塩類としては、 例えば酢酸マグネシウム、 塩化マグネシウム、 酢酸カリ ゥム、 塩化カルシウムなどを用いることができ、 抗菌剤としては、 例えばアジ化 ナトリウム、 アンピシリンなどを用いることができる。
反応条件は、 使用する無細胞タンパク質合成用細胞抽出液、 合成する目的タン パク質等によって適宜設定すればよいが、 温度は通常 20〜40°C、 好ましくは 23 〜37°Cであり、 時間は通常 1〜5時間、 好ましくは 3〜4時間である。
また、 透析法を用いて連続的に目的タンパク質を製造する場合、 上記バッチ式 の反応液を透析内液とし、 反応液の 5〜 10倍容量の透析外液に対して透析を行い、 生成した目的タンパク質を透析内液又は透析外液から回収する。 透析外液は、 透 析内液組成から無細胞タンパク質合成用細胞抽出液、 RNァーゼ阻害剤、 目的夕 ンパク質をコードする核酸、 RNAポリメラーゼを除いたものが使用できる。 従 つて、 透析外液は、 例えば、 緩衝液、 ATP、 GTP, CTP, UTP、 塩類、 目的タンパク 質の構成材料となる前記のアミノ酸混合物、 AT Ρ再生系としてホスホェノール ピルペートとピルビン酸キナーゼ、 抗菌剤などを含んでいればよい。
透析内液と透析外液を隔てる透析膜の分画分子量は、 3， 500〜100, 000、 好まし くは 10, 000〜50, 000である。 透析は、 通常 20〜40°C、 好ましくは 23〜37°Cにて 攪拌しつつ行い、 定期的 （通常 24 時間毎） に新しい外液と交換する。 また、 新 たな核酸 （好ましくは mRNA) を定期的 （通常 24時間毎） に反応液に補給しても よい。 透析外液は反応速度が低下した時点で新鮮なものと交換することが望まし い。
透析は、 透析膜を介して内液と外液とを隔離して含む振とう若しくは攪拌 （回 転攪拌など） 可能な透析装置を用いて行うことができる。 小スケール反応用装置 としては、 例えば]) i spoDi alyzer (登録商標) (Spec t rum社製) や S l i dealyze r (登録商標） （P i erce 社製） 等を用いることができる。 また、 大スケール反応 用装置としては、 Spec t ra/Por (登録商標） 透析用チューブ （Spec t rum社製） 等 を用いることができる。 また、 振とう速度若しくは攪拌速度は低速、 例えば 100 〜200 m とし、 反応時間は目的タンパク質の生成を監視しながら適当に選択す ることができる。
合成したタンパク質の精製は、 生細胞からの分離と比べて混在する汚染物質の 量及び種類が格段に少ないため、 比較的容易に行うことができる。 精製法として は、 例えば硫酸アンモニゥム若しくはアセトン沈殿、 酸抽出、 ァニオン若しくは カチオン交換クロマトグラフィー、 疎水性相互作用クロマトグラフィー、 ァフィ 二ティークロマトグラフィー、 ゲルろ過クロマトグラフィー、 ヒドロキシァパ夕 イト、 等電点クロマトグラフィー、 クロマトフォーカシング等が挙げられ、 精製 はこれらの方法を当該タンパク質の性質に応じて単独に又は適宜組み合わせて行 うことができる。 また、 当該タンパク質に予めタグと呼ばれるペプチド配列を付 加させておき、 タグを特異的に認識し吸着することを利用したァフィ二ティー精 製法を用いることができる。 当該精製法は、 高純度のタンパク質を得る上で特に 好ましい。 当該タグとしては特に限定されないが、 6χヒスチジンタグ （6xHi s) 、 GST夕グ及びマルト一ス結合性夕グ等が一般的である。
以上のようにして合成 ·精製されたタンパク質の同定及び定量は、 活性測定、 免疫学的測定、 分光学的測定、 アミノ酸分析などによって、 必要に応じて標準サ ンプルと比較しながら行うことができる。
2 . 無細胞タンパク質合成系による安定同位体標識タンパク質の製造方法 本発明によればまた、 無細胞タンパク質合成系において安定同位体標識タンパ ク質を製造する方法であって、 該系にアンモニゥム塩を添加し、 ァラニン、 アル ギニン、 ァスパラギン酸、 システィン、 グルタミン酸、 グリシン、 ヒスチジン、 イソロイシン、 ロイシン、 リジン、 メチォニン、 フエ二ルァラニン、 プロリン、 セリン、 トレォニン、 トリブトファン、 チロシン、 ノ リン、 ァスパラギン、 及び グルタミンから成る群から選択されるアミノ酸を多くとも 1 9種類含むアミノ酸 混合物を基質として用い、 かつ、 前記アンモニゥム塩及び/又は前記混合物中の ァミノ酸の少なくとも 1種が安定同位体で標識されていることを特徴とする、 上 記方法が提供される。
本方法は、 無細胞タンパク質合成系にて雇 R測定用試料となる安定同位体標識 タンパク質を合成するための方法であって、 アンモニゥム塩を系に添加し、 アン モニゥム塩及び/又はアミノ酸混合物中のアミノ酸の少なくとも 1種が安定同位 体で標識されている以外は、 上記 1 . と同様にして行えばよい。 また、 合成され た安定同位体標識タンパク質は、 NMR 測定用試料のために前記の各種手段により 精製すればよい。
ここで、 アンモニゥム塩としては、 下記式で表されるァスパラギン酸 （Asp)、 グルタミン酸（Gl u)からァスパラギン （Asn)、 グルタミン （Gin)への代謝系にお いてアンモニアのドナーとなり、 ァスパラギンとグルタミンの側鎖アミノ基に転 じる作用を有する限り、 特に限定はされない。 例えば酢酸アンモニゥム、 安息香 酸アンモニゥム、 クェン酸アンモニゥム、 塩化アンモニゥム等が挙げられるが、 酢酸アンモニゥムが好ましい。 アンモニゥム塩の反応液への添加濃度は、 20〜 120mM、 好ましくは 20〜100mM、 より好ましくは 40〜80mMである。 また、 安定同 位体とは、 2 H， 1 5 N等をいう。 酸， グルタミン酸の代謝
Figure imgf000014_0001
H00C-CH2-CH (NH2) -C00H H2N- CO- CH2- CH (NHZ) -COOH
Figure imgf000015_0001
H00C- (CH2) 2- CH (NH2) -COOH H2N- CO- (CH2) 2-CH (NH2) -COOH また、 「アミノ酸混合物」 とは、 前記と同様に、 ァラニン、 アルギニン、 ァス パラギン酸、 システィン、 グルタミン酸、 グリシン、 ヒスチジン、 イソロイシン， ロイシン、 リジン、 メチォニン、 フエ二ルァラニン、 プロリン、 セリン、 トレォ ニン、 トリブトファン、 チロシン、 バリン、 ァスパラギン、 及びグルタミンから 成る群から選択されるアミノ酸を多くとも 1 9種類含むアミノ酸混合物をいい、 具体的には、 上記のアミノ酸群からグルタミンを除いた 1 9種類のアミノ酸混合 物、 ァスパラギンを除いた 1 9種類のアミノ酸混合物、 グルタミン、 ァスパラギ ンを除いた 1 8種類のァミノ酸混合物などをいう。
アミノ酸混合物として、 例えば 1 8種類のアミノ酸混合物を用いる場合、 1 8 種類のアミノ酸単品をそれぞれ混合したものでもよく、 或いは市販の Alga l mixtue を用い、 これに含まれていないシスティンやトリプトファン等のアミノ 酸を適宜追加して 1 8種類としたものでもよい。 また、 安定同位体とは、 2 H, 13C, 15N等をいう。
蛋白質の構造解析においては、 多種類の標識蛋白質が必要となる場合が多い。 このような場合には、 数種の標識ァミノ酸を組み合わせた基質用ァミノ酸混合物 を用意することが望ましい。 従って、 アミノ酸混合物に含まれるアミノ酸は少な くとも 1種が標識されていればよく、 全種が標識されていてもよい。 標識するァ ミノ酸の数及び種類は、 解析対象となるタンパク質の種類、 解析目的等により適 宜選択すればよい。
3 . 安定同位体標識タンパク質合成用試薬キット 前述のとおり、 安定同位体で標識されたアンモニゥム塩は、 ァスパラギン
(Asn)、 グルタミン（Gin)を含まないアミノ酸混合物を基質として用いる無細胞 タンパク質合成系によるタンパク質合成においてァスパラギン酸 （Asp) 、 ダル 夕ミン酸 （Gl u) から代謝 ·生成したァスパラギン （Asn)、 グルタミン（Gin)の側 鎖を特異的に標識することができ、 また非標識のアンモニゥム塩を用いればァス パラギン （Asn)、 グルタミン（Gin)の側鎖の標識を抑え、 所望のアミノ酸の主鎖 のみが標識された試料も調製することが可能となる。 従って、 安定同位体で標識 された又は非標識のアンモニゥム塩、 好ましくは安定同位体で標識された又は非 標識の酢酸アンモニムを、 必要に応じて安定同位体で標識されたアミノ酸混合物 とを適宜組み合わせ、 無細胞夕ンパク合成系によるタンパク質製造に必要な他の 成分とともに、 安定同位体標識タンパク質合成用キッ卜の形態で提供することが できる。
例えば、 本発明の安定同位体標識タンパク質合成用キットは、 以下の成分：
(a) アンモニゥム塩
(b) ァラニン、 アルギニン、 ァスパラギン酸、 システィン、 グルタミン酸、 グ リシン、 ヒスチジン、 イソロイシン、 ロイシン、 リジン、 メチォニン、 フエニル ァラニン、 プロリン、 セリン、 トレォニン、 トリプトファン、 チロシン、 バリン、 ァスパラギン、 及びグルタミンから成る群から選択されるアミノ酸を多くとも 1 9種類含むアミノ酸混合物
(c) 無細胞タンパク質合成用細胞抽出液
を含み、 かつ、 前記アンモニゥム塩及び/又は前記混合物中のアミノ酸の少なく とも 1種が安定同位体で標識されていることを特徴とする。
本キッ卜において、 アミノ酸混合物中のアミノ酸の少なくとも 1種が安定同位 体で標識されていてもよい。
また、 アンモニゥム塩の種類、 アミノ酸混合物の意味については、 2 . に記載 した通りである。
また、 本キットには、 A T P , G T P , C T P , U T Pなどのリポヌクレオチ ド、 基質溶液の p Hを調節するための緩衝液などを含めることができる。 発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例により本発明をさらに具体的に説明する。 但し、 本発明はこれら 実施例に限定されるものではない。
[実施例 1 ] 18種類のアミノ酸を用いた無細胞タンパク質合成 （バッチ法） 以下に示す組成の反応液（全量 30^ 1) を 37°Cにて 1時間インキュベートし、 タンパク質合成反応を行った。 なお、 下記反応液において、 「pK7- CAT：」 は、 Kim ら （1996) Eur. J. Biochem. 239： 881-886 の記載に従って調製された CAT 発 現ベクターである。
(パッチ法による無細胞夕ンパク質合成反応液組成）
HEPES-KOH ( H 7.5) 60 ιηΜ
ジチオスレィトール 1.8 mM
ATP 1.3 mM
CTP, GTP, UTP 各 0.9 mM
ン酸 80 mM
-ーゼ （Roche製） 250 ig/ml ポリエチレングリコール 8000 4.0%
3', 5'- cyclic AMP 0.66 mM
L (-) - 5 -フオルミル- 5, 6， 7, 8-テトラヒドロ葉酸 36 M
大腸菌ト一タル tRNA (MRE600, Roche製） 175 g/ml
酢酸アンモニゥム 80 mM
酢酸マグネシウム 10.7 mM
20種類又は Asn， Ginを除く 18種類のアミノ酸 1 mM
T7 RNAポリメラーゼ 66.7 zg/ml
大腸菌 S30抽出液 （Roche製） Ί· 2ιι\
0.2/ g/inl铸型 DNA (pK7- CAT) 反応後、 反応液を氷上において反応を停止させ、 反応液中に含まれる CAT (ク 口ラムフエニコールァセチルトランスフェラーゼ） タンパク質の定量を、 Shaw (1975) Methods Enzymol, p.735-755 に従い以下の方法で行った。 すなわち、 ァ セチルコェンザィム Aとクロラムフエ二コールを基質として CATによるクロラム フエ二コールのァセチル化反応を行い、 その結果生じた還元型コェンザィム Aを 5， 5 '—ジチォビス一 2—二トロ安息香酸 （DTNB)を用いて発色定量した。 37°C、 412 1における吸光度の単位時間あたりの増加量より CATの活性を定量し、 これ を指標として CATタンパク質量を決定した。 20種類又は 18種類のアミノ酸を用 いて合成したタンパク質量を比較したところ、 それぞれ 0. 551mg、 0. 529nig で差 がなかった（図 1 ) 。 これにより、 ァスパラギン （Asn)及びグルタミン （Gin)を 除いた 18 種類のアミノ酸混合物でも無細胞タンパク質合成系におけるタンパク 質の合成が可能であることがわかつた。
[実施例 2 ] 酢酸アンモニゥム濃度の検討 （バッチ法）
上記のバッチ法による無細胞タンパク質合成反応液において種々の濃度の酢酸 アンモニゥムを用いる以外は実施例 1と同様にしてタンパク質合成を行い、 CAT タンパク質量を定量した。 結果を図 2に示す。 酢酸アンモニゥムの濃度が増加す るについて CAT タンパク質量が増加し、 80 で最高値に達することがわかった。
[実施例 3 ] 18種類のアミノ酸を用いた無細胞タンパク質合成 （透析法）
(1) Rasタンパク質合成
下記（i)に示す透析内液に、 铸型 DNAとして Ras タンパク質をコードする遺伝 子を含む、 配列番号 1に示す塩基配列からなる lmg/ml の環状二本鎖 MA発現べ クタ一 「pK7- NHi s- Ras」を 0. 012ral 加えて全量を 3ml とし、 この透析内液を DispoDi alyzer CE (分子量限界 10000若しくは 50000 : Spec t rum社製） に入れ、 下 記（i i)に示す透析外液 30ml 中に浮遊させて試験管振とう培養液で 30°Cにて 4時 間振とうすることによってタンパク質合成を行つた。
(透析法による無細胞タンパク質合成反応液組成）
(i)透析内液：
HEPES-KOH (pH 7. 5) 60 mM
ジチオスレィ 1 ^一ル 1. 8 mM
ATP 1. 3 mM CTP, GTP, UTP 各 0. 9 mM クレアチンリン酸 80 mM クレアチンキナーゼ （Roche製） 250 g/ml ポリエチレングリコール 8000 4. 0 %
3', 5'- cyc l ic AMP 0. 66 mM
L (-) - 5-フオルミル- 5, 6, 7, 8-テトラヒドロ葉酸 3 6 M 大腸菌トータル tRNA (置 E600、 Roche製) 175 ii g/ml 15N標識酢酸アンモニゥム 80 mM 酢酸マグネシウム 10. 7 mM
20種類又は Asn， Ginを除く 18種類のアミノ酸 2 mM
0. 05 %
T7 RNAポリメラ一ゼ 66. 7 /i g/ml 大腸菌 S30抽出液 (Roche製) 0. 9 ml lmg/ml鐯型 DNA (pK7-NHi s-Ras)
(i i)透析外液：
HEPES-KOH ( H T. 5) 60 mM ジチオスレィトール 1. 8 mM ATP 1. 3 mM
CTP, GTP, UTP 各 0. 9 mM クレアチンリン酸 80 mM ポリエチレングリコール 8000 4. 0 % 3'， 5'- cyc l ic AMP 0. 66 mM
L (-） - 5 -フオルミル _5， 6, 7, 8 -テトラヒドロ葉酸 36 M 15N標識酢酸アンモニゥム 80 mM 酢酸マグネシウム 10. 7 mM
20種類又は Asn, Ginを除く 18種類のアミノ酸 2 mM アジ化ナトリウム 0. 05¾ (2) 15N標識 Rasタンパク質の精製
上述のようにして合成した 15N標識 Rasタンパク質の精製を行った 質の精製にはヒスチジンタグとニッケルの親和性を利用し、 操作は 4°Cで行った < まず合成反応終了後、 3 mlの反応液を 4.2 mlの洗浄緩衝液 [50 mMリン酸ナトリ ゥム（pH 8.0)/300 mM塩化ナトリウム /10 mMイミダゾール]で希釈 ·回収し、 1960Xg, 5分間遠心して沈殿を取り除いた。 次に、 得られた上清を 0.8 mlの Ni- NTA樹脂（キアゲン社）に通して吸着させ、 9.6 mlの洗浄緩衝液を通すことで 夾雑物を除去した。 最後に 4 mlの溶出緩衝液 [50 mMリン酸ナトリウム（pH
8.0)/300 mM塩化ナトリウム /500 mMイミダゾール]を通すことでサンプルを樹脂 から遊離させた。 以上の手順により， 0.88 mgの精製サンプルを得た。
(3) NMR測定試料の調製
精製サンプルを NMR測定に適した溶媒にするために、 20mM リン酸ナトリウム (pH 6.5)、 lOOmM塩化ナトリウム、 5 塩化マグネシウム、 5mM DTT、 0.01重 量％N aN3からなる溶液に置換した。 その後、 サンプルを 0.25 ml (サンプル 濃度 0.28 mM)まで濃縮した。 以上の操作には限外ろ過装置（ビバスピン 2： ザル トリウス社）を用いた。 最後に 0.03 ml の重水を添加し、 丽 R測定用試料とした。
(4) 丽 R測定
丽 R測定用のサンプル管にはシゲミ社の対称型ミク口試料管（5 mmプローブ用） を用いた。 匪 R測定は、 700 MHzの NMR装置（Avance700; ブル力一社）で、 温度 25°Cのもとで行った。 判定には、 15N2次元 HSQCスペクトル（以後15 N HSQCス ベクトルと略記）を用いた。 その際の測定条件は、 下記表 1に示す通りである。
表 1
(丽 R測定条件）
スぺクトル 積算回数 中心周波数 スぺクトル幅 データポイント数
Ή-15Ν HSQC Ή: 700.2332911MHz Ή:9765.625 Hz Ή: 1 024
15N: 70.9620093MHz 15N:2593.377617 Hz ,5N: 1 28
NMR測定の結果、 図 3に示すように、 15N HSQCスペクトルには 6.5PPD1から 7.5ppmにわたつて分離したァミノプロトンのシグナルが認められた。 これらの シグナルの現れ方は、 20種類の 15N標識アミノ酸を用いて上記の透析法により調 製した均一 15 N標識 Rasタンパク質の 15 N HSQCスペクトル （図 4) と比較し、 ァ ϊン（Gin)の側鎖アミノ基に由来するピークに特徴的 である。 従って、 得られた Rasタンパク質においては、 合成系に添加された安定 同位体標識酢酸アンモニゥムにより修飾された
ン（Gin)の側鎖のみが標識されていることが明らかとなつた；
[実施例 4] 酢酸アンモニゥム濃度の検討 （バッチ法）
以下に示す組成の反応液（全量 30^1) を用いてタンパク質合成反応を行った < なお、 下記反応液において、 「pQBI T7-GFPJ は、 GFP 発現べクタ一であり、
WAKO Pure Chemical Industries, Ltd.より購入した。
(バッチ法による無細胞夕ンパク質合成反応液組成）
HEPES-KOH ( H 7.5) 60 mM
ジチオスレィ 1 ^一ル 1.8 mM
ATP 1.3 禮
CTP, GTP, UTP 各 0.9 mM
クレアチンリン酸 80 mM
クレアチンキナーゼ （Roche製）
ポリエチレングリコール 8000 4.0 %
3', 5，- cyclic AMP 0.66 mM
L (_)-5 -フオルミル- 5， 6， 7, 8-テトラヒドロ葉酸 36 M
大腸菌トータル tRNA (MRE600, Roche製） 175 xg/ml
酢酸アンモニゥム 0〜120 mM
酢酸マグネシウム 10.7 mM
20種類又は Asn, Ginを除く 18種類のアミノ酸 1 mM
T7 RNAポリメラーゼ 66.7 g/ml
大腸菌 S30抽出液 （Roche製） ΊΛμΛ
2 g/ml铸型 DNA (pQBI T7-GFP)
上記反応液を 37°Cのヒートブロック上で 1時間静置した。 さらに、 反応液を 4°Cにて 24時間静置した後、 PBSで 20倍希釈し、 GFPの蛍光強度を励起波長 485nm、 測定波長 510nniにて測定した。 データは反応液あたりの蛍光量で示した (図 5) 。
最大の GFP合成量が得られた酢酸アンモニゥム濃度は 20種類のアミノ酸、 18 種類のアミノ酸のいずれを用いた場合も共に 40 であった。
[実施例 5] 18 種類のアミノ酸を用いた無細胞タンパク質合成 （バッチ法） に おける Asp, Gluの濃度、 及び酢酸アンモニゥム濃度の検討
以下に示す組成の反応液（全量 30/il) を用いてタンパク質合成反応を行った t 合成に用いた 18 種類のアミノ酸のうち、 ァスパラギン酸 （Asp)、 グルタミン酸
(Glu)は通常の 1.5倍の濃度 （1.5mM)とした。
なお、 下記反応液において、 「pQBI T7-GFPJ は、 GFP 発現ベクターであり、 WAKO Pure Chemical Industries, Ltd.より購入した。
(バッチ法による無細胞夕ンパク質合成反応液組成）
HEPES-KOH (pH 7.5) 60 πιΜ
ジチオスレィトール 1.8 mM
ATP 1.3 mM
CTP, GTP, UTP 各 0.9 mM
クレアチンリン酸 80 mM
クレアチンキナーゼ （Roche製） 25(^g/ml
ポリエチレングリコール 8000 4.0 %
3', 5'- cyclic AMP 0.66 mM
L(-)- 5 -フオルミル- 5， 6， 7, 8 -テトラヒドロ葉酸 36 zM
大腸菌トータル tRNA (MRE600, Roche製） 175 g/ml
酢酸アンモニゥム 0〜120 mM
酢酸マグネシウム 10.7 mM
20種類のアミノ酸 各 1 mM
又は Asn, Ginを除く 18種類のアミノ酸
Asp, Glu 各 1.5mM
Asp, Gluを除く 16種類のアミノ酸 各 ImM
T7 NAポリメラーゼ 66.7 g/ml 大腸菌 S30抽出液 （Roche製） 7. 2 1
2 /ml铸型匪 (pQBI T7-GFP) 上記反応液を 37°Cのヒートブロック上で 1時間静置した。 さらに、 反応液を 4°Cにて 24時間静置した後、 PBSで 20倍希釈し、 GFPの蛍光強度を励起波長 485nm、 測定波長 510MIにて測定した。 データは反応液あたりの蛍光量で示した (図 6 ) 。
最大の GFP合成量が得られた酢酸ァンモニゥム濃度は 20種類のァミノ酸を用 い場合では 40mMであり、 18種類のアミノ酸を用いた場合 （ァスパラギン酸 (Asp) , グルタミン酸 （Glu)を通常の 1. 5倍の濃度 （1. 5mM)とした条件下） では 60mMであった。 また、 18種類のアミノ酸を用いた場合のピーク時における GHP 合成量は、 20種類のアミノ酸を用いた場合と同程度であった。 従って、 ァスパ ラギン酸 （Asp グルタミン酸 （Glu)を通常の 1. 5倍量添加することにより、 従 来の方法と同程度のアミノ酸合成量が得られることが示された。
[実施例 6 ] 20 種類又は 18 種類のアミノ酸を用いた無細胞タンパク質合成系 (バッチ法） におけるタンパク合成量の比較
20種類のアミノ酸 （各アミノ酸濃度 1. OmM) 又は 18種類のアミノ酸 （各アミ ノ酸濃度 1. OmM、 ァスパラギン酸 （Asp)とグルタミン酸 （Glu)濃度 1. 5mM) をそ れぞれ用い、 酢酸アンモニゥム濃度 6(kM条件下で GFPタンパク質、 Ras タンパ ク質の合成をそれぞれ行った。
反応液組成を下記に示す。 なお、 下記反応液において、 「pQBI T7-GFPJ 、 「pK7- NHi s- Ras」 は、 前述の通りである。
(バッチ法による無細胞タンパク質合成反応液組成）
HEPES-KOH (pH 7. 5) 60 mM
ジチオスレィトール · 1. 8 mM
ATP 1. 3 mM
CTP, GTP, UTP 各 0. 9 mM
ン酸 80 mM クレアチンキナーゼ （Roche製） 250 i g/nil ポリエチレングリコール 8000 4. 0 ¾
3'， 5'— cyc l ic AMP 0. 66 mM
L (_) _5-フオルミル- 5， 6, 7, 8-テトラヒドロ葉酸 36 x M
大腸菌トータル tRNA (MRE600, Roche製） 175 g/ml 酢酸アンモニゥム 60 mM
酢酸マグネシウム 10. 7 mM
20種類のアミノ酸 各 1
又は Asn， Ginを除く 18種類のアミノ酸
Asp, Gl u 各 1. 5mM
Asp, Gluを除く 16種類のアミノ酸 各 lmM
T7 RNAポリメラーゼ 66. 7 8/ΠΙ1
大腸菌 S30抽出液 （Roche製） 7. 2 1
2 g/ml铸型 DNA (pQBI T7- GFP又は pK7- Mi s-Ras) 上記反応液を 371のヒートブロック上で 1時間静置した。 SDS- PAGEにて分離 後、 抗 GFP抗体 （GFP)、 又は抗 HAT抗体 （Ras)を用いてィムノブロット法により タンパク質の検出を行った （図 7 ) 。 両タンパク質ともに 18種類のアミノ酸を 用いた場合でも 20種類のアミノ酸を用いた場合と同定度の合成量が得られた。 本明細書で引用した全ての刊行物、 特許及び特許出願をそのまま参考として本 明細書に組み入れるものとする。 産業上の利用可能性
以上に示したように、 無細胞タンパク質合成系においてァスパラギン （Asn) 及びグルタミン （Gin) を含まない 18種類のアミノ酸混合物を基質として用いて タンパク質の合成を行っても、 20 種類のアミノ酸を用いたときと同等な活性を 有するタンパク質を合成することができた。 また、 15N にて標識したアンモニゥ ム塩又は非標識のアンモニゥム塩を無細胞タンパク質合成系に添加すると、 ァス (Asn) 及びグルタミン （Gin) の側鎖への標識を制御できた。 従って、 本発明は、 安定同位体標識タンパク質を安価に製造することを可能とし、 ハイス ル一プッ卜なタンパク質立体構造解析を行う上で非常に有用である。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 無細胞タンパク質合成系において、 ァラニン、 アルギニン、 ァスパラギン酸、 システィン、 グルタミン酸、 グリシン、 ヒスチジン、 イソロイシン、 ロイシン、 リジン、 メチォニン、 フエ二ルァラニン、 プロリン、 セリン、 トレオニン、 トリ ブトファン、 チロシン、 バリン、 ァスパラギン、 及びグルタミンから成る群から 選択されるアミノ酸を多くとも 1 9種類含むアミノ酸混合物を基質として用いて タンパク質を合成することを特徴とする、 タンパク質の製造方法。
2 . アミノ酸混合物が、 ァラニン、 アルギニン、 ァスパラギン酸、 システィン、 グルタミン酸、 グリシン、 ヒスチジン、 イソロイシン、 ロイシン、 リジン、 メチ ォニン、 フエ二ルァラニン、 プロリン、 セリン、 トレオニン、 トリプトファン、 チロシン、 及びバリンを含む混合物である、 請求項 1に記載の方法。
3 . アミノ酸混合物が、 ァラニン、 アルギニン、 ァスパラギン酸、 システィン、 グルタミン酸、 グリシン、 ヒスチジン、 イソロイシン、 ロイシン、 リジン、 メチ ォニン、 フエ二ルァラニン、 プロリン、 セリン、 トレォニン、 トリプトファン、 チロシン、 パリン、 及びァスパラギンを含む混合物である、 請求項 1に記載の方 法。
4 . アミノ酸混合物が、 ァラニン、 アルギニン、 ァスパラギン酸、 システィン、 グルタミン酸、 グリシン、 ヒスチジン、 イソロイシン、 ロイシン、 リジン、 メチ ォニン、 フエ二ルァラニン、 プロリン、 セリン、 トレオニン、 トリプトファン、 チロシン、 バリン、 及びグルタミンを含む混合物である、 請求項 1に記載の方法。
5 . 無細胞タンパク質合成系に、 アンモニゥム塩を添加することを特徴とする、 請求項 1〜4のいずれかに記載の方法。
6 . アンモニゥム塩を 20〜120πιΜの最終濃度となるように添加することを特徴と する、 請求項 5に記載の方法。
7 . アンモニゥム塩が酢酸アンモニゥムである、 請求項 5又は 6に記載の方法。
8 . 無細胞タンパク質合成系において安定同位体標識タンパク質を製造する方法 であって、 該系にアンモニゥム塩を添加し、 ァラニン、 アルギニン、 ァスパラギ ン酸、 システィン、 グルタミン酸、 グリシン、 ヒスチジン、 イソロイシン、 ロイ シン、 リジン、 メチォニン、 フエ二ルァラニン、 プロリン、 セリン、 トレォニン、 トリブトファン、 チロシン、 バリン、 ァスパラギン、 及びグルタミンから成る群 から選択されるアミノ酸を多くとも 1 9種類含むァミノ酸混合物を基質として用 い、 かつ、 前記アンモニゥム塩及び/又は前記混合物中のアミノ酸の少なくとも 1種が安定同位体で標識されていることを特徴とする、 上記方法。
9 . アミノ酸混合物が、 ァラニン、 アルギニン、 ァスパラギン酸、 システィン、 グルタミン酸、 グリシン、 ヒスチジン、 イソロイシン、 ロイシン、 リジン、 メチ ォニン、 フエ二ルァラニン、 プロリン、 セリン、 トレォニン、 トリプトファン、 チロシン、 及びバリンを含む混合物である、 請求項 8に記載の方法。
1 0 . アミノ酸混合物が、 ァラニン、 アルギニン、 ァスパラギン酸、 システィン、 グルタミン酸、 グリシン、 ヒスチジン、 イソロイシン、 ロイシン、 リジン、 メチ ォニン、 フエ二ルァラニン、 プロリン、 セリン、 トレオニン、 トリプ卜ファン、 チロシン、 バリン、 及びァスパラギンを含む混合物である、 請求項 8に記載の方 法。
1 1 . アミノ酸混合物が、 ァラニン、 アルギニン、 ァスパラギン酸、 システィン、 グルタミン酸、 グリシン、 ヒスチジン、 イソロイシン、 ロイシン、 リジン、 メチ ォニン、 フエ二ルァラニン、 プロリン、 セリン、 トレオニン、 トリプトファン、 チロシン、 バリン、 及びグルタミンを含む混合物である、 請求項 8に記載の方法。
1 2 . アンモニゥム塩が酢酸アンモニゥムである、 請求項 8〜 1 1のいずれかに 記載の方法。
1 3 . 以下の成分：
(a) アンモニゥム塩
(b) ァラニン、 アルギニン、 ァスパラギン酸、 システィン、 グルタミン酸、 グ リシン、 ヒスチジン、 イソロイシン、 ロイシン、 リジン、 メチォニン、 フエニル ァラニン、 プロリン、 セリン、 トレォニン、 トリブトファン、 チロシン、 ノ リン、 ァスパラギン、 及びグルタミンから成る群から選択されるアミノ酸を多くとも 1 9種類含むアミノ酸混合物
(c) 無細胞タンパク質合成用細胞抽出液 を含み、 かつ、 前記アンモニゥム塩及び/又は前記混合物中のアミノ酸の少なく とも 1種が安定同位体で標識されていることを特徴とする、 安定同位体標識タン パク質合成用試薬キッ卜。
1 4 . アミノ酸混合物が、 ァラニン、 アルギニン、 ァスパラギン酸、 システィン、 グルタミン酸、 グリシン、 ヒスチジン、 イソロイシン、 ロイシン、 リジン、 メチ ォニン、 フエ二ルァラニン、 プロリン、 セリン、 トレォニン、 トリプ卜ファン、 チロシン、 及びバリンを含む混合物である、 請求項 1 3に記載のキッ ト。
1 5 . アミノ酸混合物が、 ァラニン、 アルギニン、 ァスパラギン酸、 システィン、 グルタミン酸、 グリシン、 ヒスチジン、 イソロイシン、 ロイシン、 リジン、 メチ ォニン、 フエ二ルァラニン、 プロリン、 セリン、 トレオニン、 トリプトファン、 チロシン、 バリン、 及びァスパラギンを含む混合物である、 請求項 1 3に記載の 十ッ卜。
1 6 . アミノ酸混合物が、 ァラニン、 アルギニン、 ァスパラギン酸、 システィン、 グルタミン酸、 グリシン、 ヒスチジン、 イソロイシン、 ロイシン、 リジン、 メチ ォニン、 フエ二ルァラニン、 プロリン、 セリン、 トレオニン、 トリプ卜ファン、 チロシン、 バリン、 及びグルタミンを含む混合物である、 請求項 1 3に記載のキ ッ卜。
1 7 . アンモニゥム塩が酢酸アンモニゥムである、 請求項 1 3〜 1 6のいずれか に記載のキッ卜。
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